DE102020120218A1

DE102020120218A1 - Gegen das ribosomale Protein rpL35/uL29 gerichtete Moleküle zur Verwendung in der Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Epidermolysis bullosa (EB)

Info

Publication number: DE102020120218A1
Application number: DE102020120218.0A
Authority: DE
Inventors: Hannelore Breitenbach-Koller; Jörg von Hagen; Helmut Hintner; Friedrich Lottspeich; Hans-Werner Mewes; Norbert Müller; Andreas Friedrich; Katharina Elsensohn; Claudia Moßhammer; Michael Wießner; Thomas Karl; Jan Schernthaner; Adriana Rathner
Original assignee: Kbhb Consult GmbH
Current assignee: Kbhb Consult GmbH
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2022-02-03
Also published as: EP4189401A1; WO2022023479A1; US20230288402A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren einer pharmazeutisch aktiven Verbindung, die die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugerzelle moduliert. Die mRNA kann ein vorzeitiges Terminationscodon (PTC) umfassen, einer vorzeitigen Translationstermination unterliegen, ein programmiertes ribosomales -1-Frameshifting (-1PRF) verursachen oder eine polycistronische mRNA sein. Darüber hinaus werden ein entsprechendes Screening-System, Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder eines Zustands und Verbindungen bereitgestellt, die die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation modulieren, insbesondere Atazanavir oder Derivate davon und Artemisinin oder Artesunat oder Derivate davon.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren einer pharmazeutisch aktiven Verbindung, die die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugetierzelle moduliert. Die mRNA kann ein vorzeitiges Terminationscodon (PTC) umfassen, einer vorzeitigen Translationstermination unterliegen, ein programmiertes ribosomales -1-Frameshifting (-1PRF) verursachen oder eine polycistronische mRNA sein. Darüber hinaus werden ein entsprechendes Screening-System, Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder eines Zustands und Verbindungen bereitgestellt, die die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation modulieren, insbesondere Atazanavir oder Derivate davon und Artemisinin oder Artesunat oder Derivate davon.
Hintergrund der Erfindung
Für die meisten der derzeit bekannten genetischen Erkrankungen gibt es keine Heilung. Genetische Erkrankungen sind in der Regel solche, bei denen eine Veränderung (z.B. Mutation) in einem bestimmten Gen vererbt wird oder sich in der Keimbahn entwickelt hat. Diese Mutation erzeugt oder führt dann zu einer spezifischen klinischen Manifestation einer Krankheit. Von den ca. 10.000 seltenen Krankheiten (auch Orphan Diseases genannt, treten bei weniger als 0,01 % einer Bevölkerung auf; insgesamt betreffen alle seltenen Krankheiten zusammen bis zu 10 % der Bevölkerung, also etwa 500 Millionen Menschen weltweit), ca. 6.000 sind genetische Erkrankungen mit einer Mutation wie oben erwähnt
Es gibt mehr als 1800 distinkte vererbte genetische Störungen des Menschen, bei denen Nonsense-Mutationen (In-Frame-Einzelpunktänderungen im genetischen Code, die den Translationsprozess von Proteinen vorzeitig stoppen, was nicht funktionierende, verkürzte Moleküle produziert) bei einem nennenswerten Prozentsatz der Patienten Krankheiten verursachen. Vorzeitige Terminationscodons (PTCs) im Leseraster machen etwa 11% aller beschriebenen Gendefekte aus, die genetisch bedingte Erkrankungen des Menschen, einschließlich seltener Krankheiten, verursachen, und sind häufig mit einem schweren Phänotyp verbunden. Das spezifische genetische Mutationsereignis einer PTC-Mutation während der Translation der PTC-betroffenen mRNA führt zu einer vorzeitigen Beendigung der Proteinsynthese. Eine PTC-Mutation ersetzt ein mRNA-Sense-Codon durch ein außerplanmäßiges Stop-Codon/Nonsense-Codon, ein Signal zur Beendigung der Proteinsynthese. Dies erzeugt ein verkürztes, möglicherweise nicht funktionierendes und sogar schädliches Protein.
Trotzdem gibt es einen basalen zellulären Rettungsmechanismus, um aus einer PTC-betroffenen mRNA noch ein funktionsfähiges Protein in voller Länge zu erzeugen, das sogenannte „Durchlesen“, das die Verwendung einer nahe cognaten tRNA beinhaltet, die in der Lage ist, das PTC als Sense-Codon zu erkennen, um noch eine Aminosäure in die wachsende Proteinkette einzubauen. Die Aminosäure, die durch das Durchlesen eingefügt wird, kann mit der ursprünglichen Aminosäure des Wildtyp-Proteins identisch sein oder nicht. Dennoch gibt es nur eine sehr kleine ausgewählte Untergruppe von Aminosäuren, die substituiert werden können und für die keine drastischen Auswirkungen auf die Proteinstruktur und -funktion beschrieben wurden. Darüber hinaus ist der basale Read-Through-Level niedrig und daher kann - abhängig vom Sequenzkontext des PTCs - Read-Through zwischen 1 von 10.000 mRNA-Translationsereignissen und 1 von 100 Ereignissen variieren. Daher liefern basale Read-Through-Level nicht genügend Protein in voller Länge, um die Manifestation eines Krankheitsphänotyps, insbesondere von Orphan-Krankheitsphänotypen, zu vermeiden/zu überwinden.
US 7,927,791 betrifft ein Verfahren zum Screening und der Identifizierung von Verbindungen die eine vorzeitige Termination der Translation und/oder Nonsense-vermittelte Messenger Ribonukleinsäure („mRNA“) durch Interaktion mit einer vorbestimmten Ziel-Ribonukleinsäure („RNA“) modulieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Identifizierung von Verbindungen die an Regionen der 28S ribosomalen RNA („rRNA“) und Analoga davon binden.
WO 2012/142542 betrifft Verfahren zur Identifizierung von Molekülen, die in der Neomycin-Bindetasche eines bakteriellen Ribosoms binden, unter der Verwendung von Strukturen eines intakten bakteriellen Ribosoms die aufzeigen, wie das Ribosoms tRNA in zwei funktionell getrennten Zuständen bindet.
Dabrowski et al. (in: Advances in therapeutic use of a drug-stimulated translational readthrough of premature termination codons; Mol Med. 2018; 24: 25) offenbaren das translationale Read-Through von PTCs, die durch pharmazeutische Verbindungen induziert werden, als vielversprechenden Weg, die funktionelle Proteinexpression wiederherzustellen und Krankheitssymptome zu reduzieren, ohne das Genom oder Transkriptom des Patienten zu beeinträchtigen. Obwohl sie sich in einigen Fällen als wirksam erwiesen hat, wäre die klinische Verwendung von Readthrough-induzierenden Verbindungen immer noch mit vielen Risiken und Schwierigkeiten verbunden. Der Artikel konzentriert sich auf Probleme, die direkt mit Verbindungen verbunden sind, die zur Stimulierung des PTC-Readthrough verwendet werden, wie z. B. deren Wechselwirkungen mit der Zelle und dem Organismus, ihre Toxizität und Bioverfügbarkeit (Zellpermeabilität; Gewebeablagerung usw.). Verschiedene Strategien zur Überwindung dieser Probleme werden diskutiert.
Keeling KM et al. (in: Therapeutics based on stop codon readthrough. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2014;15:371-394. doi:10.1146/annurev-genom-091212-153527) offenbaren, dass die Nonsense-Suppressionstherapie Ansätze umfasst, die darauf abzielen, die Translationstermination bei in-Frame vorzeitigen Terminationscodons (PTCs, auch als Nonsense-Mutationen bekannt) zu unterdrücken, um so eine mangelhafte Proteinfunktion wiederherzustellen. Sie untersuchen den aktuellen Stand der PTC-Suppression als Therapie genetischer Erkrankungen, die durch Nonsense-Mutationen verursacht werden, und diskutieren den Mechanismus der PTC-Suppression sowie in der Entwicklung befindliche therapeutische Ansätze zur Suppression von PTCs. Die in Betracht gezogenen Ansätze umfassen Read-through-Medikamente. Schließlich untersuchen sie, wie die PTC-Suppression eine Rolle bei der klinischen Behandlung genetischer Erkrankungen spielen könnte, die durch Nonsense-Mutationen verursacht werden.
Das Problem aller Therapieansätze bei seltenen und häufigeren genetischen Erkrankungen ergibt sich daraus, dass zwar die beteiligten Gene und deren Mutationen genau bekannt sind, das Ansprechen auf therapeutische Eingriffe in das zelluläre und molekulare Netzwerk jedoch oft nur schlecht vorhergesagt werden kann, wenn überhaupt. Auch gibt es eine unzureichende funktionelle Charakterisierung der therapeutischen Verbindungen und ihrer Wirkungen auf zelluläre Ziele und Stoffwechselwege. Dies wird beispielhaft durch die Entwicklung synthetisch entwickelter Medikamente mit komplexen und kombinatorisch generierten Strukturen veranschaulicht, bei denen toxische Wirkungen auf zelluläre Komponenten (Off-Targets) erst in späteren Phasen klinischer Studien offensichtlich werden und solche Produktkandidaten scheitern letztendlich an diesen unerwünschten Nebenwirkungen.
Gegenwärtig umfassen therapeutische Interventionen zur Erhöhung des Read-throughs Aminoglykosid-Antibiotika, Derivate davon und synthetisch entwickelte Arzneimittel, die entweder schwere Nebenwirkungen haben und nicht kontinuierlich verabreicht werden können oder nicht bei allen Patienten eine erhöhte Read-through-Rate fördern.
Als prototypische Orphan Disease mit PTC-Defekt untersuchten die Erfinder die schwere junktionale Epidermolysis bullosa (EB, gs-JEB), eine bisher unheilbare und in den meisten Fällen tödlich blasenbildende Hauterkrankung. gs-JEB wird durch loss-of-function-Mutationen in den Genen LAMA3, LAMB3 oder LAMC2 verursacht, die jeweils zum vollständigen Verlust des trimeren Laminin-332-Komplexes, bestehend aus den Proteinen Laminin α3 (Lama3), Laminin β3 (Lamb3) und Laminin 2 (Lamc2) führen. Ohne den Lamb332-Komplex kann keine funktionelle Verbindung zwischen Epidermis und Dermis hergestellt werden. Die Patienten leiden unter extremer Blasenbildung der Haut und der Schleimhäute, des Verdauungstraktes, chronischen Infektionen und eitrigen Wunden sowie einer drastisch verminderten Wundheilung.
Für PTC-Mutationen bei EB, insbesondere nicht für gs-JEB, steht keine zugelassene zielgerichtete systemische Therapie zur Verfügung. Die therapeutischen Möglichkeiten beschränken sich auf die Palliativversorgung. Einzelne therapeutische Strategien, wie Proteinersatztherapie und Knochenmarkstammzelltransplantation, waren in Zellkultur erfolgreich oder haben einzelne Patienten direkt, zumindest teilweise, geheilt, indem sie Genkorrigierte, vom Patienten stammende Keratinozytenepithelien transplantierten (Hirsch T, Rothoeft T, Teig N, et al., Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 2017;551(7680):327-332. doi:10.1038/nature24487).
Folglich besteht ein hoher Bedarf an der Entwicklung alternativer therapeutischer Interventionen. Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Strategien und Interventionen für die Therapie von Krankheiten und Zuständen von Krankheiten und Zuständen bereitzustellen, die mit PTC-betroffenen mRNAs zusammenhängen oder durch diese verursacht werden. Andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann beim Studium der folgenden detaillierteren Beschreibung der vorliegenden Erfindung einschließlich der Figuren und Beispiele offensichtlich.
Eine Möglichkeit, die oben genannten Hindernisse zu überwinden, könnte darin bestehen, bereits zugelassene synthetische Arzneimittel als re-purposed Arzneimittel für andere Krankheiten als ihre ursprüngliche Indikation/Anwendung (Off-Label) einzusetzen. Darüber hinaus weisen natürliche (natürlich gewonnene) Wirkstoffe und Produkte eine enorme strukturelle und chemische Vielfalt auf, die von keiner Bibliothek synthetischer Wirkstoffe erreicht werden kann, da etwa die Hälfte aller chemischen Strukturen, die für Naturstoffe beschrieben werden, einfach nicht Teil synthetischer Wirkstoffe von Bibliotheken sind. Im biologischen Kontext sind Naturstoffe in vielen Fällen bereits als wirkstoffähnliche Moleküle evolutionär optimiert, weil sie von Mikroorganismen, Pflanzen oder Tieren als chemische Intervention gegen konkurrierende Organismen oder Krankheitserreger eingesetzt werden. Derzeit werden weniger als 10 % aller Mikroorganismen auf ihr Spektrum möglicher therapeutischer Wirkstoffe untersucht. Dieses enorme Reservoir an potenziell therapeutisch wirksamen Naturstoffen steht somit als unerschlossene Ressource für die Entdeckung hochwirksamer Wirkstoffe zur Verfügung, während gleichzeitig Nebenwirkungen bei häufigeren Krankheiten und insbesondere bei seltenen Krankheiten wie EB minimiert werden.
Bei den meisten gs-JEB-Fällen ist das LAMB3-Gen betroffen (ca. 80 %). Bis heute sind etwa 90 verschiedene Mutationen beschrieben, von denen fast alle PTC-Mutationen sind. Eine kürzlich durchgeführte Studie an 65 gs-JEB-Patienten (mit beiden Geschlechtern innerhalb der Patientenkohorte) zeigte, dass die R635X-PTC-Mutation bei 84 % der Patienten mit einem mutierten LAMB3-Gen vorhanden ist. Daher ist diese Mutation ein primäres therapeutisches Ziel unter den LAMB3-Mutationen, um Therapien zu entwickeln, die diese PTC-Mutation unterdrücken. Ein solcher therapeutischer Ansatz ist die Verwendung von Aminoglykosid-Antibiotika wie Gentamicin und ihren Derivaten, die den seltenen, basalen, endogenen Prozess des PTC-Lesens verstärken, wodurch die Produktion eines Proteins voller Länge erhöht wird. Dies wurde bei Patienten mit PTC-Mutation im Gen für Mukoviszidose, CFTR (Wilschanski M, Yahav Y, Yaacov et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with cystic fibrosis and CFTR stop mutations. N Engl J Med. 2003;349(15):1433-1441. doi:10.1056/NEJMoa022170) nachgewiesen, aber auch in Zellkulturstudien für das DMD-Gen bei Muskeldystrophie (Bidou L, Hatin I, Perez N, Allamand V, Panthier JJ, Rousset JP. Premature stop codons involved in muscular dystrophies show a broad spectrum of readthrough efficiencies in response to gentamicin treatment. Gene Ther. 2004;11(7):619-627. doi:10.1038/sj.gt.3302211), für das ATM-Gen in Ataxia teleangiectatica (Lai et al., 2004) und für das APC-Gen im Kolonkarzinom (Zilberberg A, Lahav L, Rosin-Arbesfeld R. Restoration of APC gene function in colorectal cancer cells by aminoglycoside- and macrolide-induced read-through of premature termination codons. Gut. 2010;59(4):496-507. doi:10.1136/gut.2008.169805). In Zellkulturen wurde kürzlich gezeigt, dass eine Read-through-Verstärkung der Lamb3-Proteinproduktion mit der R635XPTC-Mutation möglich ist. Dies wird jedoch nur bei einer sehr hohen, therapeutisch nicht anwendbaren Gentamicin-Dosis erreicht, die 30% der normalen Lamb3-Proteinexpression liefert. Auch bei geringeren und therapeutisch sinnvollen Dosierungen bei der Behandlung anderer Erkrankungen mit PTC-Mutationen ist der klinische Einsatz von Aminoglykosiden aufgrund schwerer Nebenwirkungen (Nephrotoxizität und Ototoxizität) eingeschränkt, so dass auch andere Therapieansätze gesucht werden müssen (Wilschanski et al., 2003).
Bauer et al. (in: Specialized yeast ribosomes: a customized tool for selective mRNA translation. PLoS One. 2013; 8(7):e67609. doi:10.1371/journal.pone.0067609) beschreiben diploide Hefestämme, die jeweils in der einen oder anderen Kopie vom Satz der Gene für ribosomale Proteine (RP) defizient sind, um eukaryotische Zellen zu erzeugen, die unterschiedliche Populationen von veränderten „spezialisierten“ Ribosomen tragen. Unter Verwendung der Stämme identifizierte ein Screening spezialisierte Ribosomen mit reduzierten Spiegeln von RP L35B, die eine verbesserte Synthese von LAMB3 voller Länge in Zellen zeigten, die eine LAMB3-PTC-Mutante exprimieren. Es wurde spekuliert, dass die rationale Modifikation eines eukaryotischen Ribosoms eine erhöhte Translation einer spezifischen, krankheitsassoziierten mRNA erreichen könnte und eine neue therapeutische Strategie für die Zukunft darstellen könnte.
Da für Krankheiten, die mit unerwünschten Translationsprodukten in Zusammenhang mit einem ribosomalen Protein rpL35 von Säugern zusammenhängen, wie beispielsweise Epidermolysis bullosa verursacht durch PTC-Mutationen in den LAMB3-, Kollagen VII- oder Kollagen XVII-Genen, keine effiziente systemische Therapie mit geringen Nebenwirkungen zur Verfügung steht, sowie für jene Krebsarten mit PTC-Mutationen, die sich in späteren Stadien der Krankheit manifestieren, wie PTC-Mutationen in den Genen für p53 und APOBEC, nicht verfügbar ist, sind neue therapeutische Ansätze erforderlich. Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche neuen Ansätze, Verfahren und Mittel bereitzustellen. Andere Aufgaben und Vorteile werden dem Fachmann beim Studium der Beschreibung der vorliegenden Erfindung offensichtlich.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die oben genannte Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Identifizierung einer pharmazeutisch aktiven Verbindung, welche die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Zelle eines Säugetiers moduliert, umfassend a) in Kontakt bringen von rpL35 oder eines funktionellen Fragments davon mit mindestens einer Kandidatenverbindung in der Anwesenheit der mindestens einen mRNA die translatiert werden soll, und b) Nachweisen der Modulation der Translation der mindestens einen mRNA verglichen mit der Translation in der Abwesenheit der mindestens einen Kandidatenverbindung, wobei eine Modulation der Translation der mindestens einen mRNA die pharmazeutisch aktive Verbindung anzeigt.
Bevorzugt umfasst die mindestens eine mRNA ein vorzeitiges Terminationskodon (PTC), wird vorzeitiger Translationstermination unterzogen, verursacht programmiertes -1 ribosomales Frameshifting (-1PRF) oder ist eine polycistronische mRNA. Weiter bevorzugt, umfasst das Verfahren weiterhin das Nachweisen einer Bindung der mindestens einen Kandidatenverbindung an ein Fragment von rpL35, wobei das Fragment von ungefähr 70 bis ungefähr 100 der N-terminalen Aminosäuren des Säugetier-rpL35 umfasst, oder wobei das Nachweisen der Bindung an rpL35 oder dem Fragment davon als ein Vor-Screening vor einem in Kontakt bringen der mindestens einen Kandidatenverbindung mit dem rpL35 durchgeführt wird.
In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die oben genannte Aufgabe gelöst durch ein Screeningsystem zur Identifizierung einer pharmazeutisch aktiven Verbindung, welche die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugetierzelle moduliert, umfassend eine eukaryontische Zelle, die rekombinant ein Säugetier rpL35 oder ein Fragment eines Säugetier rpL35 exprimiert, wobei das Fragment von ungefähr 70 bis ungefähr 100 der N-terminalen Aminosäuren von rpL35 umfasst, zum Beispiel gemäß SEQ ID NO: 3, ein Expressionskonstrukt zur rekombinanten Expression von mindestens einer mRNA, die getestet werden soll und gegebenenfalls eine oder mehrere Kandidatenverbindungen, die getestet werden sollen.
In einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die oben genannte Aufgabe gelöst durch das zur Verfügung stellen einer Verbindung, welche rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugetierzelle moduliert zur Verwendung in der Prävention oder Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die durch i) eine mRNA umfassend ein vorzeitiges Terminationskodon (PTC), ii) eine mRNA die vorzeitiger Termination der Translation unterzogen wird, iii) programmiertem -1 ribosomalem Frameshifting (-1PRF), oder iv) der Expression einer polycistronischen mRNA verursacht wird. Bevorzugt ist die Erkrankung oder der Zustand ausgewählt aus Epidermolysis bullosa und viralen Infektionen, insbesondere retroviralen Infektionen, wie zum Beispiel HIV-1 oder Coronavirus, wie zum Beispiel SARS CoV2.
In einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die oben genannte Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Modulierung der rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängigen Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugetierzelle, umfassend in Kontakt bringen der Zelle mit einer effektiven Menge von Atazanavir oder Derivaten davon und Artemisinin oder Artesunat oder Derivaten davon.
In einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die oben genannte Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Behandlung oder der Prävention einer Erkrankung oder Zustands verursacht durch i) eine mRNA umfassend ein vorzeitiges Terminationskodon (PTC), ii) eine mRNA die vorzeitiger Termination der Translation unterzogen wird, iii) programmiertem -1 ribosomalem Frameshifting (-1PRF), oder iv) der Expression einer polycistronischen mRNA in einer Säugetierzelle, umfassend zur Verfügung stellen einer effektiven Menge von mindestens einer Verbindung, welche die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation der mRNA nach einem von i) bis iv) moduliert, an einen Patienten oder Subjekt, das der Behandlung oder Vorbeugung bedarf.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem überraschendem Ergebnis, dass das menschliche ribosomale Protein rpL35 (rpL35/rpL29) als ein Ziel für eine speziell zugeschnittene Modulation der Translation von bestimmten mRNAs in Proteine verwendet werden kann. Gegenwärtig gibt es keine Technologie, die durch systemische Modifikation eines ribosomalen Proteins das Ribosom zur Erhöhung oder Verringerung der Proteinproduktion eines bestimmten Proteins anpasst. Eine Förderung oder eine Reduktion an Proteinspezies ist wünschenswert in medizinischen Anwendungen, in biotechnologischen Anwendungen sowie in kosmetischen und Anti-Aging-Interventionen.
Letztlich liegt die vorliegende Erfindung auf dem Gebiet der spezialisierten Ribosomen, und das Targeting ribosomaler Proteine (RP) bietet neue Wege zur Behandlung schwerer Erbkrankheiten, wie EB (siehe auch: Dalla Venezia N., et al. Emerging Role of Eukaryote Ribosomes in Translational Control. Int J Mol Sci. 2019;20(5):1226. Published 2019 Mar 11. doi:10.3390/ijms20051226; Ferretti MB, Karbstein K. Does functional specialization of ribosomes really exist?. RNA. 2019;25(5):521-538. doi:10.1261/rna.069823.118). Jüngste Ergebnisse haben die Bedeutung der Translationskontrolle bei der Regulation der Genexpression unterstrichen und die traditionelle Rolle der Transkription erweitert. Die Fehlregulation der Translation ist eine der Hauptursachen für viele Krankheiten. Viren nutzen eine Vielzahl von Mechanismen, um die Translationsmaschinerie zu aktivieren, um ihre Replikation zu erleichtern, einschließlich der Manipulation von Translationsinitiationsfaktoren und spezifischer RNA-Strukturen, um die Translation innerhalb ihres Genoms zu steuern. Translationale Kontrolle wurde mit menschlichem Krebs in Verbindung gebracht, wobei Veränderungen in der Proteinsynthese durch Hochregulierung oder veränderte Funktionen von Initiationsfaktoren verursacht werden. Schließlich unterbrechen viele genetische Erkrankungen die Translation durch vorzeitige Terminationscodons (Chen J, et al. The molecular choreography of protein synthesis: translational control, regulation, and pathways. Q Rev Biophys. 2016;49:e11. doi:10.1017/50033583516000056). Diese Erfindung stellt einen Fortschritt in Richtung dieses Konzepts bereit, um das Potenzial des Targetings der Translation therapeutisch zu nutzen.
EP2251437 offenbart ein zweistufiges spezialisiertes Ribosomenscreening (2SSRC), das in der Lage ist, nach ribosomalen Proteinzielen zu screenen, die die Proteinsynthese eines interessierenden Proteins spezifisch regulieren. Diese Screens stellen eine direkten Readout der Proteinsynthese zur Verfügung. Der beim Screening verwendete Assay kann für alle Folgeschritte verwendet werden, einschließlich präklinischer Studien oder zum Testen eines kleinen Molekülbinders, der auf das ribosomale Protein abzielt, um die Proteinexpression anzupassen. In Hefe- und Humanzellen können Subpopulationen von zytoplasmatischen Ribosomen erzeugt werden, indem eine veränderte funktionelle Verfügbarkeit einzelner ribosomaler Proteine bereitgestellt wird. Solche heterologen oder spezialisierten Ribosomen sind darauf zugeschnitten, die Proteinexpression ausgewählter mRNAs zu erhöhen oder zu verringern, während die allgemeine Proteinexpression unverändert bleibt.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren einer pharmazeutisch aktiven Verbindung bereitgestellt, die die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugerzelle („Modulator“) moduliert. Das Verfahren umfasst die Schritte des Kontaktierens von rpL35 oder eines funktionellen Fragments davon mit mindestens einer Kandidatenverbindung in Gegenwart der mindestens einen zu translatierenden mRNA und Nachweisen der Modulation der Translation der mindestens einen mRNA im Vergleich zur Translation in Abwesenheit der mindestens einen Kandidatenverbindung. Eine Modulation der Translation der mindestens einen nachgewiesenen mRNA zeigt dann die pharmazeutisch aktive Verbindung an.
Der Begriff „in Kontakt bringen“ bedeutet in der vorliegenden Erfindung jede Wechselwirkung zwischen dem potentiellen Modulator mit dem ribosomalen Protein oder Fragment davon, wie hierin beschrieben, und/oder einer rekombinanten Zelle, die das ribosomale Protein oder Fragment davon exprimiert, wobei jede der beiden Komponenten unabhängig voneinander in flüssiger Phase, beispielsweise in Lösung oder in Suspension, vorhanden sein kann oder an eine feste Phase gebunden sein kann, beispielsweise in Form einer im Wesentlichen ebenen Oberfläche oder in Form von Partikeln, Perlen oder dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Vielzahl unterschiedlicher potentiell bindender Kandidatenverbindungen auf einer festen Oberfläche immobilisiert, wie beispielsweise auf einem Verbindungsbibliothekschip, und das ribosomale Protein oder Fragment davon, wie hierin beschrieben, wird anschließend mit einem solchen Chip in Kontakt gebracht.
Das erfindungsgemäße Verfahren sucht nach einer pharmazeutisch wirksamen Verbindung, die die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugerzelle („Modulator“), vorzugsweise in einer menschlichen Zelle, moduliert. Praktischerweise kann das Format des Verfahrens ziemlich flexibel sein, das Verfahren erfordert eine geeignete Kombination der drei Komponenten rpL35 (entweder isoliert oder in Kombination mit anderen ribosomalen Komponenten) oder eines funktionellen Fragments davon, der mindestens einen zu translatierenden mRNA, und der mindestens einen pharmazeutisch aktiven Kandidatenverbindung, d.h. der Substanz, die auf die Aktivität gescreent/identifiziert werden soll, die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugerzelle zu modulieren. Diese Kombination kann als zelluläres System bereitgestellt werden (d.h. in einer Zelle funktionierend, wie in einer Hefe- oder Säugerzellkultur), und die Komponenten können teilweise oder vollständig rekombinant bereitgestellt werden, oder das System kann in vitro, beispielsweise als ein in vitro-Translationssystem, das für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, falls erforderlich, leicht angepasst werden kann vorliegen. Beispiele sind Hela-Zell-in-vitro-Translationsassays und menschliche HaCat-PTC/PTC-Modellzellen.
Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren, welches die Vor-Identifikation der Translation der mindestens einen mRNA als rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängig, vorzugsweise zumindest teilweise, besonders bevorzugt zu einem wesentlichen Teil davon umfasst. Ein bevorzugtes Werkzeug zum Identifizieren einer solchen Abhängigkeit verwendet den zweistufigen spezialisierten Ribo-Screen (2SSRS), wie er z.B. in EP2251437 beschrieben ist, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, der ribosomale Zielproteine identifiziert, die die Proteinsynthese von mRNAs von interessierenden Proteinen (POIs) maßschneidern. Vergleichende Proteinsynthese-Assays identifizieren auch mRNAs, die vorzugsweise von verschiedenen Populationen spezialisierter Ribosomen translatiert werden. Darüber hinaus kann die proteomische Analyse die absolute Proteinkonzentration in einer bestimmten Probe identifizieren.
rpL35 (entweder isoliert oder in Kombination mit anderen ribosomalen Komponenten) oder ein funktionelles Fragment davon, wie hierin beschrieben, wird dann mit der mindestens einen Kandidatenverbindung in Gegenwart der mindestens einen zu translatierenden mRNA in Kontakt gebracht (siehe oben). Dann wird die Modulation der Translation der mindestens einen mRNA im Vergleich zur Translation in Abwesenheit der mindestens einen Kandidatenverbindung nachgewiesen. Die Translation kann direkt nachgewiesen werden, beispielsweise durch Nachweis der Menge und/oder Anwesenheit und/oder Größe (Länge) des hergestellten Polypeptids. Dies kann durch Massenspektrometrie, NMR, ELISA, Markierungen, die in das Polypeptid eingeschlossen sind, wie markierte Aminosäuren, Lumineszenzkonstrukte (Renilla und/oder Firefly), Fusionen (GFP) und dergleichen erreicht werden. Vorzugsweise umfasst der Nachweis eine Quantifizierung des Translationsprodukts und bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Modulation zu einer Zunahme oder Abnahme der rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängigen Translation des mindestens einen führt oder diese erzeugt mRNA. Spezifische Beispiele für die Modulation wären eine Erhöhung der Translation eines Polypeptids, wie sie durch Read-through über PTC-Codons erzeugt wird, eine Hemmung (Reduktion) von Polypeptiden, die nach programmiertem ribosomalem -1 Leserastersprung translatiert wurden, oder die Menge oder das Verhältnis (zueinander) von translatierten Polypeptiden aus einer polycistronischen mRNA.
Das Nachweisen der Modulation der Translation der mindestens einen mRNA im Fall von mRNAs, die ein vorzeitiges Terminationskodon (PTC) umfassen, mRNAs, die eine vorzeitige Translationstermination durchlaufen, mRNAs, die programmierten ribosomalen -1 Frameshift durchlaufen (-1PRF), oder eine polycistronische mRNA umfasst vorzugsweise ein Nachweisen, ob ein bestimmtes Polypeptid voller Länge oder „richtiges“ Polypeptid hergestellt wurde (wie im Kontext von PTC) und/oder ob ein Satz von Polypeptiden hergestellt wurde oder nicht (wie im Kontext von viralen polycistronischen mRNAs), und ob diese Übersetzungsprodukte in ihrer Größe, Menge und/oder Zusammensetzung je nach Bedarf moduliert wurden.
Zu einer Stützung des Verfahrens gemäß der Erfindung wurden zwei kleine Moleküle als Binder und prospektive Modulatoren von der rpL35 Translation durch eine Kombination von bioinformatischen Studien, molekularen Dockingstudien, und in vitro NMR-Studien identifiziert. Das erste identifizierte Molekül ist Artesunat (Formel 1),
ein Derivat von Artemisinin (Formel II),
ein Sesquiterpenlacton, das eine ungewöhnliche Peroxidbrücke enthält. Der Endoperoxid-1,2,4-trioxanring ist für den Wirkungsmechanismus des Wirkstoffes verantwortlich, insbesondere wenn zur Behandlung von Malaria und Infektionen durch parasitäre Würmer (Helminthen) verwendet. Artemisinin wurde als an eine große Zahl von Targets bindend gezeigt, was vermuten lässt, dass es auf promiskuitive Weise wirkt (Wang J, Zhang CJ, Chia WN, et al. Haem-activated promiscuous targeting of artemisinin in Plasmodium falciparum. Nat Commun. 2015;6:10111. doi:10.1038/ncomms10111). Interessanterweise spekuliert die Publikation von Wang et al. - in einer langen Liste von anderen Proteintargets - über eine Bindung an (in absteigender Reihenfolge im Hinblick auf Konfidenz) 40S ribosomales Protein S3, 60S ribosomales Protein L4 (RPL4), 60S ribosomales Protein L3 (RPL3), 40S ribosomales Protein S19 (RPS19), 60S ribosomales Protein L2 (RPL2), 60S ribosomales Protein L27 (RPL27), 40S ribosomales Protein S5, 40S ribosomales Protein S21 (RPS21), 60S ribosomales Protein L21 (RPL21) und Ubiquitin-60S ribosomales Protein L40. Es wird erwartet, dass Derivate und pharmazeutisch akzeptable Salze von Artemisinin und Artesunat (siehe unten) sogar noch verbesserte Eigenschaften aufweisen werden, die rpL35 Translation zu modulieren.
Artemisinin wird augenblicklich auch für die Behandlung von Malaria verwendet. WO 2010/012687A2 beschreibt Formulierungen abgeleitet von Artemisia annua und deren Verwendung in der Kosmetik und Medizin. WO 2011/030223A2 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von (2R)-Dihydroartemisinsäure oder (2R)-Dihydroartemisininsäureestern aus jeweils Artemisinsäure oder Artemisinsäureester. WO 2010/149215 beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung, in Pulverform, umfassend Artesunat als ein antiMalariamittel.
Njuguna et al. (in: Artemisinin derivatives: a patent review (2006 - present) Expert Opinion on Therapeutic Patents, Volume 22, 2012 - Issue 10, Pages 1179-1203) stellen eine Zusammenfassung von Patenten zur Verfügung, die global vielversprechende Artemisinin-Derivate und Artemisinin-basierte Wirkstoffkombinationen abdecken, die zur Verwendung in verschiedenen therapeutischen Feldern entwickelt wurden.
Die Bindestelle von Artesunat wurde durch NMR Untersuchungen charakterisiert.
Das zweite identifizierte Molekül ist Atazanavir (Formel 3)
ein synthetischer Tripeptidinhibitor von HIV Protease I und II. Diese Verbindung wird in der Behandlung von HIV-Infektionen verwendet, gewöhnlich in Kombination mit der Verbindung Ritonavir, oder Coronavirus, wie etwa SARS CoV2. Es wird erwartet, dass Derivate und pharmazeutisch akzeptable Salze von Atazanavir (siehe unten) sogar noch verbesserte Eigenschaften aufweisen werden, die rpL35 Translation zu modulieren.
Die Erfinder haben gefunden, dass Artesunat und Atazanavir jeweils an humanes rpL35 binden (3). Die Erfinder haben weiter gefunden, dass die Verabreichung von sowohl Artesunat und Atazanavir die Lamb3PTC Expression in Hefezellen (6) in Hela in vitro Translations-Assays (7) erhöhen und, wie erste Daten anzeigen, wahrscheinlich auch in humanen HaCat PTC/PTC Modellzellen. Die Erfinder identifizierten weiter, dass die Verwendung von Artesunat und Atazanavir in Kombination den Effekt sogar weiter verbessert und insbesondere synergistisch verbessert, verglichen zu beiden allein verabreichten Wirkstoffen.
Hier beschreiben die Erfinder das humane ribosomale Protein rpL35/uL29 als Ziel einer Proteintherapie, um einen PTC-Gendefekt bei der seltenen Krankheit Epidermolysis bullosa zumindest teilweise zu überwinden und zu „reparieren“. Insbesondere fanden die Erfinder, dass menschliches rpL35/uL29 als zelluläres Ziel für eine Arzneimittelwirkung dienen kann, so dass ein funktionelles Protein aus einer anfänglichen DNA produziert wird, die eine Nonsense-Mutation umfasst (die zu einem vorzeitigen Terminationscodon, PTC) führt, hier im Hautankerprotein LAMB3. Die Erfinder zeigen, dass auf diese Weise eine Behandlung der Erkrankung erreicht wird, die mit der PTC-Mutation im LAMB3-Gen verbunden ist.
Ähnlich wie bei der mRNA, die ein vorzeitiges Terminationscodon (PTC) umfasst, kann die vorliegende Erfindung die Translation einer mRNA, die einer vorzeitigen Translationstermination unterliegt, einer programmierten ribosomalen Frameshift von -1 (-1PRF) überwinden und „reparieren“ oder kann die Expression eines Satzes von Proteinen, die von einer polycistronischen mRNA abgeleitet sind überwinden oder „reparieren“ (reduzieren oder hemmen). Dies wird dabei helfen, entsprechende Krankheiten, die mit diesen mRNA-Molekülen in Zusammenhang stehen, wie beispielsweise Epidermolysis bullosa und andere PTC-Erkrankungen, sowie virale Infektionen, insbesondere retrovirale Infektionen, wie HIV-1 oder HCV, zu behandeln und zu lindern und/oder zu verhindern oder Coronavirus, zum Beispiel SARS CoV2.
Beispiele für die Wechselwirkung ribosomaler Proteine mit viraler Proteintranslation finden sich in der Literatur. Li (in: Regulation of Ribosomal Proteins on Viral Infection. Cells. 2019;8(5):508. Published 2019 May 27. doi:10.3390/cells8050508) offenbart, dass ribosomale Proteine eine neue Plattform für die Entwicklung antiviraler Therapien bieten könnten, jedoch sind gegenwärtig antivirale Therapeutika mit ribosomalen Proteinen, die an einer Virusinfektion beteiligt sind, als Ziele begrenzt, und die Erforschung einer antiviralen Strategie basierend auf ribosomalen Proteinen. Green et al. (in: Large Ribosomal Protein 4 Increases Efficiency of Viral Recoding Sequences" Journal of Virology 86 (2012): 8949 - 8958) offenbaren die Auswirkungen eines Wirtsproteins, Large Ribosomal Protein 4 (rpL4), auf die Effizienz der viralen Rekodierung. Die Expression von rpL4 erhöht die Neucodierung von Reportern, die retrovirale Readthrough- und Frameshift-Sequenzen enthalten, sowie das Sindbis-Virus-Leaky-Terminationssignal. Green L und Goff SP (in: Translational Readthrough-Promoting Drugs Enhance Pseudoknot-mediated Suppression of the stop codon at the Moloney murine leukemia virus gag-pol junction. J. Gen. Virol. 2015;96(11):3411-3421. doi:10.1099/jgv.0.000284) offenbaren dann die Auswirkungen von Read-throughfördernden Wirkstoffen - Aminoglykosid-Antibiotika und dem niedermolekularen Ataluren - auf die Effizienz des Read-throughs des Stopcodons im Kontext des MoMLV-Genoms. Der resultierende erhöhte gag-pol-Read-through hatte schädliche Auswirkungen auf die Virusreplikation.
Der Begriff „rpL35“ soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung sowohl das Säuger-, vorzugsweise das menschliche als auch das Hefeprotein oder ein funktionelles Fragment davon umfassen. Während die vorliegende Erfindung letztendlich auf pharmazeutische Verbindungen und Zusammensetzungen abzielt, die bei einem Säugetier, wie einem menschlichen Patienten, aufgrund der Konservierung der ribosomalen Proteine wirksam sind, hat sich das Hefesystem ständig als gültiges Modell für die Situation bei Säugetieren erwiesen. Darüber hinaus ist das Hefesystem auch bequemer zu verwenden. Der Begriff „rpL35“ und/oder „funktionelles Fragment“ soll auch Abschnitte und/oder Regionen des rpL35-Polypeptids umfassen, die an der Modulation der Translation einer mRNA beteiligt sind. Diese Bereiche sind an der Bindung der Verbindung (Modulator) und/oder einer nachfolgenden Änderung der mRNA-Translation beteiligt, z.B. durch sterische Hinderung der mRNA und/oder des Polypeptids, wie sie vom Ribosom produziert werden. Bevorzugt sind funktionelle Fragmente, die den N-terminalen Teil von rpL35 umfassen, wie hierin offenbart, beispielsweise in SEQ ID NO: 3, und/oder Fragmente, die der Außenseite des Ribosoms zugewandt sind (befinden sich auf der Oberfläche des Ribosoms, die der Umgebung ausgesetzt ist). Eine allgemeine Funktion und Funktionalität für die verschiedenen mRNAs, wie hierin offenbart (d.h. eine mRNA, die ein vorzeitiges Terminationscodon (PTC) umfasst, eine mRNA, die einer vorzeitigen Translationstermination unterliegt, programmierter ribosomaler -1-Frameshft (-1PRF) oder die Expression einer polycistronischen mRNA) kann auch wegen der Position am Austrittstunnel von rpL35 im Ribosom vermutet werden. Die Fragmente können auch für Bindungsstudien verwendet werden, entweder für die zu testende mRNA und/oder für das Vorscreenen des Modulators.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, weiterhin umfassend den Schritt des Nachweisens einer Bindung der mindestens einen Kandidatenverbindung an rpL35 oder ein Fragment davon, vorzugsweise an ein isoliertes oder teilweise isoliertes rpL35 oder ein Fragment davon, oder an rpL35 im Kontext mit der ribosomalen Untereinheit oder im Kontext beider Untereinheiten des Säuger-Ribosoms. Dieser Aspekt bezieht sich eher auf die Situation in vivo und im Kontext der vollständigen ribosomalen Struktur.
Bevorzugt ist auch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, das weiterhin den Schritt des Nachweisens einer Bindung der mindestens einen Kandidatenverbindung an ein Fragment von rpL35 umfasst, wobei das Fragment etwa 70 bis etwa 100 der N-terminalen Aminosäuren des Säuger-rpL35 umfasst, vorzugsweise gemäß SEQ ID NO: 3. Dieser Aspekt betrifft eher die Situation bezüglich der Position(en) an rpL35 und der in vitro-Assays im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Weiterhin bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der Nachweis der Bindung (ob in vivo oder vitro) den Nachweis einer Wechselwirkung der mindestens einen Kandidatenverbindung mit einer Aminosäureregion von rpL35 umfasst, ausgewählt aus der Basis von Helix 2, der Schleife oberhalb von Helix 3, L9, K13, E15, E67, L69, L95, K97, E99, E100, L102, dem Set aus L9, K13, E15, E67 und L69 und dem Set aus L95, K97, E99, E100 und L102. Diese Stellen und Regionen von rpL35 wurden als besonders relevant für die Bindung von Verbindungen identifiziert, wie beispielhaft für Atazanavir und Artesunat dargestellt, siehe auch Beispiele unten.
Vorzugsweise wird der Nachweis der Bindung an rpL35 oder das Fragment davon der mindestens einen Kandidatenverbindung(en) als Vorscreening durchgeführt, bevor die mindestens eine Kandidatenverbindung mit dem rpL35 in Kontakt gebracht wird. Das heißt, die vorliegende Erfindung umfasst hier eine Vorauswahl basierend auf den Bindungseigenschaften, z.B. auf einem rekombinanten rpL35, bevor Verbindungen in die komplexeren vollständigen Assays eingeschlossen werden.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, das weiterhin einen Vorselektionsschritt umfasst, der das molekulare Modellieren der Bindung der mindestens einen Kandidatenverbindung an rpL35 oder ein Fragment davon umfasst. Dies kann beispielsweise unter Verwendung eines Computerprogramms erfolgen, das Kandidatenverbindungen durch molekulares Andocken und strukturelle Analoga davon identifiziert, wie beispielsweise SwissDock. Das heißt, die vorliegende Erfindung umfasst hier eine Vorauswahl basierend auf den Bindungseigenschaften wie in silico modelliert, z.B. basierend auf dem gesamten oder einem Teil von rpL35, entweder isoliert oder im Zusammenhang mit ribosomalen Proteinen, bevor Verbindungen in die komplexeren vollständigen in vivo- und/oder vitro-Assays eingeschlossen werden.
Der obige Aspekt bezüglich des Bindens kann, falls gewünscht, kombiniert werden, z.B. die in silico-Ergebnisse können mit den in-vitro-Ergebnissen verglichen und validiert werden und umgekehrt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass die Bindung der mindestens einen Kandidatenverbindung an rpL35 oder ein Fragment davon einen wesentlichen Schritt für die Modulationsfunktion dieser Verbindung darstellt.
Nichtsdestotrotz umfassen die hierin beschriebenen Assays auch das Vortesten einer Bindung in Gegenwart oder Abwesenheit der einzuschließenden spezifischen mRNA.
Bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das rpL35 oder Fragment davon menschliches rpL35 ist. Eine vergleichende Analyse der Atazanavir-Bindung an Hefe und humanes rpL35 zeigte, dass sich die Atazanavir-Bindungscluster bis zu einem gewissen Grad überlappen, dass jedoch auf der Ebene der in-silico-Analyse die prominenteste Gruppe von Atazanavir-Clustern, die an rpL35 gebunden sind, für Hefe und Mensch etwas unterschiedlich ist ( ). Trotzdem wird das Hefemodellsystem als ausreichend konserviert angesehen, um als Werkzeug zur Identifizierung der Situation beim Menschen zu dienen (wie hier beispielhaft mit Atazanavir und Artesunat dargestellt).
Weiterhin bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren, wobei das Verfahren in vitro, in Zellkultur oder in vivo, vorzugsweise in einem nicht-menschlichen Säugetier, durchgeführt wird. Weiter bevorzugt ist der kombinierte Assay der in silico-Bindung mit humanen in vitro-Zellkulturassays.
Die im Kontext der vorliegenden Erfindung zu identifizierende (gescreente) Kandidatenverbindung kann eine beliebige chemische Substanz oder eine beliebige Mischung davon sein. Es kann sich beispielsweise um eine Substanz einer Peptidbibliothek, eine Bibliothek kleiner organischer Moleküle, eine kombinatorische Bibliothek, ein Zellextrakt, insbesondere ein Pflanzenzellextrakt, eine „Small Molecular Drug“ (d.h. mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 Da) handeln, ein Protein und/oder ein Proteinfragment und ein Antikörper oder Fragment davon, und insbesondere aus Atazanavir und Derivaten davon und Artesunat und Derivaten davon. Als besonders nützlich haben sich Pflanzenextraktbibliotheken erwiesen.
Wie oben erwähnt, hängen viele seltene Krankheiten mit der Fehltranslation von mRNAs basierend auf vorzeitigen Stoppcodons zusammen. Darüber hinaus „kapern“ viele Viren die menschliche Protein-Translationsmaschinerie (einschließlich der Ribsosomen), um sich zu vermehren. Da Therapeutika fehlen, schließt die vorliegende Erfindung die Lücke in Fällen, in denen die mindestens eine mRNA für ein Protein kodiert, das Epidermolysis bullosa, virale Infektionen, insbesondere retrovirale Infektionen, wie HIV-1 oder Coronavirus, wie SARS CoV2 verursacht oder damit assoziiert ist, wie zum Beispiel LAMB3. Es wird angenommen, dass die „strategische“ Position von L35 am Austrittstunnel des Ribosoms es zu einem besonders nützlichen Ziel für die hier diskutierten medizinischen Ansätze macht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Screening-System zum Identifizieren einer pharmazeutisch aktiven Verbindung, die die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugerzelle moduliert, umfassend eine eukaryontische Zelle, die ein Säuger-rpL35 rekombinant exprimiert oder ein Fragment eines Säuger-rpL35, wobei das Fragment etwa 70 bis etwa 100 der N-terminalen Aminosäuren von rpL35 umfasst, ein Expressionskonstrukt zum rekombinanten Exprimieren mindestens einer zu testenden mRNA und optional eine oder mehrere Kandidatenverbindungen die getestet werden sollen.
Das ribosomale Protein rpL35, das in den Verfahren und Systemen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann ein modifiziertes Protein voller Länge oder Fragmente mit N/C-terminalen und/oder internen Deletionen sein. Vorzugsweise sind die Fragmente entweder N-terminale Fragmente wie oben. Weiterhin umfasst die Erfindung die Verwendung mutierter ribosomaler Proteine, wie Proteine, die Aminosäureaustausche, modifizierte Aminosäuren enthalten und Fusionsproteine. Verfahren zur Herstellung mutierter ribosomaler Proteine sind im Stand der Technik gut bekannt und werden hierin weiter beschrieben.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Screening-System, das weiterhin ein rekombinantes Expressionskonstrukt, vorzugsweise einen Expressionsvektor, zur Expression des Säuger-rpL35 oder eines Fragments eines Säuger-rpL35, vorzugsweise eines menschlichen rpL35 oder eines Fragments davon, und/oder die (in in diesem Fall proteinartige oder Nukleinsäure) mindestens eine zu identifizierende (zu screenende) pharmazeutisch aktive Verbindung.
Ebenfalls bevorzugt ist ein Screening-System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Expressionskonstrukt zum rekombinanten Exprimieren mindestens einer zu testenden mRNA weiterhin mindestens eine geeignete Reportergruppe umfasst, wie beispielsweise Luciferase-Reporter. Am meisten bevorzugt ist ein duales Luciferase-Reportersystem, z.B. von Luciferasen aus Photinus pyralis (Glühwürmchen) und Renilla reniformis.
Die grundlegende ribosomale Funktion und der strukturelle Aufbau seiner Komponenten zeigen seit etwa 2 Milliarden Jahren Evolution in den meisten biologischen Reichen einen hohen Grad an Konservierung. Es ist bevorzugt, dass die eukaryotischen Zellen der vorliegenden Erfindung aus einer großen Auswahl verschiedener eukaryotischer Modellsysteme ausgewählt werden können, vorzugsweise ausgewählt aus Hefe- oder Säugerzellen, wie Maus-, Ratten-, Hamster- (z. B. CHO), Affen- oder menschlichen Zellen. Nicht nur Säugerzellen könnten bevorzugt werden, sondern es könnten auch Zellen von Wirbellosen für ein solches Screening-System verwendet werden, einschließlich beispielsweise Insektenzellen. Bevorzugt ist ein Screening-System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die eukaryontische Zelle ausgewählt ist aus einer Hefe-, Insekten-, Hamster- oder menschlichen Zelle.
Ebenfalls bevorzugt ist ein Screening-System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die eukaryontische Zelle eine Inaktivierungs- oder Depletionsmutante ist oder andere Modifikationen (z. B. posttranslationale Modifikationen) von rpL35 umfasst. Die Inaktivierung, Depletion oder andere Modifikationen in Bezug auf das ribosomale Protein rpL35 soll alle Veränderungen (z. B. Deletion oder Mutation) umfassen, die mit dem Fachmann bekannten Techniken induziert werden und die funktionelle Veränderung (Inaktivierung oder reduzierte Aktivität) eines ribosomalen Proteins im Vergleich zu seinem Wildtyp-Zustand und/oder die Veränderung des Expressionsniveaus des ribosomalen Proteins oder seiner entsprechenden mRNA ermöglichen. Eingeschlossen sind Verfahren, die mit die geeignete Proteinfunktion und/oder -expression auf der Ebene der genomischen DNA, der DNA-Transkription, der mRNA-Stabilität und -Translation, der Proteinexpression und des posttranslationalen Proteintransports oder der Proteinmodifikation interferieren. Als eine beispielhafte Ausführungsform davon verwendet die vorliegende Erfindung Laborstämme von Zellen, wobei das ribosomale Proteingen für rpL35 (einzelne und duplizierte ribosomale Proteingene kodieren für die 78 bzw. 79 ribosomalen Proteine in Hefe- bzw. Säugerzellen) inaktiviert wurde und/oder durch Deletion verringert wurde.
Hier offenbaren die Erfinder das humane ribosomale Protein rpL35/uL29 als Target für eine Proteintherapie, um einen PTC-Gendefekt bei der seltenen Krankheit Epidermolysis bullosa zumindest teilweise zu überwinden und durchzulesen, der idealerweise zur Expression des Volllängenproteins führt, hier von LAMB3. Insbesondere fanden die Erfinder, dass menschliches rpL35/uL29 als zelluläres Ziel für eine Wirkstoffwirkung dienen kann, so dass ein funktionelles Protein aus einer anfänglichen DNA produziert wird, die eine Nonsense-Mutation umfasst (die zu einem vorzeitigen Terminationscodon, PTC führt), hier im Hautankerprotein LAMB3. Die Erfinder zeigen, dass auf diese Weise eine Behandlung der Erkrankung erreicht wird, die mit der PTC-Mutation im LAMB3-Gen verbunden ist.
Ähnlich der mRNA, die ein vorzeitiges Terminationscodon (PTC) umfasst, kann die vorliegende Erfindung eine mRNA überwinden und durchlesen, die einer vorzeitigen Translationstermination unterzogen wird, einem programmierten -1 ribosomalen Frameshifting (-1PRF), oder die Expression einer Reihe von Proteinen, die von einer polycistronischen mRNA abgeleitet sind überwinden oder „reparieren“ (reduzieren oder hemmen). Dies wird helfen, entsprechende Krankheiten, die mit diesen mRNA-Molekülen in Zusammenhang stehen, wie beispielsweise Epidermolysis bullosa und andere PTC-Erkrankungen, sowie virale Infektionen, insbesondere retrovirale Infektionen, wie HIV-1 oder HCV oder Coronavirus, zum Beispiel SARS CoV2, zu behandeln und zu lindern und/oder zu verhindern.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher eine Verbindung, die die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugerzelle moduliert, zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung von Krankheiten oder Zuständen, die verursacht werden durch i) eine mRNA, umfassend ein vorzeitiges Terminationscodon (PTC), ii) eine mRNA, die eine vorzeitige Translationstermination durchläuft, iii) programmiertes -1 ribosomales Frameshifting (-1PRF) oder iv) die Expression einer polycistronischen mRNA. Vorzugsweise ist die Krankheit oder der Zustand ausgewählt aus Epidermolysis bullosa und viralen Infektionen, insbesondere retroviralen Infektionen, wie HCV, HIV-1 oder Coronavirus, beispielsweise SARS CoV2.
Besonders bevorzugt ist eine Verbindung zur Verwendung der Erfindung, die die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugerzelle moduliert, die mit den beigefügten Screening-Systemen und/oder Verfahren zum Screening identifiziert wurde. Es ist auch bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Verbindung modifiziert werden kann, beispielsweise chemisch wie weiter unten beschrieben.
Die im Kontext der vorliegenden Erfindung zu verwendende und/oder zu screenende Verbindung kann eine beliebige chemische Substanz oder eine beliebige Mischung davon sein. Vorzugsweise ist die Verbindung ausgewählt aus einer chemischen Substanz, einer Substanz ausgewählt aus einer Peptidbibliothek, einer Bibliothek kleiner organischer Moleküle (d.h. mit einem Molekulargewicht von etwa 500 Da oder weniger), einer kombinatorischen Bibliothek, einem Zellextrakt, insbesondere Pflanzenzellextrakt, ein Wirkstoff niederen Molekulargewichts, ein Protein und/oder ein Proteinfragment und ein Antikörper oder Fragment davon, und insbesondere aus Atazanavir und Derivaten davon und Artesunat und Derivaten davon.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „ungefähr“, sofern nicht anders angegeben, +/- 10 % des angegebenen Wertes.
Die ausgewählte oder gescreente Verbindung kann dann modifiziert werden. Diese Modifikation kann in einem zusätzlichen bevorzugten Schritt der Verfahren der Erfindung, wie hierin beschrieben, erfolgen, wobei zum Beispiel nach Analyse der Translationsaktivität von rpL35 oder des Fragments davon in Gegenwart und Abwesenheit der ausgewählten Verbindung die Verbindung weiter chemisch modifiziert wird, wie beispielsweise unten beschrieben, und erneut auf seine Wirkung auf die Translationsaktivität des ribosomalen Proteins hin analysiert wird. Diese „Modifikationsrunde(n)“ kann in allen Verfahren ein- oder mehrmals durchgeführt werden, um die Wirkung der Verbindung zu optimieren, beispielsweise um ihre Spezifität für das Zielprotein zu verbessern, und/oder um seine Spezifität für die zu beeinflussende spezifische mRNA-Translation zu verbessern. Dieses Verfahren wird auch als „gerichtete Evolution“ bezeichnet, da es eine Vielzahl von Schritten beinhaltet, einschließlich Modifikation und Selektion, wodurch Bindungsverbindungen in einem „evolutionären“ Verfahren ausgewählt werden, das ihre Fähigkeiten in Bezug auf eine bestimmte Eigenschaft optimiert, z.B. ihre Bindungsaktivität, ihre Fähigkeit, die Aktivität zu aktivieren, zu hemmen oder zu modulieren, insbesondere die Translationsaktivität des ribosomalen Proteins rpL35 oder des/der Fragmente davon.
Die Modifikation kann auch in silico simuliert werden, bevor zusätzliche Tests durchgeführt werden, um die Wirkung der modifizierten ausgewählten oder gescreenten Verbindung aus der ersten Screening-Runde zu bestätigen oder zu validieren. Entsprechende Softwareprogramme sind in der Technik bekannt und für den Fachmann leicht verfügbar.
Die Modifizierung kann weiterhin durch eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren bewirkt werden, die ohne Einschränkung die Einführung neuer Seitenketten oder den Austausch von funktionellen Gruppen umfassen, wie beispielsweise die Einführung von Halogenen, insbesondere F, C1 oder Br, die Einführung von Niederalkylgruppen, vorzugsweise mit ein bis fünf Kohlenstoffatomen wie beispielsweise Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, tert-Butyl-, n-Pentyl- oder iso-Pentylgruppen, Niederalkenylgruppen vorzugsweise mit zwei bis fünf Kohlenstoffatomen, Niederalkinylgruppen, vorzugsweise mit zwei bis fünf Kohlenstoffatomen oder durch Einführung beispielsweise einer Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NH₂, NO₂, OH, SH, NH, CN, Aryl, Heteroaryl-, COH- oder COOH-Gruppe.
Noch ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Linderung, Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten oder Zuständen, die durch i) eine mRNA, die ein vorzeitiges Terminationscodon (PTC) umfasst, ii) eine mRNA, die vorzeitige Translationstermination, iii) programmierte ribosomale -1-Frameshifting (-1PRF) oder iv) die Expression einer polycistronischen mRNA in einem Subjekt, umfassend die Schritte des Formulierens der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zu einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung oder Durchführen von einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zum Identifizieren einer Verbindung, die die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugerzelle moduliert, und Formulieren der Verbindung, wie identifiziert, zu einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung. Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird. Vorzugsweise ist die Krankheit oder der Zustand ausgewählt aus Epidermolysis bullosa und viralen Infektionen, insbesondere retroviralen Infektionen, wie beispielsweise HCV, HIV-1 oder Coronavirus, beispielsweise SARS CoV2, oder der Behandlung oder Prävention von seneszenten Zellen.
Somit kann in noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung die ausgewählte oder gescreente Verbindung und/oder Verbindung zur Verwendung bereitgestellt und/oder als eine geeignete pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden, wie beispielsweise eine topische Zusammensetzung, Tablette, Kapsel, Granulat, Pulver, Sachet, rekonstituierbares Pulver, Trockenpulverinhalator und/oder Kautablette. Solche festen Formulierungen können Hilfsstoffe und andere Bestandteile in geeigneten Mengen umfassen. Solche festen Formulierungen können z.B. Cellulose, mikrokristalline Cellulose, Polyvidon, insbesondere FB-Polyvidon, Magnesiumstearat und dergleichen enthalten. Die wie oben beschrieben identifizierte wechselwirkende Verbindung, die zusätzliche Modifikationsrunden durchlaufen haben kann oder nicht, wird mit geeigneten Hilfs- und/oder Zusatzstoffen vermischt. Solche Substanzen umfassen pharmakologisch akzeptable Substanzen, die die Stabilität, Löslichkeit, Biokompatibilität oder biologische Halbwertszeit der wechselwirkenden Verbindung erhöhen, oder umfassen Substanzen oder Materialien, die für bestimmte Applikationswege enthalten sein müssen, wie z. B. intravenöse Lösung, Sprays, Liposomen, Salben, Hautcreme, Pflaster oder Tabletten.
Es versteht sich, dass die vorliegende Verbindung und/oder eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die vorliegende Verbindung umfasst, zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten bestimmt ist. Der Begriff „verabreichen“ bedeutet die Verabreichung eines einzigen therapeutischen Mittels oder in Kombination mit einem anderen therapeutischen Mittel. Es ist daher vorgesehen, dass die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Co-Therapie-Ansätzen verwendet wird, d.h. in CoVerabreichung mit anderen Medikamenten oder Arzneimitteln und/oder jedem anderen therapeutischen Mittel, das im Kontext der Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sein könnte. Nichtsdestotrotz können die anderen Medikamente oder Arzneimittel und/oder jedes andere therapeutische Mittel getrennt von der ausgewählten oder gescreenten Verbindung und/oder der Verbindung zur Verwendung, falls erforderlich, verabreicht werden, solange sie in Kombination mit der vorliegenden Verbindung, wie ausgewählt oder gescreent und/oder zur Verwendung wirken (d.h. direkt und/oder indirekt, vorzugsweise synergistisch).
So können die ausgewählten bzw. gescreenten und/oder erfindungsgemäßen Verbindungen allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen, beispielsweise mit bereits bekannten Arzneimitteln, zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen eingesetzt werden, wobei im letzteren Fall ein additiver, verstärkender oder vorzugsweise synergistischer Effekt festgestellt wird. Geeignete an Menschen zu verabreichende Mengen liegen im Bereich von 5 bis 500 mg, insbesondere 10 mg bis 100 mg. Selbstverständlich kann jede Dosierung von dem behandelnden Arzt bei Bedarf leicht angepasst werden, beispielsweise basierend auf anderen medizinischen Parametern des zu behandelnden Patienten.
Die verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen können gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Pharmazeutisch akzeptable Träger oder Hilfsstoffe umfassen Verdünnungsmittel (Füllstoffe, bulk-Füllstoffe, z.B. Lactose, mikrokristalline Cellulose), Sprengmittel (z.B. Natriumstärkeglycolat, Croscarmellose-Natrium), Bindemittel (z.B. PVP, HPMC), Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat), Gleitmittel (z.B. kolloidales SiO₂), Lösungsmittel/Co-Lösungsmittel (z.B. wässriger Träger, Propylenglykol, Glycerin), Puffermittel (z.B. Citrat, Gluconate, Lactate), Konservierungsmittel (z.B. Na-Benzoat, Parabene (Me, Pr und Bu), BKC), Anti - Oxidationsmittel (z.B. BHT, BHA, Ascorbinsäure), Netzmittel (z.B. Polysorbate, Sorbitanester), Verdickungsmittel (z.B. Methylcellulose oder Hydroxyethylcellulose), Süßungsmittel (z.B. Sorbit, Saccharin, Aspartam, Acesulfam), Aromastoffe (z.B. Pfefferminze, Zitrone) Öle, Butterscotch usw.), Feuchthaltemittel (z.B. Propylen, Glykol, Glycerin, Sorbit). Andere geeignete pharmazeutisch verträgliche Exzipienten sind unter anderem beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 15^th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1991) und Bauer et al., Pharmazeutische Technologie, 5. Aufl., Govi-Verlag Frankfurt (1997). Der Fachmann kennt geeignete Formulierungen für die jeweiligen Verbindungen, beispielsweise topische, und wird leicht geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger oder Hilfsstoffe auswählen können, z. B. in Abhängigkeit von der Formulierung und dem Verabreichungsweg der pharmazeutischen Zusammensetzung.
Die Therapeutika können oral verabreicht werden, z.B. in Form von Pillen, Tabletten, Dragees, Dragees, Hart- und Weichgelatinekapseln, Lösungen, Sirupen, Emulsionen oder Suspensionen oder als Aerosolmischungen. Die Verabreichung kann jedoch auch rektal erfolgen, z.B. in Form von Suppositorien, oder parenteral, z.B. in Form von Injektionen oder Infusionen, oder perkutan, z.B. in Form von Salben, Cremes oder Tinkturen.
Neben den vorgenannten Verbindungen wie ausgewählt oder gescreent und/oder zur erfindungsgemäßen Verwendung kann die pharmazeutische Zusammensetzung weitere übliche, meist inerte Trägermaterialien oder Hilfsstoffe enthalten. So können die pharmazeutischen Zubereitungen auch Zusatzstoffe, wie beispielsweise Füll-, Streck-, Spreng-, Binde-, Gleit-, Netz-, Stabilisatoren, Emulgatoren, Konservierungs-, Süß-, Farb-, Geschmacks- oder Aromastoffe, Puffersubstanzen, weiterhin Lösungsmittel enthalten oder Lösungsvermittler oder Mittel zur Erzielung einer Depotwirkung, sowie Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks, Beschichtungsmittel oder Antioxidantien. Sie können auch die oben erwähnten Salze von zwei oder mehr Verbindungen zur Verwendung der Erfindung enthalten und auch andere therapeutisch wirksame Substanzen, wie oben beschrieben.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zum Modulieren der rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängigen Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugerzelle, umfassend das in Kontakt bringen der Zelle mit einer wirksamen Menge der Verbindung(en) wie ausgewählt oder gescreent und/oder zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise Atazanavir oder Derivate davon und/oder Artesunat oder Derivate davon. Vorzugsweise ist das Verfahren ein nichtmedizinisches oder kosmetisches Verfahren und/oder wird in vivo oder in vitro durchgeführt.
Noch ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Behandlung oder Linderung einer Krankheit oder eines Zustands, verursacht durch i) eine mRNA, die ein vorzeitiges Terminationscodon (PTC) umfasst, ii) eine mRNA, die einer vorzeitigen Translationstermination unterzogen wird, iii) programmierte - 1 ribosomales Frameshifting (-1PRF) oder iv) die Expression einer polycistronischen mRNA in einer Säugerzelle in einem Patienten, der diese benötigt, umfassend die Verabreichung an den Patienten einer wirksamen Menge der mindestens einen erfindungsgemäßen Verbindung, die die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation der mRNA gemäß einem von i) bis iv) moduliert oder der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, wodurch eine Krankheit oder ein Zustand behandelt oder gelindert wird
Mit „Behandlung“ oder „Behandeln“ ist jede Behandlung einer Krankheit oder Störung bei einem Säuger gemeint, einschließlich: Verhindern oder Schützen gegen die Krankheit oder Störung, d.h. Verursachen, dass sich die klinischen Symptome der Krankheit nicht entwickeln; Hemmung der Krankheit, d.h. Hemmung oder Unterdrückung der Entwicklung klinischer Symptome; und/oder Linderung der Krankheit, d.h. Verursachung der Regression der klinischen Symptome. Mit „Verbesserung“ ist die Vorbeugung, Verringerung oder Linderung eines Zustands oder Verbesserung des Zustands eines Subjekts gemeint; die Linderung eines Stresses ist das Entgegenwirken der negativen Aspekte eines Stresses. Die Besserung umfasst, erfordert jedoch keine vollständige Genesung oder vollständige Vorbeugung von Stress.
Wie oben kann die im Kontext der vorliegenden Erfindung verabreichte Verbindung eine beliebige chemische Substanz oder eine beliebige Mischung davon sein. Vorzugsweise ist die Verbindung ausgewählt aus einer Substanz ausgewählt aus einer Peptidbibliothek, einer Bibliothek kleiner organischer Moleküle (d.h. mit einem Molekulargewicht von etwa 500 Da oder weniger), einer kombinatorischen Bibliothek, einem Zellextrakt, insbesondere einem Pflanzenzellextrakt, einem Wirkstoff niederen Molekulargewichts, ein Protein und/oder ein Proteinfragment und ein Antikörper oder ein Fragment davon, und insbesondere aus Atazanavir und Derivaten davon und Artesunat und Derivaten davon.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krankheit oder der Zustand ausgewählt ist aus Epidermolysis bullosa und viralen Infektionen, insbesondere retroviralen Infektionen, wie HCV, HIV-1 oder Coronavirus, beispielsweise SARS CoV2.
In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu beachten, dass bei vielen PTC-assoziierten Krankheitszuständen oder Zuständen eine relativ geringe Zunahme einer Proteinexpression aus der PTC-mRNA (sei es durch eine Zunahme des PTC-Read-Through oder einer Abnahme des PTC-induzierten Abbaus der PTC-mRNA) ausreichend ist für eine signifikante Verbesserung des Krankheitszustandes oder -zustandes. In anderen Fällen kann es wiederum wünschenswert sein, die Menge eines Zielproteins zu reduzieren, vorzugsweise auf ein minimales Niveau. Beispiele hierfür sind Virusinfektionen.
Eine seltene Krankheit in den Vereinigten Staaten wird durch den Orphan Drug Act von 1983 als eine Erkrankung definiert, von der weniger als 200.000 Menschen betroffen sind, während die in der Europäischen Union im Jahr 2000 eingeführte analoge Definition eine Krankheit als selten einstuft, wenn weniger als einer von 2.000 Menschen davon betroffen ist. Die aktuell gelisteten 7000 seltenen Krankheiten (https://www.eurordis.org) weltweit betreffen mehr als 500 Millionen Menschen, mehr als doppelt so viele Patienten, die von AIDS und Krebs zusammen betroffen sind. Jüngste Fortschritte bei der Annotation von Mutationen in menschlichen Genen deuten darauf hin, dass es möglicherweise mehr als 10.000 seltene Krankheiten gibt (https://mondo.monarchinitiative.org/). Die Mehrzahl der seltenen Erkrankungen sind genetische Störungen, also Erkrankungen die einer Mendelschen Vererbung unterliegen.
PTCs machen etwa 11% aller beschriebenen Gendefekte aus, die genetische Erkrankungen des Menschen verursachen und sind oft mit einem schweren Phänotyp verbunden. Das spezifische genetische Mutationsereignis einer PTC-Mutation während der Translation der PTC-betroffenen mRNA führt zu einer vorzeitigen Beendigung der Proteinsynthese. Eine PTC-Mutation ersetzt ein mRNA-Sense-Codon durch ein ungeplantes Stop-Codon/Nonsense-Codon, ein Signal für die Beendigung der Proteinsynthese. Dies erzeugt ein verkürztes, möglicherweise nicht funktionsfähiges und sogar schädliches Protein.
Die LAMB3635X-PTC-Mutation ist die häufigste genetische Läsion bei der seltenen Krankheit gs-JEB, und homozygote Funktionsverlustvarianten sind postnatal tödlich. Bisher haben umfangreiche klinische Studien keine zugelassenen Therapien für diese Patienten geliefert. Die am weitesten fortgeschrittenen klinischen Studien verwenden Aminoglykosid-Antibiotika. Dieser nicht zielgerichtete, systemische Ansatz zur Behandlung von PTC-Mutationen bei EB und anderen seltenen Erkrankungen begann vor mehreren Jahrzehnten mit der Verwendung von Aminoglykosid-Antibiotika zur Behandlung von PTC-Läsionen (Burke JF, Mogg AE. Suppression of a nonsense mutation in mammalian cells in vivo by the aminoglycoside antibiotics G-418 and paromomycin. Nucleic Acids Res. 1985;13(17):6265-6272). Aminoglykosid-Antibiotika wurden verwendet, um Gram-negative bakterielle Infektionen zu behandeln, und bei Krankheitserregern binden Aminoglykoside an eine sieben-Nukleotid-Schleifenstruktur im Entschlüsselungszentrum des bakteriellen Ribosoms und verringern die Genauigkeit der entschlüsselnden mRNA-Triplets (Fan-Minogue H, Bedwell DM. Eukaryotic ribosomal RNA determinants of aminoglycoside resistance and their role in translational fidelity. Rna. 2008 Jan;14(1):148-57). Dies erhöht den Fehleinbau von nahezu cognaten tRNAs, was zu einem umfangreichen translationalen Fehllesen von Sense-Codons und Stop-Codons, einschließlich vorzeitiger Terminationscodons, führt. Bei Bakterien ist die durch Aminoglykoside induzierte Fehlinterpretation weder codon- noch mRNA-spezifisch und führt zur Akkumulation fehlerhafter Proteine, zur vollständigen Hemmung der Proteinsynthese und zum Verlust der Lebensfähigkeit des prokaryotischen Pathogens. Bei Eukaryoten verringert ein kleiner Unterschied in der rRNA-Nukleotidsequenz der Aminoglykosid-Bindungstasche neben dem Dekodierungszentrum der zytoplasmatischen Ribosomen die Effizienz der Wirkstoffbindung signifikant (Lynch SR, Puglisi JD. Structure of a eukaryotic decoding region A-site RNA. J Mol Biol. 2001 Mar 9;306(5):1023-35). Für PTC-Signale in eukaryotischen mRNAs reicht der Einfluss von Aminoglykosiden auf die Dekodierung jedoch oft aus, um die Genauigkeit der PTC-Codon-Erkennung zu verringern und das Durchlesen zu fördern. Auf diese Weise werden aus eukaryontischen PTC-mRNAs unter Behandlung mit Aminoglykosiden Volllängenproteine hergestellt.
Je nach Behandlungsschema und Art der Ermittlung der Produktion von Volllängenprotein aus einer PTC-mRNA berichten eine Reihe von Studien in Hefe- bzw. humanen Modellzellen, dass die Verabreichung von Aminoglykosiden den basalen Read-Through um das Zwei- bis Dreifache erhöht oder erzeugt zwischen 3% bis 20% des Wildtyp-Proteinspiegels (Übersicht in Dabrowski M, Bukowy-Bieryllo Z, Zietkiewicz E. Advances in therapeutic use of a drug-stimulated translational readthrough of premature termination codons. Mol Med. 2018 May 29;24(1):25). In einigen Studien zur Behandlung von Patienten mit PTC-Mutationen bei Muskeldystrophie und Mukoviszidose wurde berichtet, dass eine Steigerung der Produktion von Volllängenprotein um das 2- bis 3-Fache im Vergleich zu endogenen Read-Through-Spiegeln bei einer Aminoglykosid-Behandlung vorteilhaft ist ( Allamand V, Bidou L, Arakawa M, Floquet C, Shiozuka M, Paturneau-Jouas M, et al. Druginduced readthrough of premature stop codons leads to the stabilization of laminin alpha2 chain mRNA in CMD myotubes. J Gene Med. 2008 Feb;10(2):217-24, Sloane PA, Rowe SM. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein repair as a therapeutic strategy in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 2010 Nov;16(6):591-7, Gonzalez-Hilarion S, Beghyn T, Jia J, Debreuck N, Berte G, Mamchaoui K, et al. Rescue of nonsense mutations by amlexanox in human cells. Orphanet Journal of Rare Diseases. 2012 2012/08/31;7(1):58). Derzeit kann das PTC-Read-Through-Niveau, das für die Rekonstitution von PTC-mRNA aus dem Krankheitsphänotyp erreicht werden muss, nicht vorhergesagt werden (Dabrowski et al., 2018). Längere Anwendung von Aminoglykosiden übt starke oto- und nephrotoxische Wirkungen auf den Organismus aus. Darüber hinaus zielen Aminoglykoside auf mitochondriale Ribosomen ab. Die induzierte Fehltranslation von mitochondrial synthetisierten Proteinen der Elektronentransportkette führt zu einem Ungleichgewicht des Energiestoffwechsels und verursacht einen erhöhten oxidativen Stress in allen Zelltypen des Patienten (Kalghatgi S, Spina CS, Costello JC, Liesa M, Morones-Ramirez JR, Slomovic S, et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci Transl Med. 2013;5(192):192ra85-92ra85).
Um die aus der Aminoglykosid-Toxizität resultierenden Komplikationen zu mildern, wurden verschiedene Versuche unternommen, die Aminoglykosid-Toxizität abzuschwächen oder andere Verbindungen mit einem PTC-Read-Through-Induzierungspotential auszuwählen, dabei jedoch unerwünschte Nebenwirkungen von Aminoglykosid-Antibiotika zu vermeiden. Diese Strategien lieferten Medikamente, die die Aktivität des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs verringern (Lykke-Andersen S, Jensen TH. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015 Nov;16(11):665-77) und verringern somit den Zerfall der PTC-mRNA. Dies liefert erhöhte Mengen an PTC-mRNA zum endogenen Durchlesen und liefert erhöhte Mengen an Volllängenprotein aus der PTC-mRNA. Die kombinatorische Anwendung von NMD-Medikamenten und Read-Through-Medikamenten wurde versucht, jedoch mit geringer oder keiner überlegenen Wirkung (Dabrowski et al. 2018, Bukowy-Bieryllo Z, Dabrowski M, Witt M, Zietkiewicz E. Aminoglycoside-stimulated readthrough of premature termination codons in selected genes involved in primary ciliary dyskinesia. RNA Biol. 2016 Oct 2;13(10):1041-50). Die Entwicklung von Nicht-Aminoglykosid-Read-Through-Medikamenten, insbesondere PTC124 (Ataluren), führte zur Identifizierung kleiner Moleküle mit geringerer Toxizität, aber ohne überlegene Leistung gegenüber Aminoglykosid-Antibiotika und ohne Durchleseaktivität für Untergruppen von PTC-mRNAs. (Dabrowski et al 2018, Kerem E, Konstan MW, De Boeck K, Accurso FJ, Sermet-Gaudelus I, Wilschanski M, et al. Ataluren for the treatment of nonsense-mutation cystic fibrosis: a randomised, double-blind, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respir Med. 2014 Jul;2(7):539-47). Kürzlich wurde ein Vorbehalt für die Verwendung von Aminoglykosiden und anderen Readthrough-Medikamenten gemeldet. Wangen und Green (Wangen JR, Green R. Stop codon context influences genome-wide stimulation of termination codon readthrough by aminoglycosides. Elife. 2020 Jan 23;9) untersuchten in Säugerzellen die Wirkung einer Aminoglykosid-Behandlung auf eine genomweite Art und Weise Stimulierung des Durchlesens einer Reihe von PTCs, die von der Zelle als regulatorischer Mechanismus verwendet werden, um Proteinisoformen zu produzieren, sowie das Durchlesen von normalen Terminationscodons, die die Translation von Histonen und Histon-modifizierenden Enzymen fehlregulieren.
Um die Nachteile von nicht-diskriminierenden PTC-Read-Through Arzneimitteln zu umgehen, dachten die Erfinder daran, eine systemische Therapie für alle Patienten zu entwickeln, die die LAMB3635X-PTC-Mutation tragen, insbesondere für diejenigen, die eine Homozygotie für diese PTC-Mutation aufweisen. Die Translationsgenauigkeit ist nicht absolut und in einem kleinen Prozentsatz der Translations-Ablesungen ermöglicht dies ein basales endogenes Durchlesen von PTC-mRNAs (von 0,1% bis 0,01). Frühe Studien haben gezeigt, dass ribosomale Proteine das Durchlesen von PTC-mRNAs modulieren können, aber es wurden keine Spezifitäten für bestimmte PTC-mRNAs berichtet. Daher verwendeten die Erfinder das 2SSRS-Screening-Tool, um mögliche ribosomale Protein-Targets zu identifizieren, die als ribosomale Wirkstoff-Targets dienen könnten, die spezifisch für die systemische Reparatur des LAMB3R635XPTC-Gendefekts sind (siehe Bauer et al., 2013 für Details).
Auf diese Weise identifizierten die Erfinder das ribosomale Protein rpL35 als ribosomales Zielprotein (TRP) für eine maßgeschneiderte Erhöhung der Proteinexpression in voller Länge von Lamb3R635XPTC, jedoch nicht derjenigen anderer PTC-mRNAs, die als Kontrolle verwendet wurden und ohne beobachtbare Wirkung auf die veränderte Produktion von mRNAs ohne PTC-Mutation (Bauer et al., 2013). Das ribosomale Hefeprotein rpL35 ist ein strukturelles Homolog des humanen rpL35 und besetzt die identische Position auf der lösungsmittelzugänglichen Seite der großen ribosomalen 60S-Untereinheit in Hefe und humanem Ribosom, wo es an den Proteinausgangstunnel (PET) angrenzt. Daher untersuchten die Erfinder menschliches rpL35 als ein mögliches Wirkstoffziel, um die Erhöhung der Produktion von Lamb3-Protein voller Länge aus der LAMB3R635XPTC-mRNA zu steuern.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder die zugelassenen Wirkstoffe Atazanavir und Artesunat als Kandidaten für kleine Molekülbinder von Hefe und menschlichem rpL35 identifiziert. Repurposable Wirkstoffe sind attraktive Moleküle zum Testen auf Ligandenbindungseigenschaften an Zielproteinen, die wie rpL35 als molekularer Schalter zur Reparatur eines Krankheitszustands fungieren. Zunächst verwendeten die Erfinder molekulare Andockwerkzeuge, um Bindungsstellen von Atazanavir und Artesunat auf Hefe-rpL35 bzw. menschlichem rpL35 zu sondieren. Die in-silico-Modelle zeigten, dass überlappende Bindungscluster beider Moleküle entlang der Längsachse von Hefe-rpL35 und menschlichem rpL35 verstreut sind, wobei ein gemeinsamer prominenter Bindungscluster auf die N-terminale Stelle von rpL35 abzielt, flankiert vom N-terminalen Sequenztrakt von rpL35. Diese Ergebnisse ermutigten zu einer detaillierteren in-vitro-Analyse. Die Interaktion von menschlichem rpL35 mit kleinen Molekülen wurde durch NMR-Titrationsreihen bewertet. Die Analyse der Veränderungen in den NMR-Spektren in Gegenwart von kleinen Molekülen für sowohl Atazanavir als auch Artesunat zeigte, dass beide RPL35-Kandidatenliganden menschliches rpL35-Protein an mehreren möglichen Bindungstaschen binden, wie durch NMR-Aminosäure-Verschiebungssignale definiert. Ein solches Epitop wird durch die Aminosäurezusammensetzung definiert, die eine komplementäre elektrostatische Oberfläche für die Wechselwirkung zwischen kleinen Molekülen Atazanavir und Artesunat bereitstellt. Das Bindungsepitop wurde entweder auf die N-terminale Stelle, einschließlich des flexiblen Schwanzes der N-terminalen Sequenz, und die mehr C-terminale Stelle (mit kleiner Helix 3) eingeengt. Durch Kombination der Ergebnisse aus NMR-Titrationsanalyse, bioinformatischen Docking-Studien an Hefe und menschlichem rpL35 und der räumlichen Anordnung von rpL35 im Ribosom schlussfolgern die Erfinder, dass die günstigste Bindungsstelle für Atazanavir und Artesunat das N-terminale Epitop ist, das von den Aminosäuren A6, L9, R10, G11, K13, E15, an der rpL35-N-terminalen Stelle gebildet wird, und den Aminosäuren T64, Q65, E67, N68 und L69 von Helix zwei (4B). Obwohl die chemischen Strukturen von Artesunat und Atazanavir nicht identisch sind, sind ihre Gesamteigenschaften (Oberflächenladungsverteilung, Form) ähnlich. Beide haben einen negativ geladenen Lappen im Zentrum des Moleküls und eine relativ hohe Flexibilität in Lösung, was ihre engere Interaktion mit dem Protein-Target ermöglichen könnte. Die Erfinder konnten ein Arzneistoffbindungsmuster erkennen, das auf meist identische Aminosäuren abzielt, wenn auch mit unterschiedlichen Koordinationsparametern. ( ). Die Untersuchung von rpL35 am Ribosom legt nahe, dass für rpL35 in seinem natürlichen Zustand und integriert in das Ribosom das Epitop der N-terminalen Stelle sowohl für Atazanavir als auch für Artesunat zugänglich ist (siehe auch oben für „Fragmente“).
Hier haben die Erfinder Beweise dafür erhalten, dass das menschliche ribosomale Protein rpL35 zwei etablierte Wirkstoffe bindet. Der erste, Artesunat, gehört zur Familie der Artemisinine. Artemisinine sind pflanzliche Verbindungen, die als Antimalariamittel mit einem gut etablierten Sicherheitsprofil dienen. Der zweite, Atazanavir, ist ein synthetisches Tripeptid-Derivat, das zur Behandlung von HIV-Infektionen verwendet wird, jedoch für eine Reihe von Nebenwirkungen bekannt ist. Es gibt mehrere Beobachtungen, die eine maßgeschneiderte Wirkung eines rpL35-Liganden auf eine maßgeschneiderte Erhöhung von LAMB3R635X-PTC unterstützen. Erstens ist das Ribosom kein statischer hochmolekularer Komplex, der für die Proteinsynthese von mRNAs verwendet wird. Vielmehr wurde berichtet, dass subtile Veränderungen in der Zusammensetzung des Ribosoms das Gesamtenergieprofil verändern, was sich auf die Translationsrate nur einer oder eines ausgewählten Satzes von mRNAs auswirken kann (Choi J, Grosely R, Prabhakar A, Lapointe CP, Wang J , Puglisi JD. How Messenger RNA and Nascent Chain Sequences Regulate Translation Elongation. Annu Rev Biochem. 2018 Jun 20;87:421-49. Larsen KP, Choi J, Prabhakar A, Puglisi EV, Puglisi JD. Relating Structure and Dynamics in RNA Biologie, Cold Spring Harb Perspect Biol. 2019 Jul 1; 11(7) Prabhakar A, Puglisi EV, Puglisi JD. Single-Molecule Fluorescence Applied to Translation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2019 Jan 2; 11(1)). Zweitens häufen sich Berichte über ribosomale Proteine als Modulatoren der maßgeschneiderten Proteinproduktion (Shi Z, Fujii K, Kovary KM, Genuth NR, Röst HL, Teruel MN, et al. Heterogeneous Ribosomen Preferentially Translate Distinct Subpools of mRNAs Genome-wide. Mol Cell 6. Juli 2017;67(1):71-83.e7.Sloan KE, Warda AS, Sharma S, Entian KD, Lafontaine DLJ, Bohnsack MT. Tuning the ribosome: The influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol. 2017 Sep 2; 14 (9): 1138-52. Genuth NR, Barna M. The Discovery of Ribosome Heterogeneity and Its Implications for Genre Regulation and Organismal Life. Mol Cell. 2018 Aug 2; 71 (3): 364 -74). Drittens beobachten die Erfinder, dass die Bindung von Artesunat bzw. Atazanavir eine ansonsten flexiblere Konfiguration des rpL35-Proteins einfriert. Dies würde die Hypothese unterstützen, dass die Bindung dieser Medikamente auf subtile, aber effektive Weise die Energielandschaft des Translationsribosoms verändert, um die Erhöhung der basalen Durchleseraten für LAMB3R635XPTC und damit die Produktion des Lamb3-Proteins in voller Länge anzupassen. Gegenwärtig erfolgt dieser Effekt entweder durch eine Erhöhung der Elongationsraten für die LAMB3-mRNA, wodurch die Zeit für die Erkennung des PTC verkürzt wird, oder durch eine Änderung der rpL35-Interaktion mit dem Polypeptid-Ausgangstunnel, von dem berichtet wurde, dass er zur PTC-Erkennung in bakteriellen Ribosomen beiträgt oder ist ein komplexer Effekt.
Die Erfinder schlussfolgern, dass die hier identifizierte Wechselwirkung von Artesunat und Atazanavir mit humanem rpL35 die Leistungsfähigkeit des 2SSRS-Screens zur Identifizierung eines ribosomalen Zielproteins rpL35 und von Kandidatenwirkstoffen zeigt, die mit rpL35 so interagieren, dass eine maßgeschneiderte Steigerung der Produktion von Volllängen-Protein von vererbten PTC-Mutanten und andere mRNA-Veränderungen, wie angegeben, erreicht werden können. Es schafft die Voraussetzungen für die funktionelle Analyse dieser Verbindungen in Hefezellen, in humanen HeLa-Zellextrakten und im Allgemeinen in humanen Zellen, die so aufgebaut sind, LAMB3R635XPTC im homozygoten Zustand zu enthalten. Im Fall der Erfinder zeigen diese Experimente das Potenzial der niedermolekularen rpL35-Liganden Artesunat bzw. Atazanavir, als molekularer Schalter für rpL35 zu fungieren, um die erhöhte Produktion von Lamb3-Protein voller Länge aus einer LAMB3R635XPTC-mRNA zu steuern.
Die vorliegende Erfindung betrifft bevorzugt die folgenden Gegenstände. Gegenstand 1. Verfahren zur Identifizierung einer pharmazeutisch aktiven Verbindung, welche die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Zelle eines Säugetiers moduliert, umfassend a) in Kontakt bringen von rpL35 oder eines funktionellen Fragments davon mit mindestens einer Kandidatenverbindung in der Anwesenheit der mindestens einen mRNA die translatiert werden soll, und b) Nachweisen der Modulation der Translation der mindestens einen mRNA verglichen mit der Translation in der Abwesenheit der mindestens einen Kandidatenverbindung, wobei eine Modulation der Translation der mindestens einen mRNA eine pharmazeutisch aktive Verbindung anzeigt.
Gegenstand 2. Verfahren nach Gegenstand 1, weiterhin umfassend eine Vor-Identifizierung der Translation der mindestens einen mRNA als rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängig.
Gegenstand 3. Verfahren nach Gegenstand 1 oder 2, wobei die Modulation zu einer Zunahme oder Abnahme der rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängigen Translation der mindestens einen mRNA führt.
Gegenstand 4. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 3, wobei die mindestens eine mRNA ein vorzeitiges Terminationskodon (PTC) umfasst, vorzeitiger Translationstermination unterzogen wird, programmiertes -1 ribosomales Frameshifting (-1PRF) verursacht oder eine polycistronische mRNA ist.
Gegenstand 5. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 4, weiterhin umfassend das Nachweisen einer Bindung der mindestens einen Kandidatenverbindung an rpL35, bevorzugt an ein isoliertes oder teilweise isoliertes rpL35 oder an rpL35 im Kontext der ribosomalen Untereinheit oder im Kontext beider Untereinheiten des Säugetier-Ribosoms.
Gegenstand 6. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 4, weiterhin umfassend das Nachweisen einer Bindung der mindestens einen Kandidatenverbindung an ein Fragment von rpL35, wobei das Fragment von ungefähr 70 bis ungefähr 100 der N-terminalen Aminosäuren des Säugetier-rpL35, bevorzugt gemäß SEQ ID NO: 3, umfasst.
Gegenstand 7. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 6, wobei das Nachweisen der Bindung ein Nachweisen einer Interaktion der mindestens einen Kandidatenverbindung mit einer Aminosäureregion von rpL35 ausgewählt aus der Basis von Helix 2, der Schleife über Helix 3, L9, K13, E15, E67, L69, L95, K97, E99, E100, L102, dem Set von L9, K13, E15, E67 und L69 und dem Set von L95, K97, E99, E100 und L102 umfasst.
Gegenstand 8. Verfahren nach einem der Gegenstände 5 bis 7, wobei das Nachweisen der Bindung an rpL35 oder dem Fragment davon als ein Vor-Screening vor dem in Kontakt bringen der mindestens einen Kandidatenverbindung mit dem rpL35 durchgeführt wird.
Gegenstand 9. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 8, weiterhin umfassend einen Vor-Selektionsschritt umfassend eine molekulares Modeling der Bindung der mindestens einen Kandidatenverbindung an rpL35 oder eines Fragments davon, zum Beispiel unter der Verwendung eines Computerprogramms, wie zum Beispiel SwissDock.
Gegenstand 10. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 9, wobei das rpL35 oder Fragment davon humanes rpL35 ist.
Gegenstand 11. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 10, wobei das Verfahren in vitro, in Zellkultur oder in vivo durchgeführt wird, bevorzugt in einem nicht-menschlichen Säugetier.
Gegenstand 12. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 11, wobei die Kandidatenverbindung ausgewählt ist aus einer chemischen Substanz, einer Substanz ausgewählt aus einer Peptidbibliothek, einer Bibliothek von kleinen organischen Molekülen, einer kombinatorischen Bibliothek, einem Zellextrakt, insbesondere einem Pflanzen-Zellextrakt, einem „Wirkstoff mit kleinem Molekulargewicht“, einem Protein und/oder einem Proteinfragment und einem Antikörper oder Fragment davon und insbesondere von Atazanavir und Derivaten davon und Artemisinin und Derivaten davon.
Gegenstand 13. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 12, wobei die mindestens eine mRNA für ein Protein kodiert, das Epidermolysis bullosa, virale Infektionen, insbesondere retrovirale Infektionen, wie zum Beispiel HIV-1 oder Coronavirus, wie SARS CoV2, verursacht oder damit assoziiert ist, wie zum Beispiel LAMB3.
Gegenstand 14. Screeningsystem zur Identifizierung einer pharmazeutisch aktiven Verbindung, welche die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugetierzelle moduliert, umfassend, eine eukaryontische Zelle, die rekombinant ein Säugetier-rpL35 oder ein Fragment eines Säugetier-rpL35 exprimiert, wobei das Fragment von ungefähr 70 bis ungefähr 100 der N-terminalen Aminosäuren von rpL35 umfasst, ein Expressionskonstrukt zur rekombinanten Expression von mindestens einer mRNA, die getestet werden soll, und gegebenenfalls, eine oder mehrere Kandidatenverbindungen, die getestet werden sollen.
Gegenstand 15. Screeningsystem nach Gegenstand 14, wobei die eukaryontische Zelle ausgewählt ist aus einer Hefe-, Insekten-, Nager- oder menschlichen Zelle.
Gegenstand 16. Screeningsystem nach Gegenständen 14 oder 15, wobei die eukaryontische Zelle eine Inaktivierungs- oder Depletionsmutante von rpL35 ist.
Gegenstand 17. Verbindung, welche die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugetierzelle moduliert, zur Verwendung in der Prävention oder der Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen verursacht durch i) eine mRNA umfassend ein vorzeitiges Terminationskodon (PTC), ii) eine mRNA, die vorzeitiger Translationstermination unterzogen wird, iii) programmiertem -1 ribosomalem Frameshifting (-1PRF), oder iv) der Expression einer polycistronischen mRNA.
Gegenstand 18. Verbindung zur Verwendung nach Gegenstand 17, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus einer chemischen Substanz, einer Substanz ausgewählt aus einer Peptidbibliothek, einer Bibliothek von kleinen organischen Molekülen, einer kombinatorischen Bibliothek, einem Zellextrakt, insbesondere einem Pflanzen-Zellextrakt, einem Wirkstoff mit kleinem Molekulargewicht, einem Protein und/oder einem Proteinfragment und einem Antikörper oder Fragment davon und insbesondere von Atazanavir und Derivaten davon und Artemisinin und Derivaten davon.
Gegenstand 19. Verbindung zur Verwendung nach den Gegenständen 17 oder 18, wobei die Erkrankung oder der Zustand ausgewählt ist aus Epidermolysis bullosa und viralen Infektionen, insbesondere retroviralen Infektionen, wie zum Beispiel HIV-1 oder Coronavirus, zum Beispiel SARS CoV2.
Gegenstand 20. Verfahren zur Modulierung der rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängigen Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugetierzelle, umfassend ein in Kontakt bringen der Zelle mit einer effektiven Menge an Atazanavir oder Derivaten davon und Artesunat oder Derivaten davon.
Gegenstand 21. Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung oder Zustands verursacht durch i) eine mRNA umfassend ein vorzeitiges Terminationskodon (PTC), ii) eine mRNA, die vorzeitiger Translationstermination unterzogen wird, iii) programmiertem -1 ribosomalem Frameshifting (-1PRF), oder iv) der Expression einer polycistronischen mRNA in einer Säugetierzelle, umfassend ein zur Verfügung stellen einer effektiven Menge von mindestens einer Verbindung, welche die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation der mRNA gemäß einem von i) bis iv) moduliert an einen Patienten oder ein Subjekt, das dieser Behandlung oder Prävention bedarf.
Gegenstand 22. Verfahren nach Gegenstand 21, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus einer chemischen Substanz, einer Substanz ausgewählt aus einer Peptidbibliothek, einer Bibliothek von kleinen organischen Molekülen, einer kombinatorischen Bibliothek, einem Zellextrakt, insbesondere einem Pflanzen-Zellextrakt, einem Wirkstoff mit kleinem Molekulargewicht, einem Protein und/oder einem Proteinfragment und einem Antikörper oder Fragment davon und insbesondere von Atazanavir und Derivaten davon und Artemisinin und Derivaten davon.
Gegenstand 23. Verfahren nach Gegenstand 21 oder 22, wobei die Erkrankung oder der Zustand ausgewählt ist aus Epidermolysis bullosa und viralen Infektionen, insbesondere retroviralen Infektionen, wie zum Beispiel HIV-1 oder Coronavirus, zum Beispiel SARS CoV2.
Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren weiter beschrieben, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden alle hier zitierten Referenzen durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.

1 zeigt eine schematische Übersicht über den Ansatz der vorliegenden Erfindung im Fall einer PTC-mRNA.
2 zeigt einen schematischen Überblick über den Ansatz der vorliegenden Erfindung im Fall einer viralen polycistronischen mRNA.
3 zeigt die Ergebnisse des blinden Andockens von Artesunat und Atazanavir an humane und Hefe-Orthologe von rpL35. Vom SwissDock-Online-Server erhaltene Cluster sind farbkodiert (rot - Artesunat; grün - Atazanavir) und auf einzelne Strukturen von humanem bzw. Hefe-rpL35 geplottet. Beide Proteinstrukturen wurden aus den Kryo-EM-Strukturen der ganzen Ribosomen isoliert (Armache JP, Jarasch A, Anger AM, Villa E, Becker T, Bhushan S, et al. Cryo-EM structure and rRNA model of a translating eukaryotic 80S ribosome at 5.5-A resolution. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Nov 16;107(46):19748-53; Natchiar SK, Myasnikov AG, Kratzat H, Hazemann I, Klaholz BP. Visualization of chemical modifications in the human 80S ribosome structure. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):472-77) und die Figur wurde mit PyMOL erstellt (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.2r3pre, Schrödinger, LLC)
4 zeigt die Bindungsdomänen von humanem rpL35 für Artesunat und Atazanavir basierend auf der Analyse von NMR-Titrationsdaten. A: Primäre Sequenzen von beiden, humanem (Natchiar SK, Myasnikov AG, Kratzat H, Hazemann I, Klaholz BP. Visualization of chemical modifications in the human 80S ribosome structure. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):472-77) (SEQ ID NO: 3) und Hefe- (Armache JP, Jarasch A, Anger AM, Villa E, Becker T, Bhushan S, et al. Cryo-EM structure and rRNA model of a translating eukaryotic 80S ribosome at 5.5-A resolution. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Nov 16;107(46):19748-53), (SEQ ID NO: 4) Varianten von rpL35. Beide potentiellen Bindungsstellen sind in der Sequenz bezeichnet und zeigen auch die konservierten Aminosäuren. B: Beide Möglichkeiten der Koordination von Artesunat und Atazanavir sind auf der dreidimensionalen Struktur von rpL35, isoliert aus der Kryo-EM-Struktur des menschlichen Ribosoms, aufgetragen.
5 zeigt die Koordination von Artesunat und Atazanavir an der N-terminalen Domäne, die den flexiblen N-terminalen Schwanz, den oberen Teil von Helix1 und den zentralen Teil von Helix2 umfasst. A: Artesunat dockt an die N-terminale Region von rpL35 an. Abstände zwischen funktionellen Gruppen, die für elektrostatische Wechselwirkungen mit Sauerstoffeinheiten von Artesunat verfügbar sind, sind dargestellt. B: Ergebnisse des Andockens des Atazanavir-Moleküls in die N-terminale Region von rpL35. Mögliche elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Ligand und Zielprotein sind gezeigt. C: Überlagerung von Bindungsstellen für Artesunat bzw. Atazanavir im N-terminalen Bereich. Aminosäuren, die nur an der Interaktion mit Artesunat beteiligt sind, sind dunkelgrau hervorgehoben, der Rest, der nur mit Atazanavir (L69) interagiert, ist schwarz und die gemeinsamen Aminosäuren sind in hellerem Grau dargestellt
6 zeigt Ergebnisse von in-vivo dualen Luciferase-Reporter-Readouts von behandelten und unbehandelten Zellen. Luciferase-Readoutdaten sind normalisiert dargestellt, gegen die einzelnen Luciferase-Reporter-(Ren, Lamb3-FF, Lamb3-PTC-FF)-Readouts im unbehandelten Zustand eingestellt auf 100 % (Normalisator); für die Renilla-Kontrolle - der unbehandelte Zustand - sind Mittelwert und Standardabweichung der Quantifizierungen von zwölf biologischen Replikaten mit jeweils sechs technischen Replikaten (72 Reads) gezeigt. Für die Lamb3-FF-Kontrolle - den unbehandelten Zustand - werden Mittelwert und Standardabweichung der Quantifizierungen von sechs biologischen Replikaten mit jeweils sechs technischen Replikaten (36 Reads) gezeigt. Für die Lamb3-PTC-Kontrolle - den unbehandelten Zustand - werden Mittelwert und Standardabweichung der Quantifizierungen von zwei biologischen Replikaten mit jeweils sechs technischen Replikaten (12 Reads) gezeigt. Die Quantifizierung nach Behandlung mit ART bzw. ATZ für sowohl Ren (216 Reads) und Lamb3-FF (105 Reads) wird durch Kombination der ausgelesenen Daten gezeigt, die durch Behandlung mit jeweils 2, 4 und 10 µM ART und ATZ (behandelt) erhalten wurden, und wird auf die jeweilige unbehandelte Kontrolle (Normalisator) normalisiert. Für Luciferase-Reporter-Readouts von Lamb3-PTC-FF, die mit 2 µM, 4 µM bzw. 10 µM ART bzw. ATZ behandelt wurden, sind Mittelwert und Standardabweichung der Quantifizierung von zwei biologischen Replikaten für ART (12 Reads) und drei biologischen Replikaten für ATZ (18 Reads), mit jeweils sechs technischen Replikaten, auf Lamb3-PTC-FF-Regelung normalisiert, dargestellt
7 zeigt die normalisierte Darstellung des Effekts von ribosomaler Protein rpL35-Depletion auf die erhöhte Produktion des Volllängen-Lamb3PTC. Die Produktion von dualen Luciferasereporter-Proteinpaaren REN//Lamb3FF und REN//Lamb3PTC wurde durch Luciferaseassay im Extrakt von Diploid-Tetraden-Derivatives (DTDs) gemessen, die durch genetische Manipulation erhalten wurden, um diploiden Nachwuchs aus diploiden Elternstämmen zu erzeugen, die für eine Depletion im RPL35 Gen (35 A oder 35B) heterozygote waren; jeder Test wurde in 6 technischen Replikaten und in drei biologischen Replikaten (DTD1, DTD2 und DTD3) durchgeführt. Daten von den individuellen Reportern, REN, Lamb3-FF und Lamb3PTC-FF wurden gesammelt. In Zellen mit Wildtyp-Genotyp gesammelte Readout-Daten wurden als Normalisatoren verwendet und mit den in den Deletionsvarianten der DTDs (durch Δ angegeben) erhaltenen Readout-Daten verglichen. Gestrichelte Linien zeigen Normalisierung an. Die Einheit auf der X-Achse ist normalisiert zu Renilla-Kontrolle in Prozent ([%]). A) DTD1, B) DTD2, C) DTD3.

Beispiele
Für PTC-Mutationen bei EB, insbesondere nicht für gs-JEB, steht keine zugelassene zielgerichtete systemische Therapie zur Verfügung. Das Targeting ribosomaler Proteine (RP) bietet neue Wege zur Behandlung schwerer Erbkrankheiten, wie EB. In Hefe- und Humanzellen können Subpopulationen von zytoplasmatischen Ribosomen erzeugt werden, indem eine veränderte funktionelle Verfügbarkeit einzelner ribosomaler Proteine bereitgestellt wird. Solche heterologen oder spezialisierten Ribosomen sind darauf zugeschnitten, die Proteinexpression ausgewählter mRNAs zu erhöhen oder zu verringern, während die Expression der Masse an Proteinen unverändert bleibt. Die vorliegende Erfindung erforscht, dass an rpL35 bindende kleine Moleküle gefunden werden können, die neue Wege für die Behandlung von schweren Erbkrankheiten wie EB bieten.
In den vorliegenden Beispielen wird daher die Bindung und Art der Wechselwirkung eines kleinen Moleküls mit dem rpL35-Protein durch Titration analysiert, wie durch spezifische Wechselwirkung durch NMR-Spektroskopie in Lösung verfolgt. Dies liefert einen Machbarkeitsnachweis für die Wirkstoffentwicklung von kleinen Molekülen, die an das ribosomale Zielprotein rpL35 binden, das beispielhaft als ribosomaler Schalter zur Erhöhung der Proteinproduktion des Lamb3PTC-Proteins voller Länge in gs-JEB identifiziert wurde.
Materialien und Methoden
Molekulare Dockingstudien
Die Struktur von rpL35 wurde aus der komplexen Kryo-EM Struktur des humanen Ribosoms herausgetrennt (Natchiar SK, Myasnikov AG, Kratzat H, Hazemann I, Klaholz BP. Visualization of chemical modifications in the human 80S ribosome structure. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):472-77.), und die rpL35 PDB Datei wurde in die Swiss Dock (SwissDock Datenbank (http://www.swissdock.ch/) hochgeladen. Die elektrostatische Oberfläche des rpL35 Proteins wurde durch Ermittlung mittels der UCSF Chimera Software (Petersen et al., J Comput Chem, 2004) eingestellt auf pH und Ladung der jeweiligen Aminosäureseitenketten unter der Verwendung der Adaptive Poisson-Boltzmann Solver (APBS) Funktion bestimmt.
Anschließende Dockingstudien wurden durch Scannen der Struktur auf niedermolekulare Bindemoleküle durchgeführt (SwissDock), was die besten Hits für die Affinitätskinetiken basierend auf den ΔG Werten und den erhältlichen Strukturen aus der Swissdock Datenbank ergab.
Die besten Hits wurden isoliert und auf strukturelle Analoga hin überprüft, um praktisch erhältliche Moleküle zu ermitteln, die die Erfinder in in vitro Bindungsstudien testen könnten. Der am meisten versprechende rpL35 Bindungskandidat war CPG53820, ein unmittelbarer Vorläufer von Atazanavir, einem käuflich erhältlichen Wirkstoff, der für die weitere Analyse verwendet wurde. Ein Screening-Biotinylierungstest ergab Artesunat als einen Binder von menschlichem rpL35 (Ravindra KC, Ho WE, Cheng C, Godoy LC, Wishnok JS, Ong CN, et al. Untargeted Proteomics and Systems-Based Mechanistic Investigation of Artesunate in Human Bronchial Epithelial Cells. Chem Res Toxicol. 2015 Oct 19;28(10):1903-13). Auf analoge Weise zu dem Docking von Atazanavir sondierten die Erfinder die Bindung von Artesunat an menschliche und Hefe rpL35-Proteine. Diese in silico Analyse ermutigte Studien, um die Bindung der kleinen Moleküle an rpL35 in Lösung zu untersuchen, was der in vivo Situation nahekommt. Die Erfinder entschieden sich für Proteinlösungs-NMR Spektroskopie, da diese die Dynamiken der Ligandenbindung wiederspiegelt und über die rpL35 Reste informiert, die an der Ligandeninteraktion beteiligt sind.
Molekulares Klonieren
Der offene Leserahmen, der für C-terminal His₆-markiertes menschliches rpL35 (NCBI ID: 11224) kodierte, wurde aus einen verifizierten Vektor unter der Verwendung der Primer F-5'CATGCCATGGC-CAAGATCAAGGCTC'3 (SEQ ID NO: 1) und R-5'CTCTAGATTCAGTCAGATCTCAGTG'3 (SEQ ID NO: 2), die jeweils die Restriktions-Konsensussequenzen für NcoI und Xbal enthielten, PCR amplifiziert (PCR Bedingungen: 95°C -5 min, 42x [94°C - '30, 61°C - '30, 72°C - '30], 72°C - 10 min). Das erhaltene Amplikon wurde in den restriktions-linearisierten pMBP-Parallel 1 Expressionsvektor ligiert, der für die rekombinante Proteinexpression in E. coli vorgesehen ist. Das gentechnisch veränderte Expressionsplasmid enthält ein MBP-rpL35-His6-Doppel-Tag-Konstrukt mit einer TEV-Schnittstelle zwischen MBP und rpL35. Die Expression des rekombinanten Proteins steht unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren T7-Promotors und eines Ampicillin-Selektionsmarkers. Vektorsequenzen wurden durch ein Sequenzierungskonstrukt kontrolliert.
Transformation und Expression
Die Transformation des Expressionsplasmids in die kompetenten E. coli-Zellen erfolgte mit der Hitzeschockmethode. Kurz wurden 50 µl chemisch kompetenter E. coli BL21-Zellen der log-Phase (NEB C2523H) mit 1 µl (1 mg/µl DNA) des entsprechenden Expressionsvektors gemischt, der die humane rpl35-Sequenz mit N-terminalem MBP-Tag und C-terminalem His6-Tag trug, inkubiert für 10 min auf Eis, gefolgt von einem 30-sekündigen Hitzeschock bei 42 °C, und 10 min Ruhen auf Eis. Zu der Transformationsmischung wurden 500 µl Luria-Bertani (LB) Medium gegeben und die Probe 1 h bei 37 °C vorkultiviert. Anschließend wurden 100 µl des Transformationsmixes auf Agarplatten ausplattiert, mit dem Selektionsmarker Ampicillin (100 µg/ml) ergänzt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Eine einzelne Kolonie wurde gepickt und in 20 ml LB-Medium überführt und 4 h bei 37°C, 180 U/min kultiviert. 2,5 ml dieser Kultur wurden in 250 ml LB-Medium überführt und bei 37°C (150 U/min) kultiviert, bis die optische Dichte (OD600) 0,6 erreichte. Die Kultur wurde 15 min bei 25°C (1500 g) zentrifugiert, und das Pellet wurde vorsichtig in 250 ml ¹⁵N isotopenmarkiertem Minimalmedium M9, pH-optimiert, resuspendiert (Cai et al., J Biomol NMR, 2016). Die Zellen wurden dann bei 37°C (150 U/min) für ca. 40 min kultiviert, bis OD600 0,8 erreicht hatte. Die Temperatur wurde auf 28°C gesenkt, und die Proteinexpression wurde mit IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Die Zellen wurden 18 Stunden bei 150 U/min kultiviert, wobei die minimale Zeit verwendet wurde, um eine ausreichende Expression des nativen zur Aggregation neigenden Proteins sicherzustellen, wobei eine Akkumulation von Aggregaten in Einschlusskörperchen vermieden wurde. Die Bakterienkultur wurde zentrifugiert (4 C, 4700 g, 1 h) und die Zellpellets wurden über Nacht bei -20 °C gelagert.
Proteinreinigung
Die Zellpellets wurden in 10 mL von 50 mM Na₂HPO₄, 300 mM NaCl, 0,1% Triton, pH 7,4 resuspendiert und bei 10 % Amplitude beschallt (maximale Leistung 10 W, Fisher Scientific™Model 705). Nach Zentrifugation (27000 g, 4 °C, 20 min) wurde das Lysat langsam auf eine 5 mL MBP Säule geladen (MBPTrap™ HP, GE Healthcare). Nach der Säulenequilibrierung wurde das MBP-rpL35-His₆ Fusionsprotein unter der Verwendung eines Elutionspuffergradienten von 0 bis 50%, ergänzt mit 10 mM Maltosekompetitor, eluiert. Die Reinheit und relative Konzentration wurden durch SDS-PAGE abgeschätzt (nicht gezeigt). Das Eluat wurde in 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 % Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol, 0,5 mM EDTA, pH 7,4 unter Verwendung von Amicon® Ultrazentrifugalfiltern (Merck) mit 10 kDa Cutoff eingebracht und auf 3 ml konzentriert. TEV-Protease (2,3 mg/ml) wurde in einem Volumenverhältnis von 1:100 zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, eine Bedingung, die ein Maximum an intaktem Protein ergab. Da jedoch der Großteil des gespaltenen rpl35-His6-Proteins schlecht löslich war, wurde chaotroper Puffer (20 mM Na₂HPO₄, 8 M Harnstoff, 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl, pH 7,4) verwendet, um die Proteinprobe vollständig aufzulösen. Diese lösliche Fraktion wurde auf eine HisTrap-Säule (GE Healthcare) geladen, mit dem Laufpuffer equilibriert, und Harnstoff wurde durch Zugabe von Rückfaltungspuffer vollständig eliminiert. Das Protein wurde mit einem 500 mM Imidazolgradienten eluiert und die Proteinreinheit wurde durch SDS-PAGE bestätigt. Vor den NMR-Messungen wurde die rpL35-His6-Proteinprobe in 20 mM Bis-Tris, 300 mM NaCl, 150 mM Glycin, Protease-Inhibitoren, 10 % D₂O, pH 6,0 unter Verwendung von Amicon® Ultrazentrifugalfiltern (Merck) mit 3 kDa Cutoff eingebracht und auf 350 µL konzentriert. Die Proteinkonzentration wurde durch UV-Vis-Spektroskopie bei 280 nm (Shimadzu 1800) bestimmt.
NMR Spektroskopie
NMR-Experimente wurden bei 25°C (298K) auf einem 700 MHz Bruker Ascend-Spektrometer aufgezeichnet, das mit einer kryogen gekühlten TCI-Sonde ausgestattet war. Alle Spektren wurden mit Topspin 3.5 verarbeitet und mit CARA 1.8.4.2 (Keller R. Optimizing the Process of Nuclear Magnetic Resonance Spectrum Analysis and Computer Aided Resonance Assignment. ETH Zürich; 2004) und NMRFAM-Sparky (Lee W, Tonelli M, Markley JL. NMRFAM-SPARKY: advanced Software for biomolecular NMR spectroscopy. Bioinformatics. 15. April 2015; 31(8):1325-7) analysiert. Die Konzentration von ¹⁵N markiertem rpL35-His₆ lag im Bereich von 200 bis 400 µM, und die Probe wurde in einem salztoleranten, auf Empfindlichkeit abgestimmten Schlitzröhrchen (Shigemi™) mit einem Gesamtvolumen von 170 µl gemessen.
Die NMR-Spektroskopie ist in der Lage, durch vergleichende Analyse von Protein vs. Protein + Kleines Molekül-Binder Bindungsstellen des kleinen Moleküls auf dem Protein zu beurteilen. In dieser anfänglichen Studie wurde die Affinität von rpL35 gegenüber Artesunat und Atazanavir durch eine einfache Titrationsserie festgestellt, in der die Erfinder Störungen chemischer Verschiebungen und Peakhöhen im 2D ¹H, ¹⁵N HSQC-Spektrum verfolgt haben. Aliquots von Artesunat/Atazanavir wurden in die Lösung von ¹⁵N rpL35 gegeben, wovon 2D ¹H, ¹⁵N HSQC-Spektrum unmittelbar nach der Ligandenzugabe aufgezeichnet wurde. Störungen der chemischen Verschiebungen des Proteins im ¹⁵N HSQC-Spektrum weisen auf Veränderungen der chemischen Umgebung von Amidgruppen hin, die durch die Bindung eines Liganden an das Proteinziel verursacht werden.
Nach der Artesunat-Protein-rpL35-Komplex-Titration haben die Erfinder 3D-Spektren derselben Probe unter Verwendung von ¹⁵N NOESY-HSQC, ¹⁵N TOCSY-HSQC, HNHA-Pulssequenzen aufgezeichnet. Die Erfinder extrahierten chemische Verschiebungen von Amid ¹H, ¹⁵N, HA, HB aus den oben erwähnten Spektren und verglichen gemessene Werte mit den durchschnittlichen chemischen Verschiebungen üblicher Aminosäuren in der biologischen Magnetresonanzdatenbank (BMRB; http://www.bmrb. wisc.edu). Bei der 3D ¹H, ¹⁵N NOESY-HSQC konzentrierten sich die Erfinder auch auf das Vorhandensein eines Wassersignals, das anzeigen kann, ob die Aminogruppe lösungsmittelzugänglich ist. An diesem Punkt der Studie verfolgten die Erfinder keine vollständige Resonanzzuordnung, gewöhnlich basierend auf einem Satz von 3D-Dreifachresonanzspektren (¹H, ¹⁵N, ¹³C), da dies ein doppelt isotopenmarkiertes Protein (¹⁵N, ¹³C) erfordert. Darüber hinaus behindert die Natur von rpL35, die einen hohen Grad an intrinsisch ungeordneten Regionen besitzt, die Aufnahme von hochauflösenden 3D-Dreifach-Resonanz-Experimenten in gewissem Maße, da die meisten Signale eine geringe Dispersion in der Protonendimension der Spektren aufweisen und viele Signale überlagert sind. Die Aufnahme des zuvor erwähnten grundlegenden Satzes chemischer Verschiebungen ermöglichte es den Erfindern jedoch, den Aminosäuretyp abzuschätzen da viele von ihnen recht charakteristische Werte aufweisen (z. B. Alanin, Threonin und Glycin). 3D ¹⁵N TOCSY-HSQC half den Erfindern, zwischen Aminosäuretypen zu unterscheiden, die ähnliche chemische NH-Verschiebungen aufweisen, wie Leucin, Lysin, Valin. Dieses Spektrum zeigt für jede Aminogruppe (eine Aminosäure) alle an ein Kohlenstoffatom gekoppelten Protonensignale, d.h. Protonen, die von einer aliphatischen Seitenkette stammen. Unter Verwendung dieses Ansatzes erhielten die Erfinder einen Satz von Proteinsignalen, die ihre Position im 2D ¹H¹⁵N-HSQC-Spektrum bei Wechselwirkung mit dem Liganden (Artesunat, Atazanavir) und Informationen über den wahrscheinlichsten Aminosäuretyp änderten. Die Erfinder kartierten diesen Satz zukünftiger Aminosäuren auf der Tertiärstruktur von menschlichem rpL35 und identifizierten somit eine „Hotspot“-Region, in der Artesunat bzw. Atazanavir angreifen. PDB-Dateien von Artesunat und Atazanavir wurden zuerst in Wasser mit der YASARA-Software minimiert und dann basierend auf den Ergebnissen der NMR-Titration mit der AutoDock Vina-Funktion der Chimera-Software (Trott O, Olson AJ. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. Journal of computational chemistry. 2010;31(2):455-61).
Bioinformatische Dockingstudien zeigen eine Bindung von Atazanavir an Hefe- und menschliches ribosomales Protein RPL35
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass für eine Entwicklung einer systemischen Therapie bei PTC-Erkrankungen, wie EB, auf das humane ribosomale Protein RPL35 abgezielt werden muss. Da Hefe und humanes ribosomales Protein auf Sequenzebene, Sekundär- und Tertiärstruktur und der räumlichen Anordnung auf dem Ribosom sehr ähnlich sind, entschieden sich die Erfinder für eine bioinformatische Docking-Analyse. Humanes rpL35 wurde als isolierte Form der Kryo-EM-Struktur des vollständigen Ribosoms verwendet (Natchiar SK, Myasnikov AG, Kratzat H, Hazemann I, Klaholz BP. Visualization of chemical modifications in the human 80S ribosome structure. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):472-77), und als vielversprechendster Ligandenkandidat wurde CPG53820 identifiziert, das eine optimale Bindungskinetik und einen ΔG-Wert von -8,3 kcal/mol zeigt. Der ΔG-Wert zeigt Protein-Ligand-Bindungseigenschaften im Bereich der optimalen Bindungskapazitäten an (Du, et al., 2016). ). CPG53820 ist ein unmittelbarer Vorläufer der Verbindung Atazanavir, einem von der FDA zugelassenen Medikament, und daher wurden weitere Studien mit diesem Molekül durchgeführt.
Das Andocken von Atazanavir an die Oberfläche von rpL35 zeigte dann mehrere Cluster möglicher Ligandenkoordination, die über die gesamte Länge des Proteins verstreut waren (3A), wobei sich ein prominenter Cluster an der Basis der längeren der beiden großen Alpha-Helices, Helix 2. Diese Ergebnisse legten nahe, potenzielle Bindungsstellen von Atazanavir auf Hefe-rpL35 zu untersuchen, das im Hefe-Screening-Tool 2SSRS als prospektives ribosomales Zielprotein für eine maßgeschneiderte Erhöhung der Lamb3PTC-Proteinexpression identifiziert wurde (Bauer et al., 2013). Auch hier wurde die Bindung von Atazanavir an mehreren Regionen des Hefe-rpL35-Proteins beobachtet, jedoch befindet sich der größte Cluster im zentralen Sequenztrakt von Helix 2 und erstreckt sich bis zur N-terminalen Region, die an Helix 2 angrenzt (3B).
Eine vergleichende Analyse der Bindung von Atazanavir an Hefe und humanem rpL35 zeigte dann, dass die Bindungscluster von Atazanavir bis zu einem gewissen Grad überlappen, dass jedoch auf der Ebene der In-silico-Analyse die prominenteste Gruppe von Clustern von an rpL35 gebundenem Atazanavir für Hefe und Mensch etwas unterschiedlich ist (3A, B).
Die Analyse der molekularen Interaktionen zeigt eine Bindung von Artesunat und Hefe- und menschliches ribosomales Protein RPL35
Ein Biotinylierungsassay identifizierte Artesunat, ein von der FDA zugelassenes Medikament, auch als Binder für humanes rpL35 (Ravindra, K.C., 2015). In Analogie zu den Atazanavir-Docking-Studien untersuchten die Erfinder die Bindung von Artesunat an menschliche und Hefe-rpL3 5-Proteine.
Für humanes rpL35 beobachteten die Erfinder mehrere Cluster von Artesunat-Bindung, wobei sich der prominenteste in der zentralen Region von Helix 2 befindet (3A). Für die Hefevariante wurden mehrere Cluster nachgewiesen, wobei der größte Cluster die Atazanavir-Helix 2 und die zentrale N-Terminus-Bindungsdomäne überlappte (3B).
Wenn die jeweiligen Bindungscluster von Atazanavir und Artesunat auf Hefe und humanem rpL35 verglichen werden, kartiert der stärkste Bindungscluster von Artesunat sowohl für Hefe als auch für humanes rpL35 auf die zentrale Domäne von Helix 2 und den flexiblen N-terminalen Sequenzteil (N-terminale Stelle). Für Atazanavir befindet sich der prominenteste Bindungscluster in humanem rpL35 an der Basis von Helix 2, während sich in Hefe die Mehrheit der gebundenen Moleküle an der N-terminalen Stelle befindet und mit den jeweiligen Bindungsstellen von Artesunat in beiden Proteinen überlappt. Darüber hinaus gibt es kleinere Sätze von gebundenem Atazanavir und Artesunat, die sowohl in Hefe als auch in menschlichem rpL35 nahe der C-terminalen Region des Proteins (Helix 3; siehe 3A, B) überlappen.
Diese erste molekulare Interaktionsanalyse durch Swissdock ermutigte Studien zur Untersuchung der Bindung von Kandidaten für Binder kleinen Molekulargewichts an humanes rpL35 in Lösung, was eher eine in-vivo-Situation widerspiegelt. Die Erfinder entschieden sich für die NMR-Spektroskopie in Proteinlösung, da diese die Dynamik der Ligandenbindung widerspiegelt und über die an der Ligandenwechselwirkung beteiligte rpL35-Aminosäure informiert.
NMR Spektroskopie
Eine anfängliche Untersuchung des Proteins durch 2D ¹H, ¹⁵N HSQC (Heteronukleare Einzelquantenkohärenz) ergab, dass rpL35-His₆ dazu neigt, lösliche Aggregate zu bilden, die von den Erfindern durch Zugabe des Detergens Natriumdodecylsulfat (bei einer Konzentration von 0,5%) gelöst wurden. Da die Anwesenheit von Detergens eine mögliche molekulare Wechselwirkung zwischen Protein und Ligand maskieren könnte, haben die Erfinder das Herstellungsprotokoll optimiert, um SDS durch einen Puffer mit hoher Ionenstärke (300 mM NaCl) sowie Glycin (150 mM) zu ersetzen. Die Anreicherung dieses Puffers mit Protease-Inhibitoren (cOmplete™ EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail, Roche, verwendet nach Herstellerangaben) verhinderte Aggregation und Präzipitation. Damit waren die Voraussetzungen für langfristige NMR-Experimente geschaffen.
In einem ersten Ansatz zeigte das 2D ¹H, ¹⁵N HSQC-Spektrum 95 aufgelöste Kreuzpeaksignale, was ungefähr 70 % von 136 Aminosäuren der rpL35-His₆-Sequenz entspricht. Dieser niedrigere Wert spiegelt sowohl die Natur der Proteinfaltung wider, die teilweise ungeordnet ist, als auch die Aminosäurezusammensetzung von rpL35, die eine beträchtliche Anzahl ähnlicher Aminosäuren enthält (26 Lysine, 17 Leuzine, 15 Arginine, 13 Alanine). Die intrinsisch ungeordnete Natur des rpL35-Proteins wird durch das Vorhandensein einer signifikanten Peaküberlappung im zentralen Bereich des Spektrums und der insgesamt eher schmalen spektralen Breite in der Protonendimension des Spektrums offensichtlich. Die Aggregatbildung von rpL35 wurde durch die Beobachtung ausgeschlossen, dass eine vergleichende Analyse des Haupt-HSQC-Spektrums und seines TROSY-Derivats keine zusätzlichen Peaks ergab, was die Bildung von hochmolekularen Spezies ausschließt.
Das ¹H,¹⁵N NOESY-HSQC-Spektrum ermöglichte es abzuschätzen, welche Amidpaare besser wasserzugänglich sind. Ungefähr 20 % der Peaks hatten keine NOE-Signale, die an Wasser in ihrer Nähe koppelten, was darauf hindeutet, dass sie stärker in der Proteinstruktur vergraben sind. Dies würde einem Rest an den Grenzflächen zwischen den Helices 1 und 2 entsprechen. Aus der Kombination der Ergebnisse verschiedener NMR-Experimente schließen die Erfinder, dass rpL35 in dem optimierten Puffer ein monomeres Molekül ist, das in Lösung hochdynamisch ist, jedoch eine stabile Konformation besitzt, die mit der rpL35 dreidimensionalen Struktur kompatibel ist, wie aus der Kryo-EM-Analyse berichtet (Natchiar SK, Myasnikov AG, Kratzat H, Hazemann I, Klaholz BP. Visualization of chemical modifications in the human 80S ribosome structure. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):472-77).
Die NMR Spektroskopie zeigt zwei Kandidatenregionen von rpL35 für die Interaktion mit Artesunat
Die für eine bestimmte Gruppe von Signalen bei Zugabe von Artesunat beobachteten Störungen der chemischen Verschiebung sind von ähnlicher Größe und weisen einen eher linearen Trend auf. Diese Reste sind wahrscheinlich an der gleichen Wechselwirkung beteiligt, d. h.an der Bindung des Artesunat-Moleküls. Basierend auf den chemischen Verschiebungen von Amid ¹H, ¹⁵N, HA und HB der gestörten Peaks haben die Erfinder Reste (4A) auf der 3D-Struktur von rpL35 aus der Kryo-EM-Struktur des Ribosoms kartiert (PDB: 6EK0 Natchiar SK, Myasnikov AG, Kratzat H, Hazemann I, Klaholz BP. Visualization of chemical modifications in the human 80S ribosome structure. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):472-77) und zwei alternative Kandidatenbindungsstellen identifiziert (4B). Der erste befindet sich am Schnittpunkt von Helixl, Helix2 und dem flexiblen N-Terminus-Schwanz, der eine kleine Spalte bildet. Diese N-terminale Region umfasst geladene Aminosäuren wie Glutamat, Arginin und Lysin, begleitet von hydrophoben Resten, einschließlich Leuzin, Alanin und Glycin. Insgesamt sehen die Erfinder klare Störungen bei 10 Proteinsignalen bei der Artesunat-Zugabe. Auf der N-terminalen Region von humanem rpL35 entsprechen diese Aminosäuren den experimentellen Daten der Erfinder: A6, eine von L9/L17/L18, R10, G11, eine von K12/K13/K14, E15 oder E16, T64, Q65, E67 und N68. Die zweite Stelle, die eine solche Kombination von Aminosäuren aufnehmen könnte, liegt näher am C-Terminus von rpL35, der von Helix3 und einer flexiblen Schleife in der C-terminalen Region gebildet wird. In diesem Fall beteiligen sich die folgenden Reste an der Interaktion zwischen menschlichem rpL35 und Artesunat: G75, K87 oder K97, T88, A90, zwei von R92/R93/R94/R89, E99, E100, L95 oder L102.
Die Position von rpL35 im Ribosom begünstigt die erste Bindungsstelle näher am N-Terminus, da diese gesamte Proteinregion eine von der Lösungsmittelseite her frei zugängliche Spalte bildet. Die C-terminale Region ist unterhalb der RNA stärker verheddert und macht diese sterisch für jede Interaktion mit kleinen organischen Molekülen weniger verfügbar (siehe 5C). Darüber hinaus ist rpL35 ein dynamisches Protein und enthält einen hohen Grad an Unordnung, die hauptsächlich in der C-terminalen Region akkumuliert wird. Diese Eigenschaften machen diese verfügbare Stelle für die Bindung kleiner Moleküle eher ungünstig, es sei denn, die Bindung von Artesunat induziert eine Änderung der Sekundär- und möglicherweise Tertiärstruktur. Eine solche Konformationsverschiebung würde jedoch stärker ausgeprägten Veränderungen des Spektrums entsprechen, die von den Erfindern nicht beobachtet wurden. Die Swissdock-Vorhersage der molekularen Wechselwirkungen zwischen Artesunat und sowohl menschliches als auch Hefe-rpL35 zeigte, dass die meisten Bindungsstellen an einer analogen Stelle zu der N-terminalen Region gruppiert waren, die mit den Experimenten der Erfinder definiert wurde (siehe 3A). Das Ergebnis des Andockens von Artesunat an die N-terminale Region von humanem rpL35 unter Verwendung von Chimera-Software ermöglichte es den Erfindern, die wahrscheinlichsten Reste einzugrenzen, die an der Interaktion beteiligt sind (5A): A6, R10, G11, K13, E15, L17, T64, Q65, E67 und N68. Überraschenderweise sind die meisten dieser Aminosäuren beim menschlichen und Hefeprotein konserviert (4A). Die Erfinder schlagen vor, dass diese rpL35-Reste mit Artesunat in Lösung wechselwirken.
Atazanavir teilt eine Bindungsstelle mit Artesunat
Die NMR-Titration von humanem rpL35 mit Atazanavir in Lösung löste ähnliche Veränderungen im HSQC-Spektrum aus. Im Fall von Atazanavir zeigten nur 5 Amidgruppen signifikante Störungen der chemischen Verschiebung im Vergleich zu 10 gestörten Signalen bei der Artesunat-Titration. Alle bis auf einen waren jedoch auch von der Artesunat-Titration betroffen. Einer der Peaks, #78, der Alanin entspricht (von dem angenommen wird A6 zu sein, basierend auf der Zuordnung von gestörten Signalen zur Proteinstruktur) erfuhr Änderungen seiner chemischen Verschiebung bei der Artesunat-Titration, zeigte jedoch nur eine Abnahme seiner Intensität im Atazanavir-Experiment. Dies kann durch zwei verschiedene Effekte erklärt werden, die durch die Zugabe eines der Liganden verursacht werden. Die Änderung der chemischen Verschiebung eines Peaks entspricht der Änderung seiner chemischen Umgebung, die durch die Wechselwirkung (elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindung) mit dem Arzneimittel verursacht wird. Die Abnahme der Intensität eines Peaks ist das Ergebnis einer Änderung des dynamischen Verhaltens dieses Atoms, seine chemische Austauschrate mit dem Lösungsmittel kann verändert werden, z.B. die aliphatische Masse des Liganden könnte den Amidwasserstoff abschirmen. Dies deutet darauf hin, dass Artesunat und Atazanavir die gleiche Bindungstasche teilen, sich jedoch die Rolle der einzelnen Aminosäuren, die an den Wechselwirkungen beteiligt sind, geringfügig unterscheidet. Beim Kartieren der Kandidatenreste auf die N-terminale Region wurden die folgenden Reste gefunden: einer von L9/L17/L18, einer von K12/K13/K14, E15 oder E16, E67 und L69. Von diesen schlagen die Erfinder vor, dass L9, K13, E15, E67 und L69 die am besten geeignete Tasche für Atazanavir bilden. Da die Ähnlichkeit der Spektren anzeigt, dass diese Bindungsstelle für Artesunat und Atazanavir nahezu identisch ist, suchten die Erfinder nach verfügbaren Resten in der C-terminalen Region, die auch den NMR-Störungsdaten der chemischen Verschiebung entsprechen könnten. Der Satz von L95, K97, E99, E100 und L102 befindet sich oberhalb von Helix3, in der unstrukturierten Schleife von rpL35.
Die Vorhersage von Atazanavir-Bindungsstellen an menschliches und Hefe-rpL35 durch SwissDock war nicht schlüssig, da sich die höchste Anzahl gebundener Ligandenmoleküle in unterschiedlichen Regionen der beiden Proteine befand (Basis von Helix2 in menschlichem und in der N-terminalen Zentralregion in Hefe; 3A-B). Wenn die Erfinder die Tatsache berücksichtigen, dass für Artesunat der größte Teil des Liganden sowohl in menschlichem als auch Hefe-rpL35 an einer Stelle lokalisiert ist (hier als N-terminale Region bezeichnet) und dass die Erfinder starke experimentelle Beweise dafür haben, dass die Bindungsstellen von Artesunat und Atazanavir überlappen, schlussfolgern die Erfinder, dass die N-terminale Region die plausiblere Interaktionsstelle von rpL35 mit beiden Arzneimitteln ist. Diese Stelle ist anscheinend für jeden Liganden freier zugänglich, da sie sich auf der Oberfläche des Ribosoms befindet und dem Lösungsmittel ausgesetzt ist (5C).
In funktionalen Hefetests bewirken Artesunat und Atazanavir gezielt den Anstieg der Produktion von Volllängen-LAMB3PTC
Der Nachweis einer arzneimittelgerichteten Manipulation von rpL35 zur selektiven Erhöhung der Lamb3-PTC-Expression in voller Länge muss in funktionellen Assays getestet werden. Die Erfinder entschieden sich, die Wirkung kleiner Moleküle zuerst in der vielseitigen Hefezellfabrik zu testen, wobei das duale Luciferase-Reportersystem verwendet wurde, das im ursprünglichen 2-SSRS (Bauer et al., 2013) verwendet wurde.
Wie in 6 gezeigt, gibt es bei der Behandlung mit kleinen Molekülen für den Renilla-Luciferase-Reporter bzw. den Lamb3-FF-Luciferase-Reporter keinen signifikanten Anstieg des Proteinexpressionsniveaus. Dies gilt sowohl für die Behandlung mit ART als auch für ATZ. Es gibt jedoch nach Behandlung mit 2 µM ART einen hochsignifikanten Anstieg (2,2-fach) der Lamb3-PTC-FF-Proteinexpression in voller Länge. ART. Bei Behandlung mit 4 µM ART (1,1-fach) und 10 µM ART (1,2-fach) wurde ein minimaler nicht signifikanter Anstieg der Lamb3-FF-Proteinexpression beobachtet. Es gibt einen hochsignifikanten Anstieg der Lamb3-PTC-FF-Proteinexpression in voller Länge bei Behandlung mit 2 µM ATZ (1,8-fach), einen ähnlichen, aber nicht signifikanten Anstieg bei Behandlung mit 4 µM ATZ (1,9-fach) und einen signifikanten Anstieg bei Behandlung mit 10 µM ATZ (2,2-fach)
Die Erfinder schlussfolgern, dass die rpL35-Liganden ART und ATZ eine Erhöhung der Proteinexpression in voller Länge von Lamb3-PTC-FF auslösen, jedoch nicht von Lamb3-FF oder Ren. Die fache Zunahme der Lamb3-PTC-FF-Expression in voller Länge liegt in dem Bereich, der für eine Änderung der Proteinexpressionsniveaus berichtet wird, die durch die Modulation ribosomaler Proteine ausgelöst wird, d. h. zweifach nach oben und zweifach nach unten, verglichen mit dem unveränderten Zustand. Zusammenfassend bestätigen diese Experimente, dass die Behandlung mit kleinen Molekülen, die als mutmaßliche Modulatoren eines bestimmten ribosomalen Proteins wirken, die Erhöhung der Proteinexpression einer ausgewählten mRNA-Spezies, die spezifisch durch dieses ribosomale Protein gesteuert wird, anpasst. Darüber hinaus bestätigen diese Experimente, dass die Behandlung mit kleinen Molekülen, die darauf abzielt, ein bestimmtes ribosomales Protein zu modulieren, eine selektive Behandlung ist, da sie die Expressionsniveaus eines Zielproteins, jedoch nicht der Kontrollproteine, maßgeschneidert steuert.
Vorläufige Ergebnisse zeigten auch die Expression der LAMB3-Expression in menschlichen Zellen die behandelt wurden unter Verwendung eines hochempfindlichen Instruments (Bruker TimsTOF Plus), da die revertierte Expression gemäß der vorliegenden Erfindung oft noch viel niedriger (z. B. 100-mal) niedriger ist als im Wildtyp.
Ribosomales Protein rpL35 ist ein robustes Target zum Screening
7 zeigt, dass die Depletion von rpL35A und Depletion von rpL35B nicht den Proteinexpressionsspiegel von REN und Lamb3-FF Luciferase-Reportern verändern. Jedoch beobachteten die Erfinder sowohl für die rpL35A Depletion als auch die rpL35B Depletion einen signifikanten Anstieg in den Proteinexpressionsspiegeln von Lamb3PTC-FF-Reporter. Die Analyse unter der Verwendung einer normalisierten Darstellung der Deletionsphänotypen zeigen, dass das ribosomale Protein rpL35, wie durch jedes der Paraloga rpL35A oder rpL35B kodiert, ein robustes Target zur Vermittlung der gezielt gesteuerten erhöhten Produktion von Volllängen-Lamb3 PTC Protein. Zusammengefasst unterstützt diese Untersuchung die Hypothese, dass das ribosomale Protein rpL35 ein robustes ribosomales Target-Protein für die gezielt gesteuerte erhöhte Produktion von Volllängen Lamb3 PTC Protein ist.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 7927791 [0005]
WO 2012/142542 [0006]
EP 2251437 [0026, 0030]
WO 2010/012687 A2 [0034]
WO 2011/030223 A2 [0034]
WO 2010/149215 [0034]

Claims

Verfahren zur Identifizierung einer pharmazeutisch aktiven Verbindung, welche die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Zelle eines Säugetiers moduliert, umfassend a) in Kontakt bringen von rpL35 oder eines funktionellen Fragments davon mit mindestens einer Kandidatenverbindung in der Anwesenheit der mindestens einen mRNA die translatiert werden soll, und b) Nachweisen der Modulation der Translation der mindestens einen mRNA verglichen mit der Translation in der Abwesenheit der mindestens einen Kandidatenverbindung, wobei eine Modulation der Translation der mindestens einen mRNA eine pharmazeutisch aktive Verbindung anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend eine Vor-Identifizierung der Translation der mindestens einen mRNA als rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängig.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Modulation zu einer Zunahme oder Abnahme der rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängigen Translation der mindestens einen mRNA führt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die mindestens eine mRNA ein vorzeitiges Terminationskodon (PTC) umfasst, vorzeitiger Translationstermination unterzogen wird, programmiertes -1 ribosomales Frameshifting (-1PRF) verursacht oder eine polycistronische mRNA ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiterhin umfassend das Nachweisen einer Bindung der mindestens einen Kandidatenverbindung an rpL35, bevorzugt an ein isoliertes oder teilweise isoliertes rpL35 oder an rpL35 im Kontext der ribosomalen Untereinheit oder im Kontext beider Untereinheiten des Säugetier-Ribosoms.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiterhin umfassend das Nachweisen einer Bindung der mindestens einen Kandidatenverbindung an ein Fragment von rpL35, wobei das Fragment von ungefähr 70 bis ungefähr 100 der N-terminalen Aminosäuren des Säugetier-rpL35, bevorzugt gemäß SEQ ID NO: 3, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Nachweisen der Bindung ein Nachweisen einer Interaktion der mindestens einen Kandidatenverbindung mit einer Aminosäureregion von rpL35 ausgewählt aus der Basis von Helix 2, der Schleife über Helix 3, L9, K13, E15, E67, L69, L95, K97, E99, E100, L102, dem Set von L9, K13, E15, E67 und L69 und dem Set von L95, K97, E99, E100 und L102 umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das Nachweisen der Bindung an rpL35 oder dem Fragment davon als ein Vor-Screening vor dem in Kontakt bringen der mindestens einen Kandidatenverbindung mit dem rpL35 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiterhin umfassend einen Vor-Selektionsschritt umfassend eine molekulares Modeling der Bindung der mindestens einen Kandidatenverbindung an rpL35 oder eines Fragments davon, zum Beispiel unter der Verwendung eines Computerprogramms, wie zum Beispiel SwissDock.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das rpL35 oder Fragment davon humanes rpL35 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Verfahren in vitro, in Zellkultur oder in vivo durchgeführt wird, bevorzugt in einem nicht-menschlichen Säugetier.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Kandidatenverbindung ausgewählt ist aus einer chemischen Substanz, einer Substanz ausgewählt aus einer Peptidbibliothek, einer Bibliothek von kleinen organischen Molekülen, einer kombinatorischen Bibliothek, einem Zellextrakt, insbesondere einem Pflanzen-Zellextrakt, einem „Wirkstoff mit kleinem Molekulargewicht“, einem Protein und/oder einem Proteinfragment und einem Antikörper oder Fragment davon und insbesondere von Atazanavir und Derivaten davon und Artemisinin und Derivaten davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die mindestens eine mRNA für ein Protein kodiert, das Epidermolysis bullosa, virale Infektionen, insbesondere retrovirale Infektionen, wie zum Beispiel HIV-1 oder Coronavirus, wie SARS CoV2, verursacht oder damit assoziiert ist, wie zum Beispiel LAMB3.
Screeningsystem zur Identifizierung einer pharmazeutisch aktiven Verbindung, welche die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugetierzelle moduliert, umfassend, eine eukaryontische Zelle, die rekombinant ein Säugetier-rpL35 oder ein Fragment eines Säugetier-rpL35 exprimiert, wobei das Fragment von ungefähr 70 bis ungefähr 100 der N-terminalen Aminosäuren von rpL35 umfasst, ein Expressionskonstrukt zur rekombinanten Expression von mindestens einer mRNA, die getestet werden soll, und gegebenenfalls, eine oder mehrere Kandidatenverbindungen, die getestet werden sollen.
Screeningsystem nach Anspruch 14, wobei die eukaryontische Zelle ausgewählt ist aus einer Hefe-, Insekten-, Nager- oder menschlichen Zelle.
Screeningsystem nach Anspruch 14 oder 15, wobei die eukaryontische Zelle eine Inaktivierungs- oder Depletionsmutante von rpL35 ist.
Verbindung, welche die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugetierzelle moduliert, zur Verwendung in der Prävention oder der Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen verursacht durch i) eine mRNA umfassend ein vorzeitiges Terminationskodon (PTC), ii) eine mRNA, die vorzeitiger Translationstermination unterzogen wird, iii) programmiertem -1 ribosomalem Frameshifting (-1PRF), oder iv) der Expression einer polycistronischen mRNA, wobei die Erkrankung oder der Zustand bevorzugt ausgewählt ist aus Epidermolysis bullosa und viralen Infektionen, insbesondere retroviralen Infektionen, wie zum Beispiel HIV-1 oder Coronavirus, zum Beispiel SARS CoV2.
Verbindung zur Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus einer chemischen Substanz, einer Substanz ausgewählt aus einer Peptidbibliothek, einer Bibliothek von kleinen organischen Molekülen, einer kombinatorischen Bibliothek, einem Zellextrakt, insbesondere einem Pflanzen-Zellextrakt, einem Wirkstoff mit kleinem Molekulargewicht, einem Protein und/oder einem Proteinfragment und einem Antikörper oder Fragment davon und insbesondere von Atazanavir und Derivaten davon und Artemisinin und Derivaten davon.
Verfahren zur Modulierung der rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängigen Translation von mindestens einer mRNA in einer Säugetierzelle, umfassend ein in Kontakt bringen der Zelle mit einer effektiven Menge an Atazanavir oder Derivaten davon und Artesunat oder Derivaten davon.
Verfahren zur Behandlung oder Linderung einer Erkrankung oder Zustands verursacht durch i) eine mRNA umfassend ein vorzeitiges Terminationskodon (PTC), ii) eine mRNA, die vorzeitiger Translationstermination unterzogen wird, iii) programmiertem -1 ribosomalem Frameshifting (-1PRF), oder iv) der Expression einer polycistronischen mRNA in einer Säugetierzelle, umfassend ein zur Verfügung stellen einer effektiven Menge von mindestens einer Verbindung, welche die rpL35 (rpL35/rpL29)-abhängige Translation der mRNA gemäß einem von i) bis iv) moduliert an einen Patienten oder ein Subjekt, das dieser Behandlung oder Prävention bedarf.