CN1259958A - 用于调节免疫系统活性和抑制炎症的细胞调节性亲脂肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新颖的低聚肽,它包含得自计算机程序的序列,可用于抑制淋巴细胞的细胞毒活性,抑制炎症细胞因子的产生和与这些细胞因子有关的炎症反应,抑制含血红素酶的活性并能延缓处于自身免疫疾病发展危险中的哺乳动物所述疾病的发作。通过使本发明组合物与包括淋巴细胞和活化淋巴细胞的细胞的细胞混合物混合,可明显抑制靶细胞的溶解。可将此低聚肽与各种各样的其它基因或化合物连接以使本发明组合物的活性有不同变化。本发明组合物可用各种方便的手段给予宿主,以抑制淋巴细胞对组织,特别是对异种或同种移植物的攻击,或抑制炎症细胞因子的的产生和与其相关的炎症反应。本发明组合物也可用于抑制含血红素酶的活性。

Description

用于调节免疫系统活性和抑制炎症的细胞调节性亲脂肽
引言
技术领域
本发明是用于调节免疫系统细胞活性和抑制炎症的新颖肽。
背景
免疫系统是保护哺乳动物宿主抵抗各种病原体，同时监视体内清除有害畸变(如肿瘤)的细胞和组分的特别复杂的组合。免疫系统的一个分支涉及执行免疫系统功能的细胞，包括(a)淋巴细胞，如骨髓衍生的B-淋巴细胞、胸腺衍生的T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞，(b)单核吞噬细胞，包括单核细胞和巨噬细胞。淋巴细胞主要与特异性免疫应答相关，因为它们能特异性认别和区分抗原决定簇，而单核吞噬细胞最常涉及通过吞噬作用清除外来微生物，并由于微生物本身的直接诱导或对抗原激活的T淋巴细胞的反应而产生和分泌细胞因子。淋巴细胞和单核吞噬细胞的功能极为相关，是正确执行免疫系统功能所必不可少的。
淋巴细胞的一个重要亚群是T淋巴细胞，其名称来源于它们经过胸腺(Thymus)加工这一事实。T淋巴细胞是细胞的复杂群体，T细胞有细胞毒性、有多种机制诱发细胞死亡，或通过分泌功能为活化其它细胞的各种细胞因子来活化细胞。细胞毒T淋巴细胞(“CTL”)通过所限制的特定主要组织相容性复合物(MHC)抗原起作用，其细胞表面表达的T细胞受体包括α和β链，对MHC凹槽里的肽和相关的特定MHC复合体具有特异性亲和力。已对CTL进行了筛选，故它们对凹槽里的肽是宿主内源性肽的细胞通常不起作用。但是，对宿主来说当MHC是外来的或凹槽里的肽是外来的，CTL会攻击这类细胞并杀灭之。其它在免疫应签里起重要作用的淋巴细胞包括B-淋巴细胞和自然杀死(NK)细胞，两者的活性均受免疫系统其它细胞和各种细胞因子多肽的影响。
单核吞噬细胞构成了免疫系统第二大细胞群，它由主要功能为吞噬作用的细胞谱系构成。单核吞噬细胞衍生自祖代骨髓干细胞，成熟和继续活化后可形成各种形态，包括未完全分化的单核细胞和巨噬细胞。单核吞噬细胞的功能正常依赖于各种细胞因子蛋白的产生和对各种细胞因子蛋白的反应能力。
细胞因子，如各种干扰素、白介素(interleukins)、肿瘤坏死因子、趋化因子(chemokines)、红细胞生成的生长因子和移动抑制因子，是由免疫系统的各种不同细胞所产生的多样性蛋白质群体。最重要的是，细胞因子由各种淋巴细胞和单核吞噬细胞在对各种刺激的应答中产生和/或与之反应。在大多数情况下，在天然和特异性免疫的效应阶段产生细胞因子，其作用是介导和调节免疫反应和炎症反应。细胞因子像其它多肽激素一样，通过与靶细胞表明上的特异性受体结合来引发它们的作用，它们的活化常常导致炎症反应。虽然免疫应签的激活和细胞因子诱发的炎症反应对于宿主的健康和免疫系统的正常运行极为重要，但许多情况下这类活化是不需要的。一个特殊的领域是移植，其中供体和受体的MHC抗原之间罕见有相同的匹配。另一种情况是CTL部分存在着缺陷，其中CTL所攻击的细胞MHC和相关的肽都是内源性的，如发生在诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)等自身免疫疾病中。另外的问题是细胞因子介导的炎症反应对宿主健康有不良影响，与这类炎症反应有关的如败血性休克、类风湿性关节炎、Crohn病、肠炎等疾病。
免疫抑制是在不需要CTL活化的情况下常用的一种方法。然而，环孢素A，FK506等免疫抑制剂有许多不良副作用。此外，业已使用了各种方法来控制或抑制炎症反应，但是许多方法也有一种或多种不良作用。因此，人们很需要鉴定出能抑制淋巴细胞，特别是抑制CTL活化、同时对免疫系统整体的抑制作用较小且副作用较少的新颖药剂，以使宿主的防护抵御外来感染的免疫系统基本上正常运行。
在过去数年里，据报道低聚肽能有效地调节免疫系统的活性并延长同种移植物的寿命。这些低聚肽是人白细胞抗原-B(HLA-B)α1-结构域的肽，并具有保守的氨基酸序列Arg-X-X-X-Arg-X-X-X-X-Tyr，称为X的各种氨基酸，在相对少的几个氨基酸里变化以保留肽的活性(如，参见WO95/13288)。这些低聚肽实现其活性的机理尚不明了，特别是对它们如何与亚治疗剂量的环孢素合作延长了同种移植物寿命的机理也不了解。
也已报道(Manolios，新颖肽，PCT申请，澳大利亚申请号：PN 0589和PN 0590，申请日1995年1月16日)了对T细胞介导的炎症有作用的下式低聚肽：
                    A-B-C-D-E其中：A可没有，或是1个或2个疏水残基；B是带正电荷的氨基酸；C是由3-5个疏水氨基酸构成的肽；D是带正电荷的氨基酸；E可没有，或是多达8个疏水氨基酸。所合成的肽是：Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val；Met-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu；Leu-Gly-Ile-Leu-Leu-Leu-Gly-Val；Leu-Asp-Ile-Leu-Leu-Leu-Gly-Val；Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Ile-Leu-Val；和Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Lys-Val。推测这些序列在TCR-α的一个跨膜序列的序列上。该申请没有谈判这些肽对延长移植物的寿命有好处。
相关文献
Buelow等，移植(Transplantation)59：649-654(1995)和其中引用的参考文献。Manolios等，天然医学(Nature Medicine)3：84-88(1997)揭示了通过合理设计得到的能调节T细胞活性的低聚肽。WO 95/13288，Clayberger等描述了能调节T细胞活性的肽。描述了用结构活性关系通过计算机设计化合物的方法的参考文献包括Grassy等，分子形态杂志(J.of Molecular Graphics)13：356-367(1995)；Haiech等，分子形态杂志13：46-48(1995)；Yasri等，蛋白基因工程(Protein Engineering)11：959-976(1996)和Ashton等，今日药物揭秘(DrugDiscovery Today)1：71-78(1996)。
发明综述
本发明提供了细胞调节肽，它们能(1)调节免疫系统各种细胞，特别是淋巴细胞，更具体的是CTL的活性，(2)抑制能产生细胞因子的细胞产生此类炎症细胞因子，从而有效地治疗伴有不良炎症反应的疾病，(3)调节含血红素的酶的活性和/或(4)在易患胰岛素依赖糖尿病(IDDM)的宿主中延缓胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的发作，其中肽是根据计算机程序来设计的，低聚肽化合物的例子是含序列B-X-X-X-B-X-X-X-J-Try的低聚肽，其中B是碱性氨基酸，J是Gly，B或有5-6个碳原子的脂族疏水氨基酸，X是除了脂族极性氨基酸外的任何氨基酸，其中至少三个X是相同的脂族非极性氨基酸，它们的二聚体和它们的D-立体异构体，其中氨基酸序列可以是环的一部分。发现这些肽其本身或与其它免疫抑制剂配合可用来抑制免疫系统淋巴细胞，特别是细胞毒淋巴细胞的活化以延长移植物的寿命。本文揭示的肽在体内和在体外也可用来抑制炎症性细胞因子(如干扰素-γ、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、MIP1α等)的产生，从而可用来抑制与各种疾病，如类风湿性关节炎、败血性休克、Crohn病、肠炎、过敏反应、自身免疫疾病等相关的炎症反应，用来抑制基于血红素的酶，如血红素氧合酶、氧化氮合成酶等的活性，以及延缓处于IDDM进展危险的病人的IDDM发作。可在体外给予待移植器官或体内给予的常规手段，包括直接施加或给予肽或编码所需肽的核酸，以足以基本抑制淋巴细胞活性的量给予，抑制炎症性细胞因子的产生和相关的炎症过程，抑制血红素为基础的酶活性，抑制前述与炎症反应和/或延缓IDDM发作有关的活性。
附图简述
图1显示了bcl-nL肽的构象空间群集。该构象图得自bcl-nL轨道的群集分析。
图2显示了肽轨道投射入D2肽参照轨道的主要平面中。
具体实施方案描述
本发明提供了体内和体外调节免疫系统细胞，特别是T和B细胞以及单核吞噬细胞，更具体讲是CTL和NK细胞活性的方法和组合物。本发明也提供了能有效地抑制炎症性细胞因子产生的方法和组合物，从而用于治疗伴有不良炎症反应的疾病、抑制各种基于血红素的酶的活性和/或延缓诸如IDDM等自身免疫疾病的发作。如相关文献所述，根据计算机程序提供了有特殊作用的肽，如对CTL和NK细胞的细胞调节肽。按照Grassy等，同上，所述的方法，根据已发现能抑制T细胞活性的已知低聚肽界定了诸参数。参见，例如Buelow等，同上。免疫抑制活性所需的构型空间根据Yasri等，(同上)所述的程序进行计算。
运用这些参数，具有已知T细胞抑制活性的化合物显示包括在这些参数的范围内，并能设计和测试许多新的肽化合物。据发现，新颖的肽化合物的活性等于或超过已知活性化合物。已知有活性的化合物包括HLA-Bα1-结构域，特别是75-84位氨基酸，和该序列的变体，其中不多于2个氨基酸被替换，所述的氨基酸不包括R和Y，其中本发明无意涵盖那类已知的化合物(参见，如WO 95/13288和Buelow等，同上)。也已知基于人TCR-α跨膜区域的序列由该序列和该序列不超过2个突变的序列构成。这些序列包括2个碱性氨基酸，其中2个碱性氨基酸被4个脂族疏水氨基酸隔开，但本申请指出可有3-5个疏水氨基酸存在。突变意味着一个氨基酸被另一个取代或插入一个或删去一个氨基酸，每种可计为一次突变。
本文描述的新颖肽化合物的核心序列中，理想的是2个碱性氨基酸被3-4个疏水氨基酸，特别是被3个疏水氨基酸隔开，尤其是N-末端是碱性氨基酸。更理想的是，C-末端氨基酸是芳族氨基酸，特别是酪氨酸。特别好的是当至少一个低聚肽的核心末端氨基酸是低聚肽末端氨基酸时，它可能是该化合物的单体形式或低聚物形式：
设计了新的分离的肽化合物，它包含序列B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr，其中B是碱性氨基酸，即Lys或Arg，特别是Arg在至少一个位置上，优选地在两个位置上，J是Gly，B或有5-6个碳原子的脂族疏水氨基酸，特别是Gly或B，X是除了脂族带电荷的氨基酸外的任何氨基酸，优选的是除了极性氨基酸外的任何氨基酸，其中至少三个X是相同的脂族非极性氨基酸，优选的是至少4个X是相同的脂族非极性氨基酸，更优选的是至少(除一个以外)所有X是相同的脂族非极性氨基酸，低聚物，特别是其二聚体和其D-立体异构体，其中氨基酸序列可以是环的一部分。
N-和C-末端的一个或两个的延伸总数不多于100个氨基酸，通常不多于总数约30个氨基酸，更通常的是不多于约20个氨基酸，一般不多于约9个氨基酸，其中氨基酸少于25％，更通常的是少于20％的是极性氨基酸，更特殊的是少于20％的氨基酸是带电荷氨基酸。另外，低聚肽的末端氨基或羧基可通过烷基化或酰基化来修饰，以得到值、酰胺或取代氨基，其中烷基或酰基可有约1-30个碳原子，通常是1-24个碳原子，优选的是1-3或8-24个碳原子，特别是12-18个碳原子。
本发明也包括低聚物，特别是低聚肽的二聚体，它可为头对头，尾对尾，或头对尾，重复的肽不多于6个。另外，一个或多个氨基酸可为D-立体异构体，直至所有的氨基酸。
也可用限定结构的低聚肽，如有约9-50个，通常是12-36个氨基酸的环状肽，其中除了特写的氨基酸外各氨基酸可作为桥存在。在一些情况下，可使用非氨基酸桥，若末端为半胱氨酸，可形成二硫化物桥以关闭环。形成环的另外的方法可参见Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5872-5876(1992)和Wu等，蛋白基因工程(Protein Engineering)6：471-478(1993)。
鉴于在本发明的目的，将氨基酸(大部分是天然氨基酸或它们的D-立体异构体)划分成下列类型：
1.脂族
  (a)非极性脂族：
     Gly，Ala，Val，nL，Ile，Leu
  (b)极性脂族：
     (1)不带电荷：
        Cys，Met，Ser，Thr，Asn，Gln
     (2)带电荷：
        Asp，Glu，Lys，Arg
2.芳族：
Phe，His，Trp，Tyr其中pro可包括在非极性脂族氨基酸里，但通常不包括在内。’nL”指正亮氨酸，其中非极性脂族氨基酸可被其它异构体所取代。
在B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr肽序列中的六个氨基酸X，优选的是至少三个X是有5-6个碳原子的脂族氨基酸，更好的是至少4个X是有5-6个碳原子，更优选的是有6个碳原子的的脂族氨基酸。其它氨基酸可为其它不带电荷的脂族氨基酸，特别是非极性脂族氨基酸或芳族氨基酸。该核心序列可用氨基酸在任一方向上延伸，大部分是亲脂的，即脂族不带电荷的氨基酸和芳族氨基酸。如前所述，低聚肽的一个或两个，通常是一个末端被亲脂基团所取代，通常是被8-36个，一般是8-24个碳原子的脂族或芳烷基所取代，在脂链上的杂原子少于两个，杂原子通常为氧、氮和硫。链可为饱和或不饱和的，脂族不饱和部位不多于3处，通常不多于2处。可方便地使用市售的脂族脂肪酸、醇和胺，如月桂酸、肉豆蔻醇、硬脂酰基胺等。亲脂基团可与低聚肽合适的功能基团按常规的方法反应，通常在支持物上合成期间根据低聚肽与支持物的连接位点处进行反应。
特别好的组合物具有下式结构：
                   Arg-U-X-X-Arg-X-X-X-J-Try其中除了U(U是不带电荷的脂族氨基酸或芳族氨基酸，特别是非极性脂族氨基酸或芳族氨基酸)外，其它所有的符号定义同上。
所发现的上述序列可用于各个方面。供研究目的时，它们可用来分析与CTL活化和失活有关的生理途径。人们可将CTL，特别是具有已知肽靶的CTL细胞系与本发明的肽，特别是放射活性标记的肽，在有或没有CTL限制性抗原呈递细胞存在下结合。被CTL裂解后，然后可通过标记的CD69(体外活化时此标记上调)，将静止的CTL细胞与活化的CTL细胞分开。用FACS和荧光标记抗-CD69可实现这种分离。
通过分离大多数荧光细胞，(如最高达25％)然后溶解细胞，并通过诸如层析、非变性电泳等分离出带有该标记物的蛋白。或者，用电泳分离蛋白质，然后用Western印染法或其它带有标记肽的技术来鉴定与该肽结合的蛋白质。不用放射标记则可用任何其它类型的标记物，通常是小的有机分子，如生物素、荧光素之类进行标记。使用生物素时，分离后可加入亲和素，其中亲和素如前所述用标记物作了标记。
在有和没有本发明肽的情况下也可以比较与抗原呈递细胞结合的T细胞。在两种情况下可制备cDNA文库，并可采用代表性区分分析、扣除法等来检测有或没有本发明肽时活化细胞之间的表达差异。也可通过表达或不表达一种或多种蛋白质，特别是表面膜蛋白质来测定特定的CTL亚群对本发明肽的反应是否与其它亚群不同。用该方法，可鉴定CTL是否可能已被白细胞移动等除去，以减少不良的CTL对组织的攻击。
业已报道HLA-Bα1结构域能与hsc70结合，已知hsc70的作用是陪伴分子并能与各种序列结合。
根据它们的用途，特别是给予哺乳动物宿主，可对本发明的肽作广泛修饰，以改变它们在血流里的分布、消除或增加与血液成分的结合，增加肽在血流里的寿命等。本发明肽可与其它组分通过接头连接，这种接头在血液的生理环境里是可断裂的或不可断裂的。肽类可在具有功能基团，如羟基、巯基、羧基、氨基之类的任何位点结合。理想的是，结合在N-末端或C-末端。
为了不同的目的本发明肽可与各种其它低聚肽或蛋白质结合。例如，本发明肽可与免疫原共价连接以产生抗该肽的抗体，其中抗体可用来鉴定有可比较构型的其它肽。另外，抗体可用来制备抗独特型抗体，它可与本发明肽竞争结合靶位点。这些抗独特型抗体可用来鉴定与本发明肽结合的蛋白质。
此外，本发明肽可与其它肽或蛋白质结合一起表达，作为链内或N-末端或C-末端的链部分。例如，通过使用合适的编码序列可提供脂化，如，异戊二烯化或肉豆蔻酰化。在此情况下，本发明肽可在末端处与脂质基团连接，结果就能与脂质膜，如脂质体结合。给药时，可使用脂质体，其中药物被引入脂质体腔内，这样通过与本发明肽合作于共同消灭CTL的激活。这样，免疫抑制剂也可包含在脂质体腔里，结果本发明肽和免疫抑制剂可在局部发挥作用。
本发明肽可以PEG化，其中聚氧乙烯基团用来增加其在血流里的寿命。本发明肽也可与其它蛋白质，如IgG同种型的Fc组合，它可结合补体或不结合补体，或与诸如篦麻毒素、红豆毒素、白喉类毒素等毒素，特别是A链组合。
如下制备这些组合物：制备编码特定肽或蛋白质的基因，加入到编码本发明肽的DNA序列中。可将该基因引入合适的表达载体中，可从市场上得到许多表达载体，从而使该基因在合适的宿主里表达。见Sambrook等，分子生物学(MolecularBiology)：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，美国纽约，1989。
本发明肽可如上所述，用化学合成或用重组技术来制备。可得到各种商品化的合成装置，如Applied Biosystems Inc.(美国加利福尼亚Foster市Beckman)的自动合成仪等。通过使用合成仪，天然存在的氨基酸可用非天然氨基酸取代，特别是用D-立体异构体，有不同长度的侧链或功能团等取代。对于重组技术，可制备一种核酸序列，它编码串联的多个本发明肽，带有插入的氨基酸或序列，它可断裂成单肽或头对尾的二聚物。没有蛋氨酸时，可插入允许单个氨基酸断裂的蛋氨酸。或者，可引入共同序列，它由特定的蛋白酶识别以便进行酶解断裂。制剂的特定序列和制备方法可通过方便、经济、所需纯度之类的方法等来测定。
可提供各种肽或蛋白质的化学连接，所述的肽或蛋白质包含供结合的方便的功能基团，如氨基供形成酰胺或取代胺，如还原性胺化作用，巯基供形成硫醚或二硫化物，羧基供形成酰胺等。特别好的肽有至少2个，更通常的是3个且不多于60个赖氨酸基团，特别是约4-20个聚赖氨酸，通常是6-18个赖氨酸单位，称为MAP，其中本发明肽可与赖氨酸氨基结合，至少约20％，更常见的是与至少约50％的氨基结合以得到多肽产物。因此，可得到有多个本发明肽的分子，其中本发明肽的取向是相同的，得到尾对尾二聚-或低聚物的连接基团。另外，其它天然存在的或合成的肽和蛋白质可用来作为骨架供连接到本发明肽的C末端。
就绝大部分而言，使用的组合物将包含至少20％(重量)所需的产物，更常见地是至少约75％(重量)，优选地是至少约95％(重量)，供治疗目的时，相对于因制备方法而产生的污染物而言，肽产品及其纯度通常至少约占99.5％(重量)。通常此百分数根据总蛋白计算。
需要时，在合成期间或表达期间可将各种基团引入肽，这使肽可连接到其它分子或表面上。这样，可用半胱氨酸来制备硫醚，组氨酸用于连接金属离子络合物，羧基用于形成酰胺或酯，氨基用于形成酰胺等。或者，如前所述可提供各种标记物，包括结合抗体或天然受体的配体，其中肽可与支持物连接，或与另一个分子连接。如前所述，本发明肽可与hsc70结合，这可使hsc70从细胞里发现的其它蛋白质里分离出来和纯化。
本发明肽可用来调节CTL和/或NK细胞的增殖和/或活化。通过使本发明肽与淋巴细胞结合，抗原呈递细胞对CTL的增殖和/或活化作用至少受到约20％，更通常是至少40％，较好的是至少约60％的调节，基于实验部分所述的溶解百分数。溶解的IC50通常低于约500微克/毫升，通常低于约200微克/毫升，以及更好的是多于约0.1微克/毫升，最好是多于约1微克/毫升。
本发明组合物在体外可抑制T细胞对靶抗原呈递细胞的溶解。因此，在希望保留细胞混合物的研究中，其中CTL被活化并杀死抗原呈递细胞，如巨噬细胞或B-淋巴细胞，或可作为靶细胞的其它细胞，如瘤细胞、病毒感染细胞等，此时可以抑制这种溶解，这样可在研究时保留细胞群。
本发明组合物也可体内使用。若器官移植，特别是实体器官或特定的细胞移植不论是异种基因的或同种基因的，供体器官可浸在含有本发明肽的培养液里。用该方法，存在于植入体内的参与移植物抗宿主疾病的CTL将受到抑制。当本发明肽与植入体保持结合期间，接受者的CTL活化会受到抑制。一般来说，培养液里肽的浓度将根据肽的活性、所需的抑制水平、影响CTL活性其它化合物的存在而定。通常浓度范围为约0.1-100微克/毫升，更常见的是约1-10微克/毫升。其它可存在从免疫抑制剂包括环孢素A、FK506、与移植排斥有关的质膜蛋白质的抗体，如CD4、CD8、CD2、LFA-1、ICAM-1、CD28的抗体等等。所用的亚治疗剂量不少于正常剂量的5％，通常不高于约75％，通常在约10-60％范围里。浸入培养液的其它组分通常由器官保存溶液里使用的组分，如HBSS构成。器官在介培养液里的保存时间通常为2-72小时。
本发明组合物也可体内使用，通过常规方法给予本发明肽组合物。本发明组合物可在植入前给予，在植入前不早于14天时开始给药，优选的是在给药三天里至少给予一剂。本发明组合物可在植入前约6小时开始给予，并此后按照预定的方案连续给药，通常不超过30天，更好的是不超过20天。但是，植入后，本发明肽组合物可根据接受者对器官或细胞的反应来按需给予。在一些情况下，只要植入物在宿主体内，本发明组合物可长期给药。
一般来说，在肽组合物直接给予宿主的情况下，给予本发明组合物药团的范围是约0.1-50，更常见的是约1-25毫克/千克宿主体重。宿主可为任何哺乳动物，包括家畜、宠物、实验室动物、灵长类的动物，特别是人。给药量根据肽的半衰期而定，其中半衰期通常至少一分钟，更通常是至少10分钟，理想的是在约10分钟到12小时范围里。短的半衰期是可接受的，只要以单次剂量或连续灌注剂量或重复剂量达到其效果即可。也可用低剂量范围甚至是极低剂量，当肽具有增加的半衰期或以存贮库方式提供时，如包含缓释组合物的颗粒，引入基质(如胶原蛋白基质)中，使肽保留更长的时间，用泵以基本上不停的速率在更长的时间里连续灌注肽，等等。
除了对细胞培养物，对体外的实体器官或特定的细胞，或对哺乳动物宿主体内直接给予本发明肽组合物外，也可给予编码本发明肽的核酸分子(DNA或RNA)，从而向需要使用者提供了本发明肽的有效来源。大部分情况下，在功能是促进核酸在合适环境里表达的调控序列的转录调节下，将编码本发明肽的核酸分子克隆入许多公知的表达质粒(参见Maniatis等，同上)和/或病毒载体之一中，优选的是腺病毒或逆转录病毒(retroviral)载体物(参见，如Jacobs等，J.Virol.66：2086-2095(1992)Lowenstein Bio/Technology 12：1075-1079(1994)和Berkuer，Biotechniques 6：616-624(1988))。这类基于核酸的运载体可直接体外给予移植物(如，供移植的体外病毒感染的细胞)或在需要的部位体内给予，如注射，插管等等，或在基于病毒的载体情况下可全身给药。可任选地使用组织特异性启动子以保证感兴趣的肽仅在所选择的特定组织或细胞里表达。重组制备这类核酸为基础的载体的方法如同给予核酸为基础载体在体外和体内产生肽的技术一样，在本领域中是公知的。
移植可及到何器官或细胞，包括诸如心脏、肾脏、肺、眼睛、肝脏、肠、脉管或其它器官，细胞可为如B-小岛细胞、骨髓细胞或其它细胞，其中器官或细胞是同种的或异种的，特别是与接受者相比，一种或多种I类或II类MHC抗原不同于供者。
本发明肽本身或这类肽的偶联物，或编码这类肽的核酸载体通常以药理学上有效的剂量，以药学上可接受的介质，如盐水、PBS、乙醇水溶液、葡萄糖、丙二醇等等配制成制剂，或以合适的赋形剂配制成固体制剂。肽或编码肽的核酸浓度可根据具体目的按常规方法凭经验而定。制剂包括杀菌剂、稳定剂、缓冲剂等。宿主的给药量根据所需给予的物质、给药的目的(如预防或治疗)、宿主的状态、给药的方式、给予数量和给药间隔等而变化，这些也可由本领域技术人员根据经验而定。为了增加本发明肽或其偶联物的半衰期，可将肽胶囊化，引入脂质体的腔里、制备成胶状体或使用其它常规的技术使肽体内或体外的半衰期延长。
本发明肽能抑制细胞产生炎症细胞因子。受本发明肽类抑制的炎症细胞因子包括，体外和体内的，如肿瘤坏死因子，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，干扰素，包括干扰素-γ(INF-γ)，白介素(IL)-1，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-16，MIP1α，趋化因子(chemokines)，红细胞生成的生长因子等。因此本发明肽可用于预防和治疗性地抑制与各种疾病，如败血性休克、Crohn疾病、肠炎、类风湿性关节炎和其它自体免疫疾病有关的疾病、过敏反应、动脉硬化症、感染和许多需要抗炎症反应的其它情况。
本发明组合物也能体外和体内调节含血红素的酶。如上所述，本发明肽模拟了卟啉样结构，它能调节含血红素酶，如血红素氧合酶(HO)、一氧化氮合成酶(NOS)的各种异构形式、环氧合酶、鸟苷酸环化酶等。因此，本发明组合物可用于希望上调含血红素酶(如血红素氧合酶)表达的情况。在这点上，已知血红素氧合酶涉及的途径并非是调节淋巴细胞活性的途径。因此，通过上调血红素氧合酶的表达，会影响涉及血红素氧合酶的途径。参见，如Willis等，天然医学(NatureMedicine)2：87-89(1996)。
此外，据报道，诸如血红素氧合酶等含血红素酶是炎症反应中的一个因素，可能具有抗炎作用。因此，通过比较有或没有本发明肽存在下的细胞反应，发现本发明肽用于培养物可提高含血红素酶在各种生理过程中的作用。本发明肽也可用于体内减少与败血性休克、Crohn疾病、肠炎(包括溃疡性和粘膜性肠炎)、类风湿性关节炎、动脉硬化症、再灌注、感染等有关的炎症反应。在这些说明书里基本上可得到用本发明肽调节淋巴细胞活性的说明。
本发明肽也可用来延缓处于这类自身免疫疾病进展危险中的哺乳动物自身免疫病的发作。本发明的肽特别可用来延缓处于胰岛素依赖性糖尿病、类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮疾病进展危险的哺乳动物此类疾病的发作。在这些说明书里也可得到本发明肽用于调节淋巴细胞活性的说明。
下列实施例仅供阐述，并非用作限定。
实验
如下所述用计算机程序预测和设计肽和假肽的免疫抑制活性：
1、方法
在显示肽有或没有免疫抑制活性的最初实验数据的基础上作出下列推论：
i.一种共同的序列，它含有上述活性所需的氨基酸，并可开发出新颖的肽或假肽文库。
ii.涉及上述活性的一组物理化学和拓扑学性质，并通过可变的测绘技术转换成组约束因素(Grassy等，J.of Molecular Graphics 13：356-367(1995))。
2、可变化的绘图(Variable Mapping)
从一组演练数据的结果推论时，该方法根据理化和构型约束因素。
理化约束因素(constraints)
该方法需要确定理化约束因素，它限定在所述生物活性的性质范围内。用来测定该组约束因素的计算机方法命名为可变化的绘图，描述如下。
可变化的绘图方法
该定量技术包括评估活性和失活分子的分布作为给定参数值的函数。所有图(活性-性质)的重叠部分，对于某些参数显示有限定值(低和/或较高)，这些值是产生活性化合物所必需的。该绘图方法分析了活性和分子性质之间的定量非线性依赖关系。尽管这些性质涉及到受体配体的相互作用，业已明确存在着决定受体适应性的完全偶然性，这暗示嵌入了某些结构性能和理化性能。该方法产生了简单的规则，它可用来预测未知产物的活性。显示相对于违背规则数目的成功数目的制图表达法，让人们能比较所研究的整个分子活性的分布。
3、用于限定涉及肽和假肽免疫抑制活性的约束因素的理化和拓扑学参数。
亲脂性
肽类的亲脂性表达为logP(其中P是肽在水和正辛醇之间的分配系数)。分子的logP值可通过TSAR 2.31，用Ghose等在J.Chem.Inf.Comput.29：163(1989)所测定的自动增量logP值计算。如初始数据分析所显示的那样，免疫抑制性肽的亲脂性必须≥-6.85。
拓扑学指数
Balaban指数(Balaban，Chem.Phys.89：399(1982))
如下计算连接分子图(H抑制的)的Balaban指数： M μ + 1 Σ ( D i D j ) - 0.5 其中M是图中边缘(edge)数，μ是图的圈数，即在G变成非环形前必须除去的最小边缘数，Di＝∑Dij(j＝1)是两个顶点之间最短途径的距离矩阵。
分子体积
分子体积按每个元素假定的标准Van der Waals半径，进行计算。对肽的伸展构型进行这种计算。
椭圆体积
在测定了分子惯性动量的三个分向量后，假定了构成原子的平均原子质量，对该体积进行计算。该计算是对肽的伸展构型进行的。
摩尔折射率
用Ghose等(同上)测定的原子摩尔折射率/值计算摩尔折射率。
偶极矩
该参数在肽的伸展构型上进行计算。分子的总偶极矩以Debye单位表达。
                         μ＝e∑riqi其中ri是原子i到起源处的距离，Qi是原子i的电荷。原子上的电荷用电荷-2方法(Abraham和Smith.，J.Comput.Aided Mol.Design 3：175-187(1989))计算。
Kier Chir V 4
该指数是L.B.Kier研究出来的一种连接性指数。Kier Chi V 4计算分几个步骤(包括H)。
a.测定和计算肽分子图上长度4的所有途径的数目。
b.用下式定量长度4的每个途径的计量： C s v = Π [ ( ∂ j v ) ] - 0.5 j＝1，4，其中一个原子的δi＝Zi-hi被定义为电子价Z1的总数和结合于原子i上的氢原子数hi之间的差。
c.对这些关于图上长度4的次级图的整套数据进行加和 x = Σ ( C v s ) Kier Kappa AlphaKier Kappa Alpha 1(Kα1)
若A是分子的原子总数(包括H)，Kα1等于： ( A + a ) ( A + a - 1 ) 2 ( P 1 + α ) 2 以及： α i = γ i γ C sp 3 - 1 ri是原子i的共价半径，rCsp 3是碳sp3的共价半径，P1是沿着研究中肽的分子图中途径长度＝1的总数。
Kier Kappa alpha 2(Kα2)
若A是分子的原子总数(包括H)，Kα1等于： ( A + α - 1 ) ( A + dα - 2 ) 2 ( P 2 + α ) 2 以及： α i = γ i γ C sp 3 - 1 ri是原子i的共价半径，rCsp 3是碳sp3的共价半径，P1是沿着研究中肽的分子图中途径长度＝2的总数。
屈曲性Phi
根据上式，分子的屈曲性可定义为：
                    Phi＝(Kα1)·(Kα2)/A
其中A是原子(包括H)总数。
原子和基团计数：
许多下列类型原子的数目也用作约束因素：
-肽的氧原子总数
-肽的氮原子总数
下列基团的数目也用作约束因素：
-乙基基团总数
-羟基基团总数
4、约束因素值
肽或假肽文库的产生
从共同序列Arg-X-X-X-Arg-X-X-X-X-Tyr开始，其中X是先前类似公式限定的一种氨基酸，计算出上述的理化和拓扑学参数，并判断这些参数是否位于最初演练数据所限定的约束因素值中。例如，从X＝Leu，nLeu，Trp，Tyr，Gly或Val开始可产生一个279，936分子诉文库，其中只有26个能满足所要求的约束因素值。
得到生物活性必须的性质范围归纳于下表I。
                       表  I
              理化和结构参数值的范围
    性质     最小     最大
    LogP     -6.849     -0.004
    椭圆体积(3)     5785.5     29460.00
    分子体积(3)     660.9     1050.4
    摩尔折射率     221.30     359.3
    Kier Chi V4     3.325     5.342
    Kappaα2     26.120     44.31
    屈曲性     22.50     40.3
    Balaban指数     2.846     6.701
    总偶极矩     3.423     80.79
    氧原子数     10     15
    氮原子数     8     20
    乙基数     0     1
    羟基数     1     3
5.涉及肽和假肽免疫抑制活性的构型空间的特征。
3D结构的空间自相关向量
Broto等，Eur，J.Med.Chem.19：66-70(1984)首先引入了分子结构自相关名称的概念。该向量基本上代表了主要从分子的内部原子距离里派生出来的可分辨的距离分布。该向量(Ao)的第一分向量等于结构的原子数，其它分向量A1…An定义为原子对数，这些原子对被较低的极限(n-1)Di所限定的范围里的一个距离隔开，其中n是该向量储存的等级，Di是距离增量。相似的是，可以计算原子性质P的分布。若加权的自相关组分APn通过APn通过加合相互距离间隔为[(n-1)Di，nDi]的原子i，j的性质值P产物得到。该向量的组分数目然后被定义为n最大＝(D最大/Di)+1，其中D最大是结构里原子之间的最大距离。
自相关向量显示一些有用的特征：
●该向量达到了构型数据本质上的减少。整个构型由一套有限的n值说明。
●该向量极易根据3D坐标数据计算。因此，在分子动态刺激期间可以计算和贮存该向量，与经典贮存的一套完全距离矩阵相比，贮存体积的减少涉及到让刺激可以比常规的时间长得多这样一个过程。
●构型的自相关向量在过渡期和转动期是不变的，也与分子的原子数无关。
●该向量对构型的极小改变和大改变都很敏感：构型改变越大，该向量的组分被修饰得越多。敏感性取决于计算时所选择的距离增量，但在0.5或1(小分子)到5(大分子)的增量是常用刺激的良好选择(Yasri等，蛋白质工程(Protein Engineering)11：959-976(1996))。
可以只分析一个结构的一部分或只分析该结构一个特定的原子亚组，如蛋白质里的C，N原子，重原子等。该向量通过结构知识来完整地限定，所以可用没有任何参照的该向量对不同的结构进行比较。
用3-D自相关向量进行分子动力学分析
此分析应用于HLA-B2702.75-84肽(氨基酸序列Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Ile-Ala-Leu-Arg-Tyr)和其各种活性和非活性的衍生肽，用AMBER4.1进行分子动力学刺激、十亿分之一秒(一纳秒)动力学刺激产生了一组103构型(每皮秒一个构型)。对于每个构型，用距离增量1的TSAR计算3D自相关向量，整组构型贮存为3D自相关向量对时间的矩阵(103×n)。
该工作的目的是采用相关文献所引用参考材料中叙述的方法，通过比较活性肽和非活性肽的构型空间来明确引起免疫抑制活性的构型空间。
统计分析
分群(ctustering)分析
为了比较不同的构型，测定了在多维空间里的所有这些构型之间的距离矩阵，此多维空间由它们未加权的3D自相关向量的诸分向量所限定。两个分向量的结构越相似，它们的距离越短。该方法提供了适合刚性分子的定量。用开始的构型作为参照，该距离的数值类似于根平均平方离差。
主要的分向量分析(PCA)
PCA是数据分析的多维统计方法，适合于在其性质(分子描述符)的多维空间里代表分子。PCA可用来将大量描述符减少到较小数目的由原先描述符线性组合产生的合成直交的可变数。原先的变化被标准化，用经典的Jacobi转换途径来计算协变性矩阵的对角线。3K自相关向量的分向量提供了不同构型3K结构的良好说明，但难以处理，因为它们含有太多的数据，而不容易看清楚。PCA可将空间维数减少到2D或3D，其中尽可能多地含有原始的信息。用PCA，免疫抑制肽显示了良好限定的共同构型空间。能达到这些构型规范的所有肽可显示出免疫抑制活性。
与肽bcl-nL生物活性构型的构型空间坐标
图1显示肽bcl-nL的二维构型空间和相关的构型，其中bcl-nL肽具有氨基酸序列Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr，其中“nL”是正亮氨酸(参见如下)。绘制的结构通过对肽bcl-nL的整个轨道进行分群分析方法获得。
肽bcl-nL的主要构型
表II归纳了bcl-nL(图1，(1)，(2)，(3)，(4)和(5))的主要逗留(visited)构型在其构型空间的结构性质。这些性质涉及由三个第一主要组分(PCA坐标)界定的三维空间中的坐标和旋转半径(Rg)。
                       表II
    肽bcl-nL的动态构型的空间坐标(PCA坐标)和旋转半径(Rg)
    构型     PCA坐标     Rg
    PC1     PC2     PC3
    (1)     0.785     -2.816     -0.531     9.92
    (2)     0.382     -.0899     -.0164     7.99
    (3)     -0.811     0.345     -.0481     6.93
    (4)     0.741     0.950     -1.092     6.76
    (5)     -2.096     -0.296     0.770     6.67
活性肽的构型空间
D2肽(氨基酸序列Arg-Val-Asn-Leu-Arg-Ile-Ala-Leu-Arg-Tyr)的轨道已用3-D自相关方法和主要组分分析的数据作了描述。这提供了在轨期间含有所有逗留构型的2个第一主要分向量所界定的主要平面。D2肽轨道被用作参照轨道，所有计算的轨道被投射入它的主平面(图2)。
免疫抑制肽显示了界定良好的常见构型空间，特征在于下列诸点：
PCA二维：
PC1：最小＝-2.0；最大＝2.0
PC2：最小＝-2.0；最大＝1.0
PC3：最小＝-1.0；最大＝1.0
制备下列肽作为组合物。
  bc#
  1   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  2   Arg   Val   Leu   Leu   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  3   Arg   Ile   Leu   Leu   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  4   Arg   Leu   Val   Leu   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  5   Arg   Leu   Ile   Leu   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  6   Arg   Leu   Leu   Val   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  7   Arg   Leu   Leu   Ile   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  8   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Val   Leu   Leu   Gly   Tyr
  9   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Ile   Leu   Leu   Gly   Tyr
  10   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Leu   Val   Leu   Gly   Tyr
  11   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Leu   Ile   Leu   Gly   Tyr
  12   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Leu   Leu   Val   Gly   Tyr
  13   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Leu   Leu   Ile   Gly   Tyr
  14   Arg   Trp   Leu   Leu   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  15   Arg   Leu   Trp   Leu   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  16   Arg   Leu   Leu   Trp   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  17   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Trp   Leu   Leu   Gly   Tyr
  18   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Leu   Trp   Leu   Gly   Tyr
  19   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Leu   Leu   Trp   Gly   Tyr
  20   Arg   Tyr   Leu   Leu   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  21   Arg   Leu   Tyr   Leu   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  22   Arg   Leu   Leu   Tyr   Arg   Leu   Leu   Leu   Gly   Tyr
  23   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Tyr   Leu   Leu   Gly   Tyr
  24   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Leu   Tyr   Leu   Gly   Tyr
  25   Arg   Leu   Leu   Leu   Arg   Leu   Leu   Tyr   Gly   Tyr
  lnL   Arg   nL   nL   nL   Arg   nL   nL   nL   Gly   Tyr
nL＝正亮氨酸
实施例1-be肽的抗增殖活性
从Jackson实验室(Bor Harbor，ME)购得成年6-8周龄的雄性C57BL6/J(B6，H-2d)，Balb/c(H-2d)和CBA/J(H-2k)小鼠。按照NIH指导和卫生部位的规则将它们保持在SangStat Medical Corporation的动物设施里。
用自动肽合成仪和Fmoc化学品在synt：em(法国Nimes)处合成诸肽。所有合成的肽为酰胺形式，然后转化为乙酸盐。用制备型反相HPLC纯化肽，通过分析型反相HPLC分析显示＞95％均质性，氨基酸组成以氨基酸分析予以证实。使用前，先将肽溶于1体积DMSO(Sigma)里，然后加入99份体积培养基。DMSO在培养物里的最终浓度不大于0.25％。
通过低渗休克溶解红细胞后制备脾细胞悬液。然后以培养基洗涤细胞，最后重悬于含有10％FBS(R-10培养基)的RPMI-1640里或无血清AIM-V培养基里(Gibco，美国纽约)。
从CBA小鼠分离得到脾细胞后用最终浓度0.1-1微克/毫升的抗CD3单克隆抗体(Pharmingen，美国圣地亚哥)在96孔圆底微培养板(Nunc，丹麦)中进行刺激，在培养初加入各种浓度的bc肽。细胞37℃，5％CO2培养3天。收集前24小时向每个孔中加入1μCi[3H]-TdR(Amershan，Arlington.Heights IL)。然后用Filtermate 196收集仪(Packord Downers Grove IL)收集细胞，用TopCount微板闪烁计数仪(Packard)测量胸苷的掺入程度。
从这些研究里得到的结果显示，虽然缺乏肽的PBS/DMSO溶液和对照肽2750(氨基酸序列Arg-Glu-Asp-Leu-Arg-Thr-Leu-Leu-Arg-Tyr)对T-细胞增殖没有作用，但bc肽对T-细胞增殖的抑制达35-75％。这些数据因此显示，bc肽能显著地抑制T-细胞增殖。
实施例2-bc肽对细胞毒T-细胞活性的影响
为了测定肽对细胞毒T-细胞活性的作用，制备CBA抗B6效应细胞，方法是在含有10％FBS的RPMI-1640的24孔板(Nuncion Delta，Nunc，丹麦)的孔中将4×106CBA脾细胞与用5×106丝裂霉素处理的B6细胞一起培养6天。然后收集效应细胞并洗涤。将EL4(H-2b)细胞(C57BL/6N中诱生的一种小鼠淋巴瘤)用作靶细胞。维持培养的EL4细胞，并每三天在20微升的(51Cr)中37℃1小时亚培养一次。然后将效应(E)细胞和靶(T)细胞一起加入V-形组织培养板中，E∶T比率分别为3∶1、10∶1、30∶1、100∶1。用R-10培养基将肽稀释到工作浓度，并在4-小时培养期之初加入。为了测定最大释放，向分开的各孔加入1％Triton X-100。然后在4小时培养前离心板2小时以增加细胞接触。培养后，每个孔收集75微升上清液，用TopDount闪烁计数仪计数51Cr的量。细胞溶解程度用下式计算：
这些分析得到的结果显示，浓度高达100微克/毫升的对照肽2705对T-细胞介导的靶细胞溶解没有作用，而bc肽以剂量依赖方式抑制了细胞介导的溶解。在约0.5微克/毫升时观察到bc肽对CTL活性的半数最大抑制。
实施例3-bc肽对体内同种移植物的作用
在血管化的完全错配的小鼠心脏同种移植模型中评价了bc肽的免疫抑制活性。特别是，按Ono和Lindsey，J.Thoracic Cardiovasc.Surg.7：225(1969)所述的方法进行腹部异位心脏移植。接受了C57B1/6心脏的CBA小鼠在器官移植后每天用各种剂量的肽处理。在腹腔内给药前，使肽溶于DMSO，并用PBS稀释(最终的DMSO浓度为10％)。在移植开始那天直至5天或9天对动物进行处理。每天通过直接触诊对移植存活进行监测，排斥的定义是可触摸到的心脏收缩终止。用Mann-Whitney检验计算心脏同种移植物存活延长的统计学意义。
这些分析的结果表明，给予80毫克/千克/天(0-9天)的对照肽2702.75-84(氨基酸序列Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Ile-Ala-Leu-Arg-Tyr)能将心脏同种移植物存活延长到10.7±2.6天，用PBS/DMSO处理的对照动物是8±1.4天(p，0.01)。对照肽2702.75-84以40毫克/千克/天给药时与对照处理相比，对移植物存活没有可观察到的作用。然而，相反的是，以低达1毫克/千克/天给予bc肽导致明显延长心脏同种移植物的存活，50％的移植物存活大于28天。因此，这些结果显示，bc肽具有的免疫抑制活性足以增加哺乳动物移植物存活。
实施例4-bc肽与hsc70结合的能力
为了测定bc肽是否能与hsc70结合，进行蛋白质结合试验。具体地说，合成肽2702.75-84的生物素化形式，系使生物素通过6个碳空间臂与肽的N-末端连接。ELISA板(Nunc Maxisorb，Nunc美国)用100ng/ml重组hsc70(Stressgen加拿大维多利亚)(在100mM柠檬酸纳缓冲液，pH4.0中)4℃包被过夜。随后，剩余的结合点用PBS/0.1％Tween 20(PBS/Tween；Sigma)室温培育板2小时进行封闭。用PBS/Tween洗涤板三次以除去未结合的材料。在加入生物素化的2702.75-84(以PBS/Tween/1％DMSO)后，室温培育板2小时，洗涤三次，用0.1微克/毫升与辣根过氧化酶偶联的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)(JacksonImmunoResearch实验室，West Grove，美国宾夕法尼亚)一起培育，并再洗涤。用3毫克/毫升以底物缓冲液(SangStat，Menlo Park，美国加利福尼亚)配的邻-苯二胺(OPD；Sigma)检测结合的链霉亲和素-HRP。加入1M盐酸中止反应，用ELISA板读数仪测量吸光率(OD490-OD605)。在竞争试验里测量未标记肽的结合。使生物素化的-2702.75-84(3μM)与不同量的未标记bc肽混合，然后在hsc70包被的板上室温培育3小时。然后如上所述检测结合的生物素化的-2702.75-84。
这些实验的结果表明，用2702.84-75-75-84肽(逆向的二聚体)的亲和层析导致hsc70和hsp70的纯化。用生物素化的-2702.75-84培育hsc70包被的ELISA板时可观察到该肽与hsc70的剂量依赖性结合。生物素化的-2702.75-84与hsc70的结合可被加入逐渐增加浓度的2702.75-84所抑制。在7.0±3.0μM时观察到半数最大抑制(IC50)。对于bc肽可观察到相似的IC50(IC50＝2.5-10μM)，从而证明bc肽能有效地与hsc70结合。
实施例5-bc肽对血红素氧合酶和其它血红素酶的作用
通过在有或没有bc肽存在下测量血红素氧合酶(HO)来评估bc肽对hsp32(血红素氧合酶)的作用。具体讲，使小鼠脾样品在冰浴上在含0.5％Triton X-100和蛋白合酶抑制剂的Tris-Cl裂解缓冲液里均浆化。样品以小量等分冷冻直到使用。脾均浆用作HO的来源供所有活性测量。从大鼠肝脏里用Kutty和Maines，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，256：3956(1981)所述的方法纯化胆绿素还原酶。如下测量HO活性：使100微升脾均浆与0.8mM NADPH、0.8mM葡萄糖-6-磷酸盐、1.0单位G-6-P脱氢酶、1mM MgCl2和10微升胆绿素还原酶在4℃下混合。加入20微升2.5mM的Hemin引发反应。使反应混合物37℃黑暗中培育30分钟。培养结束时，离心去除任何不溶的物质，用Hillman和Beyer，Z.Klin.Chem.5：92(1981)(Sigma Diagnostics，试剂盒#552)的改进方法分析上清液里的胆红素浓度。对照包括在没有NADPH生成系统中的脾样品和没有脾均浆的反应混合物的所有组分。
这些实验结果显示，与无活性的对照肽2705.75-84相比，bc肽(100微克/毫升)抑制了HO活性达50％以上。因此，bc肽能抑制血红素氧合酶活性。
由于已确定bc肽能有效抑制血红素氧合酶活性，故也测定了bc肽对其它血红素酶，如-氧化氮合成酶(NOS)的作用。具体讲，分析了bc肽和对照2702肽在酶活性试验中抑制三个不同NOS同I型酶(神经元NOS，内皮NOS和发细胞因子可诱生的NOS)的能力。酶活性实验结果显示，bc肽能抑制NOS，其IC50明显低于对照2702肽的IC50。因此，bc肽似乎模拟了特异性影响含血红素酶活性的嘌呤样结构，这已用计算机模型得以验证。
实施例6-bc肽介导对炎症细胞因子产生的抑制
为了测定bc肽对炎症细胞因子产生的影响，在试验肽(1-100μM)存在或不存在条件下，用10微克/毫升细菌脂多糖(LPS)刺激培养中的RAW264.7巨噬细胞以产生炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(参见Alleva等，免疫学杂志153：1674(1994))和Tonetti等，Biochem.Biophs.Res.Comm.230：636-640(1997))。培养24小时后，用ELISA测定培养上清液里的TNF-α的量。不加LPS，RAW264.7细胞不产生可检测量的TNF-α。
这些实验的结果表明，虽然对照肽D2RP(氨基酸序列Arg-Val-Asn-Leu-Pro-Ile-Ala-Leu-Arg-Tyr)显示不能抑制RAW264.7巨噬细胞产生TNF-α，但bc肽以剂量依赖方式抑制了TNF-α的产生。因此，bc肽能用来抑制炎症细胞因子的产生，从而可有利地用来治疗发炎和与发炎有关的疾病。
实施例7-bc肽对治疗物模式的败血症休克的作用
给予小鼠LPS提供了可接受的败血症休克的动物模型(参见Otterbein等，Amer.J.Physiol.272(2)：1(1997)，Albrecht等，Hepatology 26：1553-1559(1997)，Haziot等，免疫学杂志，154：6529-6532(1995)和Otterbein等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.13：595-601(1995))。为了提供用bc肽治疗炎症反应和炎症疾病(如败血症休克)的进一步证据，在给予LPS后检验了bc肽对小鼠存活的影响。具体讲，用20毫克/千克以甘露醇配的对照肽2705或bc肽，或单用甘露醇治疗小鼠，用100毫克/千克LPS注射小鼠，每天两次监测小鼠的存活率。
这些实验结果显示，所有用甘露醇配的对照肽2705或只用甘露醇治疗的小鼠在给予LPS一天后死亡，而用bc肽治疗的小鼠在给予LPS2天后超过50％还活着，在给予LPS3天后仍有25％以上的小鼠存活。因此，这些数据显示bc肽能有效地治疗诸如败血症休克等炎症疾病。
实施例8-通过体内基因转移给予bc肽来增加小鼠异位心脏移植物的存活
接着在鼠异位心脏移植模型里测定通过质粒介导的基因转移局部输送bc肽是否能延长体内移植物的存活。具体讲，将C57BL/6供体新生的心脏皮下移植到CBA/J接收小鼠的耳翼。在移植的同时将bc肽或20微克编码bc肽的质粒DNA直接注射到同种移植物里。用心电图监测来测定同种移植物的存活情况，心电活性停止被定为排斥。移植物存活以天数表达(平均±SEM)。用非配对的Student’s t-检验来确定统计学显著意义。
将1微克对照肽2702直接注入同种移植物不会延长存活天数(13.3±0.75对未处理对照的13.9±0.9)，但注射400微克2702肽可延长存活天数(22.0±0.58)。注射20微克编码对照2702肽的质粒DNA进一步将移植物的存活天数延长到30.3±1.03。用编码bcl肽的另一种质粒得到相似的结果(29.0±4.08)，但用编码对照肽2705的质粒观察不到显著的延长，此肽在体外或体内都没有免疫调节活性(16.5±0.96)。
这些结果显示，编码bc肽的基因体内转移是提供治疗用的bc肽的一个有效手段。
实施例9-bc肽对延缓胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)发作的效果
由于本发明的肽具有免疫调节作用，下面我们体内测定了bc肽是否对抑制自身免疫疾病的发作有效。作为自身免疫疾病的一般模型，我现体内测定了bc肽延缓或抑制IDDM的发作。具体讲，将20毫克/千克bc肽腹腔内给予6周龄雌性无糖尿病(NOD)小鼠，其中对照小鼠或不处理，或用无活性的肽化合物处理。每周重复上述处理。每周对试验动物的血糖水平测量一次。试验动物IDDM的发作定义为血糖水平高于200毫克/dl。
上述实验结果显示，70-80％未处理NOD小鼠在22周发生IDDM。未处理组或用无活性对照肽处理组的对照动物组里没有观察到差异。但是，在用bc肽处理的动物种，只有一个动物在16周发生IDDM，所有其它的试验动物在24周中都没有发生IDDM。因此，这些结果显示，给予bc肽能有效地延缓体内IDDM的发作。
上述结果证实，本发明组合物和方法学提供了对CTL的细胞毒性的实质性抑制。令人惊奇的是，本发明肽与较早的低聚肽相比在抑制裂解上具有明显增加的效力。使用本发明组合物证明有明显优点：低聚肽达到治疗水平所要求的用量较低并能抑制血红素氧合酶的活性。
本说明书中提及的所有公开文本和专利申请都在一定程度上纳入本文供参考，甚至每单个公开物或专利申请都被具体地指出纳入本文供参考。
本发明现已作了完整的阐述，很显然本领域的普通技术人员能对其作出许多改变和修饰而不背离所附权利要求书的精神和范围。

Claims (33)

1.一种低聚肽，它有至少9个氨基酸，由表I的参数所限定，其中所述的氨基酸是天然存在的L-异构体，它们的D-异构体和正亮氨酸，并包括除了以下序列的低聚肽：(a)HLA-Bα1-结构域75-84的天然存在序列，(b)人T细胞受体α链跨膜序列的天然存在序列和(c)具有不到两个突变作为所述低聚肽的活性部分的(a)或(b)的突变序列。
2.根据权利要求1所述的低聚肽，其中所述的低聚肽为9-30个氨基酸，并且包括氨基酸序列：
               B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr，其中：
B是Lys或Arg，
X是不带电荷的脂簇氨基酸或其D-异构体，
J是Gly，Lys或Arg。
3.根据权利要求1所述的低聚肽，其中所述的低聚肽不多于20个氨基酸，为单体、二聚体，或含有低聚肽环部分。
4.根据权利要求2所述的低聚肽，其中：
B是Arg；
X是有5-6个碳原子的脂族非极性氨基酸，包括正亮氨酸，芳族氨基酸或其D-异构体，在所述的低聚肽里至少有3个相同的脂族非极性氨基酸；
J是Gly或Arg。
5.根据权利要求4所述的低聚肽，其中定义为X的至少5个氨基酸是缬氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，剩余的定义为X的氨基酸是Trp或Tyr。
6.根据权利要求5所述的低聚肽，其中至少5个X氨基酸是相同的。
7.根据权利要求2所述的低聚肽，它包括选自下列组的氨基酸序列。
       (a)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；
       (b)Arg-Val-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；
       (c)Arg-Ile-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；
       (d)Arg-Leu-Val-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；
       (e)Arg-Leu-Ile-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；(f)Arg-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；(g)Arg-Leu-Leu-Ile-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；(h)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Val-Leu-Leu-Gly-Tyr；(i)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Gly-Tyr；(j)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Val-Leu-Gly-Tyr；(k)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Ile-Leu-Gly-Tyr；(l)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Val-Gly-Tyr；(m)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Ile-Gly-Tyr；(n)Arg-Trp-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；(o)Arg-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；(p)Arg-Leu-Leu-Trp-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；(q)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Trp-Leu-Leu-Gly-Tyr；(r)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Trp-Leu-Gly-Tyr；(s)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Trp-Gly-Tyr；(t)Arg-Tyr-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；(u)Arg-Leu-Tyr-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；(v)Arg-Leu-Leu-Tyr-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr；(w)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Gly-Tyr；(x)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Tyr-Leu-Gly-Tyr；(y)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Tyr-Gly-Tyr；和(z)Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr
8.一种抑制淋巴细胞活化的方法，所述方法包括：
使所述的细胞与活性抑制量的化合物结合，所述的化合物包含权利要求1-7任一所述的低聚肽；
其中所述淋巴细胞的活化被抑制。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的结合步骤中除了淋巴细胞以外还有活的实体器官或活的细胞存在。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述的结合步骤包括使所述淋巴细胞与编码所述低聚肽的核酸分子接触，其中所述的低聚肽由所述核酸分子表达。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的核酸分子包含于病毒中。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述的淋巴细胞是细胞毒T淋巴细胞。
13.一种将供体哺乳动物的器官、或不是作为活器官部分的细胞，移植到哺乳动物接收者的方法，该方法包括：
从所述的供体分离所述的供体器官或细胞，并将所述的供体器官或细胞移植入所述的接收者，其改进在于，它包括至少一个下列步骤：
(a)在所述的器官或细胞移植入所述的哺乳动物接收者前，使所述的器官或细胞与活性抑制量的化合物混合，所述的化合物包含如权利要求1-7任一所述的低聚肽；或
(b)在将所述供体器官或细胞移植前开始到移植期间给予所述的哺乳动物接收者活性抑制量的化合物，所述的化合物包含如权利要求1-7任一所述的低聚肽。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的结合步骤包括使所述器官或细胞与编码所述低聚肽的核酸分子接触，其中所述的低聚肽由所述核酸分子表达。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述的给予步骤包括给予所述哺乳动物接收者编码所述低聚肽的核酸，其中所述低聚肽由所述核酸分子表达。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述的核酸分子包含于病毒。
17.一种抑制由能产生炎症细胞因子蛋白的细胞产生的炎症细胞因子蛋白方法，所述的方法包括：
使所述细胞与炎症细胞因子产生抑制剂量的化合物结合，所述的化合物包括权利要求1-7任一所述的低聚肽；
其中由所述细胞产生的所述炎症细胞因子得到抑制。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的结合步骤中有活的实体器官或除了能产生所述炎症细胞因子蛋白的细胞外的活的细胞存在。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述的炎症细胞因子蛋白选自肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16和MIP1α。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述的结合步骤包括使所述细胞与编码所述低聚肽的核酸分子接触，其中所述的低聚肽由所述核酸分子表达。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述的核酸分子包含于病毒中。
22.一种抑制哺乳动物炎症反应的方法，所述方法包括：
使所述哺乳动物与炎症反应抑制剂量的化合物接触，所述化合物包括权利要求1-7任一所述的低聚肽；
其中所述的炎症反应得到抑制。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的接触步骤包括给予所述哺乳动物编码所述低聚肽的核酸分子，其中所述的低聚肽由所述核酸分子表达。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述的核酸分子包含于病毒中。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述的炎症反应与败血症休克、类风湿性关节炎、Crohn疾病或肠炎相关。
26.一种调节含血红素酶活性的方法，所述方法包括：
使含所述酶的系统与活性调节剂量的化合物接触，所述化合物包含权利要求1-7任一所述的低聚肽；
其中所述含血红素的酶得到调节。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述的含血红素酶选自血红素氧合酶、一氧化氮合成酶、环氧合酶和鸟苷酸环化酶。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述的接触步骤包括给予所述系统编码所述低聚肽的核酸分子，其中所述的低聚肽由所述的核酸分子表达。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述的核酸分子包含于病毒中。
30.一种对处于自身免疫疾病发展危险中的哺乳动物延缓其所述疾病发作的方法，所述的方法包括：
给予所述哺乳动物自身免疫疾病抑制剂量的化合物，所述化合物包含权利要求1-7任一所述的低聚肽；
从而自身免疫疾病的发作得到抑制。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述的自身免疫疾病是IDDM、类风湿性关节炎或全身性红斑狼疮。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述的给药步骤包括给予所述哺乳动物编码所述低聚肽的核酸，其中所述低聚肽由所述核酸分子表达。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述的核酸分子包含于病毒中。
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