DE112004001054B4 - Sequenz für die BacillomycinD Synthese in Bacillus amyloliquefaciens FZB42 - Google Patents

Sequenz für die BacillomycinD Synthese in Bacillus amyloliquefaciens FZB42 Download PDF

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Abstract

Modulare DNA-Sequenz der nichtribosomalen Peptidsynthasen für die Synthese von BacillomycinD gekennzeichnet durch Sequenz (SEQ-ID-NO: 1), wobei die für die Synthese von BacillomycinD verantwortlichen Peptidsynthasen durch die Gene bmyA, bmyB und bmyC kodiert werden, die Bestandteil der modularen DNA-Sequenz sind.

Description

  • Die Erfindung betrifft die DNA- und Aminosäuresequenz des Bacillomycin D-Operons und die Verwendung der Sequenzen für die Biosynthese von antibiotisch wirksamen Lipopeptiden bzw. Verfahren zu deren Herstellung. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, die Biotechnologie, die Landwirtschaft und die pharmazeutische Industrie.
  • Aus Bacillus subtilis und verwandten Arten sind antifungal und hämolytisch wirksame Peptide isoliert und in der Literatur beschrieben worden. So ist DE 196 41 213 A1 zu entnehmen, dass Bacillus amyloliquefaciens DSM 10273 in der Lage ist die fungizide Substanz Bacillomycin D zu synthetisieren. Besondere Beachtung finden dabei die iturinartigen Verbindungen, bei denen es sich um zyklische Heptapeptide handelt, die über eine β-Aminosäure verknüpft sind und mit β-Fettsäure modifiziert sind. Charakteristisch für diese Verbindungen ist die folgende Anordnung der Stereospezifität der Aminosäuren: LDDLLDL. Bekannte Vertreter dieser Substanzklasse sind: IturinA, D und E, Bacillomycin L, D und F, Mycosubtilin und Bacillopeptin. Ähnlich wie z.B. Surfactin und Fengycin werden diese Lipopeptide nichtribosomal durch Multienzymkomplexe direkt nach einem Thiotemplate-Mechanismus synthetisiert. Die für die Biosynthese von Mycosubtilin (Duitman et al. 1999. The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633: a multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an aminotransferase, and a fatty acid synthase. PNAS 96: 13294-13299) und Iturin A (Tsuge et al. 2001. Cloning, sequencing, and characterization of the Iturin A operon. J. Bacteriol. 183: 6265-6273) in B.subtilis verantwortlichen Gencluster wurden beschrieben. Moyne et al. offenbart, dass in Bacillus subtilis AU195 Bacillomycin D via einer Multienzym-katalysierte Synthese produziert wird (Moyne et al. 2001, J. Appl. Microbiol. 90: 622-629.
  • Das verstärkte Auftreten von Antibiotika-resistenten pathogenen Mikroorganismen hat zu einer intensiven Suche nach neuen wirksamen antibakteriellen und antifungalen Verbindungen geführt. Von mindestens ebenso großer Bedeutung ist die Suche nach antiviralen Verbindungen. Dabei wird die Entdeckung neuer, geeigneter Naturstoffe immer schwieriger. Neben dem Screening von natürlichen Produzentenstämmen verspricht die kombinatorische Biosynthese eine effiziente Alternative für die Entwicklung neuer wirksamer Medikamente zu werden. Kombinatorische Biosynthese beruht auf der genetischen Manipulation von Biosynthesewegen „klassischer“ Antibiotika (z.B. von Lipopeptiden), die durch Polyketidsynthasen (PKS) bzw. nichtribosomalen Peptidsynthasen (NRPSs) synthetisiert werden. Polyketide und nichtribosomale Peptide sind zwei große Naturstoff-Familien, die zahlreiche klinisch bedeutsame Verbindungen beinhalten, z.B. antimikrobielle Verbindungen (Penicillin, Bacitracin, Erythromycin, Oleandomycin, Tylosin und Vancomycin), Immunsuppressiva (Cyclosporin, FK506 und Rapamycin) und Antitumorverbindungen (Doxorubicin, Bleomycin und Epothilone). Die meisten Entwicklungen der kombinatorischen Biosynthese basieren auf Verbindungen, die durch modulare PKSs synthetisiert werden. Daneben werden auch NRPSs und PKSs für die aromatische Polyketide für die kombinatorische Biosynthese eingesetzt.
  • Nichtribosomale Peptidsynthetasen, NRPSs weisen eine modulare Struktur auf, die die notwendigen funktionellen Einheiten repräsentieren. Entsprechend dem multiplen „thiotemplate“ Mechanismus der nichtribosomalen Peptidsynthese wird im 1. Schritt durch die Adenylierungs (A-) Domäne, das jeweilige Substrat erkannt, und durch ATP Hydrolyse zu dem korrespondierenden Adenylat aktiviert. Nachfolgend wird das aktivierte Substrat kovalent mit dem 4'- Phosphopantetheinyl (4'-PPan) Kofaktor gebunden, der seinerseits an einen konservierten Serin-Rest der Peptidyl-Carrierprotein (PCP) Domäne geknüpft ist. Die PCP-Domäne ist stromabwärts von der A-Domäne lokalisiert. Die postranslationale Modifikation der PCP-Domäne erfolgt durch eine 4'-PPan Transferase (PPtase). PPtasen sind mit den meisten NRPS Biosynthesegen-Clustern assoziiert. Während der Elongationsreaktion werden die PCP gekoppelten Präkursoren mit der nascenten Peptidkette durch die Kondensations- (C-) Domäne verbunden. Diese ist zwischen jedem konsekutivem Paar der aktivierten Einheiten lokalisiert. Zusätzlich zu A-, PCP- und C-Domäne sind weitere modifizierende Domänen in den Modulen, die modifizierte Reste inkorporieren, vorhanden. Die Freisetzung des kompletten Peptids durch Cyclisierung oder Hydrolyse wird durch eine Thioesteraseartige- (Te-) Domäne am COOH Terminus der letzten NRPS katalysiert. Als Konsequenz dieses linearen Assemblierungsmechanismus, wird die Primärsequenz und das Ausmaß der Modifikation des finalen NRPSs Produktes durch die Aufeinanderfolge der linearen Sequenz der katalytischen Domänen und Module bestimmt (Eppelmann et al. 2001. J.Biol. Chem. 276, 34824-34381).
  • Modulare PKSs und NRPSs sind polyfunktionelle „Megasynthasen“, die in repetitiven Einheiten oder „Modulen“ organisiert sind. Jedes Modul ist für einen diskreten Schritt der Polyketid- oder Polypeptidkettenverlängerung verantwortlich. Aufgrund dieser Modularität und weil jedes Modul eine katalytische Domäne kodiert, die die Wahl der nächsten Aminosäure bestimmt (einschließlich der Stereospezifität), ist es möglich, neue Verbindungen durch Manipulation der Domänen oder Module zu synthetisieren. Da die Strukturen von Polyketiden sehr komplex und reich an Stereozentren sind, erlaubt diese Technik die Manipulation von Verbindungen, die durch Anwendung konventioneller, chemischer Methoden schwer zu erhalten sind (E. Rodriguez and R. Daniel. 2001. Combinatorial biosynthesis of antimicrobials and other natural products. Current Opinion in Microbiology 4: 526-534). Voraussetzung für die Anwendung der kombinatorischen Neusynthese ist die Kenntnis der Gensequenzen, die für die erforderlichen PKSs und NRPSs kodieren und eines Wirtsstammes, der die stabile Expression großer heterologer DNA-Bereiche erlaubt.
  • Zum Beispiel erwies sich der srfA Deletion Stamm B.subtilis KE10, ein Derivat des Surfactin produzierenden Stammes B.subtilis ATCC21322, für die heterologe Expression eines 49 kb grossen Bacitracin Genclusters aus B.licheniformis, als geeignet (Eppelmann et al. 2001. Engineered biosynthesis of the peptide antibiotic Bacitracin in the surrogate host Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 276, 34824-34831). Weitere überzeugende Beispiele für die Möglichkeit kombinatorischer Lipopeptidsynthesen, insbesondere von Iturinverbindungen in genetisch zugänglichen, d.h. durch DNA Transformation transformierbaren Wirtsstämmen, vornehmlich des Genus Bacillus, sind aus der Literatur nicht bekannt.
  • Iturine, d.h. nichtribosomal synthetisierte Lipopeptide mit einer β-Aminofettsäuremodifikation, weisen Tyrosin in der D-Konfiguration an der 2. Position des ringförmigen Heptapeptids auf. Zwei zusätzliche D-Aminosäuren befinden sich an den Positionen 3 und 6. Sie besitzen eine starke antifungale und hämolytische, sowie eine begrenzte antibakterielle Aktivität. Die Struktur der Iturine Mycosubtilin, Iturin A und Bacillomycin D wird aus der ersichtlich. Für die Synthese der sehr ähnlichen Iturine IturinA und Mycosubtilin sind die verantwortlichen Gencluster (Operons) beschrieben. Für das Bacillomycin D, das gegenüber Iturin A in 4 von 7 und gegenüber Mycosubtilin in 3 von 7 Positionen der Peptidkette Abweichungen aufweist stand bisher die Sequenzinformation für die NRPS Synthesemodule noch aus. Massenspektroskopische Untersuchungen hatten gezeigt, dass durch FZB42 Bacillomycin D in der späten Wachstumsphase in einem Ammonium-Citrat-Medium synthetisiert wird (vgl. Beispiel 1).
  • Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde Gensequenzen von Polyketidsynthasen (PKS) bzw. nichtribosomalen Peptidsynthasen (NRPSs) bereitzustellen, die für kombinatorische Lipopeptidsynthesen eingesetzt werden können.
  • Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Ein wesentlicher Teil der Erfindung wird durch die Sequenz in den Ansprüchen 1 und 2 repräsentiert.
  • Im Verlauf der Genomanalyse des phytostimulatorischen Rhizobakteriums Bacillus amyloliquefaciens FZB42 (Idriss et al. 2002. Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant growth promoting effect. Microbiology 148,2097-2109) konnte überraschend das Genomcluster, das für die Synthese des Iturins Bacillomycin D kodiert, identifiziert werden. Eine Mutante mit spezifischer Insertion einer Antibiotikaresistenzkassette im bmyA Gen, war unfähig zur Bacillomycin D Biosynthese (Beispiel 6).
  • Während die flankierenden Gene sowie das bmyD und das bmyA Gen 98% Sequenzübereinstimmung (auf Proteinebene) mit den korrespondierenden Genen des IturinA Biosynthese von B.subtilis RB14 aufweisen sind der 3’Bereich des bmyB Gens und das gesamte bmyC Gen variabel. Entsprechend der Colinearitätshypothese (Übereinstimmung der Anordnung der Gen-Module mit der Peptidsequenzfolge) befinden sich hier die für die Verknüpfung des Peptids mit den abweichenden Aminosäuren L-Pro (4), L-Glu (5), D-Ser (6), und L-Thr (7) verantwortlichen Module.
  • Die Genorganisation des Bacillomycin D Biosynthesecluster von FZB42 ist schematisch in der dargestellt.
  • Mit dem Stamm FZB42 wurde ein Stamm identifiziert, der sich nicht nur durch eine erstmalig identifizierte Sequenz für die nichtribosomale Bacillomycinbiosynthese auszeichnet, sondern gleichzeitig die Fähigkeit zur DNA-Aufnahme durch genetische Kompetenz besitzt. Diese Fähigkeit ist bisher nur bei wenigen Bacillusstämmen der Species Bacillus subtilis, vornehmlich in dem Modellorganismus B.subtilis 168, nachgewiesen worden. Überraschend konnte gezeigt werden, dass der Stamm nach einer Methode, die auf der Ausbildung natürlicher Kompetenz in einer bestimmten Phase des Wachstums beruht, die Fähigkeit zur Aufnahme und Rekombination von linearer und circulärer DNA (Plasmid- und chromosomaler DNA) ausbildet ( ).
  • In dem DNA-kompetenten Stamm B.subtilis 168 ist das erfindungsgemäße Gencluster für die Bacillomycin D Biosynthese nicht vorhanden. Es wird angenommen, dass dieses Gencluster ähnlich wie bei den Stämmen ATCC 6633 und RB14 durch horizontalen Gentransfer in das Genom integriert wurde ( ). Allerdings sind weder ATCC6633 noch RB14 genetisch kompetent und können somit nicht für die kombinatorische Biosynthese neuartiger Lipopeptide, vorzugsweise von Iturinderivaten manipuliert werden. Diese Möglichkeit eröffnet der Stamm FZB 42 in dem beliebige Module für die Iturinbiosynthese via homologer Rekombination austauschbar sind.
  • Die modularen Anordnung von NRPSs erlaubt die gezielte Manipulation der nichtribosomalen Proteinmatrizen und befähigt somit zum rationalen Design neuer Peptidantibiotika. Funktionelle Hybrid-Matrizen können in vitro und in vivo hergestellt werden. Für die kombinatorische Biosynthese neuer iturinartiger Wirkstoffe ergeben sich durch die im bmyB und bmyC Gen anwesenden Module neuartige Verknüpfungsmöglichkeiten. Wahlweise können die Aminosäuren 4, 5, 6, und/oder 7 mit der L-Asn(1)-D-Tyr(2)-D-Asn(3) „core-Sequenz verknüpft werden und verschiedene Iturin-Hybrid-Varianten erhalten werden (Tabelle 1).
  • Weitere Kombinationsmöglichkeiten betreffen mögliche Positionsaustausche der colinear synthetisierten Aminosäuren durch „Domänen“shuffling“; Deletion (<7) oder Addition (>7) von Aminosäuren in dem Standard-Heptapeptid. Tabelle 1: Kombinatorische Biosynthese neuartiger Iturine durch Modulaustausch
    AS 1 AS 2 AS 3 AS 4 AS 5 AS 6 AS 7
    Iturin A
    L-Asn D-Tyr D-Asn L-Gln L-Pro D-Asn L-Ser
    Iturin-Hybrid-Varianten
    L-Asn D-Tyr D-Asn L-Gln L-Pro D-Asn L-Thr
    L-Asn D-Tyr D-Asn L-Gln L-Pro D-Ser L-Thr
    L-Asn D-Tyr D-Asn L-Gln L-Glu D-Ser L-Thr
    Bacimycin D
    L-Asn D-Tyr D-Asn L-Pro L-Glu D-Ser L-Thr
    Mycosubtilin
    L-Asn D-Tyr D-Asn L-Gln L-Pro D-Ser L-Asn
  • Durch neuartige Verknüpfung der Epimerisierungsdomänen mit den AS 1, AS 4, AS 5 und AS 7 ergeben sich zahlreiche weitere Varianten für neuartige Iturinverbindungen.
  • Der Stamm FZB42 ist kompetent für DNA-Transformation. „Gene targeting“ Strategien durch homologe Rekombination sind daher gut anwendbar. Dadurch sind die dargestellten Manipulationen direkt in FZB 42 durchführbar. FZB42 enthält weitere Gencluster für die nichtribosomale Synthese von Fengycin und Surfactin (Koumoutsi et al. 2004. J. Bacteriol. 186, 1084-1092). Ein rekombinativer Austausch dieser DNA Bereiche durch weitere Syntheseoperons für variable Iturine ist möglich und gestattet die simultane Synthese von verschiedenen Iturinen mit synergistischem Effekt. So wird der antagonistische Effekt gegenüber phytopathogenen Pilzen durch den simultanen Effekt von Bacillomycin D und Fengycin verursacht (Beispiel 7, Tabelle 4). Es ist auch möglich, mehrere Kopien eines Iturin-Biosyntheseoperons in das FZB42 Chromosom zu rekombinieren und einen Gendosiseffekt mit erhöhter Syntheserate des jeweiligen Iturins zu erhalten.
  • Durch die genannten Techniken können die jeweiligen Iturinbiosyntheseoperons unter die Kontrolle eines starken, induzierbaren Promotors gestellt werden, um eine erhöhte Biosyntheserate in FZB42 zu erhalten.
  • Es ist auch möglich, einzelne Enzyme (NRPS) der nichtribosomalen Peptidsynthese für gezielte Synthese in „in vitro“ Systemen zu produzieren.
  • Der Stamm FZB42 kann aufgrund seiner Zugänglichkeit für genetische Manipulationen und seines genetisch determinierten Biosynthesepotentials auch für die simultane Produktion von Bacillomycin D bzw. eines iturinartigen kombinatorischen Neuprodukts zusammen mit den ebenfalls antifungal wirkenden Surfactin und Fengycin, herangezogen werden.
  • Genorganisation des Bacillomycin D Biosyntheseclusters von FZB42: Die für die Biosynthese des Heptapeptids BacillomycinD verantwortlichen Peptidsynthetasen werden durch die Gene bmyA (A1), bmyB (B1, B2, B3, B4), und bmyC (C1 und C2) kodiert. Diese Gene sind Bestandteil eines ca. 38 kb großen Genclusters, das zwischen die konservierten Gene yxjF und xynD inseriert ist und dem auch das bmyD Gen, das vermutlich eine S-Malonyl-Synthetase kodiert, angehört. Diese Genorganisation ähnelt weitgehend der bei Bacillus subtilis RB14 (K. Tsuge, T. Akiyama, M.Shoda, 2001 J.Bacteriol. 183, 6265-6273) beschriebenen Struktur des Iturin A Operons. Ausserdem weist das Bacillomycin D-Operon Ähnlichkeit zum Mycosubtilin-Operon von B.subtilis ATCC 6633 (Duitman et al. 1999, PNAS 96, 13294-13299) auf ( ). Drei der insgesamt 7 Adenylierungsdomänen, die die Spezifität der Aminosäuresequenz des Heptapeptids bestimmen, sind hochkonserviert und determinieren die Sequenz L-Asn-D-Tyr-D-Asn, die in den Iturinen Iturin A, Mycosubtilin und Bacillomycin D identisch ist. Die folgenden vier Adenylierungsdomänen sind im Vergleich zu den entsprechenden Domänen im Mycosubtilin und Iturin A-Operon deutlich abweichend und determinieren eine im Vergleich zu den anderen zwei Iturinen unterschiedliche Sequenz L-Pro-L-Glu-D-Ser-L-Thr ( ). Epimerisierungsdomänen an den Modulen B1, B2 und C1 determinieren die D-Konfiguration von D-Tyr (2), D-Asn (3) und D-Ser (6).
  • Eine Clustal W Analyse der Sequenzen von konservierten und nichtkonservierten Adenylierungsdomänen aller drei bekannten Iturin- Biosyntheseoperons ergab, dass die Adenylierungsdomänen von bmy_B3 (Pro), bmy_B4 (Glu), bmy_C1 (Ser) und bmy_C2 (Thr) deutlich von den entsprechenden Domänen in den alternativen Iturin-Biosyntheseclustern abweichen ( ). Dabei ist die zu aktivierende Aminosäure von größerem Einfluß als die jeweilige Position im Iturin-Gencluster. So weist bmy_B3 (Pro) eine höhere Ähnlichkeit zu itu_B4 (Pro) und mycB4 (Pro) auf als zu itu_B3 (Gln) und myc_B3 (Gln). Ähnlich ist die Situation bei bmy_B4 (Glu), das die größte Homologie zu itu_B3 (Gln) und myc_B3 (Gln) aufweist. Eine relativ hohe Ähnlichkeit weist bmy_C1 (Ser) zu myc_C1 (Ser) bzw. itu_C2 (Ser) auf. Auch hier entspricht der Grad der Homologie der Position der Aminosäure im Iturinderivat (Ser6 bei Mycosubtilin; Ser7 bei IturinA). Eine separate Stellung nimmt bmy_C2 (Thr7), für das - ähnlich Glu5 - keine äquivalente Aminosäure in den anderen beiden Iturinen existiert ( ).
  • Mit den erfindungsgemäßen spezifischen Adenylierungsdomänen bmy_B4 (Glu) und bmy_C2 (Thr) ergeben sich besonders interessante Kombinationseffekte für neuartige Iturine, da durch sie die Aminosäuren Glu und Thr neu in Mycosubtilin- und Iturin A- Derivate eingeführt werden können. Die beste Homologie (% identische Reste) der konstanten und variablen Adenylierungs-Domänen ist in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2: Beste Homologie (% identischer Reste) bei den variablen Domänen mby_B3, mby_B4, mby_C1, und mby_C2
    Adenylierungsdomäne bmy identische aa Reste zu
    Bmy_A1 Asn (1) 98,6 % itu_A1 Asn (1)
    Bmy_B1 Tyr (2) 99,5 % ltu_B1 Tyr (2)
    Bmy_B2 Asn (3) 97,7 % Itu_B2 Asn (3)
    Bmy_B3 Pro (4) 46,8 % Myc_B4 Pro (5)
    Bmy_B4 Glu (5) 59,8 % Myc_B3 Gln (4)
    Bmy_C1 Ser (6) 65,6% Myc_C1 Ser (6)
    Bmy_C2 Thr (7) 49,8 % ituA_C2 Ser (7)
  • Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz des BacillomycinD-Operons weist überraschend große Unterschiede in repräsentativen Bereichen zur Sequenz des Mycosubtilin und IturinA-Operons auf. Der besondere Vorteil der Erfindung gegenüber dem Stand der Technik ist die Möglichkeit, neuartige Stoffe mit antibiotischer, insbesondere antifungaler und antiviraler Wirkung produzieren zu können, die wegen dem gehäuften Auftreten von Resistenzen im medizinischen Bereich von großer Bedeutung sind.
  • Da das von Bacillus FZB42 produzierte Bacillomycin D einen antagonistischen Effekt auf phytopathogene Pilze, insbesondere in Kombination mit Fengycin, einem ebenfalls in FZB 42 produzierten Lipopeptid, ausübt (siehe Ausführungsbeispiel 7), ist der Einsatz im Pflanzenschutz besonders vorteilhaft.
  • Durch die Präsenz der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz im Bacillus-Stamm Bacillus amyloliquefaciens FZB42 und dessen DNA-Kompetenz eröffnet sich für die Fachwelt nicht nur die Möglichkeit für genetische Experimente, sondern es werden gleichzeitig ideale Voraussetzungen für die kombinatorische Lipopeptidbiosynthese geschaffen.
  • Ausführungsbeispiele:
  • Beispiel 1: Massenspektroskopische Analyse von FZB 42: Nachweis von Bacillomycin D, Fengycin und Surfactin:
  • Für den Nachweis von Lipopeptidprodukten in ganzen Zellen wurde B.amyloliquefaciens FZB42 auf Landy-Agarmedium (Landy, M. et al. 1948. Proc. Doc. Exp. Biol. Med. 67, 539-541) bei 37°C 24 h kultiviert. Zur Analyse der Massenspektren durch MALDI MS wurde Zellmaterial von der Agarplatte entnommen und mit Matrix Medium (gesättigte Lösung von α-Cyanocinnaminsäure in 40% Acetonitril - 0.1% Trifluor-Essigsäure) bedeckt und luftgetrocknet wie vorher beschrieben (Leenders, F. et al. 1999. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, 943-949). Alternativ wurde eine kleine Probe des gefriergetrockneten Kulturfiltrats mit 70% Acetonitril - 0,1% Trifluor-Essigsäure extrahiert. Der Extrakt wurde 1:1 (Vol./Vol.) mit Matrixmedium gemischt. Ein 1 µl-Aliquot wurde auf das Target aufgetragen und bis zur MSMessung luftgetrocknet (Vater,J. et al. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68, 6210-6219).
  • Die Massenspektren waren bei dem Einsatz von ganzen Zellen und Kulturfiltraten identisch. Dabei wurden drei Gruppen erhalten, die den Lipopeptiden Suractin, Bacillomycin D und Fengycin entsprechen. Ihre Massenzahlen sind in der Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3: Lipopeptidprodukte von B. amyloliquefaciens FZB42 detektiert durch MALDI-TOF-MS
    Produkt und beobachtete Massenpeaks (m/z) Bestimmung als
    Surfactin (1)
    1 0308, 1,046,8 C13-Surfactin [M + Na, K]+
    1 044,8, 1060,8 C14-Surfactin [M + Na, K]+
    1 058,8, 1,074,8 C15-Surfactin [M + Na, K]+
    Bacillomycin D (2)
    1 031,7; 1 053,7, 1 069,7 C14-BacillomycinD [M + H, Na, K]+
    1 045,7, 1 067,7, 1 083,7 C15-BacillomycinD [M + H, Na, K]+
    1 059,7, 1 081,7, 1 097,7, 1095,7, 1 111,7 C16-BacillomycinD [M + H, Na, K]+
    Fengycin (3)
    1 449,9, 1,471,9, 1,487,9 Ala-6-C15 Fengycin [M + H, Na, K]+
    1 463,9, 1 485,9, 1,501,9 Ala-6-C16 Fengycin [M + H, Na, K]+
    1 477,9, 1 499,9, 1 515,9 Ala-6-C17 Fengycin [M + H, Na, K]+
    1 491,8, 1 513,9, 1 529,9 Val-6-C16 Fengycin [M - H, Na, K]+
    1 505,8, 1 527,8, 1 543,8 Val-6-C17 Fengycin [M - H, Na, K]+
  • Die Lipopeptid Produkte von Ensemble 2 wurden als Bacillomycin D durch ihre postsource decay (PSD) Massenspektren identifiziert. Die PSD-MALDI-TOF-MS wurden mit den gleichen Proben durchgeführt. Es wurden die monoisotopischen Massenzahlen aufgezeichnet. Für die Sequenzanalyse sind die (seltenen) protonierten Species vorteilhaft, da sie viel schneller in Fragmente zerfallen als die Alkali-Addukte. Z.B. wurde das Lipopeptid mit der Massenzahl m/z von 1 031,5 als protonierte Form einer Bacillomycin D Isoform mit einer Fettsäure von 14 C-Atomen identifiziert. Ihre Sequenz ( ) wurde von einer Serie von bn1-, Yn"(-H2O)- und von Prolin-abgeleiteten bn2 Fragment Ionen abgeleitet. Der Peptidring von diesem Bacillomycin D ist an der Peptidbindung zwischen ihrem Amino-Fettsäurerest und Threonin an Position 7 sowie an N-Terminus von Prolin-5 gespalten.
  • Beispiel 2: Genomanalyse von FZB42 durch shot gun Sequenzierung:
  • Chromosomale DNA wurde von FZB42 durch Anwendung einer Standardmethode (C.R.Harwood & S. M. Cutting) präpariert und durch Anwendung von partiellem Restriktionsverdau (Sau IIIA in suboptimaler Konzentration) bzw. durch hydrodynamische Scherung fragmentiert. Die Ligation der DNA-Inserts erfolgte in ein Smal-linearisiertes, dephosphoryliertes pTZ19 Vektorplasmid. Selektion der weißen Klone nach Transformation in E.coli DH5α. Sequenzanalyse in einem automatischen ABI396 Sequenziersystem. Insgesamt wurden mehr als 39 000 Sequenzläufe mit einer durchschnittlichen Leseweite von 655 bp durchgeführt und zu ca. 800 „Contigs“ assembliert. Das entspricht bei einer voraussichtlichen Genomgröße von 3 800 kb einer ca. 6,5 fachen Wiederholung („coverage“) der nichtredundanten Sequenz. Lücken zwischen den „Contigs“ wurden durch PCR-Reaktionen mit sequenzspezifischen Primern geschlossen. Das Bacillomycin D-Operon wurde als ca 38 kb große DNA Sequenz auf einem insgesamt 56 kb großen „Contig“ durch Homologievergleich der deduzierten Aminosäuresequenzen mit der Datenbank identifiziert (Blast P). Die größte Ähnlichkeit wurde zu dem Iturin A-Biosynthese-Operon von Bacillus subtilis RB 14 und dem Mycosubtilin-Biosyntheseoperon von Bacillus subtilis ATCC6633 ermittelt.
  • Beispiel 3: Identifizierung funktioneller Domänen durch Sequenzanalyse des Bacillomycin D-Genclusters
  • Durch vergleichende Analyse der Bacillomycin D Gensequenzen mit verschiedenen Sequenzhomologieprogrammen (BLAST, Pfam) wurden in den Genen bmyA, bmyB und bmyC konservierte Domänen identifiziert, die für die nichtribosomale Synthese des Bacillomycin D Peptids verantwortlich sind. Die colineare Position der identifizierten, konservierten bzw. variablen Adenylierungs-, sowie der Epimerisierungs- und Thioesterasedomänen geht aus der hervor.
  • Beispiel 4: Herstellung einer ΔbmyA:: EmR Mutante von FZB42
  • Ein 1.2 kb Fragment des bmyA Gens wurde mit chromosomaler DNA von FZB42 amplifiziert und in pGEM-T Vektor ligiert. Das Erythromycin-Resistenzgen aus dem Vektor pMX39 wurde in den zentralen Bereich des bmyA-Gens eingefügt. Das resultierende Plasmid mit der Em-Resistenzdeterminante im im bmyA Gen wurde nach Linearisierung durch doppelten cross over in das bmyA wt Gen von FZB 42 rekombiniert. Kompetente FZB 42 Zellen wurden durch Anwendung einer Modifikation der „Ein Schritt-Transformationsmethode“ von Kunst und Rapoport (1993) erhalten. Die Zellen wiesen maximale Kompetenz in einem kurzen Zeitabschnitt am Ende der logarithmischen Wachstumsphase auf ( ). Die Methode für die Herstellung kompetenter Zellen und die DNA Transformation ist in Beispiel 5 ausführlich dargestellt.Die korrekte Insertion des Resistenzgens in das FZB42 Genom wurde durch PCR mit chromosomaler DNA und durch Southern Hybridisierung von wt und EmR Transformanten nachgewiesen.
  • Beispiel 5: Herstellung kompetenter Zellen und DNA-Transformation von FZB42:
    • - 10 ml LB werden mit einer frischen Kolonie von FZB42 inokuliert und bei 28°C und 210 rpm über Nacht inkubiert.
    • - 20 ml MDCH Medium werden mit 2 ml der Vorkultur beimpft und bei 37°C und 210 rpm inkubiert. Am Ende der logarithmischen Wachstumsphase, bei einer OD600 nm zwischen 2 - 4, wird die Kultur mit jeweils 20 ml MD Medium 1:1 verdünnt und weiter unter gleichen Bedingungen 1 h geschüttelt.
    • - Anschliessend wird die Kultur bei Raumtemperatur und 6 000 rpm zentrifugiert und das Zellsediment in 4 ml des Überstands der Zentrifugation aufgenommen (Anreicherung 1:10).
    • - Die Zellpräparation wird sofort für die DNA Transformation verwendet.
    • - In einem 100 ml Erlenmeyer-Kolben werden 200 µl frische, kompetenter Zellen mit 500 - 1000 ng DNA in 200 µl frisch angesetztem Transformationspuffer für 20 min. bei 37°C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert
    • - Zugabe von 1 ml vorgewärmten (37°C) LB, das für die Induktion der Em Resistenz 0,1 µg Erythromycin (2 µl Em [50 µg/ml] in 1 ml LB) enthalten kann und Schütteln bei 37°C für weitere 90 min.
    • - 0,1 ml wird auf LB-Platten + 5 µg/ml Erythromycin und 25 µg/ml Lincomycin ausplattiert. Transformanten sind nach 2 Tagen und Bebrütung bei 37°C sichtbar.
  • Beispiel 6: Analyse des Lipopeptidspektrums der Mutante AK1 (ΔbmyA::EmR)
  • Das Lipopeptidspektrum der Gen-Disruption Mutante AK1 (ΔbmyA::EmR) wurde, wie in Beispiel 1 dargestellt, durch MALDI-TOF MS bestimmt. Während die Surfactin-Produktion unverändert blieb, waren im Massenspektrum keine Bacillomycin D Signale nachweisbar ( ).
  • Beispiel 7: Antifungale Aktivität von FZB42 und Mutantenstämmen
  • Die phytopathogenen Pilzstämme Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum DSMZ 62313 (Welkekrankheit u.a. bei Spargel und Erbse), Alternaria solani (Dürrfleckenkrankheit Tomate), Gaeumannomyces graminis (Schwarzbeinigkeit Kartoffel), Rhizoctonia solani (Fußkrankheiten, Fäulen) und Pythium aphanidermatum (Wurzelbrand Gurke) wurden auf Waksman-Medium kultiviert. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurde auf Malz-Agar angezogen. Mit diesen Stämmen wurde die antifungale Aktivität von FZB42 und den Mutanten AK1 (ΔbmyA::EmR, defizient in Bacillomycin D-Produktion, Herstellung ist in Beispiel 4 beschrieben), AK2 (ΔfenA::CmR, defizient in Fengycin-Produktion), AK3 (ΔbmyA::EmR ΔfenA::CmR, defizient in Bacillomycin D - und Fengycin-Produktion), CH1 (ΔsrfA::EmR, defekt in Surfaktinproduktion), CH2 ((ΔsrfA::EmR ΔfenA::CmR , defekt in Surfaktin- und Fengycin-Produktion) untersucht. Die Herstellung der Mutanten erfolgte wie beschrieben (Koumoutsi, A. et al. 2004 J. Bacteriol. 186, 1084-1096). Die Doppel-Mutante CH2 wurde durch Transformation von CH1 mit chromosomaler DNA von AK2 erhalten. 2µl einer 20 h Kultur in Landy-Medium von FZB 42 bzw. der Mutantenstämme wurden auf Waksman-Agar mit den regulär angeordneten, aktiv wachsenden, Pilzkulturen aufgetragen. Die Platten wurden 3 - 5 Tage bei 27°C inkubiert. Die Hemmwirkung der Bakterienkulturen ist durch die Ausbildung von reduzierten Wachstumszonen der Pilze sichtbar ( , , und ). Die antibiotische Aktivität auf Saccharomyces cerevisiae und Bacillus megaterium wurde mit verdünntem Kulturfiltrat im Agar-Diffusionstest (beschrieben bei Koumoutsi et al. 2004 J. Bacteriol. 186, 1084-1096) bestimmt. Die hämolytische Wirkung wurde im Lochtest auf Blutagarplatten bestimmt (Vater, J. et al. 2002 Appl. Environ. Microbiol. 68, 6210-6219). Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4: Antifungale, antibakterielle und hämolytische Aktivität von FZB42 und Mutantenstämmen mit defekter Lipopeptidsynthese
    Indikator-Stämme/ Biologische Aktivität FZB42 Wild type AK1 ΔbmyA:: EmR AK2 ΔfenA::CmR AK3 ΔbmyA::EmR ΔfenA::CmR CH1 ΔsrfA::EmR CH2 ΔsrfA::EmR ΔfenA::CmR
    Bacillomycin Fengycin Surfactin Fengycin Surfactin Bacillomycin Surfactin Surfactin Bacillomycin Fengycin Bacillomycin
    Saccharomyces cerevisiae +++ + +++ + +++ +++
    Fusarium oxysporum +++ ++ +++ - +++ +++
    Alternaria solani +++ ++ +++ - +++ ++
    Gaeumannomyces graminis +++ +++ +++ - +++ +++
    Rhizoctonia solani +++ ++ ++ - ++ ++
    Pythium aphadermatum + + + - + +
    Bacillus megaterium +++ +++ +++ +++ +++ +++
    Hämolyse +++ - +++ - +++ +++
  • Figurenliste
    • : Struktur von Iturinen mit antifungaler Wirkung. Die Genorganisation des BacillomycinD Biosynthesecluster von FZB42 ist schematisch unten dargestellt. Die Zahlen entsprechen der Reihenfolge der Aminosäuren im Iturinmolekül. Hochkonservierte Bereiche sind schwarz, variable Bereiche rot gekennzeichnet. E weist auf das Vorhandensein einer Epimerisierungsdomäne (verantwortlich für D-Konfiguration) hin.
    • : Genorganisation des Bacillomycin D-Clusters.
    • : ClustalW-Vergleich der ACL-Domänen A1, B1, B2, B3, B4, C1 und C2 von NRPS der Iturin-Biosynthese in FZB42 (bmy, BacillomycinD), RB 14 (itu, Iturin A) und ATCC 6633 (myc, Mycosubtilin).
    • : Das Bacillomycin D-Gencluster ist eine Insertion im Bereich der 1 944/1 955 kb Region (grün) des B.subtilis Genoms. Mit dem Bacillomycin D-Gencluster wurden auch kleinere Genomfragmente aus den Regionen 4 000 - 4 003 kb (gelb) und 3088 - 3094 (blau) in diesen Rekombinationsort integriert.
    • : Wachstum von FZB42 und AK1 in MDCH Medium. Maximale Kompetenz (> 1000 TF/µg DNA) wird nach 2, 33 h bei einer O.D.600 nm von 1,4 erreicht (roter Pfeil). Nach 2 h (O.D. 1,1) und 2,67 h (O.D. 2) sind nur wenige Transformanten (< 50 TF/µg DNA) nachweisbar (gestrichelte vertikale Pfeile). Nach 3,5 und 4 h sind keine Transformanten nachweisbar.
    • : Strukturelle Analyse des Lipopeptidproduktes mit m/z 1 031,5 in situ durch PSD-Maldi TOF-MS von ganzen Zellen von B. amyloliquefaciens FZB42. Die Struktur wurde von einer Serie C- und N-terminaler Fragmente [bn und Yn(-H2O) Ionen sowie von Prolin-abgeleiteten Pn Fragmenten erhalten.
    • : MALDI TOF MS Analyse von Bacillomycin D und Surfactin Lipopeptiden von B. amyloliquefaciens FZB42 und Mutantenstämmen. A: Nachweis von Surfactin und Bacillomycin D Massen Peaks in Extrakten von lyophilisierten Kulturfiltraten. B: Nachweis von Surfactin und Bacillomycin D Massen Peaks in FZB 42 Zellen. C: Nachweis von Surfactin aber nicht von Bacillomycin D in der Mutante AK1 (ΔbmyA::EmR)
    • : Hemmung des Wachstums von Fusarium oxysporum DSMZ 62313 (A,B) und Bacillus megaterium durch FZB42 und Mutanten AK1, AK2, CH1
    • : Hemmung des Wachstums von Gaeumannomyces graminis durch FZB42 und Mutanten AK1, AK2, AK3, CH1 und CH2
    • : Hemmung des Wachstums von Rhizoctonia solani durch FZB42 und Mutanten AK1, AK2, AK3, CH1 und CH2
    • : Hemmung des Wachstums von Alternaria solani durch FZB42 und Mutanten AK1, AK2, AK3, CH1, CH2

Claims (9)

  1. Modulare DNA-Sequenz der nichtribosomalen Peptidsynthasen für die Synthese von BacillomycinD gekennzeichnet durch Sequenz (SEQ-ID-NO: 1), wobei die für die Synthese von BacillomycinD verantwortlichen Peptidsynthasen durch die Gene bmyA, bmyB und bmyC kodiert werden, die Bestandteil der modularen DNA-Sequenz sind.
  2. Verwendung der modularen DNA-Sequenz der nichtribosomalen Peptidsynthasen für die Synthese von BacillomycinD von Bacillus amyloliquefaciens gekennzeichnet durch Sequenz SEQ-ID-NO: 1 für die kombinatorische Biosynthese neuartiger Iturinverbindungen, wobei sich die neuartigen Iturinverbindungen durch die in den bmyB und bmyC Genen anwesenden Module ergeben und wobei besagte neuartige Iturinverbindungen durch folgende Austausche der Aminosäuren 4, 5, 6 und/oder 7 der Bacillomycin D Sequenz entstehen: AS 1 AS 2 AS 3 AS 4 AS 5 AS 6 AS 7 L-Asn D-Tyr D-Asn L-Pro L-Glu D-Ser L-Thr
    wobei Aminosäure 4 (L-Pro) durch L-Gln ausgetauscht wird, Aminosäure 5 (L-Glu) durch L-Pro ausgetauscht wird, Aminosäure 6 (D-Ser) durch D-Asn ausgetauscht wird und/oder Aminosäure 7 (L-Thr) durch L-Ser oder L-Asn ausgetauscht wird, und wobei je nach Wahl des Austausches der Aminosäuren besagte neuartige Iturinverbindungen simultan mit weiteren Iturinverbindungen synthetisiert werden können.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei die Biosynthese in Bacillus amyloliquefaciens erfolgt.
  4. Verwendung gemäß den Ansprüchen 2 und 3, wobei die Biosynthese in dem Bacillus-Stamm Bacillus amyloliquefaciens FZB42 erfolgt.
  5. Verwendung gemäß den Ansprüchen 3 und 4, wobei simultan zum Biosyntheseprodukt mindestens ein weiteres Iturin, das in Bacillus amyloliquefaciens natürlich synthetisiert wird, synthetisiert wird.
  6. Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das mindestens eine weitere Iturin Iturin A ist.
  7. Verwendung gemäß den Ansprüchen 3 bis 6, wobei mehrere Kopien eines Iturin-Biosyntheseoperons in das bakterielle Genom integriert sind.
  8. Verfahren zur Herstellung von Iturinen insbesondere von verschiedenen Iturin-Hybrid-Varianten unter Verwendung der Sequenz gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass wahlweise die Aminosäuren 4, 5, 6 und/oder 7 von Bacillomycin D mit den Aminosäureaustauschen gemäß Anspruch 2 mit der Sequenz L-Asn(1)-D-Tyr(2)-D-Asn(3) verknüpft werden.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8 gekennzeichnet durch Positionsaustausche der colinear synthetisierten Aminosäuren durch „Domänen“shuffling“; Deletion (<7) oder Addition (>7) von Aminosäuren in dem Standard-Heptapeptid.
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