DE19641213A1

DE19641213A1 - Peptide, ihre Herstellung und Verwendung sowie Mikroorganismus

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Publication number: DE19641213A1
Application number: DE19641213A
Authority: DE
Inventors: Birgit Dr Krebs; Andrea Dr Ockhardt; Birgit Hoeding; Peter Dr Bendzko; Jewgenij Dr Maximov; Winfried Dr Etzel
Original assignee: FZB BIOTECHNIK GmbH
Current assignee: KREBS, BIRGIT, DR., 73061 EBERSBACH, DE
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1996-09-26
Publication date: 1998-04-16
Anticipated expiration: 2016-09-27
Also published as: DE19641213B4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide mit antifungaler, antiviraler, phytoeffektiver und nematizider Wirkung, die von Vertretern der Bacillus subtilis-Gruppe, insbesondere von einem Bacillus amyloliquefaciens-Stamm in hohen Raten produziert werden, Methoden zu ihrer Fermentation, Isolierung und Hochreinigung sowie Beispiele zu ihren Anwendungsmöglichkeiten in Pharmazie und Landwirtschaft.

Die Erfindung betrifft antibiotische Peptide, die sowohl zur Behandlung von Infek tionskrankheiten bei Mensch und Tier als auch zur Verhinderung oder Minimierung von Schädigungen landwirtschaftlicher oder gärtnerischer Kulturen eingesetzt werden können. Die Erfindung betrifft antibiotische Peptide, die zur Verhinderung von Mycotoxinkontaminationen pflanzlicher Nahrungsmittel infolge eines Pilzbefalls während der Kultur oder Lagerung und zur Desinfektion angewendet werden können. Außerdem betrifft sie biologisch aktive Peptide, die zur Steigerung der pflanzlichen Ertragsleistung eingesetzt werden können.

Aus Bacillus subtilis-Species sind antifungal wirksame Peptide isoliert und in der Literatur beschrieben worden (u. a. Loeffler et al.: J. Phytopathol. 115 (1986) 204- 213). Besondere Beachtung finden dabei die iturinartigen Verbindungen, bei denen es sich um zyklische Heptapeptide handelt, die über eine β-Aminosäure verknüpft sind. Charakteristisch für diese Verbindungen ist die folgende Anordnung der Ste reospezifität der Aminosäuren: L D D L L D L.

Erste Hinweise zu antifungalen Verbindungen von Bacillus subtilis finden sich bereits 1949 bei Michener (Michener; H.P.: Arch. Biochem. 22 (1949), 208-214). Sharon prägt 1954 (Sharon, N.: Nature 174, 1190-1191) den Begriff der antifungalen Anti biotika im Zusammenhang mit Metaboliten von Bacillus subtilis. Er wird von Katz (Katz, A.: Bacteriol. Rev. 41(1977), 449-474) in seinem Übersichtsartikel zu Peptidantibiotika desselben Mikroorganismus aufgegriffen. In der Folgezeit häufen sich die Entdeckungen neuer Vertreter der Substanzklasse der iturinartigen Verbindungen wie: Iturin A (Besson, F. et al.: J. Antibiotics 29 (1976), 1043-1049; Besson, F.: J. Antibiotics 31 (1978), 284-288); Bacillomycin L (Besson, F.: Eur. Biochem. 77 (1977), 61-67), Bacillomycin L (Peypoux, F.: J. Antibiotics 37 (1984) 12, 1600-1604); Bacillomycin D (Peypoux, F. et al.: J. Antibiotics 33 (1980) 10,1146-9; Peypoux, F. et al.: Eur. J. Biochem. 118 (1981) 2, 323-327); Bacillomycin F (Mhammedi, A. et al.: J. Antibiotics 35 (1982) 3, 306-311; Michel, G. et al.: Fr. Demande FR 2.508.766 Cl. A01N63/02 07.01.1983; Peypoux, F.: Eur. J. Biochem. 153 (1985) 2, 335-340); Iturin A_L (Winkelmann, G. et al.: J. Antibiotics 36 (1983) 11, 1451-1457; Allgaier, H.: Liebigs Ann. Chem. 5 (1984) 854-866); Iturin A-2 (Tsuchimori, N.: Comp. Biochem. Physiol.; C: Comp. Pharmacol. Toxicol. 84C (1986) 2, 381-384); Iturin D und E (Besson, F. et al.: J. Antibiotics 40 (1987) 4, 437-442); Bacillomycin F_b und F_c (Besson, F.: J. Antibiotics 41 (1988) 3, 282-288). Auch in jüngerer Zeit sind neue Peptidwirkstoffe aus Bacillus subtilis beschrieben (u. a. Tanaka, Y. et al.: PTC Int. Appl. Wo 93 20,103 C07K15/04 14.10.1993; JP 31.3.1992), weiterhin Bacillomycin Lc (Eshita, S.M. et al.:J.Antibiotics 48 (1995) 11, 1240-7 und Bacillopeptin (Kajimura, V. et al.: J.Antibiotics 48 (1995) 10,1095-103).

Die iturinartigen Substanzen zeichnen sich durch ein breites Wirkungsspektrum ge gen phytopathogene Pilze aus; einzelne Vertreter werden aufgrund dieser Eigen schaft auch wirtschaftlich genutzt (Ajinomoto: Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 59.212.416 (Cl. A01 N63/02), 01.12.1984; Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 04.166.080, 11.6.1992; Eur. Pat. Appl. EP 536.455, 14.4.1993; Fushimi, S.: Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 0551.397, 02.03.1993).

Allerdings differieren die Wirkungskonzentrationen der einzelnen iturinartigen Ver bindungen trotz nur geringer Strukturunterschiede erheblich. Zur Aufklärung ihrer Wirkungsmechanismen werden zahlreiche Untersuchungen beschrieben, z. B. die Bestimmung von minimalen Hemmkonzentrationen gegen eine Vielzahl phytopatho gener Mikroorganismen und Untersuchungen zum Einfluß von Iturin A auf Sac charomyces cerevisiae, dabei insbesondere a) die Modifizierung der Membranper meabilität und der Lipidzusammensetzung unter Peptideinwirkung (Latoud, C. et al.: J. Antibiotics 40 (1987) 11, 1588-1595), b) die Beeinflussung der Phospholipaseak tivität von Membranvesikeln (Latoud, C.: J. Antibiotics 41 (1988) 11, 1699-1700) und c) der Einfluß auf die Zusammensetzung der Sterolmembran (Latoud, C. et al.: Can. J. Microbiol. 36 (1990) 6, 384-389). Es erfolgt die Charakterisierung der porenbil denen Eigenschaften von iturinartigen Verbindungen (Maget-Dana, R. et al.: Biochim. Biophys. Acta 815 (1988) 3, 405-409). Weiterhin liegen Untersuchungen zur Charakterisierung von hämolytischen Eigenschaften der Iturine und Bacillomycine gegenüber humanen Erythrozyten vor (Latoud, C. et al. Biochim. Biophys. Acta 85 (1986) 3, 526-535).

Es wurden erste Untersuchungen zum Einfluß einer chemischen Modifizierung der Grundstruktur ausgewählter iturinartiger Verbindungen auf ihre Wirkung durchgeführt (Harnois, I.: Biochimie 71 (1989) 1, 111-116; Tenoux, J. et al.: Microbios 67 (1991) 187-193).

In der Literatur finden sich erste Hinweise zu antimykotischen Wirkungen gegenüber humanpathogenen Pilzen (Tanaka, Y. et al.: PCT Int. Appl. WO 93 20,103 JP 14.10.1993) und zu Antitumorwirkungen (Ikegami, I. et al.: JP 6193,125 12.5.86) der iturinartigen Verbindungen.

Das Ziel der Erfindung ist die Herstellung von mikrobiellen, biologisch aktiven Wirkstoffen mit breitem Wirkungsspektrum und Einsatzgebiet.

Die Aufgabe der Erfindung ist das Auffinden geeigneter Wirksubstanzen von Mikroorganismen, die diese Substanzen synthetisieren, sowie die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung und Aufarbeitung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe und der Ermittlung ihrer Wirkungen.

Der Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung sind zyklische, dem Bacillomycin D verwandte Peptide von Bacillus subtillis, die sich durch antifungale, antivirale, phytoeffektive und nematizide Wirkungen auszeichnen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein neuer Mikroorganismus der Gattung Bacillus sowie dessen Kultivierungsbedingungen, die zur Bildung der erfindungsgemäßen Peptide in hohen Konzentrationen führen.

Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin die Beschreibung des Herstellungsver fahrens der erfindungsgemäßen Peptide, welches sowohl hohe Ausbeuten als auch sehr hohe Reinheiten der isolierten Verbindungen gewährleistet.

Aus dem Kulturüberstand des erfindungsgemäßen Bacillus amyloliquefaciens- Stammes wurden sechs Peptide mit sehr hoher Reinheit isoliert. Bei den Verbindungen handelt es sich um zyklische Heptapeptide, die durch folgende Aminosäurezusammensetzungen charakterisiert sind:

I Asp, Asn, Tyr, Pro, Glu, Ser, Thr, R-CH(NH)CH₂CO-
II Asn (2x), Tyr, Pro, Glu, Ser, Thr, R-CH(NH)CH₂CO-
R = C₈H₁₇ bis C₂₅H₅₁, insbesondere C₁₀H₂₁ bis C₁₃H₂₇
Hierbei stehen
Asp für Asparaginsäure
Asn für Asparagin
Tyr für Tyrosin
Glu für Glutaminsäure
Ser für Serin
Thr für Threonin.

Mit Hilfe von TOCSY-, NOESY-, ROESY-, HMBC- und HMQC-Spektren, die mit Hilfe eines BRUKER DMX 600 MHz-NMR-Gerätes von den gereinigten Wirkstoffen ge messen wurden, wurden die nachfolgenden Aminosäuresequenzen und die Struktur der Seitenkette R wie folgt bestimmt:

Peptid A

Peptid B bis F

Die stereochemische Konfiguration der Wirkstoffe konnte mit Hilfe chromathografi scher Trennungen an Chirosyl-Val-Trägern bestimmt werden.

Die erfindungsgemäßen Peptide wurden an einem FINNIGAN MAT TSQ 700 Mas senspektrometer analysiert und mittels ESI-MS folgende Molekulargewichte be stimmt:

Analytische Meßergebnisse werden im folgenden am Beispiel des Peptids D darge stellt. Analoge Messungen liegen für die anderen erfindungsgemäßen Peptide A-F vor.

Abb. 1 zeigt die FAB-MS-Molekulargewichtsbestimmung (M + H⁺) des Peptides D;

Abb. 2 zeigt ein Protonenübersichtsspektrum (¹H-NMR, 600 MHz) von Peptid D;

Abb. 3 zeigt einen TOCSY-Ausschnitt der N-H-Protonen von Peptid D;

Abb. 4 zeigt einen TOCSY-Ausschnitt zur Identifizierung von Prolin im Peptid D;

Abb. 5 zeigt einen NOESY-Ausschnitt mit den NOE-Cross-Peaks zwischen den N-H-Protonen und den alpha-H-Protonen zur Bestimmung der Aminosäuresequenz von Peptid D;

Abb. 6 zeigt einen NOESY-Ausschnitt des N-H Bereiches von Peptid D;

Abb. 7 zeigt einen NOESY-Ausschnitt des alpha-H⁺- bis delta-H⁺-Bereiches von Peptid D;

Abb. 8 zeigt einen Ausschnitt aus dem Aliphatenbereich des HMQC-Spektrums von Peptid D.

Die Abb. 1 bis 8 befinden sich auf den Seiten 27 bis 34 der Patentschrift.

Physikochemische Eigenschaften der Peptide werden in Tab. 1 dargestellt.

Löslichkeit:

- sehr gut löslich in H₂O; CH₃QH; C₂H₅OH; C₃H₇OH; C₄H₉OH; Cyclohexanol, Acetonitril
- schlecht löslich in CCl₄; CHCl₃
- unlöslich in n-Alkanen (n-Hexan) und Alkylaromaten (Benzen).

Die erfindungsgemäßen Peptide besitzen eine amphiphile Struktur und zeichnen sich aufgrund dessen durch oberflächenaktives Verhalten aus.

Mittels HPLC-Analytik an einer RP-18-Phase konnte folgende natürliche Verteilung der Verbindungen (in %) unter den gewählten Kultivierungsbedingungen (vergl. Bei spiel 2) im Kulturüberstand nachgewiesen werden:

Peptid A 50,4
Peptid B 0,2
Peptid C 34,7
Peptid D 8,5
Peptid E 1,6
Peptid F 4,6.

Bei Veränderung der Kultivierungsbedingungen kann eine abweichende Verteilung der Wirkstoffkomponenten auftreten.

Die erfindungsgemäßen Peptide werden von Vertretern der Gattung Bacillus, insbe sondere Bacillus amyloliquefaciens DSM 10273, synthetisiert oder gegebenenfalls auch von anderen Stämmen der Bacillus subtilis Gruppe (B. subtilis, B. lichiniformis, B. pumilus bzw. B. amyloliquifaciens). Der Stamm wurde unter der Nummer DSM 10273 nach den Regeln des Budapester Vertrages hinterlegt.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide A bis F ist nicht nur auf die Verwen dung der bestimmten hier beschriebenen Mikroorganismen beschränkt, sondern betrifft auch alle deren natürlich oder künstlich (mit Hilfe allgemeiner gentechnischer Methoden, z. B. mittels Röntgenstrahlung, UV-Strahlung oder chemischer Behand lung) erzeugten Mutanten und Varianten, die in der Lage sind, eines oder mehrere der Peptide A bis F herzustellen.

Die erfindungsgemäßen Peptide können aus Kulturüberständen des Stammes Bacillus amyloliquefaciens DSM 10273 isoliert werden.

Die Identifizierung des Stammes Bacillus amyloliquefaciens DSM 10273 erfolgte nach den Methoden in "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", Teil 2, Williams & Wilkins Co., 1986, und anhand weiterer, in der Literatur (Nakamura, L. A.: Intern. Journ. of System. Bacteriol., Okt. 1987, 444-445) zur Differenzierung von Bacillus subtilis und Bacillus amyloliquefaciens beschriebener Kriterien. Die Merkmale dieses Stammes sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2 Morphologische, physiologische und biochemische Merkmale des Bacillus amyloliquefaciens DSM 10273

Form/Lage der Spore: oval/zentral
Sporulationsverhalten: 85% auf Griesagar, 4 d, 37°C
Beweglichkeit: beweglich
Gramverhalten: grampositive Kurzstäbchen
Koloniemorphologie auf Blutplatte: graubeige, glänzend, Rand glatt oder gelappt
Nähragar: beige, matt, Zentrum stark gefaltet, Rand gelappt, flach auslaufend, starke Schleimbildung
Säurebildung aus: Lactose, D-Xylose, Glucose, d-Mannose, d-Fructose, Maltose, Trehalose, Saccherose, D-Mannit, Aesculin
keine Säurebildung aus: d-Galactose, Dulcit, Rhamnose, Raffinose, Sorbit, D-Ribose
VPR: positiv
Zitratverwertung: negativ
Urease: positiv
Gasbildung aus Nitrat: negativ
Katalase: positiv
Stärkehydrolyse: Hydrolysezone 5,0 mm
Caseinhydrolyse: Hydrolysezone 6,5 mm
Gelatinehydrolyse: Hydrolysezone 7,5 mm
Lezithinase: negativ
starkes Wachstum auf: Glucose-Nitratagar und Glucose-Asparaginagar
kein Wachstum in: 10% NaCl-Bouillon
Resistenz: gegen 1500 ppm Streptomycinsulfat.

In "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" wird keine Differenzierung zwischen Bacillus subtilis und Bacillus amyloliquefaciens vorgenommen. Der Stamm Bacillus amyloliquefaciens DSM 10273 unterscheidet sich jedoch vom type strain Bacillus subtilis ATCC 6051 in folgenden Merkmalen:

- α-Hämolyse
- Säurebildung aus: Xylose, Aesculin und Lactose
- Lipopeptidbildung
- Phagensensibilität
- Streptomycinresistenz.

Entsprechend neueren Auffassungen zur Taxonomie der Gattung Bacillus bzw. zur Abgrenzung von Bacillus subtilis und Bacillus amyloliquefaciens kann die Lactose verwertung als ein Indiz der Zugehörigkeit des Stammes DSM 10273 zur Art Bacillus amyloliquefaciens gelten (Nakamura, L. A.: Intern. Journ. of System. Bacteriol., Okt. 1987, 444-445).

Das Lysotypiemuster des Stammes DSM 10273 ist dem des Stammes Bacillus amyloliquefaciens (ATCC 23844) wesentlich ähnlicher als dem des Stammes Bacillus subtilis (ATCC 6051).

Die Sequenz des Subtilisingens des Stammes DSM 10273 weist in einem zentralen Fragment von 250 Basenpaaren 97% Homologie zu der Sequenz von Bacillus amy loliquefaciens ATCC 23844 auf.

Aufgrund dieser Ergebnisse wurde eine Zuordnung des Stammes DSM 10273 zu Bacillus amyloliquefaciens vorgenommen.

Nährmedien für die Produktion bzw. Synthese der erfindungsgemäßen Peptide kön nen wäßrig oder fest sein; sie enthalten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineral salze und definierte oder komplexe organische Zusätze. Geeignete Nährmedien enthalten beispielsweise eine Kohlenstoffquelle wie Glucase, Lactose, Maltose oder Saccharose, eine Stickstoffquelle wie Ammoniumsalze, Glutaminsäure oder andere Aminosäuren, oder komplexe Nährbodenbestandteile wie Sojaschrot, Maisquellwas ser, Hefeextrakt, Pepton, Casein. Die Zugabe von Aminosäuren oder Fettsäuren kann das Spektrum der gebildeten Peptide quantitativ verändern.

Die Kultivierung erfolgt bei 23 bis 35°C, vorzugsweise bei 25°C, in üblichen Kulturge fäßen, beispielsweise in Schüttelkolben oder Fermentoren unterschiedlicher Größe.

Nach Beendigung der Fermentation werden die gewünschten Peptide aus der Kul turlösung gewonnen. Die erfindungsgemäßen Peptide können direkt aus der Kultur lösung mit organischen Lösungsmitteln extrahiert werden oder alternativ nach Sepa ration der Mikroorganismen durch Ultrafiltration vom Kulturüberstand getrennt wer den. Die Kulturlösung kann auch nach Abtrennung der Mikroorganismen und anderer fester Bestandteile mit Aktivkohle, Adsorberharzen oder entsprechendem Trä germaterial in Kontakt gebracht werden, so daß die Peptide auf dem Trägermaterial adsorbiert werden. Danach werden die Verbindungen durch geeignete Lösungsmittel wie niedere Alkohole, Cycloalkanole, Ketone eluiert. Es bietet sich dabei eine Kombination von Reinigungsschritten zur Aufreinigung an. Nach der Abtrennung der Zellen vom Kulturüberstand mittels Zentrifugation der Fermentationslösung kann durch Verringerung des ph-Wertes des Kulturüberstandes auf 2,5 bis 3,5 mittels starker Säuren wie Salzsäure oder Schwefelsäure bzw. durch Zugabe zweiwertiger Ionen wie z. B. Mg²⁺, Mn²⁺, Ba²⁺ die Präzipitation der Peptide ausgelöst werden. Das durch Zentrifugation gewonnene Präzipitat kann in alkalischem Puffer oder organischem Lösungsmittel aufgenommen werden, auf eine mit Trägermaterial wie Sephadex^® G20, Superdex^® Peptide (HR 10/30)(Pharmacia), XAD-Adsorberharze^® (Serva), Toyopeari^® HW 40 (Tosohaas) u. a. gefüllte Säule gepumpt und die adsorbierten Peptide mit Puffer-Lösungsmittel-Gemisch eluiert werden. Nach der Vereinigung der antifungal aktiven Fraktionen und Entfernen des Lösungsmittels sind weitere an sich bekannte chromatografische Aufreinigungsschritte erforderlich. Durch wiederholte Verwendung von Lösungsmittelgradienten aus polaren Eluenten (R=OH, R=C₁-C₃) in Kombination mit basischen Pufferlösungen wie (NH₄)₂HPO)₄ können die erfindungsgemäßen Peptide in einer Reinheit von 96 bis 98,5% gewonnen werden.

Nach der ersten chromatografischen Aufreinigung können die peptidangereicherten lyophilisierten Fraktionen auch an einer präparativen Reversed-Phase-HPLC-Säule (RP18; Tosohaas, Macherey-Nagel) unter Verwendung polarer Lösungsmittel (Trifluoressigsaure, -CH₃OH-H₂O-Gemische) bis zu einer Reinheit von 98 bis 99% aufgereinigt werden. Nach abschließender Einengung und Lyophilisation der aufgereinigten Fraktion kann mittels einer HPLC-Analyse die erhaltene Reinheit mittels einer RP-18-Säule (Merck, LiChrospher^® 100RP-18, 5 µm, L124 mm/ID 4 mm) ermittelt werden. Die erfindungsgemäßen Peptide liegen nach der Aufreinigung in Pulverform vor. Sie können aber auch als wäßriges Konzentrat, am Träger getrocknetes Granulat bzw. in Tablettenform bei T= 0 °C bis 50°C gelagert werden.

Die Peptide A, B, C, D, E, F zeigen ein breites antimikrobielles Wirkungsspektrum, das eine Vielzahl wirtschaftlich bedeutender Pilze, insbesondere phyto- und human pathogene Arten, einschließt (Tabelle 3).

Tabelle 3 Pilze, die durch die erfindungsgemäßen Peptide gehemmt werden filamentöse Pilze

- Altemaria radicina
- Altemaria chrysanthemi
- Aspergillus avamori
- Asperginus fumigatus
- Aspergillus niger
- Aumobasidium pulians
- Botrytis cinerea
- Chaetomium globosum
- Cladosporium herbarum
- Cochliobolus lunata
- Coniophora putanea
- Coriolus versicolor
- Curvularia inequalis
- Curvularia radicina
- Cylindrocarpon destructans
- Fusarium avenaceum
- Fusarium culmorum
- Fusarium equiseti
- Fusarium graminearum
- Fusarium oxysporum f.sp. callistephus
- Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum
- Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis
- Fusarium oxysporum f.sp. dianthi
- Fusarium oxysporum f.sp. gerberae
- Fusarium oxysporum f.sp. gladioli
- Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici
- Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici
- Fusarium oxysporum f.sp. pisi
- Fusarium solani
- Gäumannomyces graminis
- Gerlachia nivale
- Gloeophyllum trabeum
- Humicola grisea
- Penicillium chrysogenum
- Penicillium islandicum
- Penicillium roqueforti
- Petriella setifera
- Phialophora cinerescens
- Phoma chrysanthemicola f.sp. chrysanthemicola
- Phoma lingam
- Phoma medicagenes
- Phomopsis sclerotioides
- Phytophthora nicotianae
- Pleurotus ostreatus
- Polyspora sydowina
- Porea placenta
- Pyrenochaeta lycopersici
- Rhizoctonia solani
- Sclemtinia sclerotiorum
- Serpula lacrimans
- Stromatinia fresiae
- Thilaviopsis basicolae
- Trichoderma lignorum
- Trichorus specialis
- Verticillium dahliae

Hefen

- Candida albicans
- Candida famata
- Candida glabrata
- Candida guilliermondii
- Candida kruseli
- Candida parapsilosis
- Candida pseudotropicalis
- Candida tropicalis
- Candida utilis
- Cryptococcus neoformans
- Endomycopsis lipolytica
- Saccharomyces cerevisae
- Trichospora cutaneum.

Durch die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (im folgenden MHK genannt) mittels Agarverdünnungstest wurde die antifungale Aktivität der erfin dungsgemäßen Peptide gegen ausgewählte Pilze bewertet und mit der Wirkung ausgewählter kommerzieller Antimykotika und Fungizide verglichen (Tabelle 4).

Zur Bestimmung der MHK wurden Petrischalen mit einem biomalzhaltigem Medium oder einem Hefeminimalmedium eingesetzt, denen die erfindungsgemäßen Peptide in verschiedenen Konzentrationsstufen zugesetzt wurden.

Die ausgewählten Pilze wurden 10 Tage auf einem geeigneten Agarmedium wie Kartoffeldextrose- oder Sabouraud-Agar in Petrischalen kultiviert, und durch Ab schwemmung und ggf. Verdünnung mit physiologischer Kochsalzlösung wurde eine Sporen- bzw. Zellsuspension mit definierter Keimdichte in Abhängigkeit von der Pilzspecies hergestellt. Von diesen Suspensionen wurden je 5 µl punktförmig auf die vorbereiteten Testpetrischalen aufgeimpft.

Die Inkubation erfolgte bei 21°C, 25°C bzw. 30°C in Abhängigkeit von der Pilzart. Nach 2 bis 5 d, je nach Entwicklungsgeschwindigkeit der Testpilze, wurde ausgewertet.

Als MHK wurde die Konzentration des Wirkstoffs in der ersten nicht bewachsenen Testpetrischale bewertet.

Die Erfindung betrifft im besonderen Maße die pharmazeutische Wirkung der erfin dungsgemäßen Peptide.

Hierbei betrifft die Erfindung insbesondere die Verwendung eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Peptide allein oder neben anderen Substanzen als antimykoti sche oder antivirale Wirksubstanz in einem therapeutisch anwendbaren Präparat.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind hochwirksam gegen humanpathogene pilzliche Erreger, wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist. Die MHK-Werte der einzelnen Peptide A bis F unterscheiden sich aufgrund ihrer differenzierten Struktur und in Abhängigkeit von den untersuchten humanpathogenen Pilzen, sie liegen etwa im Bereich zwischen 1 bis 100 µg/ml. Insbesondere die Peptide D und E sind dabei mit den parallel untersuchten kommerziellen Wirkstoffen unter den gegebenen Testbedingungen vergleichbar.

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide gegen humanpathogene Pilze ist ins besondere bedeutungsvoll, da weltweit zunehmend chronische, rezidivierende oder andere massiv verlaufende Pilzinfektionen mit ihren Auswirkungen auf das Immun system auftreten. Forciert wird die Zunahme von systemischen pilzlichen Infektionen bei entsprechender Prädisposition durch eine Schwächung der Immunkompetenz aufgrund der Verwendung von immunsuppressiven Mitteln, Karzinostatika u. a. Dabei stellt die Zunahme von Resistenzen der pilzlichen Erreger gegen therapeutisch eingesetzte Antibiotika ein besonderes Problem dar. Die Resistenzentwicklung und die oft damit verbundene Ausbildung von Kreuzresistenzen wird dadurch begünstigt, daß Wirkstoffe ähnlicher Struktur zum Einsatz kommen. So zeichnet sich bei den Antimykotika eine Favorisierung azolhaltiger Wirkstoffe ab, die gegen ein breites Spektrum pilzlicher Erreger wirksam sind und sich chemisch synthetisieren lassen, z. B. Clotrimazol, Ketokonazol und Itraconazol (Imidazol) oder Fluconazol (Triazol). Die erfindungsgemäßen Peptide unterscheiden sich in ihrer Struktur grundlegend von dieser Wirkstoffgruppe und stellen damit eine echte Alternative für die Behandlung von Pilzinfektionen dar.

Es wurde weiterhin gefunden, daß die erfindungsgemäßen Peptide eine antivirale Wirkung haben. Beispielsweise wird durch die Peptide A, E und F die Virusreproduktion bei infizierten Zellen und/oder isolierten Viren in vitro hemmend beeinflußt. Desweiteren wird die Adsorption der Viren an die Zellen unterdrückt.

Untersuchungen zu möglichen allergieauslösenden Wirkungen durch die erfin dungsgemäßen Peptide an einem Modellsystem zur Histaminfreisetzung aus Mast zellen ergaben, daß derartige Wirkungen erst bei Konzentrationen auftreten, die medizinisch nicht mehr relevant sind.

Das unterstützt die Möglichkeit einer therapeutischen Nutzung der erfindungsgemä ßen Peptide bei Mensch und Tier.

Für eine Anwendung in der Landwirtschaft ist der Einsatz von hochreinen erfin dungsgemäßen Peptidwirkstoffen nicht erforderlich.

Gegenstand des Patentes sind daher auch Wirkstoffextrakte die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide enthalten. Diese, im folgenden als Extrakte bezeichneten, Wirkstoffextrakte werden unter standardisierten Bedingungen her gestellt, sind in ihrem Peptidspektrum definiert zusammengesetzt und können auf grund ihrer relativ einfachen Herstellungsweise großflächig, zum Beispiel als Fungizid gegen phytopathogene Pilze, eingesetzt werden.

Zur Herstellung der Extrakte können Extraktionsverfahren mit organischen Lö sungsmitteln, Batchverfahren, bei denen die Kulturlösung über das Trägerbett gespült und anschließend eliminiert wird, verwendet werden, oder die Extrakte werden nach Präzipitation bzw. Zentifugation über Säulenchromathographie, anschließende Entfernung der organischen Lösungsmittelanteile und abschließende Lyophylisation gewonnen.

Die erfindungsgemäßen Extrakte können als Pulver, Granulat, in Tabletten- oder Stäbchenform bei einer Temperatur von 0°C bis 50°C gelagert werden. Aufgrund ihrer guten wasserlöslichen Eigenschaften kann bedarfsgerecht Sprüh- oder Tauchlösung aus dem Pulver/Granulat hergestellt werden, während die Stäbchen z. B. insbesondere für Langzeitbehandlungen geeignet sind.

Die Extrakte haben ein antifungales Wirkungsspektrum, das mit dem der hochreinen erfindungsgemäßen Peptide vergleichbar ist. Ihre minimalen Hemmkonzentrationen liegen aufgrund der unterschiedlichen qualitativen und quantitativen Zusammenset zung, entsprechend dem angewendeten Herstellungsverfahren, höher als die der hochreinen Peptide (Tabelle 5). Die MHK wurden ermittelt wie für die MHK der hoch reinen Peptide beschrieben.

Tabelle 5

Antifungale Aktivität der Extrakte, enthaltend erfindungsgemäße Peptide im Vergleich zu einem kommerziellen Fungizid (MHK in µg/ml)

Verwendungsmöglichkeiten für die beschriebenen Extrakte bzw. erfindungsgemäßen Peptide sind aufgrund ihrer antifungalen Wirkung die Anwendung im Pflanzenschutz, z. B. bei der Bekämpfung von Pilzkrankheiten bei Pflanzen, bei Gewächshaus- und Feldkulturen, bei der Pflege von infizierten Bäumen, bei der Wiederaufforstung zu rekultivierender Flächen sowie auch als antifungaler Zusatz zu Desinfektionsmitteln. Dabei können die erfindungsgemäßen Wirkstoffkomplexe als lagerfähiges trockenes Pulver, Granulat, Zuschlagsstoff oder Sprüh- bzw. Tauchlösung formuliert sein.

Die Extrakte bzw. erfindungsgemäßen Peptide können mit verschiedenen Träger stoffen in einem beliebigen herkömmlichen Verfahren zur Formulierung von Agro chemikalien kombiniert werden und sind so als biogenes Fungizid in Landwirtschaft und Gartenbau einsetzbar.

Neben der primären antifungalen Wirkung wurden weitere Wirkungen der erfin dungsgemäßen Peptide/Extrakte nachgewiesen, die in Land- und Forstwirtschaft sowie Landschafts- und Gartenbau bedeutungsvoll sind. Das betrifft insbesondere pflanzenwachstumsfördernde, pflanzenvermittelte nematodenhemmende, pflanzen virenhemmende und spezifische antibakterielle Effekte.

Daher bezieht sich die Erfindung aufgrund der pflanzenwachstums- bzw. vitalitäts fördernden Eigenschaften auch auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Pepti de/Extrakte in geeigneter Formulierung als pytoeffektiver Wirkkomplex bzw. Pflanzenstärkungsmittel. Beispielsweise können Wurzelwachstum, Blattmasse und/oder Fruchtgewicht positiv beeinflußt werden. Das Auflaufen von Saatgut und die Entwicklung der Keimpflanzen werden gefördert.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Pep tide/Extrakte in geeigneter Formulierung als selektives Nematizid, da über eine Pflanzenbehandlung eine hemmende Wirkung auf Phytonematoden, z. B. Meloido gyne spp., vermittelt wird.

Im Gegensatz zur generellen Schädigung von Phytonematoden und ökologisch nützlichen Nematoden durch kommerzielle Nematizide wird somit durch die erfin dungsgemäßen Peptide bzw. Extrakte eine selektive Hemmung der Vermehrung von Phytonematoden bewirkt.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Pep tide/Extrakte in geeigneter Formulierung als Mittel zur Verhinderung und/oder Be kämpfung von Viruskrankheiten bei Pflanzen, wie z. B. Tabakmosaikvirus.

Die erfindungsgemäßen Peptide/Extrakte üben eine spezifische antibakterielle Wirkung aus, die insbesondere in einer Hemmwirkung gegen Clavibacter michiganense und Streptomyces spp., insbesondere Streptomyces scabies, besteht. Hierdurch können die erfindungsgemäßen Extrakte in geeigneter Formulierung als Mittel zur Bekämpfung spezieller Bakterienerkrankungen bei Kulturpflanzen, wie zum Beispiel von Kartoffelschorf und der bakteriellen Tomatenwelke, eingesetzt werden.

Die Erfindung soll anhand folgender Beispiele näher erläutert werden:

Beispiel 1 Fermentation im Schüttelkolbenmaßstab

Bacillus amyloliquefaciens DSM 10273 wird in folgendem Medium kultiviert, um erfin dungsgemäße Peptide zu erhalten:

Pankreatisches Pepton (Casein, Fleisch)	22,5 g
Glucose	1,0 g
Dikaliumhydrogenphosphat	2,0 g
Natriumchlorid	3,0 g
Destilliertes Wasser	1,0 l
pH	7,2
(Sterilisation 15 Min. bei 121°C)

Die Fermentation wird in Rundschüttelkolben (500 ml Volumen) durchgeführt. Die Schüttelkolben werden mit 100 ml Medium gefüllt. Beimpft wird mit einer Impföse von einem frisch bewachsenen Schrägagarröhrchen (24 h, 30°C). Die Kultivierung erfolgt bei 25°C und 220 rpm, der Abbau nach 72 Stunden.

Beispiel 2 Fermentation im 5 l-Maßstab

Die Fermentation wird in folgendem Medium durchgeführt, um eine hohe Ausbeute der erfindungsgemäßen Peptide zu erhalten:

Sojaschrot	12,0 g
Casein	1,5 g
Lactose	22,4 g
Natriumchlorid	2,0 g
Dinatriumhydrogenphosphat	2,0 g
Leitungswasser ad	1,0 l

Die Fermentation erfolgt in einem 5 l-Laborfermentor mit einer Füllmenge des Me diums von 2,5 l. Beimpft wird mit einer 8-Stunden-Kultur des Stammes DSM 10273 im Medium aus Beispiel 1. Die Beimpfungsdichte beträgt 1×10⁷ cfu/ml. Die Kultivierung erfolgt bei 25°C, 700 rpm und einem Sauerstoffeintrag von 30 l/h. Zur Unterdrückung der Schaumbildung wird nach Bedarf Antischaummittel hinzudosiert.

Der Abbau erfolgt nach ca. 56 Stunden.

Beispiel 3 Aufarbeitung der Kulturlösung

Nach dem Abbau der Schüttelkultur bzw. des Fermentors erfolgte eine Kombination von Reinigungsschritten zur Aufreinigung.

Die Fermentationslösung wird 20 min bei 5°C und 9000 U/min zentrifugiert. Die Zellen und unlöslichen Medienbestandteile werden durch Dekantieren vom Kulturüberstand getrennt, und mit einem Wasser-Methanol-Gemisch (50%) gewaschen und erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Die methanolhaltigen Fugate können nach der Entfernung des Methanol im Vakuum mit dem Kulturüberstand vereint werden.

Es wird 6n HCL (5 bis 20 ml/l) zum Fugat unter Rühren zugesetzt bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 3,0 bei einer Temperatur von 5°C bis 10°C; nach mehrstündi gem Stehen (2 bis 6 h) wird das Präzipitat durch Zentrifugation 10 bis 20 min bei 5°C und 7000 bis 9000 U/min abgetrennt und der Überstand verworfen. Das Präzipitat wird in 1 molarem (NH)₂HPO₄ aufgenommen und die pH-neutralen wasserlöslichen Anteile werden einer chromatografischen Trennung zugeführt.

Beispiel 4 Hochreinigung der Peptide A

Das Präzipitat wird in alkalischem Puffer, vorzugsweise in Ammoniumhydrogenphosphat-Puffer, aufgenommen und an einer Adsorberharzsäule z. B. aus Polyacrylesterharzen, vorzugsweise mit einer Poren größe < 10 nm, mittels Gradiententechnik unter Verwendung eines Wasser-Methanol- Gradienten vorgereinigt.

Nach der Vereinigung und Konzentration der antifungal aktiven Fraktionen im Vakuum, welche durch die Hemmung des Wachstums von Endomycopsis lipolytica mittels eines Agardiffusionstests definiert werden, wird das Konzentrat (2-4% des Säulenvolumens) auf eine Toyopearl^® HW 40-F-Säule (TosoHaas) zur weiteren Trennung aufgebracht und unter Verwendung von Lösungsmittelgradienten aus polaren Lösungsmitteln und alkalischem Puffer, wie zum Beispiel 0,05 m (NH)₂HPO₄- Puffer und Methanol im Verhältnis 5 : 1 bis 1 : 2 in Gradiententechnik, eine Auftrennung der Komponenten erreicht. Durch Wiederholung des gesamten Regimes und anschließender Entsalzung und Lyophilisation können die erfindungsgemäßen Peptide in einer Reinheit von 96 bis 98,5% gewonnen werden.

B

Nach der ersten Aufreinigung mittels Gelchromatografie, vorzugsweise bestehend aus Copolymerisaten aus Ethylenglykol und polymerem Metacrylaten, können die peptidangereicherten Fraktionen auch an einer präparativen HPLC-Säule (Silasorb^® C8, 250×16,5 µm) unter Verwendung polarer Lösungsmittel, vorzugsweise Methanolgemische in verschiedenen Konzentrationen mit Trifluoressigsäure-Zusatz (TFA), bis zu einer Reinheit von 98 bis 99% aufgereinigt werden. Nach erfolgter Einengung der aufgereinigten aktiven Fraktion und Lyophilisation derselben kann mittels einer HPLC-Analyse an einer RP-18-Säule (Merck, LiChrospher^® RP-18, 5µm, L124 mm/ID 4 mm) die erhaltene Reinheit bestimmt werden.

Beispiel 5 Herstellung von Extrakten A aus Schüttelkulturen

Die Fermentationslösung wird 30 min bei 5°C und 9000 U/min zentrifugiert. Die Zellen und unlöslichen Medienbestandteile werden durch Dekantieren vom Kulturüberstand getrennt, mit einem Wasser-Methanol-Gemisch (50%) gewaschen und erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Die methanolhaltigen Fugate können nach der Entfernung des Methanol im Vakuum mit dem Kulturüberstand vereint werden. Es wird 6n HCL (ca. 10 ml/l ) zum Fugat unter Rühren zugesetzt bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 3,0 bei einer Temperatur von 10°C; nach mehrstündigem Stehen (2 bis 6 h) wird das Präzipitat durch Zentrifugation 20 min bei 5 °C und 9000 U/min abgetrennt und der Überstand verworfen.

Das Präzipitat wird in alkalischem Puffer, 0,05 M Ammoniumhydrogenphosphat, aufgenommen und an einer Adsorberharzsäule, vorzugsweise Polyacrylesterharze wie Serdolit^® (Serva), mittels Gradiententechnik unter Verwendung von Methanol- Wasser-Gemischen vorgereinigt. Dazu wird die beladene Säule zunächst mit zwei Säulenvolumina Wasser und anschließend mit 20%igem Methanol gewaschen. Die Elution der Wirkstoffe erfolgt dann mit zwei Säulenvolumina 75%igem Methanol und die Reinigung der Säule mit Methanol. Die antifungal aktiven Fraktionen werden mikrobiologisch bestimmt und vereinigt, im Vakuum eingeengt und erneut an der Adsorberharzsäule gereinigt. Die antifungalen Fraktionen werden lyophilisiert und mittels HPLC die Zusammensetzung der Extrakte bestimmt.

B aus Fermentorbrühen

I) Bei Kultivierung in 300 l bis 3000 l-Fermentoren wird im ersten Schritt die Abtren nung des Bioschlammes im Separator vorgenommen. Der Fermentationsüberstand mit den extrazellulären Peptiden wird mittels Ultrafiltration (30 kD cut off) für die an schließende Umkehrosmose vorbereitet. Dabei erfolgt eine Aufkonzentrierung um den Faktor 10. Die verbleibende Kulturlösung wird im Batchverfahren in 300 l Rührkesseln mit den mechanisch stabilen Adsorberharzen wie Serdolit^® (Serva) intensiv vermischt. Anschließend erfolgt die Abtrennung des Trägers in einer Siebkorbzentrifuge. Der so vom Kulturüberstand befreite Träger wird mit Wasser und anschließend einem Lösungsmittel-Wasser-Gemisch, vorzugsweise CH₃OH im Verhältnis von 25 : 75, gewaschen, abzentrifugiert und anschließend mit Lösungsmittel bzw. einem Gemisch, vorzugsweise CH₃OH/H₂O-Gemisch im Verhältnis 75 : 25, das Produkt eluiert. Das durch Zentrifugation abgetrennte produktenthaltende Eluat wird nach der Entfernung des Methanols im Vakuumrotationsverdampfer zur Trocknung mittels Lyophilisation, Sprühtrocknung oder Wirbelschichttrocknung an Trägern überführt.

II) Nach der Abtrennung der Biomasse im Separator werden die Kulturüberstände in große Hängegefäße à 300 l überführt und im Verhältnis von 1 : 4 mit iso-Butanol eine Stunde kräftig verrührt; nach 3 h ist die Phasentrennung erfolgt und die organische Phase wird vom Kulturüberstand abgetrennt und im Vakuum vom Produkt entfernt.

Die Prozesse I) und II) sind ebenso kontinuierlich durchführbar.

Beispiel 6 Wirkung gegen azolresistente humanpathogene Hefen

Es wurde die Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide C und E gegen verschiedene humanpathogene Pilze im Agarverdünnungstest in Form eines MHK-Testes unter sucht.

Als Agarmedium wurde ein Hefe-Minimalmedium verwendet, zu dem die lyophylisier ten Peptide (weißes Pulver) in verschiedenen Verdünnungen bzw. als Vergleichssubstanz der therapeutische Wirkstoff Fluconacol zugegeben wurden. Es wurden humanpathogene Laborstamme und azolresistente Patientenstamme getestet.

Wirkung der Peptide C und E gegen azolresistente humanpathogene Hefen

Hieraus ist ersichtlich, daß die geprüften azolresistenten Stämme sensibel sind gegen die erfindungsgemäßen Peptide.

Beispiel 7 Wirkung gegen Influenzaviren

Es wurde der Einfluß der erfindungsgemäßen Peptide A, E und F auf die Reproduk tion des Influenzavirus A/Viktoria/35/72 untersucht. Im Vergleich dazu wurde Reman tadin getestet, ein therapeutisch relevanter Wirkstoff, dessen Wirkung in der Frühphase der Virusvermehrung einsetzt und auf der Blockierung der viralen RNA- Synthese in der Transkriptionsphase beruht.

Zur Vermehrung der Viren wurden Chorioallantoismembranen von 12 bis 15 Tage alten Hühnerembryonen verwendet, deren Nährlösungen mit unterschiedlichen Kon zentrationen (1 bis 100 µg/ml) der Wirkstoffe versetzt wurden. Mittels der Bestim mung der Hämagglutination wurde nach 48 h festgestellt, bei welcher Konzentration die Virusvermehrung gehemmt wurde (Tabelle 7).

Das Peptid E zeigte bereits bei geringerer Konzentration als Remantadin eine ver gleichbare virusreproduktionshemmende Wirkung (Peptid E: 10 µg/ml = 3,5; Reman tadin: 25 µg/ml = 3,5).

Einfluß der zyklischen Peptide A, E und F und von Remantadin auf die Reproduktion des Influenzavirus A/Viktoria/35/72

Beispiel 8 Wirkung gegen HIV- Erreger

Es wurde der Einfluß der erfindungsgemäßen Peptide auf das HIV-1-Virus unter sucht.

Insbesondere wurde das Peptid A zu zwei verschiedenen Zeitpunkten der Infektion der Wirtszelle mit HIV-1-Viren appliziert (1 h bzw. 5 d bei 37°C) und nach fünftägiger Inkubation sowohl seine Wirkung auf die Adsorption des HIV-1-Virus an die Wirts zelle als auch auf die Virusreproduktion geprüft.

Mit Hilfe eines ELISA-Tests zum quantitativen Nachweis eines definierten Antigens (Expression des Hüllproteins p24) wurde die Menge der löslichen viralen Antigene des HIV-1-Virus bestimmt. Es zeigte sich, daß das erfindungsgemäße Peptid A einen Einfluß auf die Adsorption des Virus an der Zelloberfläche ausübt.

Parallel wurde in einem Immunofluoreszenznachweis mittels markierter monoklonaler Antikörper gegen das HIV-I-R24-Protein an der Zellinie MT4 der Einfluß des Peptides auf die Vermehrung gemessen.

Die Ergebnisse (Tabelle 8) zeigen, daß das Peptid A sowohl die Adsorption als auch die Reproduktion des HIV-1-Virus an der geprüften Zellinie inhibiert.

Konzentrationen von < 10 µg/ml Peptid A verringern die Reproduktion des HIV-1-Virus um ca. 50 bzw. 40%. Damit liegt es im Wirkungsbereich des vergleichsweise in diesem Test geprüften Azidothymidin (AZT), einem bei der HIV-Therapie eingesetzten Virostatikum. Im untersuchten Konzentrationsbereich gibt es keine Hinweise für zytotoxische Wirkungen.

Nachweis der Wirkung des Peptides A auf die Adsorption und Reproduktion des HIV-1 an humanen Lymphozytenzellkulturen MT 4

Beispiel 9 Wirkung auf Papilloma-Viren

Es wurde der Einfluß der erfindungsgemäßen Peptide auf DNA-Viren, speziell das Papilloma-Virus, untersucht.

Als Testsystem diente eine humane epitheliale Cervixcarzinomzellinie mit integriertem Humanpapillomvirus (HPV)-18-Genom (HeLa).

Die Untersuchung des Einflusses der Peptide auf den Gehalt an virusspezifischer Sequenz wurde mit NORTHERN-Blot-Analysen mit zellulärer Gesamt-RNS durchge führt.

Dazu wurden 5000 HeLa-Zellen/ml über 96 h mit verschiedenen Peptidkonzentratio nen inkubiert, die RNS der subkonfluenten Kultur isoliert, an Nylonfilter gebunden und mit radioaktiv markierten HPV 18 bzw. HPV 16 Proben hybridisiert. Es wurde die Abschwächung des Hybridisierungssignals im Vergleich zur unbehandelten Kontroll kultur bestimmt:

Beeinflussung der Translation der Virus-RNS (HPV)-18-Genom(HeLa) durch erfindungsgemäße Peptide (NORTHERN-Blot-Analyse)

In Abhängigkeit von der Peptidkonzentration konnte eine unterschiedliche Beein flussung der Translation der Virus-RNS nachgewiesen werden.

Beispiel 10 Selektive phytonematodenhemmende Wirkung

Es wurde die phytonematodenhemmende Wirkung eines Extraktes, hergestellt nach Beispiel 5, enthaltend die erfindungsgemäßen Peptide in definierter Zusammen setzung, ermittelt. Dazu erfolgte eine Quarzsandanzucht von Salatpflanzen der Sorte "Attraktion" in 4 cm-Topfpaletten. Nach 28 Tagen wurden die Pflanzen mit dem Extrakt behandelt. Hierbei wurden 5 Verdünnungsstufen (100 µg bis 0,01 µg/ml) im Sprühverfahren auf die Blätter mit einer Aufwandmenge von 0,5 ml ausgebracht. Als eine weitere Variante wurde der gleiche Extrakt in 3 Verdünnungsstufen (100 µg bis 1 µg/ml) im Gießverfahren mit einer Aufwandmenge von 5 ml/Gefäß in den wurzelnahen Raum der Salatpflänzchen appliziert. Pro Variante wurden 36 Pflanzen getestet.

Vier Tage nach der Behandlung wurden 500 Larven von Meloidogyne hapla in jeden Topf gegossen. Die Inkubation der Pflanzen erfolgte bei 22°C und 16 h Licht. 21 Ta ge nach Zugabe der Larven wurde die Anzahl der gebildeten Gallen bestimmt.

Wirkung von Wirkstoffextrakten auf die Invasion und die Vermehrung von Meloidogyne hapla an Salatpflanzen

Die Ergebnisse zeigen, daß konzentrationsabhängig eine deutliche Verminderung der Zahl gebildeter Gallen durch Meloidogyne hapla infolge einer Extraktapplikation erreicht wird. Die ermittelten Effekte, die insbesondere durch jeweils geringe Konzentrationen ausgelöst wurden, werden indirekt über den beeinflußten Stoffwechsel der Pflanze vermittelt.

Beispiel 11 Beeinflussung von Gesundheit und Fruchtbildung bei Tomaten

In einem Gefäßversuch mit Tomatenpflanzen der Sorte "Harzfeuer" wurden unter Gewächshausbedingungen die gesundheits- und ertragsfördernden Wirkungen der erfindungsgemäßen Peptide/Extrakte untersucht.

Es wurden 6 Wochen alte Tomaten pflanzen in die Versuchsgefäße gepflanzt und einer Behandlung mit Extrakt (0,7 µg/ml bzw. 70 µg/ml) oder Leitungswasser (Kontrollvarianten) unterzogen. Zusätzlich wurde mit einer Inokulationssuspension des Tomaten-Welkepathogens Fusarium oxysporum f.sp.radicis lycopersici (10⁷ Konidien/ml) ein latenter Krankheitsstreß gesetzt. Jeweils die Hälfte der behandelten bzw. unbehandelten Pflanzen wurden entweder mit 50 ml der Fusariumsuspension als Gießapplikation sofort nach erfolgter Behandlung inokuliert (Methode A) oder 6 Wochen nach der Behandlung mittels Verletzung im Wurzelraum und nachfolgendem Gießen von ebenfalls 50 ml der gleichen Fusariumsuspension (Methode B). Nach 6 Wochen wurden die Tomatenpflanzen gestutzt. Die Pflanzen wurden regelmäßig ausgegeizt und gedüngt. Im Verlaufe der Kultur traten nur geringfügige Wel kesymptome im Versuchsteil A auf. Am Versuchsende wurde bei diesen Pflanzen durch eine Stengelquerschnittsbonitur und anschließende Erregerisolierung der Anteil erkrankter Pflanzen festgestellt. Die Pflanzen, die mittels Inokulationsmethode A inokuliert waren, wurden hinsichtlich der Merkmale "Blütenzahl" und "Welkebefall" nach 8 Wochen beurteilt. Da keine Welkesymptome auftraten, wurden die Pflanzen, die mittels Inokulationsmethode B inokuliert waren, bis zur Fruchtbildung weiterkul tiviert und hinsichtlich der Fruchtbildung bewertet.

Tabelle 11

Beeinflussung des Welkebefalls (Fusarium oxysporum f.sp.radicis lycopersici) und der Fruchtbildung bei Tomaten durch Behandlungen mit Wirkstoffextrakten

Die Ergebnisse zeigen, daß sowohl ein aufgetretener Welkebefall eingeschränkt als auch das Blühen und Fruchten der Tomatenpflanzen durch die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Extrakten in den untersuchten Konzentrationen begünstigt wer den.

Beispiel 12 Fungizide Wirkung gegen Fusarium oxysporum f.sp. dianthi sowie Effekte auf das Wachstum bei Dianthus caryophyllus

Unter Gewächshausbedingungen wurde die Wirkung der erfindungsgemäßen Pep tide/Extrakte auf die Welkeentwicklung und das Längenwachstum von Dianthus caryophyllus der Sorte "Wiener Mischung" geprüft. Dazu wurden die Pflanzen mittels Aussaat in humose Einheitserde 23 Tage vor dem Versuchsansatz angezogen und in 6 cm Multitopfpaletten pikiert. Drei Tage später erfolgte die Behandlung der Pflanzen mit einer Extraktlösung bzw. Leitungswasser (Kontrolle). Die Hälfte der Pflanzen einer Behandlungsvariante wurde durch Gießen von 2 ml einer Konidiensuspension von Fusarium oxysporum f.sp. dianthi (10⁶ Konidien/ml) inokuliert. Die Zahl der Wie derholungen betrug 12, die Versuchsdauer 70 Tage.

In regelmäßigen Abständen wurden die Nelken auf Welkesymptome untersucht (visuelle Bonitur: 0. . .5; 5=tot) und die Pflanzenhöhe gemessen.

Effekt einer Wirkstoffextraktbehandlung auf den Erreger der Weißge fäßfusariose (Fusarium oxysporum f.sp. dianthi) bei Dianthus caryo phyllus und das Längenwachstum der Nelken

Die Ergebnisse zeigen eine erhebliche Hemmung der Welkeentwicklung durch App likation von 1 µg/ml Extraktlösung in das Modellsystem, wobei ein relativ hoher Be fallsdruck durch den eingebrachten Welkeerreger vorlag. Bei Nelkenpflanzen ohne Fusariuminokulation war eine signifikante Längenwachstumsförderung nachweisbar.

Beispiel 13 Reduktion des Welkeauftretens bei Callistephus chinensis

In einem Modellsystem mit Callistephus chinensis der Sorte "Silberturm" wurde der zeitliche Welkeverlauf an mit Extrakten behandelten Pflanzen im Vergleich zu unbe handelten Kontrollpflanzen untersucht.

Zehn Tage alte Asternpflänzchen wurden in 5 ml-Topfpaletten in quarzsandhaltiges Substrat pikiert und mit einer extrakthaltigen Lösung in Form einer Gießapplikation, Vergleichspflanzen mit Leitungswasser, behandelt.

Ein Teil der Pflanzen aus der behandelten und unbehandelten Variante wurden sofort bzw. drei Tage später mit Fusarium oxysporum f.sp. callistephus als Gießbehandlung inokuliert.

Es kamen 24 Pflänzchen pro Variante zum Einsatz. Der Welkeverlauf wurde regel mäßig visuell bewertet (Boniturnoten 0. . . 5; 5=tot).

Effekt einer Wirkstoffextraktbehandlung auf den Erreger des Astern sterbens (Fusarium oxysporum f.sp.callistephus) in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Inokulation bei Callistephus chinensis

Das Beispiel zeigt, daß eine Behandlung mit erfindungsgemäßen Peptiden/Extrakten den Welkeverlauf direkt hemmt und diese in Abhängigkeit vom Infektionsdruck (Fusarium sofort bzw. 3 Tage später inokuliert) ihre fungizide Wirkung entfalten.

Beispiel 14 Beschleunigung der Keimung bei Mais

Maiskörner wurden in Extraktlösungen unterschiedlicher Konzentrationen für 20 min. eingelegt, anschließend rückgetrocknet und in feuchtem Milieu zur Keimung ge bracht.

Der Prozeß des Keimens wurde regelmäßig bonitiert, die Längen der Koleoptile und Radikula gemessen. Nach 3 Tagen wurden die Keimwurzeln von jeweils 15 gekeim ten Maiskörnern zum Verfolgen der weiteren Entwicklung durch die Löcher eines vorgestanzten Plasteschalendeckels gefädelt und so in eine dazugehörige Schale gehängt. Die Schale enthielt Knop'sche Nährlösung (50%). Nach weiteren 3 Tagen wurden erneut die Wurzeln und die Primärblätter gemessen.

Aus den Ergebnissen in Tabelle 14 ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Peptide/Extrakte in der Lage sind, konzentrationsabhängig den Keimungsprozeß von Maissaatgut und die nachfolgende Entwicklung der Pflanzen zu fördern.

Wirkung von Wirkstoffextraktbehandlungen in unterschiedlicher Konzentration auf die Keimung bei Zea mays

Beispiel 15 Förderung des Wurzelwachstums

Vorgekeimtes Maissaatgut mit einer durchschnittlichen Keimwurzellänge von 2 cm wurde zur Untersuchung des Einflusses der erfindungsgemäßen Peptide/Extrakte auf die Wurzelentwicklung mit der Keimwurzel durch die Löcher eines vorgestanzten Plasteschalendeckels gefädelt und so in eine dazugehörige Schale gehängt. Die Schale enthielt Knop'sche Nährlösung (50%). Nach 3 Tagen wurde die Wurzellänge gemessen.

Beeinflussung des Längenwachstums der Keimwurzel (Radicula) bei Mais durch Wirkstoffextraktbehandlungen in Abhängigkeit von der Konzentration

Aus den Ergebnissen ist abzuleiten, daß bestimmte Extraktkonzentrationen die Entwicklung des pflanzlichen Wurzelsystems günstig beeinflussen. In einer 10tägigen Nachbeobachtungszeit wurde außer der Verbesserung der Wurzellänge der Maispflanzen gefunden, daß sich auch die Zahl der Adventivwurzeln und die Zahl der Seitenwurzeln in der Variante mit 10 µg/ml deutlich verbesserte.

Beispiel 16 Nachweis allgemeiner phytoeffektiver Aktivität im Testsystem mit Lemna perpusilla

Unter Anwendung eines Testsystems zum Nachweis phytoeffektiver Verbindungen (Jungnickel P. et al.: Wiss. Zeitschr.d. FSU Jena, 35 (1986) 5) wurde das Vermögen der reinen Peptidwirkstoffe getestet, allgemein das Pflanzenwachstum zu beeinflussen.

Es wurde der Einfluß der Peptide A und E auf die Vermehrung von Wasserlinsen der Art Lemna perpusilla untersucht. Dazu wurden die Pflänzchen in einem Flüssigme dium ausreichend vermehrt (ca. 14 d) und jeweils drei in ein Reagenzglas, das Flüssigkulturmedium und die Peptide in unterschiedlicher Konzentration enthielt, geimpft. Eine Variante enthielt 15 Reagenzgläser, die zur Kultivierung schräg gelegt wurden. Nach 10 Tagen wurde die Anzahl der Wasserlinsen bestimmt.

Nachweis phytoeffektiver Aktivität durch erfindungsgemäße Peptide im Modellsystem mit Lemna perpusilla

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Peptide A und insbesondere E die Vermehrungsrate der Wasserlinsen erheblich erhöhen können.

Beispiel 17 Wirkung gegen Pflanzenviren

Es wurde die virushemmende Wirkung einer Extraktbehandlung bei Gurkenjung pflanzen untersucht. Die Anzucht der Gurkenpflanzen der Sorte "Bidretta" erfolgte in gedämpftem humosen Substrat ca. 14 Tage unter Gewächshausbedingungen. Da nach wurden die Pflanzen in 3-l-Plastgefäße ebenfalls in gedämpfte humose Erde umgetopft und mit Peptidextrakt (1 µg/ml; 10 µg/ml) behandelt, eine entsprechende Menge Pflanzen blieb unbehandelt als Kontrolle. Die Extraktbehandlungen erfolgten mit jeweils 5 ml der verschiedenen Konzentrationen in Form einer Sprühbehandlung auf die Blätter der Versuchspflanzen. Nach weiteren 3 Tagen erfolgte die Inokulation mit vorbereitetem Virusinokulum: Das Inokulationsmaterial war zuvor typisch er krankten Pflanzen in Form von Blattgewebe entnommen worden und wurde unter Zusatz eines Phosphatpuffers (Verhältnis 1 : 3) extrahiert. Die Inokulation der Pflanzen in den entsprechend vorgesehenen Varianten erfolgte durch Verreiben der Ge webeextrakte auf der Blattoberfläche mittels desinfizierter Glasspatel. Danach wurde die inokulierte Blattoberfläche mit sterilem Leitungswasser abgespült. Pro Variante kamen 37 Pflanzen zum Einsatz. Die Kultivierung erfolgte unter Gewächshausbe dingungen. Nach einem Zeitraum von 30 Tagen wurde die Zahl erkrankter Pflanzen anhand einer visuellen Bonitur ermittelt.

Wirkung von Wirkstoffextrakt-Blattapplikationen auf den Befall von Gurkenpflanzen mit CMV-Virus

Die Ergebnisse zeigen, daß eine präinfektionelle Extraktbehandlung in der Lage ist, eine Virusinfektion bei Gurkenpflanzen erheblich zu reduzieren.

Beispiel 18 Spezifische antibakterielle Wirkung der Wirkstoffextrakte

Es wurde die antibakterielle Wirkung eines Wirkstoffextraktes, hergestellt nach Beispiel 5, untersucht. Die Testungen erfolgten mittels Agardiffusionsmethode. Mit einer definierten Menge Nähragar befüllte Petrischalen (Durchmesser 9 cm) wurden gleichmäßig mit einer Suspension des entsprechenden Testbakteriums (ca. 10⁴ cfu/Platte) beimpft. In den Agar wurden pro Platte mittels Korkbohrer vier Löcher (Durchmesser 8 mm) gestanzt, in welche je 100 µl der verschiedenen Wirkstoffverdünnungen eingefüllt wurden. Die Inkubation der Platten erfolgte je nach Testbakterium 48 h bis 96 h bei 25°C. Die Bewertung der antibakteriellen Aktivität der Wirkstoffe erfolgte über die Bestimmung der Hemmhofdurchmesser.

Antibakterielle Wirkung der Wirkstoffextrakte (Durchmesser des Hemmhofes (mm) im Agardiffusionstest)

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Wirkstoffextrakte eine spezifische anti bakterielle Wirkung gegen Clavibacter michiganense und Streptomyces spp. besitzen.

Claims

1. Neue Peptidverbindungen A bis F mit der folgenden Aminosäurezusammensetzung:
I Asp, Asn, Tyr, Pro, Glu, Ser, Thr, X
II Asn (2x), Tyr, Pro, Glu, Ser, Thr, X
worin X für eine β-Aminocarbonsäure steht.

2. Neue Peptidverbindungen A bis F gemäß Anspruch 1 mit der folgenden chiralen Aminosäuresequenz:
wobei Y = Asn oder Asp
und R = verzweigte oder geradkettige Alkylgruppen der Kettenlänge C₈ bis C₂₅ sind.

3. Neue Peptidverbindungen A bis F gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine β-Aminocarbonsäure X mit verzweigten oder geradkettigen Alkylgruppen R der Kettenlänge C₈-C₂₅, insbesondere R = C₁₀ bis C₁₃ mit folgenden Strukturen enthalten:

4. Neue Peptidverbindungen A bis F gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine β-Aminocarbonsäure X mit R
enthalten.

5. Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Molekulargewicht von M = 1000 bis M = 1150 g/mol, insbesondere von 1031 g/mol, 1032 g/mol, 1045 g/mol, 1059 g/mol und 1073 g/mol aufweisen.

6. Verfahren zur Herstellung der Peptide A bis F, dadurch gekennzeichnet,daß Mikroorganismen der Gattung Bacillus inkubiert, die Peptide A bis F gebildet, adsorbtiv und/oder extraktiv isoliert und hochgereinigt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Vertreter der Bacillus subtilis-Gruppe, insbesondere B. amyloliquefaciens, B. pumilus, B. lichiniformis, B. subtilis, speziell B.amyloliquefaciens DSM 10273, oder deren Mutanten oder das genetische Material davon, das an der Synthese der neuen Peptidverbindungen A-F beteiligt ist, verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Hochreinigung der Peptide mit Reinheiten < 96% als farblose amorphe Substanzen durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und/oder unter Verwendung chromatografischer Trennverfahren und durch anschließende Trocknung durch an sich bekannte Trocknungsverfahren aus der Kulturlösung bzw. dem Kulturüberstand erfolgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Extraktion aus der Fermentationslösung, oder nach Separation des Bioschlamms unter Verwendung eines an sich bekannten Adsorbtionsvorgangs, oder durch Anwendung der Ultrafiltration und/oder der Umkehrosmose, eine Aufkonzentrierung erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß für den Adsorbtionsvorgang Adsorberharze, bevorzugt Polyacrylesterharze wie Serdolit^® XAD 7 der Korngrößen 0.05-1 mm, insbesondere 0.05-0.1 mm verwendet werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß aus Kulturlösungen oder Kulturüberständen die Peptide A bis F einzeln oder im Gemisch (Extrakt) angereichert werden.

12. Verwendung der Peptide A bis F als antimykotische und/oder virizide Wirkstoffe in Anzneimitteln, als Antimykotika und/oder Virostatika.

13. Verwendung der Peptide A bis F nach Anspruch 12, einzeln oder im Gemisch untereinander oder in Kombination mit weiteren pharmazeutischen Wirk-, Hilfs-, Träger und Zusatzstoffen zur Herstellung pharmazeutischer Präparate.

14. Verwendung der Peptide A bis F und ihrer Gemische einschließlich der Extrakte als Fungizid, Phytoeffektivum, Nematizid, Virostatikum, Desinfektionsmittel und Konservierungsmittel.

15. Verwendung des Extraktes (Wirkstoffkomplex) als Fungizid in Gartenbau und Landwirtschaft, in Form eines lagerfähigen trockenen Pulvers, Granulates, Zuschlagstoffes oder einer Sprüh- bzw. Tauchlösung.

16. Verwendung des Extraktes (Wirkstoffkomplex) als phytoeffektiven Wirkkomplex bzw. Pflanzenstärkungsmittel in Landschafts- und Gartenbau, Bodensanierung und Landwirtschaft, in Form eines lagerfähigen trockenen Pulvers, Granulates Zuschlagstoffes oder einer Sprüh- bzw. Tauchlösung.

17. Verwendung des Extraktes (Wirkstoffkomplex) als pflanzenvermitteltes nematodenhemmendes, selektives Nematizid in Gartenbau und Landwirtschaft in Gartenbau und Landwirtschaft, in Form eines lagerfähigen trockenen Pulvers, Granulates, Zuschlagstoffes oder einer Sprüh- bzw. Tauchlösung.

18. Verwendung des Extraktes (Wirkstoffkomplex) als Virostatikum in Landwirtschafts- und Gartenbau, in Form eines lagerfähigen trockenen Pulvers, Granulates, Zuschlagstoffes oder einer Sprüh- bzw. Tauchlösung.

19. Verwendung des Extraktes (Wirkstoffkomplex) als Desinfektionsmittel bzw. Desinfektionsmittelbestandteil zur Anwendung in der Umgebung von Mensch und Tier.

20. Verwendung des Extraktes (Wirkstoffkomplex) als Konservierungsmittel bzw. als Bestandteil von Konservierungsmitteln zur Konservierung von Gemüse und Obst.

21. Verwendung des Extraktes (Wirkstoffkomplexe) als selektive antibakterielle Wirkkomponente zur Bekämpfung von Bakterienerkrankungen an Kulturpflanzen in Landwirtschaft und Gartenbau besonders zur Bekämpfung der bakteriellen Erkrankungen bei Tomate durch Clavibacter michiganense und bei Kartoffel durch Streptomyces scabies in Gartenbau und Landwirtschaft.

22. Bacillus amyloliquefaciens DSM 10273.