TWI422378B - 使用薯蕷皂素來改善與停經期症候群有關聯的認知缺陷 - Google Patents

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Description

使用薯蕷皂素來改善與停經期症候群有關聯的認知缺陷
本發明是有關於使用薯蕷皂素來改善與停經期症候群(menopausal syndrome)有關聯的認知缺陷(cognitive deficit)(諸如學習、辨識以及記憶能力的下降)。
停經期(menopause)與女性體內循環的性激素(circulating sexual hormones)的快速減少有關聯，並且意指女性的卵巢功能(ovarian function)逐漸衰退，最終導致月經終止(cessation of menstruation)的過渡期，而停經後期(postmenopause)則意指女性的卵巢功能在完全喪失之後的時期。停經期或停經後期的女性通常會出現停經期症候群(menopausal syndrome)，而停經期症候群的症狀主要可區分成下列3大類：(1)生理症狀(physiological symptom)，諸如熱潮紅(hot flushes)、陰道乾燥(vaginal dryness)、疲勞(fatigue)、頭痛(headaches)、體重增加(weight gain)、皮膚老化(skin aging)以及骨質疏鬆症(osteoporosis)；(2)心理症狀(psychological symptom)，諸如焦慮(anxiety)以及憂鬱(depression)；以及(3)認知缺陷(cognitive deficit)，諸如精神錯亂(mental confusion)、記憶能力(memory ability)下降、學習能力(learning ability)下降、辨識能力(recognition ability)下降以及無法應對(inability to cope)。
目前在停經期症候群的治療上大多是使用激素替代療法(hormone replacement treatment,HRT)，藉由投藥含有一或多種性激素的醫藥品給停經期或停經後期的女性來補充她們體內不足的性激素。然而，性激素的長期投藥或過量使用可能會導致乳癌。相較於性激素，植物雌激素(phytoestrogens)[諸如異黃酮(isoflavone)]更為安全並且具有相似於人類雌激素(human estrogen)的效用，因而是一供用於HRT的更佳選擇。
山藥(dioscorea)是一種常見的食物，它因為富含植物類固醇(phytosteroids)而長期被使用做為中草藥，用以改善胃腸(gastrointestinal)、感覺(sensory)以及與性有關的功能(sexual-related functions)，同時亦可改善停經後期的女性(postmenopausal women)的熱潮紅以及頻尿(frequent urination)。另外，山藥亦被證實具有抗骨質疏鬆(anti-osteoporotic)、抗糖尿病(anti-diabetic)以及抗高膽固醇血症(anti-hypercholesterolemia)的活性。
在Y.J. Hoet al .(2007),Annals of General Psychiatry ,6:21-28中，Y.J. Ho等人主要是探討山藥對於卵巢切除(OVX)的大鼠[ovariectomized(OVX) rats]的情緒行為(emotional behavior)以及腦中的IL-2位準的影響。實驗結果顯示，藉由山藥治療可以回復OVX-誘發的焦慮(OVX-induced anxiety)以及在免疫神經功能(neuroimmunological function)上的變化。
薯蕷皂素(diosgenin)是山藥中主要的類固醇皂素(steroidal sapogenin)，它在化學結構上與性激素相似，因此已被廣泛地使用做為類固醇激素(steroidal hormones)[諸如助孕酮(progesterone)、雌激素(estrogen)、睪固酮(testosterone)以及可體松(cortisone)]的前驅物(precursor)，它可以藉由活體外化學修飾(in vitro chemical modification)而被製造成類固醇激素。
近年來，有關於利用薯蕷皂素來治療停經期症候群開始受到關注。例如，在K. Higdonet al .(2001),Biomed Sci Instrum .,37:281-286中，K. Higdon等人在卵巢切除(OVX)的大鼠中誘發骨質疏鬆症，繼而在骨質疏鬆症的臨床徵兆(clinical signs)出現之後以薯蕷皂素(diosgenin,DG)、去氫表雄脂酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)或雌激素(estrogen,E)的持續遞送(sustained delivery)來進行治療。實驗結果顯示，在OVX之後的骨質流失(bone loss)可藉由補充以持續位準(sustained levels)的DG、DHEA以及E而被顯著地降低，並且不會危害其他的身體器官。
在Y. Tadaet al .(2009),Steroids ,74:504-511中，Y. Tada等人研究薯蕷皂素在對抗停經期之時的皮膚老化(skin aging)上的安全性以及效力(efficacy)。實驗結果顯示：薯蕷皂素的投藥會回復在老化的皮膚中的角質細胞增生(keratinocyte proliferation)，因而可以改善在卵巢切除的小鼠(一種停經期的模型)中的表皮厚度(epidermal thickness)，但是不會改變脂肪累積的程度(degree of fat accumulation)。此外，薯蕷皂素亦不會加速乳癌負擔的小鼠(breast cancer-burdened mice)的腫瘤生長。根據這些發現，薯蕷皂素被預期具有可用於緩解一與停經期症候群有關聯的症狀的潛力。
經研究，申請人意外地發現：薯蕷皂素具有改善與停經期症候群有關聯的認知缺陷(諸如記憶、學習以及辨識能力的下降)的效用。
 發明概要
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於改善一具有心理症狀之停經期或停經後期女性的學習能力的組成物，其包含有一有效量之薯蕷皂素。
在第二個方面，本發明提供一種用於改善一停經期或停經後期女性的辨識和/或記憶能力的組成物，其包含有一有效量之薯蕷皂素。
在第三個方面，本發明提供一種用於改善一具有心理症狀之停經期或停經後期女性的學習能力的方法，其包括對該停經期或停經後期女性投予(administering)一有效量之薯蕷皂素。
在第四個方面，本發明提供一種用於改善一停經期或停經後期女性的辨識和/或記憶能力的方法，其包括對該停經期或停經後期女性投予一有效量之薯蕷皂素。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。
如本文中所用的，術語“停經期(menopause)”意指處於卵巢功能(ovarian function)開始衰退與月經終止(cessation of menstruation)之間的時期。術語“停經後期(postmenopause)”意指在女性的卵巢功能已完全喪失之後的時期。
如本文中所用的，術語“停經期症候群(menopausal syndrome)”意指發生於停經期或停經後期的女性個體中的症狀，這包括，但不限於：(1)生理症狀(physiological symptom)，諸如熱潮紅(hot flushes)、陰道乾燥(vaginal dryness)、疲勞(fatigue)、頭痛(headaches)、體重增加(weight gain)、皮膚老化(skin aging)以及骨質疏鬆症(osteoporosis)；(2)心理症狀(psychological symptom)，諸如焦慮(anxiety)以及憂鬱(depression)；以及(3)認知缺陷(cognitive deficit)，諸如精神錯亂(mental confusion)、記憶能力(memory ability)下降、學習能力(learning ability)下降、辨識能力(recognition ability)下降以及無法應對(inability to cope)。
如此處所用的，術語“有效量(effective amount)”意指當一種依據本發明之含有薯蕷皂素的組成物被投予一需要該組成物來治療的個體時，一足以提供所欲達致之治療功效且不會對非標的組織或器官產生非所欲的嚴重危害的用量。該有效量會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。此一有效量可為熟習此技藝之人士來決定。如本文中所用的，“有效量”此術語可與“有效劑量(effective dose)”、“治療有效量(therapeutically effective amount)”和“治療有效劑量(therapeutically effective dose)”交換使用。
處於停經期或停經後期的女性通常會因為蒙受停經期症候群而嚴重影響她們的健康以及日常生活作息。此外，個體的差異會使得這些女性在症狀(symptom)以及病況(condition)程度上會有所不同。近年來，已有許多針對停經期症候群的藥物被廣泛地研究，但是目前臨床上所使用的藥物仍無法有效地改善所有與停經期或停經後期有關聯的症狀。因此，當今醫藥界皆致力於針對個體的差異以及各種與停經期症候群有關聯的症狀來開發有用的藥物以供治療或改善的目的。
目前已知薯蕷皂素具有改善停經期所誘發的骨質疏鬆症以及回復在老化的皮膚中的角質細胞增生的效用。為了進一步探討薯蕷皂素在治療停經期症候群上的效用，申請人以卵巢切除(OVX)的大鼠[ovariectomized(OVX) rats]作為停經期或停經後期的動物模型並且藉由高架十字迷宮試驗(elevated plus-maze test)所測得的移動行為(locomotor behavior)而將牠們區分成具有或不具有焦慮症狀的OVX大鼠。之後，將薯蕷皂素分別餵食給具有以及不具有焦慮症狀的OVX大鼠，繼而藉由習得無助試驗(learned helplessness test)來評估這些大鼠的學習能力。經由實驗結果證實：薯蕷皂素可以顯著地改善具有焦慮症狀之卵巢切除的大鼠的學習能力。
基於上述，薯蕷皂素被預期具有可用於改善一具有心理症狀(特別是焦慮症狀)之停經期或停經後期女性的學習能力的高潛力。於是，本發明揭示薯蕷皂素供應用於製備一用來改善一具有心理症狀之停經期或停經後期女性的學習能力之醫藥品或食品產品的用途。
因此，本發明提供一種用於改善一具有心理症狀之停經期或停經後期女性的學習能力的組成物，其包含有一有效量的薯蕷皂素。
依據本發明，該停經期或停經後期女性具有焦慮症狀。
依據本發明，該薯蕷皂素的有效量是落在0.014 g/天至3.5 g/天之範圍內。在本發明的一個較佳具體例中，該薯蕷皂素的有效量是落在0.14 g/天至0.7 g/天之範圍內。
依據本發明，該組成物可被製造成有如一醫藥品的形式。該醫藥品可利用熟習此藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、局部地(topically)或口服地(orally)投藥的劑型，這包括，但不限於，注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)以及類似之物。
依據本發明的醫藥品可以一選自於下列所構成的群組中的非經腸道途徑來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)、舌下投藥(sublingual administration)以及穿皮投藥(transdermal administration)。
在本發明的一個較佳具體例中，該醫藥品被製成適於舌下投藥的劑型。在本發明的一個更佳具體例中，該醫藥品被製成適於穿皮投藥的劑型。
在本發明的另一個較佳具體例中，該醫藥品被製成適於口服投藥的劑型。
依據本發明，該醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。
依據本發明，該組成物可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時被添加，或是於食品的製作過程中被添加，而與任一種可食性材料被配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
依據本發明，該食品產品的種類包括，但不限於：奶粉(milk powder)、飲料(beverages)、甜點(confectionery)、糖果(candies)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、動物飼料(animal feeds)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。
本發明亦提供一種用於改善一具有心理症狀之停經期或停經後期女性的學習能力的方法，其包括對該停經期或停經後期女性投藥以一有效量的薯蕷皂素。
依據本發明，該停經期或停經後期女性具有焦慮症狀。
依據本發明，薯蕷皂素的每日有效劑量通常是0.2 mg/Kg體重至50 mg/Kg體重，呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被口服地投藥或非經腸道地投藥。在本發明的一個較佳具體例中，薯蕷皂素的每日有效劑量通常是2 mg/Kg體重至10 mg/Kg體重。
申請人進一步藉由物件辨識試驗(object recognition test)而發現到，薯蕷皂素的餵食可以改善卵巢切除的大鼠對於熟悉的舊物件的記憶能力以及對於新物件與舊物件之間的差異之辨識能力。於是，本發明亦揭示薯蕷皂素供應用於製備一用來改善一停經期或停經後期女性的辨識和/或記憶能力之醫藥品或食品產品的用途。
因此，本發明提供一種用於改善一停經期或停經後期女性的辨識和/或記憶能力的組成物，其包含有一有效量之薯蕷皂素。
依據本發明，該薯蕷皂素的有效量是落在0.07 g/天至7 g/天之範圍內。在本發明的一個較佳具體例中，該薯蕷皂素的有效量是落在0.7 g/天至1.4 g/天之範圍內。
依據本發明，該組成物可被製造成有如一醫藥品或食品產品的形式，而有關該醫藥品的投藥方式、劑型、可供使用之藥學上可接受的載劑以及該食品產品的製備方式與種類等是如上面所描述者。
本發明亦提供一種用於改善一停經期或停經後期女性的辨識和/或記憶能力的方法，其包括對該停經期或停經後期女性投藥以一有效量的薯蕷皂素。
依據本發明，薯蕷皂素的每日有效劑量通常是1 mg/Kg體重至100 mg/Kg體重，呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被口服地投藥或非經腸道地投藥。在本發明的一個較佳具體例中，薯蕷皂素的每日有效劑量通常是10 mg/Kg體重至20 mg/Kg體重。
 較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 實驗材料： 1.　實驗動物：
在下面實施例1中所使用的雌性Wistar大鼠(female Wistar rats)(8週大，體重約為264±2 g)是購自於國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center,R.O.C.)，而在下面實施例2中所使用的雌性Wistar大鼠(8週大，體重約為250±5 g)是購自於樂斯科生物科技股份有限公司(BioLasco Taiwan Co.,Ltd)。所有的實驗動物被飼養於一個光照與黑暗各為12小時(光線在早上7點開啟)、室溫維持在23±1℃以及相對濕度維持在55±5%的獨立空調的動物房內，而且水分與飼料被充分地供給。
在實驗開始之前，各個動物被安撫(handled)以減低動物對於實驗操作者以及實驗環境的壓力反應。在光線開啟的第2小時之後，動物被個別地放在一乾淨的籠子中並且被運送至一具有一照度(illumination)為28~30 lux的觀察室(observation room)中進行實驗，同時實驗操作者會離開該觀察室以避免在實驗期間與動物互動(interaction)。有關實驗動物的一切實驗程序是由中山醫學大學的動物管理委員會(Animal care Committee of Chung Shan Medical University)所認可，並依據美國國家衛生研究院(National Institutes of Health,NIH)的實驗動物飼養管理及使用規範(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)來進行。
2.　製備含有薯蕷皂素的食材(diosgenin-containing food materials)：
首先，依據要被投藥給大鼠的劑量(亦即，10、50或100 mg/kg/天)來分別計算出所需之薯蕷皂素(diosgenin)(購自於sigma,USA)的重量，繼而據此分別取既定重量(given weight)的薯蕷皂素來與1 g的土司(toast)或生麵糰(raw dough)[它是藉由將麵粉與水以一為2：1(wt/wt)的比例混合而被製成]相混合，而得到含有薯蕷皂素的食材。所形成的含有薯蕷皂素的食材被拿來餵食給實驗動物。
3.　高架十字迷宮(elevated plus-maze)：
在下面實施例1中所使用的高架十字迷宮的結構被顯示於圖1中。該高架十字迷宮是呈十字型地由2個對置的開放臂(opposed open arms) 11(50 cm×10 cm)、2個具有側壁(side wall)而不具有頂蓋(roof)之對置的封閉臂(enclosed arms) 12(50 cm×10 cm×40 cm)以及一位於中心的開放區域(open square) 13(10 cm×10 cm)所組成，並且以一為50 cm的距離而被設置在地板上方。另外，開放臂11以及封閉臂12分別以一虛擬線(virtual line) 14而被區分為一近半部(proximal half)(接近該開放區域13的部分)與一遠半部(distal half)(遠離該開放區域13的部分)。在各個實驗動物被測試之前，該高架十字迷宮以20%乙醇予以徹底地清洗，繼而予以徹底地乾燥。
4.　穿梭箱(shuttle box)：
在下面實施例1中所使用的穿梭箱是購自於AccuScan,USA，它是由2個相同的隔室(compartments)所組成，各個隔室具有一由不鏽鋼條(stainless steel bars)所製成的方格地板(grid floor)，並且藉由一具有一中央門(central door)的壁(wall)而被分隔。該中央門可被關閉以分隔該2個隔室，或者被開啟以容許實驗動物從所在的隔室中穿越至另一個隔室。該穿梭箱可藉由電腦控制來傳送制約刺激(conditioned stimuli,CS)[一由音調(tone)(75 db)以及光線(250 lux)所構成的刺激，歷時3秒]以及非制約刺激(unconditioned stimuli,UCS)[一腳電擊(electric foot shock)(0.5 mA)，歷時10秒]。在各個實驗動物被測試之前，該穿梭箱以20%乙醇予以徹底地清洗，繼而予以徹底地乾燥。
5.　開放空間箱(open box)：
在下面實施例2中所使用的開放空間箱(60 cm×60 cm×40 cm)的結構被顯示於圖2中。該開放空間箱是由黑色的聚乙烯塑膠(polyvinyl plastic)所製成，並且在該開放空間箱的底部的3個角落被放置有3個在大小、顏色、形狀以及材質上皆相同並且無特殊氣味的物件，它們分別被標示為A1、A2以及A3並且各自與該開放空間箱的角落C1、C2以及C3具有一為21 cm的距離(參見圖2A)，而角落C4沒有放置任何物件。另外，物件A3可被替代以1個在大小、顏色、形狀以及材質上皆不同於物件A3並且無特殊氣味的物件B(參見圖2B)。在實驗之前，所有物件對於實驗動物而言是不熟悉的。而在各個實驗動物被測試之前，該開放空間箱以及所有物件皆以20%乙醇予以徹底地清洗，繼而予以徹底地乾燥。
一般實驗方法： 1.　卵巢切除術(ovariectomy)：
有關卵巢切除術是參考Y.J. Hoet al .(2007)(同上述)當中所述的方法來進行，並作部分修改。簡言之，大鼠藉由克他明(ketamine)(100 mg/kg)或舒泰(zoletil)(2 mg/kg)的肌肉內注射(intramuscular injection)而被麻醉。接著，將大鼠的腰區域(lumbar region)的背側部分(dorsal part)進行剃毛(shaving)，然後以75%酒精予以消毒(disinfected)，繼而以10%聚維酮碘(povidone iodine)予以徹底地消毒。之後，使用手術刀(surgical knife)將皮膚層(skin)切開而使得在皮膚層下方的腹膜(peritoneum)被顯露出來，接著以該手術刀將腹膜切開以形成一長度約為1公分的切口(incision)，繼而將卵巢移除並使用一4-O消毒縫合線(sterile suture)來縫合傷口。
之後，各個大鼠立即被注射以盤尼西林-G普魯卡因(Penicillin-G procaine)(0.2 mL,20,000 IU)，並且傷口以10%聚維酮碘予以消毒，俾以減低術後感染(post-operative infection)的機會。接著，將各個經卵巢切除的大鼠(ovariectomized rats)單獨地放入塑膠籠(plastic cages)中飼養並讓牠們進行傷口癒合歷時大約5天，繼而將牠們隨機地分組並轉移至飼養籠(home cages)中。
實施例1.　薯蕷皂素對於具有焦慮症狀(anxiety symptom)之卵巢切除(OVX)的大鼠[ovariectomized(OVX)rats]的學習能力(learning ability)的影響 A、具有焦慮症狀之卵巢切除的大鼠的篩選： 實驗方法：
將雌性Wistar大鼠隨機地分成實驗組(n=74)以及假手術組(n=19)，其中實驗組大鼠是依照上面“一般實驗方法”的第1項「卵巢切除術」當中所述的方法來進行卵巢切除，而假手術組大鼠亦被拿來進行相同的實驗，不同之處在於：這些大鼠的卵巢沒有被移除。
在手術之後的第29天，各組大鼠被拿來進行下面的高架十字迷宮試驗(elevated plus-maze test)，俾以瞭解卵巢切除對於大鼠移動行為(locomotor behavior)的影響並藉此來判斷牠們是否具有焦慮症狀。
有關高架十字迷宮試驗是參考Y.J. Hoet al. (2007)(同上述)當中所述的方法來進行，並作部分修改。簡言之，將大鼠放在高架十字迷宮的開放區域13上並且面向2個開放臂11中之一者，然後觀察並記錄牠的行為歷時5分鐘。在試驗的期間，使用一被放置在高架十字迷宮上方的攝影機來監測並記錄大鼠的行為，藉此可得到下面的量測值：
(1)　開放臂時間(open arm time)：大鼠進入並停留在開放臂11上的時間；
(2)　封閉臂時間(enclosed arm time)：大鼠進入並停留在封閉臂12上的時間；
(3)　開放臂活動量(open arm activity)：大鼠穿越開放臂11的虛擬線14的次數；
(4)　封閉臂活動量(enclosed arm activity)：大鼠穿越封閉臂12的虛擬線14的次數；以及
(5)　總臂活動量(total arm activity)：開放臂活動量與封閉臂活動量的總合。
接著，將假手術組大鼠所測得的各項量測值進行統計運算，所得到的實驗數據是以平均值±SEM來表示。之後，以假手術組大鼠所測得的開放臂時間的平均值作為一基準值，當實驗組大鼠所測得的開放臂時間是低於該基準值時表示具有焦慮症狀，相反地，若是高於該基準值，表示不具有焦慮症狀。依據此方式，申請人進一步將實驗組的大鼠區分成具有或不具有焦慮症狀的OVX大鼠，繼而將具有或不具有焦慮症狀的OVX大鼠所測得的各項量測值分別進行統計運算，所得到的實驗數據亦以平均值±SEM來表示。
之後，各組所獲得的實驗數據藉由t-試驗(t-tests)來作分析，俾以評估具有或不具有焦慮症狀的OVX大鼠與假手術組大鼠之間的差異性，以及具有焦慮症狀的OVX大鼠與不具有焦慮症狀的OVX大鼠之間的差異性。若所得到的統計比對結果是p ＜0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。
結果：
下面表1顯示假手術組以及實驗組大鼠藉由高架十字迷宮試驗所測得的移動行為。從表1可見，相較於假手術組以及不具有焦慮症狀的OVX大鼠，具有焦慮症狀的OVX大鼠在開放臂時間與開放臂活動量上都有顯著的降低，而在封閉臂時間與封閉臂活動量上則有顯著的增加。另外，相較於假手術組的大鼠，不具有焦慮症狀的OVX大鼠在開放臂時間上有顯著的增加，而在封閉臂時間上則有顯著的降低。這個實驗結果顯示：卵巢切除會引起部分的大鼠出現焦慮症狀。
B、薯蕷皂素的餵食以及習得無助試驗(learned helplessness test)： 實驗方法：
在上面A項中從實驗組大鼠中所篩選出的具有以及不具有焦慮症狀的OVX大鼠分別被隨機地分成4組，其中包括1個對照組以及3個實驗組(亦即薯蕷皂素組1、2以及3)。薯蕷皂素組1、2以及3的OVX大鼠分別被餵食以在上面“實驗材料”的第2項「製備含有薯蕷皂素的食材」當中所製得的含有薯蕷皂素的土司(劑量分別為10、50以及100 mg/kg/天)，而對照組的OVX大鼠被餵食以不含有薯蕷皂素的土司。在連續餵食歷時23天之後，各組大鼠被拿來進行下面的習得無助試驗，俾以瞭解薯蕷皂素對於具有或不具有焦慮症狀的OVX大鼠在面對壓力時的學習能力(learning ability)的影響。
有關習得無助試驗是參考W.F. Wanget al. (2007),Chin. J. Physiol. ,50:63-68以及Y.T. Leeet al. (2008),Neuroreport ,19:1243-1247當中所述的方法來進行，並作部分修改。簡言之，令大鼠依照下列方式來進行實驗：
(1)　第1天期間(Day-1 session)，無法逃脫的腳電擊(inescapable foot shock)：將大鼠隨意地放在穿梭箱的2個隔室的任一者中，繼而容許大鼠透過開啟的中央門來探索該2個隔室歷時1分鐘。之後，中央門被關閉，大鼠被進行40次無法逃脫的CS-UCS配對(inescapable CS-UCS pairings)的測試(trials)，每一次的無法逃脫的CS-UCS配對測試是先進行1次CS，繼而為1次UCS，而各個無法逃脫的CS-UCS配對測試的平均間隔(mean interval)為60秒(範圍落在50至70秒)；以及
(2)　第2天期間(Day-2 session)，可逃脫的腳電擊(escapable foot shock)[亦即主動迴避試驗(active avoidance test)]：將大鼠隨意地放在穿梭箱的2個隔室的任一者中，繼而容許大鼠透過開啟的中央門來探索該2個隔室歷時1分鐘。之後，大鼠被進行16次可逃脫的CS-UCS配對(escapable CS-UCS pairings)的測試，每一次的可逃脫的CS-UCS配對測試是先對大鼠進行1次CS，之後，依據大鼠的反應來分別進行下面3種測試：(1)若大鼠在接受CS的期間經由開啟的中央門而從所在的隔室中穿越至另一個隔室內，CS立即停止並且不會進行UCS，此次可逃脫的CS-UCS配對測試即結束並且被記錄為1次迴避反應(avoidance response)，接著在一約為60秒的時間間隔之後，下一次的可逃脫的CS-UCS配對測試被起始；(2)若大鼠在接受CS的期間沒有經由開啟的中央門而從所在的隔室中穿越至另一個隔室內，UCS會在CS結束後立即開始，之後若大鼠在接受UCS的期間經由開啟的中央門而從所在的隔室中穿越至另一個隔室內，此次可逃脫的CS-UCS配對測試即結束並且被記錄為1次逃脫反應(escape response)，接著在一約為47-57秒的時間間隔之後，下一次的可逃脫的CS-UCS配對測試被起始；以及(3)若大鼠在接受1次CS以及1次UCS的期間當中都停留在原來所在的隔室中而沒有穿越至另一個隔室內，在UCS結束之後，此次可逃脫的CS-UCS配對測試即結束並且被記錄為1次失敗反應(failure response)，接著在一約為47秒的時間間隔之後，下一次的可逃脫的CS-UCS配對測試被起始。在一總計為16次的可逃脫的CS-UCS配對測試中，迴避、逃脫以及失敗反應的次數分別被記錄，若所測得的迴避反應次數增加或逃脫反應次數降低表示大鼠學會做出一穿梭反應(shuttling response)以迴避電擊。
所得到的實驗數據是以平均值±SEM來表示。所有數據是藉由單因子變異數分析(one-way analysis of variance,ANOVA)，繼而以最小顯著差(least-significant difference,LSD)來作分析，俾以評估各實驗組與對照組之間的差異性。若所得到的統計比對結果是p ＜0.05，代表有統計學顯著性。
結果：
下面表2顯示被餵食以薯蕷皂素之具有或不具有焦慮症狀的OVX大鼠藉由習得無助試驗所測得的行為反應(behavioral response)。從表2可見，就具有焦慮症狀的OVX大鼠而言，薯蕷皂素組1的OVX大鼠的迴避反應次數相較於對照組的OVX大鼠所具者有增加，而薯蕷皂素組1以及2的OVX大鼠的逃脫反應次數相較於對照組的OVX大鼠所具者都有降低，其中薯蕷皂素組1的OVX大鼠的逃脫反應次數是最低的。另外，就不具有焦慮症狀的OVX大鼠而言，薯蕷皂素組1、2以及3的OVX大鼠的迴避以及逃脫反應次數相較於對照組的OVX大鼠所具者皆無明顯的差異。這個實驗結果顯示：薯蕷皂素可以改善具有焦慮症狀的OVX大鼠的學習能力。
實施例2.　薯蕷皂素對於卵巢切除的大鼠的辨識 (recognition)以及記憶能力(memory ability)的影響
為進一步瞭解薯蕷皂素是否具有改善卵巢切除的大鼠的辨識和/或記憶能力的效用，下面的實驗被進行。
實驗方法：
雌性Wistar大鼠在經歷4週的飼養之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「卵巢切除術」當中所述的方法來進行卵巢的切除。在卵巢切除之後的第29天，將這些大鼠隨機地分成4組，其中包括1個對照組(n=20)以及3個實驗組[亦即薯蕷皂素組1(n=20)、薯蕷皂素組2(n=12)以及薯蕷皂素組3(n=19)]。薯蕷皂素組1、2以及3的大鼠分別被餵食以在上面“實驗材料”的第2項「製備含有薯蕷皂素的食材」當中所製得的含有薯蕷皂素的生麵糰(劑量分別為10、50以及100 mg/kg/天)，而對照組的大鼠被餵食以不含有薯蕷皂素的生麵糰。在連續餵食歷時26天之後，各組大鼠被拿來進行下面的物件辨識試驗(object recognition test)。
A、物件辨識試驗：
有關物件辨識試驗是參考Wang WFet al .(2009),Behav. Neurosci .,123:1261-1270當中所述的方法來進行，並作部分修改。簡言之，在進行試驗的前一天，將大鼠放在開放空間箱中靠近角落C4(參見圖2A)的位置，並且容許牠探索物件A1、A2以及A3歷時5分鐘，而使得牠可以適應開放空間箱內的環境。在進行試驗的當天，將大鼠放在開放空間箱中靠近角落C4(參見圖2A)的位置以進行3次測試(trials)，每次的測試時間是5分鐘，而各個測試的時間間隔是15分鐘。在第1次與第2次的測試中，開放空間箱內被放置有物件A1、A2以及A3以供大鼠探索，而在第3次的測試中則以物件B來替代物件A3(參見圖2B)。在整個測試的期間，使用一被放置在開放空間箱上方的攝影機來監測大鼠的行為，並且記錄大鼠在第2次測試的期間中探索物件A3以及在第3次測試的期間中探索物件B所花費的時間。一物件的探索(exploration)被定義為大鼠接近一物件並且以牠的鼻子(snout)和/或前掌(forepaw)而與該物件有身體接觸(physical contact)。大鼠花費在探索物件A3以及物件B上的時間之差異被用來作為評估大鼠對於熟悉的物件之記憶能力以及對於新物件與舊物件之間的差異之辨識能力的指標。
B、統計學分析：
實驗數據是以平均值±SEM來表示。所有的數據是藉由成對的樣本t-試驗(paired-samples t-tests)來作分析，俾以評估各組大鼠在探索物件A3以及物件B所花費的時間上的差異。若所得到的統計比對結果是p ＜0.05，代表有統計學顯著性。
結果：
圖3顯示卵巢切除的大鼠在被餵食以不同劑量的薯蕷皂素之後，藉由物件辨識試驗所測得的在第2次測試的期間中探索物件A3以及在第3次測試的期間中探索物件B所花費的時間。從圖3可見，與對照組大鼠相較之下，薯蕷皂素組1、2以及3的大鼠花費在探索物件B上的時間都要比在探索物件A3上的時間更長，特別地，薯蕷皂素組2的大鼠花費在探索物件B上的時間是最長的。這個實驗結果顯示：薯蕷皂素可以改善卵巢切除的大鼠對於熟悉的舊物件的記憶能力以及對於新物件與舊物件之間的差異之辨識能力。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
11．．．開放臂
12．．．封閉臂
13．．．開放區域
14．．．虛擬線
A1．．．物件A1
A2．．．物件A2
A3．．．物件A3
B．．．物件B
C1．．．角落C1
C2．．．角落C2
C3．．．角落C3
C4．．．角落C4
圖1是一高架十字迷宮的立體圖；
圖2A與圖2B是開放空間箱的俯視圖，其中圖2A顯示被放置有物件A1、A2與A3的開放空間箱，以及圖2B顯示被放置有物件A1、A2與B的開放空間箱；以及
圖3顯示卵巢切除的大鼠在被餵食以不同劑量的薯蕷皂素之後，藉由物件辨識試驗所測得的在第2次測試的期間中探索物件A3以及在第3次測試的期間中探索物件B所花費的時間，其中對照組表示被餵食以不含有薯蕷皂素的生麵糰的大鼠；薯蕷皂素組1至3分別表示被餵食以不同劑量(10、50以及100 mg/kg/天)之含有薯蕷皂素的生麵糰的大鼠；以及“＊”表示p ＜0.05。

Claims (7)

  1. 薯蕷皂素用於製備一用來改善一具有心理症狀之停經期或停經後期女性的學習能力之醫藥品或食品產品的用途。
  2. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該停經期或停經後期女性具有焦慮症狀。
  3. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該薯蕷皂素是以一範圍落在0.014g/天至3.5g/天內的有效量而被給予該停經期或停經後期女性。
  4. 薯蕷皂素用於製備一用來改善一停經期或停經後期女性的辨識和/或記憶能力之醫藥品或食品產品的用途。
  5. 如申請專利範圍第4項的用途，其中該薯蕷皂素是以一範圍落在0.07g/天至7g/天內的有效量而被給予該停經期或停經後期女性。
  6. 如申請專利範圍第1或4項的用途，其中該醫藥品是呈一供口服投藥的劑型。
  7. 如申請專利範圍第1或4項的用途，其中該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。
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