DE102008035442A1 - Zubereitungen aus Artemisia Annua, ihre Umwandlung in Mikro- und Nanopartikel und ihre Verwendung - Google Patents

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Abstract

Der Gegenstand der Erfindung sind Zubereitungen aus Artemisia annua sowie mehrere Verfahren zur Herstellung von Mikro- und Nanopartikeln aus dem einjährigen Beifuß (Artemisia annua). Im Ergebnis werden ultrafeine Partikel mit verbesserten Eigenschaften gewonnen, die als Nahrungs- und Futterergänzungsmittel, für den Einsatz in Kosmetika sowie für medizinische Anwendungen genutzt werden können.

Description

  • Der Gegenstand der Erfindung sind Zubereitungen aus Artemisia annua sowie mehrere Verfahren zur Herstellung von Mikro- und Nanopartikeln aus dem einjährigen Beifuss (Artemisia annua). Im Ergebnis werden ultrafeine Partikel mit verbesserten Eigenschaften gewonnen, die als Nahrungs- und Futterergänzungsmittel, für den Einsatz in Kosmetika sowie für medizinische Anwendungen genutzt werden können.
  • Stand der Technik
  • 1. Herstellung von Nano- und Mikropartikeln
  • Zur Herstellung von Nano- und Mikropartikeln sind verschiedene Herstellungsverfahren auf Basis von Lipiden oder Polymeren bereits bekannt. So wurden bereits Verfahren zur Herstellung von Lipid-Mikropartikeln auf Basis von Phospholipiden beschrieben, die antimykotische Eigenschaften haben und im pharmazeutischen oder kosmetischen Bereich eingesetzt werden können ( DE 69 00 2905 T2 ). Andere Verfahren beschreiben Lipidnanopartikel auf Basis von extrahierten Mono-, Di und Triglyceriden, Ölen oder Wachsen. Mit Hilfe dieser gewonnenen Lipide werden ebenfalls pharmazeutische Wirkstoffe verkapselt ( WO 94/20072 A1 ). Weitere Lipidnanopartikel beschreiben Substanzen ebenfalls auf Basis von Lipiden zur parenteralen Anwendung ( WO 98/56362 A1 ). Auch werden spezielle Techniken zur Herstellung von Lipidnanopartikeln vorgestellt (z. B. EP 0 526 666 A ). Bisher sind in der Literatur jedoch keine Mikro- und Nanopartikel auf Basis von Artemisia Annua und deren Herstellung beschrieben worden.
  • Die Herstellung von Mikro- und Nanopartikel unter Nutzung arteigener Lipide ist bereits bekannt ( WO 2004/075907 A2 und WO 2003/72118 A1 ).
  • Die Nutzung der Pflanze Artemisia annua konzentriert sich bisher auf die Verwendung des Artemisinins als Antimalaria-Mittel. Das erfordert die Extraktion mit apolaren Lösungsmitteln wie n-Hexan. Dabei werden zwangsläufig auch die Lipide entfernt. Eine direkte Nutzung der Lehre aus WO 2004/075907 A2 und WO 2003/72118 A1 für die Umwandlung der verbleibenden Biomasse von Artemisia annua, die noch weitere wertvolle Inhaltstoffe enthält, in Mikro- und Nanopartikel ist daher wegen der abgetrennten Lipide nicht möglich.
  • Die restliche Biomasse und damit auch die darin enthaltenen Wirkstoffe bleiben bei den bisherigen Verwertungskonzepten weitgehend unbeachtet.
  • 2. Bisherige Nutzung von Artemisia annua
  • Der Einjährige Beifuss (Artemisia annua) wird seit Jahrtausenden als Heilpflanze verwendet. Die Pflanze ist in Europa und Asien beheimatet. Sie wachst 2 bis 3 m hoch und hat frischgrüne, stark zerteilte Blätter und winzig cremefarbene Blütenköpfe. Zu medizinischen Zwecken werden die oberirdischen Teile der Pflanze verwendet. Die Herstellung und Anwendung von Extrakten aus Artemisia und deren Anwendung in den Bereichen Ernährung, Kosmetik und Medizin ist aus der Literatur bekannt (z. B. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1990, Vol 24/25, pp 213–222).
  • Ein Teil der Inhaltstoffe des Einjährigen Beifusses (Artemisia annua) besitzt eine hohe Wirksamkeit gegen den Malariaerreger. Im Gegensatz zu anderen Malariamitteln hat der Wirkstoff kaum Nebenwirkungen und auch eine sehr günstige Resistenzlage, wobei er zusätzlich mit anderen Stoffen kombiniert werden kann.
  • Der eigentliche Wirkstoff ist das Artemisinin (Artemesin, Cotexin), ein sekundärer Pflanzenstoff (Sesquiterpen mit Peroxidgruppe), der in den Blättern und Blüten des Einjährigen Beifusses (Artemisia annua) vorkommt. Wie alle Pflanzenstoffe sind diese in der Biomasse mit weiteren ähnlichen Substanzen vergesellschaftet, da die biochemischen Wege nicht eingleisig verlaufen. So sind 9 weitere peroxidhaltige Substanzen, die ebenfalls gegen den Malariaerreger wirken, in den Pflanzen enthalten. Über 200 Inhaltstoffe konnten in den pflanzlichen Teilen insgesamt nachgewiesen werden.
  • Die in der Literatur diskutierte Wirkungsweise des Artemisinins hängt eng mit der chemischen Struktur zusammen. Die im Molekül enthaltene Peroxidgruppe ist in Gegenwart hoher Konzentrationen von Eisenionen instabil und bildet freie Radikale. Solche hohen Konzentrationen werden in roten Blutkörperchen und auch in Malariaerregern gefunden, die Eisen akkumulieren. Gelangt Artemisinin in Erythrozyten, werden freie Radikale gebildet und der Parasit möglicherweise dadurch getötet. Es gibt aber auch Hinweise darauf, dass Artemisinin – Derivate bestimmte Enzyme hemmen.
  • Aus dem Artemisinin oder verwandten Pflanzensubstanzen wurden auch mehrere halbsynthetische Derivate hergestellt, die aber alle zur Wirksamkeit die Peroxidgruppierung enthalten müssen.
  • Weitere Anwendungen der peroxidhaltigen Strukturen werden in US 2007269537 beschrieben, beispielsweise zur lokalen Wundbehandlung.
  • Es ist davon auszugehen, dass die allgemeine Nachfrage nach Artemisinin – Präparaten in den nächsten Jahren auf mehrere hundert Millionen Behandlungen ansteigen wird. Um dieses Volumen zu produzieren, werden enorme Mengen des pflanzlichen Wirkstoffes benötigt. Es wäre deshalb von großem Vorteil, wenn es eine möglichst hochwertige Verwertung der dabei in großem Überschuss anfallenden Biomasse gäbe.
  • Aus einem Hektar Pflanzen lassen sich ein bis zwei Tonnen Blätter ernten, aus denen rund zwei bis drei Kilogramm des Artemisinin gewonnen werden können. Die Gewinnung aus pflanzlichen Rohstoffen wird dadurch erschwert, dass der Artemisinin-Gehalt der Pflanzen sehr gering ist und beträchtliche Schwankungen aufweist. Er liegt meist zwischen 0,1 und 0,4%, bezogen auf das Trockengewicht. Im Idealfall lassen sich von einem Hektar Pflanzenmaterial ein bis zwei Tonnen Blättern ernten, aus denen mittels Extraktion mit unpolaren Lösungsmitteln wie Hexan und nachfolgender Behandlung mit Petrolether rund 2 bis 3 kg des Artemisinin gewonnen werden können. Es entsteht dabei ein ölig-gelber Extrakt der Pflanze, der zu Gel und anschließend zu weißem, kristallinem Pulver raffiniert wird, welches Artemisinin als so genanntes Blutschizontozid enthält.
  • Die restliche Biomasse bleibt bei den bisherigen Verwertungskonzepten weitgehend unbeachtet, da sich die Nutzung der Pflanze bisher auf die Verwendung des Artemisinins als Antimalaria-Mittel konzentriert. Zur Lösung der gestellten Aufgabe müssen geeignete Kombinationspartner gefunden werden.
  • 3. Marine Organismen als potentielle Kombinationspartner
  • Für die Aufgabenstellung geeignete Naturstoffe wurden beispielsweise in marinen Mikroalgen gefunden (Lukowski G, Lindequist U, Mundt S, Jülich WD: Pharmazeutisch oder kosmetisch wirksame Mittel aus lipidhaltigen marinen Organismen. (2003) WO 2003/72118 A1 ). Da marine Organismen über sehr spezielle Lipidzusammensetzungen verfügen, ist es möglich, durch Auswahl der marinen Organismen daraus hergestellte Formulierungen jeweils an einen besonderen Verwendungszweck anzupassen (Lindequist U, Schweder T: Marine Biotechnology. In: Rehm HJ: Biotechnology. 2. ed., Wiley-VCH Weinheim 2001: 442–473).
  • Darüber hinaus verfügen Cyanobakterien über bemerkenswerte biosynthetische Potenzen. Haematococcus pluvialis ist beispielsweise eine einzellige Grünalge, die bis zu 5% ihrer Biomasse das Ketocarotinoid Astaxanthin produzieren kann. Astaxanthin ist als natürliches antioxidans ein wertvoller kosmetischer Rohstoff. Während Cyanobakterien als hochproduktive Produzenten von Sekundärstoffen mit vielfältigen biologischen Wirkungen bekannt sind, werden die eukaryotischen Mikroalgen insbesondere als Produzenten von Primärstoffen wie Fettsäuren, Pigmenten u. a. geschätzt.
  • Verbindungen die biogenetisch den Polyketiden zuzuordnen sind, wurden bisher in Mikroalgen seltener gefunden (Falch, B. Phaarmazie in unserer Zeit 1996, 25, 311–312; Burja, A. M.; Banaigs, B.; Abou-Mansour, E.; Burgess, J. G.; Wright, P. C. Tetrahedron 2001, 57, 9347–9377). Die ersten Paracyclophane, chloridhaltige Sekundärmetabolite des Polyketidstoffwechsels, wurden zu Beginn der 90iger Jahre aus Nostoc linkia und Cylindrospermum licheniforme isoliert und eine hemmende Wirkung auf die Proliferation von KB und LoVo-Zellinien nachgewiesen (Moore, B. S.; Chen J. L.; Patterson G. M. L.; Moore, R. E.; Brinen, L.; KatoY.; Clardy, J. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 4061–4063; Chen, J. L.; Moore, R. E.; Patterson, G. M. L. J. Org. Chem. 1991, 56, 4360–4364; Moore, B. S.; Chen, J. L.; Patterson, G. M. L.; Moore R. E. Tetrahedron 1992, 48, 3001–3006). Aus einer natürlich vorkommenden Nostoc sp. Blüte wurde ein weiteres Cyclophan, dass sich durch eine Dreifachbindung auszeichnet und antibakterielle sowie antialgale Wirkungen besitzt, isoliert (Ploutno, A.; Carmeli, S. J. Nat. Prod. 2000, 63, 1524–1526).
  • 4. Medizinische genutzte Pilze als potentielle Kombinationspartner
  • Der Lipidgehalt von Pilzen kann von weniger als 1% bis zu 15–20% des Trockengewichtes schwanken. Im Mittel kann mit etwa 2 bis 8% gerechnet werden. Pilzfett enthält alle Arten von Lipiden wie freie Fettsäuren (überwiegend ungesättigte Fettsäuren), Mono-, Di-, und Triglyceride, Sterole (speziell Ergosterol), Sterolester sowie Phospolipide (Chang, S. T.; Miles, P. G.: The nutritional attributes and medicinal value of edible mushrooms. In Edible mushrooms and their cultivation, 27–40, CRC Press, BocaRaton (1989); Garcha, H. S., Khanna, P. K., Soni, G. L.: Nutritional importance of mushrooms. In: Mushroom Biology and Mushroom Products, ed. Chang, S. T., Buswell, J. A., Chiu, S. W.: The Chinese University Press, JonKong, 227–236 (1993); Greene, W. M.: Nutritional and medicinal value of speciality mushrooms, Journal of Food Protection 53, 883–894 (1990); Bötticher, W.: Technologie der Pilzverwertung, Verlag Eugen Ulmer, Stuttgart 21–55, (1974).
  • Die Lackporlinge (Ganoderma spec) sind Holzbewohner (Saprobionten und Parasiten) auf Nadel- und Laubbäumen, die sich u. a. durch einen hohen Triterpern-Gehalt auszeichnen. Biologisch aktive Verbindungen aus Pilzen der Gattung Ganoderma sind seit langem beschrieben (U. Lindequist: Ganoderma. In: Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis/Hrsg F. von Bruchhausen, 5. vollständig neubearbeitete Auflage, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg New York 1998, Folgeband 2 Drogen A-K (Hrsg W. Blaschek). S. 750–761.
  • 5. Bisher realisierte Kombinationen mit Artemisia annua
  • Im Gegensatz zur Anwendung des Artemisinin als Malaria-Wirkstoff sind bisher relativ wenige weitere Anwendungen von Pflanzen der Gattung Artemisia beschrieben.
  • So ist in KR 20030051517 ein Nahrungsergänzungsmittel beschrieben, das neben Hovenia dulcis Thunberg and Semisulcospira libertine als Hauptbestandteilen einen Zusatz von 8% Artemisia luayomogi enthält.
  • In KR 20030005127 wird ein Nahrungsergänzungsmittel beschrieben, das neben Hoving Dulis Thunb und Alnus rubra Hovenia dulcis als Hauptbestandteilen einen Zusatz von 10% Artemisia capillaris enthält. Artemisia capillaris wird in CN 1615927 u. a. als Mittel gegen Bluthochdruck beschrieben, wobei dem Stand der Technik eine Mischung mit verschiedenen chinesischen Pflanzen entspricht. CN 1969679 beschreibt die kombinierte Anwendung von Artemisia capillaris und G. lucidum in Form eines Tees.
  • In JP 2000143437 wird ein Kosmetikum beschrieben, das wenigstens 2 der folgenden Pflanzenextrakte enthält: Veronica undulata Wall, Ottelia alismoides Pers., Artemisia apiacea Hance, Artemisia annua L., Andrographis Paniculata Nees, Dichroa febrifuga Lour., Eclipta prostrata L., Dipsacus asper Wall, Dipsacus japonicus Miq., Boehmeria nivea Gaud., Polygonum aviculare L., Sterculia lychnophera Hance, Carpesium abrotanoides L. and Polyporus mylittae Cook. Eine Kombination aus Zuckeralkoholen wie Xylitol oder Erythritol und Pflanzenextrakten, die u. a. auch Artemisia capillaries enthalten kann, wird in JP 2001081008 für die externe Anwendung auf der Haut beschrieben.
  • Ein Nahrungsergänzungsmittel, das einen Artemisia capillaris Thunb.-Extrakt enthält, wird in KR 20050024920 beschrieben. Diese Nahrungsergänzung soll der Hautalterung entgegen wirken. Auch Artemisia annua hauptsächlich in Kombinationen eingesetzt.
  • Die gesundheitsfördernden Inhaltstoffe der Gattung Ganoderma werden vielfach mit Extrakte aus Artemisia spez. kombiniert. So enthält die in von KR 20020078314 beschriebene Kombination u. a., 3% Artemisia capillaris Thunb. und 2% G. lucidum. Auch im JP 2006143711 wird eine Kombination von Extrakten aus Pflanzen und Pilzen beschrieben, die u. a. auch Artemisia argyi Levi. et Vant und G. lucidum enthält. Das in KR 20040032288 beschriebene Nahrungsmittel enthält Artemisia capillaris Thunb in Kombination mit Bierhefe und G. lucidum.
  • KR 20050001730 beschreibt ein Nahrungsergänzungsmittel mit immunaktivierender und Antitumor-Wirkung, das u. a. G. lucidum (FR) Karst und Artemisia Messerschmidtiana Besser enthält.
  • CN 1351886 beschreibt ein Mittel aus 20 Komponenten der chinesischen Medizin, das u. a. G. lucidum und Artemisia capillaris enthält und das bei Lebererkrankungen eingesetzt werden soll. Auch das CN 1092295 lehrt die Verwendung von G. lucidum und Artemisia capillaris in einer Kombination vieler Kräuterextrakte zur Bekämpfung verschiedener Erkrankungen.
  • JP 2048517 beschreibt ein Haarpflegemittel, das u. a. Artemisia apiacea Hance und G. lucidum enthält.
  • Wie dieser Aufzählung zu entnehmen ist, werden bei den beschriebenen Kombinationen aus Extrakten der Gattungen Artemisia und Ganoderma zwar verschiedene Arten von der Gattung Artemisia eingesetzt, während der Einsatz von Ganoderma-Arten bisher weitgehend auf die Verwendung der Spezies G. lucidum beschränkt ist. Eine Kombination aus Artemisia annua mit Ganoderma pfeifferi ist bisher nicht bekannt, obwohl Extrakte aus G. pfeifferi aus der deutschen Patentanmeldung DE 10 2005 031 363 A1 bekannt sind.
  • 6. Stand der Technik bei vorgesehenen Anwendungen
  • 6.1. Anti-Aging
  • Als Hautalterung wird der komplexe biologische Prozess der mit dem Alter einhergehenden Veränderung der Haut bezeichnet. Während die intrinsische Alterung, also die genetisch gesteuerte verminderte Reagibilität der Hautzellen nicht beeinflusst werden kann, kann die durch extrinsischen Faktoren (Umweltfaktoren wie UV-Licht, chemische Reagentien, mechanische Belastung, Stress, Hitze und Kälte) bewirkte Zellalterung durch Anti-Aging-Präparate vermindert werden. Insbesondere unter dem Einfluss freier Radikale kommt es zu einer Erschöpfung der Zellprozesse, der Zellteilung, zu einer erhöhten Permeabilität der Zellmembranen und zu einer Minderversorgung der Zellen.
  • Als sichtbare Zeichen dieser umweltbedingten Zellalterung bekommt die Haut tiefe Falten und Runzeln, ihre trockene Oberfläche neigt zu Einrissen und Pseudonarben, die Oberhaut wird dünner. Es wird weniger Fett produziert, die Haut verliert an Elastizität und ist nicht mehr so regenerationsfähig. Da vor allem die UVA-Strahlung tief in die Haut eindringt, erzeugt sie in der Lederhaut Singulett-Sauerstoff. Dieser bewirkt die Produktion von Enzymen, die die kollagenen Fasern schädigen und damit die Straffheit der Haut reduzieren. Gleichzeitig quellen elastische Fasern auf, was zu einem Verlust der Dehnbarkeit der Haut führt.
  • Das Problem aller Kosmetikpräparate im Zusammenhang mit Anti-Aging ist jedoch, dass bisher vor allem die sichtbaren äußeren Zeichen der Hautalterung beurteilt werden. Dem stand der Technik entsprechende Cremes können diese sichtbaren Zeichen nur mindern, solange die Ursache – die umweltbedingte Zellalterung – nicht beseitigt wird. Bereits vorhandene Falten kann man nicht zum Verschwinden bringen, sondern der Haut im Wesentlichen Feuchtigkeit und Fett zuführen, so dass sie vorübergehend glatter erscheint.
  • Da der Einfluss auf die umweltbedingte Alterung der Zellen bisher nicht experimentell nachgewiesen werden konnte, wird der Alterungsprozess der Hautzellen durch dem Stand der Technik entsprechende Mittel praktisch nicht beeinflusst.
  • 6.2. Sonnenschutz
  • Eine wesentliche Ursache für die vorzeitige Hautalterung ist die UV-Strahlung.
  • Bei herkömmlichen Sonnenschutzmitteln auf der Basis von Titandioxid (TiO2) wird die Reflektion und Adsorption durch mikrofeine Partikel aus Titandioxid oder Zinkoxid, die das einfallende UV-Licht reflektieren, ausgenutzt, um eine Erythembildung (Sonnenbrand) zu vermeiden. Als anorganische UV-Filter fungieren. In modernen Präparaten werden die Pigmentpartikel auf etwa 200 Nanometer verkleinert.
  • Bei Exposition mit ultraviolettem (UV-)Licht absorbieren photokatalytische Substanzen wie Titandioxid (TiO2;) in hohem Maße UV-Strahlung. Bei der Reaktion von Titandioxid mit UV-Strahlung bilden sich jedoch in Anwesenheit von Wasser und Sauerstoff freie Radikale. Es ist nachgewiesen, dass durch den photokatalytischen Effekt von Titandioxid bei Anwendung von Titandioxid in UV-Schutzmitteln neben einer vorzeitigen Zellalterung auch Schäden der DNA durch freie Radikale auftreten, deren Bildung durch das Schutzmittel nicht verhindert, sondern infolge der photokatalytischen Reaktion sogar verstärkt wird.
  • Praktisch kein Sonnenschutzmittel verzichtet deshalb heute auf den Zusatz von Radikalfängern. Dies ist durchaus sinnvoll, da reaktive Sauerstoffspezies an allen Entzündungsvorgängen beteiligt sind und vor allem die ungesättigten Verbindungen (Aminosäuren, Proteine, Lipide) angreifen, aus denen die Zellwände und DNA-Strukturen der Zellkerne aufgebaut sind. Freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies spielen auch bei der Polymorphen Lichtdermatose – vom Laien oft als Sonnenallergie bezeichnet – eine Rolle. In Sonnenschutzprodukten findet man deshalb eine Vielzahl von Substanzen, die freie Radikale neutralisieren sollen: Vitamin E, Vitamin C, Glucosylrutin, Furalglucitol, Ginkgo-Extrakt, Thermalwasser, Silymarin, Superoxiddismutase, Grüner Tee-Extrakt, Bakterienlysate, Bio Melanin, Ferulasäure oder Carboxymethyl-Glucan. Bei einigen Substanzen ist jedoch fraglich, ob sie auch bei topischer Anwendung als Radikalfänger wirken.
  • Ein potenter Radikalfänger ist das Flavonoid Glucosylrutin, das in Kombination mit Vitamin E als Pre Sun Creme zur Prophylaxe der Polymorphen Lichtdermatose Tage vor dem Aufenthalt in der Sonne aufgetragen wird (Hadschiew 1997). Dem gleichen Prinzip folgt die Empfehlung, die Haut frühzeitig mit einer hochkonzentrierten Vitamin E-Creme (Beispiel Optolind E) abzusättigen (Heinrich 1994).
  • Fast jedes Sonnenschutzmittel enthält Vitamin E (Tocopherol). Reine Vitamin E-Cremes erreichen einen Lichtschutzfaktor von etwa 3. Durch die perorale Aufnahme lassen sich in der Epidermis keine ausreichend hohen Tocopherol-Konzentrationen erreichen. Überdies zeigen Studien, dass sich die Vitamin E-Konzentration in der Haut durch Sonneneinstrahlung um bis zu fünfzig Prozent verringern kann (Thiele 1998). Deshalb ist eine lokale Applikation erforderlich. Als Acetat penetriert Vitamin E gut in die Epidermis, wo es durch Esterasen in freies Vitamin E gespalten wird. Auf Grund seiner Struktur kann es gut in die Zellwand eingelagert werden und schützt diese vor dem Angriff der Radikale.
  • Zur Charakterisierung der Qualität eines Sonnenschutzmittels wird der Schutz vor Sonnenbrand in Zukunft nicht mehr im Vordergrund stehen. Der Lichtschutzfaktor hilft zwar, bei richtiger Anwendung ein Erythem zu vermeiden, er gibt aber keine Anleitung, wie der Verbraucher eine Immunsuppression oder nicht mehr reparierbare Zellkernschäden vermeiden kann. Dazu braucht man neue Messkriterien.
  • Bei der photokatalytischen Reaktion entstehen u. a. sehr reaktionsfähige freie OH-Radikale, die eine starke antimikrobielle Wirkung haben (A. Heller: Chemistry and Applications of Photocatalytic Oxidation of Thin Organic Films. Acc. Chem. Res., Vol. 28, No. 12 (1995) 503/D. Bahnemann: Photocatalytic Detoxification of Polluted Waters. The Handbook of Environmental Chemistry, Springer Verlag 1999, Volume 2, Part L, 285–351. Es wird unter photokatalytischer Aktivierung durch UV-Licht eine sehr starke Reduktion des Ausgangskeimgehaltes bei E. faecium auf 0,01%, bei S. aureus auf = 0,001% und bei E. coli auf 0,00002% erreicht. Diese starke biozide Wirkung ist bei Anwendungen auf der Haut unerwünscht.
  • 6.3. Anti-Tumor-Wirkung
  • Es gibt erste Anhaltspunkte einer Wirkung von Inhaltstoffen von Artemisia annua auf verschiedene menschliche Krebsarten.
  • Nach Ergebnissen des Deutschen Krebsforschungszentrums Heidelberg beruht auch diese Wirkung auf der Bildung freier Radikale durch die Peroxid-Gruppierung in Gegenwart von Eisenionen.
  • Die Prüfung des Artemisinins als potentielles Antikrebsmedikament befindet sich noch in einem frühen Stadium.
  • Triterpene, isoliert aus Ganoderma concinna, können die Apoptose in HL-60-Zellen einleiten (Gonzalez AG, Leon F, Rivera A, Padron JI, Gonzalez-Plata J, Zuluaga JC et al. New Lanostanoids from the Fungus Ganoderma concinna. J Nat Prod 2002; 65: 417–21).
  • Triterpene, erhältlich aus Ganoderma applanatum, sind gegen Hauttumore der Maus wirksam (Chairul, Tokuyama T, Hayashi Y, Nishizawa M, Tokuda H, Chairul SM, Hayashi Y. Applanoxidic acids A, B, C and D, biologically active tetracyclic triterpenes from Ganoderma applanatum. Phytochemistry 1991; 30: 4105–9; Chairul, Chairul SM, Hayashi Y. Lanostanoid triterpenes from Ganoderma applanatum. Phytochemistry 1994; 35: 1305–8). Eine Derivat des Illudin war in klinischen Studien wirksam (Murgo A, Cannon DJ, Blatner G, Cheson BD. Clinical trials of MGI-114. Oncology 1999; 13: 233–8).
  • Bewährt hat sich die Zuführung von Lentinan in Ergänzung zur Chemotherapie bei Patienten mit Magenkrebs, Darmkrebs und anderen Tumoren (Hazama S, Oka M, Yoshino S, Iizuka N, Wadamori K, Yamamoto et al. Clinical effects and immunological analysis of intraabdominaland intrapleural injection of lentinan for malignant ascites and pleural effusion of gastric carcinoma. Cancer & Chemotherapy 1995; 22: 1595–7).
  • Nach dem P 53-Modell (Nature 415, 26–27 (2002)) bestehen enge Beziehungen zwischen niedriger Tumor-Morbidität und Anti-Aging-Effekten.
  • 6.4. Verminderung der Verkeimung von Implantaten
  • Die Infektionsraten bei permanenten Implantaten liegen meist zwischen 0,5 und 6% Präventionsstrategien werden dringend benötigt. Zusammen mit Candida sind Staphylokokken die häufigsten Erreger einer Katheter-assoziierten Sepsis, von denen etwa 50% tödlich verlaufen. In einem sich auf der Kunststoffoberfläche ausbildenden Biofilm sind die Staphylokokken teilweise vor dem Angriff von Antibiotika geschützt und entwickeln sehr häufig eine Mehrfachresistenz.
  • Jede Implantat-assoziierte Infektion ist mit einem starken Anstieg der Behandlungskosten verbunden [Kohnen & Jansen, 2001]. In Deutschland geht man von 3000 bis 4000 Katheter-assoziierten Todesfällen pro Jahr aus.
  • Antiseptisch ausgerüstete Implantate können z. B. im Gastrointestinal- und Urogenitalbereich verwendet werden (Brauers et. al., Biocompatibility, cell adhesion and degradation of surface-modified biodegradable polymers designet for the upper unrinary tract. Tech. Urol. (1998), 4, 214–220; Multanen et al., Bacterial adherence to ofloxacin-blendet polyacetone-coated self-reinforced I-lactid acid polymer uroological stents. BJU Intern (2000), 900, 44–56; Schierholz, J. M., H.-M. Wenchel, D. König, J. Beuth und G. Pulverer: Stellenwert antimikrobieller Slow-release-Systeme zur Prävention kathetherassoziierter Infektionen. Hyg. Med. 23 (1998). 548–556.
  • Die Adhäsion von Mikroorganismen und Zellen an ein Implantat stellt in der Pathogenese von nosokomialen Fremdkörperinfektionen an Kunststoffoberflächen den ersten wichtigen Schritt dar. In der PCT/EP 2008/056 730 vom 31.5.08 wird Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen mit Mikro- und Nanopartikel mit Hilfe von Plasmaverfahren beschrieben, das zur Verhinderung der Adhäsion durch Keime eingesetzt werden kann. Arbeiten zur Beschichtung von Medizinprodukten mit Lipidnanopartikeln hergestellt aus Artemisia annua liegen nach unseren Recherchen nicht vor.
  • 7. Nachteile des Stands der Technik
  • Alle im Stand der Technik beschriebenen Kombinationen nutzen Extrakte aus der Gesamtpflanze Artemisia annua.
  • Die Nutzung der Pflanze Artemisia annua konzentriert sich bisher auf die Verwendung des Artemisinins als Antimalaria-Mittel. Das erfordert die Extraktion mit apolaren Lösungsmitteln wie n-Hexan. Dabei werden zwangsläufig auch die Lipide entfernt. Damit ist die im Stand der Technik beschriebene Umwandlung der Biomasse in Mikro- und Nanopartikel unter Nutzung der arteigenen Lipide nicht mehr möglich.
  • Die restliche Biomasse und deren Inhaltstoffe bleiben bei den bisherigen Verwertungskonzepten weitgehend unbeachtet.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung
  • Eine Aufgabe, die durch die Erfindung gelöst werden soll, bestand darin, aus der Biomasse von Artemisia annua Mittel zur Verfügung zu stellen, die nach entsprechender klinischer Prüfung zur Tumorbehandlung eingesetzt werden können.
  • Eine zusätzliche Aufgabe bestand darin, lipidhaltige Mikro- und Nanopartikel für die Beschichtung von Instrumenten und/oder Implantaten zur Verfügung zu stellen.
  • Eine vordringliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Anwendungen für die nach Abtrennung des Arteminsins aus Artemisia annua verbleibenden Reststoffe zu finden und dafür neue Formulierungen bereitzustellen.
  • Darstellung des Wesens der Erfindung
  • Die Aufgaben wurden gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst, einerseits durch Zubereitungen aus Biomassen der Pflanze Artemisia annua und andererseits durch Biomassen lipidhaltiger Algen oder Pilze, sowie durch die Umwandlung dieser Zubereitung in Mikro- und Nanopartikel.
  • Erfindungsgemäß werden neuartige Partikel mit einem mittleren Durchmesser, der je nach Herstellungsart zwischen 10 nm und 10 μm liegt, erhalten, die die Inhaltstoffe von Artemisia annua und den jeweiligen Kombinationspartner integrieren.
  • Je nach dem, ob Artemisin-haltige oder Artemisin-freie Biomassen aus Artemisia annua eingesetzt werden, werden Mikro- und Nanopartikel erhalten, die für sehr unterschiedliche Aufgabenstellungen eingesetzt werden können.
  • Mikro- und Nanopartikel, dadurch gekennzeichnet, dass für ihre Herstellung Biomassen der Pflanze Artemisia annua verwendet werden, die alle Inhaltstoffe einschließlich Artemisinin (Sesquiterpen-Peroxide) enthalten, stellen einerseits neue Mittel zur Verfügung, die nach entsprechender klinischer Prüfung zur Tumorbehandlung eingesetzt werden können, andererseits werden auch Mittel gewonnen, die für die Beschichtung von Oberflächen und deren antimikrobielle Ausrüstung geeignet sind.
  • Bei dieser Anwendung wird die starke Radikalbildung beim Zerfall der Peroxidgruppe besonders in Gegenwart von Eisenionen für zytotoxische und antimikrobielle Wirkungen genutzt.
  • Um sich selbst vor der Radikalwirkung zu schützen, enthält Artemisia annua radikalfangende Wirkstoffe. Mikro- und Nanopartikel, dadurch gekennzeichnet, dass für ihre Herstellung Biomassen der Pflanze Artemisia annua verwendet werden, deren Gehalt an Artemisinin (Sesquiterpen-Peroxide) vor der Umwandlung in Mikro- und Nanopartikel entfernt wurde, nutzen diese radikalfangenden Eigenschaften. Die unter Abtrennung der Peroxid-Strukturen hergestellten Mikro- und Nanopartikel sind deshalb für Anti-Aging-Präparate, Hautpflegemittel und Sonnenschutzprodukte geeignet.
  • Unabhängig davon, ob Artemisin-haltige oder Artemisin-freie Biomassen verwendet werden kann die für die Lösung der Aufgabe erforderliche Umwandlung in Mikro- und Nanopartikel wahlweise mit dem Homogenisationsverfahren, dem Lösungsmittel-Homogenisations-Verfahren oder dem Lösungsmittel-Emulsionsverfahren erfolgen.
  • 1. Homogenisationsverfahren
  • Die zerkleinerte Biomasse von Artemisia annua bzw. die Reste nach Abtrennung der Sesquiterpen-Peroxide werden zunächst erwärmt. Dieser Anteil wird in den Fettsäuren von anderen lipidhaltigen Pilzen oder Cyanaobakterien) bzw. der gesamten lipidhaltigen Biomasse suspendiert, dispergiert bzw. adsorbiert. Parallel dazu wird ein Tensid-Wasser-Gemisch hergestellt. In diese Biomasse können ein oder mehrere Wirkstoffe (fest oder flüssig) hinzu gegeben werden. Dieses Tensid-Wasser-Gemisch wird auf eine Temperatur oberhalb der Schmelztemperatur der Fettsäuren erwärmt. Die beiden Phasen werden bei der gewählten Temperatur vereint. Anschließend wird mit Hilfe eines Rührers (Rotor-Stator-Prinzip) oder mit Hilfe von Ultraschall eine Vorsuspension hergestellt. Die Vorsuspension wird danach mit Hilfe eines Hochdruckhomogenisators homogenisiert, wobei die Zahl der Homogenisationszyklen und der Arbeitsdruck nach der erwünschten Partikelgröße und Stabilität der Zubereitung gewählt werden. Zwischen den einzelnen Zyklen ist darauf zu achten, dass die Herstellungstemperatur immer wieder eingestellt wird. Das Tensid dient zur Stabilisierung der Suspension.
  • Sollte es bei der Herstellung Probleme mit der Höhe der Temperatur (z. B. empfindliche Wirkstoffe) geben, so besteht die Möglichkeit, das gesamte Verfahren auch bei Raumtemperatur durchzuführen. In diesem Falle wird das Verfahren in gleicher Weise, wie zuvor beschrieben, durchgeführt, wobei der Wirkstoff an den lipidhaltigen Organismen adsorbiert oder bei Zusatz einer geringen Wassermenge dispergiert wird.
  • 2. Lösungsmittel-Homogenisations-Verfahren
  • Die zerkleinerte Biomasse von Artemisia Annua bzw. Extraktionsreste nach Abtrennung der Sesquiterpen-Peroxide sowie lipidhaltige Biomassen einer zweiten Spezies und gegebenenfalls ausgewählte Wirkstoffe vorzugsweise Vitaminmischungen werden in einem verdampfbaren organischen Lösungsmittel suspendiert. Danach wird dieses Gemisch vordispergiert (Stator-Rotor-Prinzip oder Ultraschall), homogenisiert (Hochdruckhomogenisator) und anschließend sprühgetrocknet oder gefriergetrocknet (Schema 2). Beim Gefriertrocknen ist zu beachten, dass geeignete Kryoprotektoren eingesetzt werden. Es besteht darüber hinaus auch die Möglichkeit, das organische Lösungsmittel durch geeignete Verdampfer (z. B. Rotationsverdampfer) zu entfernen. Anschließend können die Partikel in geeigneten wässrigen Tensid-Lösungen redispergiert werden. Danach ist eine erneute Dispergierung (Stator-Rotor-Prinzip oder Ultraschall) und Homogenisierung (Hochdruckhomogenisator) notwendig.
  • 3. Lösungsmittel-Emulsions-Verfahren
  • Dieses Verfahren basiert auf der Bereitung einer Emulsion aus Wasser und einer Lösung von Artemisia annua bzw. der Extraktionsrestes von Artemisia annua nach Abtrennung der Sesquiterpen-Peroxide in einem geeigneten organischen Lösungsmittel. Dazu wird ein Emulgator zur Dispergierung des Biomasse-Wirkstoffes eingesetzt. Emulgator und Biomasse werden in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst. Zu dieser Lösung wird eine wässrige Phase, die ein wasserlösliches Cotensid enthält, hinzugefügt und mit der lipidhaltigen Biomasse einer zweiten Art vermischt. Danach wird dieses Gemisch vordispergiert (Stator-Rotor-Prinzip oder Ultraschall). Nach einem Homogenisationsschritt mit Hilfe eines Hochdruckhomogenisators wird das organische Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt, wobei die Wirkstoff enthaltende Biomasse in Form von festen Partikeln ausfällt.
  • Die biologisch aktiven Inhaltsstoffe aus Artemisia annua bzw. aus dem Kombinationspartner können sich je nach Ladung und Größenverteilung der Inhaltstoffe und den Herstellungsbedingungen in der festen Matrix (Nanopellet) und/oder in der lipidhaltigen Hülle (Nanokapsel), in der Hülle eingeschlossen, und/oder im gelösten oder hochdispersen Zustand in der Formulierung verteilt und/oder an den Randzonen der Nanopellets adsorbiert oder adhäriert befinden. Durch die Umwandlung der Kombination aus Artemisia annua und der lipidhaltigen Biomasse einer zweiten Spezies in Mikro- und Nanopartikel werden Inhaltsstoffe beider Komponenten kontrolliert abgegeben.
  • Bei der Herstellung der Mikro- und Nanopartikel können sowohl Artemisin-haltige als auch Artemisin-freie Biomassen mit lipidhaltigen Algen vorzugsweise mit Cyanobakterien mit einem Lipidgehalt von mindestens 10% und/oder mit der einzelligen Grünalge Haematococcus pluvialis kombiniert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Artemisin-haltige Biomassen mit Mikroalgen kombiniert, die zusätzlich einen natürlichen Gehalt an Carbamidocyclophanen aufweisen. Sowohl Carbamidocyclophane enthaltende Biomassen von Cynanobakterien als auch die peroxidhaltigen Strukturen von Artemisia annua üben eine starke zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen aus, verfügen aber über unterschiedliche Wirkungsmechanismen, so dass es zu einem synergistischen Effekt kommt.
  • Dafür besonders geeigneten sind Mikroalgen, die Carbamidocyclophane entsprechend dem Formelbild 1, gekennzeichnet durch ein symmetrisches Kohlenstoffskelett mit Carbamidostrukturen in der Seitenkette sowie durch ein unterschiedliches Substitutionsmuster der den Carbamidostrukturen gegenüberliegenden Seitenketten, wobei R1 bis R7 sowohl Halogen-, Hydroxyl-, Carbonyl- als auch Alkylgruppen sein können, enthalten. Die Carbamidocyclophane nach Formelbild 1 und daraus hergestellten Zubereitungen hemmen das Wachstum verschiedener Tumorzellinien (MCF-7 Zellen Mammakarzinom; 5637 Zellen Blasenkarzinom) besonders stark. Besonders bevorzugt sind Mikro- und Nanopartikel, die den Wirkstoff nach Formelbild 1 in einer Konzentration von 0,01 bis 3% enthalten.
  • Durch die erfindungsgemäße Überführung in Mikro- und Nanopartikel kommt es einerseits zu einer synergistischen zytotoxischen Wirkung der Kombination aus Wirkstoffe nach Formelbild 1 und der peroxidhaltigen Strukturen aus Artemisia annua gegen Tumorzellen.
  • Figure 00150001
  • Um die zytotoxische Wirksamkeit zu steigern, kann der Anteil der Wirkstoffe nach Formelbild 1 oder der Sesquiterpen-Peroxide in den erfindungsgemäßen Zubereitungen durch Zugabe des reinen Wirkstoffes erhöht werden.
  • Werden für die Herstellung der Mikro- und Nanopartikel dagegen Artemisin-freie Biomassen und Carbamidocyclophan-freie Mikroalgen eingesetzt, werden besonders günstige Hautpflegeprodukte erhalten. Für diese Aufgabenstellung sind als lipidhaltige Biomassen einer zweiten Spezies insbesondere Mikroalgen geeignet, die sich durch ein besonderes Fettsäuremuster im Lipidanteil auszeichnen. Durch Pflege mit Formulierungen, die die erfindungsgemäß aus Artemisia annua und Mikroalgen hergestellten Mikro- und Nanopartikel enthalten, werden der Haut schützende Lipide zugeführt. Darüber hinaus besitzen einige Mikroalgen ein extrem hohes Wasserrückhaltevermögen, das in diesen Formulierungen genutzt werden kann. Damit wird mit den erfindungsgemäßen Formulierungen dem transepidermalen Wasserverlust entgegen gewirkt. Mit den erfindungsgemäßen Mikro- und Nanopartikeln wird der Haut Feuchtigkeit und Fett in besonders günstiger Form zugeführt, so dass sie glatter erscheint.
  • In einer besonders günstigen Ausführungsform wird als Kombinationspartner der Artemisia annua die einzellige Grünalge Haematococcus pluvialis eingesetzt. Diese Grünalge enthält bis zu 5% ihrer Biomasse das Ketocarotinoid Astaxanthin. Durch die erfindungsgemäße Mikroverkapselung wird Astaxanthin geschützt und kontrolliert abgegeben.
  • Durch die Radikalfängereigenschaften der erfindungsgemäßen Mikro- und Nanopartikel wird bei regelmäßiger Anwendung die durch Umweltfaktoren wie UV-Licht, chemische Reagentien, mechanische Belastung, Stress, Hitze und Kälte bedingte vorzeitige Hautalterung verhindert.
  • In einer anderen Ausführungsform können bei der Herstellung der Mikro- und Nanopartikel sowohl Artemisin-haltige als auch Artemisin-freie Biomassen mit lipidhaltigen Pilzen kombiniert werden. Besonders bevorzugt sind die Arten Ganoderma lucidum und/oder Ganoderma pfeifferi und/oder Ganoderma applanatum und/oder Ganoderma concinna und/oder Ganoderma tsugae und/oder Auricularia auricula-judae und/oder Grifola frondosa und/oder Hericium erinaceus und/oder Lentinula edodes und/oder Pleurotus ostreatus und/oder Pleurotus eryngii.
  • Werden Artemisin-haltige Biomassen oder Kombinationen aus Artemisin-haltigen Biomassen und Carbamidocyclophan-haltige Mikroalgen mit Pilzen insbesondere der Gattung Ganoderma kombiniert, kommt es zu einem synergistischen Effekt.
  • Sowohl Carbamidocyclophane der Mikroalgen als auch die peroxidhaltigen Strukturen von Artemisia annua üben eine direkte zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen aus.
  • Demgegenüber bewirkt die Biomasse der Gattung Ganoderma eine Induktion der Apoptose und eine Immunstimulation insbesondere durch den Glucan-Gehalt der Ganoderma-Arten. Inhaltstoffe von Ganoderma-Arten bewirken eine Aktivierung der Phagozytose durch Makrophagen. Die Wirksamkeit kann verstärkt werden, wenn Kombinationen mit Triterpenen aus Ganoderma concinna und/oder aus Ganoderma applanatum und/oder aus Ganoderma lucidum, Ganoderma tsugae und/oder aus Ganoderma pfeifferi eingesetzt werden. Vorteilhafterweise können für diesen therapeutischen Verwendungszweck Triterpene aus diesen fünf Ganoderma-Arten kombiniert werden.
  • Das Zusammenwirken von zytotoxischer Wirkung, Induktion von Apoptose und Makrophagen-Aktivierung ist überraschend und ermöglicht neue Wege bei der Prävention und Bekämpfung von Tumoren. Die erfindungsgemäße Mikro- und Nanopartikel können cytostatische Wirkstoffe, apoptosinduzierende Wirkstoffe und Immunstimmulantien als Zweier- oder Dreierkombinationen enthalten.
  • Werden dagegen Artemisin-freie Biomassen oder Kombinationen aus Artemisinfreien Biomassen und Carbamidocyclophan-freien Mikroalgen mit Pilzen kombiniert, die sich bei der Gesundheitsförderung und bei der Prophylaxe bewährt haben, werden Präparate mit besonderen pflegenden Eigenschaften erhalten. Die Mikro- und Nanopartikel besitzen ausgeprägte Radikalfängereigenschaften, was für viele Anwendungen von Vorteil ist.
  • Auch durch die unterschiedlichen Fettsäuremuster der Pilze und/oder der Cyanobakterien können die Eigenschaften der entstehenden Produkte den Erfordernissen angepasst werden.
  • Insbesondere Ganoderma pfeifferi als Kombinationspartner für diese Anwendungen geeignet. Der Stoffwechsel von humanen Zellen (FL-Zellen) Mikro- und Nanopartikeln, hergestellt aus G. pfeifferi, wird sehr stark stimuliert. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass mit Mikro- und Nanopartikeln, hergestellt aus einer Kombination aus Artemisia annua und Ganoderma pfeifferi, ähnlich starke stimulierende Effekte auf den Zellstoffwechsel erreicht werden, selbst wenn Ganoderma pfeifferi in seiner Konzentration stark vermindert ist und die Artemisia annua-Komponente im großen Überschuss vorliegt.
  • Die Inhaltstoffe von G. pfeifferi reduzieren den oxidativen Stress und verstärken die endogene Radikalabwehr. Die nur bei G. pfeifferi nachgewiesenen Inhaltsstoffe Ganomycin A und B hemmen bei einer Konzentration von 10 μg/ml die durch Luminol induzierte und die spontane Sauerstoffradikalfreisetzung.
  • Durch die kontrolliert abgegebenen Inhaltstoffe wird die Proliferation von humanen Keratinocyten gesteigert. Unter dem Einfluss der Kombination steigt der Glucoseverbrauch von humanen Zellen, was auf eine Anregung des Stoffwechsels hinweist. Es wurde gefunden, dass die Respiration verstärkt, die Bildung von Proteinen gefördert und die Zellalterung verlangsamt wird. Unter den gleichen Versuchsbedingungen lässt sich bei Extrakten aus G. lucidum keine Verlangsamung des Alterungsprozesses nachweisen.
  • Die unter UV-Einfluss erhöhte Zellpermeabilität – messbar durch Bestimmung der LDH-Aktivität im Medium – wird vermindert. Die Regenerationsfähigkeit der Zellen nach einer UV-Schädigung wird deutlich erhöht. Die Mikro- und Nanopartikel haben darüber hinaus den Vorteil, ausgeprägte Radikalfängereigenschaften zu besitzen, was für viele Anwendungen von Vorteil ist. Aus den Mikro- und Nanopartikel werden die radikalfangenden Inhaltstoffe sowohl von Artemisia annua als auch von G. pfeifferi kontrolliert abgegeben.
  • Nicht unwesentlich ist darüber hinaus, dass die Produktion von speziellen Ganoderma-Arten, die noch nicht in großem Umfang kommerziell genutzt werden, auf Grund des langsamen Pilzwachstums sehr aufwendig ist. Der Kombinationspartner aus Artemisia annua fällt dagegen bei der Produktion des Wirkstoffes gegen Malaria als Nebenprodukt an. Mit der erfindungsgemäßen Kombination aus Ganoderma-Arten und Artemisia annua-Reststoffen wird daher eine kostengünstige Möglichkeit zur Produktion eines Anti-Aging-Wirkstoffes mit den zellstoffwechsel stimulierenden Eigenschaften zur Verfügung gestellt.
  • Besonders vorteilhafte Anwendungseigenschaften werden erhalten, wenn die nach Abtrennung der Sesquiterpen-Peroxide verbleibenden Reste von Artemisia annua mit Biomassen sowohl aus Mikroalgen als auch aus Pilzarten-Arten kombiniert werden. Die aus dieser Dreier-Kombination resultierenden Mikro- und Nanopartikel eignen sich vorzugsweise zum Einsatz in Sonnenschutzpräparaten.
  • Dieser Effekt kann verstärkt werden, wenn Vitamine in die Mikro- und Nanopartikel integriert werden. Vitamine können sowohl im Homogenisationsverfahren, im Lösungsmittel-Homogenisationsverfahren oder im Lösungsmittel-Emulsionsverfahren während der Herstellung der Mikro- und Nanopartikel zugesetzt werden, wobei sie in die Mikro- und Nanopartikel integriert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird dabei Vitamin E als Acetat eingesetzt. Die Vitamine werden aus den Mikro- und Nanopartikeln kontrolliert an die Haut abgegeben. Als Acetat penetriert Vitamin E gut in die Epidermis, wo es durch Esterasen in freies Vitamin E gespalten wird. Auf Grund seiner Struktur kann es gut in die Zellwand eingelagert werden und schützt diese vor dem Angriff der Radikale.
  • Da bei der Entstehung von Hauttumoren Schädigungen durch freie Radikale eine besondere Rolle spielen, wird bei regelmäßiger prophylaktischer Anwendung von Sonnenschutzmitteln, die die erfindungsgemäßen Mikro- und Nanopartikel enthalten, das Risiko einer Tumorentwicklung reduziert. Zellen, die dennoch unter dem Einfluss der UV-Strahlung entarten, werden durch die in den Zubereitungen enthaltenen Triterpene aus Ganoderma-Arten, insbesondere aus Ganoderma concinna zur Apoptose angeregt.
  • Die Aufgabe, lipidhaltige Mikro- und Nanopartikel für die Beschichtung von Oberflächen, beispielsweise von Instrumenten und/oder Implantaten zur Verfügung zu stellen, wurde durch Herstellung von Mikro- und Nanopartikeln aus der die Biomasse von Artemisia annua ohne Abtrennung der Peroxide gelöst. Dabei entstehen Mikro- und Nanopartikel mit starker antimikrobieller Aktivität. Diese Partikel können zur Verminderung der Adhäsion von Proteinen, Zellen und Keimen eingesetzt werden. In der zum Anmeldezeitpunkt unveröffentlichten Patentanmeldung PCT/EP2008/056730 vom 31.05.2008 wird ein Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen mit Mikro- und Nanopartikel mit Hilfe von Plasmaverfahren beschrieben, das zur Verhinderung der Adhäsion durch Keime eingesetzt werden kann. Die erfindungsgemäßen Mikro- und Nanopartikel können für eine Erweiterung dieses Verfahrens genutzt werden.
  • Die Merkmale der Erfindung gehen außer aus den Ansprüchen auch aus der Beschreibung hervor, wobei die einzelnen Merkmale jeweils für sich allein oder zu mehreren in Form von Kombinationen vorteilhafte schutzfähige Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird.
  • Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
  • Ausführungsbeispiel
  • Beispiel 1: Fettsäurezusammensetzung der für die Herstellung der Mikro- und Nanopartikel aus einer Kombination von Artemisia annua mit marinen Organismen geeigneten Mikroalgen
  • Methodik
  • Pro Ordnung wurden 5–6 Stämme jeweils mit einer Doppelbestimmung untersucht.
  • Ergebnisse
  • In der Tabelle 1 ist die Schwankungsbreite der dabei gefundenen Gehalte angegeben.
    Fettsäure Kurzbezeichnung Gehalt
    Ordnung
    Chroococcales Oscillatoriales Nostocales
    Tetradecansäure 14:0 30,1–35,3 1,3–44 0,7–2,0
    Tetradecensäure 14:1 13,1–17,6
    Pentadecansäure 15:0 0,1–1,1 0,03–9,6 0,2–4,7
    n-Hexadecansäure 16:0 10,3–13,4 26,2–71,6
    n-Hexadec-cis-7-ensäure 16:1 (7) 2,2–3,9 0–3,7
    n-Hexadec-cis-9-ensäure 16:1 (9) 38–48
    11-Hexadecensäure 16:1 (11) 0–46 3,.4–5,8 0,5–29
    7,10-Hexadecadiensäure 16:2 (7,10) 0–4,7 2,2,–6,6
    7,10,13-Hexadecatriensäure 16:3 (7,10,13) 0–16,6 4.0–7,9
    Heptadecansäure 17:0 0,04–0,7 0,03–0,25 0,1–0,6
    n-Octadecansäure 18:0 0,1–0,5 0,1–3,2 0,2–4,9
    n-Octadec-cis-9-ensäure 18:1 (9) 0,1–07 0–3,4
    6,9-Octadecadiensäure 18:2 (6,9) 0–23,6
    n-Octadeca-cis-7-cis-10-diensäure 18:2 (7,10) 3,5–22,8 6.1–11,0
    9,12-Octadecadiensäure 18:2 (9,12) 0–1,3
    n-Octadeca-cis-9,cis 12, cis 15-triensäure 18:3 (9,12,15) 20,8–31,4 18,6–30,2
    n-Octadeca-cis-6,cis 9, cis 12-triensäure 18:3 (6,9,12) 0–5,8
    Octadecatetraensäure 18:4 1,9–11,2
    Eicosansäure 20:0 0,05-0,1
    Docosensäure 20:1
    Docosansäure 22:0 0,3–0,6
    Tridecansäure 23:0
    3-Hydroxyfettsäuren 0,1–1,4 0,05–3,2 0,2–1,2
  • Bei den Chroococcales werden die Tetradecansäure und die Tetradecensäure mit einem konstanten hohen Gehalt gefunden. Ebenfalls auffallend hoch ist der Gehalt an entweder n-Hexadec-cis-9-ensäure oder 11-Hexadecensäure. 8 weitere Fettsäuren werden mit jeweils niedrigem Gehalt, in der Regel < 1%, gefunden.
  • Bei den Oscillatoriales wurde die Tetradecensäure überhaupt nicht gefunden, die gesättigte C-14-Säure wurde nur bei einzelnen Stämmen nachgewiesen. n-Hexadecansäure wurde mit einem Gehalt zwischen 10 und 14% und n-Octadeca-cis-9,cis 12, cis 15-triensäure mit einem Gehalt zwischen 20 und 30% bei allen Stämmen nachgewiesen. Ebenfalls dominierend war die Octadecadiensäure, wobei die Lage der Doppelbindung bei den einzelnen Stämmen variierte.
  • Bei den Nostocales dominiert die n-Hexadecansäure, die zwischen 26 und 72% nachgewiesen wurde, während die entsprechende untersättigte Säure nur mit einem kleinen Anteil gefunden wurde.
  • Dagegen überwogen bei Fettsäuren mit höherer Kettenlänge die mehrfach ungesättigten, Formen, insbesondere die n-Octadeca-cis-9,cis 12, cis 15-triensäure oder die Octadecatetraensäure. Da mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit großer Kettenlänge von besonderem Einfluss auf das Wachstum von S. aureus sind, ist dieser Befund besonders bemerkenswert. Bei den weiteren Untersuchungen hat sich dabei der Stamm Bio 33 aus der Familie der Nostocaceae als besonders geeignet herausgestellt, dessen Fettsäurezusammensetzung in Tab. 2 im Vergleich zu anderen Stämmen dieser Ordnung dargestellt ist. Tabelle 2: Fettsäurezusammensetzung bei Stämmen der Ordnung Nostocales
    Fettsäure Kurzbezeichnung Gehalt
    Stamm
    97-8 Nod 953-14 Nod 951-11 Bio 24 Bio 33
    Tetradecansäure 14:0 1,2–1,6 0,7–1,3 1,8–2,0 0,7–0,85
    Pentadecansäure 15:0 1,0–1,1 0,2–0,24 0,5 2,9–4,7
    n-Hexadecansäure 16:0 34–44- 71,4–71,6 61–74 26,2–34,4 48,8–57,6
    n-Hexadec-cis-7-ensäure 16:1 (7) 3–3,7
    n-Hexadec-cis-9-ensäure 16:1 (9) 22–29 0,55–8,8 14,6–21,6 13,8
    11-Hexadecensäure 16:1 (11) 8,14 0,4 12,5–12,6
    7,10-Hexadecadiensäure 16:2 (7,10) 6,5–6,6 2,6–2,8
    7,10,13-Hexadecatriensäure 16:3 (7,10,13) 6,6–7,9 4,04–4,16
    Heptadecansäure 17:0 0,4–0,6 0,09–0,15
    n-Octadecansäure 18:0 1,5–4,9 0,7–0,78 1,3–2,0 0,2 0,7–0,71
    n-Octadec-cis-9-ensäure 18:1 (9) 3,3–3,4
    6,9-Octadecadiensäure 18:2 (6,9) 7,4–8,6 1,2–1,38
    n-Octadeca-cis-7-cis-10-diensäure 18:2 (7,10) 7,1–11,0 6,0–8,2
    9,12-Octadecadiensäure 18:2 (9,12) 1,2–1,3
    n-Octadeca-cis-9,cis 12, cis 15-triensäure 18:3 (9,12,15) 18,6–19,8 21,7–25,8 24,7–30,2
    n-Octadeca-cis-6,cis 9, cis 12-triensäure 18:3 (6,9,12) 5,5–5,8 5,12
    Octadecatetraensäure 18:4 10,21–11,24 1,9–4,0
    Docosansäure 22:0 0,7–2,1 0,3 0,5–0,6
    Tridecansäure 23:0 0,044–0,045
    3-Hydroxyfettsäuren 0,02–0,1
    3-Hydroxytetradecan säure 0,7–0,71 0,11–0,12
    3-Hydroxyundecansäure 1,12–1,16
  • Es stehen Kombinationspartner aus unterschiedlichen Ordnungen mit ausreichend hohen Lipidgehalt zur Verfügung. Die Eigenschaften der Mikro- und Nanopartikel können durch Auswahl der für die jeweilige Anwendung geeigneten Lipide variiert werden.
  • Beispiel 2 Antioxidative Eigenschaften
  • Methodik
  • Die Bestimmung der antioxidativen Eigenschaften erfolgte dünnschichtchromatografisch (SIEVERS A et al. (2002) Simple thin-layer chromatographic test for antioxidative compounds using DPPH assay. CBS Camag Bibliography service 88: 14–15).
  • Ergebnis
  • 1 zeigt den qualitativen DPPH-Test der Artemsia annua/Ganoderma pfeifferi-Mikropartikel (links) im Vergleich zur Ascorbinsäure (rechts).
  • Wie aus der Größe der Entfärbungszone der Artemsia annua/Ganoderma pfeifferi-Mikropartikel zu sehen ist, liegen starke antioxidative Eigenschaften der untersuchten Mikropartikeln vor.
  • Beispiel 3 Einfluss der erfindungsgemäßen Mikropartikeln auf den Zellstoffwechsel
  • Methodik
  • Es wurde eine Versuchsanordnung benutzt, die in DP 19709649.2 (Jülich, W.-D., Woedtke, Th. von, Abel, P.: Messanordnung zur Erfassung von toxischen, subtoxischen, chronisch toxischen oder stimulierenden Effekten von Wirk- und Schadstoffen mit Hilfe von Perfusionszellkulturen) beschrieben wurde. Konfluent gewachsene FL-Zellen wurden dazu zur Hemmung des Wachstums mit Mitomycin C behandelt.
  • Ergebnisse
  • Mikro- und Nanopartikeln, hergestellt aus G. pfeifferi, stimulieren sehr stark der Stoffwechsel von humanen Zellen (FL-Zellen).
  • Mit einer Kombination aus Artemisia annua und Ganoderma pfeifferi, erfindungsgemäß hergestellt durch Umwandlung in Mikro- und Nanopartikel unter Nutzung der arteigenen Lipide von G. pfeifferi konnten diese Effekte erreicht, selbst wenn Ganoderma pfeifferi in seiner Konzentration stark vermindert ist und die Artemisia annua-Komponente im großen Überschuss vorliegt.
  • Beispiel 4 Cytostatische Wirkung
  • Methodik
  • Die Zytotxozität der Carbamidocyclophane sowie der carbamidocyclophanhaltigen Kombinationen erfolgt an in vitro kultivierten MCF-7 Zellen, 5637 Zellen sowie an Fl-Zellen in 96well Mikrotiterplatten. Die MCF-7 Zellen sowie die 5637 Zellen werden 48 h in IMDM (Invitrogen) mit 10% Fetalem Rinderserum bzw. die Fl-Zellen im Eagle-MEM + 8% Fetalem Rinderserum vorkultiviert (37°C, 5% CO2). Dann werden die Carbamidocyclophanhaltigen Extrakte der aquatischen Organismen bzw. die isolierten Carbamidocyclophane in Konzentrationen von 100 μg/mL bis 0.00001 μg/mL zugesetzt und die Zellen über weitere 48 h unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Anschließend werden die Zellen fixiert und mit 0.02% Kristallviolett über 30 min gefärbt. Nach Waschen und Trocknen wird der zellgebundene Farbstoff mit 70% Ethanol gelöst und die optische Dichte bei λ = 550 nm mit einem Anthos ht II Platten reader (Anthos, Salzburg, Austria) gemessen (Bracht, K.; Boubakari; Grünert, R.; Bednarski, P. J., Anti-Cancer Drugs 2006, 17, 41–51) Die Hemmung der Zellproliferation wird berechnet aus der optischen Dichte gemessen in den Ansätzen, inkubiert mit den Carbamidocyclophanen bzw. den carbamidocyclophanhaltigen Extrakten der aquatischen Organismen im Vergleich zur Zellkontrolle (Zellen inkubiert nur mit Medium) und für die isolierten Carbamidocyclophane werden die IC50 Werte-Werte berechnet.
  • Für die beiden Tumorzellinien ergeben sich für die isolierten Carbamidocyclophane IC50-Werte zwischen 0.7 μg/mL und 1.7 μg/mL, für die Fl-Zellen, die als nicht transformierte Zellen anzusehen sind, IC50-Werte zwischen 2.5 μg/mL, 3.1 μg/mL and 3.5 μg/mL ermittelt.
  • Mit Mikro- und Nanopartikel, die Kombinationen aus Sesquiterpen-Peroxiden und Carbamidocyclophanen enthalten, werden IC50-Werte kleiner 0.3 μg/mL ermittelt.
  • Beispiel 5 Herstellung von Mikro- und Nanopartikeln
  • Tabelle 3: Rezeptur der Nano- und Mikropartikel
    Stoff Menge in g
    Zerkleinerte Biomasse aus Artemisia annua 5,00
    Zerkleinerte Biomasse aus einer Spezies der Ordnung Chroococcales 5,00
    Emulgator (Plantacare 2000®) 0,05
    Demineralisiertes Wasser 40,00
    Homogenisationszyklen 4
  • Die Biomassen werden vereinigt und auf eine Temperatur von 80°C erwärmt. Davon getrennt wird eine wässrige Emulgatorlösung auf die entsprechende Temperatur (80°C) erwärmt. Danach werden beide Phasen vereint und mit Hilfe eines Ultra Turrax T25 der Fa. Janke und Kunkel GmbH & Co KG (Staufen, Deutschland) in einem Emulgierungsprozess bei 8000 Umdrehungen pro Minute und einer Dauer von 30 Sekunden verarbeitet. Die Suspension wird danach mit einem Kolbenspalt-Hochdruckhomogenisator Micron Lab 40 (APV-Gaulin, Lübeck) bei einem Druck von 500 bar und einer Temperatur von 80°C viermal homogenisiert.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (17)

  1. Mikro- und Nanopartikel aus Biomassen der Pflanze Artemisia annua einerseits und Biomassen lipidhaltiger Algen oder Pilze andererseits.
  2. Mikro- und Nanopartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um solche Biomassen der Pflanze Artemisia annua handelt, die alle Inhaltstoffe einschließlich Artemisinin (Sesquiterpen-Peroxide) enthalten.
  3. Mikro- und Nanopartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um solche Biomassen der Pflanze Artemisia annua handelt, deren Gehalt an Artemisinin (Sesquiterpen-Peroxide) vor der Umwandlung in Mikro- und Nanopartikel entfernt wurde.
  4. Mikro- und Nanopartikel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den für die Herstellung verwendeten lipidhaltigen Algen um Cyanobakterien mit einem Lipidgehalt von mindestens 10% und/oder um Cyanobakterien mit einem Lipidgehalt von mindestens 10% und/oder um die einzellige Grünalge Haematococcus pluvialis handelt.
  5. Mikro- und Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den ausgewählten lipidhaltigen Cyanobakterien um Stämme mit einem natürlichen Gehalt an Carbamidocyclophanen handelt
  6. Mikro- und Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählten Carbamidocyclophan-haltigen Stämme Wirkstoffe der Formel 1
    Figure 00250001
    Vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01% bis 3% enthalten, wobei R1 bis R7 sowohl für Halogen-, Hydroxyl-, Carbonyl- als auch Alkylgruppen stehen kann, oder das diese Wirkstoffe der Formel 1 den Mikro- und Nanopartikel bei der Herstellung zugesetzt werden bis eine Konzentration von 0,01 bis 3% erreicht ist.
  7. Mikro- und Nanopartikel, gekennzeichnet dadurch, dass Wirkstoffe nach Formelbild 1 und Sesquiterpen-Peroxide aus Artemisia annua miteinander kombiniert werden.
  8. Mikro- und Nanopartikel nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den für die Herstellung verwendeten lipidhaltigen Pilzen um die Pilzarten • Ganoderma lucidum und/oder • Ganoderma pfeifferi und/oder • Ganoderma applanatum und/oder • Ganoderma concinna und/oder • Ganoderma tsugae und/oder • Auricularia auricula-judae und/oder • Grifola frondosa und/oder • Hericium erinaceus und/oder • Lentinula edodes und/oder • Pleurotus ostreatus und/oder • Pleurotus eryngii handelt.
  9. Mikro- und Nanopartikel, gekennzeichnet dadurch, dass Wirkstoffe nach Formelbild 1 und Biomassen aus Ganoderma-Arten kombiniert werden.
  10. Mikro- und Nanopartikel, gekennzeichnet dadurch, dass Sesquiterpen-Peroxide aus Artemisia annua und Biomassen aus Ganoderma-Arten kombiniert werden.
  11. Mikro- und Nanopartikel, gekennzeichnet dadurch, dass Wirkstoffe nach Formelbild 1, Sesquiterpen-Peroxide aus Artemisia annua und Biomassen aus Ganoderma-Arten kombiniert werden.
  12. Mikro- und Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich mindestes eines der Vitamine A, C oder E enthalten, wobei Vitamin E vorzugsweise als Acetat eingesetzt wird.
  13. Verfahren zur Herstellung der Mikro- und Nanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass entweder zerkleinerte Biomasse aus Artemisia annua, die alle Wirkstoffe enthält, oder andererseits Biomasse aus Artemisia annua, deren Gehalt an Artemisinin (Sesquiterpen-Peroxide) entfernt wurde, mit den Algen oder Pilzen gemäß Anspruch 1 und/oder Zusatzstoffen vermischt und nach bekannten Verfahren in Mikro- und Nanopartikel umgewandelt werden.
  14. Verwendung der Mikro- und Nanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 für kosmetische und/oder pharmazeutischen Zubereitungen und/oder als Nahrungsergänzungsmittel.
  15. Verwendung von Zusammensetzungen nach Anspruch 3 als a) Mittel zur Verlangsamung der Zellalterung und/oder b) Sonnenschutzmittel und/oder c) Mittel mit Anti-Aging-Effekt. d) Mittel zur Prophylaxe von Hauttumoren e) Mittel zur Induktion der Apoptose in Tumorzellen
  16. Verwendung von Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 2, 9, 10, 11, 13 als a) Mittel mit Anti-Tumor-Wirkung b) Mittel zur Behandlung von Tumoren c) Mittel zur Induktion der Apoptose in Tumorzellen
  17. Verwendung der Mikro- und Nanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Beschichtung von Oberflächen.
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