DE60038735T2

DE60038735T2 - Pseudomycin analoge

Info

Publication number: DE60038735T2
Application number: DE60038735T
Authority: DE
Inventors: Palaniappan Carmel KULANTHAIVEL; Matthew David Greenfield BELVO; James William Coatesville MARTIN; Thomas John Indianapolis PERUN; Douglas Joseph Greenwood ZECKNER
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2000-04-14
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2020-04-15
Also published as: EP1173471A2; JP2002542257A; US6793925B2; MXPA01010245A; HUP0200896A3; WO2000063237A3; BR0009731A; PT1173471E; WO2000063237A2; DK1173471T3; CN1355812A; NO20014937L; EP1173471B1; AU4188700A; HUP0200896A2; US20040067879A1; ES2304954T3; NO20014937D0; CN1191269C; DE60038735D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Pseudomycine A' und B', Verfahren zur Herstellung solcher Pseudomycine und Verfahren, bei denen die fungizide Wirkung dieser Pseudomycine verwendet wird.
HINTERGRUND
Pilzinfektionen sind eine signifikante Ursache für Krankheiten, eine Verschlechterung der Lebensqualität und Sterblichkeit bei Menschen, insbesondere bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem. Die Häufigkeit von Pilzinfektionen bei Menschen hat in den letzten 20 Jahren außerordentlich zugenommen. Dies ist teilweise auf eine steigende Anzahl von Menschen mit einem Immunsystem zurückzuführen, das infolge von Organtransplantationen, einer Krebstherapie, AIDS, dem Alter oder anderen ähnlichen Störungen oder Bedingungen geschwächt oder zerstört ist. Solche Patienten sind für Angriffe durch Pilzpathogene anfällig, die in der Bevölkerung weit verbreitet sind, von einem funktionierenden Immunsystem aber in Schach gehalten werden. Diese Pathogene sind schwierig zu kontrollieren, weil einige vorhandene Fungizide entweder hochtoxisch sind oder die Pilzaktivität nur hemmen. Beispielsweise sind die Polyene fungizid, aber toxisch, während die Azole viel weniger toxisch, aber nur fungistatisch sind. Noch wichtiger gibt es seit Kurzem Berichte von azol- und polyenresistenten Stämmen von Candida, wodurch die Therapieoptionen gegen solche Stämme außerordentlich eingeschränkt werden.
Pseudomonas syringae erzeugen mehrere Klassen von Fungiziden oder Antibiotika, wie die Pseudomycine, Syringomycine, Syringotoxine und Syringostatine, bei denen es sich um Lipodepsinonapeptide handelt. Natürliche Stämme und mittels eines Transposons erzeugte Mutanten von P. syringae erzeugen diese Lipodepsinonapeptide. Mehrere der Pseudomycine, Syringomycine und andere Lipodepsipeptid-Fungizide sind isoliert sowie chemisch charakterisiert worden, und es wurde gezeigt, dass sie eine Breitspektrum-Fungizidwirkung einschließlich einer Wirkung gegen wichtige Pilzpathogene sowohl bei Menschen als auch bei Pflanzen aufweisen. Beispielsweise sind die Pseudomycine A, B, C und C' jeweils isoliert und gereinigt worden, und ihre Strukturen sind mit Methoden einschließlich einer Aminosäure-Sequenzierung, NMR und Massenspektrometrie charakterisiert worden. Siehe beispielsweise Ballio et al. "Novel bioactive lipodepsipeptides from Pseudomonas syringae: the Pseudomycine," FEBS Lett, 355, 96–100 (1994) und U.S. Patent No. 5,576,298 . Die Pseudomycine, Syringomycine, Syringotoxine und Syringostatine stellen strukturell verschiedene Familien von fungiziden Verbindungen dar.
Keines der Pseudomycine, Syringomycine, Syringotoxine und Syringostatine ist zur Fungizidtherapie auf den Markt gebracht worden. Die Entdeckung von unerwünschten Nebenwirkungen, die Herstellung von Formulierungen, die maßstäbliche Vergrößerung der Produktion und andere Entwicklungsprobleme haben bisher eine Verwertung der Pseudomycine, Syringomycine, Syringotoxine oder Syringostatine gegen den vollständigen Bereich von Pilzinfektionen, die Tiere, Menschen und Pflanzen angreifen können, verhindert. Es bleibt ein Bedarf an einem Fungizid bestehen, das gegen Infektionen, die mit vorhandenen Fungiziden nicht behandelt werden können, und zur Anwendung gegen Infektionen bei Tieren, Menschen oder Pflanzen verwendet werden kann.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung macht die natürlichen Pseudomycin-Produkte A' und B' verfügbar, die von P. syringae erzeugt werden. Das natürliche Pseudomycin-Produkt umfasst einen Depsinonapeptidring mit der Sequenz Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr, insbesondere L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys- L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl), wobei die Carboxylgruppe von ClThr und die Hydroxylgruppe des Serins den Ring mit einer Lactonbindung schließen. Das Pseudomycin A' (IA) umfasst einen 3,4-Dihydroxypentadecansäurerest, dessen Carboxylgruppe eine Amidbindung mit der Amingruppe des N-terminalen Serins bildet.
Das Pseudomycin B' (IB) umfasst einen 3-Hydroxydodecansäurerest, dessen Carboxylgruppe eine Amidbindung mit der Amingruppe des N-terminalen Serins bildet.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung von Pseudomycin A', Pseudomycin B' oder einer Mischung davon zur Hemmung einer Pilzaktivität oder zur Verminderung der Symptome einer Pilzinfektion in einem Patienten, der dessen bedarf. Solche Verfahren können den Pilz töten, die Belastung durch eine Pilzinfektion vermindern, Fieber herabsetzen und/oder das allgemeine Wohlergehen eines Patienten verbessern. Die Verfahren der Erfindung sind gegen Pilze wie Candida parapsilosis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans und/oder Histoplasma capsulatum wirksam.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Pseudomycine
Die hier verwendeten Begriffe "Pseudomycin" oder "natürliches Pseudomycin-Produkt" beziehen sich auf ein oder mehrere Elemente einer Familie von Fungiziden, die aus dem Bakterium Pseudomonas syringae isoliert worden sind. Ein Pseudomycin ist ein Lipodepsipeptid, ein cyclisches Peptid, das ein oder mehrere unübliche Aminosäuren einschließt und ein oder mehrere hydrophobe oder Fettsäure-Seitenketten aufweist. Insbesondere sind die Pseudomycine Lipodepsinonapeptide mit einem cyclischen Peptidteil, der mit einer Lactonbindung geschlossen ist und welche die unüblichen Aminosäuren 4-Chlorthreonin, 3-Hydroxyasparaginsäure, Dehydro-2-aminobuttersäure und 2,4-Diaminobuttersäure einschließen. Es wird angenommen, dass diese unüblichen Aminosäuren in die biologischen Merkmale der Pseudomycine, wie ihre Beständigkeit in Serum und ihre abtötende Wirkung, einbezogen sind.
Alle Pseudomycine haben denselben cyclischen Peptidkern, wobei die an diesen Kern gebundene hydrophobe Seitenkette aber verschieden sein kann. Jedes Pseudomycin hat einen cyclischen Nonapeptidring mit der Sequenz Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr (d. h. Serin; 2,4-Diaminobuttersäure; Asparaginsäure; Lysin; 2,4-Diaminobuttersäure; allo-Threonin; Dehydro-2-aminobuttersäure; 3-Hydroxyasparaginsäure; 4-Chlorthreonin), wobei die Carboxylgruppe von ClThr und die Hydroxylgruppe des Serins den Ring mit einer Lactonbindung schließen. Der lipophile Rest ist an die Amingruppe des N-terminalen Serins gebunden. Die Amingruppe des Serins bildet eine Amidbindung mit dem Carboxyl eines 3,4-Dihydroxytetradecanoylrests in Pseudomycin A, einem 3-Monohydroxytetradecanoylrest in Pseudomycin B, einem 3,4-Dihydroxyhexadecanoylrest in Pseudomycin C und einem 3-Monohydroxyhexadecanoylrest in Pseudomycin C'. Die Carboxylgruppe des Serins bildet eine Amidbindung mit dem Dab des Rings.
Pseudomycine A' und B'
Die hier verwendeten Begriffe "Pseudomycin A'" und "Pseudomycin B'" beziehen sich auf Fungizide, die aus dem Bakterium Pseudomonas syringae isoliert worden sind. Die Pseudomycine A' und B' sind Pseudomycine mit dem charakteristischen Depsinonapeptidring mit der Sequenz Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr, wobei die Carboxylgruppe des ClThr und die Hydroxylgruppe des Serins den Ring mit einer Lactongruppe schließen. Das Pseudomycin A' umfasst einen 3,4-Dihydroxypentadecansäurerest, dessen Carboxylgruppe eine Amidbindung mit der Amingruppe des N-terminalen Serins bildet. Das Pseudomycin B' umfasst einen 3-Hydroxydodecansäurerest, dessen Carboxylgruppe eine Amidbindung mit der Amingruppe des N-terminalen Serins bildet.
Biologische Wirkungen von Pseudomycinen
Ein Pseudomycin hat mehrere biologische Wirkungen einschließlich eines Abtötens von verschiedenen Pilzen wie Pilzpathogenen von Pflanzen und Tieren. Insbesondere ist ein Pseudomycin ein aktives Antimykotikum gegen Pilze, die bei Personen mit geschwächtem Immunsystem opportunistische Infektionen verursachen. Diese Pilze umfassen verschiedene Spezies von Candida einschließlich C. parapsilosis, C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis und C. krusei. Sie umfassen auch andere Gattungen wie Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus und Histoplasma capsulatum. Ein Abtöten statt einer Hemmung des Wachstums von Pilzen, insbesondere von Pilzpathogenen, ist eine wünschenswerte und bevorzugte biologische Wirkung eines Fungizids wie Pseudomycin A' und/oder B'.
Es ist gezeigt worden, dass Pseudomycine gegenüber einem weiten Bereich von pflanzenpathogenen Pilzen einschließlich Rynchosporium secalis, Ceratocystis ulmi, Rizoctonia solani Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium alboatrum, Verticillium dahliae, Thielaviopis basicola, Fusarium oxysporum und Fusarium culmorum toxisch sind. (siehe Harrison, L., et al., "Pseudomycine, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broadspectrum antifungal activity," J. of General Microbiology, 7, 2857–2865 (1991).) Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass P. syringae MSU 16H Ulmen, die mit Ceratocystis ulmi, dem das Ulmensterben verursachenden Mittel, einen größeren Schutz als der Wildtyp-Stamm verleiht (siehe z. B. Lam et al., Proc. Natl. Sci. USA. 84, 6447–6451 (1987)).
Pseudomonas syringae
Pseudomonas syringae umfassen einen weiten Bereich von Bakterien, die im Allgemeinen mit Pflanzen assoziiert sind. Einige der P. syringae sind Pflanzenpathogene, während andere nur schwach pathogen oder Saprophyten sind. Viele verschiedene Isolate von P. syringae erzeugen ein oder mehrere zytotoxische Mittel, die diesem Bakterium das Leben in der Wildnis erleichtern können, wo es mit Pilzen und anderen Bakterien konkurrieren muss. Die von P. syringae erzeugten zytotoxischen Mittel umfassen Fungizide wie die Pseudomycine, die Syringomycine, die Syringotoxine und die Syringostatine.
Stämme von P. syringae, die ein oder mehrere Pseudomycine erzeugen, sind im Fachgebiet beschrieben. Zum Beispiel sind ein Wildtyp-Stamm MSU 174 (aus einem Gerstenfeld in Montana isoliert) und eine Mutante dieses Stamms, die durch eine Transposonmutagenese unter Verwendung von TN905 (MSU 16H) erzeugt wurde, im U.S. Patent No. 5,576,298 , erteilt am 19. November 1996 an G. Strobel et al; Harrison et al., J. "Pseudomycine, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity," Gen. Microbiology 137, 2857–2865 (1991); und Lamb et al., "Transposon mutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonas: Antimycotic production is necessary for control of Dutch elm disease," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6447–6451 (1987), beschrieben. Verfahren zum Wachstum verschiedener Stämme von P. syringae und ihre Verwendung bei der Herstellung von Fungiziden wie Pseudomycinen sind auch in der U.S.-Patentanmeldung, Ser. Nr. 09/958996, jetzt US 6,919,188 , Matthew D. Hilton et al., mit dem Titel "Pseudomycin Production By Pseudomonas Syringae" offenbart, die am selben Datum wie diese Anmeldung eingereicht wurde und die unten beschrieben sind. Kulturen von MSU 174 und MSU 16H sind an der Montana State University (Bozeman, Montana, USA) hinterlegt und über die American Type Culture Collection (Parklaven Drive, Rockville, MD, USA) erhältlich.
Die vorliegende Erfindung umfasst einen Stamm, ein Isolat und eine biologisch gereinigte Kultur von P. syringae, die Pseudomycin A' und/oder B' in Mengen von wenigstens etwa 10 μg/ml erzeugt. Vorzugsweise stammt die biologisch gereinigte Kultur eines Mikroorganismus vom Pseudomonassyringae-Stamm MSU 16H, 25-B1, 67H1, oder 7H9-1 oder einer Mutante, Variante, einem Isolat oder einer Rekombinante dieser Stämme, die Pseudomycin A' und/oder B' erzeugen. Die Kulturen MSU 174 und MSU 16H wurden so erhalten, wie in den oben aufgeführten Literaturstellen beschrieben ist.
Ein Stamm von P. syringae, der zur Erzeugung von Pseudomycin A' und/oder B' geeignet ist, kann aus Umweltquellen einschließlich Pflanzen wie Gerstenpflanzen, Zitruspflanzen und Fliederpflanzen und auch aus Quellen wie Erde, Wasser, Luft und Staub isoliert werden. Ein bevorzugter Stamm wird aus Pflanzen isoliert. Stämme von P. syringae, die aus Umweltquellen isoliert werden, können als Wildtyp bezeichnet werden. Der hier verwendete Begriff "Wildtyp" bezieht sich auf einen dominanten Genotyp, der in der normalen Population von P. syringae (d. h. Stämmen oder Isolaten von P. syringae, die in der Natur gefunden und nicht durch eine Labormanipulierung erzeugt werden) natürlich vorkommt. Wie im Fall von anderen Organismen sind die Merkmale der Pseudomycin A' und/oder B' erzeugenden Kulturen, die in dieser Erfindung verwendet werden, P. syringae Stämmen wie MSU 174, MSU 16H, MSU 206, 25-B1, 7H9-1 und 67H1, einer Variation unterworfen. Somit kann die Nachkommenschaft dieser Stämme, z. B. Rekombinanten, Mutanten und Varianten, durch Verfahren erhalten werden, die den Fachleuten wohlbekannt sind.
Mutantenstämme von P. syringae sind ebenfalls zur Herstellung von Pseudomycin A' und/oder B' geeignet. Der hier verwendete Begriff "Mutante" bezieht sich auf eine plötzliche vererbte Änderung des Phänotyps eines Stamms, die spontan oder durch bekannte mutagene Stoffe einschließlich Strahlung und verschiedene Chemikalien induziert werden kann. Mutante P. syringae der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung einer Vielzahl von mutagenen Stoffen einschließlich Strahlung wie Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlung, chemischen mutgenen Stoffen, einer ortsspezifischen Mutagenese und einer transposonvermittelten Mutagenese erzeugt werden. Beispiele für chemische mutagene Stoffe sind Ethylmethansulfonat (EMS), Diepoxyoctan, N-Methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanin (NTG) und salpetrige Säure.
Pseudomycin A' und/oder B' erzeugende Mutanten von P. syringae der vorliegenden Erfindung können hergestellt, werden, indem die Bakterien mit einer Menge eines mutagenen Mittels behandelt werden, mit der Mutanten erzeugt werden, die Pseudomycin A' und/oder B' überproduzieren, die Pseudomycin A' und/oder B' bevorzugt gegenüber anderen Pseudomycinen erzeugen oder die Pseudomycin A' und/oder B' unter vorteilhaften Wachstumsbedingungen erzeugen. Obwohl der Typ und die Menge des zu verwendenden mutagenen Mittels variieren können, besteht ein bevorzugtes Verfahren in einer seriellen Verdünnung von NTG zu Konzentrationen, die von 1 bis 100 μg/ml reichen. Bevorzugte Mutanten der Erfindung sind diejenigen, die das Wachstum von Pseudomycin A' und/oder B' in definierten Minimalmedien überproduzieren. Die Mutanten überproduzieren Pseudomycin A' und/oder B' vorzugsweise bis zu wenigstens 10 μg/ml.
Umweltisolate, Mutantenstämme und andere wünschenswerte Stämme von P. syringae können einer Auswahl auf wünschenswerte Merkmale des Wachstumsverhaltens, des Wachstumsmediums, der Nährstoffquelle, der Kohlenstoffquelle, der Wachstumsbedingungen und der Aminosäure-Anforderungen unterzogen werden. Vorzugsweise wird ein Pseudomycin A' und/oder B' erzeugender Stamm von P. syringae auf ein Wachstum in einem definierten Minimalmedium, wie dem Medium N21, und/oder zur Erzeugung von Pseudomycin A' und/oder B' mit Konzentrationen von mehr als etwa 10 μg/ml ausgewählt. Bevorzugte Stämme weisen das Merkmal der Erzeugung von Pseudomycin A' und/oder B' auf, wenn sie in einem Medium gezogen werden, das Glycin und gegebenenfalls entweder ein Lipid, ein Kartoffelprodukt oder eine Kombination davon einschließt.
Rekombinante Stämme können entwickelt werden, indem die P. syringae-Stämme transformiert werden, wobei etablierte Laborverfahren verwendet werden, die den Fachleuten wohlbekannt sind. Durch Verwendung der Rekombinanttechnik können die P. syringae-Stämme so transformiert werden, dass sie eine Vielzahl von Genprodukten zusätzlich zu den Antibiotika exprimieren, die von diesen Stämmen erzeugt werden. Beispielsweise kann man die Stämme mit einem rekombinanten Vektor transformieren, der Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht, gegen das die Stämme normalerweise empfindlich sind. So erhaltene Transformanten erzeugen nicht nur Pseudomycine wie die Pseudomycine A' und/oder B', sondern auch das resistenzverleihende Enzym, das eine Selektion der transformierten Zellen aus Wildtypzellen ermöglicht. Weiterhin kann man unter Verwendung ähnlicher Techniken die vorhandenen Stämme so modifizieren, dass sie mehrere Kopien der Gene zur Pseudomycin-Biosynthese einführen, so dass eine größere Ausbeute eines Pseudomycins wie Pseudomycin A' und/oder B' erhalten wird. Die Nachkommenschaft, d. h. natürliche und induzierte Varianten, Mutanten und Rekombinanten der P. syringae-Stämme 25-B1, 67H1 und 7H9-1, die das Merkmal einer Überproduktion eines Pseudomycins wie Pseudomycin A' und/oder B' beibehalten, sind Teil dieser Erfindung.
Wachstum von Pseudomonas syringae
Das hier beschriebene "wässrige Nährmedium" bezieht sich auf eine wasserverdünnbare Zusammensetzung, die mineralische und organische Verbindungen und deren Salze einschließt, die zum Wachstum des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Bakteriums erforderlich sind. Bevorzugte Nährmedien enthalten eine wirksame Menge von drei oder weniger Aminosäuren, vorzugsweise Glutaminsäure, Glycin, Histidin, oder eine Kombination davon. In einer Ausführungsform enthält das Medium eine wirksame Menge an Glycin und gegebenenfalls ein oder mehrere der folgenden Substanzen, eines Kartoffelprodukts und eines Lipids. Glycin kann als einzige Aminosäure oder als Teil einer Mischung von Aminosäuren wie hydrolysiertem Protein bereitgestellt werden. Geeignete Lipide umfassen Sojabohnenöl oder eine Fettsäure. Geeignete Kartoffelprodukte umfassen Kartoffeldextrosebrühe, Kartoffeldextrin, Kartoffelprotein und ein kommerzielles gemischtes Kartoffelpüree-Nahrungsmittelprodukt. Bevorzugte Mineralien im Nährmedium umfassen Salzmischungen, die typischerweise in der Zellkultur und Fermentierung verwendet werden, wie die Czapek-Mineralsalzlösung (z. B. KCl, MgSO₄ und FeSO₄). Die organische Verbindung im Nährmedium umfasst vorzugswei se Glucose und kann gegebenenfalls lösliche Stärke umfassen: andere wie organische Verbindungen können ebenfalls eingeschlossen sein. Der pH-Wert des Mediums liegt vorzugsweise zwischen etwa 4 und 6,5, beträgt noch mehr bevorzugt etwa 4,5 bis etwa 5,7 und am meisten bevorzugt etwa 5,2.
Obwohl die Menge eines jeden Bestandteils in der Nährstoffbrühe für das Wachstum der Bakterien oder für die Erzeugung von Pseudomycin A' und/oder B' typischerweise nicht kritisch ist, sind bestimmte Nährstoffkonzentrationen vorteilhaft. Eine bevorzugte Menge an Glycin beträgt etwa 0,1 g/l bis etwa 10 g/l, noch mehr bevorzugt etwa 0,3 g/l bis etwa 3 g/l, am meisten bevorzugt etwa 1 g/l. Eine bevorzugte Lipidmenge beträgt etwa 1 g/l bis etwa 10 g/l eines Ölprodukts wie Sojabohnenöl, noch mehr bevorzugt etwa 0,5 g/l bis etwa 2 g/l Sojabohnenöl. Eine bevorzugte Menge einer Fettsäure oder eines Fettsäureesters beträgt etwa 0,5 g/l bis etwa 5 g/l. Bevorzugte Mengen an Kartoffelprodukten umfassen etwa 12 g/l bis etwa 36 g/l, vorzugsweise etwa 24 g/l Kartoffeldextrosebrühe, etwa 5 g/l bis etwa 50 g/l, vorzugsweise etwa 30 g/l einer kommerziellen Kartoffelpüreemischung, etwa 1 g/l bis etwa 30 g/l, vorzugsweise etwa 20 g/l Kartoffeldextrin oder etwa 1 g/l bis etwa 10 g/l, vorzugsweise etwa 4 g/l Kartoffelprotein. Ein bevorzugtes Nährmedium umfasst Mineralien, vorzugsweise etwa 0,02 bis etwa 2 g/l, noch mehr bevorzugt etwa 0,2 g/l KCl; etwa 0,02 bis etwa 2 g/l, noch mehr bevorzugt etwa 0,2 g/l MgSO₄, vorzugsweise MgSO₄·7 H₂O, und etwa 0,4 bis etwa 40 mg/l, noch mehr bevorzugt etwa 4 mg/l FeSO₄, vorzugsweise FeSO₄·7 H₂O. Falls vorhanden, liegt lösliche Stärke vorzugsweise mit etwa 0,5 bis etwa 50 g/l, noch mehr bevorzugt etwa 5 g/l vor. Glucose ist vorzugsweise mit etwa 2 bis etwa 80 g/l, noch mehr bevorzugt etwa 20 g/l vorhanden.
P. syringae werden typischerweise in den beschriebenen Medien unter Bedingungen eines kontrollierten oder geregelten pH-Wertes und einer kontrollierten oder geregelten Temperatur gezogen. P. syringae und Pseudomycin A' und/oder B' wachsen bei Temperaturen zwischen etwa 15°C und etwa 35°C, vorzugsweise etwa 20°C bis etwa 30°C, noch mehr bevorzugt etwa 22°C bis etwa 27°C, am meisten bevorzugt etwa 25°C. P. syringae wachsen und erzeugen Pseudomycin A' und/oder B' bei einem pH-Wert zwischen etwa 4 und etwa 9, vorzugsweise etwa 4 und etwa 6, noch mehr bevorzugt etwa 4,5 bis etwa 5,5. Ein typisches Wachstum von P. syringae erfolgt nicht, wenn die Temperatur mehr als 37°C oder weniger als 10°C beträgt oder wenn der pH-Wert mehr als 9 oder weniger als 4 beträgt.
Verfahren zur Herstellung der Pseudomycine A' und B'
Zur Herstellung von Pseudomycin A' und/oder B' aus einem Wildtyp- oder Mutantenstamm von P. syringae wird der Organismus unter Rühren in einem wässrigen Nährmedium kultiviert, das eine wirksame Menge von drei oder weniger Aminosäuren einschließt. Die drei oder weniger Aminosäuren sind vorzugsweise Glutaminsäure, Glycin, Histidin oder eine Kombination davon. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Aminosäuren Glycin und gegebenenfalls eine oder mehrere eines Kartoffelprodukts und eines Lipids. Die Kultivierung wird unter Bedingungen durchgeführt, die für das Wachstum von P. syringae und die Erzeugung von Pseudomycin A' und/oder B' wirksam sind. Wirksame Bedingungen umfassen eine Temperatur von etwa 22°C bis etwa 27°C und eine Dauer von etwa 36 h bis etwa 96 h. Wenn P. syringae in einem Medium wie den hier beschriebenen gezogen wird, kann es in Zelldichten bis etwa 10–15 g/l Trockengewicht wachsen und Pseudomycine A' und/oder B' in Gesamtmengen von wenigstens etwa 10 μg/ml erzeugen.
Die Regelung der Sauerstoffkonzentration im Medium während des Kultivierens von P. syringae zur Erzeugung von Pseudomycin A' und/oder B' ist vorteilhaft. Vorzugsweise werden Sauerstoffkonzentrationen bei einer Sättigung von etwa 5% bis etwa 50%, vorzugsweise einer Sättigung von etwa 30% gehalten. Die Sauerstoffkonzentration im Medium kann durch das Durchperlenlassen von Luft, reinem Sauerstoff oder Sauerstoff einschließenden Gasmischungen geregelt werden. Weiterhin kann die Einstellung der Rührdrehzahl zur Einstellung der Sauerstoffübertragungsgeschwindigkeit verwendet werden.
Die Regelung des pH-Wertes des Mediums während der Kultivierung von P. syringae zur Erzeugung eines Pseudomycins A' und/oder B' ist vorteilhaft. Pseudomycine wie Pseudomycine A' und/oder B' sind bei einem basischen pH-Wert labil, und ein signifikanter Zerfall kann erfolgen, wenn der pH-Wert des Kulturmediums mehr als etwa 12 h lang mehr als etwa 6 beträgt. Vorzugsweise wird der pH-Wert des Kulturmediums auf weniger als etwa 6, vorzugsweise weniger als etwa 5,5 und vorzugsweise mehr als 4,0 gehalten. Der pH-Wert wird vorzugsweise auf etwa 5 bis etwa 5,4, noch mehr bevorzugt etwa 5,0 bis etwa 5,2 gehalten. Obwohl dies für die vorliegende Erfindung nicht einschränkend ist, wird angenommen, dass ein Abbau von Pseudomycin bei einem basischen pH-Wert auf eine Öffnung des Lactonrings und eine Umwandlung von ClThr in Thr zurückzuführen ist.
Bei einem Ziehen in einer diskontinuierlichen Kultur kann P. syringae die Pseudomycine A' und/oder B' erzeugen. Die Bildung von Pseudomycin wird jedoch durch eine Zulauf- oder halbkontinuierliche Zuführung von Glucose und gegebenenfalls einer Säure oder Base wie Ammoniumhydroxid zur Steuerung des pH-Werts erhöht. Die Bildung von Pseudomycin durch P. syringae kann durch die Verwendung von kontinuierlichen Kulturverfahren, bei denen Glucose und gegebenenfalls eine Säure oder Base wie Ammoniumhydroxid zur Regelung des pH-Wertes automatisch zugegeben werden, weiter erhöht werden.
Die Pseudomycine A' und/oder B' können durch ein beliebiges einer Vielzahl von Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, nachgewiesen, bestimmt, isoliert und/oder gereinigt werden. Beispielsweise kann der Grad der Pseudomycin-Aktivität in einer Brühe oder in einer isolierten oder gereinigten Zusammensetzung durch eine fungizide Wirkung gegen einen Pilz wie Candida bestimmt werden. Zur Herstellung und Analyse der Pseudomycine sind zahlreiche Verfahren bekannt. Beispielsweise können ein oder mehrere Pseudomycine mit einer Chromatographie wie HPLC isoliert und gereinigt werden.
Pharmazeutische Verwendungen
Formulierungen und fungizide Wirkung von Pseudomycin A' oder B'
Sowohl Pseudomycin A' als auch B' weisen eine in vitro- und in vivo-Aktivität auf und können daher brauchbar sein, um entweder systemische Pilzinfektionen oder Haupt-Pilzinfektionen zu bekämpfen. Demgemäß macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung einer Pilzwirkung verfügbar, das ein In-Kontakt-Bringen von Pseudomycin A' und/oder B' oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon mit einem Pilz einschließt. Ein bevorzugtes Verfahren umfasst die Hemmung des Wachstums oder der Aktivität verschiedener Pilze wie C. parapsilosis, C. albicans, Cryptococcus neoformans und Histoplasma capsulatum. Der hier verwendete Begriff "In-Kontakt-Bringen einer erfindungsgemäßen Verbindung mit einem Parasiten oder Pilz" bezieht sich auf eine Vereinigung oder Verbindung oder eine scheinbare Berührung oder wechselseitige Berührung zwischen einer erfindungsgemäßen Verbindung und einem Parasiten oder Pilz. Der Begriff "In-Kontakt-Bringen" impliziert jedoch keinen bestimmten Hemmungsmechanismus.
Die vorliegende Erfindung macht weiterhin die Verwendung von Pseudomycin A' oder B' bei der Herstellung eines Medikaments verfügbar, das bei einem Verfahren zur Behandlung einer Pilzinfektion verwendbar ist, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge an Pseudomycin A' und/oder B' oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, Hydrats oder Esters davon an einen Wirt, der eine solche Behandlung benötigt. Ein bevorzugtes Verfahren umfasst die Behandlung einer Infektion durch verschiedene Pilze einschließlich C. parapsilosis, C. albicans, Cryptococcus neoformans und Histoplasma capsulatum. Wenn eine Formulierung von Pseudomycin A' und/oder B' in einer wirksamen und zweckmäßigen Menge verabreicht wird, vermindert sie die Belastung durch eine Pilzinfektion, vermindert Symptome im Zusammenhang mit der Pilzinfektion und kann zur Eliminierung der Pilzinfektion führen.
Einige Patienten, die eine Fungizidtherapie benötigen, haben schwere Infektionssymptome wie hohes Fieber und befinden sich wahrscheinlich in Intensivpflege oder kritischer Pflege. Verschiedene Pilze können solche schweren Infektionen verursachen. Candida spp. kann beispielsweise Schleimhaut- und schwere systemische Infektionen bewirken. Mit steigender Häufigkeit wird von azol- und polyenresistenten Candida-Stämmen berichtet. Aspergillus bewirkt lebensbedrohende systemische Infektionen. Cryptococcus ist für Meningitis verantwortlich. Solche schweren Pilzinfektionen können bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem auftreten, wie denjenigen, die Organ- oder Knochenmarktransplantate erhalten, eine Chemotherapie gegen Krebs durchmachen, sich von einer größeren Operation erholen oder an einer HIV-Infektion leiden. Bei solchen Patienten würde eine Fungizidtherapie typischerweise eine sich über mehrere Tage oder länger erstreckende intravenöse Verabreichung einer Formulierung einschließen, die Pseudomycin A' und/oder B' enthält, um die Infektion zum Stillstand zu bringen.
Mit Bezug auf die Fungizidtherapie bedeutet der Begriff "wirksame Menge" eine Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, die dazu fähig ist, das Pilzwachstum oder die Pilzaktivität zu hemmen oder Symptome der Pilzinfektion zu vermindern. Bei den meisten Pilzinfektionen umfasst eine Verminderung von Symptomen der Infektion eine Verminderung von Fieber, das Wiedererlangen des Bewusstseins und ein erhöhtes Wohlergehen des Patienten. Vorzugsweise werden Symptome vermindert, indem der Pilz abgetötet wird, wodurch die Infektion eliminiert wird, oder die Infektion auf einen Grad gebracht wird, der vom Patienten toleriert oder vom Immunsystem des Patienten kontrolliert wird. Der hier verwendete Begriff "Hemmung" bezieht sich auf die Hemmung einer Pilzaktivität einschließlich eines Abstoppens, Verzögerns oder prophylaktischen Be- oder Verhinderns des Wachstums oder eines beliebigen Begleitmerkmals und resultiert aus dem Vorhandensein eines Pilzes.
Die verabreichte Dosis variiert in Abhängigkeit von Faktoren wie der Beschaffenheit und Schwere der Infektion, dem Alter und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Wirtes und der Toleranz des Wirtes gegenüber dem Fungizid. Typischerweise werden die Zusammensetzungen einem Patienten (einem Menschen oder einem anderen Tier einschließlich Säugetiere wie Katzen, Pferde und Rinder und Vogelarten, ohne darauf beschränkt zu sein), der sie benötigt, in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Pilzinfektion zu hemmen. Die spezielle therapeutische Dosis kann gleichermaßen in Abhängigkeit von solchen Faktoren variieren und kann in einer einzigen Tagesdosis oder in mehreren Dosen tagsüber verabreicht werden. Die Therapie kann von etwa 2–3 Tagen bis zu etwa 2–3 Wochen oder länger reichen. Eine typische Tagesdosis (die in einer einzigen oder in aufgeteilten Dosen verabreicht wird) enthält einen Dosierungsgrad von etwa 0,01 mg/kg Körpergewicht bis zu etwa 100 mg/kg Körpergewicht eines Wirkstoffs dieser Erfindung. Bevorzugte Tagesdosen betragen im Allgemeinen etwa 0,1 mg/kg bis etwa 60 mg/kg und idealerweise von etwa 2,5 mg/kg bis etwa 40 mg/kg. Bei schweren Infektionen kann die Verbindung mittels einer intravenösen Infusion verabreicht werden, wobei beispielsweise 0,01 bis 10 mg/kg/h des Wirkstoffs verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung macht auch pharmazeutische Formulierungen verfügbar, die zur Verabreichung der fungiziden Verbindungen der Erfindung brauchbar sind. Demgemäß macht die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Formulierung verfügbar, die ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel, Vehikel, Trägerstoffe oder andere Additive und als Wirkstoff Pseudomycin A' und/oder B' einschließt. Der Wirkstoff in solchen Formulierungen umfasst 0,1 Gew.-% bis 99,9 Gew.-% der Formulierung, allgemeiner etwa 10 Gew.-% bis etwa 30 Gew.-%. Mit "pharmazeutisch annehmbar" ist gemeint, dass der Träger, das Verdünnungsmittel oder der Trägerstoff mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich und für den Patienten nicht nachteilig ist.
Die Formulierung kann Additive wie verschiedene Öle einschließlich derjenigen von Petroleum, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, zum Beispiel Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl und Sesamöl einschließen.
Geeignete pharmazeutische Trägerstoffe umfassen Stärke, Cellulose, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Natriumchlorid, Magermilchpulver, Glycerin, Propylenglycol, Wasser und Ethanol. Die Zusammensetzungen können herkömmlichen pharmazeutischen Verfahren wie einer Sterilisierung unterzogen werden und herkömmliche pharmazeutische Additive wie Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Benetzungsmittel oder Emulgatoren, Salze zur Einstellung des osmotischen Drucks und Puffer enthalten. Geeignete pharmazeutische Träger und deren Formulierung sind in Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences," 15. Auflage; Mack Publishing Co., Easton (1975), beschrieben; siehe beispielsweise S. 1405–1412 und S. 1461–1487.
Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch annehmbares Salz" bezieht sich auf Salze der oben beschriebenen Verbindungen, die im Wesentlichen für Lebewesen nicht toxisch sind. Typische pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen diejenigen Salze, die durch die Umsetzung der Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einer mineralischen oder organischen Säure oder einer anorganischen Base hergestellt sind. Solche Salze sind als Säureadditions- und Basenadditionssalze bekannt.
Salze, die üblicherweise zur Bildung von Säureadditionssalzen verwendet werden, sind Mineralsäuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure und organische Säuren wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Oxalsäure, p-Bromphenylsulfonsäure, Kohlensäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Benzoesäure und Essigsäure. Beispiele für solche pharmazeutisch annehmbaren Salze sind das Sulfat, Pyrosulfat, Hydrogensulfat, Sulfit, Hydrogensulfit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, Iodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Formiat, Isobutyrat, Caproat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,6-dioat, Benzoat, Chlorbenzoat, Methylbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, Sulfonat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbuty rat, Citrat, Lactat, Gamma-hydroxybutyrat, Glycolat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Napththalin-2-sulfonat und Mandelat. Bevorzugte pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze sind diejenigen, die mit Mineralsäuren wie Salzsäure und Bromwasserstoffsäure gebildet sind, und diejenigen, die mit organischen Säuren wie Maleinsäure und Methansulfonsäure gebildet sind.
Basenadditionssalze umfassen diejenigen, die von anorganischen Basen stammen, wie Ammonium- oder Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxide, Carbonate und Hydrogencarbonate. Solche Basen, die zur Herstellung der Salze dieser Erfindung brauchbar sind, umfassen somit Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Kaliumhydrogencarbonat, Calciumhydroxid und Calciumcarbonat. Die Kaliumsalz- und die Natriumsalzformen sind besonders bevorzugt.
Es gilt als vereinbart, dass das spezielle Gegenion, das einen Teil eines beliebigen Salzes dieser Erfindung darstellt, nicht kritisch ist, solange das Salz als Ganzes pharmazeutisch annehmbar ist und solange das Gegenion keine unerwünschten Eigenschaften zum Salz als Ganzes hinzufügt.
Pseudomycin A' und/oder B' können über einen parenteralen, zum Beispiel unter Verwendung einer intramuskulären, subkutanen oder intraperitonealen Injektion, nasalen oder oralen Weg verabreicht werden. Zusätzlich zu diesen Verabreichungsverfahren können Pseudomycin A' und/oder B' für oberflächliche Hautinfektionen oder eine Vernichtung oder Hemmung von Pilzen im Mukus topisch aufgetragen werden.
Zur parenteralen Verabreichung umfasst die Formulierung Pseudomycin A' und/oder B' und ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel wie deionisiertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, 5%ige Dextrose und andere üblicherweise verwendeten Verdünnungsmittel. Die Formulierung kann ein Cyclodextrin und/oder ein löslichmachendes Mittel wie Polyethylengycol oder Polypropylenglycol oder ein anderes bekanntes löslichmachendes Mittel enthalten. Solche Formulierungen können in sterilen Ampullen hergestellt werden, die das Fungizid und den Trägerstoff in Form eines trockenen Pulvers oder lyophilisierten Pulvers enthalten. Vor der Verwendung wird ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel zugegeben und die Lösung mit einer Spritze zur Verabreichung an den Patienten entnommen.
Die vorliegenden pharmazeutischen Formulierungen werden mit bekannten Verfahren unter Verwendung bekannter und leicht erhältlicher Inhaltsstoffe hergestellt. Bei der Herstellung der Formulierungen der vorliegenden Erfindung wird der Wirkstoff im Allgemeinen mit einem Träger vermischt oder mit einem Träger verdünnt oder in einem Träger eingeschlossen, der in Form einer Kapsel, eines Säckchens, eines Papier- oder eines anderen Behälters vorliegen kann. Wenn der Träger als Verdünnungsmittel dient, kann es sich um ein festes, halbfestes oder flüssiges Material handeln, das als Vehikel, Trägerstoff oder Medium für den Wirkstoff dient. Somit können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten, Pillen, Pulvern, Lutschpastillen, Säckchen, Briefchen, Elexieren, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupen, Aerosolen (als Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Salben, die beispielsweise bis zu 10 Gew.-% des Wirkstoffs enthalten, weichen und harten Gelatinekapseln, Zäpfchen, sterilen injizierbaren Lösungen und steril verpackten Pulvern vorliegen.
Zur oralen Verabreichung wird die fungizide Verbindung in Gelatinekapseln gefüllt oder zu Tabletten geformt. Solche Tabletten können auch ein Bindemittel, ein Dispergiermittel oder andere geeignete Trägerstoffe enthalten, die zur Herstellung einer Tablette mit der richtigen Größe zur Dosierung von Pseudomycin A' und/oder B' geeignet ist. Zur pädiatrischen oder geriatrischen Verwendung kann die fungizide Verbindung zu einer geschmackskorrigierten flüssigen Suspension, Lösung oder Emulsion formuliert werden. Eine bevorzugte orale Formulierung besteht aus Linolsäure, Cremophor RH-60 und Wasser und vorzugsweise (auf das Volumen bezogen) einer Menge von 8% Linolsäure, 5% Cremophor RH-60, 87% sterilem Wasser und Pseudomycin A' und/oder B' in einer Menge von etwa 2,5 bis etwa 40 mg/ml.
Zur topischen Verwendung kann die fungizide Verbindung mit einem trockenen Pulver zur Anwendung auf die Hautoberfläche formuliert werden, oder sie kann zu einer flüssigen Formulierung formuliert werden, die eine in-Lösung-bringende wässrige Flüssigkeit oder eine nichtwässrige Flüssigkeit, z. B. einen Alkohol oder ein Glycol einschließt.
Verwendungen der Formulierungen von Pseudomycin A' oder B'
Die vorliegende Erfindung umfasst auch einen Kit, der die vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzungen einschließt und mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist. Der Kit kann eine Ampulle enthalten, die eine Formulierung der vorliegenden Erfindung und geeignete Träger entweder getrocknet oder in flüssiger Form enthält. Der Kit umfasst weiterhin eine Anleitung in Form einer Etikette auf der Ampulle und/oder in Form eines Einschubs, der in einer Schachtel eingeschlossen ist, in der die Ampulle verpackt ist, zur Verwendung und Verabreichung der Verbindungen. Die Anleitung kann auch auf die Schachtel aufgedruckt sein, in der die Ampulle verpackt ist. Die Anleitung enthält Informationen wie Informationen zur ausreichenden Dosierung und Verabreichung, damit eine Kraft vor Ort das Medikament verabreichen kann. Es wird erwartet, dass eine Kraft auf dem Gebiet eine(n) beliebige(n) Ärztin (Arzt), Krankenpfleger(in) oder Techniker(in) einschließt, die (der) das Medikament verabreichen könnte.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Formulierung von Pseudomycin A' und/oder B' einschließt und zur Verabreichung mittels einer Injektion geeignet ist. Gemäß der Erfindung kann eine Formulierung von Pseudomycin A' und/oder B' zur Herstellung einer Zusammensetzung oder eines Medikaments verwendet werden, die bzw. das zur Verabreichung mittels einer Injektion geeignet ist. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, die eine Formulie rung von Pseudomycin A' und/oder B' in einer Form einschließen, die zur Verabreichung mittels einer Injektion geeignet ist. Beispielsweise kann eine flüssige oder feste Formulierung auf mehrere Arten unter Verwendung von herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Eine flüssige Formulierung kann hergestellt werden, indem Pseudomycin A' und/oder B' in einem geeigneten Lösungsmittel wie Wasser bei einem geeigneten pH-Wert, das Puffer oder andere Trägerstoffe einschließt, aufgelöst wird.
Verwendungen in der Landwirtschaft
Es ist gezeigt worden, dass Antibiotika, die aus P. syringae NRRL B-12050 erzeugt wurden, das Ulmensterben wirksam behandeln (siehe z. B. die U.S.-Patente Nr. 4,342,746 und 4,277,462 ). Insbesondere ist gezeigt worden, dass P. syringae MSU 16H Ulmen, die mit Ceratocystis ulmi, dem das Ulmensterben verursachenden Mittel, einen größeren Schutz als der Wildtyp-Stamm verleiht (siehe z. B. Lam et al, Proc. Natl. Sci. USA. 84, 6447–6451 (1987)). Umfassendere Tests an Ulmen, die im Freiland gezogen wurden, bestätigten das Phänomen einer biologischen Kontrolle auf prophylaktischer Ebene. Daher können die Pseudomycine der vorliegenden Erfindung als präventive Behandlung für das Ulmensterben brauchbar sein. Es ist gezeigt worden, dass Pseudomycine gegenüber einem weiten Bereich von pflanzenpathogenen Pilzen einschließlich Rynchosporium secalis, Ceratocystis ulmi, Rizoctonia solani Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium albo-atrum, Verticillium dahliae, Thielaviopis basicola, Fusarium oxysporum und Fusarium culmorum toxisch sind. (siehe Harrison. L., et al., "Pseudomycine, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity," J. General Microbiology, 7, 2857–2865 (1991).) Folglich können das isolierte Pseudomycin A' und/oder B' (einschließlich Hydraten, Solvaten und Estern davon) zur Behandlung von Pilzen in Pflanzen (insbesondere V. albo-atrum, Rhizoctonia solani und F. oxysporum) entweder als direkte Behandlung oder als präventive Behandlung brauchbar sein. Im Allgemeinen werden die infizierten Pflanzen behandelt, indem eine wässrige Suspension der Pseudomycin-Verbindungen in die Pflanze injiziert oder auf die Pflanze gesprüht wird.
Injektionsvorrichtungen sind den Fachleuten wohlbekannt (z. B. eine Bohrloch-Injektionsvorrichtung (Gouge Pistol). Es kann jede beliebige Vorrichtung zum Sprühen der Suspension verwendet werden, die eine wirksame Menge des aktiven Materials auf der Pflanzenoberfläche verteilt. Die Suspension kann andere Additive einschließen, die üblicherweise von den Fachleuten verwendet werden, wie Löslichmacher, Stabilisatoren, Benetzungsmittel und Kombinationen davon.
Die Behandlung der Pflanze kann auch unter Verwendung einer trockenen Zusammensetzung bewerkstelligt werden, die als Wirkstoffe die isolierten Verbindungen Pseudomycin A' und/oder B' enthält. Die trockene Formulierung kann durch jedes beliebige, den Fachleuten bekannte Mittel wie Sprühen oder Schütteln aus einem Behälter auf die Pflanzenoberfläche aufgetragen werden.
Die vorliegende Erfindung kann unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verstanden werden. Diese Beispiele sollen für spezielle Ausführungsformen der Erfindung repräsentativ sein und dürfen nicht dahingehend aufgefasst werden, dass sie den Rahmen der Erfindung einschränken.
BEISPIELE
Hinterlegte biologische Materialien
P. syringae MSU 16H von der American Type Culture Collection, Parklaven Drive, Rockville, MD, USA, unter der Hinterlegungsnr. ATCC 67028 für die Öffentlichkeit erhältlich. Die P. syringae-Stämme 25-B1, 7H9-1 und 67H1 wurden am 23. März 2000 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielten die folgenden Hinterlegungsnummern:

25-B1 Hinterlegungsnr. PTA-1622

7H9-1 Hinterlegungsnr. PTA-1623

67H1 Hinterlegungsnr. PTA-1621
Beispiel 1
Herstellung der Pseudomycine A' und B'
Es wurden Fermentationsverfahren zur Herstellung von Pseudomycin A' und/oder B' in der Fermentationsbrühe eines Pseudomonas-syringae-Stamms entwickelt.
Materialien und Verfahren
Herstellung des Inokulums: Ein Aliquot von Zellen, die in der Dampfphase über flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurden, wurde aufgetaut und zur Inokulation von zwei 900-ml-Portionen CSM-Brühe verwendet. CSM-Brühe bestand aus (g/l): Dextrose (5), Maltose (4), tryptischer Sojabrühe von Difco (30), Difco-Hefeextrakt (3) und MgSO₄·7 H₂O (2). Zum Inokulieren einer jeden 900-ml-Portion des in einem 2-l-Kolben enthaltenen Mediums wurden 0,5 ml Zellen verwendet. Kolben wurden durch ein 24-stündiges Schütteln bei 25°C inokuliert. Der Inhalt der beiden Kolben wurde vereinigt, um einen 150-l-Fermenter zu inokulieren, der 1151 einer sterilen Fermentationsbrühe enthielt.
Fermentationsstufe: Die Fermentationsbrühe bestand aus (g/l): Dextrose (20), löslicher Stärke (5), Instant-Kartoffelpüree, Country Style Potato Pearls von Basic American Foods (30), Glycin (1), MgSO₄·7 H₂O (0,2), KCl (0,2) und FeSO₄·7 H₂O (0,004) in Leitungswasser. Vor der Sterilisierung wurde der pH-Wert auf 5,2 eingestellt. Die Fermentierung wurde 68 h lang bei 25°C durchgeführt. Gelöster Sauerstoff wurde durch eine kontinuierliche Einstellung des Luftstroms und der Rührdrehzahl des Rührwerkzeugs auf 30% der Luftsättigung oder darüber gehalten. Der pH-Wert wurde durch die Zugabe von entweder H₂SO₄ oder NaOH zwischen 4,0 und 5,4 gehalten.
Variationen der diskontinuierlichen Verfahren: Es wurde gefunden, dass mehrere Variationen des einfachen diskontinuierlichen Verfahrens zur Herstellung der Pseudomycine A' und/oder B' führten. Dextrose kann 24 nach der anfänglichen Inokulation mit einer Rate von 60 ml pro Stunde den Fermentern zugeführt werden. Die Zuführung kann über den gesamten Verlauf der Fermentierung fortgesetzt werden. Alternativ ist ein Verfahren eingesetzt worden, bei dem bei einem Beginn von 24 h nach der Inokulierung gelöster Sauerstoff auf 5% der Luftsättigung gehalten wurde und dies bis zum Ende der Fermentierung fortgesetzt wurde. Das Halten von gelöstem Sauerstoff auf 5% wurde durch die Zufuhr von inertem Stickstoffgas (N₂) zur Luftzufuhr, die in den Fermenter führte, erreicht. In allen Fällen wurde Gas durch ein einziges Durchperl-Tauchrohr mit einer Öffnung zugeführt, die unmittelbar unter der unteren Rührturbine im Fermenter angeordnet war.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Mehrere Fermentationsverfahren führen zur Bildung von Pseudomycin A' und/oder B' aus P. syringae.
Beispiel 2
Isolierung und Reinigung der Pseudomycine A' und B'
Es wurden Verfahren zur Isolierung und Reinigung der Pseudomycine A' und B' aus der Fermentationsbrühe eines Pseudomonas syringae-Stamms entwickelt.
Materialien und Verfahren
Die gesamte Fermentationsbrühe (4 × 100 l) wurde nach der Ernte durch einen Membralox-Keramikfilter (0,45 μm) filtriert, wodurch ein Filtrat (Fraktion A) und eine feste Aufschlämmung (Fraktion B) erhalten wurden. Fraktion B (135 l) wurde mit einem gleichen Volumen an Aceton, das 0,1% TFA enthielt, 120 min lang extrahiert und absitzen gelassen. Der klare Acetonextrakt wurde durch Filtration abgetrennt und dann im Vakuum zu einer wässrigen Lösung eingedampft, wodurch Fraktion C (88 l) erhalten wurde. Zuerst wurde Fraktion A auf eine in Wasser mit dem Harz HP20ss gepackte Säule (10 l) gegeben, und die Säule wurde mit 15%igem Acetonitril gewaschen, das 0,1% TFA (20 l) enthielt. Dann wurde dieselbe Säule mit Fraktion C beladen, und die Säule wurde wie oben mit 20 l 15%igem Acetonitril gewaschen, das 0,1% TFA enthielt.
Dann wurde die Säule mit einem linearen Gradienten von 15–20% Acetonitril, das 0,1% TFA enthielt, 30 min lang und mit 20–35% Acetonitril, das 0,1% TFA enthielt, über 60 min lang mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 l/min eluiert. Es wurden 1-l-Fraktionen isoliert. Die Fraktionen 6–9 wurden vereinigt (4 l), wodurch Fraktion D (24 g) erhalten wurde. Ein Teil von Fraktion D (~1 g) wurde an einer Reversed-Phase-Säule (Dynamax C18 41,4 × 250 mm) chromatographiert, wobei Triethylammoniumphosphat-Puffer (pH-Wert 3)-Acetonitril-Methanol als mobile Phase (Elution mit einem Gradienten von 65:17:18 bis 30:35:35 in 45 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/min) verwendet wurde. Zweckmäßige Fraktionen wurden vereinigt, das Volumen wurde auf 75 ml vermindert und an einer C18-Säule wie oben nochmals chromatographiert, wobei ein Gradient von 80:10:10 bis 46:27:27 verwendet wurde, wodurch Fraktion E (113 mg) und Fraktion F (116 mg) erhalten wurden. Eine weitere Chromatographie der Fraktionen E und F an einer C18-Säule (Dynamax 21,4 × 250 mm) ergab 45 mg Pseudomycin A' bzw. 62 mg Pseudomycin B'.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen
HPLC-Verfahren, die denjenigen ähnlich waren, die zur Reinigung anderer Pseudomycine verwendet wurden, führten zur Reinigung der Pseudomycine A' und B' aus einer Fermentationsbrühe.
Beispiel 3
Bestimmung der Struktur der Pseudomycine A' und B'
Die Struktur der Pseudomycine A' und B' wurde mittels Massenspektrometrie und NMR bestimmt.
Strukturbestimmung von Pseudomycin A'
Verfahren und Ergebnisse
Die Molekularformel von Pseudomycin A' wurde durch eine FABMS mit hoher Auflösung als C₅₂H₈₉ClN₁₂O₂₀ [m/z 1237,6112 für C₅₂H₉₀ClN₁₂O₂₀ (M+H)⁺, Δ –2,4 ppm] bestimmt. Im Vergleich zu Pseudomycin A wies die Molekularformel von Pseudomycin A' eine zusätzliche CH₂-Gruppe auf. Diese Beobachtung ließ vermuten, dass bei Pseudomycin A' das N-terminale Serin mit 3,4-Dihydroxypentadecansäure statt 3,4-Dihydroxytetradecansäure wie bei Pseudomycin A acyliert sein kann. Dieses Argument wird durch die Tatsache gestützt, dass bei allen zuvor charakterisierten Pseudomycinen der Kern einen spezifischen und identischen Nonadepsipeptidring aufweist und der einzige Unterschied zwischen ihnen aus der Beschaffenheit der hydrophoben Seitenkette besteht.

Demgemäß sind die NMR-spektroskopischen Daten von Pseudomycin A' praktisch identisch mit denjenigen aller bekannten Pseudomycine wie Pseudomycin A, B, C und C'. Eine umfassende Analyse der ¹H-, ¹³C- und 2D-NMR-Spektren unter Einbeziehung von TOCSY und HMQC von Pseudomycin A' etablierten eine 3,4-Diol-Funktionalität in der hydrophoben Seitenkette von Pseudomycin A' und ermöglichten eine Zuordnung aller Protonen und protonentragenden Kohlenstoffe des Moleküls (Tabelle 1). Die für Pseudomycin A' bestimmte Struktur auf der Grundlage dieser massenspektrometrischen und NMR-Daten ist unten aufgeführt.

Struktur von Pseudomycin A', abgeleitet aus massen- und NMR-spektrometrischen Daten Tabelle 1 – ¹H- und ¹³C-NMR-Daten von Pseudomycin A' in H₂O + CD₃CN

Aminosäure	Position	δ_H	δ_C

Ser	NH	8,28	-
	α	4,59	54,0
	β₁	4,50	65,5
	β₂	4,41

Dab-1*	NH	8,48	-
	α	4,15	53,1
	β₁	1,98
	γ	2,91	37,4
	NH₂	7,50	-

Asp	NH	8,34	-
	α	4,54	51,5
	β₁	2,86	36,0
	β₂	2,80

Lys	NH	7,80	-
	α	4,16	54,6
	β	1,75	30,8
	γ₁	1,31	23,2
	γ₂	1,22
	δ	1,54	27,2
	ε	2,83	40,4
	NH₂	7,34	-

Dab-2*	NH	8,09	-
	α	4,28	52,1
	β₁	2,11	28,7
	β₂	1,96
	γ	2,89	37,6
	NH₂		-

Thr	NH	7,63	-
	α	4,28	59,8
	β	3,92	68,6
	γ	1,16	20,4

Dhb	NH	9,45	-
	β	6,49	133,9
	γ	1,69	13,5

Hyd. Asp	NH	7,85	-
	α	4,94	56,9
	β	4,78	71,6

ClThr	NH	7,88
	α	4,87	56,0
	β	4,31	72,3
	γ₁	3,50	45,6
	γ₂	3,42

Seitenkette	2a	2,47	39,4
	2b	2,30
	3	3,76	72,6
	4	3,39	75,1
	5	1,41	33,3
	6–14	1,21	32,4, 30,2 × 4, 29,9, 27,2, 26,4, 23,2
	15	0,81	14,3

*Die Zuordnungen von Dab-1 und Dab-2 sind austauschbar

Strukturbestimmung von Pseudomycin B'

Die Strukturbestimmung von Pseudomycin B' wurde wiederum durch die Interpretation von massen- und NMR-spektrometrischen Daten bewerkstelligt. Die Molekularformel von C₄₉H₈₃ClN₁₂O₁₉ [m/z 1179,5685 für C₄₉H₈₄ClN₁₂O₁₉ (M+H)⁺, Δ –1,8 ppm] wurde durch FAB-MS-Daten mit hoher Auflösung etabliert. Diese Formel zeigte zwei CH₂ weniger, als sie für Pseudomycin B beobachtet wurden. Eine ausführliche Analyse mittels ¹H-, ¹³C- und 2D-NMR einschließlich TOCSY- und HMQC-Spektren und ein Vergleich der spektralen Daten mit denjenigen bekannter Pseudomycine offenbarte wiederum eine identische Aminosäure-Zusammensetzung. Darüber hinaus wiesen die NMR-Daten auf das Vorhandensein von 3-Hydroxydodecansäure hin (Tabelle 2). Somit wird die Struktur von Pseudomycin B' aus diesen Spektraldaten gemäß der Darstellung unten abgeleitet.

Struktur von Pseudomycin B', abgeleitet aus massen- und NMR-spektrometrischen Daten Tabelle 2 – ¹H- und ¹³C-NMR-Daten von Pseudomycin B' in H₂O + CD₃CN

Aminosäure	Position	δ_H	δ_C

Ser	NH	8,31	-
	α	4,64	53,5
	β1	4,54	65,8
	β2	4,35

Dab-1*	NH	8,52	-
	α	4,13	53,3
	β₁	2,02	28,7
	β₂
	γ	2,94	37,3
	NH₂	7,54	-

Asp	NH	8,30	-
	α	4,56	51,6
	β₁	2,86	36,0
	β₂	2,80

Lys	NH	7,90	-
	α	4,09	54,9
	β	1,75	29,8
	γ₁	1,28	23,2
	γ₂	1,18
	δ	1,52	27,3
	ε	2,82	40,4
	NH₂	7,34	-

Dab-2*	NH	8,24
	α	4,35	51,8
	β₁	2,12	29,2
	β₂	1,99
	γ	2,90	37,7
	NH₂		-

Thr	NH	7,75	-
	α	4,23	60,4
	β	3,93	68,2
	γ	1,18	20,5

Dhb	NH	9,45	-
	β	6,57	134,8
	γ	1,68	13,7

Hyd. Asp	NH	7,79	-
	α	4,95	57,1
	β	4,71	72,0

ClThr	NH	7,98
	α	4,87	55,8
	β	4,31	72,5
	γ₁	3,48	45,6
	γ₂	3,42

Seitenkette	2a	2,33	43,8
	2b	2,24
	3	3,85	69,6
	4	1,37	37,6
	5–11	1,20	32,4, 30,1, 30,1, 29,8, 23,2
	12	0,81	14,4

*Die Zuordnungen von Dab-1 und Dab-2 sind austauschbar

Schlussfolgerungen
Die Pseudomycine A' und B' stellen zwei neue Elemente einer einzigartigen Klasse von Nonadepsipeptiden dar. Obwohl diese Moleküle mit den bekannten Pseudomycinen sehr eng verwandt sind, wobei sie sich nur in der Beschaffenheit der hydrophoben Seitenkette unterscheiden, sollten sie eine Schlüsselrolle bei der Ermittlung der Struktur-Wirkung-Beziehung dieser Klasse von Fungiziden spielen.
Beispiel 4
Isolation, Charakterisierung und Mutagenese von Pseudomonas syringae
Mutanten aus der Umwelt und Mutanten von P. syringae wurden erzeugt und bei der Herstellung von Fungiziden verwendet.
Materialien und Verfahren
Die Stämme MSU 174 und MSU 16-H wurden gemäß der Beschreibung im U.S.-Patent Nr. 5,576,298 , erteilt am 19. November 1996, G. Strobel et al., Harrison et al., "Pseudomycine. a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity." J. Gen. Microbiology 137, 2857–2865 (1991), und Lamb et al., "Transposon mutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonas: Antimycotic production is necessary for control of Dutch elm disease.", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6447–6451 (1987), isoliert und charakterisiert.
Zusätzliche Stämme wurden von solchen Wildtyp- und mittels Transposonen erzeugten Mutanten mittels einer chemischen Mutagenese erzeugt. Einer Mutagenese unterzogene Stämme umfassen MSU 174, MSU 16H und 25-B1. Der zu mutagenisierende Stamm wurde in CSM-Medium gezogen und dann im Medium aufgeteilt, das 0, 1, 2, 4, 16 oder 32 μg/ml des chemischen Mutagens 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin (NTG oder MNNG) enthielt. Diese Zellen wurden dann für ein zukünftiges Screening und eine zukünftige Selektion gefroren.

Mutagenisierte Zellen wurden mit Hinblick auf wünschenswerte Wachstumsbedingungen und/oder die Erzeugung eines oder mehrerer Pseudomycine wie Pseudomycin A' und/oder B' ausgewählt. Chemisch mutagenisierte Zellen von P. syringae wie der mutagenisierte Stamm 25-B1 wurden aufgetaut und im Medium N21SM (Tabelle 5) auf 6 Zellen/ml verdünnt. Dieses Medium enthielt manchmal ein oder mehrere Komponenten zur Selektion, wie variierende Phosphatkonzentrationen. Ein 50-μl-Volumen mutagenisierter Zellen wurde in einem Napf einer Mikrotiterplatte mit 96 Näpfen mit rundem Boden mit durchschnittlich 0,3 Zellen/Napf verteilt. Typischerweise wurde Siliconöl zu jedem Napf gegeben, um eine Verdampfung zu minimieren. Die Platten wurden unter Schütteln 6 bis 12 Tage lang bei 25°C inkubiert. Tabelle 5 – Die Zusammensetzung des Mediums N21SM

BESTANDTEIL	GRAMM PRO LITER
Glucose	20
Ammoniumsulfat	0,5
Mononatriumglutamate oder L-Glutaminsäure	2
L-Histidin	2
Glycin	0,5
Lösliche Stärke	5
KH₂PO₄	0,2
Czapek-Mineralsalzlösung	2 ml
MES-Puffer	9,8
Einstellung des pH-Wertes auf 5,0

Nach dieser Inkubation wurde ein Aliquot, typischerweise 5 tl, aus jedem Napf seriell verdünnt (z. B. 1:56, 1:196, 1:320, 1:686 und/oder 1:1715) und in einem flüssigen Mikrotiterplatten-Assay auf eine Wirkung gegen Candida albicans untersucht. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert, und die Näpfe wurden hinsichtlich einer Hemmung des Wachstums von C. albicans markiert. Geeignete Stämme wurden aufgenommen, in CSM-Medium (Tabelle 6) inokuliert und 1 bis 3 Tage lang bei 25°C gezogen. Tabelle 6 Vollständiges Streptomyces-Medium (CSM)

Komponente Konzentration (g/l)

Glucose 5

Maltose 4

Tryptische Sojabrühe von Difco 30

Difco-Hefeextrakt 3

MgSO₄·7 H₂O 2
Keine Einstellung des pH-Wertes
Die ausgewählten Stämme wurden konserviert und in Fermentationsflaschen inokuliet, die 13 ml des Mediums N21SM enthielten, und etwa 66 h lang bei 25°C gezogen. Ein Aliquot wurde aus dieser Fermentation entfernt, 1 h lang mit einem Volumen an Acetonitril extrahiert, das gleich dem Volumen des Aliquoten war, zentrifugiert und zur HPLC-Analyse eines oder mehrerer Pseudomycine wie Pseudomycin A' oder B' dekantiert, wie in den Beispielen 1–3 beschrieben ist. Stämme, die ein oder mehrere Pseudomycine wie Pseudomycin A' oder B' erzeugten, wurden reisoliert, refermentiert und zum Wachstum in einem größeren Maßstab hergestellt.
Ergebnisse
Stämme, die ein oder mehrere Pseudomycine wie Pseudomycin A' oder B' erzeugten, wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren hergestellt.
Schlussfolgerung
Die hier offenbarten Selektionsverfahren und -kriterien sind zur Erzeugung von Stämmen von P. syringae brauchbar, die in einem mineralischen Medium wachsen und ein oder mehrere Pseudomycine wie Pseudomycin A' oder B' erzeugen.
Beispiel 5
Wachstum von P. syringae und Erzeugung von Pseudomycinen
Eine Fermentierung von P. syringae im Medium N21, das keine Kartoffelprodukte einschließt und in publizierten Medien zum Wachstum von P. syringae verwendet wurde, erzeugte Pseudomycine mit Konzentrationen, die zur Isolierung geeignet waren.
Herstellung von Pseudomycinen in Schüttelgefäßen und dem Medium N21
Materialien und Verfahren

P. syringae wurden in 50 ml des Kulturmediums N21 (Tabelle 7) in einem 250-ml-Kolben gezogen. Die Kultur wurde mit einem Aliquot einer Inokulierung von P. syringae MSU 16H begonnen und 7 Tage lang unter Schütteln mit 250 U./min in einem Inkubator auf 25°C und einer Feuchtigkeit von 70% gehalten. Am Ende des Inkubationszeitraums wurden 4 ml der Brühe aus dem Kolben entfernt und mit 6 ml Methanol, das 0,1% Phosphorsäure enthielt, vermischt. Es wird angenommen, dass der niedrige pH-Wert die Pseudomycine stabilisiert. Teilchenförmige Substanzen werden durch Filtration oder Zentrifugation entfernt, und die Pseudomycine wurden gemäß der Beschreibung hier mittels HPLC bestimmt. Tabelle 7 – Die Zusammensetzung des Mediums N21

BESTANDTEIL	GRAMM PRO LITER
Saccharose	35
Ammoniumsulfat	0,5
Mononatriumglutamat	2
L-Histidin	2
Glycin	0,5
Lösliche Stärke	5
KH₂PO₄	0,2
Czapek-Mineralsalzlösung	2 ml
Hefeextrakt	1
MES-Puffer	9,8
Einstellung des pH-Wertes auf 5,2

Die Erzeugung von Pseudomycin durch mehrere Stämme von P. syringae wurde ausgewertet, wobei das Medium N21 mit und ohne die Zugabe von Methylmyristat verwendet wurde. Die ausgewerteten Stämme von P. syringae umfassten MSU 16BL 25-B1, 67H1 und 7H9-1.
Ergebnisse
Die verschiedenen Stämme von P. syringae erzeugten, wenn sie mit oder ohne Methylmyristat gezogen wurden, signifikante Konzentrationen eines oder mehrerer Pseudomycine, zum Beispiel mehr als 10 Tg/ml eines oder mehrerer der Pseudomycine Pseudomycin A, Pseudomycin B und/oder Pseudomycin C.
Methylmyristat stimulierte bei bestimmten Stämmen die Erzeugung von Pseudomycin.
Schlussfolgerungen
Verschiedene Stämme von P. syringae erzeugen in einem Medium, dem Kartoffelprodukte fehlen, kommerziell signifikante Pseudomycin-Konzentrationen, und diese Erzeugung kann durch Methylmyristat stimuliert werden.
Erzeugung von Pseudomycinen in einem Maßstab von 5000 l unter Verwendung des Mediums N21
Der Maßstab der Verfahren zur Erzeugung von Pseudomycinen wurde unter Verwendung eines Mediums ohne zugegebene Kartoffelprodukte auf eine Menge von 5000 l vergrößert.
Materialien und Verfahren
Behälter für das vegetative Stadium, die vollständiges Streptomyces-Medium (CSM, Tabelle 5) enthielten, wurden mit einer gefrorenen P. syringae-Kultur, typischerweise dem Stamm 67H1, inokuliert und 24 h lang bei 250 U./min und 25°C geschüttelt. Nach einer 24-stündigen Inkubation der Behälter für das vegetative Stadium wurde der Inhalt dieser Behälter zum Inokulieren von Kolben für das Bump-Stadium verwendet. Die Kolben für das Bump-Stadium umfassten das CSM-Medium und wurden mit 250 U./min gedreht und auf 25°C gehalten. Die Kolben für das Bump-Stadium wurden mit etwa 0,45 ml gepoolter Kultur aus drei oder vier Kolben des vegetativen Stadiums inokuliert. Die Kolben für das Bump-Stadium umfassten typischerweise etwa 900 ml CSM in einem 2,5-l-Tunair^TM-Kolben ohne Ablenkplatten. Zwei Kulturen im Bump-Stadium in Tunair^TM-Kolben wurden für jeden der Fermenter eingerichtet. Die Kolben für das Bump-Stadium wurden 16 h lang inkubiert.
Dann wurden zwei der Kulturen im Bump-Stadium gepoolt, indem sie in einem manuell betätigten Inokulator vereinigt wurden. Diese kombinierten Kulturen wurden zum Inokulieren eines Tanks verwendet, der das in Tabelle 15 beschriebene Medium enthielt, das um zusätzliche 3 g/l (für insgesamt 4 g/l) Glycin, 1 g/l Sojabohnenöl und 1 g/l Hefeextrakt ergänzt worden war. Diese Kulturen im großen Maßstab wurden drei bis vier Tage lang bei 25°C gezogen: Während dieser Wachstumsperiode wurde der gelöste Sauerstoff durch Rühren und einen Luftstrom auf 30% der Luftsättigung geregelt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Schwefelsäure oder Natriumhydroxid nach Bedarf auf 5,2 + 0,2 geregelt. Achtzehn Stunden nach Beginn der Kultur im großen Maßstab wurde eine Glucosezufuhr mit einer Rate von 200 ml/h gestartet. Zwanzig Stunden nach Beginn der Kultur im großen Maßstab wurde eine Ammoniumhydroxid-Zufuhr mit einer Rate von 20 ml/h gestartet. Während dieser Kultur betrug der Rückhaltedruck 5 psig. Die anfängliche Einstellung für das Rühren betrug 150 U./min, und der Luftstrom betrug 0,5 scfm. Bei Bedarf wurde auch ein Antischaummittel zugegeben. Bestimmte Variationen dieser Bedingungen wurden ebenfalls getestet. Nach drei bis vier Tagen einer Kultur im großen Maßstab wurden die P. syringae geerntet. Die fungizide Wirkung wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 6 gemessen.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Pseudomycine wurden in kommerziell signifikanten Mengen im 5000-l-Maßstab hergestellt, wobei ein Medium verwendet wurde, das frei von zugegebenen Kartoffelprodukten war.
Beispiel 6
Bestimmung und Reinigung von Pseudomycinen
Nachweis und Quantifizierung von Pseudomycinen durch die fungizide Wirkung
Das Vorhandensein oder die Menge eines Pseudomycins oder einer Mischung von Pseudomycinen kann bestimmt werden, indem die fungizide Wirkung eines Präparats gemessen wird. Die fungizide Wirkung wurde in vitro bestimmt, indem die Mindest-Hemmkonzentration (MIC) des Präparats unter Verwendung eines standardmäßigen Agar-Verdünnungstests oder eines Scheibendiffusionstests erhalten wurde. Ein Präparat von einem oder mehreren Pseudomycinen kann ein Extrakt einer Zellkultur oder einer besser gereinigten Mischung sein. Ein typischer Pilz, der beim Testen einer fungiziden Wirkung verwendet wird, ist C. albicans. Die fungizide Wirkung wurde als signifikant betrachtet, wenn das Testpräparat auf Agarplatten, die mit Candida albicans x657 beimpft waren, Zonen einer Hemmung mit einem Durchmesser von 10–12 mm bewirkte.
Die Studien zur Fungizität wurden unter Verwendung eines Mikrotiterbrühe-Verdünnungsassays gemäß der Richtlinien des National Committee for Clinical Laborstory Standards in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen durchgeführt. Sabouraud- und Dextrosebrühe wurde so eingestellt, dass sie 2,5 × 10⁴ Conidien/ml enthielt. Die Testverbindung wurde in Wasser gelöst und in doppelten Verdünnungen getestet, wobei mit der höchsten Konzentration von 20 μg/ml begonnen wurde. Platten wurden 48 h lang bei 35°C inkubiert. Die Ergebnisse in Tabelle 3 und 4 zeigen, dass die Mindest-Hemmkonzentration (MIC) der Verbindung das Wachstum im Vergleich zu unbehandelten Wachstumskontrollen vollständig hemmte. Tabelle 3. Fungizide Wirkung von Pseudomycin A'

Organismus MIC (μ/ml)

Candida albicans 2,5

C. parapsilosis 5,0

Cryptococcus neoformans 1,25

Aspergillus fumigatus > 20

Histoplasma capsulation 5,0

Tabelle 4. Fungizide Wirkung von Pseudomycin B'

Organismus MIC (μ/ml)

Candida albicans 10

C. parapsilosis 10

Cryptococcus neoformans 1,25

Aspergillus fumigatus > 20

Histoplasma capsulation 1,25–5,0
Nachweis und Quantifizierung von Pseudomycinen mittels HPLC
Eine Probe, von der angenommen wurde, dass sie ein oder mehrere Pseudomycine enthielt, wurde mittels Filtration oder Klärfiltration geklärt. Die geklärte Mischung wurde an einer Säule mit Zorbax R × C8 (3,5 T Teilchen 25 × 0,46 cm) bei einer Fließrate von 1 ml/min chromatographiert. Die Säule wurde mit 20–55% Acetonitril mit 0,2% TFA mit einem linearen Gradienten in 15 min eluiert und 5 min lang auf 55% Acetonitril mit 0,2% TFA gehalten. Typischerweise wurden Pseudomycin A' bei etwa 13,7 min (822 s) und Pseudomycin B' bei etwa 12,4 min (822 s) eluiert. Pseudomycine wurden anhand der Extinktion bei 215 nm nachgewiesen und durch Integration der UV-Peaks quantifiziert. Zur Identifizierung und Quantifizierung wurde ein Standard eines jeden der Pseudomycine verwendet.
Beispiel 7
Formulierungen, die Pseudomycin A' und/oder B' einschließen
Die folgenden Formulierungsbeispiele sind nur veranschaulichend, und es ist nicht beabsichtigt, dass sie den Rahmen der Erfindung auf irgend eine Weise einschränken. Der Begriff "Wirkstoff" bedeutet Pseudomycin A' und/oder B' oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Formulierung 1
Harte Gelatinekapseln werden unter Verwendung der folgenden Bestandteile hergestellt:

Bestandteil Menge (mg/Kapsel)

Wirkstoff 250

Stärke, getrocknet 200

Magnesiumstearat 10

Insgesamt 460 mg
Formulierung 2
Eine Tablette wird unter Verwendung der nachfolgenden Bestandteile hergestellt. Die Komponenten werden vermischt und komprimiert, wodurch Tabletten gebildet werden, die jeweils 665 mg wiegen.

Bestandteil Menge (mg/Kapsel)

Wirkstoff 250

Cellulose, mikrokristallin 400

Siliciumdioxid, Staub 10

Stearinsäure 5

Insgesamt 665 mg
Formulierung 3
Es wird eine Aerosollösung hergestellt, die die folgenden Komponenten enthält. Der Wirkstoff wird mit Ethanol vermischt, und die Mischung wird zu einem Teil des Treibmittels 22 gegeben, auf –30°C abgekühlt und in eine Füllvorrichtung transferiert. Die erforderliche Menge wird dann in einen Behälter aus rostfreiem Stahl gegeben und mit dem Rest des Treibmittels verdünnt. Dann werden die Ventileinheiten am Behälter angebracht.

Komponente Gewicht (g)

Wirkstoff 0,25

Methanol 27,75

Treibmittel 22 (Chlordifluormethan) 74,00

Insgesamt 100,00
Formulierung 4

Tabletten, die jeweils 60 mg Wirkstoff enthalten, werden wie folgt hergestellt:

Wirkstoff	60 mg
Mikrokristalline Cellulose	45 mg
Polyvinylpyrrolidon (als 10%ige Lösung in Wasser)	4 mg
Natriumcarboxymethylstärke	4,5 mg
Magnesiumstearat	0,5 mg
Talk	1 mg
Insgesamt	150 mg

Der Wirkstoff, die Stärke und die Cellulose werden durch ein Sieb mit 45 U.S.-Mesh passiert und gründlich vermischt. Die Polyvinylpyrrolidon enthaltende wässrige Mischung wird mit dem resultierenden Pulver vermischt, und dann wird die Mischung durch ein Sieb mit 14 U.S.-Mesh passiert. Die so erzeugten Körner werden bei 50°C getrocknet und durch ein Sieb mit 18 U.S.-Mesh passiert. Die Natriumcarboxymethylstärke, Magnesiumstearat und Talk, die zuvor durch ein Sieb mit 60 U.S.-Mesh passiert worden waren, werden dann zu den Körnern gegeben, die nach dem Mischen in einer Tablettiermaschine komprimiert werden, wodurch Tabletten erhalten werden, die jeweils 150 mg wiegen.
Formulierung 5
Kapseln, die jeweils 80 mg Wirkstoff enthalten, werden wie folgt hergestellt:

Wirkstoff 80 mg

Stärke 59 mg

Mikrokristalline Cellulose 59 mg

Magnesiumstearat 2 mg

Insgesamt 200 mg
Der Wirkstoff, die Cellulose, die Stärke und das Magnesiumstearat werden vermischt, durch ein Sieb mit 45 U.S.-Mesh passiert und in 200-mg-Mengen in harte Gelatinekapseln gefüllt.
Formulierung 6
Zäpfchen, die jeweils 225 mg Wirkstoff enthalten, werden wie folgt hergestellt:

Wirkstoff 225 mg

Gesättigte Fettsäureglyceride 2000 mg

Insgesamt 2225 mg
Der Wirkstoff wird durch ein Sieb mit 60 U.S.-Mesh passiert und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die zuvor mit der minimalen zum Schmelzen erforderlichen Wärme geschmolzen wurden. Die Mischung wird dann in eine Zäpfchenform mit einer Nennkapazität von 2 g gegossen und abkühlen gelassen.
Formulierung 7
Suspensionen, die jeweils 50 mg Wirkstoff pro 5-ml-Dosis enthalten, werden wie folgt hergestellt:

Wirkstoff 50 mg

Natriumcarboxymethylcellulose 50 mg

Sirup 1,25 ml

Benzoesäurelösung 0,10 ml

Aroma q. v.

Farbstoff q. v.

Gereinigtes Wasser auf insgesamt 5 ml
Der Wirkstoff wird durch ein Sieb mit 45 U.S.-Mesh passiert und mit der Natriumcarboxymethylcellulose und dem Sirup vermischt, wodurch eine geschmeidige Paste gebildet wird. Die Benzoesäure, das Aroma und der Farbstoff werden mit einem Teil des Wassers vermischt und unter Rühren zugegeben. Dann wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Volumen zu erzeugen.
Formulierung 8
Eine intravenöse Formulierung kann wie folgt hergestellt werden. Die Lösung dieser Bestandteile wird einem Patienten mit einer Rate von 1 ml/min intravenös verabreicht.

Wirkstoff 100 mg

Isotonische Kochsalzlösung 1000 mg

Claims

Isoliertes Pseudomycin A' mit der Formel:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, Hydrat oder ein pharmazeutisch annehmbarer Ester davon.
Isoliertes Pseudomycin B' mit der Formel:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, Hydrat oder ein pharmazeutisch annehmbarer Ester davon.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung einer Pilzaktivität oder zur Verminderung der Symptome einer Pilzinfektion in einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Pilz Candida parapsilosis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans oder Histoplasma capsulatum umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, wobei der Wirkstoff eine Verbindung eines der Ansprüche 1 bis 2 oder eine Mischung davon ist, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein pharmazeutisch annehmbares Trägerverdünnungsmittel, Vehikel oder Trägermittel umfasst.
Verwendung von isoliertem Pseudomycin A' oder Hydraten, Solvaten oder Estern davon und/oder isoliertem Pseudomycin B' oder Hydraten, Solvaten oder Estern davon bei der direkten oder präventiven Behandlung einer Pilzaktivität in Pflanzen.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der behandelte Pilz aus Verticillium albo-atrum, Rhizoctonia solani und Fusarium oxysporum ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Behandlung durch Injizieren oder Sprühen einer wässrigen Suspension von Pseudomycin A' oder Hydraten, Solvaten oder Estern davon oder Pseudomycin B' oder Hydraten, Solvaten oder Estern davon in oder auf eine Pflanze erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Behandlung das Auftragen einer trockenen Formulierung auf eine Pflanze durch Sprühen oder Schütteln umfasst.
Wässrige Zusammensetzung zur direkten oder präventiven Behandlung einer Pilzaktivität in Pflanzen, wobei der Wirkstoff isoliertes Pseudomycin A' oder Hydrate, Solvate oder Ester davon und/oder isoliertes Pseudomycin B' oder Hydrate, Solvate oder Ester oder Mischungen davon ist.
Trockene Zusammensetzung zur direkten oder präventiven Behandlung einer Pilzaktivität in Pflanzen, wobei der Wirkstoff isoliertes Pseudomycin A' oder Hydrate, Solvate oder Ester davon und/oder isoliertes Pseudomycin B' oder Hydrate, Solvate oder Ester oder Mischungen davon ist.