CN1156965A - 细胞因子调节剂及其在与改变的细胞因子水平相关的病理和状态中的应用方法 - Google Patents

细胞因子调节剂及其在与改变的细胞因子水平相关的病理和状态中的应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及为潜在的细胞因子调节剂的新的肽。另外，本发明还涉及包括药物可接受载剂和细胞因子调节剂的药物组合物。给予患者这样的细胞因子调节剂可以增强或抑制细胞因子活性，因此，本发明提供了调节患者的细胞因子活性的方法，该患者具有以发生改变或迷乱的细胞因子活性为特征的状态。本发明还提供了治疗以下状态的方法，包括，例如，废用性去适应，氧化氮和细胞因子介导的疾病，药物负反应，肥胖，脓毒休克，和癌症化疗引起的或器官移植时出现的副作用。

Description

细胞因子调节剂及其在与改变的细胞因子水平相关的病理和状态中的应用方法
发明背景
本申请是1995年6月7日申请的系列号为No.08/484,262的申请的部分继续申请，而后者又是申请日为1995年3月6日、申请号为No.08/400,983的申请的部分继续申请。此处的每个申请以其全文作为参考文献。
发明领域
本发明一般地涉及肽化学和分子病理学，更具体地说，涉及新的细胞因子调节剂和其在控制细胞因子调节的生理过程和病理中的应用。
背景信息
细胞因子是一类可溶性分泌蛋白，由各种各样的细胞在应答不同种类的诱导刺激如环境的，机械的和病理的胁迫的情况下产生。淋巴样细胞，炎症细胞和红细胞生成细胞分泌各种各样的细胞因子，这些细胞因子通过控制细胞增殖，分化和效应物功能来调节免疫反应。例如，在免疫反应中因应答T细胞刺激而产生的调节性细胞因子可以是免疫抑制的或免疫刺激的。与改变的细胞因子水平相关联的免疫反应和急性期反应可以因，例如，与废用性去适应，癌症治疗，脓毒休克和其它细菌相关病理导致的器官损坏，药物负反应，氧化氮介导的组织损坏和糖尿病而发生。
正常状态下，组织中的细胞因子浓度非常低，它们的作用是通过与特殊细胞类型上的高亲和性受体相结合来介导的。诸如白介素(IL)，干扰素(IFN)，集落刺激因子(CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)等的不同细胞因子在免疫，发炎，修复和急性期反应时产生，它们控制这些反应的不同方面。伴随着这种免疫，发炎，修复或急性期反应的诱导，不同的细胞因子的浓度在不同的时间可以增加或降低。例如，增加的细胞因子水平与一系列诸如太空飞行，固定，脊索损伤和卧床休息等导致废用性去适应的状态相伴随。在太空飞行中，例如，实验对象一旦处于失重状态时TNF，IL-6和IL-2水平即增加，从太空返回后恢复正常。
改变的细胞因子水平也与异常的骨骼代谢和在固定术，脊索损伤或长期卧床休息时发生的迅速脱钙相关联。与此相似，在诸如对器官损坏的修复和自身免疫反应，与器官移植，癌症化疗时使用环孢菌素相关联的肾中毒等的长期状态时和肥胖或患糖尿病，脓毒休克(内毒性的)或肾小球性肾炎的个体中，细胞因子水平会发生改变。
包括TNF，CSF，干扰素和白介素等的细胞因子调节寄主防御反应，细胞调节和细胞分化。例如，这些细胞因子可以诱导患者发热，可以引起T细胞，B细胞和巨噬细胞活化，可以影响其它细胞因子的水平从而导致级联效应，藉此，其它细胞因子调节第一个细胞因子的生物学水平和活性。
细胞因子可通过免疫刺激或免疫抑制效应调节免疫反应。例如，IL-10可以封闭包括TNF，IL-1和IL-6在内的很多炎症细胞因子的活性，而增高诸如IL-12等的抗炎细胞因子。由巨噬细胞和其它细胞产生的IL-10也刺激肥大细胞和胸腺细胞的增殖，抑制单核细胞和巨噬细胞的各种功能。这种单核细胞和巨噬细胞被抑制的结果是T细胞的活性也被影响。在免疫系统中IL-10的全部作用只是刚刚开始被了解。
细胞因子具有多种生物学活性并与不止一种细胞相互作用。因此，选用某特定细胞因子或细胞类型来防止治疗时的破坏性副作用是不可能的。防止由于非期望的和不可控制的细胞因子活性的过度抑制或过度刺激引起的损坏作用的更好方法是调节免疫反应中涉及的相关或控制性细胞因子的表达而不消除或过分表达任何其它的细胞因子。这样的治疗不会创建或加重某病理的或持续的免疫反应。以这种方法，可以防止诸如免疫抑制或自身免疫反应等的病理免疫介导的效应，保持内环境稳定。
皮质类固醇可以用于调整细胞因子表达。但是它们可引起完全的免疫抑制，并有其它非期望的诸如诱导“萎缩”综合症，糖尿病和骨质疏松症的副作用。与此类似，诸如ketorolac(Toradol；Syntex)的非类固醇抗炎药物(NSAID)，对治疗炎症和疼痛有效，但是，NSAID也通过抑制前列腺素的产生引起非期望的副作用，可以导致包括胃溃疡，出血和肾衰竭在内的潜在的严重并发症。
为了防止由上述的细胞因子迷乱表达引起的病理状态或对正常免疫介导的功能的干扰，精确操作和有效控制细胞因子水平将是有利的。因此，需要某种可以调整患者的细胞因子水平而不引起非期望的副作用的制剂。另外，还需要鉴定可以用于治疗与改变的细胞因子水平相关的病理和状态的制剂。本发明满足了这些需要而且提供了相关的便利。
本发明概述
本发明涉及为潜在的细胞因子调节剂的新肽。正如本文所披露的，这种细胞因子调节剂具有通用结构，X1-X2-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-X3，和X4-X5-(D)Phe-Arg-(D)-Trp-X3，其中X1，X2，X3，X4和X5可以是氨基酸或氨基酸类似物。本发明涉及具有Ac-His-(D)Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2结构的细胞因子调节剂，其含有一个还原的(D)Trp类似物。
另外，本发明还涉及包括药物可接受载剂和一种或多种细胞因子调节剂的药物组合物。给予患者这样一种细胞因子调节剂或其联合使用可以修饰个体内的不同细胞因子的水平，由此，根据所调节的特定细胞因子，将产生免疫刺激或免疫抑制。
本发明还提供了通过增强患者的细胞因子活性来调节的方法，和治疗以改变的或迷乱的细胞因子活性为部分特征的状态、病理或损伤的方法。这些状态、病理或损伤包括废用性去适应，氧化氮和细胞因子介导的疾病，糖尿病，肥胖，自身免疫疾病，脓毒休克(内毒性的)，肾小球性肾炎，诸如移植时发生的器官损坏和诸如肾中毒的癌症化疗的副作用。
附图的简要描述
图1a和1b显示一种细胞因子调节剂能有效地抑制因环孢菌素诱导的肾中毒而发生的肾小球滤过率降低。
图2显示EX-2增强小鼠血浆中的IL-10水平。
图3a和图3b显示EX-2增强人血浆中的IL-10水平。
图4显示用EX-2处理的肥胖大鼠(fa/fa)和正常(Fa/+)大鼠的体重。
本发明的详细描述
本发明涉及具有X1-X2-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-X3结构的新的细胞因子调节剂，其中：
X1是
Figure A9619045100111
，H或COCH3；
X2是
Figure A9619045100121
；和
X3是
Figure A9619045100122
，或R5；其中Y是O，H2或S；R1是H，COCH3，C2H5，CH2Ph，COPh，COO-叔丁基，COOCH2Ph，CH2CO-(聚乙二醇)或A；R2是H或COCH3；R3是一个具有1到6个碳原子的线性的或分支的烷基基团或一个具有3到6个碳原子的环烷基团，R4是(CH2)m-CONH2，(CH2)m-CONHR1或(CH2)m-CONHA；R5是OH，OR3，NH2，SH，NHCH3，NHCH2Ph或A；和R6是H或R3；其中“Ph”是C6H5；“m”是1，2或3；“n”是0，1，2或3；和“A”是具有如下通式的碳水化合物：
Figure A9619045100123
在本发明的一个实施方案中，肽的X1和X2具有上述的任何一种变化，特别是X3为OH(X3是R5，其中R5是OH)。在另外一个实施方案中，Y，R1，R2，R4，R5和R6可以是上述的任何一种变化，R3是一个具有3到6个碳原子的环烷基团。
由上面披露的结构式所涵盖的肽的例子包括Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2和Ac-(环己基)Gly-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2，其中每个肽都可以调节细胞因子活性。
本发明涉及具有X4-X5-(D)Phe-Arg-(D)Trp-X3结构的新的细胞因子调节剂，其中
X4是 ，H，COCH3，或无；
X5是His，H，或COCH3；和
X3是 ，或R5；其中Y是O，H2或S；R1是H，COCH3，C2H5，CH2Ph，COPh，COO-叔丁基，COOCH2Ph，CH2CO-(聚乙二醇)或A；R2是H或COCH3；R4是(CH2)m-CONH2，(CH2)m-CONHR1或(CH2)m-CONHA；R5是OH，OR3，NH2，SH，NHCH3，NHCH2Ph或A；和R6是H或R3；其中“Ph”是C6H5；“m”是1，2或3；“n”是0，1，2或3；和“A”是具有如下通式的碳水化合物：
Figure A9619045100132
在本发明的一个实施方案中，肽是X4和X5具有上述的任何一种变化，特别是X3为OH(X3是R5，其中R5是OH)的3到5个氨基酸残基的缩短的类似物。在另外一个实施方案中，X4不存在，X5是H或COCH3，X3是R5，细胞因子调节剂是(D)Phe-Arg-(D)Trp的三肽。优选的肽包括可以调节细胞因子活性的His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2；His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-OH；Ac-(D)Phe-Arg-Trp-NH2；和环(His-(D)Phe-Arg-(D)Trp)。
如本文所用到的，术语“调节”或“调节性的”意思是通过增强，限定，限制，遏制，调整或缓和来控制。这种调节包括因诸如细胞因子等的生物学制剂的活性而发生的多向性效应，冗余效应，协同效应或拮抗效应，这些效应可以直接或间接地通过级联或生物学反馈机制影响一系列生物学功能。
如本文所用到的，术语“细胞因子调节剂”意思是通过增强，限定，限制，遏制，调整或缓和细胞因子的生物学活性来控制细胞因子活性的制剂。但是，应该认识到尽管细胞因子调节剂通常可调节细胞因子活性，但是没有提出有关细胞因子调节剂是如何作用以影响以改变的或迷乱的细胞因子活性为特征的状态的具体机制。
细胞因子是本领域所公知的，包括但不限于肿瘤坏死因子(TNFs)，集落刺激因子(CSFs)，干扰素(INFs)，白介素(IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，和IL-15)，转化生长因子(TGFs)，致癌蛋白M(OSM)，白血病抑制因子(LIF)，血小板激活因子(PAF)，和其它介导寄主防御反应，细胞调节和细胞分化的可溶性免疫调节肽(参见，例如，Kuby， Immunology 2nd ed.(W.H.Freeman andCo.1994)；见13章，在本文作为参考文献)。
本发明的细胞因子调节剂可以调节一或多种细胞因子的迷乱的或改变的表达，这种表达发生在包括如病理，免疫反应和炎症反应的各种状态中。这些状态部分地以改变的或迷乱的细胞因子活性为特征，因此可以用一种或多种细胞因子调节剂来调节治疗，本发明综合考虑了这些状态。
如本文所用到的，术语“以......为特征”意思是至少部分地贡献或影响。尽管细胞因子的作用对这些状态来说可以是唯一的、基本的、甚至是主要的因素，但是不是必定的。例如，本领域所公知的某感染具有改变的细胞因子水平，因此是一个以细胞因子活性为特征的状态，但细胞因子活性只是此感染状态的一部分。
如本文所用到的，术语“以改变的或迷乱的细胞因子活性为特征的状态”包括所有细胞因子调节的或调整的病理或损伤，这些病理和损伤包括免疫、发炎和与损伤相关联的痊愈过程。熟练技术人员可以通过鉴定与健康个体中的正常水平相比某特定细胞因子升高或降低的水平或活性来确认这种状态。测定这种正常水平的方法是本领域所公知的。
以改变的或迷乱的细胞因子活性为特征的状态包括，但不限于，废用性去适应，诸如发生在器官移植时的器官损坏；与癌症化疗相伴的负反应；肥胖；诸如由自由基和氧化氮活动介导的糖尿病和动脉硬化症的疾病；细菌内毒性脓毒和相关休克；疼痛；恶病；成人呼吸困难综合症；和自身免疫或其它病理性免疫疾病或反应，如过敏性反应，关节炎，肠炎，肾小球性肾炎，系统狼疮红斑，移植体粥样硬化和诸如Chagas氏病的寄生虫介导的免疫机能障碍。
细胞因子调节剂可以是，例如，包括本文描述的氨基酸或氨基酸类似物的肽，除上面提供的例子外，其它细胞因子调节剂肽的代表例子包括：1)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-OH；2)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；3)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-OC2H5；4)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH-NH2；5)Ac-Nle-Asn-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；6)Ac-Nle-Asn-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-OH；7)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NHCH2CH2Ph；8)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NHCH2Ph；10)Ac-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；11)Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2；12)Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2；13)His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2；14)Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-OH；和15)Ac-His-(D)Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2，其中{(D)Trp(CH2)}是(D)Trp的类似物，在此H2替代了α-羰基氧，(NAc)Gly是带有一个N-乙酰基的甘氨酸衍生物。
上面描述的细胞因子调节剂肽部分地以一个具有(D)Phe-Arg-(D)Trp氨基酸序列或(D)Trp类似物的核心结构为特征，更优选的是具有His-(D)Phe-Arg-(D)Trp核心氨基酸序列或(D)Trp的类似物。本文的氨基酸以通用的三字母代码指示，(D)指明某氨基酸具有“D”构型，与自然产生的L-氨基酸相反。本领域熟练技术人员应该明白没有给出具体构型的氨基酸均为(L)-氨基酸。在上面例举的肽中，“Nle”是正亮氨酸的三字母代码，“Ph”代表一个“苯基”基团(C6H5)。
诸如上面描述的细胞因子调节剂肽是根据Merrifield的固相肽合成方法( J.Am. Chem.Soc.，85：2149(1964)，在本文作为参考文献)的改进方法合成的，或可以用本领域所公知的标准溶液方法合成(参见，例如，Bodanzsky，M.， Principles of Peptide Synthsis 2nd revised ed.(Springer-Verlag，1988 and 1993)，在本文作为参考文献)。由Merrifield的方法制备的肽可以用诸如Applied Biosystems 431A-01肽合成仪(Mountain View，CA)合成，或使用Houghten， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 82：5131(1985)描述的人工肽合成技术(引入本文作为参考文献)。
肽用氨基酸或氨基酸类似物合成，其活性基团有必要用如t-丁基二碳酸酯(t-BOC)基团或芴甲氧羰基(FMOC)基团来保护。氨基酸和氨基酸类似物可以商购得到(Sigma ChemicalCo.；Advanced Chemtec)或用本领域所公知的方法合成。用固相方法合成的肽可以结合到包括4-甲基二苯甲基胺(MBHA)，4-(氧甲基)苯乙酰胺和4-(羟甲基)苯氧甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)(王氏树脂)的树脂上，所有树脂均可从市场买到，或结合到p-硝基苯并酚肟聚合物(肟树脂)上，此树脂可以按De Grado and Kaiser， J.Org.Chem.47：3248(1982)的描述合成，引入本文作为参考文献。
本领域熟练技术人员应该知道掺入肽的氨基酸或氨基酸类似物的选择部分依赖于细胞因子调节剂所要求的特定物理、化学或生物学特性。这些特性部分地由细胞因子调节剂的给药途径或患者需要细胞因子调节剂发挥作用的部位所决定。
肽内反应性基团的选择性修饰还可以给予细胞因子调节剂附加的期望特性。当肽还与树脂结合时就可以对其进行操作以获得诸如乙酰化肽的N-端修饰化合物，或用氟化氢或相当的断裂试剂将肽从树脂上移走并得到修饰。含有C-端羧基基团(王氏树脂)的合成化合物从树脂上断裂下来后可以被修饰，在某些情况下可在液相合成之前修饰。修饰肽的N-端或C-端的方法是本领域所公知的，例如包括N-端的乙酰化方法或C-端的酰胺化方法。与此相似，氨基酸或氨基酸类似物侧链的修饰方法对肽合成领域的熟练技术人员来说是公知的。肽上反应性基团修饰的选择由熟练技术人员要求的细胞因子调节剂应具有的特性所决定。
特定的环状肽也可以作为有效的细胞因子调节剂。环状肽可以通过诱导，例如，肽的N-端氨基基团和C-端羧基基团之间共价键的形成来获得。例如，环(His-(D)Phe-Arg-(D)Trp)肽，它可以通过诱导His和(D)Trp之间共价键的形成来产生，并具有细胞因子调节活性。作为一种选择，通过在末端反应性基团和反应性氨基酸侧链之间或在两个反应性氨基酸侧链之间形成共价键，也可以获得环状肽。本领域熟练技术人员应该知道特定环状肽的选择由肽上的反应性基团和肽的期望特性所决定。例如，环状肽可以使细胞因子调节剂在体内增强稳定性，增加可溶性，降低免疫原性，或降低清除作用。
新合成的肽可以用诸如下面详细描述(参见实施例1)的反相高效液相色谱(RP-HPLC)的方法纯化，或用其它的基于肽的大小和电荷的分离方法。纯化的肽可以用诸如下面详细描述(参见实施例1)的氨基酸分析和质谱分析和其它公知的方法来定性。
本发明还涉及包括一种或多种细胞因子调节剂和一种药物可接受载剂的药物组合物。药物可接受载剂是本领域所公知的，并且包括水溶液如生理缓冲盐溶液或其它缓冲液，或者溶剂或载体如乙二醇、甘油、油类如橄榄油或者可注射的有机酯等。
一种药物可接受载剂可以含有起，例如，稳定细胞因子调节剂或者增加调节剂吸收作用的生理可接受化合物。这类生理可接受化合物包括，例如，碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或者葡聚糖，抗氧化剂，如抗坏血酸或者谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白或其它稳定剂或者赋形剂。本领域熟练技术人员应该知道包括生理可接受化合物的药物可接受载剂的选择依赖于，例如，细胞因子调节剂的给药途径和特定细胞因子调节剂的特殊生理生化特性。
为了调节患者因病理而改变的细胞因子活性(包括降低和升高)，可以用上面描述的细胞因子调节剂或含有细胞因子调节剂的药物组合物给患者用药。例如，可以用此肽或组合物治疗外伤，细菌脓毒和内毒性休克，炎症，疼痛，恶病，成年人呼吸困难综合症，移植体粥样硬化，和诸如关节炎，肠炎，系统狼疮红斑的病理性免疫疾病和其它自身免疫机能障碍，每一种病变都是以病理性升高的炎症细胞因子活性为特征。
如本文所用到的，术语“病理性升高的”意思是细胞因子活性升高至超过正常人群的活性水平，并与病理性反应相关。例如，某特定组织中的IL-1如IL-1β的正常水平可以通过在人群中大量采样来测定。一个患有以细胞因子诱导的病理效应为特征的疾病的患者可以通过测定其细胞因子活性方法来容易地鉴定，其细胞因子活性病理性地升高至超过正常范围并导致诸如发热等的病理反应。
另外，正如下面所详细描述的一样，本发明的肽或药物组合物还可以用于治疗肥胖，废用性去适应和氧化氮介导的疾病，如糖尿病和肾小球性肾炎，移植体粥样硬化，复杂硬化，和降低癌症化疗试剂的副作用，保护器官免受由化疗试剂，抗真菌试剂(两性霉素)，抗细菌试剂(氨基糖苷抗菌素)，和抗病毒试剂(叠氮胸苷)诱导的损害，上述所有状态都与病理性改变的细胞因子水平相关联。废用性去适应
改变的细胞因子水平与一系列导致废用性去适应的状态相关联，如太空飞行，固定术，脊索损伤，卧床休息，和外伤。导致废用性去适应的其它状态的例子有模拟失重，投掷，和神经切除。
例如，太空飞行可改变很多免疫反应和免疫反应的调节成分，包括细胞因子系统。太空飞行和太空飞行的模拟系统影响包括白介素和TNF的各种细胞因子的产生和激活。在太空飞行的第一天，IL-6和IL-2的水平升高，从太空飞行返回后恢复正常。
细胞因子还调整造骨细胞的功能，IL-1和TNF与由固定术，卧床休息和脊索损伤造成的骨内矿质密度快速脱钙和损失有牵连。细胞因子表达和伤后增加的逆行性转运的相关性暗示细胞因子在外周神经损伤中起作用。卧床休息，当与口服类固醇结合时，对由细胞因子介导的急性期反应产生一个特定的快速系统效应。
本发明的一种细胞因子调节剂或含有此肽的组合物可以通过降低或改善与改变的细胞因子活性相关的废用性去适应的副作用而用于治疗废用性去适应。副作用包括，例如，肌肉质量、骨密度、锻炼能力和氧消耗的降低，和肌肉组织中诸如柠檬酸合成酶的氧化和抗氧化酶类水平的降低。器官保护
细胞因子还在器官损害和器官保护中起重要作用。例如，细胞因子显著地影响如下病理和状态如器官移植，尤其是移植器官的排斥反应，移植体粥样硬化，局部缺血-再灌注，环孢菌素诱导的肾中毒，心肌梗塞，和中风。
关于器官移植，细胞因子，尤其是肿瘤坏死因子(TNF)，是异源移植排斥反应的重要中介者。患肾脏，肝脏和心脏异源移植排斥反应的患者中，血清TNF水平升高。在排斥大鼠心脏和肾脏异源移植体和人肾脏和肝脏移植体中已经显示出TNF存在的进一步证据。在肾脏移植患者中的剧烈排斥反应伴随着血清IL-6水平的提高。Ray et al.，J.Am.Soc.Nephr.2(12)：5214-5221(1992)报道在这种反应期间使用糖皮质激素可导致IL-6水平的迅速和显著的下降，同时排斥反应的剧烈性降低。本发明的细胞因子调节剂在降低这种排斥反应的剧烈性和由此引起的损害方面有相似的作用。
给器官移植患者使用诸如环孢菌素的免疫抑制剂也影响细胞因子活性，引起导致肾脏损害的环孢菌素诱导的肾中毒。调节细胞因子的制剂，如本发明的细胞因子调节剂，可以有效地降低环孢菌素诱导的肾中毒。
另外，本发明的细胞因子调节剂可以保护器官免受与局部缺血-再灌注有关的损害，包括肾脏中肾小球滤过率的降低和血管抗性的增高。局部缺血-再灌注损害也与细胞因子的升高有关联。IL-1和TNF介导心肌局部缺血，在骨骼肌局部缺血的再灌注期时IL-1的水平提高。增加的TNF释放导致肝脏的中等和严重局部缺血损害。
因此，本发明提供了一种给器官移植患者使用细胞因子调节剂，以保护患者的器官免受损害的方法。要避免的器官损害可以是如下状态或病理的结果，如器官移植、使用诸如环孢菌素的免疫抑制剂，局部缺血-再灌注，心肌梗塞，中风的结果等等。
本文用到的“损害”包括对整个器官的损害，如器官的机能障碍，或对器官的某一组织的损害。在很多例子中，这种损害不只牵涉细胞因子水平的增加，也与自由基的增加有关。例如，因局部缺血导致的激活的白细胞释放氧自由基并释放对白细胞有趋化性的诸如细胞因子和PAF的攻击性因子。这导致一个循环，其中氧自由基和中介因子如细胞因子是局部缺血后损害加重的原因。
自由基和细胞因子可诱导的损害的类型包括，但不限于炎症，粥样硬化，血管壁通透性增加，纤维化和坏死。这些和其它类型的损害可以用本领域所公知的方法进行组织形态学评估。损害还可以用反映器官机能障碍的生理和生化参数的变化来证实，这些参数对某一特定的器官或组织是专一的，并可以用本领域所公知的技术进行常规测量。例如，指示肾脏损害的肾脏机能障碍可导致肾小球滤过率和肾脏血流量的降低，和肾脏血管抗性的增强。可用作组织和器官损害早期指标的生化参数的例子包括增加的氧化氮或丙二醛水平。丙二醛是脂类过氧化的副产物，因此可指示自由基水平。此外，也可以测定诸如细胞死亡的指示剂乳酸脱氢酶等酶类水平的增加。
可以使用本发明的细胞因子调节剂保护的器官包括，但不限于心脏，肾脏，肝脏，肺，大脑，肌肉，皮肤，或骨骼。可以用本发明来保护的器官内组织的例子有皮肤内的上皮。还包括可以移植的或因使用免疫抑制剂引起的副作用的器官，和遭受局部缺血-再灌注，梗塞，中风或其它可导致细胞损害或死亡的特定状态或病理的器官。同时可以有超过一个的器官被保护。癌症化疗
本发明的细胞因子调节剂或含有该制剂的组合物还可以用于癌症化疗，以降低癌症化疗制剂的肾中毒效应或其它副作用。
诸如顺式氨铂，Taxol和Adriamycin的癌症化疗制剂诱导和加强细胞因子的产生。Taxol，一种稳定微管的抗赘生性制剂，诱导TNF和IL-1的表达并加强巨噬细胞中TNF的产生。接受顺式氨铂治疗的患者中IL-6和TNF的浓度增加，同时在患肾脏或肝脏中毒的患者中细胞因子浓度特别地提高。在癌症患者化学-体温过高时细胞因子的产生也增加。当使用含有顺式氨铂的体温过高-诱导加热的溶液给药时测量TNF和IL-6，治疗开始后30分钟IL-6显著增加，TNF值只是稍稍提高。
如实施例中所示，在癌症化疗中使用本发明的细胞因子调节剂可以降低癌症化疗制剂的肾中毒效应。另外，可以给接受癌症化疗的患者使用此肽以降低化疗药物的其它副作用，包括但不限于，恶心，呕吐，流鼻涕，厌食，疲劳，和其它器官功能障碍。
包括糖尿病和肾小球性肾炎的氧化氮和细胞因子介导的疾病
细胞因子和氧化氮(NO)都是一系列疾病状态的重要中介因子，包括，例如，糖尿病和肾小球性肾炎。在早期胰岛素依赖型糖尿病中细胞因子和NO调节β-细胞损害。IL-1，干扰素γ和TNF诱导胰岛NO。在NO产生的同时，IL-1，干扰素γ和TNF破坏胰岛功能，降低葡萄糖水平和降低葡萄糖诱导的胰岛素释放。大多数由细胞因子引起的对胰岛细胞的有害效应可以通过阻止NO的产生来避免。虽然一些研究显示分离的人胰岛对细胞因子和NO的抑制效应的抗性比分离的啮齿动物胰岛强。但是细胞因子可以抑制人胰岛功能而与其对NO产生的效应无关。
细胞因子和NO还影响肾小球性肾炎引起的损害的程度。在肾炎中TNF和IL-1可增加肾小球损伤的严重性，因此在临床中它们可能在调整肾小球损伤中是重要的。Karker etal.， Clin.Expt.Immunol.90(2)：312-318(1992)报道在肾小球性肾炎中抑制细胞因子的制剂可有效地降低增高的白蛋白水平和组织损害。其它研究揭示诱导性氧化氮合成酶(iNOS)的体内诱导发生在免疫复合体肾小球性肾炎中(Jansen et al.， Kid.Internat.45(4)：1215-1219(1994))。
本发明的细胞因子调节剂可以用于治疗患有由氧化氮和细胞因子介导的疾病的患者，如糖尿病和肾小球性肾炎。如本文所用到的，术语“治疗”包括降低或缓解与由NO和细胞因子介导的特定疾病状态相关的一或多种症状或状态的方法。例如，治疗糖尿病可以通过降低糖尿病患者的葡萄糖水平来表明。细胞因子调节剂对体重的效应
细胞因子调节剂对降低患者的体重有用。特别是，细胞因子调节剂对降低肥胖患者的体重有用。肥胖与非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)之间的联系是本领域所公知的(参见Hotamisligil and Spiegelman，Diabetes 43：1271-1278(1994a))。在肥胖患者的脂肪组织中鉴定出TNF-α的表达增加，TNF-α表达的增加暗示其在这些肥胖患者中出现NIDDM的情况中有作用(Hotamisligil et al.， J.Clin.Invest.95：2409-2415(1995))。但是，在一个大鼠肥胖/糖尿病模型，Zucker fa/fa大鼠模型中使用与TNF受体结合的抗体中和TNF活性的努力没有产生明显的体重降低(Hotamisligil et al.， J.Clin.Invest.94：1543-1549(1994b))。
引人注目的是，给正常或肥胖大鼠使用细胞因子调节剂EX-2，根据给药剂量的不同，引起了体重增长率的显著降低或体重的显著降低(参见实施例20)。如本文所用到的，术语“体重的降低”广泛地用于表示体重的现实降低或与一段时间内预期的正常体重增加相比体重增加率的降低。如实施例20所示，EX-2对正常(非肥胖)大鼠的体重产生小的但明显的降低。这些结果指示细胞因子调节剂可引起体重增加率的降低和体重的降低。
EX-2治疗的大鼠中出现的体重降低与增加的新陈代谢率相关，新陈代谢率的增加由增加的静止氧消耗决定。这些结果显示细胞因子调节剂也对增加患者的静止氧吸收有用。正如上面所讨论的，细胞因子调节剂还可以减轻由于(例如)废用性去适应而产生的最大氧消耗的降低。增加患者最大氧消耗的能力可对患者提供明显的临床优势，如，遭受充血性心力衰竭或其它以氧吸收不足为特征的状态的患者，如在废用性去适应期间发生的氧消耗降低(参见实施例13)。另外，废用性去适应的结果显示用细胞因子调节剂连续治疗至少约两个星期可以在患者内产生积极的适应性变化，导致增强的需氧能力和锻炼表现。因此，细胞因子调节剂可进一步地用于增加患者的氧消耗。如本文所用到的，术语“增加氧消耗”或“增加氧吸收”广泛地用于表示正常的静止或最大氧消耗基线水平以上的增加或期望的静止或最大氧消耗损失的降低。人癌症化疗引起的副作用的治疗
细胞因子调节剂可以用于改良或降低癌症化疗制剂的副作用。在治疗某癌症期间或预防期间，一种细胞因子调节剂可以与一种癌症化疗制剂联合用药，例如，与用于降低乳腺癌再发生的Taxol联合用药。
实施例19披露了细胞因子调节剂EX-2对改良诸如顺式氨铂，Taxol和Adriamycin的癌症化疗制剂的副作用的用途，这些癌症化疗制剂可诱导和增强细胞因子的产生。
通过静脉内注射的方法，可以给正在进行或将要进行癌症化疗或癌症化学预防期间的患者使用EX-2。例如，顺式氨铂，Taxol，Adriamycin或其它化疗或放疗制剂可以与一种细胞因子调节剂联合用药以降低或抑制化疗或放疗引起的副作用。增加哺乳动物内的细胞因子水平
本发明的细胞因子调节剂或含有该制剂的组合物，还可以用于增加一或多种细胞因子的生理水平。例如，某特定状态可降低某细胞因子的水平和活性，从而全部或部分地抑制某免疫反应或免疫系统。以药物有效剂量的一种细胞因子调节剂给药可以增强细胞因子的的水平或活性，从而降低免疫抑制的水平。
细胞因子调节剂可以增加哺乳动物例如人体内的IL-10水平(参见图2和3)。IL-10可以封闭一些炎症细胞因子的激活，包括TNF，IL-1和IL-6，而增量调节诸如IL-12的细胞因子。IL-10还刺激肥大细胞和胸腺细胞的增生。IL-10抑制几种单核细胞和巨噬细胞的功能，例如包括，通过抑制II类MHC表达给T细胞提供抗原；IL-1，IL-6，IL-8，CSF，和TNF的合成；和抗微生物的活性。被抑制的抗微生物活性包括抑制氧化氮和杀微生物代谢物的产生。单核细胞和巨噬细胞IL-10介导的抑制的结果是一些类型的协助T细胞的活性被抑制。尤其是，诸如延迟型过敏细胞和细胞溶解T细胞的TH1细胞被抑制，这些细胞负责细胞介导的功能。TH1细胞抑制的进一步结果是TH2细胞活性增加，尤其是增加B细胞激活，细菌和驱虫剂抗性和过敏反应的T细胞子集。如本文所披露的，使用细胞因子调节剂可增加哺乳动物血浆中IL-10水平(参见实施例17和18和图2和3)，因此对调整，例如，患者的免疫反应有用。
细胞因子调节剂或含有该肽的药物组合物可以用于治疗上述任一种的病理和状态。本领域熟练技术人员应该知道包括细胞因子调节剂的药物组合物可以通过各种各样的途径给予细胞因子活性提高的患者，给药途径包括，例如，口服，阴道内，直肠，或肠胃外，如静脉内，肌肉内，皮下，眶内，囊内，腹膜内，池内或通过皮肤的被动或促进吸收，如使用皮肤贴片或透皮离子电渗疗法。另外，组合物可以通过注射，插管法，口服或局部给药，后者可以是被动的，例如，通过药膏或粉末的直接使用，或是主动的，例如，使用鼻腔喷雾器或吸入器。细胞因子调节剂还可以用局部喷射给药，其中本成分中的一个组成是一个适当的推进剂。如果需要，本药物组合物还可以与脂质体，微球体或其它多聚物基质合并使用(Gregoriadis，Liposome Technology，Vol.1(CRC Press，Boca Raton，FL1984)，在本文作为参考文献列出)。例如，由磷脂或其它脂类组成的脂质体是易于制造和使用的无毒的、生理可接受的和可代谢的载剂。
细胞因子可以在局部表达，如在感染部位，或可以系统表达，例如，在废用性去适应或某免疫反应中。细胞因子表达可以诱导患者的热病(发烧)和痛觉过敏(对疼痛极度敏感)，和巨噬细胞和单核细胞的激活，这些细胞的激活使患者产生或进一步加强炎症反应。因为细胞因子表达可以是局部的或系统的，所以本领域熟练技术人员应该根据患者体内细胞因子的来源和分布来选择细胞因子调节剂的特定给药途径和方法。例如，在遭受诸如废用性去适应的系统状态的患者中，由一种细胞因子调节剂组成的药物组合物可以通过静脉内，口服或其它可以使细胞因子调节剂系统分布的方法给药。但是，在遭受由细胞因子局部表达引起的病理的患者中，如急性呼吸困难综合症，可以将细胞因子悬浮或溶解在适当的药物可接受载剂中，并用鼻腔喷雾器(例如)直接对肺给药。
为了调节细胞因子的生物学活性，细胞因子调节剂必须以有效剂量给药，有效剂量为每次注射每千克体重约0.0001至0.5mg，或另外给药方式的有效剂量为每千克体重约0.0001至100mg。全部有效剂量可以在一段相当短的时间内以一个单剂量给患者用药，或者是丸剂或者是通过注射，或用分次治疗方案给药，即在一段更长的时间内多次用药。本领域熟练技术人员应该知道获得患者所需的细胞因子调节剂浓度的用药有效剂量依赖于很多因素，包括患者的年龄和健康状况，还有给药途径和治疗次数。考虑到这些因素，熟练技术人员应该调整特定剂量以获得有效调节细胞因子活性的有效剂量。
细胞因子调节剂的例子和细胞因子调节剂在阻止或减小或消除细胞因子介导的负生物学效应的疗效的例子提供如下并总结如表I-V。如下面所描述的，诸如实施例2所描述的细胞因子调节剂肽可以有效调节小鼠体内细胞因子的表达(实施例3和4)并减轻细胞因子介导的疼痛，肿胀，发热和致死现象，这些作用是用本领域认可的小鼠，大鼠和兔模型系统来显示，可作为是否对人有效的预测(实施例5至12)。
本文所描述的化合物可用作药剂治疗诸如炎症，疼痛，恶病和病理性免疫疾病，如关节炎，肠炎，系统狼疮红斑和其它自身免疫机能障碍，这些疾病都是以改变的细胞因子活性为特征。另外，实施例提供了本发明的细胞因子调节剂如下用途的证据，这些用途包括缓解废用性去适应的副作用方面(实施例13)，保护器官，尤其是在局部缺血-再灌注损伤和环孢菌素诱导的肾中毒后(实施例14)，降低癌症化疗的肾中毒效应(实施例15)，治疗与氧化氮有关的疾病状态，包括糖尿病和肾小球性肾炎(实施例16)和降低个体的体重(实施例20)。
还有进一步的证据由实施例17至19提供，这些证据证明本发明的制剂可调节细胞因子的表达，并因此对治疗上面提到的状态是有用的。使用细胞因子调节剂后，哺乳动物包括小鼠(例17)和人(例18)中增高的细胞因子水平提供了本发明的制剂调节细胞因子表达和活性的额外证据。
下面这些实施例意在描述而非限制本发明。实施例1  细胞因子调节剂肽的合成
本实施例描述细胞因子调节剂肽的固相合成方法。A. Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH 2
具有Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly(“EX-1”)氨基酸序列的一种细胞因子调节剂肽用Merrifield(1964)的固相肽合成方法的改进方法合成。简而言之，含有t-BOC甘氨酸衍生物的MBHA树脂(Advanced Chemtech；Louisville，KY)加到适于固相肽合成的反应容器中(参见Houghten(1985)，supra)。树脂用亚甲基氯洗三次，t-BOC保护性基团在亚甲基氯中用含有1-2％苯甲醚的三氟乙酸(TFA)除去。然后树脂用亚甲基氯洗涤并用二异丙基乙酰胺处理。
肽通过在二甲基甲酰胺中加入3.2当量的N-甲酰基-BOC-保护的D-色氨酸和3.0当量的二环己基碳二亚胺来延伸。反应用茚三酮监测并进行25分钟，然后树脂用亚甲基氯洗涤。用二-tolulyl-BOC-精氨酸重复上述步骤，然后用需要的被保护的氨基酸直到完整的七肽合成。
七肽合成后色氨酸残基上的N-甲酰基保护基团用含20％六氢吡啶的DMF除去，树脂用亚甲基氯洗涤。肽用含10％苯甲醚的无水氟化氢从树脂上切下来，浓缩反应混合物并用含水的乙酸抽提残余物。移走含有溶解样品的乙酸部分，残余物用水洗涤。将洗涤物加到乙酸部分中并将合并样品浓缩。最终的肽粗提物用RP-HPLC纯化(Vydac C-18柱，用1到60％溶液B梯度30分钟(溶液A是0.1％TFA/水，溶液B是0.1％TFA/乙腈)。
RP-HPLC纯化后测定肽纯度为97％(Vydac C-18柱，用等权的24％溶液B；上述的溶液A和溶液B；在215nm处测定光吸收)。纯化七肽的质量用BioIon 20 Mass Analyer的飞行检波器的时间通过等离子体解吸附质谱分析来测定。测定的EX-1肽的质量为942.7，这实际上与期望的分子量(MS(M+1)＝942.2)相同。B.His-(D)-Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH 2
具有His-(D)-Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2氨基酸序列的本发明的细胞因子调节剂按上面的描述合成并纯化，但有下列改进。Boc-(D)Trp用甲基氯甲酸和盐酸N，O-二甲基羟酰胺转变成相应的N，O-二甲基氧肟酸。用氢化锂铝还原色氨酰胺产生Boc-(D)Trp醛。
Boc-(D)Trp醛的溶液和含氰基氢硼化钠的DMF加到结合在Rink酰胺树脂上的甘氨酸中，树脂在含有1％乙酸的DMF中。当还原的氨基化完成后，第二个胺用乙酸酐乙酰化，树脂用1∶1的三氟乙酸和亚甲基氯摇动以除去Boe基团。剩余的氨基酸的继续连接在一个肽合成仪(applied Biosystems)上完成以产生His-(D)-Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2肽。肽用上面描述的方法从树脂上切下来并进行纯化。实施例2  乙酰化细胞因子调节剂肽的制备
本实施例描述制备N-乙酰化的细胞因子调节剂肽的方法。
七肽Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2按实施例1中A.的描述合成，但是在从树脂上切下新合成的肽之前，通过用乙酸酐，二异丙基乙酰胺和亚甲基氯处理2小时将肽的氨基末端乙酰化。乙酰化后，按上面描述的方法将七肽从树脂上切下来，用RP-HPLC纯化并用质谱分析定性。实施例2的乙酰化七肽，本文命名为EX-2，测定纯度为98％，测定质量为985.2道尔顿，与预期分子量相同。
与实施例1和实施例2描述的相似方法被用于合成本发明的其它细胞因子调节剂，包括Ac-(环己基)Gly-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2(“EX-3”)；Ac-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2(“EX-4”)；Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2(“EX-5”)；和Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2(“EX-6”)。用实施例1中B.描述的方法制备Ac-His-(D)-Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2，只是在从树脂上切下肽之前用过量的乙酸酐将肽乙酰化。实施例3  降低小鼠中脂多糖诱导的肿瘤死亡因子水平
本实施例描述两种细胞因子调节剂在降低脂多糖(LPS；内毒素)处理的小鼠体内肿瘤坏死因子(TNF)水平中的疗效。
体重约为20g的Balb/c雌鼠分成两组，一个对照组和一个处理组。通过腹腔内注射给对照组小鼠使用溶于0.9％盐水的5mg/kg的LPS。处理组小鼠首先用溶于盐水的30μgEX-2或150μg EX-3注射，注射EX-2或EX-3后一分钟，按对照组的描述给小鼠使用LPS。
在LPS使用后不同时间段从处理和对照小鼠的眶窦内采血样，直至使用LPS后4小时。3000g离心5分钟分离血浆，然后用4倍体积的含有1％牛血清白蛋白的1X磷酸盐缓冲液稀释。100μl血清样品用ELISA分析TNF-α(Genzyme；Cambridge MA)。
测定来自每组的六只小鼠中的平均(+/-SEM)TNF-α水平并计算TNF水平下降的百分数。如表I所示，用EX-2处理的小鼠与未处理的对照组小鼠相比TNF-α水平下降50％。用EX-3处理的小鼠与未处理的对照组小鼠相比TNF-α水平下降56％和用EX-4处理降低53％(表II)。这些结果指示本发明的肽可以抑制LPS诱导的细胞因子活性。
                                 表I
                     细胞因子调节剂EX-2的生物学数据生物学测试                                 剂量                   疗效TNF水平的下降                              30μg/只小鼠           50％IL-6水平的下降                             300μg/只小鼠          60％Carageenan诱导的爪肿胀的下降               1μg/只小鼠            45％LPS诱导的致死性的抑制                      11×300μg/只小鼠      83％IL-1诱导的痛觉过敏的下降                   1μg/只小鼠            125％LPS诱导的PMN计数的下降                     100μg/kg              58％IL-1诱导的发热的下降                       50μg/kg               45％
                                       150μg/kg              52％花生四烯酸诱导的耳肿胀的下降               100μg/只小鼠          72％吗啡诱导的呼吸抑制的下降                   10+20+20μg/kg/兔      50％
                                 表II
                   细胞因子调节剂EX-3和EX-4的生物学资料
生物学测试                             剂量                   疗效
                                                           EX-3    EX-4
TNF水平的下降                          150μg/小鼠         56％    53％
Carageenan诱导的爪肿胀的下降           1μg/小鼠           49％    未测
LPS诱导的致死性的抑制                  11×300μg/小鼠     86％    75％
IL-1诱导的发热的下降                   150μg/kg           57％    52％
花生四烯酸诱导的耳肿胀的下降           100μg/k小鼠        62％    未测
吗啡诱导的呼吸抑制的下降               10+20+20            65％    未测
                                       μg/kg/兔实施例4  降低小鼠中脂多糖诱导的白介素-6水平
本实施例描述细胞因子调节剂在降低LPS处理的小鼠体内白介素-6(IL-6)水平中的疗效。
将Balb/c小鼠分组并按上面实施例3的描述处理。在不同的时间段从眶窦采血样直到6个小时，血清的收集和稀释按上面的描述进行。100μl样品用IL-6特异性ELISA测定IL-6水平，按Starnes et al.，J.Immunol.145：4185-4194(1990)方法的改进方法进行。
测定来自每组的六只小鼠中的平均(+/-SEM)IL-6水平并计算IL-6水平下降的百分数。如表I所示，用EX-2处理的小鼠与未处理的对照组小鼠相比IL-6水平下降60％。实施例5  Carageenan诱导的爪肿胀
本实施例描述两种细胞因子调节剂在缓解炎症和疼痛中的疗效。
Carageenan诱导的爪肿胀用Hiltz and Lipton， Peptides 11：979-982(1990)；Vinegar et al.， Fed.Proc.46：118-126(1987)；和Vinegar et al.， J.Pharmacol. Expt.Therap.166：96-103(1969)描述方法的改进方法诱导，每个方法作为参考文献在本文列出。简要地说，用7mg/kg酮胺和0.6mg/kg rompun通过腹腔内注射麻醉成年Balb/c雌鼠。用弹簧测微计(Swiss Precision Instruments)测定脚爪厚度。脚爪厚度以1/100英寸为单位表示。测量基线后，用0.2ml生理盐水(对照)和溶于0.2ml的不同剂量的EX-2或EX-3(处理)注射小鼠的后脚垫。第一次注射后马上注射0.02ml 0.15％K-carageenan(Sigma Chemical Co.；St.Louis，MO.)。
每小时测量一次后脚垫厚度到6小时，测定厚度的变化，计算因EX-2处理而引起的肿胀下降的百分率。如表I和表II所示，腹腔内注射1μg EX-2和1μg EX-3使carageenan诱导的肿胀在2小时测量点相应地下降了45％或49％。实施例6  脂多糖诱导的致死性
本实施例描述细胞因子调节剂EX-2，和EX-3和EX-4在降低LPS诱导的脓毒的致死性中的疗效。
这些实验是根据Rivier et al.， Endocrinology 125：2800-2805(1989)提供的信息来进行的，在本文作为参考文献列出。成年Balb/c雌鼠根据其食欲提供食物和水。用30至300μg溶于0.2ml盐水的EX-2，EX-3或EX-4(处理组)或只用0.2ml盐水(对照组)，每4小时腹腔内注射小鼠(每组10只小鼠)至40小时。第一次注射后马上给每只小鼠注射溶于0.2ml盐水的0.6mg LPS内毒素。LPS注射后，给处理组小鼠或对照组小鼠相应地注射EX-2或盐水。每4小时一次至36小时。
如表I和表II所示，与对照组小鼠相比使用3.3mg EX-2，EX-3，或EX-4(每次300μg，共注射11次)，小鼠的存活率相应地上升83％，86％，和75％。这些结果显示腹腔内注射本发明的细胞因子调节剂可以降低LPS诱导的脓毒的致死性。实施例7  白介素-1β诱导的痛觉过敏的下降
本实施例描述细胞因子调节剂EX-2预防疼痛的疗效。
这些实验是按Poole et al.， Br.J.Pharmacol.106：489-492(1992)；Follenfantet al.， Br.J.Pharmacol. 98：41-43(1989)；和Randall and Sellito， Arch.Internatl. Pharmacodyn.111：409-419(1957)描述的方法的改进方法进行的，在本文作为参考文献列出。成年Sprague-Dawley雄性大鼠(175-275g)用各种各样的压力仪器(IITC LifeSciences；Woodland Hills，CA)通过爪压力技术测量痛觉过敏。使大鼠适应室内环境并在训练开始前触摸三天。在开始痛觉过敏实验前一天，将每只大鼠装入一个袋中，每隔15分钟测量一次爪压力，共两次。第二天，测试每只大鼠表现出逃避反应(诸如全身挣扎和/或叫喊)的压力(毫米汞柱)。约有5-10％的大鼠没有反应并在接下来的实验中排除这些大鼠。
对爪压力有反应的大鼠用1ml/kg的体积不同浓度的EX-2(处理)或只用盐水(对照)腹腔内注射进行预处理。20分钟后，通过足底内注射100μl IL-1β(1单位/100μl)。IL-1注射后2小时，对大鼠进行另外两次爪压力测试，测定与对照组大鼠相比EX-2处理的大鼠适应的毫米汞柱压力的上升。如表I所示，与对照组大鼠相比，用1μgEX-2处理增加了大鼠可忍受的压力，增加幅度为125％。实施例8  成人呼吸困难综合症
本实施例描述细胞因子调节剂EX-2在降低LPS处理的大鼠的呼吸困难综合症中的疗效。
这些实验用Ulich et al.， Am.J.Pathol.141：61-68(1992)和Wheelden et al.，Lab.Animals 26：29-37(1992)描述的方法的改进方法进行。在本文作为参考文献列出。成年Harlan Sprague-Dawley雄性大鼠用70mg/kg酮胺和6mg/kg rompun的混合物通过腹腔内注射麻醉。在每只麻醉的大鼠的颈部切开一个2-3厘米的口，通过周围软组织解剖暴露其气管。将大鼠悬于一块近垂直平板上，通过在暴露的气管喉头后1厘米位置插入一根与1cc注射器连接的25G×1/2英寸针头进行气管内注射。
每只大鼠通过缓慢的气管内注射得到0.5ml/kg的盐水或0.5ml/kg的10mg/ml(5mg/kg)LPS内毒素。LPS内毒素注射后马上腹腔内注射1ml/kg的盐水(对照)或含有不同浓度EX-2的盐水(处理)。将大鼠放在升高的位置上1到2分钟以有助于LPS和盐水在肺内的分布。缝合切口并让大鼠苏醒。气管内注射2和4小时后，再次以盐水或EX-2腹腔内注射相应的对照组和处理组大鼠。
气管内注射后6小时，将大鼠重新麻醉并通过心脏穿刺放空血液。收集并保藏血清。打开颈部和胸部以暴露气管和肺，用一个27G×3/4英寸的针头以6×5ml盐水洗涤肺并收集洗涤液体。
计数EX-2处理大鼠的支气管肺泡洗涤液体中的全部多形核白细胞(PMN；中性白细胞)并与对照大鼠中的数量比较。如表I所示，用100μg/kg EX-2处理抑制了LPS处理的肺中的PMN渗透的增加，抑制率为58％。实施例9  白介素-1β或脂多糖诱导的体温升高的抑制
本实施例描述细胞因子调节剂EX-2，EX-3和EX-4在大鼠中抑制两种不同因子诱导的体温升高中的疗效。
雄性Wistar大鼠(45-75天龄)置于温度为26℃的控温室中，此温度对大鼠的正常体温来说是热中性的，测试前，大鼠在可自由接近食物和水的房间内放置24小时。在研究开始的早晨，将大鼠作好鉴别标记并称重。将大鼠放入为减少压力而设计的一个调节笼中，将温度探针(YSI probe # 402)插入大鼠直肠3-5厘米测定每只大鼠的体温。读数稳定后记录温度15秒。1小时后重复测量以建立每只大鼠的基线温度。
建立基线温度后，用盐水，IL-1β或LPS内毒素对大鼠进行腹腔内注射。然后，用盐水(对照)或不同浓度的EX-2，EX-3，或EX-4(处理)对大鼠进行腹腔内注射。每一小时测定一次大鼠的体温至6小时，测定EX-2，EX-3，或EX-4对由IL-1β或LPS引起的体温升高的抑制。
如表I所示，用500μg/kg EX-2处理抑制了52％的IL-1诱导的发热。另外，当LPS注射后6小时测定时，用50或150μg/kg EX-2处理相应地抑制了45％或52％的LPS诱导的发热。还有，用150μg/kg EX-3或EX-4处理相应地抑制了57％或52％的LPS诱导的发热(表II)。这些结果显示本发明的不同细胞因子调节剂可以有效地降低发热。实施例10  小鼠中花生四烯酸诱导的耳肿胀的下降
本实施例显示EX-2和EX-3可以降低小鼠中花生四烯酸诱导的耳肿胀。
实验用体重为18-23g的雌性Balb/c小鼠进行。在局部使用花生四烯酸(AA)前30分钟用盐水或100μg EX-2或EX-3进行腹腔内注射。用10μl吸管将10μl AA溶液(100mg/ml乙醇；Calbiochem-Novabiochem；San Diego CA)滴于每只小鼠右耳的内表面和外表面。将10μl乙醇滴于每只小鼠左耳的内表面和外表面。
在使用AA前和60分钟后用手持式弹簧测径器测定耳厚度。用在AA处理耳上观察到的厚度变化减去在对照耳观察到的变化来计算耳厚度的增加。每组(盐水和对照)的值是每组中个体小鼠上观察到的肿胀的平均值。肿胀下降的百分率是基于在盐水对照组中观察到的肿胀。如表I和表II所示，EX-2和EX-3相应地降低了72％和62％的AA诱导的耳肿胀。实施例11  吗啡诱导的兔呼吸抑制的下降
本实施例显示EX-2和EX-3可以降低吗啡诱导的兔呼吸抑制。
将雄性Shelton兔(3-4kg)束缚，将一个呼吸传感器(Model F-RCT；Grass Instruments；Quincy MA)安装在其前肢后的胸部。用EKG电缆将传感器连接至一个Grass多路描记器上。用一个25G蝴蝶针插入耳部边缘的静脉中以建立静脉内给药途径。
待兔呼吸稳定，然后静脉内注射吗啡硫酸盐(2mg/kg，溶于0.5ml盐水)，监视呼吸次数和呼吸深度10分钟。注射第二个剂量的吗啡，10分钟后，静脉内注射EX-2或EX-3(10μg/kg，溶于0.5ml盐水)并监视20分钟。以20分钟的间隔注射两个附加剂量的EX-2或EX-3(20μg/kg，溶于1.0ml盐水)，如第一次注射后40和60分钟。
结果以基线值变化的百分数计算，以在实验结束后(80分钟)处理组的平均值减对照组平均值的差异表示。如表I和表II所示，EX-2和EX-3相应地降低了50％和65％的吗啡诱导的呼吸抑制。实施例12  口服的细胞因子调节剂在降低TNF-α水平和LPS诱导的致死性中的效果
本实施例描述不同细胞因子调节剂在降低小鼠LPS诱导的TNF-α水平和致死性中的口服效果。
LPS诱导的致死性研究是根据Rivier et al.，supra，1989报道的信息来进行的。成年Balb/c雌性小鼠按需提供食物和水。每4小时给小鼠喂食一次溶于100μl盐水的150μg或300μg EX-2，EX-3，EX-5或EX-6至40小时(总剂量1.65mg和3.3mg，相应地)。对照组小鼠只喂食100μl盐水。第一次喂食细胞因子调节剂或盐水后，马上腹腔内注射溶于0.2ml盐水的0.6mg LPS。与对照组小鼠(0％)或喂食EX-2或EX-3(0％到11％)相比，在喂食3.3mg EX-5(63％)，1.65mg EX-6(68％)或3.3mg EX-5(44％)的小鼠中观察到了存活率的统计显著性上升。
口服细胞因子调节剂降低LPS诱导的TNF-α水平的能力也做了调查。雌性Balb/c小鼠喂食溶于100μl盐水的150μg或300μg EX-2，EX-3，EX-5或EX-6。对照组小鼠只喂食100μl盐水。1分钟后，腹腔内注射0.1mg LPS。按上面例III描述的方法收集样品并测定TNF-α水平。
测定每组(n＝9-20)小鼠的平均TNF-α水平并计算TNF-α水平下降的百分数。与对照组小鼠(0％)和喂食EX-2(26％到28％)相比，在喂食150μg EX-3(49％)，300μg EX-3(40％)或300μg EX-5(44％)的小鼠中TNF-α水平显著地下降了。这些结果显示本发明的不同细胞因子调节剂口服时是有效的。实施例13  大鼠中的废用性去适应
本实施例描述细胞因子调节剂EX-2在改善大鼠中与14天废用性去适应相关联的副作用中的疗效。
此研究使用成年Sprague-Dawley雄性大鼠(355-365g)。大鼠分只安排在标准鼠笼中并适应踏车运动4天。第二天，进行基线尾部放血，随后于下一天进行最大踏车胁迫测试。胁迫测试后第二天，将大鼠分成适当的处理组和对照组并通过其尾部将其悬于悬挂笼中，这样做可以刺激失重并因此使大鼠脱离锻炼状态。另一组对照组大鼠置于有栅格地板的标准大鼠笼中，栅格地板与用在悬挂笼中的相似。所以的大鼠分成每笼一只并按需提供食物和水。每天测量体重和食物消耗。每天两次腹腔内注射1μg/kg或5μg/kg体重的EX-2(处理)，或1ml/kg体重的盐水(对照)。在第10天，所有大鼠在踏车上进行胁迫测试直到它们耗尽体力。收集VO2最大值和锻炼时间数据并与悬挂前的结果比较。第14天，处死所有大鼠并收集血液，组织和器官进行进一步分析。所有的步骤和测试均蒙眼进行以避免研究者的主观性。用Student-Newman-Keuls测试的ANOVA来评价组与组之间的统计显著性(p＜0.05)以进行多重对比。所有的数据以平均值±标准误(SE)的形式报告。
不管处理与否，所有悬挂大鼠的体重均明显下降。组与组之间的食物消耗没有明显差别。所有的大鼠均接受了胁迫测试，其中测量了锻炼时间和最大VO2值。还有，测试了氧化酶soleus柠檬酸合成酶的水平和胫骨密度。
如表III所示，EX-2对与废用性去适应相关的很多参数有明显影响。每天两次的低剂量EX-2注射(1或5μg/kg)显著减弱了废用性去适应对锻炼时间，最大VO2，soleus柠檬酸合成酶水平和胫骨密度的影响。更精确地说，当比较盐水对照组和悬挂组大鼠之间的降低时，EX-2显著减弱了锻炼性能参数，锻炼时间和最大VO2的降低，减弱百分数相应为44％和80％。soleus柠檬酸合成酶的降低减弱了50％。胫骨密度测量显示EX-2显著减弱了悬挂诱导的骨骼脱矿质化作用50％。这些结果显示使用本发明的细胞因子调节剂可降低废用性去适应的副作用。
                           表III
                        废用性去适应变量                                                ％减弱度*锻炼时间                                            44％**最大VO2                                            80％**Soleus柠檬酸合成酶                                  50％**胫骨密度                                            50％**
*-与对照组相比悬挂组悬挂诱导下降的％减弱度。
**-比悬挂对照的显著性增大(p＜0.05)。实施例14  器官保护
本实施例描述细胞因子调节剂EX-2在防止两个大鼠模型中的肾脏损害中的疗效，两个大鼠模型分别为局部缺血-再灌注模型和环孢菌素诱导的肾中毒模型。A.局部缺血-再灌注损伤：
这些实验用来测定具有细胞因子调节特性的肽EX-2是否可以改善肾脏动脉被夹住引起的再灌注诱导的血管收缩作用和肾小球滤过率的下降。在同样的模型中使用了NSAIDketorolac作为对比。
Sprague-Dawley大鼠(250-300g)用Inactin(120mg/kg)麻醉。确认深度麻醉后，将大鼠用聚乙烯(PE)套管(PE 240)套住气管，用PE 50套住颈静脉，股动脉和膀胱，用延伸的PE 50套住左输尿管。套管完成后，在左肾上方切开一个2厘米的侧面切口，暴露肾脏骨盆和血管窦。轻轻解剖并去除左肾动脉周围的组织。用一个小的血管钳夹住暴露的肾动脉1小时。
肾动脉夹住前，静脉内注射EX-2(50或500μg/kg)，ketorolac(KETO，1mg/kg)，或载剂。肾动脉夹住后1小时(局部缺血)，轻轻移走血管钳，小心操作以避免肾动脉或神经受损伤。以4μCi/hr的恒定速率开始注入3H标记的菊粉(NEN/Dupont；Wilmington，DE)，(0.6μCi/ml溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中)(2ml/hr)。60分钟的再灌注后，在两个30分钟的收集阶段中评测肾小球滤过率(GFR)，肾血浆流量(RPF)和肾血管抗性(RVR)。然后将肾脏摘除并进行分析。假操作的和夹住的大鼠用作上面实验的对照。相对一侧肾脏的功能用于确定测量阶段的大鼠肾脏功能的稳定性。结果显示EX-2引起肾小球滤过率的增高和血管抗性的降低(表IV)。此数据证明本发明的细胞因子调节剂有效保护肾脏免受与局部缺血-再灌注相关的损害。
                                    表IV
                            肾脏局部缺血/再灌注(I/R)
                         GFR               RVR            RPF
                                          (ml/mm)假操作                       1.0±0.1         1.0±0.1       4.2±0.4I/R+PBS                      0.2±0.1         6.6±2.1       0.8±0.2I/R+EX-2                     0.5±0.1         1.8±0.2       2.3±0.3B.环孢菌素诱导的肾中毒
本实验用来证实EX-2是否可以缓解用环孢菌素A进行免疫抑制治疗诱导的肾小球滤过率(GFR)和肾血流量的下降，还有体液和电解质紊乱。
在第一个研究中，将处于环孢菌素A(CsA)起始治疗阶段的体重为240-290g的Sprague-Dawley雄性大鼠(n＝43)分成4个体重相当的组。分组情况如下：(1)对照：没有CsA，没有EX-2，只用CsA载剂(PBS)口服(PO)和EX-2载剂(也是PBS)腹腔内注射处理；(2)CsA：用CsA处理(50mg/kg溶于PBS，每天8：30被动口服9天)并腹腔内注射PBS(EX-2载剂)；(3)CsA和50μg：CsA处理与第2组相同，外加EX-2(溶于EX-2载剂，每天8：00和17：00腹腔内注射50μg/kg)；和(4)CsA和500μg：CsA处理与第2和第3组相同，除了剂量为500μg/kg体重外，EX-2处理方案与第3组相似。确认深度麻醉后，将大鼠用PE 240套住气管，用PE 50套住颈静脉，股动脉和膀胱。在测量开始前50分钟注入3H标记的菊粉以评测肾小球滤过率，肾血流量和血浆流量。通过菊粉抽提技术测定肾血流量。在研究的最后，将肾脏摘除以进行组织学分析。
在第二个研究中，将处于环孢菌素A(CsA)起始治疗阶段的体重为240-290g的Sprague-Dawley雄性大鼠(n＝43)分成4个体重相当的组。此研究的时间进程和方案与第一个相似但有以下例外：(1)CsA每日剂量降为30mg/kg并通过皮下给药(SC)和(2)50μg/kg剂量的EX-2用每天两次200μg/kg剂量的EX-2替代。500μg/kg剂量的EX-2在此研究中与第一次重复。测定肾脏的血液动力学并测定细胞外液体积。
因为数据的分散，此项研究中CsA处理没有显著降低肾脏血流量。但是，EX-2处理改进了血流量，其血流量的值不同于对照。在测量细胞外液体积(ECF)的第二个研究中，ECF在对照组和处理组间没有差异(对照组为27.6±1.9，CsA和载剂组为27.5±1.7，CsA+200μg/kg EX-2组为26.2±0.9，CsA+500μg/kg EX-2组为25.7±1.4％)。
另外还测量了尿蛋白排泄，数据显示与CsA处理大鼠相比尽管EX-2处理明显增加了GFR但没有增加尿蛋白排泄。与CsA和载剂对照相比，两个研究中EX-2均显著增加了GFR，并恢复血流量到了不同于对照的值。EX-2处理没有改变ECF，但有降低作为肾小球滤过率标准的尿蛋白排泄的趋势。两个实验的结果如图1a和1b所示，这些结果证实本发明的细胞因子调节剂降低环孢菌素诱导的肾中毒和由此引起的损害。实施例15  癌症化疗
本实施例描述细胞因子调节剂EX-2在降低癌症化疗制剂的肾中毒作用中的疗效。
用Sprague-Dawley雄性大鼠测定EX-2对顺式氨铂(CDDP)使用后的肾脏功能的影响。所有的大鼠腹腔内注射CDDP(4mg/kg)并分成3个处理组(n＝6/组)。分组情况如下：(1)每天3次载剂和无菌PBS；(2)每天3次5μg/kg剂量的EX-2；和(3)每天3次50μg/kg剂量的EX-2。
在外科准备阶段结束后注入3H标记的菊粉(0.6μCi/ml溶于PBS)(2ml/hr)。在肾脏功能测定前60分钟连续灌注直到研究结束。在两个30分钟的时间段内用菊粉清除技术测定肾小球过滤，并用菊粉抽提技术(动脉对肾静脉的菊粉浓度)测定肾血流量(RBF)和肾血浆流量(RPF)，血样在第二次肾小球滤过率测定阶段时从左肾静脉采集。还监测了尿液输出量以测定尿液流量和水的分部排泄。用火焰测光法(Model 51 Ca，Bacharch，Inc.；Pittsburgh，PA)测定尿电解质浓度(Na+和K+)并测定了尿液蛋白浓度。测定结束后，摘除肾脏用于组织学分析。不同处理剂量的EX-2对3只注射CDDP的大鼠(腹腔内注射4mg/kg的CDDP)肾脏功能的影响总结如表V。数据显示本发明的细胞因子调节剂增加肾小球滤过率，肾血浆流量和肾血流量，因此降低癌症化疗制剂的肾中毒作用。
                                    表V
                                  癌症化疗
                          GFR                 RPF              RBF
                                            (ml/mm)CDDP+载剂                     1.0±0.4          5.6±0.9         10.2±1.6CDDP+5μg/kg                  0.8±0.2          6.5±1.0         12.1±2.0CDDP+50μg/kg                 1.6±0.4          8.8±1.1         16.8±2.2实施例16  氧化氮和细胞因子介导的疾病的治疗
本实施例描述EX-2在抑制诱导性氧化氮合成酶(iNOS)，降低链脲佐菌素诱导的糖尿病中的葡萄糖和降低肾小球性肾炎中白蛋白水平中的疗效。A.诱导性氧化氮合成酶(iNOS)：
用Gelsterfer et al.， Circ.Res.62：749-756(1988)(在本文作为参考文献)已发表的方法从雄性大鼠(325-350g)分离大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMC)。通过用小鼠抗-α-肌动蛋白的抗体和抗-小鼠IgG的异硫氰酸荧光素(FITC)接合物对抗-α-肌动蛋白进行间接免疫荧光染色的方法鉴定平滑肌细胞。细胞在装有补加10％牛血清，0.2g/l L-谷氨酸，青霉素(100单位/ml)和链霉素(0.1mg/ml)的50％F12和50％Delbelco’s Modified EagleMedium(DMEM)培养基的组织培养瓶(Corning Delbelco’s Glass，Inc.；Corning，NY)中生长。
通道1-5之间的细胞用下列试剂之一预处理6小时：载剂，LPS(1μg/ml)，IL-1β(10单位/ml)，或TNF-α(100单位/ml)。在相似的其它组中，在加LPS，IL-1β或TNF-α之前10分钟加入0.1或1μM的EX-2。6小时后，用Eagle’s平衡盐溶液清洗细胞并与100μM载剂L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)保温30分钟。在有或没有1mM L-精氨酸的情况下，接受0.3mM 3-异丙基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)O处理后测定cGMP的积累。然后快速吸出培养基，每孔内加入500μ 10.1N HCl以中止反应并抽提cGMP。30分钟后，收集HCl抽提物，在孔内加入1.0N热的NaOH并用橡皮胶擦洗小孔以除去细胞残渣。HCl抽提物用放射免疫测定法分析cGMP，溶于NaOH的细胞残渣用来测定蛋白质。
Sprague-Dawley雄性大鼠腹腔内注射55mg/kg戊巴比妥进行麻醉。将导管插入颈动脉和颈静脉，相应地用于抽血和给药。给一组6只大鼠使用EX-2或盐水。1小时后，大鼠仍然处于麻醉状态，将血液抽入一个肝素化的注射器中，离心收集血浆。将RASMC与对照或EX-2处理大鼠的血浆一起培养，按上面的方法测定血浆成分抑制LPS或IL-1 β对INOS诱导的能力。
用自由125I通过Hunter and Greenwood  Nature，94：495-496(1962)的方法(在本文作为参考文献列出)制备放射性佐剂(125I-琥铂酰cGMP-酪氨酸甲酯)。根据Patel andLindent， Anal. Biochem.168：417-425(1988)提供的方案(在本文作为参考文献列出)用RP-HPLC分离碘化反应产物。根据Brooker et al.， Science 191：270-276(1976)披露的方法(在本文作为参考文献列出)，使用cGMP的单克隆抗体在GammaflowTM自动放射免疫分析系统上进行放射免疫分析。cGMP(20μM)标准贮液用0.1N HCl配制，溶液的吸收照例进行分光光度检测(岛津，UV 160U)。用贮液进行标准稀释(0.63-80nM)。含cGMP的HCl抽提物直接用于放射免疫分析。结果总结于下面的表VI，结果显示EX-2可以抑制诱导性氧化氮合成酶，因此可以降低NO产生，EX-2还可以抑制与诸如糖尿病和肾小球性肾炎的疾病相关的副作用。B.诱导性糖尿病：
通过尾部静脉对Sprague-Dawley雄性大鼠静脉内注射65mg/kg链脲佐菌素(STZ)。将大鼠分成两组。第一组每8小时注射150μg/kg EX-2至72小时，第二组为对照。在前72小时内每8小时抽取乙醚麻醉状态下大鼠的血样，然后每12小时或24小时抽血一次直至观察阶段结束。用葡萄糖分析试剂盒(Trinder，Sigma Chemical Co.)分析血浆样品中的葡萄糖。如下面的表VI所示EX-2造成血液中葡萄糖水平下降72％。C.遗传性糖尿病：
正如Ward et al.， Ann.Clin.Lab.Sci.，24：266-277，(1994)所描述的(在本文作为参考文献列出)，Zucker雄性大鼠是一个研究遗传性非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的成熟的大鼠模型。18只Zucker雄性大鼠用来研究EX-2对慢性病NIDDM的影响。将大鼠分成两组，每8小时注射一次盐水或25μg/kg的EX-2，持续约3个月。通过剪尾收集血样，并将大鼠置于代谢笼中24小时以收集尿样。用放射免疫分析试剂盒(AmershamLife Sciences，Arlington Heights，IL)分析血浆中的胰岛素。用蛋白分析试剂盒(Coomassie Plus，Pierce，Rockford，IL)分析尿液蛋白。体重测量用一个Mettler toledo高负荷天平。如表VI所示，EX-2造成胰岛素下降39％，尿蛋白下降87％，和体重下降约100克(下降32％；参见实施例20)。
                              表VI
                        糖尿病和肾小球性肾炎模型/分析                      测量变量                         ％下降*iNOS                           cGMP(pmol/100mg/15min)           60％STZ糖尿病                      血液葡萄糖(mg/dl)                72％Zucker NIDDM糖尿病             胰岛素(ng/ml)                    39％
                           尿蛋白(mg/24 hr)                 87％
                           体重(克)                         32％肾小球性肾炎                   尿白蛋白(mg/天)                  62％
*使用EX-2后模型/分析中的因素诱导的测量变量上升的下降百分数。D.肾小球性肾炎：
用福氏完全佐剂(Sigma Chemical Co.)乳化的1mg正常兔IgG(Sigma Chemical Co.)通过皮下注射免疫Sprague-Dawley雄性大鼠(体重194-248g)。在整个实验阶段内每天3次注射EX-2(每次注射100μg/kg)。7天后，通过背静脉静脉内注射1.5ml肾中毒的血清。肾中毒的血清注射前4，6，24，48，和96小时时收集尿液，血浆，和血清。根据24小时白蛋白排泄显示，所有的大鼠都出现急性肾小球性肾炎和蛋白尿，病症从4到96小时逐渐严重。蛋白尿用免疫电泳定量。结果总结于表VI，结果显示本发明的细胞因子调节剂减少肾小球性肾炎中出现的白蛋白水平上升，白蛋白水平指示病症的发展。
总之，上述数据显示本发明的细胞因子调节剂抑制诱导性氧化氮合成酶水平，因此降低NO的产生。细胞因子调节剂对治疗氧化氮造成的诸如糖尿病，肾小球性肾炎，动脉硬化和多种硬化症的特殊疾病也是有用的。实施例17  增加小鼠中IL-10的水平
本实施例以EX-2使用后小鼠血浆中IL-10水平增加为示例描述EX-2在增加哺乳动物中IL-10水平中的疗效。
图2显示EX-2对小鼠血浆中IL-10的诱导效应。对19只小鼠腹腔内注射剂量范围为1.0μg/只到1000.0μg/只的EX-2。结果显示IL-10水平依剂量的升高而升高，范围从5.0pg/ml到23.0pg/ml。实施例18  增加人IL-10的水平
本实施例描述细胞因子调节剂EX-2对人的细胞因子的增强效应。
对8个健康的男性志愿者静脉内注射剂量200或500μg/kg的EX-2。使用200μg/kgEX-2的4个志愿者中有2个血浆IL-10水平升高(图3a)，使用500μg/kg EX-2的4个志愿者血浆IL-10水平都升高(图3b)。结果显示在接受200μg/kg EX-2的患者中IL-10升高85％，接受500μg/kg EX-2的患者中IL-10升高230％。实施例19  治疗人癌症化疗引起的副作用
本实施例描述诸如EX-2的细胞因子调节剂在改善使用顺式氨铂，Taxol或Adriamycin进行癌症化疗时的副作用中的用途，这些癌症化疗制剂诱导和增强细胞因子的产生。
可以使用例如EX-2的细胞因子调节剂对正在进行和将要进行化疗的患者进行静脉内注射。例如，可以安排患者接受顺式氨铂，Taxol或Adriamycin或其它适当的化疗或放疗治疗。EX-2的使用剂量可以在约1和100μg/kg之间，优选注入剂量为500μg/kg。剂量的使用可以通过连续滴注或间歇丸剂。实施例20  因使用细胞因子调节剂而体重降低
本实施例显示使用细胞因子调节剂可以引起患者体重的降低。
将肥胖的成年Zucker大鼠(fa/fa；325-350g)或非肥胖Zucker大鼠(Fa/+；250-275g)都分成两组。fa/fa大鼠的一组和Fa/+大鼠的一组每天3次腹腔内注射250μg/kg(每次)的EX-2，持续86天，另外29天每天两次注射。fa/fa和Fa/+的其它一组按同样的时间表注射盐水。
EX-2的使用引起fa/fa和Fa/+大鼠体重增加的明显下降(见图4)。确切地说，在105天的治疗时间内，盐水处理的fa/fa大鼠增加约360g体重，而EX-2处理的fa/fa大鼠只增加275g体重，表明体重增加下降24％。这种体重的下降与皮下脂肪重量的下降明显相关，说明使用EX-2后体重的下降是脂肪重量的下降而非肌肉物质的下降。在Fa/+大鼠中体重增加的下降稍少，但也是与脂肪物质相关而非肌肉物质。这些结果指示细胞因子调节剂可以通过降低脂肪的积累来降低正常和肥胖个体的体重增加。
在另外的实验中，fa/fa大鼠接受每天两次的0.5-10mg/kg的EX-2(1-20mg/天)，持续14天。每个组中都观察到了体重增加的下降。另外，用20mg EX-2/天处理的大鼠体重下降10％。与对照相比，这种体重损失与EX-2处理的大鼠的消耗增加相关。这些结果指示细胞因子调节剂有益于降低体重。
虽然用上面的例子描述了本发明，但是应该知道本领域的熟练技术人员可以进行各种各样的修饰而没有与本发明偏离。因此，本发明提出以下权利要求。

Claims (63)

1.一种细胞因子调节剂，包括：
X1-X2-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-X3，
其中：
X1是 ，H或COCH3；
X2是
Figure A9619045100022
；和
X3是
Figure A9619045100023
，或R5；
其中Y是O，H2或S；
R1是H，COCH3，C2H5，CH2Ph，COPh，COOCH2Ph，COO-叔丁基，CH2CO-(聚乙二醇)或A；
R2是H或COCH3；
R3是一个具有1到6个碳原子的线性的或分支的烷基基团或一个具有3到6个碳原子的环烷基团；
R4是(CH2)m-CONH2，(CH2)m-CONHR1或(CH2)m-CONHA；
R5是OH，OR3，NH2，SH，NHCH3，NHCH2Ph或A；以及
R6是H或R3；其中“Ph”是C6H5；“m”是1，2或3；“n”是0，1，2或3；和“A”是具有如下通式的碳水化合物：
Figure A9619045100031
2.权利要求1的肽，其中氨基末端是修饰的。
3.权利要求1的肽，其中羧基末端是修饰的。
4.权利要求1的肽，其中R1选自C2H5和CH2Ph组成的一组，其中R1选自H和COCH3组成的一组。
5.权利要求1的肽，其中R1和R2是相同的基团，所说的基团选自H，C2H5和CH2Ph组成的一组。
6.权利要求1的肽，其中X1选自正亮氨酸，正缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸组成的一组。
7.权利要求1的肽，其中R5与X1共价结合，所说共价键形成一个环状肽。
8.一种细胞因子调节剂，包括：
X4-X5-(D)Phe-Arg-(D)Trp-X3，
其中：
X4是 ，H，COCH3，或无；
X5是His，H，或COCH3；和
X3是
Figure A9619045100041
，或R5；
其中Y是O，H2或S；
R1是H，COCH3，C2H5，CH2Ph，COPh，COOCH2Ph，COO-叔丁基，CH2CO-(聚乙二醇)或A；
R2是H或COCH3；
R4是(CH2)m-CONH2，(CH2)m-CONHR1或(CH2)m-CONHA；
R5是OH，OR3，NH2，SH，NHCH3，NHCH2Ph或A；以及
R6是H或R3；其中“Ph”是C6H5；“m”是1，2或3；“n”是0，1，2或3；和“A”是具有如下通式的碳水化合物：
Figure A9619045100042
9.权利要求8的肽，其中氨基末端是修饰的。
10.权利要求8的肽，其中羧基末端是修饰的。
11.权利要求8的肽，其中R1选自C2H5和CH2Ph组成的一组，R2选自H和COCH3组成的一组。
12.权利要求8的肽，其中R1和R2是相同的基团，所说的基团选自H，C2H5和CH2Ph组成的一组。
13.权利要求8的肽，其中R5与X4共价结合，所说共价键形成一个环状肽。
14.具有选自如下一组的氨基酸顺序的细胞因子调节剂：
   (环己基)Gly-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly；
   His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly；
   His-(D)Phe-Arg-(D)Trp；
   (D)Phe-Arg-(D)Trp；和
   His-(D)Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly。
15.权利要求14的肽，其中羧基末端是经酰胺化修饰的。
16.权利要求14的肽，其中所说肽的氨基末端是乙酰化的。
17.氨基酸序列为环(His-(D)Phe-Arg-(D)Trp)的细胞因子调节剂。
18.调节患者的细胞因子活性的方法，该患者具有以改变的或迷乱的细胞因子活性为特征的状态，该方法包括给患者以有效剂量的权利要求1的细胞因子调节剂。
19.权利要求18的方法，其中所说的细胞因子调节剂增强所说细胞因子的活性。
20.权利要求19的方法，其中所说的细胞因子活性是IL-10活性。
21.权利要求19的方法，其中所说的状态是炎症反应。
22.权利要求19的方法，其中所说的状态是恶病。
23.权利要求19的方法，其中所说的状态是病理免疫反应。
24.权利要求19的方法，其中所说的状态是成人呼吸困难综合症。
25.降低患者废用性去适应的影响的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求1的细胞因子调节剂。
26.保护患者的器官免受损害的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求1的细胞因子调节剂。
27.权利要求26的方法，其中器官损害是选自由器官移植，免疫抑制剂的使用，和局部缺血-再灌注组成的一组的一种状态的结果。
28.权利要求27的方法，其中免疫抑制剂是环孢菌素。
29.改善患者癌症化疗的副作用的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求1的细胞因子调节剂。
30.权利要求29的方法，其中副作用是癌症化疗制剂的肾中毒效应。
31.权利要求30的方法，其中癌症化疗制剂选自顺式氨铂，Taxol和Adriamycin组成的一组。
32.治疗患有氧化氮和细胞因子介导的疾病的患者的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求1的细胞因子调节剂。
33.权利要求32的方法，其中的疾病选自糖尿病和肾小球性肾炎组成的一组。
34.降低患者体重的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求1的细胞因子调节剂。
35.增加患者氧消耗的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求1的细胞因子调节剂。
36.调节患者细胞因子活性的方法，该患者具有以改变的或迷乱的细胞因子活性为特征的状态，该方法包括给患者以有效剂量的权利要求8的细胞因子调节剂。
37.权利要求36的方法，其中所说的细胞因子调节剂增强所说细胞因子的活性。
38.权利要求37的方法，其中所说的细胞因子活性是IL-10活性。
39.权利要求37的方法，其中所说的状态是炎症反应。
40.权利要求37的方法，其中所说的状态是恶病。
41.权利要求37的方法，其中所说的状态是病理免疫反应。
42.权利要求37的方法，其中所说的状态是成人呼吸困难综合症。
43.降低患者废用性去适应的影响的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求8的细胞因子调节剂。
44.保护患者的器官免受损害的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求8的细胞因子调节剂。
45.权利要求44的方法，其中器官损害是选自由器官移植，免疫抑制剂的使用，和局部缺血-再灌注组成的一组的一种状态的结果。
46.权利要求45的方法，其中免疫抑制剂是环孢菌素。
47.改善患者癌症化疗的副作用的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求8的细胞因子调节剂。
48.权利要求47的方法，其中副作用是肾中毒作用。
49.权利要求47的方法，其中化疗包括使用选自顺式氨铂，Taxol和Adriamycin组成的一组的化疗制剂。
50.治疗患有氧化氮和细胞因子介导的疾病的患者的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求8的细胞因子调节剂。
51.权利要求50的方法，其中的疾病选自糖尿病和肾小球性肾炎组成的一组。
52.降低患者体重的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求8的细胞因子调节剂。
53.增加患者氧消耗的方法，包括给患者以有效剂量的权利要求8的细胞因子调节剂。
54.调节患者细胞因子活性的方法，该患者具有以改变的或迷乱的细胞因子活性为特征的状态，该方法包括给患者以有效剂量的权利要求14的细胞因子调节剂。
55.调节患者细胞因子活性的方法，该患者具有以改变的或迷乱的细胞因子活性为特征的状态，包括给患者以有效剂量的权利要求17的细胞因子调节剂。
56.降低患者废用性去适应的影响的方法，包括给患者以有效剂量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的细胞因子调节剂。
57.保护患者的器官免受损害的方法，包括给患者以有效剂量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的细胞因子调节剂。
58.降低患者癌症化疗的副作用的方法，包括给患者以有效剂量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的细胞因子调节剂。
59.治疗患有氧化氮和细胞因子介导的疾病的患者的方法，包括给患者以有效剂量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的细胞因子调节剂。
60.降低患者体重的方法，包括给患者以有效剂量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的细胞因子调节剂。
61.增加患者氧消耗的方法，包括给患者以有效剂量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的细胞因子调节剂。
62.增加患者细胞因子水平的方法，包括给患者以有效剂量的具有Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2序列的细胞因子调节剂。
63.权利要求62的方法，其中所说的细胞因子是IL-10。
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