KR100447044B1 - 오발리신을 함유하는 식물역병 방제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 오발리신을 함유하는 식물역병 방제용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 오발리신, 바람직하게는 인체에 무해한메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에CS1448 균주로부터 분리 및 정제한 천연 화합물인 오발리신〔4-하이드록시-5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)-2-옥시란닐]- 1-옥사스피로[2,5]옥탄-6-온〕을 유효성분으로 함유함으로써파이타프토라종에 의해 발생하는 식물역병을 예방 또는 치료하는 효과가 뛰어난 비료 성분 조성물 또는 농약제학적 성분 조성물 형태의 식물역병 방제용 조성물 및 항진균 효과가 뛰어난 오발리신을 이용하는 식물역병 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

오발리신을 함유하는 식물역병 방제용 조성물 {Composition for the control of late blight disease containing Ovalicin}
본 발명은 오발리신을 함유하는 식물역병 방제용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 오발리신, 바람직하게는 인체에 무해한메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에CS1448 균주로부터 분리 및 정제한 천연 화합물인 오발리신〔4-하이드록시-5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)-2-옥시란닐] -1-옥사스피로[2,5]옥탄-6-온〕을 유효성분으로 함유함으로써파이타프토라종에 의해 발생하는 식물역병을 예방 또는 치료하는 효과가 뛰어난 비료 성분 조성물 또는 농약제학적 성분 조성물 형태의 식물역병 방제용 조성물 및 항진균 효과가 뛰어난 오발리신을 이용하는 식물역병 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
20세기 후반, 산업화 이후로 농촌 노동력이 크게 감소함에 따라 식량 증산을 위하여 병충해 및 잡초 방제를 위한 유기합성농약이 비약적으로 발전하여 왔다. 그러나, 유기 합성된 생물학적 활성 물질들이 의약과 농약 등에 첨가되어 다방면으로 널리 사용됨에 따라 식품 오염 및 환경 호르몬 배출이 증가하게 되고 결과적으로 인체와 환경에 심각한 폐해를 주고 있다. 이에 생물학적 활성을 보유하면서도 저독성 내지 무공해성인 천연 물질을 탐색 및 개발하고자 하는 시도가 여러 연구자들을 통하여 진행되어 왔다.
그 결과, 자연계 특히 미생물 자원으로부터 의약 또는 농약으로서의 응용이 가능하고 역가가 높으면서도 독성이나 환경 오염이 적은 여러 가지 천연 물질이 발견되어 그 자체 형태로 또는 반합성 형태로 실용화되기에 이르렀다. 이는 오늘날 약해 문제나 농작물에의 잔류독성 문제 및 환경오염 문제를 해결할 수 있는 돌파구가 되어 왔다.
이미 상당한 수의 항진균 물질이 미생물로부터 발견되어 농약과 의약에 널리 이용되고 있다. 예를 들면, 1939년 옥스퍼드(Oxford, A. E.)등에 의하여 페니실리움 그리세오풀범 (Penicillium griseofulvum)의 배양액으로부터 분리된 그리세오풀빈 (griseofulvin)〔Oxford, A. E., Raistrick, H., Simonart, P. (1939).Biochem. J.33: 340〕은 처음에는 농약으로 개발되었다가, 그 후 피부사상균증에 대한 효과적인 경구제로 개발되어 현재도 널리 이용되고 있고, 이 외에도 1950년 하젠 (Hazen, E. L.)과 브라운 (Brown, A.)에 의하여 니스테션 (nystation)〔Hazen, E. L. and Brown, R. (1950).Science112: 423〕이, 1955년 골드 (Gold, W)등에 의하여 앰포테리신 B (amphotericin B)〔Gold, W., Stour, H. A., Pagano, J. F., and Donovick, R. (1955).Antibiot. Ann.1956: 579〕가 각각 방선균들로부터 발견되어 진균증에 대한 다양한 화학 요법이 확립되게 되었다.
한편, 농업용 항진균 물질의 개발은 유기합성 농약이 주류를 이루던 1960년대 초반부터 일본을 중심으로 이루어져, 그 동안 벼의 도열병에 대한 블라스티시딘S (blasticidin S)〔Takeuchi, S., Hirayama, K., Ueda, K., Sakai, K. and Yonehara, H.(1958).J. Antibiotics. 11A: 1-5〕와 카수가마이신 (kasugamycin) 〔Umezawa, H., Okami, Y., Hishimoto, T., Suhara, Y. and Takeuchi, T. (1965).J. Antibiotics18: 101-108〕, 문고병에 대한 폴리옥신 (polyoxin)〔Isono, K., Nagatsu, J., Kawahima, Y. and Suzuki, S. (1965).Agric. Blio. Chem.29: 848-854〕이나 발리다마이신(validamycin)〔Iwasa, T., Yamamoto, H. and Shibata, M. (1970).J. Antibiotics31:595-602〕, 맥류의 흰가루병에 대한 임디오마이신 (imdiomycin)〔Harada, S. and Kishi, J. (1978).J. Antibiotics31:519-521〕등의 항생 물질이 개발되어 독성이 강한 일부 유기합성 농약을 대체하였다. 그러나, 과채류 및 과수에 심각한 피해를 끼치는 식물역병을 방제하기 위한 항진균 물질은 아직까지 개발된 바 없어, 현재까지는 주로 유기 합성 농약을 사용하고 있는 실정이다.
식물역병 방제를 위한 유기합성 농약의 살포에 따른 상기와 같은 폐해를 방지하기 위하여 각종 진균류에 대해 광범위한 항진균력을 나타내면서도 유기합성 농약에 비하여 독성이 상대적으로 적은 항진균 물질을 탐색하고자, 인체에 무해한 것으로 알려진 국내의 각종 동충하초 및 동충하초의 불완전세대 곰팡이 자원을 탐색하고 분리하여 연구한 결과, 본 발명자들은메타리지움균주, 특히 국내 토착균주인메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에(Metarhizium anisopliaevar.anisopliae) CS1448로부터 식물역병균, 특히파이타프토라균종에 대한 항진균 활성이 있는 물질을 분리 및 정제할 수 있었다. 그 다음, 상기 분리 정제한 물질의 생물학적 및 이화학적 성상을 분석한 결과, 상기 항진균 활성물질이 4-하이드록시-5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)-2-옥시란닐]-1-옥사스피로[2,5]옥탄-6-온, 즉 신생혈관을 억제하는 물질로 잘 알려져 있는 오발리신임을 밝혀 식물역병의 예방 및 치료에 사용할 수 있는 오발리신의 신규한 이용가능성을 제공하는 한편, 상기 물질을 함유하는 식물역병 방제용 조성물을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 항진균 활성이 있는 화합물 오발리신〔4-하이드록시-5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)-2-옥시란닐]-1-옥사스피로[2,5]옥탄-6-온〕을 함유하는 식물역병 방제용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항진균 활성이 있는 오발리신을 이용하여 식물역병을 예방 및 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
도 1은 본 발명에 따른메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에CS1448 (Metarhizium anisopliae var. anisopliaeCS1448) 균주의 형태학적 특성을 나타내는 사진으로 포자생성세포 (conidiogenous cell)에 붙어있는 분생포자의 모습을 나타낸다.
도 2는 오발리신의 수소핵자기공명 스펙트럼을 보여주는 사진이다.
도 3은 오발리신의 탄소핵자기공명 스펙트럼을 보여주는 사진이다.
도 4는P. cactorum에 대한 4-하이드록시-5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)-2-옥시란닐]-1-옥사스피로[2,5]옥탄-6-온의 항진균 및 최소 억제 농도(Minimum Inhibiton Concentration: MIC)를 나타낸다.
도 5는P. cambivora에 대한 4-하이드록시-5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)-2-옥시란닐]-1-옥사스피로[2,5]옥탄-6-온의 항진균 및 최소 억제 농도를 나타낸다.
도 6은P. capsici에 대한 4-하이드록시-5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)-2-옥시란닐]-1-옥사스피로[2,5]옥탄-6-온의 항진균 및 최소 억제 농도를 나타낸다.
도 7은P. drechleri에 대한 4-하이드록시-5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)-2-옥시란닐]-1-옥사스피로[2,5]옥탄-6-온의 항진균 및 최소 억제 농도를 나타낸다.
도 8은P. infestans에 대한 4-하이드록시-5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)-2-옥시란닐]-1-옥사스피로[2,5]옥탄-6-온의 항진균 및 최소 억제 농도를 나타낸다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오발리신, 바람직하게는 국내 토착균주메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에CS1448로부터 분리 및 정제한 천연 화합물인 오발리신이파이타프토라(Phytophthora) 균종으로 인하여 발생한 식물역병을 예방 및 치료하는 방제 효과가 있음을 밝히고, 이를 함유함으로써 식물역병을 예방 또는 방제하는 효과가 뛰어난 비료 성분 또는 농약제학적 성분식물역병 방제용 조성물을 제공함을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른"오발리신 (ovalicin)"은 4-하이드록시-5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)-2-옥시란닐]-1-옥사스피로[2,5]옥탄-6-온〔4-hydroxy-5-methoxy-4-[2-methyl-3-(3-methyl-2-butenyl)-2-oxiranyl]-1-oxaspiro[2,5]octan-6-one〕을 의미하는 것이다.
본 발명에 따른 오발리신의 획득방법은 하기 (1) 및 (2)와 같다.
(1) 화학 합성에 의한 오발리신의 획득
본 발명에 따른 식물역병 방제용 조성물의 활성물질로 사용되는 화합물 오발리신은 하기 일반식 1로 표시된다.
...(Ⅰ)
화합물 오발리신은 Corey 등의 논문〔Corey, Elias J.;Dittami, James P. Dep. Chem., Harvard Univ., Cambridge, MA, USA.J. Am. Chem. Soc. (1985), 107(1): 256-7〕에 기술된 바와 같은 화학적 합성법에 의해 제조하여 수득할 수 있다. 이 방법을 간단히 설명하면, 스파이로 케톤 (spiro ketone)의 알케닐레이션(alkenylation)을 통해 오발리신을 수득하는 것이다. 이외에도 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 화학적 합성법을 이용하여 오발리신을 획득할 수 있다.
(2) 미생물로부터 분리
화합물 오발리신은 미생물의 배양물로부터 분리 정제하여 획득할 수 있다. 오발리신을 생성하는 미생물로서메타리지움이 널리 알려져 있다.
그 중에서도메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에(Metarhizium anisopliaevar.anisopliae)는곤충병원성 곰팡이 중 가장 잘 알려진 것 중의 하나이다. 이 균은하이포마이세츠(Hyphomycetes)강동충하초속(Cordyceps)에 속하는 불완전균류이며, 약 400여 종의 곤충에 대하여 병원성을 지닐 정도로 광범위한 기주 범위를 가지고 있으나, 척추동물에 대하여는 병원성을 지니지 않고 있어 안전하므로 천연 살충제 성분으로 이용할 수 있다. 이 균주에 감염된 곤충은 처음에는 곤충의 몸 전체가 흰색을 띠는 포자와 균사로 뒤덮인 후, 균사와 포자가 발달하면서 초록색을 띠게 된다. 이 균주의 분생포자는 긴 타원형으로, 플라스크 모양의 분생자 자루 위에 연쇄상으로 존재한다.
메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에는 일반적으로 감각기관의 기문이나 구멍을 통하여 곤충 체내에 침입한다. 곤충 체내에 침입한 균주의 균사는 측면생장을 하면서 증식하여 결국에는 곤충의 내부 내용물을 고갈시킨다. 균사의 생장은 곤충이 균사체로 가득할 때까지 계속되며 내부 내용물이 고갈되면 곤충의 큐티클을 뚫고 나와 포자를 형성하여 다른 곳으로 전파된다. 이 때, 곤충은 보풀에 덮인 것처럼 보이게 된다.
메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에는 감자한천평판배지에 접종하여 약 22∼28 ℃의 온도조건으로 쉽게 배양할 수 있다.
화합물 오발리신을 생성하는메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에균주는 미생물 연구 분야에서 통상의 지식을 가진 사람이라면 누구나 자연계로부터 용이하게 분리 입수하여 이용할 수 있다. 또한, 이 균주는 기탁기관인 미국 USDA-ARS을 비롯한 기타 기탁기관에 기탁 보관되어 있는 것을 분양받아 이용할 수 있다.
화합물 오발리신은 상기에서 설명한메타리지움이외에 오발리신을 생산하는 기타 균주로부터 분리한 것을 사용할 수 있다. 이러한 균주로는슈도로티움 오발리스(Pseudorotium ovalis)를 들 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명자들은 국내 토착의 각종 동충하초 및 동충하초의 불완전세대 종으로부터 화합물 오발리신을 생성 분비하는 균주를 직접 분리 및 동정하여 이를메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에CS1448 (이하, CS1448로 약칭될 수 있다)로 명명하였다. 본 발명에 따른 상기메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에CS1448는 국내 담배거세미나방에 감염시킨 형태로 채집된 것으로, 본 발명 화합물 오발리신은 CS1448 균주의 액체 배양 여액으로부터 분리 정제한 것이다.
상기메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에의 배양물로부터 본 발명에 따른 화합물 오발리신을 분리 및 정제하는 방법은 본 분야의 통상적인 기술을 이용할 수 있다. 이러한 기술로는 용매추출, 분배 크로마토그래피, 흡착과 용출 (예로는 흡착 컬럼 크로마토그래피 및 박층 크로마토그래피), 초원심분리 (예로는 분획원심 및 밀도구배원심), 분별증류 (예로는 단순증류 및 감압증류) 등이 포함되나 이에 한정하는 것은 아니다.
화합물 오발리신을 분리 및 정제하는 방법의 하나의 예로는메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에균주, 바람직하게는 CS1448 균주의 배양물을 여과한 다음 그 발효액을 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매와 혼합하여 두 층으로 분리하고, 활성 화합물을 포함한 비극성 분획을 크로마토그래피하여 화합물 오발리신을 분리 정제하는 것을 들 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 화합물 오발리신이 식물역병균, 특히파이타프토라균종에 대하여 항진균 활성이 있음을 처음으로 발견하고, 이 물질을 비료 성분 조성물 또는 농약제학적 성분 조성물 등에 첨가하여 식물역병을 예방 또는 치료하기 위한 것이다.
본 발명 명세서에 사용된"농약제학적 성분 식물역병 방제용 조성물"은 농약적으로 유효한 오발리신을 활성 성분으로 함유하여파이타프토라종에 의해 유발된 식물역병을 예방 또는 치료할 수 있는 수화제 또는 액상 등 모든 형태의 농약 조성물을 포함하는 것이다.
통상적으로,파이타프토라종에 의해 전체적 또는 부분적으로 유발된 모든 식물의 이상 징후 상태를 포괄적으로"역병"이라 한다.
본원에 사용된 용어"예방"은 본 발명의 농약제학적 성분 식물역병 방제용 조성물을 식물에 적용함으로써파이타프토라종의 감염 또는 성장을 억제 또는 차단함으로써 역병 증세가 사전에 발생되지 않도록 하는 것을 의미한다.
본 발명 명세서에 사용된"치료"는 본 발명의 농약제학적 성분 식물역병 방제용 조성물을 식물역병 징후를 나타내는 식물에 적용한 결과로서 역병의 완치는 물론 부분적 완치, 호전 및 경감을 보이는 경우를 모두 포함하는 것이다.
본 발명에 따른 비료 성분 또는 농약제학적 성분 식물역병 방제용 조성물은 유효성분으로 오발리신을 함유함으로써파이타프토라종에 의해 유발된 식물역병을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 식물역병 방제용 조성물은 화학적 합성에 의하여 제조된 화학 합성 오발리신;메타리지움균주로부터 생산되는 천연 오발리신; 메타리지움 이외에슈도로티움 오발리스균주로부터 생산되는 천연 오발리신; 또는 기타 다른 균주로부터 생산되는 천연 오발리신 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 비료 성분 또는 농약제학적 성분 식물역병 방제용 조성물은 수화제 또는 액상 등의 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 이들 제제는 모든 비료 및 농약 화학에서 일반적으로 적용되는 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 비료 성분 또는 농약제학적 성분 식물역병 방제용 조성물의 식물역병에 대한 예방 또는 치료 용량 범위는 병징의 정도 및 제형에 따라 변할 수 있다. 또한, 그 적용 횟수도 식물의 종류, 나이, 기후 조건 등에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 식물역병 방제용 조성물에 유효성분으로 함유되는 오발리신은 조성물 총 중량에 대하여 0.01중량%∼2중량%, 바람직하게는 0.1중량%∼1중량%의 농도로 존재할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 특히, 이러한 범위 내에서 특정 제형에서의 오발리신의 농도는 이들의 사용 용도에 따라 결정되는데, 사용하기 전에 희석해야 하는 액상 제제와 같은 특정 제제는 좀 더 높은 농도로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 비료 성분 또는 농약제학적 성분 식물역병 방제용 조성물은 오발리신을 포함한 기타 성분을 본 발명 분야의 통상적인 기술을 사용하여 혼합하고 그 혼합물을 적절히 원하는 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 오발리신을 함유하는 식물역병 방제용 조성물은 통상적인 방식으로, 바람직하게는 식물역병을 예방 또는 치료하기 위해서 분무 또는 분말 상태의 제형으로 뿌리 부분에 뿌려서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 비료 성분 또는 농약제학적 성분 식물방제용 조성물은파이타프토라종균에 의한 식물역병을 예방 및 치료하는 효과가 뛰어난 조성물로서, 바람직하게는 인체에 무해한 동충하초의 불완전세대 균주인메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에균주가 생산하는 천연 화합물 오발리신을 함유하기 때문에 인체에 미치는 부작용이 적어 안전하고, 환경 친화적으로 식물역병을 치료할 수있는 장점이 있다.
이하, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나, 이들은 단지 구현예로서 본 발명의 권리 범위를 한정하는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 본 발명의 구성부뿐만 아니라 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석될 수 있다.
〔실시예 1〕오발리신을 생성하는 균주의 분리 및 동정
제 1단계. 균주의 분리
곤충이메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에에 감염되면 충체 표면과 내부는메타리지움 아니소플리에의 균사체로 덮이며, 이 균사체로부터 충체 표면에 녹색의 분생포자가 생산되어 충체 표면이 녹색으로 보이게 된다. 그러나, 균체의 정확한 종 동정을 위해서는 광학현미경하에서 분생포자의 형태 및 크기와 포자 생산 세포 (conidiogenous cell)의 배열 형태를 관찰하여야 한다. 이에,메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에에 감염된 이화명충 (2000.8.충청남도 서산에서 채집)의 표면으로부터 분리된 각각의 균사체를 항생물질인 테트라사이클린이 함유된 감자한천평판배지 또는 일반 배지에 접종한 다음 약 22∼28 ℃에서 충분한 포자가 생성될 때까지 배양하고 생성된 포자와 균사체를 광학현미경으로 관찰하여 종을 동정하였다.
생성된 포자를 광학현미경을 사용하여 관찰한 결과, 분생포자는 긴 타원형으로, 플라스크 모양의 분생자 자루 위에 연쇄상으로 존재하며, 크기는 3.5∼9 ×3.5 ㎛이었다 (도 1). 그 결과,메타리지움 아니소플리에 버라이어티 아니소플리에임을 확인하였다.
제 2단계. 균주의 액체 배양
종균 배양을 위하여, 감자한천배지 위에 생성된 상기 포자를 멸균수로 현탁시킨 후, 헤모사이토미터 (hemocytometer)를 사용하여 포자농도가 107/㎖가 되도록 포자 현탁액을 제조하였다. 그 중 1 ㎖을 감자액상배지인 포테이토 덱스트로즈 브로스 (Potato Dextrose Broth) 100 ㎖을 함유한 플라스크에 접종한 다음 3일간 25℃에서 진탕 배양하였다. 본 배양을 위해서는 100 ㎖의 종균 배양액을 PDB 1 ℓ에 접종하여 동일한 조건으로 7일간 진탕 배양하였다.
〔실시예 2〕 균주 배양물로부터 식물역병균 파이타프토라 종 균주에 대한 항식물역병균 물질의 정제
배양이 끝난 상기메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에의 균사체를 여과지로 걸러 발효액만을 취하였다. 이와 같이 얻은 발효액을 이용하여 항식물역병균 물질을 분리 및 정제하였다.
발효액 1 ℓ당 이와 섞이지 않는 비극성 용매 에틸아세테이트를 500 ㎖씩 2회 가하고 격렬하게 흔들어 활성성분을 용매층으로 전이시키는 액-액 분리를 실시하였다. 상기 에틸아세테이트 분획층에 대하여 주요 식물역병균 파이타프토라 종 (Phytophthora cactorum, P. cambivora, P. capsici, P. drechsleri, P. infestans)들을 피검균으로 사용하여 활성물질을 확인하였다. 이 활성물질을 50 ℃에서 200 ㎖까지 감압농축한 뒤 여기에 플로리실 (60∼100 mesh) 50 g를 가하고, 이를 감압농축하여 에틸아세테이트 용매를 완전히 증발시킨 후, 플로리실 (florisil)에 에틸아세테이트층 물질을 흡착시켰다. 플로리실에 흡착된 물질을 다시 350g의 플로리실 (100∼200 mesh)로 충진된 크로마토그래피 칼럼 (5.5 ×50 ㎝)에서 핵산:아세톤 (100/0, 70/30, 20/80, v/v), 아세톤:메탄올 (80/20, 0/100, v/v) 등 5종의 혼합용매 시스템으로 용출시켜 4개의 분획을 분취하였다. 이때, 용출 용매량과 분취량은 분획당 500 ㎖로 하였다. 4개의 분획물 중 가장 높은 항식물역병균 활성을 나타낸 핵산:아세톤 (20/80, v/v) 분획과 아세톤:메탄올 (80/20, v/v) 분획을 혼합한 다음 다시 50g의 플로리실 (60∼100 mesh)에 흡착시키고 350g의 플로리실 (100∼200 mesh)로 충진된 크로마토그래피 칼럼 (5.5 ×50 ㎝)에서 2차 분리를 수행하였다. 이때, 용출 용매로는 핵산:아세톤 (100/0, 90/10, 70/30, v/v) 혼합용매와 아세톤:메탄올 (80/20, 20/80, 0/100, v/v) 혼합용매를 500 ㎖씩 이용하였고 이중 생리활성이 가장 높은 아세톤:메탄올 (20/80, v/v) 여액을 감압농축한 후 핵산:다이옥산 (80/20, v/v)으로 희석한 후 GPC (전개용매 클로로포름)를 이용하여 분획을 받아 순수한 생리활성 물질을 분리 및 정제하였다.
이를 이용하여 하기 실험을 수행하였다.
〔실시예 3〕분리된 식물역병균 파이타프토라 종 균주에 대한 항식물역병균 물질의 성상 분석
제 1단계. 질량분석
상기 분리 및 정제한 활성분획 용액을 질량분석기 (Finnigan Mat Model 4510B GC/MS)를 이용하여 분자량을 측정한 결과, 분리 정제된 물질의 분자량은 296.359로 판명되었다.
제 2단계. 핵자기공명 (NMR) 시험
상기 활성분획 시료를 NMR용 용매 CDCl3에 녹인 후 5 ㎜ 튜브에 넣어 (Varian Inova-300) 내부 표준시약으로 TMS를 사용하여 NMR분석을 실시하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 도시하였다.
상기와 같은 질량분석 및 NMR 스펙트럼 등을 해석한 결과, 실시예 2를 통하여메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에로부터 분리 및 정제된 물질이 오발리신임을 알 수 있었다.
〔시험예 1〕오발리신의 파이타프토라 종 균주에 대한 항식물역병균 활성의 효과 측정
제 1단계. 항식물역병균 효과 측정
본 실험을 위해서 페이퍼 디스크 확산법 (paper disc diffusion)을 사용하였다. 피검균으로는Phytophthora cactorum, P. cambivora, P. capsici, P.drechsleri, P. infestans를 사용하였다.P. infestans는V-8 쥬스 (0.4% CaCO3) 배지에서 20 ℃의 온도 조건으로, 나머지 균들은 감자액체배지에서 25 ℃의 온도 조건으로 7일간 진탕 배양하였다. 배양이 끝난 후, 균사체가 자란 발효액을 분쇄기 (homogenizer)로 분쇄한 다음P. infestans는 V-8 고체배지와 혼합하였으며, 나머지 균들은 감자한천배지와 혼합하여 직경 6 cm 평판에 분주하여 굳혔다. 배지가 고형화되면 오발리신 0.1%가 함유된 아세톤 용액 45 ㎕를 페이퍼 디스크에 분주한 다음 아세톤을 완전 증발시키고 각각의 균주가 함유된 배지 위에 얹었다.P. infestans는 20 ℃에서 15일간, 나머지 균들은 25 ℃에서 3∼4일간 배양하여 저지환 생성유무를 측정한 결과 (도 4∼도 8), 모든 피검균들에 대한 항진균 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
제 2단계. 식물역병균에 대한 오발리신의 최소 억제농도 측정
주요 식물역병균들에 대한 오발리신의 최소 억제 농도 (Minimum Inhibiton Concentration: MIC)를 구명하기 위하여,P. infestans경우 20 ℃, 나머지P. cactorum, P. cambivora, P. capsici, P. drechsleri는 25 ℃에서 100 ㎖의 V-8 쥬스 배지에 7일간 진탕 배양한 다음 균사체가 자란 발효액을 분쇄기로 분쇄하여 균들을 준비하였다. 각각의 직경 6 cm 평판에 감자한천배지를 분주하고 오발리신 용액을 농도별로 각각 첨가한 다음 미리 분쇄하여 준비한 균들을 평판배지 당 150 ㎕씩 넣고 균이 고르게 퍼지도록 흔들어 주었다. 배지가 고형화되면 각각 20 ℃, 25 ℃에서 3∼10일간 배양한 후 육안으로 관찰하여 균의 생육이 억제된 농도를 최소억제 농도로 정하였다. 그 결과를 도 4∼도 8에 나타내었다.
오발리신의 식물역병균에 대한 최소 억제 농도는 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 300 ppm 이하인 것으로 확인되었다.
오발리신의 식물역병균에 대한 활성 스펙트럼(MIC: ㎍/㎖)
피검균 식물역병균에 대한 오발리신의 최소 억제 농도
P. cactorum 〈 300 ppm
P. cambivora 〈 300 ppm
P. capsici 〈 300 ppm
P. drechsleri 〈 200 ppm
P. infestans 〈 300 ppm
〔시험예 2〕오발리신의 경피독성시험
배양 여액으로부터 분리 정제된 오발리신을 랫트 (스프라그-다우리 계통의 생후 6∼7주, 몸무게 300g)를 대상으로 급성경피독성 시험을 한국식약청 기준에 의거하여 실시하였다.
랫트의 체모를 삭발한 후 체표면적의 10% 정도에 4000 mg/kg (체중)의 농도로 균일하게 바른 후 15일간 관찰하였다. 관찰결과, 피부 홍반과 가피 형성과 같은 피부자극은 나타나지 않았다. 따라서, 오발리신은 피부에도 안전한 저독성 항진균 물질임이 판명되었다.
이상을 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명을 통하여 식물역병, 특히파이타프토라종균에 의한 식물역병을 예방 및 치료하는 효과가 있는 것으로 밝혀진 화합물 오발리신을 유효성분으로 함유하는 식물역병 방제용 조성물은 다양한파이타프토라균종에 의해 발생하는 식물역병을 예방 및 치료하는데 상당히 우수한 효과를 나타내고, 바람직하게는 동충하초의메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에종으로부터 분리된 천연의 오발리신을 이용함으로써, 경피에 대한 독성이 없어 안전한 뛰어난 효과가 있으므로, 비료 또는 농약제조산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (9)

  1. 오발리신을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 식물역병 방제용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 오발리신을 조성물 총 중량에 대하여 0.01중량%∼10.0중량%의 양으로 함유함을 특징으로 하는 식물역병 방제용 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 식물역병 방제는 오발리신의 항진균 활성에 기인하는 것임을 특징으로 하는 식물역병 방제용 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 오발리신은메타리지움 아니소플리에버라이어티아니소플리에로부터 분리한 것임을 특징으로 하는 식물역병 방제용 조성물.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 식물역병 방제용 조성물은 비료 성분 조성물 또는 농약제학적 성분 조성물임을 특징으로 하는 식물역병 방제용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 비료 성분 조성물 또는 농약제학적 성분 조성물은 수화제 형태인 것을 특징으로 하는 식물역병 방제용 조성물.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 비료 성분 조성물 또는 농약제학적 성분 조성물은 액상 형태인 것을 특징으로 하는 식물역병 방제용 조성물.
  8. 삭제
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