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Die Erfindung betrifft Lektinzusammensetzungen, vorzugsweise emulgierte Lektinzusammensetzungen, deren Herstellung und die Verwendung der Lektinzusammensetzungen zur Prophylaxe oder/und Behandlung verschiedener Krankheiten oder Beschwerdekomplexe.
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Lektinzusammensetzungen sowie medizinische Anwendungen sind beispielsweise bekannt aus der
WO97/49420 A1 , der
WO 99/11278 A1 ,
EP 2106707 und der
EP-A-09162527 . Emulgierte oder nanoemulgierte Lektinzusammensetzungen werden allerdings weder beschrieben noch nahe gelegt. Gleichermaßen wird die in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verwendung nicht beschrieben und auch nicht nahe gelegt.
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Es war eine der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe Formulierungen und Darreichungsformen bereitzustellen, die u. a. eine verbesserte Resorption oder/und eine verbesserte Bioverfügbarkeit des Wirkstoffs Lektin aufweisen oder/und eine verbesserte Wirkung gegenüber den bekannten Lektinzusammensetzungen in den beanspruchten Anwendungen und Indikationen zeigen oder zumindest die Nachteile des Standes der Technik zu verbessern.
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In einem Aspekt betrifft die Erfindung Lektinzusammensetzung zur Prophylaxe oder/und Behandlung von Aromatase-Hemmer-, Antiöstrogen- oder Östrogenrezeptormodulator(SERM)- oder/und GnRH-Analoga- bedingten unerwünschten Arzneimittelnebenwirkungen in einem Individuum, oder von einem induzierten oder endogenen Östrogenmangel- bedingten Beschwerdekomplex bei einer Frau, oder zur Behandlung eines Spektrums von Symptomen, welche Übelkeit, Erbrechen/Durchfall, trockene Schleimhäute, Gelenkbeschwerden, Müdigkeit/Schwäche und Hautreizung umfassen, bei einem Individuum, das sich einer onkologischen Strahlen- und/oder Chemotherapie unterzieht oder unterzogen hat, wobei die Lektinzusammensetzung ein oder mehrere emulgierte Lektine umfasst oder diese im wesentichen enthält und die gegebenenfalls weitere Hilfs- und Trägerstoffe umfasst.
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Die erfindungsgemäßen Lektinzusammensetzungen können hergestellt werden mittels einem Verfahren wie es offenbart ist beispielsweise in
WO2008/000534 A1 ,
DE 102 55 195A1 ,
WO2006/042574A2 ,
EP0206240A2 ,
US 6,573,299 oder
US 5,922,331 . Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß
WO2008/000534 A1 .
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Lektinzusammensetzung und ihre Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass der Aromatase-Hemmer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminoglutethimid, Anastrozol (Arimidex), Letrozol (Femara), Vorozol (Rivizor), Exemestan (Aromasin), 1,4,6-androstatrien-3,17-dione ATD), Formestan (Lentaron), Testolactone (Teslac) und Fadrozol (Afeman), das Antiöstrogen oder der Östrogenrezeptormodulator (SERM) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Clomifen, Raloxifen, Tamoxifen, Toremifen, Bazedoxifen, Lasofoxifen und Ormeloxifen, die GnRH-Analoga ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Leuprorelin (Eligard®, Enantone®), Goserelin (Zoladex®) und Buserelin (Profact®).
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist der induzierte Östrogenmangel bei einer Frau verursacht durch eine Arzneimittelbehandlung oder/und einen chirurgischen Eingriff im Bereich der Fortpflanzungsorgane. Hierbei kann es sich um jedwede Verhaltensweise, Behandlung oder Operation handeln, die einen Östrogenmangel bei Frauen verursacht. Beispiele hierfür sind die begleitende Therapie bei einer Krebsbehandlung oder nach einer Strahlen- oder Chemotherapie sowie operative Eingriffe im Rahmen einer Krebstherapie oder notwendige Eingriffe oder die Entnahme von Organen des Fortpflanzungsapparates.
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Die erfindungsgemäß behandelten Beschwerden bzw. der Beschwerdekomplex bzw. die unerwünschten Arzneimittelnebenwirkungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Austrocknen der Haut und Schleimhäute und die damit verbundenen unangenehmen Begleiterscheinungen wie Hautjucken, trockener Mund, Augenbrennen/-schmerzen und die Unmöglichkeit Kontaktlinsen zu tragen, Austrocknen des gesamten Schleimhautkomplexes umfassend Augen-, Nasen-, Mund-, Rachen-, Vaginalschleimhäute sowie der Magen-Darm-Trakt, Gelenkschmerzen, insbesondere morgendlicher Anlaufschmerz. Der induzierte oder der endogene Östrogenmangel- bedingte Beschwerdekomplex bei einer Frau umfasst Hitzewallungen, Brustschmerzen, Gewichtszunahme, übermäßige Nervosität sowie Empfindlichkeit, Müdigkeit, Insomnia, Trockenheit der Vaginalschleimhaut sowie Gelenk- und Knochenprobleme und eine erhöhte Rate von Infektionen im urogenitalen Bereich, psychische Probleme wie Angstzustände, Schlafstörungen und Schwermut bis hin zur Depressionen.
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Die Verwendung der erfindungsgemäßen Lektinzusammensetzungen in den beschriebenen Anwendungen und Indikationen hat gegenüber der Anwendung von bekannten Lektinzusammensetzungen verschiedene Vorteile. Zu nennen ist hier beispielsweise vorzugsweise eine erhöhte Resorptionsrate, die mit bekannten in vitro und mittels in vivo Untersuchungen nachgewiesen werden kann. Weiterhin ist vorzugsweise auch die Makrophagen-aktivierende Wirkung der erfindungsgemäßen Lektinzusammensetzung zu nennen. Ein Nachweis der vorteilhaften Wirkungen in den erfindungsgemäß beanspruchten Indikationen kann beispielsweise in in vitro Makrophagenmodellen (siehe Beispiel) und in in vitro Phagozytosetests gezeigt werden.
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Das in der erfindungsgemäßen Lektinzusammensetzung verwendete Lektin kann jedes Lektin sein, vorzugsweise ist das Lektin ein pflanzliches Lektin, vorzugsweise ein Lens culinaris oder ein Pisum sativum, oder das Lektin ist ein tierisches Lektin.
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Das Lektin liegt vorzugsweise als Emulsion vor, besonders bevorzugt in Vesikeln, Mischmizellen, als Mikroemulsion, als nanodisperses System oder Nanoemulsion.
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Besonders bevorzugt ist die emulgierter Form der Lektinzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass das emulgierte Lektin vorliegt als flüssige, wässrige, mizellare Emulsion oder als flüssige, wässrig-ölige, mizellare Emulsion.
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Die Mizellen in der erfindungsgemäßen Lektinzusammensetzung weisen vorzugsweise einen mittleren Durchmesser von 3 bis 300 nm, vorzugsweise von 5 bis 250 nm, besonders bevorzugt von 10 bis 120 nm, mehr bevorzugt von 50 bis 80 nm, auf. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von der mittleren Tröpfchengröße und von einer Nanoemulsion, wenn die mittlere Tröpfchengröße weniger als 100 nm beträgt.
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Die erfindungsgemäße Lektinzusammensetzung hat vorzugsweise einen Lektingehalt von 1 bis 30 mg/ml Emulsion. Vorzugsweise beträgt der Lektingehalt 5 bis 20 mg/ml Emulsion.
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Die erfindungsgemäße Lektinzusammensetzung ist vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass die weiteren Hilfs- und Trägerstoffe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Phospholipiden, vorzugsweise Phosphoglyceride, Mizellstabilisatoren, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carnitin oder/und einem physiologisch verträglichen Carnitin-Derivat oder/und Polyol(en), oder/und Radikalfängern, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ascorbinsäure oder/und Alkali- oder/und Erdalkalisalze der Ascorbinsäure oder/und Ester einer oder mehrerer organischer Säuren mit Ascorbinsäure.
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Die Vorteile der erfindungsgemäßen Lektinzusammensetzung sind, dass bei Verwendung von lipophilen und hydrophilen Substanzen Systeme hergestellt und verwendet werden können, die Mizellen mit einer mittleren Größe von 30 bis 200 nm realisieren ohne den Einsatz von synthetischcen Emulgatoren/Tensiden erforderlich zu machen. Die geringe Größe der Tröpfchen/Mizellen führt u. a. zu der ausgezeichneten Stabilität dieser Systeme. Die erfindungsgemäßen Nanoemulsionen, die den nanodispersen Systemen zugeordnet werden können, sind vorzugsweise ölig/wässrige Emulsionen. Vorzugsweise werden diese mittels dem Fachmann bekannten Hochdruckhomogenisationsverfahren erhalten. Hierbei werden vorteilhafter Weise besonders gute Aufrahmstabilitäten erreicht. Es können sehr dünnflüssige sprühbare Formulierungen gewonnen werden, die bei der Lagerung keine Phasentrennung erfahren. Weiterhin sind diese Systeme mit Wasser in jedem Verhältnis mischbar und sind somit vorteilhaft in ihrer technischen Anwendung.
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Die Emulsion der erfindungsgemäßen Lektinzusammensetzung hat vorzugsweise einen pH von 4 bis 9,5, besonders bevorzugt von 6 bis 8,5 und mehr bevorzugt von 8,5 bis 9,5.
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Die erfindungsgemäße Lektinzusammensetzung kann weiterhin umfassen mindestens eine Selenverbindung oder/und mindestens ein proteolytisches Enzym sowie weitere Hilfs- und Zusatzstoffe.
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In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Lektinzusammensetzung ist die Selenverbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natruim-Selenit, Kalium-Selenit, Magnesium-Selenit, Ammonium-Selenit oder/und einer vergleichbaren Selenverbindung.
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Das proteolytische Enzym ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Papain, Bromelain, Trypsin oder/und Chymotrypsin.
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Die erfindungsgemäße Lektinzusammensetzung ist vorzugsweise hergestellt als wässrige oder ölige Lösung, Emulsion, Nanoemulsion, Nanodispersionssystem, Lyophilisat, Pulver, Granulat, Kapsel, Dragee, Kautablette oder Tablette. Hierbei werden dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet, die somit nicht im Einzelnen dargelegt werden.
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Eine Möglichkeit ist die erfindungsgemäße Lektinzusammensetzung als konzentrierte Emulsion z. B. in Form eines Trockensupplementes als Tablette, Kautäfelchen oder Kapsel herzustellen, bei dem die Emulsion in eine Pulververmischnug eingesprüht wird. Das hierbei eingesprühte Wasser kann vorzugsweise mit Warmluft teilweise oder ganz sofort wieder entfernt werden.
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In einem weiteren Aspekt kann die erfindungsgemäße Lektinzusammensetzung für sich alleine lyophilisiert werden, d. h. in der Emulsion ist als aktive Substanz nur Lektin enthalten. Hierbei kann diese in eine wasserlösliche Trockenform überführt werden, die dann beim Zutritt von Wasser (z. B. im Darm) wieder zu einer Nanoemulsion wird. Dies kann durch bekannte Verfahren wie Niedertemperatursprühtrocknung oder Gefriertrocknung erfolgen. Der so erhaltene Lektin-Rohstoff kann dann mit weiteren Stoffen (z. B. Selen oder proteolytischen Enzymen) kombiniert werden und als Tablette, Kapsel oder Dragee hergerichtet werden.
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Vorzugsweise wird das Pulver oder Granulat einer erfindungsgemäßen Lektinzusammensetzung durch eine Sprühtrocknung oder eine Gefriertrocknung gewonnen. Die Apparate und das Vorgehen entsprechen den in diesem Feld üblichen Verfahren und der üblichen Methodologie.
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Lektinzusammensetzung hergestellt als Tablette und enthält 5 mg Lektin, vorzugsweise Lens culinaris, 100 oder 140 mg Papain, 60 oder 100 mg Bromelain, 50 oder 75 microgramm Natriumselenit sowie als Zusatz und Hilfsmittel Reisstärke, Magnesiumstearat und Schellack.
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Die erfindungsgemäße Lektinzusammensetzung kann in einer Tagesdosis verabreicht werden, wobei die Tagesdosis des Lektin's mindestens 2–100 mg, vorzugsweise 10–50 mg entspricht, die Tagesdosis der Selenverbindung 30–700 mikrogramm, vorzugsweise 50–500 mikrogramm oder eine äquimolare Menge einer anderen Selenverbindung entspricht oder/und die Tagesdosis des proteolytischen Enzym's 200–2000 mg oder 1000–10000 FIP-Einheiten, vorzugsweise 600–1200 mg, entspricht.
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Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Lektinzusammensetzung hergerichtet als eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein diätetisches Lebensmittel, ein Lebensmittel für die bilanzierte Diät, eine Nahrungsergänzungszusammensetzung oder/und ein Medizinprodukt.
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In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Lektinzusammensetzung mit den oben beschriebenen Inhaltsstoffen für medizinische Verwendungen.
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Die Ausführungen zu dem Gegenstand der Erfindung sind so zu verstehen, dass jegliche Kombinationen von den oben beschriebenen Merkmalen von der Erfindung umfasst sein sollen.
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Beispiel
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Eine erfindungsgemäße Lektinzusammensetzung wird beispielsweise hergestellt wie beschrieben in
WO2008/000534 A1 .
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Vorzugsweise wird der Lektinrohstoff in Wasser bei Raumtemperatur gelöst und die Gewichtsteile an Gelöstem und Ungelöstem Lektin in einer dem Fachmann bekannten Weise bestimmt.
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Bei Ansatz 1 in 9-facher Menge Wasser waren 16% des Ausgangsstoffes gelöst und 84% ungelöst.
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Bei einer Lösung in 49-facher Menge Wasser (Ansatz 2) waren 22% Lektin gelöst und 78% ungelöst.
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Bei Ansatz 3 wurde über Nacht und unter Einsatz eines Homogenisierrührers gelöst, wobei deutlich mehr Rohstoff in Lösung ging, nämlich 80%.
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Ansatz 4 entspricht Ansatz 3, wobei der pH-Wert auf 8,5 bis 9 unter Verwendung eines physiologisch verträglichen Säureemulgators eingestellt wurde.
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Alle Wasserphasen wurden mit geeigneten, physiologischen (nährstoffähnlichen) Emulgatoren durch einstufige Hochdruckbehandlung emulgiert. Es ist auch möglich eine mehrstufige Hochdruckbehandlung durchzuführen, wodurch die Tröpfchengröße gesteuert werden kann. Hierbei wurde eine fast klare Emulsion erhalten. Die Nanoemulsionen weisen folgenden Gehalt an Lektin auf:
Ansatz 1: 5,0 mg Lektin/ml Emulsion; Tröpfchengröße: 236 nm
Ansatz 2: 1,4 mg Lektin/ml Emulsion; Tröpfchengröße: 195 nm
Ansatz 4: 20 mg Lektin/ml Emulsion;
Vorteilhaft ist, dass die Streuung der Tröpfchengröße sehr gering ist.
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Zur weiteren Charakterisierung kann nicht-mizelliertes gegen mizelliertes/nanoemulgiertes Lektin getestet bzw. verglichen werden hinsichtlich weiterer Parameter.
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Weiterhin ist ein Vergleich der beiden Lektinlösungen (emulgiert gegen nicht-emulgiert sowie gegen Grundlagenlösung) in bekannten Makrophagenmodellen/Makrophagentest oder Phagozytosetests in vitro möglich, um die vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lektinzusammensetzung nachzuweisen. Es kann so vorzugsweise eine erhöhte Resorptionsrate der erfindungsgemäßen Lektinzusammensetzung sowie vorzugsweise eine erhöhte immunstimulierende Wirkung gezeigt werden.
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Ein Makrophagentest kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: Grundlage der Bestimmung Zell immunologischer/phagozytotischer Eigenschaften sind beispielsweise dem Fachmann bekannte fluorimetrische Messmethoden. Es können z. B. Zellen der Zellinie RAW 264.7 (murine Makrophagen) verwendet werden.
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Die Kultivierung der Zellen erfolgt in 75 cm2 Zellkulturflaschen (Sarstedt) im Brutschrank (FDH Cell-Cult CO2 Inkubator Mod. 311, Thermo Forma) bei 37°C, 95% Raumluft und 5% CO2. Als Zellkulturmedium kann Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) von Sigma verwendet werden. Zusätzlich kann dem Medium 10% fötales Rinderserum (Gibco), 2 micromol pro ml L-Glutamin (Biochrom), 1000 pro ml Penicillin (Biochrom) und 100 microgramm pro ml Strepromycin (Biochrom) zugesetzt werden.
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Die Testung erfolgt vorzugsweise mit 2 Tage alten Zellen. Dazu wird eine geeignete Anzahl von Zellkulturen (je nach Anzahl der Versuchsansätze) zunächst mit HANK's Lösung (Sigma) gewaschen, dann in NaHCO3 gepuffertem (1,5%) Minimum Essential Medium mit Earl's Salzen (MEM-Earl ohne Phenolrot; Biochrom) suspendiert. Die Suspension wird in 50 ml Schraubröhrchen überführt und 10 min bei 300 × g zentrifugiert (Multifuge 1 L-R, Heraeus). Der Überstand wird verworfen und das Pellet in MEM Earl resuspendiert. Die Menge richtet sich nach der Anzahl der Inkubationsansätze, wobei 1 ml MEM-Earl pro Ansatz üblich ist. Anschließend wird die Zellzahl in einer Neubauerkammer bestimmt.
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Die Zellsuspension wird entsprechend der Inkubationsansätze in 5 ml Rundbodenröhrchen mit Belüftungskappen (BD Falcon, BD Biosciences) aufgeteilt. Und mit jeweils 100 microliter der zu analysierenden Substanzlösung bei 37°C, 95% Raumluft und 5% CO2 in einem Brutschrank (FDH Cell-Cult CO2 – Inkubaor Mod. 311, Thermo Forma) für 1 Stunde inkubiert.
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Die Zellen werden vorzugsweise mit unterschiedlichen Konzentrationen an emulgiertem Lektin, nicht-emulgiertem Lektin und den entsprechenden Kontrollen inkubiert. Die Dosiskinetik beruht vorzugsweise auf Vorversuchen, in denen der aktivierende Konzentrationsbereich (0,0625–1,25) ermittelt und erweitert wurde.
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Als Positivkontrolle kann beispielsweise ein Messansatz ohne testsubstanz mit Zymosan, als Negativkontrolle ein Messansatz ohne Testsubstanz und ohne Zymosan dienen.
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Nach der Inkubation werden die Ansätze 5 in bei 300 × g zentrifugiert (Multifuge 1 L-R, Heraeus). Der Überstand wird verworfen. Sofern die Zellzahl in den Inkubationsansätzen kleiner als 4 × 106 Zellen pro ml ist, werden die Pellets in 0,5 ml MEM-Earl resuspendiert, sofern die Zellzahl größer als 4 × 106 Zellen pro ml ist, wird 1 ml zugegeben.
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Als international verwendetes Substrat für die Aktivierung der Zellen dient Zymosan aus Saccharomyces cerevisiae (Sigma). Das Zymosan wird zunächst mit murinem Serum (Charles River; 1:6 mit Hank's-Lösung verdünnt) opsoniert. Dazu werden 2 mg Zymosan in 1 ml verdünntem Serum gelöst und 30 min bei 37°C im Brutschrank (s. o.) inkubiert. Anschließend wird das Serum vom Zymosan durch Zentrifugation bei 300 × g getrennt (Multifuge 1 L-R, Heraeus) und das Pellet in 2 ml MEM-Earl resuspendiert.
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3 mg Bis-N-Methylacridiniumnitrat (Lucigenin; Sigma) wird in 25 ml Hank's-Lösung gelöst und im Wasserbad (Thermomix, Braun) auf 37°C temperiert. Die Lösung muss dabei vor Licht geschützt werden.
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Für die Messung wird 250 microliter Zellsuspension und 450 microliter Lucigeninlösung in Rundküvetten (Sarstedt) pipettiert und in ein Luminometer (Luminoskan 1251, Labsystems) eingebracht. Gestartet wird die Reaktion mit 50 microliter der Zymosan-Lösung. Der Verlauf der Lumineszenz wird 50 min lang aufgezeichnet.
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Durch die beschriebenen Versuche kann beispielsweise nachgewiesen werden, wie stark die Aktivität der Schleimhautzellen durch die erfindungsgemäße Lektinzusammensetzung verstärkt werden kann.
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An Probanden kann danach mit bekannten Tests die erhöhte Resorptionsrate sowie weitere Vorteile der Erfindung in vivo nachgewiesen werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 97/49420 A1 [0002]
- WO 99/11278 A1 [0002]
- EP 2106707 [0002]
- EP 09162527 A [0002]
- WO 2008/000534 A1 [0005, 0005, 0030]
- DE 10255195 A1 [0005]
- WO 2006/042574 A2 [0005]
- EP 0206240 A2 [0005]
- US 6573299 [0005]
- US 5922331 [0005]