CN101679488A - 能与白介素-10(il-10)结合的肽 - Google Patents
能与白介素-10(il-10)结合的肽 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101679488A CN101679488A CN200880015179A CN200880015179A CN101679488A CN 101679488 A CN101679488 A CN 101679488A CN 200880015179 A CN200880015179 A CN 200880015179A CN 200880015179 A CN200880015179 A CN 200880015179A CN 101679488 A CN101679488 A CN 101679488A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- peptide
- arg
- cell
- leu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2066—IL-10
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
- A61P33/06—Antimalarials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5428—IL-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8291—Hormone-influenced development
- C12N15/8295—Cytokinins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Hematology (AREA)
Abstract
本发明涉及能与白介素-10(IL-10)结合的肽和其在治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态和病理病症如感染性疾病、肿瘤、癌症和急性损伤状况中的用途。
Description
发明领域
本发明一般性地涉及能与白介素-10(IL-10)结合的肽和其应用。本发明特别涉及通过与IL-10直接结合的方式抑制IL-10生物学活性的肽,以及它们在治疗与IL-10表达、特别是与IL-10高表达有关的临床状态和病理病症中的用途。
发明背景
免疫应答既包括细胞应答又包括体液应答。细胞应答主要由T细胞介导,而体液应答由B细胞介导。淋巴细胞在免疫应答中发挥重要作用,包括指导病毒感染的细胞的死亡、细胞因子和抗体产生等。淋巴细胞也与急性和慢性炎性疾病有关。
细胞因子是可溶蛋白,其介导细胞间的反应并影响细胞的生长和分化。细胞因子通过与特异受体结合发挥其作用,导致激活所述细胞因子的特异性转导信号。
白介素-10(IL-10)是由几类细胞产生的多效细胞因子(pleiotropiccytokine),所述细胞类型如巨噬细胞、单核细胞、Th2型和调节性T细胞以及B细胞。IL-10是具有免疫抑制特性和抗炎特性的细胞因子;其调节许多髓样细胞和淋巴样细胞的活性,并直接抑制T细胞和NK(天然杀伤)细胞产生几种炎性细胞因子。
IL-10最初描述为Th2细胞所产生的细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor,CSIF),Th2细胞抑制Th1细胞产生促炎细胞因子,如γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-1-α(IL-1α)、白介素-1-β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)。已经证明,除了抑制促炎细胞因子产生之外,IL-10可以抑制抗原特异性Th1细胞增殖,由此通过使这些细胞中主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)-II的表达失调节来降低单核细胞抗原呈递能力。
IL-10对Th1细胞的激活以及对促炎细胞因子的产生具有强烈的抑制作用这一发现,产生了IL-10是细胞介导的免疫应答的强免疫抑制剂这一假说。其他的作者已经提议使用这种细胞因子治疗急性和慢性炎症以及治疗自身免疫病。基于这些原因,这种细胞因子已经用于几种自身免疫病中,如牛皮癣、类风湿性关节炎和克罗恩氏病(Crohn′sdisease)。然而,在其他疾病,如感染性过程或癌症中,因为其阻碍了益于治疗的Th1应答的诱导,因而具有副作用。这些过程的实例包括,麻疯病、肺结核、利什曼病和病毒感染。因此,IL-10在丙型肝炎病毒导致的慢性感染中大量表达,已有记载。作为用HCV抗原刺激的结果,这种细胞因子可以由Th2细胞产生。其也可以由抑制Th1型抗病毒效应细胞形成的调节性T细胞(D4和CD8)产生。最后,与HCV蛋白接触的感染的树突细胞(DC)或单核细胞,比非感染的细胞产生更大量的IL-10,这有利于Th2应答的发生,同时阻碍病毒的消除。
如上文所述,IL-10发挥重要作用的另一个领域是抗肿瘤应答。因此,除其他分子以外,肿瘤细胞或肿瘤渗透细胞还可以产生破坏DCs机能的IL-10。肿瘤中完全的DC机能抑制是不发生抗肿瘤应答的原因之一。鉴于IL-10的体内和体外抑制导致白介素12(IL-12)产生的增加,以及伴随Th1应答的增加,所述IL-10抑制在诸如慢性HCV感染的某些抗病毒治疗以及抗肿瘤治疗中非常有用,在这些治疗中强大的Th1型应答待被诱导。因此,据记载,阻碍IL-10和其受体间相互作用的非甲基化寡核苷酸(CpG)以及抗IL-10受体抗体的组合,允许诱导更有效的抗肿瘤应答,比仅使用CpG所达到的更强(Vicari A.P.et al.Reversal of tumor-induced dendritic cell paralysis by CpGimmuno-stimulatory oligonucleotide and anti-interleukin 10 receptorantibody(CpG免疫刺激性寡核苷酸和抗白介素10受体抗体对肿瘤诱导的树枝状细胞麻痹的逆转).J Exp Med.2002 Aug 19;196(4):541-9)。通常用来抑制IL-10生物学活性的其他策略包括,使用特异性中和抗体或者使用阻断IL-10表达的IL-10编码基因的反义寡核苷酸(寡聚体)。尽管由于血液中外源免疫球蛋白的存在以及由于来自IL-10系统阻断的作用导致副作用有所增加,但是,使用抗体可以完全并特异性地阻断这种细胞因子(IL-10)。而且,免疫球蛋白随时间的稳定性不允许对这种细胞因子的活性进行短时期的阻断控制。反义寡核苷酸在基因表达水平抑制IL-10的产生,这在所有与该细胞因子有关的过程中产生重要的去调节作用。
因此,需要鉴定特异性的、功效更强且可潜在地用于人类治疗中的新的IL-10抑制剂。
发明概述
本发明通常所面临的难题是寻找可以抑制IL-10生物学活性的新化合物。
本发明所提供的解决方案基于以下事实:本发明人已经鉴定出不但可以与IL-10结合而且通过它们与IL-10自身直接结合抑制IL-10生物学活性的肽。通过使用与噬菌体文库有关的技术,已经鉴定出了这些肽,所述技术允许测定具有与IL-10高亲和力结合的、通常包含6-15个氨基酸大小的肽,随后通过体外测定,对不同肽抑制IL-10生物学活性的能力进行定量。
可以与IL-10结合的肽,特别是通过与IL-10直接结合抑制IL-10生物学活性的肽,潜在地用于治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态和病理病症。同样,可以与IL-10结合的肽为研究IL-10的生物学作用提供了工具。
因此,本发明一方面涉及能与IL-10结合的肽。在具体且优选的实施方案中,所述肽还能抑制IL-10的生物学活性。
本发明另一方面涉及包含至少一种所述肽的药物组合物。
本发明另一方面涉及治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态和病理病症的所述肽。
本发明另一方面涉及所述肽在制备用于治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态和病理病症的医药产品中的用途。
本发明另一方面涉及编码所述肽的DNA序列。
本发明另一方面涉及包含编码本发明所提供的肽的DNA序列的DNA构建体。
本发明另一方面涉及包含所述DNA序列或所述DNA构建体的载体。
本发明另一方面涉及包含所述DNA序列或DNA构建体或所述载体的宿主细胞,如转化的宿主细胞。
本发明另一方面涉及产生本发明所提供的肽的方法,其包括在允许所述肽表达的条件下,培养所述宿主细胞,以及如果需要,回收获得的肽。
本发明另一方面涉及治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态和病理病症的所述DNA序列和DNA构建体。
本发明另一方面涉及所述DNA序列和DNA构建体在制备用于治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态和病理病症的载体和细胞中的用途。
附图简要说明
图1是表示具有15个氨基酸的肽(P15aa)的位置的示意图,所述肽在丝状噬菌体M13的表面与蛋白III基因融合。
图2表示通过生物淘洗技术(biopanning technique)选择肽的示意图。将生物素化的IL-10固定于含有链霉抗生物素的平板中(经由生物素-链霉抗生物素结合)。基于IL-10和噬菌体呈现的肽之间的相互作用,筛选噬菌体文库。通过洗涤,除去对IL-10具有低亲和力的噬菌体。通过降低pH,洗脱保留在平板中的噬菌体。在富集对IL-10具有高亲和力的噬菌体三轮后,将噬菌体分离并测序(参阅实施例1)。
图3是表示在存在不同浓度的人IL-10和小鼠白介素-4(IL-4)时MC/9细胞增殖的图。
图4由柱状图组成,表示以浓度为150、100和50μg/mL的每种肽获得的人IL-10(hIL-10)和鼠IL-10(mIL-10)的抑制百分比(从左到右)(图4A),以及毒性百分比(表示为粒细胞巨噬细胞菌落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)对MC/9细胞增殖抑制的百分比)(图4B)。每个柱对应于2或3次独立实验的平均值。
图5是柱状图,表示能与IL-10结合的几种肽对karpas细胞系(IL-10生产者)免疫抑制活性的影响。用这些细胞进行“混合淋巴细胞反应”(mixed lymphocyte reaction,MLR)测定,其中所产生的IFN-γ水平测量为免疫应答的量。具有显著的IL-10抑制能力以及可以重建MLR的IFN-γ水平的肽,以条纹柱表示。图例:PBL:外周血淋巴细胞,PBL1和PBL2:来自两种不同健康供体的外周血淋巴细胞(从定义上来说,这些细胞的混合物通过经由MHC和TLR间反应的异源识别,诱导增殖的激活),MLR:混合的淋巴细胞反应,MLR+K:混合的淋巴细胞反应+Karpas299细胞系,K:Karpas 299细胞系)。
图6是柱状图,表示肽P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID NO:8)在再刺激具有不同T辅助决定肽的淋巴细胞中的体外作用,其定量为IFN-γ的产量。该系统中IL-10的抑制将有利于Th1细胞因子谱,因此增加IFN-γ。肽FISEA G(SEQ ID NO:38)是上清液中诱导可检测的IL-10水平以及最高IFN-γ水平的唯一肽。肽P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID NO:8)仅在此情况下增加IFN-γ的产量。
图7是表示皮下接种5×105个肿瘤细胞(CT26)的不同组BALB/C小鼠中平均肿瘤生长的图示。不同组显示,没有治疗(对照组)、用多I:C和抗CD-40抗体(佐剂)治疗、用肽P9(SEQ ID NO:6)(肿瘤内)和P13(SEQ ID NO:8)(腹膜内)(IL-10抑制剂)治疗或佐剂和IL-10抑制剂组合(Adj+IL-10 Inhib)治疗的情况下平均肿瘤生长。
图8是表示通过表面等离子共振(SPR)分析获得的生物分子相互作用特征的图表,所述相互作用发生于IL-10和肽P9(SEQ ID NO:6)之间,以及用对照肽[P301(SEQ ID NO:54)]获得的相互作用。
图9是表示由生物分子相互作用获得的结果的柱状图,其通过SPR分析测量,所述相互作用发生于IL-10和肽P9(SEQ ID NO:6)、P13(SEQ ID NO:8)和其截短的和/或修饰形式之间,所述截短的和/或修饰形式为:P9(2-15)(SEQ ID NO:45)、P9(1-14)(SEQ ID NO:46)、P9(1-13)(SEQ ID NO:47)、P9(2-14)(SEQ ID NO:48)、P9(2-13)(SEQID NO:49)、P9(3-14)(SEQ ID NO:50)、P9(15 Ala)(SEQ ID NO:51)、P9(14 Ala)(SEQ ID NO:52)、P9(1-13;1 Ser)(SEQ ID NO:53)。
图10表示肽P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID NO:8)对IL-10所诱导的STAT3磷酸化的影响。通过Western印迹技术,分析磷酸化的STAT3表达(图10A)。柱状图(图10B)表示通过光密度分析法定量的磷酸化STAT3条带的含量与获得的每个样品的肌动蛋白含量的比例。
图11表示柱状图中肽P9(SEQ ID NO:6)、P 13(SEQ ID NO:8)、P15(SEQ ID NO:10)、P16(SEQ ID NO:11)、P31(SEQ ID NO:22)和P34(SEQ ID NO:25)诱导的细胞增殖的抑制百分比,以及对照肽P301(SEQ ID NO:54)诱导的细胞增殖的抑制百分比。将它们都以200μg/ml的浓度进行检测。所示结果对应于一式三份进行的两次测定的平均值和偏差。
图12是表示在用TLR9配体(CpG)刺激以及在存在丙型肝炎病毒核壳(HCV核心(HCV core))蛋白时的外周血单核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)培养物中,肽P13(SEQ ID NO:8)对IFN-α产生的影响。简而言之,在有或无HCV核心(2.5μg/ml)以及在存在或缺少肽P13(SEQ ID NO:8)的情况下,用TLR9配体(CpG,5μg/ml)刺激来自健康供体的PBMCs。浓度为1μg/ml的抗IL-10抗体(eBioscience,16-7108-81)用作阳性对照。37℃和5%CO2下孵育48小时后,通过ELISA测量培养物上清液中IFN-α的产量。所示结果代表结果相似的4次实验。
发明详述
本发明一般性地涉及能与IL-10结合的肽和它们的应用。
因此,本发明一方面涉及能与IL-10结合的肽,下文称为本发明的肽,其选自:
a)肽,其氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21;SEQ ID NO:22;SEQ ID NO:23;SEQ ID NO:24;SEQ ID NO:25;SEQ ID NO:26;SEQ ID NO:33;SEQ ID NO:34;SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36,
b)a)中限定的肽的变体;以及
c)a)中限定的肽或b)中限定的变体的片段,包含5-15个连续氨基酸,以及
其药学上可接受的盐。
本文所用术语“肽”包括其修饰物和衍生物,例如糖基化、磷酸化、乙酰化、氨基化等。
本说明书所用的术语“变体”指衍生于a)部分中所定义的肽的肽,其中氨基酸通过例如取代的方式进行了修饰,或者其具有一个或多个氨基酸的插入或缺失,条件是,其保留至少一种最初肽的功能,有利的是,保留至少一种与结合IL-10有关的功能。所述变体通常包括保守取代,其中最终肽的功能未被修饰。肽P9(SEQ ID NO:6)的示例性的、非限制性的实例包括其中P9(SEQ ID NO:6)第15位的氨基酸(Phe)已被Ala取代的肽P9(15Ala)(SEQ ID NO:51),其中P9(SEQ ID NO:6)第14位的氨基酸(Val)已经被Ala取代的肽P9(14Ala)(SEQ ID NO:52)及其它。
本说明书中所用的术语“片段”指衍生于在前面a)或b)中所定义的肽的肽,其中,已经从氨基端或羧基端或者两端除去氨基酸,同时维持最初肽的一种或多种功能,优选地,与IL-10结合有关的功能。肽P9(SEQ ID NO:6)的示例性、非限制性的实例包括肽P9(2-15)(SEQID NO:45)、P9(1-14)(SEQ ID NO:46)、P9(1-13)(SEQ ID NO:47)、P9(2-14)(SEQ ID NO:48)、P9(2-13)(SEQ ID NO:49)、P9(3-14)(SEQID NO:50)、P9(1-13;1 Ser)(SEQ ID NO:53)及其它。
本发明的肽的药学上可接受的盐,落于本发明的范围内。本文所用术语“药学上可接受的盐”包括通常用来形成金属盐或者酸加成盐的盐。盐的特性并不重要,只要其是药学上可接受的。本发明的肽的药学上可接受的盐,可以从有机或无机酸或碱中获得。所述盐可以通过本领域技术人员所公知的常规方法获得。
本发明的肽能与IL-10结合。一些所述的肽还能在体外和/或体内抑制IL-10的生物学活性。
本发明的肽与IL-10结合的能力,可以通过允许测定两个分子间的结合的任何适宜的方法测定,例如通过亲和力测定,所述亲和力测定包括使IL-10与待测定的肽在允许所述肽与IL-10结合的条件下接触,并评估所述肽和IL-10的结合。在具体实施方案中,利用例如放射性标记的IL-10进行所述亲和力测定。可选地,可以被标记的化合物是待测定的肽。这种类型的亲和力测定通常包括将固定于用例如链霉抗生物素封闭的平板上的IL-10与IL-10结合能力待知的肽接触,在孵育适当的时间后,分析该肽与IL-10的结合,如本说明书所附的实施例1所示。通过洗涤,去除低IL-10亲和力的肽,而具有较高亲和力的肽保持与IL-10结合,并可以通过破坏两种分子间的相互作用释放,这可以通过例如降低pH进行。通过测定针对不同浓度IL-10的肽,反之亦然,可获得针对IL-10的所讨论的肽的亲和力。
尽管本发明所有的肽都能与IL-10结合,但是,在具体实施方案中,能与IL-10结合的本发明的肽选自:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所示的肽、其变体或片段以及它们药学上可接受的盐。
可以评估本发明的肽体外抑制IL-10生物学活性的能力,如果需要,通过抑制MC/9细胞系(CRL-8306,美国典型细胞培养物保藏中心(American Type Cell Culture,ATCC),美国维吉尼亚(Virginia,UnitedStates))生长的测定定量,所述MC/9细胞系是衍生于大鼠肝脏的肥大细胞,其增殖受IL-10的诱导(参见实施例3)。
在另一个具体的实施方案中,本发明的肽是能抑制IL-10生物学活性的肽,并选自:SEQ ID NO:1(P1)、SEQ ID NO:6(P9)、SEQ ID NO:8(P13)、SEQ ID NO:10(P15)、SEQ ID NO:13(P19)、SEQ ID NO:14(P20)、SEQ ID NO:16(P22)、SEQ ID NO:19(P25)和SEQ ID NO:25(P34)所示的肽、其变体或片段,以及它们药学上可接受的盐。除了能与IL-10结合并抑制IL-10的生物学活性外,所述肽还具有共同的结构特征。因此,所述肽(i)在其氨基酸序列上具有60%至90%的疏水氨基酸(Ala、Val、Leu、Ile、Gly和Pro)和碱性氨基酸(Arg、His和Lys),比预期的百分比(约45%)高的多;(ii)具有至少一个芳香氨基酸,通常2个或3个,所述芳香氨基酸选自Phe、Trp和Tyr,优选Phe。同样,如所观察的,以SEQ ID NO:8(P13)所示的肽作为参考肽进行的氨基酸序列比对分析表明,在第2-5位存在具有碱性氨基酸(Arg、His、Lys)以及在第10-14位存在疏水氨基酸的倾向,这种模式维持于SEQ ID NO:1(P1)、SEQ ID NO:6(P9)、SEQ ID NO:8(P13)、SEQ ID NO:13(P19)和SEQ ID NO:25(P34)所示的肽中,这种位置对SEQ ID NO:10(P15)和SEQ ID NO:16(P22)所示的肽是反向的,且在SEQ ID NO:14(P20)和SEQ ID NO:19(P25)所示的肽中是丧失的。
在具体的实施方案中,人IL-10和肽P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID NO:8)以及其一些衍生物(平截的和/或修饰形式)间的生物分子相互作用,已通过表面等离子共振(SPR)分析进行了测定,证实了它们与IL-10结合的能力(实施例7)。同样,肽P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID NO:8)所发挥的抑制作用已通过它们对STAT3磷酸化的影响得以证实,在STAT3分子与其细胞受体结合后,STAT3分子与信号传导有关(参阅实施例8)。在体外B 16-F10黑素瘤细胞增殖测定中已经证实本发明所提供的IL-10抑制肽的作用(参见实施例9)。此外,由于IL-10是一种可以测定由丙型肝炎病毒(HCV)导致的感染迁延化(chronification)的负因子,在体外模型中,已检测了肽P13(SEQ ID NO:8)的功效,在所述模型中,HCV核心蛋白(其能诱导IL-10)负责产生所检测的低量IFN-α;如图12中所观察的,所述肽P13(SEQ ID NO:8)可以援救IFN-α的产生。
对于能与IL-10结合的肽的初始鉴定,本发明人已经使用噬菌体文库有关的技术,该技术允许测定具有与IL-10高亲和力结合的肽,并随后通过体外测定定量不同肽抑制IL-10生物学活性的能力。与IL-10结合的肽的序列,其体外抑制IL-10的生物学活性,可以在几轮生物淘洗通常是3轮后由相应的DNA序列推导出。利用噬菌体文库鉴定某些产物的抑制剂,已由例如Chirinos-Rojas C.L.et al.,inImmunology,1999,Jan.96(1):109-113;McConnell S.J.,et al.,in Gene1994,Dec.30,151(1-2):115-118或Smith G.P.,Science,1985,Jun.14,228(4705):1315-1317记载。
因此本发明提供了鉴定能与IL-10结合的肽的方法,包括:
(i)使用包含多个丝状噬菌体的噬菌体文库,每个所述噬菌体的基因组含有编码不同肽的、与噬菌体包被蛋白基因连接的核苷酸序列,据此,每个噬菌体含有与噬菌体包被蛋白在基因上融合的不同肽;
(ii)通过亲和力测定选择含有以更高亲和力与IL-10结合的肽的噬菌体;
(iii)基于插入步骤(ii)中所选择的噬菌体且编码与IL-10结合的肽的相应DNA序列,测定与IL-10结合的所述肽的序列。
在具体实施方案中,为了获得可以以高亲和力与IL-10结合、长度为15个氨基酸且可能抑制所述细胞因子的生物学活性的肽,使用由多个丝状噬菌体(M13)所形成的噬菌体文库,所述多个丝状噬菌体中的每个都含有长度为15个氨基酸、与噬菌体包被蛋白在基因上融合由此结合于包被蛋白III的N末端的肽。噬菌体因此在其表面上,在表面蛋白的5个分子中的每一个中都具有15个氨基酸的肽,而其内部含有编码所述肽序列的DNA。在噬菌体文库中,肽编码序列来自在15个位置中的每一个位置由20个天然氨基酸简并的序列,这允许在不同噬菌体中显示15个氨基酸的1.1×1012个可能的序列。噬菌体中肽序列与编码它的DNA的物理比(physical ratio)为1∶1,允许从大量变体中选择与IL-10特异性结合的序列。这个过程可以由亲和力测定来进行。
在具体的实施方案中,所述亲和力测定由称为生物淘洗的体外选择方案组成。简而言之,所述技术组成为,在加入生物素化的IL-10的、用链霉抗生物素封闭的平板内孵育一组噬菌体,出于实践的目的,所述一组噬菌体代表具有15个氨基酸的肽的所有变体(在此情况下)。生物素化的IL-10通过生物素-链霉抗生物素相互作用,锚定于平板上,据此,正确地展示了其与噬菌体所携带的肽的相互作用。孵育后,通过洗涤除去未结合的噬菌体,随后通过降低pH由此破坏噬菌体所展示的IL-10和肽之间的相互作用而洗脱特异性结合的肽。随后通过感染细菌菌株,扩增洗脱的噬菌体。该过程重复总共3轮,以便富集与IL-10特异性且以高亲和力结合的噬菌体的量。在每一轮中,渐进性地减少用来封闭平板的生物素化的IL-10,例如,从2.5至0.02μg/mL,以及最后0.002μg/mL。因而在每一轮中所选择的噬菌体具有更高程度的IL-10亲和力。在该过程末,将已针对IL-10亲和性选择的噬菌体用引物进行测序。这允许获得噬菌体中所展示的肽的序列。
本说明书所附的实施例1显示,通过噬菌体文库选择与IL-10结合的肽、通过生物淘洗技术和测序选择以高亲和力与IL-10结合的肽。通过这种技术,已经获得SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO 8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的肽。
在另一个具体实施方案中,为了进行能与IL-10结合的肽的初始鉴定,本发明考虑了(IL-10)-(IL-10受体)复合体的结构(Josephson K,Logsdon NJ,Walter MR.Crystal structure of the IL-10/IL-10R 1complexreveals a shared receptor binding site.Immunity,2001 Jul;15(1):35-46)。通过这种方法(参见实施例2),本发明人观察到,在所述结构中,在IL-10中,存在具有α螺旋构型的区域,并进行了定位,以便可能认为它们与细胞因子与其受体的相互作用相关。因此,本发明人发现,在IL-10中存在两个α螺旋区域,具体来说,第一区域包含IL-10氨基酸序列的第19-35位氨基酸序列,另一第二区域包含IL-10氨基酸序列的第86-110位氨基酸序列,其是以反平行的方式定位的,因此,可以认为它们与细胞因子及其受体的相互作用可能相关。因此,鉴定LI-10氨基酸序列的区域是可能的,所述区域可以用来合成具有IL-10抑制活性的肽,随后,如上文所述,通过体外测定定量不同肽抑制IL-10生物学活性的能力。
通过本文所述方法鉴定的、具有潜在IL-10抑制能力的肽的示例性、非限制性实例,显示于表2(实施例2)中,并且包括SEQ ID NO:30(F24)、SEQ ID NO:31(F25)、SEQ ID NO:32(F26)、SEQ ID NO:33(F27)、SEQ ID NO:34(F28)、SEQ ID NO:35(F29)和SEQ ID NO:36(F30)所示的肽。由所述表2可以看出,SEQ ID NO:30(F24)所示的肽是包含天然的人IL-10(hIL-10)氨基酸序列的第86-97位氨基酸序列的肽,SEQ ID NO:31(F25)所示的肽是包含天然反向hIL-10氨基酸序列的第23-34位氨基酸序列的肽;SEQ ID NO:32(F26)所示的肽是包含天然hIL-10氨基酸序列的第23-34位氨基酸序列的肽;SEQ ID NO:33(F27)所示的肽是包含互补的天然hIL-10氨基酸序列的第23-34位氨基酸序列的肽,且能与IL-10结合;SEQ ID NO:34(F28)所示的肽是包含互补反向的天然hIL-10氨基酸序列的氨基酸第23-34位的序列,且能与IL-10结合;SEQ ID NO:35(F29)所示的肽是包含互补的天然hIL-10氨基酸序列的第99-107位氨基酸的序列,且能与IL-10结合;以及SEQ ID NO:36(F30)所示的肽是包含互补的反向天然hIL-10氨基酸序列的氨基酸第99-107位的序列,且能与IL-10结合。
本文所用术语“反向的”意指氨基酸序列对应于以反向方式阅读的蛋白或天然蛋白片段的氨基酸序列。本文所用术语“互补的”涉及包含可以与天然蛋白氨基酸序列的其他互补残基“主动地相互作用”的残基的氨基酸序列。本文所用术语“主动地相互作用”涉及两个氨基酸之间的相互作用通过静电力、疏水相互作用、氢键等产生吸引力的情况。
由于IL-10在许多生物学过程中的作用,本发明的肽的IL-10抑制活性的结果与潜在地研发新的药物家族有关,所述新的药物家族可以用来治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态和病理病症,因为此类肽允许阻断引起损伤作用的所述细胞因子过量。因此本发明的肽潜在地适用于IL-10增加与个体或患者临床状态恶化有关的任何临床状态或病理病症。
本文所用术语“个体”涉及哺乳动物种类的任何成员,包括但不限于家养动物、灵长类和人;个体优选是任何年龄或种族的男人或女人。
因此,本发明的肽可以用来治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态或病理病症。可以用本发明的肽治疗的所述临床状态或病理病症的示例性实例包括病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染、肿瘤、癌症或急性损伤状况,其中IL-10具有免疫抑制作用。在这些类型的感染过程、肿瘤、癌症或急性损伤状况中,因为IL-10阻止有利于治疗的Th1应答的诱导,因而具有副作用。实际上,可以用本发明的肽治疗的病毒感染的示例性、非限制性的实例包括,病毒来源的任何感染,例如,疱疹病毒引起的感染,例如人疱疹病毒,如1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV-6)、人疱疹病毒7(HHV-7)、EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、卡波西氏疱疹病毒(HHV-8)等,以及任选地,伴有暴露于阳光后的皮肤再活化作用;引起肝炎的病毒引起的感染,例如丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)等。可以用本发明的肽治疗的细菌感染的示例性、非限制性实例包括但不限于,麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)引起的感染、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的感染、鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)引起的感染、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)引起的胃感染等。可以用本发明的肽治疗的、真菌引起的感染的示例性非限制性实例包括但不限于,白色念珠菌(Candida albicans)引起的感染、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)引起的感染、曲霉(Aspergillus sp.)引起的感染等。可以用本发明的肽治疗的寄生虫感染的示例性非限制性实例包括但不限于,利什曼病,如内脏利什曼病,恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)引起的感染、弓形体病等。可以用本发明的肽治疗的肿瘤和癌症的示例性非限制性实例包括但不限于霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’slymphoma)、头颈癌、黑素瘤、基底细胞癌(basal cell carcinoma)和由被UV辐射突变的角质细胞发展成的鳞状细胞癌等。可以用本发明的肽治疗的急性损伤状况的示例性、非限制性实例包括但不限于,烧伤和有关的败血症等。通常,肿瘤发展、病毒、细菌、真菌或寄生虫感染中的任何过程可以用本发明的肽治疗,在所述过程中,IL-10的活性在个体临床状态的恶化或迁延中具有重要的免疫抑制作用。
因此本发明另一方面涉及药物组合物,其包含治疗有效量的本发明的肽,以及至少一种药学上可接受的赋形剂。本发明提供的药物组合物可以含有一种或多种本发明的肽,以及任选地,一种或多种可选的IL-10抑制化合物。所述药物组合物可以施用和/或应用于人体或动物体,优选人体。事实上,如果需要,除本发明的肽以外,任何IL-10抑制化合物可以存在于本发明的药物组合物中。除本发明的肽以外,可与本发明的肽一起使用的可选的IL-10抑制化合物的示例性、非限制性实例包括但不限于IFN-γ、AS101三氯(二氧乙烯-O,O′)碲酸铵盐)、中和抗体、15d-PGJ2(15-脱氧-Δ-12,14-前列腺素J2)、嵌合鼠抗人CD20抗体(Ritubimax)等。
利用肽如本发明的肽,而不是利用反义寡核苷酸或抗体,具有许多优势,因为它们是小分子,具有更大的扩散能力以及更短的半衰期。这些肽可以具有对IL-10的高亲和力,但比抗体降解的更快,不利的副作用可以通过剂量控制。与其他类型的化合物相比,将肽运送至靶器官或组织更容易。
通过使本发明的肽与其在人体或动物体内的作用位点接触,可以给予本发明的肽来治疗与IL-10表达、特别是与IL-10高(过量)表达有关的临床状态或病理病症。可以存在于本发明提供的组合物中的肽、其衍生物或药学上可接受的盐的量可以在大范围内变动。
用本发明的肽和/或药物组合物治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的病理病症或疾病的剂量,取决于许多因素,包括年龄、患者的状况、病理病症或疾病的严重性、给药的途径和频率,以及取决于待给药的本发明的肽。
含有本发明的肽的药物组合物可以以任何给药形式存在,例如固体或液体形式,并且可以通过任何适宜的方法给药,例如口服、肠道外、直肠或局部,为此,配置期望的给药形式所需的药学上可接受的赋形剂将包括在内,所述期望的给药形式如软膏(脂凝胶、水凝胶等)滴眼液、喷雾剂(sprays)、注射溶液、渗透泵(osmotic pumps)等。有关医药产品以及用于获得它们的所需赋形剂的不同给药剂型的综述见于例如“Tratado de Farmacia Galénica”,C.Faulíi Trillo,1993,Luzán 5,S.A.Ediciones,Madrid。
因此,本发明另一方面涉及用于治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态或病理病症的本发明的肽。在具体的实施方案中,所述临床状态或病理病症是呈现IL-10表达特别是IL-10高表达的临床状态或病理病症。在具体实施方案中,所述呈现IL-10表达特别是IL-10高表达的临床状态或病理病症包含Th1细胞受到抑制的临床状态。可以治疗的所述临床状态或病理病症的示例性实例包括前面提到的病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染、肿瘤、癌症或急性损伤情况。
本发明的另外方面是,本发明的肽在制备所述药物组合物中的用途。因此,本发明的另一方面涉及本发明的肽在制备用于治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态或病理病症的医药产品中的用途。在具体的实施方案中,所述临床状态或病理病症是呈现IL-10表达特别是IL-10高表达的临床状态或病理病症。在具体的实施方案中,所述呈现IL-10表达特别是IL-10高表达的临床状态或病理病症包含Th1细胞应答受到抑制的临床状态。可以治疗的所述临床状态或病理病症的示例性实例包括前面提到的病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染、肿瘤、癌症或急性损伤情况。
测量样品中IL-10表达水平的方法是本领域技术人员公知的。因此,就非限制性说明而言,所述方法包括,例如,通过例如ELISA技术测量血清、痰或精液样本中IL-10的水平或浓度。所述技术允许定量样品中与正常水平相比即与健康个体样品中的IL-10水平相比的IL-10的水平。
本发明的肽可以通过常规方法获得,例如通过固相化学合成技术;通过常规方法纯化,例如通过高效液相色谱(HPLC);并且,如果需要,其可以通过常规技术进行分析,例如通过测序和质谱、氨基酸分析、核磁共振等。就非限制性说明而言,根据利用AthertonFmoc变体(Atherton Fmoc variant,Atherton,E.,Logan,J.C.and Sheppard,R.C.1989.Peptide synthesis II.Procedures for solid phase synthesis usingN-fluorenyl methoxycarbonyl amino acids on polyamide supports.Synthesis of substance P and of acyl carrier protein 65-74 decapeptide(肽的合成II,利用聚酰胺支持体上的N芴甲氧羰酰氨基酸固相合成方法,P物质和酰基载体蛋白65-74十肽的合成).J.Chem.Soc.Perkin Trans.1:538)的常规方法(Merrifield RB.J Am Chem Soc 1963;85:2149-2154),本发明的肽可以通过肽合成获得。所获得的肽的纯度可以通过例如反相HPLC色谱和/或质谱测定。
可选地,本发明的肽可以通过重组DNA技术获得。因此本发明的另一方面提供了编码本发明的肽的DNA序列。所述DNA序列可以很容易地由本发明的肽的氨基酸序列推导。
所述DNA序列可以包含于DNA构建体中。因此,本发明另一方面提供了包含编码本发明的肽的DNA序列的DNA构建体。所述DNA构建体可以结合调节编码本发明肽的DNA序列表达的可操作地结合的序列。控制序列是控制和调节本发明的肽的转录以及如果合适翻译的序列,且包括在包含所述DNA构建体或序列的转化的宿主细胞中发挥功能的启动子序列和终止子序列等。在具体实施方案中,所述表达控制序列在细菌中发挥功能。有利的是,所述DNA构建体还包含编码允许用所述DNA构建体选择转化的宿主细胞的基元或表型的标记或基因。本发明提供的DNA构建体可以通过利用本领域公知的技术[Sambrook et al.,“Molecular cloning,a Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册)”,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.,1989 Vol.1-3]获得。
可以将本发明提供的DNA序列或DNA构建体插入适宜的载体。因此本发明另一方面涉及载体,如包含所述DNA构建体或序列的表达载体。载体的选择,取决于它将随后被导入的宿主细胞。举例来说,引入所述DNA序列的载体可以是质粒或载体,当引入宿主细胞时,其整合或不整合于所述细胞的基因组。所述载体可以通过本领域技术人员已知的常规方法[上文提到的Sambrok et al.,1989]获得。
本发明另一方面涉及包含本发明提供的DNA序列或DNA构建体或之前提到的载体的宿主细胞,如转化的宿主细胞。所述细胞可以是原核或真核细胞。
本发明另一方面涉及包含本发明提供的DNA序列、本发明提供的DNA构建体、本发明提供的载体或本发明提供的宿主细胞以及药学上可接受的载体的药物组合物。在具体实施方案中,所述药物组合物包含基因转移载体中的本发明提供的DNA序列或本发明提供的DNA构建体,所述载体如病毒或非病毒载体。使本发明的该实施方案付诸实施的适宜的病毒载体包括但不限于,腺病毒载体、腺相关载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体(lentiviral vector)、α病毒载体、疱疹病毒载体、冠状病毒衍生载体等。使本发明的该实施方案付诸实施的适宜的非病毒类型载体包括但不限于,裸DNA、脂质体、多胺、树状大分子(dendrimers)、阳离子含糖多聚体(glycopolymer)、脂质体-聚阳离子复合物、蛋白、受体介导的基因转移系统等。
因此,本发明另一方面涉及用于治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态或病理病症的本发明提供的DNA序列,或涉及本发明提供的DNA构建体,或涉及本发明提供的载体,或涉及本发明提供的宿主细胞。在具体实施方案中,所述临床状态或病理病症是呈现IL-10表达特别是IL-10高表达的临床状态或病理病症。在具体实施方案中,所述呈现IL-10表达特别是IL-10高表达的临床状态或病理病症,包含Th1细胞应答受到抑制的临床状态。可以治疗的所述临床状态或病理病症的示例性实例包括,之前提到的病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染、肿瘤、癌症或急性损伤情况。
本发明另一方面涉及所述DNA序列和DNA构建体在制备用于治疗与IL-10表达特别是与IL-10高表达有关的临床状态和病理病症的载体和细胞中的用途。根据本发明的这一方面,使所述DNA构建体或序列与基因转移载体如病毒载体或非病毒载体接触。使此实施方案付诸实施的适宜病毒载体包括但不限于,腺病毒载体、腺相关载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、α病毒载体、疱疹病毒载体、冠状病毒衍生载体等。使此实施方案付诸实施的适宜非病毒载体包括但不限于,裸DNA、脂质体、多胺、树状大分子、阳离子含糖多聚体、脂质体-聚阳离子复合物、蛋白、受体介导的基因转移系统等。
本发明另一方面涉及制备本发明的肽的方法,其包括在允许制备所述本发明的肽的条件下培养包含本发明提供的DNA构建体、序列或载体的宿主细胞,以及,如果需要,回收所述本发明的肽。优化培养所述宿主细胞的条件取决于所用的宿主细胞。如果需要,制备本发明的肽的方法还包括分离和纯化所述肽。
下面的实施例说明本发明,并且不得认为是对其范围的限制。
实施例1
通过噬菌体文库选择与IL-10结合的肽
为了获得能够以高亲和力与IL-10结合且可能对该细胞因子生物学活性具有抑制活性的15个氨基酸的肽,利用体外选择技术,其是基于由噬菌体文库发展来的技术。这些文库由含有肽的丝状噬菌体(M13)组成,所述肽通常基因融合于病毒包被蛋白,在此情况下,与包被蛋白pIII的N末端结合(Figure 1)。因此,噬菌体在其表面上,在该噬菌体表面具有的该蛋白的5个分子中的每一个中都具有带有15个氨基酸的肽,而且其内部含有编码所述肽的DNA。在噬菌体文库中,肽编码序列来自由20个天然氨基酸在15个位置中的每一个简并的序列。这允许在不同噬菌体中显示15个氨基酸的1.1×1012个可能的序列。在细菌噬菌体中肽序列和编码该肽的DNA之间的物理比值1∶1,允许从大量变体中选择与IL-10特异性结合的序列。该方法通过称为“生物淘洗”的体外选择实验方案进行。
用于进行本实施例的噬菌体文库含有2×108个不同的克隆,并且由George P.Smith(University of Missouri,USA)实验室惠赠。有关该技术的其他信息,可见于下述网页:
http://www.biosci.missouri.edu/smithgp/PhageDisplayWebsite/Phage
DisplayWebsiteIndex.html
选择技术(生物淘洗)
首先,在进行生物淘洗前,利用大肠杆菌(Escherichia coli)K91 Kan菌株(由G.P.Smith提供,Division of Biological Sciences Tucker Hall.University of Missouri)作为宿主菌株,扩增10μl噬菌体文库,接着以聚乙二醇(PEG)/NaCl和CsCl梯度离心进行两次沉淀而纯化。
由光谱测定法计算的噬菌体悬浮液的滴度是3.82×1014病毒体/ml,且感染性微粒的数量为1.3×1013TU/ml。在开始选择测定前,将该噬菌体悬浮液的一部分进行测序,以便证实扩增并未影响克隆的多样性。
生物淘洗技术由在用链酶抗生物素封闭的平板中孵育代表所有具有15个氨基酸的变体的一组噬菌体组成(出于实施的目的),所述平板用链酶抗生物素(10μg/ml,溶解于0.1M NaHCO3中,室温下2小时)封闭,加入生物素化的IL-10。生物素化的IL-10通过生物素-链酶抗生物素相互作用锚定于平板上,据此正确地显示其与噬菌体所携带的肽的相互作用。使IL-10与浓度为3×104病毒/ml的噬菌体所携带的肽接触,并允许其孵育约12小时。孵育后,用PBS/Tween(phosphate-buffered saline/polyoxyalkylene derivatives of sorbitan fattyacid esters,磷酸缓冲盐/山梨糖醇酐脂肪酸酯聚氧化亚烷基衍生物)洗涤5次,除去未结合的噬菌体,随后,通过降低pH(洗脱缓冲液),破坏IL-10和噬菌体所展示的肽之间分子相互作用,洗脱特异性结合的噬菌体。随后通过在细菌菌株(E.coli K91 Kan)中感染来扩增洗脱的噬菌体。该过程重复总计三轮,以便与IL-10特异性结合且具有高亲和力的噬菌体的含量得以富集(图3)。在每一轮中,渐进性地降低用来封闭平板的生物素化的IL-10的浓度,从2.5μg/ml至0.02μg/ml,最后为0.002μg/ml。因此,在每一轮中选择的噬菌体具有程度逐渐增加的IL-10亲和力。在该方法末,感染E.coli后,通过基因修饰的噬菌体提供的四环素抗性分离后,用引物对已经基于对IL-10的亲和力选择的噬菌体进行测序。这允许在分离菌落获得的众多克隆的噬菌体中获得展示的肽的序列。在总的已测序克隆中,对应于每个克隆所携带的具有15个氨基酸的肽的序列重复的次数,给出了所述具有15个氨基酸的肽对IL-10的相对亲和力程度。
肽序列
为了获得由生物淘洗所获得的噬菌体克隆,在存在这些噬菌体所感染的细菌菌落抗生素的情况下,进行选择,所述细菌菌落的抗性由存在于噬菌体基因组中的四环素抗性基因赋予。利用此方法,仅被噬菌体感染的菌落生长。每个菌落因此含有单个噬菌体的基因组,在所述单个噬菌体表面展示的单个肽的序列与所述单个噬菌体基因组相对应。
从噬菌体感染的细菌菌落中提取DNA,所述噬菌体来自通过生物淘洗的最后一轮选择,且利用与SEQ ID NO:27确定的某区域紧密杂交的特异性引物,对含有该区域的基因组部分进行测序,所述区域对应于噬菌体的蛋白pIII中展示的肽。由此获得表1所显示的序列,在表1中,还显示了所述序列携带的菌落(克隆)的编号。
表1:与IL-10相互作用的、来自噬菌体的氨基酸序列
肽编号 | SEQ ID NO: | 菌落编号 |
P1 | 1 | 25 |
P2 | 2 | 29 |
P5 | 3 | 2 |
P7 | 4 | 1 |
P8 | 5 | 1 |
P9 | 6 | 3 |
P10 | 7 | 2 |
P13 | 8 | 2 |
P14 | 9 | 4 |
P15 | 10 | 3 |
P16 | 11 | 3 |
P18 | 12 | 3 |
P19 | 13 | 2 |
P20 | 14 | 1 |
P21 | 15 | 1 |
P22 | 16 | 1 |
P23 | 17 | 1 |
P24 | 18 | 2 |
P25 | 19 | 1 |
P26 | 20 | 1 |
P29 | 21 | 1 |
肽编号 | SEQ ID NO: | 菌落编号 |
P31 | 22 | 1 |
P32 | 23 | 1 |
P33 | 24 | 1 |
P34 | 25 | 1 |
P35 | 26 | 1 |
每个序列的克隆(菌落)编号给出了肽和IL-10之间相对亲和力程度,即克隆编号越大,则结合亲和力越强。然而,亲和力程度并不对应于阻断IL-10活性的能力,因为,一些最具活性的肽,如SEQ ID NO:6(P9)和SEQ ID NO:17(P23)所示的肽,分别提供了3和1个克隆,而SEQ ID NO:2所示的肽,提供了29个克隆,其在抑制测定(实施例3)中活性低的多。尽管不希望与任何理论相关,但此问题可以根据最具活性的肽可能阻断IL-10与其受体结合来解释。
肽序列比较
利用从互联网上获得(http://www.expasy.org/tools/dna.html)的“翻译工具(translate tool)”程序,分析所获得的序列,该程序允许推导随后用来工作的序列。总共测序了143个克隆,这允许鉴定35种不同的肽(P1-P35),其中所述肽的9种(P3、P4、P6、P11、P12、P17、P27、P28和P30)也发现于利用其他蛋白的其他生物淘洗测定中,因此,认为它们不是特异的与IL-10结合,因此,可以丢弃它们。这些非特异性的结合可归因于与选择过程中存在的组分(塑料制品、生物素、链酶抗生物素等)的相互作用和/或归因于噬菌体表面蛋白。
实施例2
基于人IL-10(hIL-10)和其受体的复合体的结构设计肽
在该实例中,考虑(hIL-10)-(hIL-10受体)复合体的结构,研发人IL-10(hIL-10)抑制剂。在所述结构中,在hIL-10的一级结构中存在两个α螺旋区(氨基酸19-35和氨基酸86-110),它们以反向平行的方式定位,并且与hIL-10和其受体的相互作用有关。这些肽的序列显示如下:
(SEQ ID NO:28)Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp AlaPhe Ser Arg Val Lys Thr(hIL-10的氨基酸19-35)
(SEQ ID NO:29)Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu AsnLeu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg(hIL-10的氨基酸86-110)。
基于这些序列,本发明人推测,下文表2所示且在其C末端(所述末端己酰胺化)具有修饰的肽,可能与hIL-10的区域(或与hIL-10受体的区域)结合,并阻止hIL-10和其受体间的相互作用。因此,预测表2中所示且SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的肽将与hIL-10受体结合,而SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的肽将与hIL-10结合。
表2:预测为hIL-10潜在抑制剂的肽
肽编号 | SEQ ID NO: | 氨基酸序列 | 氨基酸(hIL-10) |
F24 | 30 | Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly GluAsn | 86-97 |
F25 | 31 | Lys Val Arg Ser Phe Ala Asp Arg Leu Asp ArgLeu | Rev 23-34 |
F26 | 32 | Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg ValLys | 23-34 |
F27 | 33 | Leu Asp Arg Leu Asp Arg Ala Phe Ser Asp ValAsp | comp23-34 |
F28 | 34 | Asp Val Asp Ser Phe Ala Arg Asp Leu Arg AspLeu | Rev comp23-34 |
F29 | 35 | Asp Thr Leu Asp Leu Asp Leu Asp Asp | comp99-107 |
F30 | 36 | Asp Asp Leu Asp Leu Asp Leu Thr Asp | Rev comp99-107 |
Rev:反向阅读的肽序列;以及
comp:序列具有互补的残基,换句话说,它们可以主动地与相关序列的残基相互作用。
因此,例如,限定为“comp 99-107”(SEQ ID NO:35)的肽,因为氨基酸Lys和Arg存在于所述肽99-107(下文粗体所示)中,其氨基酸序列与包含于氨基酸99和氨基酸107(肽99-107)的hIL-10片段的氨基酸序列互补,可以与所预测的肽的氨基酸Asp(也以粗体显示)相互作用,并且其设计为“comp 99-107”:
实施例3
在用MC/9细胞进行的增殖测定中通过肽抑制IL-10的体外生物
学活性
MC/9细胞系(CRL-8306,美国典型细胞培养物保藏中心(ATCC),美国维吉尼亚)是衍生于小鼠肝脏的肥大细胞,它们在悬浮液中生长,并且它们的增殖受外源性地加入至培养基中的IL-10的存在的诱导。为此,通过抑制所述细胞因子的合成肽抑制外源IL-10的作用,降低了MC/9细胞的生长,这允许体外测量所述肽的IL-10抑制活性。在此测定中,增殖间接地测定为DNA合成过程中含氚的胸苷的并入。
当评估人IL-10(hIL-10)和小鼠IL-10(mIL-10)两者的抑制时,进行该测定的最适宜条件如下。以在完全培养基中的初始密度为20,000个细胞/孔,向96孔板中加入MC/9细胞,所述培养基为具有10%FBS(10270-106 Gibco),50μg/mL链霉素和50U/mL青霉素(15140-122Gibco),2mM谷酰胺(BE17-605E Bio Whittaker)和2巯基乙醇的DMEM(BE-12-604F Bio Whittaker),如果合适,添加5%RAT-STIM(354115Becton Dickinson)和0.5ng/mL小鼠IL-4(Preprotech EC,London,United Kingdom)和1.25ng/mL hIL-10(e-Bioscience)或mIL-10(e-Bioscience),将它们在37℃和5%CO2下孵育24小时。之后,每孔加入1μCi甲基-3H-胸苷(Amersham Life Science,Buckinghamshire,United Kingdom),并将平板在相同的条件下孵育多于12小时。最后,收获细胞,含氚的胸苷并入合成的DNA中,转移至平板(UniFilter-96GF/Perkin Elmer),并在加入闪烁液(scintillation liuquid)后在闪烁计数器(Top Count,Microplate Scintillation Counter,Packard)中定量放射性,并且测量每个孔每分钟计数(cpm)的发射,对其进行定量。
利用不同浓度(150、100和50μg/ml)的待测定的每种肽,测定肽的抑制能力。如果合适,将肽溶液与1.25ng/ml hIL-10或mIL-10一起孵育2小时,随后加入MC/9细胞与小鼠IL-4,以便IL-4的终浓度是0.5ng/ml。阴性增殖对照由与小鼠IL-4一起孵育的细胞构成,而阳性增殖对照由与小鼠IL-4和IL-10一起孵育的细胞构成。如果适当,用抗人IL-10抗体(e-Bioscience)或抗-小鼠IL-10抗体(e-Bioscience)(3ng/ml)作为抑制对照。每种肽一式三份进行分析。结果表示为通过下述公式计算的抑制百分比:
%抑制=(cpm max-cpm exp)/(cpm max-cpm min)×100
其中:
“cpm max”是每分钟的最大计数;
“cpm exp”是肽的每分钟的实验计数;以及
“cpm min”是每分钟的基线计数。
利用Atherton Fmoc变体(Atherton,E.,Logan,J.C.and Sheppard,R.C.1989.Peptide synthesis II.Procedures for solid phase synthesis usingN-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids on polyamide supports.Synthesis of substance P and of acyl carrier protein 65-74 decapeptide(肽的合成II,利用聚酰胺支持体上的N芴甲氧羰酰氨基酸固相合成方法,P物质和酰基载体蛋白65-74十肽的合成).J.Chem.Soc.Perkin Trans.1:538),根据常规方法,通过肽合成获得测定的肽(图4)。肽的纯度通过反相高效液相色谱(HPLC)和/或质谱测定。就其抑制IL-10活性的能力而言,仅纯度等于或大于80%的那些肽得以检测。
为了测量肽抑制IL-10的能力,必须将它们置于以MC/9细胞进行增殖测定的培养基中的溶液中。为此,首先试图将肽以1mg/ml的浓度溶解于完全培养基中,由于在这些条件下表1的26种肽中仅10种是可溶的,且2种是部分可溶的(表3)这一事实,必须通过加入不同比例的二甲基亚砜(DMSO)或尿素来改善剩余肽的溶解性。还检测了其他增溶剂,如盐酸胍、乙醇、甲醇、异丙醇、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙腈、氨和乙酸,但由于它们对于细胞不是非常有效或是有毒的这一事实,因而放弃使用它们。为了尽可能地限制DMSO或尿素的毒性,培养基中两种试剂的浓度尽可能地低,且与体外测定相容。因此,首先确定允许进行MC/9细胞的体外增殖测定的、待加入的增溶剂的最大浓度。如上文所示,检测了1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005和0.001%乙酸、氨、DMSO、DMF、丙酮、乙腈、异丙醇、甲醇和乙醇,以及2、1、0.5、0.250、0.125、0.062和0.031M的尿素和盐酸胍。
在所有检测的浓度中,盐酸胍的毒性非常强。乙酸、DMSO和DMF与测定相容的最终最大浓度为0.01或0.005%,该浓度不能使肽溶解。如果是尿素,界限浓度为125mM,对于氨,为0.2%(检测的最大浓度)。就醇而言,它们高达1%(最大)是相容的,且丙酮和乙腈看起来诱导MC/9细胞增殖。
DMSO:
检测用DMSO(1mg/mL母液的2%的终体积)和干净培养基重悬浮的、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的肽。在将它们用超声波降解后,除了SEQ ID NO:16所示的肽外,所有的肽仍然都是浑浊的。
甲醇/乙醇
为了利用这些醇溶解肽,必须使用100%的它们,且在此浓度下,它们对MC/9细胞是有毒性的。即使在70%下,它们也是有毒的。
尿素
将SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20所示的肽溶解于8M尿素(在1mg/mL中的终浓度为0.8M)和完全培养基中。相对来说,尿素是有毒性的(无尿素的cpm为1.128,120mM的尿素时,为109,80mM时,为308,20mM时,为800,但维持窗口)。
用来溶解肽的条件概括于表3中。在所示的39种肽中,11种(粗体显示)不能用任何所述条件溶解,因此,它们不能在体外测定中得到检测。
表3:用于溶解1mg/mL的肽的条件
不能以任何所检测的条件溶解的肽以粗体显示。part S:部分可溶;S:可溶;I:不溶。
由于IL-10促进MC/9细胞增殖这一事实,向已经加入外源IL-10的MC/9细胞中加入能抑制IL-10活性的肽,具有抑制这些细胞增殖的作用。然而,向培养物中加入对MC/9细胞有毒性的肽或任何组分(用来改善肽的溶解性),也具有抑制细胞增殖的作用。因此,为了确保肽真正地抑制IL-10,而不是由于对细胞的毒性抑制增殖,必须证明向培养物中加入的肽或其他试剂对细胞来说是非毒性的。为此,利用小鼠粒细胞-单核细胞集落刺激因子(mouse granulocyte-monocytecolony-stimulating factor,mGM-CSF,其也促进MC/9细胞增殖)代替IL-10,进行肽的并行测定。所用的mGM-CSF的浓度为0.01ng/mL。在此情况下,不用IL-4作为共刺激物(co-stimulus)。将毒性表示为mGM-CSF所诱导的增殖的抑制百分比。
就溶解于尿素中的肽而言,当分析IL-10抑制和毒性两者时,包括阴性对照、阳性对照和具有存在于肽样品中的尿素浓度(120mM、80mM和20mM)的抗体的对照,以及无尿素对照。将样品的cpm值与含有相同浓度尿素的对照的值进行比较,计算肽在每一浓度下的抑制百分比。
通过考虑图4所示的肽[P1(SEQ ID NO:1)、P2(SEQ ID NO:2)、P7(SEQ ID NO:4)、P9(SEQ ID NO:6)、P10(SEQ ID NO:7)、P13(SEQID NO:8)、P15(SEQ ID NO:10)、P16(SEQ ID NO:11)、P19(SEQ IDNO:13)、P20(SEQ ID NO:14)、P22(SEQ ID NO:16)、P23(SEQ ID NO:17)、P23-3(SEQ ID NO:43)、P23-4(SEQ ID NO:44)、P24(SEQ ID NO:18)、P25(SEQ ID NO:19)、P26(SEQ ID NO:20)、P31(SEQ ID NO:22)、P32(SEQ ID NO:23)、P33(SEQ ID NO:24)、P34(SEQ ID NO:25)、P35(SEQ ID NO:26)、F24(SEQ ID NO:30)、F25(SEQ ID NO:31)、F27(SEQ ID NO:33)、F28(SEQ ID NO:34)、F29(SEQ ID NO:35)和F30(SEQ ID NO:36)]导致的IL-10的抑制百分比,以及它们的毒性,观察到:
-在表3的12种肽中,其在完全培养基中是可溶的或部分可溶的,P7(SEQ ID NO:4)、P10(SEQ ID NO:7)和P20(SEQ ID NO:14)(图4)所示的肽不具有显著的hIL-10或mIL-10抑制活性(值为约10%-20%抑制);剩余的肽具有30%至50%的IL-10抑制活性。P15(SEQ ID NO:10)、P19(SEQ ID NO:13)、P25(SEQ ID NO:19)和P34(SEQ ID NO:25)所示的肽活性最强。
-对于利用尿素而溶解的肽[P9(SEQ ID NO:6)、P22(SEQ ID NO:16)、P23(SEQ ID NO:17)、P23-3(SEQ ID NO:43)、P23-4(SEQ ID NO:44)、P24(SEQ ID NO:18)和P26(SEQ ID NO:20)所示的肽]而言,P9(SEQ ID NO:6)和P22(SEQ ID NO:16)所示的肽活性很强,其IL-10抑制活性为约60%;该组剩余的肽是无活性的,且P24(SEQ ID NO:18)和P26(SEQ ID NO:20)所示的肽对MC/9细胞有部分毒性;以及
-在基于与IL-10序列区“互补”的考虑预测的肽组(实施例2)[F24(SEQ ID NO:30)、F25(SEQ ID NO:31)、F27(SEQ ID NO:33)、F28(SEQ ID NO:34)、F29(SEQ ID NO:35)和F30(SEQ ID NO:36)所示的肽中]中,F28(SEQ ID NO:34)、F29(SEQ ID NO:35)和F30(SEQ IDNO:36)所示的肽也显示了一些IL-10抑制活性。
实施例4
在抑制混合淋巴细胞应答(mixed lymphocyte response,MLR)测定
中,通过能与IL-10结合的肽,体外抑制Karpas调节T细胞(Karpas
regulatory T cells)的生物学活性
有文献最近描述了具有产生IL-10和调节T细胞特征的、衍生于人淋巴细胞的Karpas 299细胞系(DSMZ ACC 31)的存在。用这些细胞进行“混合的淋巴细胞反应”或MLR。这种技术基于在具有不同组织相容性的不同来源的淋巴细胞共培养物中产生IFN-γ,所述不同来源的淋巴细胞将彼此识别为外源的。这种反应使淋巴细胞增殖,分泌包括IFN-γ在内的细胞因子。对于该测定而言,将每个供体的100,000个细胞(MLR阳性对照)单独或与数量渐增的Karpas299细胞(0-100,000Karpas 299)一起培养于96孔板中。为了测量肽的活性,每孔加入100μg/mL的每种肽。48小时后,移走上清液的等分试样以测量IFN-γ。在此情况下,由于Karpas 299细胞系的存在在MLR增值中掩盖了任何可能的作用这一事实,因此不可能测量细胞增殖。IFN-γ的测量结果显示于图5中。
在本测定中,肽P1(SEQ ID NO:1)、P13(SEQ ID NO:8)、P15(SEQID NO:10)、P19(SEQ ID NO:13)、P20(SEQ ID NO:14)、F24(SEQ IDNO:30)、F25(SEQ ID NO:31)、F28(SEQ ID NO:34)和F29(SEQ IDNO:35)作为IL-10活性抑制剂的作用显著。
实施例5
用Th0决定子免疫后,体外再刺激淋巴细胞,通过定量上清液中
所产生的干扰素-γ(IFN-γ),能与IL-10结合的肽[P9(SEQ ID NO:6)和
P13(SEQ ID NO:8)]对体外Th1应答的诱导作用
取决于序列的特征,通过肽(抗原)诱导免疫系统的应答,产生特异性的细胞因子谱。辅助决定子肽诱导衍生于Th1特征(细胞毒性应答)或Th2(体液应答)的Th0应答,Th1或Th2的特征均为特异性的细胞因子谱。存在抑制Th1特征且导致针对Th2特征的免疫应答的IL-10,利于最佳Th2特征(由IL-4的存在限定)。在此情况下,在诱导Th0型应答过程中,用IL-10抑制剂治疗,具有Th1型细胞因子诱导作用(IFN-γ)。
就本项研究而言,已选择6种优化的肽作为Th0决定子,其中3种衍生于卵白蛋白(OVA),3种衍生于抹香鲸(FISEA)的肌红蛋白(MIO)(表4)。
表4:衍生于OVA和FISEA的Th0决定子肽
用来进行本次测定的IL-10抑制肽是不溶的肽P9(SEQ ID NO:6)和可溶的P13(SEQ ID NO:8)。简而言之,用200μL弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant)和含有50纳摩尔的相应Th0决定子肽的含水溶液的1∶1乳剂,皮下免疫4-6周龄的雌性BALB/c小鼠。免疫10天后,处死小鼠,提取腹股沟、主动脉周和腿弯部的淋巴结以及脾。在96孔U底板中,在存在或不存在免疫中所用的浓度为30mg/ml的肽,以及在存在或不存在IL-10抑制肽[P9(50mg/ml)和P13(100mg/ml)]的情况下,将提取的淋巴细胞在终体积为200μl的完全培养基(MC;RPMI 1640,10%FBS;2mM谷酰胺,100U/ml青霉素;100μg/mL链霉素;5×105M2β-巯基乙醇;25mM Hepes以及0.5%(v/v)丙酮酸钠)中培养48小时。37℃和5%CO2下培养48小时后,每孔取100μL上清液(50μL用于定量IFN-γ+50μL用于定量IL-10)。将上清液冰冻于-20℃,直到通过ELISA技术测定细胞因子。
在本次测定中,已经发现,来自用肽FISEA G(SEQ ID NO:38)免疫的动物的淋巴细胞,在用该肽体外再刺激后,相对所检测的其他肽,产生的IFN-γ的水平最高(图6)。而且,这些IFN-γ的水平通过与IL-10抑制相容的机制,在存在肽P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID NO:8)的情况下,明显增加。事实上,该肽[FISEA G(SEQ ID NO:38)]是在上清液中诱导可检测的IL-10水平(70pg/mL)的唯一肽。
实施例6
皮下接种CT26细胞后,能与IL-10结合的肽[P9(SEQ ID NO:6)
和P13(SEQ ID NO:8)]对诱导抗肿瘤应答的影响
IL-10是具有强有力的有关肿瘤生长的免疫抑制作用的细胞因子。因此,其是许多肿瘤产生的、作为预防有效的免疫学应答机制的细胞因子。
在本实施例中,在用佐剂免疫进行肿瘤内免疫治疗或不进行肿瘤内免疫治疗的情况下,皮下接种CT26细胞[小鼠结肠腺癌细胞系(Fearon,E.R.,Vogelstein,B.1990.A genetic model for colorectal tumorigenesis.Cell61:759)],随后诱导抗肿瘤细胞毒性应答,之后,在肿瘤生长模型中检测肽P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID NO:8)的作用,所述佐剂为激活树突细胞、NK细胞和T细胞的聚肌苷-聚胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid)和抗-CD40激动剂抗体。
在本次测定中,将Balb/C小鼠用5×105CT26肿瘤细胞激发,用200μL PBS皮下接种,分成4组:
(1)对照组:用CT26细胞接种的小鼠。
(2)佐剂组:通过肿瘤内途径用100μLPBS中的50μg poly I:C和50μg抗-CD40处理0、7和14天的小鼠。
(3)抑制剂组:每只小鼠仅用在PBS中的IL-10抑制剂即50μg P9(SEQ ID NO:6)通过肿瘤内途径以及50μg P9(SEQ ID NO:6)通过腹膜内途径每周处理三次共处理三周的小鼠。
(4)完全组:用佐剂外加IL-10抑制剂处理的小鼠。
当肿瘤直径达到5-6mm时,视为“0”天。
用IL-10抑制肽处理能保护6.6%的动物,并对肿瘤生长产生很大程度的延迟(图7)。佐剂保护53%的动物,并显著降低肿瘤生长的平均水平(图7)。佐剂和IL-10抑制剂的组合相对仅用佐剂处理的组而言轻微限制肿瘤生长的平均水平(图7),但增加了针对肿瘤保护的百分比,高达76.6%。
本实施例清楚地表明,IL-10抑制肽在该因子介导的免疫抑制背景下在肿瘤发展中的适用性。
实施例7
人IL-10和能与IL-10结合的肽[P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID
NO:8)]之间的生物分子相互作用,以及通过表面等离子共振分析测定
的其衍生物
通过表面等离子共振(SPR)分析,测量人IL-10与肽P9(SEQ IDNO:6)和P13(SEQ ID NO:8),以及下述截短的和/或修饰形式的P9之间的生物分子相互作用:
表5
*)单字母代码的氨基酸命名
由表5可以看出:
SEQ ID NO:45[P9(2-15)]是包含肽P9(SEQ ID NO:6)第2-15位氨基酸序列的肽;
SEQ ID NO:46[P9(1-14)]是包含肽P9(SEQ ID NO:6)第1-14位氨基酸序列的肽;
SEQ ID NO:47[P9(1-13)]是包含肽P9(SEQ ID NO:6)第1-13位氨基酸序列的肽;
SEQ ID NO:48[P9(2-14)]是包含肽P9(SEQ ID NO:6)第2-14位氨基酸序列的肽;
SEQ ID NO:49[P9(2-13)]是包含肽P9(SEQ ID NO:6)第2-13位氨基酸序列的肽;
SEQ ID NO:50[P9(3-14)]是包含肽P9(SEQ ID NO:6)第3-14位氨基酸序列的肽;
SEQ ID NO:51[P9(15Ala)]是包含肽P9(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的肽;其中在第15位(Phe)的氨基酸已经被Ala取代;
SEQ ID NO:52[P9(14Ala)]是包含肽P9(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的肽;其中在第14位(Val)的氨基酸已经被Ala取代;以及
SEQ ID NO:53[(1-13;1Ser)]是包含肽P9(SEQ ID NO:6)第1-13位氨基酸序列的肽;其中第13位(Ala)的氨基酸已经被Ser取代。
为了进行本次测定,使用Biosensor BIAcore X(BIAcore,AB,Uppsala,Sweden)。简而言之,如De Crescenzo et al.2001(JBC,Vol 276;29632-29643)中所述,将人重组蛋白IL-10(R & D Systems,cat No.217-IL/CF)共价固定于CM5芯片(BIAcore)的流式细胞2(flow cell,FC2)的表面。用在表面没有固定IL-10的流式细胞1(FC1)作为对照流式细胞。以30μl/分钟的流速,注射至少两次肽溶液(10μM),所述肽溶液在10mM Hepes缓冲液pH 7.4,150mM NaCl,0.005%Tween 20(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate,聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯)中。从在FC2获得的应答减去在FC1中获得的应答,处理结合曲线。将平衡时的应答在检测肽和相同长度的不相关对照肽之间进行比较。所用的对照肽是肽P301(SEQ ID NO:54)(源自HIV-1包被,gp120(301-315):NNTRKRIRIQRGPGR)。以质量修正因子(mass correctionfactor)MW(PX)/MW(P)乘每次应答,其中,MW(PX)是检测肽P的分子量,MW(P)是对照肽(P301)的分子量。观察到所检测的不同肽都产生阳性信号,这清楚地表明,它们能与IL-10特异性结合。
图8表示通过SPR分析获得的生物分子相互作用特征的实例,所述生物分子相互作用发生于IL-10和肽P9(SEQ ID N0:6)之间,以及用对照肽[P301(SEQ ID NO:54)]获得的生物分子相互作用。
图9表示由SPR分析所测量的生物分子相互作用获得的结果,所述生物分子相互作用存在于IL-10和肽P9(SEQ ID NO:6),P13(SEQID NO:8)以及它们平截的和/或修饰的形式P9(2-15)(SEQ ID NO:45)、P9(1-14)(SEQ ID NO:46)、P9(1-13)(SEQ ID NO:47)、P9(2-14)(SEQID NO:48)、P9(2-13)(SEQ ID NO:49)、P9(3-14)(SEQ ID NO:50)、P9(15 Ala)(SEQ ID NO:51)、P9(14 Ala)(SEQ ID NO:52)、P9(1-13;1Ser)(SEQ ID NO:53)之间。
总之,良好的相互作用发现存在于IL-10和测定的肽之间。当分析衍生于P9(SEQ ID NO:6)的肽时,观察到,对羧基端的氨基酸进行修饰,不影响其与IL-10结合的能力;然而,如果肽在其氨基端或羧基端是截短的,则发现肽与IL-10结合的能力是改善的。
实施例8
能与IL-10结合的肽P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID NO:8)对
IL-10与其膜受体结合所诱导的转录因子STAT3磷酸化的影响。
IL-10的活性受特异性膜受体IL-10R结合的介导,所述受体在种类繁多的免疫细胞中表达。IL-10/IL-10R相互作用吸引并捕获磷酸化和激活转录因子STAT3(Signal Transducer and Activator ofTranscription 3,信号转导物和转录激活剂3)的2种激酶(Jak1和Tyk2),STAT3以非活性形式见于细胞质中,并且是IL-10所有已知功能所必需的(Donnelly et al.,Journal of Interferon & Cytokine Research.June 1,1999,19(6):563-573)。
检测肽P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID NO:8)能与IL-10结合抑制IL-10诱导的STAT3磷酸化的能力。利用对人和鼠IL-10应答的MC/9细胞(CRL-8306,美国典型细胞培养物保藏中心(ATCC),美国维吉尼亚)进行测定。在96孔U底板(TPP,92097)中,且在与细胞接触前,将肽P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID NO:8)以50μg/ml的浓度,与浓度为0.15ng/ml的IL-10在37℃和5%CO2下、在体积为100μl的完全培养基(RPMI 1640,10%胎牛血清(FBS);2mM谷酰胺,100U/ml青霉素;100μg/mL链霉素;5×105Mβ-巯基乙醇;25mM Hepes和0.5%(v/v)丙酮酸钠)中,孵育2小时。随后,每孔加入2×105个,并在37℃和5%CO2下再孵育2小时,终体积为200μl/孔。以1,500rpm离心细胞5分钟并弃掉上清液后,将沉淀重悬浮于150加样缓冲液(10%甘油、5%2-巯基乙醇、2%十二烷基硫酸钠、Tris-HCl 62.5mM[pH6.8]、0.006%溴酚蓝),进行电泳,并将样品在-80℃下冰冻。由这些样品进行Western印迹,测定在所测定的不同条件下磷酸化的STAT-3的量,包括阴性对照(仅细胞)和阳性对照(细胞+IL-10)。也测定每个样品中肌动蛋白的量,作为分析对照。在密度计中分析Western印迹中所获得的条带,以便定量它们中每一个的含量。用相应的肌动蛋白对照校正所获得的每个样品的密度计读数。
图10表示肽P9(SEQ ID NO:6)和P13(SEQ ID NO:8)对IL-10所诱导的STAT3磷酸化的抑制作用。通过Western印迹(图10A),分析磷酸化的STAT3表达。图10B表示通过密度计定量的每个样品的磷酸化的STAT3条带的量和获得的肌动蛋白对照的量的比值。
实施例9
在用B16-F10肿瘤细胞进行的增殖测定中,IL-10抑制肽的作用
IL-10免疫抑制作用与肿瘤生长相关,此类IL-10是许多肿瘤产生的细胞因子,用来逃避有效的免疫应答。实际上,某些肿瘤细胞组成型地分泌IL-10,其是恶性细胞增殖所必需的,已经证明,它们的中和降低肿瘤细胞的生长。B16-F10(B16)黑素瘤系就是如此,其分泌相当数量的IL-10,并且其增殖在存在IL-10中和抗体时受到抑制。
在本次测定中,检测IL-10抑制肽对生长需要该细胞因子的B16细胞增殖的活性。为了进行本测定,在存在或不存在肽P9(SEQ ID NO:6)、P13(SEQ ID NO:8)、P15(SEQ ID NO:10)、P16(SEQ ID NO:11)、P31(SEQ ID NO:22)和P34(SEQ ID NO:25)的情况下,将添加了2%PBS的RPMI培养基中的5,000个细胞/孔,培养于96孔板(组织培养板,96W,平底,具盖,无菌,CELLSTAR N°655180)中;用肽P301(SEQ ID NO:54)作为阴性对照。所测定的肽的浓度为200μg/ml。因此在37℃和5%CO2下将细胞孵育24小时。孵育时间结束后,用结晶紫染色细胞,通过用10%乙酸洗涤定量染料,并在570nm下在ELISA读数器中测量。在200μg/ml浓度下,检测所有的肽。所获得的结果包括于图11中,并对应于一式三份所进行的测定的平均值和偏差。
实施例10
当在外周血单核细胞培养物中产生IFN-α时,肽P13(SEQ ID NO:
8)对丙型肝炎病毒核壳(HCV核心)蛋白抑制活性的影响
浆细胞样树突细胞(plasmacytoid dendritic cells,pDC)产生IFN-α对抗病毒免疫应答非常关键。在丙型肝炎病毒(HCV)的情况下,所述病毒具有长期性倾向,逃避这种应答的机制之一可能受单核细胞在与HCV核心蛋白通过受体TLR2(Toll样受体2)结合后的激活介导,单核细胞激活后刺激诸如IL-10的细胞因子产生,诸如IL-10的细胞因子反过来抑制pDCs产生IFN-α(Dolganiuc et al.,The Journal of Immunology,2006,177:6758-6768)。用TLR9配体刺激外周血单核细胞(peripheralblood mononuclear cells,PBMC),诱导pDCs产生IFN-α,且HCV核心的存在抑制IFN-α的产生。这种抑制至少部分受单核细胞产生的IL-10的介导,因此决定检测本发明提供的能与IL-10结合的肽在本系统中的作用。为此,从不同健康供体中获得血液样品,从该血样样品中通过Ficoll梯度(Ficoll gradient,GE Healthcare,17-1440-03)分离PBMCs。在96孔U底板中,每孔加入2×105个细胞,将细胞在RPMI培养基中孵育,所述培养基添加有10%FBS,以及浓度为5μg/ml的TLR9配体CpG(Genosys,ODN2216)、浓度为2.5μg/ml的重组HCV核心(BioDesign,R8A115)和肽P13(SEQ ID NO:8)。用浓度为1μg/ml的抗IL-10抗体(eBioscience,16-7108-81)作为阳性对照。将细胞在37℃和5%CO2下孵育48小时。孵育时间结束后,从每个孔中取上清液,利用商业试剂盒(MabTech,3424-1H-6),通过ELISA技术,测定产生的IFN-α。
图12以柱状图显示了如前所述的在存在HCV核心的情况下,肽P13(SEQ ID NO:8)对用CpG刺激的PBMC培养物中IFN-α产生的影响。显示的结果代表了四次结果相似的实验。
序列表
<110>西玛生物医学信息公司(Proyecto de Biomedicina CIMA,S.L.)
<120>能与白介素10(IL-10)结合的肽
<130>P2109PC00
<150>P200700806.8
<151>2007-03-27
<160>54
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽p1
<400>1
Arg Lys Leu Arg Pro His Trp Leu His Phe His Pro Val Ala Val
1 5 10 15
<210>2
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽p2
<400>2
Ala Arg Trp Met His Arg His His Gly Trp Ser Asp Arg His Arg
1 5 10 15
<210>3
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽p5
<400>3
Pro Phe Val Val Ser Asp Ile Ala Phe Met Gly Leu Phe Tyr Asp
1 5 10 15
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽p7
<400>4
Ala Lys Val Pro Ser Phe Arg Arg Ser Ser Leu Gly Ser Val Arg
1 5 10 15
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P8
<400>5
Arg Phe Tyr His Ala Asp Met Leu Leu Arg His Val Leu Met Met
1 5 10 15
<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽p9
<400>6
Cys His Arg Cys Phe His Phe Arg Arg His Pro Val Ala Val Phe
1 5 10 15
<210>7
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P10
<400>7
His Arg Trp Met Pro His Val Phe Ala Val Arg Gln Gly Ala Ser
1 5 10 15
<210>8
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P13
<400>8
Thr Arg His Arg His Val Pro Arg Phe Leu Pro Leu Arg His Val
1 5 10 15
<210>9
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P14
<400>9
Trp Ala Tyr Tyr His Ala Gly His Ser Ser Phe Ala Val Trp Thr
1 5 10 15
<210>10
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P15
<400>10
Gly Ala Gly Val Leu Thr Pro Phe Thr Trp Arg Arg Phe His Met
1 5 10 15
<210>11
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P16
<400>11
Arg Met Leu Gly Phe Met Ser Gly Ser Trp Arg Thr Pro Val Arg
1 5 10 15
<210>12
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P18
<400>12
Gly Val Leu Ser Ser Ile Phe Ser Trp Arg Leu Val Ala Leu His
1 5 10 15
<210>13
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P19
<400>13
Ile Phe Arg Val Leu Ser Arg Met Leu Pro Gly Thr Ser Val Ile
1 5 10 15
<210>14
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P20
<400>14
Ala Arg Phe Pro Lys Glu Leu Arg Gly Ser Val Arg Ser Ala His
1 5 10 15
<210>15
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P21
<400>15
Gly Arg Val Pro Ser Met Phe Gly Gly His Phe Phe Phe Ser Arg
1 5 10 15
<210>16
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P22
<400>16
Trp Ser Leu Leu Arg Ile Val Tyr Asn Arg His Ser His Ser Lys
1 5 10 15
<210>17
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P23
<400>17
Arg Gly Trp Ile Leu Asp Val Val Tyr Leu Tyr Pro Gly Pro Leu
1 5 10 15
<210>18
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P24
<400>18
Phe Ser Trp Tyr Phe Arg His His Arg Leu Met Val Ala Gly Pro
1 5 10 15
<210>19
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P25
<400>19
Gly Arg Phe Arg His Tyr Ser Met Leu Arg His His Ser Ile Arg
1 5 10 15
<210>20
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P26
<400>20
His Gly Phe Phe Ala Gly Gly Leu Ala His Trp His Gly His Arg
1 5 10 15
<210>21
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P29
<400>21
Ala His Arg Cys Cys His Leu Phe Thr Leu Ala Phe Leu Phe Ala
1 5 10 15
<210>22
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P31
<400>22
Phe Arg Ser Phe His Tyr His Thr Gly Arg Trp His Trp Leu Pro
1 5 10 15
<210>23
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P32
<400>23
Glu Ser Phe Phe Val Cys Ala Gly Leu Cys Arg Leu Gln Pro Tyr
1 5 10 15
<210>24
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P33
<400>24
Leu Phe Leu Leu Ser Gly Val Phe Val Pro Asp Leu His Glu Gly
1 5 10 15
<210>25
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P34
<400>25
His Arg His Phe Arg Trp Leu Asn Gly Met Pro Arg Leu Leu Gly
1 5 10 15
<210>26
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P35
<400>26
Gly Cys Ser Ala Leu Val Gly Phe Leu Ile Leu Leu Cys Cys Met
1 5 10 15
<210>27
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>27
agccctcata gttagcgt 18
<210>28
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hIL-10的第19-35位氨基酸
<400>28
Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys
1 5 10 15
Thr
<210>29
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hIL-10的第86-35位氨基酸
<400>29
Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu
1 5 10 15
Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
20 25
<210>30
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽F24
<400>30
Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn
1 5 10
<210>31
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽F25
<400>31
Lys Val Arg Ser Phe Ala Asp Arg Leu Asp Arg Leu
1 5 10
<210>32
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽F26
<400>32
Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys
1 5 10
<210>33
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽F27
<400>33
Leu Asp Arg Leu Asp Arg Ala Phe Ser Asp Val Asp
1 5 10
<210>34
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽F28
<400>34
Asp Val Asp Ser Phe Ala Arg Asp Leu Arg Asp Leu
1 5 10
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽F29
<400>35
Asp Thr Leu Asp Leu Asp Leu Asp Asp
1 5
<210>36
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽F30
<400>36
Asp Asp Leu Asp Leu Asp Leu Thr Asp
1 5
<210>37
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽FISEA
<400>37
Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile His Val Leu His Ser Arg
1 5 10
<210>38
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽FISEA G
<400>38
Phe Ile Gly Glu Ala Ile Ile His Val Leu His Ser Arg
1 5 10
<210>39
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽FISEA K
<400>39
Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile Lys Val Leu His Ser Arg
1 5 10
<210>40
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽OVA E
<400>40
Glu Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala
1 5 10 15
<210>41
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽OVA G
<400>41
Gly Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala
1 5 10 15
<210>42
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽OVA K
<400>42
Lys Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala
1 5 10 15
<210>43
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P23-3
<400>43
Arg Gly Trp Ile Lys Asp Val Val Tyr Leu Tyr Pro Gly Pro Leu
1 5 10 15
<210>44
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽P23-4
<400>44
Arg Gly Trp Ile Arg Asp Val Val Tyr Leu Tyr Pro Gly Pro Leu
1 5 10 15
<210>45
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>截短的肽P9(2-15)
<400>45
His Arg Cys Phe His Phe Arg Arg His Pro Val Ala Val Phe
1 5 10
<210>46
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>截短的肽P9(1-14)
<400>46
Cys His Arg Cys Phe His Phe Arg Arg His Pro Val Ala Val
1 5 10
<210>47
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>截短的肽P9(1-13)
<400>47
Cys His Arg Cys Phe His Phe Arg Arg His Pro Val Ala
1 5 10
<210>48
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>截短的肽P9(2-14)
<400>48
His Arg Cys Phe His Phe Arg Arg His Pro Val Ala Val
1 5 10
<210>49
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>截短的肽P9(2-13)
<400>49
His Arg Cys Phe His Phe Arg Arg His Pro Val Ala
1 5 10
<210>50
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>截短的肽P9(3-14)
<400>50
Arg Cys Phe His Phe Arg Arg His Pro Val Ala Val
1 5 10
<210>51
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>截短的肽P9(15 Ala)
<400>51
Cys His Arg Cys Phe His Phe Arg Arg His Pro Val Ala Val Ala
1 5 10 15
<210>52
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>截短的肽P9(14 Ala)
<400>52
Cys His Arg Cys Phe His Phe Arg Arg His Pro Val Ala Ala Phe
1 5 10 15
<210>53
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>截短的肽P9(1-13;1 Ser)
<400>53
Ser His Arg Cys Phe His Phe Arg Arg His Pro Val Ala
1 5 10
<210>54
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>对照肽p301
<400>54
Asn Asn Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg
1 5 10 15
Claims (15)
1.能与IL-10结合的肽,选自:
a)肽,其氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21;SEQ ID NO:22;SEQ ID NO:23;SEQ ID NO:24;SEQ ID NO:25;SEQ ID NO:26;SEQ ID NO:33;SEQ ID NO:34;SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36,
b)a)中限定的肽的变体;以及
c)a)中限定的肽或b)中限定的变体的片段,包含5-15个连续的氨基酸;以及
其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的肽,选自SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所示的肽以及它们药学上可接受的盐。
3.如权利要求1所述的肽,其中所述肽能在体外和/或体内抑制IL-10的生物学活性。
4.如权利要求3所述的肽,选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:16、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:25所示的肽、其变体或片段以及它们药学上可接受的盐。
5.核酸序列,编码权利要求1-4中任一项所述的肽。
6.基因构建体,包含权利要求5所述的核酸序列。
7.载体,包含权利要求5所述的核酸序列或权利要求6所述的基因构建体。
8.宿主细胞,包含权利要求5所述的核酸序列或权利要求6所述的基因构建体或权利要求7所述的载体。
9.药物组合物,包含治疗有效量的权利要求1-4中任一项所述的肽,以及至少一种药学上可接受的赋形剂;或权利要求5所述的核酸序列,或权利要求6所述的基因构建体,或权利要求7所述的载体,或权利要求8所述的宿主细胞,和药学上可接受的载体。
10.如权利要求6所述的药物组合物,包含至少一种权利要求1-4中任一项所述的肽,以及任选地一种或多种不同的IL-10抑制化合物。
11.用于治疗呈现IL-10表达的临床状态或病理病症的产品,选自权利要求1-4中任一项所述的肽、权利要求5所述的核酸序列、权利要求6所述的基因构建体、权利要求7所述的载体以及权利要求8所述的宿主细胞。
12.如权利要求11所述的产品,用于治疗包含Th1细胞应答受到抑制的临床状态或病理病症的呈现IL-10表达的临床状态或病理病症。
13.如权利要求11所述的产品,用于治疗选自感染性疾病、肿瘤、癌症和急性损伤情况的呈现IL-10表达的临床状态或病理病症。
14.如权利要求13所述的产品,用于治疗由麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、白色念珠菌(Candida albicans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、曲霉(Aspergillus sp.)或由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、利什曼病、弓形体病引起的感染;或用于治疗霍奇金淋巴瘤、头颈癌、黑素瘤或基底细胞瘤和由被UV突变的角质细胞发展的鳞状细胞癌;或用于治疗烧伤和相关败血症。
15.产生权利要求1-4中任一项所述的肽的方法,其包括,在允许产生所述肽的条件下,培养权利要求8所述的宿主细胞,以及如果需要,回收所述肽。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200700806A ES2304315B1 (es) | 2007-03-27 | 2007-03-27 | Peptidos con capacidad para unirse a la interleuquina 10 (il-10). |
ESP200700806 | 2007-03-27 | ||
PCT/ES2008/000181 WO2008116956A2 (es) | 2007-03-27 | 2008-03-27 | Péptidos con capacidad para unirse a la interleuquina 10 (il-10) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101679488A true CN101679488A (zh) | 2010-03-24 |
Family
ID=39744788
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200880015179A Pending CN101679488A (zh) | 2007-03-27 | 2008-03-27 | 能与白介素-10(il-10)结合的肽 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8148334B2 (zh) |
EP (1) | EP2157098A2 (zh) |
JP (1) | JP2010522551A (zh) |
CN (1) | CN101679488A (zh) |
AU (1) | AU2008231660A1 (zh) |
BR (1) | BRPI0809373A2 (zh) |
CA (1) | CA2682021A1 (zh) |
ES (1) | ES2304315B1 (zh) |
MX (1) | MX2009010451A (zh) |
RU (1) | RU2009139651A (zh) |
WO (1) | WO2008116956A2 (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104231054A (zh) * | 2014-09-01 | 2014-12-24 | 王跃建 | Il-10多肽抑制剂 |
CN104922659A (zh) * | 2015-07-03 | 2015-09-23 | 刘永庆 | 防治肿瘤和/或慢性结核病的Th2免疫反应抑制剂及其应用 |
CN114931547A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-08-23 | 四川大学华西医院 | 治疗牙槽骨损伤的多肽水凝胶及其制备方法和用途 |
CN115260291A (zh) * | 2022-06-23 | 2022-11-01 | 浙江大学 | 一种特异性亲和白介素-10的亲和多肽及其用途 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014227338A (ja) * | 2013-05-17 | 2014-12-08 | キヤノン株式会社 | インドシアニングリーン含有粒子およびその製造方法 |
US10512673B2 (en) * | 2015-01-07 | 2019-12-24 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of peptide-based inhibitors of the stat3-IL10 pathway for treating bacterial infection and granulomatous disease |
BR102019007044A2 (pt) * | 2019-04-05 | 2021-12-28 | Universidade Federal de Uberlândia | Peptídeos sintéticos com afinidade ao receptor de interleucina-10, composição farmacêutica e uso dos mesmos como imunomuduladores no tratamento de doenças autoimunes, inflamatórias ou alérgicas |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08151396A (ja) * | 1994-11-28 | 1996-06-11 | Teijin Ltd | Hla結合性オリゴペプチド及びそれを含有する免疫調節剤 |
JPH10237098A (ja) * | 1997-02-26 | 1998-09-08 | Immuno Japan:Kk | 糖脂質糖鎖レプリカペプチド |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2729960A1 (fr) | 1995-01-30 | 1996-08-02 | Bio Merieux | Polypeptides mimotopes de toxoplasma gondii et applications |
AU2531397A (en) * | 1996-03-21 | 1997-10-10 | President And Fellows Of Harvard College | Enantiomeric screening process, and compositions therefor |
WO2006031727A2 (en) * | 2004-09-13 | 2006-03-23 | President And Fellows Of Harvard College | Peptides for treatment of autoimmune diseases |
US20100028296A1 (en) * | 2005-05-02 | 2010-02-04 | Chavez Raymond A | Use of cytokine-derived peptides in treatment of pain and neurodegenerative disease |
-
2007
- 2007-03-27 ES ES200700806A patent/ES2304315B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-03-27 BR BRPI0809373-3A2A patent/BRPI0809373A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-03-27 CN CN200880015179A patent/CN101679488A/zh active Pending
- 2008-03-27 MX MX2009010451A patent/MX2009010451A/es not_active Application Discontinuation
- 2008-03-27 AU AU2008231660A patent/AU2008231660A1/en not_active Abandoned
- 2008-03-27 JP JP2010500303A patent/JP2010522551A/ja active Pending
- 2008-03-27 CA CA002682021A patent/CA2682021A1/en not_active Abandoned
- 2008-03-27 EP EP08750416A patent/EP2157098A2/en not_active Withdrawn
- 2008-03-27 RU RU2009139651/04A patent/RU2009139651A/ru unknown
- 2008-03-27 US US12/593,321 patent/US8148334B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-03-27 WO PCT/ES2008/000181 patent/WO2008116956A2/es active Application Filing
-
2012
- 2012-03-08 US US13/415,151 patent/US20130064790A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08151396A (ja) * | 1994-11-28 | 1996-06-11 | Teijin Ltd | Hla結合性オリゴペプチド及びそれを含有する免疫調節剤 |
JPH10237098A (ja) * | 1997-02-26 | 1998-09-08 | Immuno Japan:Kk | 糖脂質糖鎖レプリカペプチド |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
HUI DING ET AL.: "Identification of CD21-Binding Peptides with Phage Display and Investigation of Binding Properties of HPMA Copolymer-Peptide Conjugates", 《BIOCONJUGATE CHEMICAL》 * |
SANDRINE MICHEL ET AL.: "Anti-Free Prostate-specific Antigen Monoclonal Antibody Epitopes Defined by Mimotopes and Molecular Modeling", 《CLINICAL CHEMISTRY》 * |
SHO MATSUSHITA ET AL.: "HLA-DQ-binding peptide motifs. I. Comparative binding analysis of type II collagen-derived peptides to DR and DQ molecules of rheumatoid arthritis-susceptible and non-susceptible haplotypes", 《INTERNATIONAL IMMUNOLOGY》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104231054A (zh) * | 2014-09-01 | 2014-12-24 | 王跃建 | Il-10多肽抑制剂 |
CN104922659A (zh) * | 2015-07-03 | 2015-09-23 | 刘永庆 | 防治肿瘤和/或慢性结核病的Th2免疫反应抑制剂及其应用 |
CN114931547A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-08-23 | 四川大学华西医院 | 治疗牙槽骨损伤的多肽水凝胶及其制备方法和用途 |
CN114931547B (zh) * | 2022-05-16 | 2023-04-28 | 四川大学华西医院 | 治疗牙槽骨损伤的多肽水凝胶及其制备方法和用途 |
CN115260291A (zh) * | 2022-06-23 | 2022-11-01 | 浙江大学 | 一种特异性亲和白介素-10的亲和多肽及其用途 |
CN115260291B (zh) * | 2022-06-23 | 2023-10-31 | 浙江大学 | 一种特异性亲和白介素-10的亲和多肽及其用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2304315B1 (es) | 2009-07-28 |
ES2304315A1 (es) | 2008-10-01 |
MX2009010451A (es) | 2009-12-14 |
CA2682021A1 (en) | 2008-10-02 |
JP2010522551A (ja) | 2010-07-08 |
AU2008231660A1 (en) | 2008-10-02 |
WO2008116956A2 (es) | 2008-10-02 |
US20130064790A1 (en) | 2013-03-14 |
WO2008116956A3 (es) | 2008-12-18 |
EP2157098A2 (en) | 2010-02-24 |
BRPI0809373A2 (pt) | 2014-11-11 |
US20100168015A1 (en) | 2010-07-01 |
US8148334B2 (en) | 2012-04-03 |
RU2009139651A (ru) | 2011-05-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mattei et al. | IL-15 is expressed by dendritic cells in response to type I IFN, double-stranded RNA, or lipopolysaccharide and promotes dendritic cell activation | |
JP7288405B2 (ja) | ヒトドメインを有する抗b細胞成熟抗原キメラ抗原受容体 | |
Patidar et al. | Interleukin 15: A key cytokine for immunotherapy | |
CN101679488A (zh) | 能与白介素-10(il-10)结合的肽 | |
Moroz et al. | IL-21 enhances and sustains CD8+ T cell responses to achieve durable tumor immunity: comparative evaluation of IL-2, IL-15, and IL-21 | |
Thomsen et al. | Imiquimod and resiquimod in a mouse model: adjuvants for DNA vaccination by particle-mediated immunotherapeutic delivery | |
CN103201284B (zh) | 用于癌症和慢性感染的治疗的具有激动剂活性的衍生自il-2的多肽 | |
Manoutcharian et al. | Recombinant bacteriophage-based multiepitope vaccine against Taenia solium pig cysticercosis | |
CN100560130C (zh) | 基于癌抑制基因wt1的产物的癌抗原 | |
EP3112378B1 (en) | Wt1 antigenic polypeptide, and anti-tumor agent containing said polypeptide | |
KR102148866B1 (ko) | 암 치료를 위한 t 세포의 활성화 방법 | |
US10350284B1 (en) | Antigen specific multi epitope-based anti-infective vaccines | |
CN101287487B (zh) | 基于使用纤连蛋白eda结构域的试剂和方法 | |
EP3047024A1 (en) | Compositions and methods for treatment of autoimmune and inflammatory diseases and disorders | |
KR20070097423A (ko) | 흉선-특이성 단백질 | |
Balan et al. | Unexplored horizons of cDC1 in immunity and tolerance | |
SK91696A3 (en) | Use of il-10 to stimulate peripheral blood mononuclear cell cytolytic activity | |
CN101928695A (zh) | 生产免疫细胞的方法及诱发产生免疫作用细胞的方法 | |
EP1962891B1 (en) | Dna vaccine for cancer therapy | |
CN112533629A (zh) | 结合使用il-10药剂与嵌合抗原受体细胞疗法的组合物和方法 | |
KR20180038553A (ko) | 질환 및 장애를 치료하기 위한 인터류킨-10을 사용하는 방법 | |
CN101903514B (zh) | 能与scurfin结合的肽及其应用 | |
JP2022541925A (ja) | ポリオーマウイルスのための免疫療法 | |
CN107868119B (zh) | 用于抑制cd279相互作用的组合物和方法 | |
Pakravan et al. | Adjuvant activity of GP96 C-terminal domain towards Her2/neu DNA vaccine is fusion direction-dependent |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100324 |