Freie
Radikale entstehen natürlicherweise
im Rahmen der Zellatmung. Faktoren wie höheres Alter, Stress oder Krankheiten
erhöhen
die Bildung von freien Radikalen, während gleichzeitig die Fähigkeit
der Säugerzellen
abnimmt, selbst Schutzfaktoren zu bilden.
Man
hat deshalb verschiedentlich versucht, Radikalfänger als Nahrungsergänzungsmittel
einzusetzen, um so radikalbedingten Alterungsprozessen vorzubeugen.
Als
für diese
Zwecke einsetzbare Nahrungsergänzungsmittel
werden auch Extrakte von Pilzen empfohlen. Biologisch aktive Verbindungen,
die durch Extraktion mit Lösungsmitteln
aus bestimmten Pilzen der Gattung Ganoderma erhältlich werden, sind seit langem
beschrieben und wurden von uns in einer Monographie zusammengefasst
(U. Lindequist: Ganoderma. In: Hagers Handbuch der pharmazeutischen
Praxis/Hrsg F. von Bruchhausen, 5. vollständig neubearbeitete Auflage,
Springer-Verlag Berlin-Heidelberg New York 1998, Folgeband 2 Drogen
A-K (Hrsg W.Blaschek). S. 750-761.
Anti-oxidativen
Eigenschaften von Ganoderma-Arten sind bekannt (Mau JL; Lin HC;
Chen CC: Antioxidant properties of several medicinal mushrooms.
J Agric Food Chem 2002 Oct 9;50(21):6072-7; You YH; Lin ZB: Protective
effects of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide on injury of
macrophages induced by reactive oxygen species. Acta Pharmacol Sin
2002 Sep;23(9):787-91). Bioaktive Substanzen mit Radikalfängerkapazität können auch
aus den Sporen von G. lucidum extrahiert werden. Diese können erfolgreich
eingesetzt werden zur unterstützenden
Behandlung von immunologischen Störungen, Krebs, AIDS, Hepatitis,
Diabetes und cardiovasculären
Erkrankungen.
Um
die antioxidative Wirkung zu verstärken ist es möglich, G.
lucidum mit Grapefrucht-Kernextrakten zu mischen (WO 02/11744 A1).
Es ist ferner möglich,
G. lucidum während
der Kultivierung mit Selen anzureichern (WO 01/05938 A1). Eine vorteilhafte
Nutzung der antioxidativen Eigenschaften ergibt sich in der Andropause
bei Männern
(US2003/0054014 A1).
Ein
Wasser-Extrakt bzw. ein Extrakt mit niedrigem Alkoholgehalt von
G. lucidum kann als Kosmetikum eingesetzt werden (WO 01/32192 A1).
Ein alkoholischer Extrakt von G. lucidum vermindert den Juckreiz
und kann bei Dermatosen zur Verhinderung von Entzündungen
eingesetzt werden (
JP
11180889 A ).
Es
entspricht dem Stand der Technik, Extrakte aus G. lucidum durch
Behandlung mit Lösungsmitteln herzustellen.
Es entspricht ebenfalls dem Stand der Technik, Extrakte aus G. lucidum
durch Behandlung mit superkritischem CO2 zu
gewinnen (WO 98/13512 A1).
Aus
WO 00/53207 A1 bzw.
US
6,726,911 B1 sind neue biologisch aktive Verbindungen aus
Pilzen der Species Ganoderma pfeifferi, Verfahren zu ihrer Herstellung
und ihre Verwendung. bekannt. Aus dem Fruchtkörper und dem Mycel der Spezies
Ganoderma pfeifferi werden Extrakte erhältlich, die antimikrobiell
wirksam sind und sich als Konservierungsmittel, für pharmazeutische
und kosmetische Zubereitungen, zur Bekämpfung von Infektionen sowie
zum Einsatz in der Fischzucht eignen. Bekannt ist die Verwendung
einer oder mehrere der Verbindungen und/oder Extrakte aus G. pfeifferi
als Radikalfänger,
zur Hemmung der Aktivität
von neutralen Endopeptidasen und/oder zur Hemmung der Aktivität des Angiotensin-Konverting-Enzyms
sowie die darauf beruhende Verwendung der Extrakte als vitalisierender
und keimmindernder Zusatzstoffe für Lebensmittel und als Nahrungsergänzungsmittel
und als Gesundheitspflegemittel.
Ein
Problem bei der Beschreibung altersabhängiger Phänomene ist das Auffinden verlässlicher
Biomarker des Alterns von Zellen. Bislang ist nur die Mortalität als Marker akzeptiert,
wodurch die Unterscheidung von physiologischem Altern und pathologischen
Prozessen erschwert wird.
Im
Vorfeld der Suche nach geeigneten Naturstoffen war es deshalb notwendig,
ein Versuchsmodell aufzubauen, mit dessen Hilfe altersabhängige Phänomene an
der Zelle untersucht werden können.
Das ist uns mit der biosensorkontrollierten Perfusionszellkultur
gelungen.
Glucose
stellt eines der Hauptenergiequellen für tierische Zellen dar. In
primären
Zellen und Insektenzellen findet eine Oxidation der Glucose im Cytosol
bis zum Pyruvat statt, das anschließend in den Mitochondrien vollständig zu
CO2 und H2O oxidiert
wird. Glucose wird zunächst
glycolytisch zu Pyruvat abgebaut. In primären Zellen wird Pyruvat vom
PDHC zu Acetyl-CoA decarboxyliert, das anschließend mit Oxalacetat zu Citrat
kondensiert wird. Damit wird der erste Schritt des Citratcyclus
eingeleitet. In einer weiteren Reaktion wandelt die Pyruvat-Carboxylase
einen Teil des gebildeten Pyruvats zu Oxalacetat um und füllt somit
den Citratcyclus immer wieder mit neuen Intermediaten auf. Diese
Reaktion ist ebenso wichtig wie die Einführung des Pyruvats in den Citratcyclus,
da aus dem Pool der Citratcyclusintermediate ständig Moleküle für den Aufbau von Aminosäuren und
Porphyrinen abgeführt
werden.
Glucose
wird in den Zellen neben der Energiegewinnung auch zur Synthese
von Zellbausteinen benötigt.
Dazu wird ein kleiner Teil der Glucose in den Pentosephosphatweg
zu Ribose-5-phosphat und NADPH umgebaut. Während Ribose-5-phosphat für den Aufbau
von RNA und DNA benötigt
wird (Stryer, 1990, Zielke et al., 1984, Reitzer et al., 1979 und
1980), dient NADPH als Cofaktor in reduktiven Biosynthesen.
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, Präparate zu entwickeln, die den
Zellstoffwechsel stimulieren. Insbesondere war es eine Aufgabe der
Erfindung, Zubereitungen mit gegenüber dem Stand der Technik verbesserten
Eigenschaften zu finden, die den Glucosestoffwechsel stimulieren
und Zellen vor Schädigungen schützen und/oder
die Zellalterung verlangsamen und die daher als Arzneimittel für therapeutische
und prophylaktische Anwendungen bei Mensch und/oder Tier und/oder
als Nahrungs- oder Futtermittel und/oder als Nahrungs- oder Futterergänzungsmittel
und/oder als Kosmetika genutzt werden können.
Die
Aufgabe wurde – wie
in den Patentansprüchen
formuliert – gelöst.
Erfindungsgemäß wurden
mit Extrakte aus G. pfeifferi als Mittel mit Anti-Aging-Effekt bereitgestellt.
Es wurde gefunden, dass Extrakte von G. pfeifferi den Glucosestoffwechsel
von Zellen stimulieren, die Respiration verstärken, die Bildung von Proteinen
fördern
und die Zellalterung verlangsamen. Unter den gleichen Versuchsbedingungen
lässt sich
bei Extrakten aus G. lucidum keine Verlangsamung des Alterungsprozesses nachweisen.
Dieser Effekt von G. pfeifferi ist also völlig überraschend und lässt sich
aus dem bekannten Stand der Technik nicht ableiten.
Erfindungsgemäß ist die
Verwendung von Extrakten aus Ganoderma pfeifferi als Nahrungsergänzungsmittel
oder zur Herstellung von Nahrungsergänzungsmitteln mit dem Ziel,
die Alternsrate zu verlangsamen und das Auftreten und die Progression
altersassoziierter Krankheiten und Einschränkungen wie Immunseneszenz,
Krebs, Katarakt, kognitive Mängel
und Abnahme der Muskelstärke
zu verzögern.
Die
Gabe von G. pfeifferi-Extrakten reduziert – wie auch von G. lucidum bekannt – zusätzlich den
oxidativen Stress und verstärkt
die endogene Radikalabwehr, und unterstützt damit den Anti-Aging Effekt.
Viele Nahrungsmittel verfügen über keine
experimentell nachweisbaren Radikalfängerkapazitäten. Diesem Mangel wird durch
den erfindungsgemäßen Zusatz
von Extrakten aus G. pfeifferi als Nahrungsergänzungsmittel abgeholfen.
Vorteilhafterweise
wird 1 Teil des ethanolischen Extraktes auf 99 Teile des Nahrungsmittels
eingesetzt.
Durch
erfindungsgemäße Kombinationen
der Extrakte von G. pfeifferi mit Mineralstoffmischungen der Elemente
Na, K, Ca, Mg, Fe sowie der Spurenelemente P, Si, B, F, Mn, Zn,
Cr, Cu, V, Mo sowie mit Zeolithen und anderen Ionenaustauschern
kann eine ausgeglichenen Bilanz von Makro- und Mikroelementen im
Organismus erreicht werden, die den Anti-Aging-Effekt unterstützt. Optimierte
Calcium-haltige Mineralien in Kombinationen mit Pilzinhaltsstoffen
von G. pfeifferi bieten zum Beispiel ein großes Potential bei der Prophylaxe der
Osteroporose.
Gegenstand
der Erfindung sind daher Gesundheitspflegemittel für Mensch
und Tier auf der Basis von Biomassen oder Extrakten von G. pfeifferi
und/oder Mineralstoffmischungen, gekennzeichnet durch einen Gehalt
von 0,1 bis 50 %, insbesondere von 1 bis 3 % eines kalten oder heißen Extraktes
von Fruchtkörpern
Ganoderma pfeifferi, bezogen auf das gesamte Gesundheitspflegemittel.
Vorteilhafterweise wird ein ethanolischer Extrakt von G. pfeifferi
eingesetzt, wobei der Ethanolgehalt in den Grenzen 10 Vol. % bis
96 Vol. % schwanken kann. Es ist auch möglich, Extrakte, die aus dem
Mycel gewonnen wurden, einzusetzen. Bei Submeers-Kulturen ist es
möglich,
die Kulturflüssigkeit
mit Ethylacetat auszuschütteln
und diesen Extrakt allein oder in Kombination mit alkoholischen
Extrakten einzusetzen.
Möglich ist
auch die Verwendung von Extrakten, die durch Behandlung von Ganoderma
pfeifferi mit superkritischem CO2 gewonnen
wurden.
Die
Biomassen können
in pulverisierter Form direkt als Nahrungsergänzungs- und/oder Gesundheitspflegemittel eingesetzt
werden. Die schwerlösliche
Biomasse kann als Ballaststoff mit Anti-Aging-Effekt gegebenenfalls
in Kombination mit stark quellenden Präparaten, die ein Sättigungsgefühl hervorrufen,
zur Gewichtsreduktion eingesetzt werden, da die negativen Folgen
einer Nahrungs-Restriktion durch Zuführung von Ballaststoffen auf
der Basis von Biomassen aus G. pfeifferi vermindert werden.
Durch
Vermeidung von Mangelzuständen
essentieller Nährstoffe
und Gabe von Ballaststoffen auf der Basis von G. pfeifferi wird
die Alternsrate verlangsamt, gleichzeitig wird das Auftreten und
die Progression altersassoziierter Krankheiten vermindert.
Extrakte
von G.pfeifferi können
mit bekannten, handelsüblichen
Gesundheitspflegemitteln kombiniert werden. Das Mittel kann durch
einfaches Vermischen der Bestandteile hergestellt werden.
Durch
Kombination des Anti-Aging-Effektes und des Zellschutz-Effektes
mit den aus 13239 PCT/EP 00/02026 (WO 00/53207 A1 bzw.
US 6,726,911 B1 ) bekannten
antimikrobiellen Wirkstoffen, die aus G. pfeifferi gewonnen werden
können,
kommt man zu neuen hochwirksamen Arzneimitteln, die eine neue Qualität darstellen.
Die erfindungsgemäße Kombination
von aus 13239 PCT/EP 00/02026 bekannten Elementen und neuen überraschend
gefundenen Wirkungen von G. pfeifferi-Extrakten führt zu neuen,
wertvollen Produkten, die auf bekannten Wegen nicht erreicht werden
können.
Mit
erfindungsgemäßen Kombinationen
aus G. pfeifferi und Mineralstoffen, und/oder Vitamine und/oder
Proteinen und/oder Fettsäuren
kann der Anti-Aging-Effekt verstärkt
werden. In den Kombinationen sind praktisch alle Mischungsverhältnisse
möglich.
Gegenstand
der Erfindung ist neben der Verwendung des oben beschriebenen Mittels
als Nahrungsergänzungsmittel
auch die Verwendung als Kosmetikum, da auch bei kosmetischen Anwendungen
die Verzögerung
der Alterung von Hautzellen eine wesentliche Rolle spielt. Mit Extrakten
von G. pfeifferi wird erfindungsgemäß ein Schutz der Hautzellen,
insbesondere ein Schutz vor Schädigungen
durch UV-Strahlung, erreicht.
Die
Merkmale der Erfindung gehen außer
aus den Ansprüchen
auch aus der Beschreibung hervor, wobei die einzelnen Merkmale jeweils
für sich
allein oder zu mehreren in Form von Kombinationen vorteilhafte schutzfähige Ausführungen
darstellen, für
die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Das Wesen der Erfindung
besteht in der Verwendung eines bekannten Mittels zu einem neuen
Zweck – 2.
medizinische Indikation. Diese erfindungsgemäße Verwendung ergibt den erstrebten
Erfolg, der darin liegt, dass nunmehr Mittel mit experimentell an
der lebenden Zelle nachgewiesenem Anti-Aging-Effekt bereitgestellt
werden können.
Die
Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen
erläutert
werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Beispiel 1
Nachweis
des stimulierenden Effekts an stationären Zellkulturen durch Bestimmung
des Proteingehaltes der Zellen
Methodik
Durchführung:
Konfluent
gewachsene FL-Zellen werden zur Hemmung des Wachstums mit Mitomycin
C folgend behandelt: Medium aus Gewebekulturflasche abgießen, Zellrasen
1mal mit PBS waschen, 5ml handelsübliches Medium (DulbeccoMEM+
Antibiotika + 10% fetales Kälberserum
+ 1 % L Glutamin) mit 50μl
Mitomycin C (50μg)
auf die Zellen geben, 2h bei 37°C
und 5%CO2 im Brutschrank inkubieren, danach
Gemisch abgießen und
3mal mit PBS waschen
Nun
wurden die Zellen abtrypsiniert, in einer Zelldichte von 2 × 105/ml Medium in Mikrotiterplatten eingesät und bei
37°C und
5% CO2 kultiviert.
Nach
24 Stunden wurde das Medium entfernt, Ganoderma-Extrakt in Medium
(25μg/ml)
auf die Zellen gegeben und anschließend 24h bei 37°C und 5%
CO2 weiter kultiviert. Die Kontrollkulturen
erhielten frisches Kulturmedium ohne Extrakt.
Nach
5 maligen Waschen mit PBS wurden die Zellen mit 100μl einer 0,04%igen
Tritonlösung
je well und 30 min schütteln
auf einem Shaker (500rpm) lysiert. Die Proteinbestimmung erfolgte
mit Roti-Nanoquant und einem BSA-Standard als Eichlösung
Die
Extinktion wurde bei 450 und 620nm gemessen und zur Auswertung der
Quotient OD620/450nm gebildet.
Die
Proteinkonzentration wurde anhand der Quotienten aus der BSA-Standardkurve
ermittelt.
Ergebnisse
Die
Gabe von G. pfeifferi-Extrakten können den Zellstoffwechsel stimulieren.
Der Proteingehalt ist durchschnittlich um etwa 10 % erhöht. Dieser
Effekt ist hochsignifikant.
Beispiel 2
Vergleich
mit Ginseng
Dieser
Effekt wird mit einem bekannten Produkt verglichen, das als Anti-Aging-Mittel
vielfältig
angewendet wird. Auch hier werden die Effekte in der stationären Zellkultur
untersucht
Methodik
Die
Proteinbestimmung wurde wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Ergebnisse
Der
verwendete G. pfeifferi-Heißextrakt
bewirkte eine sehr deutliche Stimulierung des Zellstoffwechsels.
Der Protein-Gehalt der Zelle erhöhte
sich um 20 %. Bei der Untersuchung von Ginseng-Extrakten haben 25 μμg/ml praktisch
keinen Einfluss, erst die Verdoppelung der Konzentration auf 50 μg/ml bewirkt
eine Steigerung der Proteinbildung um 5 %. Bei der Untersuchung
des Fertig-Präparates
wurde sogar ein geringerer Proteingehalt beobachtet.
siehe 1
Beispiel 3
Schutz der Zellen vor
schädigenden
Einflüssen
Methodik
Unter
Standardbedingungen (37°C,
95% Feuchtigkeit, 5% CO2, RPMI-Medium mit
8% FKS) wurden in 60mm2 Zellkulturschalen
adhärente
humane Zellen (HaCaT, DKFZ) bis zur einer Konfluenz von 50% gezüchtet.
Um
eine Stresssituation zu simulieren wurde das Medium durch 2ml PBS
ersetzt und die Zellen mit einer Dosis von 20mJ/cm2 UV-Licht
(medizinisches UVB, Breitband, Maximum 311 nm) bestrahlt. Im PBS
wurden Extrakte von Ganoderma-Arten mit einer Konzentration von
10μg/ml
(Extr. 1) bzw. 0,01 μg/ml(Extr.
2) gelöst.
Anschließend wurde
das PBS sowie der darin gelöste
Extrakt entfernt und durch RPMI-Medium mit 0,01 % BSA (Bovines Serumalbumin)
ersetzt. In den darauf folgenden 10 Stunden wurde die morphologische Entwicklung
der Zellen sowie die Freisetzung des zytoplasmatischen Enzyms Laktatdehydrogenase
verfolgt. Kontrollzellen wurden ebenso behandelt, jedoch ohne tatsächlich bestrahlt
zu werden.
siehe 2 :
LDH-Freisetzung aus HaCaT-Zellen nach Bestrahlung mit medizinischem
UVB (Breitband)
Die
eingesetzten Extrakte waren in der Lage, die durch die UV-Strahlung
verursachte Schädigung
der Zellen zu vermindern (2).
Insbesondere der Ganoderma-Extr. 1 (gelbe Linie) führt zu einer
bis zu 5fachen Schutzwirkung. Für
den geringer konzentrierten Ganoderma-Extr. 2 (hellblaue Linie)
konnte ein etwa 1,5facher Schutzeffekt für die Zellen nachgewiesen werden.
Titandioxid,
das sehr häufig
in Sonnenschutzmitteln eingesetzt wird, verstärkt durch den photokatalytischen
Effektes die schädigende
Wirkung der UV-Strahlen. Titandioxid wurde dabei im direkten Vergleich
als Suspension von Titandioxid-Nanopartikel in PBS mit einer Dosis
von 3μg/cm2 eingesetzt.
Beispiel 4
Nachweis des Anti-Aging-Effektes
Methodik:
Es
wurde eine Versuchsanordnung, beschrieben in Jülich, W.-D., Woedtke, Th. von,
Abel, P.:Messanordnung zur Erfassung von toxischen, subtoxischen,
chronisch toxischen oder stimulierenden Effekten von Wirk- und Schadstoffen
mit Hilfe von Perfusionszellkulturen.
DP 19709649.2 benutzt. Die Zellkulturen
wurden von der 21 bis zur 31 h mit einem handelsüblichem Medium (Dulbecco's Minimal Essential
Medium with 10 % Kälberserum)
versorgt, das mit 0,025 mg eines ethanolischen Extraktes aus G.
pfeifferi pro ml Kulturmedium versetzt wurde. Danach wurde die Perfusionszellkultur
mit Medium ohne Zusätze
fortgeführt.
Ergebnisse
Durch
die Zellalterung sinkt der Glucosestoffwechsel nach etwa 150 h ab.
Eine
einmalige Behandlung mit G. pfeifferi-Extrakt verzögert diese
Entwicklung. Bei G. lucidum war dieser Anti-aging-Effekt nicht nachzuweisen.
siehe 3
Bei
weiteren Versuchen wurde die Zeit gemessen, in der sich der Glucosestoffwechsel
auf 50 % des Ausgangswertes (vor der Gabe des mit G. pfeifferi angereichten
Mediums) reduzierte.
Auch
hier zeigte sich ein hochsignifikanter Einfuß einer Versorgung der Zellen
mit Ganodema-pfeifferi-Extrakt.
(Tab.). Tab.
Anti-Aging-Effekt von G.pfeifferi
Das
Ergebnis ist signifikant (t-Test im paarweisen Vergleich) mit einer
Irrtumswahrscheinlichkeit < 1
%
