JP2002542257A - シュードマイシン天然産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、シュードマイシンＡ'およびＢ'を含むシュードマイシン天然産物、該シュードマイシンの製造方法およびこれらのシュードマイシンの抗真菌活性を用いる方法に関する。ＮＭＲおよび質量分析はシュードマイシンＡ'に対して式(Ｉ)を示した。ＮＭＲおよび質量分析はシュードマイシンＢ'に対して式(ＩＩ)を示した。 【化１５】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の属する分野 本発明は、シュードマイシンＡ'およびＢ'を含むシュードマイシン天然産物、
このようなシュードマイシンの製造方法およびこれらのシュードマイシンの抗真
菌活性を用いる方法に関する。

【０００２】 背景 真菌感染は、ヒト、特に免疫易感染性患者における疾患、生活の質の崩壊およ
び死亡の重大な原因である。ヒトにおける真菌感染の発生率は、過去２０年間に
大きく増大してきた。このことは部分的に、器官移植、癌化学療法、ＡＩＤＳ、
年齢および他の同様の障害または症状によって免疫系が弱められているか、ある
いは破壊されているヒトの数の増加によるものである。このような患者は、人々
に流行しているが、機能的免疫系によるチェックにおいては排除されている真菌
病原によって攻撃を受けやすい。いくつかの既存の抗真菌剤は高度に毒性である
か、あるいは真菌活性を阻害するだけであるので、これらの病原は制御が困難で
ある。例えば、ポリエンは殺菌性であるが、毒性であり；一方、アゾールはずっ
と毒性が低いが、静真菌性のみである。より重大なことに、このような株に対す
る治療の選択を大きく制限する Candida のアゾールおよびポリエン耐性株が最
近報告された。

【０００３】 Pseudomonas syringae はいくつかのクラスの抗真菌または抗生物質、例えば
リポデプシノナペプチドである、シュードマイシン、シリンゴマイシン、シリン
ゴトキシンおよびシリンゴスタチンなどを生産する。P. syringae の天然株およ
びトランスポゾンによって製造された突然変異体はこれらのリポデプシノナペプ
チドを生産する。いくつかのシュードマイシン、シリンゴマイシンおよび他のリ
ポデプシペプチド抗真菌剤が単離され、化学的に特徴付けされ、ヒトおよび植物
の両方における重要な真菌病原に対する活性を含む広い範囲の抗真菌活性を有す
ることが示された。例えばシュードマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＣ'はそれぞれ単
離精製され、その構造はアミノ酸配列決定、ＮＭＲおよび質量分析によって特徴
付けされている。例えば Ballio et al., "Novel bioactive lipodepsipeptides
from Pseudomonas syringae: the pseudomycins." FEBS Lett. 355. 96-100 (1
994) および米国特許第５，５７６，２９８号を参照のこと。シュードマイシン
、シリンゴマイシン、シリンゴトキシンおよびシリンゴスタチンは構造的に明確
な抗真菌化合物のファミリーを示す。

【０００４】 シュードマイシン、シリンゴマイシン、シリンゴトキシンまたはシリンゴスタ
チンはいずれも抗真菌治療に関する市場に持ちこまれていない。望ましくない副
作用、製剤の作成、生産の拡大および他の開発問題の発見は、動物、ヒトおよび
植物に影響する全範囲の真菌感染に対するシュードマイシン、シリンゴマイシン
、シリンゴトキシンまたはシリンゴスタチンの活用を大きく妨げてきた。既存の
抗真菌剤によって治療できない感染に対して用いることができる抗真菌剤および
動物、ヒトまたは植物における感染に対する適用が依然必要とされている。

【０００５】 発明の要旨 本発明は P. syringae によって生産されるシュードマイシン天然産物を提供
する。このシュードマイシン天然産物には、ClThrのカルボキシル基とセリンの
ヒドロキシル基が閉環し、ラクトン結合を有する、配列 Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-a
Thr-Dhb-HOAsp-ClThr、より具体的には、L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aTh
r-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl) を有するデプシノナペプチド環を含む。シュ
ードマイシンＡ'（ＩＡ）は３，４−ジヒドロキシペンタデカン酸部分を含み、
そのカルボキシル基はＮ末端セリンのアミン基とアミド結合を形成する。

【化１１】

【０００６】 シュードマイシンＢ'（ＩＢ）は３−ヒドロキシドデカン酸部分を含み、その
カルボキシル基はＮ末端セリンのアミン基とアミド結合を形成する。

【化１２】

【０００７】 本発明はまた、それを必要としている患者において、真菌活性を阻害するか、
あるいは真菌感染の症状を軽減するために、シュードマイシン天然産物、例えば
シュードマイシンＡ'、シュードマイシンＢ'またはその混合物を用いる方法に関
する。このような方法は真菌を殺し、真菌感染の苦しみを減少させ、熱を下げ、
ならびに／あるいは患者の全体的幸福を増大させることができる。本発明の方法
は真菌、例えば Candida parapsilosis、Candida albicans、Cryptococcus neof
ormans ならびに／あるいは Histoplasma capsulatum に対して有効である。

【０００８】 詳細な説明 シュードマイシン 本明細書中で用いるシュードマイシンまたはシュードマイシン天然産物は、細
菌 Pseudomonas syringae から単離された抗真菌剤のファミリーの１またはそれ
以上のメンバーを意味する。シュードマイシンはリポデプシペプチド、１個また
はそれ以上の異常アミノ酸を含み、１個またはそれ以上の追加の疎水性または脂
肪酸側鎖を有する環式ペプチドである。詳細には、シュードマイシンは、ラクト
ン結合によって閉環された環式ペプチド部分を有するリポデプシノナペプチドで
あり、これは異常アミノ酸４−クロロスレオニン、３−ヒドロキシアスパラギン
酸、デヒドロ−２−アミノ酪酸および２，４−ジアミノ酪酸を含む。これらの異
常アミノ酸はこのシュードマイシンの生物学的特徴、例えば血清中の安定性およ
びその殺生作用に関与する。

【０００９】 各シュードマイシンは同じ環式ペプチド核を有するが、これらはこの核に結合
した疎水性側鎖において異なっている。各シュードマイシンは、ClThr のカルボ
キシル基とセリンのヒドロキシル基が閉環し、ラクトン結合を有する、配列 Ser
-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr（すなわちセリン：２，４−ジアミノ
酪酸；アスパラギン酸；リジン；２，４−ジアミノ酪酸；アロスレオニン；デヒ
ドロ−２−アミノ酪酸；３−ヒドロキシアスパラギン酸；４−クロロスレオニン
）を有する環式ノナペプチド環を有する。親油性部分はＮ末端セリンのアミン基
と結合している。セリンのアミン基は、シュードマイシンＡの３，４−ジヒドロ
キシテトラデカノイル部分、シュードマイシンＢの３−モノヒドロキシテトラデ
カノイル部分、シュードマイシンＣの３，４−ジヒドロキシヘキサデカノイル部
分およびシュードマイシンＣ'の３−モノヒドロキシヘキサデカノイル部分のカ
ルボキシルとアミド結合を形成する。セリンのカルボキシル基はこの環のＤａｂ
とアミド結合を形成する。

【００１０】 シュードマイシンＡ'およびＢ' 本明細書中で用いる用語、シュードマイシンＡ'およびシュードマイシンＢ'は
、細菌 Pseudomonas syringae から単離された抗真菌性物質を意味する。シュー
ドマイシンＡ'およびＢ'は、ClThr のカルボキシル基とセリンのヒドロキシルが
閉環し、ラクトン結合を有する、配列 Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-Cl
Thr を有する特徴的デプシノナペプチド環を有するシュードマイシンである。シ
ュードマイシンＡ'は３，４−ジヒドロキシペンタデカン酸部分を含み、そのカ
ルボキシル基はＮ末端セリンのアミン基とアミド結合を形成する。シュードマイ
シンＢ'は３−ヒドロキシドデカン酸部分を含み、そのカルボキシル基はＮ末端
セリンのアミン基とアミド結合を形成する。

【００１１】 シュードマイシンの生物学的活性 シュードマイシンは、種々の真菌、例えば植物および動物の真菌性病原を殺す
ことを含むいくつかの生物学的活性を有する。特にシュードマイシンは、免疫易
感染性の個人における日和見感染を引き起こす真菌に対する活性な抗真菌剤であ
る。これらの真菌には、C. parapsilosis、C. albicans、C. glabrata、C. trop
icalis および C. krusei を含む種々の種類の Candida が含まれる。これらは
また、他の属、例えば Cryptococcus neoformans、Aspergillus fumigatus およ
び Histoplasma capsulatum を含む。真菌、特に真菌性病原の生育阻害よりむし
ろ殺生は、抗真菌剤、例えばシュードマイシンＡ'および／またはＢ'の所望かつ
好ましい生物学的活性である。

【００１２】 シュードマイシンは、Rynchosporium secalis、Ceratocystis ulmi、Rizocton
ic solani、Sclerotinia sclerotiorum、Verticillium albo-atrum、Verticilli
um dahliae、Thielaviopis basicola、Fusarium oxysporum および Fusarium cu
lmorum を含む広い範囲の植物病原性真菌に対する毒性を示した（Harrison, L.,
et al., "Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syri
ngae possessing broad-spectrum antifungal activity," J. of General Micro
biology, 7, 2857-2865 (1991)）。さらに、P. syringae MSU 16H は、Dutch ニ
レ疾患の原因物質である Ceratocystic ulmi に感染したニレにおいて野生型よ
り大きな保護を与えることが示されている。（例えば Lam et al, Proc. Natl.
Sci. USA, 84, 6447-6451 (1987) を参照のこと）。

【００１３】 Pseudomonas syringae Pseudomonas syringae は、一般に植物関連の広い範囲の細菌を含む。P. syri
ngae のいくつかは植物病原であるが、他のものは弱病原性のみであるか、ある
いは雑菌である。P. syringae の多くの種々の単離体は、真菌および他の細菌と
競合しなければならない野生においてこの細菌の生存を援助する１個またはそれ
以上の細胞毒性物質を生産する。P. syringae によって生産される細胞毒性物質
には、抗真菌性物質、例えばシュードマイシン、シリンゴマイシン、シリンゴト
キシンおよびシリンゴスタチンが含まれる。

【００１４】 １個またはそれ以上のシュードマイシンを生産する P. syringae の株は当分
野に記載されている。例えば、野生型株ＭＳＵ １７４（モンタナ大麦畑から単
離）およびＴＮ９０５を用いるトランスポゾン突然変異誘発によって調製された
この株の突然変異体（ＭＳＵ １６Ｈ）は、１９９６年１１月１９日発行の米国
特許第５，５７６，２９８号から G. Strobel et al.; Harrison et al., J. "P
seudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae posses
sing broad-spectrum antifungal activity, " Gen. Microbiology 137, 2857-2
865(1991); および Lamb et al., "Transposon mutagenesis and tagging of fl
uorescent pseudomonas; Antimycotic production is necessary for control o
f Dutch elm disease," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6447-6451 (1987) に
記載されている。P. syringae の種々の株を培養する方法および抗真菌性物質、
例えばシュードマイシンの生産におけるその使用はまた、本出願と同日に提出さ
れた Matthew D. Hilton et al, 米国特許第 号、標題 "Pseu
domycin Production By Pseudomonas Syringae" に開示され、以下に記載されて
いる。ＭＳＵ １７４およびＭＳＵ １６Ｈの培養は Montana State University
(Bozeman, Montana, USA) に寄託され、American Type Culture Collection (Pe
rklawn Drive, Rockville, MD, USA) から入手可能である。本段落中のこの引用
文献の開示内容は引用により本明細書中に包含される。

【００１５】 本発明は、少なくとも１０μｇ／ｍＬ量のシュードマイシンＡ'および／また
はＢ'を生産する P. syringae の株、単離体および生物学的に精製された培養を
含む。好ましくは、生物学的に精製された微生物の培養は、シュードマイシンＡ
'および／またはＢ'を生産する Pseudomonas syringae 株ＭＳＵ １６Ｈ、２５
−Ｂ１、６７Ｈ１または７Ｈ９−１または突然変異体、変異体、単離体またはこ
れらの株の組換え体である。培養ＭＳＵ １７４およびＭＳＵ １６Ｈを、本明細
書中、上に引用される文献中に記載されているように得た。

【００１６】 シュードマイシンＡ'および／またはＢ'の生産に適当な P. syringae の株は
、植物、例えば大麦植物、カンキツ属植物、およびハシドイ属植物を含む周囲の
供給源から、ならびに土壌、水、空気およびちりのような供給源から単離可能で
ある。好ましい株は植物から単離されたものである。周囲の供給源から単離され
た P. syringae は野生型と称することができる。本明細書中で用いる「野生型
」とは、P. syringae の正常な集団（すなわち、天然に発見されたものであり、
実験室の操作によって生産されたものではない P. syringae の株または単離体
）中に天然に存在する優性な遺伝型を意味する。他の生物を用いる場合と同じで
、本発明において用いられる、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'を生産す
る培養、P. syringae 株、例えばＭＳＵ １７４、ＭＳＵ １６Ｈ、ＭＳＵ ２０
６、２５−Ｂ１、７Ｈ９−１および６７Ｈ１の特徴は変化を受ける。したがって
、これらの株の子孫、例えば組換え体、突然変異体および変異体は当業者に周知
の方法によって得ることができる。

【００１７】 P. syringae の突然変異株はまた、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'の
生産に適当である。本明細書中で用いる突然変異体は、株の表現型の突然の遺伝
性変化を意味し、これは自然発生的であるか、あるいは、放射線および種々の化
学物質を含む既知の突然変異を起こさせる物質によって誘導されたものであり得
る。本発明の突然変異体 P. syringae は、放射線、例えば紫外線、ｘ線；化学
変異誘発物質、部位特異的突然変異誘発およびトランスポゾンが媒介する突然変
異誘発を含む種々の突然変異を起こさせる物質を用いて作成できる。化学変異誘
発物質の例はメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、ジエポキシオクタン、Ｎ−メ
チル−Ｎ−ニトロ−Ｎ'−ニトロソグアニン（ＮＴＧ）および亜硝酸である。

【００１８】 本発明の、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'を生産する P. syringae
突然変異体は、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'を過剰発現するか、他の
シュードマイシンを超えて過剰のシュードマイシンＡ'および／またはＢ'を生産
するか、あるいは有利な生育条件下でシュードマイシンＡ'および／またはＢ'を
生産する突然変異体を作成するのに有効な一定量の突然変異を起こさせる物質で
細菌を処理することによって製造できる。用いるべき突然変異を起こさせる物質
のタイプおよび量は変化し得るが、好ましい方法はＮＴＧを１〜１００μｇ／ｍ
Ｌの範囲のレベルに連続希釈することである。本発明の好ましい突然変異体はシ
ュードマイシンＡ'および／またはＢ'を過剰発現し、最小規定培地で生育するも
のである。この突然変異体は、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'を、好ま
しくは少なくとも約１０μｇ／ｍＬまで過剰発現する。

【００１９】 P. syringae の環境単離体、突然変異株および他の望ましい株を、生育性質、
培養培地、栄養源、炭素源、培養条件およびアミノ酸要求性の所望の特徴に関す
る選択に付することができる。好ましくは、シュードマイシンＡ'および／また
はＢ'を生産する P. syringae の株を最小規定培地、例えばＮ２１培地での生育
、および／または約１０μｇ／ｍＬより高いレベルのシュードマイシンＡ'およ
び／またはＢ'の生産に関して選択する。好ましい株は、グリシンおよび、場合
により、脂質、ポテト産物またはそれらの組み合わせを含む培地で培養した場合
、特徴的なシュードマイシンＡ'および／またはＢ'生産を示す。

【００２０】 当業者に周知の確立された実験手法を用いて P. syringae 株を形質転換する
ことによって組換え株を開発できる。組換え技術の使用を通して、P. syringae
株を形質転換し、これらの株が生産する抗生物質に加えて種々の遺伝子産物を発
現させることができる。例えば、この株が通常は感受性である抗生物質に対する
耐性を付与する組換えベクターで株を形質転換することができる。このように得
られた形質転換体はシュードマイシン、例えばシュードマイシンＡ'および／ま
たはＢ'だけでなく、野生型細胞からの形質転換体の選択を可能にする耐性付与
酵素を生産するであろう。さらに、同様の技術を用いて、現在の株を修飾して、
複数コピーの内因性シュードマイシン生合成遺伝子を導入し、より多量のシュー
ドマイシン、例えばシュードマイシンＡ'および／またはＢ'収量を達成すること
ができる。特徴的なシュードマイシン、例えばシュードマイシンＡ'および／ま
たはＢ'の過剰発現を達成する P. syringae 株２５−Ｂ１、６７Ｈ１および７Ｈ
９−１の子孫、すなわち、天然および誘導化変異体、突然変異体および組換え体
は本発明の一部である。

【００２１】 Pseudomonas syringae の培養 本明細書中で記載される水性栄養培地とは、本発明において用いられる細菌の
生育に必要な無機および有機化合物およびその塩を含む水ベースの組成物を意味
する。好ましい栄養培地は、有効量の３個あるいはより少ないアミノ酸、好まし
くはグルタミン酸、グリシン、ヒスチジンまたはそれらの組み合わせを含む。１
つの態様では、培地は有効量のグリシンおよび、場合により、１個またはそれ以
上のポテト産物および脂質を含む。グリシンは単一のアミノ酸としてか、あるい
は加水分解されたタンパク質のようなアミノ酸の混合物の部分として提供できる
。適当な脂質には、ダイズ油または脂肪酸が含まれる。適当なポテト産物にはポ
テトデキストロースブロス、ポテトデキストリン、ポテトタンパク質および市販
のマッシュポテト混合食品が含まれる。栄養培地中の好ましい無機物には、一般
に細胞培養および発酵において用いられる塩の混合物、例えば Czapek 無機塩類
溶液（例えばＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４およびＦｅＳＯ_４）が含まれる。栄養培地中の
有機化合物には、好ましくは、グルコースが含まれ、場合により、可溶性デンプ
ンを含ませることができ、他の同様の有機化合物を含ませることもできる。培地
のｐＨは好ましくは約４〜６．５の範囲であり、より好ましくは約４．５〜約５
．７の範囲、最も好ましくは約５．２である。

【００２２】 栄養ブロス中の各成分の量は典型的には、細菌の生育またはシュードマイシン
Ａ'および／またはＢ'の生産には重要ではないが、一定レベルの栄養素が有利で
ある。グリシンの好ましい量は約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌであり、より好ま
しくは約０．３ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、最も好ましくは約１ｇ／Ｌである。脂質の
好ましい量は約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの油状生成物、例えばダイズ油であり、
より好ましくは約０．５ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌのダイズ油である。脂肪酸または脂
肪酸エステルの好ましい量は約０．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌである。ポテト産物の
好ましい量は、約１２ｇ／Ｌ〜約３６ｇ／Ｌ、好ましくは約２４ｇ／Ｌのポテト
デキストロースブロス；約５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約３０ｇ／Ｌの
市販のマッシュポテトミックス；約１ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、好ましくは約２０
ｇ／Ｌのポテトデキストリン；または約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、好ましくは約
４ｇ／Ｌのポテトタンパク質を含む。好ましい栄養培地には、無機物、好ましく
は約０．０２〜約２ｇ／Ｌ、より好ましくは約０．２ｇ／ＬのＫＣｌ；約０．０
２〜約２ｇ／Ｌ、より好ましくは約０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４、好ましくはＭｇ
ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；および約０．４〜約４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは約４ｍｇ
／ＬのＦｅＳＯ_４、好ましくはＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏを含む。存在するならば、
可溶性デンプンは約０．５〜約５０ｇ／Ｌ、より好ましくは約５ｇ／Ｌである。
グルコースは好ましくは約２〜約８０ｇ／Ｌ、より好ましくは約２０ｇ／Ｌで存
在する。

【００２３】 P. syringae を制御または調節されたｐＨおよび温度条件下、記載の培地中で
典型的に培養する。約１５℃〜約３５℃の範囲、好ましくは約２０℃〜約３０℃
、より好ましくは約２２℃〜約２７℃の範囲、最も好ましくは約２５℃の温度で
P. syringae は生育し、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'を生産する。
ｐＨ約４〜約９の範囲、好ましくは約４〜約６の範囲、より好ましくは約４．５
〜約５．５の範囲で P. syringae は生育し、シュードマイシンＡ'および／また
はＢ'を生産する。典型的には、P. syringae の生育は、温度３７℃以上または
１０℃以下、あるいはｐＨ９以上または４以下では生じない。

【００２４】 シュードマイシンＡ'およびＢ'の生産方法 P. syringae の野生型または突然変異株からシュードマイシンＡ'および／ま
たはＢ'を生産するため、この生物を、有効量の３つまたはより少ないアミノ酸
を含む水性栄養培地中で攪拌しながら培養する。この３つまたはより少ないアミ
ノ酸は好ましくはグルタミン酸、グリシン、ヒスチジンまたはそれらの組み合わ
せである。１つの好ましい態様では、このアミノ酸はグリシンおよび、場合によ
り、１個またはそれ以上のポテト産物および脂質を含む。培養は、P. syringae
の生育およびシュードマイシンＡ'および／またはＢ'の生産に有効な条件下で行
う。有効な条件には、約２２℃〜約２７℃の温度、および約３６時間〜約９６時
間の期間が含まれる。本明細書中に記載のような培地で培養した場合、P. syrin
gae は約１０〜１５ｇ／Ｌ乾燥重量までの細胞密度で生育でき、総量が少なくと
も約１０μｇ／ｍＬのシュードマイシンＡ'および／またはＢ'を生産できる。

【００２５】 P. syringae の培養時、培地中の酸素濃度を制御することは、シュードマイシ
ンＡ'および／またはＢ'の生産に有利である。好ましくは酸素レベルを約５％〜
約５０％飽和、好ましくは約３０％飽和で維持する。空気、純粋な酸素、または
酸素を含むガス混合物でスパージし、培地中の酸素濃度を調節できる。さらに、
攪拌速度を調節して、酸素輸送速度を調節できる。

【００２６】 P. syringae の培養時に、培地のｐＨを制御することは、シュードマイシンＡ
'および／またはＢ'の生産に有利である。シュードマイシン、例えばシュードマ
イシンＡ'および／またはＢ'は塩基性ｐＨでは不安定であり、培養培地のｐＨが
約１２時間以上の間、約６より高い場合、重大な分解が生じ得る。好ましくは、
培養培地のｐＨを約６より低く、好ましくは約５．５より低く、好ましくは４．
０より高く維持する。このｐＨを好ましくは約５〜約５．４、より好ましくは約
５．０〜約５．２で維持する。本発明を制限しないが、塩基性ｐＨでのシュード
マイシン分解はラクトン環の開環およびＣｌＴｈｒのＴｈｒへの変換によるもの
であると考えられる。

【００２７】 P. syringae は、バッチ培養法で培養された場合、シュードマイシンＡ'およ
び／またはＢ'を生産できる。しかし、グルコースおよび、場合により、ｐＨを
制御するための酸または塩基、例えば水酸化アンモニウムの流加または半継続フ
ィードはシュードマイシン生産を高める。P. syringae によるシュードマイシン
生産は、グルコースおよび、場合により、ｐＨを制御するための酸または塩基、
例えば水酸化アンモニウムが自動的にフィードされる継続培養法を用いることに
よってさらに高めることができる。

【００２８】 シュードマイシンＡ'および／またはＢ'は、当業者に既知の種々の方法のいず
れかによって検出、測定、単離および／または精製できる。例えば、ブロスまた
は単離または精製組成物中のシュードマイシン活性のレベルは、真菌、例えば C
andida に対する抗真菌作用によって測定できる。シュードマイシンの製造およ
び分析に関する多数の方法が既知である。例えば１個またはそれ以上のシュード
マイシンをクロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣによって単離および精製できる
。

【００２９】 医薬用途 シュードマイシンＡ'またはＢ'の製剤化および抗真菌活性 シュードマイシンＡ'およびＢ'はそれぞれインビトロおよびインビボで活性を
示し、したがって、全身性真菌感染または真菌皮膚感染と闘うのに有用であり得
る。したがって、本発明は、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'または製薬
的に許容されるその塩を真菌と接触させることを含む真菌活性の阻害方法を提供
する。好ましい方法には、C. parapsilosis、C. albicans、Cryptococcus neofo
rmans および Histoplasma capsulatum を含む種々の真菌の生育または活性を阻
害することが含まれる。本明細書中で用いる本発明の化合物を寄生虫または真菌
と接触させることとは、本発明の化合物を寄生虫または真菌と結合または連結、
または明白な接触または相互接触させることを意味する。しかし、接触という用
語はいずれの阻害機構をも含まない。

【００３０】 本発明はさらに、有効量のシュードマイシンＡ'および／またはＢ'、または製
薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルを、その処置を必要としている
宿主に投与することを含む真菌感染の処置方法を提供する。好ましい方法には、
C. parapsilosis, C. albicans, Cryptococcus neoformans および Histoplasma
capsulatum を含む種々の真菌による感染の処置が含まれる。有効かつ適当な量
を投与した場合、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'の処方は真菌感染の苦
しみを減少させ、真菌感染に付随する症状を軽減し、結果として真菌感染を排除
することができる。

【００３１】 抗真菌治療を必要としている幾人かの患者は、高熱のような深刻な感染症状を
有し、集中治療または緊急治療となり得る。種々の真菌は深刻な感染を生じさせ
る。例えば Candida spp. は粘膜および深刻な全身性感染を生じさせることがあ
る。Candida のアゾールおよびポリエン耐性株が頻繁に報告された。Aspergillu
s は生命を脅かす全身性感染を引き起こす。Cryptococcus は髄膜炎の原因であ
る。このような深刻な真菌感染は、免疫易感染性の患者、例えば器官または骨髄
移植を受けたか、癌に対する化学治療を受けたか、大手術から回復したか、ある
いはＨＩＶ感染を患っている患者で生じ得る。このような患者に関しては、抗真
菌治療には、典型的に、数日またはそれ以上にわたる、感染を止めるための、シ
ュードマイシンＡ'および／またはＢ'を含む製剤の静脈内投与が含まれる。

【００３２】 抗真菌活性に関して、用語「有効量」とは、真菌生育または活性を阻害するこ
とができるか、あるいは真菌感染の症状を軽減することができる本発明の化合物
の量を意味する。ほとんどの真菌感染に関して、感染症状の軽減には、熱の低下
、意識の回復、および患者の幸福の増大が含まれる。好ましくは、真菌を殺して
感染を排除するか、あるいは感染を患者によって寛容されるか、あるいは患者の
免疫系によって制御されるレベルにまで持っていくことによって症状を軽減する
。本明細書中で用いる阻害とは、生育または任意の付随する特徴および真菌の存
在から生じる結果の停止、遅延または予防的妨害または防止を含む真菌活性の阻
害を意味する。

【００３３】 投与量は感染の性質および重篤度、宿主の年齢および全体的健康および抗真菌
物質に対する宿主の寛容性のような要因に応じて変化するだろう。典型的には、
真菌感染を阻害する有効量の組成物を、それを必要としている患者（ヒトまたは
、例えばネコ、ウマおよびウシであるがこれらに限定されない哺乳類および鳥類
を含む他の動物）に投与する。具体的な投与療法も同様に、このような要因によ
って変化し得るし、１日を通して単回投与または複数回投与を与えることができ
る。この治療は約２〜３日から約２〜３週間またはそれ以上で終了し得る。（単
回または分割投与による）典型的な１日の用量は、約０．０１ｍｇ／体重ｋｇ〜
約１００ｍｇ／体重ｋｇの投与量の本発明の活性化合物を含むであろう。好まし
くは、１日の用量は一般に、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇであり、理
想的には、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇであるだろう。深刻な感染に
対しては、例えば０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間の活性成分を用いる静脈内注
入により本化合物を投与できる。

【００３４】 本発明はまた、本発明の抗真菌性化合物の投与に有用な医薬製剤を提供する。
したがって本発明はまた、１個またはそれ以上の製薬的に許容される担体、希釈
剤、ビヒクル、賦形剤、または他の添加剤とシュードマイシンＡ'および／また
はＢ'を含む医薬製剤を提供する。このような製剤には、製剤の０．１重量％〜
９９．９重量％、より一般的には約１０重量％〜約３０重量％の活性成分が含ま
れる。「製薬的に許容される」とは、担体、希釈剤または賦形剤が製剤の他の成
分と混合しても化学反応を起こさず、その服用者に有害でないことを意味する。

【００３５】 製剤には、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば落花生油、ダイズ
油、鉱油およびゴマ油を含む種々の油状物などの添加剤を含ませることができる
。適当な医薬的賦形剤には、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、
スクロース、ゼラチン、麦芽、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリ
ウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グ
リセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールが含まれる。この組成
物は、慣用の製薬方法、例えば滅菌化に付することができ、慣用の医薬的添加剤
、例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、浸透圧調節用の塩およびバッ
ファーを含ませることができる。適当な医薬的担体およびその製剤化は Martin,
"Remington's Pharmaceutical Sciences," 15th Ed.; Mack Publishing Co., E
aston (1975); 例えば pp. 1405-1412 および pp. 1461-1487 を参照。

【００３６】 本明細書中で用いる用語「製薬的に許容される塩」とは、生命に対して実質的
に無毒な上記化合物の塩を意味する。典型的な製薬的に許容される塩には、本発
明の化合物を無機または有機の酸または無機塩基と反応させることによって調製
される塩が含まれる。このような塩は酸付加塩および塩基付加塩として既知であ
る。

【００３７】 酸付加塩の形成に一般に用いられる酸は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、
ヨウ化水素酸、硫酸およびリン酸、および有機酸、例えばｐ−トルエンスルホン
酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハ
ク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸である。このような製薬的に許容される塩
の例には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、
リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、クロライド、
ブロミド、ヨーダイド、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、
アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル
酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フ
マル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，６−二酸塩
、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒ
ドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレ
ンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、
クエン酸塩、乳酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、
メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、
ナフタレン−２−スルホン酸塩およびマンデル酸塩がある。好ましい製薬的に許
容される酸付加塩には、無機酸、例えば塩酸および臭化水素酸と形成されたもの
、および有機酸、例えばマレイン酸およびメタンスルホン酸と形成されたものが
ある。

【００３８】 塩基付加塩には、無機塩基、例えばアンモニウムまたはアルカリまたはアルカ
リ土類金属ヒドロキシド、カルボナートおよびビカルボナート由来のものが含ま
れる。したがって、このような本発明の塩の調製に有用な塩基には、水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム
、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウム
が含まれる。カリウムおよびナトリウム塩形態は特に好ましい。

【００３９】 塩が全体として薬理学的に許容され、対イオンが全体としての塩に望ましくな
い性質を与えない限り、本発明の任意の塩の部分を形成する特定の対イオンは重
要な性質のものではないことが理解されるべきである。

【００４０】 シュードマイシンＡ'および／またはＢ'は、例えば筋肉内、皮下、または腹腔
内注射を使用して非経口的に、鼻腔または経口経路により投与することができる
。これらの投与方法に加えて、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'は表皮感
染に関して局所的に適用することができ、あるいは粘液中の真菌を根絶し、ある
いは阻害することができる。

【００４１】 非経口投与では、製剤に、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'および生理
学的に許容される希釈剤、例えば脱イオン水、生理食塩水、５％デキストロース
および他の一般に用いられる希釈剤を含ませる。この製剤には、シクロデキスト
リンおよび／または可溶化剤、例えばポリエチレングリコールまたはポリプロピ
レングリコールまたは他の既知の可溶化剤を含ませてもよい。このような製剤は
、抗真菌剤および賦形剤を含む滅菌バイアル中で乾燥粉末または凍結乾燥粉末形
態で作成することができる。使用前に生理学的に許容される希釈剤を加え、患者
への投与用に溶液をシリンジで吸引する。

【００４２】 本医薬製剤は、既知であり、かつ容易に入手可能な成分を用いる既知の手法に
よって製造する。本発明の組成物の作成では一般に、活性成分を担体と混合する
か、あるいは担体で希釈するか、あるいはカプセル、サシエ、ペーパーまたは他
の容器の形態であってよい担体中に包含させる。担体が希釈剤として働く場合、
これは、活性成分に対するビヒクル、賦形剤または媒体として作用する固形、半
固形または液状物質であり得る。したがって、組成物は錠剤、ピル剤、粉末剤、
トローチ剤、サシエ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液
剤、シロップ剤、エアロゾル剤、（固形物として、あるいは液状媒体中）、例え
ば１０重量％までの活性化合物を含む軟膏剤、ゼラチン軟および硬カプセル剤、
坐剤、滅菌注射用溶液剤および滅菌パッケージ化粉末剤の剤型であってよい。

【００４３】 経口投与用には、抗真菌化合物をゼラチンカプセルに充填するか、あるいは錠
剤に成形する。このような錠剤は、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'適用
量に対して適正なサイズの錠剤を製造するのに適した結合剤、分散剤または他の
適当な賦形剤を含んでもよい。小児用または老人用の使用では、抗真菌性化合物
を香気を添えた液状懸濁液、溶液またはエマルジョン中に製剤化することができ
る。好ましい経口製剤は、リノール酸、クレモフォア（cremophor）RH-60 およ
び水、ならびに好ましくは８％リノール酸、５％ クレモフォア RH-60、８７％
滅菌水の量（用量％）、ならびに約２．５〜約４０ｍｇ／ｍＬ量のシュードマイ
シンＡ'および／またはＢ'である。

【００４４】 局所的使用では、抗真菌性化合物を皮膚表面への適用のための乾燥粉末ととも
に製剤化することができ、またこれは、可溶化水溶液または非水溶液、例えばア
ルコールまたはグリコールを含む液状製剤として製剤化してもよい。

【００４５】 シュードマイシンＡ'またはＢ'製剤の使用 また本発明は本医薬組成物を含み、本発明の方法とともに用いられるキットを
含む。このキットは、乾燥または液状形態の本発明の製剤および適当な担体を含
むバイアルを含み得る。このキットはさらに、バイアルのラベルとして、および
／または、バアルがパッケージされているボックス中に含まれる挿入物として、
化合物の使用および投与に関する指示書を含む。この指示書は、バイアルがパッ
ケージされているボックスに印刷されていてもよい。この指示書は、当分野の働
き手がこの薬物を投与できるように、十分な適用量および投与情報などの情報を
含む。当分野の働き手には、この薬物を投与するかもしれない任意の医者、看護
婦または技師が含まれることが予想される。

【００４６】 本発明はまた、シュードマイシンＡ'および／またはＢ'の製剤を含む医薬組成
物であって、注射による投与に適したものに関する。本発明では、シュードマイ
シンＡ'および／またはＢ'の製剤は、注射による投与に適した組成物または薬物
を製造するために用いることができる。本発明はまた、注射による投与に適した
剤型のシュードマイシンＡ'および／またはＢ'の製剤を含む組成物を製造する方
法に関する。例えば、液状または固形製剤は、慣用技術を用いるいくつかの経路
で製造できる。ある液状製剤はシュードマイシンＡ'および／またはＢ'を、緩衝
剤または他の賦形剤を含む適当なｐＨの適当な溶媒、例えば水に溶解することに
よって製造できる。

【００４７】 農業上の使用 P. syringae から生産される抗生物質 NRRL B-12050 は、Dutch ニレ疾患を有
効に処置することが示された（例えば、米国特許第４，３４２，７４６号および
第４，２７７，４６２号を参照）。特に、P. syringae MSU 16H は、Dutch ニレ
疾患の原因物質である Ceratocystis ulmi に感染したニレにおいて、野生型株
より大きな保護を与えることが示された（例えば Lam et al, Proc. Natl. Sci.
USA, 84, 6447-6451 (1987) を参照）。畑で生育したニレに対するより大規模
な試験により、予防レベルでバイオコントロールの現象が確認された。したがっ
て、本発明のシュードマイシンは Dutch ニレ疾患の予防処置にとして有用であ
り得る。このシュードマイシンは、Rynchosporium secalis、Ceratocystis ulmi
、Rizoctonia solani、Sclerotinia sclerotiorum、Verticillium albo-atrum、
Verticillium dahliae、Thielaviopis basicola、Fusarium oxysporum および F
usarium culmorum を含む広い範囲の植物病原性真菌に対して毒性であることが
示された（Harrison, L., et al., "Pseudomycins, a family of novel peptide
s from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activit
y," J. General Microbiology, 7, 2857-2865 (1991) を参照）。結論として、
単離されたシュードマイシンＡ'および／またはＢ'（その水和物、溶媒和物およ
びエステルを含む）は、直接処置または予防処置として、植物における真菌（特
に、V. albo-atrum、Rhizoctonia solani および F. oxysporum）の処置に有用
であり得る。一般に、シュードマイシン化合物の水性懸濁液を植物中へ、あるい
は植物上に注射またはスプレーすることによって感染植物を処置する。注射の手
段は当業者に周知である（例えば、切骨器ピストル (gouge pistol)）。有効量
の活性物質を植物表面に分配する、いずれかの懸濁液スプレー手段を用いること
ができる。この懸濁液には、当業者が一般に用いる他の添加剤、例えば可溶化剤
、安定化剤、湿潤剤およびその組み合わせを含ませてもよい。

【００４８】 植物の処置はまた、単離のシュードマイシンＡ'および／またはＢ'化合物を含
む乾燥組成物を用いて行うことができる。乾燥製剤は当業者に周知のいずれかの
手段、例えば容器からのスプレーまたはシェイクにより植物表面に適用すること
ができる。

【００４９】 以下の実施例を参照して、本発明をより理解することができる。これらの実施
例は本発明の具体的態様を示すことを意図するものであり、本発明の範囲の限定
を意図しない。

【００５０】 実施例 寄託された生物学的材料 P. syringae ＭＳＵ １６Ｈは American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, MD, USA から受入れ番号 No. ATCC 67028 として公に利用
可能である。P. syringae 株２５−Ｂ１、７Ｈ９−１および６７ Ｈ１は２００
０年３月２３日に American Type Culture Collection に寄託され、以下の受入
れ番号を割り当てられた： ２５−Ｂ１ 受入れ番号 PTA-1622 ７Ｈ９−１ 受入れ番号 PTA-1623 ６７ Ｈ１ 受入れ番号 PTA-1621

【００５１】 実施例１ シュードマイシンＡ'およびＢ'の生産 Pseudomonas syringae 株の発酵ブロス中、シュードマイシンＡ'およびＢ'生
産に関する発酵方法を開発した。

【００５２】 材料および方法 種菌の調製： 液体窒素の蒸気相中に保存された一定量の細胞を解凍し、９００ｍＬ量のＣＳ
Ｍブロス２つを接種するのに用いた。ＣＳＭブロスは以下から構成されるもので
あった（単位ｇ／Ｌ）：デキストロース（５）、マルトース（４）、Difco Tryp
tic Soy Broth（３０）、Difco 酵母抽出物（３）およびＭｇＳＯ_４ ７Ｈ_２Ｏ（
２）。細胞約０．５ｍＬを用いて、２個のリットルフラスコ中に入れられた培地
各９００ｍＬを接種した。フラスコを２４時間振りながら、２５℃でインキュベ
ートした。２個のフラスコ中の内容物をまとめ、滅菌発酵ブロス１１５リットル
を含む１５０リットル発酵槽を接種した。

【００５３】 発酵段階： 発酵ブロスは以下から構成されるものであった（単位ｇ／Ｌ）：デキストロー
ス（２０）、可溶性デンプン（５）、Basic American Foods Country Style Pot
ato Pearls インスタントマッシュポテト（３０）、グリシン（１）、ＭｇＳＯ
_４ ７Ｈ_２Ｏ（０．２）、ＫＣｌ（０．２）およびＦｅＳＯ_４ ７Ｈ_２Ｏ（０．０
０４）（生水中）。ｐＨを５．２に調節した後、滅菌した。発酵は２５℃で６８
時間行った。空気流およびインペラー攪拌速度を継続して調節することにより、
溶存酸素を空気飽和の３０％またはそれ以上に維持した。Ｈ_２ＳＯ_４またはＮａ
ＯＨを加えることによってｐＨを４．０〜５．４の間で維持した。

【００５４】 バッチ法のバリエーション： 単純バッチ処理のいくつかのバリエーションによりシュードマイシンＡ'およ
び／またはＢ'を生産できることがわかった。初期接種２４時間後に出発し、１
時間当たり６０ｍＬの割合でデキストロースを発酵槽に移すことができる。発酵
工程を通してフィードを継続できる。別法では、接種２４時間後に出発し、発酵
期間の終わりまで継続して、溶存酸素を空気飽和の５％で維持する方法を用いた
。発酵槽に連結されている空気供給器に不活性窒素ガス（Ｎ_２）を加えることに
よって溶存酸素を５％で維持することができた。すべての場合で、発酵槽中の底
部攪拌タービンの直下に開口部が位置する単一の水中スパージャー管を介してガ
スを供給した。

【００５５】 結果および結論 いくつかの発酵方法で P. syringae からシュードマイシンＡ'および／または
Ｂ'が生産される。

【００５６】 実施例２ シュードマイシンＡ'およびＢ'の単離および精製 Pseudomonas syringae 株の発酵ブロスからのシュードマイシンＡ'およびＢ'
の単離および精製に関して方法を開発した。

【００５７】 材料および方法 回収後の全発酵ブロス（４Ｘ１００Ｌ）を Membralox セラミックフィルター
（０．４５μｍ）を通してろ過し、ろ液（フラクションＡ）および固形スラリー
（フラクションＢ）を得た。フラクションＢ（１３５Ｌ）を等量の、０．１％Ｔ
ＦＡを含むアセトンで１２０分間抽出し、静置した。透明なアセトン抽出物をろ
過によって分離し、次いで減圧下で蒸発させ、水溶液にし、フラクションＣ（８
８Ｌ）を得た。まずフラクションＡを水中に詰めたＨＰ２０ｓｓ樹脂カラム（１
０Ｌ）に載せ、カラムを０．１％ＴＦＡを含む１５％アセトニトリル（２０Ｌ）
で洗浄した。次いでフラクションＣを同じカラムにロードし、このカラムを０．
１％ＴＦＡを含む１５％アセトニトリル２０Ｌで前記のように洗浄した。

【００５８】 次いでこのカラムを、０．１％ＴＦＡを含む１５〜２０％アセトニトリルの直
線状濃度勾配で３０分間、０．１％ＴＦＡを含む２０〜３５％アセトニトリルの
直線状濃度勾配で６０分間、流速１Ｌ／分で溶出した。１Ｌフラクションを収集
した。フラクション６〜９をまとめ（４Ｌ）、フラクションＤ（２４ｇ）を得た
。フラクションＤの一部（〜１ｇ）を、トリエチルアンモニウムホスフェートバ
ッファー（ｐＨ３）−アセトニトリル−メタノールを移動相として用いて逆相カ
ラム（Dynamax C₁₈ 41.4 X 250mm）でクロマトグラフィーした（６５：１７：１
８から３０：３５：３５濃度勾配溶出、４５分間、流速４０ｍＬ／分）。適当な
フラクションをまとめ、容量を７５ｍＬに減らし、８０：１０：１０から４６：
２７：２７の濃度勾配を用いてＣ_１８カラムで前記のように再クロマトグラフィ
ーし、フラクションＥ（１１３ｍｇ）およびフラクションＦ（１１６ｍｇ）を得
た。Ｃ_１８カラム（Dynamax 21.4 X 250mm）で、フラクションＥおよびＦをさら
にクロマトグラフィーし、シュードマイシンＡ'４５ｍｇおよびシュードマイシ
ンＢ'６２ｍｇをそれぞれ得た。

【００５９】 結果および結論 他のシュードマイシンの精製に用いられるものと同様のＨＰＬＣ法により、発
酵ブロスからシュードマイシンＡ'およびＢ'を精製した。

【００６０】 実施例３ シュードマイシンＡ'およびＢ'の構造の決定 質量分析およびＮＭＲによりシュードマイシンＡ'およびＢ'構造を測定した。

【００６１】 シュードマイシンＡ'の構造決定 方法および結果 シュードマイシンＡ'の分子式を、高分解能ＦＡＢＭＳによって、Ｃ_５２Ｈ_８
９ＣｌＮ_１２Ｏ_２０［ｍ／ｚ １２３７．６１１２（Ｃ_５２Ｈ_９０ＣｌＮ_１２Ｏ
_２０に関して)（Ｍ＋Ｈ）^＋、Δ−２．４ｐｐｍ）］として決定した。シュード
マイシンＡと比較すると、シュードマイシンＡ'の分子式は１個の追加のＣＨ_２
基を示した。この観察は、シュードマイシンＡ'においては、Ｎ末端セリンが、
シュードマイシンＡにおける３，４−ジヒドロキシテトラデカン酸のかわりに３
，４−ジヒドロキシペンタデカン酸でアシル化され得ることを示した。この議論
は、以前に特徴付けられたすべてのシュードマイシンにおいて、コアが特有かつ
同一のノナデプシペプチド環を有し、これらの間の唯一の相違は疎水性側鎖の性
質によって生じることによって支持される。

【００６２】 したがって、シュードマイシンＡ'のＮＭＲスペクトルデータは実質的にすべ
ての既知のシュードマイシン、例えばシュードマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＣ'と
同一である。シュードマイシンＡ'のＴＯＣＳＹおよびＨＭＱＣを含む^１Ｈ、^１
３Ｃおよび２Ｄ ＮＭＲスペクトルの総合的分析により、シュードマイシンＡ'の
疎水性側鎖における３，４−ジオール官能基が確立され、分子中のすべてのプロ
トンおよびプロトンを保持する炭素を割り当てることが可能になった（表１）。
これらの質量分析およびＮＭＲデータに基づく、シュードマイシンＡ'に対して
測定された構造を以下に示す。

【化１３】 質量およびＮＭＲスペクトルデータから得られたシュードマイシンＡ'の構造 表１ Ｈ_２Ｏ＋ＣＤ_３ＣＮ中のシュードマイシンＡ'の^１Ｈおよび^１３ＣＮＭ
Ｒデータ

【表１】

【表２】 ＊Ｄａｂ−１およびＤａｂ−２に関する割り当ては交換可能である。

【００６３】 シュードマイシンＢ'の構造決定 シュードマイシンＢ'の構造決定も質量およびＮＭＲスペクトルデータの解釈
によって行った。分子式：Ｃ_４９Ｈ_８３ＣｌＮ_１２Ｏ_１９［ｍ／ｚ １１７９．
５６８５（Ｃ_４９Ｈ_８４ＣｌＮ_１２Ｏ_１９に関して）(Ｍ＋Ｈ)^＋、Δ−１．８ｐ
ｐｍ］は高分解能ＦＡＢ−ＭＳデータによって確立した。この式は、シュードマ
イシンＢに関して観察されるものではない２個のＣＨ_２を示した。ＴＯＣＳＹお
よびＨＭＱＣスペクトルを含む^１Ｈ、^１３Ｃおよび２Ｄ ＮＭＲの詳細な分析お
よび既知のシュードマイシンとのスペクトルデータの比較により、同一のアミノ
酸組成が示された。さらにＮＭＲデータは３−ヒドロキシドデカン酸の存在を示
した（表２）。したがってこのスペクトルデータからシュードマイシンＢ'の構
造は以下に示すものであることがわかる。

【化１４】 質量およびＮＭＲスペクトルデータから得られたシュードマイシンＢ'の構造 表２ Ｈ_２Ｏ＋ＣＤ_３ＣＮ中のシュードマイシンＢ'の^１Ｈおよび^１３ＣＮＭ
Ｒデータ

【表３】

【表４】

【表５】 ＊Ｄａｂ−１およびＤａｂ−２に関する割り当ては交換可能である。

【００６４】 結論 シュードマイシンＡ'およびＢ'は、独特のクラスのノナデプシペプチドの新規
メンバーである。これらの分子は既知のシュードマイシンに非常に密接に関連し
、疎水性側鎖の性質のみが異なっているが、これらは、抗真菌剤としてのこのク
ラスの化合物の構造−活性相関を解明する鍵となる役割を担うはずである。

【００６５】 実施例４ Pseudomonas syringae の単離、特徴付けおよび突然変異誘発 P. syringae の環境単離体および突然変異体を生産し、抗真菌物質の製造に用
いた。

【００６６】 材料および方法 １９９６年１１月１９日発行の米国特許第５，５７６，２９８号から G. Stro
bel et al.; Harrison et al., "Pseudomycins, a family of novel peptides f
rom Pseudomonas syringae possessing broad-spectrun antifungal activity."
J. Gen. Microbiology 137, 2857-2865 (1991); および Lamb et al., "Transp
oson mutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonas; Antimycotic pro
duction is necessary for control of Dutch elm disease." Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 84, 6447-6451 (1987) に記載されるように、株ＭＳＵ １７４およ
びＭＳＵ １６−Ｈを単離し、特徴付けした。この段落に引用されている文献の
開示内容は引用により本明細書中に包含される。

【００６７】 このような野生型および化学突然変異誘発によるトランスポゾン作成突然変異
体からさらなる株を派生させた。突然変異誘発に付された株にはＭＳＵ １７４
、ＭＳＵ １６Ｈおよび２５−Ｂ１が含まれる。突然変異を起こさせるべき株を
ＣＳＭ培地中で生育させ、次いで０、１，２，４、１６または３２μｇ／ｍＬの
化学突然変異原である、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（Ｎ
ＴＧまたはＭＮＮＧ）を含む培地に分けた。次いでこれらの細胞を後のスクリー
ニングおよび選択用に凍結した。

【００６８】 突然変異を起こさせた細胞を、所望の生育条件および／または１個またはそれ
以上のシュードマイシン、例えばシュードマイシンＡ'および／またはＢ'の生産
に関して選択した。化学的に突然変異を起こさせた、P. syringae の細胞、例え
ば突然変異を起こさせた株２５−Ｂ１を解凍し、Ｎ２１ＳＭ培地中６細胞／ｍＬ
に希釈した（表５）。この培地は１個またはそれ以上の選択に関する成分、例え
ば種々の濃度のホスフェートを含んでいることもあった。５０μＬ容量の突然変
異を起こさせた細胞を９６ウェル丸底ミクロタイタープレートのウェルに、平均
０．３細胞／ウェルのデリバリーで分配した。典型的に、シリコーンオイルを各
ウェルに加え、蒸発を最小化した。このプレートを６〜１２日間２５℃でシェイ
クしながらインキュベートした。 表５ Ｎ２１ＳＭ培地の組成

【表６】

【００６９】 このインキュベーション後、各ウェルからの一定量、典型的には５ＴＬを連続
希釈（例えば１：５６、１：１９６、１：３２０、１：６８６および／または１
：１７１５）し、Candida albicans に対する活性に関して、液体ミクロタイタ
ープレートバイオアッセイにおいて評価した。このプレートを３７℃で一晩イン
キュベートし、C. albicans 生育の阻害に関してウェルを評点した。適当な株を
選び、ＣＳＭ培地（表６）に接種し、２５℃で１〜３日間生育させた。 表６ 完全ストレプトマイセス培地（ＣＳＭ）

【表７】

【００７０】 選択された株を保存し、Ｎ２１ＳＭ培地１３ｍＬを含む発酵ボトルに接種し、
２５℃で約６６時間生育させた。この発酵物から一定量を取り出し、該一定量と
等容量のアセトニトリルで１時間抽出し、遠心し、実施例１〜３に記載のように
１個またはそれ以上のシュードマイシン、例えばシュードマイシンＡ'またはＢ'
のＨＰＬＣ分析用にデカンテーションした。１個またはそれ以上のシュードマイ
シン、例えばシュードマイシンＡ'またはＢ'を生産する株を再び単離し、再発酵
させ、大規模培養用に調製した。

【００７１】 結果 上記方法を用いて、１個またはそれ以上のシュードマイシン、例えばシュード
マイシンＡ'またはＢ'の生産を示す株を作成した。

【００７２】 結論 本明細書中に開示されている選択方法および基準は、最小培地で生育し、１個
またはそれ以上のシュードマイシン、例えばシュードマイシンＡ'またはＢ'を生
産する P. syringae の株の作成に有効である。

【００７３】 実施例５ P. syringae の培養およびシュードマイシンの生産 P. syringae の培養に関して公開されている培地中で用いられているポテト産
物を一切含まない培地Ｎ２１中で P. synringae を発酵させると、単離に適当な
レベルのシュードマイシンが生産された。

【００７４】 シェイクしたフラスコおよびＮ２１培地中のシュードマイシン生産 材料および方法 P. syringae を、２５０ｍＬフラスコ中、Ｎ２１培養培地（表７）５０ｍＬ中
で生育させた。P. syringae ＭＳＵ １６Ｈの一定量の種菌で培養を開始し、２
５℃および７０％湿度で７日間、インキュベーター中、２５０ｒｐｍで振りなが
ら維持した。インキュベーション期間の終わりに、ブロス４ｍＬをフラスコから
取り出し、０．１％リン酸を含むメタノール６ｍＬと混合した。低ｐＨはシュー
ドマイシンを安定化すると考えられる。粒状物質をろ過および遠心によって取り
出し、シュードマイシンを、本明細書中上に記載のようにＨＰＬＣによって測定
した。 表７ Ｎ２１培地の組成

【表８】

【００７５】 いくつかの P. syringae の株によるシュードマイシン生産を、添加ミリスチ
ン酸メチルを含むか、あるいは含まないＮ２１培地を用いて評価した。評価され
た P. syringae の株には、ＭＳＵ １６Ｈ、２５−Ｂ１、６７Ｈ１および７Ｈ９
−１が含まれていた。

【００７６】 結果 P. syringae の種々の株を、ミリスチン酸メチルの存在または不存在下で培養
すると、有意なレベルの１個またはそれ以上のシュードマイシン、例えば１０Ｔ
ｇ／ｍＬ以上の１個またはそれ以上のシュードマイシンＡ、シュードマイシンＢ
および／またはシュードマイシンＣが生産された。ミリスチン酸メチルは特定の
株に関するシュードマイシン生産を刺激した。

【００７７】 結論 P. syringae の種々の株は、ポテト産物を欠いている培地中、商業的に有意な
レベルのシュードマイシンを生産し、この生産はミリスチン酸メチルによって刺
激できる。

【００７８】 Ｎ２１培地を用いる５０００Ｌ規模でのシュードマイシンの生産 ポテト産物を添加しない培地を用いてシュードマイシンを生産する方法を５０
００Ｌレベルに規模拡大した。

【００７９】 材料および方法 完全ストレプトマイセス培地（ＣＳＭ、表５）を含む生長期のフラスコを凍結 P. syringae 培養、典型的には株６７Ｈ１で接種し、２５℃で２４時間、２５
０ｒｐｍでシェイクした。生長期フラスコを２４時間インキュベートした後、こ
れらのフラスコの内容物を用いてバンプ期（bump-stage）のフラスコを接種した
。バンプ期のフラスコには、ＣＳＭ培地が含まれ、これを２５０ｒｐｍで回転さ
せ、２５℃で維持した。バンプ期のフラスコを、３個または４個の生長期フラス
コ由来のプール化培養約０．４５ｍＬで接種した。バンプ期のフラスコは典型的
に非緩衝化２．５Ｌ Tunair（登録商標）フラスコ中のＣＳＭ約９００ｍＬを含
む。各発酵槽に対して Tunair（登録商標）フラスコ中のバンプ期培養２個をセ
ットした。バンプ期フラスコを１６時間インキュベートした。

【００８０】 次いで、２個のバンプ期培養を種菌バズーカにおいて混合してプールした。こ
れらの混合培養を用いて、さらに３ｇ／Ｌ（トータルで４ｇ／Ｌ）のグリシン、
１ｇ／Ｌのダイズ油および１ｇ／Ｌの酵母抽出物を補った表１５中に記載の培地
を含むタンクに接種した。これらの大規模培養を２５℃で３〜４日間生育させた
。この生育期間中、溶存酸素を、攪拌および空気流を用いて空気飽和の３０％で
制御した。必要に応じて硫酸または水酸化ナトリウムを加えることにより、ｐＨ
を５．２±０．２で制御した。大規模培養の開始１８時間後、グルコース供給を
２００ｍＬ／時間の割合で開始した。大規模培養の開始２０時間後、水酸化アン
モニウム供給を２０ｍＬ／時間の割合で開始した。この培養時に、ホールドバッ
ク圧は５psigであった。攪拌の初期設定は１５０ｒｐｍであり、空気流は０．５
scfmである。必要であれば、抗泡沫剤をさらに加えた。これらの条件に対する特
定のバリエーションをさらに試験した。大規模培養の３〜４日後、P. syringae
を回収した。実施例６に記載されるように抗真菌活性を測定した。

【００８１】 結果および結論 添加ポテト産物を含まない培地を用いて５０００Ｌ規模で、商業的に有意な量
のシュードマイシンを生産した。

【００８２】 実施例６ シュードマイシンの測定および精製 抗真菌活性によるシュードマイシンの検出および定量 シュードマイシンまたはシュードマイシン混合物の存在または量は調製物の抗
真菌活性を測定することによって測定できる。標準寒天希釈試験またはディスク
拡散試験を用いて調製物の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を得ることにより抗真菌活性
をインビトロで測定した。１個またはそれ以上のシュードマイシンの調製物は、
細胞培養の抽出物、あるいはより精製された混合物であってよい。抗真菌活性の
試験に用いられる典型的な真菌は C. albicans である。試験調製物が、Candida
albicans ｘ６５７播種寒天プレート上１０〜１２ｍｍ直径領域の阻害を生じさ
せた場合、抗真菌活性は有意であると考えた。

【００８３】 抗真菌実験は、９６ウェルミクロタイタープレート中、National Committee f
or Clinical Laboratory Standards ガイドラインにしたがって、ミクロタイタ
ーブロス希釈アッセイを用いて行った。サブロー（Sabourauds）およびデキスト
ロースブロスは、２．５Ｘ１０^４conida／ｍＬを含むように調節した。試験化合
物を水に溶解し、２０μｇ／ｍＬの最も高い濃度で出発する２倍希釈物中で試験
した。プレートを３５℃で４８時間インキュベートした。表３および表４中の結
果は、化合物の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を示し、これは非処理培養コントロール
と比べて完全に生育を阻害する。 表３ シュードマイシンＡ'の抗真菌活性

【表９】 表４ シュードマイシンＢ'の抗真菌活性

【表１０】

【００８４】 ＨＰＬＣによるシュードマイシンの検出および定量 １個またはそれ以上のシュードマイシンを含むと考えられるサンプルをろ過お
よび遠心によって明らかにした。明らかにされた混合物を Zorbax ＲｘＣ８カラ
ム（３．５Ｔ粒子２５ｘ０．４６ｃｍ）において流速１ｍＬ／分でクロマトグラ
フィーする。このカラムを０．２％ＴＦＡを含む２０〜５５％アセトニトリルの
直線状濃度勾配で１５分間溶出し、０．２％ＴＦＡを含む５５％アセトニトリル
で５分間保持した。典型的に、シュードマイシンＡ'は約１３．７分（８２２秒
）で溶出し、シュードマイシンＢ'は約１２．４分（８２２秒）で溶出した。シ
ュードマイシンは２１５ｎｍでの吸光度によって検出し、ＵＶピークの積分によ
って定量した。各シュードマイシンの標準物を同定および定量に用いた。

【００８５】 実施例７ シュードマイシンＡ'および／またはＢ'を含む製剤 以下の製剤例は単に例示であり、いかなる意味においても本発明の範囲の限定
を意図しない。用語「活性成分」はシュードマイシンＡ'および／またはＢ'また
は製薬的に許容されるその塩を意味する。

【００８６】 製剤例１ 以下の成分を用いてゼラチン硬カプセル剤を製造する：

【表１１】

【００８７】 製剤例２ 以下の成分を用いて錠剤を製造する。成分を混合し、各６６５ｍｇ重量の錠剤
に圧縮成形する。

【表１２】

【００８８】 製剤例３ 以下の成分を含むエアロゾル溶液を製造する。活性化合物をエタノールと混合
し、混合物を、―３０℃に冷却したプロペラント２２の一部に加え、充填装置に
移す。次いで必要量をステンレス鋼の容器に移し、残りのプロペラントで希釈す
る。次いでバルブユニットを容器に取り付ける。

【表１３】

【００８９】 製剤例４ それぞれ活性成分６０ｍｇを含む錠剤を以下のように製造する：

【表１４】 活性成分、デンプンおよびセルロースをＮｏ．４５メッシュ米国ふるいに通し
、十分に混合する。ポリビニルピロリドンを含む水溶液を得られた粉末と混合し
、次いで混合物をＮｏ．１４メッシュ米国ふるいに通す。このように製造された
顆粒を５０℃で乾燥し、Ｎｏ．１８メッシュ米国ふるいに通す。次いで、あらか
じめＮｏ．６０メッシュ米国ふるいに通しておいたカルボキシメチルデンプンナ
トリウム、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクを顆粒に加え、これを混合し
た後、打錠機で圧縮し、各１５０ｍｇ重量の錠剤を得る。

【００９０】 製剤例５ それぞれ活性成分８０ｍｇを含むカプセルを以下のように製造する：

【表１５】 活性成分、セルロース、デンプンおよびステアリン酸マグネシウムを混合し、
Ｎｏ．４５メッシュ米国ふるいに通し、ゼラチン硬カプセルに２００ｍｇ量を充
填する。

【００９１】 製剤例６ それぞれ活性成分２２５ｍｇを含む坐剤を以下のように製造する：

【表１６】 活性成分をＮｏ．６０メッシュ米国ふるいに通し、必要最小限の加熱によりあ
らかじめ融解させておいた飽和脂肪酸グリセリドに懸濁する。次いでこの混合物
を呼称２ｇ容量の坐剤型に注ぎ、放冷する。

【００９２】 製剤例７ それぞれ５ｍＬ用量当たり活性成分５０ｍｇを含む懸濁剤を以下のように製造
する：

【表１７】 活性成分をＮｏ．４５メッシュ米国ふるいに通し、カルボキシメチルセルロー
スナトリウムおよびシロップと混合して滑らかなペーストを形成する。安息香酸
溶液、香料および着色料を一部の水で希釈し、攪拌しながら加える。次いで十分
な水を加え、必要量を得る。

【００９３】 製剤例８ 静脈内製剤を以下のように製造することができる。これらの成分の溶液を１分
当たり１ｍＬの割合で患者に静脈内投与する。

【表１８】

【００９４】 種々の具体的で好ましい態様および技術に関して、本発明を記載した。しかし
、本発明の思想および範囲から逸脱することなく多くのバリエーションおよび修
飾を施すことができることが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:38） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マシュー・デイビッド・ベルボ アメリカ合衆国46140インディアナ州グリ ーンフィールド、グリーンブルック・コー ト24番 (72)発明者 ジェイムズ・ウィリアム・マーティン アメリカ合衆国46121インディアナ州コー ツビル、ミル・スプリングズ177番 (72)発明者 トーマス・ジョン・ペラン・ジュニア アメリカ合衆国46239インディアナ州イン ディアナポリス、クロス・ウィロー・レイ ン2127番 (72)発明者 ダグラス・ジョゼフ・ゼックナー アメリカ合衆国46143インディアナ州グリ ーンウッド、ベイサイド・ドライブ980番 Ｆターム(参考） 4B064 AG37 CA02 DA03 4C084 AA02 AA07 BA01 BA17 BA27 BA36 CA05 DA43 NA05 NA07 ZB352 4H045 AA10 AA30 BA15 BA33 CA11 EA29 FA73

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シュードマイシン、シュードマイシンＢ'、それらの混合物
   または製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルを含む単離のシュード
   マイシン天然産物。
2. 【請求項２】 シュードマイシンＡ'または製薬的に許容されるその塩、水
   和物またはエステルを含む、請求項１に記載のシュードマイシン。
3. 【請求項３】 式： 【化１】 で示されるか、あるいは製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルであ
   る、請求項２に記載のシュードマイシン。
4. 【請求項４】 シュードマイシンＢ'または製薬的に許容されるその塩、水
   和物またはエステルを含む、請求項１に記載のシュードマイシン。
5. 【請求項５】 式： 【化２】 で示されるか、あるいは製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルであ
   る、請求項４に記載のシュードマイシン。
6. 【請求項６】 式： 【化３】 で示される単離の化合物または製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステ
   ル。
7. 【請求項７】 式： 【化４】 で示される単離の化合物または製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステ
   ル。
8. 【請求項８】 真菌を、シュードマイシンＡ'、シュードマイシンＢ'、それ
   らの混合物または製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルを含む単離
   のシュードマイシン天然産物と接触させることを含む、真菌活性を阻害する方法
   。
9. 【請求項９】 シュードマイシン天然産物がシュードマイシンＡ'または製
   薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルを含む、請求項８に記載の方法
   。
10. 【請求項１０】 シュードマイシン天然産物が式： 【化５】 示されるか、あるいは製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルである
    、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 シュードマイシン天然産物がシュードマイシンＢ'または
    製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルを含む、請求項８に記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 シュードマイシン天然産物が式： 【化６】 で示されるか、あるいは製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルであ
    る、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 真菌が Candida parapsilosis, Candida albicans, Crypt
    ococcus neoformans または Histoplasma capsulatum を含む、請求項８に記載
    の方法。
14. 【請求項１４】 真菌を、式： 【化７】 で示される単離の化合物または製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステ
    ルと接触させることを含む、真菌活性を阻害する方法。
15. 【請求項１５】 真菌を、式： 【化８】 で示される単離の化合物または製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステ
    ルと接触させることを含む、真菌活性を阻害する方法。
16. 【請求項１６】 真菌感染の症状の軽減を必要としている患者において、真
    菌感染の症状を軽減する方法であって、この患者に、シュードマイシンＡ'、シ
    ュードマイシンＢ'、それらの混合物または製薬的に許容されるその塩、水和物
    またはエステルを含む単離のシュードマイシン天然産物を含む組成物の有効量を
    投与することを含む方法。
17. 【請求項１７】 シュードマイシン天然産物がシュードマイシンＡ'または
    製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルを含む、請求項１６に記載の
    方法。
18. 【請求項１８】 シュードマイシン天然産物が式： 【化９】 で示されるか、あるいは製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルであ
    る、請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 シュードマイシン天然産物がシュードマイシンＢ'または
    製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルを含む、請求項１６に記載の
    方法。
20. 【請求項２０】 シュードマイシン天然産物が式： 【化１０】 で示されるか、あるいは製薬的に許容されるその塩、水和物またはエステルであ
    る、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 真菌が Candida parapsilosis、Candida albicans、Crypt
    ococcus neoformans または Histoplasma capsulatum を含む、請求項１６に記
    載の方法。
22. 【請求項２２】 真菌活性を阻害する医薬組成物の製造における、請求項１
    、２、３、４、５、６または７に記載の化合物の使用。
23. 【請求項２３】 真菌活性を阻害するか、あるいは患者における真菌感染の
    症状を軽減する医薬組成物の製造における、請求項１、２、３、４、５、６また
    は７に記載の化合物の使用。