ES2304954T3 - Analogos de pseudomicina. - Google Patents

Abstract

Una pseudomicina A'' aislada que tiene la fórmula: (Ver fórmula) o una sal, hidrato o éster farmacéuticamente aceptable de la misma.

Description

Análogos de pseudomicina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a las pseudomicinas A' y B', los procedimientos para elaborar tales pseudomicinas y los procedimientos que emplean la actividad antifúngica de estas pseudomicinas.

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Antecedentes

Las infecciones fúngicas son una causa importante de enfermedad, degradación de la calidad de la vida y mortalidad entre los seres humanos, en particular en los pacientes inmunocomprometidos. La incidencia de infecciones fúngicas en los seres humanos ha aumentado enormemente en los últimos 20 años. Esto se debe en parte a las cantidades crecientes de personas con sistemas inmunes debilitados o devastados por los trasplantes de órganos, la quimioterapia para el cáncer, el SIDA, la edad y otros trastornos o afecciones similares. Tales pacientes son propensos al ataque por patógenos fúngicos que son prevalentes en toda la población pero que son controlados por un sistema inmune en funcionamiento. Estos patógenos son difíciles de controlar porque algunos agentes antifúngicos existentes son altamente tóxicos o solamente inhiben la actividad fúngica. Por ejemplo, los polienos son fungicidas pero tóxicos; mientras que los azoles son mucho menos tóxicos pero solamente fungistáticos. Lo que es más importante, ha habido informes recientes de cepas de Candida resistentes a los azoles y polienos que limitan gravemente las opciones de terapia contra tales cepas.

La Pseudomonas syringae produce varias clases de agentes antifúngicos o antibióticos, tales como las pseudomicinas, siringomicinas, siringotoxinas y siringostatinas, que son lipodepsinonapéptidos. Las cepas naturales y los mutantes generados por transposones de P. syringae producen estos lipodepsinonapéptidos. Se han aislado varias de estas pseudomicinas, siringomicinas y otros agentes antifúngicos lipodepsipéptidos caracterizados químicamente y mostraron tener un amplio espectro de actividades antifúngicas, que incluye actividad contra importantes patógenos fúngicos en seres humanos y plantas. Por ejemplo, se han aislado y purificado cada una de las pseudomicinas A, B, C y C' y sus estructuras se han caracterizado por procedimientos que incluyen secuenciación de aminoácidos, RMN y espectrometría de masas. Véase, por ejemplo Ballio y col., "Novel bioactive lipodepsipeptides from Pseudomonas syringae: the pseudomycins", FEBS Lett. 355, 96-100 (1994) y la Patente de E.E.U.U. Nº 5.576.298. Las pseudomicinas, las siringomicinas, las siringotoxinas y las siringostatinas representan estructuralmente distintas familias de compuestos antifúngicos.

Ninguna de las pseudomicinas, siringomicinas, siringotoxinas o siringostatinas se han incorporado al mercado para terapia antifúngica. El descubrimiento de efectos secundarios indeseables, la producción de formulaciones, el ampliar la escala de producción y otros problemas de desarrollo han impedido la explotación hasta el momento de las pseudomicinas, siringomicinas, siringotoxinas o siringostatinas contra la variedad total de infecciones fúngicas que afectan animales, seres humanos y plantas. Sigue resultando necesario contar con un agente antifúngico que pueda utilizarse contra las infecciones no tratadas por los agentes antifúngicos existentes y para el uso contra infecciones en animales, seres humanos, o plantas.

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Resumen de la invención

La presente invención proporciona un producto natural de pseudomicina, pseudomicinas A' y B' producidos por P. syringae. El producto natural de la pseudomicina incluye un anillo depsinonapéptido con la secuencia Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr, más específicamente, L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl), con el grupo carboxilo del CIThr y el grupo hidroxilo de la serina cercana al anillo con un enlace lactona. La pseudomicina A' (IA) incluye un resto de ácido 3,4-dihidroxipentadecanoico, cuyo grupo carboxilo forma un enlace amida con el grupo amina de la serina N-terminal.

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La pseudomicina B' (IB) incluye un resto ácido 3-hidroxidodecanoico, cuyo grupo carboxilo forma un enlace amida con el grupo amina de la serina N-terminal.

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La invención también se refiere a los procedimientos que emplean pseudomicina A', pseudomicina B' o una mezcla de las mismas, para inhibir la actividad fúngica o para reducir los síntomas de una infección fúngica en un paciente que necesita de las mismas. Tales procedimientos pueden matar los hongos, disminuir la carga de una infección fúngica, reducir la fiebre y/o aumentar el bienestar general de un paciente. Los procedimientos de la invención son eficaces contra los hongos tales como Candida parapsilosis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans y/o Histoplasma capsulatum.

Descripción detallada Pseudomicinas

Como se usa en este documento, pseudomicina o el producto natural pseudomicina se refiere a uno o más miembros de una familia de agentes antifúngicos que se han aislado de la bacteria Pseudomonas syringae. Una pseudomicina es un lipodepsipéptido, un péptido cíclico que incluye uno o más aminoácidos inusuales y que tienen una o más cadenas laterales hidrófobas o de ácidos grasos añadidas. Específicamente, las pseudomicinas son lipodepsinonapéptidos, con una porción de péptido cíclico cerrada por un enlace lactona y que incluye los aminoácidos inusuales 4-clorotreonina, ácido 3-hidroxiaspártico, ácido dehidro-2-aminobutírico y ácido 2,4-diaminobutírico. Se cree que estos aminoácidos inusuales están involucrados en características biológicas de las pseudomicinas, tales como estabilidad en suero y su acción microbicida.

Cada pseudomicina tiene el mismo núcleo péptido cíclico, pero difieren en la cadena lateral hidrófoba unida a su núcleo. Cada pseudomicina tiene un anillo cíclico nonapeptídico que tiene la secuencia Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr (es decir, Serina; Ácido 2,4-Diaminobutírico: Ácido aspártico: Lisina: Ácido 2,4-diaminobutírico: alloTreonina; Ácido dehidro-2-aminobutírico; Ácido 3-hidroxiaspártico: 4-cloroTreonina), con el grupo carboxilo del CIThr y el grupo hidroxilo de la serina cerrando el anillo con un enlace lactona. El resto lipófilo está unido al grupo amina de la serina N-terminal. El grupo amina de la serina forma un enlace amida con el carboxilo de un resto 3,4-dihidroxitetradecanoílo en pseudomicina A, un resto 3-monohidroxitetradecanoílo en pseudomicina B, un resto 3,4-dihidroxihexadecanoílo en pseudomicina C y un resto 3-monohidroxihexadecanoílo en pseudomicina C'. El grupo carboxilo de la serina forma un enlace amida con el Dab del anillo.

Pseudomicinas A' y B'

Como se usa en este documento los términos pseudomicina A' y pseudomicina B' se refieren a agentes antifúngicos que se aislaron de la bacteria Pseudomonas syringae. Las pseudomicinas A' y B' son pseudomicinas que tienen el característico anillo depsinonapéptido con la secuencia Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr, con el grupo carboxilo del ClThr y el grupo hidroxilo de la serina cerrando el anillo con un enlace lactona. La pseudomicina A' incluye un resto ácido 3,4-dihidroxipentadecanoico, cuyo grupo carboxilo forma un enlace amida con el grupo amina de la serina N-terminal. La pseudomicina B' incluye un resto ácido 3-hidroxidodecanoico, cuyo grupo carboxilo forma un enlace amida con el grupo amina de la serina N-terminal.

Actividades Biológicas de las Pseudomicinas

Una pseudomicina tiene varias actividades biológicas que incluyen matar diversos hongos, tales como hongos patógenos de plantas y animales. En particular, una pseudomicina es un agente antimicótico activo contra los hongos que causan infecciones oportunistas en individuos inmunocomprometidos. Estos hongos incluyen diversas especies de Candida que incluyen C. parapsilosis, C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis y C. krusei. También incluyen otros géneros tales como Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus e Histoplasma capsulatum. Una actividad biológica deseable y de preferencia de un antifúngico, tal como pseudomicina A' y/o B' es la de matar, más que la de inhibir el crecimiento de los hongos, particularmente de los hongos patógenos.

Las pseudomicinas mostraron ser tóxicas en una gran variedad de hongos de plantas patógenas que incluyen Rynchosporium secalis, Ceratocystis ulmi, Rizoctonic solani, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium albo-atrum, Verticillium dahliae, Thielaviopis basicola, Fusarium oxysporum y Fusarium culmorum. (véase Harrison L., y col., "Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity", J. of General Microbiology, 7. 2857-2865 (1991)). Además, se ha demostrado que P. syringae MSU 16H confiere una mayor protección que la cepa de tipo salvaje en olmos infectados con Ceratocystic ulmi, el agente causal de la enfermedad del olmo holandés. (véase por ejemplo, Lam y col., Proc. Natl. Sci. EEUU. 84. 6447-6451 (1987 )).

Pseudomonas syringae

Las Pseudomonas syringae incluyen una gran variedad de bacterias que están asociadas generalmente con plantas. Algunas de las P. syringae son patógenos de plantas, mientras que otras son sólo débilmente patogénicas o son saprófitas. Muchos aislamientos diferentes de P. syringae producen uno o más agentes citotóxicos que pueden ayudar a esta bacteria a sobrevivir en la naturaleza donde debe competir con hongos y otras bacterias. Los agentes citotóxicos producidos por P. syringae incluyen agentes antifúngicos tales como las pseudomicinas, las siringomicinas, las siringotoxinas y las siringostatinas.

Se han descrito en la técnica cepas de P. syringae que producen una o más pseudomicinas. Por ejemplo, la cepa de tipo salvaje MSU 174 (aislada de un campo de cebada de Montana) y un mutante de esta cepa generada por mutagénesis de transposón usando TN905 (MSU 16H) están descritos en la Patente de EEUU Nº 5.576.298, expedida el 19 de noviembre de 1996, a G. Strobel y col.; Harrison y col., J. "Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity", Gen. Microbiology 137, 2857-2865 (1991); y Lamb y col., "Transposon mutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonas: Antimycotic production is necessary for control of Dutch elm disease", Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 84, 6447-6451 (1987). También se describen procedimientos para el cultivo de diversas cepas de P. syringae y su uso en la producción de agentes antifúngicos tales como pseudomicinas en la Solicitud de Patente de EEUU Nº de Serie 09/958996, ahora US6919188 de Matthew D. Hilton y col. titulada "Pseudomicina Production By Pseudomonas Syringae" presentada junto con ella en la misma fecha y descrita a continuación. Los cultivos de MSU 174 y MSU 16H están depositados en la Universidad del Estado de Montana (Bozeman, Montana, EEUU) y están disponibles en la American Type Culture Collection (Parklawn Drive, Rockville, MD, EEUU).

La presente invención incluye una cepa, un aislamiento y un cultivo biológicamente purificado de P. syringae que produce pseudomicina A' y/o B', en cantidades de al menos aproximadamente 10 \mug/ml. De preferencia, el cultivo biológicamente purificado de un microorganismo es de la cepa de Pseudomonas syringae MSU 16H, 35-B1, 67H1, o 7H9-1, o un mutante, variante, aislado o recombinante de estas cepas que producen pseudomicina A' y/o B'. Se obtuvieron los cultivos MSU 174 y MSU 16H como se describió en las referencias citadas anteriormente en este documento.

Una cepa de P. syringae que es adecuada para la producción de pseudomicina A' y/o B' puede aislarse de las fuentes ambientales que incluyen plantas, tales como las plantas de cebada, las plantas de cítricos y las plantas de lilas, y también de fuentes tales como el suelo, el agua, el aire y el polvo. Una cepa de preferencia se aísla de las plantas. Las cepas de P. syringae que se aíslan de las fuentes ambientales pueden denominarse de tipo salvaje. Como se usa en este documento, "tipo salvaje" se refiere a un genotipo dominante que se presenta naturalmente en la población normal de P. syringae (es decir cepas o aislamientos de P. syringae que se encuentran en la naturaleza y no se producen por manipulaciones de laboratorio). Como es el caso con otros organismos, las características de la pseudomicina A' y/o B' que produce cultivos empleados en esta invención, las cepas de P. syringae tales como MSU 174, MSU 16H, MSU 206, 25-B1, 7H9-1 y 67 H1 están sujetas a variaciones. Por consiguiente, la progenie de estas cepas, por ejemplo, recombinantes, mutantes y variantes, puede obtenerse por medio de procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Las cepas mutantes de P. syringae también son adecuadas para la producción de pseudomicina A' y/o B'. Como se usa en este documento, mutante se refiere a un cambio súbito que puede heredarse en el fenotipo de una cepa, que puede ser espontáneo o inducido por agentes mutagénicos conocidos, que incluyen radiación y diversos químicos. Los mutantes de P. syringae de la presente invención pueden producirse usando una diversidad de agentes mutagénicos que incluyen radiación tal como luz ultravioleta, rayos x; mutágenos químicos, mutagénesis específica de sitio y mutagénesis mediada por transposones. Son ejemplos de mutágenos químicos el metanosulfonato de etilo (EMS), diepoxioctano, N-metil-N-nitro-N'-nitrosoguanina (NTG) y ácido nitroso.

Pueden producirse mutantes de P. syringae de la presente invención que producenpseudomicina A' y/o B' tratando las bacterias con una cantidad de un agente mutagénico eficaz para producir mutantes que producen en exceso pseudomicina A' y/o B', que producen pseudomicina A' y/o B' en exceso sobre otras pseudomicinas o que producen pseudomicina A' y/o B' bajo condiciones de crecimiento ventajosas. A pesar de que puede variar el tipo y cantidad de agente mutagénico a usarse, un procedimiento de preferencia es diluir NTG en series a niveles que varían desde 1 hasta 100 \mug/ml. Los mutantes de la invención de preferencia son los que producen en exceso pseudomicina A' y/o B' cultivados en medios mínimos definidos. Los mutantes producen en exceso pseudomicina A y/o B' de preferencia hasta al menos aproximadamente 10 \mug/ml.

Los aislamientos ambientales, cepas mutantes y otras cepas deseables de P. syringae pueden estar sujetas a la selección de rasgos deseables de hábitos de crecimiento, medios de cultivo, fuentes de nutrientes, fuentes de carbono, condiciones de crecimiento y requerimientos de aminoácidos. De preferencia, se selecciona una cepa de P. syringae que produce pseudomicina A' y/o B' para cultivo en un medio mínimos definido, tal como medio N21, y/o para la producción de pseudomicina A' y/o B' a niveles mayores que aproximadamente 10 \mug/ml. Las cepas de preferencia exhiben las características de producir pseudomicina A' y/o B' cuando se cultivaron en un medio que incluye glicina y, opcionalmente, un lípido, o un producto de la patata o una combinación de los mismos.

Pueden desarrollarse las cepas recombinantes mediante la transformación de cepas de P. syringae, usando procedimientos de laboratorio establecidos bien conocidos por los expertos en la técnica. A través del uso de tecnología recombinante, las cepas de P. syringae pueden transformarse para expresar una diversidad de productos genéticos además de los antibióticos que estas cepas producen. Por ejemplo, se pueden transformar las cepas con un vector recombinante que confiere resistencia a un antibiótico al que las cepas son normalmente sensibles. Los transformantes obtenidos de esta manera producirán no sólo pseudomicinas, tal como pseudomicinas A' y/o B', sino también la enzima que confiere resistencia que permite la selección de los transformados de las células tipo salvaje. Además, al usar técnicas similares, pueden modificarse las cepas presentes para introducir copias múltiples de los genes de biosíntesis de pseudomicina endógenos para conseguir mayores rendimientos de pseudomicina, tal como pseudomicina A' y/o B'. Las progenies, es decir las variantes naturales e inducidas, mutantes y recombinantes, de cepas de P. syringae 25-B 1, 67H1 y 7H9-1 que mantienen las características de la pseudomicina, tal como la sobreproducción de pseudomicina A' y/o B' son parte de esta invención.

Cultivo de Pseudomonas syringae

Como se describe en este documento, "medios nutritivos acuosos" se refiere a una composición basada en agua que incluye compuestos minerales y orgánicos y sus sales necesarias para el cultivo de las bacterias usadas en la presente invención. Los medios nutritivos de preferencia contienen una cantidad eficaz de tres o menos aminoácidos, de preferencia, ácido glutámico, glicina, histidina o una combinación de los mismos. En una forma de realización, el medio contiene una cantidad eficaz de glicina y, opcionalmente, uno o más de un producto de la patata y un lípido. La glicina puede proporcionarse como un aminoácido simple o como parte de una mezcla de aminoácidos, tal como proteína hidrolizada. Los lípidos adecuados incluyen aceite de soya, o un ácido graso. Los productos de la patata adecuados incluyen caldo de dextrosa de patata, dextrina de patata, proteína de patata y producto alimenticio comercial de de puré de patatas. Los minerales de preferencia en el medio nutritivo incluyen mezclas de sales usadas típicamente en el cultivo celular y en la fermentación, tal como solución de sales minerales Czapek (por ejemplo, KCl, MgSO_{4} y FeSO_{4}). El compuesto orgánico en los medios nutritivos de preferencia incluye glucosa y opcionalmente puede incluir almidón soluble: también pueden incluirse otros compuestos orgánicos similares. De preferencia el pH del medio está entre aproximadamente 4 y 6,5, de más preferencia aproximadamente entre 4,5 hasta aproximadamente 5,7, de mayor preferencia aproximadamente 5,2.

Aunque la cantidad de cada ingrediente en el caldo nutritivo no es típicamente crítica para el cultivo de las bacterias o para la producción de pseudomicina A' y/o B' ciertos niveles de nutrientes son ventajosos. Una cantidad glicina de preferencia es desde aproximadamente de 0,1 g/l hasta aproximadamente 10 g/l, de más preferencia desde aproximadamente 0,3 g/l hasta aproximadamente 3 g/l, de mayor preferencia aproximadamente 1 g/l. Una cantidad de lípido de preferencia es desde aproximadamente 1 g/l hasta aproximadamente 10 g/l de un producto de aceite tal como aceite de soya, de más preferencia desde aproximadamente 0,5 g/l hasta aproximadamente 2 g/l de aceite de soya. Una cantidad de un ácido graso o éster de ácido graso de preferencia es desde aproximadamente 0,5 g/l hasta aproximadamente 5 g/l. Las cantidades de preferencia de productos de patatas incluyen desde aproximadamente 12 g/l hasta aproximadamente 36 g/l, de preferencia aproximadamente 24 g/l de caldo de dextrosa de patata; desde aproximadamente 5 g/l hasta aproximadamente 50 g/l, de preferencia aproximadamente 30 g/l de mezcla de puré de patata comercial; desde aproximadamente 1 g/l hasta aproximadamente 30 g/l, de preferencia aproximadamente 20 g/l de dextrina de patata; o desde aproximadamente 1 g/l hasta aproximadamente 10 g/l, de preferencia aproximadamente 4 g/l de proteína de patata. Un medio nutritivo de preferencia incluye minerales, de preferencia, KCl desde aproximadamente 0,02 hasta aproximadamente 2 g/l, de más preferencia aproximadamente 0,2 g/l; MgSO_{4}, de preferencia
MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O, desde aproximadamente 0,02 hasta aproximadamente 2 g/l, de más preferencia aproximadamente 0,2 g/l; y FeSO_{4}, de preferencia FeSO_{4} \cdot 7H_{2}O, desde aproximadamente 0,4 hasta aproximadamente 40 mg/l, de más preferencia aproximadamente 4 mg/l. Cuando está presente, el almidón soluble está de preferencia en una concentración desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 50 g/l, de más preferencia aproximadamente 5 g/l. De preferencia la glucosa está presente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 80 g/l, de más preferencia aproximadamente 20 g/l.

P. syringae se cultiva típicamente en los medios descritos bajo condiciones de pH y temperatura controlados o regulados. La P. syringae se cultiva y produce pseudomicina A' y/o B' a temperaturas entre aproximadamente 15ºC y aproximadamente 35ºC, de preferencia desde aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 30ºC, de más preferencia desde aproximadamente 22ºC hasta aproximadamente 27ºC, de mayor preferencia aproximadamente 25ºC. P. syringae se cultiva y produce pseudomicina A' y/o B' a pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 9, de preferencia entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6, de más preferencia entre aproximadamente 4,5 hasta aproximadamente 5,5. Típicamente el cultivo de P. syringae no se produce cuando la temperatura está por encima de 37ºC o por debajo de 10ºC o cuando el pH está encima de 9 o por debajo de 4.

Procedimiento para la Producción de Pseudomicinas A' y B'

Para producir pseudomicina A' y/o B' a partir una cepa de P. syringae de tipo salvaje o mutante, el organismo se cultiva con agitación en un medio nutritivo acuoso que incluye una cantidad eficaz de tres o menos aminoácidos. Los tres o menos aminoácidos de preferencia son ácido glutámico, glicina, histidina o una combinación de los mismos. En una forma de realización de preferencia, los aminoácidos incluyen glicina y, opcionalmente, uno o más de un producto de patata y un lípido. El cultivo se lleva a cabo bajo condiciones eficaces para el cultivo de P. syringae y producción de pseudomicina A' y/o B'. Las condiciones eficaces incluyen temperatura desde aproximadamente 22ºC hasta aproximadamente 27ºC, y una duración desde aproximadamente 36 horas hasta aproximadamente 96 horas. Cuando se cultivan en los medios tal como los que se describen en este documento, la P. syringae puede crecer en densidades celulares hasta aproximadamente 10-15 g/l en peso seco y producir pseudomicinas A' y/o B' en cantidades totales de al menos aproximadamente 10 \mug/ml.

Resulta ventajoso controlar la concentración de oxígeno en el medio durante el cultivo de P. syringae para la producción de pseudomicina A' y/o B'. De preferencia, los niveles de oxígeno se mantuvieron desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 50% de saturación, de preferencia aproximadamente 30% de saturación. El burbujeo con aire, con oxígeno puro, o con mezclas de gases que incluyan oxígeno puede regular la concentración de oxígeno en el medio. Además, el ajuste de la velocidad de agitación puede usarse para ajustar la velocidad de transferencia de oxígeno.

Resulta ventajoso controlar el pH del medio durante el cultivo de P. syringae para la producción de una pseudomicina A' y/o B'. Las pseudomicinas, tales como las pseudomicinas A' y/o B', son lábiles a pH básico, y puede producirse una degradación significativa si el pH del medio de cultivo está encima de aproximadamente 6 durante más de aproximadamente 12 horas. De preferencia, el pH del medio de cultivo se mantiene en valores inferiores a aproximadamente 6, de preferencia en valores inferiores a aproximadamente 5,5, y de preferencia por encima de 4,0. De preferencia el pH se mantiene a aproximadamente 5 hasta aproximadamente 5,4, de más preferencia desde aproximadamente 5,0 hasta aproximadamente 5,2. Aunque no se limita a la presente invención, se cree que la degradación de pseudomicina a pH básico se debe a la apertura del anillo lactona y a la conversión de ClThr a Thr.

P. syringae puede producir pseudomicinas A' y/o B' cuando se cultiva en cultivos en lotes. Sin embargo, la alimentación continua o fed-batch de glucosa y, opcionalmente, un ácido o una base, tal como hidróxido de amonio, para controlar el pH, mejora la producción de pseudomicina. La producción de pseudomicina por medio de P. syringae puede mejorar más usando procedimientos de cultivo continuos en los que se alimentan automáticamente la glucosa y, opcionalmente, un ácido o una base, tal como hidróxido de amonio, para controlar pH.

Las pseudomicinas A' y/o B' pueden detectarse, determinarse, aislarse y/o purificarse mediante una diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse el nivel de actividad de pseudomicina en un caldo o en un aislamiento o composición purificada por medio de la acción antifúngica contra hongos tales como Candida. Se conocen numerosos procedimientos para la preparación y análisis de las pseudomicinas. Por ejemplo, pueden aislarse y purificarse una o más pseudomicinas mediante cromatografía, tal como HPLC.

Usos farmacéuticos Formulaciones y Acción Antifúngica de la Pseudomicina A' o B'

Cada una de las pseudomicinas A' y B' muestran actividad in vitro e in vivo y por consiguiente pueden ser útiles para combatir infecciones fúngicas sistémicas o infecciones fúngicas cutáneas. Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir la actividad fúngica que incluye poner en contacto pseudomicina A' y/o B' o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas con un hongo. Un procedimiento de preferencia incluye inhibir el crecimiento o la actividad de diversos hongos incluidos C. parapsilosis, C. albicans, Cryptococcus neoformans e Histoplasma capsulatum. Como se usa en este documento, poner en contacto un compuesto de la invención con un parásito u hongo se refiere a una unión o adhesión, o contacto aparente o proximidad mutua de un compuesto de la invención con un parásito u hongo. Sin embargo, el término poner en contacto no implica ningún mecanismo de inhibición.

La presente invención además proporciona el uso de la pseudomicina A' o B' en la fabricación de un medicamento para uso en un procedimiento para tratar una infección fúngica que incluye la administración de una cantidad eficaz de pseudomicina A' y/o B', o una sal, hidrato o éster farmacéuticamente aceptable de las mismas, a un huésped que necesite tal tratamiento. Un procedimiento de preferencia incluye tratar una infección por diversos hongos, incluidos C. parapsilosis, C. albicans, Cryptococcus neoformans e Histoplasma capsulatum. Cuando se administra en una cantidad eficaz y adecuada, una formulación de pseudomicina A' y/o B' reduce la carga de una infección fúngica, reduce los síntomas asociados con la infección fúngica y puede dar como resultado la eliminación de la infección fúngica.

Algunos pacientes que necesitan terapia antifúngica tienen síntomas graves de infección, tales como fiebre alta y es probable que se encuentren en cuidado intensivo o crítico. Diversos hongos pueden causar tales infecciones serias. Candida spp., por ejemplo, puede causar infecciones mucosas e infecciones sistémicas serias. Con creciente frecuencia se han informado cepas de Candida resistentes a azoles y polienos. Aspergillus causa infecciones sistémicas que ponen en riesgo la vida. Cryptococcus es responsable de la meningitis. Tales infecciones fúngicas serias pueden presentarse en pacientes inmunocomprometidos, tales como los que reciben transplantes de órganos o médula ósea, los que están sometidos a quimioterapia para el cáncer, los que están en recuperación de cirugías mayores, o que sufren infecciones por VTH. Para tales pacientes, la terapia antifúngica incluirá típicamente la administración intravenosa de una formulación que contenga pseudomicina A' y/o B' durante varios días o más para detener la infección.

Con respecto a la actividad antifúngica, el término "cantidad eficaz" significa una cantidad de un compuesto de la presente invención que sea capaz de inhibir el crecimiento o actividad fúngicos o de disminuir los síntomas de la infección fúngica. Para la mayoría de las infecciones fúngicas, la disminución de los síntomas incluye la reducción de la fiebre, el retorno a la conciencia y el aumento del bienestar del paciente. De preferencia, los síntomas se reducen matando al hongo para eliminar la infección o para llevar la infección a un nivel tolerado por el paciente o controlado por el sistema inmunológico del paciente. Como se usa en este documento, inhibir significa inhibir la actividad fúngica, incluidos la detención, el retardo o el bloqueo profiláctico o evitar el crecimiento o cualquier característica o resultado esperado a partir de la existencia de un hongo.

La dosis administrada variará dependiendo de factores tales como la naturaleza y gravedad de la infección, la edad y el estado de salud general del huésped y la tolerancia del huésped al agente antifúngico. Típicamente, las composiciones se administrarán a un paciente (ser humano u otro animal, incluidos mamíferos tales como, pero no limitado a ellos, gatos, caballos y ganado y especies aviarias) que necesiten de las mismas, en una cantidad eficaz para inhibir la infección fúngica. El régimen de dosificación particular puede, por consiguiente, variar de acuerdo a tales factores y puede administrarse en una monodosis diaria o en múltiples dosis a lo largo del día. El régimen puede durar desde aproximadamente 2-3 días hasta aproximadamente 2-3 semanas o más. Una dosis diaria típica (administrada como monodosis o en dosis repartidas) contendrá un nivel de dosificación de desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de un compuesto activo de esta invención. Las dosis diarias de preferencia serán generalmente de desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 60 mg/kg e idealmente desde aproximadamente 2,5 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg. Para infecciones serias, puede administrarse el compuesto por infusión intravenosa usando, por ejemplo, desde 0,01 hasta 10 mg/kg/hora del ingrediente activo.

La presente invención también proporciona formulaciones farmacéuticas útiles para la administración de los compuestos antifúngicos de la invención. Por consiguiente, la presente invención también proporciona una formulación farmacéutica que incluye uno o más vehículos, diluyentes, excipientes u otros aditivos farmacéuticamente aceptables y como agente activo pseudomicina A' y/o B'. El ingrediente activo en tales formulaciones incluye desde 0,1% hasta 99,9% en peso de la formulación, más generalmente, desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 30% en peso. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende que el vehículo, diluyente o excipiente es compatible con los otros ingredientes de la formulación y no es deletéreo para el receptor del mismo.

La formulación puede incluir aditivos tales como diversos aceites, incluidos los provenientes del petróleo, los de origen animal, vegetal o sintético, por ejemplo aceite de cacahuete, de soya, aceite mineral y aceite de sésamo. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, celulosa, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche en polvo desnatada, glicerol, propilenglicol, agua y etanol. Las composiciones pueden someterse a expedientes farmacéuticos convencionales, tales como esterilización, y pueden contener aditivos farmacéuticos convencionales, tales como conservantes, agentes estabilizadores, humectantes o agentes emulsivos, sales para ajustar la presión osmótica y tampones. Los vehículos farmacéuticos adecuados y sus formulaciones se describen en Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15º Ed.; Mack Publishing Co. Easton (1975); véase por ejemplo páginas. 1405-1412 y páginas 1461-1487.

El término "sal farmacéuticamente aceptable" tal como se usa en el presente documento, se refiere a las sales de los compuestos descritos anteriormente que son sustancialmente no tóxicos para los organismos vivos. Las típicas sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas sales preparadas por la reacción de los compuestos de la presente invención con un ácido mineral u orgánico o una base inorgánica. Tales sales se conocen como sales de adición de ácidos y adición de bases.

Los ácidos comúnmente empleados para formar las sales de adición de ácidos son ácidos minerales tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico y ácidos orgánicos tales como ácidos p-toluenosulfónico, metanosulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenilsulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico y ácido acético. Son ejemplos de esas sales farmacéuticamente aceptables: el sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenfosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro, yoduro, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butin-1,4-dioato, hexin-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gamma-hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metanosulfonato, propanosulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato y mandelato. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables de preferencia son las que se forman con ácidos minerales tales como ácido clorhídrico y ácido bromhídrico y aquellas formadas con ácidos orgánicos tales como ácido maleico y ácido metanosulfónico.

Las sales de adición de bases incluyen las derivadas de bases inorgánicas, tales como hidróxidos, carbonatos y bicarbonatos de amonio metales alcalinos o de metales alcalinotérreos. Tales bases útiles para preparar las sales de esta invención incluyen por consiguiente hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, carbonato de potasio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, bicarbonato de potasio, hidróxido de calcio y carbonato de calcio. Resultan particularmente de preferencias las formas de sales de potasio y de sodio.

Debe reconocerse que el contraión particular que forma parte de cualquier sal de esta invención no es de naturaleza crítica, a condición de que la sal como un todo sea farmacológicamente aceptable y a condición de que el contraión no introduzca cualidades indeseables a la sal como un todo.

La pseudomicina A' y/o B' pueden administrarse por vía parenteral, por ejemplo, usando inyección intramuscular, subcutánea o intraperitoneal, o vías nasal u oral. Además de estos procedimientos de administración, las pseudomicina A' y/o B' pueden aplicarse por vía tópica para infecciones cutáneas superficiales o para erradicar o inhibir hongos en el mucus.

Para la administración parenteral la formulación incluye pseudomicina A' y/o B' y un diluyente fisiológicamente aceptable tal como agua desionizada, solución salina fisiológica, dextrosa al 5% y otros diluyentes comúnmente usados. La formulación puede contener una ciclodextrina y/o un agente solubilizante tal como un polietilenglicol o polipropilenglicol u otro agente solubilizante conocido. Tales formulaciones pueden prepararse en viales estériles que contengan el antifúngico y el excipiente en un polvo seco o en forma de polvo seco o polvo liofilizado. Previo al uso, se añade un diluyente fisiológicamente aceptable y la solución se retira mediante una jeringa para su administración al paciente.

Las presentes formulaciones farmacéuticas se preparan por medio de procedimientos conocidos usando ingredientes conocidos fácilmente disponibles. Para producir las composiciones de la presente invención, el ingrediente activo se mezclará generalmente con un vehículo, o se diluirá con un vehículo, o se incluirá dentro de un vehículo que puede estar en la forma de una cápsula, saco, papel u otro contenedor. Cuando el vehículo sirve como diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido que actúe como vehículo, excipiente o medio para el ingrediente activo. Por consiguiente, las composiciones pueden estar en forma de comprimidos, píldoras, polvos, pastillas, sacos, sellos, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido), ungüentos que contengan, por ejemplo, hasta el 10% en peso del compuesto activo, cápsulas blandas y duras de gelatina, supositorios, soluciones inyectables estériles y polvos envasados de manera estéril.

Para la administración oral, el compuesto antifúngico se coloca dentro de cápsulas de gelatina o se le da forma de comprimidos. Tales comprimidos pueden también contener un agente ligante, un desagregante u otros excipientes adecuados para preparar un comprimido de tamaño adecuado para la dosificación de la pseudomicina A' y/o B'. Para uso pediátrico o geriátrico el compuesto antifúngico puede formularse en una suspensión solución o emulsión líquida, aromatizada. Una formulación oral de preferencia es el ácido linoleico, cremofor RH-60 y agua y de preferencia en la cantidad (en volumen) 8% de ácido linoleico, 5% creomofor RH-60, 87% de agua estéril y pseudomicina A' y/o B' en una cantidad desde aproximadamente 2,5 hasta aproximadamente 40 mg/ml.

Para uso tópico el compuesto antifúngico puede formularse con un polvo seco para aplicar a la superficie de la piel o puede formularse en una formulación líquida que incluya un líquido acuoso o un líquido no acuoso solubilizante, por ejemplo un alcohol o un glicol.

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Usos de Formulaciones de pseudomicina A' o B'

La presente invención también abarca un kit que contiene las presentes composiciones farmacéuticas y para uso con los procedimientos de la presente invención. El kit puede contener un vial que contiene una formulación de la presente invención y vehículos adecuados, ya sea secos en forma líquida. El kit además incluye instrucciones en forma de una etiqueta en el vial y/o en forma de un prospecto incluido en una caja en la que está empaquetado el vial, para el uso y administración de los compuestos. Las instrucciones también pueden estar impresas en la caja que está empaquetado el vial. Las instrucciones contienen información tal como dosificación suficiente e información para su administración, para permitir que un trabajador el campo administre el fármaco. Se anticipa que un trabajador en el campo de la salud incluye cualquier médico, enfermero o técnico que pueda administrar el fármaco.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que incluye una formulación de pseudomicina A' y/o B' y que es adecuada para administración por medio de inyección. De acuerdo con la invención, puede usarse una formulación de pseudomicina A' y/o B' para fabricar una composición o medicamento adecuado para administración por medio de inyección. La invención también se refiere a procedimientos para elaborar composiciones que incluyen una formulación de pseudomicina A' y/o B' en una forma adecuada para administración por medio de inyección. Por ejemplo, una formulación líquida o sólida puede elaborarse de varias maneras, usando técnicas convencionales. Una formulación líquida puede prepararse disolviendo pseudomicina A' y/o B' en un disolvente adecuado, tal como agua, a un pH adecuado, incluyendo tampones u otros excipientes.

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Usos en Agricultura

Los antibióticos producidos a partir de P. syringae NRRL B-12050 han demostrado ser eficaces en el tratamiento de la enfermedad del olmo holandés, (véase, por ejemplo, las patentes de EEUU Nº 4.342.746 y 4.277.462). En particular, se ha demostrado que P. syringae MSU 16H confiere una mayor protección que la cepa de tipo salvaje en los olmos infectados con Ceratocystis ulmi, el agente causal de la enfermedad del olmo holandés. (Véase, por ejemplo, Lam y col., Proc. Natl. Sci. EEUU 84.6447-6451 (1987)). Se confirmó el fenómeno del biocontrol a nivel profiláctico mediante pruebas más extensas en olmos crecidos en el campo. De aquí que las pseudomicinas de la presente invención pueden ser útiles como un tratamiento preventivo de la enfermedad del olmo holandés. Las pseudomicinas han demostrado ser tóxicas para una gran variedad de hongos patogénicos de plantas incluidos Rynchosporium secalis, Ceratocystis ulmi, Rizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium albo-atrum, Verticillium dahliae, Thielaviopis basicola, Fusarium oxysporum y Fusarium culmorum. (Véase Harrison, L. y col., "Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity", J. General Microbiology, 7, 2857-2865 (1991). Por consiguiente, la pseudomicina aislada A' y/o B' (incluidos hidratos, solvatos y ésteres de las mismas) pueden ser útiles en el tratamiento de los hongos en plantas (en particular, V. albo-atrum, Rhizoctonia solani y F. oxysporum) ya sea como tratamiento directo o tratamiento preventivo). Generalmente, las plantas infectadas se tratan mediante inyección o pulverización de una suspensión acuosa de los compuestos de pseudomicina dentro o fuera de la planta. Los modos de inyección son bien conocidos por los expertos en la técnica (por ej. pistola inyectora). Para pulverizar la suspensión puede usarse cualquier medio que distribuya una cantidad eficaz del material activo sobre la superficie de las plantas. La suspensión puede incluir otros aditivos generalmente usados por los expertos en la técnica, tales como solubilizantes, estabilizantes, agentes humectantes o combinaciones de los mismos.

El tratamiento de la planta también puede llevarse a cabo usando una composición seca que contenga los compuestos pseudomicina A' y/o B' aislados como agente activo. La formulación seca puede aplicarse a la superficie de la planta por cualquier medio bien conocido para los expertos en la técnica, tal como la pulverización o la agitación desde un recipiente.

La presente invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos intentan ser representativos de formas de realización específicas de la invención y no pretenden limitar el ámbito del alcance.

Ejemplos Materiales Biológicos en Depósito

P.syringae MSU 16H está disponible públicamente en la American Type Culture Collection. Parklawn Drive, Rockville, MD, EEUU como Nº de Acceso ATCC 67028. Las cepas de 25-B1, 7H9-1 y 67 H1 de P.syringae se depositaron el 23 de marzo de 2000 en la American Type Culture Collection y se les asignaron los siguientes Nº de Acceso:

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25-B1 Nº de Acceso PTA-1622

7H9-1 Nº de Acceso PTA-1623

67 H1 Nº de Acceso PTA-1621

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Ejemplo 1 Producción de Pseudomicinas A' y B'

Se desarrollaron procedimientos de fermentación para producir pseudomicina A' y/o B' en el caldo de fermentación de una cepa de Pseudomonas syringae.

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Materiales y Procedimientos

Preparación del inóculo: Se descongeló una alícuota de células almacenadas en la fase de vapor de nitrógeno líquido y se usó para inocular dos porciones de 900 ml de caldo CSM. El caldo CSM estaba compuesto de (g/l): dextrosa (5), maltosa (4), Caldo de Triptona y Soya Difco (30), extracto de levadura Difco (3) y MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (2). Se usaron aproximadamente 0,5 ml de células para inocular cada porción de 900 ml de medio contenido en un matraz de dos litros. Los Nº de Acceso se incubaron con agitación durante 24 horas a 25ºC. Se combinó el contenido de los dos matraces para inocular un fermentador de 150 litros que contenía 115 litros de caldo de fermentación
estéril.

Etapa de Fermentación: El caldo de fermentación estaba compuesto de (g/l): dextrosa (20), almidón soluble (5), puré de patatas instantáneo en perlas estilo Country de Basic American Foods (30), glicina (1), MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,2) KCl (0,2) y FeSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,004) en agua de grifo. El pH se ajustó hasta 5,2 previo a la esterilización. La fermentación se llevó a cabo a 25ºC durante 68 horas. El oxígeno disuelto se mantuvo a 30% o más de saturación de aire mediante un ajuste continuo del flujo de aire y de la velocidad de agitación del impulsor. El pH se mantuvo entre 4,0 y 5,4 mediante la adición de H_{2}SO_{4} o NaOH.

Variaciones en los procedimientos por lotes: Se descubrió también que varias variaciones del proceso por lotes simple producen pseudomicinas A' y B'. La dextrosa puede alimentarse a los fermentadores comenzando 24 tas la inoculación inicial a una velocidad de 60 ml por hora. La alimentación puede continuarse durante el transcurso de la fermentación. Como alternativa, se ha usado un procedimiento en el que se mantiene el oxígeno disuelto al 5% de saturación de aire comenzando 24 horas tras la inoculación y continuando hasta el final del período de fermentación. El mantenimiento del oxígeno disuelto al 5% se alcanzó mediante la adición de gas nitrógeno inerte (N_{2}) al suministro de aire que lleva al fermentador. En todos los casos, el gas se suministró a través de un único tubo inyector sumergido con una abertura posicionada justo por debajo de la turbina inferior del agitador en el fermentador.

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Resultados y Conclusiones

Varios procedimientos de fermentación producen pseudomicina A' y B' a partir de P. syringae.

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Ejemplo 2 Aislamiento y Purificación de Pseudomicinas A' y B'

Se desarrollaron procedimientos para aislar y purificar pseudomicinas A' y B' a partir del caldo de fermentación de una cepa de Pseudomonas syringae.

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Materiales y Procedimientos

Se filtró todo el caldo de fermentación (4 X 100 l) tras la recogida a través de un filtro de cerámica Membralox (0,45 \mum) para dar un filtrado (fracción A) y una suspensión sólida (fracción B). La fracción B (135 l) se extrajo con un volumen igual de acetona que contenía TFA al 0,1% durante 120 minutos y se dejó en reposo. El extracto de acetona transparente se separó por filtración y a continuación se evaporó en vacío hasta una solución acuosa para rendir una fracción C (88 l). Primero, se cargó la fracción A en una columna de resina HP20ss (10 l) empaquetada en agua y se lavó la columna con acetonitrilo al 15% que contenía TFA al 0,1% (20 l). A continuación se cargó la fracción C en la misma columna y la columna se lavó con 20 l de acetonitrilo al 15% que contenía TFA al 0,1% como anteriormente.

A continuación se eluyó la columna con un gradiente lineal de acetonitrilo al 15-20% que contenía TFA al 0,1% durante 30 minutos y acetonitrilo al 20-35% que contenía TFA al 0,1% durante 60 minutos con un caudal de un l/minuto. Se recogieron fracciones de un litro. Las fracciones 6-9 se combinaron (4 l) para dar la fracción D (24 g). Una porción de la fracción D (aproximadamente 1 g) se sometió a cromatografía sobre una columna en fase inversa (Dynamax C_{18} 41,4 x 250 mm) usando un tampón de fosfato de trietilamonio (pH 3)-acetonitrilo-metanol como fase móvil (elusión con gradiente 65:17:18 hasta 30:35:35 durante 45 minutos con un caudal de 40 ml/min). Se combinaron fracciones adecuadas, el volumen se redujo hasta 75 ml y se volvió a someter a cromatografía a través de una columna C_{18} como anteriormente usando un gradiente 80:10:10 hasta 46:27:27 para dar la fracción E (113 mg) y la fracción F (116 mg). Otras cromatografías de las fracciones E y F a través de una columna C_{18} (Dynamax 21,4 x 250 mm) proporcionaron 45 mg de pseudomicina A' y 62 mg de pseudomicina B', respectivamente.

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Resultados y Conclusiones

Los procedimientos de HPLC similares a los que se usan para purificar otras pseudomicinas dieron por resultado la purificación de pseudomicinas A' y B' a partir del caldo de fermentación.

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Ejemplo 3 Determinación de la Estructura de Pseudomicinas A' y B'

La espectrometría de masas y la RMN determinaron las estructuras de las pseudomicinas A' y B'.

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Determinación de la Estructura de Pseudomicina A' Procedimientos y Resultados

La fórmula molecular de la pseudomicina A' se determinó por EMAR de alta resolución como C_{52}H_{89}ClN_{12}O_{20} [m/z 1237,6112 para C_{52}H_{90}ClN_{12}O_{20} (M+H)^{+}, \Delta - 2,4 ppm]. Cuando se compara con la pseudomicina A, la fórmula molecular de la pseudomicina A' mostró un grupo CH_{2} adicional. Esta observación sugiere que en la pseudomicina A' la serina N-terminal puede estar acilada con ácido 3,4- dihidroxipentadecanoico en vez de ácido 3,4-dihidroxitetradecanoico como en la pseudomicina A. Este argumento está respaldado por el hecho de que en todas las pseudomicinas previamente caracterizadas, el núcleo tiene un anillo nonadepsipéptido distintivo e idéntico y la única diferencia entre ellos surge de la naturaleza de la cadena lateral hidrófoba.

Por consiguiente, los datos del espectro RNM de la pseudomicina A' son virtualmente idénticos a todas las pseudomicinas conocidas, tales como las pseudomicinas A, B, C y C'. Un análisis exhaustivo de los espectros de RMN de ^{1}H, ^{13}C y 2D, incluyendo TOCSY y HMQC de pseudomicina A' establecieron una funcionalidad de 3,4 diol en la cadena lateral hidrófoba de la pseudomicina A' y permitió asignar a todos los protones y a los carbonos que llevan protones en la molécula (Tabla 1). La estructura determinada para la pseudomicina A' basada en los datos de estos datos de espectrometría de masas y RNM se muestra a continuación.

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Estructura de la pseudomicina A' derivada de los datos de espectros de masas y RNM

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TABLA 1 Datos de RNM de ^{1}H y ^{13}C de Pseudomicina A' en H_{2}O+CD_{3}CN

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Determinación de la Estructura de Pseudomicina B'

La determinación de la estructura de pseudomicina B' se realizó una vez más a través de la interpretación de datos de espectros de masas y RMN. La fórmula molecular C_{49}H_{83}ClN_{12}O_{19} [m/z 1179,5685 para C_{49}H_{84}ClN_{12}O_{19} (M+H)^{+}, \Delta - 1,8 ppm] se estableció por medio de los datos de EMAR. Esta fórmula mostró dos CH_{2} menos que la observada para la pseudomicina B. El análisis detallado de los espectros de RMN de ^{1}H, ^{13}C y 2D, incluyendo TOCSY y HMQC y la comparación de los datos de los espectros con los de pseudomicinas conocidas reveló nuevamente la composición de aminoácidos idéntica. Además los datos de RMN indicaron la presencia de ácido 3-hidroxidodecanoico (Tabla 2). Por consiguiente, a partir de los datos de los espectros, se deriva la estructura de la pseudomicina B' como se muestra a continuación.

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Estructura de la pseudomicina B' derivada de los datos de espectros de masas y RNM

TABLA 2 Datos de RNM de ^{1}H y ^{13}C de Pseudomicina B' en H_{2}O+CD_{3}CN

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Conclusiones

Las pseudomicinas A' y B' representan nuevos miembros de una clase única de nonadepsipéptidos. Aunque estas moléculas están relacionadas muy estrechamente con las pseudomicinas conocidas y difieren sólo en la naturaleza de la cadena lateral hidrófoba, podrían desempeñar una función clave en la elucidación de la relación entre estructura y actividad entre esta clase de compuestos como antifúngicos.

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Ejemplo 4 Aislamiento, Caracterización y Mutagénesis de Pseudomonas syringae

Los aislamientos ambientales y mutantes de P. syringae se produjeron y emplearon en la producción de agentes antifúngicos.

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Materiales y Procedimientos

Se aislaron y caracterizaron las cepas MSU 174 y MSU 16-H como se describe en la Patente de EEUU Nº 5.576.298 expedida el 19 de noviembre de 1996 a G. Strobel y col.: Harrison y col., "Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity". J. Gen. Microbiology 137, 2857-2865 (1991); y Lamb y col., "Transposon mutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonas: Antimycotic production is necessary for control of Dutch elm disease". Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 84, 6447-6451 (1987).

A partir de tales mutantes generados por transposones y de tipo salvaje se derivaron otras cepas por medio de mutagénesis química. Las cepas sometidas a mutagénesis incluyen MSU 174, MSU 16H, y 25-B1. Se cultivó la cepa a someter a mutagénesis en medio CSM, a continuación se dividió en el medio que incluía 0, 1, 2, 4, 16, o 32 \mug/ml del mutágeno químico 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina (NTG o MNNG). A continuación se congelaron estas células para selección en el futuro.

Las células mutagenizadas se seleccionaron para condiciones de cultivo deseables y/o producción de una o más Pseudomicinas, tales como pseudomicinas A' y/o B'. Las células de P. syringae producidas por mutagénesis químicas, tales como la cepa 35-B1 mutagenizada, se descongelaron y diluyeron hasta 6 células/ml en medio N21SM (Tabla 5). Este medio algunas veces contenía uno o más componentes para la selección, tal como concentraciones variables de fosfato. Se colocó un volumen de 50 \mul de células mutagenizadas en un pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos de base redonda para una administración de un promedio de 0,3 células/pocillo. Típicamente, se añadió aceite de silicona a cada pocillo para minimizar la evaporación. Se incubaron las placas con agitación durante 6 a 12 días a 25ºC.

TABLA 5 La Composición del medio N21SM

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Tras esta incubación, se realizaron diluciones en serie de una alícuota, típicamente 5 TL (por ejemplo 1:56, 1:196, 1:320, 1:686, y/o 1:1715) y se evaluó la actividad contra Candida albicans en un bioensayo líquido en placas de microvaloración. Las placas se incubaron a 37ºC durante la noche y se asignó una puntuación a los pocillos para la inhibición del crecimiento de C. albicans. Se tomaron cepas adecuadas, se inocularon en el medio CSM (Tabla 6), y se cultivaron durante 1 a 3 días a 25ºC.

TABLA 6 Medio completo de Streptomyces (CSM)

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Se conservaron las cepas seleccionadas y se inocularon en botellas de fermentación que contenían 13 ml de medio N21SM y se cultivaron durante aproximadamente 88 horas a 25ºC. Se retiró una alícuota de esta fermentación, se extrajo durante 1 hora con un volumen de acetonitrilo igual al volumen de la alícuota, se centrifugó y decantó para el análisis por HPLC de una o más Pseudomicinas, tales como pseudomicina A' o B', como se describió en los Ejemplos 1-3. Las cepas que producían una o más Pseudomicinas, tales como pseudomicina A' o B', se reaislaron, se volvieron a fermentar y se prepararon para cultivo a gran escala.

Resultados

Las cepas que exhibían producción de una o más Pseudomicinas, tales como pseudomicina A' o B', se produjeron usando los procedimientos descritos anteriormente.

Conclusiones

Los procedimientos y criterios de selección descritos en este documento son eficaces para producir cepas de P. syringae que crecen en medio mínimo y producen una o más Pseudomicinas, tales como pseudomicina A' o B'.

Ejemplo 5 Cultivo de P. syringae y Producción de Pseudomicinas

La fermentación de P. syringae en medio N21, que no incluye ninguno de los productos de patata usados en los medios publicados para el cultivo de P. syringae, produjo pseudomicinas en niveles adecuados para el aislamiento.

Producción de Pseudomicinas en Matraces Agitados y Medio N21 Materiales y Procedimientos

Se cultivó P. syringae en 50 ml de medio de cultivo N21 (Tabla 7) en un matraz de 250 ml. El cultivo se inició con una alícuota de un inóculo de P. syringae MSU 16H y se mantuvo a 25ºC y 70% de humedad durante 7 días con agitación a 250 rpm en un incubador. Al final del período de incubación se retiraron 4 ml de caldo del matraz y se mezclaron con 6 ml de metanol que contenían ácido fosfórico al 0,1%. Se cree que el pH bajo estabiliza las pseudomicinas. El material particulado se elimina por filtración o centrifugación y las pseudomicinas se determinan por medio de HPLC como se describe en este documento.

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TABLA 7 La Composición del Medio N21

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Se evaluó la producción de pseudomicina por medio de varias cepas de P. syringae usando medio N21 con y sin miristato de metilo añadido. Las cepas de P. syringae evaluadas incluyeron MSU 16H, 25-B1, 67H1 y 7H9-1.

Resultados

Las diversas cepas de P. syringae cultivadas con y sin miristato de metilo produjeron niveles significativos de una o más Pseudomicinas, por ejemplo más de 10 Tg/mL de una o más de pseudomicina A, pseudomicina B, y/o pseudomicina C. El miristato de metilo estimuló la producción pseudomicina production de ciertas cepas.

Conclusiones

Diversas cepas de P. syringae producen niveles comercialmente significativos de pseudomicinas en medios carentes de productos de la patata, y esta producción puede estimularse por el miristato de metilo.

Producción de Pseudomicinas a una Escala de 5.000 l Usando Medio N21

El procedimiento para producir pseudomicinas usando un medio sin productos de patata añadidos se aumentó hasta un nivel de 5,000 litros.

Materiales y Procedimientos

Se inocularon matraces de etapa vegetativa que contenían medio completo de Streptomyces (CSM, Tabla 5) con un cultivo congelado de P. syringae, típicamente la cepa 67H1 y se agitaron a 250 rpm y 25ºC durante 24 horas. Tras 24 horas de incubación de los matraces de etapa vegetativa, se usó el contenido de estos matraces para inocular matraces de etapa de gemación. Los matraces de etapa de gemación incluían el medio CSM y se hicieron rotar a 250 rpm y mantuvieron a 25ºC. Los matraces de etapa de gemación se inocularon con aproximadamente 0,45 ml de cultivo combinado de tres o cuatro matraces de etapa vegetativa. Los matraces de etapa de gemación incluían típicamente aproximadamente 900 ml de CSM en un matraz Tunair^{TM} de 2,5 l sin tabiques. Se colocaron dos cultivos en etapa de choque en frascos Tunair^{TM} para cada fermentador. Los matraces de etapa de gemación se incubaron durante 16 horas.

A continuación, se combinaron dos de los cultivos en etapa de choque en una bazuca de inoculación. Estos cultivos combinados se usaron para inocular un tanque que contenía el medio descrito en la Tabla 15 que se había suplementado con otros 3 g/l (para un total de 4 g/l) de glicina, 1 g/l de aceite de soya y 1 g/l de extracto de levadura. Estos cultivos a gran escala se cultivaron a 25ºC durante tres o cuatro días. Durante este período de cultivo, se controló el oxígeno disuelto en 30% de saturación de aire con agitación y flujo de aire, el pH se controló en 5,2 \pm 0,2 por medio de la adición de ácido sulfúrico o hidróxido de sodio según necesidad. Dieciocho horas tras el inicio del cultivo a gran escala, se comenzó la alimentación de glucosa a una velocidad de 200 ml/h. Veinte horas tras el inicio del cultivo a gran escala, se comenzó la alimentación de hidróxido de amonio a una velocidad de 20 ml/h. Durante este cultivo, la presión de contención fue de 0,34 atm (5 psig). La configuración inicial para agitación fue de 150 rpm y el flujo de aire de 14,16 l/min (0,5 scfm). Si resulta necesario, también se añade un agente antiespuma. También se probaron ciertas variaciones de estas condiciones. Tras los tres o cuatro días de cultivo a gran escala, se recogió la P. syringae. La actividad antifúngica se midió como se describe en el Ejemplo 6.

Resultados y Conclusiones

Se produjeron pseudomicinas en cantidades comercialmente significativas a una escala de 5.000 l usando un medio carente de productos de la patata.

Ejemplo 6 Determinación y Purificación de Pseudomicinas Detección y Cuantificación de Pseudomicinas por Actividad Antifúngica

La presencia o cantidad de una pseudomicina o mezcla de pseudomicinas puede determinarse midiendo la actividad antifúngica de una preparación. Se determinó la actividad antifúngica in vitro al obtener la concentración inhibitoria mínima (CIM) de la preparación usando una prueba de dilución de agar convencional o una prueba de difusión con discos. Una preparación de una o más pseudomicinas puede ser un extracto de un cultivo celular, o una mezcla más purificada. Un hongo típico usado para probar la actividad antifúngica es C. albicans. Se consideró significativa la actividad antifúngica cuando la preparación de prueba causó zonas de inhibición de 10-12 mm de diámetro en placas de agar sembradas con Candida albicans (x657).

Los estudios antifúngicos se realizaron usando un ensayo de microvaloración por dilución de caldo según las pautas del National Committee for Clinical Laboratory Standards en placas de microvaloración de 96 pocillos. Se ajustaron los caldos de dextrosa y Sabouraud para contener 2,5 X 10^{4} conidios/ml. Se disolvió el compuesto de prueba en agua y se probó en diluciones al medio comenzando con la concentración más alta de 20 \mug/ml. Las placas se incubaron a 35ºC durante 48 horas. Los resultados en las Tablas 3 y 4 muestran la concentración inhibitoria mínima (CIM) del compuesto que inhibió completamente el crecimiento comprado con los controles de crecimiento sin tratamiento.

TABLA 3 Actividad antifúngica de Pseudomicina A'

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TABLA 4 Actividad antifúngica de Pseudomicina B'

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Detección y Cuantificación de Pseudomicinas por HPLC

Se aclaró una muestra que supuestamente contenía una o más pseudomicinas por filtración o centrifugación. La mezcla aclarada se sometió a cromatografía en una columna Zorbax RxC8 (partículas 3,5 T, 25 x 0,46 cm) con un caudal de 1 ml/min. Se eluyó la columna con gradiente lineal acetonitrilo al 20-55% con TFA al 0,2% durante 15 minutos y se mantuvo con acetonitrilo al 55% con TFA al 0,2% durante 5 minutos. Típicamente, la pseudomicina A' eluyó en aproximadamente 13,7 minutos (822 segundos) y la pseudomicina B' eluyó en aproximadamente 12,4 minutos (822 segundos). Se detectaron las pseudomicinas por medio de absorbancia a 215 nm y se cuantificó mediante la integración de los picos de UV. Para la identificación y cuantificación se usaron patrones de cada una de las pseudomicinas.

Ejemplo 7 Formulaciones que Incluyen Pseudomicina A' y/o B'

Los siguientes ejemplos de formulación son sólo ilustrativos y no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la invención. El término "ingrediente activo" significa pseudomicina A' y/o B' o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.

Formulación 1

Las cápsulas duras de gelatina se prepararon usando los siguientes ingredientes:

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Formulación 2

Se preparó un comprimido usando los siguientes ingredientes. Los componentes se mezclan y comprimen para formar comprimidos con un peso 665 mg cada uno.

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Formulación 3

Se preparó una solución de aerosol que contenía los siguientes componentes. El componente activo se mezcla con etanol y se añade la mezcla a una porción del propulsor 22, enfriado hasta - 30ºC y se transfiere a un dispositivo de llenado. A continuación se carga la cantidad necesaria en un recipiente de acero inoxidable y se diluye con el resto del propulsor. Posteriormente se montan las válvulas al recipiente.

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Formulación 4

Los comprimidos, con 60 mg de ingrediente activo cada uno, se producen de la siguiente manera:

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El ingrediente activo, el almidón y la celulosa se hacen pasar a través de un tamiz U.S. de malla Nº 45 y se mezcla exhaustivamente. La solución acuosa que contiene polivinilpirrolidona se mezcla con el polvo resultante y se hace pasar la mezcla a través de un tamiz U.S. de malla Nº 14. Los gránulos producidos de esta manera se secan a 50ºC y se hacen pasar a través de un tamiz U.S. de malla Nº 18. El carboximetil almidón sódico, el estearato de magnesio y el talco, previamente pasados a través de un tamiz U.S. de malla Nº 60, se añaden a continuación a los gránulos que, tras mezclar, se comprimen en una máquina de comprimidos para dar comprimidos con un peso de 150 mg cada una.

Permutación 5

Las cápsulas, con 80 mg de ingrediente activo cada una, se producen de la siguiente manera:

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El ingrediente activo, la celulosa, el almidón y el estearato de magnesio se mezclan, se pasan a través de un tamiz U.S. de malla Nº 45 y se cargan dentro de cápsulas duras de gelatina en cantidades de 200 mg.

Formulación 6

Los supositorios, con 225 mg de ingrediente activo, cada uno se producen de la siguiente manera:

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El ingrediente activo se hace pasar a través de un tamiz U.S. de malla Nº 60 y se suspende en los glicéridos de ácidos grasos saturados previamente fundidos usando la cantidad mínima de calor necesaria. A continuación se vierte la mezcla en un molde de supositorio de capacidad nominal 2 g y se deja enfriar.

Formulación 7

Las suspensiones, cada una con 50 mg de ingrediente activo por 5 ml de dosis, se producen de la siguiente manera:

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El ingrediente activo se hace pasar a través de un tamiz U.S. de malla Nº 45 y se mezcla con la carboximetilcelulosa sódica y el jarabe para formar una pasta suave. La solución de ácido benzoico, el aroma y el color se diluyen con una porción del agua y se añaden con agitación. A continuación se añade suficiente agua para producir el volumen necesario.

Formulación 8

Puede prepararse una formulación intravenosa de la siguiente manera. La solución de estos ingredientes se administra generalmente por vía intravenosa a un sujeto a una velocidad de 1 ml por minuto.

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Claims (11)

1. Una pseudomicina A' aislada que tiene la fórmula:

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o una sal, hidrato o éster farmacéuticamente aceptable de la misma.

2. Una pseudomicina B' aislada que tiene la fórmula:

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o una sal, hidrato o éster farmacéuticamente aceptable de la misma.

3. El uso de un compuesto de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 ó 2 en la fabricación de una composición farmacéutica para inhibir la actividad fúngica o para reducir los síntomas de una infección fúngica en un paciente.

4. El uso según la Reivindicación 3, en el que el hongo comprende Candida parapsilosis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans o Histoplasma capsulatum.

5. Una composición farmacéutica en la que el agente activo es un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o una mezcla de los mismos, dicha composición comprende además un diluyente vehículo, un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

6. El uso de pseudomicina A' aislada o hidratos, disolventes o ésteres de la misma y/o pseudomicina B' o hidratos, disolventes o ésteres de la misma en el tratamiento directo o preventivo de la actividad fúngica en plantas.

7. El uso según la reivindicación 6 en el que el hongo tratado se selecciona de Verticillium albo-atrum, Rhizoctonia solani y Fusarium oxysporum.

8. El uso según la reivindicación 6 ó 7 en el que el tratamiento es por inyección o pulverización de una suspensión acuosa de dicha pseudomicina A' o hidratos, disolventes o ésteres de la misma o pseudomicina B' o hidratos, disolventes o ésteres de la misma en o sobre una planta.

9. El uso según la reivindicación 6 ó 7 en el que el tratamiento comprende aplicar una formulación seca a una planta por medio de pulverización o agitación.

10. Una suspensión acuosa para el tratamiento directo o preventivo de la actividad fúngica en plantas, en la que el agente activo es pseudomicina A' aislada o hidratos, disolventes o ésteres de la misma, y/o pseudomicina B' o hidratos, disolventes o ésteres de la misma o sus mezclas.

11. Una composición seca para el tratamiento directo o preventivo de la actividad fúngica en plantas, en la que el agente activo es pseudomicina A' aislada o hidratos, disolventes o ésteres de la misma, y/o pseudomicina B' o hidratos, disolventes y ésteres de la misma o sus mezclas.