DE60304447T2

DE60304447T2 - Pflanzliche Zusammensetzung mit Angelica gigantis, Cnidium officinale und Paeonia japonica

Info

Publication number: DE60304447T2
Application number: DE60304447T
Authority: DE
Inventors: Sung Kee Jo; Sung Ho Kim; Sung Tae Yee; Hae Ran Park; Heon Seo-gu Gwangju 502 Oh; Myung Woo Byun
Original assignee: Korea Atomic Energy Research Institute KAERI
Current assignee: Korea Atomic Energy Research Institute KAERI
Priority date: 2003-04-07
Filing date: 2003-12-04
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2023-12-05
Also published as: KR20040087711A; EP1466608B1; ATE322277T1; DE60304447D1; EP1466608A1; US20040197427A1; JP2004307458A; JP4055951B2; KR100506384B1; US6964785B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pflanzliche Zusammensetzung zum Verbessern der Aktivität gegen Krebs, Immunreaktion und Hämatopoese des Körpers und Schützen des Körpers vor oxidativem Schaden. Ganz besonders betrifft die vorliegende Erfindung eine pflanzliche Zusammensetzung, umfassend einen ersten Heißwasserextrakt aus einem Gemisch der Arzneipflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis, und eine Polysaccharidfraktion als ein Präzipitat, das durch Zugeben von Ethanol zu einem zweiten Heißwasserextrakt aus einem Gemisch der Pflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis gebildet wird.
Beschreibung des Stands der Technik
Krebs ist durch direktes Töten von Krebszellen durch Chemotherapie mit Mitteln gegen Krebs und Strahlentherapie, durch chirurgische Entfernung oder durch Aktivieren des Immunsystems, das sich an der Hemmung von Krebszellen beteiligt, behandelt worden. In der Vergangenheit wurden in der Krebstherapie vorwiegend das direkte Tötungsverfahren oder die Chirurgie verwendet. In letzter Zeit ist Krebs durch Immuntherapie in Kombination mit dem direkten Tötungsverfahren behandelt worden. Darüberhinaus ist mit Fortschritten im Verstehen der Mechanismen des Immunsystems viel Mühe darauf gerichtet worden, Immunmodulatoren für die Behandlung von Krebs einzusetzen. Immunmodulatoren verbessern die Immunität des Körpers durch unspezifisches Stimulieren der Immunzellen, was zu einem verbesserten Schutz gegen Faktoren führt, die Krankheiten verursachen. Beispiele für die unspezifischen Immunmodulatoren schließen inaktivierte bakterielle Herstellungen, chemisch synthetisierte Verbindungen (synthetisierte Nukleinsäurederivate oder Glykoside) und biologische Faktoren (Cytokine oder Hormone) ein. Untersuchungen von Krebstherapien, die auf dem Verbessern der Immunität des Körpers unter Verwendung der Immunmodulatoren beruhen, sind im Gange. Wegen ihrer Toxizität oder Nebenwirkungen sind jedoch die meisten der unspezischen Immunmodulatoren in ihren klinischen Anwendungen beschränkt. Mit der Identifizierung von Cytokinen, die am Immunsystem beteiligt sind, laufen insbesondere aktive Untersuchungen zur Verwendung von Cytokinen in der Krebstherapie, wobei Cytokine in großem Maßstab durch gentechnische Hilfsmittel hergestellt werden. Immunstimulatoren, einschließlich Interleukin-2 und dem Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), wurden zum Beispiel auf ihr Potenzial hin ausgewertet, auf die Krebstherapie angewendet zu werden, aber es wurde gezeigt, dass sie schwere Nebenwirkungen haben und daher in beschränkten Fällen ausprobiert worden sind.
Hämatopoese ist der Vorgang des Herstellens einer Vielfalt von Blutzellen, einschließlich der Immunzellen, aus den hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks und ist der Aktivität des Immunsystems nahe verwandt. In letzter Zeit sind insbesondere Cytokine identifiziert worden, die an jedem Schritt der Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen zu Blutzellen wirken, und Faktoren, die die Proliferation der hämatopoetischen Zeilen induzieren, wie zum Beispiel der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF), sind aktiv untersucht worden, um sie auf die Behandlung von Krankheiten anzuwenden. Um jedoch therapeutische Wirkungen zu erhalten, sollten sie dem Körper in einer großen Menge verabreicht werden. Darüberhinaus werden in diesem Fall oft schwere Nebenwirkungen aufgewiesen, wodurch ihre Anwendungen beschränkt werden.
Die Krebsbehandlung durch Chemotherapie oder Strahlentherapie wird von einem Schaden am hämatopoetischen System und den sich selbst erneuernden Gewebe begleitet. Derartige Nebenwirkungen entstehen aus oxidativem Schaden an den Geweben durch Arzneistoffe gegen Krebs oder Strahlung. Viele Bemühungen sind gemacht worden, um Substanzen zu finden, die zum Schützen des Körpers vor Strahlung fähig sind. Nach dem ersten Bericht 1949, dass Cystein, das eine Thiolgruppe hat, eine Wirkung zum Schützen des Körpers vor Strahlung hat, ist die Forschung auf Aminthiolderivate konzentriert worden (besonders Verbindungen der WR-Serie, synthetisiert durch das Walter Reed Army Hospital in Washington, D.C.). Die Aminthiol-Strahlenschutzmittel sind jedoch wegen ihrer Toxizität in ihrer klinischen Anwendung beschränkt. Anschließend wurde die vor Strahlen schützende Wirkung chemisch synthetisierter Verbindungen einschließlich Dipyridamol, Adenosinmonophosphat und Desoxyspergualin untersucht, aber auch sie waren wegen ihrer schweren Toxizität in praktischen Anwendungen beschränkt. Andere Bemühungen, vor Strahlen schützende Wirkungen zu erhalten, wurden durch Stimulieren des Immun- und hämatopoetischen Systems unter Verwendung von Polysacchariden, wie zum Beispiel Glucan, und inaktiverten bakteriellen Herstellungen, wie zum Beispiel dem Streptokokken-Mittel OK-432, gemacht. In letzter Zeit sind Faktoren, die mit den Immunreaktionen und hämatopoetischen Funktionen in Verbindung stehen, für die Immunstimulatoren einschließlich Interleukin-1, der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Mittel, welche die hämatopoetische Zellproliferation induzieren, wie zum Beispiel der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF), und Hormone als Beispiele dienen, in Untersuchungen verwendet worden, um die vor Strahlen schützende Wirkung zu erhalten, aber wegen ihrer Nebenwirkungen sind derartige Versuche in sehr beschränkten Fällen ausgeführt worden.
Wie vorstehend beschrieben, gibt es einen dringenden Bedarf für die Entwicklung von Substanzen, die fähig sind, die Funktion gegen Krebs, Immunfunktion und hämatopoetische Funktion durch Aktivieren des Immunsystems zu verbessern sowie den Körper vor den Nebenwirkungen, die durch Krebstherapie, wie zum Beispiel Strahlentherapie, verursacht werden, zu schützen. In dieser Hinsicht hat sich eine große Anzahl kürzlicher Untersuchungen auf die Entwicklung physiologisch aktiver Substanzen mit leichten Nebenwirkungen unter Verwendung von natürlichen Produkten konzentriert. Beruhend auf der Tatsache, dass verschiedene Krankheiten einschließlich des Alterns und Krebs durch oxidativen Schaden am Körper durch Strahlung oder chemische Verbindungen sowie durch schädliche aktive Sauerstoff-Spezies oder freie Radikale verursacht werden, sind insbesondere Antioxidantien auf ihre vorbeugenden und therapeutischen Wirkungen gegen Krankheiten untersucht worden. Zusätzlich sind Bemühungen, physiologisch aktive Substanzen aus natürlichen Produkten zu entdecken, welche die Wirkungen haben, den Körper zu regulieren und zu schützen, aktiv durchgeführt worden, und einige der entdeckten natürlichen Substanzen sind auf Nahrungsmittelergänzungen zum Verbessern der Gesundheit oder als therapeutische Mittel angewendet worden.
Die Forschung, die auf das Entdecken von Immunmodulatoren aus natürlichen Produkten zielt, hat sich auf die Auswertung der Effekte natürlicher, pflanzlicher Komponenten oder bekannter chinesischer pflanzlicher Materialien konzentriert, und einige der natürlichen Substanzen, von denen erkannt wurde, dass sie immunmodulatorische Aktivität haben, sind in praktische Verwendung genommen worden. Eine Forschungsgruppe in Frankreich berichtete, dass die Pflanze Eleutherococcus senticosus eine Wirkung auf das Verbessern der Erholung von hämatopoetischer Störung hat, die durch Strahlung verursacht wird. Auch sind Ginseng, natürliche Pigmente, die Pflanze Codonopsis pilosula, die Pflanze Cnidium officinale Makino, der Pilz Ganoderma lucidum und andere chinesische Kräuter und pflanzliche Komponenten auf ihre vor Strahlung schützende Aktivität hin untersucht worden, vorwiegend in Japan, Taiwan und China. Yamada et al. (Planta Medica 58 (2): 166–170) offenbaren die mitogenen und Komplement-aktivierenden Aktivitäten individueller pflanzlicher Komponenten von Juzen-Taiho-To (TJ-48).
Strahlung verursacht Störungen des Immunsystems und des hämatopoetischen Systems, sowie Schaden an den sich selbst erneuernden Geweben. Beruhend auf den Ergebnissen von Forschungen für chinesische pflanzliche Materialien mit schützender Wirkung gegen jedes die Strahlenbehandlung begleitende Symptom versuchten die Erfinder früher, eine Kräuterkombination zu finden, die fähig ist, alle auf eine Strahlenbehandlung folgenden Symptome zu überwinden, was zu dem Befund führte, dass eine pflanzliche Zusammensetzung, die durch Mischen der Pflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis und Extrahieren des Gemisches durch heißes Wasser hergestellt wurde, ungefährlicher war als die herkömmlichen immunstimulierenden Arzneistoffe. Die pflanzliche Zusammensetzung wird in der koreanischen Patentanmeldung Nr. 2000-23772 offenbart. Im Hinblick auf das Erhöhen der Immunfunktion und der hämatopoetischen Funktion des Körpers hat die pflanzliche Zusammensetzung jedoch nur 2- bis 3-fach höhere Wirkungen im Vergleich zu einer Kontrolle mit keiner Verabreichung der pflanzlichen Zusammensetzung und beschränkte Wirkungen auf die Aktivierung der Immunreaktionen gegen Krebs.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, unter Verwendung der Arzneipflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda, eine pflanzliche Zusammensetzung mit den darin bestehenden Wirkungen bereitzustellen, die Aktivität gegen Krebs, Immunreaktion und Hämatopoese des Körpers zu verbessern, wobei die Wirkung höher ist als die herkömmlichen Arzneistoffe mit den darin bestehenden Wirkungen, die Immun- und hämatopoetischen Funktionen zu verbessern, und auch noch zum Schützen des Körpers vor oxidativem Schaden fähig ist.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, umfassend eine derartige pflanzliche Zusammensetzung als einen wirksamen Bestandteil.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein funktionelles Nahrungsmittel bereitzustellen, umfassend eine derartige pflanzliche Zusammensetzung als einen wirksamen Bestandteil.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorstehenden und anderen Zielsetzungen, Merkmale und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung, zusammengenommen mit den begleitenden Zeichnungen, klarer verstanden werden, wobei:
1 eine graphische Darstellung ist, welche die Wirkungen der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und einer pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, darin bestehend, die Immunzellen zu aktivieren, zeigt (C: Kontrolle, W: Heißwasserextrakt, P: Polysaccharidfraktion, M: in Methanol lösliche Fraktion und E: in Ethanol lösliche Fraktion);
2a eine graphische Darstellung ist, welche die Wirkungen der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, darin bestehend, durch das Stimulieren der Proliferation der Stammzellen des Knochenmarks die hämatopoetische Funktion zu verbessern, zeigt;
2b eine graphische Darstellung ist, welche die Wirkungen der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, darin bestehend, durch das Stimulieren der Proliferation der Stromazellen des Knochenmarks die hämatopoetische Funktion zu verbessern, zeigt;
3a eine graphische Darstellung ist, welche die hemmenden Wirkungen der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegen den Erfindung gegen durch Strahlung induzierten oxidativen DNA-Schaden zeigt (N: normale Kontrolle, R: der Strahlung ausgesetzte Kontrolle, W: Heißwasserextrakt, P: Polysaccharidfraktion, M: in Methanol lösliche Fraktion und E: in Ethanol lösliche Fraktion);
3b eine graphische Darstellung ist, welche die hemmenden Wirkungen der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gegen durch Wasserstoffperoxid induzierten oxidativen DNA-Schaden zeigt (N: normale Kontrolle, N: mit H₂O₂ behandelte Kontrolle, W: Heißwasserextrakt, P: Polysaccharidfraktion, M: in Methanol lösliche Fraktion und E: in Ethanol lösliche Fraktion);
4a eine graphische Darstellung ist, welche die hemmenden Wirkungen der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gegen durch Strahlung induzierten oxidativen Chromosomenschaden zeigt;
4b eine graphische Darstellung ist, welche die hemmenden Wirkungen der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gegen durch Wasserstoffperoxid induzierten oxidativen Chromosomenschaden zeigt;
5a eine graphische Darstellung ist, welche die hemmenden Wirkungen der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gegen durch Strahlung induzierten oxidativen Lipidschaden zeigt;
5b eine graphische Darstellung ist, welche die hemmenden Wirkungen der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gegen durch CCl₄ induzierten oxidativen Lipidschaden zeigt (N: normale Kontrolle, C: mit CCl₄ behandelte Kontrolle, W: Heißwasserextrakt, P: Polysaccharidfraktion, M: in Methanol lösliche Fraktion und E: in Ethanol lösliche Fraktion);
5c eine graphische Darstellung ist, welche die hemmenden Wirkungen der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gegen durch Strahlung induzierten oxidativen Proteinschaden zeigt;
6a eine graphische Darstellung ist, welche die Wirkung der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, darin bestehend, DPPH-Radikale abzufangen, zeigt;
6b eine graphische Darstellung ist, welche die Wirkung der Fraktionen eines Heißwasserextrakts und der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, darin bestehend, OH-Radikale abzufangen, zeigt;
7a eine graphische Darstellung ist, welche die hemmende Wirkung der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gegen Tumorwachstum in männlichen Mäusen zeigt, was zu einer Erhöhung ihrer Lebenserwartung führt;
7b eine graphische Darstellung ist, welche die hemmende Wirkung der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gegen Tumorwachstum in weiblichen Mäusen zeigt, was zu einer Erhöhung ihrer Lebenserwartung führt;
8 eine graphische Darstellung ist, die keine Wirkung der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf das direkte Töten oder die Wachstumshemmung von Tumorzellen in vitro zeigt;
9a eine graphische Darstellung ist, welche die Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für das Verbessern der Immunreaktion des Körpers gegen Krebs durch das Aktivieren der NK-Zellen, um ihre im Töten von Tumorzellen bestehende Aktivität zu erhöhen, zeigt;
9b eine graphische Darstellung ist, welche die Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für das Verbessern der Immunreaktion des Körpers gegen Krebs durch das Aktivieren der Makrophagen, um ihre im Töten von Tumorzellen bestehende Aktivität zu erhöhen, zeigt;
9c eine graphische Darstellung ist, welche die Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für das Verbessern der Immunreaktion des Körpers gegen Krebs durch das Aktivieren der zytotoxischen T-Zellen, um ihre im Töten von Tumorzellen bestehende Aktivität zu erhöhen, zeigt;
10a eine graphische Darstellung ist, welche die stimulierende Wirkung der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf die Regeneration von Leukozyten im Blut nach Strahlenbelastung zeigt;
10b eine graphische Darstellung ist, welche die stimulierenden Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf die Regeneration von Lymphozyten im Blut nach Strahlenbelastung zeigt;
11a eine graphische Darstellung ist, welche die stimulierenden Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf die Regeneration von jeder Untergruppe der Immunzellen in der Milz am Tag 14 nach Strahlenbelastung zeigt (1: Gesamtlymphozyten, 2: B-Lymphozyten, 3: T-Lymphozyten, 4: T-Helfer-Zellen, 5: zytotoxische T-Zellen);
11b eine graphische Darstellung ist, welche die stimulierende Wirkung der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf die Regeneration von jeder Untergruppe der Immunzellen in der Milz am Tag 47 nach Strahlenbelastung zeigt;
12a eine graphische Darstellung ist, welche die stimulierenden Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf die Wiederherstellung der Funktion der regenerierten B-Zellen am Tag 14 nach Strahlenbelastung im Assay auf die im Produzieren von Antikörpern bestehende Aktivität der B-Zellen am Tag 14 nach Strahlenbelastung zeigt;
12b eine graphische Darstellung ist, welche die stimulierenden Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf die Erholung der Funktion der regenerierten B-Zellen im Assay auf die im Produzieren von Antikörpern bestehende Aktivität der B-Zellen am Tag 25 nach Strahlenbelastung zeigt;
13a eine graphische Darstellung ist, welche die stimulierenden Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf die Wiederherstellung der Funktion (Reaktion auf allogene Immunzellen) der regenerierten T-Zellen am Tag 21 nach Strahlenbelastung zeigt;
13b eine graphische Darstellung ist, welche die stimulierenden Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf die Wiederherstellung der Funktion (Reaktion auf allogene Immunzellen) der regenerierten T-Zellen am Tag 36 nach Strahlenbelastung zeigt;
14a eine graphische Darstellung ist, welche die regulierenden Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf das gestörte Muster der Antikörperherstellung durch das Wiederherstellen der reduzierten IgG-Herstellung nach Strahlenbelastung zeigt;
14b eine graphische Darstellung ist, welche die regulierenden Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf das gestörte Muster der Antikörperherstellung durch das Senken der IgE-Überproduktion nach Strahlenbelastung zeigt;
15 eine graphische Darstellung ist, welche die stimulierenden Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf die Wiederherstellung der im Töten von Tumorzellen bestehenden Aktivität der regenerierten NK-Zellen nach Strahlenbelastung zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Um die Zielsetzungen wie vorstehend beschrieben zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung eine pflanzliche Zusammensetzung, umfassend einen ersten Heißwasserextrakt aus einem Gemisch der Arzneipflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis und eine Polysaccharidfraktion als ein Präzipitat, das durch Zugeben von Ethanol zu einem zweiten Heißwasserextrakt aus einem Gemisch der Pflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis gebildet wird, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Behandeln von Krebs, Verbessern der Immunfunktion und hämatopoetischen Funktion des Körpers, Schützen des Körpers vor oxidativem Schaden und Verhindern der Nebenwirkungen der Krebstherapie bereit, die eine derartige pflanzliche Zusammensetzung als einen wirksamen Bestandteil umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein funktionelles Nahrungsmittel bereit, umfassend eine derartige pflanzliche Zusammensetzung.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin noch ein Verfahren zum Herstellen einer pflanzlichen Zusammensetzung bereit, umfassend die folgenden Schritte: (1) Herstellen des Gemisches, bestehend aus den Pflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis, Zugeben des 5- bis 20-fachen des Gesamtgewichts des Gemisches an Wasser und Erhitzen des so erhaltenen Gemisches, um einen ersten Heißwasserextrakt herzustellen; (2) Zugeben von Ethanol zu einem zweiten Heißwasserextrakt, der nach dem gleichen Verfahren wie Schritt (1) hergestellt wird, und Sammeln eines Präzipitats, um eine Polysaccharidfraktionzu erhalten; und (3) Mischen der in Schritt (2) hergestellten Polysaccharidfraktion mit dem in Schritt (1) hergestellten Heißwasserextrakt, um eine pflanzliche Zusammensetzung zu erzeugen.
Die Erfinder glaubten, dass der Heißwasserextrakt aus einem Gemisch, bestehend aus einem gleichen Gewichtsverhältnis der Pflanzen A. gigantis, C. officinale und P. japonica, Bestandteile enthält, die beim Verbessern der Funktion gegen Krebs, Immunfunktion und hämatopoetischen Funktion des Körpers und beim Schützen des Körpers vor oxidativem Schaden besonders wirksam sind, und dass die Identifizierung derartiger Bestandteile zu der Entwicklung einer pflanzlichen Zusammensetzung mit einer besseren Aktivität gegen Krebs führen kann als die herkömmlichen Zusammensetzungen gegen Krebs.
In dieser Hinsicht wurde der Heißwasserextrakt aus einem Gemisch, bestehend aus einem gleichen Gewichtsverhältnis der Pflanzen A. gigantis, C. officinale und P. japonica, in eine Methanolfraktion, eine Ethanolfraktion und eine Polysaccharidfraktion, das heißt das durch Zugeben von Ethanol gebildete Präzipitat, getrennt. Verschiedene Tests führten zu dem Befund, dass die Polysaccharidfraktion eine ausgezeichnete Wirkung auf die Verbesserung der Funktion gegen Krebs, Immunfunktion und hämatopoetischen Funktion des Körpers hat. Im Hinblick auf den Schutz vor oxidativem Schaden wurde festgestellt, dass die Polysaccharidfraktion etwas weniger wirksam als die Methanolfraktion und die Ethanolfraktion war.
Auf diesen Befunden beruhend identifizierten die Erfinder, dass, wenn der Heißwasserextrakt aus einem Gemisch, bestehend aus einem gleichen Gewichtsverhältnis der Pflanzen A. gigantis, C. officinale und P. japonica, in Kombination mit der Polysaccharidfraktion, das heißt ein durch Zugeben von Ethanol zu dem Heißwasserextrakt gebildetes Präzipitat, um den Gehalt an Polysaccharid zu erhöhen, verwendet wird, das so erhaltene Gemisch, hierin als "pflanzliche Zusammensetzung" bezeichnet, eine verbesserte Wirkung, bestehend im Schützen des Körpers vor oxidativem Schaden und im Verbessern der hämatopoetischen Funktion, Funktion gegen Krebs und Immunfunktion, hat.
Im Folgenden werden die Wirkungen des Heißwasserextrakts aus dem Gemisch der Pflanzen A. gigantis, C. officinale und P. japonica in einem gleichen Gewichtsverhältnis und seiner drei Fraktionen, d. h. in Methanol lösliche, in Ethanol lösliche, und Polysaccharidfraktionen, in Abbildungen gezeigt und verglichen, wobei jeder Parameter wie vorstehend beschrieben betrachtet wird, so dass gezeigt werden kann, dass die kombinierte Zusammensetzung, hergestellt durch Zugeben der Polysaccharidfraktion zu dem Heißwasserextrakt, wodurch der Gehalt des Polysaccharids erhöht wird, verbesserte Wirkungen hat. Als Nächstes werden die Wirkungen der pflanzlichen Zusammensetzung, die durch Kombinieren des Heißwasserextrakts mit der Polysaccharidfraktion hergestellt wird, zusammen mit Beispielen detaillierter beschrieben.
Wirkungen von Fraktionen, die aus dem Heißwasserextrakt aus dem Kräutergemisch isoliert werden
(1) Isolierung von Fraktionen aus dem Heißwasserextrakt aus dem Kräutergemisch
Die drei Pflanzen A. gigantis, C. officinale und P. japonica, die als Nahrungsmaterialien im Korean Food Code registriert sind und als chinesische pflanzliche Materialien verwendet werden, wurden im Schatten getrocknet, geschnitten und in einem gleichen Gewichtsverhältnis gemischt. Dem Pflanzengemisch wurden 10 Gewichtsäquivalente destilliertes Wasser zugegeben, und es wurde 8–10 Std. lang in einem Gefäß zum Extrahieren chinesischer Arzneikräuter gekocht, wodurch sich ein Heißwasserextrakt (Heißwasserextrakt: W-Fraktion) ergab. Dem Heißwasserextrakt wurde Methanol zugegeben, um eine in Methanol lösliche Fraktion (M-Fraktion) zu erhalten. Dem Heißwasserextrakt wurde Ethanol zugegeben, um eine in Ethanol lösliche Fraktion (E-Fraktion) zu erhalten. Auch wurde, als Ethanol dem Heißwasserextrakt in einer Endkonzentration von 80% zugegeben wurde, gefolgt von Inkubation bei 5–15 °C über Nacht, ein Präzipitat erhalten, das zur Herstellung einer Polysaccharidfraktion (P-Fraktion) führte.
(2) Auswertung der Wirkungen der isolierten Fraktionen
Jede Fraktion des Heißwasserextrakts wurde auf die Wirkungen hin ausgewertet, die im Aktivieren der Immunzellen, im Verbessern der hämatopoetischen Funktion und im Reduzieren des oxidativen Schadens im Körper bestehen.
Zuerst wurde die Aktivierung der Immunzellen folgendermaßen untersucht.
Falls die Immunzellen der Milz aktiviert werden, wenn sie in einem Kulturmedium kutliviert werden, das durch jede Fraktion des Heißwasserextrakts ergänzt wird, proliferieren die Immunzellen mit erhöhtem Zellstoffwechsel und erhöhter Zellteilung unter Einbeziehung von DNA-Replikation. Deshalb kann die Aktivierung der Immunzellen der Milz durch Zugeben eines radioaktiven DNA-Vorläufers (³H-markiertes Thymidin) zu dem Kulturmedium und Messen der Menge an Isotop, die in die Immunzellen aufgenommen wird, analysiert werden. Ein derartiger Assay der Aufnahme von ³H-Thymidin wurde folgendermaßen durchgeführt.
Die aus Mausmilzen gesammelten Immunzellen (Lymphozyten) wurden in einem Vollmedium suspendiert und auf eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden in einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml allquotiert und mit jeder Fraktion des Heißwasserextrakts behandelt. Nach 3 Tage langer Inkubation in einem CO₂-Inkubator wurde der Kulturvertiefung einer Menge von 1.5 μCi pro Vertiefung zugegeben. Nach weiterer, 4 Std. langer Inkubation wurden die Zellen unter Verwendung eines Zellernters auf einem Filterpapier aus Glasfasern geerntet. Der Papierstreifen wurde in ein Zählröhrchen gelegt und 3 ml eines Szintillationscocktails wurden zu dem Röhrchen gegeben. Das in die Zellen aufgenommene ³H-Thymidin wurde in einem β-Szintillationszähler gemessen und die Ergebnisse wurden als das arithmetische Mittel der Zählimpulse pro Minute (cpm) ausgedrückt.
Wie in 1 gezeigt, wurde festgestellt, dass die Polysaccharidfraktion die Immunzellen der Milz signifikant aktivierte und eine derartige Aktivierung war 3-fach höher als die des Heißwasserextrakts. Im Gegensatz dazu waren die in Methanol lösliche Fraktion und die in Ethanol lösliche Fraktion kaum wirksam im Aktivieren der Immunzellen.
Als Nächstes wurde die Wirkung des Heißwasserextrakts und seiner isolierten Fraktionen auf die hämatopoetische Funktion folgendermaßen untersucht.
Zunächst wurden der Heißwasserextrakt und seine Fraktionen auf ihre Wirkung auf die Proliferation der Stammzellen des Knochenmarks hin untersucht.
Die Stammzellen des Knochenmarks, bei denen es sich um nicht adhärente Zellen handelt, die aus Knochenmarkszellen erhalten werden, differenzieren zu Monozyten/Makrophagen, Blutplättchen, Erythrozyten usw. Nach dem Kultivieren von Knochenmarkszellen in einem Kulturmedium, das mit jeder Fraktion des Heißwasserextrakts ergänzt wurde, wurden die nicht adhärenten Zellen zusammen mit dem Kulturüberstand gesammelt. Die Proliferation der Stammzellen des Knochenmarks wurde durch Messen der Zellzahlen unter Verwendung eines Zellzählgerätes untersucht. Die Ergebnisse werden in 2a angegeben.
Wie in 2a gezeigt, wurde festgestellt, dass die Polysaccharidfraktion des Heißwasserextrakts die Proliferation der Stammzellen des Knochenmarks signifikant stimuliert, und eine derartige Stimulationswirkung war etwa 2-fach höher als die des Heißwasserextrakts. Andererseits wurde für die Methanolfraktion und die Ethanolfraktion festgestellt, dass sie eine viel schwächere Stimulationswirkung hatten als der Heißwasserextrakt.
Dann wurden der Heißwasserextrakt und seine Fraktionen auf ihre Wirkung auf die Proliferation der Stromazellen des Knochenmarks hin ausgewertet.
Es ist berichtet worden, dass eine Vielfalt von hämatopoetischen Faktoren (eiweißartige Faktoren, Cytokine usw.), die von den Stromazellen sezerniert werden, an der Proliferation der Stammzellen des Knochenmarks und ihrer Differenzierung zu diversen reifen Zellen beteiligt sind, und der Kontakt der Stammzellen des Knochenmarks mit den ihnen nahen Stromazellen für eine derartige Proliferation und Differenzierung entscheidend ist. Deshalb wird geglaubt, dass die Stromazellen in der hämatopoetischen Mikroumwelt eine wichtige Rolle beim Regulieren der Hämatopoese spielen.
Die Wirkung des Heißwasserextrakts und seiner Fraktionen auf die Proliferation der Stromazellen des Knochenmarks wurde untersucht. Knochenmarkszellen wurden kultiviert, um Stromazellen zu erhalten, die sich an den Boden der Kulturschalen anheften. Die isolierten Stromazellen des Knochenmarks wurden über einen langen Zeitraum kultiviert. Während der Kultivierung wurde in Abständen von 7 Tagen etwa die Hälfte des Kulturmediums gegen ein frisches Medium ausgetauscht. Die Zellen wurden mit jeder Fraktion des Heißwasserextrakts behandelt, worauf eine 2–3 Wochen lange Inkubation folgte. Die Proliferation der Stromazellen des Knochenmarks wurde durch Messen der Zellzahlen analysiert. Die Ergebnisse werden in 2b angegeben. Wie in 2b gezeigt, wies die Polysaccharidfraktion eine starke stimulierende Aktivität zur Proliferation der Stromazellen auf, und eine derartige Aktivität war über 4-fach höher als die des Heißwasserextrakts.
Schließlich wurden der Heißwasserextrakt und seine Fraktionen auf die reduzierende Wirkung gegen oxidativen Schaden im Körper hin ausgewertet.
Zellen wurden mit jeder Fraktion des Heißwasserextrakts behandelt, 4 Std. lang in einem CO₂-Inkubator inkubiert und mit Strahlung oder Wasserstoffperoxid behandelt. DNA-Schaden und Chromosomenschaden wurden mit einer Kontrolle verglichen und die Ergebnisse werden in den 3a, 3b, 4a und 4b angegeben. Wie in den 3a, 3b, 4a und 4b gezeigt, wurde festgestellt, dass die Polysaccharidfraktion eine reduzierende Wirkung gegen durch Strahlung oder Wasserstoffperoxid verursachten DNA-Schaden und Chromosomenschaden hat und eine derartige reduzierende Wirkung war etwas stärker als oder gleich mit der Ethanolfraktion, der Methanolfraktion und dem Heißwasserextrakt.
Zusätzlich wird die hemmende Wirkung jeder Fraktion des Heißwasserextrakts gegen Peroxidation der Membranlipide und -proteine, die durch Strahlung und oxidativen Schaden verursacht wird, in den 5a bis 5c gezeigt. Wie in den 5a bis 5c gezeigt, hat die Polysaccharidfraktion eine etwas schwächere hemmende Wirkung gegen Peroxidation der Membranlipide und -proteine als die Ethanolfraktion und der Heißwasserextrakt.
Weiterhin wird die reduzierende Wirkung jeder Fraktion des Heißwasserextrakts gegen oxidativen Schaden durch das Abfangen freier Radikale, die im Körper erzeugt werden, in den 6a und 6b gezeigt. Wie in den 6a und 6b gezeigt, hat die Polysaccharidfraktion eine schwächere Wirkung, freie Radikale abzufangen, als die in Ethanol lösliche Fraktion und die in Methanol lösliche Fraktion.
Wie vorstehend beschrieben, wurde festgestellt, dass die Polysaccharidfraktion im Hinblick auf die darin bestehenden Wirkungen, die Funktion gegen Krebs, Immunfunktion und hämatopoetische Funktion zu verbessern, den Ethanol- und Methanolfraktionen und dem Heißwasserextrakt überlegen ist. Der Heißwasserextrakt zeigte jedoch eine etwas höhere schützende Wirkung gegen oxidativen Schaden auf als die Polysaccharidfraktion. Deshalb können, wenn eine pflanzliche Zusammensetzung durch das Kombinieren des Heißwasserextrakts mit der Polysaccharidfraktion hergestellt wird, um den Gehalt an Polysaccharid zu erhöhen, alle vorher erwähnten vorteilhaften Wirkungen erhalten werden. Die pflanzliche Zusammensetzung mit einem erhöhten Gehalt an Polysaccharid durch das Kombinieren des Heißwasserextrakts mit der Polysaccharidfraktion wird folgendermaßen detaillierter beschrieben.
Pflanzliche Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung
Die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst einen ersten Heißwasserextrakt aus dem Gemisch der Pflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis und eine Polysaccharidfraktion als ein Präzipitat, das durch Zugeben von Ethanol zu einem zweiten Heißwasserextrakt aus dem Gemisch der Pflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis gebildet wird.
Im Detail wird die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung durch einen Vorgang hergestellt, umfassend die folgenden Schritte: (1) Herstellen des Gemisches, bestehend aus den Pflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis, Zugeben des 5- bis 20-fachen des Gesamtgewichts des Gemisches an Wasser und Erhitzen des so erhaltenen Gemisches, um einen ersten Heißwasserextrakt herzustellen; (2) Zugeben von Ethanol zu einem zweiten Heißwasserextrakt, der nach dem gleichen Verfahren wie Schritt (1) hergestellt wird, und Sammeln eines Präzipitats, um eine Polysaccharidfraktion zu erhalten; und (3) Mischen der in Schritt (2) hergestellten Polysaccharidfraktion mit dem in Schritt (1) hergestellten Heißwasserextrakt, um eine pflanzliche Zusammensetzung zu erzeugen.
Die Heißwasserextraktion in Schritt (1) wird vorzugsweise durch 8–10 Std. langes Kochen der Pflanzen in einem Gefäß zum Extrahieren chinesischer Arzneikräuter unter Verwendung von heißem Wasser durchgeführt. Das gekochte Produkt kann filtriert und bei Unterdruck durch einen Verdampfer konzentriert werden. In Schritt (2) wird bevorzugt, dass der Ethanol zu dem zweiten Heißwasserextrakt in einer Endkonzentration von 80 % zugegeben wird, und der zweite Heißwasserextrakt wird dann bei 5–15 °C über Nacht inkubiert, um ein Präzipitat zu erhalten, das heißt die Polysaccharidfraktion.
Um eine pflanzliche Zusammensetzung herzustellen, wird die Polysaccharidfraktion mit dem ersten Heißwasserextrakt, der in Schritt (1) hergestellt wurde, vermischt, wobei das Gemisch selbst verwendet oder durch Gefriertrocknung zu einem Pulver formuliert werden kann.
Vorzugsweise ist die Polysaccharidfraktion in der pflanzlichen Zusammensetzung in einer 1,5- bis 4-fach höheren Konzentration als im ersten Heißwasserextrakt enthalten. Deshalb wird der zweite Heißwasserextrakt vorzugsweise in einer 0,5- bis 3-mal so großen Menge wie die des ersten, in Schritt (1) hergestellten Heißwasserextrakts verwendet, um die Polysaccharidfraktion innerhalb des vorstehenden Bereichs zu erhalten.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die pflanzliche Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben als einen wirksamen Bestandteil, bereitgestellt. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann oral oder parenteral verabreicht und in einer auf dem Fachgebiet gewöhnlichen pharmazeutischen Formulierung verwendet werden.
Das heißt, dass die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bei der klinischen Anwendung in verschiedenen Formulierungen oral oder parenteral verabreicht werden kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann unter Verwendung eines Füllstoffes, eines Verdickungsmittels, eines Bindemittels, eines Befeuchtungsmittels, eines Sprengmittels, eines Verdünnungsmittels, wie zum Beispiel eines oberflächenaktiven Mittels, oder eines Exzipienten zu einer pharmazeutischen Herstellung formuliert werden. Beispiele fester Herstellungen für die orale Verabreichung schließen Tabletten, Pillen, Pulver, Granulatkörner und Kapseln ein. Derartige feste Herstellungen können einen oder mehrere Exzipienten ausgewählt aus Stärke, Calciumcarbonat, Saccharose oder Laktose und Gelatine enthalten. Zusätzlich zu dem einfachen Exzipienten können die festen Herstellungen auch ein Gleitmittel, wie zum Beispiel Magnesiumstearat oder Talkum enthalten. Beispiele flüssiger Herstellungen für die orale Verabreichung schließen Suspensionen, flüssige Lösungen, wie zum Beispiel Elixiere, Emulsionen und Sirupe ein. Die flüssigen Herstellungen können ein einfaches Verdünnungsmittel, wie zum Beispiel Wasser oder flüssiges Paraffin, und verschiedene Exzipienten, für die Befeuchtungsmittel, Süßungsmittel, aromatische Mittel und Konservierungsmittel als Beispiele dienen, enthalten. Beispiele pharmazeutischer Herstellungen für die parenterale Verabreichung schließen sterilisierte wässrige Lösungen, nicht flüssige Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, gefriergetrocknete Herstellungen und Zäpfchen ein. Die nicht flüssigen Lösungen und Suspensionen können unter Verwendung von Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenölen, wie zum Beispiel Olivenöl, und injizierbaren Estern, wie zum Beispiel Ethyloleat, hergestellt werden. Grundlagen für die Zäpfchen können Witepsol, Macrogol, Tween-61, Kakaobutter, Laurinfett und Glyceringelatine einschließen.
Die tägliche Dosierung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist 30–300 mg/kg, aber vorzugsweise 80–150 mg/kg. Die tägliche Dosierung kann getrennt 1- bis 3-mal verabreicht werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird ein funktionelles Nahrungsmittel bereitgestellt, umfassend die pflanzliche Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben als einen wirksamen Bestandteil. Das funktionelle Nahrungsmittel kann weiterhin gemäß den Bevorzugungen des Verbrauchers und zum Verbessern der Qualität des Endnahrungsmittels ein Nahrungsergänzungsmittel umfassen.
Die vorliegende Erfindung wird detaillierter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele zusammen mit den begleitenden Zeichnungen erklärt.
BEISPIEL: Herstellung der pflanzlichen Zusammensetzung
Die drei Pflanzen A. gigantis, C. officinale und P. japonica, die als Nahrungsmaterialien im Korean Food Code registriert sind und als chinesische pflanzliche Materialien verwendet werden, wurden im Schatten getrocknet, geschnitten und in einem gleichen Gewichtsverhältnis gemischt. Dem Pflanzengemisch wurden 10 Gewichtsäquivalente destilliertes Wasser zugegeben, und es wurde 8–10 Std. in einem Gefäß zum Extrahieren chinesischer Arzneikräuter gekocht. Das gekochte Produkt wurde filtriert und bei Unterdruck unter Verwendung eines Verdampfers konzentriert, wodurch sich ein Heißwasserextrakt ergab. Ein Viertel bis zwei Drittel der konzentrierten Lösung wurde aufbewahrt, und der Rest, ein Drittel bis drei Viertel des Konzentrats wurde mit Ethanol in einer Endkonzentration von 80 % gemischt, gefolgt von Inkubation bei 5–15 °C über Nacht. Die so erhaltene präzipitierte Polysaccharidfraktion wurde gesammelt und mit dem aufbewahrten Heißwasserextrakt gemischt. Das Gemisch kann selbst oder in einer durch Gefriertrocknung hergestellten Pulver-Formulierung verwendet werden. Um in den folgenden Tests verwendet zu werden, wird die Hälfte des Konzentrats aufbewahrt und Ethanol wird zu der restlichen Hälfte des Konzentrats gegeben. Dann wird die restliche Hälfte, zu der Ethanol zugegeben wurde, über Nacht bei 5–15 °C inkubiert und die so erhaltene präzipitierte Polysaccharidfraktion wurde gesammelt und mit der aufbewahrten Hälfte des Konzentrats gemischt. Nach dem Gefriertrocknen dieses Gemisches wurde das so erhaltene pflanzliche Pulver richtig in destilliertem Wasser aufgelöst und durch Filtration durch eine Membran von 0,45 μm (Millipore) sterilisiert und in den folgenden Tests verwendet.
In dem folgenden experimentellen Beispiel ist "Kontrolle" die Gruppe, die mit Kochsalzlösung anstelle der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt wird, und in dieser Kontrolle wird die Gruppe, die zusätzlich mit Strahlung behandelt wird als die "Strahlungskontrolle" bezeichnet, die Gruppe, die zusätzlich mit H₂O₂ behandelt wird, wird als die " H-Kontrolle" bezeichnet, die Gruppe, die zusätzlich mit CCl₄ behandelt wird, wird als die "C-Kontrolle" bezeichnet, und die Gruppe, die mit keiner Strahlung oder keinen Chemikalien behandelt wird, wird als die "normale Kontrolle" bezeichnet.
EXPERIMENTELLES BEISPIEL 1: Auswertung der Aktivität gegen Krebs der pflanzlichen Zusammensetzung und ihre Wirkungen auf die Immunfunktion
1) Hemmende Wirkung gegen Tumorwachstum
Um die Aktivität der in dem vorstehenden Beispiel hergestellten filtrierten pflanzlichen Zusammensetzung gegen Krebs zu untersuchen, wurden Mäuse, denen Tumorzellen injiziert worden waren, mit der pflanzlichen Zusammensetzung behandelt, wobei eine Kochsalzlösung als eine Kontrolle verwendet wurde. Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine Wirkung bestehend im Hemmen von Tumorwachstum hatte.
Männlichen und weiblichen Mäusen (BDF1, 7 Wochen alt) wurden 1 × 10⁵ B16F0-Melanomzellen intraperitoneal injiziert. Vom folgenden Tag an wurden die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung und die Kontrollprobe 10 Tage lang intraperitoneal in die Mäuse verabreicht. Danach wurden die überlebenden Mäuse jeden Tag gezählt, und die Ergebnisse werden in den 7a und 7b angegeben.
Wie in 7a gezeigt, waren im Fall der männlichen Mäuse, denen Tumorzellen injiziert wurde, alle Mäuse der Kontrollgruppe bis zum Tag 21 tot, während einige Mäuse der mit der pflanzlichen Zusammensetzung behandelten Gruppe bis zum Tag 25 überlebten, wobei die Überlebenszeit der mit der pflanzlichen Zusammensetzung behandelten männlichen Mäuse um etwa 15 % verlängert war. Wie in 7b gezeigt, waren im Fall der weiblichen Mäuse die Mäuse der Kontrollgruppe bis zum Tag 19 tot. Im Gegensatz dazu überlebten etwa 50 % der weiblichen Mäuse der Behandlungsgruppe bis zum Tag 24 und einige von ihnen überlebten bis zum Tag 26, wobei die Überlebenszeit der weiblichen Mäuse um etwa 34 % verlängert war.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung Aktivität gegen Krebs durch Hemmen des Wachstums der Tumorzellen aufweist.
Andererseits wurden Tumorzellen mit der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einem Reagenzglas behandelt, um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung Aktivität gegen Krebs durch direktes Töten von Tumorzellen aufweist, und ihre Lebensfähigkeit wurde analysiert. Das heißt, B16F0-Melanomzellen wurden in Vollmedium suspendiert und auf eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden in einer Dichte von 5 × 104 Zellen pro Vertiefung allquotiert und mit der pflanzlichen Zusammensetzung behandelt. Nach 1 Tag langer Inkubation in einem CO₂-Inkubator wurde eine MTT-Lösung zu den Kulturvertiefungen gegeben, gefolgt von 4 weiteren Std. Inkubation. Lebende Zellen wandeln MTT zu Formazan um, und das Formazan-Produkt wird in den lebenden Zellen abgelagert. Das in lebenden Zellen abgelagerte wasserunlösliche Formazan-Produkt wurde durch Zugeben von 0,07 N HCl in Isopropanol zu jeder Vertiefung solubilisiert und durch Messen der Absorption bei 570 nm unter Verwendung eines UV-Spektrometers quantifiziert. Die gemessene Absoprtion wurde in eine relative Zahl lebender Zellen umgewandelt. Die Ergebnisse werden in 8 angegeben. Wie in 8 gezeigt, gibt es keinen Unterschied in den Zahlen lebender Zellen zwischen den mit der pflanzlichen Zusammensetzung behandelten oder nicht behandelten Gruppen. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung Tumorzellen weder direkt tötet noch ihre Proliferation hemmt.
2) Wirkung, bestehend im Verbessern der Immunfunktion
2.1) Wirkung, bestehend im Aktivieren der Immunzellen
Falls die Immunzellen der Milz aktiviert werden, wenn sie in einem Kulturmedium kultiviert werden, das mit der pflanzlichen Zusammensetzung und dem Heißwasserextrakt aus einem Gemisch der drei Pflanzen A. gigantis, C. officinale und P. japonica ergänzt wird, die in dem vorstehenden Beispiel hergestellt wurden, proliferieren die Immunzellen mit erhöhtem Zellstoffwechsel und erhöhter Zellteilung unter Einbeziehung von DNA-Replikation. Deshalb kann die Aktivierung der Immunzellen der Milz durch Zugeben eines radioaktiven DNA-Vorläufers (³H-markiertes Thymidin) zu dem Kulturmedium und Messen der Menge an Isotopen, die in die Splenozyten aufgenommen wird, analysiert werden. Ein derartiger Assay der Aufnahme von ³H-Thymidin wurde folgendermaßen durchgeführt.
Die aus Mausmilzen gesammelten Immunzellen (Lymphozyten) wurden in Vollmedium suspendiert und auf eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Vertiefung allquotiert und mit der pflanzlichen Zusammensetzung und dem Heißwasserextrakt behandelt. Nach 3 Tage langer Inkubation in einem CO₂-Inkubator wurde dem Medium ³H-Thymidin in einer Menge von 1.5 μCi pro Vertiefung zugegeben. Nach weiterer, 4 Std. langer Inkubation wurden die Zellen unter Verwendung eines Zellernters auf einem Filterpapier aus Glasfasern geerntet. Der Papierstreifen wurde in ein Zählröhrchen gelegt und ein 3 ml-Szintillationscocktail wurde zu dem Röhrchen zugegeben. Die Aufnahme von ³H-Thymidin wurde in einem β-Szintillationszähler gemessen und die Ergebnisse wurden als die durchschnittlichen Zählimpulse pro Minute (cpm) ausgedrückt. Die Ergebnisse werden in 1 angegeben.
Wie in 1 gezeigt, wurde festgestellt, dass die pflanzliche Zusammensetzung in bemerkenswerter Weise wirksam beim Aktivieren der Immunzellen war, und eine derartige Wirkung war 2-mal höher als die des Heißwasserextrakts und 10-mal höher als die der nicht mit einem pflanzlichen Extrakt behandelten Kontrolle.
2.2) Wirkung, bestehend im Verbessern der Funktion gegen Krebs durch Aktivieren der NK-Zellen
Natürliche Killer(NK)-Zellen, die zu einem primären Schutzsystem gegen Tumorzellen gehören, eliminieren Tumorzellen auf unspezifische Weise. In diesem Test wurde die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf ihre Wirkungen auf das Erhöhen der Zytotoxizität der NK-Zellen gegen die Tumorzellen hin ausgewertet.
Mäusen wurde die pflanzliche Zusammensetzung (1 mg/Maus) 3 Tage lang einmal täglich intraperitoneal verabreicht. Am nächsten Tag wurden, nach dem Töten der Mäuse, Immunzellen der Milz aus der Milz isoliert und als Effektorzellen in dem folgenden Chromfreisetzungsassay verwendet, um ihre zytolytische Aktivität gegen die Zielzellen (Tumorzellen) zu analysieren.
2 × 10⁶ YAC-1-Zellen (Maus-Lymphom) wurden als Zielzellen mit Na₂ ⁵¹CrO₄ (40 μCi) in einem 37 °C warmen Wasserbad eine Stunde lang markiert. Die isolierten Splenozyten als Effektorzellen (als E bezeichnet) und die markierten Zielzellen (als T bezeichnet) wurden auf eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen in Verhältnissen von 50 : 1 und 100 : 1 allquotiert. Nach 4 Std. langer Inkubation wurden 100 μl des Kulturüberstands in ein Röhrchen gesammelt und in einem Gamma-Zähler auf die Menge an radioaktivem Chrom hin analysiert, das aus den toten Tumorzellen freigesetzt wurde, und die Ergebnisse wurden als die durchschnittlichen Zählimpulse pro Minute (cpm) ausgedrückt. Alle Tests wurden dreifach ausgeführt, und die Zytotoxizität der NK-Zellen gegen die Tumorzellen wurde gemäß der folgenden Gleichung 1 berechnet: % Zytotoxizität = (ER – SR)/(MR – SR) × 100 (Gleichung 1)wobei ER (experimentelle Freisetzung, cpm) die experimentelle Freisetzung von ⁵¹Cr aus den markierten Zielzellen, die mit den Effektorzellen kokultiviert werden, in den Kultur überstand ist, SR (spontane Freisetzung, cpm) die spontane Freisetzung von ⁵¹Cr aus den markierten Zielzellen, die allein inkubiert werden, in den Kulturüberstand ist, und MR (maximale Freisetzung, cpm) durch Zugeben von 1 % Triton X-100 zu 2 × 10⁴ Zielzellen, die mit ⁵¹Cr markiert wurden, bei einer Effizienz von über 90% erhalten wird.
Wie in 9a gezeigt, wurde festgestellt, dass NK-Zellen eine 1,5-mal höhere Zytotoxizität gegen die Tumorzellen haben. Dieses Ergebnis zeigt an, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung NK-Zellen aktiviert, um ihre Zytotoxizität zu erhöhen.
2.3) Wirkung, bestehend im Verbessern der Funktion gegen Krebs durch Aktivieren der Makrophagen
Aktivierte Makrophagen spielen durch Phagozytose eine wichtige Rolle in Immunreaktionssystemen und können Tumorzellen auch direkt zerstören. Die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wurde auf ihre Wirkung auf das Aktivieren der Makrophagen, Tumorzellen zu töten, hin ausgewertet. Peritoneale Makrophagen wurden aus der Bauchhöhle der Mäuse isoliert, auf eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Vertiefung allquotiert und mit der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt, gefolgt von 24 Std. langer Inkubation. Nachdem jede Vertiefung dreimal gewaschen worden war, wurden die anhaftenden Makrophagen als Effektorzellen in dem folgenden Chromfreisetzungsassay verwendet, um ihre Zytotoxizität gegen Tumorzellen zu analysieren.
5 × 10³ ⁵¹Cr-markierte YAC-1-Zellen als Zielzellen wurden jeder Vertiefung, die kultivierte Makrophagen enthielt, zugegeben, wobei das Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen etwa 40 : 1 war. Nach 24 Std. langer Inkubation wurden 100 μl des Kulturüberstands in ein Röhrchen gesammelt und wurden auf von den toten Tumorzellen freigesetztes radioaktives Chrom in einem Gamma-Zähler analysiert und die Ergebnisse wurden als die durchschnittlichen Zählimpulse pro Minute (cpm) ausgedrückt. Alle Tests wurden dreifach ausgeführt, und die Zytotoxizität der Makrophagen gegen die Tumorzellen wurde gemäß dem gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben berechnet (Gleichung 1).
Wie in 9b gezeigt, wurde festgestellt, dass die Zytotoxizität der Makrophagen gegen die Tumorzellen in einer negativen Kontrolle etwa 10% war und sich in einer mit der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe auf etwa 80% erhöhte. Die Erhöhung der Zytotoxizität der mit der pflanzlichen Zusammensetzung behandelten Makrophagen war vergleichbar zu der von Makrophagen, die mit einer positiven Kontrollchemikalie, LPS (Lipopolysaccharid), behandelt wurden.
Andererseits zeigten die Makrophagen eine verbesserte Phagozytose gegen die zugegebenen Mikropartikel auf, wenn sie mit der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt wurden (Daten nicht gezeigt).
2.4) Wirkung, bestehend im Verbessern der Funktion gegen Krebs durch Aktivieren der zytotoxischen T-Zellen
Die Zerstörung von Tumorzellen wird durch Aktivierung verschiedener Immunzellen erreicht und kann durch das Immunsystem auf eine spezifische Weise wirksam erreicht werden. Immunzellen, die einer derartige Funktion durchführen, schließen zytotoxische T-Zellen ein, die fähig sind, Tumorzellen direkt zu töten.
Um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Funktion gegen Krebs durch Aktivieren zytotoxischer T-Zellen verbessert, wurden Immunzellen der Milz, die von einer mit Tumorzellen sensibilisierten Maus isoliert wurden, auf Zytotoxizität gegen die Tumorzellen hin analysiert. Den Mäusen wurde die pflanzliche Zusammensetzung (1 mg/Maus) 3 Tage lang einmal täglich intraperitoneal verabreicht. Am nächsten Tag wurden den Mäusen 1 × 106 durch Strahlenbelastung getötete B16F0-Melanomzellen intraperitoneal injiziert. Danach wurde die pflanzliche Zusammensetzung 2 weitere Tage lang einmal täglich intraperitoneal in die Mäuse verabreicht. Am Tag 7 nach der Injektion der getöteten Tumorzellen wurden die Mäuse getötet und die mit den Tumorzellen sensibilisierten Splenozyten wurden isoliert und ihre Zytotoxizität gegen Tumorzellen wurde durch den Chromfreisetzungsassay untersucht. Die Immunzellen der Milz als Effektorzellen und ⁵¹Crmarkierte B16F0-Melanomzellen wurden in jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen in Verhältnissen von 50 : 1 und 100 : 1 allquotiert. Nach 4 Std. langer Inkubation wurden 100 μl des Kulturüberstands in ein Röhrchen gesammelt und wurden auf von den toten Tumorzellen freigesetztes radioaktives Chrom in einem Gamma-Zähler analysiert und die Ergebnisse wurden als die durchschnittlichen Zählimpulse pro Minute (cpm) ausgedrückt. Alle Tests wurden dreifach ausgeführt und die Zytotoxizität der zytotoxischen T-Zellen gegen die Tumorzellen wurde gemäß dem gleichen Verfahren, wie vorstehend beschrieben, berechnet (Gleichung 1).
Wie in 9c gezeigt, wurde festgestellt, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Zytotoxizität der zytotoxischen T-Zellen gegen die Tumorzellen im Vergleich zur Kontrolle etwa 2-mal erhöhte.
EXPERIMENTELLES BEISPIEL 2: Auswertung der Wirkung der pflanzlichen Zusammensetzung auf die Verbesserung der hämatopoetischen Funktion und die Erholung des hämatopoetischen Immunsystems von oxidativem Schaden
1) Wirkung, bestehend im Verbessern der hämatopoetischen Funktion
1.1) Stimulation der Proliferation der Stammzellen des Knochenmarks
Die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wurde auf ihre Wirkung auf die Proliferation der Stammzellen des Knochenmarks hin ausgewertet. Wenn man Knochenmarkszellen kultiviert, wachsen Stromazellen anhaftend an den Boden einer Kulturschale und nicht anhaftende Zellpopulationen wachsen in Suspension. Die nicht anhaftenden Zellen proliferieren durch Kontakt mit den Stromazellen und differenzieren zu Monozyten/ Makrophagen, Blutplättchen, Erythrozyten usw. Knochenmarkszellen wurden aus einem Maus-Femur isoliert. Die Knochenmarkszellen wurden in einem mit der pflanzlichen Zusammensetzung und dem Heißwasserextrakt, die in Beispiel 1 hergestellt wurden, ergänzten Medium kultiviert. Der Kulturüberstand, der nicht anhaftende Stammzellen des Knochenmarks enthielt, wurde gesammelt und die Zellzahl wurde unter Verwendung einer Zellzählgerätes bestimmt. Die Ergebnisse werden in 2a angegeben.
Wie in 2a gezeigt, wurde festgestellt, dass die pflanzliche Zusammensetzung eine stimulierende Wirkung auf die Proliferation der Stammzellen des Knochenmarks hat, und eine derartige Wirkung war 1,6-fach und 7-fach höher als die Wirkungen des Heißwasserextrakts beziehungsweise der Kontrolle.
1.2) Stimulation der Proliferation der Stromazellen des Knochenmarks
Es ist berichtet worden, dass eine Vielfalt von hämatopoetischen Faktoren (eiweißartige Faktoren, Cytokine usw.), die von den Stromazellen sezerniert werden, an der Proliferation der Stammzellen des Knochenmarks und ihrer Differenzierung zu diversen reifen Zellen beteiligt sind, und der Kontakt der Stammzellen des Knochenmarks mit den ihnen nahen Stromazellen ist für eine derartige Proliferation und Differenzierung entscheidend. Deshalb wird geglaubt, dass die Stromazellen in der hämatopoetischen Mikroumwelt eine wichtige Rolle beim Regulieren der Hämatopoese spielen.
Die Wirkung der pflanzlichen Zusammensetzung und des Heißwasserextrakts und seiner Fraktionen auf die Proliferation der Stromazellen des Knochenmarks wurde untersucht. Knochenmarkszellen wurden kultiviert, um an den Boden einer Kulturschale angeheftete Stromazellen zu erhalten. Die isolierten Stromazellen des Knochenmarks wurden 2–3 Wochen lang in einem durch die pflanzliche Zusammensetzung und jede Fraktion des Heißwasserextrakts ergänzten Medium kultiviert. Während der Kultivierung wurde in Abständen von 7 Tagen etwa die Hälfte des Kulturmediums gegen ein frisches, durch die Proben ergänztes Medium ausgetauscht. Die Proliferation der Stromazellen des Knochenmarks wurde durch Messen der Zellzahlen analysiert. Die Ergebnisse werden in 2b angegeben.
Wie in 2b gezeigt, wurde festgestellt, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine stimulierende Wirkung auf die Proliferation der Stromazellen hat, und eine derartige stimulierende Wirkung war 2-fach und 8-fach höher als die des Heißwasserextrakts beziehungsweise der Kontrolle.
2) Wirkung, bestehend im Verbessern der Erholung des hämatopoetischen Immunsystems von oxidativem Schaden
2.1) Wirkung auf die Wiederherstellung der hämatopoetischen Funktion nach Strahlenbelastung: stimulierende Wirkung auf die Regeneration der Blutzellen (Immunzellen) und Immunzellen der Milz
Es ist bekannt, dass die Blutzellzahlen plötzlich abnehmen, wenn ein Tier mit Strahlung belastet wird, und sich dann langsam erholen.
Vor und nach der Strahlenbelastung (5 Gray) wurde Mäusen die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verabreicht und die Zellzahlen der Blutzellen und Lymphozyten der Milz wurden analysiert. 36 Std. und 12 Std. vor und 30 Min. und 24 Std. nach der Strahlenbelastung wurde die pflanzliche Zusammensetzung intraperitoneal in Mäuse verabreicht und dann wurde eine derartige Verabreichung 3 weitere Male in Abständen von 2 Tagen ausgeführt.
Blut wurde von der Maus durch die Orbitalvene gesammelt und die Zahl der Blutzellen wurde unter Verwendung eines Analysegerätes für tierische Blutzellen bestimmt.
Die Untergruppen der Immunzellen der Milz (Lymphozyten; in 11a und 11b als 1 bezeichnet) wurden unter Verwendung eines Durchflusszytometers analysiert. Die hergestellten Lymphozyten der Milz wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,1 % Rinder serumalbumin und 0,1 % Natriumazid enthält, gewaschen und Teilmengen von 106 Zellen wurden in Reagenzgläser transferiert. Um unspezifisches Binden der für Untergruppen von Zellen spezifischen Antikörper gegen Fc-yII/III-Rezeptoren zu verhindern, wurden die Fc-Rezeptoren durch 5 Min. langes Inkubieren der Lymphozyten mit anti-CD16/CD32-Antikörper bei 4°C blockiert. Danach wurden die Lymphozyten bei 4 °C 40 Min. lang mit spezifischen monoklonalen Antikörpern inkubiert, wobei anti-IgM-Antikörper für B-Lymphozyten (in 11a und 11b als 2 bezeichnet), anti-Thy1.2-Antikörper für alle Arten von T-Lymphozyten (in 11a und 11b als 3 bezeichnet), anti-CD4-Antikörper für T-Helfer-Zellen (in 11a und 11b als 4 bezeichnet), und anti-CD8-Antikörper für zytotoxische T-Zellen (in 11a und 11b als 5 bezeichnet) verwendet wurden. Alle Antikörper waren mit einem fluoreszierenden Farbstoff (FITC, Fluorisothiocyanat) konjugierte monoklonale Antikörper. Danach wurden die Lymphozyten zweimal mit einer 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Natriumazid enthaltenden, phosphatgepufferten Kochsalzlösung gewaschen, die Zellzahlen jeder Zelluntergruppe wurden unter Verwendung eines Durchflusszytometers (FACStar, COULTER, USA) durch Quantifizieren des an einen spezifischen Zelloberflächenmarker gebundenen monoklonalen Antikörpers bestimmt.
Wie in den 10a und 10b gezeigt, erholten sich die Zahlen der Leukozyten ( 10a) und Lymphozyten (10b) im Blut im Fall der strahlenbelasteten, mit der pflanzlichen Zusammensetzung behandelten Mäuse ab 3 Wochen auf einen nahezu normalen Wert und waren viel höher als die der strahlenbelasteten Kontrollgruppe, der aber nicht die pflanzliche Zusammensetzung verabreicht wurde, was anzeigt, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Regeneration der Leukozyten und Lymphozyten im Blut stimuliert. Im Gegensatz dazu erholten sich die Zahlen der Leukozyten und Lymphozyten im Fall der Kontrollgruppe, die strahlenbelastet wurde, nach etwa 7 Wochen auf einen normalen Wert.
Die Ergebnisse des Regenerationstests der Lymphozyten der Milz werden in 11a und 11b angegeben. Wie in 11a gezeigt, hatte sich die Gesamtzellzahl der Lymphozyten der Milz am Tag 14 nach der Strahlenbelastung im Fall der Behandlungsgruppe, der die pflanzliche Zusammensetzung verabreicht wurde, auf einen viel höheren Wert erholt als die strahlenbelastete Kontrollgruppe, der die pflanzliche Zusammensetzung nicht verabreicht wurde. Im Hinblick auf die Zelluntergruppen erholten sich die B-Zellen in der Behandlungsgruppe fast auf den normalen Wert, während sich T-Zellen und ihre Subtypen auf einen höheren Wert als die Kontrollgruppe erholt hatten, aber ein derartiger Erholungswert war nicht mehr als 50 % des normalen Wertes. Am Tag 47 nach der Strahlenbelastung erholten sich die Zellzahlen der gesamten Lymphozyten der Milz und B-Zellen wie in 11b gezeigt auf einen normalen Wert. Die Zellzahlen der T-Zellen und ihrer Subtypen erholten sich auf etwa 50 % des normalen Wertes in der strahlenbelasteten Kontrollgruppe und fast 80 % des normalen Wertes in der Behandlungsgruppe.
2.2) Wirkung auf die Wiederherstellung der Funktion der nach der Strahlenbelastung regenerierten Immunzellen
2.2.1) Wirkung, bestehend im Verbessern der Aktivität der regenerierten B-Zellen
Um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Aktivität der regenerierten B-Zellen in Mäusen verbessert, die der Strahlung ausgesetzt wurden, wurde ein Plaque-bildender Zellassay gegen SRBC folgendermaßen durchgeführt.
36 Std. und 12 Std. vor und 30 Min. und 24 Std. nach der Strahlenbelastung (5 Gray) wurde die pflanzliche Zusammensetzung Mäusen intraperitoneal verabreicht und dann wurde eine derartige Verabreichung noch 3-mal in Abständen von 2 Tagen ausgeführt. Am Tag 14 und 25 nach der Strahlenbelastung wurden den C57BL/6-Mäusen durch die Schwanzvene 1 × 109 rote Blutzellen vom Schaf (SRBC) in 0.2 ml Kochsalzlösung injiziert. Nach 4 Tagen wurden Lymphozyten der Milz aus den Mäusen isoliert, auf eine Dichte von 7 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt und auf Eis platziert. Die SRBC wurden dreimal mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung gewaschen und in einem Medium resuspendiert, um eine Zellsuspension von 20 % (Vol./Vol.) zu erzeugen. Eine 0.5 % Agarose-RPMI-Lösung wurde in einem 45 °C warmen Wasserbad für das Fixieren der Lymphozyten und SRBC hergestellt. 100 μl der Lymphozytensuspension wurden schonend mit 100 μl der SRBC-Suspension in 1600 μl der 0.5 % Agarose-RPMI-Lösung gemischt und das so erhaltene Gemisch wurde auf eine Kulturschale ausplattiert. Nach dem Verfestigen wurde die Kulturschale 2 Std. lang in einem Inkubator inkubiert und 600 μl einer 70-fachen Verdünnung eines Meerschweinchen-Komplements (GPC) wurden zu der Schale gegeben. Nach weiterer, 2 Std. langer Inkubation wurden hämolytische Plaques, die in der Umgebung der Antikörper-produzierenden Zellen durch die Interaktion des Komplements mit den Komplexen aus Antigen (SRBC) und Antikörper gebildet wurden, gezählt und in die Zahl Plaque-bildender Zellen (PFC) pro Milz unter Berücksichtigung des Verdünnungsgrades der Lymphozyten umgewandelt. Die Ergebnisse werden in den 12a und 12b angegeben.
Wie in den 12a und 12b gezeigt war im Fall einer strahlenbelasteten Kontrolle, die nicht mit der pflanzlichen Zusammensetzung behandelt wurde, am Tag 14 nach der Strahlenbelastung die Antikörper-produzierende Funktion der B-Zellen nur etwa 4 % des normalen Wertes, obwohl sich die Zahl der B-Zellen auf etwa 60 % des normalen Wertes erholt hatte (11a), während sie am Tag 25 nach der Strahlenbelastung nur etwa 41 % des normalen Wertes betrug. Im Gegensatz dazu zeigten die B-Zellen im Fall der Behandlungsgruppe mit der pflanzlichen Zusammensetzung an den Tagen 14 und 25 nach der Strahlenbelastung eine Antikörper-produzierende Funktion von etwa 20% beziehungsweise 57% des normalen Wertes. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine im Verbessern der Antikörper-herstellenden Funktion der regenerierten B-Zellen ebenso wie im Stimulieren der Regeneration der B-Zellen bestehende Aktivität hat (11a und 11b).
2.2.2) Wirkung, bestehend im Verbessern der Aktivität der regenerierten Helfer-T-Zellen
Um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Aktivität der regenerierten T-Helfer-Zellen bei strahlenbelasteten Mäusen verbessert oder nicht, wurde die Reaktion der T-Zellen auf die Stimulation allogener Immunzellen durch die gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) analysiert.
36 Std. und 12 Std. vor und 30 Min. und 24 Std. nach der Strahlenbelastung (5 Gray) wurde C57BL/6-Mäusen (MHC-Typ H-2b) die pflanzliche Zusammensetzung intraperitoneal verabreicht und dann wurde eine derartige Verabreichung 3 weitere Male in Abständen von 2 Tagen ausgeführt. An den Tagen 21 und 36 nach der Strahlenbelastung wurden die Mäuse getötet und Immunzellen der Milz (Lymphozyten) wurden isoliert, um sie als Responderzellen zu verwenden. Stimulatorzellen wurden durch Töten von Immunzellen der Milz (Lymphozyten) aus BALB/c (N-2d)-Mäusen durch Belastung mit Gamma-Strahlen (3.000 rads) hergestellt. Die Responderzellen und die Stimulatorzellen wurden gemischt und auf eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden in einer Konzentration von je 1 × 105 Zellen in 0,2 ml Vollmedium pro Vertiefung ausplattiert und 4 Tage lang in einem Inkubator kultiviert. 4 Std. vor dem Ernten der Zellen wurden 2 μCi ³H-Thymidin zu jeder Vertiefung gegeben. Danach wurden die Zellen unter Verwendung eines Zellernters auf einem Filterpapier aus Glasfasern geerntet. Der Papierstreifen wurde in ein Zählröhrchen gelegt und ein 3 ml-Szintillationscocktail wurde zu dem Röhrchen gegeben. Die Aufnahme von ³H-Thymidin durch die Responderzellen wurde in einem β-Szintillationszähler gemessen und die Ergebnisse wurden als die durchschnittlichen Zählimpulse pro Minute (cpm) ausgedrückt.
Wie in den 13a und 13b gezeigt, wurde festgestellt, dass die Reaktion (Proliferation) der regenerierten T-Helfer-Zellen im MLR-Assay in der Behandlungsgruppe mit der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung am Tag 21 nach der Strahlenbelastung viel höher war als die strahlenbelastete Kontrolle, die nicht mit der pflanzlichen Zusammensetzung behandelt wurde. Etwa 5 Wochen nach der Strahlenbelastung hatte sich die Reaktion (Proliferation) der regenerierten T-Helfer-Zellen in der Behandlungsgruppe auf den normalen Wert erholt. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine im Verbessern der Reaktion der regenerierten Helfer-T-Zellen bestehende Aktivität hat.
2.2.3) Wirkung, bestehend im Normalisieren des gestörten Musters der Antikörperherstellung nach der Strahlenbelastung
Um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung das gestörte Muster der Antikörperherstellung in strahlenbelasteten Mäusen reguliert oder nicht, wurde die Herstellungsmenge jeder Antikörperart nach der Injektion eines T-Zellabhängigen Antigens gemessen.
36 Std. und 12 Std. vor und 30 Min. und 24 Std. nach der Strahlenbelastung wurde die pflanzliche Zusammensetzung Mäusen intraperitoneal verabreicht und dann wurde eine derartige Verabreichung weitere 3 Male in Abständen von 2 Tagen ausgeführt. In der Woche 1, 2, 3, 5 und 8 nach der Strahlenbelastung wurde den Mäusen intraperitoneal ein Proteinantigen (DNP-KLH) injiziert. Am Tag 7 und 14 nach der Antigeninjektion wurde Blut von den Mäusen durch die Orbitalvene gesammelt und Serum wurde isoliert und bis zur Verwendung bei –70 °C aufbewahrt. Das aufbewahrte Serum wurde folgendermaßen durch enzymverbundenen Immunabsorptionsassay (ELISA) auf den Antikörpertiter hin analysiert. Nach dem Beschichten jeder Vertiefung einer Mikroplatte mit dem Antigen wurde das Serum zu der Vertiefung gegeben, um dem Antikörper im Serum zu ermöglichen, mit dem beschichteten Antigen zu interagieren. Nach dem Waschen der Vertiefung wurde mit Peroxidase konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG oder mit Biotin konjugiertes anti-Maus-IgE zu der Vertiefung gegeben, um mit dem antigengebundenen Antikörper zu interagieren. Im Fall der Zugabe des mit Biotin konjugierten IgEs wurde mit Streptavidin konjugierte Pferde-Peroxidase zu der Vertie fung gegeben, um weiter mit dem konjugierten Biotin zu interagieren. Ein TMB-Substrat der Peroxidase wurde zur Farbentwicklung zugegeben. Nach dem Anhalten der Farbentwicklung wurde die Absorption bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Lesegerätes gemessen, wobei eine Referenzwellenlänge 570 nm war.
Wie in den 14a und 14b gezeigt, wiesen Mäuse eine reduzierte IgG-Herstellung im Vergleich zur normalen Kontrolle (14a) auf, wenn sie der Strahlung ausgesetzt wurden, während sie eine erhöhte IgE-Herstellung aufzeigten (14b). Eine derartige Änderung in der IgG- und IgE-Herstellung durch Strahlung erholte sich fast auf das normale Muster durch die Verabreichung der pflanzlichen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung.
2.2.4) Wirkung, bestehend im Verbessern der Zytotoxizität der regenerierten NK-Zellen gegen die Tumorzellen
Um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Aktivität der regenerierten NK-Zellen in strahlenbelasteten Mäusen verbessert oder nicht, wurden die aus den Mäusen isolierten Lymphozyten der Milz mit dem Chromfreisetzungsassay (siehe 2.2) auf Zytotoxizität gegen Tumorzellen hin ausgewertet.
36 Std. und 12 Std. vor und 30 Min. und 24 Std. nach der Strahlenbelastung (5 Gray) wurde Mäusen die pflanzliche Zusammensetzung intraperitoneal verabreicht. An den Tagen 22, 29, 35 und 49 nach der Strahlenbelastung wurden Splenozyten aus den Mäusen isoliert und Lymphozyten wurden durch Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Hypaque von den Splenozyten erhalten. Die Lymphozyten wurden zum Verwenden als Effektorzellen im folgenden Chromfreisetzungsassay, wobei mit ⁵¹Cr markierte YAC-1-Zellen (2 × 105 Zellen/ml) als Zielzellen verwendet wurden, in einem Vollmedium resuspendiert. Sowohl die Effektorzellen als auch die Zielzellen wurden mit je 0,1 ml auf Mikroplatten mit 96 Vertiefungen und rundem Boden in Verhältnissen von 6,5 : 1, 12,5 : 1, 25 : 1 und 50 : 1 ausplattiert. Nach 4 Std. langer Inkubation wurde 0,1 ml des Kulturüberstands gesammelt und die Menge an radioaktivem Chrom wurde in einem Gamma-Zähler gemessen. Alle Tests wurden dreifach ausgeführt und die Zytotoxizität der Lymphozyten gegen die Tumorzellen wurde gemäß dem gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben (Gleichung 1) berechnet.
Um die im Töten von Tumorzellen bestehende Aktivität der Lymphozyten der Milz in einzelnen Mäusen zu vergleichen, wurde die Zahl der Lymphozyten (lytische Einheit: LU), die für das Töten einer gewünschten Zahl von Tumorzellen erforderlich ist, berechnet. In diesem Test war 1 LU₁₀ als die Zahl der Effektorzellen definiert, die für 10% Lyse der Zielzellen nötig sind. Die LU₁₀ wurden aus einer Dosis-Wirkungs-Kurve durch lineare Regressionsanalyse berechnet. Die Tumorzell-tötenden Aktivitäten zwischen einzelnen Mäusen wurden durch Berechnen der LU pro Milz verglichen, indem die LU pro 1 × 10⁷ Lymphozyten mit der Gesamtzahl der Lymphozyten der Milz multipliziert wurden.
Wie in 15 gezeigt, wiesen im Fall der strahlenbelasteten Kontrolle die regenerierten NK-Zellen für einen langen Zeitraum nach der Strahlenbelastung eine in bemerkenswerter Weise verringerte Aktivität im Töten von Tumorzellen auf. Im Gegensatz dazu erholte sich im Fall der Behandlungsgruppe, der die pflanzliche Zusammensetzung verabreicht wurde, die Funktion (Tumorzell-tötende Aktivität) der regenerierten NK-Zellen in bemerkenswerter Weise zu einem etwa 2-fach höheren Wert als die strahlenbelastete Kontrolle.
EXPERIMENTELLES BEISPIEL 3: Auswertung der Wirkung der pflanzlichen Zusammensetzung auf den Schutz der DNA und Chromosomen vor oxidativem Schaden
1) Hemmende Wirkung gegen oxidativen Schaden der intrazellulären DNA und den Chromosomen
Nachdem Lymphozyten 4 Std. lang mit der pflanzlichen Zusammensetzung und dem Heißwasserextrakt und seinen isolierten Fraktionen behandelt wurden und dann mit Strahlung oder Behandlung mit H₂O₂ belastet wurden, wurde der Schaden der intrazellulären DNA und der Chromosomen mit dem der strahlenbelasteten Kontrolle verglichen.
1.1) Hemmende Wirkung gegen oxidativen DNA-Schaden
Um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung DNA-Einzelstrang-Bruch verhindert, der sich aus oxidativem Schaden ergibt, der durch Strahlung oder chemische Verbindungen induziert wird, wurde ein Einzelzell-Gelelektrophorese-Assay folgendermaßen durchgeführt.
Zuerst wurden die behandelten Zellen mit Agarosegel gemischt und auf einem Objektträger verteilt. Die Zellen wurden dann in einem Lysepuffer bei 4 °C 1 Std. lang lysiert. Der Objektträger wurde einer Elektrophorese unterworfen und die DNA-Fragmente wurden mit Ethidiumbromid (20 μg/ml) gefärbt. Die gewanderten DNA-Fragmente wurden unter einem mit einer CCD-Kamera ausgestatteten Fluoreszenzmikroskop durch ein Bildanalysesystem (Komet 4.0, Kinetic imaging, Ltd., Großbritannien) analysiert. Das Ausmaß des DNA-Schadens wurde als Tailmoment (TM) ausgedrückt, wobei TM = Wanderweglänge des DNA-Fragments (Schweiflänge) × Prozentsatz der DNA-Fragmente in dem Schweif. Ein höheres Tailmoment bedeutet höheren DNA-Schaden.
Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung durch Strahlung (3a) und H₂O₂ (3b) induzierten DNA-Einzelstrang-Bruch wirksam hemmt, wobei die Hemmrate etwa 49 % beziehungsweise 37 betrug.
1.2) Hemmende Wirkung gegen oxidativen Chromosomenschaden
Um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung Chromosomenaberration, die durch oxidativen Schaden durch Strahlung und chemische Verbindungen verursacht wird, verhindert oder nicht, wurde die Frequenz des während der Kernteilung der Zellen mit Chromosomenschaden gebildeten Mikronukleus in einem Mikronukleus-Test gemessen.
Zuerst wurden Lymphozyten 4 Std. lang in einem Medium kultiviert, dem die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zugegeben wurde, und dann mit Strahlung belastet oder mit H₂O₂ behandelt. Die Zellen wurden mit Cytochalasin B behandelt, um die Teilung der cytoplasmatischen Membran zu verhindern. Nach 24 Std. wurden die Zellen gesammelt, auf einen Objektträger platziert und mit Giemsa gefärbt. Die Mikronukleusfrequenz wurde in 1.000 Zellen mit zwei Kernen aufgezeichnet, die sich einer Kernteilung unterzogen hatten.
Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass die pflanzliche Zusammensetzung durch oxidativen Schaden durch Strahlung (4a) und H₂O₂ (4b) verursachte Chromosomenaberration wirksam hemmte, wobei die Hemmrate etwa 33 % beziehungsweise 64 % betrug.
2) Hemmung der Oxidation der intrazellulären Lipide und Proteine
2.1) Hemmung der Lipid-Peroxidation
Um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die durch Strahlung und chemische Verbindungen induzierte Peroxidation von Membranlipiden hemmt oder nicht, wurde durch Lipid-Peroxidation hergestelltes Malondialdehyd in der Mausleber mit dem Assay Thiobarbitursäure-reaktiver Substanzen (TBARS) gemessen.
36 Std. und 12 Std. vor der Strahlenbelastung (8 Gray) wurde Mäusen die pflanzliche Zusammensetzung und jede Fraktion des Heißwasserextrakts intraperitoneal verabreicht.
Um oxidativen Schaden durch eine chemische Verbindung zu induzieren, wurde den Mäusen ein Gemisch (0.5 ml/kg) von CCl₄ und Maisöl intraperitoneal injiziert und man ließ sie etwa 18 Std. lang hungern, um einen Leberschaden zu induzieren. In diesem Fall wurde Mäusen die pflanzliche Zusammensetzung und jede Fraktion des Heißwasserextrakts 27 Std. und 3 Std. vor der Behandlung mit CCl₄ intraperitoneal injiziert.
Nach dem Töten der Mäuse wurden die Lebern herausgeschnitten und homogenisiert. Die 3 mg Protein enthaltenden homogenisierten Leberproben wurden mit 0,2 ml 8,1 % SDS (Natriumdodecylsulfat), 1,5 ml 20 % Essigsäure und 1,5 ml 0,8 % TBA-Lösung gemischt und das Gemisch wurde bei 95 °C 30 Min. lang in einem Waserbad inkubiert. Die Absorption wurde bei 532 nm gemessen. Auf einer unter Verwendung einer Standardlösung von 1,1,3,3-Tetraethoxypropan erhaltenen Standardkurve wurde die Menge des hergestellten Malondialdehyds geschätzt und als nmol/mg Protein ausgedrückt.
Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die durch Strahlung (5a) und CCl₄ (5b) induzierte Lipid-Peroxidation wirksam hemmt, wobei die Hemmrate etwa 31 % beziehungsweise 36 % betrug.
2.2) Hemmung der Proteinoxidation
Um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung Proteinoxidation durch Strahlung hemmt oder nicht, wurden Carbonlygruppen in Proteinen der Mausleber quantifiziert, wobei die Carbonylgruppen in manchen Aminosäureresten der Proteine durch Oxidation davon gebildet werden.
36 Std. und 12 Std. vor der Strahlenbelastung (8 Gray) wurde Mäusen die pflanzliche Zusammensetzung und jede Fraktion des Heißwasserextrakts intraperitoneal verabreicht. 4 Stunden nach der Strahlenbelastung wurden Mauslebern herausgeschnitten und homogenisiert. 4 mg Protein enthaltende homogenisierte Leberproben wurden mit einem gleichen Volumen 20 % TCA (Trichloressigsäure) gemischt, um die Proteine zu präzipitieren. Die präzipitierte Proteinprobe wurde 1 Std. lang mit 500 μl 10 mM 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) umgesetzt und ein gleiches Volumen 20 % TCA wurde zugegeben, gefolgt von Zentrifugation. Nach dem Verwerfen des Überstands wurde das Proteinpellet mit 1 ml Ethanol/Ethylacetat (1:1) gewaschen und mit 1,2 ml 6M Guanidin-HCl resuspendiert, gefolgt von Zentrifugation. Die Absorption des Überstands wurde spektrophotometrisch bei 370 nm gemessen. Die Konzentration der Carbonylgruppen wurde aus der Absorption unter Verwendung eines molaren Absorptionskoeffizienten von 22.000 Mol/l^–1 cm^–1 berechnet.
Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die durch Strahlung induzierte Proteinoxidation in bemerkenswerter Weise hemmte, so dass die Proteinoxidation der der normalen Kontrolle (5c) ähnlich war.
3) Wirkung, bestehend im Abfangen freier Radikale
3.1) Wirkung, bestehend im Abfangen des DPPH-Radikals
Um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine radikalfangende Aktivität, darin bestehend, Elektronen an im Körper erzeugte freie Radikalmoleküle abzugeben, hat oder nicht, wurde die Fähigkeit der pflanzlichen Zusammensetzung, Elektronen an das DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)-Radikal abzugeben, gemessen.
1,8 ml 4 × 10^–4 M DPPH wurde zu 0,2 ml der pflanzlichen Zusammensetzung und dem Heißwasserextrakt und seinen Fraktionen bei verschiedenen Konzentrationen gegeben und das Gemisch wurde mit einem Vortex 10 Sek. lang gut gemischt. Nach 30 Min. langer Inkubation wurde die Absorption bei 517 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (Shimadzu UV-1201, Japan) gemessen. Das DPPH-Radikal hat auf Grund seines ungepaarten Elektrons eine tiefviolette Farbe. Wenn die Testprobe Elektronen an das DPPH-Radikal abgibt, d. h. dass das ungepaarte Radikalelektron durch Paarung mit dem abgegebenen Elektron stabilisiert wird, wandelt sich die Farbe von Tiefviolett zu Blassgelb und die Absorption bei 517 nm nimmt ab. Unter Verwendung dieses Prinzips wurde die elektronenabgebende Fähigkeit (EDA) der Testproben als Prozentsatz des Unterschieds der Absorption bei 517 nm zwischen der Testlösung und der Kontrolllösung ausgedrückt. EDA (%) = (Ac – As)/Ac × 100wobei Ac die Absorption der Kontrolllösung ist, welche die Testprobe nicht enthält, und As die Absorption der Testlösung ist, welche die Testprobe enthält.
Als ein Ergebnis zeigten der Heißwasserextrakt und seine Ethanol- und Methanolfraktionen eine sehr hohe Elektronen abgebende Aktivität und die Polysaccharidfraktion und die pflanzliche Zusammensetzung wiesen eine signifikante Elektronen abgebende Aktivität auf (6a).
3.2) Wirkung, bestehend im Abfangen des OH-Radikals
Um zu untersuchen, ob die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine Aktivität hat oder nicht, die darin besteht, OH (Hydroxyl)-Radikale abzufangen, die hauptsächlich für in vivo oxidativen Schaden verantwortlich sind, die eine relativ starke Reaktivität unter den reaktiven Sauerstoff-Spezies haben, wurde die pflanzliche Zusammensetzung auf die OH-Radikal-fangende Aktivität hin ausgewertet, wobei das OH-Radikal in vitro unter Verwendung von H₂O₂ hergestellt wurde (2-Desoxyribose-Oxidationsverfahren).
0,2 ml jeder Probe der pflanzlichen Zusammensetzung und des Heißwasserextrakts und seiner Fraktionen wurden mit 0,2 ml 0,1 mM FeSO₄/EDTA, 0,2 ml 10 mM 2-Desoxyribose und 1,2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) gemischt. Dann wurden 0,2 ml 10 mM H₂O₂ zu dem Gemisch gegeben. Nach 4 Std. langer Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 ml 2,8 % TCA (Trichloressigsäure) angehalten. Nach der Zugabe von 1 ml 1 % TBA (2-Thiobarbitursäure) wurde das Endreaktionsgemisch 10 Min. lang in einem Wasserbad bei 95 °C inkubiert und abgekühlt. Die Absorption bei 532 nm wurde in einem UV-Spektrophotometer gemessen. Die Hydroxylradikal-fangende Aktivität wurde als Prozentsatz des Unter schieds in der Absorption bei 532 nm zwischen der Testlösung und der Kontrolllösung ausgedrückt. Hydroxylradikal-fangende Aktivität (%) = [1 – (As – Ao)/(Ac – Ao)] × 100wobei Ao die Absorption der negativen Kontrolle ist, die sowohl die Testprobe als auch H₂O₂ nicht enthält, Ac die Absorption der positiven Kontrolle ist, die mit H₂O₂ behandelt wird aber die Testprobe nicht enthält, und As die Absorption der Testlösung ist, die die Testprobe enthält und mit H₂O₂ behandelt wird.
Die Ergebnisse werden in 6b angegeben. Es wurde festgestellt, dass die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die höchste OH-Radikal-fangende Aktivität hat.
EXPERIMENTELLES BEISPIEL 4: Toxizitätstest
Als ein Ergebnis eines Toxizitätstests, wobei die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung oral und intraperitoneal an Mäuse verabreicht wurde, wurde festgestellt, dass eine 50% Letaldosis (LD50) über 2 g pro kg Körpergewicht beträgt, was anzeigt, dass die pflanzliche Zusammensetzung keine Toxizität hat.
WIRKUNG DER ERFINDUNG
Wie vorstehend beschrieben hat die pflanzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine darin bestehende Wirkung, die Aktivität gegen Krebs, Immunfunktion und hämatopoetische Funktion des Körpers zu verbessern und oxidativen Schaden am Körper zu hemmen. Deshalb kann die pflanzliche Zusammensetzung zur Vorbeugung von Nebenwirkungen der Krebstherapie durch Stimulieren der Wiederherstellung der geschädigten Immunfunktion und hämatopoetischen Funktion und Hemmen von oxidativem Schaden angewendet werden. Weiterhin kann die pflanzliche Zusammensetzung wegen ihrer vorteilhaften Eigenschaften zum Verhindern verschiedener degenerativer chronischer Krankheiten und Verbessern der Gesundheit der schwachen und älteren Menschen angewendet werden.

Claims

Pflanzliche Zusammensetzung zum Verbessern der Aktivität gegen Krebs, Immunreaktion und Hämatopoese des Körpers und Schützen des Körpers vor oxidativem Schaden, umfassend einen ersten Heißwasserextrakt aus einem Gemisch der Pflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis und eine Polysaccharidfraktion als ein Präzipitat, das durch Zugeben von Ethanol zu einem zweiten Heißwasserextrakt aus einem Gemisch der Pflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis gebildet wird.
Pflanzliche Zusammensetzung wie in Anspruch 1 dargelegt, wobei die Polysaccharidfraktion in der pflanzlichen Zusammensetzung mit einer 1,5- bis 4-fachen Menge der Polysaccharidfraktion in dem ersten Heißwasserextrakt enthalten ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Behandeln von Krebs, umfassend die pflanzliche Zusammensetzung nach Anspruch 1 als einen wirksamen Bestandteil.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Verbessern der Immunfunktion, umfassend die pflanzliche Zusammensetzung nach Anspruch 1 als einen wirksamen Bestandteil.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Verbessern der hämatopoetischen Funktion, umfassend die pflanzliche Zusammensetzung nach Anspruch 1 als einen wirksamen Bestandteil.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Schützen des Körpers vor oxidativem Schaden, umfassend die pflanzliche Zusammensetzung nach Anspruch 1 als einen wirksamen Bestandteil.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Verhindern der Nebenwirkungen der Krebstherapie, umfassend die pflanzliche Zusammensetzung nach Anspruch 1 als einen wirksamen Bestandteil.
Verwendung der pflanzlichen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs und zum Verbessern der Immunfunktion und hämatopoetischen Funktion.
Funktionelles Nahrungsmittel zum Schützen des Körpers vor oxidativem Schaden und Verhindern der Nebenwirkungen der Krebstherapie, umfassend die pflanzliche Zusammensetzung nach Anspruch 1 als einen wirksamen Bestandteil.
Verfahren zum Herstellen einer pflanzlichen Zusammensetzung, umfassend die folgenden Schritte: (1) Herstellen des Gemisches, bestehend aus den Pflanzen Angelicae gigantis Radix, Cnidium officinale Makino und Paeonia japonica Miyabe et Takeda in einem gleichen Gewichtsverhältnis, Zugeben des 5- bis 20-fachen des Gesamtgewichts des Gemisches an Wasser und Erhitzen des so erhaltenen Gemisches, um einen ersten Heißwasserextrakt herzustellen; und (2) Zugeben von Ethanol zu einem zweiten Heißwasserextrakt, der nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt (1) hergestellt wird, und Sammeln des Präzipitats, um eine Polysaccharidfraktion zu erhalten; und (3) Mischen der in Schritt (2) hergestellten Polysaccharidfraktion mit dem in Schritt (1) hergestellten Heißwasserextrakt, um eine pflanzliche Zusammensetzung zu erzeugen.
Verfahren wie in Anspruch 10 dargelegt, wobei der zweite Heißwasserextrakt in Schritt (2) vorzugsweise bei 0,5- bis 3-facher Menge des ersten, in Schritt (1) hergestellten Heißwasserextrakts verwendet wird, um die Polysaccharidfraktion innerhalb des Bereichs zu erhalten.