CN1191269C - 假单胞霉素的天然产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到假单胞霉素天然产品，本发明包括假单胞霉素A’和B’、用于制造这样的假单胞霉素的方法和使用这些假单胞霉素的抗真菌活性的方法，NMR和质谱显示的结构式(I)为假单胞霉素A’，NMR和质谱显示的结构式(II)为假单胞霉素B’。

Description

假单胞霉素的天然产品
                     发明领域
本发明涉及到假单胞霉素天然产品，本发明包括假单胞霉素A’和B’、用于制造这样的假单胞霉素的方法和使用这些假单胞霉素的抗真菌活性的方法。
                     发明背景
真菌感染是疾病、生活质量降低以及人类死亡的一个重要原因，尤其是对于免疫受损的患者。在过去20年中，人体的真菌感染发生率猛增。这部分由免疫系统受到削弱或由于器官移植、癌症化疗、AIDS、衰老和其它类似的失调或症状而被毁坏的患者数量的增加所导致。这样的患者易于被真菌病原攻击，这些真菌在整个人类群体中十分普遍，但它们可以被有功能的免疫系统所检查出来。由于现存的抗真菌试剂不是毒性高就是只能抑制真菌活性，因此这些病原难于控制。例如，多烯可以杀死真菌但毒性高；而吡咯类毒性较低但只能抑制真菌。更重要的是，近来有关于抗吡咯类和多烯的的菌株假丝酵母报道，该菌株严重地限制了针对这些菌株的医疗选择。
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)产生几个类别的抗真菌和抗生素试剂，例如假单胞霉素(pseudomycin)、丁香霉素、syringotoxin，syringostatins，这些试剂为脂缩酚九肽(lipodepsinonapeptide)。由天然菌株和转座子产生的丁香假单胞菌突变体产生这些脂缩酚九肽。几种假单胞霉素、丁香霉素和其它脂缩酚九肽抗真菌试剂已经被分离、，化学鉴定并表现出具有光谱抗真菌活性，这些活性包括抵抗人类和植物体内的重要真菌抗原的活性。例如，假单胞霉素A、B、C和C’均已被分离并纯化，并且已通过包括氨基酸测序、NMR和质谱分析在内的方法对其结构进行了特征研究。例见，Ballio et al.，“Novel bioactive lipodesipeptides fromPseudomonas syringae：the pseudomycins.”FEBS Lett.355，96-100(1994)以及美国专利No.5,576,298。假单胞霉素、丁香霉素、syringotoxin、syringostatin为结构不同的抗真菌化合物家族。
假单胞霉素、丁香霉素、syringotoxin、syringostatin均未被引入抗真菌治疗市场。不良副作用的发现、制剂制造、产量的提高和其它开发问题进一步阻碍了假单胞霉素、丁香霉素、syringotoxin、syringostatin在对抗各种影响人类、动物和植物的真菌感染中的应用。对一种抗真菌试剂以及该试剂对于抵抗人类、动物和植物的真菌感染的应用的需要依然存在，该试剂应可被用于抵抗现存的抗真菌试剂所不能治疗的感染。
                       发明概要
本发明提供了一种假单胞霉素天然产品，该产品由丁香假单胞菌所产生。该假单胞霉素天然产品包括一种缩九肽环，其序列为Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr，在更特定的情况下，该序列为L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl)，其ClThr的羧基基团和丝氨酸的羟基基团以一个内酯键闭合了该环。假单胞霉素A’(IA)包括3，4-二羟基十五烷酸基团，其羧基基团同N-末端丝氨酸的氨基基团形成一个酰胺键。
Figure C0080625800051
假单胞霉素B’(IB)包括3-羟基十二烷酸基团，其羧基基团同N-末端丝氨酸的氨基基团形成一个酰胺键。
本发明还涉及到使用假单胞霉素天然产品，诸如假单胞霉素A’、假单胞霉素B’或其混合物，以抑制真菌活性或减轻有需要的患者体内的真菌感染症状的方法。这些方法可以杀死真菌，减轻真菌感染的负担，退烧和/或患者的一般生活质量。本发明的方法可有效地抵抗诸如假丝酵母菌parasilosis、假丝酵母菌adbicans、Crytococcusneoformans和/或Histoplasma capsulatum这样的真菌。
具体地，本发明的一个方面涉及一种被分离的具有以下结构式的假单胞霉素A’：
本发明的一个方面涉及一种被分离的具有以下结构式假单胞霉素B’：
本发明的一个方面涉及一种抑制真菌在植物上或植物中生长的方法，该方法包括将植物与分离的假单孢霉素接触，该假单孢霉素包括具有以下结构的假单胞霉素A’
以下结构的假单胞霉素B’、
Figure C0080625800081
或它们的一种混合物。
                       发明详述
假单胞霉素
本文所用的假单胞霉素或假单胞霉素天然产物指的是抗真菌试剂家族的一个或多个成员，该成员分离自丁香假单胞菌。假单胞霉素为一种脂缩酚九肽，其为一种环形肽，该肽含有一种或多种非常见氨基酸并且具有一个或多个额外的疏水或脂肪酸侧链。在特定情况下，该假单胞霉素为一种脂缩酚九肽，其具有一个环形肽部分，该环通过内酯键闭合并且含有非常见的氨基酸4-氯-苏氨酸、3-羟基天冬氨酸、脱羟基-2-氨基丁酸以及2，4-二氨基丁酸。据信这些非常见的氨基酸涉及到了假单胞霉素生物学特性，例如在血清中的稳定性和它们的杀伤活动。
各假单胞霉素均具有同样的环肽核心，但是它们的与核心连接的羟基侧链不同。各假单胞霉素均具有一个九肽核心，其序列为Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr(即，丝氨酸；2，4-二氨基丁酸；天冬氨酸；赖氨酸；2，4-二氨基丁酸；allo苏氨酸；脱羟基-2-氨基丁酸；3-羟基天冬氨酸；4-氯-苏氨酸)，其ClThr的羧基基团和丝氨酸的羟基基团以一个内酯键闭合了该环。亲脂性基团连接于N-末端的氨基基团。该丝氨酸的氨基基团同在假单胞霉素A’中的3，4-二羟基十四烷酸基团的羧基形成肽键，在假单胞霉素B’中的3-单羟基十四烷酸基团的羧基形成肽键，在假单胞霉素C中的3，4-二羟基十六烷酸基团的羧基形成肽键，在假单胞霉素C’中的3-单羟基十六烷酸基团的羧基形成肽键。该丝氨酸的羧基基团同该环中的Dab形成酰胺键。
假单胞霉素A’和B’
本文所用的术语假单胞霉素A’和假单胞霉素B’指的是分离自丁香假单胞菌的抗真菌试剂。假单胞霉素A’和B’为具有特征的缩九肽环的假单胞霉素，该环的序列为Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr，其ClThr的羧基基团和丝氨酸的羟基基团以一个内酯键闭合了该环。假单胞霉素A’(IA)包括3，4-二羟基十五烷酸基团，其羧基基团同N-末端丝氨酸的氨基基团形成一个酰胺键。假单胞霉素B’(IB)包括3-羟基十二烷酸基团，其羧基基团同N-末端丝氨酸的氨基基团形成一个酰胺键。
假单胞霉素的生物活性
假单胞霉素具有多种生物活性，其中包括杀伤多种真菌，例如植物体和动物体的真菌病原体。特别地，假单胞霉素为一种活性的抗霉菌试剂，该试剂可抵抗导致免疫受损个体中的机会性感染的真菌。这些真菌包括不同种类的假丝酵母，其中包括C.parapsilosis，C.albicans，C.glabrata，C.tropicalis，以及C.krusei。这些真菌还包括其它属的真菌，例如Crytococcus neoformans，Aspergillusfumigatus以及Histoplasma capsulatum。诸如假单胞霉素A’和/或B’这样的抗真菌物质的一种理想的以及优选的生物活性是其杀伤而不是抑制真菌的生长，尤其是真菌病原体的生长。
假单胞霉素对范围很广的植物病原体真菌表现出毒性，这些真菌包括Rynchosporium secalis，Ceratocystis ulmi，Rizoctonicsolani，Sclerotinia sclerotiorum，Verticillium albo-atrum，Verticillium dahilae，Thielaviopis basicola，Fusariumoxysporum以及Fusarium culmorum。(见Harrison，L.，et al.，“Pseudomycins，a family of novel peptides from Pseudomonassyringae possessing broad-spectrum antifungal activity”，J.of General Microbiology，7.2857-2865(1991))另外，在被Ceratocystis ulmi感染的榆树中，P.Syringae MSU 16H表现出可产生比野生型菌株更强的保护，Ceratocystis ulmi为荷兰榆树疾病的引发物(例见，Lam et al.，Proc.Natl Sci.USA.84，6447-6451(1987))。
丁香假单胞菌
丁香假单胞菌包括范围很广的细菌，这些细菌一般同植物有关。一些丁香假单胞菌是植物病原体，而另一些仅为较弱的病原或腐生物。丁香假单胞菌的许多分离菌株产生一种或多种细胞毒性试剂，这些试剂可帮助该细菌在必须同真菌和其它细菌竞争的野生环境中生存。由丁香假单胞菌产生的细胞毒性试剂包括抗真菌试剂，例如假单胞霉素、丁香霉素、syringotoxin以及syringostatin。
产生一种或多种假单胞霉素的丁香假单胞菌菌株已在本领域中有所描述。例如，野生型菌株MSU 174(分离自蒙大拿州的麦田)以及使用TN905(MSU 16H)通过转座子突变而产生的该菌株的一种突变体的描述见美国专利No.5,576,298，该专利属于Strobel等人，发布于1996年11月19日；Harrison et al.，J.“Pseudomycins，a a family of novel peptides from Pseudomonas syringaepossessing broad-spectrum antifungal activity”，Gen.Microbiology，137，2857-2865(1991)；以及Lamb et al.，“Transposon mutagenesis and tagging of fluorescentpseudomonas：Antimycotic production is necessary for controlof Dutch elm disease，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，6447-6451(1987)。用于生长多种丁香假单胞菌菌株的方法以及其在诸如假单胞霉素这样的抗真菌试剂的生产中的应用披露于Matthew D.Hilton等人的美国专利申请序列号No.＿＿＿＿＿＿＿＿，其标题为“Pseudomycin Production By Pseudomonas Syringae”，与本文同日递交并在下文有描述。MSU 174和MSU 16H的培养物保存于蒙大拿州立大学(Bozeman，Montana，USA)，并且可获自American TypeCulture Collection(Parklawn Drive，Rockville，MD，USA)。
在本段中引用的参考的技露在此引入作为参考。
本发明包括一个菌株，一种分离菌以及一种生物学上纯化的丁香假单胞菌培养物，该培养物产生假单胞霉素A’和/或B’，其量至少为10μg/ml。在优选的情况下，微生物体的生物学纯化的培养物为丁香假单胞菌菌株MSU 16H、25-B1、67H1或7H9-1，或这些产生假单胞霉素A’和/或B’的菌株的一种突变体、变体、分离菌或重组体。培养物MSU 174和MSU 16H如上文所描述获得。
适于假单胞霉素A’和/或B’的生产的丁香假单胞菌菌株可分离自环境来源，该来源包括植物，例如大麦作物、柑橘类的植物以及丁香类植物，该菌株还可分离自诸如土壤、水、空气和灰尘这样的来源。优选的菌株分离自植物。分离自环境来源的丁香假单胞菌菌株可被称为野生型。本文所使用的“野生型”指的是一种显性基因型，该基因型天然存在于丁香假单胞菌的普通群体中(即，可见于自然界中并且非由实验室操作产生的丁香假单胞菌菌株或分离菌)。对于其它的生物体，应用于本发明的产生假单胞霉素A’和/或B’的培养物，丁香假单胞菌菌株如MSU 174、MSU 16H、MSU 206、25-B1、67H1或7H9-1的特征有一定的变化。由此，这些菌株的后代，例如，重组体、突变体和变体，可以通过本领域的技术人员所熟知的方法来获得。
丁香假单胞菌的突变体也适于假单胞霉素A’和/或B’的生产。本文所用的突变体指的是在一个菌株的表型上具有一个突然的可遗传的变化，该变化可以是自发产生的或通过已知的突变试剂诱导产生，该试剂包括照射和各种化学物质。本发明的突变体丁香假单胞菌可以使用各种突变试剂产生，这些突变试剂包括照射，如紫外线、x射线；化学突变原，位点特异性突变和转座子介导的突变。化学突变原的例子为甲基碳酸乙酯(ethyl methanesulfonate)(EMS)、diepoxyoctane、N-甲基-N-硝基-N’-nitrosoguanine亚硝基胍(NTG)以及亚硝酸。
本发明的产生假单胞霉素A’和/或B’的丁香假单胞菌突变体可以通过以一定量的突变试剂处理细菌而产生，该量足以产生突变体，该突变体过量产生假单胞霉素A’和/或B’，产生超过其它丁香假单胞菌的假单胞霉素A’和/或B’，或者在更有利的生长条件下产生假单胞霉素A’和/或B’。尽管被使用的突变试剂的类型和量可以有变动，一种优选的方法为对NTG进行一系列的稀释，其水平从1到100μg/ml。本发明的优选突变体为在最低限度培养基中生长过量产生假单胞霉素A’和/或B’的丁香假单胞菌突变体。该突变体过量产生的假单胞霉素优选为至少约10μg/ml。
丁香假单胞菌的环境分离菌、突变体菌株以及其它理想菌株可进行针对生长习性、生长培养基、营养来源、碳源、生长条件以及氨基酸需求的理想特征的选择。在优选的情况下，对产生假单胞霉素A’和/或B’的丁香假单胞菌进行诸如N21培养基这样的最低限度培养基的生长进行选择，和/或进行假单胞霉素A’和/或B’的产量高于10μg/ml的选择。优选的菌株表现的特征为其在某种培养基上生长时可产生假单胞霉素A’和/或B’，该培养基含有甘氨酸，并且根据情况含有一种脂、一种马铃薯产品或它们的组合。
重组菌株的开发可通过转化丁香假单胞菌来进行，该转化使用本领域的技术人员所熟知的已确立的实验室程序。通过使用重组技术，丁香假单胞菌可被转化以表达抗生素之外的多种基因。例如，可以以一种重组载体对该菌株进行转化，该载体可导致对某种抗生素的抗性，该菌株正常情况下对该抗生素敏感。由此获得的转化子将不止产生诸如假单胞霉素A’和/或B’这样的假单胞霉素，而且还产生导致抗性的酶，该酶使转化子得以从野生型中选出。进一步，使用类似的工艺，现存的菌株可以经修饰而引入多拷贝的内源假单胞霉素合成基因以获得更高的假单胞霉素产量，例如假单胞霉素A’和/或B’。丁香假单胞菌菌株25-B1、67H1和7H9-1的后代，即，天然的和诱导的变体、突变体和重组体，它们为本发明的一部分，这些菌株均保持了过量生产假单胞霉素A’和/或B’的特征。
丁香假单胞菌的生长
本文所描述的“水性营养培养基”指的是一种水基的组合物，该组合物含有本发明使用的细菌的生长所必需的无机物质和有机化合物以及它们的盐。优选的营养培养基含有有效量的3种或更少的氨基酸，在优选的情况下其为谷氨酸、甘氨酸、组氨酸或它们的组合。在一个实施方案中，该培养基含有有效量的甘氨酸并且根据情况含有一种或多种马铃薯产品以及一种脂。甘氨酸可作为一种氨基酸单独提供，也可作为一种氨基酸混合物，例如水解蛋白的一部分来提供。适当的脂包括大豆油或一种脂肪酸。适当的马铃薯产品包括马铃薯葡萄糖肉汤、马铃薯糊精、马铃著蛋白以及商品化的马铃著泥(mashedpotato)混合物食物产品。营养培养基中的优选的无机物质包括在细胞培养和发酵中典型使用的盐混合物，例如Czapek无机物盐溶液(例如，KCl，MgSO4以及FeSO4)。营养培养基中的有机化合物在优选的情况下包括葡萄糖并且可根据情况包括可溶性淀粉；还可含有其它类似的有机化合物。该培养基的pH在优选的情况下在约4到6.5之间，在更优选的情况下在约4.5到5.7之间，在最优选的情况下为约5.2。
尽管营养肉汤中的各组分的量在典型的情况下对于假单胞霉素A’和/或B’的产生并不关键，但特定水平的营养是有利的。甘氨酸的一个优选的量为约0.1g/L到10g/L，更优选的量为约0.3g/L到3g/L，最优选的量为约1g/L。脂的一个优选的量为约1g/L到10g/L的一种油产品，例如大豆油，更优选的量为约0.5g/L到2g/L的大豆油。脂肪酸或脂肪酸酯的优选的量为约0.5g/L到5g/L。优选的量的马铃薯产品含有约12g/L到36g/L的马铃薯葡萄糖肉汤，在优选的情况下为约24g/L；含有约5g/L到50g/L的商品化的马铃薯泥混合物，在优选的情况下为约30g/L；含有约1g/L到30g/L的马铃薯糊精，在优选的情况下为约20g/L；含有约1g/L到10g/L的马铃薯蛋白，在优选的情况下为约4g/L。一种优选的营养培养基含有的无机物质中，KCL在优选的情况下为0.02到2g/L，更优选的情况下约0.2g/L；MgSO4，优选地为MgSO4·7H2O，在优选的情况下为0.02g/L到2g/L，更优选的情况下约0.2g/L；FeSO4，优选地为FeSO4·7H2O，在优选的情况下为0.4mg/L到4mg/L，更优选的情况下约4mg/L。在其存在时，可溶性淀粉在优选情况下为约0.5到50g/L，更优选的情况下约5g/L。葡萄糖在优选的情况下约含有2到80g/L，更优选的情况下约20g/L。
丁香假单胞菌典型地在所描述的培养基上在控制或调节pH和温度的条件下生长。丁香假单胞菌在15℃到35℃的温度下生长并产生假单胞霉素A’和/或B’，在优选的情况下温度为约20℃到30℃，更优选的情况下温度为约22℃到27℃，最优选的情况下温度为约25℃。丁香假单胞菌在约4到9的pH下生长并产生假单胞霉素A’和/或B’，在优选的情况下pH为约4到6，在更优选的情况下pH为约4.5到5.5。在典型的情况下，丁香假单胞菌不在高于37℃或低于10℃的温度下或高于9或低于4的pH下生长。
产生假单胞霉素A’和/或B’的方法
为从一种野生型或突变体的丁香假单胞菌中生产假单胞霉素A’和/或B’，在一种水性营养培养基中对该微生物进行振荡培养，该培养基含有有效量的三种或更少的氨基酸。这三种或更少种的氨基酸在优选的情况下为谷氨酸、甘氨酸、组氨酸或它们的混合物。在一个优选的实施方案中，这些氨基酸包括甘氨酸并且根据情况含有一种或多种马铃薯产品以及一种脂。培养在足以使丁香假单胞菌生长并产生假单胞霉素A’和/或B’的有效条件下进行。有效的条件包括约22℃到27℃的温度以及约36到96小时的持续时间。在培养基，例如本文所述的培养基上进行培养时，丁香假单胞菌可生长至细胞密度高达干重约10-15g/L并且产生的假单胞霉素A’和/或B’总量为至少约10μg/ml。
在培养丁香假单胞菌期间对培养基中的氧的浓度进行控制对于假单胞霉素A’和/或B’的产生是有利的。在优选的情况下，氧的水平维持在约5％到50％饱和度，在优选的情况下，约30％饱和度。喷射空气、纯氧或含氧的混合气体可调控培养基中的氧含量。进一步，搅拌速度的调节可被用于调节氧传输速度。
在培养丁香假单胞菌期间对培养基中的pH进行控制对于假单胞霉素A’和/或B’的产生是有利的。假单胞霉素，例如假单胞霉素A’和/或B’在碱性pH下不稳定，并且如果培养基的pH持续12小时以上高于约6可能发生显著的降解。在优选的情况下，该培养基的pH维持在至少约6上，较为优选的情况下至少为约5.5，更优选的情况下高于4.0。该pH在优选的情况下维持在约5到约5.4，更优选的情况下维持在约5.0到约5.2。尽管本发明未作限定，据信假单胞霉素在碱性pH下的降解是由于内酯环的打开以及ClThr变为Thr。
丁香假单胞菌在大量培养时可产生假单胞霉素A’和/或B’。然而，以葡萄糖以及根据情况以一种酸或碱，例如氢氧化铵进行fed-batch或半连续进料培养以控制pH可提高假单胞霉素的产量。丁香假单胞菌进行的假单胞霉素生产可通过使用连续培养方法进一步加强，在该方法中，以葡萄糖以及根据情况以一种酸或碱，例如氢氧化铵进行自动进料来控制pH。
假单胞霉素A’和/或B’可通过多种本领域的技术人员已知的方法进行检测、测定、分离和/或纯化。例如，在肉汤或在分离或纯化的组合物中的假单胞霉素活性水平可通过其对诸如假丝酵母菌这样的真菌的抗真菌活动来检测。多种用于制备和分析假单胞霉素的方法是已知的。例如，可通过色谱来分离和纯化一种或多种假单胞霉素，例如通过HPLC。
                        药学应用
假单胞霉素A’和/或B’的制剂和抗真菌作用
假单胞霉素A’和/或B’均表现出体内和体外活性并且因此可用于抵抗系统真菌感染或真菌皮肤感染。因此，本发明提供了一种抑制真菌活性的方法，该方法包括使假单胞霉素A’和/或B’或它们的一种药学上可接受的盐同一种真菌相接触。一种优选的方法包括对多种真菌的生长或活动进行抑制，这些真菌包括C.parasilosis、C.albicans、Cryptococcus neoformans以及Histoplasmacapsulatum。本文所用的使本发明的一种化合物同一种寄生虫或真菌相接触指的是本发明的一种化合物同一种寄生虫或真菌的一种连接或联合，或者表面接触或相互接触。但是，术语接触并不意味着任何的抑制机制。
本发明进一步提供了一种治疗一种真菌感染的方法，该方法包括以一种有效量的假单胞霉素A’和/或B’或它们的一种药学上可接受的盐、水合物或酯对需要该处理的宿主进行给药。一种优选的方法包括对多种真菌造成的感染进行治疗，这些真菌包括C.parasilosis、C.albicans、Cryptococcus neoformans以及Histoplasmacapsulatum。当以有效并且适当的量进行给药时，假单胞霉素A’和/或B’的一种制剂降低了真菌感染的负担，减轻了与真菌感染相关的症状，并且可导致该真菌感染的消除。
需要抗真菌治疗的一些患者具有严重的感染症状，例如高烧，并且可能处于加强或病危护理中。多种真菌可导致这样的严重感染。例如，假丝酵母菌spp。可能导致粘膜和严重的系统感染。吡咯或多烯抗性的假丝酵母菌的报道频率正在增加。Aspergillus导致威胁生命的系统感染。Cryptococcus与脑膜炎有关。这样的严重真菌感染可能发生在免疫受损的患者体内，例如那些接受了器官或骨髓移植、正在进行癌症化疗、正从大型手术中恢复或遭受HIV感染的患者。对于这样的患者，抗真菌治疗典型地包括以一种制剂进行几天或更长时间的静脉内给药以阻止感染，该制剂含有假单胞霉素A’和/或B’。
涉及到抗真菌活性，术语“有效量”指的是本发明的化合物的一种量，该量的化合物能够抑制真菌的生长或活动，或者可以减轻真菌感染的症状。对于多数的真菌感染，感染症状的减轻包括退烧、恢复知觉或者提高该患者的生活质量。在优选的情况下，这些症状可以通过杀灭真菌以消除感染，或将感染降低至患者可忍受的程度或患者的免疫系统可控制的程度。本文所用的抑制指的是对真菌活动的抑制，该抑制包括对真菌生长或任何伴随的特征以及真菌的存在所导致的结果的终止、延缓或预防性的阻碍或防止。
用于给药的剂量可根据诸如感染性质和严重程度、宿主的年龄和整体健康状况以及该宿主对抗真菌试剂的耐受能力而变动。在典型的情况下，以足以抑制真菌感染的有效量的组合物对有需要的患者(人类或其它动物，包括哺乳动物，例如猫、马和牛，但不限于这些，还包括鸟类)进行给药。特定的药剂方案同样可根据这样的因素而变动并且可以以日单剂量或日多剂量给药。该方案可持续约2-3天到约2-3周或更长时间。一个典型的日单剂量(一次给药或以分割剂量给药)所含有的药剂水平为从约0.01mg/kg体重到约100mg/kg体重的本发明的活性化合物。优选的日剂量一般从约0.1mg/kg到约60mg/kg，在理想的情况下从约2.5mg/kg到约40mg/kg。对于严重感染，该化合物可以通过静脉灌输来进行，例如使用0.01到10mg/kg/小时的活性成分。
本发明还提供了可用于以本发明的抗真菌化合物进行给药的药学制剂。因此，本发明还提供了一种药学制剂，该制剂包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、携带物、赋形剂或其它添加剂，还包括假单胞霉素A’和/或B’。在这样的制剂中的活性成分包括该制剂重量的约0.1％到约99.9％，更普遍的情况下为约10％到约30％。“药学上可接受的”指的是该载体、稀释剂或赋形剂与制剂中的其它成分兼容并且对其受体无毒。
该制剂可以含有诸如各种油类的添加剂，这些油类包括石油、动物油、植物油或合成来源的油类，例如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。合适的药物赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、干燥脱脂牛奶、甘油、丙二醇、水和乙醇。可对该组合物使用传统的药物赋形剂，例如灭菌，并且可以含有传统的药物添加剂，例如防腐剂、稳定剂、湿剂或乳化剂，调节渗透压的盐，以及缓冲液。适当的药学载体和它们的制剂的描述见Martin，“Remington’s PharmaceuticalSciences”，15th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton(1975)，例见pp.1405-1412以及1461-1487。
本文所使用的术语“药学可接受的盐”指的是上述的化合物的盐，这些盐对于活的有机体基本无毒。典型的药学可接受的盐包括通过本发明的化合物与一种无机或有机酸或一种无机碱。这样的盐被称为酸加成盐和碱加成盐。
通常用于形成酸加成盐的酸为无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸，也可以是有机酸，例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、安息香酸和乙酸。这样的药学可接受的盐为硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、溴化盐、碘化盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、acrylate、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐(propionate)、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、顺丁烯二酸盐、丁炔-1-4-二酸(butyne-1，4-dioate)、己炔-1，6-二酸(hexyne-1，6-dioate)、安息香酸盐、氯代苯甲酸(chlorobenzoate)、甲基苯甲酸(methylbenzoate)、二硝基苯甲酸(dinitrobenzoate)、hydrobenzoate、甲氧基苯甲酸(methoxybenzoate)、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸以及苯基乙醇酸盐。优选的药学可接受的酸加成盐为诸如同盐酸和氢溴酸这样的无机酸以及同诸如顺丁烯二酸和甲磺酸这样的有机酸形成的盐。
碱加成盐包括来自无机碱的盐，例如铵、或碱金属或碱土金属的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。由此，可用于本发明的盐的制备的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙以及碳酸钙。钾盐和钠盐形式特别地优选。
应当认识到，只要一种盐其整体为药学可接受的并且其平衡离子并不对该盐的整体造成不良性质，形成本发明的任何盐的一部分的特定平衡离子并不是关键性的。
假单胞霉素A’和/或B’可以进行不经肠胃的给药，例如使用肌肉间、皮下或腹膜内注射、鼻腔或口腔途径。除这些给药方法之外，假单胞霉素A’和/或B’可被局部应用于皮肤表面感染或用于消除或抑制粘液中的真菌感染。
对于非肠胃给药，该制剂包括假单胞霉素A’和/或B’以及一种药学可接受的稀释剂，如去离子水、生理盐水、5％的葡萄糖和其它常用稀释剂。该制剂可含有一种环糊精和/或一种增溶试剂，如聚乙二醇或聚丙二醇或其它已知的增溶剂。这样的制剂可包装入消毒的药瓶中，该瓶中含有干粉状或冻干的该抗真菌制剂和赋形剂。在使用之前，加入一种药学可接受的稀释剂并以注射器将溶液从瓶中取出以用于对患者进行给药。
本药学制剂通过一致的程序使用已知的并且可容易获得的组分进行制备。在本发明的组合物的制备中，该活性组分一般同一种载体进行混合，或以载体进行稀释或以载体进行封装，该载体可以为胶囊、小袋、纸或其它容器形式。当载体作为一种稀释剂起作用时，该载体可以为固体、半固体或液体材料，该材料可作为活性成分的一种载体、赋形剂或介质。这样，该组合物可以为药片、药丸、粉末、药糖块、药囊、胶囊、酏剂、悬浮物、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶(固体或液体介质)、药膏的形式，该药膏中含有，例如，最高至重量百分比10％的该活性化合物，该组合物还可以为软或硬明胶胶囊、栓剂、消毒的注射溶液和消毒的包装粉末形式。
对于口腔给药，该抗真菌化合物被装填入明胶胶囊或被制成药片。这样的药片还可以含有一种粘合剂，一种分散剂或其它的适当赋形剂，这些赋形剂适于将假单胞霉素A’和/或B’药剂制成合适大小的药片。对于儿科或老人的应用，该抗真菌化合物可被制成一种可口的液体悬浮物、溶液或乳剂。优选的口腔制剂为亚油酸、cremophorRH-60和水，在优选的情况下为体积比为8％的亚油酸、5％cremophorRH-60、87％无菌水和含量为约2.5到40mg/ml假单胞霉素A’和/或B’。
对于局部使用，该抗真菌化合物可被制成干粉以用于皮肤表面，或者可被制备成液体制剂，该制剂含有溶解性的含水液体或不含水的液体，例如乙醇或甘油。
假单胞霉素A’或B’制剂的使用
本发明还包括一种试剂盒，该试剂盒含有本药学组合物并可被用于本发明的方法。该试剂盒可含有一种药瓶，该药瓶含有本发明的一种制剂和适当的载体，干燥形式或液体形式均可。该试剂盒进一步含有用于该化合物给药的指导说明，该说明为药瓶上的标签形式和/或该药瓶的包装盒中的插入说明。该说明可被印刷在药瓶的包装盒上。该说明包含有诸如充分剂量以及给药信息这样的信息以使本领域的工作人员进行给药。预计本领域的工作人员包括任何医生、护士或可以给药的技术人员。
本发明还涉及到一种药学组合物，该组合物含有假单胞霉素A’和/或B’的一种制剂，并且该组合物适于通过注射进行给药。根据本发明，假单胞霉素A’和/或B’的一种制剂可被用于制造一种组合物或药剂，该组合物或药剂适于通过注射给药。本发明还涉及到用于制造组合物的方法，该组合物含有假单胞霉素A’和/或B’的一种制剂，该制剂为适于通过注射进行给药的形式。例如，可通过几种方法使用传统工艺制造一种液体或固体制剂。可通过将假单胞霉素A’和/或B’在适当的pH溶于一种适当的溶剂，例如溶于水来制备液体制剂，该溶剂包括缓冲液或其它赋形剂。
                       农业应用
产自丁香假单胞菌NRRL B-12050的抗生素已经证明可有效地治疗荷兰榆树疾病。(例见，美国专利Nos.4,342,746和4,277,462)特别地，丁香假单胞菌MSU 16H已经表明可在被Ceratocystis ulmi感染的榆树体内导致比野生型菌株更强的防护，Ceratocystis ulmi是荷兰榆树疾病的引发物。(例见，Lam et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,6447-6451(1987))。在土栽榆树上进行的更广泛测试证实了在预防水平上的生物控制现象。因此，本发明的假单胞霉素可被用作对荷兰榆树疾病的预防处理。
已经表明该假单胞霉素对广泛范围的植物病原真菌具有毒性，这些真菌包括Rynchosporium secalis，Ceratocystis ulmi，Rizoctonic solani，Sclerotinia sclerotiorum，Verticilliumalbo-atrum，Verticillium dahilae，Thielaviopis basicola，Fusarium oxysporum以及Fusarium culmorum。(见Harrison，L.，et al.，“Pseudomycins，a family of novel peptides fromPseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungalactivity”，J.of General Microbiology，7.2857-2865(1991))。因此，被分离的假单胞霉素A’和/或B’(包括水化物、溶剂化物及其酯)可以用于对植物体内的真菌的治疗(特别是V.albo-atrum、R.solani以及F.oxysporum)，作为直接的处理或预防性处理均可。通常情况下，被感染的植物通过向其注射或喷洒假单胞霉素化合物的一种水化悬浮物来进行治疗。注射的方法为本领域的技术人员所熟知(例如，gouge pistol)。可以使用任何可使有效量的活性物质分布于植物表面的喷洒悬浮物的方法。该悬浮物可含有其它的添加剂，这些添加剂通常为本领域的技术人员所使用，例如增溶剂、稳定剂、加湿试剂及它们的组合。
对该植物的治疗还可使用一种干组合物来完成，该组合物含有被分离的假单胞霉素A’和/或B’化合物。该干制剂可通过本领域的技术人员所知的任何方法而被应用于植物表面，例如从容器中喷出或摇出。
本发明可通过参考以下实施例而被更好地理解。这些实施例意图显示本发明的具体实施方案而非作为本发明的范围的限定。
                      实施例
                   保藏的生物材料
丁香假单胞菌MSU 16H可公开地获自American Type CultureCollection，Parklawn Drive，Rockville，MD，USA，其保藏号为No.ATCC 67028。丁香假单胞菌菌株25-B1、7H9-1和67H1于2000年3月23日保存于American Type Culture Collection，被指定为以下的Nos.：
25-B1    保藏编号No.PTA-1622
7H9-1    保藏编号No.PTA-1623
67H1     保藏编号No.PTA-1621
                       实施例1
                 假单胞霉素A’和/或B’
发酵方法经开发以用于在一种丁香假单胞菌菌株的发酵肉汤中生产假单胞霉素A’和/或B’。
材料和方法
接种物的制备：在液氮中的气相中贮藏的一份细胞被融化并用于接种两瓶900ml的CSM肉汤。CSM肉汤由以下成分组成(g/L)：葡萄糖(5)、麦芽糖(4)、Difco胰酶大豆肉汤(30)、Difco酵母抽提物(3)以及MgSO47H2O(2)。约0.5mL的细胞被用于接种在2L的烧瓶中的900mL培养基。烧瓶被接种并在25℃下振荡24小时。两个烧瓶中的内含物一起被接种入一个150L的发酵罐，该罐中含有115L的灭菌过的发酵肉汤。
发酵阶段：发酵肉汤由以下成分组成(g/L)：葡萄糖(20)、可溶淀粉(5)、Basic American Foods Country Style Potato Pearls土豆泥(30)、甘氨酸(1)、MgSO47H2O(0.2)、KCl(0.2)以及FeSO47H2O(0.004)，溶于自来水中。其pH在灭菌之前被调节至5.2。发酵在25℃下进行68小时。溶解的氧被维持在30％空气饱和之上，这可以通过空气气流和搅拌器的搅拌速度的调节来进行。其pH通过添加H2SO4或NaOH而维持在4.0到5.4之间。
批量方法的变化：简单的批量加工的几种变化也被发现可用于产生假单胞霉素A’和/或B’。在开始接种24后可以开始以60mL每小时的速度投放葡萄糖。可在整个发酵期间连续投放。或者，可以使用一种加工过程，在该过程中在开始接种24后开始维持溶解氧在5％的空气饱和度，并且持续直至发酵结束。将溶解氧维持在5％通过向为发酵罐提供的空气中添加惰性的氮气(N2)来完成。在所有的情况下，空气通过一根液面下的喷射管来提供，该管的开口位于发酵罐中的底部搅拌器螺旋之下。
结果和结论
几种发酵方法从丁香假单胞菌中产生假单胞霉素A’和/或B’。
                       实施例2
             假单胞霉素A’和B’的分离和纯化
开发了用于从丁香假单胞菌菌株的发酵肉汤中分离和纯化假单胞霉素A’和/或B’的方法。
材料和方法
完整的发酵肉汤(4×100L)在收集之后以Membralox陶瓷滤器(0.45μm)进行过滤以产生一个过滤组分(级分A)和一个固体浆状物(级分B)。以等体积的含0.1％的TFA的丙酮抽提级分B(135L)120分钟并使其沉降。通过过滤分离出澄清的丙酮抽提物并随后在真空中蒸发成含水溶液以产生级分C(88L)。首先，级分A被上样于一个HP20ss树脂柱(10L)，该柱以水填充并以含0.1％的TFA的15％的乙腈(20L)洗涤。随后以级分C对同样的柱子上样并同上以20L含0.1％的TFA的15％的乙腈(20L)洗涤。
该柱随后以含0.1％的TFA的15-20％乙腈线性梯度洗脱30分钟，并以含0.1％的TFA的20-35％乙腈线性梯度洗脱60分钟，流速为1L/分钟。收集每一升的级分。混合级分6-9(4L)以产生级分D(24g)。以级分D的一部分在一个反相柱(Dynamax C18 41.4×250mm)上进行层析，使用三乙铵磷酸缓冲液(pH3)-乙腈-甲醇作为流动相(进行40分钟的65∶17∶18到30∶35∶35的梯度洗脱，流速40ml/分钟)。混合适当的级分，体积减为75ml并在一个C18柱上同上使用80∶10∶10到46∶27∶27的梯度进行再次层析以产生级分E(113mg)和级分F(116mg)。级分E和F在C18柱上的进一步层析分别产生了45mg的假单胞霉素A’和62mg的假单胞霉素B’。
结果和结论
类似用于纯化其它的假单胞霉素的HPLC方法导致了假单胞霉素A’和B’从发酵肉汤中的纯化。
                      实施例3
             假单胞霉素A’和B’的结构测定
假单胞霉素A’的结构测定
材料和结果
通过高分辨率FABMS测定了假单胞霉素A’的分子式为C52H89ClN12O20[C52H89ClN12O20(M+H)+的m/z为1237.6112，Δ-2.4ppm]。同假单胞霉素A相比较，假单胞霉素A’的分子式显示了一个额外的CH2基团。该结果表明在假单胞霉素A’中N-末端的丝氨酸可能被3，4-二羟基十五烷酸酰化而非如在假单胞霉素A中被3，4-二羟基十四烷酸酰化。这一论点被以下事实支持，在先前特征被研究的所有假单胞霉素中，其核心具有一个独特并相同的缩九肽并且唯一的区别是由疏水侧链的性质所产生。
因此，其NMR谱数据于所有已知的假单胞霉素相同，如假单胞霉素A、B、C和C’。包括TOCSY和HMQC在内的以1H、13C和2D NMR谱进行的对假单胞霉素A’全面分析显示了在其疏水侧链上的3，4二醇功能性并且完成了在该分子上的所有质子和带碳质子的排列(表1)。对假单胞霉素A’的结构的测定根据这些质谱数据进行，NMR数据在下文显示。
质谱和NMR谱数据所产生的假单胞霉素A’结构
表1  假单胞霉素A’在H2O+CD3CN中的1H和13C NMR数据
氨基酸  位置   δH    δC
Ser     NH     8.28      -
        α            4.59      54.0
        β1    4.50      65.5
        β2    4.41
Dab-1* NH     8.48      -
        α             4.15      53.1
        β1    1.98
        γ             2.91      37.4
        NH2   7.50      -
Asp     NH     8.34      -
        α           4.54      51.5
        β1    2.86      36.0
        β2    2.80
Lys     NH     7.80      -
        α           4.16      54.6
        β           1.75      30.8
       γ1     1.31      23.2
       γ2     1.22
氨基酸      位置   δH    δC
            δ             1.54    27.2
            ε             2.83    40.4
            NH2   7.34    -
Dab-2*    NH     8.09    -
           α             4.28    52.1
           β1    2.11    28.7
           β2    1.96
           γ             2.89    37.6
           NH2            -
Thr        NH      7.63    -
           α             4.28    59.8
           β             3.92    68.6
           γ             1.16    20.4
Dhb        NH     9.45    -
           β             6.49    133.9
           γ             1.69    13.5
Hyd.Asp    NH     7.85     -
           α             4.94    56.9
           β             4.78    71.6
ClThr      NH     7.88
           α             4.87    56.0
           β             4.31    72.3
           γ1    3.50    45.6
           γ2    3.42
Side chain 2a     2.47    39.4
           2b     2.30
           3      3.76    72.6
           4      3.39    75.1
           5      1.41    33.3
           6-14   1.21    32.4.30.2X4.29.9.27.2.
                          26.4.23.2
           15     0.81    14.3
*Dab-1和Dab-2的排列可互换
假单胞霉素B’的结构测定
假单胞霉素B’的结构也是通过对质谱和NMR谱数据的解释来完成的。通过高分辨率FAB-MS数据确定了分子式为C49H83ClN12O19[C49H83ClN12O19(M+H)+的m/z为1179.5685，Δ-1.8ppm]。该分子式显示其比假单胞霉素B少两个CH2。包括TOCSY和HMQC在内的以1H、13C和2D NMR谱进行的详细分析以及该谱数据同其它已知的假单胞霉素的数据的比较再一次显示了相同的氨基酸位置。另外，NMR数据显示了3-羟基十二烷酸基团的存在(表2)。这样，假单胞霉素B’的结构如下文显示。
质谱和NMR谱数据所产生的假单胞霉素B’结构
表2  假单胞霉素B’在H2O+CD3CN中的1H和13C NMR数据
氨基酸    位置    δH    δC
Ser       NH      8.31     -
          α              4.64     53.5
          β1     4.54     65.8
          β2     4.35
氨基酸   位置  δH   δC
Dab-1*  NH   8.52    -
         α         4.13    53.3
         β1   2.02    28.7
         β2
         γ           2.94    37.3
         NH2  7.54    -
Asp      NH    8.30    -
         α          4.56    51.6
         β1   2.86    36.0
         β2   2.80
Lys      NH    7.90    -
         α          4.09    54.9
         β          1.75    29.8
         γ1   1.28    23.2
         γ2   1.18
         δ          1.52    27.3
         ε          2.82    40.4
         NH2  7.34    -
Dab-2*  NH    8.24
         α          4.35    51.8
         β1   2.12    29.2
         β2   1.99
         γ          2.90    37.7
         NH2          -
Thr      NH    7.75    -
         α          4.23    60.4
         β          3.93    68.2
         γ          1.18    20.5
Dhb      NH    9.45    -
         β          6.57    134.8
         γ          1.68    13.7
Hvd.Asp  NH    7.79    -
         α          4.95    57.1
         β          4.71    72.0
氨基酸     位置   δH  δC
ClThr       NH    7.98
            α          4.87  55.8
            β          4.31  72.5
            γ1   3.48  45.6
            γ2   3.42
Side chain  2a    2.33  43.8
            2b    2.24
            3     3.85  69.6
            4     1.37  37.6
            5-11  1.20  32.4，30.1，30.1，29.8，23.2
            12    0.81  14.4
*Dab-1和Dab-2的排列可互换
结论
假单胞霉素A’和B’为脂缩酚九肽的一个独特的家族的新成员。尽管这些分子非常接近地类似于已知的假单胞霉素而仅仅在疏水侧链性质上有所区别，但它们应在阐明该类化合物作为抗真菌物的结构-活性的关系上起重要作用。
                        实施例4
         丁香假单胞菌的分离、特征研究和突变
丁香假单胞菌的环境分离菌和突变体被产生并应用于抗真菌试剂的生产。
材料和方法
菌株MSU 174和MSU16-H被分离并且进行了特征研究，过程同美国专利No.5,576,298，该专利属于Strobel等人，发布于1996年11月19日；Harrison et al.，J.“Pseudomycins，a a family ofnovel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity”，J.Gen.Microbiology，137，2857-2865(1991)；以及Lamb et al.，“Transposon mutagenesis andtagging of fluorescent pseudomonas：Antimycotic production isnecessary for control of Sutch elm disease，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，6447-6451(1987)中描述。在本段落中的参考的披露在此引为参考。
额外的菌株通过化学突变而产自这样的野生型和转座子产生的突变体。用于突变的菌株包括MSU 174、MSU 16H和25-B1。在CSM培养基上生长待突变的菌株，随后将之分入含有0、1、2、4、16或32μg/ml化学突变原1-甲基-3-氮-1-亚硝基胍(NTG或MNNG)的培养基。随后冻存这些细胞以备检测和选择。
对突变细胞进行针对理想生长条件和/或一种或多种假单胞霉素的产生的选择，例如假单胞霉素A’和/或假单胞霉素B’。丁香假单胞菌的化学突变体，例如，经突变的菌株25-B1被融化并在N21SM培养基(表5)中稀释至6细胞/ml。该培养基有时含有一种或多种用于选择的组分，例如浓度不同的磷酸。50μL体积的突变细胞被分散入一个96孔圆底微滴度板中以使其平均0.3个细胞每孔。在典型情况下，向每孔中加入硅树脂油以使蒸发最小化。该板在25℃下振荡温育6至12天。
            表5-N21SM的组成
    成份     克每升
    葡萄糖     20
    硫酸铵     0.5
    谷氨酸单钠盐或L-谷氨酸     2
    L-组氨酸     2
    甘氨酸     0.5
    可溶淀粉     5
    KH2PO4     0.2
    Czapek无机盐溶液     2ml
    MES缓冲液     9.8
    调节pH至5.0
温育之后，从各孔中取一份，在典型情况下取5TL进行一系列稀释(例如，1∶56、1∶196、1∶320、1∶686和/或1∶1715)并且在液体微滴度板生物分析中检测其抗假丝酵母菌albicans的活性。该板在37℃下温育过夜，并且评测各孔中C.albicans生长的抑制。选出适当的菌株，接种入CSM培养基(表6)，并且在25℃下生长1到3天。
     表6.完全链霉素培养基(CSM)
  成分     含量(g/L)
  葡萄糖麦芽糖Difco胰酶大豆肉汤Difco酵母抽提物MgSO4·7H2O     543032
  不调节pH
被选择的菌株被保存并接种入含13mL的N21SM培养基的发酵瓶中并在25℃下生长66小时。从该发酵物中取出一份，以等体积的乙腈抽提1小时，离心并倒出用于对一种或多种假单胞霉素的HPLC分析，例如假单胞霉素A’或B’，过程同实施例1-3。产生一种或多种假单胞霉素，例如产生假单胞霉素A’或B’的菌株被再次分离，重新发酵并准备用于大规模生长。
结果
通过上述方法产生了表现出诸如假单胞霉素A’或B’这样的一种或多种假单胞霉素的产生的菌株。
结论
在此披露的选择方法和标准可有效地用于产生可在最低限度培养基中生长并产生一种或多种假单胞霉素，例如产生假单胞霉素A’或B’的丁香假单胞菌菌株。
                         实施例5
            丁香假单胞菌的生长和假单胞霉素的生产
丁香假单胞菌在培养基N21中的发酵产生假单胞霉素的水平适于分离，该培养基不含任何在已公开的媒体中使用过的用于丁香假单胞菌生长的马铃薯产品。
假单胞霉素在振荡烧瓶和N21培养基中的生产
材料和方法
在一个250mL烧瓶内的50mL N21培养基(表7)中生长丁香假单胞菌。以一小份丁香假单胞菌MSU 16H接种物起始该培养，并在一个孵育器中在25℃和70％湿度下维持250rpm振荡7天。孵育结束时，从烧瓶中取出4mL肉汤并同6mL含有0.1％的磷酸的甲醇混合。据信低pH可使假单胞霉素稳定。通过过滤或离心除去颗粒状物质并且同上文通过HPLC测定假单胞霉素。
      表7-N21培养基的组成
    成分     克每升
    蔗糖     35
    硫酸铵     0.5
    谷氨酸单钠盐     2
    L-组氨酸     2
    甘氨酸     0.5
    可溶淀粉     5
    KH2PO4     0.2
    Czapek无机盐溶液     2mL
    酵母浸出液     1
    MES缓冲液     9.8
    调节pH至5.2
使用含有和不含添加的豆蔻酸甲酯的N21培养基对丁香假单胞菌的几个菌株的假单胞霉素生产进行评测。经评测的丁香假单胞菌的菌株包括MSU 16H、25-B1、67H1和7H9-1。
结果
当在有和不含添加的豆蔻酸甲酯的N21培养基中生长时，丁香假单胞菌的多种菌株产生水平明显的一种或多种假单胞霉素，例如，高于10Tg/mL的假单胞霉素A、假单胞霉素B和/或假单胞霉素C的一种或多种。豆蔻酸甲酯刺激特定菌株的假单胞霉素生产。
结论
丁香假单胞菌的多种菌株在缺乏马铃薯产品的培养基中产生具商业价值的假单胞霉素，并且该生产可被豆蔻酸甲酯刺激。
使用N21培养基在5,000L规模上生产假单胞霉素
用于使用一种不含添加的马铃薯产品的培养基来生产假单胞霉素的方法被扩展到5,000升水平。
材料和方法
以冻存的假单胞霉素培养物对含有完全链霉素培养基的vegetative-stage烧瓶进行接种并且在25℃下以250rpm振荡24小时，在典型情况下该培养物为菌株67H1。对这些vegetative-stage烧瓶温育24小时后，这些烧瓶被用于接种bump-stage烧瓶。这些bump-stage烧瓶含有CSM培养基，维持在25℃下以250rpm摇转。以来自三到四个vegetative-stage烧瓶的约0.45mL的收集的培养物对这些bump-stage烧瓶进行接种。该bump-stage烧瓶在典型情况下含有900mL的CSM，该CSM处于一个无塞的2.5L TunairTM烧瓶中。每个发酵罐设置两个在TunairTM烧瓶中的bump-stage培养物，bump-stage烧瓶温孵16小时。
随后，通过在一个接种bazooka中混合来汇合两个bump-stage培养物。这些混合的培养物被用来接种一个大罐，该罐含有在表15中描述的培养基，该培养基被补充以额外的3g/L的甘氨酸(总共4g/L)、1g/L大豆油以及1g/L的酵母抽提物。在25℃下生长这些大规模培养物3到4天。在这一生长期间，以搅拌和空气流将溶解氧控制在30％的空气饱和度。通过根据需要添加硫酸或氢氧化钠来将pH控制在5.2±0.2。启动大规模培养18个小时后开始以200mL/小时的速度加入葡萄糖。启动大规模培养20个小时后开始以20mL/小时的速度加入氢氧化铵。在该培养期间，保持压力为5psig。搅拌的起始设置为150rpm，空气流为0.5scfm。如果需要，还可加入一种防泡沫试剂。可以测试对这些条件的改动。三到四天的大规模培养后，收集该丁香假单胞菌。如实施例6测量抗真菌活性。
结果与结论
在5,000升规模下，使用不含添加的马铃薯产品生产了具有商业意义的量的假单胞霉素。
                         实施例6
                  假单胞霉素的纯化和测定
通过抗真菌活性进行的假单胞霉素的检测和定量
一种假单胞霉素或几种假单胞霉素的混合物的存在或量可通过测量一个制备物的抗真菌活性来测定。通过使用标准的琼脂稀释测试或碟分散测试(disc-diffusion test)而获得该制备物的最低抑制浓度(MIC)来在体外测定抗真菌活性。一种或多种假单胞霉素的制备物可以是细胞培养物的一个抽提物或一种更加纯化的混合物。用于测试抗真菌活性一种典型的真菌为C.albicans。当测试制备物在假丝酵母菌albicanx 657接种的琼脂平板上导致10-12mm直径抑菌圈时抗真菌活性被认为是明显的。
根据临床实验室标准国家委员会(National Committee forClinical Laboratory Standard)的规定，抗真菌的研究使用在96孔板中的微滴度肉汤稀释分析来进行。调节Sabourauds和葡萄糖肉汤至含有2.5×104分生孢子/ml。将测试化合物溶于水中并在起始于最高浓度为20μg/ml的二倍稀释液中进行测试。平板在35℃下温育48小时。表3和4的结果显示了与未处理的生长参照相比该化合物的完全抑制生长的最低抑制浓度(MIC)。
      表3.假单胞霉素A’的抗真菌活性
    有机体     MIC(μ/ml)
    假丝酵母菌albicansC.parapsilosisCryptococcus neoformansAspergillus fumigatusHistoplasma capsulatum     2.55.01.25＞205.0
      表4.假单胞霉素B’的抗真菌活性
    有机体     MIC(μ/ml)
    假丝酵母菌albicansC.parapsilosisCryptococcus neoformansAspergillus fumigatusHistoplasma capsulatum     10101.25＞201.25-5.0
通过HPLC对假单胞霉素的检测和定量
通过过滤或离心澄清一个据信含有一种或多种假单胞霉素的样品。该澄清混合物在一个Zorbax RxC8柱(3.5T颗粒25×0.46cm)中以1ml/分钟的流速进行层析。以含0.2％的TFA的20-55％的线性梯度的乙腈进行15分钟的洗脱并在含0.2％的TFA的55％的乙腈中维持5分钟。在典型的情况下，假单胞霉素A’在约13.7分钟被洗脱(822秒)，假单胞霉素B’在约12.4分钟被洗脱(822秒)。通过在215nm下的吸收检测假单胞霉素并通过紫外峰的积分进行定量。各种假单胞霉素的标准被用于鉴定和定量。
                          实施例7
              含有假单胞霉素A’和/或B’的制剂
以下的制剂实施例仅仅是阐释性的，并不在任何方面对本发明进行限制。术语“活性组分”指的是假单胞霉素A’和/或B’或它们的药学可接受的盐。
制剂1
使用以下组分制备硬明胶胶囊：
组分       含量(mg/胶囊)
    活性组分       250
    干燥淀粉       200
    硬脂酸镁       10
    总量       460mg
制剂2
使用以下组分制备一种药片。这些成分经混合和压缩以形成每片重665mg的药片。
组分       含量(mg/胶囊)
   活性组分       250
   微晶的纤维素       400
   烘熏的(fumed)二氧化硅       10
   硬脂酸       5
   总量       665mg
制剂3
制备一种含有以下成分的气溶胶溶液。将活性化合物同乙醇混合，并且将混合物加入气雾发生剂22的一部分，冷冻至-30℃并且转移至一个填充设备中。随即将所需要的量加入不锈钢容器中并以该气雾发生剂剩下的部分进行稀释。随后为该容器装上阀门装置。
组分      含量(mg/胶囊)
    活性组分      0.25
    甲醇      27.75
    气雾发生剂22(氯二氟甲烷) 74.00
    总量      100.00
制剂4
含有60mg活性组分的药片如下配制：
  活性组分     60mg
  微晶的纤维素     45mg
  聚乙烯吡咯烷酮(10％的水溶液)     4mg
  羧甲基淀粉钠(Sodiumcarboxymethyl starch)     4.5mg
  硬脂酸镁     0.5mg
  Talc     1mg
  总量     150mg
以该活性组分、淀粉和纤维素通过一个No.45网眼的US筛并完全混合。将含有聚乙烯吡咯烷酮的水溶液同所产生的这些粉末混合，随后将该混合物通过一个No.14网眼的US筛。在50℃下干燥所产生的颗粒并且通过一个No.18网眼的US筛。先将羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和Talc通过一个No.60网眼的US筛，随后将其加入该颗粒中，将这些物质混合后在一台药片机器上压缩以产生重150mg的药片。
制剂5
含有80mg活性组分的胶囊如下配制：
    活性组分     80mg
    淀粉     59mg
    微晶的纤维素     59mg
    硬脂酸镁     2mg
    总量     200mg
将该活性组分、淀粉和纤维素混合后通过一个No.45网眼的US筛并且将其每200mg装填入硬明胶胶囊。
制剂6
含有225mg活性组分的栓剂如下配制：
    活性组分     225mg
    饱和的脂肪酸甘油酯     2,000mg
    总量     2,225mg
以该活性组分通过一个No.60网眼的US筛并悬浮于饱和的脂肪酸甘油酯中，该酯事先使用所需的最低热量进行融化。随后将该混合物倒入一个普通的2克栓剂模具中并将其冷却。
制剂7
50mg活性组分每5ml剂量的悬浮物如下配制：
    活性组分     50mg
    羧甲基纤维素钠(Sodiumcarboxymethyl cellulose)     50mg
    糖浆     1.25ml
    安息香酸溶液     0.10ml
    调味剂     q.v.
    色素     q.v.
    加纯水至总量     5ml
将该活性组分通过一个No.45网眼的US筛并且将其同羧甲基纤维素钠和糖浆混合以形成均匀的糊状物。以一部分水稀释安息香酸溶液、调味剂和色素并搅拌加入。随后加入足量的水以产生所需体积。
制剂8
如下制备一种静脉内制剂。这些组分的溶液通常以1ml每分钟的速度对医疗对象进行静脉内给药。
    活性组分     100mg
    等渗的盐     1,000mg
本发明已经参考多种具体和优选的实施例以及工艺进行了描述。然而，应当考虑到在保持本发明的精髓和范围的情况下可以做出许多的改动和修饰。

Claims (3)

1.一种被分离的具有以下结构式的假单胞霉素A’：
2.一种被分离的具有以下结构式假单胞霉素B’：
Figure C008062580002C2
3.一种抑制真菌在植物上或植物中生长的方法，该方法包括将植物与分离的假单孢霉素接触，该假单孢霉素包括具有以下结构的假单胞霉素A’
Figure C008062580003C1
、以下结构的假单胞霉素B’、
或它们的一种混合物。
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