JP2003144192A - エストロゲン受容体リガンドのｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング - Google Patents
エストロゲン受容体リガンドのｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングInfo
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-
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- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/743—Steroid hormones
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-
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- G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
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- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】生殖と関連しない脳機能を有するCNS の領域で
エストロゲン様作用を有するエストロゲン受容体リガン
ドを検出するin vitroスクリーニングの提供。 【解決手段】以下の工程よりなる、少なくとも２つの検
定系を用いた試験物質のin vitroスクリーニング方法。
（ｉ）第１の細胞または組織検定系で、ERの活性により
媒介され、ERおよびER誘導レポーター遺伝子を含んだ前
記細胞または組織系での効力の検出により測定される転
写活性、を有するリガンドを選択し、前記リガンドは、
10nmol/l以下のEC 50(ER)の前記第１の検定系で効力を活
性化することにより転写の活性化を検出する工程と、
（ii）第２の無細胞または酵素検定系で、前記無細胞ま
たは酵素系での相互作用の効力の検出により測定される
SRC-1 およびそのフラグメントと、前記ERとの物理化学
相互作用、を選択し、前記リガンドは、100nmol/l 以上
のEC50 (ER+SRC)の前記第２の検定系で、前記ERを活性化
して、前記SRC-1 およびフラグメントとの相互作用を誘
導して、SRC-1 およびそのフラグメントと、ERの前記物
理化学相互作用を検出する工程。
エストロゲン様作用を有するエストロゲン受容体リガン
ドを検出するin vitroスクリーニングの提供。 【解決手段】以下の工程よりなる、少なくとも２つの検
定系を用いた試験物質のin vitroスクリーニング方法。
（ｉ）第１の細胞または組織検定系で、ERの活性により
媒介され、ERおよびER誘導レポーター遺伝子を含んだ前
記細胞または組織系での効力の検出により測定される転
写活性、を有するリガンドを選択し、前記リガンドは、
10nmol/l以下のEC 50(ER)の前記第１の検定系で効力を活
性化することにより転写の活性化を検出する工程と、
（ii）第２の無細胞または酵素検定系で、前記無細胞ま
たは酵素系での相互作用の効力の検出により測定される
SRC-1 およびそのフラグメントと、前記ERとの物理化学
相互作用、を選択し、前記リガンドは、100nmol/l 以上
のEC50 (ER+SRC)の前記第２の検定系で、前記ERを活性化
して、前記SRC-1 およびフラグメントとの相互作用を誘
導して、SRC-1 およびそのフラグメントと、ERの前記物
理化学相互作用を検出する工程。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リガンドのｉｎ
ｖｉｔｒｏ検出方法、ならびに神経親和性および最小全
身性（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）エストロゲン様特性を有する
エストロゲン受容体リガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリ
ーニングに関する。本発明は、さらに定義した特性を有
するエストロゲン受容体リガンドを検出するためのステ
ロイド受容体のコアクチベータ−１（ＳＲＣ−１）のｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。
ｖｉｔｒｏ検出方法、ならびに神経親和性および最小全
身性（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）エストロゲン様特性を有する
エストロゲン受容体リガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリ
ーニングに関する。本発明は、さらに定義した特性を有
するエストロゲン受容体リガンドを検出するためのステ
ロイド受容体のコアクチベータ−１（ＳＲＣ−１）のｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】他のエストロゲン感受性組織に影響を与
えることのない、神経親和機能を有する物質 ＰＡＴＣＨＥＶらの国際公開公報ＷＯ９９／４２１０８
号には、他の器官または系に影響を与えることなしに、
中枢神経系でのエストロゲン欠乏を選択的に補充する薬
剤としてステロイドが記載されている。そのような化合
物（リガンド）は、選択的な神経親和特性を有してお
り、他のエストロゲン感受性の器官に影響を与えない。
神経系に対する選択的な神経親和効果は、動物モデルで
試験されている。
えることのない、神経親和機能を有する物質 ＰＡＴＣＨＥＶらの国際公開公報ＷＯ９９／４２１０８
号には、他の器官または系に影響を与えることなしに、
中枢神経系でのエストロゲン欠乏を選択的に補充する薬
剤としてステロイドが記載されている。そのような化合
物（リガンド）は、選択的な神経親和特性を有してお
り、他のエストロゲン感受性の器官に影響を与えない。
神経系に対する選択的な神経親和効果は、動物モデルで
試験されている。
【０００３】中枢神経系でのエストロゲン欠乏症候群の
治療用薬剤の望ましい特性として、これらの薬剤が生殖
系のエストロゲン感受性の組織（例えば、子宮内膜、乳
房、下垂体）にほとんど影響を与えることなしに、また
は影響を与えることなしに、脳内のエストロゲン依存性
の標的遺伝子に作用することが要求されている。
治療用薬剤の望ましい特性として、これらの薬剤が生殖
系のエストロゲン感受性の組織（例えば、子宮内膜、乳
房、下垂体）にほとんど影響を与えることなしに、また
は影響を与えることなしに、脳内のエストロゲン依存性
の標的遺伝子に作用することが要求されている。
【０００４】エストロゲンは、中枢神経系（ＣＮＳ）に
多数の作用を有する。エストロゲンの内的作用は、脳機
能のいくつかの側面を決定する神経回路の不可逆的なハ
ード配線（ｈａｒｄ ｗｉｒｉｎｇ）を生じる［Ｖ．
Ｋ．Ｐａｔｃｈｅｖ ａｎｄＯ．Ｆ．Ｘ．Ａｌｍｅｉｄ
ａ， Ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄ
ｅｎｔ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏ
ｅｎｄｏｃｒｉｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， Ｒ．Ｇ．Ｌ
ａｎｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ａｕｓｔｉｎ，１９９
９］。
多数の作用を有する。エストロゲンの内的作用は、脳機
能のいくつかの側面を決定する神経回路の不可逆的なハ
ード配線（ｈａｒｄ ｗｉｒｉｎｇ）を生じる［Ｖ．
Ｋ．Ｐａｔｃｈｅｖ ａｎｄＯ．Ｆ．Ｘ．Ａｌｍｅｉｄ
ａ， Ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄ
ｅｎｔ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏ
ｅｎｄｏｃｒｉｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， Ｒ．Ｇ．Ｌ
ａｎｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ａｕｓｔｉｎ，１９９
９］。
【０００５】成体の脳において、生殖腺から導かれるエ
ストロゲンの生理的レベルは、生殖機能に影響するとと
もに、学習、記憶、方向感覚、感情、認知情報の処理の
ような、生殖および性的行動と関連しない脳の活動に影
響をおよぼす［Ｓ．Ｅ．Ａｌｖｅｓ ａｎｄ Ｂ．Ｓ．
ＭｃＥｗｅｎ， Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｂｒａｉ
ｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｆｏｒ ａｇｉｎｇａｎｄ ｄｅｍｅｎｔｉａ； ｉｎ
Ｍ．Ｏｅｔｔｅｌ ａｎｄ Ｅ．Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ
ｅｒ， ｅｄｓ．， Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ａ
ｎｔｉｅｓｔｒｏｇｅｎｓ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ
ｙ， Ｖｏｌ．１３５／ｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｂ
ｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， １９９９，
ｐｐ．３１５−３２８］。エストロゲンの神経親和作用
の大部分は、標的遺伝子の転写調節に関連し、この調節
は、別の神経領域でのエストロゲン活性により誘導され
る。
ストロゲンの生理的レベルは、生殖機能に影響するとと
もに、学習、記憶、方向感覚、感情、認知情報の処理の
ような、生殖および性的行動と関連しない脳の活動に影
響をおよぼす［Ｓ．Ｅ．Ａｌｖｅｓ ａｎｄ Ｂ．Ｓ．
ＭｃＥｗｅｎ， Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｂｒａｉ
ｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｆｏｒ ａｇｉｎｇａｎｄ ｄｅｍｅｎｔｉａ； ｉｎ
Ｍ．Ｏｅｔｔｅｌ ａｎｄ Ｅ．Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ
ｅｒ， ｅｄｓ．， Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ａ
ｎｔｉｅｓｔｒｏｇｅｎｓ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ
ｙ， Ｖｏｌ．１３５／ｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｂ
ｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， １９９９，
ｐｐ．３１５−３２８］。エストロゲンの神経親和作用
の大部分は、標的遺伝子の転写調節に関連し、この調節
は、別の神経領域でのエストロゲン活性により誘導され
る。
【０００６】エストロゲン受容体
エストロゲン受容体（ＥＲ）には２つの異性体、ＥＲα
およびＥＲβが存在する。それらの分布およびリガンド
結合性については示されている［Ｖ．ＧＩＧＵＥＲＥ
ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ β： ｒｅ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ａｎｔｉ−ｅｓｔｒｏｇ
ｅｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ； Ｓｔｅｒｏｉｄｓ Ｖｏ
ｌ．６３， ｐｐ．３３５−３３９ ａｎｄ Ｇ．Ｇ．
ＫＵＩＰＥＲ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｔｈｅ ｎ
ｏｖｅｌ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕ
ｂｔｙｐｅ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ
ｔｈｅ ｃｅｌｌ− ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅ
ｎｓ ａｎｄ ａｎｔｉ−ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ， ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ，Ｖｏｌ．４１０： ｐｐ．８７−９
０］。リガンドで活性化されるエストロゲン受容体は、
エストロゲン感受性遺伝子プロモーターの、エストロゲ
ン応答配列と呼ばれる特定のＤＮＡ配列と結合し、リガ
ンドで活性化される転写因子として、それらの転写に影
響をおよぼす。２つのＥＲ異性体は、いずれも脳内に存
在しており、それぞれ別々の、機能的に異なる脳の領域
で、必ずしもオーバーラップしない、異なった分布を有
している［Ｐ．Ｊ．Ｓｈｕｇｈｒｕｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａ ａｎ
ｄ −ｂ ｍＲＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔｃｅｎｔｒ
ａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ， Ｊ．Ｃｏｍ
ｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．， Ｖｏｌ．３８８， ｐｐ．５０
７−５２５， １９９７］。天然または合成のリガンド
との結合時、ＥＲは、ＥＲＥｓと結合して標的遺伝子の
転写に影響を与える前に、ＥＲで媒介される標的遺伝子
の転写モジュレーター（増幅器または減衰器）として作
用する内因性のコアクチベーターおよびアダプタープロ
テインを漸増（ｒｅｃｒｕｉｔ）してもよい。
およびＥＲβが存在する。それらの分布およびリガンド
結合性については示されている［Ｖ．ＧＩＧＵＥＲＥ
ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ β： ｒｅ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ａｎｔｉ−ｅｓｔｒｏｇ
ｅｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ； Ｓｔｅｒｏｉｄｓ Ｖｏ
ｌ．６３， ｐｐ．３３５−３３９ ａｎｄ Ｇ．Ｇ．
ＫＵＩＰＥＲ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｔｈｅ ｎ
ｏｖｅｌ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕ
ｂｔｙｐｅ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ
ｔｈｅ ｃｅｌｌ− ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅ
ｎｓ ａｎｄ ａｎｔｉ−ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ， ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ，Ｖｏｌ．４１０： ｐｐ．８７−９
０］。リガンドで活性化されるエストロゲン受容体は、
エストロゲン感受性遺伝子プロモーターの、エストロゲ
ン応答配列と呼ばれる特定のＤＮＡ配列と結合し、リガ
ンドで活性化される転写因子として、それらの転写に影
響をおよぼす。２つのＥＲ異性体は、いずれも脳内に存
在しており、それぞれ別々の、機能的に異なる脳の領域
で、必ずしもオーバーラップしない、異なった分布を有
している［Ｐ．Ｊ．Ｓｈｕｇｈｒｕｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａ ａｎ
ｄ −ｂ ｍＲＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔｃｅｎｔｒ
ａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ， Ｊ．Ｃｏｍ
ｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．， Ｖｏｌ．３８８， ｐｐ．５０
７−５２５， １９９７］。天然または合成のリガンド
との結合時、ＥＲは、ＥＲＥｓと結合して標的遺伝子の
転写に影響を与える前に、ＥＲで媒介される標的遺伝子
の転写モジュレーター（増幅器または減衰器）として作
用する内因性のコアクチベーターおよびアダプタープロ
テインを漸増（ｒｅｃｒｕｉｔ）してもよい。
【０００７】ステロイド受容体コアクチベーター１
ステロイド受容体コアクチベーター１（ＳＲＣ−１）
は、リガンドの結合によって活性化される、核内受容体
により媒体される転写の“増幅器”として作用する細胞
タンパク質の一群に属している［Ｓ．Ａ．Ｏｎａｔｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈａｒａ
ｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏａｃｔｉｖａ
ｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏ
ｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．２７０， ｐｐ．１３５４
−１３５７，１９９５］。エストロゲン受容体で調節さ
れる転写の、ＳＲＣ−１で媒介されるコアクチベーショ
ンは、アゴニストのコンホメーションにおけるＥＲの存
在を必要とし、付加的な媒介物質（例えばＣＢＰ／ｐ３
００）の漸増を伴う。しかし、自律的な活性ドメインも
また、確認されている［Ｄ．Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ ａｃｔｉｏ
ｎ： Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ ｓｈａｒｅｄ ｔ
ａｓｋｓ， Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， Ｖｏ
ｌ．１４， ｐｐ．３２９−３４７， ２０００］。
は、リガンドの結合によって活性化される、核内受容体
により媒体される転写の“増幅器”として作用する細胞
タンパク質の一群に属している［Ｓ．Ａ．Ｏｎａｔｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈａｒａ
ｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏａｃｔｉｖａ
ｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏ
ｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．２７０， ｐｐ．１３５４
−１３５７，１９９５］。エストロゲン受容体で調節さ
れる転写の、ＳＲＣ−１で媒介されるコアクチベーショ
ンは、アゴニストのコンホメーションにおけるＥＲの存
在を必要とし、付加的な媒介物質（例えばＣＢＰ／ｐ３
００）の漸増を伴う。しかし、自律的な活性ドメインも
また、確認されている［Ｄ．Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ ａｃｔｉｏ
ｎ： Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ ｓｈａｒｅｄ ｔ
ａｓｋｓ， Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， Ｖｏ
ｌ．１４， ｐｐ．３２９−３４７， ２０００］。
【０００８】ＳＲＣ−１は、エストロゲン標的器官およ
びエストロゲン感受性腫瘍で、広範囲に発現している
［ＢＥＲＮＳ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｐｒｅｄｉ
ｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＳＲＣ−１ ｆｏｒ
ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｒｅｃ
ｕｒｒｅｎｔ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ， Ｂｒｅ
ａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． Ｖｏ
ｌ．４８， ９７−９２， ｆｕｒｔｈｅｒ ＮＥＷＭ
ＡＮＮ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｃｏｆａｃｔｏｒ
ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ
ｌｉｇａｎｄ−ｂｏｕｎｄ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ ａｎｄ ａｎ ｉｎｔｒｏｎ１ ｅｎｈａ
ｎｃｅｒ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＲＢＢ２ ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ， Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ， Ｖｏｌ．１９， ４９０−４９７， ａ
ｎｄ ＬＡＢＲＩＥ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） ａ
ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＳＥＲＭ ａｃ
ｔｉｎｇ ａｓ ｐｕｒｅ ａｎｔｉ−ｅｓｔｒｏｇｅ
ｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ａｎ
ｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ， Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．６９，
５１−８４］。ＳＲＣ−１が遺伝子ターゲッティング
によって不活性化された場合、エストロゲンに対する部
分的な耐性が、子宮、前立腺、睾丸および乳腺のような
いくつかの組織で検出される［ＸＵ ｅｔ ａｌ．［１
９９８］ Ｐａｒｔｉａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｉ
ｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｉｃｅｗｉｔｈ ｄｉｓｒｕｐ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１（ＳＲＣ−１）ｇ
ｅｎｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７９， １９２
２−１９２５］。しかし、ホモ接合ＳＲＣ−１ヌル突然
変異体で、天然の表現型に比べて脳機能に変化が生じて
いることは証明されていない。これらの結果は、ＳＲＣ
−１が、ＣＮＳにおいて、ＥＲに媒介される化学信号を
調節する役割も果たしていない可能性を教示している。
ＳＲＣ−１の２つの異性体、すなわちＳＲＣ−１ａおよ
びＳＲＣ−１ｅが、成体ラットの脳の異なる領域に分布
していることが示されている［Ｏ．Ｃ．ＭＥＩＪＥＲ，
Ｐ．Ｊ．ＳＴＥＥＮＢＥＲＧＥＮ ａｎｄ Ｅ．Ｒ. Ｄ
Ｅ ＫＬＯＥＴ（２０００）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎａｌ
ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｒｏｉｄ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ＳＲＣ−１
ａｎｄ ＳＲＣ−２ ｉｎ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｐ
ｉｔｕｉｔａｒｙ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ．１４１， ｐｐ．２１９２−２１９９］。ＳＲ
Ｃ−１は、海馬、扁桃体、視床下部、基底核および等皮
質を含む多くの脳領域で発現しており、認知情報の処理
または生殖関連機能の調節のいずれかに関する別々の機
能を果たす。それらがエストロゲン感受性であることは
周知である。
びエストロゲン感受性腫瘍で、広範囲に発現している
［ＢＥＲＮＳ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｐｒｅｄｉ
ｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＳＲＣ−１ ｆｏｒ
ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｒｅｃ
ｕｒｒｅｎｔ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ， Ｂｒｅ
ａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． Ｖｏ
ｌ．４８， ９７−９２， ｆｕｒｔｈｅｒ ＮＥＷＭ
ＡＮＮ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｃｏｆａｃｔｏｒ
ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ
ｌｉｇａｎｄ−ｂｏｕｎｄ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ ａｎｄ ａｎ ｉｎｔｒｏｎ１ ｅｎｈａ
ｎｃｅｒ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＲＢＢ２ ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ， Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ， Ｖｏｌ．１９， ４９０−４９７， ａ
ｎｄ ＬＡＢＲＩＥ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） ａ
ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＳＥＲＭ ａｃ
ｔｉｎｇ ａｓ ｐｕｒｅ ａｎｔｉ−ｅｓｔｒｏｇｅ
ｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ａｎ
ｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ， Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．６９，
５１−８４］。ＳＲＣ−１が遺伝子ターゲッティング
によって不活性化された場合、エストロゲンに対する部
分的な耐性が、子宮、前立腺、睾丸および乳腺のような
いくつかの組織で検出される［ＸＵ ｅｔ ａｌ．［１
９９８］ Ｐａｒｔｉａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｉ
ｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｉｃｅｗｉｔｈ ｄｉｓｒｕｐ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１（ＳＲＣ−１）ｇ
ｅｎｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７９， １９２
２−１９２５］。しかし、ホモ接合ＳＲＣ−１ヌル突然
変異体で、天然の表現型に比べて脳機能に変化が生じて
いることは証明されていない。これらの結果は、ＳＲＣ
−１が、ＣＮＳにおいて、ＥＲに媒介される化学信号を
調節する役割も果たしていない可能性を教示している。
ＳＲＣ−１の２つの異性体、すなわちＳＲＣ−１ａおよ
びＳＲＣ−１ｅが、成体ラットの脳の異なる領域に分布
していることが示されている［Ｏ．Ｃ．ＭＥＩＪＥＲ，
Ｐ．Ｊ．ＳＴＥＥＮＢＥＲＧＥＮ ａｎｄ Ｅ．Ｒ. Ｄ
Ｅ ＫＬＯＥＴ（２０００）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎａｌ
ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｒｏｉｄ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ＳＲＣ−１
ａｎｄ ＳＲＣ−２ ｉｎ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｐ
ｉｔｕｉｔａｒｙ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ．１４１， ｐｐ．２１９２−２１９９］。ＳＲ
Ｃ−１は、海馬、扁桃体、視床下部、基底核および等皮
質を含む多くの脳領域で発現しており、認知情報の処理
または生殖関連機能の調節のいずれかに関する別々の機
能を果たす。それらがエストロゲン感受性であることは
周知である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、生殖
と関連しない脳機能を有するＣＮＳの領域でエストロゲ
ン様作用を有するエストロゲン受容体リガンドを検出す
るためのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングを提供するこ
とである。同時にリガンドは、脳以外のエストロゲン標
的器官に効果的であってはならない。そのようなＣＮＳ
選択性のエストロゲン受容体リガンドは、エストロゲン
の欠乏によって引き起こされるＣＮＳの機能障害の予防
および治療に使用することができる。そのようなリガン
ドは、エストロゲン投与による子宮内膜および乳房への
副作用、ならびに性腺分泌ホルモン分泌の神経内分泌調
節における副作用を防止する。
と関連しない脳機能を有するＣＮＳの領域でエストロゲ
ン様作用を有するエストロゲン受容体リガンドを検出す
るためのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングを提供するこ
とである。同時にリガンドは、脳以外のエストロゲン標
的器官に効果的であってはならない。そのようなＣＮＳ
選択性のエストロゲン受容体リガンドは、エストロゲン
の欠乏によって引き起こされるＣＮＳの機能障害の予防
および治療に使用することができる。そのようなリガン
ドは、エストロゲン投与による子宮内膜および乳房への
副作用、ならびに性腺分泌ホルモン分泌の神経内分泌調
節における副作用を防止する。
【００１０】
【発明を解決するための手段】本発明の課題は、以下の
工程よりなる少なくとも２つの検定系を用いた選択およ
び検出を含んだ、第１の態様の試験物質（リガンド）の
ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法により解決され
る。 （ｉ）第１の細胞検定系または組織検定系で、小胞体
（ＥＲ）の活性により媒介され、ＥＲおよびＥＲに誘導
されるレポーター遺伝子を含んだ前記細胞検定系または
組織検定系での効力の検出によって測定される転写活
性、を有するリガンドを選択し、前記リガンドは、１０
ｎｍｏｌ／ｌ以下のＥＣ50(ER)（最大有効リガンド濃度
半値）を有する前記第１の検定系で効力を活性化し、そ
れにより転写の活性化を検出する工程と、（ii）第２の
無細胞検定系または酵素検定系で、前記無細胞検定系ま
たは酵素検定系での相互作用の効力の検出により測定さ
れる、ＳＲＣ−１およびそのフラグメントと、前記ＥＲ
との物理化学相互作用（漸増）、を選択し、前記リガン
ドは、１００ｎｍｏｌ／ｌ以上のＥＣ50(ER+SRC)を有す
る前記第２の検定系で、前記ＥＲを活性化し、共に存在
している前記ＳＲＣ−１およびそのフラグメントとの相
互作用を誘導してＳＲＣ−１およびそのフラグメント
と、ＥＲとの前記物理化学相互作用を検出する工程。
工程よりなる少なくとも２つの検定系を用いた選択およ
び検出を含んだ、第１の態様の試験物質（リガンド）の
ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法により解決され
る。 （ｉ）第１の細胞検定系または組織検定系で、小胞体
（ＥＲ）の活性により媒介され、ＥＲおよびＥＲに誘導
されるレポーター遺伝子を含んだ前記細胞検定系または
組織検定系での効力の検出によって測定される転写活
性、を有するリガンドを選択し、前記リガンドは、１０
ｎｍｏｌ／ｌ以下のＥＣ50(ER)（最大有効リガンド濃度
半値）を有する前記第１の検定系で効力を活性化し、そ
れにより転写の活性化を検出する工程と、（ii）第２の
無細胞検定系または酵素検定系で、前記無細胞検定系ま
たは酵素検定系での相互作用の効力の検出により測定さ
れる、ＳＲＣ−１およびそのフラグメントと、前記ＥＲ
との物理化学相互作用（漸増）、を選択し、前記リガン
ドは、１００ｎｍｏｌ／ｌ以上のＥＣ50(ER+SRC)を有す
る前記第２の検定系で、前記ＥＲを活性化し、共に存在
している前記ＳＲＣ−１およびそのフラグメントとの相
互作用を誘導してＳＲＣ−１およびそのフラグメント
と、ＥＲとの前記物理化学相互作用を検出する工程。
【００１１】さらに、本発明の課題は、無細胞検定系ま
たは酵素検定系において、前記無細胞検定系または酵素
検定系での相互作用の効力の検出により測定されるＳＲ
Ｃ−１およびそのフラグメントと、ＥＲとの物理化学相
互作用（漸増（ｒｅｃｒｕｉｔｅｍｅｎｔ））を選択す
ることにより試験物質（リガンド）をｉｎ ｖｉｔｒｏ
スクリーニングする方法で、前記リガンドは、既知のエ
ストロゲンまたはエストロゲン活性を有するリガンドで
あり、前記リガンドは、１００ｎｍｏｌ／ｌ以上のＥＣ
50(ER+SRC)を有する前記第２の検定系で、前記ＥＲを活
性化し、共に存在しているＳＲＣ−１およびそのフラグ
メントとの相互作用を誘導して、ＳＲＣ−１およびその
フラグメントと、ＥＲとの前記物理化学相互作用を検出
する、第２の態様の試験物質（リガンド）のｉｎ ｖｉ
ｔｒｏスクリーニング方法により解決される。
たは酵素検定系において、前記無細胞検定系または酵素
検定系での相互作用の効力の検出により測定されるＳＲ
Ｃ−１およびそのフラグメントと、ＥＲとの物理化学相
互作用（漸増（ｒｅｃｒｕｉｔｅｍｅｎｔ））を選択す
ることにより試験物質（リガンド）をｉｎ ｖｉｔｒｏ
スクリーニングする方法で、前記リガンドは、既知のエ
ストロゲンまたはエストロゲン活性を有するリガンドで
あり、前記リガンドは、１００ｎｍｏｌ／ｌ以上のＥＣ
50(ER+SRC)を有する前記第２の検定系で、前記ＥＲを活
性化し、共に存在しているＳＲＣ−１およびそのフラグ
メントとの相互作用を誘導して、ＳＲＣ−１およびその
フラグメントと、ＥＲとの前記物理化学相互作用を検出
する、第２の態様の試験物質（リガンド）のｉｎ ｖｉ
ｔｒｏスクリーニング方法により解決される。
【００１２】
【発明の実施の形態】定義 ｉｎ ｖｉｖｏ
“ｉｎ ｖｉｖｏ技術”は、手術または物理療法によ
り、人体または動物の身体を治療する方法、および人体
または動物の身体に対して実施される診断方法を表す。
り、人体または動物の身体を治療する方法、および人体
または動物の身体に対して実施される診断方法を表す。
【００１３】ｉｎ ｖｉｔｒｏ
表現“ｉｎ ｖｉｔｒｏ”は、全てのｉｎ ｖｉｖｏ技
術および上記した方法を除く。本願において、表現“ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ”は、細胞培養、組織培養、器官の部
分、器官、器官系および動物の身体、特に人体、の部分
の切片、のような培養を表す。これらの試験片は、全て
動物または人間の生体から取り出される。試験片は、動
物（人間を含む）の生体に再び導入されない。好ましく
は、表現“ｉｎ ｖｉｔｒｏ”は、生体の外部での、細
胞、その部分、精製した成分またはホモジネートを用い
る人工の系により特徴付けられる化学的な、および／ま
たは商業的な実験を表す。
術および上記した方法を除く。本願において、表現“ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ”は、細胞培養、組織培養、器官の部
分、器官、器官系および動物の身体、特に人体、の部分
の切片、のような培養を表す。これらの試験片は、全て
動物または人間の生体から取り出される。試験片は、動
物（人間を含む）の生体に再び導入されない。好ましく
は、表現“ｉｎ ｖｉｔｒｏ”は、生体の外部での、細
胞、その部分、精製した成分またはホモジネートを用い
る人工の系により特徴付けられる化学的な、および／ま
たは商業的な実験を表す。
【００１４】リガンド
表現“リガンド”は、ＥＲとの結合時、ＳＲＣ−１を漸
増することなしに、ＥＲと結合することができ、および
／または中枢神経系組織において、選択的で、神経親和
性のエストロゲン様作用を有し、生殖系の組織に副作用
を与えない、あらゆる種類の天然発生または合成的に製
造される化学物質を含む。本表現において、前記リガン
ドは前記試験物質である。
増することなしに、ＥＲと結合することができ、および
／または中枢神経系組織において、選択的で、神経親和
性のエストロゲン様作用を有し、生殖系の組織に副作用
を与えない、あらゆる種類の天然発生または合成的に製
造される化学物質を含む。本表現において、前記リガン
ドは前記試験物質である。
【００１５】検出
エストロゲン感受性因子の遺伝子産物は、ＥＬＩＳＡ、
ＲＩＡまたは酵素検定系のような、ＥＲＥ産物の関数が
測定される様々な系で識別することができる。そのよう
な方法は、ハンドブック類に記載されている。
ＲＩＡまたは酵素検定系のような、ＥＲＥ産物の関数が
測定される様々な系で識別することができる。そのよう
な方法は、ハンドブック類に記載されている。
【００１６】細胞または組織の検定
本願において、この表現は、さらに細胞培養、組織培
養、器官の部分、器官、器官の系統および動物の身体、
特に人体、の部分の切片のような、培養を用いた検定を
意味する。
養、器官の部分、器官、器官の系統および動物の身体、
特に人体、の部分の切片のような、培養を用いた検定を
意味する。
【００１７】転写活性およびその検出
転写活性は、対応する遺伝子のプロモーター領域への外
的（薬剤）影響の結果によって生じる、定義されたタン
パク質の変化をエンコードするｍＲＮＡ量の範囲を表
す。
的（薬剤）影響の結果によって生じる、定義されたタン
パク質の変化をエンコードするｍＲＮＡ量の範囲を表
す。
【００１８】第２の検定系は、コアクチベーターの漸増
機構を基礎とし、転写には間接的にのみ基づいている。
この場合におけるコアクチベーターの漸増は、コアクチ
ベーターが、より低い範囲まで欠乏している場合にのみ
活性化される転写を刺激する。本発明において、発明の
核心は、無細胞検定系または酵素検定系に関する記載で
あり、そこではコアクチベーターの漸増が、転写そのも
のに関する結果を生じることなしに測定される。コアク
チベーターＳＲＣ−１の存在する検定系が、明らかに転
写における増加を導くという事実は、当業者に周知であ
る。
機構を基礎とし、転写には間接的にのみ基づいている。
この場合におけるコアクチベーターの漸増は、コアクチ
ベーターが、より低い範囲まで欠乏している場合にのみ
活性化される転写を刺激する。本発明において、発明の
核心は、無細胞検定系または酵素検定系に関する記載で
あり、そこではコアクチベーターの漸増が、転写そのも
のに関する結果を生じることなしに測定される。コアク
チベーターＳＲＣ−１の存在する検定系が、明らかに転
写における増加を導くという事実は、当業者に周知であ
る。
【００１９】そのようなＥＲで調節される転写の活性と
コアクチベーターとの相関は、例えば１９９９年４月１
５日に発行されたＣｕｍｍｉｎｇｓらの国際公開公報Ｗ
Ｏ９９／１８１２４号に記載されている。より古い方法
は、ＫＡＭＥＩらにより記載されている［Ｃｅｌｌ Ｖ
ｏｌ．８５， ｐａｇｅｓ ４０３−４１４］。そのよ
うな方法は、他の事項の中でも、融合タンパク質の構
築、32Ｐ標識タンパク質の調製、特殊発現ベクター、す
なわち酵母２種ハイブリッド検定用、転写活性検定用の
特殊発現ベクターの構築、多くのゲルの運動、抗体の増
加を伴う。これらの方法は、核受容体とコアクチベータ
ーとのリガンドに依存した結合において有利である。リ
ガンドが存在しない場合に、核受容体と核受容体アクチ
ベーターとの結合は起こらない。しかし、リガンドが存
在する場合、そのような結合が起こり、蛍光標識核受容
体と蛍光標識アクチベーターの間の共鳴蛍光エネルギー
移動（ＦＲＥＴ）によって検出することができる。さら
なるリガンドは、試薬に誘導される核受容体コアクチベ
ーターの相互作用を防止する、または様々な程度に（ま
たは様々な用量で）中断する能力に基づいて識別するこ
とができる。核受容体またはそのリガンド結合ドメイン
は、上記した核受容体のリガンドの検出方法で使用され
る蛍光試薬で標識される。
コアクチベーターとの相関は、例えば１９９９年４月１
５日に発行されたＣｕｍｍｉｎｇｓらの国際公開公報Ｗ
Ｏ９９／１８１２４号に記載されている。より古い方法
は、ＫＡＭＥＩらにより記載されている［Ｃｅｌｌ Ｖ
ｏｌ．８５， ｐａｇｅｓ ４０３−４１４］。そのよ
うな方法は、他の事項の中でも、融合タンパク質の構
築、32Ｐ標識タンパク質の調製、特殊発現ベクター、す
なわち酵母２種ハイブリッド検定用、転写活性検定用の
特殊発現ベクターの構築、多くのゲルの運動、抗体の増
加を伴う。これらの方法は、核受容体とコアクチベータ
ーとのリガンドに依存した結合において有利である。リ
ガンドが存在しない場合に、核受容体と核受容体アクチ
ベーターとの結合は起こらない。しかし、リガンドが存
在する場合、そのような結合が起こり、蛍光標識核受容
体と蛍光標識アクチベーターの間の共鳴蛍光エネルギー
移動（ＦＲＥＴ）によって検出することができる。さら
なるリガンドは、試薬に誘導される核受容体コアクチベ
ーターの相互作用を防止する、または様々な程度に（ま
たは様々な用量で）中断する能力に基づいて識別するこ
とができる。核受容体またはそのリガンド結合ドメイン
は、上記した核受容体のリガンドの検出方法で使用され
る蛍光試薬で標識される。
【００２０】効力
効力は、ＥＣ50（このリガンドに結合する受容体により
特異的に影響される標的パラメータの最大影響値の半値
に必要とされる用量）により決定されるリガンド濃度の
値である。効力は、主に個々のリガンドと、受容体との
間の結合親和性および、化学信号伝達を変化させる可能
性のある、受容体タンパク質におけるリガンドに誘導さ
れるコンホメーション変化に依存する。
特異的に影響される標的パラメータの最大影響値の半値
に必要とされる用量）により決定されるリガンド濃度の
値である。効力は、主に個々のリガンドと、受容体との
間の結合親和性および、化学信号伝達を変化させる可能
性のある、受容体タンパク質におけるリガンドに誘導さ
れるコンホメーション変化に依存する。
【００２１】ＥＲの調節
ＥＲの調節は、従来技術に広く記載されている。
【００２２】レポーター遺伝子
他の遺伝子または調節配列と、連鎖してまたは共役し
て、それら配列の活性を検出する遺伝子または遺伝子フ
ラグメントである。レポーター遺伝子は、容易に検出す
ることができる遺伝子産物を産生することが必要とされ
る。さらに、遺伝子産物は、これらの産物を発現する生
体に対して有毒であってはならない。レポーター遺伝子
については、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．
Ｖｏｌ．１５２，ｐａｇｅｓ ７０９−７１３（１９８
７）に記載されている。さらなる方法は、ＨＡＲＲＩＳ
らの国際公開公報ＷＯ００／３７６８１号（２０００年
６月２９日発行）、ＫＵＳＨＮＥＲらのＷＯ９９／１１
７６０号（１９９９年３月１１日発行）に記載されてお
り、これらは引用することにより本明細書の一部をな
す。
て、それら配列の活性を検出する遺伝子または遺伝子フ
ラグメントである。レポーター遺伝子は、容易に検出す
ることができる遺伝子産物を産生することが必要とされ
る。さらに、遺伝子産物は、これらの産物を発現する生
体に対して有毒であってはならない。レポーター遺伝子
については、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．
Ｖｏｌ．１５２，ｐａｇｅｓ ７０９−７１３（１９８
７）に記載されている。さらなる方法は、ＨＡＲＲＩＳ
らの国際公開公報ＷＯ００／３７６８１号（２０００年
６月２９日発行）、ＫＵＳＨＮＥＲらのＷＯ９９／１１
７６０号（１９９９年３月１１日発行）に記載されてお
り、これらは引用することにより本明細書の一部をな
す。
【００２３】転写
ＤＮＡを鋳型として用い、５’→３’方向のＲＮＡポリ
メラーゼを利用したＲＮＡ合成である。転写は、２本の
ＤＮＡ鎖のうちの１つのＤＮＡ配列を、１本鎖のＲＮＡ
配列に伝達する工程である。
メラーゼを利用したＲＮＡ合成である。転写は、２本の
ＤＮＡ鎖のうちの１つのＤＮＡ配列を、１本鎖のＲＮＡ
配列に伝達する工程である。
【００２４】転写の活性
この用語は、ＥＲで調節される、またはＥＲに依存する
レポーター遺伝子の活性における、リガンドが存在しな
い場合に観察される基礎転写速度を上回る増加をいう。
レポーター遺伝子の活性における、リガンドが存在しな
い場合に観察される基礎転写速度を上回る増加をいう。
【００２５】調節
分子はＥＲの転写速度に作用している。活性化は、全て
のより速い転写速度を含む。減少は、転写速度の低下を
表す。基礎転写速度は、リガンドが存在しない条件での
値であり、その条件は、様々な検定系で比較することが
できる（ＥＲを含む少なくとも１つの検定系と、ＥＲと
ＳＲＣ−１とを含む他の検定系）。
のより速い転写速度を含む。減少は、転写速度の低下を
表す。基礎転写速度は、リガンドが存在しない条件での
値であり、その条件は、様々な検定系で比較することが
できる（ＥＲを含む少なくとも１つの検定系と、ＥＲと
ＳＲＣ−１とを含む他の検定系）。
【００２６】無細胞系
無細胞系を得るために、細胞膜または細胞壁を破壊し、
細胞の内部（サイトゾル）から、細胞膜の断片および細
胞壁の断片を、部分的に、または完全に、例えば遠心分
離により除去する。そのような細胞区画を含んだ有機成
分は、無傷な細胞に特有の生化学相互作用の開始する能
力を維持することができる。
細胞の内部（サイトゾル）から、細胞膜の断片および細
胞壁の断片を、部分的に、または完全に、例えば遠心分
離により除去する。そのような細胞区画を含んだ有機成
分は、無傷な細胞に特有の生化学相互作用の開始する能
力を維持することができる。
【００２７】酵素検定
酵素検定では、特定の基質を触媒するため、特定の酵素
と、必要に応じて補助因子が使用される。基質および産
物の濃度の変化が測定される。酵素検定は、通常、特別
の酵素と基質のカスケードを含む。
と、必要に応じて補助因子が使用される。基質および産
物の濃度の変化が測定される。酵素検定は、通常、特別
の酵素と基質のカスケードを含む。
【００２８】コアクチベーターの漸増
ＳＲＣ−１の漸増とは、ＥＲおよびＳＲＣ−１間でのタ
ンパク質−タンパク質相互作用における、ＥＲを活性化
するリガンドが存在しない場合に測定される基礎相互作
用速度を上回る増加をいう。
ンパク質−タンパク質相互作用における、ＥＲを活性化
するリガンドが存在しない場合に測定される基礎相互作
用速度を上回る増加をいう。
【００２９】漸増
ＳＲＣ−１の漸増は、共に存在しているＥＲと、ＳＲＣ
−１との間でのタンパク質−タンパク質相互作用による
会合の度合の、ＥＲアゴニストの存在する場合と、存在
しない場合との比較に関する。数値で表すと、漸増は、
試験系で共に発現したＥＲとＳＲＣ−１の間のタンパク
質−タンパク質相互作用の有意な発生（ベースラインか
らの標準的なずれの２倍以上）に必要とされるＥＲアゴ
ニストのモル濃度により定義される。ベースラインは、
ＥＲアンタゴニストが添加されていない理想的な試験系
で測定される相互作用により定義される。
−１との間でのタンパク質−タンパク質相互作用による
会合の度合の、ＥＲアゴニストの存在する場合と、存在
しない場合との比較に関する。数値で表すと、漸増は、
試験系で共に発現したＥＲとＳＲＣ−１の間のタンパク
質−タンパク質相互作用の有意な発生（ベースラインか
らの標準的なずれの２倍以上）に必要とされるＥＲアゴ
ニストのモル濃度により定義される。ベースラインは、
ＥＲアンタゴニストが添加されていない理想的な試験系
で測定される相互作用により定義される。
【００３０】発現フラグメントは、ＮＩＤ（核不活性化
ドメイン（ｎｕｃｌｅａｒ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ
ｄｏｍａｉｎ））１，２または３のみを表しており、
それらについては定義されている［Ｘｉｕ Ｆｅｎ Ｄ
ｉｎｇ， Ｃａｒｏｌ Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｈａｎ
Ｍａ， Ｈｅｎｇ Ｈｏｎｇ， ＲｏｓａｌｉｅＭ．
Ｕｈｔ， Ｐｅｔｅｒ Ｊ．Ｋｕｓｈｎｅｒ ａｎｄ
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒ．Ｓｔａｌｌｃｕｐ（１９９８）
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ １２（２）： ３０２−３１３ Ｃｏｐｙｒｉｇｈ
ｔ １９９８ｂｙ Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏ
ｃｉｅｔｙ； Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｂ
ｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｃｏａｃｔｉｖａｔ
ｏｒｓ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １
（ＧＲＩＰ１） ａｎｄ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ １（ＳＲＣ−１）：
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｏｔｉｆｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔ
ｉｅｓ］。
ドメイン（ｎｕｃｌｅａｒ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ
ｄｏｍａｉｎ））１，２または３のみを表しており、
それらについては定義されている［Ｘｉｕ Ｆｅｎ Ｄ
ｉｎｇ， Ｃａｒｏｌ Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｈａｎ
Ｍａ， Ｈｅｎｇ Ｈｏｎｇ， ＲｏｓａｌｉｅＭ．
Ｕｈｔ， Ｐｅｔｅｒ Ｊ．Ｋｕｓｈｎｅｒ ａｎｄ
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒ．Ｓｔａｌｌｃｕｐ（１９９８）
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ １２（２）： ３０２−３１３ Ｃｏｐｙｒｉｇｈ
ｔ １９９８ｂｙ Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏ
ｃｉｅｔｙ； Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｂ
ｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｃｏａｃｔｉｖａｔ
ｏｒｓ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １
（ＧＲＩＰ１） ａｎｄ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ １（ＳＲＣ−１）：
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｏｔｉｆｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔ
ｉｅｓ］。
【００３１】第１の態様の試験物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ
スクリーニング方法において、検定系における（ｉ）お
よび（ii）の順序は、変更可能である。好ましく使用さ
れる検定系において、第１の検定系は、最小の正の選択
数または最小の作業に導く検定系である。リガンドのエ
ストロゲン活性が既知である全ての場合において、ＥＲ
およびコアクチベーターＳＲＣ−１の組み合わせを含ん
だ第２の検定系のみが実施される。
スクリーニング方法において、検定系における（ｉ）お
よび（ii）の順序は、変更可能である。好ましく使用さ
れる検定系において、第１の検定系は、最小の正の選択
数または最小の作業に導く検定系である。リガンドのエ
ストロゲン活性が既知である全ての場合において、ＥＲ
およびコアクチベーターＳＲＣ−１の組み合わせを含ん
だ第２の検定系のみが実施される。
【００３２】第１の態様の試験物質のスクリーニング方
法において、（ｉ）および（ii）と記載した検定系の連
続した使用は、好ましいリガンド、すなわち、検定系
（ｉ）で最大転写活性の半値を生じさせるのに必要な用
量と比べると、定義した濃度で検定系（ii）を測定した
際に、ＳＲＣ−１相互作用をほとんど誘導しない化合
物、の選択を与える。
法において、（ｉ）および（ii）と記載した検定系の連
続した使用は、好ましいリガンド、すなわち、検定系
（ｉ）で最大転写活性の半値を生じさせるのに必要な用
量と比べると、定義した濃度で検定系（ii）を測定した
際に、ＳＲＣ−１相互作用をほとんど誘導しない化合
物、の選択を与える。
【００３３】第２の態様の試験物質のスクリーニング方
法において、好ましくは、本発明による試験物質（リガ
ンド）のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法におい
て、前記リガンドは、エストロゲンであり、かつＥＲお
よびＥＲに誘導されるレポーター遺伝子よりなる細胞検
定系を転写により活性化し、前記リガンドは、１０ｎｍ
ｏｌ／ｌ以下のＥＣ50(ER)（最大有効リガンド濃度の半
値）で効力を活性化する。
法において、好ましくは、本発明による試験物質（リガ
ンド）のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法におい
て、前記リガンドは、エストロゲンであり、かつＥＲお
よびＥＲに誘導されるレポーター遺伝子よりなる細胞検
定系を転写により活性化し、前記リガンドは、１０ｎｍ
ｏｌ／ｌ以下のＥＣ50(ER)（最大有効リガンド濃度の半
値）で効力を活性化する。
【００３４】
【実施例】（実施例１）生後発育時のラットの脳でのＳ
ＲＣ−１の発現における領域的な相違の定量化雌雄のウ
ィスターラットを、タイムプレグナントダム（ｔｉｍｅ
−ｐｒｅｇｎａｎｔ ｄａｍ）から得た（Ｍａｘ Ｐｌ
ａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＰｓｙｃｈｉａｒ
ｙ， Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。出生後最初
の２４時間以内に、同腹子から６匹を選択した。選択さ
れた６匹のマウスは、管理された照明（明／暗：１２時
間／１２時間；午前７時から午後７時まで照明点灯）、
温度（２２〜２４℃）および湿度（６０％）条件下で飼
育され、標準的な研究所の食餌および生水を自由に利用
できるようにされていた。生後２２日目の離乳時に、ラ
ットは雌親から分離され、性別により５つの群に分類さ
れた。生後３５日目から４５日目までの期間、毎日膣ス
ミアを測定することで、膣口、および膣上皮における周
期的な変化を調べることにより、雌の春季発動期をモニ
タした。
ＲＣ−１の発現における領域的な相違の定量化雌雄のウ
ィスターラットを、タイムプレグナントダム（ｔｉｍｅ
−ｐｒｅｇｎａｎｔ ｄａｍ）から得た（Ｍａｘ Ｐｌ
ａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＰｓｙｃｈｉａｒ
ｙ， Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。出生後最初
の２４時間以内に、同腹子から６匹を選択した。選択さ
れた６匹のマウスは、管理された照明（明／暗：１２時
間／１２時間；午前７時から午後７時まで照明点灯）、
温度（２２〜２４℃）および湿度（６０％）条件下で飼
育され、標準的な研究所の食餌および生水を自由に利用
できるようにされていた。生後２２日目の離乳時に、ラ
ットは雌親から分離され、性別により５つの群に分類さ
れた。生後３５日目から４５日目までの期間、毎日膣ス
ミアを測定することで、膣口、および膣上皮における周
期的な変化を調べることにより、雌の春季発動期をモニ
タした。
【００３５】ラットは、生後以下の日数を経た時点で、
断頭により犠牲にされた。１日（生後２４時間以
内、）、７日、４０〜４５日（雌で定義した春季発動
期）、９０日（性的成熟） 春季発動期および性的成熟の雌は、発情間期に犠牲にさ
れた。脳を頭蓋から取り出し（新生ラットのものを除
く）、プレチルド（ｐｒｅｃｈｉｌｌｅｄ）イソペンタ
ン中でスナップ凍結（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）させ
た。組織は切断するまで−８０℃で保存した。実験手順
は、動物保護に関する地方の、および国の規則を遵守し
ていた。
断頭により犠牲にされた。１日（生後２４時間以
内、）、７日、４０〜４５日（雌で定義した春季発動
期）、９０日（性的成熟） 春季発動期および性的成熟の雌は、発情間期に犠牲にさ
れた。脳を頭蓋から取り出し（新生ラットのものを除
く）、プレチルド（ｐｒｅｃｈｉｌｌｅｄ）イソペンタ
ン中でスナップ凍結（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）させ
た。組織は切断するまで−８０℃で保存した。実験手順
は、動物保護に関する地方の、および国の規則を遵守し
ていた。
【００３６】ヒトＳＲＣ−１Ａ（Ｕ９０６６１）のｂｐ
１１２５−１７４３に相当するＡ６２２−ｂａｓｅｓ
ＥｃｏＲｌフラグメントを精製し、ベクターｐＢＳ
（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ ＧｍｂＨ； Ｃｏｌｏｇｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）
にクローンした。増幅、配列確認および適切な制限ヌク
レアーゼを用いた線形化（ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏ
ｎ）によって、ｃＲＮＡが、アンチセンスプローブ用の
ポリメラーゼＴ３およびセンスプローブ用ポリメラーゼ
Ｔ７を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成された。
放射性の標識物質は、35Ｓ−ＵＴＰおよび−ＣＴＰ（Ｎ
ＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ＧｍｂＨ； Ｃｏｌｏｇｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使
用した。標識したｃＲＮＡをフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコールにより抽出し、Ｎｕｃｔｒａｐ
カラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で精製した。使用した
プローブの比活性は、１０6 ｃｐｍ／μｌ超であった。
内側視索前核（ＭＰＮ）および視床腹内側核（ＶＭＮ）
を含んだ厚さ１５μｍの冠状凍結切片を、各々ブレグマ
レベル−０．５１ｍｍおよび−２．４５ｍｍの成体ラッ
トの脳から得た［Ｌ．Ｗ．Ｓｗａｎｓｏｎ， Ｂｒａｉ
ｎ ｍａｐｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆｔｈｅ ｒ
ａｔ ｂｒａｉｎ； Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ，１９９８］。春季発動期、幼形および新生の
ラットについて、連続した吻側尾側切片から関心のある
２つの領域を選択した。ＶＭＮ切片は、また、海馬体の
吻部と、扁桃核体を含んでいる。切片は、ゼラチンでコ
ートされたスライドガラス上に載せられた。標準化され
たプロトコルに従い、固定、易透化、35Ｓ標識プローブ
とのハイブリダイゼーションおよび厳密な洗浄を実施し
た［Ｈ．Ｊ．Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｏ
ｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＲＮＡ ｉｎ ｒａ
ｔ ｂｒａｉｎ： Ａ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏ．，
Ｖｏｌ．１０， ｐｐ．１４５−１５７， １９９
０］。各年齢グループからの対照切片をセンスプローブ
でハイブリダイズすることにより、非特異的なハイブリ
ダイゼーション信号がモニタされた。Ｈｙｐｅｒｆｉｌ
ｍ βｍａｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ； Ｂｒａｕｎｓｃｈ
ｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に１４日間に露出してオ
ートラジオグラフを作成した。
１１２５−１７４３に相当するＡ６２２−ｂａｓｅｓ
ＥｃｏＲｌフラグメントを精製し、ベクターｐＢＳ
（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ ＧｍｂＨ； Ｃｏｌｏｇｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）
にクローンした。増幅、配列確認および適切な制限ヌク
レアーゼを用いた線形化（ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏ
ｎ）によって、ｃＲＮＡが、アンチセンスプローブ用の
ポリメラーゼＴ３およびセンスプローブ用ポリメラーゼ
Ｔ７を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成された。
放射性の標識物質は、35Ｓ−ＵＴＰおよび−ＣＴＰ（Ｎ
ＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ＧｍｂＨ； Ｃｏｌｏｇｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使
用した。標識したｃＲＮＡをフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコールにより抽出し、Ｎｕｃｔｒａｐ
カラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で精製した。使用した
プローブの比活性は、１０6 ｃｐｍ／μｌ超であった。
内側視索前核（ＭＰＮ）および視床腹内側核（ＶＭＮ）
を含んだ厚さ１５μｍの冠状凍結切片を、各々ブレグマ
レベル−０．５１ｍｍおよび−２．４５ｍｍの成体ラッ
トの脳から得た［Ｌ．Ｗ．Ｓｗａｎｓｏｎ， Ｂｒａｉ
ｎ ｍａｐｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆｔｈｅ ｒ
ａｔ ｂｒａｉｎ； Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ，１９９８］。春季発動期、幼形および新生の
ラットについて、連続した吻側尾側切片から関心のある
２つの領域を選択した。ＶＭＮ切片は、また、海馬体の
吻部と、扁桃核体を含んでいる。切片は、ゼラチンでコ
ートされたスライドガラス上に載せられた。標準化され
たプロトコルに従い、固定、易透化、35Ｓ標識プローブ
とのハイブリダイゼーションおよび厳密な洗浄を実施し
た［Ｈ．Ｊ．Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｏ
ｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＲＮＡ ｉｎ ｒａ
ｔ ｂｒａｉｎ： Ａ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏ．，
Ｖｏｌ．１０， ｐｐ．１４５−１５７， １９９
０］。各年齢グループからの対照切片をセンスプローブ
でハイブリダイズすることにより、非特異的なハイブリ
ダイゼーション信号がモニタされた。Ｈｙｐｅｒｆｉｌ
ｍ βｍａｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ； Ｂｒａｕｎｓｃｈ
ｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に１４日間に露出してオ
ートラジオグラフを作成した。
【００３７】オートラジオグラフフィルムは、コンピュ
ータ利用デンシトメトリー（ＮＩＨＩｍａｇｅ ５．
１； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，
ＵＳＡ）で評価された。個々の個体からの２つの隣接す
る切片について、関心がある領域の吸光度測定（グレイ
レベル）を４回実施した（バックグラウンドを自動減
算）。全ての年齢グループについて、同一の大きさの四
角形（大脳皮質，ＭＰＮおよびＶＭＮ）またはストリッ
プ（海馬部分体ＣＡ１）で測定を行い、年齢に関連する
変化へのこれらの構造の大きさによる影響を防止した。
個々の平均吸光度は、共に露出させた14Ｃ標準物質（Ａ
ＲＣ； Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）の測定から得ら
れた三次の多項式を用いて、比放射能信号（μＣｉ／ｇ
（組織））を解析するのに使用された。グループ平均
は、一方向の分散分析（ＡＮＯＶＡ）により比較され
た。そこでは、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕ
ｌｓ ｔｅｓｔによる適切な、一組の比較が実施され
た。有意水準は、ｐ＜０．０５に予め設定された。
ータ利用デンシトメトリー（ＮＩＨＩｍａｇｅ ５．
１； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，
ＵＳＡ）で評価された。個々の個体からの２つの隣接す
る切片について、関心がある領域の吸光度測定（グレイ
レベル）を４回実施した（バックグラウンドを自動減
算）。全ての年齢グループについて、同一の大きさの四
角形（大脳皮質，ＭＰＮおよびＶＭＮ）またはストリッ
プ（海馬部分体ＣＡ１）で測定を行い、年齢に関連する
変化へのこれらの構造の大きさによる影響を防止した。
個々の平均吸光度は、共に露出させた14Ｃ標準物質（Ａ
ＲＣ； Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）の測定から得ら
れた三次の多項式を用いて、比放射能信号（μＣｉ／ｇ
（組織））を解析するのに使用された。グループ平均
は、一方向の分散分析（ＡＮＯＶＡ）により比較され
た。そこでは、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕ
ｌｓ ｔｅｓｔによる適切な、一組の比較が実施され
た。有意水準は、ｐ＜０．０５に予め設定された。
【００３８】調査した解剖レベルにおいて、歯状回およ
び海馬体のＣＡ部分体で、異なった、強い、固有のハイ
ブリゼーション信号が確認された。内側視索の腹内側弓
状核、帯状をした頭蓋側頭皮質および扁桃核は全て適度
の信号強度を示していた。標識センスプローブを用いた
インキュベーションは、いずれかの構造または年齢グル
ープで固有のハイブリダイゼーション信号を与えること
ができなかった。
び海馬体のＣＡ部分体で、異なった、強い、固有のハイ
ブリゼーション信号が確認された。内側視索の腹内側弓
状核、帯状をした頭蓋側頭皮質および扁桃核は全て適度
の信号強度を示していた。標識センスプローブを用いた
インキュベーションは、いずれかの構造または年齢グル
ープで固有のハイブリダイゼーション信号を与えること
ができなかった。
【００３９】調査した全構造中、新生ラットの大脳皮質
が、最も高いＳＲＣ−１ａコード化転写強度を示してい
た。出生後１週間以内に、信号強度に有意な低下が測定
された。低下の傾向は、年齢の増加と共に継続し、成体
でのレベルは、出生時に測定したレベルの約３０％であ
った。調査したいずれの年齢においても、脳皮質におけ
るＳＲＣ−１ａの発現は、性別による相違を示すことが
できなかった（表１参照）。
が、最も高いＳＲＣ−１ａコード化転写強度を示してい
た。出生後１週間以内に、信号強度に有意な低下が測定
された。低下の傾向は、年齢の増加と共に継続し、成体
でのレベルは、出生時に測定したレベルの約３０％であ
った。調査したいずれの年齢においても、脳皮質におけ
るＳＲＣ−１ａの発現は、性別による相違を示すことが
できなかった（表１参照）。
【００４０】
【００４１】これらの結果は、認知活動にとってきわめ
て重要な大脳皮質における、ＥＲに媒介される信号の、
共に存在するＳＲＣ−１による増幅が、年齢の増加と共
に突然減少し、おそらく機能的な重要性を喪失すること
を示唆している。さらに、これらのデータは、初期の脳
の発育（神経発育、ニューロンの成長およびシナプスの
接続性を含む）が一度達成されると、ＳＲＣ−１の、活
性化されたＥＲによる漸増は、大脳皮質におけるエスト
ロゲン作用においてほとんど役割を果たさないことを示
唆している。この脳領域の機能的特異性（認知処理）に
関して、ＳＲＣ−１の漸増は、この脳機能へのエストロ
ゲン作用の発現に対する有意な重要性を持たないと考え
られる。
て重要な大脳皮質における、ＥＲに媒介される信号の、
共に存在するＳＲＣ−１による増幅が、年齢の増加と共
に突然減少し、おそらく機能的な重要性を喪失すること
を示唆している。さらに、これらのデータは、初期の脳
の発育（神経発育、ニューロンの成長およびシナプスの
接続性を含む）が一度達成されると、ＳＲＣ−１の、活
性化されたＥＲによる漸増は、大脳皮質におけるエスト
ロゲン作用においてほとんど役割を果たさないことを示
唆している。この脳領域の機能的特異性（認知処理）に
関して、ＳＲＣ−１の漸増は、この脳機能へのエストロ
ゲン作用の発現に対する有意な重要性を持たないと考え
られる。
【００４２】ＳＲＣ−１発現についての、反対方向の発
育面での原動力が、ＥＲを十分に供給されており、エス
トロゲンによる生殖機能および性的機能の調節において
重要性が高い視床腹内側核で確認された。出生時、ＶＭ
ＮにおけるＳＲＣ−１ａハイブリダイゼーション信号
は、雌雄いずれにおいても適度の強度である。生後第１
週以内に、転写強度における有意な増加が記録されてい
る。この構造体における最大信号強度は、雌雄いずれに
おいても春季発動期頃に測定された（表２参照）。
育面での原動力が、ＥＲを十分に供給されており、エス
トロゲンによる生殖機能および性的機能の調節において
重要性が高い視床腹内側核で確認された。出生時、ＶＭ
ＮにおけるＳＲＣ−１ａハイブリダイゼーション信号
は、雌雄いずれにおいても適度の強度である。生後第１
週以内に、転写強度における有意な増加が記録されてい
る。この構造体における最大信号強度は、雌雄いずれに
おいても春季発動期頃に測定された（表２参照）。
【００４３】
【００４４】これらの結果は、ＳＲＣ−１の存在と、お
そらくその漸増が、ＥＲを介した、生殖関連の内分泌物
の活性および挙動を調節する脳の領域における化学信号
の伝達に必要な予備条件を表している。この結論は、Ｖ
ＭＮでのＳＲＣ−１の発現が、生命段階のうち、生殖系
に劇的な変化が起こる段階、例えば春季発動期（表２の
４０日のデータ参照）および発情周期中（表３）、に突
然増加するという事実により確認される。
そらくその漸増が、ＥＲを介した、生殖関連の内分泌物
の活性および挙動を調節する脳の領域における化学信号
の伝達に必要な予備条件を表している。この結論は、Ｖ
ＭＮでのＳＲＣ−１の発現が、生命段階のうち、生殖系
に劇的な変化が起こる段階、例えば春季発動期（表２の
４０日のデータ参照）および発情周期中（表３）、に突
然増加するという事実により確認される。
【００４５】
【００４６】（実施例２）活性化されたＥＲによるＳＲ
Ｃ−１漸増を定量評価するための検定およびこの検定に
おけるＥＲリガンドの行動分化本実施例で実施した検定
では、エストロゲン活性により特徴付けられる化合物の
みを使用した。エストロゲン活性を有する化合物を見い
出すための検定法は開発され、開示されている。これら
の検定は、当業者に周知の標準的な検定である。
Ｃ−１漸増を定量評価するための検定およびこの検定に
おけるＥＲリガンドの行動分化本実施例で実施した検定
では、エストロゲン活性により特徴付けられる化合物の
みを使用した。エストロゲン活性を有する化合物を見い
出すための検定法は開発され、開示されている。これら
の検定は、当業者に周知の標準的な検定である。
【００４７】本実施例では、ＥＲおよびコアクチベータ
−ＳＲＣ−１の漸増を調査するための検定を、Ｇａｕｃ
ｈａｏ ＺＨＯＨらの刊行物［Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｆｆｉ
ｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ：
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ
ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏ， Ｖｏｌ．１
２， ｐｐ．１５９４−１６０４（特に１６０２頁）
（１９９８）］に従って実施した。さらに、検定系は、
Ｃｕｍｍｉｎｇｓらの国際公開公報ＷＯ／１８１２４に
示されている。本検定では、同公報に示されたユーロピ
ウムクリプテートの代わりに、ユーロピウムキレート、
１ウェル当たりユーロピウム標識抗ＧＳＴ抗体１００ｎ
ｇ、を使用した。標識された抗体は、Ｗａｌｌａｃ社
（現Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ社）製である（Ｌａｎｃｅ Ａｓｓａｙ用のＥｕ−
Ｗ１０２４標識抗ＧＳＴ抗体、パーツ番号 ＡＤ００６
５）。
−ＳＲＣ−１の漸増を調査するための検定を、Ｇａｕｃ
ｈａｏ ＺＨＯＨらの刊行物［Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｆｆｉ
ｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ：
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ
ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏ， Ｖｏｌ．１
２， ｐｐ．１５９４−１６０４（特に１６０２頁）
（１９９８）］に従って実施した。さらに、検定系は、
Ｃｕｍｍｉｎｇｓらの国際公開公報ＷＯ／１８１２４に
示されている。本検定では、同公報に示されたユーロピ
ウムクリプテートの代わりに、ユーロピウムキレート、
１ウェル当たりユーロピウム標識抗ＧＳＴ抗体１００ｎ
ｇ、を使用した。標識された抗体は、Ｗａｌｌａｃ社
（現Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ社）製である（Ｌａｎｃｅ Ａｓｓａｙ用のＥｕ−
Ｗ１０２４標識抗ＧＳＴ抗体、パーツ番号 ＡＤ００６
５）。
【００４８】ＳＲＣ−１は、１ウェル当たり標識された
ＳＲＣ−１が１７５ｎｇとなる濃度で使用した。ＳＲＣ
−１はこの検定系の全てのウェルで存在していた。
ＳＲＣ−１が１７５ｎｇとなる濃度で使用した。ＳＲＣ
−１はこの検定系の全てのウェルで存在していた。
【００４９】この検定系を用いて、以下の結果が得られ
た。天然エストロゲン１７βエストラジオール［ｉ］を
含んだ対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、１０-9Ｍで、ＥＲと
ＳＲＣ−１との間の有意な相互作用を示した。合成エス
トロゲン（ｅｎｔ−１，３，５（１０）−エストラトリ
エン−３，１７βジオール）［ii］，（３’，１５β−
ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］−エストラ−１，
３，５（１０），８−テトラエン−３，１７αジオー
ル）［iii ］，（１５βアリル−エストラ−１，３，
５，（１０）−トリエン−３，１７βジオール）［iv］
および（１５β−プロピル−エストラ−１，３，５，
（１０）−トリエン−３，１７βジオール）［ｖ］につ
いて、上記した系で比較試験を実施した。比較の結果を
以下の表４に示した。
た。天然エストロゲン１７βエストラジオール［ｉ］を
含んだ対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、１０-9Ｍで、ＥＲと
ＳＲＣ−１との間の有意な相互作用を示した。合成エス
トロゲン（ｅｎｔ−１，３，５（１０）−エストラトリ
エン−３，１７βジオール）［ii］，（３’，１５β−
ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］−エストラ−１，
３，５（１０），８−テトラエン−３，１７αジオー
ル）［iii ］，（１５βアリル−エストラ−１，３，
５，（１０）−トリエン−３，１７βジオール）［iv］
および（１５β−プロピル−エストラ−１，３，５，
（１０）−トリエン−３，１７βジオール）［ｖ］につ
いて、上記した系で比較試験を実施した。比較の結果を
以下の表４に示した。
【００５０】結果は、ＥＲに媒介される転写調節に関し
て、同様のアゴニスト活性を示す合成化合物が、ＥＲと
の結合時に、共に存在しているＳＲＣ−１を漸増する能
力において有意な相違を示すことを証明していた。２つ
の検定系で得られた数値間での計算された比は、転写の
調節において、異なるＳＲＣ−１との結合能を有するＥ
Ｒリガンドの識別を与える。選択的なニューロン特性を
有するＥＲアゴニストは、検定系Ｉ（ＥＲ）および検定
系II（ＥＲおよびコアクチベーターＳＲＣ−１の漸増）
で測定された数値間の比がより高い値を示している。
て、同様のアゴニスト活性を示す合成化合物が、ＥＲと
の結合時に、共に存在しているＳＲＣ−１を漸増する能
力において有意な相違を示すことを証明していた。２つ
の検定系で得られた数値間での計算された比は、転写の
調節において、異なるＳＲＣ−１との結合能を有するＥ
Ｒリガンドの識別を与える。選択的なニューロン特性を
有するＥＲアゴニストは、検定系Ｉ（ＥＲ）および検定
系II（ＥＲおよびコアクチベーターＳＲＣ−１の漸増）
で測定された数値間の比がより高い値を示している。
【００５１】
【表１】
【００５２】（実施例３）
ＥＲ結合時、ＳＲＣ−１漸増が発生しないことにより識
別される、ＥＲリガンドによる選択的なニューロン活性
の証明 実施例２に示した検定法を用いて、化合物３’１５β−
ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］エストラ−１，
３，５（１０），８−テトラエン−３，１７αジオール
を選択して、神経的作用および全身作用をさらに調査し
た。化合物は、天然ＥＲリガンド１７β−エストラジオ
ール［ｉ］に対して、２５〜３０％の相対親和性でＥＲ
αおよびＥＲβと結合することが示された。さらに、化
合物は、１０-9ＭのＥＣ50で、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＥＲ
誘導レポーター遺伝子の転写において測定可能な活性を
示していた（１７β−エストラジオールは、１０-10 Ｍ
のＥＣ50で示す）。
別される、ＥＲリガンドによる選択的なニューロン活性
の証明 実施例２に示した検定法を用いて、化合物３’１５β−
ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］エストラ−１，
３，５（１０），８−テトラエン−３，１７αジオール
を選択して、神経的作用および全身作用をさらに調査し
た。化合物は、天然ＥＲリガンド１７β−エストラジオ
ール［ｉ］に対して、２５〜３０％の相対親和性でＥＲ
αおよびＥＲβと結合することが示された。さらに、化
合物は、１０-9ＭのＥＣ50で、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＥＲ
誘導レポーター遺伝子の転写において測定可能な活性を
示していた（１７β−エストラジオールは、１０-10 Ｍ
のＥＣ50で示す）。
【００５３】関心のある化合物と対照標準の１７β−エ
ストラジオールを、卵巣切除された雌のラットに、異な
る当量で、連続７日間皮下投与した。実験動物の認知行
動における化合物の投与の効果は、積極的な回避行動の
習得、強化および回復をモニタすることで評価した。実
験動物を犠牲にした際、エストロゲン感受性の器官（子
宮、胸腺、分泌器官）の体形測定評価を実施した。神経
化学作用は、異なる量のＳＲＣ−１が供給された、異な
る脳領域のＥＲに誘導されるＣＮＳ固有の遺伝子の転写
を定量することで評価した。
ストラジオールを、卵巣切除された雌のラットに、異な
る当量で、連続７日間皮下投与した。実験動物の認知行
動における化合物の投与の効果は、積極的な回避行動の
習得、強化および回復をモニタすることで評価した。実
験動物を犠牲にした際、エストロゲン感受性の器官（子
宮、胸腺、分泌器官）の体形測定評価を実施した。神経
化学作用は、異なる量のＳＲＣ−１が供給された、異な
る脳領域のＥＲに誘導されるＣＮＳ固有の遺伝子の転写
を定量することで評価した。
【００５４】要約すると、以下の結果が示された。
３’，１５β−ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］エ
ストラ−１，３，５（１０），８−テトラエン−３，１
７α−ジオール［iii ］が、末梢エストロゲン標的器官
（子宮、胸腺、副腎）でエストロゲン様作用を誘導する
能力は、ＥＲ結合時にＳＲＣ−１を強く漸増させる、天
然エストロゲン１７β−エストラジオールのそれよりも
数倍低い。
３’，１５β−ジヒドロシクロプロプ［１４，１５］エ
ストラ−１，３，５（１０），８−テトラエン−３，１
７α−ジオール［iii ］が、末梢エストロゲン標的器官
（子宮、胸腺、副腎）でエストロゲン様作用を誘導する
能力は、ＥＲ結合時にＳＲＣ−１を強く漸増させる、天
然エストロゲン１７β−エストラジオールのそれよりも
数倍低い。
【００５５】化合物３’１５β−ジヒドロシクロプロプ
［１４，１５］エストラ−１，３，５（１０），８−テ
トラエン−３，１７α−ジオール［iii ］は、大脳皮質
（ＳＲＣ−１の発現が少ない脳領域）で抗アポトーシス
のエストロゲンで調節される遺伝子ｂｃｌ−２を刺激す
る度合が、１７β−エストラジオールを同一用量与えた
場合に比べてより高い。
［１４，１５］エストラ−１，３，５（１０），８−テ
トラエン−３，１７α−ジオール［iii ］は、大脳皮質
（ＳＲＣ−１の発現が少ない脳領域）で抗アポトーシス
のエストロゲンで調節される遺伝子ｂｃｌ−２を刺激す
る度合が、１７β−エストラジオールを同一用量与えた
場合に比べてより高い。
【００５６】化合物３’１５β−ジヒドロシクロプロプ
［１４，１５］エストラ−１，３，５（１０），８−テ
トラエン−３，１７α−ジオール［iii ］は、ＳＲＣ−
１リッチでのオキシトシン受容体、および生殖関連の腹
内側核の、エストロゲンに依存した発現を誘導する度合
が、１７β−エストラジオールよりも有意に低い。
［１４，１５］エストラ−１，３，５（１０），８−テ
トラエン−３，１７α−ジオール［iii ］は、ＳＲＣ−
１リッチでのオキシトシン受容体、および生殖関連の腹
内側核の、エストロゲンに依存した発現を誘導する度合
が、１７β−エストラジオールよりも有意に低い。
【００５７】新たに習得した積極的な回避行動の保有に
より測定されるように、化合物３’１５β−ジヒドロシ
クロプロプ［１４，１５］エストラ−１，３，５（１
０），８−テトラエン−３，１７α−ジオール［iii ］
の行動面（認知面）への影響は、１７β−エストラジオ
ールのそれと区別できない。しかし、この行動面への影
響は、末梢のエストロゲン感受性器官におけるエストロ
ゲンに依存した変化に関連していない。
より測定されるように、化合物３’１５β−ジヒドロシ
クロプロプ［１４，１５］エストラ−１，３，５（１
０），８−テトラエン−３，１７α−ジオール［iii ］
の行動面（認知面）への影響は、１７β−エストラジオ
ールのそれと区別できない。しかし、この行動面への影
響は、末梢のエストロゲン感受性器官におけるエストロ
ゲンに依存した変化に関連していない。
【００５８】上記要約した結果は、ＥＲに対して測定可
能な親和性を示し、エストロゲン依存の遺伝子の転写調
節に関して、ＥＲのアゴニストとして作用し、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏのＥＲとの結合時に、ＳＲＣ−１の漸増を発生
させない化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏの選択的な神経親和
エストロゲンとして作用し、その一方で末梢のエストロ
ゲン標的器官にはほとんど影響を与えないことを示唆し
ている。
能な親和性を示し、エストロゲン依存の遺伝子の転写調
節に関して、ＥＲのアゴニストとして作用し、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏのＥＲとの結合時に、ＳＲＣ−１の漸増を発生
させない化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏの選択的な神経親和
エストロゲンとして作用し、その一方で末梢のエストロ
ゲン標的器官にはほとんど影響を与えないことを示唆し
ている。
【００５９】本発明に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏスクリー
ニング方法は、強いＳＲＣ−１の漸増を同時に引き起こ
すことなく、ＥＲを介した、強い転写活性を発現する能
力に基づく、固有の神経親和活性を有する天然または合
成化合物を選択することができる。本発明に基づくスク
リーニング方法は、動物実験を排除している。
ニング方法は、強いＳＲＣ−１の漸増を同時に引き起こ
すことなく、ＥＲを介した、強い転写活性を発現する能
力に基づく、固有の神経親和活性を有する天然または合
成化合物を選択することができる。本発明に基づくスク
リーニング方法は、動物実験を排除している。
【００６０】そのようなリガンドの識別するための従来
のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術では、リガンドの全身的作用
（例えばｕｔｅｒｏｔｒｏｐｉｃ）と神経的作用の間で
の分離を予測できない代用パラメータ（ニューロンプロ
セスの伸張、神経毒の影響時の生存のような）を使用し
ている。エストロゲン関連のリガンドの選択的な神経作
用に関する定義された基準は、従来技術では見つけられ
ていない。リガンドの選択は、動物の使用を欠くことが
できない全身的作用および神経的作用間での比較に依存
している。
のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術では、リガンドの全身的作用
（例えばｕｔｅｒｏｔｒｏｐｉｃ）と神経的作用の間で
の分離を予測できない代用パラメータ（ニューロンプロ
セスの伸張、神経毒の影響時の生存のような）を使用し
ている。エストロゲン関連のリガンドの選択的な神経作
用に関する定義された基準は、従来技術では見つけられ
ていない。リガンドの選択は、動物の使用を欠くことが
できない全身的作用および神経的作用間での比較に依存
している。
【００６１】本発明の明確な長所は、投与された動物ま
たは人間が雌性化されないリガンドを見つけるのに、動
物実験をもはや必要としないことである。
たは人間が雌性化されないリガンドを見つけるのに、動
物実験をもはや必要としないことである。
【００６２】従来技術においては、動物を用いた少なく
とも１つの系が必要であった。本発明の進歩性は、従来
技術と、脳の部位の相違、および発育年齢の相違のいず
れにおいても、驚くほど異なったＳＲＣ−１の発現を示
す本発明での検定結果との比較によって支持される。
とも１つの系が必要であった。本発明の進歩性は、従来
技術と、脳の部位の相違、および発育年齢の相違のいず
れにおいても、驚くほど異なったＳＲＣ−１の発現を示
す本発明での検定結果との比較によって支持される。
【００６３】皮質において、以下の点が明らかになって
いる。年齢の高い動物ほど、この脳の領域におけるＳＲ
Ｃ−１の存在量は少ない。したがって、エストロゲン受
容体に媒介される神経保護および修復が、この脳の領域
におけるＳＲＣ−１の漸増およびＥＲ信号の増幅を伴う
可能性はほとんどない。
いる。年齢の高い動物ほど、この脳の領域におけるＳＲ
Ｃ−１の存在量は少ない。したがって、エストロゲン受
容体に媒介される神経保護および修復が、この脳の領域
におけるＳＲＣ−１の漸増およびＥＲ信号の増幅を伴う
可能性はほとんどない。
【００６４】腹内側核においては、以下の点が明らかに
なっている。性的成熟の臨界段階および成体におけるＳ
ＲＣ−１の存在量の増加は、このコアクチベーターが性
的機能の調節に関連しているこの脳の領域でのＥＲシグ
ナルを補助していることを示唆している。この寿命を通
して異なった発現は、従来技術では言及されていない。
なっている。性的成熟の臨界段階および成体におけるＳ
ＲＣ−１の存在量の増加は、このコアクチベーターが性
的機能の調節に関連しているこの脳の領域でのＥＲシグ
ナルを補助していることを示唆している。この寿命を通
して異なった発現は、従来技術では言及されていない。
【００６５】ホモ接合のＳＲＣ−１ヌル突然変異体で
は、脳機能に明白な変化はない［ＸＵｅｔ ａｌ．（１
９９８） Ｐａｒｔｉａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｉ
ｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｄｉｓｒｕ
ｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１（ＳＲＣ−１）ｇ
ｅｎｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．２７９， １９
２２−１９２５］。これらの結果は、ＳＲＣ−１が、Ｃ
ＮＳでのＥＲに媒介される化学信号の調節にいかなる役
割も果たしていないことを示唆している。
は、脳機能に明白な変化はない［ＸＵｅｔ ａｌ．（１
９９８） Ｐａｒｔｉａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｉ
ｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｄｉｓｒｕ
ｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１（ＳＲＣ−１）ｇ
ｅｎｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．２７９， １９
２２−１９２５］。これらの結果は、ＳＲＣ−１が、Ｃ
ＮＳでのＥＲに媒介される化学信号の調節にいかなる役
割も果たしていないことを示唆している。
【００６６】異なる脳領域の細胞におけるＳＲＣ−１の
分布は示されている［Ｃ．ＭＥＩＪＥＲ， Ｐ．Ｊ．Ｓ
ＴＥＥＮＢＥＲＧＥＮ ａｎｄ Ｅ．Ｒ．ＤＥ ＫＬＯ
ＥＴ（２０００）， Ｖｏｌ．１４１， ｐｐ．２１９
２−２１９９］。これらの実験には同一年齢のラットの
みが使用された。上記した文献の筆者は、脳におけるＳ
ＲＣ−１発現の機能について示していない。試験結果
は、脳におけるＳＲＣ−１の発現の有無のみを示してい
る。発現速度は、定量的に測定されていない。この記載
から、ＳＲＣ−１は、神経系のエストロゲン受容体によ
る何らかの信号伝達を、領域特有の関係で媒体する可能
性があると導くことはできない。ＭＥＩＪＥＲらの刊行
物は、単に事実に基づくものであり、異なる脳領域での
ＳＲＣ−１の発現の定量化を含んでおらず、またＥＲに
媒介される信号との関係について結論を述べていない。
分布は示されている［Ｃ．ＭＥＩＪＥＲ， Ｐ．Ｊ．Ｓ
ＴＥＥＮＢＥＲＧＥＮ ａｎｄ Ｅ．Ｒ．ＤＥ ＫＬＯ
ＥＴ（２０００）， Ｖｏｌ．１４１， ｐｐ．２１９
２−２１９９］。これらの実験には同一年齢のラットの
みが使用された。上記した文献の筆者は、脳におけるＳ
ＲＣ−１発現の機能について示していない。試験結果
は、脳におけるＳＲＣ−１の発現の有無のみを示してい
る。発現速度は、定量的に測定されていない。この記載
から、ＳＲＣ−１は、神経系のエストロゲン受容体によ
る何らかの信号伝達を、領域特有の関係で媒体する可能
性があると導くことはできない。ＭＥＩＪＥＲらの刊行
物は、単に事実に基づくものであり、異なる脳領域での
ＳＲＣ−１の発現の定量化を含んでおらず、またＥＲに
媒介される信号との関係について結論を述べていない。
【００６７】
【発明の効果】本発明のスクリーニング方法は、脳皮質
における神経変性の治療および予防に使用可能なリガン
ドを見つけるための高精度の技術的ツールを与える。本
スクリーニング方法は、したがって年齢に関連する認知
障害、情動障害、アルツハイマー病および脳虚血／脳卒
中の治療および予防のための有用な方法である。
における神経変性の治療および予防に使用可能なリガン
ドを見つけるための高精度の技術的ツールを与える。本
スクリーニング方法は、したがって年齢に関連する認知
障害、情動障害、アルツハイマー病および脳虚血／脳卒
中の治療および予防のための有用な方法である。
【００６８】本発明のスクリーニング方法で得られたリ
ガンドは、神経系の通常細胞機能の維持、およびこれら
の機能の病的低下の予防および治療に使用することがで
きる。
ガンドは、神経系の通常細胞機能の維持、およびこれら
の機能の病的低下の予防および治療に使用することがで
きる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ
33/566 33/566
// Ａ６１Ｋ 31/565 Ａ６１Ｋ 31/565
(72)発明者 ミーテフ ユーリ
ドイツ国 イエナ Ｄ−07745 シュライ
デンシュトラーセ ９
(72)発明者 ヴォルフ ジークムント
ドイツ国 イエナ Ｄ−07745 グレーテ
ーウンラインシュトラーセ 15
(72)発明者 ランガー ゲーアノート
ドイツ国 ベルリン Ｄ−10551 ヴィル
ヘルムスハーヴェナー シュトラーセ 63
Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 BA11 BB50 DA13
DA36 FB02
4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ13 QQ20
QQ21 QQ53 QQ79 QR32 QR56
QR77 QR80 QS34 QS38
4C086 AA02 DA09 NA05 ZC11 ZC41
Claims (3)
- 【請求項１】以下の工程よりなる、少なくとも２つの検
定系を用いた選択および検出を含んだ、試験物質（リガ
ンド）のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法。 （ｉ）第１の細胞検定系または組織検定系で、小胞体
（ＥＲ）の活性により媒介され、ＥＲおよびＥＲに誘導
されるレポーター遺伝子を含んだ前記細胞検定系または
組織検定系での効力の検出によって測定される転写活
性、を有するリガンドを選択し、 前記リガンドは、１０ｎｍｏｌ／ｌ以下のＥＣ
50(ER)（最大有効リガンド濃度の半値）を有する前記第
１の検定系で効力を活性化することにより転写の活性化
を検出する工程と、（ii）第２の無細胞検定系または酵
素検定系で、前記無細胞検定系または酵素検定系での相
互作用の効力の検出により測定されるＳＲＣ−１および
そのフラグメントと、前記ＥＲとの物理化学相互作用
（漸増）、を選択し、 前記リガンドは、１００ｎｍｏｌ／ｌ以上のＥＣ
50(ER+SRC)を有する前記第２の検定系で、前記ＥＲを活
性化して、共に存在している前記ＳＲＣ−１およびフラ
グメントとの相互作用を誘導して、ＳＲＣ−１およびそ
のフラグメントと、ＥＲの前記物理化学相互作用を検出
する工程。 - 【請求項２】無細胞検定系または酵素検定系において、
前記無細胞検定系または酵素検定系での相互作用の効力
の検出により測定される、ＳＲＣ−１およびそのフラグ
メントと、ＥＲとの物理化学相互作用（漸増）を選択す
ることにより、試験物質（リガンド）をｉｎ ｖｉｔｒ
ｏスクリーニングする方法で、 前記リガンドは、既知のエストロゲンまたはエストロゲ
ン活性を有するリガンドであり、 前記リガンドは、１００ｎｍｏｌ／ｌ以上のＥＣ
50(ER+SRC)を有する前記第２の検定系で、前記ＥＲを活
性化し、共に存在しているＳＲＣ−１およびそのフラグ
メントとの相互作用を誘導して、ＳＲＣ−１およびその
フラグメントと、ＥＲとの前記物理化学相互作用を検出
する、試験物質（リガンド）のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリ
ーニング方法。 - 【請求項３】前記リガンドは、エストロゲンであり、か
つＥＲおよびＥＲに誘導されるレポーター遺伝子を含ん
だ細胞検定系を転写により活性化し、 前記リガンドは、１０ｎｍｏｌ／ｌ以下のＥＣ
50(ER)（最大有効リガンド濃度半値）で効力を活性化す
る、請求項２に記載の試験物質（リガンド）のｉｎ ｖ
ｉｔｒｏスクリーニング方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01126336.5 | 2001-11-07 | ||
| EP01126336A EP1310799B1 (en) | 2001-11-07 | 2001-11-07 | In vitro screening for ligands of the estrogen receptor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003144192A true JP2003144192A (ja) | 2003-05-20 |
| JP3754647B2 JP3754647B2 (ja) | 2006-03-15 |
Family
ID=8179169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001374287A Expired - Fee Related JP3754647B2 (ja) | 2001-11-07 | 2001-12-07 | エストロゲン受容体リガンドのｉｎｖｉｔｒｏスクリーニング |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7166438B2 (ja) |
| EP (1) | EP1310799B1 (ja) |
| JP (1) | JP3754647B2 (ja) |
| AT (1) | ATE313803T1 (ja) |
| DE (1) | DE60116109T2 (ja) |
| ES (1) | ES2253318T3 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7658912B2 (en) * | 2003-06-20 | 2010-02-09 | University Of Massachusetts | Spatial evolution of neural activity |
| BRPI0519111A2 (pt) * | 2004-12-17 | 2008-12-23 | Wyeth Corp | mÉtodos para tratar o mal de parkinson, para melhorar um sintoma do mal de parkinson e para melhorar um sintoma de uma doenÇa ou distérbio cognitivos, e, uso de um ligando seletivo de erbeta |
| CA2653513C (en) | 2006-05-25 | 2015-03-31 | Elminda Ltd. | Neuropsychological spatiotemporal pattern recognition |
| WO2009069135A2 (en) * | 2007-11-29 | 2009-06-04 | Elminda Ltd. | System and method for neural modeling of neurophysiological data |
Family Cites Families (6)
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