PT1066042E

PT1066042E - Saponinas esteroides para o tratamento de doença de alzheimer

Info

Publication number: PT1066042E
Application number: PT99913453T
Authority: PT
Inventors: Jonathan Brostoff; Zongqin Xia; Yaer Hu; Ian Rubin; Brian Whittle; Weijun Wang; Phil Gunning
Original assignee: Phytopharm Plc
Priority date: 1998-03-26
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2006-12-29
Also published as: HK1091417A1; CN1198622C; NO20004804L; EP1719512A2; WO1999048482A3; CA2325634A1; AU3158199A; KR20010042205A; TR200002774T2; ATE314057T1; PL343423A1; WO1999048507A3; ES2257042T3; NO20083993L; GB2335599A; DK1719512T3; HRP20000637A2; ID26989A; MXPA00009437A; NZ507355A

Description

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DESCRIÇÃO

"SAPONINAS ESTERÓIDES PARA O TRATAMENTO DE DOENÇA DE ALZHEIMER" A presente invenção refere-se a receptores ligados a membranas e à sua função; a disfunção cognitiva e estados afins; os tratamentos para aqueles, e a composições para utilização nesses tratamentos. Mais particularmente, mas não exclusivamente, a invenção diz respeito ao tratamento de estados caracterizados por uma deficiência do número ou função de receptores ligados a membranas. No que se segue, a presente invenção será descrita principalmente com referência ao tratamento de doença de Alzheimer (AD) e demência senil do tipo de doença de Alzheimer (SDAT), onde foi demonstrado existirem deficiências em alguns tipos de receptores. No entanto, deve entender-se que a presente invenção se refere genericamente ao tratamento de estados que podem ser atribuídos a estados patológicos intrínsecos e/ou exposição a condições ambientais adversas, em que estes estados são caracterizados por uma deficiência do número ou função de receptores ligados a membranas ou a uma deficiência da transmissão nas junções entre neurónios ou nas junções de neurónios e células efectoras.

Estados do tipo mencionado acima incluem doença de Parkinson, demência de corpos de Lewi, hipotensão postural, autismo, síndroma da fadiga crónica, Miastenia Gravis, doença de Lambert Eaton, doenças e problemas associados à Síndroma da Guerra do Golfo, exposição ocupacional a compostos organofosforados e problemas associados ao envelhecimento. 2 A doença de Alzheimer (AD) e demência senil do tipo de Alzheimer (SDAT) são problemas graves e crescentes em todas as sociedades nas quais, devido ao aumento da esperança média de vida e controlo de doenças adventícias, o perfil demográfico está cada vez mais a tender para uma população mais envelhecida. São urgentemente necessários agentes que possam tratar ou ajudar a gerir AD/SDAT. 0 enfraquecimento da memória associado à idade (AAMI) é uma característica de pacientes mais idosos que se queixam de perda de memória, apesar de estarem psicologicamente e fisicamente normais. É uma síndroma mal definida, mas agentes eficazes no tratamento de AD/SDAT também podem ter valor nestes pacientes. A investigação de AD/SDAT tem sido feita por métodos e disciplinas tradicionais e convencionais de investigação médica. Na medicina convencional há várias abordagens ao tratamento de AD/SDAT. Sabe-se que os processos bioquímicos subjacentes à memória no córtex cerebral são (pelo menos em parte) mediados de forma colinérgica. Os experimentados na área sabem que mecanismos "mediados de forma colinérgica" podem ser directamente atribuídos a acetilcolina que actua em receptores, e estes são efeitos directos. Outros efeitos clinicamente úteis também podem ser causados por modulação da libertação de acetilcolina a partir de extremidades pré-sinápticas de nervos ou inibição de enzimas que destroem a acetilcolina. Estes factores moduladores podem ser exercidos através de neurónios em que o mediador é não colinérgico; estes são referidos como efeitos indirectos. Algumas tentativas de tratamento têm-se centrado no papel de outros mediadores, como a 5-hidroxitriptamina, que é um mediador noutras áreas do cérebro, como os núcleos do 3 mesencéfalo. No entanto, uma vez que fibras destas áreas são projectadas em frente para o córtex cerebral, onde o transmissor principal é a acetilcolina, a atenção tem-se centrado na gestão deste mediador na busca de agentes terapêuticos apropriados.

Estratégias colinérgicas para o tratamento de AD/SDAT têm sido dirigidas para vários pontos ao longo da via da formação, libertação sináptica e remoção de acetilcolina libertada.

Uma abordagem envolve o tratamento com doses elevadas de lecitina e outros precursores da acetilcolina. Isto tem utilização limitada na produção de melhorias prolongadas do desempenho cognitivo.

Outra abordagem envolve a utilização de fármacos vegetais, como extracto de raízes de Polygalae, que se verificou intensificar a actividade de colina-acetilcolina transferase (CAT) e secreção do factor de crescimento do nervo (NGF) no cérebro. A administração oral de NGF não exerce nenhum efeito em neurónios do sistema nervoso central porque é uma proteína de elevado peso molecular que não consegue atravessar a barreira sangue-cérebro. Todavia, agentes que conseguem atravessar a barreira sangue-cérebro e que exercem um efeito estimulador sobre a síntese de NGF no sistema nervoso central foram propostos para melhorar o comportamento relacionado com a memória.

Os resultados de uma terceira abordagem clínica, que utiliza inibidores da colinesterase, como cloridrato de tacrina, têm sido marginalmente mais positivos do que os acima. Verificou-se que substâncias obtidas de plantas 4 utilizadas na medicina chinesa e ocidental, por exemplo, huperzina, galantamina e fisostigmina, todas elas exibem algum beneficio - se bem que limitado - no tratamento de AD/SDAT em estudos clínicos e também em modelos laboratoriais. Todas estas substâncias são inibidores da acetilcolina esterase (AChE). Em pacientes com AD/SDAT pode ocorrer síntese reduzida de acetilcolina (ACh), eficiência reduzida da libertação de ACh a partir de armazéns pré-sinápticos e um decréscimo do número ou função de receptores pós-sinápticos (Mi). Também se verificou existirem reduções em receptores pré-sinápticos M2. 0 efeito benéfico de inibidores da AChE é atribuído ao aumento dos níveis de acetilcolina em sinapses no cérebro por abrandamento da destruição do transmissor libertado.

Sabe-se que composições que modulam a função colinérgica afectam a memória e a recordação. Por exemplo, a nicotina estimula receptores nicotínicos da acetilcolina, e pensa-se que os efeitos intensificadores da memória de curto prazo de fumar cigarros se devem ao efeito da nicotina. A escopolamina, um antagonista da acetilcolina, produzirá amnésia e função cognitiva enfraquecida, manifestadas em testes psicomotores, na forma de um prolongamento de tempos de reacção simples, possivelmente em resultado de atenção enfraquecida, e é utilizada para esta finalidade como tratamento analgésico auxiliar. 0 efeito amnésico da escopolamina pode ser antagonizado pela nicotina. Há duas famílias de subtipos de receptores nicotínicos (a e β) e cada uma inclui quatro subgrupos que diferem na especificidade para ligandos. 0 papel dos receptores nicotínicos no SNC não está bem compreendido ao nível 5 molecular. É possível que agentes que se ligam a receptores nicotínicos possam modificar a velocidade de renovação em sítios de receptores muscarínicos no cérebro. Os receptores nicotínicos são canais iónicos dependentes de ligandos e a sua activação provoca um aumento rápido (milissegundos) da permeabilidade celular a Na+ e Ca++, despolarização e excitação.

Outra classe de receptores colinérgicos pode ser estimulada pela muscarina. Esses receptores muscarínicos (M) são receptores acoplados à proteína G. As respostas de receptores muscarínicos são mais lentas; podem ser excitadoras ou inibidoras. Não estão necessariamente ligadas a alterações da permeabilidade iónica. Cinco tipos de receptores muscarínicos foram detectados por clonagem de receptores colinérgicos e são designados mi-m5. A quatro dos receptores clonados estão associados efeitos farmacológicos, sendo designados como com base na especificidade farmacológica.

Utilizando proteínas receptoras específicas e anticorpos monoclonais tem sido possível localizar suplementarmente receptores muscarínicos no cérebro como mi (pós-sinápticos) e 1¾ (pré-sinápticos). No coração, os receptores M2 são pós-sinápticos. Pensa-se que os receptores muscarínicos pré-sinápticos sejam inibidores, em que a ligação de ACh a estes receptores atenua a libertação de mais ACh, fornecendo um mecanismo de realimentação negativa para a libertação de ACh. Em consequência, antagonistas selectivos de receptores M2 que são preferencialmente distribuídos para o cérebro podem ser úteis no tratamento de doença de Alzheimer. 6

Sabe-se que, em estados de doença como AD/SDAT, ocorre perda neuronal geral e deficiências na função dos nervos colinérgicos. Tem-se especulado que os sítios de ligação nicotínicos de afinidade elevada nos restantes neurónios colinérgicos poderão ser convertidos em sítios de ligação de baixa afinidade no tratamento dessas doenças, desse modo prolongando a libertação de transmissores. Ao diminuir a afinidade dos sítios de ligação nicotínicos evita-se um processo de dessensibilização rápida. A activação agonista em receptores nicotínicos no cérebro tem aparecimento e desaparecimento rápidos. Uma afinidade decrescida dos receptores nicotínicos irá reduzir o processo de dessensibilização. Schwarz R.D. et al. (J. Neuro. Chem. _42_ (1984) 1495-8) mostraram que sítios de ligação de nicotina estão localizados de forma pré-sináptica em terminais axónicos colinérgicos (e também 5-hidroxitriptaminérgicos e catecolaminérgicos). Uma alteração nos sítios de ligação de afinidade elevada em AD/SDAT também pode induzir uma alteração no efeito modulador que os sítios de ligação nicotínicos podem exercer sobre outros sistemas transmissores.

Os mecanismos colinérgicos pré-sinápticos também estão sob o controlo inibidor de neurónios GABAérgicos, pensando-se que esta inibição está intensificada em AD/SDAT. A remoção ou redução desta inibição intensifica a actividade colinérgica cortical pré-sináptica e intensifica o processamento cognitivo.

Tanto as interacções de fibras inter-neuronais inervadas por nicotina (que reduzem a afinidade de ligação) 7 como a desinibição de fibras GABAérgicas têm um locus pré-sináptico.

Este modelo é um modelo simplista da transmissão central, mas fornece uma estrutura para compreender as tentativas que têm sido feitas para aumentar a concentração eficaz de acetilcolina em sinapses centrais. Isto ilustra suplementarmente o conceito de acção directa e indirecta. As três abordagens terapêuticas convencionais ao tratamento de AD/SDAT mencionadas acima têm desvantagens: suplementação de precursores da ACh, substituição de agonistas e inibição da acetilcolina esterase. Estes tratamentos podem resultar num aumento a curto prazo da disponibilidade da ACh, que pode activar mecanismos de realimentação resultantes na dessensibilização de receptores pós-sinápticos. Teoricamente não se prevêem benefícios a longo prazo, e quando o tratamento é interrompido, quaisquer benefícios na gestão de AD/SDAT e AAMI desaparecem e o estado pode mesmo agravar-se.

Foi mostrado que um composto com actividade agonista de Mi e antagonista de M2/M3 melhorou o desempenho cognitivo em pacientes com SDAT (Sramak et al., Life Sciences, volume 2, N° 3, 195-202, 1997). No entanto, este composto causa efeitos secundários colinérgicos inaceitáveis, como fadiga, diarreia e náuseas.

Uma abordagem mais radical a AD/SDAT e AAMI pretende aumentar o número de receptores pós-sinápticos (Mi) no cérebro. É conhecido da Patente Chinesa N° CN1096631A que a sarsasapogenina (SaG) pode regular positivamente receptores colinérgicos Mi e também regular negativamente (isto é, deslocar para níveis normais de) receptores b-adrenérgicos, 8 cujo número pode estar patologicamente aumentado em AD/SDAT.

Um Resumo intitulado "The Mechanism of a Sapogenin from Anemarrhenae Asphodeloides Bge. in the Treatment of Senile Dementia", dos co-autores Ningyu Yi, Yaer Hu e Zongqin Xia e publicado no 6o Simpósio Internacional da Sociedade Internacional de Isótopos em Filadélfia, E.U.A., que ocorreu desde 14 até 18 de Setembro de 1997, revela uma actividade da sarsasapogenina contra demência senil e contra memória fraca, deficiências na aprendizagem e conhecimento em pessoas idosas. Uma descrição mais completa deste trabalho foi publicada em 1 de Abril de 1998 com o titulo "Sarsasapogenin: Mechanism in Treating Senile Dementia" em "Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds" 1997, Editores J.R. Heys e D.G. Melillo (Publicado pela J. Wiley & Sons), páginas 315 até 320. A publicação WO-A-99/016786 (data de prioridade reivindicada: 26 de Setembro de 1997; data do registo internacional: 28 de Setembro de 1998; data da publicação internacional: 8 de Abril de 1999; data da publicação da candidatura da fase regional EP n° EP-A-1024146: 2 de Agosto de 2000; estados designados da fase regional de EP: DE, FR, GB, IT, SE) revela, em termos genéricos e sem especificidade, a utilização de uma gama de saponinas e sapogeninas esteróides contra demência e exemplifica certas saponinas pertencentes à fórmula genérica.

Os inventores descobriram algumas saponinas e sapogeninas que exibem a capacidade para regular receptores. 9

Os experimentados na área estarão a par da relação entre saponinas e suas sapogeninas, e de que os efeitos desejados de sapogeninas podem ser exibidos em pacientes por administração das saponinas correspondentes, ou respectiva mistura. No tracto gastrointestinal ocorre hidrólise de pelo menos uma proporção de saponinas. 0 experimentado também estará a par da epimerização de certas sapogeninas em condições de hidrólise ácida.

Nem todas as saponinas e/ou suas agliconas são tratamentos úteis para AD/SDAT e algumas, como as saponinas e sapogeninas de digitalis, exercem acções inotrópicas potentes no miocárdio. Este grupo de saponinas não parece exercer efeitos no sistema nervoso central (SNC), o que seria uma previsão de utilização terapêutica em AD/SDAT; a sua potência e toxicidade em doses elevadas também o exclui. A presente invenção é como definida nas reivindicações em apêndice.

Algumas das principais sapogeninas têm a fórmula geral seguinte:

Com referência a esta fórmula geral, a estrutura de certas sapogeninas está indicada na Tabela abaixo: 10

Composto Insatm ação Cis/Trans do anel A/B Estere o química do C25 me tilo (R ou H) Grupo(s) hidroxilo no anel Espirostano Sarsasapogenina Cis § 3|i-OH Esitiilagenina Cis R 5[}-OH AmurogeninaD Tnsrs R 3β-ΟΗ, hi),On : 6J.VOH Sisalagenina Traas S 31.VO.H {C=0 -aí C l 2) Tigogenina Tf&as R 3(í-OH Diosgenina Λ5 R 3^-OH Ruscogenina Δ5 R -;β-ΟΗ A variação das propriedades farmacológicas e acções farmacodinâmicas de vários tipos de sapogeninas sublinha a necessidade de seleccionar aqueles agentes que são mais úteis para o tratamento de AD/SDAT. A descoberta de novos factos acerca da acção da SaG possibilitou determinar quais são as substâncias mais úteis para o tratamento de AD/SDAT e afins.

As saponinas e sapogeninas de principal interesse em certos aspectos da presente invenção ocorrem naturalmente numa gama de espécies de plantas, especialmente dos géneros Smilax, Asparagus, Anemarrhena, Yucca e Agave. As espécies presentemente de maior interesse incluem Smilax regelii Kilip & Morton - habitualmente conhecida como salsaparrilha hondurenha; Smilax aristolochiaefolia Miller -habitualmente conhecida como salsaparrilha mexicana; Smilax omata Hooker - habitualmente conhecida como salsaparrilha jamaicana; Smilax aspera - habitualmente conhecida como salsaparrilha espanhola; Smilax glabra Roxburgh; Smilax febrífuga Kunth - habitualmente conhecida como salsaparrilha equatoriana ou peruana; Anemarrhena asphodeloides Bunge; Yucca schidigera Roezl ex Ortgies, e Yucca brevifolia Engelm. Saponinas e sapogeninas que podem ter interesse também ocorrem naturalmente noutros géneros, por exemplo, Dioscorea, Trillium, Solanum, Strophantus, 11

Digitalis e Trigonella. Como indicado acima, algumas saponinas e sapogeninas destas fontes possuem propriedades indesejáveis e, assim, não são recomendadas para utilização na invenção.

Em consequência, a presente invenção disponibiliza uma composição farmacêutica possuindo propriedades intensificadoras da função cognitiva, que compreende uma quantidade eficaz de esmilagenina como agente activo. Este agente activo é uma sapogenina esteróide não estrogénica.

Será apreciado que a invenção também disponibiliza a utilização das composições definidas acima. Assim, a presente invenção disponibiliza um método para intensificar a função cognitiva, que compreende administrar a um humano ou animal uma dosagem eficaz de uma composição preparada de acordo com a invenção. A invenção também disponibiliza um método para intensificar a função cognitiva num humano ou animal não humano, que compreende administrar uma dose eficaz de esmilagenina como agente activo.

Tal como é aqui utilizado, o termo "função cognitiva" refere-se a funções tais como o pensamento, raciocínio, recordação, imaginação e aprendizagem.

Um ou mais entre um astragalósido, tigogenina, hecogenina e diosgenina também podem ser utilizados no fabrico de um medicamento de acordo com a presente invenção, juntamente com o agente activo como previamente definido. 12

Os inventores também descobriram que, quando a sarsasapogenina é combinada com certas sapogeninas diferentes, se obtém um efeito sinergético inesperado.

Assim, a invenção também disponibiliza uma composição para o tratamento de um estado como definido nas reivindicações em apêndice, em que a composição compreende pelo menos duas entre sarsasapogenina, esmilagenina, prazerigenina, um astragalósido, tigogenina, ruscogenina, hecogenina e diosgenina, desde que esteja presente esmilagenina.

As substâncias utilizadas na invenção não têm actividade estrogénica e/ou androgénica e/ou anabólica manifesta elevada em pacientes. Ainda assim, nalgumas especificações, há um nível baixo de suplementação estrogénica e/ou androgénica.

Surpreendentemente, os inventores descobriram que a SaG etiquetada de forma radioactiva se concentra nos núcleos de células do cérebro isoladas de ratos, e que os níveis de mRNA de receptores M estão aumentados em ratos tratados com SaG. Não obstante os inventores não pretenderem ficar restringidos por qualquer teoria, crê-se que a SaG exerce os efeitos descritos na Patente Chinesa N° CN1096031A por modulação da expressão de DNA.

Uma explicação possível de acordo com esta invenção é que a SaG é um agonista intracelular de um receptor esteróide, possivelmente o receptor de estrogénio, ou um factor ou promotor da transcrição. As estruturas de esteróides e SaG têm semelhanças químicas, sendo consequentemente possível que o mecanismo de transporte da 13

SaG do citoplasma para o núcleo seja o mesmo dos esteróides. Assim, após difusão através da membrana celular, a SaG liga-se a um receptor esteróide presente no citoplasma e promove uma transformação conformacional do receptor, de modo que um complexo nuclear de afinidade elevada é distribuído para um sítio de resposta no complexo proteína DNA nuclear. Aí, intensifica a transcrição de mRNA que migra do núcleo para os ribossomas, resultando em produção acrescida de receptores muscarínicos.

Uma segunda possibilidade é que a SaG seja um agonista de um receptor conhecido, cuja acção causa um aumento da expressão de mRNA por ligação ao complexo proteína DNA no núcleo e actuação como promotor.

Em qualquer um dos casos, a ligação do complexo SaG-receptor a DNA pode provocar um aumento da expressão de mRNA que codifica para receptores colinérgicos, receptores dopaminérgicos ou receptores adrenérgicos ou outros receptores ligados a membranas.

Alternativamente, a ligação do complexo SaG receptor ao DNA pode provocar um aumento da produção de proteínas ligadas, como proteína G, ou impedir a sua degradação, ou posteriormente a ligação entre essas proteínas e receptores associados, desse modo causando alterações secundárias do número de receptores.

Os efeitos da SaG podem ser mediados por aumentos dos níveis de um ou mais factores neurotróficos, por exemplo, factor de crescimento do nervo (NGF). 14

Também é reconhecido que, para além dos mecanismos neuronais e sinápticos mediados de forma colinérgica, seja possível que substâncias tais como óxido nítrico (NO) e agonistas não colinérgicos possam exercer um efeito modulador na transmissão colinérgica.

Qualquer que seja a natureza precisa do componente celular ao qual se liga a SaG de modo a exercer o seu efeito, isto proporciona uma nova via para a qual podem ser dirigidos tratamentos potenciais para AD/SDAT, AAMI e afins.

Foi mostrado que a SaG aumenta os níveis de mRNA de receptores ligados a membranas, especificamente mRNA de receptores mi. Em consequência, é possível que o receptor ou promotor citosólico ou nuclear, quando activado, aumente a produção de moléculas de mRNA no tecido, órgão, tipo de célula ou organelo que codificam para receptores ligados a membranas, ou que diminua a destruição de moléculas de mRNA no tecido, órgão, tipo de célula ou organelo que codificam para receptores ligados a membranas. 0 receptor citosólico ou nuclear, quando activado, também pode aumentar a transcrição de moléculas de mRNA no tecido, órgão, tipo de célula ou organelo que codificam para receptores ligados a membranas.

Como mencionado acima, receptores nicotínicos podem modular o número e/ou renovação de receptores ligados a membranas. Em conformidade, num exemplo deste processo, a acção do receptor citosólico ou nuclear pode ser modulada por administração de uma substância que é pelo menos um agonista parcial de receptores nicotínicos. 15

Presentemente considera-se que a acção do receptor citosólico ou nuclear pode ser modulada por administração, de acordo com o tratamento disponibilizado pela presente invenção, de uma substância que é pelo menos um seu agonista parcial. 0 receptor pode estar localizado no citosol das células do tecido, órgão, tipo de células ou organelo e, quando activado por ligação a um agonista, migra para o núcleo das células. Também é possível que o receptor esteja localizado no núcleo das células do tecido, órgão, tipo de células ou organelo, em que o agonista é difundido para o núcleo ou é para aí transportado por outro mecanismo.

No tratamento disponibilizado pela presente invenção, não é essencial que uma substância administrada actue directamente no próprio receptor citosólico ou nuclear. Ao invés, a acção pode ocorrer a montante ou a jusante do envolvimento do receptor ou promotor citosólico ou nuclear na via. Assim, a acção do receptor citosólico ou nuclear pode ser modulada administrando uma substância que aumenta a expressão das moléculas de mRNA no tecido, órgão, tipo de célula ou organelo que codificam para receptores ligados a membranas. 0 papel do estrogénio e outros compostos relacionados como possíveis tratamentos para SDAT tem recebido um interesse considerável. Nos estudos conduzidos para observar os efeitos de um inibidor da colinesterase, tacrina, na função cognitiva em pacientes com SDAT, uma análise secundária sugeriu que todas as melhorias eram observadas em pacientes femininos que também estavam a receber terapia de substituição hormonal (estrogénio) 16 (ERT). Dados epidemiológicos também sugerem que a ERT pode proteger contra o desenvolvimento de SDAT. Existem trabalhos extensos praticados no rato sugerindo que a ovariectomia resulta em função cognitiva reduzida e que este efeito pode ser invertido, pelo menos em parte, pela administração de estrogénio. Os efeitos do estrogénio neste modelo podem consistir em aumentar a captação de colina de afinidade elevada em certas áreas do cérebro, particularmente o hipocampo, desse modo melhorando a transmissão colinérgica. No mesmo modelo, verificou-se que a administração de estrogénio aumenta os níveis de mRNA para o factor neurotrópico derivado do cérebro (BDNF) utilizando técnicas adequadas de hibridização in situ (Singh 1995).

Investigaram-se possíveis mecanismos por detrás dos efeitos do estrogénio em experiências in vitro. Estes estudos foram conduzidos utilizando uma linha de células de neuroblastoma e a resposta das células à privação de soro ou os efeitos de fracções de beta amilóide (BA) . Pensa-se que este último estímulo é particularmente relevante devido à predominância de placas amilóides nas fases tardias da SDAT. Tanto a privação de soro como BA induzem morte celular. Verificou-se que ο 17-β estradiol protege de morte celular induzida por privação de soro e BA. 0 efeito protector não foi abolido quando ο 17-β estradiol foi testado na presença do antagonista de estrogénio tamoxifeno. 0 enantiómero não estrogénico, 17-a estradiol, foi eficaz na inibição da morte celular. Trabalhos subsequentes sugeriram que os efeitos protectores destes compostos dependem da presença de um anel A fenólico completamente dessaturado e de um grupo hidroxilo não 17 bloqueado na posição três (Simpkins 1997; Green 1997). Em culturas de células de neuroblastoma, verificou-se que compostos estrogénicos aumentam a libertação do factor de crescimento do nervo. A relevância destas descobertas para os efeitos do estrogénio em SDAT permanece obscura.

Foram publicadas candidaturas de patentes que reivindicam a utilidade, no tratamento de doenças, de algumas sapogeninas esteróides possuindo estruturas de espirostano, furo-espirostano, espirosolano ou solanidina. Duas publicações de patentes são aqui particularmente relevantes: a Candidatura de Patente Chinesa N° CN1096031A revela efeitos reguladores de duas vias da sapogenina espirostano, sarsasapogenina, em receptores β-adrenérgicos e M-colinérgicos. No entanto, a revelação neste documento é breve. 0 outro documento relevante é a publicação de patente DE 4303214A1, que reivindica a utilização de uma gama muito ampla de saponinas e sapogeninas no tratamento de toda uma gama de doenças que os inventores consideram ser de origem virai. Todavia, esta revelação tem valor duvidoso, pois é amplamente reconhecido que não há nenhum elemento infeccioso de um número muito grande de estados caracterizados por transmissão sináptica deficiente; assim, a premissa básica da alegada invenção é imperfeita. Adicionalmente, não apresentam dados de nenhum tipo que permitam ao experimentado na área conseguir seleccionar um composto preferido do grande número que é reivindicado.

Ao identificar compostos que pudessem ter aplicação no tratamento de SDAT e outras doenças caracterizadas por redução do número de receptores ou transmissões sinápticas, os inventores tomaram em consideração a necessidade de identificar compostos que tivessem o efeito desejado mas 18 que não tivessem nenhuns efeitos estrogénicos, pois estes seriam inaceitáveis, particularmente em pacientes masculinos. Alguns dos compostos reivindicados como sendo activos na candidatura de patente DE 4303214A1 têm actividade estrogénica acentuada e, em consequência, são inaceitáveis. Estes dados estão resumidos abaixo na Tabela 1.

Tabela 1 Efeitos estrogénicos de compostos de sapogeninas esteróides e triterpenóides seleccionados

Composto Actividade Estrogénica Diosgenina Positiva Anzurogenina D Negativa Ruscogenina Positiva Sarsasapogenina Negativa Tigogenina Negativa Astragalósido Negativa Esmilagenina Negativa

Adicionalmente, estes compostos foram testados noutros receptores esteróides, pois considerou-se que compostos com aplicação clinica não devem exercer efeitos nos outros receptores esteróides. Verificou-se que nenhum dos compostos exibiu qualquer actividade em nenhum dos seguintes receptores:

Progesterona

Glucocorticóide

Testosterona 19

Assim, os compostos que se verificou não terem actividade no receptor de estrogénio também foram inactivos nos outros receptores esteróides importantes.

Os compostos seleccionados também foram testados quanto à sua actividade em alguns ensaios in vitro. Os ensaios/ experiências que foram considerados de importância chave para determinar uma possível actividade no aumento do número de receptores ligados a membranas foram os seguintes: 1. Células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectadas com um fragmento de DNA que codifica para um receptor muscarínico. A linha celular utilizada para a maior parte das experiências foi uma linha celular que expressa o receptor m2. 2. Investigaram-se os efeitos da expressão de receptores muscarínicos em linhas de células cultivadas de origem neuronal. 3. Obtiveram-se células cultivadas do músculo cardíaco de ratos Sprague Dawley neonatais. As células do músculo cardíaco expressam receptores muscarínicos, tipicamente m2. 0 nível destes receptores decai por cultura prolongada, tendo-se investigado os efeitos de compostos de interesse na prevenção do decaimento do número de receptores.

Descrevem-se agora, por sua vez, os métodos e os resultados destas experiências.

1 Experiências com a linha de células CHO 20

Investigaram-se os efeitos de vários compostos sobre a expressão de receptores m2 em células CHO transfectadas com DNA para o receptor m2. Avaliou-se o número de receptores utilizando ligação de QNB tritiado e subtraindo a ligação inespecifica. Os compostos foram dissolvidos em DMSO e utilizou-se DMSO como controlo. Testaram-se os compostos numa gama de concentrações finais. Os compostos também foram testados na presença e ausência de tamoxifeno, para tentar distinguir um mecanismo mediado por receptores de estrogénio. Os resultados estão resumidos na tabela 2 abaixo.

Tabela 2 Efeitos de compostos sobre a expressão de receptores m2 em células CHO

Composto Concentração molar do composto Efeito sobre a expressão de receptores - dado como % de aumento em comparação com o controlo (valores negativos entre parênteses) Sarsasapogenina 1CT5 34 1CT6 (14) Anzurogenina D 1CT5 22 icrb (26) Sisalagenina 1CT5 NS 1CT6 NS Esmilagenina 10“5 57 1(T6 18 Diosgenina ΚΓ5 NS 1(T6 NS Ruscogenina ícr5 (22) 1(T6 NS Tigogenina 1(T5 NS 1(T6 NS NS = Sem efeito significativo

Assim, as experiências indicam que vários dos compostos foram capazes de aumentar o número de receptores muscarinicos expressos na superfície de células CHO cultivadas in vitro. O efeito não foi antagonizado pelo 21 tamoxifeno, indicando que o mecanismo envolvido não envolveu o receptor de estrogénio. Ao contrário do trabalho publicado por Simpkin et al., verificou-se não ser necessário um anel A de fenol intacto. Igualmente, alguns compostos que são sapogeninas esteróides não exibiram actividade. Suplementarmente, experiências adicionais indicaram que o β-estradiol exerceu um efeito semelhante no aumento da expressão dos receptores quando administrado a uma concentração de 1CT1 2 3 M. 2 Efeitos de compostos sobre a sobrevivência celular

Utilizaram-se outros ensaios in vitro para distinguir entre compostos activos e não activos. Em particular, várias linhas de células de neuroblastoma, incluindo células SKN-SN e SH-SY5Y, bem como linhas de células de feocromocitoma, foram cultivadas in vitro na presença de fragmentos β-amilóides ou depleção de soro. Investigaram-se algumas técnicas para demonstrar a eficácia dos compostos na protecção das células cultivadas. Estas técnicas incluíram exclusão com azul de Tripano, quimioluminescência e libertação de lactato desidrogenase. Foi muito interessante a observação de que a incubação de células, em particular células PC12, com β-amilóide reduziu o número de receptores muscarínicos medido utilizando técnicas de ligação de ligandos etiquetados de forma radioactiva. Verificou-se que esta redução do número de receptores era melhorada pelos compostos activos. 1

Efeitos de compostos em células cultivadas do músculo 2 cardíaco 3

Isolaram-se células do músculo cardíaco do músculo ventricular de ratos Sprague Dawley neonatais utilizando 22 técnicas comuns. Cultivaram-se as células in vitro e estimou-se o número de receptores muscarinicos expressos em fragmentos de membranas de superfícies celulares após homogeneização das células recolhidas em vários instantes utilizando ligação específica de QNB tritiado. Experiências preliminares demonstraram que o número de receptores expressos tendeu a diminuir após 10 dias de cultura. Em consequência, as experiências foram concebidas para investigar os efeitos dos vários compostos na inibição deste decréscimo do número de receptores.

Os resultados destas experiências estão resumidos na Tabela 3.

Tabela 3 Efeitos de vários compostos sobre a expressão de receptores muscarinicos em células cultivadas do músculo cardíaco

Composto Concentração de composto que causa um aumento significativo do número de receptores expressos em músculo cardiaco neonatal após cultura in vitro durante 10 dias Diosgenina NS Anzurogenina D 10"6 M Ruscogenina NS Sarsasapogenina 10"5 M Tigogenina NS Astragalósido 10"5 M Esmilagenina 10"6 M NS = Sem efeito significativo

Surpreendentemente, os inventores descobriram que as sapogeninas estão preferencialmente concentradas nos núcleos de células cultivadas in vitro. Isto é surpreendente porque, como discutido acima, a sarsasapogenina (SaG) e alguns outros compostos que se verificou aumentarem o número de receptores muscarinicos não se ligam a receptores esteróides conhecidos. 23

Adicionalmente, é surpreendente que a SaG seja preferencialmente captada para o núcleo, porque os efeitos destes compostos podem ser observados em sistemas de ensaio in vitro que expressam o receptor muscarinico mas em que o DNA para o receptor foi transfectado para o citoplasma e, assim, não fica sujeito ao mecanismo de controlo nuclear normal.

Verificou-se que nenhum entre a SaG e os outros compostos que foram testados e que demonstraram regular positivamente os níveis de receptores se liga directamente a nenhuma das grandes classes conhecidas de receptores ligados a membranas. Assim, pode postular-se não ser provável que os efeitos observados se devam, por exemplo, a um efeito no receptor nicotínico e a um aumento consequente do número de receptores muscarínicos. Esta explicação parece ser ainda menos plausível (apesar de não poder ser excluída) se tomarmos em consideração que os inventores também mostraram que alguns dos compostos aumentam o número de receptores beta adrenérgicos expressos em linfócitos do sangue periférico. Em consequência, o mecanismo parece ter um efeito mais geral na regulação de receptores ligados a membranas.

Especula-se aqui que o efeito dos compostos activos reivindicados nesta patente pode operar através de um efeito sobre a proteína G e que os efeitos sobre o número de receptores são secundários relativamente a um efeito sobre a proteína G. Quando um receptor ligado à proteína G ligada a membranas é estimulado, são iniciados dois conjuntos básicos de acontecimentos: a resposta efectora e a interiorização do receptor. 0 processamento subsequente do receptor para o estado em que está novamente numa forma 24 na superfície celular ou outra superfície membranar, onde pode interagir com outro ligando do receptor, parece depender de alguns factores. Alguns destes factores ou mecanismos parecem estar ligados à proteína G. Há evidências de que a activação de receptores irp pode ter um efeito na expressão ou níveis da proteína G. Especula-se que as acções dos compostos descritos nesta patente possam dever-se a uma interacção nos processos de regeneração de receptores, ligação da proteína G ou homeostasia da proteína G.

Uma hipótese alternativa é que os compostos estejam a aumentar a síntese ou libertação ou uma velocidade decrescida de degradação de factores neurotrópicos, como factor de crescimento derivado do cérebro e/ou factor de crescimento do nervo. Estes efeitos sobre factores de crescimento podem dever-se a um efeito do composto num receptor citosólico ou nuclear, ou à ligação de um composto a uma região promotora, com um efeito consequente directamente na velocidade de produção de mRNA para o factor de crescimento, ou em consequência do aumento da produção de outro factor material, como proteína G, ou, por fim, os efeitos podem ser secundários relativamente a um efeito sobre o processamento do receptor ou proteína G. A expressão acrescida e/ou processamento anormal da proteína precursora de amilóide (APP) estão associados à formação de placas amilóides e depósitos amilóides cerebrovasculares, que são as grandes características morfológicas distintivas de doença de Alzheimer. Têm particular interesse os processos que regulam a clivagem proteolitica da APP em fragmentos amiloidogénicos e não amiloidogénicos. A clivagem da APP pela enzima β-secretase 25 na sequência β-amilóide da proteína resulta na formação de um fragmento C-Terminal não amiloidogénico e no fragmento APPs solúvel; verificou-se que este último fragmento tem actividade neurotrópica e neuroprotectora, bem como intensifica a memória em ratinhos quando injectado intracerebro-ventricularmente (ICV). Em contraste, o processamento da APP pela β-secretase expõe o terminal N da β-amilóide, que é libertado por clivagem por γ-secretase no terminal C variável. Verificou-se que os péptidos β-amilóides resultantes, que têm 39-43 aminoácidos, são neurotóxicos e acumulam-se em placas que interferem com conexões inter-neurónios.

Alguns estudos mostraram que a estimulação de receptores muscarínicos Mi e M3 ligados à proteína quinase (PKC) resulta num aumento da actividade da α-secretase. Em consequência, o processamento da APP em APPsa, com os seus efeitos neuroprotectores, é aumentado. Em paralelo, o processamento da APP por β- e γ-secretase diminui e ocorre uma redução consequente de β-amilóide. Outros transmissores, como factor de crescimento do nervo (NGF) e factor neurotrópico derivado do cérebro (BDNF), bem como bradiquinina e vasopressina, podem exercer efeitos semelhantes no aumento da proporção de APP processada em APPsa. Pode haver alguns factores envolvidos nos efeitos do NGF, que podem incluir ligação do factor ao receptor da tirosina quinase (TrkA) e a estimulação de fosfolipase Cy, com fosforilação e activação subsequentes da proteína quinase C (PKC) e aumento da actividade relativa da a-secretase. 26

Em consequência, pode esperar-se que qualquer tratamento que aumente selectivamente a actividade da proteína quinase C no cérebro seja útil na gestão de doença de Alzheimer. Até há pouco tempo não estavam disponíveis agonistas selectivos no receptor Mi. Seria de esperar que agonistas não selectivos estimulassem receptores M2 pré-sinápticos, que causam uma realimentação negativa e, assim, enfraquecessem ainda mais, de forma grave, a transmissão muscarínica. Estão agora a ser disponibilizados agonistas selectivos no receptor Mi (talsaclidina), e esses agentes estão a ser investigados para o tratamento de AD. Contudo, há um risco substancial de que, tal como com a administração crónica de qualquer agonista de receptores, os benefícios clínicos observados sejam extensamente limitados em termos da dimensão do benefício, ao reduzir o número de receptores ou reduzir a sensibilidade, e em termos de efeitos secundários, devido à ausência de especificidade para receptores. Assim, será de esperar que compostos como descritos nesta invenção, que aumentam selectivamente o número de receptores muscarínicos Mi, com pouco ou nenhum efeito sobre o número de receptores muscarínicos M2, no cérebro não tenham os problemas observados com um agonista muscarínico e, em consequência, que tenham utilidade particular. De facto, os benefícios podem ser observados em três partes, do modo seguinte. 1. Um aumento selectivo do número de receptores Mi conducente a transmissão sináptica acrescida. A administração crónica de um agonista selectivo não terá, no melhor dos casos, nenhum efeito adverso sobre a transmissão; 27 2. De forma secundária ao número acrescido de receptores, um aumento da estimulação de PKC, com um aumento consequente da actividade da α-secretase, conducente a: 2.1 Uma produção reduzida de β-amilóide e uma redução consequente da formação de placas e perda neuronal; 2.2 Um aumento da APPsa e melhoria consequente da função cerebral, como testemunhado por uma melhoria da memória de curto e longo prazo.

Por fim, os efeitos do sistema GABA na modulação da transmissão foram discutidos acima. É bem conhecido que há um sitio de ligação de esteróides no receptor do GABA que é distinto dos sítios de ligação da benzodiazepina, cloreto e GABA. Conhecem-se alguns compostos terapêuticos que se ligam a este sítio e que têm sido utilizados para intensificar ou reduzir o nível de consciência. Especula-se que a administração crónica de um agonista parcial neste sítio poderá conduzir a um reforço da transmissão. A invenção será agora suplementarmente descrita no exemplo seguinte.

Exemplo - Investigação dos níveis de mRNA utilizando hibridização in situ

Ratos SD machos de linhagem pura com 20 meses de idade foram divididos aleatoriamente em 2 grupos. Um grupo recebeu uma média de 3 mg de sarsasapogenina por rato por dia misturados na ração diária. O grupo de controlo recebeu ração normal e água. Quatro meses mais tarde, os seus cérebros foram utilizados em experiências com a técnica de 28 hibridização, com ratos de 4 até 6 meses de idade utilizados como grupo mais jovem de controlo. Outras combinações de alimentação para cada grupo foram completamente idênticas.

Sintetizou-se uma cadeia de cDNA que corresponde, respectivamente, ao mRNA de mi e m2. A sequência de mi corresponde à sequência de 3-18 aminoácidos da proteína receptora, isto é, TGG TGC CAA GAC AGT GAT GTT GGG ACT GAC AGC AGG GGG CAC TGA GGT, e M2 à sequência de 1-16 aminoácidos, isto é, ATG AAT AAC TCA ACA AAC TCC TCG AAC AAT GGC TTG GCT ATT ACC AGT. O cDNA foi etiquetado utilizando um estojo de reagente de etiqueta 3'-terminal com a-35S-dATP (8,9 TBq/mmol) como material de etiquetagem. Depois da reacção ter terminado, foi purificado com uma coluna de nucleótidos. Estimou-se a actividade específica do lote (16,67-33,34) χ 108 MBq^g. A a-35S-dATP, o estojo de reagente de etiqueta 3'-terminal e a coluna de nucleótidos foram adquiridos à Du Pont Co., E.U.A.

Obteve-se um rato de cada grupo de cada vez e efectuaram-se experiências em paralelo. Os ratos foram decapitados e os seus cérebros foram removidos intactos. Prepararam-se tiras coronais de 15 μιη de espessura num criomicrótomo constantemente congelado (criomicrótomo AS-600, Anglia Scientific Co, R.U.). As tiras foram recolhidas de diferentes áreas (sítios idênticos de cada rato) e foram montadas em lamelas untadas com polilisina, foram secas numa corrente de ar frio, fixadas numa solução de paraformaldeído a 4% (contendo 1 χ solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,0) durante 5 minutos antes de serem lavadas duas vezes em PBS. Em seguida, foram colocadas em solução de anidrido acético a 0,25% (contendo cloridrato de 29 trietanolamina 0,1 Μ, pH 8,0, e cloreto de sódio 0,9%) durante 10 minutos, foram desidratadas em álcool etílico a 70%, 80%, 95% e 100% durante 1 minuto, desengorduradas em clorofórmio durante 5 minutos e, por fim, tratadas em álcool etílico a 100% e 95% durante 1 minuto sucessivamente.

As tiras utilizadas como controlos negativos foram recolhidas e desidratadas em álcool etílico, etc., como pormenorizado acima, mas foram logo tratadas em 100 mg ml de RNase e 2 χ solução de SSC (solução de sal/citrato de sódio contendo 300 mmol/1 de cloreto de sódio e 45 mmol/1 de citrato de sódio) a durante 2 horas a 37 °C.

Para a hibridização, a matriz de fluido para a hibridização foi composta com formamida desionizada 50% de fresco, 4 χ SSC, sulfato de dextrano 10%, 250 μρ/μΐ de tRNA de levedura, 5 χ solução de Denhardt, 500 μρ/ιηΐ de DNA de protamina de desnaturação, 10 mmol/1 de ditiotreitol. A sonda oligonucleotídica [(16,67-33,34) χ 10 MBq/50 μΐ] etiquetada com 35S foi finalmente adicionada e misturada uniformemente. Gotejaram-se em cada tira 50 μΐ da matriz e um vidro de cobertura de silicato foi colocado levemente por cima, evitando bolhas de ar. Em seguida, as tiras foram armazenadas numa caixa de hibridização com 2 χ SSC na base, para conservar a humidade, e foram incubadas a 37 °C durante 18 até 24 horas.

Após a hibridização, as lamelas foram embebidas em 1 χ solução de SSC e foram agitadas ligeiramente para enxaguar o vidro de cobertura. Foram lavadas brevemente em 1 χ solução de SSC, depois foram submetidas a vibração suave em 30 2 χ SSC contendo formamida 50%, a 37 °C durante 20 minutos, com a solução mudada quatro vezes, e depois foram transferidas para 1 χ solução de SSC, para vibração à temperatura laboratorial durante 30 minutos (repetido duas vezes) . Por fim, as lamelas foram lavadas com água duplamente destilada, foram desidratadas com álcool etilico a 70%, depois a 95%, e foram secas ao ar.

Prepararam-se autorradiografias numa sala escura, em que o espécime e o Hyperfilm beta max foram comprimidos em conjunto, utilizando o método de contacto, e foram colocados numa cassete com um exsicador, expostos a 4 °C durante 2 até 3 semanas. Foram desenvolvidos (D196) e fixados (F5). Por fim, analisaram-se as autorradiografias utilizando um analisador de imagens computorizado (analisador de imagens VIDAS, Kontron, Alemanha). A sonda de 1¾ não conseguiu mostrar nenhuma área localizada de actividade. A sonda de mi exibiu actividade no núcleo dentado, córtex cerebral e corpo estriado. Mostra-se na Figura 4 a comparação destas três áreas para os diferentes grupos de animais.

Tabela 4

Comparação Área Idosos versus jovens SaG versus Idosos Córtex -5,14+2,68 (23) 5,77+3,82 (20) Hipocampo -3,18+2,87 (12) 0,96+4,26 (10) Corpo estriado -12,2+3,6* 15,71+3,27* (10) As médias positivas aumentaram em comparaçao com 0 comparador. * p<0,01. Números entre parênteses = números de tiras

Ocorreu uma redução significativa da expressão de mRNA para receptores 1¾ no corpo estriado de ratos idosos, em comparação com controlos jovens. A administração de SaG resultou num aumento significativo de mRNA do receptor 1¾ 31 nas mesmas áreas do cérebro para as quais animais tratados foram comparados com controlos idosos não tratados.

Lisboa, 30 de Outubro de 2006

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de esmilagenina como agente activo na preparação de uma composição para o tratamento de disfunção cognitiva num humano ou animal não humano.

2. Utilização como reivindicada na Reivindicação 1 em que se utilizam pelo menos dois agentes activos, compreendendo esmilagenina e sarsasapogenina.

3. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o animal é um humano que sofre de doença de Alzheimer ou SDAT.

4. Utilização como reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que o animal é um humano que sofre de doença de Parkinson.

5. Utilização como reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que o animal é um humano que sofre de demência de corpos de Lewi.

6. Utilização como reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que o animal é um humano que sofre de hipotensão postural.

7. Utilização como reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que o animal é um humano que sofre de autismo.

8. Utilização como reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que o animal é um humano que sofre da síndroma da fadiga crónica. 2

9. Utilização como reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que o animal é um humano que sofre de Miastenia Gravis.

10. Utilização como reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que o animal é um humano que sofre de doença de Lambert Eaton.

11. Utilização como reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que o animal é um humano que sofre da Síndroma da Guerra do Golfo.

12. Utilização como reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que o animal é um humano que sofre de exposição ocupacional a compostos organofosforados.

13. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o animal é um humano de idade avançada. Lisboa, 30 de Outubro de 2006