DE69717849T2

DE69717849T2 - Lektinzusammenstellungen und deren verwendung

Info

Publication number: DE69717849T2
Application number: DE69717849T
Authority: DE
Inventors: Zsuszanna Magdolna Bardocz; Neil William Fish; Gyorgy J. Koteles; Richard Michael John Palmer; Arpad Janos Pusztai
Original assignee: Alizyme Therapeutics Ltd
Current assignee: Alizyme Therapeutics Ltd
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 2003-11-13
Anticipated expiration: 2017-06-21
Also published as: ES2190535T3; AU738386B2; NO323880B1; PL330865A1; DE69717849D1; GB9613070D0; NZ333411A; AU3183297A; EP0942741A1; JP2001510447A; RU2202361C2; CA2258503C; NO985980L; WO1997049420A1; DK0942741T3; PT942741E; NO985980D0; CN1157225C; EP0942741B1; ATE229341T1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lektinen bei der Herstellung von Medikamenten für die Steuerung der Proliferation von Schleimhautzellen sowie für die Verringerung und/oder Behandlung von Schäden, die durch ein zellschädigendes Mittel hervorgerufen werden.
Lektine sind Proteine oder Glykoproteine, typischerweise von Pflanzen oder auch mikrobieller oder tierischer Herkunft, die spezifische Glykokonjugatstrukturen erkennen und sich daran anheften. Oral verabreichte Lektine wie das der Bohne (Phaseolus vulgaris), Phytohämagglutinin (PHA), können wirkungsvolle, externe Wachstumsfaktoren für den Darm von Ratten sein und induzieren vollständig reversibles, polyamin-abhängiges, hyperplastisches Wachstum des Dünndarms (Bardocz et al., 1992). Das Lektin bindet gut an den Bürstensaum (brush border) und wird teilweise durch Transzytose in die Zirkulation aufgenommen (Pusztai, 1991). In bestimmten Dosismengen schädigen Lektine wie z. B. PHA die Darmwand und verursachen ein übermäßiges Wachstum von Koliformen im Darmlumen (Pusztai et al., 1993), was die Rate der Lipidmobilisation und der Glukoseoxidation erhöht (Grant et al., 1987) und den Anteil der Geschwindigkeit der Proteinsynthese im Skelettmuskel signifikant verringert (Palmer et al., 1987; Bardocz et al., 1992). Lektine wie PHA gelten daher im Allgemeinen als Nahrungsgifte, da sie in hohen oralen Dosismengen schwere Verluste von Körperlipiden, Glykogen und Muskelprotein (Pusztai, 1991) und möglicherweise Tod verursachen.
Unbedenkliche, nicht-toxische Grenzwerte für die orale Verabreichung von Lektinen an Menschen und andere Tiere sind nicht bekannt.
Schleimhautzellen sind solche, aus denen jede Schleimhaut besteht (die feuchte Membran, die viele tubuläre Strukturen auskleidet). Viele sind Zellen, die eine Schutzschicht zwischen der äußeren Umgebung und den inneren Organen eines Tieres bilden. Beispiele für Schleimhautzellen beinhalten die Epithelzellen der Haut, die Auskleidung des Verdauungskanals, das die Augen abdeckende Gewebe und die Auskleidung der Lunge und der Nase. Es sind eine Reihe von Erkrankungen von Schleimhautzellen bekannt, einschließlich Zuständen, bei denen die Zellteilung beschleunigt oder verringert ist, oder bei denen die Schleimhautzellen geschädigt sind oder die schützende äußere Schicht, wie die schleimtragende Schicht, fehlt. Zustände in Bezug auf abnormale Steuerung der Proliferation von Schleimhautzellen können Hautkrebsarten, Schuppenflechte, Reizdarmsyndrom, Darmentzündung und Schleimhautentzündung beinhalten. Schleimhautentzündung ist ein schmerzhafter und behindernder Zustand, bei dem die schnell wachsenden Epithel- und Schleimhautzellen beschädigt sind und die externe Schleimhautschicht entfernt und/oder nicht ausreichend ersetzt wird. Schleimhautentzündung kann zu einer Infektion durch z. B. im Mund oder im Darm vorhandene Mikroorganismen führen. Der Zustand gilt als hauptsächliche Nebenwirkung bei der Behandlung von Krebs. Die Inzidenz und der Schweregrad einer Schleimhautentzündung können sich mit zunehmender Häufigkeit von Krebstherapien erhöhen und können letztendlich die Behandlungsbefolgung und das Überleben des Patienten beeinträchtigen.
Mittel, die Schleimhautzellen (oder andere Zellen) schädigen und Schleimhautentzündung verursachen, beinhalten chemotherapeutische Mittel, Strahlentherapie, Chemikalien (organisch oder anorganisch), Toxine, Säuren, Laugen, alle Strahlenquellen und freie Radikale. Chemotherapie und Strahlentherapie, entweder einzeln oder in Kombination zusammen mit einer Operation angewandt, sind die wichtigsten therapeutischen Ansätze für die Behandlung von Krebs. Chemotherapie kann ein zytotoxisches Mittel verwenden, um die DNA einer Zielzelle direkt zu schädigen. Wird einem Zielgewebe, z. B. einem Tumor, eine ausreichende Dosis des zytotoxischen Mittels verabreicht, kann eine Fehlreparatur der DNA zu einer Ansammlung von DNA-Mutationen, Läsionen und chromosomalen Aberrationen führen, die letztendlich zum Zelltod führen. Strahlentherapie nutzt Strahlung, um entweder die DNA einer Zielzelle direkt zu schädigen oder nutzt das Potenzial ionisierender Strahlung zur Produktion freier Radikale, die DNA- Stränge aufbrechen können (Steel, 1996).
Das Prinzip der Verwendung von Chemotherapie zur Behandlung von Krebs ist, dass ein zytotoxisches Arzneimittel verabreicht wird, um die Zellteilung zu hemmen, was letztendlich zum Zelltod führt. Da Krebszellen in der Regel schneller als normales Gewebe wachsen, wird erwartet, dass das zytotoxische Arzneimittel mehr Krebszellen als normale Zellen tötet. Im Gegensatz zur Strahlentherapie werden die zytotoxischen Arzneimittel jedoch auf eine Weise verabreicht, dass sie systemisch im ganzen Körper wirken. Schwere Nebenwirkungen, wie z. B. Toxizität für lebenswichtige Gewebe, einschließlich dem Knochenmark, können die Dosis der zytotoxischen Arzneimittel, die verabreicht werden kann, ohne den Patienten zu töten, begrenzen. In ähnlicher Weise unterscheidet die Verwendung von Strahlen zur Behandlung von Krebs nicht zwischen Krebsgewebe und normalem Gewebe. Die Verwendung einer Strahlentherapie ist daher ein Kompromiss zwischen dem Versuch, den Krebszellen den größten Schaden zuzufügen, ohne dabei normales Gewebe unwiderruflich zu schädigen.
Für die Behandlung von Krebs sind viele zytotoxische Arzneimittel entwickelt und evaluiert worden. Das Hauptprinzip der Wirkungsweise dieser Arzneimittel ist, dass sie in Schlüsselschritte des Zellteilungswegs eingreifen oder diese hemmen. Die wichtigsten Arzneimittelklassen zielen entweder auf die DNA-Replikation, die DNA-Reparatur, die Chromosomenteilung oder die zytoplasmatische Teilung. Die überwiegende Mehrzahl der zytotoxischen Arzneimittel greift in die Synthese und Replikation von DNA ein. 5- Fluoruracil (5-FU) ist eines der am häufigsten verwendeten zytotoxischen Arzneimittel in dieser Klasse. Die Aktivität von 5-FU kann außerdem durch Addition reduzierter Folate, wie z. B. Kalziumleucovorin, moduliert werden (Isacoff et al., 1994). Es sind andere zytotoxische Arzneimittel bekannt, die DNA-Synthese und Replikation hemmen und die verschiedene Desoxyribonukleotide, die zur Herstellung von DNA verwendet werden, wie z. B. Cytarabin, angreifen. DNA-Stränge, die Cytarabin enthalten, hemmen direkt die Aktivität der DNA- Polymerase (Archimund & Thomas, 1994).
Eine zweite wichtige Klasse von zytotoxischen Arzneimitteln sind die, welche direkt ein Brechen der DNA-Stränge induzieren, oder diejenigen, welche die Reparatur von DNA- Brüchen hemmen. Ein Beispiel für ein Arzneimittel, das DNA-Stränge direkt brechen kann, ist Cyclophosphamid (Sparano & Wiernik, 1994). Eine dritte wichtige Klasse von Arzneimitteln sind die, die das Zusammenfügen und Trennen von Tubulin unterbrechen und damit direkt die Mitose und die Zellteilung hemmen. Taxane, wie z. B. Paclitaxel und Docetaxel, sind Arzneimittel, die Tubulin zu stabilen Mikrotubuli-Bündel polymerisieren. Synthetische Efeualkaloide, wie z. B. Vinorelbin, sind Spindelapparatgifte, die ihre Antitumorwirkung ausüben, indem sie den Zusammenbau von Tubulin in Mikrotubuli verhindern (Dieras & Pouillart, 1995).
Derzeitige Strahlentherapiepraxis setzt zur Krebsbehandlung eine Reihe von Strahlenquellen ein. Die am häufigsten verwendeten Quellen sind Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, Protonen oder Neutronenquellen α- oder β-emittierender Strahlung. In der Praxis gewährleistet eine anhaltende, niedrig dosierte Strahlentherapie über mehrere Tage die besten Chancen für die Unterscheidung zwischen normalem Gewebe und Krebsgewebe. Diese Technik ist jedoch auf die Verwendung von Strahlenisotopen beschränkt, die derzeit nur bei wenigen Tumortypen wirksam sind, so z. B. bei Schilddrüsenkarzinomen. In der klinischen Situation verwenden die meisten Strahlentherapietechniken hohe Strahlendosen, die als Strahl auf das Krebsgewebe gerichtet werden. Die Exposition von normalem Gewebe wird, wenn möglich, durch Verwendung einer Bleiabschirmung oder durch Drehen des Patienten verringert, so dass normales Gewebe eine geringere Dosis als die Krebszellen erhält. Obwohl dieser Ansatz wirksam sein kann, ist seine Anwendung durch kumulative Exposition des Normalgewebes gegenüber Strahlung und durch den Widerstand vieler Tumoren gegenüber hohen Strahlendosen beschränkt.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass einzelne zytotoxische Mittel oder Strahlenquellen für bestimmte Krebsarten besser geeignet sind. So wird Cisplatin beispielsweise gemeinhin für Hodenkrebs verwendet, Taxane sind für Brustkrebs besser geeignet und 5-FU wird häufig für Dickdarmkrebs verwendet. Therapien mit einzelnen Mitteln gewährleisten jedoch nur selten eine vollständige Heilung des Krebses, und die Überlebensrate ist noch immer gering. Bezüglich des Einsatzes mehrerer Arzneimittel wurden manche Verbesserungen erreicht (Au et al., 1996).
Im Stand der Technik wurde eine Anzahl von Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Sensitivierung von Krebszellen für die Wirkung von Strahlen und Chemotherapie evaluiert (wobei Normalgewebe verschont wird). Auch die Verwendung von Strahlensensitivierern, wie z. B. der Vitamin-K-Mimetika Synkavit und Menadion, und von schützenden Mitteln, wie z. B. den sulfhydrylhaltigen Verbindungen Cystein, Cysteamin und Ethyol war enttäuschend (Denekamp, 1996).
Obwohl Chemotherapie und Strahlentherapie die am häufigsten verwendeten Behandlungen für Krebs sind, sind die Überlebensraten aufgrund einer Reihe von Faktoren begrenzt. Der Schlüsselfaktor ist, dass das zytotoxische Arzneimittel oder die Strahlung nicht zwischen Normal- und Krebsgewebe unterscheidet. In vielen Fällen ist es unmöglich, eine Dosis des zytotoxischen Arzneimittels oder der Strahlung zu geben, die ausreicht, das gesamte Krebsgewebe zuverlässig abzutöten, da dies für den Patienten tödlich wäre. Häufige Nebenwirkungen der bestehenden Therapieschemata beinhalten Haarausfall, Suppression des Knochenmarks, Übelkeit, Erbrechen und Durchfall (Paulsen et al., 1996). Darüber hinaus gibt es viele Fälle, in denen die Verwendung einer Strahlentherapie, besonders für den Beckenbereich, zu einer Veränderung der Magendarmfunktion (Yeboah et al., 1993) und zu einer langfristigen Schädigung des Darms führte, was eine Operation erforderlich machte (Van Halteren et al., 1993).
Mit der Verfügbarkeit hämatopoietischer Wachstumsfaktoren wurde in den letzten 10 Jahren ein wichtiger Durchbruch erzielt. Es ist nun möglich, höhere Dosismengen an zytotoxischen Arzneimitteln und Strahlung zu geben, und dann Gewebe wie das Knochenmark und weiße Blutkörperchen durch die Verabreichung von rekombinanten Wachstumsfaktoren, wie z. B. Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierendem Faktor (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), zu retten (Erkisis et al., 1996). Ein solcher Ansatz ermöglichte, dass eine verbesserte Prognose und bessere Überlebensraten erreicht werden können. Obgleich Epidermis-spezifische Wachstumsfaktoren, wie z. B. der Epidermiswachstumsfaktor (epidermal growth factor) bekannt sind, erschwerte die Komplexität der Wachstumsregulation des Darms die Entwicklung wirksamer Darm"rettungs"verfahren (Podolsky, 1993). Da für den Darm derzeit kein solcher Wachstumsfaktor existiert, wurde der Schaden für den Magendarmtrakt durch zytotoxische Arzneimittel und Strahlung mittlerweile dosisbegrenzend.
Die vorliegende Erfindung nutzt die gewebeschützenden Eigenschaften und die metabolischen Auswirkungen geringer Dosismengen von Lektinen, um biologisches Material, das durch Strahlentherapie oder Chemotherapie geschädigt ist, zu schützen und zu reparieren. Die vorliegende Erfindung ist aufgrund des bekannten prophylaktischen Effekts von Lektinzusammensetzungen (positive Wachstumsfaktoren) von besonderem Interesse vor Behandlungen wie Strahlentherapie und/oder Chemotherapie.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung als einen ersten Aspekt die Verwendung eines Lektins in der Herstellung eines Medikamentes zur Steuerung der Proliferation von Schleimhautzellen bereit. Die Steuerung der Proliferation von Schleimhautzellen beinhaltet die Verringerung und/oder Behandlung aller Schäden der Schleimhautzellen und/oder des Schleimhautgewebes. Im ganzen Text bedeutet "Verringerung" jeden Effekt, der alle Schäden oder jede medizinische Erkrankung bis zu jedem Ausmaß lindert, und beinhaltet die Prävention. Im ganzen Text bedeutet "Behandlung" jede Verbesserung einer Störung, einer Erkrankung, eines Syndroms, eines Zustandes, eines Schmerzes oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon.
Insbesondere bezieht sich der erste Aspekt der Erfindung auf die Steuerung der Proliferation von Schleimhautzellen in der Verringerung und/oder Behandlung einer Schleimhautentzündung und/oder von Darmläsionen.
Steuerung der Proliferation von Schleimhautzellen ist besonders nützlich in der Verringerung und/oder Behandlung von Schäden, verursacht durch ein zellschädigendes Mittel. Typische zellschädigende Mittel aller Aspekte der Erfindung beinhalten Strahlentherapie, Chemotherapie oder eine Kombination davon. In der vorliegenden Anmeldung werden die Begriffe "Bestrahlung" und "Strahlentherapie" so verwendet, dass sie dieselbe Bedeutung haben, d. h. im Sinne einer Quelle von Strahlung, die als therapeutische Technik angewandt werden kann oder nicht.
Der erste Aspekt der Erfindung ist besonders wirksam bei der Steuerung der Proliferation von Schleimhautzellen vor, während oder nach der Strahlentherapie, Chemotherapie oder einer Kombination davon. Die Erfindung wird erreicht als Ergebnis der schützenden und reparierenden Eigenschaften von Lektinen.
Schleimhautzellen sind solche, aus denen jede Schleimhaut besteht (die feuchte Membran, die viele tubuläre Strukturen und Höhlungen auskleidet). Viele bilden eine Schutzschicht zwischen der äußeren Umgebung und den inneren Organen eines Tieres. Schleimhautzellen/-gewebe beinhalten Zellen der Nasenhöhle, der Atemwege, der Haut, des Magendarmtraktes sowie des Gallen- und des Bauchspeichelsystems. Auch die Oberfläche des Mundes wird von einer Schleimhaut ausgekleidet. Die Schleimhaut besteht aus einer Oberflächenschicht eines Epithels, das Schleim absondernde Drüsen enthält, und darunter liegenden Schichten aus Bindegewebe und Schleimhautmuskeln, die die innere Grenzschicht der Schleimhaut bilden.
Die Verwendung des Lektins für die Steuerung der Proliferation von Schleimhautzellen ist besonders in Bezug auf die Zellen des Magendarmtraktes nützlich. Die Steuerung kann sich auf eine Steigerung der Funktion und/oder Länge des Magendarmtraktes oder auf die Kontrolle der Eigenschaften und/oder Dichte der Glykoproteine, die auf, der Oberfläche der Magendarmzellen exprimiert sind, beziehen. Andere Verwendungen in Bezug auf die Steuerung der Proliferation der Schleimhaut beinhalten die Verringerung und/oder Behandlung von Darmerkrankungen wie Darmentzündungen und Reizdarmsyndrom sowie auf die Verringerung und/oder Behandlung von Darmläsionen und auf die Reparatur und den Austausch von Schleimhautzellen vor, während oder nach Strahlentherapie, Chemotherapie oder einer Kombination von zweien oder mehreren davon.
Die Anwendungen dieser Kontrolleigenschaften beinhalten:
a) Darmzellproliferation, was zu einer Vergrößerung des funktionellen Darmbereichs und der funktionellen Darmlänge führt, was eine nützliche Therapie sein könnte, wenn die Darmfunktion eingeschränkt ist, wie z. B. durch eine Operation oder einen Unfall, und/oder
b) Steuerung der Turnover-Geschwindigkeit der Darmzellen, was eine Kontrolle des Wesens und der Dichte der exprimierten Oberflächenglykoproteine erlaubt, da diese mit zunehmendem Alter der Zelle zunehmend komplexer werden. Da die Glykokonjugate bestimmte Darmeigenschaften beeinflussen, wie z. B. die Neigung für das Anheften von Bakterien, ist die Lektinverabreichung als therapeutische oder prophylaktische Kontrolle dieser Eigenschaften beabsichtigt.
Insbesondere kann die Steuerung der Zellproliferation verwendet werden, um eine erhöhte Nährstoffkapazität des Dünndarms zu erreichen, und/oder zum Kontrollieren der Glykokonjugatexpression auf Darmzellen. Solche Effekte sind nicht notwendigerweise medizinische Erkrankungen und können lediglich kosmetisch oder funktional sein, und zwar über oder unter der zufrieden stellenden medizinischen Ebene.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Lektins bei der Herstellung eines Medikamentes für die Verringerung und/oder Behandlung eines, durch ein zellschädigendes Mittel hervorgerufenen Schadens, vorgesehen. Zellschädigende Mittel beinhalten Strahlentherapie, Chemotherapie oder eine Kombination davon. Der Schaden beinhaltet insbesondere Darmläsionen und/oder Schleimhautentzündungen.
Für den ersten und zweiten Aspekt der Erfindung beinhalten die Quellen der Strahlentherapie Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, Protonen oder Neutronenquellen, α- oder β-Strahler oder eine Kombination von zweien oder mehreren davon, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Strahlentherapie kann in Kombination mit Chemotherapie unter Verwendung eines zytotoxischen Mittels wie z. B. Methotrexat, Cisplatin und/oder 5-FU und auch in Kombination mit chirurgischen Verfahren eingesetzt werden.
Für den ersten und zweiten Aspekt der Erfindung beinhalten die chemotherapeutischen Mittel jedes zytotoxische Mittel und beinhalten Mittel wie 5-Fluoruracil, Cisplatin, Doxirubicin, Methotrexat, ein Taxol oder eine Kombination von zweien oder mehreren davon, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Wie oben beschrieben, können ein oder mehrere chemotherapeutische Mittel in Kombination mit Strahlentherapie und/oder chirurgischen Verfahren verwendet werden.
Die Erfindung ist von besonderer Anwendbarkeit für die Verringerung und/oder Behandlung von Schäden für Säugetiergewebe, im Speziellen auf menschliches Gewebe. Die vorliegende Erfindung ist für menschliches Gewebe aufgrund ihrer beträchtlichen Notwendigkeit für Strahlentherapie und/oder Chemotherapie bei der Behandlung von Krebs von besonderer Bedeutung. Die vorliegende Erfindung ist jedoch auch in der tiermedizinischen Industrie anwendbar, einschließlich für Tiere in der Landwirtschaft und Haustiere.
Der erste Aspekt der Erfindung betrifft alle Schleimhautzellen und/oder -gewebe und beinhaltet Schleimhautzellen und -gewebe innerhalb eines ganzen Körpers sowie außerhalb des ganzen Körpers, einschließlich isolierte Schleimhautzellen und -gewebe. Der zweite Aspekt der Erfindung betrifft jede biologische Materie, einschließlich ganze Körper und Teilen davon, und beinhaltet isolierte Organe und isolierte Gewebe, einschließlich Schleimhautzellen und -gewebe. Die Erfindung betrifft auch Materie, die absichtlich oder unabsichtlich einem zellschädigenden Mittel ausgesetzt ist.
Die Erfindung ist von besonderer Verwendung für biologische Materie, die besonders empfindlich für zellschädigende Mittel ist, wie z. B. für Strahlentherapie und/oder chemotherapeutische Mittel. Solche biologische Materie gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung beinhaltet die Schleimhautabdeckung des Darms, des Mundes, des Nasengangs, der Speiseröhre, des Magens, der Lunge, des Dünndarms, des Dickdarms (einschließlich des Kolons und des Rektums), des Epithelgewebes (z. B. Abdeckung des Auges) sowie alle anderen Schleimhautzellen und/oder -gewebe.
Solche biologische Materie gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung beinhaltet alle oben definierten Schleimhautzellen und -gewebe sowie Knochenmark, Milz, alle blutbildenden Zellen, Blutgewebe, Thymus, haarproduzierendes Gewebe, Augengewebe und Gewebe der Hoden/Prostata. Die Empfindlichkeit des Darms für Schäden durch zellschädigende Mittel ist mit seinem Stoffwechselstatus verbunden. Es sind die Wachstumsfaktoreffekte von Lektinen, insbesondere auf den Darm (und speziell auf den Dünndarm), die so verstanden werden, dass sie für die prophylaktischen und/oder therapeutischen Effekte vor und während der Verabreichung zellschädigender Mittel wichtig sind.
Lektine können entweder als "toxisch" oder "nicht-toxisch" eingestuft werden. Toxische Lektine beinhalten oder können klassifiziert werden als Ribosomen inaktivierende Proteine (RIPs) vom Typ 2. Bei diesen handelt es sich um Hybridmoleküle, die eine Toxische (A) Untereinheit enthalten, welche nach dem Eintritt in die Zelle die Proteinsynthese irreversibel hemmt, und eine Lektin-Untereinheit (B), welche den Eintritt des RIP in die Zelle erleichtert. Typ-2-RIPs, wie z. B. Ricin, gehören zu den giftigsten, dem Menschen bekannten Substanzen, und können so geringe LD&sub5;&sub0;-Werte wie 0,1 g pro kg Körpergewicht haben. Bei langfristiger Verabreichung können sie einem Säugetier irreversiblen Schaden zufügen, was letztendlich zum Tod führt.
Die Bindung von Lektinen an Zellen variiert stark. Manche binden schwach, und bei anderen ist die Bindung sehr stark. Starke Bindung beschreibt ein Lektin, von dem nach oraler Verabreichung von 10 mg an eine Ratte, über 75% (und bis zu 100%) an den Darm binden. Bohnenlektin ist ein Beispiel für ein stark bindendes Lektin. In manchen Fällen kann starke Bindung zu Toxizität führen, und diese Lektine werden als toxisch bezeichnet.
Die Lektine der vorliegenden Erfindung beinhalten solche, die entweder in natürlich vorkommenden Zusammensetzungen vorkommen oder daraus gereinigt sind (in jeglichem Ausmaß), chemisch synthetisierte Lektine, modifizierte Lektine oder Derivate (natürlich vorkommend oder synthetisch) davon. Lektinderivate beinhalten eine oder mehrere Untereinheiten von Lektinen mit mehreren Untereinheiten. Verfahren für die Produktion von Lektinen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und beinhalten die Reinigung von Lektinen aus natürlichen Quellen (Pusztai and Palmer, 1977; Carvalho, 1993) und biotechnologisch gewonnene Lektine wie in der US-Patentschrift. 4,889,842 beschrieben.
Gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung kann jedes Lektin verwendet werden. Es sind viele Lektine bekannt. Ein häufig verwendetes Verfahren zum Charakterisieren von Lektinen ist deren Kohlenhydratbindungsspezifität. Eine Anzahl von spezifischen Gruppen der Kohlenhydratbindung beinhaltet: N-acetyl-D-Galaktosamin, -D-Mannose, -L-Fukose, Beta- Laktose, Galaktosyl-beta-(1-3)-N-Acetyl-D-Galaktosamin, D-Glukose, N-Acetyl- Glukosamin, N-Acetyl-Neuraminsäure. Manche Lektine gehören zu mehr als einer spezifischen Gruppe der Kohlenhydratbindung. Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung sind Lektine aus: Gartenbohne, Sojabohne, Jack-Bohne, Weizenkeimen, Lotussamen, Zwiebel, Linsen, Tomaten, Kartoffeln und Kombinationen von zwei oder mehreren davon.
Da Lektine Proteine sind, sind sie eindeutig einer Destabilisierung/Denaturierung durch eine Anzahl von Parametern wie Hitze, Säure, Laugen, etc. unterworfen. Manche Lektine sind diesen Effekten gegenüber resistenter als andere. Da die Verwendung von Lektinen in der vorliegenden Erfindung (durchgehend) deren Proteineigenschaften erfordert, ist es wichtig, dass die Lektine vor oder während ihres Einsatzes (z. B. in den stark sauren Bedingungen im Magen und den schwach basischen Bedingungen des unteren Darms) nicht vollständig zerstört oder denaturiert werden. Entsprechend kann es erforderlich sein, dass Lektine zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung zunächst hinsichtlich ihres Verhaltens während der Verarbeitung und/oder Verabreichung charakterisiert werden müssen. Eine solche Charakterisierung ist Standardtechnik und kann leicht von allen Fachleuten durchgeführt werden. Die Konzentration an Lektin, die für einen der Aspekte der Erfindung benötigt wird, variiert, wenn das Lektin denaturiert oder destabilisiert wurde.
Die Konzentrationen der Lektine, die in diesem Text bereitgestellt werden, beruhen auf deren natürlichen Eigenschaften mit tatsächlich keiner Verringerung ihrer Aktivität durch Denaturierung oder Destabilisierung. Die bereitgestellten Konzentrationen der Lektine sind daher nicht absolut, sondern spiegeln die Aktivität des Lektins wider. Dementsprechend entspricht z. B. eine Zusammensetzung, die ein Lektin enthält, dessen Aktivität um die Hälfte verringert wurde, jedoch in doppelter Konzentration vorhanden ist, einer Zusammensetzung, die nur die halbe Menge an Lektin enthält, die Aktivität des Lektins jedoch nicht verändert wurde. Darüber hinaus kann die Aktivität eines jeden Lektins durch Modifikation erhöht werden, beispielsweise während rekombinanter Herstellung und/oder durch Produzieren kürzerer Mutanten mit erhöhter Aktivität. Dieselben Überlegungen wie hinsichtlich der Konzentration gegenüber der Aktivität von Lektin gelten auch für Lektine mit erhöhter Aktivität. Alle modifizierten Lektine werden von der vorliegenden Erfindung abgedeckt, einschließlich diejenigen mit erhöhter oder verringerter Aktivität, und beinhalten beispielsweise verkürzte Lektinmonomere mit voller oder modifizierter Aktivität.
Die Lektine gemäß der vorliegenden Erfindung sind gewebsschützende Mittel.
Der erste und zweite Aspekt der Erfindung betrifft die Herstellung von Medikamenten, für die das spezielle Dosisschema letztendlich vom behandelnden Arzt bestimmt wird, und zieht solche Faktoren in Betracht wie das oder die eingesetzten Lektine, die Art des Tieres, dessen Alter, Gewicht, Schwere der Symptome und/oder Grad der derzeit verabreichten oder geplanten Behandlung, Verfahren zur Verabreichung der Zusammensetzung, Gegenreaktionen und/oder andere Gegenanzeigen. Spezifisch definierte Dosisbereiche können durch standardmäßig konzipierte klinische Studien bestimmt werden, in denen der Fortschritt und die Verbesserung des Zustands des Patienten umfassend überwacht werden. Solche Studien können so konzipiert sein, dass die Dosis erhöht und als Einstiegsdosis ein geringer Prozentsatz der von Tieren tolerierten Höchstdosis verwendet wird. Vorläufige Anhaltspunkte in Bezug auf den Dosisbereich können den Ergebnissen, die im experimentellen Abschnitt dieses Textes gegeben sind, und den folgenden Bereichen, die auf den Menschen extrapoliert wurden, entnommen werden.
Eine geeignete Obergrenze scheint eine Konzentration eines Lektins von bis zu etwa 0,3 g pro kg Körpergewicht pro Tag zu sein. Eine Konzentration von 0,3 g pro kg Körpergewicht pro Tag kann zwar eine Magendarmstörung bei einem Patienten hervorrufen, diese Symptome können jedoch auf der Basis, dass der Patient damit bei Krankheiten wie Krebs eine gesteigerte Überlebenschance hat, akzeptabel sein. Eine geeignete Untergrenze scheint eine Konzentration eines Lektins von zirka 0,0001 mg (0,1 ug) pro kg Körpergewicht pro Tag zu sein. Bevorzugte Zwischendosiskonzentrationen beinhalten das Vorhandensein eines Lektins bis zu zirka 0,2 g, 0,15 g und 0,05 g pro kg Körpergewicht pro Tag, und danach von Konzentrationen von zirka 1 mg, 0,5 mg, 0,1 mg, 0,01 mg und 0,005 mg pro kg Körpergewicht pro Tag. Jede dieser Konzentrationen kann als Ober- und/oder Untergrenze verwendet werden und stellt damit eine Vielzahl von nützlichen Konzentrationsbereichen bereit. Im Hinblick auf die Konzentrationen von Lektinen zur Verabreichung kann die Lektindosis leicht erhöht werden, wenn sie nicht für einen therapeutischen oder prophylaktischen Effekt verwendet wird.
Die Medikamente für alle Aspekte der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die erforderliche Konzentration des Lektins in einer oder mehreren "Einnahmen" pro Tag bereit zu stellen ("Einnahme" einschließlich jede Form der Verabreichung). Manche Aspekte der Erfindung eignen sich für eine einzige Einnahme einer hohen Lektinkonzentration, während sich andere für eine Anzahl von Einnahmen eignen, wobei diese gleich oder ungleich über denselben Zeitraum verteilt sind, jedoch mit einer geringeren Lektinkonzentration pro Einnahme oder mit geteilten Dosierungen.
Verwendung des Lektins bei der Herstellung irgendeines Medikaments gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger und/oder Exzipienten erfolgen. Solche Träger und Exzipienten sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (z. B. Handbook of Pharmaceutical Excipients (1994) 2nd Edition, Eds. A. Wade/P. J. Weller, The Pharmaceutical Press, American Pharmaceutical Association). Von besonderer Verwendung sind gemäß der vorliegenden Erfindung Zusammensetzungen und/oder Medikamente, die in einem Arzneimittelverabreichungssystem für den Darm oder in einer Kapsel formuliert sind.
Der erste und zweite Aspekt der Erfindung deckt auch die Verwendung eines Lektins in Kombination mit einem Zellschutzmittel ab. Das Zellschutzmittel ist bevorzugt ein Strahlensensitivierer, ein chemoprotektives Mittel (einschließlich freie Sammler), ein Wachstumsfaktor oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon. Von der obigen Liste von Zellschutzmitteln sind die folgenden Beispiele bevorzugt: Strahlensensitivierer - Vitamin-K-Mimetika, wie beispielsweise Synkavit oder Menadion, Gadolinium-Texaphyrin oder Iobenguan (([[3-Iodo-13311)phenyl]methyl]guanidin); chemoprotektive Mittel - Suleraphat, Cystein, Cysteamin, Ethyol, Balazipon oder Dosmalfat; freie Radikalfänger - WR 3689 (2-[[3-Methylamino)propyl]amino]ethandioldihydrogenphosphatester, AD 20 (2[[2-Methoxyphenyl)acetyl]amino]-2-propansäure oder Nitroxid-Antioxidans; Wachstumsfaktoren - Granulozyten-Kolonie-Stimulierender-Faktor (granulocyte-colony stimulating-factor; G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierender-Faktor (granulocyte-macrophage colony-stimulating-factor; GM-CSF); Erythropoietin (EPO), epidermaler Wachstumsfaktor (epidermal growth factor; EGF), Keratinozyten- Wachstumsfaktor (keratinocyte growth factor; KGF), transformierender Wachstumsfaktor (transforming growth factor; TGFα und β), jedes Interleukin, einschließlich IL-11 und IL- 15, insulinähnlicher Wachstumsfaktor (insulin-like growth factor; IGF), Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor; NGF), von Blutplättchen abstammender Wachstumsfaktor (platelet derived growth factor; PDGF), Bombesin, Relaxin, Calcitonin, aus Kolostrum stammender Wachstumsfaktor (colostrum derived growth factor; CDGF), Amlexanox oder Amoxanox; Protegrin, Pilocarpinhydrochlorid, Stammzellfaktor (stem cell factor; STF), Thrombopoietin, Steel factor (SF), jedes Interferon, einschließlich Interferone oder alle Zytokine.
Außer den Zellschutzmitteln kann das Medikament eine oder mehrere andere pharmazeutische Verbindungen/Mittel beinhalten. Insbesondere können antimikrobielle Mittel enthalten sein. Solche Mittel können enthalten sein, um Infektionen zu bekämpfen, zum Beispiel sekundäre Infektionen in Verbindung mit Schleimhautentzündung, Darmentzündung, Reizdarmsyndrom, etc.
Das gemäß einem Aspekt der Erfindung hergestellte Medikament wird vorzugsweise über den Mund oder rektal verabreicht (zur leichteren Verabreichung an einen oder mehrere Teile des Darms), obwohl auch eine parenterale Verabreichung des Medikamentes verwendet werden kann.
Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Lektin umfasst, und zwar zur Verwendung für die Steuerung der Proliferation der Schleimhautzellen, die Verringerung und/oder Behandlung von Schäden, verursacht durch ein zellschädigendes Mittel, oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon. Dieser Aspekt der Erfindung gilt insbesondere für Lektine, von denen zuvor nicht bekannt war, dass sie medizinischen Nutzen haben. Relevante Merkmale des ersten, zweiten und dritten Aspektes der Erfindung betreffen auch den vierten Aspekt der Erfindung.
Gemäß einem fünften Aspekt der Erfindung gibt es eine Zusammensetzung, die ein Lektin und ein Zellschutzmittel enthält. Solch ein Aspekt der Erfindung kann den ersten und/oder zweiten Aspekt der Erfindung betreffen, da es sich dabei um eine Ausführungsform eines Medikamentes handeln kann, das gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung hergestellt ist. Demgemäß gelten oben beschriebene, relevante Merkmale des ersten und zweiten Aspektes der Erfindung auch für den fünften Aspekt der Erfindung. Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung ist eine, in der das Lektin mindestens teilweise gereinigt oder isoliert ist.
Die Zusammensetzung des fünften Aspekts der Erfindung kann eine gemischte Zubereitung zur Verabreichung sein oder eine kombinierte Zubereitung für gleichzeitige, einzelne oder sequenzielle Verwendung (oder Verabreichung). In der kombinierten Zubereitung können entweder das Lektin oder der Zellschutzanteil der Zusammensetzung zuerst verabreicht werden.
Der fünfte Aspekt der Erfindung eignet sich besonders für die Verwendung zur Verringerung oder Behandlung von Schäden, die durch ein zellschädigendes Mittel hervorgerufen werden, insbesondere Strahlung und/oder Chemotherapie. Entsprechend kann es angezeigt sein, pharmazeutisch akzeptable Exzipienten und/oder Träger in die Zusammensetzung einzuschließen, wie beschrieben gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der Erfindung. Wie gleichfalls gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der Erfindung beschrieben, ist die Zusammensetzung gegenüber biologischer Materie, die am empfindlichsten gegen zellschädigende Mittel ist, insbesondere Strahlung und Chemotherapie, am wirkungsvollsten.
Alle relevanten Merkmale der Aspekte eins bis vier der vorliegenden Erfindung gelten auch für den fünften Aspekt.
Ein sechster Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung gemäß dem fünften Aspekt der Erfindung. Das Verfahren kann das Zumischen des Lektins und des Zellschutzmittels umfassen, gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren Bestandteilen, wie z. B. zusätzliche Zellschutzmittel, antimikrobielle Mittel und/oder pharmazeutisch akzeptable Exzipienten und/oder Träger. Alternativ können für eine Zusammensetzung, bei der die verschiedenen Bestandteile gleichzeitig, einzeln oder nacheinander verabreicht werden, die einzelnen Bestandteile zubereitet werden, die sich in Kombination mit anderen Bestandteilen, einschließlich pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und/oder Trägern befinden.
Für alle therapeutischen (alleinigen) Aspekte der Erfindung (d. h. bei denen das Lektin nur nach einer Behandlung, nach einer Quelle eines zellschädigenden Mittels, etc.) verwendet wird, beträgt die bevorzugte Dosis des Lektins weniger als 0,2 g pro kg Körpergewicht pro Tag.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch eine Zahl nicht-einschränkender Beispiele veranschaulicht. Die Beispiele beziehen sich auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
Fig. 1 die Trockenmasse von Ratten zeigt, die 10 Tage lang mit Futter mit unterschiedlichen Mengen von Phytohämagglutinin gefüttert wurden (Experiment 1a, b, c).
Fig. 1a; Trockenmasse des Körpergewichtes gegen mg PHA/Tag und Fig. 1b relative Trockenmasse des Körpergewichtes gegen log10 (mg PHA/Tag). (o, Experiment 1a; , Experiment 1b; Δ Experiment 1c).
Fig. 2 zeigt das Wachstum von Ratten, die in wiederholten Zyklen mit Soja- Albumin-Futter, gefolgt von Laktalbuminfutter, gefüttert wurden, im Vergleich zu dem von Ratten, die parallel während des ganzen Experimentes mit einem Kontrollfutter gefüttert wurden. Es sind auch die Zeitpunkte, zu denen die Ratten auf unterschiedliche Futter und Futteraufnahmen umgestellt wurden, angezeigt.
Fig. 3 zeigt die Auswirkungen der Verabreichung von 5-FU und PHA auf die Frischmasse des Körpergewichtes.
Fig. 4 zeigt die Auswirkungen der Verabreichung von 5-FU und PHA auf die tägliche Futteraufnahme.
Fig. 5 zeigt die Auswirkungen des lektinhaltigen Futters auf das Überleben der Tiere nach 30 Tagen, nach Erhalt einer Strahlendosis von 6,75 Gy.

BEISPIELE

Material und Methoden

Reinigung von PHA

Für die Beispiele für Fettleibigkeit und Chemotherapie wurde PHA durch Affinitätschromatographie auf Sepharose 4B-Fetuin unter Verwendung des Verfahrens nach Pusztai & Palmer (1977) mit einigen Verbesserungen (Carvalho, 1993) gereinigt. Gartenbohnen wurden mit 0,05 M Natriumboratpuffer (pH 8,0) extrahiert und durch Dialyse gegen 0,033 M Natriumacetatpuffer, pH 5,0, in Globuline und Albumine aufgetrennt. Fraktionen mit PHA vom Typ E (erythroagglutinierend) wurden auf Sepharose 4B-Fetuin bei pH 7,6 (0,05 M Tris-HCl) absorbiert und mit 0,05 M Glycin-HCl-Puffer, pH 3,0 und 0,5 M NaCl enthaltend, desorbiert, gefolgt von Dialyse und Gefriertrocknen. Für die Reinigung von PHA vom L-Typ (lymphoagglutinierend) wurde die nicht absorbierte Fraktion nach dem Entfernen kleiner Mengen an PHA vom E-Typ von den Albuminen durch Sepharose 4B-Fetuin auf einer Sulphopropylkationenaustausch-HPLC-Säule (TSK SP-SPW, 21,5 mm · 150 mm; Anachem GB Ltd) in 0,005 M Natriumacetat-Essigsäurepuffer, pH 3,8, mit 0,1 M NaCl fraktioniert und durch einen programmierten Gradienten mit ansteigender Ionenstärke (0,1-0,5 M NaCl) eluiert. Schließlich wurden die Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht durch Chromatographie auf Sephadex G-100 entfernt, und nach der Dialyse und dem Gefriertrocknen wurde reines PHA vom L-Typ erhalten. Ertrag: 0,32 g PHA vom E-Typ und 0,61 g PHA vom L-Typ pro 100 g gemahlene Gartenbohnen.
Für das Strahlentherapiebeispiel wurde PHA isoliert, indem 50 g Gartenbohnen in einer Mühle mit einem Sieb der Porengröße 1 mm zermahlen wurden. Es wurden 500 ml 0,02 M Essigsäure mit 0,1 g Ascorbinsäure zugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert wurde mit 1 M NaOH auf 5,0 eingestellt und die Lösung für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde über Nacht bei 4ºC stehengelassen und dann bei 9000 rpm 15 Minuten lang zentrifugiert. Zum Überstand wurden 0,075 g CaCl&sub2; gegeben und der pH-Wert mit 1 M NaOH auf 9,0 eingestellt. Der Überstand wurde wiederum über Nacht bei 4ºC stehengelassen und die Probe bei 3000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert. Die Probe wurde dann vor der Reinigung auf einer Fetuin-Sepharose-4B- Affinitätssäule gegen Tris (pH7,6) dialysiert. Die PHA-Spitze wurde mit einem 0,05 M Glycinpuffer eluiert, und dann wurde die PHA-Fraktion vor dem Gefriertrocknen gegen Wasser dialysiert.

Insulinassay

Die Konzentration an immunreaktivem Insulin im Plasma wurde unter Verwendung einer Doppelantikörperpräzipitationstechnik (MacRae et al., 1991) und einem Ratteninsulinstandard (Incstar Corporation, Stillwater, Min. USA) gemessen. I¹²&sup5;-markiertes Rinderinsulin, 5 uCi/0,1 ug (ref. IM38) stammte von Amersham International plc (Amersham, Bucks.) und Meerschweinchen-Antiserum gegen Schweineinsulin von Miles Scientific (Stoke Poges, Slough). Anti-Meerschweinchen-IgG-Serum und normales Meerschweinchenserum stammten von der Scottish Antibody Production Unit (Law Hospital, Carluke, Lanarkshire).

Plasmaglukose

Die Konzentration der Glukose im Plasma wurde mit dem Autoanalyseverfahren nach Trinder (1967) bestimmt.

Antikörperproduktion

Antikörper gegen KTI, BBI, LA wurden entsprechend dem Verfahren von Harboe und Inglid (1973) wie zuvor beschrieben (Hajos et al., 1995) in Kaninchen entwickelt. Antikörper gegen SBA stammten von Sigma Chemical Co (UK Ltd.).

Kompetitiver indirekter ELISA

Für die quantitative Bestimmung von SBA in Darmproben wurden indirekte ELISA- Assays verwendet (Hajos et al., 1995). Mit LA wurden die ELISA-Platten jedoch mit LA beschichtet und der Immunkomplex durch Verwendung eines Anti-LA-Antikörpers vom IgG-Typ aus Kaninchen gebildet. Ergebnisse wurden ausgedrückt als Prozent Material, erhalten aus der intragastrisch inkubierten Dosis.

Elektrophoretische Auftrennung von Antinährstoffen in Darmproben

SDS-Gelelektrophorese, gefolgt von halbtrockenem Übertragungs-Blotting auf Nitrozellulosemembranen und Immunfärbung mit antigenspezifischen Antikörpern gegen Antinährstoffe wurde wie zuvor beschrieben (Hajos et al., 1995) durchgeführt. Zusammensetzung von experimentellem Futter Tabelle 1. Zusammensetzung von Futter für Beispiele für Fettleibigkeit und Chemotherapie
Alle Bestandteile sind gegeben als g Bestandteil/kg Futter. Für die Zusammensetzung der Vitaminmischung und der Mineralstoffmischung siehe Carvalho (1993). Tabelle 2. Zusammensetzung der Futter für Sojabohnen-Antinährstoff-Beispiele
Alle Bestandteile sind gegeben als g/Bestandteil/kg Futter. Für die Zusammensetzung der Vitaminmischung und der Mineralstoffmischung siehe Grant et al. (1993). Tabelle 3. Zusammensetzung der Futter für die Strahlentherapiebeispiele
Alle Futterbestandteile sind angegeben in g/kg Futter. Der PHA-Gehalt der Gartenbohne beträgt 2,6%. Entsprechend lag die Aufnahme von PHA/Maus bei einer eingeschränkten täglichen Futteraufnahme von 6 g bei 20 mg. Zusammensetzung der Vitaminmischung: Thiamin, 1000 mg; Pyridoxin (B6), 1000 mg; Riboflavin, 100 mg; p- Aminobenzoesäure, 1000 mg; Nikotinsäure, 3000 mg; Ca-Pantothenat, 2000 mg; Folsäure, 500 mg; Biotin, 550 mg; Inositol, 40.000 mg; α-Tocopherol, 25 g; Retinylacetat, 1150 mg; Calziferol (D3), 1500 mg; Vitamin B12, 2,5 mg; Menadion, 500 mg; Cholinchlorid, 100 g; Maisstärke, 5000 g.

Verabreichung von 5-FU

300 mg von 5-Fluoruracil wurden in 14 ml destilliertes Wasser eingerührt. Es wurde langsam 1 M NaOH zugegeben, bis sich das 5-FU gelöst hatte. Die Lösung wurde auf ein Endvolumen von 20 ml gebracht. Der End-pH-Wert der Lösung betrug 8,3. Dem Tier wurde durch intraperitoneale Injektion eine Dosis von 150 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Unmittelbar nach der Injektion wurde den Ratten 15 g des Kontrollfutters angeboten, wobei das Futter für den Rest des Experimentes ad libitum verfügbar war.

Bestrahlungsquelle

Kobalt-Co&sup6;&sup0;-Strahler; insgesamt 6,75 Gy, Ganzkörperbestrahlung; Dosisrate: 0,3 Gy/Min.

Beispiel 1.

Es wurden drei separate, jedoch gleich konzipierte Experimente (I a, b, c) durchgeführt. Ratten wurden im Alter von 19 Tagen entwöhnt, 11 Tage lang mit Stammfutter und 3 Tage mit LA-Futter gefüttert (Tabelle 1), um ein Startgewicht von 82-84 g zu erreichen. Die Ratten wurden dann je nach Körpergewicht in Gruppen von jeweils fünf Ratten eingeteilt, und innerhalb einer jeden Gruppe wurden sie im Zufallsverfahren einer Behandlung zugeteilt. In jeder Gruppe wurden die Ratten täglich jeden Morgen mit 6 g Kontrollfutter, LA-Futter oder Futter auf der Basis des LA-Futters und unterschiedlichem Gehalt an PHA gefüttert, so dass ihre tägliche PHA-Aufnahme zwischen 0,65 und 42 mg/Ratte (0,007 und 0,45 g/kg Körpergewicht) betrug. Nach 10 Tagen wurde den Ratten am Morgen 2 g des jeweiligen Futters verfüttert und die Ratten genau 2 Stunden später getötet. Die Gastrocnemius-Muskeln wurden heraus geschnitten, abgespült und sowohl Körper als auch Muskeln gefriergetrocknet und gewogen. In Experiment 1c wurden die Körper zu Pulver gemahlen und zur Lipidbestimmung mit Chloroform-Methanol (2 : 1, Volumen/Volumen) extrahiert.
Das durchschnittliche Körpergewicht der Kontrollgruppen in den Experimenten 1a, b, c war sehr ähnlich und lag zwischen 23,2 und 24 g. Wurden Ratten mit Futter gefüttert, das PHA im Bereich von 0 bis 42 mg/Ratte/Tag (0 bis 0,45 g/kg Körpergewicht) enthielt, so verringerte sich das Körpergewicht in einer zweiphasigen Weise (Fig. 1a, b; Tabelle 4, 5).
Selbst bei kleinen PHA-Mengen (z. B. 4% bei 3,5 mg/Ratte/Tag; 0,04 g/kg Körpergewicht) gab es eine kleine Verringerung des Körpergewichtes, woraufhin ein relativ großer Anstieg der Lektindosis (auf zirka 0,32 g/kg) nur geringfügig mehr Verringerung des Körpergewichtes produzierte. Im Gesamtdurchschnitt aller Experimente betrug die mittlere Verringerung des Körpergewichtes bei Dosismengen unter 10 mg PHA/Tag (0,12 g/kg Körpergewicht) 1,14 im Vergleich zur Kontrolle (4,9% des Kontrollkörpergewichtes). Bei einer täglichen PHA-Dosis zwischen 10 und 27 mg (0,12 und 0,32 g/kg Körpergewicht) gab es eine weitere Verringerung von 0,64 (SA 0,21) g (2,7% des Kontrollkörpergewichtes). Bei höheren Dosismengen (0,20-0,45 g/kg Körpergewicht) war die Verringerung größer. Das Verhältnis zwischen der relativen Körpertrockenmasse (als Anteil der Nulldosiskontrolle), RBDW und der PHA-Dosis, ausgedrückt als mg/Tag aus drei separaten Fütterungsstudien (Experimente 1a, b, c) unter der PHA-Dosis von 27 mg/Tag war:
RBDW = 0,918 (SA 0,008) - 0,0334 (SA 0,0062) · log10 (Dosis PHA/27)
Über dieser PHA-Dosis war die Gleichung:
RBDW = 0,918 (SA 0,008) - 0,5138 (SA 0,0876) · log10 (Dosis PHA/27)
Veränderungen in der Trockenmasse der Gastrocnemius(Skelett-)-Muskeln folgten bei ansteigender Lektinzufuhr einem ähnlichen Trend (Tabelle 4, 5). Der proportionale Verlust an Muskelgewicht im Vergleich zu Kontrollratten tendierte dazu, zirka 1,5 bis 2,0 Mal der äquivalente Verlust von Körpergewicht zu sein (Tabelle 4, 5), bei täglichen Dosismengen unter 10 mg PHA (0,12 g/kg Körpergewicht) war jedoch die Differenz zwischen der anteilsmäßigen Abnahme von Körper- und Muskelgewicht nicht signifikant (p > 0,05).
Ähnlich wie die Verringerung von Körper- und Muskelgewicht verringerte sich der Lipidgehalt des Körpers der Ratten bei ansteigenden PHA-Mengen im Futter (Tabelle 5; Experiment 1c). Der Lipidverlust überstieg jedoch anteilsmäßig den des Körpers und des Skelettmuskels, obwohl das Verhältnis der Verluste bei allen Dosismengen ungefähr konstant blieb. Tabelle 4. Körpergewicht und Gewicht des Gastrocnemius-Muskels der Ratten, die 10 Tage lang mit Futter mit unterschiedlichen PHA-Mengen gefüttert wurden.
Alle Dosismengen wurden per Gruppe an 5 Ratten getestet. Tabelle 5. Körperzusammensetzung der Ratten, die 10 Tage lang mit Futter, das unterschiedliche PHA-Mengen enthielt, gefüttert wurden (Experiment 1c).

Fußnoten zu Tabelle 5:

In jeder Gruppe waren 5 Ratten.
*TMDW (Gesamtmuskeltrockenmasse) wurde geschätzt auf der Basis der Annahmen, dass (i) die Trockenmasse des Gastrocnemius/TMDW dieselbe ist bei allen Behandlungen, und dass (ii)für die Kontrollgruppe TMDW/BDW (Körpertrockenmasse) = 0,4 ist.
**OW (Andere Trockenmasse) wurde berechnet durch Subtraktion der Summe von LW (Lipidgewicht) und TMSW (Gesamtmuskelausgangsmasse) vom Gesamtgewicht.
PHA gilt gemeinhin als Lebensmitteltoxin, da Ratten, die nur mit Gartenbohnenproteinen, die hohe PHA-Mengen (0,8-1,0 g/kg Körpergewicht) enthalten, innerhalb ein paar Tagen sterben (Pusztai, 1991). Da PHA jedoch für keimfrei gehaltene Ratten nicht schädlich ist, ist sein toxischer Effekt in Ratten mit einer herkömmlichen Mikroflora wahrscheinlich die Folge des dramatischen Überwachstums von E.coli im Dünndarmlumen, was unter 0,2 g/kg vernachlässigbar war, jedoch abrupt und proportional mit dem Anstieg der PHA-Menge im Futter (Pusztai et al., 1993) anstieg. Beispiel 1 zeigt, dass in diesem niedrigen Konzentrationsbereich, in dem kein bakterielles Überwachstum stattfindet (unter 0,2 g/kg), die Antinährstoffeffekte von PHA in Ratten mit einer herkömmlichen Mikroflora schwach sind, da die Verringerung des Körpergewichts nach zehntägigerlektin-Exposition minimal ist. Darüberhinaus fand im Gegensatz zu der bei hohen Dosismengen beobachteten Muskelatrophie (0,45 g/kg und darüber) bei PHA-Dosismengen unter 0,10 g/kg Körpergewicht proportional zum Verlust des endgültigen Körpergewichts nur eine leichte Verringerung des Sekelettmuskelgewichts statt (Tabelle 4, 5). Relativ zur Kontrolle war der proportionale Verlust des Körpergewichtes dagegen höher als der proportionale Verlust von Muskeln, obgleich das Verhältnis zwischen den beiden ungefähr konstant blieb (Tabelle 4, 5). Die erste Wirkung des Lektins ist daher eine Stimulation des Körperfettkatabolismus, und deshalb könnte eine geringe Lektindosis eine geeignete Behandlung für metabolische Erkrankungen wie Fettleibigkeit sein.

Beispiel 2

In den Beispielen 2-5 wurde die Insulinreaktion von Ratten auf PHA getestet. In Beispiel 2 wurden Ratten mit Futter gefüttert, das 42 mg PHA/Tag enthielt, und der Insulinspiegel im Blut wurde nach 9 bzw. 10 Tagen gemessen. Einzeln gehaltene männliche Hooded-Lister-spf (specific pathogen-free)-Ratten wurden nach 19 Tagen entwöhnt und etwa 14 Tage ad lib mit Stammfutter gefüttert (Special Diet Services, Manea, Cambridgeshire), gefolgt von eingeschränkter Fütterung (8 g/Ratte/Tag) mit einem Kontrollfutter auf Laktoalbuminbasis (LA; Tabelle 1) für 5 Tage. Ratten wurden dreimal täglich gefüttert; mit 2,5 g um 9 Uhr morgens; 1,0 g um 13 Uhr und 4,5 g um 18 Uhr. Am fünften Tag zwischen 9 Uhr und 9.30 Uhr wurde den Ratten 1,5 g LA-Futter gegeben und 2 Stunden später wurden aus der Schwanzvene präexperimentelle Blutproben entnommen. Das Blut wurde in heparinisierten Röhrchen (15 ul Heparinlösung mit 26 USP Einheiten/Röhrchen) abgenommen und in einer Tischzentrifuge bei +1ºC 15 Minuten lang zentrifugiert. Zur Trennung des Plasmas von den Erythrozyten wurden Plastikgranula verwendet; es wurde in Aliquots von 100 ul aufgeteilt und bis zur Analyse bei -20ºC aufbewahrt. Die Ratten wurden dann im Zufallsverfahren in zwei Gruppen mit 13 Tieren aufgeteilt und einzeln gehalten. Gruppe 1 wurde 10 Tage lang ausschließlich mit einem bohnenhaltigen Futter (KB-Futter; Tabelle 1) gefüttert (8 g Futter/Ratte/Tag; aufgeteilt in 3 Mahlzeiten; mit 2,5 g um 9 Uhr; 1 g um 13.00 Uhr und 4,5 g um 18 Uhr), während die Kontrollgruppe parallel in Paarfütterung unter den gleichen Bedingungen mit LA-Futter gefüttert wurde. Am 9.Tag wurden am Morgen genau 2 Stunden nach der Morgenfütterung von 1,5 g des GB-Futters Blutproben genommen, und dieses Protokoll wurde am 10ten (letzten) Tag wiederholt. Die Ratten wurden dann unter Ätherbetäubung getötet, der Bauchraum geöffnet und das restliche Blut aus dem Herzen entnommen. Der Magendarmtrakt wurde zusammen mit der Bauchspeicheldrüse entnommen und nach raschem Abspülen mit eiskaltem Wasser in flüssigem Stickstoff eingefroren. Mit den Kontrollratten wurden auf die gleiche Weise verfahren, außer dass ihnen vor Entnahme der Blutproben 1,5 g LA-Futter verabreicht wurde. Die Plasmaproben wurden bis zur Insulinanalyse gefroren aufbewahrt.
Aus der Bauchspeicheldrüse wurde Insulin extrahiert (sechs zufällig ausgewählte Ratten in jeder Gruppe), indem eine Probe dieses Gewebes mit 10 ml angesäuertem Ethanol (Ethanol : Wasser : konz. H&sub2;SO&sub4; = 96 : 18 : 2,5; Volumen/Volumen/Volumen) über Nacht im Kühlraum homogenisiert wurde (zirka 25-50 mg Trockenmasse) und dann bei 1.500 g 10 Minuten lang gekühlt zentrifugiert wurden. Der klare Überstand wurde mit Insulinassaypuffer auf zirka 1 : 200 (Volumen/Volumen) verdünnt, bevor er im Insulinradioimmungssay verwendet wurde.
Das Füttern der Ratten mit KB mit 42 mg PHA/Ratte/Tag (0,45 g/kg Körpergewicht)über 10 Tage verringerte die Plasmainsulinkonzentration signifikant und zwar von einem präexperimentellen Spiegel von 2,97 (SA 0,84) ng/ml auf 0,36 (SA 0,05) am 9.Tag des Experiments (Tabelle 6). Der Abfall war offensichtlich während der PHA- Exposition permanent, da die am 10ten Tag abgenommenen Blutproben ähnlich gering waren, 0,23 (SA 0,06) ng Insulin/ml. Im Gegensatz dazu blieb der Plasmainsulinspiegel in den Kontrollen hoch, d. h. 3,31 (SA 0,30) ng/ml am 9.Tag der Fütterung und 1,55 (SA 0,21) ng/ml am 10.Tag der Fütterung. Tabelle 6. Gewicht und Insulingehalt der Bauchspeicheldrüse von Ratten, die 10 Tage lang mit Futter gefüttert wurden, das Gartenbohnen oder Laktalbumin (Kontrolle) enthielt.
GB = Gartenbohnenfutter, LA = Laktalbuminfutter
Die Werte sind Mittelwerte ±SA für 6 Tiere in jeder Gruppe. *Signifikant unterschiedlich gegenüber mit Laktalbumin gefütterten Kontrollen (p < 0,01).
Das absolute und relative Trockengewicht der Bauchspeicheldrüse von Ratten, die 10 Tage lang mit GB-Futter mit der höchsten PHA-Dosis gefüttert wurden, war im Vergleich zu den paargefütterten Kontrollen signifikant erhöht (Tabelle 6). Im Gegensatz dazu war der Insulingehalt der Bauchspeicheldrüse, ausgedrückt als ug/Bauchspeicheldrüse oder ug/g Protein, signifikant verringert. Trotz der hochsignifikanten Verringerung des Insulinspiegels waren die Plasmaglukosekonzentrationen in mit GB gefütterten Tieren nicht signifikant verändert und hatten sowohl bei behandelten Tieren als auch bei Kontrolltieren einen allgemeinen Durchschnittswert von 1,7 (SA 0,1) mg Glukose/ml.
Die zuvor vermutete Verbindung zwischen den starken katabolischen Effekten hoher Dosismengen an PHA auf den Körpermetabolismus von Lipiden, Kohlehydraten und Proteinen und sein Absenken der Plasmainsulinspiegel (Pusztai, 1991) wurde nunmehr bestätigt. In der Tat waren die Insulinspiegel während der 10-tägigen oralen Exposition der Ratten gegenüber PHA nicht nur in der Blutzirkulation verringert, sondern es war auch der Insulingehalt der Bauchspeicheldrüse in diesen Tieren signifikant verringert.

Beispiel 3

Ratten wurden im Alter von 19 Tagen entwöhnt, in Gruppen von 8-10 Ratten gehalten und 12 Tage lang mit Stammfutter gefüttert. Sie wurden im Zufallsverfahren in zwei Gruppen aufgeteilt (je 13 Ratten pro Gruppe), für den Rest des Experimentes einzeln gehalten und weitere 8 Tage mit Stammfutter gefüttert. Nach einer Nacht Fasten wurde den Ratten am Morgen 2 g Stammfutter gegeben und 2 Stunden später Blutproben entnommen (präexperimentelle Probe). Unmittelbar danach wurden die Ratten intragastrisch mit einem 1 ml-Extrakt von GB (50 mg; 5-7 mg PHA) inkubiert, während die Kontrollen eine Dosis von 1 ml 0,01 M phosphatgepufferter Salzlösung (0,9% NaCl; Gewicht/Volumen; PBS) erhielten. Von jedem Tier wurden 15, 60 und 120 Minuten nach der Inkubation Blutproben entnommen. Eine einzige Dosis einer löslichen GB-Proteinprobe verursachte eine allmähliche Abnahme des Plasmainsulins. Der präexperimentelle Wert von 1,78 (SA 0,22) ng Insulin/ml Plasma verringerte sich nach 120 Minuten auf 1,05 (SA 0,22) ng/ml, d. h. um zirka 59% des Anfangswertes (Tabelle 7). Bei den Kontrollratten blieb der Insulinspiegel in etwa konstant, und zwar zu allen Zeitpunkten innerhalb des experimentellen Fehlerbereichs (1,76 (SA 0,42) ng/ml)). Tabelle 7. Relative Insulinspiegel (ausgedrückt als % der Kontrolle) in Ratten nach akuter intragastrischer Verabreichung von Gartenbohnen oder gereinigten Lektinen vom E- Typ und L-Typ.
Die Ergebnisse sind Mittelwerte ±SA, und * gibt an, dass der Mittelwert sich signifikant von 100 unterscheidet (p < 0,05).

Beispiel 4

Beispiel 4 wurde in der gleichen Weise wie Beispiel 3 durchgeführt, außer, dass die Versuchstiere über eine Sonde 1 ml Lösung von entweder 5 mg Lektin vom E-Typ oder mit 5 mg Lektin vom L-Typ erhielten. Einige dieser Lektinproben waren mit I¹²&sup5; markiert (Gesamtdosis 2,5-3 Millionen cpm). Die Kontrollen erhielten PBS. Wie zuvor wurden nach 1, 15, 60 und 120 Minuten Blutproben entnommen. Um die tatsächliche Menge an PHA, das ins Duodenum weiter geleitet wurden, zu messen, wurde in einigen Ratten, die 1 oder 2 Stunden nach der Inkubation getötet wurden, sowohl in Auswaschungen des Magens und des Dünndarms die Strahlenaktivität gemessen.
Bei Ratten, die mit reinem PHA vom E-Typ inkubiert wurden, waren die präexperimentellen Plasmainsulinspiegel auch nach den ersten 60 Minuten auf 1,03 (SA 0,32) ng/ml verringert und zwar in ähnlicher Weise wie bei den Tieren, die über eine Sonde KB-Proteine (Tabelle 7) erhielten. Dennoch ergab sich anscheinend während der nächsten 60 Minuten eine leichte Erholung, weshalb die Veränderung des Insulinspiegels nach 120 Minuten nicht signifikant unterschiedlich (p > 0,05) zum präexperimentellen Wert war. Eine kleine Dosis von PHA vom L-Typ ergab anscheinend ebenfalls eine stufenweise Verringerung des Plasmainsulins, jedoch waren die Veränderungen an jedem der Zeitpunkte während der 120 Minuten des Experiments nicht signifikant (1,39 SA 0,35 ng/ml bei 120 Minuten). Die Raten der Magenentleerung bei den mit den Lektinen inkubierten Ratten waren langsam und für die beiden PHA-Typen nicht signifikant unterschiedlich (p > 0,05). Beim E-Typ erreichten nach 120 Minuten zirka 52% der Anfangsdosis den Dünndarm, während es bei PHA vom L-Typ etwas mehr war, d. h. zirka 63%. Plasmaglukosespiegel waren bei akuter Exposition mit PHA und/oder KB-Albuminen von 1,6 (SA 0,2) auf 1,4 (SA 0,2) leicht verringert, jedoch war die Verringerung nicht signifikant (p > 0,05).
Ein Futter, das reines PHA entweder vom E-Typ oder vom L-Typ enthielt, war in der Lage, eine Reduktion des Seruminsulins hervorzurufen, wie es mit einem Futter beobachtet wurde, das Gartenbohnenprotein enthält. Die Verringerung des Seruminsulins ist daher auf einen direkten Effekt des PHA zurückzuführen und nicht auf die schlechte Nährstoffqualität des Bohnenproteins.

Beispiel 5

Sechzehn, an Tag 19 entwöhnte und während des Experimentes einzeln gehaltene Ratten wurden 15 Tage lang mit Stammfutter und dann 5 Tage mit LA-Futter gefüttert (8 g Futter/Ratte/Tag). Zwölf zufällig ausgewählte Ratten wurden dann während der nächsten 3 Tage auf ein Futter umgestellt, das Gartenbohnenalbumin (GBA-Futter; Tabelle 1) enthielt, und zwar mit einer täglichen Aufnahme von zirka 30 mg PHA/Ratte, während vier Kontrollratten weiter das LA-Futter erhielten. Am Abend des dritten Tages erhielten die mit GBA- Futter gefütterten Ratten keine Abendmahlzeit, sondern wurden intragastrisch mit einer 1 ml Lösung mit einer 100 g GBA-Probe mit 25 mg PHA inkubiert, während die Kontrollen die Abendportion ihres LA-Futters erhielten. Danach wurden die Tiere bis zum nächsten Morgen nicht mehr gefüttert, erhielten dann aber alle 2 g LA-Futter, um ihren Plasmainsulinspiegel zu erhöhen. Genau 2 Stunden später wurde den Ratten Blut abgenommen (präexperimentelle Probe), die zuvor mit GBA gefütterten Ratten wurden zufällig in Gruppen von vier eingeteilt und erhielten 1 ml Lösungen mit entweder 20 mg GBA oder 5 mg PHA-Lektin vom E-Typ oder vom L-Typ, manche davon markiert mit I¹²&sup5;, als Gavage. Als Vergleich erhielten die vier Kontrollratten über eine Sonde GBA (40 mg; 4- 6 mg PHA). Nach 120 Minuten wurde den Ratten eine Blutprobe entnommen, die Tiere getötet und die Bauchspeicheldrüse entnommen und für Insulinanalysen eingefroren.
Intragastrische Inkubation mit einer einzigen Dosis gereinigter PHA-Isolektine von Ratten, die mit GB-Albuminprotein-haltigem Futter oder einem Kontrollfutter vorgefüttert und 3 Tage lang mit PHA-Dosismengen intubiert wurden, verringerte wesentlich die Plasmainsulinkonzentration im Kreislauf. Sowohl mit den E-Typ-Lektinen als auch mit den L-Typ- Lektinen war die Differenz zwischen den präexperimentellen Insulinspiegeln (0,59 (SA 0,05)ng/ml) und den 120-Minuten-Werten ((0,15 (SA 0,09) ng/ml) signifikant (p > 0,05). Auch das Vorfüttern schien die Rate der Magenentleerung der intragastrisch verabreichten E-Typ-Lektine zu beschleunigen, da innerhalb der ersten 60 Minuten über 80% der Dosis das Duodenum erreichten. L-Typ-Lektine erreichten das Duodenum dagegen langsam, und nach den ersten 60 Minuten waren immer noch zirka 50% der Anfangsmenge PHA im Magen. Trotz der Differenz der absoluten Plasmainsulinkonzentrationen zwischen den Ratten, die mit GBA-Futter vorgefüttert wurden (niedrig), und denen, die mit Kontrollfutter gefüttert wurden (mäßig hoch), war die proportionale Verringerung des Plasmainsulins nach dem Verabreichen von GB-Albumin-Proteinen mit einer Sonde bei den Ratten beider Gruppen ähnlich. Der Insulingehalt der Bauchspeicheldrüse war nach dreitägiger Vorfütterung mit dem GBA-Futter leicht, aber nicht signifikant verringert, und zwar von 58,3 (SA 10,8) bei den Kontrollen auf 42,5 (SA 8,3) (g Insulin/Bauchspeicheldrüse). Es lagen jedoch keine signifikanten Veränderungen der präexperimentellen Durchschnittswerte der Plasmaglukose von zirka 1,6 (SA 0,2) mg/ml vor, obwohl die Werte während des Experimentes leicht abfielen. Es gab keine signifikanten Veränderungen in Bezug auf Körper- und Muskelgewicht nach der 3-tägigen PHA-Exposition.

Beispiel 6

Fütterungsstrategie zum Überwinden der Antinährstoffeffekte von Soja durch Ausnutzung des Anstiegs der Futterumstellungseffizienz nach kurzzeitigen Exposition der Ratten auf Sojamolke mit einem hohen Gehalt von Agglutinin.
Männliche Hooded-Lister-Ratten wurden im Alter von 19 Tagen entwöhnt und erhielten 7 Tage lang freien Zugang zum Stammfutter (Labsure, Manea, Großbritannien) und wurden danach 3 Tage lang ad libitum mit einem LA-Kontrollfutter (100 g Laktalbuminprotein/kg; Tabelle 2) gefüttert, gefolgt von 5-tägigen Verfüttern von 6 g desselben Futters/Ratte/Tag. Zu jedem Zeitpunkt war Wasser frei verfügbar. Die Ratten wurden dann in 2 Gruppen mit jeweils 5 Ratten aufgeteilt. Das Futter für die experimentelle Gruppe enthielt 100 g/kg Protein auf der Basis von SBALB (Tabelle 2). Die Ratten in der Kontrollgruppe wurden während des Experimentes mit LA-Futter gefüttert, und dessen Menge war beschränkt auf die freiwillige Aufnahme durch die Versuchstiere. Das Experiment war so konzipiert (Fig. 2), dass der Sojagruppe zu Anfang 7 Tage lang Sojafutter gegeben, dann 8 Tage auf LA-Futter umgestellt und danach wieder 7 Tage lang Sojafutter und 7 Tage lang LA-Futter gegeben wurde. Nach weiteren 6 Tagen mit Sojafutter, gefolgt von 20 Tagen LA-Futter, wurden die Ratten schließlich 5 Tage lang mit Sojafutter gefüttert. Am folgenden Morgen, d. h. am 61sten Tag des Experimentes mit kombinierter Fütterung, wurde allen Ratten 2 g LA-Futter verabreicht, wonach die Sojagruppe intragastrisch mit 280 mg SBALB, gelöst in 2 ml Salzlösung, inkubiert wurde, während die Kontrollen nur Salzlösung erhielten. Die Ratten wurden genau 90 Minuten später mit einer Überdosis Halothan getötet und vollständig seziert. Es wurden der Magen und der Dünndarm entfernt und der Dünndarm in 10 cm lange Stücke geschnitten. Das Lumen eines jeden Gewebestücks wurde mit 2 ml eiskaltem, destilliertem Wasser gewaschen, gefriergetrocknet und später mit destilliertem Wasser (1 mg Trockenmasse/100 ul) rekonstituiert und im ELISA verwendet. Für die histologische Untersuchung wurde eine gespülte Dünndarmsektion von 2 cm (zwischen 5-7 cm vom Pylorus entfernt) verwendet. Alle Gewebe wurden gefriergetrocknet und gewogen. Die Körper der Ratten wurden ebenfalls gefriergetrocknet und für die Bestimmung des Protein- und Lipidgehaltes verwendet. Magen und Dünndarmsektionen wurden mit 0,1 M Galaktoselösung (5 ml/Trockenprobe) homogenisiert (3 Mal), und diese Extrakte wurden im ELISA verwendet. Während des ganzen Experimentes wurde täglich der Kot gesammelt und zur Stickstoffbestimmung verwendet.
In einem Kontrollexperiment wurde der erste Zyklus des Umstellungsexperimentes wiederholt, dieses Mal jedoch wurde außer der SBALB-Gruppe eine zweite Gruppe von Ratten 7 Tage lang zunächst mit einem LD-SBALB-haltigen Futter anstatt mit SBALB- haltigem Futter gefüttert, gefolgt von LA-Futter für 8 Tage, während die Kontrollratten während der ganzen 15 Tage des Experimentes paarweise das LA-Futter erhielten. Gewichtszunahme, Verdaulichkeit und Effizienz der Futterumstellung der beiden Versuchsgruppen wurden in den beiden separaten Teilen des Zyklus mit denen der Kontrollgruppe verglichen.
Die in den Fütterungsexperimenten verwendete Zubereitung enthielt, wie im ELISA gezeigt, 38,7 g SBA/kg. LD-SBALB enthielt weniger als 4 g SBA/kg. Das Gewicht der Ratten, die im Wechsel mit Soja- und LA-Futter gefüttert wurden, war am Ende eines jeden Sojafütterungszeitraums, einschließlich dem letzten, immer signifikant geringer als das der entsprechenden, paarweise gefütterten Kontrollratten (Tabelle 8 & 9). Die Ratten in der Versuchsgruppe wuchsen in dem LA-Futterzeitraum, gefolgt von der Sojafütterung, jedoch immer schneller, als die Kontrollratten, die immer nur LA-Futter erhielten (Fig. 2; Tabelle 9). Die Effizienz der Futterumstellung der Versuchsgruppe im LA-Zeitraum war immer signifikant höher als die der Kontrollen (Tabelle 9). Tabelle 8. Körpergewicht (KG) und Zusammensetzung der Ratten.
Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ±SA von 5 Ratten pro Gruppe. Werte in einer waagrechten Reihe mit unterschiedlichen Indices unterscheiden sich signifikant (p ≤ 0,05). Tabelle 9. Gewichtsveränderungen und Effizienz der Futterumstellung bei Ratten in den Versuchs- und Kontrollzeiträumen.
In jedem Zeitraum unterscheiden sich in einer waagrechten Reihe die Werte mit unterschiedlichen Indices signifikant (p ≤ 0,05):
Im Soja-Fütterungszeitraum waren Gewicht und Stickstoffgehalt des Kots in der Versuchsgruppe signifikant höher als die der Kontrollratten. In den LA-Fütterungszeiträumen gab es zwischen den Ratten der Versuchs- und der Kontrollgruppe jedoch keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf diese Kotwerte. Darüber hinaus waren in den beiden Gruppen weder der Lipid- und Proteingehalt noch deren Konzentration in den Rattenkörpern signifikant unterschiedlichen (Tabelle 8).
Ratten, die im Versuchszeitraum mit LD-SBALB gefüttert wurden, nahmen mehr Gewicht zu und hatten eine bessere Effizienz der Futterumstellung als die mit SBALB gefütterten Ratten, aber ihre Leistung war dennoch unter der der mit LA-Futter gefütterten Ratten (Tabelle 10). Die im Kontrollzeitraum von LD-SBALB- auf LA-Futter umgestellten Ratten zeigten jedoch keine signifikante Verbesserung der Effizienz der Futterumstellung wie es bei den SBALB-Ratten im LA-Futter-Fütterungsteil des Zyklus der Fall war (Tabelle 10). Tabelle 10. Effekt der Lektindepletion auf Gewichtszunahme und Futterumstellung.
In jedem Zeitraum unterscheiden sich in einer waagrechten Reihe die Werte mit unterschiedlichen Indices signifikant (p ≤ 0,05).
Auswirkungen auf die inneren Organe. Das Gewicht des Magens, Dünn- und Dickdarm, Milz, Nieren, Thymus, Lunge, Herz und Gastrocnemiusmuskel waren durch das abwechselnde Füttern der Ratten mit Soja- und LA-Futter über 61 Tage nicht beeinflusst. In der Testgruppe war jedoch das Gewicht der Bauchspeicheldrüse signifikant höher und das der Leber geringer bei den Kontrollen.
Die Schlussfolgerung ist, dass eine Futterumstellung, bei der die Ratten abwechselnd und in kurzen Zyklen mit Soja- oder Laktalbuminhaltigem Futter gefüttert wurden, gezeigt hat, dass es möglich ist, das durch SBA oder anderen Lektinen hervorgerufene hyperplastische Wachstum dazu zu nutzen, sowohl die Absorption als auch die Verwertung hochwertiger Nährstoffe zu verbessern, wenn hochwertiges Futter verfüttert wird. Mit diesem neuartigen Verfahren ist die Weiterverarbeitung von Futtermitteln, die Soja oder andere Lektine enthalten, unnötig, und darüber hinaus können Sojaabfallprodukte oder andere lektinhaltige Futtermittel, die hohe Lektinmengen enthalten, verwendet werden (einschließlich insbesondere die Molkefraktion, die nach dem Entfernen der Sojaglobulinproteine für viele industrielle Anwendungen übrig bleibt).

Beispiel 7

Es wurde die Fähigkeit von oral aufgenommenem PHA zum Schutz von Ratten vor einer hohen Dosis Chemotherapie und besonders dessen gewebsschützender Effekt auf den Darm untersucht.
Vier Gruppen, jede bestehend aus 5 Ratten, wurden über einen Zeitraum von 7 Tagen bei einem genauen Futterschema gehalten (Tabelle 11).

Tabelle 11. Chemotherapie-Fütterungsprotokolle

Behandlung Fütterungsprotokoll
1 LA-Futter durchweg, kein 5-FU
2 LA 3 Tage, 5-FU injizieren, LA 4 Tage
3 PHA 3 Tage, 5-FU injizieren, LA 4 Tage
4 PHA 3 Tage, 5-FU injizieren, 3 Tage, LA 1 Tage

Legende

LA = Laktalbumin
PHA = Phaseolus vulgaris-Agglutinin
5-FU = 5-Fluoruracil
Ratten (ca. 100 g), die zuvor eine Dosis PHA erhalten hatten, wurden 10 g des Kontrollfutters (Tabelle 1) angeboten, das 10% Laktalbumin enthielt. Jedes Tier erhielt über eine Sonde das Äquivalent von 20 mg PHA in 0,9% Salzlösung. Den Ratten wurde in zwei Mahlzeiten um 10.00 Uhr und um 17.00 Uhr jeweils das Kontrollfutter angeboten. Die verabreichte Futtermenge wurde strikt paarweise der Futtermenge angepasst, die von den Tieren gefressen wurde, die zuvor eine Dosis PHA erhalten hatten. Erhielten die Tiere unmittelbar danach eine Dosis PHA, wurde das Lektin zwei Stunden nach der Injektion von 5-FU über eine Sonde verabreicht. Tieren, die weder vorher noch nachher PHA erhielten, wurde 1 ml 0,09% Salzlösung über eine Sonde verabreicht. Nach 3 Tagen erhielten Tiere in drei der Gruppen eine Dosis von 150 mg 5-FU/kg Körpergewicht. Das Körpergewicht jedes Tieres wurde täglich notiert und das durchschnittliche Körpergewicht berechnet.
Fig. 3 (siehe auch die Daten aus Fig. 3 unten) zeigt den Effekt des Futters auf das Körpergewicht des Tieres nach Verabreichen von 5-FU. Tiere in der unbehandelten Kontrollgruppe wuchsen während des ganzen Experimentes mit gleich bleibender Geschwindigkeit (Daten nicht gezeigt). Tiere, die bei Laktalbuminfutter gehalten wurden, wuchsen 2 Tage nach Erhalt des 5-FU-Futters weiter, bevor sie begannen, Gewicht zu verlieren. Da diese Gruppe paarweise mit der Gruppe gefüttert wurde, die zuvor eine Dosis PHA erhalten hatte und deren Aufnahme durch das Vorhandensein von PHA im Futter begrenzt ist, fand eine kompensatorische Erhöhung der Futteraufnahme statt, wenn das Futter wieder ad libitum angeboten wurden, bevor sich der volle zytotoxische Effekt von 5- FU bemerkbar machte. Tiere, die drei Tage lang vor Erhalt von 5-FU PHA erhielten und mit einem Laktalbumin-haltigen Futter gefüttert wurden, behielten während der folgenden vier Tage ein stabiles Gewicht bei und erschienen normal. Während der übrigen Behandlung zeigten die Tiere vier Tage nach der 5-FU-Dosis einen 5-10%igen Gewichtsverlust.
Die Futteraufnahme jedes Tiers wurde täglich notiert und die durchschnittliche Futteraufnahme berechnet (Fig. 4 und Fig. 4 Daten unten). Bei allen Behandlungen, in denen zuvor PHA verabreicht wurden, zeigten die Tiere vor der 5-FU-Injektion einen stetigen Anstieg der Futteraufnahme. Die Tiere in der unbehandelten Kontrollgruppe war die stetig ansteigende tägliche Futteraufnahme gleich bleibend (Daten nicht gezeigt). Tiere, die das Futter mit nur Laktalbumin erhielten, verringerten ihre Futteraufnahme zirka einen Tag nach Erhalt der 5-FU-Dosis. Die Futteraufnahme von Tieren, die zuvor drei Tage lang PHA erhielten, war nach der 5-FU-Injektion 4 Tage lang gleich bleibend mit zirka 7 g/Tag. Während der übrigen Behandlung zeigte sich in den vier Tagen nach der Verabreichung von 5-FU eine ausgeprägte Verringerung der Futteraufnahme.
Am Ende des Experimentes wurden die Tiere getötet und dann seziert. Bei jedem Tier wurde die Trockenmasse der wichtigsten Organe notiert und das Durchschnittsgewicht berechnet. Das durchschnittliche Trockengewicht der wichtigsten Organe des Magendarmtraktes bei jeder Behandlung sind in Tabelle 12 gezeigt. Anhang mit Daten aus den Figuren Fig. 3. Der Effekt der Verabreichung von 5-FU und PHA auf die Frischmasse des Körpers (g). Fig. 4. Der Effekt der Verabreichung von 5-FU und PHA auf die tägliche Futteraufnahme (g). Tabelle 12. Das durchschnittliche Trockengewicht (mg) der wichtigsten Organe des Magendarmtraktes nach 7 Tagen.

Legende

Behandlungen, siehe Tabelle 11.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Verabreichung von PHA vor oder nach dem Dosieren mit 5-FU wenig Auswirkungen auf das Trockengewicht des Magens hatte. Allerdings hatte die Verabreichung von PHA Auswirkungen auf das Trockengewicht des Dünndarms. War nur Laktalbumin im Futter enthalten, so wurde der Dünndarm durch 5-FU geschädigt und das Trockengewicht war um fast 50% verringert. Wurde jedoch PHA 3 Tage lang entweder direkt davor (Behandlung 3) oder vor oder nach dem Dosieren mit PHA (Behandlung 4) verabreicht, so konnte das Lektin den Dünndarm vor einem Schaden durch 5-FU schützen, und das Trockengewicht war ähnlich wie das der Kontrolle.
Innerhalb des Dünndarms waren sowohl das Jejunum als auch das Ileumgewebe am empfindlichsten gegenüber Schäden durch 5-FU (Tabelle 12). Wurde jedoch PHA direkt vor, oder vor und nach der 5-FU-Injektion verabreicht, so konnte das Lektin einen signifikanten gewebsschützenden Effekt ausüben, besonders auf das Jejunum. Vordosieren der Tiere mit PHA drei Tage vor der 5-FU-Dosis ergab ebenfalls einen signifikanten protektiven Effekt auf den gesamten Dünndarm (Tabelle 12). Das Verabreichen von PHA entweder direkt vor (Behandlung 3) oder direkt vor und nach dem Dosieren mit 5-FU (Behandlung 4) ergab den besten gewebsschützenden Effekt. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die verabreichte PHA-Dosis das Wachstum und die Reparatur lebensfähiger Zellen im Dünndarm stimulieren und einen Schutz gegen die zytotoxischen Effekte von 5-FU bieten kann.
Nach 7 Tagen wurde den Tieren Blut entnommen und sowohl die wichtigsten molekularen als auch die wichtigsten zellulären Komponenten analysiert. Die Ergebnisse sind präsentiert in Tabelle 13. Tabelle 13. Analyse der wichtigsten molekularen und zellulären Komponenten aus dem Blut von Kontrolltieren und behandelten Tieren.

Legende

Behandlungen wie in Tabelle 3
WBK Weiße Blutkörperchen
RBK Rote Blutkörperchen
HGB Hämoglobin
HCT Hämatokrit
MCV Mittleres Korpuskularvolumen
MCH Mittleres Korpuskularhämoglobin
MCHC Mittlere Korpuskularhämoglobinkonzentration
PLT Plättchen
Nach der Verabreichung von 5-FU an die Ratten, denen das laktalbuminhaltige Futter verfüttert wurde, zeigte sich die erwartete Zytotoxizität an der Anzahl der weißen Blutkörperchen und der Plättchen. Keine der Behandlungen hatte im Vergleich zur nicht behandelten Kontrolle einen signifikanten Effekt auf die Anzahl der roten Blutkörperchen, den Hämoglobingehalt und den Hämatokrit, das mittlere Korpuskularvolumen oder die Hämoglobinkonzentration. Verabreichen von PHA direkt vor der 5-FU-Dosis (Behandlung 3) hatte im Vergleich zur Behandlung mit ausschließlich Laktalbumin (Behandlung 2) wenig Auswirkungen auf die gemessenen Parameter. Verabreichen von PHA direkt vor und nach der Dosis (Behandlung 4) erhöhte relativ zur Laktalbuminkontrolle die Zahl der produzierten weißen Blutkörperchen.
Die Ergebnisse oben lassen vermuten, dass die relative zeitliche Abstimmung des Verabreichens einer oralen Dosis eines Lektins in Relation zu dem zytotoxischen Arzneimittel die hämatologische Toxizität des Arzneimittels beeinflussen könnte.

Beispiel 8

Um einen Dosisbereich zu identifizieren, in dem das Vordosieren mit PHA den Magendarmtrakt von einer Beschädigung durch 5-FU schützte.
3 Gruppen mit Ratten (5 Ratten per Gruppe) wurden mit dem Standardfutter (Tabelle 1) gefüttert und erhielten 3 Tage lang täglich über eine Sonde entweder 200, 100 & 50 mg/kg/Tag PHA. Die Futteraufnahme einer jeden Ratte wurde täglich notiert. Ein zweiter Satz von 3 Kontrollgruppen mit Ratten (5 Ratten pro Gruppe) wurde mit dem Standardfutter gefüttert und erhielt 3 Tage lang jeden Tag über eine Sonde 1 ml Salzlösung. Jedes Tier der Kontrollgruppe wurde paarweise mit einem Tier in der mit PHA behandelten Gruppen gefüttert. Am Morgen des vierten Tages wurde jedes Tier mit 150 mg/kg Körpergewicht 5- FU injiziert und dann 6 Tage lang mit dem Standardfutter gefüttert. 2 Ratten wurden 9 Tage lang ad libitum mit dem Standardfutter gefüttert. Am 9.Tag wurden die Ratten getötet und die Tiere seziert. Nach dem Einfrieren in flüssigen Stickstoff wurden die Feuchtmasse notiert. Tabelle 14. Der Effekt des 3-tägigen Vordosierens mit 200, 100 oder 50 mg/kg/Tag PHA auf die Feuchtmasse (mg) des Jejunums und des Ileums nach Verabreichen einer Dosis von 150 mg 5-FU/kg KG.
Durch Vordosieren mit 200 mg/kg/Tag PHA vor dem Injizieren von 5-FU wurde im Vergleich zu der Behandlung ohne Injektion und der gepaarten Kontrolle ein signifikanter protektiver Effekt im Jejunum beobachtet (Tabelle 14). Durch Reduzieren der PHA-Dosis auf entweder 100 oder 50 mg/kg/Tag wurde im Vergleich zu der Behandlung ohne Injektion und der gepaarten Kontrolle noch immer ein signifikanter Schutz des Jejunumgewebes beobachtet. Auf das Ileumgewebe schien PHA in der untersuchten Dosismengen und im Vergleich zu den nicht injizierten Kontrollen keinen solch grundlegenden Schutzeffekt auszuüben. In jedem Fall jedoch hatten Tiere, die mit PHA vordosiert wurden, mehr Ileumgewebe als die entsprechenden gepaarten Kontrollen.
Die obigen Beispiele zeigen, dass Chemotherapie das Wachstum und die Lebensfähigkeit eines Tieres schwerwiegend beeinträchtigen kann. Manipulation des Futters und insbesondere das Hinzufügen eines Lektins vor oder nach dem Verabreichen des zytotoxischen Arzneimittels kann einen Schutz gegen Chemotherapie vermitteln. Insbesondere richtet sich dieser Schutz auf die Lebensfähigkeit und das Wachstum von Magendarmgewebe. Der Schutz von Magendarmgewebe nach Verabreichen des zytotoxischen Arzneimittels wurde mit Lektindosismengen von 200 mg/kg/Tag bis 50 mg/kg/Tag beobachtet.

Beispiel 9

Es wurde die Fähigkeit von oral eingenommenen PHA zum Schutz von Mäusen vor einer tödlichen Strahlendosis und insbesondere sein gewebsschützender Effekt auf den Darm untersucht.
Acht Gruppen, jede bestehend aus 12 männlichen Albinomäusen, wurde mit einer Strahlung von 6,75 Gy bestrahlt (0,3 Gy/Min). Jede Gruppe von Mäusen wurde 30 Tage lang bei einem genauen Futterschema gehalten (Tabelle 15). Tabelle 15. Futterprotokolle für die acht verwendeten Gruppen von Mäusen.

Legende zu Tabelle 15

SD kommerzielles Standardfutter (Charles River Ltd., Bioplan Ltd. Isaszeg, Ungarn).
LA Laktalbuminfutter. Ein halbsynthetisches Futter mit bekannter Zusammensetzung, gezeigt in Tabelle 1 (lektinfrei) und im Labor formuliert. Das Laktalbumin stammte von Sigma (Poole, Dorset).
PHA Futter mit Gartenbohnen. Ein Futter mit bekannter Zusammensetzung, gezeigt in Tabelle 1 (enthält das Gartenbohnenlektin, PHA) und formuliert im Labor. Die Gartenbohnen stammten von der Kulturpflanze "Processor" (jede andere Phaseolus vulgaris- Bohne, die PHA enthält, eignet sich in gleicher Weise).
FT Nüchtern (kein Futter).
*Bestrahl* Zeitpunkt der Bestrahlung.
Es wurde die Anzahl der Mäuse, die nach 30 Tagen am Leben waren, sowie deren durchschnittliches Körpergewicht notiert.
Fig. 5 zeigt den Effekt des Futters auf das Überlebens der Tiere nach 30 Tagen. Tiere, die im Rahmen der Kontrollbehandlungen 6, 7 & 8 keine Bestrahlung; erhielten zeigten keine Auswirkung des Verabreichens des kommerziellen Standardfutters, des Laktalbuminfutters und des Gartenbohnenfutters. Es wurde keine Mortalität beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten die Tiere in den bestrahlten Behandlungsgruppen 1, 2 & 3 mit dem nach der Bestrahlung verabreichten kommerziellen Standardfutter, dem Laktalbuminfutter und dem PHA-Futter signifikante Mortalität (Behandlung 3 beinhaltete eine Fastenperiode). Nur insgesamt 2 Tiere in Behandlung 1-3 überlebten die Bestrahlungsbehandlung.
Wurden die Tiere vor dem Bestrahlen mit dem PHA-haltigen Futter gefüttert (Behandlung 4 & 5), so zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Zahl der überlebenden Tiere. Die Anzahl der überlebenden Tiere korrelierte eng mit dem Zeitraum, in dem die Tiere vor dem Bestrahlen das PHA-Futter erhielten. Tabelle 16. Durchschnittliches Körpergewicht der Tiere nach 30 Tagen.
Nach 30 Tagen wogen die Tiere in den Kontrollbehandlungen 6-8 30-32 g (Tabelle 16). Die Tiere in den Behandlungen 1-3 zeigten hohe Mortalität. Die Tiere in Behandlungsgruppen 4 & 5 zeigten jedoch einen Anstieg des Körpergewichtes, der mit dem Zeitraum korrelierte, über den die Tiere vor der Bestrahlung mit PHA-Futter gefüttert wurden. In Behandlungsgruppe 5 (vor der Bestrahlung 3 Tage auf PHA-haltigem Futter)war das Körpergewicht ähnlich wie in den Kontrollbehandlungen. Verabreichung von PHA in das Futter in der untersuchten Dosis hatte keinen schädigenden Effekt. Wo das Lektin vor der Bestrahlung verabreicht wurde, wurde ein signifikanter schützender Effekt beobachtet.
Nach der Bestrahlung der Tiere wurden für jede Behandlung das Durchschnittsgewicht des Dünndarms, der Milz und der Hoden bestimmt (Tabelle 17). Das Durchschnittsgewicht in der Behandlungsgruppe 7 wurde nicht bestimmt. Tabelle 17. Gewicht (mg +/- Standardabweichung) von Dünndarm, Milz und Hoden der überlebenden Mäuse.

Legende zu Tabelle 17

zeigt an, dass keine Daten vorhanden sind, da alle Mäuse gestorben sind. ND zeigt an, dass keine Daten aufgezeichnet wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Hodengewebe am empfindlichsten auf die Wirkung der Bestrahlung war. Verabreichung von PHA vor oder nach der Bestrahlung hatte geringe Auswirkung auf das Wachstum der Hoden.
Behandlung 1-3 zeigte nach der Bestrahlung geringe Überlebensraten. Die Ergebnisse für Behandlungen 4&5 lassen eine dosisabhängige Erhöhung des Gewichts des Dünndarms vermuten, die zu dem Zeitraum, in dem die Tiere vor der Bestrahlung PHA erhielten, korrelierte. Das Durchschnittsgewicht des Milzgewebes in Behandlung 4&5 war ähnlich wie das der Kontrollen.
Dieses Beispiel zeigt, dass Bestrahlung die Lebensfähigkeit der Tiere ernsthaft schwerwiegend beeinträchtigt, und dass Futtermanipulationen verwendet werden können, um das Ausmaß, in dem Bestrahlung die Lebensfähigkeit beeinträchtigt, zu modifizieren. Eine Fastenperiode vor dem Bestrahlen bietet keinen Schutz gegen Bestrahlungseffekte, sondern ist dagegen schädlich. PHA im Futter hatte keinen schädigenden Effekt auf die gemessenen Parameter (Gruppen 7&8 im Vergleich zu Gruppe 6) und das Hodengewebe war, was den Gewichtsverlust anbelangte, unter den untersuchten Geweben gegen Bestrahlungsschäden am empfindlichsten.

Literaturstellen

Archimund, E. & Thomas, X (1994). Administration of cytotoxic agents by continuous infusion in the therapy of acute myeloid leukaemia. Journal of Infusional Chemotherapy, 4, 3-8.
Au, E., Koo, W. H., Tan, E. H. & Ang, P. T. (1996). A Phase II trial of etoposide, leucovorin and 5-Fluorouracil (ELF) in patients with advanced gastric cancer. Journal of Chemotherapy, 8, 300-303.
Bardocz, S., Brown, D. S., Grant, G., Pusztai, A., Stewart, J. C. & Palmer, R. M. (1992). Effect of the β-adrenoreceptor agonist clenbuterol and phytohaemagglutinin on growth, protein synthesis and polyamine metabolism of tissues of the rat. British Journal of Pharmacology 106, 476-482.
Carvalho, A. F. F. U. de, (1993) Dietary kidney bean lectins affect insulin levels, change gene expression and modulate metabolism. Ph.D. thesis; University of Aberdeen.
Dieras, v & Pouillart, P. (1995). Infusional chemotherapy with new drugs: Taxanes, vinorelbine and topoisomerase I inhibitors. Journal of Infusional Chemotherapy, 5, 191-192.
Denekamp, J. (1996). The broad spectrum of preclinical radiobiology: British contributions. International Journal of Radiation Oncology, Biology & Physics, 36, 497-509.
Erkisi, M., Erkurt, E., Ozbarlas, S., Burgut, R., Doran, F. & Seyrek, E. (1996). The use of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in combination with single or fractionated doses of isofamide and doxorubicin in patients with soff tissue sarcoma. Journal of Chemotherapy, 8, 224-228.
Grant, G., McKenzie, N. H., Watt, W. B., Stewart, J. C., Dorward, P. M. & Pusztai, A. (1986) Nutritional evaluation of soya beans (Glycine max): Nitrogen balance and fractionation studies. Journal of the Science of Food and Agriculture, 37, 1001-1010.
Grant, G., Oliveira, J. T. A., de, Dorward, P. M. Annand, M. G." Waldron, M. & Pusztai, A. (1987). Metabolic and hormonal changes in rats resulting front consumption of kidney bean (Phaseolus vulgaris) or soyabean (Glycine max). Nutritional Reports International 36, 763-772.
Grant, G., Dormand, P. M. and Pusztai, A. (1993) Pancreatic enlargement is evident in rats Fed diets containing raw soybean (Glycine max) or cowpeas (Vigna unguiculata) but not those fed diets dased on kidney beans (Phaseolus vulgaris) or lupinseed (Luinas augustlfalinus). Journal of Nutrition 123, 2207-2215.
Gupta, Y. P. (1987) Nutritive value of soybean. International Journal of Tropical Agriculture, 5, 247-279.
Hajos, Gy., Gelencser, E., Pusztai, A., Grant, G., Sakhri, M. & Bardocz, S. (1995) Biological effects and survival of trypsin inhibitors and the agglutinin from soybean in the small intestine of the rat. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43, 165-170.
Harboe, N. & Inglid, A. (1973) Immunization, isolation of immunoglobulins, estimation of antibody titre. In A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Methods and Applications: (N. H. Axelsen, J. Kroll & B. Weeke, editors) Scandinavian Journal of Immunology, (Suppl. 1), pp. 161-164.
Isacoff, W. H., Frederick, R., Kuchenbecker, S. L., Jacobs, A. D. & Taylor, O. (1994). Continuous infusion 5-fluorouracil given with calcium luucovorin, dipyridamole, and Mitomycin-C in patients with advancer colorectal carcinoma: A Phase II trial. Journal of Infusional Chemotherapy, 4, 107-111.
Liener, L. E. (1994) Implications of antinutritional components in soybean foods. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 34, 31-67.
Macrae, J. C., Bruce, L. A, Hovell, F. B. de B., Hart, LC., Inkster, J., Walker, A. & Atkinson, T. (1991). Influence of protein nutrition on the response of growing lambs to exogenous bovine growth hormone. Journal of Endocrinology 130, 53-61.
Palmer, R. M., Pusztai, A., Bain, P. & Grant, G. (1987). Changes in rates of tissue protein synthesis in rats induced in vivo by consumption of kidney bean lectins. Comparative Biochemistry and Physiology 88C, 179-183.
Paulsen, F., Hoffmann, W., Kortmann, R. D., Porschen, R. & Bamberg, M. (1996). Akute gastrointestinal Nebenwirkungen in der Radio-onkologie - Was ist gesichert in der Therapie?. Strahlenther. Onkol. 172, 53-56 (Nr 2).
Padolsky, D. K. (1993). Regulation of intestinal epithelial proliferation: a few answers, many questions. Am. J. Physiol. 264, pp G179-G186.
Pusztai, A. (1991). Plant Lectins. Cambridge: Cambridge University Press.
Yeoh, E., Horowitz, M., Russo, A., Muecke, T. Ahmad, A. & Chatterton, B. (1993). International Journal of Radiation Oncology, Biology & Physics, 26, 229-237.

Claims

1. Verwendung eines Lektins bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verringerung und/oder zur Behandlung eines Schadens von Schleimhautzellen und/oder Geweben.

2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Verringerung und/oder Behandlung von Darmläsionen und/oder Schleimhautentzündung.

3. Verwendung nach Anspruch 1 zur Verringerung und/oder die Behandlung von entzündlichen Darmkrankheiten oder Reizdarmsyndrom.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verringerung und/oder Behandlung von geschädigten Säugetierzellen und/oder geschädigtem Gewebe, insbesondere vom geschädigten menschlichen Zellen und/oder Gewebe.

5. Verwendung eines Lektins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Schaden durch ein zellschädigendes Mittel verursacht ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das zellschädigende Mittel Strahlentherapie, ein chemotherapeutisches Mittel oder eine Kombination davon ist.

7. Verwendung eines Lektins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kombination mit einem Zellschutzmittel, wobei das Zellschutzmittel ein Strahlensensitivierer, ein chemoprotektives Mittel, ein Wachstumsfaktor oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon ist.

8. Verwendung eines Lektins nach Anspruch 7, wobei das Zellschutzmittel ein oder mehrere Vitamin-K-Mimetika ist, wie beispielsweise Synkavit oder Menadion, Gadolinium-Texaphyrin oder Iobenguan (([[3-Iodo-13311) phenyl]methyl]guanidin): Sulcraphat, Cystein, Cysteamin, Ethyol, Balazipon oder Dosmalfat; freie Radikalfänger, WR 3689 (2-[[3-Methylamino)propyl]amino] ethandioldihydrogenphosphatester, AD 20 (2[[2-Methoxyphenyl)acetyl]amino]-2- propansäure oder Nitroxid-Antioxidans; Granulozyten-Kolonie-Stimulierender- Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierender-Faktor (GM- CSF), Erythropoietin (EPO), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Keratinozyten- Wachstumsfaktor (KGF), transformierender Wachstumsfaktor (TGF α und β), jedes Interleukin, einschließlich IL-11 und IL-15, insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGR), Bombesin, Relaxin, Calcitonin, aus Kolostrum abgeleiteter Wachstumsfaktor (CDGF), Amlexanox oder Amoxanox; Protegrin, Pilocarpinhydrochlorid, Stammzellfaktor (STF), Thrombopoietin, Steel factor (SF), jedes Interferon, einschließlich Interferon, oder jedes Zytokin ist.

9. Verwendung eines Lektins nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Medikament ein Lektin in einer Konzentration von 0,3 g bis 0,1 ug pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht.

10. Verwendung eines Lektins nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Lektin aus der Gartenbohne, Sojabohne, Jackbohne, Weizenkeimen, Lotussetzlingen, Zwiebeln, Linsen, Tomaten, Kartoffeln stammt oder aus Kombinationen von zwei oder mehreren davon.

11. Verwendung eines Lektins nach einem der Ansprüche 7 bis 10 in Kombination mit einem antimikrobiellen Mittel.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Lektin und ein Zellschutzmittel, ausgewählt aus einem Strahlensensitivierer, einem chemoprotektiven Mittel, einem Wachstumsfaktor oder Kombinationen davon.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Verwendung bei der Verringerung und/oder bei der Behandlung eines Schadens von Schleimhautzellen und/oder Geweben.

14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 13 für simultane, einzelne oder aufeinander folgende Verwendung in der Prävention oder Behandlung von Schäden, verursacht durch ein zellschädigendes Mittel.

15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei das Lektin aus der Gartenbohne, Sojabohne, Jackbohne, Weizenkeimen, Lotussetzlingen, Zwiebeln, Linsen, Tomaten, Kartoffeln oder Kombinationen von zwei oder mehreren davon stammt.

16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, die weiters ein antimikrobielles Mittel enthält.