CN104231054A

CN104231054A - Il-10多肽抑制剂

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Publication number: CN104231054A
Application number: CN201410441333.8A
Authority: CN
Inventors: 刘晓松; 王天放; 王跃建
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-09-01
Filing date: 2014-09-01
Publication date: 2014-12-24

Abstract

本发明涉及一种多肽及其制备方法，可采用固相合成法和生物合成法，本发明的生物合成法还涉及编码所述多肽的核苷酸序列，包含编码所述多肽的核苷酸序列在内的表达载体，包含所述表达载体在内的宿主细胞，本发明还涉及含有所说的多肽的药物组合物，本发明还涉及这种多肽或其组合物在制药领域的应用，尤其是这种多肽或含该多肽的组合物在制备预防或治疗疾病时阻断白介素10药物中的应用。

Description

IL-10多肽抑制剂

技术领域

本发明涉及一种多肽及其制备方法，本发明还涉及这种多肽在制药领域的应用，尤其是利用这种多肽具有抑制白细胞介素－10的功能，在制备预防或治疗疾病时，阻断白介素10药物中的应用。

背景技术

白细胞介素－10(IL-10)是一个在免疫调节和炎症反应中具有多向性作用的细胞因子，其功能包括了截然相反的两个方面，免疫抑制和免疫促进。IL-10蛋白是二聚体，每个亚单位的长度为178个氨基酸。由很多免疫细胞分泌，包括TH1，TH2和TH17亚类，调节性T细胞(TReg)，CD8+T和B细胞。也在启动免疫反应的细胞中表达，包括树突状细胞(DCs)、巨噬细胞、浆细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等，IL-10通过抑制病原体的免疫反应来防止对宿主的损害。

当IL-10在免疫反应启动阶段出现时可中止T细胞的反应，能抑制现有T细胞抗病毒感染的能力。而且IL-10可直接作用于T细胞，限制其复制、功能分化和效能。在慢性病毒感染和癌症患者血清中常发现IL-10非常过量的表达，使针对慢性病毒感染，肿瘤免疫反应消失而引起严重后果而在丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、免疫缺陷病毒(HIV)和EB病毒(EBV)感染中低水平的IL-10常与病毒的清除和病毒的有效控制存在相关性。

IL-10还与体内自身免疫相关。自身免疫由靶向正常组织的自身抗体、自身反应性T细胞或它们的某些组合的发展引起。自身免疫性疾病的一个实例是全身红斑狼疮(SLE)，一种全身的结缔组织都成为炎性的慢性风湿性疾病；自身抗体将正常的身体组织误认为是外部侵入的物质，攻击正常的身体组织，引起特征性的炎症，其中一些是有肾脏病毒性的；SLE在女性中的发病率高于男性十倍，它可以在任何年龄段发作，但最常见的是在年轻成年人中。体内和体外研究都表明，阻断IL-10产生可以减轻SLE的临床表现【参见，Gonzalez-Amaro等，J.Autoimmunity 11：395-402(1998)】。

治疗性地阻断IL-10信号来增加抗病毒免疫和疫苗效果在抗病毒治疗中越来越有前景。动物实验表明，阻断白介素10，可以清除慢性病毒感染，如果在DNA疫苗免疫时阻断白介素10，可以更好地清除慢性病毒感染。卡介苗免疫时阻断白介素10，可以诱导动物产生更强的T细胞免疫反应，比仅仅使用卡介苗免疫，可以更好地保护免疫动物免受结核菌感染。此外，肿瘤组织局部注射Toll样受体9配体CpG，腹腔注射抗白介素10受体抗体，可以抑制肿瘤生长；病毒样颗粒免疫时阻断白介素10，可以提高病毒样颗粒疫苗诱导的T细胞免疫反应。疫苗多肽疫苗结合Toll样受体4配体脂多糖LPS免疫时阻断IL-10信号，也可以抑制人乳头瘤病毒E7抗原转化的TC-1肿瘤细胞在小鼠中的生长。免疫时阻断白介素10提高疫苗诱导的T细胞反应，清除病毒感染，抑制肿瘤生长的可能机理是，阻断了白介素10对抗原提呈细胞、特别是树突状细胞的抑制作用。

IL-10受体是由IL-10R1和IL-10R2亚单位组成的二类细胞因子家庭成员，IL-10R1是唯一的配体连接亚单位。IL-10R2是信号传导的亚单位，与其他细胞因子(IL-22，IL-26，IL-28和IL-29)所共有。因此最近认为使用特定的分子、抗IL-10或抗IL-10受体的抗体来阻断IL-10R1与IL-10结合是解决这个问题的可行方法。美国先灵公司申请的200480040148.2及其两份分案申请201010004581.8、201010004582.2均涉及白细胞介素-10抗体。但临床使用级的抗体(如单克隆抗体)由于高成本生产和复杂的管理批准程序等原因尚未投入临床使用。

发明内容

本发明的目的就是为了提高一种与IL-10配体连接亚单位IL-10R1易于结合、从而据此机制来抑制IL-10生物学功能的多肽。

本发明还公开了这种多肽的制备方法。

本发明还公开了这种多肽在制药领域中的应用。

PharmaR&D计算模型和模拟方法已成为药物研发程序的整体组分之一。以结构为基础的药物设计方法(Structure-based drug design,SBDD)迅速得到发展和广泛应用。可在靶分子(如相关的蛋白/受体的疾病)、药物候选分子和获得更可靠的模型等方面提供非常好的前景，如连接位置(蛋白与受体连接位置)、互相作用机制(蛋白与受体结合，氢键连接，库仑相互作用和某一残端侧链的螯合的方式)，相互作用力(破坏蛋白与受体间共价或非共价键所需的最小能量)和复合物的稳定性(例如温度和PH改变的影响，其他分子或离子存在的影响等)。通过分析这些数据，构建候选多肽，并用生物学检测方法来进一步验证。随着计算能力的增强以及高分辨率量子加速X线晶体学获得更准确的蛋白/受体结构，基于寻找理想的候选肽的SBDD方法由于其易于合成，低毒性和无公害吸引了越来越多研究者的兴趣。

本发明应用分子动力学模拟模型用AMBER12系列程序来模拟分析体内外IL-10和IL-10R1相互作用，鉴定结合区域和作用力。然后以目标QM/MM模拟方法获得的生物学信息为基础设计若干个多肽序列。理想的多肽在计算模拟中具有阻断IL-10和IL-10R1之间信号的能力，模拟方法显示在生理状态下IL-10R1与多肽更易于结合，据此机制来抑制IL-10的生物学功能。

根据上述原理，本发明经过计算，设计并提供了一种多肽序列(氨基酸序列)，是在端部具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列：

SEQ ID No：1：FFKKF FKKFF KKFFK K-OH,即

NH3-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-COOH.

其中，氨基酸K(赖氨酸,Lys)可以为R(精氨酸，Arg)全部替代；替代后，多肽序列(氨基酸序列)端部的氨基酸序列为SEQ ID No：2：FFRRF FRRFF RRFFR R-OH。

这种替代也可以部分取代，包括一个替代、两个替代、三个替代、四个替代和五个替代，替代的氨基酸可以是任何位置。包括SEQ ID NO：1和2的所有片段序列，如FFKKF FKKFF KK-OH，FFKKF FKKFF KKFF-OH，FFKKF FKKFF-OH,FFRRFFRRFF RRFF-OH，FFRRF FRRFF RR等。

本发明多肽的氨基酸序列优选为：SEQ ID No：1：FFKKF FKKFF KKFFK K-OH,即

NH3-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-COOH；或者

优选为SEQ ID No：2：FFRRF FRRFF RRFFR R-OH；即

NH3-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-COOH。

模拟结果：SEQ ID No：1、2多肽可以与IL-10R1受体结合，并形成较IL-10更为稳定的复合物结构。

1、设计多肽SEQ ID No：1,2和IL-10R1受体的相互作用

分子动力学模拟结果显示通过长时间的模拟SEQ ID No：1，2与IL-10R1所形成复合物的代表构型的主链构型根平均方差均在以下，而且，势能也逐渐下降并趋于平稳，说明已经形成了稳定的构型。

2.复合物解离能的比较

在此，我们引入解离能的定义及计算方法。解离能，E_D，为解离IL-10R1与IL-10或设计多肽序列所形成复合物形成单体所需要的能量，具体计算公式如下，

E_D＝E_CX-E_r＝E_p

其中，E_D为解离能(负值表示需要从外界吸收能量)，E_CX、E_r、E_p依次为复合物、IL-10R1、IL-10或设计多肽序列的势能。

计算结果如表1所示，相对于IL-10与IL-10R1形成的复合物，SEQ ID NO：1、2多肽与IL-10R1所形成的复合物均需要更多的能量才能被解离。由此可以从理论上证明，设计多肽与IL-10R1形成的复合物更稳定，所以具有与IL-10R1优先结合的能力，从而抑制了IL-10，而且SEQ ID NO：1的效果更好。

表1IL-10或设计多肽序列与IL-10R1形成复合物解离能

体外实验表明本发明所说的多肽具有白细胞介素-10抑制剂的作用。

1.SEQ ID No:1和SEQ IDNo:2多肽可以抑制抗白介素10受体抗体与人巨噬细胞U937细胞上的受体结合。

U937细胞表面的白介素10受体可以与经荧光标记的抗白介素10受体抗体结合后，经流式细胞仪检测出。当U937细胞与SEQ ID No:1或者SEQ IDNo:2多肽混合后，再与经荧光标记的抗白介素10受体抗体结合后，其细胞膜表面上的白介素10受体的检出水平明显降低，表明SEQ IDNo：1和No：2多肽与U937细胞膜上的白介素10受体结合后，降低和阻断了抗白介素10受体抗体与受体的结合(见图3)。

2.SEQ ID:No.1和SEQ No.2多肽抑制IL-10分泌。

U937细胞经Toll样受体4配体脂多糖LPS刺激后，可以分泌白介素10。白介素10通过与细胞膜上白介素10受体结合，进一步增加白介素10的分泌。U937细胞中如果加入SEQ ID No：1或No：2多肽，U937细胞分泌的白介素10的水平明显降低。说明SEQ ID No：1和No：2在与白介素10受体结合后，阻断了LPS诱导的白介素10分泌(见图4)。提示使用Toll样受体配体作为佐剂时,SEQ ID No：1和No：2多肽可以明显减少疫苗诱导的白介素10分泌，进而增强疫苗诱导的T细胞免疫反应。

3.SEQ IDNo：2多肽促进IL-12分泌

白介素12的增加有助于疫苗诱导T细胞免疫反应，特别是Th1细胞反应和细胞毒性T细胞反应。Th1，细胞毒性T细胞反应增高可以增强疫苗的抗肿瘤、抗病毒反应。人单个核细胞经LPS刺激后，分泌白介素12，阻断白介素10，可以增加LPS诱导的白介素12的分泌。单个核细胞在LPS刺激时，加入SEQ No：2多肽，可以增加LPS刺激人单个核细胞诱导的白介素12的分泌(见图5)。

4.SEQ ID No:1和No:2多肽不引起U937细胞死亡

SEQ ID No:1和No:2多肽降低细胞分泌白介素10，并非由于它们的细胞毒性所引起的。7-AAD试剂可以进入死亡细胞，与细胞核结合后，可以用流式细胞仪检测出。U937细胞分别经LPS，LPS与SEQ ID No:1或No:2结合刺激后，其死亡细胞的数量没有差别(见图6)，说明SEQ ID No:1和No:2对于细胞的毒性可以忽略。

因此，SEQ IDNo:1和No:2多肽具有显著抑制白介素10分泌的功能。

本发明的SEQ ID No:1和No:2多肽或者其他多肽与Toll样受体配体，如脂多糖，CpG等联合使用，刺激增强非特异性免疫的效果。

本发明的SEQ ID No:1和No:2多肽或者其他多肽，可在结核菌预防性疫苗卡介苗中联合使用，增强卡介苗的免疫效果。

本发明的SEQ ID No:1和No:2多肽或者其他多肽，具有增强治疗性疫苗治疗疾病的效果，如与人乳头瘤病毒疫苗联合使用，治疗由人乳头瘤病毒感染引起的疾病，如宫颈癌，外阴癌，头颈部肿瘤，呼吸道人乳头瘤病毒感染，尖锐湿疣等。

本说明书中，“治疗”是指能够发挥被检者的疾病或伴随疾病的1个以上症状的、预防或状改善效果。

本发明所说的多肽，经过设计后，包括但不限于SEQ ID No:1和No:2多肽，可以采用本领域人员所熟知的方法化学合成方法常规合成,例如：固相合成法等。

本发明所说的多肽，包括但不限于SEQ ID No:1和No:2多肽，也可以采用生物方法合成。为此，本发明还涉及编码所说的多肽(氨基酸序列)的核苷酸序列。本发明还提供包含所说的核苷酸序列的表达载体，以及用所述的表达载体转化宿主细胞所得的转化体。本发明进一步提供了一种制备所说的多肽的方法，包括以下步骤：培养所述转化体，回收所表达的所说的多肽。

本发明通过设计一对引物，将编码所说的多肽的基因克隆到真核整合型分泌表达载体，如：pHIL-S1上，构建成表达质粒，并将重组表达载体转化毕赤酵母GS115。此表达载体以AOX为启动子。通过对培养时间和诱导时间的摸索，所说的多肽的表达量占培养基总蛋白的25％以上，并且处于可溶状态。

本发明所用的真核表达载体还可选用胞内型载体：pAO815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ，或者分泌型载体：pPIC9K、pPICZα、pGAPZα，或者市面上销售的同类载体。所用的真核表达菌株也可以选用毕赤酵母菌KM71、MC100-3、SMD1168、SMD1165、SMD1163等作为宿主细胞。

本发明也可用原核表达体系来实现，选用表达载体：pET、pUCH33等，或者市面上销售的同类载体；选用原核表达菌株：大肠杆菌BL21、大肠杆菌JM109等作为宿主细胞。

如果需要，可用已知的方法进行分析，以确认正确的序列出现在所构建的载体中。构建表达载体、体外制备转录产物、将DNA导入到宿主细胞、进行分析以评价表达和功能的合适方法为本领域技术人员所知。用如Southern或Northern分析法、Western印迹、DNA、RNA或蛋白的斑点杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学、核酸或蛋白分子的序列分析的常规方法来检测样品中的基因序列，或对其扩增和/或表达进行定量分析,或高效液相色谱和质谱联用。本领域技术人员如果需要则可适当调整这些方法。

表达载体的复制方法：参照Sambrook等的方法(Sambrook，et al.2002，Molecular cloning.Cold Spring Harbor Laboratory Press.USA)，按CaCl₂法制备并转化感受态细胞E.Coli.DH5α，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基培养细菌，碱法提取质粒。

本发明还摸索了重组所说的多肽的纯化条件，发酵液经硫酸氨沉淀后采用疏水色谱层析和金属亲和色谱层析两步纯化法得到重组所说的多肽，重组蛋白纯度达95％以上。若采用固相合成，则可直接应用反相高效液相色谱纯化，合成蛋白纯度在97％以上。。

本发明还涉及一种组合物，其包括所述的多肽包括但不限于SEQ ID No:1和No:2多肽，和药学上可接受的载体，制备成制剂，包括溶剂如，生理盐水，磷酸缓冲盐水(PBS)，林格氏溶液，右旋糖苷/盐水，Hank′s溶液，和葡萄糖；载体还可以含有药学上可接受的的辅助物质，如缓冲剂，张力调节剂，润湿剂，洗涤剂，等等；也包括另外的活性成分，如，杀菌剂或稳定剂。给患者施用的量随给药的对象，给药的目的如预防或治疗，宿主的状态，给药的方式，等等不同而改变。

预试验结果表明，本发明含有SEQ ID No:1或No:2多肽的组合物,具有与SEQ ID No:1或No:2多肽单体相类似的作用，相近似的结果。

本发明的组合物也可以与Toll样受体配体，如脂多糖、CpG，或者与结核菌预防性疫苗卡介苗，或者与人乳头瘤病毒疫苗组合，制成组合物，起到增强卡介苗的免疫效果，或者增强治疗性疫苗治疗疾病的效果，如与人乳头瘤病毒疫苗联合使用，治疗由人乳头瘤病毒感染引起的疾病，如宫颈癌，外阴癌，头颈部肿瘤，呼吸道人乳头瘤病毒感染，尖锐湿疣等。

一般药物组合物是胃肠道给药，也可以采用静脉或肌肉注射，也可以采用透皮吸收制剂。口腔给药形式可改进组合物制备成肠溶制剂以绕过胃环境在肠道吸收的方式提供。这些组合物可用常规灭菌技术灭菌，或者可通过无菌过滤灭菌。

所得到的含水溶液可储存备用，或者被冻干，在给药前把这种冻干制剂与一种无菌含水载体结合。本发明的多肽还可以与第二种生物活性剂如常用的化学治疗剂一起给药。这种试剂包括但并不限定为长春新碱，柔毛霉素，左旋天冬酰胺酶，mitoxantrone和胺苯吖啶。

在治疗使用中，足以产生所需功效的用量被定义为“治疗有效剂量”。多肽的治疗有效剂量随着如，进行治疗的特定用途，给药方式，患者的健康状况，和治疗医生诊断的不同而变化。例如，对一个70Kg患者连续输入的剂量一般是每天500ng左右到800μg左右的范围，优选在约1.0μg和约300μg之间。该剂量一般为700ng/Kg/天和16μg/Kg/天之间。

在药物制剂中多肽的浓度能够较大地变动，就是，从约10μg到约5mg/ml，优选在约100μg和约2mg/ml之间。一般根据所选的特定给药方式，主要用液体体积，粘度等方法来选择浓度。这样，用于静脉内输入的常用药物组合物能被制成含有250ml右旋糖苷/盐水溶液和2.5mg多肽。

对于固体组合物，可使用常规的非毒性固态载体，它包括：如，药用甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等等。对于口腔给药，一般混合常用的赋型剂，如前面所列出的那些载体，和一般为10-95％的活性成份，也就是本发明的多肽，优选25％-75％，来形成一药学上可接受的非毒性组合物。

对于气雾剂给药，多肽最好是以磨成细粉的形式与表面活性剂和推进剂一起使用。一般多肽的百分率是0.01％-20％(按重量计)，优选1％-10％。当然，表面活性剂必须无毒，并最好溶于推进剂中。这类试剂的代表是含有6到22个碳原子的脂肪酸酯或部分酯，如癸酸，辛酸，十二烷酸，棕榈酸，硬脂酸，亚油酸，亚麻酸，油硬脂酸，油酸与脂族多元醇或其环状脱水物，如，乙二醇，丙三醇，丁四醇，arbitol，甘露醇，山梨醇，源于山梨醇的己糖醇脱水物形成的酯，以及这些酯的聚氧乙烯和聚氧丙烯衍生物。可以使用混合酯类如混合的或天然的甘油酯。

气雾剂中的表面活性剂可占有组合物重量的0.1％-20％，优选0.25-5％。组合物的余量通常为推进剂。液态推进剂一般在环境条件下为气体，并在压力下被压缩。适宜的液化推进剂是含5个碳原子的低级烷烃，如丁烷和丙烷；最好是氟化的或氟氯化的烷烃。也可以使用上述的混合物。在制备气雾剂时，用适宜的推进剂填充含有磨成细粉的肽和表面活性剂的配有适当阀门的容器。将这些组分在高压下保持直到启动阀门释放出来。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为合成多肽SEQ ID No:1，SEQ ID No:2及对照多肽P3反相高效液相色谱实验结果。

图2为合成多肽SEQ ID No:1，SEQ ID No:2及对照多肽P3质谱实验结果。

图3为本发明SEQ ID No:1，SEQ ID No:2抑制抗白介素10受体抗体与人巨噬细胞U937细胞上的受体结合的结果：上图X轴为脂多糖量，Y轴为白介素10受体表达水平。中图X轴为不同处理组，Y轴为白介素10受体表达水平。下图X轴为不同处理组，Y轴为平均荧光强度。

图4为本发明SEQ ID:No 1和SEQ No 2抑制IL-10分泌的结果：上图X轴为不同处理组，Y轴为白介素10水平。中左图：X轴为脂多糖，脂多糖加不同浓度的SEQ ID No 1处理组，Y轴为白介素浓度。中右图：X轴为脂多糖，脂多糖加不同浓度的SEQ ID No 2处理组，Y轴为白介素浓度.下图：X轴为时间(小时)，Y轴为白介素10水平。

图5为本发明SEQ No 2促进IL-12分泌的结果：X轴为不同处理组别，Y轴为白介素12水平

图6为本发明SEQ ID:No 1和SEQ ID:No 2不引起U937细胞死亡的结果。X轴为7氨基放线菌D荧光强度，Y轴为细胞数量。

具体实施方式

实施例1.SEQ ID:No 1、SEQ ID:No 2及对照多肽P3的合成

本发明中的多肽合成应用化学固相合成Fmoc法，大大的降低了每步产品提纯的难度；为了防止副反应的发生，合成柱和添加的氨基酸的侧链预先被保护的，羧基端游离，并且在反应之前先用化学试剂活化。固相肽的合成是在CS336X的多肽合成仪上进行的，氨基酸的固定在羧基树脂如王氏树脂，主要通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法是加入适当的缩合剂如DCC或羧基二咪唑，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定。树脂的去保护和解聚在(TFA/DCM/H20/TIPS 90/5/2.5/2.5)溶液中能够自发进行，合成方向是从C端(羧基端)向N端(氨基端)进行，然后通过10倍当量的冷乙醚对其沉淀，并用高效液相色谱(HPLC)纯化所合成SEQ ID:No 1，氨基酸序列为：

NH₂-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-COOH，

同理,制备出SEQ ID No：2(用Arg替换Lys)，其氨基酸序列为

NH₂-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-COOH，

同时，我们设计了不具有抑制功能的多肽P3作为对照，以证明SEQ ID:No:1和No:2的有效特性，其氨基酸序列为：

NH₂-Gly-Thr-Glu-Leu-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Val-Trp-Phe-Glu-Ala-Glu-Phe-COOH，

具体包括以下合成步骤：

(1)去保护：Fmoc保护的柱子和单体用碱性溶剂(piperidine)去除氨基的保护基团；

(2)激活和交联：下一个氨基酸(Phe，Lys，Arg或其它氨基酸)的羧基被一种激活剂DCC激活溶解，激活的单体与游离的氨基在交联剂的作用下交联，形成肽键；将羧基活化，变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的去除剂(如碳二亚氨)形成对称酸酐等方法来形成醯胺键；由于合成中赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)均带侧链功能基，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来；四氢噻唑-2-硫酮用于赖氨酸的侧链保护；精氨酸用金刚烷氧羰基(Adoc)保护，用冷的三氟乙酸脱去；

(3)循环：这两步反应反复循环直到整条肽链合成完毕；

(4)用高效液相色谱(HPLC)纯化多肽，用质谱(mass spectrometry)对多肽进行表征；

(5)制备好的多肽通过真空冻干成白色粉末，保存于-20℃冰箱中待用。

实施例2.反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化SEQ ID:No 1、SEQ ID:No 2及对照多肽P3

色谱柱为Kromasil C18(4.6x250毫米,5微米)，流动相A为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，流动相B为0.1％的三氟乙酸水溶液。注入量为20微升，流动相流量为1毫升每分钟，检测波长为220纳米。洗脱剃度为：0-25分钟，A浓度由15％增加到40％，之后25-25.10分钟，A浓度由40％增加到100％，之后维持在这个梯度至30分钟结束。HPLC谱图如图1所示，图中X轴为多肽在色谱柱中的保留时间，Y轴为探测波长为220纳米时的色谱峰强度，峰的相对面积可用来计算色谱峰对应成分的浓度。其中，上图为本发明SEQ ID No:1的高效液相色谱图，中图为本发明SEQ ID No:2的高效液相色谱图，下图为对照多肽P3的高效液相色谱图。表1、2和3分别示出了洗脱出的SEQ ID：No 1、No 2和对照多肽P3的保留时间及峰面积，通过计算可知合成的多肽纯度均大于95％，

表1SEQ ID No：1纯度及HPLC保留时间

表2SEQ ID No：2纯度及HPLC保留时间

表3对照多肽P3纯度及HPLC保留时间

实施例3.质谱表征多肽

质谱仪为SHIMADZU LCMS-2010EV，电离方法为电喷射，具体参数设定：雾化气流量为1.5毫升每分钟，探头电压为+4.5千伏，探测器电压1.5千伏，毛细管电压-20伏，毛细管温度250摄氏度，加热快温度200摄氏度，进样速度0.2毫升每分钟。多肽溶于50％/50％水/乙腈溶液。详细质谱峰信息如图2所示，图中X轴代表多肽的质荷比，Y轴为质谱峰强度。由于多肽可带多于1个的正电荷，如+2，+3，+4等，所以图中[M+2H]²⁺即表示多肽带有2个正电荷，[M+3H]³⁺即表示多肽带有3个正电荷，[M+Na+H]²⁺表示多肽与一个钠离子和一个氢离子结合并带有一2个正电荷，以此类推，其中M代表多肽的质量数。通过计算可以确定M与合成多肽序列的质量数完全一致，所以可以确定合成出的多肽序列与设计的一致。其中，上图为本发明SEQ ID No:1的质谱谱图，中图为本发明SEQID No:2的质谱谱图，下图为对照多肽P3的质谱谱图。表4列出了质谱鉴定出的SEQ ID：No 1、No 2和P3的序列质荷比，可以得出合成的多肽序列与设计一致。

表4SEQ IDNo：1、No：2和对照多肽NEQ ID No：3的质谱信息

实施例4.SEQ ID No：1和2可以抑制抗白介素10受体抗体与白介素10受体结合

SEQ ID No：1，SEQ ID No：2和P3溶于DMSO中，保存在-20℃备用。使用时，用含10％小牛血清的RPMI1640培养基稀释至工作浓度。

体外培养人巨噬细胞U937，培养液为RPMI1640加10％的小牛血清。用不同浓度的Toll样受体4配体脂多糖(LPS)刺激3×10⁵的U937细胞过夜，离心1300rpm 5分钟后，重悬细胞到300微升体积，加入1微升荧光PE标记的抗白介素10受体抗体，4℃孵30分钟，用含2％小牛血清的PBS缓冲液洗2遍，然后用流式细胞仪检测U937细胞膜上的白介素10受体表达水平。U937细胞上的白介素10受体表达随LPS刺激的浓度增加而增高(图3上图)。当脂多糖刺激的U937细胞中加入10微克/毫升的SEQ ID No:1，或者SEQ ID No:2,和对照多肽序列SEQ ID No3后，P1和P2可以显著降低白介素10受体在U937细胞膜上的表达(图3中图)。图3下图是同一实验的U937细胞的荧光强度结果。

实施例5.SEQ ID No 1和SEQ ID No 2抑制脂多糖刺激的U937细胞分泌白细胞介素10

体外培养人巨噬细胞U937，培养液为RPMI1640加10％的小牛血清.用100奈克/毫升Toll样受体4配体脂多糖(LPS)刺激在含10％小牛血清的1毫升PRMI1640培养基3×10⁵的U937细胞，收集细胞培养液上清，然后采用酶联免疫吸附法检测上清中的白介素10水平，人白介素10酶联免疫吸附法试剂盒购于ebioscience公司，操作按说明书。

图4上图实验，体外培养人巨噬细胞U937，培养液为RPMI1640加10％的小牛血清。1毫升PRMI 1640培养基有3×10⁵的U937细胞：(1)细胞不处理，

(2)100奈克/毫升脂多糖刺激，(3)脂多糖+10微克/毫升抗白介素10抗体，(4)脂多糖+10微克/毫升抗白介素10受体抗体，(5)脂多糖+10微克/毫升SEQ IDNo：1，脂多糖+10微克/毫升SEQ ID No：2和脂多糖+10微克/毫升NEQ ID No：3刺激过夜，收集细胞培养液上清，然后采用酶联免疫吸附法检测上清中的白介素10水平，人白介素10酶联免疫吸附法试剂盒购于eBioscience公司，操作按说明书，结果显示，SEQ ID No：1，SEQ ID No：2可以抑制脂多糖刺激的U937细胞分泌白介素10分泌，而对照多肽NEQ ID No：3无这个功能,结果见表5。

表5SEQ ID No：1和2抑制U937细胞分泌白介素10

图4中左图实验：体外培养人巨噬细胞U937，培养液为RPMI1640加10％的小牛血清。1毫升PRMI 1640培养基有3×10⁵的U937细胞。U937细胞经100奈克/毫升脂多糖,和不同浓度的SEQ ID No：1激过夜，SEQ ID No：1浓度范围从0.1到10微克/毫升，结果为SEQ ID No：1在1微克/毫升时，即可以有抑制白介素10分泌的作用，结果见表6。

表6SEQ ID No：1抑制白介素10与其剂量成正比

图6中右图实验：体外培养人巨噬细胞U937，培养液为RPMI1640加10％的小牛血清。1毫升PRMI 1640培养基有3×10⁵的U937细胞。U937细胞经100奈克/毫升脂多糖,和不同浓度的SEQ ID No 2刺激过夜，浓度范围从0.1到10微克/毫升，结果为SEQ ID No：2在1微克/毫升时，既可以有抑制白介素10分泌的作用，结果见表7。

表7SEQ ID No：2抑制白介素10与其剂量成正比

图6下图实验：体外培养人巨噬细胞U937，培养液为RPMI1640加10％的小牛血清。1毫升PRMI 1640培养基有3×10⁵的U937细胞。(1)U937细胞不刺激，或经(2)100奈克脂多糖，(3)脂多糖和10微克/毫升抗抗白介素10抗体，(4)脂多糖和抗白介素10受体抗体，(5)脂多糖和10微克/毫升SEQ No1，脂多糖和10微克/毫升SEQ No 2分别刺激4，12，24，48小时，收集细胞培养液上清，然后采用酶联免疫吸附法检测上清中的白介素10水平，人白介素10酶联免疫吸附法试剂盒购于ebioscience公司，操作按说明书。结果：SEQ ID No1和SEQ ID 2可以抑制脂多糖刺激的U937细胞分泌白介素10，在刺激48小时候仍有抑制作用，结果见表8。

表8SEQ ED No：1，SEQ ID No：2抑制白介素10与时间的关系

实施例6.SEQ ID No：1中K被R替代后的活性

合成K被R替代的多肽序列为：(1)FFKKFFKKFFKKFFRR，(2)FFKKF FKKFFRKFFR R，(3)FFKKF FRRFF KKFFR R，(4)FFKRF FRKFF RKFFR R。体外培养人巨噬细胞U937，培养液为RPMI1640加10％的小牛血清。1毫升PRMI1640培养基有3×10⁵的U937细胞。U937细胞经100奈克/毫升脂多糖,和不同SEQ ID No：1替代多肽刺激过夜，多肽浓度为10微克/毫升。表9示出了替代多肽也有抑制效果。通过比较，可以得出SEQ ID No：1为优选序列。

表9SEQ ID No：1中K被R替代后的多肽的活性(多肽序列标号与上述一致)

实施例7.SEQ ID No:2增加脂多糖刺激的人外周血单核细胞白介素12的分泌

采集人外周血30毫升，用Ficoll法分离人外周血单个核细胞(PBMCs)，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基培养人PBMCs.3x10⁵人PBMCs不刺激，100奈克/毫升脂多糖刺激，或脂多糖与10微克/毫升抗人IL10抗体,脂多糖和20微克/毫升SEQ ID No：1和SEQ ID No：2刺激过夜后，收集上清后，用酶联免疫吸附法检测白介素12p40，白介素12p40酶联免疫吸附法试剂盒购于ebioscience公司，操作按说明书，结果为SEQ ID No：2可以增加脂多糖刺激额的人PBMCs分泌白介素12的水平，具体见图5。

实施例8.SEQ IDNo：1和SEQ ID No 2抑制LPS刺激的U937细胞分泌白介素10不是由于它们引起U937细胞死亡

在SEQ ID No：1，SEQ ID No：2或P3存在或不存在下，用100奈克/毫升Toll样受体4配体脂多糖(LPS)刺激或不刺激在1毫升的RPMI1640培养基培养的3×10⁵U937细胞过夜，其他组别分别是脂多糖+10微克/毫升SEQ IDNo：1，脂多糖+10微克/毫升SEQ ID No：2，脂多糖+10微克/毫升P3。离心1300rpm 5分钟后，弃上清，重悬细胞，然后加入3微升7-氨基放线菌D(7-AAD)，7-AAD是一种可以鉴别细胞是否死亡的常用试剂，然后用流式细胞仪检测死亡细胞。结果是，SEQ ID No：1和SEQ ID No：2与P3一样，不增强脂多糖刺激的U937死亡。

实施例9.OVA/脂多糖/SEQ ID No:2刺激诱导更强的T细胞反应

采集人外周血30毫升，用Ficoll法分离人外周血单个核细胞(PBMCs)，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基培养人PBMCs.PBMCs不刺激，或使用1微克鸡卵蛋白(OVA)/100奈克脂多糖，1微克OVA/100奈克脂多糖/10微克毫升抗白介素10受体抗体，1微克OVA/100奈克脂多糖/10微克毫升SEQ ID No:2，1微克OVA/100奈克脂多糖/10微克毫升P3，分别刺激3x10⁵人PBMCs 72小时。细胞经洗涤后，用1微升抗-CD3，1微升抗-CD8抗体标记后，用细胞内染色法，用BD试剂公司固定，细胞膜打孔后，加入1微克抗人干扰素γ抗体，40℃孵育30分钟，用含2％小牛血清的PBS缓冲液洗涤后，检测CD8+T细胞内的干扰素γ。结果表明，使用OVA/脂多糖/SEQ ID No:2，可以比OVA/脂多糖刺激更多的干扰素γ阳性CD8+T细胞反应,具体见表10。

表10OVA/脂多糖/SEQ ID No:2刺激诱导更强的T细胞反应

在没有超出了本发明的构思和范围情况下可以对本发明进行许多改进和变化。这些对本领域熟练技术人员来说是显而易见的，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种多肽，所述的多肽末端SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，其中氨基酸K为R全部、部分替代或者不取代:

SEQ ID No：1：FFKKF FKKFF KKFFK K-OH。

2.根据权利要求1所述的多肽，所述的多肽为SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的多肽，所述的多肽为SEQ ID No：2所示的氨基酸序列：

SEQ ID No：2：FFRRF FRRFF RRFFR R-OH。

4.一种权利要求1－3所述多肽的制备方法，其特征在于采用固相合成法合成。

5.一种权利要求1－3所述多肽的制备方法，其特征在于采用生物方法合成。

6.一种核苷酸序列，其特征在于编码权利要求1－3所述的氨基酸序列。

7.一种表达载体，其包含编码权利要求6所述的核苷酸序列。

8.一种宿主细胞，其包含权利要求7所述的表达载体。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于其是大肠杆菌。

10.一种组合物，包括权利要求1－3的多肽和药学上可接受的载体。

11.权利要求1－3所述多肽在制备预防或治疗疾病时阻断白介素10药物中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述应用为在制备具有免疫刺激作用药物中的应用。

13.根据权利要求11或12所述的应用，其特征在于所述应用为在制备具有刺激T细胞免疫作用药物中的应用。

14.根据权利要求11所述的应用，其特征在于与Toll样受体配体联合使用。

15.根据权利要求11所述的应用，其特征在于在增强预防性疫苗的预防疾病的效果的应用。

16.根据权利要求11所述的应用，其特征在于在制备增强治疗性疫苗治疗疾病的效果的应用。

17.权利要求10所述的组合物在制备预防或治疗疾病时阻断白介素10药物中的应用。