CN112707958B - 一种提取l型和e型植物凝集素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物提取技术领域，公开了一种提取L型和E型植物凝集素的方法。本发明所述方法通过对豆子进行浸泡，破碎、离心、硫酸铵分步沉淀等步骤进行蛋白粗提，然后通过疏水层析和离子交换层析对L型和E型植物凝集素进行分离和纯化。本发明所述方法操作简单，而且提取的L型和E型植物凝集素纯度高，适合于大规模的生产L型和E型植物凝集素。

Description

一种提取L型和E型植物凝集素的方法
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体的说是涉及一种提取L型和E型植物凝集素的方法。
背景技术
植物凝集素(Phytohemagglutinin PHA)是从豆科植物种子中提取的一种含糖蛋白质。PHA又分为E型和L型，其中PHA-E型具有红细胞凝集作用；PHA-L型能够刺激淋巴细胞转化，是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，即在PHA-L作用下，原处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
现有专利技术中也有对植物凝集素PHA进行提取的方法，目前已经公开了多种从豆科植物中提取植物凝集素的方法。如公开号为CN101508730A的中国发明专利申请中公开了一种豆类植物凝集素的提取方法，是用超声和微波在40-60℃水浴条件下提取植物凝集。公开号为CN101340923A的中国发明专利申请中公开了用乙醇沉淀的菜豆提取物。CN110283242 A中对PHA进行提取，该专利中，取豆子浸提液离心后取上清液，用酸调整上清液的pH至4.5-5.0，得酸调混合液；酸调混合液离心后取上清液，在上清液中加入质量浓度0.1-0.4％的氯化钠溶液，然后离心取上清液，即为PHA(所有亚型PHA)。但以上公开专利中并无提及PHA亚型的分离方法。
现有专利CN103833839A公开了一种C型凝集素及其制备方法，但是该C型凝集素以鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴为原料，对于植物凝集素的提取分离没有很大的参考价值。现有国内尚无豆子中提取植物凝集素PHA-L和PHA-E两种亚型提取方式相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从豆科植物中提取L型和E型植物凝集素的方法，使得所述方法能够同时获得两种亚型植物凝集素并具有较高纯度，工艺简便，成本较低。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提取L型和E型植物凝集素的方法，包括：
步骤1、豆子加水破碎并离心去除不溶性物质，然后调节pH值为4.4-5.0(用于去除豆子中的豆清蛋白，豆清蛋白含量太高会影响后续纯化效果)，搅拌，离心留取上清；
步骤2、所述上清用硫酸铵分级沉淀法沉淀蛋白；
步骤3、沉淀的蛋白溶解后继续添加硫酸铵至饱和度25％-35％，过滤取滤液；
步骤4、滤液进行疏水层析，上样后收集流穿组分，获得L型植物凝集素；然后采用阶梯型洗脱方法，洗脱液为tris-HCl，洗脱液浓度分别为10％、20％、40％三个梯度，每个梯度3-5个柱体积，收集40％梯度洗脱组分为E型植物凝集素；
步骤5、所述流穿组分和40％梯度洗脱组分用tris-HCl透析，对透析后的两个组分分别用离子交换层析纯化，洗脱液为tris-HCl，采用10％梯度洗脱的方式进行3-5个柱体积洗脱，均收集10％洗脱组分，获得纯化后的PHA-L型和PHA-E型植物凝集素。
作为优选，步骤1中豆子与水的质量体积比为1g:10mL。其中，豆子用水在4℃条件下先浸泡12-24h，然后破碎(破碎温度不超过25℃，破碎温度达到25℃，停止破碎，并预冷至4-25℃后再进行破碎)，破碎完毕后，用量筒计量破碎液体积，并在4-25℃条件下搅拌6-12h，10000rpm离心30min，留离心上清组分用于后续调节pH值，所述豆子可以是红芸豆、红腰豆、花腰豆、白芸豆中的一种或两种以上。
作为优选，步骤2为：所述上清用硫酸铵分两级沉淀蛋白，第一级硫酸铵饱和度为20-35％，第二级硫酸铵饱和度为35-65％，第二级硫酸铵饱和度大于第一级硫酸铵饱和度。
更具体地，所述步骤2为：
步骤2.1、所述上清加硫酸铵至20-35％饱和度，搅拌，离心，保留上清组分；
步骤2.2、步骤2.2中获得的上清组分继续加硫酸铵至35-65％饱和度，搅拌，离心，弃上清，留蛋白沉淀。
作为优选，步骤3中沉淀的蛋白用tris-HCl溶解。更具体地是用0.2M Tris-HClpH8.0溶解，定容至豆子破碎后的溶液量，待沉淀完全溶解后添加固体硫酸铵至饱和度30％，0.45um滤膜过滤，取滤液。
作为优选，步骤4中疏水层析采用Butyl-sepharose 4FF。所用平衡缓冲液为0.02Mtris-HCl30％(NH4)2SO4 pH8.0，洗脱缓冲液为0.02M tris-HCl pH8.0。
作为优选，所述流穿传组分和40％梯度洗脱组分用缓冲液0.02Mtris-HCl pH8.0进行透析，所用缓冲液与上述两种组分体积比为100:1，每3h换液一次，总透析三次。
作为优选，步骤5中离子交换层析纯化采用DEAE sepharose 4FF进行纯化。平衡缓冲液为0.02Mtris-HCl pH8.0，洗脱液为0.02Mtris-HCl 1M NaCl pH8.0。
由以上技术方案可知，本发明所述方法通过对豆子进行浸泡，破碎、离心、硫酸铵分步沉淀等步骤进行蛋白粗提，然后通过疏水层析和离子交换层析对L型和E型植物凝集素进行分离和纯化。本发明所述方法操作简单，而且提取的L型和E型植物凝集素纯度高，适合于大规模的生产L型和E型植物凝集素。
附图说明
图1所示为PHA-L和PHA-E疏水层析Butyl-sepharose 4FF填料纯化出峰位置图；
图2所示为PHA-L和PHA-E使用离子交换层析DEAE-sepharose 4FF纯化出峰位置图；
图3所示为PHA-L和PHA-E的SDS-PAGE分析结果。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种提取L型和E型植物凝集素的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种提取L型和E型植物凝集素的方法做进一步说明。
实施例1：提取纯化L型和E型植物凝集素
1.芸豆用纯化水按质量体积比1：10在4℃条件下浸泡12-24h，然后用电动破碎机破碎(破碎温度不超过25℃，破碎温度达到25℃，停止破碎，并预冷至4-25℃后再进行破碎)，破碎完毕后，用量筒计量破碎液体积，并再4-25℃条件下搅拌6-12h，10000rpm离心30min，留离心上清组分；
2.离心后上清调节pH至4.4-5.0，搅拌2h；再次离心，离心条件为10000rpm离心30min，再次留上清组分；
3.对步骤2中的离心后上清组分缓慢加固体硫酸铵至35％饱和度，搅拌30min；10000rpm离心30min，继续保留留上清组分；
4.步骤3中的上清组分继续缓慢加固体硫酸铵至65％饱和度，搅拌30min后，10000rpm离心30min，弃上清，留沉淀。
5.步骤4中的沉淀组分用20mm Tris-HCl pH8.0溶解，定容至芸豆破碎后的溶液量，待沉淀完全溶解后添加固体硫酸铵至饱和度30％，0.45um滤膜过滤。
6.过滤后滤液用Butyl-sepharose 4FF纯化，所用平衡缓冲液为0.02M tris-HCl30％(NH4)2SO4 pH8.0，洗脱缓冲液为0.02M tris-HCl pH8.0，上样后收集流穿组分，获得植物凝集素PHA-L型，然后采用阶梯型洗脱方法，洗脱液浓度分别为10％、20％、40％、100％四个梯度(增加100％梯度用于填料再生)，其中40％梯度洗脱组分为PHA-E型。PHA-L和PHA-E疏水层析Butyl-sepharose 4FF填料纯化出峰位置附图见图1。
7.分别对Butyl-sepharose 4FF流穿组分和40％洗脱组分用缓冲液0.02Mtris-HCl pH8.0进行透析，所用缓冲液与上述两种组分体积比为100：1，每3h换液一次，总透析三次。
8.对透析后的两个组分分别用DEAE sepharose 4FF填料进行纯化。平衡缓冲液为0.02Mtris-HCl pH8.0，洗脱液为0.02Mtris-HCl 1M NaCl pH8.0。采用10％、40％、100％三个梯度(增加40％和100％梯度用于填料再生)洗脱得方式进行洗脱。均收集10％洗脱组分，即为精纯PHA-L型和PHA-E型。PHA-L和PHA-E使用离子交换层析DEAE-sepharose 4FF纯化出峰位置附图见图2。
将纯化所得的PHA-L和PHA-E进行SDS-PAGE分析，见附图3，两个蛋白条带分子量稍有差别，一个分子量在29.5KD左右，一个在29.7KD左右，通过SDS电泳观察，纯度L型在95％左右，E型在90％左右。
将两个亚型的样品送检测公司进行鉴定检测，相关检测数据如下表1；
表1
其中，Avg.Mass是分子量检测，质谱鉴定结果与SDS结果相一致，证明所获亚型为E型和L型。
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。

Claims (4)

1.一种提取L型和E型植物凝集素的方法，其特征在于，包括：
步骤1、豆子加水破碎并离心去除不溶性物质，然后调节pH值为4.4-5.0，搅拌，离心留取上清；
步骤2、所述上清加硫酸铵至35%饱和度，搅拌，离心，保留上清组分，继续加硫酸铵至65%饱和度，搅拌，离心，弃上清，留蛋白沉淀；
步骤3、沉淀的蛋白溶解后继续添加硫酸铵至饱和度30%，过滤取滤液；
步骤4、滤液进行疏水层析，上样后收集流穿组分，获得L型植物凝集素；然后采用阶梯型洗脱方法，洗脱液为tris-HCl，pH8.0，洗脱液浓度分别为10%、20%、40%三个梯度，每个梯度3-5个柱体积，收集40%梯度洗脱组分为E型植物凝集素；所述疏水层析采用Butyl-sepharose 4FF；
步骤5、所述流穿组分和40%梯度洗脱组分用tris-HCl，pH8.0透析，对透析后的两个组分分别用离子交换层析纯化，洗脱液为0.02M tris-HCl，1M NaCl pH8.0，采用10%、40%、100%三个梯度洗脱的方式进行3-5个柱体积洗脱，均收集10%洗脱组分，获得纯化后的PHA-L型和PHA-E型植物凝集素；所述离子交换层析采用DEAE sepharose 4FF。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1中豆子与水的质量体积比为1g:10mL。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述豆子选自红芸豆、红腰豆、花腰豆、白芸豆中的一种或两种以上。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3中沉淀的蛋白用tris-HCl溶解。
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