DE69933016T2

DE69933016T2 - Steroidale saponine zur behandlung der alzheimerischen krankheit

Info

Publication number: DE69933016T2
Application number: DE69933016T
Authority: DE
Inventors: Zongqin Xia; Yaer Hu; Ian Castle Donington RUBIN; Jonathan Brostoff; Brian Hornsea WHITTLE; Weijun Huntingdon WANG; Phil Saffron Walden GUNNING
Original assignee: Phytopharm Ltd
Current assignee: Phytopharm Ltd
Priority date: 1998-03-26
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2019-03-27
Also published as: EP1719512A3; ES2257042T3; MXPA00009437A; KR100632052B1; HRP20000638A2; IL138663A0; ATE314057T1; DK1719512T3; JP2004217666A; BR9909109A; EP1719512B1; DK1066042T3; PT1066042E; US6812213B2; NZ507355A; PL195897B1; AU3158199A; DE69933016D1; NO20004804L; NO20083993L

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf membrangebundene Rezeptoren und ihre Funktion, auf kognitive Disfunktion und verwandte Zustände; auf Behandlungen dafür; und auf Zusammensetzungen für die Verwendung bei solchen Behandlungen. Genauer, aber nicht ausschließlich beschäftigt sich die Erfindung mit der Behandlung von Zuständen, die durch einen Mangel in der Anzahl oder Funktion membrangebundener Rezeptoren gekennzeichnet sind. Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung hauptsächlich mit Bezugnahme auf die Behandlung von Alzheimer'scher Erkrankung (AD) und seniler Demenz vom Alzheimer'schen Typ (SDAT) beschrieben werden, wo Mängel in einer Anzahl von Rezeptortypen gezeigt worden sind. Es soll jedoch verstanden werden, dass sich die vorliegende Erfindung allgemein auf die Behandlung von Zuständen bezieht, die intrinsischen pathologischen Zuständen und/oder dem Aussetzen an nachteilige Umweltbedingungen zuzuschreiben sind, wobei diese Zustände durch einen Mangel in der Anzahl oder Funktion membrangebundener Rezeptoren oder einen Mangel an der Übertragung an den Verbindungen zwischen Neuronen oder an den Verbindungen zwischen Neuronen und Effektorzellen gekennzeichnet sind.
Zustände des oben erwähnten Typs schließen Parkinson'sche Erkrankung, Demenz mit Lewi-Körperchen, orthostatischen Hypotonus, Autismus, chronisches Müdigkeitssyndrom, Myasthenia gravis, Lambert-Eaton-Krankheit, Erkrankungen und Probleme im Zusammenhang mit dem Golfkrieg-Syndrom, berufliches Aussetzen an organische Phosphorverbindungen und Probleme im Zusammenhang mit Alterung ein.
Alzheimer'sche Erkrankung (AD) und senile Demenz vom Alzheimer'schen Typ (SDAT) sind ernste und wachsende Probleme in allen Gesellschaften, wo sich aufgrund einer Zunahme in der Lebenserwartung und Kontrolle von zufällig erworbener Erkrankung das demographische Profil zunehmend in Richtung einer älteren Population erstreckt. Mittel, welche AD/SDAT behandeln können oder bei ihrer Handhabung helfen können, werden dringend benötigt.
Mit Alter zusammenhängende Gedächtnisbeeinträchtigung (AAMI) ist eine Eigenschaft von älteren Patienten, welche, während sie psychologisch und physiologisch normal sind, Gedächtnisverlust beklagen. Es ist ein schlecht definiertes Syndrom, aber Mittel, welche bei der Behandlung von AD/SDAT wirksam sind, können auch bei diesen Patienten von Nutzen sein.
Forschung über AD/SDAT wurde durch traditionelle und konventionelle medizinische Forschungsverfahren und Disziplinen durchgeführt. Bei der konventionellen Medizin gibt es etliche Ansätze der Behandlung von AD/SDAT. Es ist bekannt, dass die biochemischen Vorgänge, die dem Gedächtnis in dem zerebralen Kortex dienlich sind, (wenigstens zum Teil) cholinerg vermittelt sind. Fachleute werden wissen, dass „cholinerg vermittelte" Mechanismen direkt Acetylcholin, das auf Rezeptoren wirkt, zuzuschreiben sind und dass diese direkte Wirkungen sind. Andere, klinisch nützliche Wirkungen können auch durch die Modulierung der Freisetzung von Acetylcholin aus präsynaptischen Nervenendigungen oder durch die Inhibition von Enzymen, welche Acetylcholin zerstören, bewirkt werden. Diese modellierenden Faktoren können durch Neuronen ausgeübt werden, wo der Mediator nicht cholinerg ist; auf diese wird Bezug genommen als indirekte Wirkungen. Etliche Behandlungsansätze konzentrierten sich auf die Rolle von anderen Mediatoren wie 5-Hydroxytryptamin, welches ein Mediator in anderen Gehirnregionen ist, wie zum Beispiel den Mittelhirnkernen. Da Fasern aus diesen Regionen jedoch in den zerebralen Kortex vorwärts projiziert werden, wo der primäre Transmitter Acetylcholin ist, richtete sich die Aufmerksamkeit bei der Suche nach geeigneten therapeutischen Mitteln auf die Handhabung dieses Mediators.
Cholinerge Strategien für die Behandlung von AD/SDAT wurden auf etliche Punkte entlang des Informationsweges, auf die synaptische Freisetzung und das Entfernen von freigesetztem Acetylcholin gerichtet.
Ein Ansatz involviert die Behandlung mit hohen Lecithindosen und anderen Vorläufern von Acetylcholin. Dies ist von begrenztem Nutzen bei der Erzeugung von nachhaltigen Verbesserungen der kognitiven Leistung.
Ein anderer Ansatz involviert die Verwendung von pflanzlichen Arzneimitteln wie Polygalae-Wurzelextrakt, von welchem gezeigt worden ist, dass er die Aktivität der Cholin- Acetylcholin-Transferase (CAT) und die Sekretion von Nervenwachstumsfaktor (NGF) im Gehirn steigert. Die orale Applikation von NGF hat keine Wirkung auf Neuronen des zentralen Nervensystems, da er ein Protein mit hohem Molekulargewicht ist, das die Blut-Hirn-Schranke nicht durchqueren kann. Mittel, welche jedoch die Blut-Hirn-Schranke durchqueren können und eine stimulierende Wirkung auf die NGF-Synthese im zentralen Nervensystem haben, wurden für die Verbesserung von mit Gedächtnis im Zusammenhang stehendem Verhalten vorgeschlagen.
Die Ergebnisse eines dritten klinischen Ansatzes, welcher Cholinesteraseinhibitoren wie Tacrinhydrochlorid nutzt, waren nur geringfügig positiver als die obigen. Von aus in der chinesischen und westlichen Medizin verwendeten Pflanzen gewonnene Substanzen, zum Beispiel Huperzin, Galanthamin und Physostigmin, wurde von allen gezeigt, dass sie von einem gewissen, obgleich beschränkten Nutzen bei der Behandlung von AD/SDAT in klinischen Studien und auch in Labormodellen sind. Sämtliche dieser Substanzen sind Inhibitoren der Acetylcholinesterase (AChE). In Patienten mit AD/SDAT mag es eine reduzierte Synthese von Acetylcholin (ACh), eine reduzierte Effizienz bei der Freisetzung von ACh aus präsynaptischen Speichern und eine Abnahme in der Anzahl oder Funktion von postsynaptischen (M₁-) Rezeptoren geben. Es wurden auch Reduktionen bei präsynaptischen M₂-Rezeptoren gezeigt. Die nützliche Wirkung von AChE-Inhibitoren wird der Steigerung von Acetylcholinspiegeln an Synapsen im Gehirn durch Verlangsamen des Abbaus von freigesetztem Transmitter zugeschrieben.
Es ist von Zusammensetzungen, welche die cholinerge Funktion modulieren, bekannt, dass sie das Gedächtnis- und Erinnerungsvermögen beeinflussen. Zum Beispiel stimuliert Nikotin nikotinische Acetylcholinrezeptoren und man nimmt an, dass die kurzzeitigen gedächtnissteigernden Wirkungen des Zigarettenrauchens an der Wirkung von Nikotin liegen. Scopolamin, ein Antagonist von Acetylcholin, wird Amnesie und eine beeinträchtigte kognitive Funktion hervorrufen, was sich in psychomotorischen Tests als eine Verlängerung von einfachen Reaktionszeiten manifestiert, möglicherweise als ein Ergebnis von reduzierter Aufmerksamkeit, und wird für diesen Zweck als einen begleitende analgetische Behandlung verwendet. Die Amnesiewirkung von Scopolamin kann durch Nikotin antagonisiert werden.
Es gibt zwei Familien an nikotinischen Rezeptorsubtypen (α und β) und jede schließt vier Untergruppen ein, welche sich in der Ligandenspezifität unterscheiden. Die Rolle von nikotinischen Rezeptoren im ZNS ist auf dem molekularen Niveau nicht gut verstanden. Es ist möglich, dass an nikotinische Rezeptoren bindende Mittel die Umsatzrate an muskarinischen Rezeptorstellen im Gehirn modifizieren. Nikotinische Rezeptoren sind ligandenabhängige Innenkanäle und ihre Aktivierung bewirkt eine schnelle Zunahme (im Millisekundenbereich) der zellulären Permeabilität für Na⁺ und Ca⁺⁺, Depolarisation und Exzitation.
Eine andere Klasse an cholinergen Rezeptoren kann durch Muskarin stimuliert werden. Solche muskarinischen (M-) Rezeptoren sind G-Protein gekoppelte Rezeptoren. Antworten von muskarinischen Rezeptoren sind langsamer; sie können exzitatorisch oder inhibitorisch sein. Sie sind nicht notwendigerweise mit Änderungen in der Ionenpermeabilität verknüpft. Es wurden fünf Arten an muskarinischen Rezeptoren durch Klonieren von cholinergen Rezeptoren detektiert und werden als m₁-m₅ bezeichnet. Pharmakologische Wirkungen sind mit vier der klonierten Rezeptoren verbunden und diese werden als M₁-M₄, basierend auf der pharmakologischen Spezifität, bezeichnet.
Unter Verwendung von spezifischen Rezeptorproteinen und monoklonalen Antikörpern war es möglich, muskarinische Rezeptoren im Gehirn weiter als m₁ (postsynaptisch) und m₂ (präsynaptisch) zu lokalisieren. Im Herzen sind M₂-Rezeptoren postsynaptisch. Von präsynaptischen muskarinischen Rezeptoren wird gedacht, dass sie inhibitorisch sind, wobei die Bindung von ACh an diese Rezeptoren die Freisetzung von weiterem ACh reduziert, um einen negativen Rückkopplungsmechanismus für die ACh-Freisetzung bereitzustellen. Selektive M₂-Rezeptorantagonisten, welche bevorzugt im Gehirn verteilt sind, können deshalb nützlich sein beim Behandeln von Alzheimer'scher Erkrankung.
Es ist bekannt, dass es in Erkrankungszuständen wie AD/SDAT allgemeinen Neuronenverlust und Defizite in der cholinergen Nervenfunktion gibt. Es wurde spekuliert, dass die hochaffinen nikotinischen Bindungsstellen in den verbleibenden cholinergen Neuronen beim Behandeln solcher Erkrankungen zu Bindungsstellen mit niedriger Affinität umgewandelt werden könnten, wodurch die Transmitterfreisetzung aufrechterhalten wird. Durch Reduzieren der Affinität der nikotinischen Bindungsstellen wird ein schneller Desensitivierungsprozess vermieden.
Agonistenaktivierung an nikotinischen Rezeptoren im Gehirn hat ein schnelles Einsetzen und Beendigung. Eine reduzierte Affinität der nikotinischen Rezeptoren wird den Desensitivierungsvorgang reduzieren. Schwarz R. D. et al. (J. Neuro Chem 42, (1984), 1495-8) zeigten, dass nikotinische Bindungsstellen präsynaptisch auf cholinergen (und auch auf 5-hydroxytryptaminergen und catecholaminergen) Axonendigungen lokalisiert sind. Eine Änderung der hochaffinen Bindungsstellen bei AD/SDAT mag auch eine Änderung in der modulatorischen Wirkung induzieren, welche nikotinische Bindungsstellen auf andere Transmittersysteme haben mag.
Präsynaptische cholinerge Mechanismen befinden sich auch unter der inhibitorischen Kontrolle durch GABAerge Neuronen und von dieser Inhibition wird gedacht, dass sie bei AD/SDAT intensiviert wird. Entfernen oder Reduktion dieser Inhibition intensiviert die präsynaptische kortikale cholinerge Aktivität und steigert die kognitive Verarbeitung.
Die Wechselwirkungen von durch Nikotin innervierte interneuronale Fasern (wodurch die Bindungsaffinität reduziert wird) mit der De-Inhibition von GABAergen Fasern haben jeweils einen präsynaptischen Ort.
Dies ist ein vereinfachtes Modell der zentralen Übertragung, aber stellt ein Gerüst zum Verständnis der Ansätze bereit, welche gemacht worden sind, um die effektive Konzentration von Acetylcholin bei zentralen Synapsen zu steigern. Dies erläutert weiter das Konzept der direkten und indirekten Wirkung. Es gibt Nachteile, welche den drei konventionellen therapeutischen Ansätzen der AD/SDAT-Behandlung, die oben erwähnt worden sind, anhaften: ACh-Vorläuferergänzung, Agonistenersatz und Acetylcholinesteraseinhibition. Diese Behandlungen können in einer kurzzeitigen Steigerung der Verfügbarkeit von ACh resultieren, welche Rückkopplungsmechanismen aktivieren kann, was in der Desensitivierung von postsynaptischen Rezeptoren resultiert. Aus theoretischen Gründen würden Langzeitnutzen nicht vorhergesagt werden und, wenn die Behandlung unterbrochen wird, verschwinden alle Nutzen bei der Handhabung von AD/SDAT und AAMI und der Zustand kann sich sogar verschlechtern.
Es wurde gezeigt, dass eine Verbindung mit M₁-Agonisten- und M₂/M₃-Antagonistenaktivität die kognitive Leistung bei SDAT-Patienten verbesserte (Sramak et al., Life Sciences, Band 2, Nr. 3, 195–202, 1997). Diese Verbindung bewirkt jedoch unannehmbare cholinerge Nebenwirkungen wie Müdigkeit, Diarrhöe und Übelkeit.
Ein radikalerer Ansatz für AD/SDAT und AAMI zielt darauf, die Anzahl an postsynaptischen (M₁-) Rezeptoren im Gehirn zu steigern. Es ist aus dem chinesischen Patent Nr. CN1096031A bekannt, dass Sarsasapogenin (SaG) cholinerge M₁-Rezeptoren heraufregulieren kann und auch die Spiegel von β-adrenergen Rezeptoren herunterregulieren kann (d. h. in Richtung zu normalen Spiegeln bewegen), deren Anzahl pathologisch bei AD/SDAT erhöht sein kann.
Eine Zusammenfassung, betitelt „The Mechanism of a Sapogenin from Anemarrhenae Asphodeloides Bge. in the Treatment of Senile Dementia" dessen gemeinsame Autoren Ningyu Yi, Yaer Hu und Zongqin Xia sind, und die auf dem 6^th International International Symposium der International Isotope Society in Philadelphia, USA, abgehalten vom 14. bis 18. September 1997, veröffentlicht worden ist, offenbart eine Aktivität von Sarsasapogenin gegen Altersdemenz und gegen leichte Gedächtnis-, Lern- und Kognitionsmängel bei gealterten Personen. Ein vollständigerer Beitrag dieser Arbeit wurde am 1. April 1988 unter dem Titel „Sarsasapogenin: Mechanism in Treating Senile Dementia" in Synthesis and Appliations of Isotopically Labelled Compositions 1997, Hrsg. J. R. Heys und D. G. Melillo (Pub. J. Wiley & Sons), Seiten 315 bis 320, veröffentlicht.
WO-A-99/016786 (beanspruchte Priorität: 26. September 1997; internationaler Anmeldetag: 28. September 1998; internationales Veröffentlichungsdatum: 8. April 1999; Veröffentlichungsdatum der regionalen Phase EP-Anmeldung Nr. EP-A-1 024 146: 2. August 2000; benannte Staaten der regionalen EP-Phase: DE, FR, GB, IT, SE) offenbart in allgemeinen Begriffen ohne Spezifität die Verwendung einer Reihe von Steroidsaponinen und Sapogeninen gegen Demenz und veranschaulicht beispielhaft gewisse Saponine innerhalb der allgemeinen Formel.
Die Erfinder fanden eine Anzahl von Saponinen und Sapogeninen, welche die Fähigkeit zeigen, Rezeptoren zu regulieren.
Fachleute werden sich der Beziehung zwischen Saponinen und ihren Sapogeninen bewusst sein und dass die gewünschten Wirkungen von Sapogeninen in Patienten durch die Verabreichung der entsprechenden Saponine oder einer Mischung davon ausgeübt werden können. Hydrolyse von wenigstens einem Anteil von Saponin geschieht im Gastrointestinaltrakt. Der Fachmann wird sich auch der Epimerisierung von gewissen Sapogeninen unter Bedingungen der sauren Hydrolyse bewusst sein.
Nicht alle Saponine und/oder ihre Aglykone sind nützliche Behandlungen für AD/SDAT und gewisse, wie zum Beispiel die Saponine und Sapogenine aus Digitalis, haben potente inotrope Wirkungen auf das Myokard. Diese Saponingruppe scheint keine Wirkungen auf das zentrale Nervensystem (ZNS) zu haben, welche die therapeutische Verwendung bei AD/SDAT prädizieren würde; ihre Potenz und Toxizität bei hohen Dosen schließen dies auch aus.
Die vorliegende Erfindung ist wie in den angehängten Ansprüchen definiert.
Gewisse der Hauptsapogenine haben die folgende allgemeine Formel:
Mit Bezugnahme auf diese allgemeine Formel ist die Struktur gewisser Sapogenine wie in der Tabelle unten angegeben:
Die Variation in den pharmakologischen Eigenschaften und pharmakodynamischen Wirkungen von verschiedenen Sapogenintypen unterstreicht den Bedarf für die Auswahl jener Mittel, welche für die Behandlung von AD/SDAT am nützlichsten sind. Die Entdeckung von neuen Tatsachen über die Wirkung von SaG machte es möglich zu bestimmen, welche Substanzen am nützlichsten für die Behandlung von AD/SDAT und Ähnliche sind.
Die Saponine und Sapogenine von hauptsächlichem Interesse bei gewissen Aspekten der vorliegenden Erfindung kommen natürlicherweise in einer Reihe von Pflanzenarten vor, namentlich in den Gattungen Smilax, Asparagus, Anemarrhena, Yucca und Agave. Die Arten, die gegenwärtig von größtem Interesse sind, schließen Smilax regelii Kilip & Morton – gewöhnlich bekannt als honduranisches Sarsaparilla; Smilax aristolochiaefolia Miller – gewöhnlich bekannt als mexikanisches Sarsaparilla; Smilax ornata Hooker – gewöhnlich bekannt als jamaikanisches Sarsaparilla; Smilax aspera – gewöhnlich bekannt als spanisches Sarsaparilla; Smilax glabra Roxburgh; Smilax febrifuga – Kunth – gewöhnlich bekannt als ecuadorianisches oder peruanisches Sarsaparilla; Anemarrhena asphodeloides Bunge; Yucca schidigera Roezl ex Ortgies; und Yucca brevifolia Engelm. Saponine und Sapogenine, welche von Interesse sein könnten, kommen auch natürlicherweise in anderen Gattungen vor, zum Beispiel Dioscorea, Trillium, Solanum, Strophanthus, Digitalis und Trigonella. Wie oben angegeben, besitzen etliche Saponine und Sapogenine aus diesen Quellen unerwünschte Eigenschaften und werden folglich nicht für die Verwendung bei der Erfindung empfohlen.
Die vorliegende Erfindung macht deshalb eine pharmazeutische Zusammensetzung mit die kognitive Funktion steigernden Eigenschaften zugänglich, welche eine effektive Menge von Smilagenin als ein aktives Mittel umfasst. Dieses aktive Mittel ist ein nicht östrogenes Steroidsapogenin.
Es wird geschätzt werden, dass die Erfindung auch die Verwendung der oben definierten Zusammensetzungen zugänglich macht. Folglich macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von kognitiver Funktion zugänglich, welches die Verabreichung einer effektiven Dosis einer gemäß der Erfindung zubereiteten Zusammensetzung an einen Menschen oder ein Tier umfasst.
Die Erfindung macht auch ein Verfahren zum Steigern von kognitiver Funktion in einem Menschen oder nicht menschlichen Tier zugänglich, welches das Verabreichen einer effektiven Dosis von Smilagenin als ein aktives Mittel umfasst.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „kognitive Funktion" auf Funktionen wie Denken, Begründen, Erinnern, Vorstellen und Lernen.
Eines oder mehrere von Astragalosid, Tigogenin, Hecogenin und Diosgenin können auch bei der Herstellung eines Medikamentes gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zusammen mit dem wie zuvor definierten aktiven Mittel.
Die Erfinder fanden auch heraus, dass, wenn Sarsasapogenin mit gewissen anderen Sapogeninen kombiniert wird, eine unerwartete synergistische Wirkung erhalten wird.
Folglich macht die Erfindung auch eine Zusammensetzung für die Behandlung eines in den beigefügten Ansprüchen definierten Zustandes zugänglich, wobei die Zusammensetzung wenigstens zwei aus Sarsasapogenin, Smilagenin, Prazerigenin, ein Astragalosid, Tigogenin, Ruscogenin, Hecogenin und Diosgenin umfasst, vorausgesetzt, dass Smilagenin vorhanden ist.
Die bei der Erfindung verwendeten Substanzen haben keine offenkundig östrogene und/oder androgene und/oder anabole Aktivität in Patienten. Nichtsdestotrotz gibt es einen geringen Grad an östrogener und/oder androgener Ergänzung bei gewissen Ausführungen.
Überraschenderweise haben die Erfinder herausgefunden, dass radioaktiv markiertes SaG in den aus Ratten isolierten Kernen von Gehirnzellen konzentriert ist und dass die Spiegel an M-Rezeptor-mRNA in mit SaG behandelten Ratten erhöht sind. Während die Erfinder es nicht wünschen, durch irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass SaG die in dem chinesischen Patent Nr. CN1096031A beschriebenen Wirkungen durch Modulieren der DNA-Expression ausübt.
Eine mögliche Erklärung in Übereinstimmung mit dieser Erfindung ist, dass SaG ein intrazellulärer Agonist eines Steroidrezeptors ist, möglicherweise der Östrogenrezeptor, oder eines Transkriptionsfaktors oder Promoters. Es gibt chemische Ähnlichkeiten zwischen der Struktur von Steroiden und SaG und es ist deshalb möglich, dass der Transportmechanismus von SaG aus dem Cytoplasma in den Kern derselbe ist wie jener für Steroide. Folglich bindet SaG nach dem Diffundieren über die Zellmembran an einen in dem Cytoplasma vorhandenen Steroidrezeptor und fördert eine Konformationstransformation des Rezeptors, so dass ein hochaffiner nukleärer Komplex einer Reaktionsstelle auf dem nukleären DNA-Protein-Komplex zugeführt wird. Dort steigert er die Transkription von mRNA, welche aus dem Kern zu den Ribosomen wandert, um in einer gesteigerten Produktion von muskarinischen Rezeptoren zu resultieren.
Eine zweite Möglichkeit ist, dass SaG ein Agonist eines unbekannten Rezeptors ist, welcher wirkt, um eine Steigerung in der mRNA-Expression zu bewirken, durch Binden des DNA-Protein-Komplexes in dem Kern und Wirken als ein Promoter.
In jedem Fall mag die Bindung des SaG-Rezeptor-Komplexes an DNA eine Steigerung in der Expression von mRNA bewirken, welche für cholinerge Rezeptoren, dopaminerge Rezeptoren oder adrenerge Rezeptoren oder andere membrangebundene Rezeptoren kodiert.
Alternativ mag die Bindung des SaG-Rezeptorkomplexes an die DNA eine Steigerung in der Produktion von gekoppelten Proteinen wie G-Protein bewirken oder ihren Abbau verhindern oder die Verknüpfung zwischen solchen Proteinen und assoziierten Rezeptoren verzögern, wodurch sekundäre Änderungen in der Rezeptorzahl bewirkt werden.
Die Wirkungen von SaG können durch Steigerungen in den Spiegeln eines oder mehrerer neurotropher Faktoren, wie zum Beispiel Nervenwachstumsfaktor (NGF), vermittelt werden.
Es ist auch anerkannt, dass es zusätzlich zu den neuronalen und cholinerg vermittelten synaptischen Mechanismen möglich ist, dass Substanzen wie Stickstoffmonoxid (NO) und nicht cholinerge Agonisten eine modellierende Wirkung auf die cholinerge Transmission haben können.
Welche die präzise Natur des Zellbestandteils, an welchen SaG bindet, um seine Wirkung auszuüben, auch ist, dies stellt einen neuen Weg bereit, auf welchem potentielle Behandlungen für AD/SDAT, AAMI und ähnliche angegangen werden können.
Es wurde gezeigt, dass SaG die Spiegel von mRNA von membrangebundenen Rezeptoren steigert, genauer m₁-Rezeptor-mRNA. Es ist deshalb möglich, dass der cytosolische oder nukleäre Rezeptor oder Promoter, wenn er aktiviert wird, die Produktion von mRNA-Molekülen, welche für membrangebundene Rezeptoren kodieren, in dem Gewebe, Organ, der Zellart oder Organelle steigert oder dass er den Abbau von mRNA-Molekülen, welche für membrangebundene Rezeptoren kodieren, in dem Gewebe, Organ, der Zellart oder Organelle reduziert.
Der cytosolische oder nukleäre Rezeptor, wenn er aktiviert wird, mag auch die Transkription von mRNA-Molekülen, welche für membrangebundene Rezeptoren kodieren, in dem Gewebe, Organ, Zelltyp oder der Organelle steigern.
Wie oben erwähnt können nikotinische Rezeptoren die Anzahl und/oder den Umsatz von membrangebundenen Rezeptoren modulieren. Demgemäß kann in einem Beispiel davon die Wirkung des cytosolischen oder nukleären Rezeptors durch Verabreichen einer Substanz moduliert werden, welche wenigstens zum Teil ein Agonist von nikotinischen Rezeptoren ist.
Es wird gegenwärtig gedacht, dass die Wirkung des cytosolischen oder nukleären Rezeptors durch Verabreichen einer Substanz, die wenigstens zum Teil ein Agonist davon ist, in Übereinstimmung mit der durch die vorliegende Erfindung zugänglich gemachten Behandlung moduliert werden kann.
Der Rezeptor kann in den Cytosol der Zellen des Gewebes, Organs, der Zellart oder Organelle lokalisiert sein und migriert, wenn er durch Binden eines Agonisten aktiviert wird, zu dem Kern der Zellen. Es ist auch möglich, dass der Rezeptor im Kern der Zellen des Gewebes, Organs, der Zellart oder der Organelle lokalisiert ist, wobei der Agonist in den Kern diffundiert oder dorthin durch einen anderen Mechanismus transportiert wird.
Bei der durch die vorliegende Erfindung zugänglich gemachten Behandlung ist es für eine verabreichte Substanz nicht wesentlich, dass sie direkt auf den cytosolischen oder nukleären Rezeptor selbst wirkt. Stattdessen kann die Wirkung entweder stromaufwärts oder stromabwärts des Anteils des cytosolischen oder nukleären Rezeptors oder Promoters in dem Weg stattfinden. Folglich kann die Wirkung des cytosolischen oder nukleären Rezeptors durch Verabreichen einer Substanz moduliert sein, welche die Expression der mRNA- Moleküle, welche für membrangebundene Rezeptoren kodieren, in dem Gewebe, Organ, Zelltyp oder der Organelle steigert.
Der Rolle von Östrogen und anderen verwandten Verbindungen als mögliche Behandlungen für SDAT wurde merkliches Interesse zuteil. In den durchgeführten Studien, um die Wirkungen eines Cholinesteraseinhibitors, Tacrin, auf die kognitive Funktion in Patienten mit SDAT zu betrachten, legt eine Sekundäranalyse nahe, dass die ganze Verbesserung in weiblichen Patienten beobachtet wurde, welche auch Hormon- (Östrogen-) Ersatztherapie (ERT) erhielten. Epidemiologische Daten legten auch nahe, dass ERT gegen die Entwicklung von SDAT schützen könnte. Es gibt ausgedehnte Arbeiten an der Ratte, welche nahe legen, dass Ovariektomie in einer reduzierten kognitiven Funktion resultiert und dass diese Wirkung wenigstens zum Teil durch die Verabreichung von Östrogen umgekehrt werden kann. Die Wirkungen von Östrogen bei diesem Modell können sein, die hochaffine Cholinaufnahme in gewisse Bereiche im Gehirn, besonders im Hippocampus, zu steigern, wodurch die cholinerge Übertragung verbessert wird. In demselben Modell wurde von der Verabreichung von Östrogen gezeigt, dass sie die mRNA-Spiegel für neurotrophen Faktor des Gehirns (BDNF) unter Verwendung von geeigneten In-Situ-Hybridisierungstechniken (Singh 1995) steigert.
Mögliche Mechanismen hinter den Wirkungen von Östrogen wurden in In-Vitro-Experimenten untersucht. Diese Studien wurden unter Verwendung einer Neuroblastomzelllinie und des Ansprechens der Zellen auf Serumentzug oder die Wirkungen von β-Amyloid-(BA-) Fraktionen gemacht. Von diesem letzteren Stimulus wird gedacht, dass er von besonderer Relevanz ist aufgrund der Bedeutung von Amyloidplaques in den späten Stadien von SDAT. Sowohl Serumentzug als auch BA induzieren Zelltod. Von 17-β-Östradiol wurde gezeigt, dass es gegen durch Serumentzug und BA induzierten Zelltod schützt. Die schützende Wirkung wurde nicht aufgehoben, wenn das 17-β-Östradiol in der Anwesenheit des Östrogenantagonisten Tamoxifen getestet wurde. Das nicht östrogene Enantiomer, 17-α-Östradiol, war ebenso wirksam beim Inhibieren von Zelltod. Nachfolgende Arbeiten schlugen vor, dass die schützenden Wirkungen dieser Verbindungen von der Anwesenheit eines vollständig ungesättigten phenolischen A-Rings und einer nicht blockierten Hydroxylgruppe an der 3-Position abhängen (Simpkins 1997; Green 1997). In Neuroblastomzellkulturen wurde von Östrogenverbindungen gezeigt, dass sie die Freisetzung von Nervenwachstumsfaktor steigern. Die Relevanz dieser Erkenntnisse auf die Wirkungen von Östrogen bei SDAT bleibt unklar.
Es wurden Patentanmeldungen veröffentlicht, welche die Nützlichkeit einer Anzahl von Steroidsapogeninen mit Spirostan-, Furo-Spirostan-, Spirosolan- oder Solanidinstrukturen bei der Behandlung von Erkrankungen beanspruchen. Zwei Patentanmeldungen sind hier von besonderer Relevanz: die chinesische Patentanmeldung Nr. CN1096031A offenbart Zwei-Wege-Regulationswirkungen des Spirostansapogenins Sarsasapogenin auf β-adrenerge und M-cholinerge Rezeptoren. Die Offenbarung in diesem Dokument ist jedoch kurz. Das andere Dokument von Relevanz ist die Patentveröffentlichung DE 43 03 214 A1 , welche die Verwendung eines sehr großen Bereichs von Saponinen und Sapogeninen bei der Behandlung eines ganzen Bereichs von Erkrankungen beansprucht, von denen die Erfinder denken, dass sie viralen Ursprungs sind. Diese Offenbarung ist jedoch von zweifelhaftem Wert dahingehend, dass es wohl anerkannt ist, dass es kein infektiöses Element bei einer großen Anzahl der Zustände gibt, welche durch eine mangelhafte synaptische Transmission gekennzeichnet sind, und folglich ist die Grundprämisse der angeblichen Erfindung fehlerhaft. Zusätzlich zeigen sie keine Daten irgendeiner Art, welche einem Fachmann erlauben, dass er in der Lage ist, eine bevorzugte Verbindung aus der großen Anzahl der beanspruchten auszuwählen.
Beim Identifizieren von Verbindungen, welche Verwendung bei der Behandlung von SDAT und anderen Erkrankungen, die durch Reduktionen in Rezeptorzahlen oder der synaptischen Übertragung gekennzeichnet sind, haben würden, haben die Erfinder den Bedarf bedacht, Verbindungen zu identifizieren, welche die gewünschte Wirkung haben würden, aber denen jegliche östrogene Wirkungen fehlen würden, da diese nicht annehmbar wären, besonders bei männlichen Patienten. Eine Anzahl der Verbindungen in der Patentanmeldung DE 43 03 214 A1 , von denen beansprucht wird, dass sie Aktivität haben, hat merkliche östrogene Aktivität und ist deshalb unannehmbar. Diese Daten sind unten in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Östrogene Wirkungen von Steroidsapogeninverbindungen und ausgewähltem Triterpenoid
Zusätzlich wurden diese Verbindungen an anderen Steroidrezeptoren getestet, da gedacht wurde, dass Verbindungen, welche von klinischem Wert sein würden, keine Wirkungen auf die anderen Steroidrezeptoren haben sollten. Von keiner der Verbindungen wurde gefunden, dass sie irgendeine Aktivität auf irgendeinen der folgenden Rezeptoren hat:
Progesteron
Glucocorticoid
Testosteron
Folglich waren die Verbindungen, von denen gezeigt wurde, dass sie keine Aktivität auf den Östrogenrezeptor haben, auch inaktiv an den anderen wichtigen Steroidrezeptoren.
Die ausgewählten Verbindungen wurden auch für ihre Aktivität in einer Anzahl von In-Vitro-Tests getestet. Die Tests/Experimente, von denen gedacht wurde, dass sie von einer entscheidenden Wichtigkeit beim Bestimmen einer möglichen Aktivität bei der Erhöhung von membrangebundenen Rezeptorzahlen sind, waren die folgenden:

1. Chinesische Hamsterovar-(CHO-) Zellen, transfiziert mit dem DNA-Fragment, das für einen muskarinischen Rezeptor kodiert. Die für die Mehrheit der Experimente verwendete Zelllinie war eine Zelllinie, die den m₂-Rezeptor exprimiert.
2. Die Wirkungen der muskarinischen Rezeptorexpression in kultivierten Zelllinien neuronalen Ursprungs wurden untersucht.
3. Kultivierte Herzmuskelzellen, gewonnen aus neonatalen Sprague-Dawley-Ratten. Die Herzmuskelzellen exprimieren muskarinische Rezeptoren, typischerweise m₂. Der Spiegel dieser Rezeptoren fällt bei einer verlängerten Kultur und die Wirkungen der Verbindungen von Interesse beim Verhindern des Abfallens der Rezeptorzahlen wurden untersucht.

Die Verfahren und die Ergebnisse dieser Experimente werden nun wiederum beschrieben.
1. CHO-Zelllinienexperimente
Die Wirkungen verschiedener Verbindungen auf die Expression von m₂-Rezeptoren auf CHO-Zellen, transfiziert mit DNA für den m₂-Rezeptor, wurden untersucht. Die Rezeptorzahlen wurden bewertet unter Verwendung von tritiummarkierter QNB-Bindung und durch Abziehen von unspezifischer Bindung. Die Verbindungen wurden in DMSO gelöst und DMSO wurde als eine Kontrolle verwendet. Die Verbindungen wurden über einen Bereich von Endkonzentrationen getestet. Die Verbindungen wurden auch in Anwesenheit und Abwesenheit von Tamoxifen getestet, um zu versuchen, einen östrogenrezeptorvermittelten Mechanismus zu unterscheiden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 unten zusammengefasst. Tabelle 2: Wirkungen von Verbindungen auf die Expression von m₂-Rezeptoren auf CHO-Zellen
Folglich zeigen die Experimente, dass etliche der Verbindungen in der Lage waren, die Zahl muskarinischer Rezeptoren zu steigern, die auf der Oberfläche von CHO-Zellen, die in vitro kultiviert worden sind, exprimiert werden. Die Wirkung wurde nicht durch Tamoxifen antagonisiert, was zeigt, dass der involvierte Mechanismus den Östrogenrezeptor nicht involvierte. Anders als in der durch Simpkin et al. veröffentlichten Arbeit wurde gefunden, dass es keinen Bedarf für einen intakten Phenol-A-Ring gab. Ähnlich fehlte einer Anzahl von Verbindungen, die Steroidsapogenine sind, Aktivität. Ferner zeigten zusätzliche Experimente, dass β-Östradiol eine ähnliche Wirkung beim Steigern der Rezeptorexpression hatte, wenn es in einer Konzentration von 10^–5 M verabreicht worden ist.
2. Wirkungen von Verbindungen auf das Zellüberleben
Andere In-Vitro-Tests wurden verwendet, um zwischen aktiven und inaktiven Verbindungen zu unterscheiden. Insbesondere zahlreiche Neuroblastomzelllinien, einschließlich SKN-SN- und SH-SY5Y-Zellen, ebenso wie Phaeochromocytomzelllinien wurden in vitro in der Anwesenheit von β-Amyloidfragmenten oder Serumabreicherung kultiviert. Eine Anzahl von Techniken, um die Wirksamkeit der Verbindungen beim Schützen der kultivierten Zellen zu zeigen, wurde untersucht. Diese Techniken schlossen Trypanblauausschluss, Chemilumineszenz und die Freisetzung von Lactatdehydrogenase ein. Von höchstem Interesse war die Beobachtung, dass die Inkubation von Zellen, insbesondere PC12-Zellen, mit β-Amyloid die Anzahl von muskarinischen Rezeptoren, die unter Verwendung von radioaktiv markierten Ligandenbindungstechniken gemessen wurde, reduzierte. Diese Reduktion in den Rezeptorzahlen wurde als durch die aktiven Verbindungen verbessert befunden.
3. Wirkungen von Verbindungen auf kultivierte Herzmuskelzellen
Herzmuskelzellen wurden unter Verwendung von Standardtechniken aus dem Ventrikelmuskel von neonatalen Sprague-Dawley-Ratten isoliert. Zellen wurden in vitro kultiviert und auf Zelloberflächenmembranfragmenten exprimierte muskarinische Rezeptorzahlen wurden nach Homogenisation von Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet worden sind, unter Verwendung von spezifischer Bindung von tritiummarkiertem QNB abgeschätzt. Vorläufige Experimente zeigten, dass die Zahl von exprimierten Rezeptoren nach zehn Kulturtagen dazu neigte, abzunehmen. Die Experimente wurden deshalb so gestaltet, dass sie die Wirkungen der verschiedenen Verbindungen beim Inhibieren dieser Abnahme in den Rezeptorzahlen untersuchen.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 3 zusammengefasst: Tabelle 3: Wirkungen von verschiedenen Verbindungen auf die muskarinische Rezeptorexpression auf kultivierten Herzmuskelzellen
Überraschenderweise fanden die Erfinder heraus, dass Sapogenine vorzugsweise in den Kernen von in vitro kultivierten Zellen konzentriert sind. Dies ist überraschend, da, wie oben diskutiert, Sarsasapogenin (SaG) und gewisse andere Verbindungen, von denen gezeigt worden ist, dass sie die Anzahl muskarinischer Rezeptoren steigern, an bekannte Steroidrezeptoren nicht binden. Zusätzlich ist es überraschend, dass SaG bevorzugt in den Nukleus aufgenommen wird, da die Wirkungen dieser Verbindungen in In-Vitro-Testsystemen gesehen werden können, die den muskarinischen Rezeptor exprimieren, bei denen aber die DNA für den Rezeptor in das Cytoplasma transfiziert worden ist und sich folglich nicht unter dem normalen nukleären Kontrollmechanismus befindet.
Von SaG und von allen anderen Verbindungen, welche getestet worden sind und von denen gezeigt worden ist, dass sie die Rezeptorspiegel heraufregulieren, wurde gezeigt, dass sie nicht direkt an irgendeine der bekannten Hauptklassen eines membrangebundenen Rezeptors binden. Folglich kann postuliert werden, dass die beobachteten Wirkungen möglicherweise nicht zum Beispiel an einer Wirkung auf den nikotinischen Rezeptor liegen und einer daraus folgenden Steigerung in der Anzahl an muskarinischen Rezeptoren. Diese Erklärung scheint sogar noch weniger plausibel (obwohl sie nicht ausgeschlossen werden kann), falls man bedenkt, dass von gewissen Verbindungen auch durch die Erfinder gezeigt worden ist, dass sie die Anzahl β-adrenerger Rezeptoren, die auf peripheren Blutlymphozyten exprimiert werden, steigern. Folglich würde der Mechanismus als einer erscheinen, welcher eine allgemeinere Wirkung auf die Regulation von membrangebundenen Rezeptoren hat.
Es wird hier spekuliert, dass die Wirkung der aktiven Verbindungen, die in diesem Patent beansprucht werden, durch eine Wirkung auf G-Protein erfolgen kann und dass die Wirkungen auf Rezeptorzahlen sekundär zu einer Wirkung auf G-Protein sind. Wenn ein membrangebundener, G-Protein gekoppelter Rezeptor stimuliert wird, werden zwei grundsätzliche Sätze an Ereignissen gestartet: die Effektorantwort und die Aufnahme des Rezeptors. Das nachfolgende Verarbeiten des Rezeptors zu dem Zustand, in dem er sich wiederum in einer Form auf der Zelloberfläche oder einer anderen Membranoberfläche findet, wo er mit einem anderen Rezeptorliganden in Wechselwirkung treten kann, scheint Gegenstand einer Anzahl von Faktoren zu sein. Eine Anzahl dieser Faktoren oder Mechanismen scheint G-Protein gekoppelt zu sein. Es gibt Anzeichen, dass die Aktivierung von m₃-Rezeptoren eine Wirkung auf die G-Proteinexpression oder -spiegel haben kann. Es wird spekuliert, dass die Wirkungen der in diesem Patent beschriebenen Verbindungen an einer Wechselwirkung in den Vorgängen der Rezeptorregeneration, G-Proteinkopplung oder G-Proteinhomöostase liegen können.
Eine alternative Hypothese ist, dass die Verbindungen die Synthese oder die Freisetzung oder eine reduzierte Rate des Abbaus von neurotrophen Faktoren wie neurotropher Faktor des Gehirns und/oder Nervenwachstumsfaktor steigern. Diese Wirkungen auf Wachstumsfaktoren könnten an einer Wirkung der Verbindung auf einen cytosolischen oder nukleären Rezeptor oder an der Bindung einer Verbindung an eine Promoterregion mit einer daraus resultierenden direkten Wirkung auf die Rate der Produktion von mRNA für den Wachstumsfaktor oder als eine Konsequenz des Steigerns der Produktion eines anderen Materialfaktors wie G-Protein liegen oder schließlich können die Wirkungen sekundär zu einer Wirkung auf den Rezeptor oder die G-Proteinverarbeitung sein.
Die gesteigerte Expression und/oder das anormale Verarbeiten des Amyloidvorläuferproteins (APP) wird mit der Bildung von Amyloidplaques und zerebrovaskulären Amyloidablagerungen in Zusammenhang gebracht, welche die hauptsächlichen morphologischen Kennzeichen der Alzheimer'schen Erkrankung sind. Von besonderem Interesse sind die Vorgänge, welche die proteolytische Spaltung von APP in amyloidogene und nicht amyloidogene Fragmente regulieren. Die Spaltung von APP durch das Enzym α- Sekretase innerhalb der β-Amyloidsequenz des Proteins resultiert in der Bildung eines nicht amyloidogenen C-terminalen Fragmentes und des löslichen APPsα-Fragments; von diesem letzteren Fragment wurde gezeigt, dass es neurotrophe und neuroprotektive Aktivität hat, ebenso wie es das Gedächtnis in Mäusen steigert, wenn es intrazerebroventrikulär (ICV) injiziert wird. Im Gegensatz dazu legt die Verarbeitung von APP durch β-Sekretase den N-Terminus von β-Amyloid frei, welches durch γ-Sekretasespaltung an dem variablen C-Terminus freigesetzt wird. Von den resultierenden β-Amyloidpeptide, welche 39–43 Aminosäuren enthalten, wurde gezeigt, dass sie neurotoxisch sind und dass sie in Plaques akkumulieren, welche Interneuronenverbindungen beeinflussen.
Eine Anzahl von Studien zeigte, dass die Stimulation der Protein-Kinase-(PKC-) gekoppelten muskarinischen M₁- und M₃-Rezeptoren in einer Zunahme in der α-Sekretaseaktivität resultiert. Als eine Konsequenz davon wird das Verarbeiten von APP zu APPsα mit seinen neuroprotektiven Wirkungen gesteigert. Parallel dazu wird das Verarbeiten von APP durch β- und γ-Sekretase reduziert und es gibt eine daraus folgende Reduktion von β-Amyloid. Andere Transmitter wie Nervenwachstumsfaktor (NGF) und neurotropher Faktor des Gehirns (BDNF), ebenso wie Bradykinin und Vasopressin, können ähnliche Wirkungen beim Steigern des Anteils von APP, der zu APPsα verarbeitet wird, haben. Es mag eine Anzahl von Faktoren geben, die in die Wirkungen von NGF verwickelt sind, was die Bindung des Faktors an den Tyrosinkinaserezeptor (TrkA) und die Stimulation von Phospholipase Cγ einschließen mag, mit einer nachfolgenden Phosphorylierung und Aktivierung von Proteinkinase C (PKC) und Steigerung in der relativen Aktivität von α-Sekretase.
Von jeder Behandlung, welche die Aktivität von Proteinkinase C selektiv im Gehirn steigert, könnte deshalb erwartet werden, dass sie bei der Handhabung von Alzheimer'scher Erkrankung verwendet werden kann. Bis vor kurzem waren Agonisten, die für den M₁-Rezeptor selektiv sind, nicht erhältlich. Von nicht selektiven Agonisten würde erwartet werden, dass sie präsynaptische M₂-Rezeptoren stimulieren, welche eine negative Rückkopplung bewirken und folglich weiter stark die muskarinische Übertragung beeinträchtigen würden. Selektive Agonisten für den M₁-Rezeptor werden nun erhältlich (Talsaclidin) und solche Mittel befinden sich unter Untersuchung für die Behandlung von AD. Es besteht jedoch ein wesentliches Risiko, dass, wie bei der chronischen Applikation jedes Rezeptoragonisten, die beobachteten klinischen Nutzen stark begrenzt sein werden in Begriffen der Größe des Nutzens durch Reduzieren von Rezeptorzahlen oder durch Reduzieren der Empfindlichkeit und in Begriffen von Nebenwirkungen aufgrund des Fehlens von Rezeptorspezifität. Folglich würde von in dieser Erfindung beschriebenen Verbindungen, welche selektiv muskarinische M₁-Rezeptorzahlen steigern, mit einer geringen oder gar keinen Wirkung auf muskarinische M₂-Rezeptorzahlen im Gehirn, erwartet werden, dass ihnen die Probleme fehlen, die mit einem muskarinischen Agonisten beobachtet werden, und dass sie folglich eine besondere Nützlichkeit haben. In der Tat können die Nutzen in drei Teilen wie folgt gesehen werden.

1. Eine selektive Steigerung in den M₁-Rezeptorzahlen, die zu einer gesteigerten synaptischen Übertragung führt. Chronische Applikation eines selektiven Agonisten wird, im besten Fall, gar keine gegenteilige Wirkung auf die Übertragung haben;
2. Sekundär zu den gesteigerten Rezeptorzahlen, wird eine gesteigerte Stimulation von PKC mit einer daraus folgenden Zunahme der α-Sekretaseaktivität, zu Folgendem führen: 2.1. eine reduzierte Produktion von β-Amyloid und eine daraus folgende Reduktion von Plaquebildung und neuronalem Verlust; 2.2. eine Zunahme in APPsα und eine darauf folgende Verbesserung der zerebralen Funktion, wie belegt durch eine Verbesserung im Kurzzeit- und Langzeitgedächtnis.

Schließlich wurden die Wirkungen des GABA-Systems beim Modulieren der Übertragung oben diskutiert. Es ist wohl bekannt, dass es eine Steroidbindungsstelle auf dem GABA-Rezeptor gibt, welche von den Benzodiazepin-, Chlorid- und GABA-Bindungsstellen verschieden ist. Von einer Anzahl von therapeutischen Verbindungen ist bekannt, dass sie an diese Stelle binden und dass sie verwendet worden sind, um das Maß an Bewusstsein zu steigern oder zu reduzieren. Es wird spekuliert, dass die chronische Applikation eines Teilagonisten an diese Stelle zu einer Steigerung der Übertragung führen könnte.
Die Erfindung wird weiter in dem folgenden Beispiel beschrieben werden.
Beispiel – Untersuchung von mRNA-Spiegeln unter Verwendung von In-Situ-Hybridisierung
20 Monate alte männliche SD-Ratten einer reinen Linie wurden zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt. Eine Gruppe erhielt durchschnittlich 3 mg Sarsasapogenin pro Ratte pro Tag, gemischt in das tägliche Futter. Die Kontrollgruppe erhielt normal Futter und Wasser. Vier Monate später wurden ihre Gehirne in Hybridisierungstechnikexperimenten verwendet, wobei vier bis sechs Monate alte Ratten als eine junge Kontrollgruppe verwendet worden sind. Andere Fütterungsanordnungen für jede Gruppe waren vollständig identisch.
Eine cDNA-Kette, welche jeweils der mRNA sowohl von m₁ als auch m₂ entspricht, wurde synthetisiert. m₁ entspricht der 3–18 Aminosäuresequenz von Rezeptorprotein, d. h. TGG TGC CAA GAC AGT GAT GTT GGG ACT GAC AGC AGG GGG CAC TGA GGT, und M₂ der 1–16 Aminosäuresequenz, d. h. ATG AAT AAC TCA ACA AAC TCC TCG AAC AAT GGC TTG GCT ATT ACC AGT. Die cDNA wurde unter Verwendung eines 3'-terminalen Markierungsreagenzkits mit a-³⁵S-dATP (8,9 TBq/mmol) als das Markierungsmaterial markiert. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde sie mit einer Nukleotidsäule gereinigt. Die spezifische Aktivität der Charge wurde abgeschätzt (16,67 – 33,34) × 108 MBq/μg. a-³⁵S-dATP, 3'-terminales Markierungsreagenzkit und Nukleotidsäule wurden von Du Pont Co., USA erhalten.
Eine Ratte wurde aus jeder Gruppe zu jedem Zeitpunkt genommen und Parallelexperimente wurden durchgeführt. Die Ratten wurden enthauptet und ihre Gehirne wurden intakt entnommen. 15 μm dicke koronale Schnitte wurden zubereitet in einem konstant einfrierenden Cryomikrotom (AS-600 Cryomikrotom, Anglia Scientific Co, UK). Schnitte wurden von unterschiedlichen Bereichen gemacht (identische Stellen für jede Ratte) und wurden auf mit Polylysin eingeschmierten Objektträger befestigt, in einem kühlen Luftstrom getrocknet, in einer Lösung aus 4% Paraformaldehyd (enthaltend 1 × Phosphatpuffersalzlösung (PBS), pH 7,0) für fünf Minuten fixiert, bevor sie zweimal in PBS gewaschen worden sind. Sie wurden für zehn Minuten in 0,25% Essigsäureanhydridlösung gegeben (enthaltend 0,1 M Triethanolaminhydrochlorid, pH 8,0, und 0,9% Natriumchlorid), für eine Minute in 70%, 80%, 95% und 100% Ethylalkohol dehydriert, in Chloroform für fünf Minuten entfettet und schließlich nacheinander in 100% und 95% Ethylalkohol für eine Minute behandelt.
Als Negativkontrollen verwendete Schnitte wurden gemacht und in Ethylalkohol etc., wie oben detailliert, dehydriert, aber im Voraus in 100 mg ml RNase und 2 × SSC-Lösung (Salz/Natriumcitratlösung, enthaltend 300 mmol/l Natriumchlorid und 45 mmol/l Natriumcitrat) für zwei Stunden bei 37°C behandelt.
Für die Hybridisierung wurde die Fluidmatrix für Hybridisierung frisch zusammengestellt, enthaltend 50% deionisiertes Formamid, 4 × SSC, 10% Dextransulfat, 250 μg/μl HefetRNA, 5 × Denhard's Lösung, 500 μg/ml Denaturierungsprotamin-DNA, 10 mmol/l Dithiothreitol. Mit ³⁵S markierte Oligonukleotidsonde [(16,67 – 33,34) × 10 MBq/50 μl] wurde zuletzt hinzugefügt und gleichmäßig vermischt. 50 μl der Matrix wurden auf jeden Schnitt getropft und ein Silicatdeckglas wurde leicht darüber platziert, unter Vermeidung von Lufteinschlüssen. Die Schnitte wurden dann in einer Hybridisierungsbox mit 2 × SSC auf dem Boden gelagert, um feucht zu bleiben, und bei 37°C für 18–24 Stunden inkubiert.
Nach Hybridisierung wurden die Objektträger in 1 × SSC-Lösung eingeweicht und leicht geschüttelt, um das Deckglas zu spülen. Sie wurden in 1 × SSC-Lösung kurz gewaschen, dann in 2 × SSC, enthaltend 50% Formamid, bei 37°C für 20 Minuten sanft vibriert, wobei die Lösung viermal gewechselt wurde, und dann in 1 × SSC-Lösung zur Vibration bei Labortemperatur für 30 Minuten übertragen (zweimal wiederholt). Schließlich wurden die Objektträger mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen, mit 70%, dann 95% Ethylalkohol dehydriert und an der Luft getrocknet.
Autoradiographien wurden in einem dunklen Raum zubereitet, wobei das Muster und der Hyperfilm beta max unter Verwendung des Kontaktverfahrens zusammengepresst wurden und in eine Kassette mit einem Trockenmittel gegeben wurden, woran sie bei 4°C für zwei bis drei Wochen ausgesetzt wurden. Sie wurden entwickelt (D196) und fixiert (F5). Schließlich wurden die Autoradiographien unter Verwendung eines Computerbildanalysegerätes (VIDAS-Bildanalysegerät, Kontron, Deutschland) analysiert.
Die m₂-Sonde vermochte es nicht, irgendeine lokalisierte Aktivitätsregion zu zeigen. Die m₁-Sonde zeigte Aktivität im Nukleus dentatus cerebelli, im zerebralen Kortex und im Striatum. Ein Vergleich dieser drei Bereiche für die unterschiedlichen Tiergruppen ist in Tabelle 4 gezeigt: Tabelle 4
Es gab eine signifikante Reduktion in der mRNA-Expression für m₁-Rezeptoren im Striatum gealterter Ratten im Vergleich mit jungen Kontrollen. Applikation von SaG resultierte in einer signifikanten Zunahme in der m₁-Rezeptor-mRNA in demselben Hirngebiet, wenn behandelte Tiere mit gealterten, unbehandelten Kontrollen verglichen wurden.

Claims

Verwendung von Smilagenin als ein aktives Mittel bei der Zubereitung einer Zusammensetzung für die Behandlung von kognitiver Disfunktion in einem Menschen oder in einem nicht-menschlichen Tier.
Verwendung nach Anspruch 1, worin wenigstens zwei aktive Mittel verwendet werden, umfassend Smilagenin und Sarsasapogenin.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Tier ein Mensch ist, der an Alzheimer'scher Krankheit oder SDAT leidet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, worin das Tier ein Mensch ist, der an Parkinson'scher Krankheit leidet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, worin das Tier ein Mensch ist, der an Demenz mit Lewy-Körperchen leidet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, worin das Tier ein Mensch ist, der an orthostatischem Hypotonus leidet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, worin das Tier ein Mensch ist, der an Autismus leidet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, worin das Tier ein Mensch ist, der an chronischem Müdigkeits-Syndrom leidet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, worin das Tier ein Mensch ist, der an Myasthenia gravis leidet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, worin das Tier ein Mensch ist, der an der Lambert-Eaton-Krankheit leidet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, worin das Tier ein Mensch ist, der am Golfkrieg-Syndrom leidet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, worin das Tier ein Mensch ist, der unter dem beruflichen Aussetzen an organische Phosphorverbindungen leidet.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Tier ein Mensch im Alter ist.