KR102206870B1 - 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치자, 황백, 자감초, 후코이단의 약재 혼합물을 물(水)로써 추출하는 약재 추출물인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 복합제제에 관한 것이다.
또한 본 발명은 1) 치자, 황백, 자감초, 후코이단을 혼합하여 약재 혼합물을 얻는 제 1단계; 2) 상기 제 1단계에서 얻은 약재 혼합물을 물(水)로써 추출하여 약재 추출물을 얻는 제 2단계:를 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 복합제제의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 아토피 피부염 예방 또는 치료용 복합제제 및 그 제조방법은 항아토피 효능이 우수할 뿐만 아니라 간단한 방법으로 약재 추출물을 쉽게 얻을 수 있는 등 장점이 많다.

Description

아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제 및 그 제조방법{Combined Formulation for Prevention or Treatment of Atopic Dermatitis and Process for Thereof}

본 발명은 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한약재인 치자(梔子), 황백(黃柏), 자감초(炙甘草)에 후코이단(Fucoidan)을 혼합한 약재 혼합물을 물(水)로써 추출하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제이다.

또한 본 발명은 치자, 황백, 자감초, 후코이단을 혼합하여 약재 혼합물을 얻은 후에 물(水)로써 추출하여 약재 추출물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제의 제조방법이다.

아토피피부염은 호전과 악화를 반복하는 만성 재발성 습진 질환으로 최근 점점 증가하는 추세이며, 우리나라의 경우에도 아토피피부염을 진단받은 초등학생의 수가 1995년의 13.7%에 비해 2005년에는 29.2%로 증가하였고, 중증 환자의 비율도 점차 증가하고 있는 것으로 나타났다. 또한 18세에 이르러서도 8.5%의 유병률을 보이는 등 현재 주요한 국민 보건문제로 대두되고 있다.

현재 양방에서 경증 또는 중증의 아토피피부염 환자들에게 시행되고 있는 치료는 항히스타민제와 국소스테로이드 외용제, 스테로이드 경구제, 국소 면역조절 외용제, 보습제가 있으나, 질환의 중증도에 따른 차별화된 치료법이 제시되지 못하고 있다. 또한 중증 환자에 대해서도 치료에 대해 설명하고 교육할 시간을 확보하기 어렵고, 환자와 의사 모두 치료 효과의 불완전성이나 부작용을 우려하여 국제적인 치료지침에서 권장하고 있는 전신 면역억제 약물요법, 광선요법, 알레르겐-면역요법 등이 시행되지 못하고 있는 실정이다.

한의학적으로는 아토피 피부염을 침음창(浸淫瘡), 유선(乳癬), 내선(*癬)이라 기재한 이래로, 그 원인을 열 혹은 혈허풍조(血虛風燥)로 보아 급·만성으로 나누어 진단해 치료하거나, 유아·아동의 병인을 습열(濕熱), 태열(胎熱), 비허풍조(脾虛風燥)로 나누고, 성인의 병인은 풍습(風濕), 습열(濕熱), 비허(脾虛), 혈허(血虛)로 나누어 보는 아토피 피부염 변증 분류3)가 시행되고 있으며, 이와 같은 변증 분류를 병인과 증상에 따라 나누어 소화기와 호흡기의 급·만성으로 접근하였다.

최근 한의학에서는 아토피 피부염에 다양한 약물요법과 외치법을 응용하고 있다. 기존 연구논문 중에서 아토피피부염에 상한론 처방을 활용한 경우로는 계피가황기탕(桂枝加黃기湯) 치험 3례, 대시호탕(大柴胡湯), 반하사심탕(半夏瀉心湯)을 이용한 치험 1례, 기혈수(氣血水) 이론에 근거한 시호계피지탕가미방(柴胡桂枝湯加味方) 치험 1례, 계지마황(桂枝麻黃) 각반탕(各半湯) 치험 1례, 오수유탕(吳茱萸湯) 치험 1례, 회역산(回逆散) 치험 2례, 감초사심탕(甘草瀉心湯) 치험 1례, 소시호탕(小柴胡湯) 치험 1례, 소시호탕(小柴胡湯) 치험 2례 등이 보고되어 있다.

이와 관련한 종래기술로서, 하기 특허문헌 001에는 치자 6g, 황백 6g, 감초 3g의 한약재로 구성된 치자벽피탕(梔子檗皮湯)으로 호전을 보인 아토피피부염의 치험 2례"가 개시되어 있다. 그러나 이는 2명의 아토피피부염 환자를 대상으로 한 아토피 등급측정(SCORAD) 지수가 78에서 20.2, 67.4로 각각 감소하였고, 그 구체적인 효과는 소양감, 홍반, 부종, 가피, 찰과, 태선화 등이 호전되었다고 하나, 피부 건조, 피부 장벽의 개선에는 아직 만족스럽지 못한 수준이다.

또한 하기 특허문헌 001에는 감비르에서 유래한 카테킨을 고순도로 정제하여 얻어진 분말을 금은화, 인진쑥, 어성초, 몰약, 황금, 형개, 감초, 치자, 연교, 황백, 자초를 에탄올, 물 또는 1,3-부틸렌글리콜로 추출하여 얻어진 추출액에 용해하여 얻어지는 조성물을 유효성분으로 함유하는 “아토피 피부용 화장품 조성물"이 개시되어 있다. 그러나 상기 기술은 면역조절 이상으로 인한 아토피 피부염의 항균, 항염, 항소양증에 우수한 효과를 나타낼 뿐이며, 본원 발명과 비교하여 구성성분이 전혀 다르고, 성분이 많아 복잡한 차이가 있다.

또한 하기 특허문헌 002에는 "후코이단 및 생약성분 추출물을 함유하는 아토피피부염 증상 개선용 크림"이 개시되어 있다. 그러나 상기 기술은 후코이단 또는 생약성분 추출물을 단독으로 사용하는 경우에 비해 아토피피부염 증상을 현저히 완화시키는 효과를 나타낸다고 하나, 이 역시 본원 발명과 비교하여 구성성분이 전혀 다르고, 그 효과가 만족스럽지 못하다.

그리고 하기 특허문헌 003에는 "염증성 관절 질환 예방 또는 치료용 한약재 추출물 및 그 제조방법"이 개시되어 있다. 그러나 상기 기술은 황백 등 다수의 한약재로부터 얻은 추출물은 연골세포를 증식시키고 IL-1β, TNF-α 등의 염증성 사이토카인을 감소시켜 염증성 관절 질환 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 뿐이고, 이 역시본원 발명과 비교하여 구성성분 및 구체적인 질환이 전혀 다르고, 그 효과가 만족스럽지 못하다.

따라서 본 발명자들은 한약재로부터 추출된 복합추출물을 사용하여 피부질환의 연구를 하던 중 아토피 효과, 특히 피부 건조 또는 피부 장벽 개선에 매우 뛰어난 효과가 있음을 알아내어 본 발명을 완성하게 되었다.

한국 공개특허공보 제10-2017-0138714호(2017. 12. 18.) 한국 등록특허 제10-1291343호(2013. 7. 24.) 한국 특허등록 제10-1666450호(2016. 10. 10.)

대한한의학 방제학회지 제25권 제3호, 429-436(2017. 8.)

본 발명은 치자(梔子), 황백(黃柏), 자감초(炙甘草), 후코이단(Fucoidan)을 혼합한 약재 혼합물로부터 추출하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제 및 그 제조방법의 제공을 그 과제로 한다.

본 발명은 치자, 황백, 자감초, 후코이단의 한약재 혼합물을 물(水)로부터 추출하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제를 제공한다.

또한 본 발명은 1) 치자, 황백, 자감초, 후코이단을 혼합하여 약재 혼합물을 얻는 제 1단계; 2) 상기 제 1단계에서 얻은 약재 혼합물을 물(水)로써 추출하여 약재 추출물을 얻는 제 2단계:를 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제의 제조방법을 제공한다.

한편, 본 발명에 의한 그 밖의 구체적인 과제의 해결수단은 발명의 상세한 설명에 기재되어 있다.

본 발명에 의한 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제는 항아토피 효과, 특히 피부 건조 내지 피부장벽의 개선에 매우 우수한 장점이 있다.

또한 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제의 제조방법은 간단한 방법으로 항아토피 효과, 특히 피부 건조 내지 피부장벽의 개선에 매우 우수한 약재 추출물을 쉽게 제조할 수 있다.

도 1은 NC/Nga 생쥐의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 NC/Nga 생쥐의 피부발진 점수를 나타낸 그래프이다.
도 3은 NC/Nga 생쥐의 피부발진 상태를 나타낸 사진이다.
도 4는 NC/Nga 생쥐의 혈액 분석을 나타낸 그래프이다.
도 5는 NC/Nga 생쥐의 피부조직에서 총세포수를 나타낸 그래프이다.
도 6은 NC/Nga 생쥐의 혈청 내 면역글로불린 E 측정을 나타낸 그래프이다.
도 7은 NC/Nga 생쥐의 비장세포액 내 IL-4 등 단백질 생성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 NC/Nga 생쥐의 등피부조직을 적출하여 H&E와 톨루이딘 블루 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 NC/Nga 생쥐의 등피부 조직에서 면역형광염색을 통한 Claudin 1 등의 발현도 측정결과를 나타내는 사진이다.

먼저, 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 뿐만 아니라, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 것이다.

본 발명에 의한 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제의 제조방법은 1) 치자, 황백, 자감초, 후코이단을 혼합하여 약재 혼합물을 얻는 제 1단계; 2) 상기 제 1단계에서 얻은 약재 혼합물을 물(水)로써 추출하여 약재 추출물을 얻는 제 2단계:를 포함하는 것을 특징으로 한다. 더 구체적으로 상기 약재 혼합물은 치자 18중량부, 황백 12중량부, 자감초 중량부 6중량부, 후코이단 4.5중량부로 혼합되는 것이 바람직하다.

상기 제 2단계에서 추출된 추출물은 20~50℃로 식힌 다음에 그 속에 포함될 수 있는 이물질을 제거하기 위하여 여과지를 사용하여 여과하는 것이 바람직하고, 이어서 상기 추출물은 농축시킬 수 있다. 이때 농축은 50~70℃에서 실행하는 것이 바람직하고, 농축 시에 진공증발건조기 또는 회전감압농축기를 이용하여 농축시킬 수 있다.

나아가 상기 농축된 추출물은 동결 건조시키는 것이 바람직한데, 이때 동결건조는 -60 ~ -90℃에서 수행하는 것이 바람직하다.

한편, 상기 약재 혼합물을 구성하기 위해 사용되는 여러 가지 한방 재료의 특징은 하기와 같다.

치자(梔子)는 꼭두서니과의 상록 활엽 관목으로서, 9~11월에 타원형의 과실이 성숙하여 홍황색을 띄면 이를 채취하여 건조시켜 약용 및 염료용으로 사용한다. 특히, 한방에서는 이뇨제, 해열제, 진정제 및 눈병, 황달 등에 치료에 사용되고, 지혈제로 중요하게 사용된다. 치자의 성분으로는 게니핀(genipin), 게니포시드(geniposide), 가르데노시드(gardenoside) 등의 이리도이도(iridoid) 배당체, 크로신(crocin), 크로세틴(crocetin) 등의 성분, 가르다닌(gardanin)의 플라보노이드계 성분과 그 외에 콜린(choline), 우르솔릭산(ursolic acid) 등을 함유하고 있다.

치자에 대한 연구로는, 과거에는 주로 치자를 이용한 색소관련 연구(김희구 외, 한국식품영양학회지, 1998, 11:68-71) 및 치자색소 이용 피클(김애정 외, 2008. 한국식품영양학회지, 21, 524-529), 치자첨가 국수(김미림,2006. 한국식품조리과학회, 22: 237-243), 치자첨가 돈육패티 전미란 외, 2011. 한국축산식품학회지 31: 741-747) 등의 치자 색소를 이용한 식품제조연구가 주를 이루었으나, 최근에는 치자의 유용 생리활성에 대한 연구가 집중되고 있다. 즉, 치자의 간 보호 효과(Chen YH 등, 2012. World J Gastroenterol. 18: 7158-7165), 신경세포 보호효과(Choi SJ 등, 2007. Mol Cells. 24: 113-118), 암세포 성장 억제효과(Peng CH 등, 2005. Curr Cancer Drug Targets. 5: 299-305), 혈관신생반응 억제효과(Koo HJ 등, 2004. Planta Med. 70: 467-469), nitric oxide 생성억제를 통한 항염증 활성(Peng K 외, 2012. Bioorg Med Chem Lett. S0960-894X(12)01551-X], 피부장벽 손상 완화효과(형순희 외, 2010. 대한미용과학회지 6: 65-72), tyrosinase 효소활성 저해 및 melanogenesis 억제 효과(곽정훈 외, 2004. 한국생물공학회지, 19: 437-440), monoamine oxidase 저해활성(황금희 외, 2007. 한국생약학회지 38: 1-16) 및 항산화 활성(Pham TQ 외, 2000. J Agric Food Chem. 48:1455-1461) 등이 보고되고 있다. 항혈전 활성 관련으로는 치자의 열수 추출물로부터 iridoid계 genipin과 수용성 카로티노이드계 색소 crocin이 항혈전 활성을 나타내는 것이 알려져 있다. 이들 물질은 혈소판 응집을 저해하여 항혈전 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있으나, 현재까지 치자로부터 헥센에 용해되는 지용성 물질의 항혈전 활성에 대한 보고는 없으며, 특히 지용성 물질의 혈소판 응집저해 활성을 통한 항혈전 활성에 대해서는 알려진바 없다.

황백(黃柏)은 황벽나무의 껍질을 약재로 이르는 말로, 황경피라고도 한다. 낙엽활엽 교목으로 높이 10m 정도로 자라는데, 껍질에는 코르크가 발달했으며 속껍질은 황색이다. 잎은 마주나며, 깃꼴겹잎으로 작은 잎사귀는 5~13장이며, 달걀모양의 피침형(披針形) 또는 긴 원형이다. 잎 가장자리에는 작은 톱니 및 연한 털이 있으며, 중간 맥(脈)의 기부(基部)에는 긴 털이 약간 있다. 5~6월에 황색의 꽃이 피는데, 자웅이주(雌雄異株)의 단성(單性)이다. 원추 모양의 수술은 긴 원형으로, 수꽃에는 5개의 수술이 있고, 암꽃에는 퇴화된 수술이 비늘 조각 모양을 하고 있다. 자방은 5실로 되어 있으며 암술대는 짧고 암술머리는 5갈래로 갈라진다. 열매는 장과상(漿果狀)의 육질이 많고 중심부에 단단한 핵을 갖고 있으며, 동그란 모양으로 익었을 때에는 자흑색을 띤다. 우리나라에서는 제주, 전남 지역을 제외한 전 지역에서 분포하고 있으며, 일본, 만주, 중국, 아무르 및 우수리 등지에 분포하고, 잡목 숲 또는 산속의 계곡에서 자란다.

황백나무줄기에서 껍질을 벗겨내어 조피(粗皮:거친 껍질)를 제거하거나 썰어서 햇볕에 말린 후에 얻는 황백은 약으로서 혈당저하 작용을 한다. 또한 폐렴쌍구균, 인형결핵균, 포도상구균 등에 대하여 발육저지 작용을 함과 동시에 종양세포의 번식을 저지시키고, 살균작용을 한다. 복용하는 경우에는 미각 반사의 항진에 의하여 위액의 분비를 촉진시키고, 식욕의 항진도 가져오게 한다. 또한 일반 알칼로이드가 지니는 전신작용을 하지 않기 때문에 다량으로 투여해도 부작용이 없으므로 정장제 뿐 아니라 건위제로 사용할 수 있다. 또한 이 약재에 대하여 여러 세균의 내성(耐性)도 생기지 않으므로 유행성 눈병이 유행할 때 세안 소독약으로도 사용할 수 있다. 그 외에도 혈압강하, 중추신경계 억제, 항염증 등의 효과도 보고되어 있으며, 동양의학에서는 황련해독탕, 시호청간탕, 형개연교탕 등에 사용되고 있으나, 현재까지 황백의 골유합, 골재생 활성에 의한 골절 치료 효과가 교시되거나 개시된 바는 없다.

자감초(炙甘草)는 감초의 표면 색깔이 보라색이 될 때까지 볶아서 만든다. 감초(甘草)는 콩과(fabaceae)에 속하는 다년생 초본식물로 주로 뿌리를 이용하며 적갈색 또는 암갈색을 나타내고, 특유의 단맛이 있다. 감초의 주요 성분으로는 글리시리진(glycyrrhizin), 사포닌(saponin), 플라보노이드(flavonoid), 다당류 및 아스파라긴산(asparagine)이 있으며, 약간의 호모나탈로인(homonataloin), 레진(resins) 및 섬유질(fibers)을 함유하고 있다. 특히, 글리시리진의 경우 고혈압 환자에서 콜레스테롤 및 혈압을 낮추며, 항암효과, 항산화효과 및 항진균 효과가 있다. 또한, 감초는 다른 약재들과 쉽게 섞일 수 있는 장점이 있어서 약품, 건강식품 및 화장품 원재료로 쓰일 수 있다.

후코이단(Fucoidan)은 중량 평균분자량이 30-2,000kDa의 점성이 있는 고분자 형태의 당류로서, 미역이나 다시마와 같은 갈조류 또는 전복, 오징어와 같은 연체동물의 점액에 주로 포함되어 있으며, 특히 미역 포자엽에서 추출된 후코이단은 중량 평균분자량이 약 170kDa이다. 갈조류 유래의 후코이단의 기능성에 대해서 1990년대 이후 일본을 중심으로 연구되고 있으며, 면역증강 및 항종양 작용, 혈당상승 억제 및 혈액응고 저지작용, 중성지방 및 콜레스테롤 저하작용, 그리고 항산화 작용 및 위궤양 치유 촉진작용 등에 관한 연구가 진행된 바 있다.(Scand. J. Urol. Nephrol., 40(1)(2006); Am. J.Hematol., 78(1)(2005); Journal of the Korean Chemical Society, 46(2)(2002); 월간 식품산업 11월호 특집기사(2005))

상기와 같은 제조방법에 의하여 치자, 황백, 자감초, 후코이단의 약재 혼합물을 물(水)로써 추출하는 약재 추출물인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제를 제조할 수 있다.

또한 상기 약재 혼합물은 치자 18중량부, 황백 12중량부, 저감초 중량부 6중량부, 후코이단 4.5중량부로 혼합되는 것을 특징으로 하며, 상기 약재 혼합물은 물 4,660중량부, 95℃에서 2시간 30분 동안 추출되는 것이 바람직하다.

그리고 상기 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 복합제제는 투여량을 300㎎/㎏로 하여 경구 투여하는 것이 바람직하다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

원광대학교 한방병원으로부터 다음 약재를 구입하여 사용하였으며, 치자 18g, 황백 12g, 자감초 6g, 후코이단(해원바이오테크 제품, 평균분자량 440kDa) 4.5g을 혼합한 약재 혼합물 40.5g에 물 4,660g을 약탕기에 넣고 가열하여 95℃에서 2시간 30분 동안 추출하였다. 상기에서 얻은 약재 추출물을 35℃로 식힌 후에 여과지로 여과하여 이물질을 걸러내어 약재 추출물을 얻었다.

<실시예 2>

실시예 1과 비교하여 치자 18g, 후코이단 4.5g 대신에 치자 15g, 후코이단 3g을 혼합하는 점만 다를 뿐 나머지는 동일하게 하여 약재 추출물을 얻었다.

<실시예 3>

실시예 1과 비교하여 치자 18g 대신에 치자 21g을 혼합하는 점만 다를 뿐 나머지는 동일하게 하여 약재 추출물을 얻었다.

<비교예 1>

양성대조군으로서 시중에서 판매되고 있는 덱사메타손(dexamethsone)을 구입하여 사용하였다.

<비교예 2>

치자벽피탕인 치자 12g, 황백 12g, 감초 6g을 혼합하는 점만 다를 뿐 나머지는 실시예 1과 동일하게 하여 한약 추출물을 얻었다.

<실험예>

1. 실험 재료의 준비

실험동물은 수컷으로 4주령의 ALC NC/Nga Tnd mice(Charles River Laboratories, Nihon SLC, Shizuoka, Japan)를 오리엔트바이오(Korea)에서 공급 받아서 염증 및 건조화의 자연적인 유발을 위해 공기 여과시설이 없는 일반 사육실에서 유지한다. 동물은 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료社 제품)와 물을 충분히 공급하고, 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간 밤낮주기 환경을 유지하며 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.

2. 실험방법

가. DNCB 피부염 유도

4주령의 NC/Nga 생쥐를 1주일 동안 적응시킨 후 생쥐의 등을 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지 전체를 제모하고 24시간 방치한 후에 1%의 디니트로클로로벤젠(DNCB) 용액(아세톤 : 올리브오일 = 3 : 1) 200㎖를 제모 부위에 도포하고, 3일 후 2차 도포한다. 1차 도포 후 7일째부터는, 1주일에 3회씩 5주간 0.4% DNCB 용액 150㎖를 재차 도포하여 아토피 피부염을 유발한다.

나. 피부염 유발 평가

아토피성 피부발진이 유발된 NC/Nga 생쥐의 발진의 임상평가는 3가지 기준으로 1주일 간격으로 평가한다. 1) 소양행동을 동반한 홍반(erythema/hemorrhage), 2) 린설 및 가피(scarring/dryness), 3) 태선화(excoriation/erosion)를 0(무), 1(약간), 2 (적당), 3(심각)으로 개체마다 평가 기록하여 피부발진 점수로 정한다.

다. 약물 처리

실시예 1 내지 3, 비교예 1, 2 등으로 나누어 0.2㎖ 용량으로 경구 투여를 실시한다.

라. 혈액 중 백혈구와 호중구, 호산구 세포수의 측정

최종 실험종료 후 EDTA 처리된 튜브형 주사기로 심장 혈액 0.5㎖를 채취한다. 전혈을 대전대학교 임상병리학과에 의뢰하여 혈액 중 백혈구와 호중구, 호산구의 총 세포수를 측정한다.

마. 채혈 및 IgE 수준 측정

NC/Nga 생쥐의 눈에서 1주, 2주, 5주에 모세관을 이용하여 약 100㎕의 혈액을 채혈한 후 원심분리기 6,500rpm에서 20분간 원심분리한 다음 30㎕의 혈청을 분리한다. 분리된 혈청은 취하여 -70℃에 냉동 보관한다. 혈청내 IgE 농도측정은 효소면역측정법(ELISA)로 IgE 수준을 측정한다. 각 well에 혈청 5㎕(1/10 희석)와 dilution buffer 45㎕를 혼합하여 각 well에 분주하고, 2시간 동안 25℃ 실온에서 방치한 후 2회 세척완충용액으로 세척한 다음 antibody biotin-IgE conjugated를 넣고 2시간 방치한다. 다시 2회 수세 후 완충용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugeted 100㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척한다. TMB 기질을 100㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 100㎕의 정지 용액을 처리한 후 ELISA leader 450㎚에서 흡광도를 측정한다.

바. 비장세포에서 Th1/Th2 사이토카인 발현 변화

NC/Nga 생쥐 실험 14주에 실험을 종료하고 비장을 적출하여 100mesh로 비장 세포를 분리한다. 전날 CD3 mAb 1㎍/ml을 96 well plate에 코팅하여 4℃ 냉장고에서 overnight한 다음 D-PBS로 2회 수세한다. 분리한 비장세포는 ACK 용액으로 적혈구를 제거한 후 DNCB extract가 코팅된 각각의 well에 5x10⁵ 세포씩 5% FBS-DMEM 배양액에서 48시간 동안 배양한 다음, 원심분리기 2,000rpm에서 3분간 원심분리한 후 200㎕의 배양상층액을 얻었다. 배양상층액내의 IL-4, 혈청내 IL-5, 그리고 혈청내 IL-13의 수준 측정은 ELISA로 측정한다. 각 well에 배양상층액 50㎕를 분주하고, 2시간 동안 25℃ 실온에서 방치한 후 2회 세척완충용액으로 세척한 다음 antibody biotin-IgE conjugated를 넣고 2시간 방치한다. 다시 2회 수세 후 완충용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugeted 100㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척한다. TMB 기질을 100㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 100㎕의 stop 용액을 처리한 후 ELISA leader 450㎚에서 흡광도를 측정한다.

사. ALN, 등피부 조직에서 형광 유세포 분석

실험을 종료한 후 ALC NC/Nga Tnd 생쥐에서 ALN를 각각 적출하여 100mesh로 세포를 분리하여 D-PBS로 5분간 원심분리(1700 rpm)하고 2회 세척한 후 세포분리기(FALCON)에 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거한다. 등피부 조직은 잘게 ?h핑(chopping)한 후 콜라기나제(collagenase) 1㎎/㎖(in 2% FBS + RPMI 1640)를 넣고 37℃ 진탕기(shaker, 180rpm, 20min.) 배양기에서 배양한 후 상층액을 회수하는 방법으로 4회 반복한다. 분리한 ALN, 그리고 피부조직 침윤세포의 총세포수를 측정한 다음 모든 조직의 세포등을 5 × 10⁵ 세포로 조정한 후 4℃에서 면역 형광염색을 실시한다. 각각에 anti-CD3e-PE, anti-CD11b-FITC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-FITC, anti-CD23-FITC, anti-CD69-FITC, anti-CCR3-PE, 그리고 anti-B220-PE를 넣고 30분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후에 3회 이상 PBS로 수세한 후 유세포분석의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺,CD3⁺CD69⁺, 그리고 B220⁺CD23⁺ 세포수를 백분율(%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대세포수를 산출한다.

아. 조직염색 분석

등 쪽 목 부분의 피부를 떼어내어 10% 파라포름알데히드에서 24시간 동안 포르말린에 고정한다. 그 조직을 파라핀으로 포맷하였고, 5㎛ 두께로 블록을 만들었다. 그 조직부분은 염증을 일으키는 표피, 진피, 각질, 호중구/호산구, 그 외 다른 세포와 부종을 식별하는 헤마톡실린/에오신(H&E) 염색과 비만세포를 염색하는 톨루이딘 블루 염색으로 비만세포의 침윤을 광학현미경(Nikon, Japan, x200)으로 관찰한다.

자. 면역형광법을 이용한 표피 각층에서의 필라그린 발현 측정

표피 각층에서의 필라그린(filaggrin)의 발현변화는 피부조직을 4% 파라포름알데히드를 사용하여 4℃에서 24시간 동안 고정한 후, 파라핀에 고정시키고 동결절편기(Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 4μm 두께로 절편하였다. 10% 혈청과 0.1% Tween-20의 존재 하에 1차 항체와(anti rabbit polyclonal filaggrin: Abcam ab24584, MA, USA) 배양하였다. anti-rabbit FITC-conjugated IgG 2차 항체(Sigma)와 배양시킨 후 형광현미경(Zeiss LSM 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 판독하였다.

3. 통계 처리

실험 집단 간 수치 데이터는 각 실험군 결과값을 mean ± standard deviation(SD)으로 나타내었으며, 동물실험에서는 SPSS 11.0 소프트웨어(IBM-SPSS Inc., Chicago, IL)를 이용하여 일원배치 분산분석(ANOVA) 후에 Duncan’s multiple comparison tests로 유의성을 검증하였고, 세포실험에서는 독립표본 T-검정(independent samples T-test)을 이용하여 유의성을 검증하였다. p 값이 0.05, 0.01 혹은 0.001 보다 작은 경우를 구분하여 분석하였으며 (#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs. DNCB_CTL or Nr ; **p<0.01 and ***p<0.001 vs. DNCB-CTL.), 각 경우에 해당 시 통계적으로 유의적 차이가 있는 것으로 판정하였다.

<실험결과>

1. 체중변화

실험동물의 체중 변화를 측정한 결과, NC/Nga 생쥐에 DNCB를 도포하여 아토피 피부염 모델을 유도한 후, 매일 3주간 일정한 시각에 3주간 비교예 1의 양성대조군(DNCB_Dex)을 경구 투여하고, 천연물인 실시예 1 내지 3(DNCB_CP-5, 4, 6), 비교예 2(DNCB_OP)의 추출물을 300㎎/㎏씩 매일 1회 경구 투여하였다. 체중의 증감 확인을 위해 5주간 몸무게를 측정하였다. 그 결과, 비교예 1의 양성대조군 투여군만 5주간 체중증가가 제일 적었고, 그 외 모든 실험군에서 약간의 체중증가가 나타났다(도 1).

2. 피부발진 점수

NC/Nga 생쥐에 DNCB를 3주간 도포하고 최종 5주 후 등피부에 나타난 소양행동을 동반한 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 단계를 0(무), 1(약간), 2 (적당), 3(심각)으로 개체마다 평가 기록하여 피부발진 점수로 평가하였다. 그 결과 대조군의 피부발진 점수는 DNCB를 도포하지 않은 정상군(NC/Nga_Nr)에 비하여 증가를 나타내었고, DNCB를 도포한 후 실시예 2(DNCB_CP-4)에서는 좀 더 감소를 나타내었고, 실시예 1(DNCB_CP-5), 3(DNCB_CP-6)의 투여군은 대조군(DNCBC_TL)에 비하여 유의성 있게 피부발진 점수의 감소를 나타내었다(도 2, 도 3).

3. 혈액검사

백혈구는 말초혈액에서 외부항원에 대한 면역기능을 갖는데, 아토피 환자 말초혈액에서 백혈구수는 과립구 세포수가 증가하면서 함께 증가한다. 호중구는 정상 말초 백혈구의 40~75%를 점유하고 있으며, 생체 방어계에서 탐식, 살균, 분해 작용 등을 하며, 호산구는 정상 말초 백혈구의 2∼5%로 호중구와 함께 알레르기 및 국소염증에서 세포반응의 주역을 연출하는 세포로서 주목받고 있다.

혈액 중 백혈구의 수를 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 유의성 있게 증가하였으며, 비교예 1의 양성대조군은 대조군에 비해 감소하였다. 피부발진 초기에는 백혈구 수는 증가하였을 것이며 염증반응이 지속적으로 진행되면서 병변부위로 이동했을 것이다. 시료처리 영향으로 실시예 2의 추출물, 양성대조군에서는 백혈구의 수가 정상군과 유사한 수준으로 나타나는 것으로 사료된다(도 4).

4. ALN, PBMCs, 등 피부조직에서 총 세포수 측정

실험 종료 후 15주령의 NC/Nga 생쥐를 에틸에테르로 마취한 한 후 ALN, 비장 및 등 피부 부위를 적출하여 총 세포수를 측정하였다. 등 피부조직의 총세포수는 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게(p<0.001) 증가하였고, 양성대조군인 비교예 1은 대조군에 비해 유의성 있게(p<0.001) 감소하였으며, 그리고 실시예 1이 감소률이 가장 높았으며, 실시예 3, 실시예 1, 비교예 2 순으로 나타났다. ALN 총세포수는 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게(p<0.001) 증가하였고, 비교예 1은 대조군에 비해 유의성 있게(p<0.001) 감소하였으며, 그리고 실시예 1이 감소율이 가장 높았으며, 실시예 3, 실시예 2, 비교예 2 순으로 나타났다. 비장(spleen)의 총세포수는 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게(p<0.01) 증가하였고, 비교예 1은 대조군에 비해 유의성 있게(p<0.01) 감소하였으며, 그리고 실시예 1이 감소율이 가장 높았으며, 비교예 2, 실시예 2, 실시예 3 순으로 나타났다(도 5).

5. ALN & 비장의 면역세포에 대한 총절대세포수 변화

실험 종료 후, [표 1]에서 DNCB 도포 5주 후에서의 ALN과 비장세포를 분석하여 CD3⁺/CD19^-, CD4⁺/CD8^-, CD4⁺/CD69⁺, 그리고 CD23⁺/B220⁺의 총절대세포수는 ALN의 경우 정상군에 비해 대조군에서 통계학적으로 유의성 있게(p<0.01, p<0.001) 증가하였고, ALN 조직에서 실시예 1 내지 실시예 3에서 유의성 있게 감소를 나타내었다. 비장에서는 ALN 조직과 같은 감소하는 경향을 나타내었으나 통계학적 유의성은 나타나지 않았다.

ALN & 비장의 면역세포에 대한 총절대세포수 변화 효과

Fluorescence-activated cell sorting analysis (FACS) of immune cell subtypes in ALN and spleen ; #P<0.05, ##P<0.01, and ###P<0.001 (compared with NC/Nga_Nr), *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 (compared with DNCB-CTL) as determined by unpaired Student's t-tests and analyses of variance(ANOVA) followed by Duncan's multiple range tests

6. 등피부조직의 면역세포에 대한 총절대세포수 변화

실험 종료 후, [표 2]에서 DNCB 도포 5주 후에서의 등피부조직 세포를 분석하여 CD3⁺/CD19^-와 CCR3⁺/CD11b⁺의 총절대세포수는 정상군에 비해 대조군에서 통계학적으로 유의성 있게(p<0.01, p<0.001) 증가하였고, 양성대조군인 비교예 1은 대조군에 비해 유의성 있게(p<0.01) 감소하였다. 그리고 CD3⁺/CD19^- 총절대세포수)는 실시예 1에서는 유의성 있게 감소를 나타내었다(p<0.01). 또한 CCR3⁺/CD11b⁺ 총절대세포수는 실시예 1와 실시예 3 모두 유의성 있게 감소를 나타내었다.

등피부조직의 면역세포에 대한 총절대세포수 변화 효과

Fluorescence-activated cell sorting analysis (FACS) of immune cell subtypes in dorsal skin tissue (D-skin) ; #P<0.05, ##P<0.01, and ###P<0.001 (compared with NC/Nga_Nr), *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 (compared with DNCB-CTL) as determined by unpaired Student's t-tests and analyses of variance(ANOVA) followed by Duncan's multiple range tests.

7. 혈청내 면역글로블린 E 측정

아토피피부염 환자는 랑게르한스 세포에 알레르기 원인물질을 전달해 주는 세포표면의 수용체가 정상인보다 증가되어 있다. 환자의 만성 피부병변에는 랑게르한스 세포가 증가되어 있으며, 세포 표면에 IgE와 결합하는 수용체가 존재한다. 피부병변 내의 랑게르한스 세포는 T림프구를 강력하게 자극할 수 있고, 항원에 대한 특이 IgE는 랑게르한스 세포가 가진 이러한 항원전달능력을 증가시킨다. 항원이 들어와 IgE에 결합하면 랑게르한스 세포가 항원을 림프구에 전달하여 세포매개 면역반응을 유도함으로서 병변을 유발시킬 수 있을 뿐만 아니라, 면역반응을 지속적으로 유지시키는데 중요한 역할을 한다는 개념이 제시되어 랑게르한스 세포가 체액 면역반응과 세포 면역반응 사이에 연결고리 역할을 한다고 알려져 있다.

실험 종료 후, 혈청을 분리하여 1주, 2주, 5주에서 IgE 수준을 측정하였다. [도 6]에서와 같이, NC/Nga생쥐 15주령에서 IgE 수준은 정상군에 비해 대조군에서 증가하였고, 비교예 1의 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게(p<0.05) 감소하였으며, 그리고 DNCB를 도포한 후 실시예 1에서는 두드러진 감소를 나타내었다. 이와 같은 결과 실시예 1 내지 3의 추출물 투여로 인하여 알레르기 면역반응을 억제하여 B세포 분화과정에서 분비되어 염증반응을 유도하는 IgE 분비를 억제하는 것으로 사료된다.

8. 비장세포 배양액내 IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ 단백질 생성 측정.

아토피 피부염은 급성일 경우 Th2세포가 편향적으로 발달하며 아토피피부염이 심화되면 Th1 사이토카인도 동시에 증가해 염증반응을 더욱 악화시킨다. Th2세포는 다양한 사이토카인과 케모카인 인자들을 생성하여 아토피 피부염의 진행을 유도하는데 Th2세포에서 발현된 IL-4, IL-5, IL-13 사이토카인은 B림프구의 생성과 분화를 유도하며, IFN-γ는 대식세포를 활성화하고, 대식세포의 항미생물 활성을 증가하도록 자극하며, Th1 림프구의 분화와 활성을 촉진시키는 주된 조절분자의 발현을 상향조절하고 Th2 집단의 확장을 저해한다. 아토피 피부염 환자의 말초혈액과 피부조직에서 IFN-γ 생산저하가 보고되고 있고 IFN-γ가 IgE 생성 및 Th2 림프구의 증식을 억제한다는 관점에서 IFN-γ의 치료시도가 이루어지게 되었고 유효한 치료효과를 보인다고 보고되고 있다. IL-5는 Th2세포가 생산하고 호산구의 발달, 생존에 중요한 역할을 하며, 호산구를 활성화시키고, IL-13은 Th2세포가 생산하는 사이토카인이고 대식세포가 미생물을 죽이는 활동을 억제한다.

실험 종료 후, 비장을 적출하여 비장세포를 분리한 후 anti-CD3 mAb에서 동시 배양하여 배양상층액에서 IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ 단백질 생성수준을 측정하였다. 비장세포 배양상층액에서 IL-4(도 7A), IFN-γ(도 7B), IL-5(도 7C), IL-13(도 7D) 측정결과에서 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게(p<0.001-ABC, p<0.01-D) 증가하였고, 비교예 1의 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게(p<0.001-ABC, p<0.01-D) 감소하였으며, 그리고 DNCB를 도포한 후 IL-4 단백질 생성수준이 양성대조군과 유사한 감소를 보인 군이 실시예 1이였다. DNCB를 도포한 후 IL-5 단백질 생성수준이 실시예 1와 실시예 3이 대조군과 비교하여 유의성 있는 감소를 보였다. IL-13의 단백질 생성수준도 마찬가지로 실시예 1 내지 3 투여군이 대조군에 비견하여 양성대조군 수준으로 감소하는 경향을 보였으며, 실시예 1과 실시예 3은 비교예 1의 양성대조군 보다 더 감소를 나타냈다. 또한 비교예 2와 실시예 1 내지 3을 투여했을 때 대조군보다 혈청중 IFN-γ 단백질 생산량 수준의 증가가 상승효과로 나타내었다. 이와 같은 결과는 아토피 피부염은 급성일 경우 Th2세포가 발달하고, 심화되면 Th1사이토카인도 동시에 증가해 염증반응을 더욱 악화시키는데, 실시예 1 내지 3이 Th2사이토카인을 억제하고 IFN-γ의 발현을 조절하여 피부염증반응을 억제한다고 사료된다.

9. 등 피부 조직검사 및 분석

실험 종료 후 피부 일부를 채취하여 H&E 염색과 비만세포의 침윤정도를 알 수 있는 톨루이딘 블루염색을 실시하였다. 비만세포는 진피 층에서 관찰되는데, 이는 세포질 내에 과립을 풍부하게 가지고 있는 세포로서 알레르기 염증반응에 관여하여 알레르기 염증의 초기반응과 추기 반응을 일으키고 만성적으로 염증을 지속시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

[도 8]에서처럼 H&E 와 톨루이딘 블루염색 결과, 정상군에 비해 대조군에서 표피 두께가 과형성 및 확장되었으며(녹색 화살표로 표시), 주변 조직세포의 색소침착, 부전각화증, 비만세포의 침윤, 과립 생성 등이 증가하였다. 양성대조군은 대조군에 비해 표피의 두께는 대조군에 비해 현저하게 줄어들었으며, 일부는 정상군과 비슷한 정도였다. 그 주변의 각화증상, 비만세포 침윤, 과립 생성 등은 감소하였다. 실험군에서 실시예 1 내지 3에서 표피 두께가 감소함을 보였다. 그 주변의 과각화, 부전각화증, 색소침착, 과립 생성, 비만세포의 침윤 등은 감소하였다.

10. 등피부 조직에서 면역형광염색을 통한 Claudin 1과 Sirt 1의 발현도 평가 및 분석

손상된 피부장벽이 병인으로 작용하는 피부질환에서 세포 간의 밀착연접(TJ) 단백질은 각질층 손상에 따른 외부 알레르겐 침입에 대하여 추가적인 장벽 기능을 수행하게 된다. 최근 아토피피부염에서도 세포간 밀착연접의 이상에 대한 보고가 이어지고 있다. De Benedetto 등은 세포간 밀착연접을 구성하는 단백질인 claudin-1과 claudin-23이 아토피피 부염 환자에서 감소되어 있는 것을 확인하였으며 claudin-1의 발현은 Th2 면역반응과는 역상관관계에 있는 것을 보고하였다. 또한 자외선을 조사한 세포에 주글론을 처리한 경우 증가된 Pin1 단백질의 발현을 감소시키고, 감소한 Sirt1 단백질의 발현을 증가시켰으며, 자외선을 조사하지 않은 정상 세포에서 Sirt1의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다.

[도 9A]에서처럼 IHF법을 통한 면역형광염색을 통한 Claudin 1과 Sirt 1의 발현도 측정 결과, 등피부 조직에서 정상군에 비해 대조군에서 Claudin 1(도 9A, 도 9C)과 Sirt 1(도 9B, 도 9C)의 발현도가 감소되었고, 비교예 1의 양성대조군은 대조군에 비해 감소 내지는 차이가 나타나지 않았다. 실험군에서 DNCB를 도포한 후 실시예 1 내지 3에서는 대조군에 비해 좀더 Claudin 1과 Sirt 1의 발현도를 증가시키는 것으로 나타내었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 기술적 사상은 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 전술한 실시예 외의 많은 실시예들이 본 발명의 특허청구범위 내에 존재한다.

Claims (9)

1. 치자 18중량부, 황백 12중량부, 자감초 6중량부, 평균분자량 440kDa인 후코이단 4.5중량부로 혼합되는 약재 혼합물에 물(水) 4,660중량부를 가하여 95℃에서 2시간 30분 추출하여 여과, 농축, 동결 건조되는 약재 추출물로서, 상기 약재 추출물은 300㎎/㎏로 투여되는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 복합제제.
   
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 1) 치자 18중량부, 황백 12중량부, 자감초 6중량부, 평균분자량 440kDa인 후코이단 4.5중량부로 혼합하여 약재 혼합물을 얻는 제 1단계;
   2) 상기 제 1단계에서 얻은 약재 혼합물에 물(水) 4,660중량부를 가하고 95℃에서 2시간 30분 추출하고, 여과, 농축, 동결 건조하여 약재 추출물을 얻는 제 2단계:를 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 복합제제의 제조방법.
   
   
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