WO2008116956A2 - Péptidos con capacidad para unirse a la interleuquina 10 (il-10) - Google Patents

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Inés Noelia CASARES LAGAR
Nancy DÍAZ-VALDÉS FARRAY
Javier DOTOR DE LAS HERRERÍAS
Juan José LASARTE SAGASTIBELZA
Pablo Sarobe Ugarriza
Jesús PRIETO VALTUEÑA
Francisco BORRÁS CUESTA
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    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8295—Cytokinins

Definitions

  • the invention relates in general to peptides that have the ability to bind interleukin 10 (IL-IO) and its applications.
  • the invention relates to peptides inhibiting the biological activity of IL-10 by its direct binding to IL-10, and its use in the treatment of clinical conditions or pathological alterations associated with expression of IL-10, in particular , with a high expression of IL-10.
  • the immune response includes both a cellular response and a humoral response.
  • the cellular response is mostly mediated by T lymphocytes, while the humoral response is mediated by B lymphocytes.
  • Lymphocytes play important roles in the immune response, including directing cell death of virus-infected cells, the production of cytokines and antibodies, etc. Lymphocytes are also involved in acute and chronic inflammatory diseases.
  • Cytokines are soluble proteins that mediate reactions between cells and that influence cell growth and differentiation. Cytokines exert their effects through binding to specific receptors which leads to the activation of specific transduction signals for these cytokines.
  • Interleukin 10 is a pleiotropic cytokine produced by various cell types such as macrophages, monocytes, B cells and regulatory and Th2 type T cells.
  • IL-10 is a cytokine with immunosuppressive and anti-inflammatory properties, regulates numerous myeloid and cellular lymphoid activities and directly inhibits the production of various inflammatory cytokines by T cells and NK cells ("Natural Killer").
  • IL-10 was first described as a cytokine synthesis inhibitor factor (FISC) produced by Th2 cells that inhibited the production of proinflammatory cytokines such as interferon-gamma (IFN- ⁇ ), interleukin 1-alpha (IL-l ⁇ ), interleukin 1-beta (IL-l ⁇ ), interleukin 2 (IL-2) and tumor necrosis factor alpha (TNF- ⁇ ), by ThI cells .
  • FISC cytokine synthesis inhibitor factor
  • IL-IO has been shown to be able to inhibit ThI antigen-specific cell proliferation by reducing the ability of antigen presenting monocytes through deregulation of the expression of the main complex of histocompatibility (MHC) of the major class histocompatibility complex in these cells.
  • MHC histocompatibility
  • IL-IO has a strong inhibitory effect on the activation of ThI cells and on the production of proinflammatory cytokines led to the hypothesis that IL-10 was a potent immunosuppressant of cell-mediated immune responses.
  • Other authors have proposed the use of this cytokine in the treatment of acute and chronic inflammatory processes as well as in autoimmune diseases. For these reasons, this cytokine has been used in several autoimmune diseases, such as psoriasis, rheumatoid arthritis and Crohn's disease. However, in other diseases, such as in infectious processes or in cancer, it has a negative effect, since it prevents the induction of ThI responses that would promote healing.
  • IL-10 is expressed in abundance.
  • This cytokine can be produced by Th2 cells as a result of stimulation with HCV antigens. It can also be produced by regulatory T cells (CD4 and CD8) that inhibit the development of ThI type effector antiviral cells.
  • DC infected dendritic cells
  • monocytes in contact with HCV proteins, produce more IL-10 than uninfected cells, which favors the development of Th2 responses and prevents virus elimination.
  • IL-10 plays an important role
  • tumor cells or tumor infiltrate cells can produce, among other molecules, IL-10, which impairs the functioning of DC. Inhibiting the proper functioning of DC in tumors would be one of the reasons why an antitumor response does not occur.
  • IL-12 interleukin 12
  • ThI response said inhibition of IL-10 It would be very useful both in certain antiviral therapies, such as chronic HCV infection, and in antitumor therapies, where it is desired to induce potent ThI responses.
  • IL-10 Other strategies commonly used to inhibit the biological activity of IL-10 include either the use of specific neutralizing antibodies or the use of antisense oligonucleotides (oligos) of the gene encoding IL-10 that block its expression.
  • the use of antibodies allows a total and specific blockade of this cytokine (IL-10) although certain side effects are enhanced both by the presence of exogenous immunoglobulins in the blood and by the effects derived from the systemic blockade of IL-10.
  • the stability over time of immunoglobulins does not allow a short-term control of the blockage in the activity of this cytokine.
  • the antisense oligos inhibit the production of IL-10 at the level of gene expression, which can generate important deregulations in all the processes in which this cytokine is involved.
  • the invention generally faces the problem of searching for new compounds capable of inhibiting the biological activity of IL-10.
  • the solution provided by the present invention is based on the fact that the inventors have identified peptides capable of not only binding to IL-10 but also capable of inhibiting the biological activity of IL-10 by direct binding to IL itself -10. These peptides have been identified through the use of the technology associated with phage libraries that allow the determination of peptides, with a size typically between 6 and 15 amino acids, which have a high affinity binding with IL-10, subsequently quantifying by in vitro assays, the ability to inhibit the biological activity of the IL-10 of the different peptides.
  • Peptides capable of binding to IL-10 in particular, those capable of inhibiting the biological activity of IL-10 by direct binding to IL-10 are potentially useful for the treatment of clinical conditions and alterations. pathological associated with expression of IL-IO, in particular, with an elevated expression of IL-IO. Likewise, peptides capable of binding to IL-10 provide a tool for studying the biological role of IL-10.
  • one aspect of this invention relates to peptides that possess the ability to bind to IL-10.
  • said peptides also have the ability to inhibit the biological activity of IL-10.
  • the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition comprising at least one of said peptides.
  • the invention relates to said peptides for the treatment of clinical conditions and pathological alterations associated with expression of IL-10, in particular, with a high expression of IL-10.
  • the invention relates to the use of said peptides in the preparation of a medicament for the treatment of clinical conditions and pathological alterations associated with expression of IL-10, in particular, with a high expression of IL-10.
  • the invention relates to DNA sequences encoding said peptides.
  • the invention in another aspect, relates to a DNA construct comprising a DNA sequence encoding a peptide provided by this invention.
  • the invention in another aspect, relates to a vector comprising said DNA sequence or said DNA construct.
  • the invention relates to a host cell, such as a transformed host cell, comprising said DNA sequence or DNA construct or said vector.
  • the invention relates to a process for producing a peptide provided by this invention comprising culturing said host cells under conditions that allow the expression of said peptide and, if desired, recovering the obtained peptide.
  • the invention relates to said DNA sequences and DNA constructs for the treatment of clinical conditions and pathological alterations associated with expression of IL-10, in particular, with an elevated expression of IL-10.
  • the invention relates to the use of said DNA sequences and DNA constructs in the elaboration of vectors and cells for the treatment of clinical conditions or pathological alterations associated with ILlO expression, in particular, with a high expression of IL-IO
  • Figure 1 schematically shows the position of a 15 amino acid peptide (P15aa), genetically fused to the pIII protein, on the surface of the filamentous bacteriophage Ml 3.
  • Figure 2 schematically shows the selection of peptides by the "biopanning" technique. Biotinylated IL-10 is immobilized on streptavidin-containing plates (through the biotin-streptavidin junction). The phage library is selected based on the interaction between IL-10 and the peptides presented by the phages. Phages with low affinity for IL-10 are removed by washing. The phages retained on the plate are eluted by lowering the pH. After three cycles of phage enrichment with high affinity for IL-10, phages are isolated and sequenced (see Example 1).
  • Figure 3 is a graph showing the proliferation of MC / 9 cells in the presence of different concentrations of human IL-10 and mouse interleukin 4 (IL-4).
  • Figure 4 consists of bar charts indicating the percentage of inhibition of human IL-10 (hIL-10) and murine IL-10 (mIL-10) obtained with each peptide at the concentration of 150, 100 and 50 ⁇ g / mL (from left to right) (Figure 4A), and the percentage of toxicity [expressed as a percentage of inhibition of MC / 9 cell proliferation by granulocyte and macrophage colony stimulating factor (GM-CSF, of English, "granulocyte macrophage-colony stimulating factor" (Figure 4B). Each bar corresponds to the average of 2 or 3 independent experiments.
  • hIL-10 human IL-10
  • mIL-10 murine IL-10
  • FIG. 5 is a bar chart showing the effect of some peptides with IL-10 binding capacity on the immunosuppressive activity of the Karpas cell line (producing IL-10). With these cells a "mixed lymphocyte reaction” (MLR) assay was performed in which the levels of IFN- ⁇ produced as a measure of the immune response are measured. Those peptides with significant IL-10 inhibitory capacity and capable of restoring MLR IFN- ⁇ levels are indicated by striped bars.
  • MLR mixed lymphocyte reaction
  • PBL peripheral blood lymphocytes
  • PBLl and PBL2 peripheral blood lymphocytes from two different healthy donors (by definition, the mixture of these cells induces a proliferative activation by allogeneic recognition through the reaction between MHC and TLR)
  • MLR mixed lymphocyte reaction
  • MLR + K mixed lymphocyte reaction + Karpas 299 cell line
  • K Karpas 299 cell line
  • Figure 6 is a bar chart showing the in vitro effect of peptides P9 (SEQ ID NO: 6) and P13 (SEQ ID NO: 8) in the re-stimulation of lymphocytes with different T helper determining peptides (ThO) , quantified as the production of IFN- ⁇ . Inhibition of IL-IO in this system would favor a ThI cytokine profile and, therefore, an increase in IFN- ⁇ .
  • the FISEA G peptide (SEQ ID NO: 38) was the only one that induced detectable levels of IL-IO in supernatants along with the highest levels of IFN- ⁇ .
  • Peptides P9 (SEQ ID NO: 6) and Pl 3 (SEQ ID NO: 8) increase IFN- ⁇ production only in this case.
  • Figure 7 is a diagram showing the average tumor growth in different groups of BALB / c mice inoculated subcutaneously with 5x10 5 tumor cells (CT26).
  • the different groups represent the average tumor evolution in the absence of treatments (Control group), treated with poly I: C and anti-CD-40 antibody (Adjuvants), treated with P9 peptides (SEQ ID NO: 6) (intratumoral route ) and P13 (SEQ ID NO: 8) (intraperitoneally) (IL-IO inhibitors) or a combination of adjuvants and IL-IO inhibitors (Ady + Inhibit IL-IO).
  • Figure 8 is a graph showing the profile of the biomolecular interaction, obtained by a surface plasmon resonance analysis (SPR), which occurs between the IL-IO and the P9 peptide (SEQ ID NO: 6), as well as obtained with the control peptide [P301 (SEQ ID NO: 54)].
  • SPR surface plasmon resonance analysis
  • Figure 9 is a bar chart showing the results obtained from the biomolecular interaction, measured by a SPR analysis, which occurs between the IL-IO and the P9 peptides (SEQ ID NO: 6), P13 ( SEQ ID NO: 8) and its truncated and / or modified forms: P9 (2-15) (SEQ ID NO: 45), P9 (l-14) (SEQ ID NO: 46), P9 (l-13) ( SEQ ID NO: 47), P9 (2-14) (SEQ ID NO: 48), P9 (2-13) (SEQ ID NO: 49), P9 (3-14) (SEQ ID NO: 50), P9 (15 Ala) (SEQ ID NO: 51), P9 (14 Ala) (SEQ ID NO: 52), P9 (1-13; 1 Ser) (SEQ ID NO: 53).
  • Figure 10 shows the inhibitory effect of peptides P9 (SEQ ID NO: 6) and Pl 3 (SEQ ID NO: 8) on the phosphorylation of STAT3 induced by IL-IO.
  • the expression STAT3-phosphorylated was analyzed by Western Blot technique (Figure 10A).
  • Figure 10B In the bar chart ( Figure 10B) the ratio between the content of the STAT3-phosphorylated bands, quantified by densitometry, and that obtained in the actin control for each sample is represented.
  • the percentage inhibition of cell proliferation induced by P9 peptides (SEQ ID NO: 6), Pl 3 (SEQ ID NO: 8), P15 (SEQ ID NO: 10) is shown in a bar chart.
  • Figure 12 is a bar chart showing the effect of P13 peptide (SEQ ID NO: 8) on IFN- ⁇ production in a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) culture stimulated with a TLR9 ligand (CpG) and in the presence of the hepatitis C virus nucleocapsid protein (HCV core).
  • PBMCs from healthy donors were stimulated with a TLR9 ligand (CpG, 5 ⁇ g / ml) with or without core HCV (2.5 ⁇ g / ml) and in the presence or absence of the P13 peptide (SEQ ID NO: 8).
  • an anti-IL-10 antibody (eBioscience, 16-7108-81) was used at a concentration of 1 ⁇ g / ml. After 48 hours of incubation at 37 ° C and 5% CO 2 , the production of IFN- ⁇ in the culture supernatants was measured by ELISA. The results shown are representative of four experiments with similar results.
  • the present invention relates, in general, to peptides capable of binding to IL-IO and its applications.
  • the invention relates to a peptide, hereinafter, peptide of the invention, capable of binding to IL-IO, selected from: a) a peptide whose amino acid sequence is selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:
  • peptide includes modifications or derivatives thereof, for example glycosylation, phosphorylation, acetylation, amidation, etc.
  • variant refers to a peptide derived from a peptide as defined above in section a) in which some amino acid has been modified, for example, by substitution, or which has inserts or deletions of one or more amino acids, with the proviso that it retains at least one of the functions of the original peptide, advantageously, at least one function related to IL-IO binding. Normally, said variants comprise conservative substitutions, in which the function of the final peptide is not modified.
  • variants of the P9 peptide include the P9 peptides (15 Ala) (SEQ ID NO: 51), in which the amino acid at position 15 (Phe) of P9 (SEQ ID NO: 6) has been replaced by an Ala, the peptide, P9 (14 Ala) (SEQ ID NO: 52), in which the amino acid at position 14 (Val) of P9 (SEQ ID NO: 6) has been replaced for a wing, among others.
  • fragment refers to a peptide derived from a peptide as defined above in a) or in b) in which some amino acid has been removed either from the amino terminus or from the end carboxyl or both ends that maintains one or more of the functions of the original peptide, preferably functions related to IL-IO binding.
  • P9 peptide fragments include P9 (2-15) peptides (SEQ ID NO: 45), P9 (1-14) (SEQ ID NO: 46), P9 (l-13) (SEQ ID NO: 47), P9 (2-14) (SEQ ID NO: 48), P9 (2-13) (SEQ ID NO: 49), P9 (3-14) (SEQ ID NO: 50), P9 (1-13; 1 Ser) (SEQ ID NO: 53), among others.
  • pharmaceutically acceptable salts of the peptide of the invention are pharmaceutically acceptable salts of the peptide of the invention.
  • pharmaceutically acceptable salts includes the salts commonly used for form metal salts or acid addition salts. The nature of the salt is not critical as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • Pharmaceutically acceptable salts of the peptide of the invention can be obtained from organic or inorganic acids or bases. Said salts can be obtained by conventional methods well known to those skilled in the art.
  • the peptides of the invention have the ability to bind to IL-IO. Some of these peptides also have the ability to inhibit, in vitro and / or in vivo, the biological activity of IL-IO.
  • the ability of the peptides of the invention to bind to IL-10 can be determined by any appropriate method that allows to determine the binding between two molecules, for example, by an affinity assay, which comprises contacting IL-10 with the peptide to be tested under conditions that allow the binding of said peptide to IL-10 and evaluate the binding between the peptide and IL-10.
  • said affinity assay can be performed using, for example, radiolabeled IL-10.
  • the compound that may be labeled is the peptide to be tested.
  • this type of affinity assay comprises contacting IL-10, for example, immobilized in a streptavidin-blocked plate, with the peptide whose binding capacity to IL-10 is desired to be known, and, after incubating for a period at appropriate time, analyze the binding of the peptide to IL-10, as shown in Example 1 accompanying the present description.
  • Peptides with low affinity for IL-10 are removed by washing while peptides with higher affinity remain bound to IL-10 and can be released by breaking the molecular interactions between both molecules, which can be done, for example, by lowering the pH .
  • the peptide of the invention capable of binding to IL-10 is selected from the group consisting of peptides identified as SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 53, a variant or fragment thereof, and their pharmaceutically acceptable salts.
  • IL-IO In vitro IL-IO can be evaluated and, if desired, quantified, by an MC / 9 cell line growth inhibition assay (CRL-8306, American Type CeIl
  • the peptide of the invention is a peptide capable of inhibiting the biological activity of IL-IO and is selected from the peptides identified as SEQ ID NO: 1 (Pl); SEQ ID NO: 6 (P9); SEQ ID NO: 8 (P 13); SEQ ID NO: 10 (P 15); SEQ ID NO: 13 (P 19); SEQ ID NO: 14 (P20); SEQ ID NO: 16 (P22); SEQ ID NO: 19 (P25) and SEQ ID NO: 25 (P34), a variant or fragment thereof, and their pharmaceutically acceptable salts.
  • Said peptides in addition to presenting the ability to bind to IL-IO and inhibit the biological activity of IL-10, have structural characteristics common to all of them.
  • said peptides (i) have in their amino acid sequence a percentage of hydrophobic amino acids (Ala, Val, Leu, He, GIy and Pro) and basic (Arg, His and Lys) between 60% and 90%, very higher than the expected percentage (about 45%); and (ii) they have at least one aromatic amino acid, in general, 2 or 3, selected from Phe, Trp and Tyr, preferably, Phe.
  • an alignment analysis of amino acid sequences taking the peptide identified as SEQ ID NO: 8 (P 13) as the reference peptide, shows the existence of a certain tendency to present basic amino acids (Arg, His, Lys) between positions 2 to 5 and hydrophobic amino acids at positions 10 to 14, maintaining that pattern in the peptides identified as SEQ ID NO: 1 (Pl), SEQ ID NO: 6 (P9), SEQ ID NO: 8 (P 13), SEQ ID NO: 13 (P 19) and SEQ ID NO: 25 (P34), that location being reversed for the peptides identified as SEQ ID NO: 10 (P 15) and SEQ ID NO: 16 (P22 ) and lost in the peptides identified as SEQ ID NO: 14 (P20) and SEQ ID NO: 19 (P25).
  • SPR surface plasmons
  • the inhibition exerted by peptides P9 (SEQ ID NO: 6) and P13 (SEQ ID NO: 8) has been proven by their effect on the phosphorylation of STAT3, a molecule involved in signaling after the binding of IL-IO to its cellular receptor (Example 8).
  • IL-IO inhibitor peptides provided by this invention has also been observed in an in vitro assay of B16-F10 melanoma tumor cell proliferation (Example 9).
  • IL-IO is one of the negative factors that could determine the timing of hepatitis C virus (HCV) infection
  • the efficacy of peptide P 13 (SEQ ID NO: 8) has been tested in a model in vitro in which the core HCV protein (through its ability to induce IL-IO) is responsible for the low production of IFN- ⁇ that is detected (Example 10);
  • said Pl 3 peptide SEQ ID NO: 8 is capable of rescuing IFN- ⁇ production.
  • phage libraries that allow to determine peptides that have a high affinity binding with IL-IO, and subsequently quantify by means of in-house tests.
  • In vitro the ability to inhibit the biological activity of the IL-IO of the different peptides.
  • the sequence of the peptides that bind to IL-IO, inhibiting in vitro the biological activity of IL-10, can be deduced from the corresponding DNA sequence after several "biopanning" cycles, generally 3.
  • the use of phage libraries to identify inhibitors of certain products has been described, for example, by Chirinos-Rojas CL. et ai, in Immunology, 1999, Jan.
  • the invention provides a method for the identification of peptides that have the ability to bind to IL-IO comprising:
  • a phage library comprising a plurality of filamentous phages, the genome of each of said phages containing a nucleotide sequence encoding a different peptide linked to the gene of a phage coat protein, whereby each phage contains a different peptide genetically fused to a phage coat protein;
  • step (iii) determine the sequence of the peptides that bind to IL-IO, from the corresponding DNA sequences inserted in the phages selected in step (ii) and encode for said peptides that bind to IL-10
  • a phage library consisting of a plurality of filamentous bacteriophages (M 13) each containing a different 15 amino acid peptide genetically fused to a phage coat protein, in this case attached to the N-terminal end of the pIII coat protein.
  • M 13 filamentous bacteriophages
  • the phage has a 15 amino acid peptide on its surface, in each of the five molecules of the surface protein, while inside it contains the DNA encoding said peptide sequence.
  • the peptide coding sequence comes from a degenerate sequence in each of the 15 positions with the 20 natural amino acids, which allows the presentation of 1, IxIO 12 possible sequences of 15 amino acids in different phages.
  • the physical relationship, I to I, between the peptide sequence and the DNA encoding it in the bacteriophage makes it possible to select, from a large number of variants, those sequences that specifically bind to IL-10. This process is done through an affinity test.
  • said affinity test consists of an in vitro selection protocol called "biopanning".
  • biopanning an in vitro selection protocol
  • said technique consists in the incubation of a set of phages representing, for practical purposes, all variants of 15 amino acid peptides (in this case), in a streptavidin-blocked plate to which IL-10 is added.
  • biotinylated Biotinylated IL-10 is anchored to plaque through biotin-streptavidin interaction, which is correctly presented for interaction with peptides carried by phage.
  • phages After incubation, unbound phages are removed by washing and subsequently specifically bound phages are eluted, by a decrease in pH that breaks the molecular interactions between IL-10 and the peptides presented by phages.
  • the eluted phages are then amplified by infection in a bacterial strain. He This process is repeated a total of 3 rounds, so that the content of phages that bind specifically and with high affinity for IL-IO is enriched.
  • the concentration of biotinylated IL-IO used to block the plaques is gradually reduced in each round, for example, from 2.5 to 0.02 ⁇ g / mL and, finally, 0.002 ⁇ g / mL.
  • the phages selected in each round have an increasing degree of affinity for IL-10.
  • phages that have been selected for their affinity for IL-10 are sequenced with primers. This allows to obtain the sequences of the peptides presented in the phages.
  • Example 1 illustrates the selection of peptides that bind to IL-10 by phage library, selection by the "biopanning" technique and sequencing of peptides with high affinity binding to IL-10.
  • the inventors have found that there are two zones of alpha helix in the IL-IO, namely, a first zone comprising amino acid sequence 19-35 of the amino acid sequence of IL-IO and another second zone comprising the amino acid sequence 86-110 of the amino acid sequence of the IL-IO that are oriented in an antiparallel form, so they can be considered of possible relevance in the interaction of the cytokine with its receptor.
  • a first zone comprising amino acid sequence 19-35 of the amino acid sequence of IL-IO
  • another second zone comprising the amino acid sequence 86-110 of the amino acid sequence of the IL-IO that are oriented in an antiparallel form
  • peptides with potential IL-IO inhibitory capacity identified using the approach described above are set out in Table 2 (Example 2) and include peptides identified as SEQ ID NO: 30 (F24), SEQ ID NO : 31 (F25), SEQ ID NO: 32 (F26), SEQ ID NO: 33 (F27), SEQ ID NO: 34 (F28), SEQ ID NO: 35 (F29) and SEQ ID NO: 36 (F30) .
  • the peptide identified as SEQ ID NO: 30 is a peptide comprising amino acid sequence 86-97 of the amino acid sequence of native human IL-10 (hIL-10);
  • the peptide identified as SEQ ID NO: 31 is a peptide comprising amino acid sequence 23-34 of the amino acid sequence of the native reverse hIL-10;
  • the peptide identified as SEQ ID NO: 32 is a peptide comprising amino acid sequence 23-34 of the amino acid sequence of native hIL-10;
  • the peptide identified as SEQ ID NO: 33 (F27) is a peptide that comprises amino acid sequence 23-34 of the complementary amino acid sequence of native hIL-10 and has IL-IO binding capacity;
  • the peptide identified as SEQ ID NO: 34 is a peptide that comprises amino acid sequence 23-34 of the reverse complementary amino acid sequence of native hIL-10 and has IL-IO binding capacity;
  • the peptide identified as SEQ ID NO: 30 is a peptide comprising amino acid sequence
  • inverse means that the amino acid sequence corresponds to the amino acid sequence of the protein or fragment of the native protein read in reverse.
  • complementary refers to an amino acid sequence comprising residues that can “positively interact” with other complementary residues of the amino acid sequence of the native protein.
  • interact positively refers to situations in which the interaction between two amino acids generate attractive forces, either by electrostatic forces, hydrophobic interactions, hydrogen bonds, etc.
  • the peptide of the invention Due to the role that IL-IO plays in numerous biological processes, a consequence of the IL-IO inhibitory activity of the peptide of the invention has to do with the potential development of a new family of drugs useful for the treatment of clinical conditions. and pathological alterations associated with expression of IL-IO, in particular, with an elevated expression of IL-10, since such peptides allow blocking the excess of said cytokine that causes the damage.
  • the peptide of the invention would be of potential application in any clinical situation or pathological alteration in which an increase in IL-10 is related to a worsening of the clinical situation of the subject or patient.
  • subject refers to any member of an animal species of mammals and includes, but is not limited to, domestic animals, primates and humans;
  • the subject is preferably a male or female human being of any age or race.
  • the peptide of the invention therefore, can be used in the treatment of clinical conditions or pathological alterations associated with expression of IL-10, in particular, with an elevated expression of IL-10.
  • Illustrative examples of said clinical conditions or pathological alterations that can be treated with the peptide of the invention where IL-10 plays an immunosuppressive role include viral infections, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, tumors, cancers or acute damage situations. . In this type of infectious processes, tumors, cancer, or situations of acute damage, IL-10 has a negative effect, since it prevents the induction of ThI responses that would promote healing.
  • viral infections that can be treated with the peptide of the invention include virtually any infection of viral origin, for example, infections caused by herpesviruses, for example, human herpesviruses, such as herpes simplex virus type 1 (HSV- I), herpes simplex virus type 2 (HS V-2), variousla zoster virus (VZV), cytomegalovirus (CMV), human herpesvirus 6 (HHV-6), human herpesvirus 7 (HH V-7), Epstein-Barr (EBV), Kaposi herpesvirus (HHV-8), etc., and, optionally, with its skin reactivation after sun exposure, infections caused by hepatitis-causing viruses, for example, hepatitis C virus (HCV), etc.
  • HCV herpes simplex virus
  • HCV-2 herpes simplex virus type 2
  • VZV variousla zoster virus
  • CMV cytomegalovirus
  • HHV-6 human herpesvirus 6
  • HH V-7 human herpesvirus
  • Illustrative, non-limiting examples of bacterial infections which can be treated with the peptide of the invention include, but are not limited to infections caused by Mycobacterium leprae, infections caused by Mycobasterium tuberculosis, infections caused by Yersinia pestis, gastric infection caused by Helicobacter pylori, etc.
  • Illustrative, non-limiting examples of fungal infections that can be treated with the peptide of the invention include, but are not limited to, infections caused by Candida albicans, infections caused by Trichophyton rubrum, infections caused by Aspergillus sp., Etc.
  • Illustrative, non-limiting examples of parasitic infections that can be treated with the peptide of the invention include, but are not limited to, leishmaniasis, eg, visceral leishmaniasis, infections caused by Plasmodium falciparum, toxoplasmosis, etc.
  • Illustrative, non-limiting examples of tumors and cancers that can be treated with the peptide of the invention include, but are not limited to, Hodgkin lymphoma, head and neck cancer, melanoma, basoliomas and spinoliomas developed from radiation-mutated keratinocytes. UV, etc.
  • Illustrative, non-limiting examples of acute damage situations that can be treated with the peptide of the invention include, but are not limited to, burns and associated sepsis, etc.
  • any process of tumor development, viral, bacterial, fungal or parasitic infection where the activity of IL-IO has a key immunosuppressive role in the aggravation or chronification of the clinical condition of a subject can be treated with the peptide of the invention.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a peptide of the invention together with at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention may contain one or more peptides of the invention, together with, optionally, one or more, alternative IL-10 inhibitor compounds.
  • Said pharmaceutical composition is useful for administration and / or application in the human or animal body, preferably in the human body. Practically, any IL-10 inhibitor compound, other than the peptides of the invention, may be present, if desired, in the pharmaceutical composition of the invention.
  • Illustrative, non-limiting examples of alternative IL-10 inhibitor compounds, other than the peptides of the invention, which may be employed in conjunction with the peptide of the invention include, but are not limited to, IFN- ⁇ , AS101 (ammonium trichloro (dioxoethylene-O, O ! ) tellurate), neutralizing antibodies, 15d-PGJ2 (15- deoxy-delta-12,14-prostaglandin J2), anti-human chimeric murine anti-CD20 (Ritubimax), etc.
  • peptides such as the peptide of the invention, instead of using antibodies or antisense oligonucleotides, has numerous advantages, since they are small molecules, with greater diffusion capacity and shorter half-life. Peptides may have a high affinity for IL-IO, but they degrade more rapidly than antibodies, and adverse side effects can be controlled by dosing. The vehiculization of the peptides to target organs or tissues is also more accessible compared to other types of compounds.
  • the peptide of the invention can be administered to treat the clinical conditions or pathological alterations associated with expression of IL-10, in particular with an elevated (excess) expression of IL-10 by any means that produces contact of the peptide of the invention. with its site of action in the human or animal body.
  • the amount of peptide, derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof that may be present in the pharmaceutical composition provided by this invention may vary within a wide range.
  • the dosage for treating a disease or pathological disorder associated with expression of IL-10, in particular, with an elevated expression of IL-10 with the peptides and / or pharmaceutical compositions of the invention will depend on numerous factors, including age, condition of patient, the severity of the disease or pathological alteration, the route and frequency of administration and the peptide of the invention to be administered.
  • compositions containing the peptide of the invention may be presented in any form of administration, for example, solid or liquid, and may be administered by any appropriate route, for example, orally, parenterally, rectally or topically, for which they will include the pharmaceutically acceptable excipients necessary for the formulation of the desired administration form, for example, ointments (lipogels, hydrogels, etc.), eye drops, spray aerosols, injectable solutions, osmotic pumps, etc.
  • ointments lipogels, hydrogels, etc.
  • eye drops for example, eye drops, spray aerosols, injectable solutions, osmotic pumps, etc.
  • the invention relates to a peptide of the invention for the treatment of clinical conditions or pathological alterations associated with the expression of IL-IO, in particular, with a high expression of IL-IO.
  • said clinical condition or pathological alteration is a clinical condition or pathological alteration that occurs with expression of IL-IO, in particular, with an elevated expression of IL-10.
  • said clinical condition or pathological alteration that occurs with expression of IL-10, in particular, with an elevated expression of IL-10 comprises clinical conditions in which the ThI cellular response is inhibited.
  • Illustrative examples of such clinical conditions or pathological alterations that can be treated include viral infections, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, tumors, cancers or acute damage situations as mentioned above.
  • the invention relates to the use of a peptide of the invention in the preparation of a medicament for the treatment of clinical conditions or pathological alterations associated with expression of IL-10, in particular, with high expression. of IL-10.
  • said clinical condition or pathological alteration is a clinical condition or pathological alteration that occurs with expression of IL-10, in particular, with an elevated expression of IL-10.
  • said clinical condition or pathological alteration that occurs with expression of IL-10, in particular, with an elevated expression of IL-10 comprises clinical conditions in which the ThI cellular response is inhibited.
  • Illustrative examples of such clinical conditions or pathological alterations that can be treated include viral infections, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, tumors, cancers or acute damage situations as mentioned above.
  • Methods for measuring IL-10 expression levels in a sample are well known to those skilled in the art.
  • such methods include, for example, measurements in serum, sputum or seminal fluid samples of IL-10 concentration or levels by, for example, the ELISA technique.
  • This technique allows the quantification of IL-10 levels in a sample compared to normal levels, that is, compared to IL-IO levels in samples from healthy individuals.
  • the peptide of the invention can be obtained by conventional methods, for example, by solid phase chemical synthesis techniques; purify by conventional methods, for example, by high performance liquid chromatography (HPLC); and, if desired, can be analyzed by conventional techniques, for example, by sequencing and mass spectrometry, amino acid analysis, nuclear magnetic resonance, etc.
  • the peptide of the invention can be obtained by peptide synthesis following conventional procedures (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85: 2149-2154) using the Fmoc variant of Atherton (Atherton, E., Logan, JC and Sheppard, RC 1989.
  • the peptide of the invention can be obtained by recombinant DNA technology. Therefore, in another aspect, the invention provides a DNA sequence encoding a peptide of the invention. Said DNA sequence can be easily deduced from the amino acid sequence of the peptide of the invention.
  • Said DNA sequence may be contained in a DNA construct. Therefore, in another aspect, the invention provides a DNA construct comprising a DNA sequence encoding a peptide of the invention. Said DNA construct may incorporate, operably linked, a sequence regulating the expression of the DNA sequence encoding the peptide of the invention. Control sequences are sequences that control and regulate transcription and, where appropriate, translation of the peptide of the invention, and include promoter, terminator, etc. sequences functional in transformed host cells comprising said DNA sequence or construct. In a particular embodiment, said expression control sequence is functional in bacteria.
  • said DNA construct further comprises a marker or gene encoding a motif or for a phenotype that allows cell selection. host transformed with said DNA construct.
  • the DNA construct provided by this invention can be obtained by using techniques well known in the prior art [Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY , 1989 VoI 1- 3].
  • the invention relates to a vector, such as an expression vector, comprising said DNA sequence or construct.
  • a vector such as an expression vector
  • the choice of the vector will depend on the host cell into which it will be subsequently introduced.
  • the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid or a vector that, when introduced into a host cell, is integrated or not into the genome of said cell.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrok et al., 1989, cited supra].
  • the invention relates to a host cell, such as a transformed host cell, comprising a DNA sequence or a DNA construct provided by this invention or a vector as mentioned above.
  • Said cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a DNA sequence provided by this invention, a DNA construct provided by this invention, a vector provided by this invention, or a host cell provided by this invention, and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • said pharmaceutical composition comprises a DNA sequence provided by this invention or a DNA construct provided by this invention in a gene transfer vector, such as a viral or non-viral vector.
  • Viral vectors suitable for practicing this embodiment of the invention include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, alpha-viral vectors, herpesviral vectors, coronavirus-derived vectors, etc.
  • Non-viral type vectors suitable for practicing this embodiment of the invention include, but are not limited to naked DNA, liposomes, polyamines, dendrimers, cationic glycopolymers, liposome-polycation complexes, proteins, receptor-mediated gene transfer systems, etc. . Therefore, in another aspect, the invention relates to a DNA sequence provided by this invention, or to a DNA construct provided by this invention, or to a vector provided by this invention, or to a host cell provided by this invention. , for the treatment of clinical conditions or pathological alterations associated with the expression of IL-IO, in particular, with an elevated expression of IL-IO.
  • said clinical condition or pathological alteration is a clinical condition or pathological alteration that occurs with expression of IL-10, in particular, with an elevated expression of IL-10.
  • said clinical condition or pathological alteration that occurs with expression of IL-10, in particular, with an elevated expression of IL-10 comprises clinical conditions in which the ThI cellular response is inhibited.
  • Illustrative examples of such clinical conditions or pathological alterations that can be treated include viral infections, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, tumors, cancers or acute damage situations as mentioned above.
  • the invention relates to the use of said DNA sequences and DNA constructs in the preparation of vectors and cells for the treatment of clinical conditions and pathological alterations associated with IL-10 expression, in particular with high expression. of IL-10.
  • said DNA sequence or construct is contacted with a gene transfer vector, such as a viral or non-viral vector.
  • a gene transfer vector such as a viral or non-viral vector.
  • viral vectors suitable for practicing this embodiment of the invention include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, alpha-viral vectors, herpesvirus vectors, coronavirus-derived vectors, etc.
  • Non-viral type vectors suitable for practicing this embodiment of the invention include, but are not limited to naked DNA, liposomes, polyamines, dendrimers, canon glycopolymers, liposome-polycation complexes, proteins, receptor-mediated gene transfer systems, etc. .
  • the invention in another aspect, relates to a process for producing a peptide of the invention that comprises growing a host cell comprising the sequence, construction of DNA or vector provided by this invention under conditions that allow the production of said peptide of the invention. and, if desired, recover said peptide of the invention.
  • the conditions to optimize the cultivation of said host cell will depend on the host cell used.
  • the process for producing the peptide of the invention further includes isolation and purification of said peptide.
  • phages consist of filamentous bacteriophages (M 13) that contain a peptide genetically fused to a virus coat protein, in this case attached to the N-terminal end of the coat protein pIII ( Figure 1).
  • M 13 filamentous bacteriophages
  • Figure 1 the phage has a 15 amino acid peptide on its surface in each of the 5 molecules of this protein that the phage has on its surface, while inside it contains the DNA encoding said peptide.
  • the peptide coding sequence comes from a degenerate sequence in each of the 15 positions with the 20 natural amino acids. This allows the presentation of 1, IxIO 12 possible sequences of 15 amino acids in different phages.
  • the physical relationship, I to I, between the peptide sequence and the DNA encoding it in the bacteriophage makes it possible to select, from a large number of variants, those sequences that specifically bind to IL-10. This process is performed using an in vitro selection protocol called "biopanning".
  • biopanning an in vitro selection protocol
  • the phage suspension titre calculated by spectrometry was 3.82 x 10 14 virions / ml and the number of infectious particles was 1.3 x 10 13 TU / ml.
  • a fraction of this phage suspension was sequenced to verify that the amplification had not affected the diversity of the clones.
  • the biopanning technique consists of the incubation of a set of phages, representatives (for practical purposes) of all 15 amino acid variants, in a streptavidin-blocked plate (10 ⁇ g / ml in 0.1 M NaHCO 3 , 2 hours at room temperature) to which biotinylated IL-IO is added.
  • Biotinylated IL-10 is anchored to plaque through biotin-streptavidin interaction, which is correctly presented for interaction with peptides carried by phage.
  • the IL-10 is contacted with the phage-borne peptides at a concentration of 3x10 4 viruses / ml and allowed to incubate for approximately 12 hours.
  • the concentration of biotinylated IL-10 used to block the plates is gradually reduced in each round from 2.5 ⁇ g / ml to 0.02 ⁇ g / ml, and finally to 0.002 ⁇ g / ml.
  • the phages selected in each round have an increasing degree of affinity for IL-10.
  • phages that have been selected for their affinity for IL-10 are sequenced with primers, after being isolated by tetracycline resistance conferred by genetically modified phages after infecting E. coli cells. This allows to obtain the sequences of the peptides presented in the phages of a number of clones obtained from isolated colonies. The number of times a sequence is repeated, corresponding to a 15 amino acid peptide carried by each clone, of the total sequenced clones gives an idea of the degree of relative affinity that said 15 amino acid peptide has for IL-IO.
  • each colony contains the genome of a single phage that corresponds to the sequence of a single peptide presented on its surface.
  • the number of clones (colonies) of each sequence gives a relative idea of the degree of affinity between the peptides and IL-10, that is, the greater the number of clones, the greater the binding affinity.
  • the degree of affinity does not correspond to the ability to block the activity of IL-10 since some of the most active peptides, eg, peptides identified as SEQ ID NO: 6 (P9) and SEQ ID NO: 17 (P23), provide 3 and 1 clones, respectively, while the peptide identified as SEQ ID NO: 6 (P9) and SEQ ID NO: 17 (P23), provide 3 and 1 clones, respectively, while the peptide identified as SEQ ID NO: 6 (P9) and SEQ ID NO: 17 (P23), provide 3 and 1 clones, respectively, while the peptide identified as SEQ ID NO: 6 (P9) and SEQ ID NO: 17 (P23), provide 3 and 1 clones, respectively, while the peptide identified as SEQ ID NO: 6 (P9) and SEQ ID
  • SEQ ID NO: 2 which provides 29 clones, is much less active in the inhibition assay (Example 3). Although it is not desired to be linked to any theory, this issue could be explained on the basis that the most active peptide would probably block the binding of IL-IO to its receptor.
  • sequences obtained were analyzed with the "trans ⁇ ate tool" program available on the Internet http://www.expasy.org/tools/dna.html that allows to deduce the amino acid sequences that were subsequently worked on. They sequenced a total of 143 clones, which allowed to identify 35 different peptides (P1-P35), of which 9 of said peptides (P3, P4, P6, Pl 1, P 12, P 17, P27, P28 and P30) were also found in other biopanning tests with other proteins, it was considered that they were not specific for IL-IO binding and, consequently, could be discarded. These nonspecific junctions may be due to interactions with some of the components present during the selection process (plastic, biotin, streptavidin, etc.) and / or phage surface proteins.
  • ChIL-IO ChIL-IO
  • hIL-10 inhibitors were developed taking into account the structure of the complex (h ⁇ L-10) - (hIL-10 receptor). In this structure there are two zones of alpha helix in the primary structure of hIL-10 (amino acids 19-35 and amino acids 86-110) that are oriented antiparallel and that could be of relevance in their interaction with the receptor. The sequences of these peptides are indicated below: (SEQ ID NO: 28) Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser
  • SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 would bind to the hIL-10 receptor while the peptides identified as SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36 se they would join the hIL-10.
  • Table 2 Predicted peptides as potential hIL-10 inhibitors
  • inv the peptide sequence is read in reverse; and comp: the sequence has residues that are complementary, that is to say that they can interact positively with the residues of the relative sequence.
  • the peptide defined as "comp 99-107” (SEQ ID NO: 35) whose amino acid sequence is complementary to the amino acid sequence of the hIL-10 fragment comprised between amino acid 99 and amino acid 107 ( peptide 99-107) since the amino acids Lys and Arg present in said peptide 99-107 (indicated in bold below) could interact with the amino acids Asp (also indicated in bold) of the predicted peptide and which has been designated as "comp 99 -107 ":
  • MC / 9 cells are added to 96-well plates at an initial density of 20,000 cells / well in complete medium: DMEM (BE-12-604F BioWhittaker) with 10% SFB (10270-106 Gibco), 50 ⁇ g / mL of streptomycin and 50 LVmL of penicillin (15140-122 Gibco), 2 mM glutamine (BE17-605E BioWhittaker) and 2-mercaptoethanol supplemented with 5% RAT-STIM (354115 Becton Dickinson) together with 0.5 ng / mL of IL -4 of mouse (Preprotech EC, London, United Kingdom) and 1.25 ng / mL of hIL-10 (e-Bioscience) or mIL-10 (e-Bioscience) depending on the case, and incubate at 37 °
  • methyl- 3 H-thymidine (Amersham Life Science, Buckinghamshire, United Kingdom) is added per well and the plate is incubated an additional 12 hours under the same conditions. Finally, the cells are harvested by transferring the tritiated thymidine, incorporated into the DNA synthesis, to plates (UniFilter-96 GF / C ® , Perkin Elmer) and the radioactivity is quantified, after addition of scintillation liquid, in a scintillation counter (Top Count, Microplate Scintillation Counter, Packard) and quantified by measuring the emission of counts per minute (cpm) of each well.
  • a scintillation counter Top Count, Microplate Scintillation Counter, Packard
  • the inhibition capacity of the peptides is determined using different concentrations (150, 100 and 50 ⁇ g / ml) of each peptide to be tested.
  • the peptide solutions are incubated for 2 hours with 1.25 ng / ml of hIL-10 or mIL-10 as appropriate, and then MC / 9 cells are added together with the mouse IL-4, so that The final concentration of IL-4 is 0.5 ng / ml.
  • the negative proliferation control consists of cells incubated with mouse IL-4 while positive proliferation control consists of cells incubated with mouse IL-4 and IL-10.
  • cpm max is the maximum counts per minute
  • cpm exp are the experimental minute counts with peptide
  • cpm min are the basic counts per minute.
  • solubilizing agents such as guanidine hydrochloride, ethanol, methanol, isopropanol, dimethylformamide (DMF), acetone, acetonitrile, ammonia and acetic acid, were also tested, but because they were ineffective or toxic to cells, their use was ruled out .
  • solubilizing agents such as guanidine hydrochloride, ethanol, methanol, isopropanol, dimethylformamide (DMF), acetone, acetonitrile, ammonia and acetic acid.
  • Guanidine hydrochloride proved to be very toxic at all concentrations tested.
  • the maximum final concentration, compatible with the assay, of acetic acid, DMSO and DMF was 0.01 or 0.005%, concentrations that do not allow solubilization of peptides In the case of urea, the limit concentration was 125 raM, and 0.2% ammonia (maximum tested).
  • the alcohols up to 1% (maximum) were compatible and acetone and acetonitrile seemed to induce the proliferation of MC / 9 cells.
  • DMSO DMSO:
  • the peptides identified as SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 with DMSO (2% of the volume) were tested to resuspend end of stock at 1 mg / mL) and half clean. After sonication, except for the peptide identified as SEQ ID NO: 16, all followed turbid.
  • the peptides identified as SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 20 were dissolved in 8 M urea (0.8 M final concentration in 1 mg / mL) and half complete. Urea is relatively toxic (cpm without urea 1,128, with 120 mM urea 109, with 80 raM 308 and with 20 mM 800, but the window is maintained).
  • Table 3 summarizes the conditions used to solubilize the peptides. Of the total of 39 indicated peptides, 1 1 (bold) could not be solubilized with any of the conditions indicated, so they could not be tested in the in vitro assay.
  • peptides capable of inhibiting the activity of IL-10 to the culture of MC / 9 cells has the effect of inhibiting the proliferation of these cells because IL-10 promotes the proliferation of these.
  • the addition of a peptide or some component to the culture (used to improve the solubility of the peptide) that was toxic to MC / 9 cells would also have the effect of inhibiting cell proliferation. For this reason, to ensure that a peptide actually inhibits IL-10, and not proliferation due to cell toxicity, it is necessary to demonstrate that the peptide or other agent that is added to the culture is not toxic to the cells.
  • mGM-CSF mouse colony and monocyte colony stimulating factor
  • concentration of mGM-CSF used was 0.01 ng / mL.
  • IL-4 was not used as a co-stimulus.
  • Toxicity was expressed as the percentage of proliferation inhibition induced by mGM-CSF.
  • ThI cytotoxic response
  • Th2 sleep response
  • An optimal Th2 profile (defined by the presence of IL-4) is favored by the presence of IL-IO that inhibits the ThI profile and directs the immune response towards a Th2 profile.
  • treatment with IL-10 inhibitors during the induction of ThO type response would have a ThI profile cytokine inducing effect (IFN- ⁇ ).
  • ThO 6 optimized peptides, 3 ovalbumin derivatives (OVA) and 3 sperm whale myoglobin (MIO) derivatives (FISEA) have been chosen for this study (Table 4).
  • the IL-IO inhibitor peptides used to carry out this assay were peptides P9 (SEQ ID NO: 6), insoluble, and Pl 3 (SEQ ID NO: 8), soluble.
  • BALB / c female mice of 4 to 6 weeks were subcutaneously immunized with 200 ⁇ L of a 1: 1 emulsion of Freund's incomplete adjuvant and an aqueous solution containing 50 nmoles of the corresponding ThO determining peptide.
  • the animals were sacrificed and the inguinal, periaortic poplietal lymph nodes were removed, as well as the spleens.
  • the extracted lymphocytes were cultured for 48 hours in a 96-well U-bottom plate, in the presence or absence of the peptide used in immunization at a concentration of 30 mg / ml, and in the presence or absence of IL-inhibitory peptides.
  • these IFN- ⁇ levels were clearly increased in the presence of peptides P9 (SEQ ID NO: 6) and Pl 3 (SEQ ID NO: 8) by a mechanism compatible with IL-IO inhibition ( Figure 6).
  • peptide [FISEA G (SEQ ID NO: 38)] has been the only one that has induced detectable levels of IL-IO (70 pg / mL) in supernatants.
  • IL-IO is a cytokine with a potent immunosuppressive effect related to tumor growth. It is, therefore, a cytokine generated by many tumors as a mechanism to avoid an effective immune response.
  • P9 peptides SEQ ID NO: 6
  • Pl 3 in a tumor growth model after subcutaneous inoculation of CT26 cells [a mouse colon adenocarcinoma cell line (Fearon, ER, Vogelstein, B. 1990. A genetic model for colorectal tumorigenesis. CeIl 61: 759], in the presence or absence of intratumoral immunotherapy with adjuvants: polyinosinic-polycycididic acid (poly I: C) and an anti-CD40 agonist antibody for the activation of dendritic cells, NK and T lymphocytes, and subsequent induction of a Cytotoxic antitumor response.
  • CT26 cells a mouse colon adenocarcinoma cell line (Fearon, ER, Vogelstein, B. 1990. A genetic model for colorectal tumorigenesis. CeIl 61: 759
  • poly I polyinosinic-polycycididic acid
  • an anti-CD40 agonist antibody for the activation of dendritic cells, NK and T lymphocytes, and subsequent
  • mice were challenged with 5 x 10 5 CT26 tumor cells inoculated subcutaneously with 200 ⁇ L of PBS, divided into 4 groups: (1) Control group: mice inoculated with CT26 cells.
  • Adjuvant group mice treated with 50 ⁇ g of polyLC and 50 ⁇ g anti-CD40 intratumorally in 100 ⁇ L of PBS at days 0, 7 and 14.
  • Inhibitor group mice treated only with IL-IO inhibitors, 50 ⁇ g of P9 (SEQ ID NO: 6) intratumorally and 50 ⁇ g of Pl 3 (SEQ ID NO: 8) intraperitoneally via mouse, three times per week in PBS, for 3 weeks.
  • mice treated with adjuvants plus IL-IO inhibitors mice treated with adjuvants plus IL-IO inhibitors.
  • Day “0" was considered when the tumor reached a diameter of 5-6 mm.
  • peptide SEQ ID NO: 45 is a peptide comprising amino acid sequence 2-15 of peptide P9 (SEQ ID NO: 6);
  • peptide SEQ ID NO: 46 [P9 (1-14)] is a peptide comprising amino acid sequence 1-14 of peptide P9 (SEQ ID NO: 6);
  • peptide SEQ ID NO: 47 [P9 (1-13)] is a peptide comprising amino acid sequence 1-13 of peptide P9 (SEQ ID NO: 6);
  • peptide SEQ ID NO: 48 [P9 (2-14)] is a peptide comprising amino acid sequence 2-14 of peptide P9 (SEQ ID NO: 6);
  • peptide SEQ ID NO: 49 [P9 (2-13)] is a peptide comprising amino acid sequence 2-13 of peptide P9 (SEQ ID NO: 6);
  • peptide SEQ ID NO: 50 [P9 (3-14)] is a peptide comprising amino acid sequence 3-14 of peptide
  • FC2 flow cell 2
  • FCl CM5 chip
  • the peptide solutions (10 ⁇ M) were injected at least 2 times in a 10 mM pH Hepes buffer 7.4, 150 mM NaCl, Tween 20 (Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate) 0.005% at a flow of 30 ⁇ l / min.
  • Binding curves were processed by subtracting the response in FCl from that obtained in FC2. The equilibrium response was compared between the test peptide and an irrelevant control peptide of the same length.
  • the control peptide used was peptide P301 (SEQ ID NO: 54) (derived from the envelope of HIV-1, gpl20 (301-315): NNTRKRIRIQRGPGR). Each response was multiplied by a mass correction factor: MW (PX) / MW (P), where MW (PX) is the molecular weight of the problem peptide and MW (P) that of the control peptide (P301). It was observed that the different peptides tested gave a positive signal, which showed their ability to specifically bind to IL-10.
  • Figure 8 shows an example of the biomolecular interaction profile, obtained by a SPR analysis, which occurs between IL-10 and P9 peptide (SEQ ID NO: 6), as well as that obtained with the control peptide [P301 (SEQ ID NO: 54)].
  • Figure 9 shows the results obtained from the biomolecular interaction, measured by a SPR analysis, which occurs between IL-10 and peptides P9 (SEQ ID NO: 6), P13 (SEQ ID NO: 8) and its truncated and / or modified forms: P9 (2-15) (SEQ ID NO: 45), P9 (l-14) (SEQ ID NO: 46), P9 (l-13) (SEQ ID NO: 47), P9 (2-14) (SEQ ID NO: 48), P9 (2-13) (SEQ ID NO: 49), P9 (3-14) (SEQ ID NO: 50), P9 (15 Ala) (SEQ ID NO: 51), P9 (14 Ala) (SEQ ID NO: 52), P9 (1-13; 1 Ser) (SEQ ID NO: 53).
  • IL-IO The activity of IL-IO is mediated by binding to a specific membrane receptor, IL-IOR, which is expressed in a wide variety of immune cells.
  • IL-10 / IL-1 OR interaction attracts and captures 2 kinases (Jakl and Tyk2), which phosphorylate and activate the transcription factor STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3), which is inactive in the cytoplasm and It is essential for all known functions of IL-IO (Donnelly et al., Journal of Interferon & Cytokine Research. June 1, 1999, 19 (6): 563-573).
  • peptides P9 SEQ ID NO: 6
  • P13 SEQ ID NO: 8
  • RPMI 1640 fetal bovine serum (SFB ) 10%
  • 2 mM glutamine 100 U / ml penicillin
  • 100 ⁇ g / mL streptomycin 100 ⁇ g / mL
  • 5x10 5 M ⁇ -mercaptoethanol 25 mM Hepes and 0.5% (v / v) sodium pyruvate).
  • Figure 10 shows the inhibitory effect of peptides P9 (SEQ ID NO: 6) and P13 (SEQ ID NO: 8) on the phosphorylation of STAT3 induced by IL-10.
  • the expression of STAT3-phosphorylated was analyzed by Western Blot (Figure 10A).
  • Figure 10B shows the ratio between the content of the STAT3-phosphorylated bands, quantified by densitometry, and that obtained in the actin control for each sample.
  • IL-IO immunosuppressive effect of IL-IO has been linked to tumor growth, this being a cytokine generated by many tumors to evade an effective immune response.
  • certain tumor lines constitutively secrete IL-10 which is essential for the proliferation of malignant cells having shown that their neutralization slows their growth.
  • B 16 B16-F10 murine melanoma tumor line
  • a 96-well plate (Tissue Culture P ⁇ ate, 96 W, Fiat Bottom, with Lid, Sterile, CELLSTAR No. 655180) was grown in 5,000 plates per well in RPMI medium supplemented with 2% SFB, in presence or absence of peptides: P9 (SEQ ID NO: 6), P13 (SEQ ID NO: 8), P15 (SEQ ID NO: 10), P16 (SEQ ID NO: 11), P31 (SEQ ID NO: 22 ) and P34 (SEQ ID NO: 25); P301 peptide (SEQ ID NO: 54) was used as a negative control.
  • the peptide concentration tested was 200 ⁇ g / ml.
  • the cells were thus incubated for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 . After that time the cells were stained with violet crystal and the quantification of the dye was carried out by washing with 10% acetic acid and measured in the ELISA reader at 570 nm. All peptides were tested at a concentration of 200 ⁇ g / ml. The results obtained are shown in Figure 11 and correspond to the mean and deviations of two tests performed in triplicate.
  • IFN- ⁇ in a peripheral blood mononuclear cell culture The production of IFN- ⁇ by plasmacytoid dendritic cells (pDCs) is critical in the antiviral immune response.
  • pDCs plasmacytoid dendritic cells
  • HCV hepatitis C virus
  • one of the escape mechanisms to this response could be mediated by the activation of monocytes after their union with the HCV core protein through of the TLR2 receptor (Toll-Like Receptor 2), which stimulates the production of cytokines such as IL-IO, which in turn inhibit the production of IFN- ⁇ by pDCs (Dolganiuc et al., The Journal of Immunology, 2006, 177: 6758-6768).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells

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Abstract

Se describen péptidos que tienen la capacidad de unirse a la interleuquina 10 (IL-10) y su empleo en el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10, por ejemplo, enfermedades infecciosas, tumores, cánceres y situaciones de daño agudo.

Description

PÉPTIDOS CON CAPACIDAD PARA UNIRSE A LA INTERLEUQUINA 10 (IL lO)
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere, en general, a péptidos que tienen la capacidad de unirse a la interleuquina 10 (IL-IO) y a sus aplicaciones. En particular, la invención se refiere a péptidos inhibidores de la actividad biológica de la IL-10 mediante su unión directa a IL-10, y a su empleo en el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La respuesta inmune incluye ambas, una respuesta celular y una respuesta humoral. La respuesta celular está mayoritariamente mediada por los linfocitos T, mientras que la respuesta humoral está mediada por linfocitos B. Los linfocitos juegan papeles importantes en la respuesta inmune, incluyendo dirigir la muerte celular de células infectadas por virus, la producción de citoquinas y anticuerpos, etc. Los linfocitos también están involucrados en las enfermedades inflamatorias agudas y crónicas.
Las citoquinas son proteínas solubles que median reacciones entre las células y que influyen en el crecimiento y diferenciación celular. Las citoquinas ejercen sus efectos a través de la unión a receptores específicos lo que lleva a la activación de señales de trasducción específicas para dichas citoquinas.
La interleuquina 10 (IL-10) es una citoquina pleiotrópica producida por varios tipos celulares tales como macrófagos, monocitos, células B y células T reguladoras y de tipo Th2. La IL-10 es una citoquina con propiedades inmunosupresoras y antiinflamatorias, regula numerosas actividades mieloides y linfoides celulares e inhibe directamente la producción de varias citoquinas inflamatorias por las células T y células NK (del inglés, "Natural Killer").
La IL-10 fue descrita por primera vez como un factor inhibidor de la síntesis de citoquinas (FISC) producido por células Th2 que inhibía la producción de citoquinas proinflamatorias tales como el interferón-gamma (IFN-γ), la interleuquina 1-alfa (IL- lα), la interleuquina 1-beta (IL- lβ), la interleuquina 2 (IL-2) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α, del inglés "tumor necrosis factor alpha"), por las células ThI. Además de inhibir la producción de citoquinas proinflamatorias, se ha mostrado que la IL-IO es capaz de inhibir la proliferación celular ThI específica de antígeno reduciendo la capacidad de los monocitos de presentación del antígeno a través de la desregulación de la expresión del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, del inglés "major histocompatibility complex") de clase II en estas células.
El descubrimiento de que la IL-IO tiene un fuerte efecto inhibidor sobre la activación de células ThI y sobre la producción de citoquinas proinflamatorias llevó a la hipótesis de que la IL-10 era un potente inmunosupresor de respuestas inmunes mediadas por células. Otros autores han propuesto el empleo de esta citoquina en el tratamiento de procesos inflamatorios agudos y crónicos así como en enfermedades autoinmunes. Por estas razones, esta citoquina se ha utilizado en varias enfermedades autoinmunes, tales como la psoriasis, la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn. Sin embargo, en otras enfermedades, tales como en procesos infecciosos o en cáncer, tiene un efecto negativo, puesto que impide la inducción de respuestas ThI que favorecerían la curación. Ejemplos de estos procesos incluyen la lepra, la tuberculosis, la leishmaniasis, así como las infecciones virales. Así, se ha descrito que en la infección crónica por el virus de la hepatitis C (HCV), la IL-10 se expresa en abundancia. Esta citoquina puede producirse por las células Th2 como consecuencia de la estimulación con antígenos del HCV. También puede ser producida por células T reguladoras (CD4 y CD8) que inhiben el desarrollo de células antivirales efectoras de tipo ThI. Finalmente, las células dendríticas (DC) infectadas, o los monocitos en contacto con proteínas del HCV, producen mayor cantidad de IL-10 que las células no infectadas, lo que favorece el desarrollo de respuestas Th2 e impide la eliminación del virus.
Como se ha comentado anteriormente, otro campo en el que la IL-10 juega un papel importante es en la respuesta antitumoral. Así, las células tumorales o las células del infiltrado tumoral pueden producir, entre otras moléculas, IL-10, que perjudica el funcionamiento de las DC. La inhibición del buen funcionamiento de las DC en los tumores sería una de las razones por las que no se produce una respuesta antitumoral. Puesto que la inhibición de la IL-10 in vi tro e in vivo tiene como resultado un aumento en la producción de interleuquina 12 (IL- 12) y, de forma concomitante, un aumento de la respuesta ThI, dicha inhibición de IL-10 sería de gran utilidad tanto en ciertas terapias antivirales, como la infección crónica por el HCV, como en terapias antitumoral es, donde se desee inducir potentes respuestas de tipo ThI. Así, se ha descrito que la combinación de un oligonucleótido no metilado (CpG) y un anticuerpo anti-receptor de la IL-IO, que impide la interacción entre IL-IO y su receptor, permite inducir una respuesta antitumoral más eficaz, superior a la alcanzada cuando se utiliza solamente CpG (Vicari A.P. et al. Reversal of tumor-induced dendritic cell paralysis by CpG immuno-stimulatory oligonucleotide and anti-interleukin 10 receptor antibody. J Exp Med. 2002 Aug 19; 196(4):541-9). Otras estrategias habitualmente utilizadas para inhibir la actividad biológica de la IL-10 incluyen bien el empleo de anticuerpos específicos neutralizantes o bien el empleo de oligonucleótidos (oligos) antisentido del gen que codifica la IL-10 que bloquean su expresión. El empleo de anticuerpos permite un bloqueo total y específico de esta citoquina (IL-10) aunque se potencian ciertos efectos secundarios tanto por la presencia de inmunoglobulinas exógenas en sangre como por los efectos derivados del bloqueo sistémico de la IL-10. Además, la estabilidad a lo largo del tiempo de las inmunoglobulinas no permite un control a tiempos cortos del bloqueo en la actividad de esta citoquina. Los oligos antisentido inhiben la producción de la IL-10 a nivel de expresión génica, lo que puede generar desregulaciones importantes en todos los procesos en los que interviene esta citoquina.
Así pues, es necesaria la identificación de nuevos inhibidores de la IL-10, específicos y de mayor eficacia, potencialmente útiles en terapia humana.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se enfrenta, en general, con el problema de buscar nuevos compuestos capaces de inhibir la actividad biológica de la IL-10.
La solución proporcionada por la presente invención se basa en que los inventores han identificado unos péptidos capaces no sólo de unirse a la IL-10 sino, además, capaces de inhibir la actividad biológica de la IL-10 mediante su unión directa a la propia IL-10. Estos péptidos han sido identificados mediante el empleo de la tecnología asociada con las librerías de fagos que permite determinar péptidos, con un tamaño típicamente comprendido entre 6 y 15 aminoácidos, que presentan una unión de alta afinidad con la IL-10, cuantificando, posteriormente, mediante ensayos in vitro, la capacidad de inhibición de la actividad biológica de la IL-10 de los distintos péptidos.
Los péptidos capaces de unirse a la IL-10, en particular, aquéllos capaces de inhibir la actividad biológica de la IL-10 mediante su unión directa a la IL-10 son potencialmente útiles para el tratamiento de condiciones clínicas y alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-IO, en particular, con una expresión elevada de IL-IO. Asimismo, los péptidos capaces de unirse a la IL-10 proporcionan una herramienta para el estudio del papel biológico de la IL-10.
Por tanto, un aspecto de esta invención se relaciona con unos péptidos que poseen la capacidad de unirse a la IL-10. En una realización particular y preferida, dichos péptidos tienen, además, la capacidad de inhibir la actividad biológica de IL-10.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende, al menos, uno de dichos péptidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con dichos péptidos para el tratamiento de condiciones clínicas y alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichos péptidos en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de condiciones clínicas y alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL- 10.
En otro aspecto, la invención se relaciona con secuencias de ADN que codifican para dichos péptidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un péptido proporcionado por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende dicha secuencia de ADN o dicha construcción de ADN.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora transformada, que comprende dicha secuencia de ADN o construcción de ADN o dicho vector.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido proporcionado por esta invención que comprende cultivar dichas células hospedadoras bajo condiciones que permiten la expresión de dicho péptido y, si se desea, recuperar el péptido obtenido. En otro aspecto, la invención se relaciona con dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN para el tratamiento de condiciones clínicas y alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con expresión de ILlO, en particular, con una expresión elevada de IL-IO.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra esquemáticamente la posición de un péptido de 15 aminoácidos (P15aa), genéticamente fusionado a la proteína pIII, en la superficie del bacteriófago filamentoso Ml 3. La Figura 2 muestra esquemáticamente la selección de péptidos mediante la técnica de "biopanning". La IL-10 biotinilada se inmoviliza en placas que contienen estreptavidina (a través de la unión biotina-estreptavidina). La librería de fagos es seleccionada en base a la interacción entre la IL-10 y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos con baja afinidad por la IL-10 son eliminados mediante lavados. Los fagos retenidos en la placa son eluidos mediante descenso de pH. Después de tres ciclos de enriquecimiento de fagos con alta afinidad por la IL-10, los fagos se aislan y secuencian (véase el Ejemplo 1).
La Figura 3 es un gráfico que muestra la proliferación de las células MC/9 en presencia de diferentes concentraciones de IL-10 humana y de interleuquina 4 (IL-4) de ratón.
La Figura 4 consta de unos diagramas de barras que indican el porcentaje de inhibición de la IL-10 humana (hIL-10) y de la IL-10 murina (mIL-10) obtenido con cada péptido a la concentración de 150, 100 y 50 μg/mL (de izquierda a derecha) (Figura 4A), y el porcentaje de toxicidad [expresado como porcentaje de inhibición de la proliferación de células MC/9 por el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, del inglés, "granulocyte macrophage-colony stimulating factor") (Figura 4B). Cada barra corresponde a la media de 2 ó 3 experimentos independientes.
La Figura 5 es un diagrama de barras que muestra el efecto de algunos péptidos con capacidad de unión a la IL-10 sobre la actividad inmunosupresora de la línea celular Karpas (productoras de IL-10). Con estas células se realizó un ensayo de "reacción mixta linfocitaria" (MLR) en el que se miden los niveles de IFN-γ producidos como medida de la respuesta inmunitaria. Aquellos péptidos con capacidad inhibidora de IL- 10 significativa y capaces de restaurar los niveles de IFN-γ de la MLR se indican con barras rayadas. Leyendas: PBL: linfocitos de sangre periférica, PBLl y PBL2: linfocitos de sangre periférica de dos donantes sanos diferentes (por definición, la mezcla de esas células induce una activación proliferativa por reconocimiento alogénica a través de la reacción entre MHC y TLR), MLR: reacción mixta linfocitaria, MLR+K: reacción mixta linfocitaria + línea celular Karpas 299, K: línea celular Karpas 299).
La Figura 6 es un diagrama de barras que presenta el efecto in vitro de los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y P13 (SEQ ID NO: 8) en la re-estimulación de linfocitos con diferentes péptidos determinantes T helper (ThO), cuantificado como la producción de IFN-γ. La inhibición de la IL-IO en este sistema favorecería un perfil de citoquinas ThI y, por lo tanto, un aumento de IFN-γ. El péptido FISEA G (SEQ ID NO: 38) fue el único que indujo niveles detectables de IL-IO en sobrenadantes junto con los niveles más altos de IFN-γ. Los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y Pl 3 (SEQ ID NO: 8) aumentan la producción de IFN-γ sólo en este caso.
La Figura 7 es un diagrama que muestra el promedio de crecimiento tumoral en diferentes grupos de ratones BALB/c inoculados subcutáneamente con 5x105 células tumorales (CT26). Los diferentes grupos representan el promedio de evolución tumoral en ausencia de tratamientos (Grupo control), tratados con poli I:C y anticuerpo anti-CD- 40 (Adyuvantes), tratados con los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) (vía intratumoral) y P13 (SEQ ID NO: 8) (vía intraperitoneal) (Inhibidores de IL-IO) o una combinación de adyuvantes e inhibidores de IL-IO (Ady + Inhib IL-IO).
La Figura 8 es una gráfica que muestra el perfil de la interacción biomolecular, obtenido mediante un análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR), que se produce entre la IL-IO y el péptido P9 (SEQ ID NO: 6), así como el obtenido con el péptido control [P301 (SEQ ID NO: 54)]. La Figura 9 es un diagrama de barras en el que se muestran los resultados obtenidos de la interacción biomolecular, medida mediante un análisis de SPR, que se produce entre la IL-IO y los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6), P13 (SEQ ID NO: 8) y sus formas truncadas y/o modificadas: P9(2-15) (SEQ ID NO: 45), P9(l-14) (SEQ ID NO: 46), P9(l-13) (SEQ ID NO: 47), P9(2-14) (SEQ ID NO: 48), P9(2-13) (SEQ ID NO: 49), P9(3-14) (SEQ ID NO: 50), P9(15 Ala) (SEQ ID NO: 51), P9(14 Ala) (SEQ ID NO: 52), P9(l-13; 1 Ser) (SEQ ID NO: 53).
La Figura 10 muestra el efecto inhibidor de los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y Pl 3 (SEQ ID NO: 8) sobre la fosforilación de STAT3 inducida por IL-IO. La expresión de STAT3-fosforilada se analizó mediante la técnica de Western Blot (Figura 10A). En el diagrama de barras (Figura 10B) se representa el cociente entre el contenido de las bandas de STAT3-fosforilada, cuantificadas mediante densitometría, y el obtenido en el control de actina para cada muestra. En la Figura 11 se representa en un diagrama de barras el porcentaje de inhibición de la proliferación celular inducida por los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6), Pl 3 (SEQ ID NO: 8), P15 (SEQ ID NO: 10), P16 (SEQ ID NO: 11), P31 (SEQ ID NO: 22) y P34 (SEQ ID NO: 25), así como el inducido por el péptido control P301 (SEQ ID NO: 54). Todos ellos fueron probados a una concentración de 200 μg/ml. Los resultados mostrados corresponden a la media y desviaciones de dos ensayos realizados por triplicado.
La Figura 12 es un diagrama de barras que muestra el efecto del péptido P13 (SEQ ID NO: 8) sobre la producción de IFN-α en un cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimulado con un ligando de TLR9 (CpG) y en presencia de la proteína de la nucleocápside del virus de la hepatitis C (HCV core). Brevemente, PBMCs de donantes sanos fueron estimuladas con un ligando de TLR9 (CpG, 5 μg/ml) con o sin HCV core (2,5 μg/ml) y en presencia o ausencia del péptido P13 (SEQ ID NO: 8). Como control positivo se utilizó un anticuerpo anti-IL-10 (eBioscience, 16- 7108-81) a una concentración de 1 μg/ml. Tras 48 horas de incubación a 37°C y CO2 al 5% se midió la producción de IFN-α en los sobrenadantes del cultivo mediante ELISA. Los resultados mostrados son representativos de cuatro experimentos con resultados similares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, en general, con péptidos con capacidad de unirse a IL-IO y sus aplicaciones.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un péptido, en adelante, péptido de la invención, con capacidad de unirse a IL-IO, seleccionado entre: a) un péptido cuya secuencia de aminoácidos se selecciona entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:
13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:
18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, b) una variante de un péptido definido en a); y c) un fragmento de un péptido definido en a) o de una variante definida en b), que comprende entre 5 y 15 aminoácidos consecutivos; y sus sales farmacéuticamente aceptables.
El término "péptido", tal como aquí se utiliza, incluye modificaciones o derivados del mismo, por ejemplo glicosilación, fosforilación, acetilación, amidación, etc. El término "variante" según se utiliza en la presente descripción se refiere a un péptido derivado de un péptido según se ha definido anteriormente en el apartado a) en el que algún aminoácido ha sido modificado, por ejemplo, mediante sustitución, o que presenta inserciones o deleciones de uno o más aminoácidos, con la condición de que conserve al menos una de las funciones del péptido original, ventajosamente, al menos una función relacionada con la unión a IL-IO. Normalmente, dichas variantes comprenden sustituciones conservativas, en las que no se modifica la función del péptido final. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de variantes del péptido P9 (SEQ ID NO: 6) incluyen los péptidos P9(15 Ala) (SEQ ID NO: 51), en el que el aminoácido en posición 15 (Phe) de P9 (SEQ ID NO: 6) ha sido reemplazado por una Ala, el péptido, P9(14 Ala) (SEQ ID NO: 52), en el que el aminoácido en posición 14 (Val) de P9 (SEQ ID NO: 6) ha sido reemplazado por una Ala, entre otros.
El término "fragmento" tal como se utiliza en la presente descripción se refiere a un péptido derivado de un péptido según se ha definido anteriormente en a) o en b) en el que se ha eliminado algún aminoácido bien del extremo amino o bien del extremo carboxilo o de ambos extremos que mantiene una o más de las funciones del péptido original, preferentemente funciones relacionadas con la unión a IL-IO. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de fragmentos del péptido P9 (SEQ ID NO: 6) incluyen los péptidos P9(2-15) (SEQ ID NO: 45), P9(l-14) (SEQ ID NO: 46), P9(l-13) (SEQ ID NO: 47), P9(2-14) (SEQ ID NO: 48), P9(2-13) (SEQ ID NO: 49), P9(3-14) (SEQ ID NO: 50), P9(l-13; 1 Ser) (SEQ ID NO: 53), entre otros.
Dentro del alcance de esta invención se encuentran las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención. El término "sales farmacéuticamente aceptables", tal como aquí se emplea, incluye las sales habitualmente utilizadas para formar sales metálicas o sales de adición de ácidos. La naturaleza de la sal no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención pueden obtenerse a partir de ácidos o bases, orgánicos o inorgánicos. Dichas sales pueden obtenerse por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia.
Los péptidos de la invención tienen la capacidad de unirse a IL-IO. Algunos de dichos péptidos tienen, además, la capacidad de inhibir, in vitro y/o in vivo, la actividad biológica del IL-IO.
La capacidad de los péptidos de la invención de unirse a IL-10 se puede determinar mediante cualquier método apropiado que permita determinar la unión entre dos moléculas, por ejemplo, mediante un ensayo de afinidad, que comprende poner en contacto la IL-10 con el péptido a ensayar bajo condiciones que permiten la unión de dicho péptido a IL-10 y evaluar la unión entre el péptido y la IL-10. En una realización particular, dicho ensayo de afinidad puede realizarse utilizando, por ejemplo, la IL-10 marcada radiactivamente. Alternativamente, el compuesto que puede estar marcado es el péptido a ensayar. En general, este tipo de ensayos de afinidad comprende poner en contacto IL-10, por ejemplo, inmovilizada en una placa bloqueada con estreptavidina, con el péptido cuya capacidad de unión a IL-10 se desea conocer, y, tras incubar durante un periodo de tiempo apropiado, analizar la unión del péptido a IL-10, tal como se muestra en el Ejemplo 1 que acompaña a la presente descripción. Los péptidos con baja afinidad por la IL-10 son eliminados mediante lavados mientras que los péptidos con mayor afinidad permanecen unidos a IL-10 y pueden ser liberados rompiendo las interacciones moleculares entre ambas moléculas, lo que puede realizarse, por ejemplo, bajando el pH. Ensayando el péptido frente a distintas concentraciones de IL-10, o viceversa, se puede obtener una idea de la afinidad del péptido en cuestión frente a IL- 10.
Aunque todos los péptidos de la invención tienen la capacidad de unirse a IL-10, en una realización particular, el péptido de la invención con capacidad de unirse a IL-10 se selecciona del grupo formado por los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53, una variante o un fragmento de los mismos, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
La capacidad de los péptidos de la invención de inhibir la actividad biológica de
IL-IO in vitro se puede evaluar y, si se desea, cuantifícar, mediante un ensayo de inhibición del crecimiento de la línea celular MC/9 (CRL-8306, American Type CeIl
Culture (ATCC), Virginia, Estados Unidos), una línea celular de mastocitos derivada del hígado de ratón cuya proliferación es inducida por la IL-IO (véase el Ejemplo 3).
En otra realización particular, el péptido de la invención es un péptido con capacidad de inhibir la actividad biológica de IL-IO y está seleccionado entre los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 (Pl); SEQ ID NO: 6 (P9); SEQ ID NO: 8 (P 13); SEQ ID NO: 10 (P 15); SEQ ID NO: 13 (P 19); SEQ ID NO: 14 (P20); SEQ ID NO: 16 (P22); SEQ ID NO: 19 (P25) y SEQ ID NO: 25 (P34), una variante o un fragmento de los mismos, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Dichos péptidos, además de presentar capacidad de unirse a IL-IO e inhibir la actividad biológica de IL- 10, presentan unas características estructurales comunes a todos ellos. Así, dichos péptidos (i) presentan en su secuencia de aminoácidos un porcentaje de aminoácidos hidrofóbicos (Ala, Val, Leu, He, GIy y Pro) y básicos (Arg, His y Lys) entre un 60% y un 90%, muy superior al porcentaje esperado (alrededor de un 45%); y (ii) tienen, al menos, un aminoácido aromático, en general, 2 ó 3, seleccionado entre Phe, Trp y Tyr, preferentemente, Phe. Asimismo, como puede apreciarse, un análisis de alineamiento de secuencias de aminoácidos, tomando al péptido identificado como SEQ ID NO: 8 (P 13) como péptido de referencia, pone de manifiesto la existencia de una cierta tendencia a presentar aminoácidos básicos (Arg, His, Lys) entre las posiciones 2 a 5 y aminoácidos hidrofóbicos en las posiciones 10 a 14, manteniéndose ese patrón en los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 (Pl), SEQ ID NO: 6 (P9), SEQ ID NO: 8 (P 13), SEQ ID NO: 13 (P 19) y SEQ ID NO: 25 (P34), invirtiéndose esa localización para los péptidos identificados como SEQ ID NO: 10 (P 15) y SEQ ID NO: 16 (P22) y perdiéndose en los péptidos identificados como SEQ ID NO: 14 (P20) y SEQ ID NO: 19 (P25). En una realización particular, se ha ensayado la interacción biomolecular entre la
IL-IO humana y los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y P 13 (SEQ ID NO: 8), así como de algunos derivados de los mismos (formas truncadas y/o modificadas) mediante análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR), confirmándose su capacidad de unión a IL-10 (Ejemplo 7). Asimismo, se ha comprobado la inhibición que ejercen los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y P13 (SEQ ID NO: 8) mediante su efecto sobre la fosforilación de STAT3, molécula implicada en la señalización tras la unión de IL-IO a su receptor celular (Ejemplo 8). También se ha observado el efecto de péptidos inhibidores de IL-IO proporcionados por esta invención en un ensayo in vitro de proliferación de células tumorales de melanoma B16-F10 (Ejemplo 9). Además, como la IL-IO es uno de los factores negativos que podrían determinar la cronifícación de la infección por el virus de la hepatitis C (HCV) se ha probado la eficacia del péptido P 13 (SEQ ID NO: 8) en un modelo in vitro en el que la proteína HCV core (a través de su capacidad de inducir IL-IO) es responsable de la baja producción de IFN-α que se detecta (Ejemplo 10); como puede apreciarse en la Figura 12, dicho péptido Pl 3 (SEQ ID NO: 8) es capaz de rescatar la producción de IFN-α.
Para la identificación inicial de péptidos con capacidad de unirse a IL-IO los inventores han utilizado la tecnología asociada con las librerías de fagos que permite determinar péptidos que presentan una unión de alta afinidad con IL-IO, y cuantificar, posteriormente, mediante ensayos in vitro, la capacidad de inhibición de la actividad biológica de la IL-IO de los distintos péptidos. La secuencia de los péptidos que se unen a la IL-IO, inhibiendo in vitro la actividad biológica de la IL-10, se puede deducir a partir de la secuencia del ADN correspondiente al cabo de varios ciclos de "biopanning", generalmente 3. El empleo de librerías de fagos para identificar inhibidores de ciertos productos ha sido descrito, por ejemplo, por Chirinos-Rojas CL. et ai, en Immunology, 1999, Jan. 96(l):109-113; McConnell S.J., et al., en Gene 1994, Dec. 30, 151(1-2):115-1 18; o por Smith G.P., Science, 1985, Jun. 14, 228(4705): 1315- 1317. Por tanto, la invención proporciona un método para la identificación de péptidos que tienen la capacidad de unirse a IL-IO que comprende:
(i) utilizar una librería de fagos que comprende una pluralidad de fagos filamentosos, conteniendo el genoma de cada uno de dichos fagos una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido diferente ligada al gen de una proteína de la cubierta del fago, con lo que cada fago contiene un péptido diferente genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago; (ii) seleccionar, mediante un ensayo de afinidad, los fagos que contienen los péptidos que se unen con mayor afinidad a IL-IO; y
(iii) determinar la secuencia de los péptidos que se unen a IL-IO, a partir de las secuencias de ADN correspondientes insertadas en los fagos seleccionados en la etapa (ii) y que codifican para dichos péptidos que se unen a IL-10
En una realización particular, con el fin de obtener péptidos de una longitud de 15 aminoácidos capaces de unirse con alta afinidad a la IL-10 y con posible actividad inhibitoria de la actividad biológica de dicha citoquina, se utilizó una librería de fagos compuesta por una pluralidad de bacteriófagos filamentosos (M 13) conteniendo cada uno de ellos un péptido diferente, de 15 aminoácidos, genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago, en este caso unido al extremo N-terminal de la proteína de cubierta pIII. De esta forma, el fago presenta sobre su superficie un péptido de 15 aminoácidos, en cada una de las cinco moléculas de la proteína de superficie, mientras en su interior contiene el ADN que codifica dicha secuencia peptídica. En las librerías de fagos, la secuencia codificante del péptido proviene de una secuencia degenerada en cada una de las 15 posiciones con los 20 aminoácidos naturales, lo que permite la presentación de 1,IxIO12 secuencias posibles de 15 aminoácidos en diferentes fagos. La relación física, I a I, entre la secuencia peptídica y el ADN que lo codifica en el bacteriófago permite seleccionar, de entre un gran número de variantes, aquellas secuencias que se unen específicamente a la IL-10. Este proceso se realiza mediante un ensayo de afinidad.
En una realización particular, dicho ensayo de afinidad consiste en un protocolo de selección in vitro denominado "biopanning". Brevemente, dicha técnica consiste en la incubación de un conjunto de fagos representantes, a efectos prácticos, de todas las variantes de péptidos de 15 aminoácidos (en este caso), en una placa bloqueada con estreptavidina a la que se le añade la IL-10 biotinilada. La IL-10 biotinilada queda anclada a la placa a través de la interacción biotina-estreptavidina, con lo que queda correctamente presentada para su interacción con los péptidos portados por los fagos. Tras una incubación se eliminan los fagos no unidos mediante lavados y posteriormente se eluyen los fagos unidos específicamente, mediante un descenso de pH que rompe las interacciones moleculares entre la IL-10 y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos eluidos son, entonces, amplificados mediante infección en una cepa bacteriana. El proceso se repite un total de 3 rondas, de manera que el contenido de fagos que se unen específicamente y con alta afinidad a la IL-IO se va enriqueciendo. La concentración de IL-IO biotinilada utilizada para bloquear las placas se va reduciendo progresivamente en cada ronda, por ejemplo, de 2,5 a 0,02 μg/mL y, finalmente, 0,002 μg/mL. De este modo, los fagos seleccionados en cada ronda presentan cada vez mayor grado de afinidad por la IL-10. Al final del proceso, los fagos que han sido seleccionados por su afinidad por IL-10 son secuenciados con cebadores. Esto permite obtener las secuencias de los péptidos presentados en los fagos.
El Ejemplo 1 que acompaña a la presente descripción ilustra la selección de péptidos que se unen a la IL-10 mediante librería de fagos, selección por la técnica de "biopanning" y secuenciación de los péptidos con unión de alta afinidad a la IL-10. Los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; y SEQ ID NO: 26, han sido obtenidos mediante esta técnica.
En otro caso particular, para la identificación inicial de péptidos con capacidad de unirse a IL-IO los inventores han tenido en cuenta la estructura del complejo (IL-IO)- (Receptor IL-IO) (Josephson K, Logsdon NJ, Walter MR. Crystal structure of the IL- 10/IL-10R1 complex reveáis a shared receptor binding site. Immunity, 2001 JuI; 15(1):35-46). Mediante esta aproximación (véase el Ejemplo 2), los inventores han observado que en dicha estructura existen zonas en la IL-IO que presentan una conformación de alfa hélice y que se encuentran orientadas de tal forma que podrían considerarse de relevancia para la interacción de la citoquina con su receptor. Así, los inventores han encontrado que existen dos zonas de alfa hélice en la IL-IO, concretamente, una primera zona que comprende la secuencia de aminoácidos 19-35 de la secuencia de aminoácidos de la IL-IO y otra segunda zona que comprende la secuencia de aminoácidos 86-110 de la secuencia de aminoácidos de la IL-IO que se encuentran orientadas en forma antiparalela por lo que pueden considerarse de posible relevancia en la interacción de la citoquina con su receptor. De este modo, es posible identificar zonas de la secuencia de aminoácidos de la IL-IO que pueden emplearse en la síntesis de péptidos con capacidad inhibitoria de la IL-IO, y cuantificar, posteriormente, mediante ensayos in vitro, la capacidad de inhibición de la actividad biológica de la IL- 10 de los distintos péptidos tal como se ha mencionado más arriba.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de péptidos con potencial capacidad inhibidora de IL-IO identificados empleando la aproximación arriba descrita se recogen en la Tabla 2 (Ejemplo 2) e incluyen los péptidos identificados como SEQ ID NO: 30 (F24), SEQ ID NO: 31 (F25), SEQ ID NO: 32 (F26), SEQ ID NO: 33 (F27), SEQ ID NO: 34 (F28), SEQ ID NO: 35 (F29) y SEQ ID NO: 36 (F30). Como puede apreciarse en dicha Tabla 2, el péptido identificado como SEQ ID NO: 30 (F24) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 86-97 de la secuencia de aminoácidos de la IL- 10 humana (hIL-10) nativa; el péptido identificado como SEQ ID NO: 31 (F25) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 23-34 de la secuencia de aminoácidos de la hIL-10 nativa inversa; el péptido identificado como SEQ ID NO: 32 (F26) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 23-34 de la secuencia de aminoácidos de la hIL-10 nativa; el péptido identificado como SEQ ID NO: 33 (F27) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 23-34 de la secuencia de aminoácidos complementaria de la hIL-10 nativa y tiene capacidad de unión a IL-IO; el péptido identificado como SEQ ID NO: 34 (F28) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 23-34 de la secuencia de aminoácidos complementaria inversa de la hIL-10 nativa y tiene capacidad de unión a IL-IO; el péptido identificado como SEQ ID NO: 35 (F29) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 99-107 de la secuencia de aminoácidos complementaria de la hIL-10 nativa y tiene capacidad de unión a IL-IO, y el péptido identificado como SEQ ID NO: 36 (F30) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 99-107 de la secuencia de aminoácidos complementaria inversa de la hIL-10 nativa y tiene capacidad de unión a IL-IO.
Tal como aquí se emplea, el término "inversa" significa que la secuencia de aminoácidos se corresponde con la secuencia de aminoácidos de la proteína o fragmento de la proteína nativa leída de forma inversa. El término "complementaria" tal como aquí se emplea, se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende residuos que pueden "interactuar positivamente" con otros residuos, complementarios, de la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa. Tal como aquí se utiliza, el término "interactuar positivamente" se refiere a situaciones en las que la interacción entre dos aminoácidos genere fuerzas de atracción, ya sea por fuerzas electrostáticas, interacciones hidrofóbicas, puentes de hidrógeno, etc.
Debido al papel que desempeña la IL-IO en numerosos procesos biológicos, una consecuencia de la actividad inhibidora de la IL-IO del péptido de la invención tiene que ver con el desarrollo potencial de una nueva familia de fármacos útiles para el tratamiento de condiciones clínicas y alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-IO, en particular, con una expresión elevada de la IL-10, ya que tales péptidos permiten bloquear el exceso de dicha citoquina que origina el daño. Así, el péptido de la invención sería de aplicación potencial en cualquier situación clínica o alteración patológica en la que un aumento de IL-10 se relacione con un empeoramiento de la situación clínica del sujeto o paciente.
El término "sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier miembro de una especie animal de mamíferos e incluye, pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano masculino o femenino de cualquier edad o raza.
El péptido de la invención, por tanto, puede utilizarse en el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de la IL-10. Ejemplos ilustrativos de dichas condiciones clínicas o alteraciones patológicas que pueden ser tratadas con el péptido de la invención donde la IL-10 juega un papel inmunosupresor incluyen infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones por hongos, infecciones parasitarias, tumores, cánceres o situaciones de daño agudo. En este tipo de procesos infecciosos, tumores, cáncer, o situaciones de daño agudo, la IL-10 tiene un efecto negativo, puesto que impide la inducción de respuestas ThI que favorecerían la curación. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de infecciones virales que pueden ser tratadas con el péptido de la invención incluyen virtualmente cualquier infección de origen viral, por ejemplo, infecciones causadas por herpesvirus, por ejemplo, herpesvirus humanos, tales como virus herpes simplex tipo 1 (HSV-I), virus herpes simplex tipo 2 (HS V-2), virus de la variedla zoster (VZV), citomegalovirus (CMV), herpesvirus humano 6 (HHV-6), herpesvirus humano 7 (HH V-7), virus de Epstein-Barr (EBV), herpesvirus de Kaposi (HHV-8), etc., y, opcionalmente, con su reactivación cutánea tras exposición al sol, infecciones causadas por virus causantes de la hepatitis, por ejemplo, el virus de la hepatitis C (HCV), etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de infecciones bacterianas que pueden ser tratadas con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a infecciones causadas por Mycobacterium leprae, infecciones causadas por Mycobasterium tuberculosis, infecciones causadas por Yersinia pestis, infección gástrica causada por Helicobacter pylori, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de infecciones causadas por hongos que pueden ser tratadas con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a, infecciones causadas por Candida albicans, infecciones causadas por Trichophyton rubrum, infecciones causadas por Aspergillus sp., etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de infecciones parasitarias que pueden ser tratadas con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a, leishmaniasis, e.g., leishmaniasis visceral, infecciones causadas por Plasmodium falciparum, toxoplasmosis, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de tumores y cánceres que pueden ser tratados con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a, linfoma de Hodgkin, cáncer de cuello y cabeza, melanoma, basoliomas y espinoliomas desarrollados a partir de queratinocitos mutados por radiación UV, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de situaciones de daño agudo que pueden ser tratadas con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a, quemaduras y sepsis asociada, etc. En general, cualquier proceso de desarrollo tumoral, infección viral, bacteriana, fúngica o parasitaria donde la actividad de la IL-IO tenga un papel inmunosupresor clave en el agravamiento o cronificación de la condición clínica de un sujeto puede ser susceptible de ser tratado con el péptido de la invención.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de la invención junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede contener uno o más péptidos de la invención, junto con, opcionalmente, uno o más, compuestos inhibidores de IL-10 alternativos. Dicha composición farmacéutica es útil para su administración y/o aplicación en el cuerpo humano o animal, preferentemente en el cuerpo humano. Prácticamente, cualquier compuesto inhibidor de IL-10, distinto a los péptidos de la invención, puede estar presente, si se desea, en la composición farmacéutica de la invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de compuestos inhibidores de la IL-10 alternativos, distintos a los péptidos de la invención, que pueden emplearse junto con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a, IFN-γ, AS101 (ammonium trichloro (dioxoethylene-O,O!) tellurate), anticuerpos neutralizantes, 15d-PGJ2 (15- deoxy-delta-12,14-prostaglandin J2), anticueφo murino quimérico anti-CD20 humano (Ritubimax), etc.
El empleo de péptidos, tales como el péptido de la invención, en lugar de utilizar anticuerpos u oligonucleótidos antisentido, presenta numerosas ventajas, ya que son moléculas pequeñas, con mayor capacidad de difusión y vida media más corta. Los péptidos pueden llegar a tener una elevada afinidad por IL-IO, pero se degradan más rápidamente que los anticuerpos pudiéndose controlar mediante dosificación los efectos secundarios adversos. También es más accesible la vehiculización de los péptidos a órganos o tejidos diana en comparación con otro tipo de compuestos. El péptido de la invención puede administrarse para tratar las condiciones clínicas o las alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular con una expresión elevada (en exceso) de IL-10 por cualquier medio que produzca el contacto del péptido de la invención con el sitio de acción del mismo en el cuerpo humano o animal. La cantidad de péptido, derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que puede estar presente en la composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede variar dentro de un amplio intervalo.
La dosificación para tratar una enfermedad o alteración patológica asociada con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10 con los péptidos y/o composiciones farmacéuticas de la invención dependerá de numerosos factores, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la enfermedad o alteración patológica, la ruta y frecuencia de administración y del péptido de la invención a administrar.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el péptido de la invención pueden presentarse en cualquier forma de administración, por ejemplo, sólida o líquida, y pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, rectal o tópica, para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada, por ejemplo, pomadas (lipogeles, hidrogeles, etc.), colirios, aerosoles por nebulización, soluciones inyectables, bombas osmóticas, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S. A. Ediciones, Madrid. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un péptido de la invención para el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con la expresión de IL-IO, en particular, con una expresión elevada de IL-IO. En una realización particular, dicha condición clínica o alteración patológica es una condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-IO, en particular, con una expresión elevada de IL-10. En una realización particular, dicha condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10, comprende condiciones clínicas en las que la respuesta celular ThI se encuentra inhibida. Ejemplos ilustrativos de dichas condiciones clínicas o alteraciones patológicas que pueden ser tratadas incluyen infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones rungicas, infecciones parasitarias, tumores, cánceres o situaciones de daño agudo tal como se ha mencionado anteriormente.
El empleo del péptido de la invención en la elaboración de dicha composición farmacéutica constituye un aspecto adicional de esta invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un péptido de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10. En una realización particular, dicha condición clínica o alteración patológica es una condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10. En una realización particular, dicha condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10, comprende condiciones clínicas en las que la respuesta celular ThI se encuentra inhibida. Ejemplos ilustrativos de dichas condiciones clínicas o alteraciones patológicas que pueden ser tratadas incluyen infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones fungicas, infecciones parasitarias, tumores, cánceres o situaciones de daño agudo tal como se ha mencionado anteriormente.
Métodos para medir los niveles de expresión de IL-10 en una muestra son bien conocidos por los expertos en la materia. Así, a modo ilustrativo, no limitativo, dichos métodos incluyen, por ejemplo, medidas en muestras de suero, esputo o líquido seminal de la concentración o niveles de IL-10 mediante, por ejemplo, la técnica de ELISA. Dicha técnica permite la cuantificación de los niveles de IL-10 en una muestra comparados con los niveles normales, es decir, comparado con los niveles de IL-IO en muestras de individuos sanos.
El péptido de la invención se puede obtener por métodos convencionales, por ejemplo, mediante técnicas de síntesis química sobre fase sólida; purificar mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC); y, si se desea, se pueden analizar mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante secuenciación y espectrometría de masas, análisis de aminoácidos, resonancia magnética nuclear, etc. A modo ilustrativo, no limitativo, el péptido de la invención puede obtenerse mediante síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154) utilizando la variante Fmoc de Atherton (Atherton, E., Logan, J. C. and Sheppard, R. C. 1989. Peptide synthesis II. Procedures for solid phase synthesis using iV-fluorenyl methoxycarbonyl aminoacids on polyamide supports. Síntesis of substance P and of acyl carrier protein 65-74 decapeptide. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:538). La pureza del péptido obtenido puede determinarse mediante, por ejemplo, cromatografía HPLC de fase inversa y/o espectrometría de masas.
Alternativamente, el péptido de la invención puede obtenerse mediante la tecnología del ADN recombinante. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una secuencia de ADN que codifica un péptido de la invención. Dicha secuencia de ADN puede ser deducida fácilmente a partir de la secuencia de aminoácidos del péptido de la invención.
Dicha secuencia de ADN puede estar contenida en una construcción de ADN. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un péptido de la invención. Dicha construcción de ADN puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de la secuencia de ADN que codifica el péptido de la invención. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción del péptido de la invención, e incluyen secuencias promotoras, terminadoras, etc., funcionales en células hospedadoras transformadas que comprenden dicha secuencia o construcción de ADN. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en bacterias. Ventajosamente, dicha construcción de ADN comprende, además, un marcador o gen que codifica un motivo o para un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora transformada con dicha construcción de ADN. La construcción de ADN proporcionada por esta invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., 1989 VoI 1- 3].
La secuencia de ADN o la construcción de ADN proporcionadas por esta invención, pueden ser insertadas en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha secuencia o construcción de ADN. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra]. En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora transformada, que comprende una secuencia de ADN o una construcción de ADN proporcionadas por esta invención o un vector según se ha mencionado anteriormente. Dicha célula puede ser una célula procariota o eucariota.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una secuencia de ADN proporcionada por esta invención, una construcción de ADN proporcionada por esta invención, un vector proporcionado por esta invención, o una célula hospedadora proporcionada por esta invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende una secuencia de ADN proporcionada por esta invención o una construcción de ADN proporcionada por esta invención en un vector de transferencia génica, tal como un vector viral o no viral. Vectores virales apropiados para poner en práctica esta realización de la invención incluyen, pero no están limitados a, vectores adenovirales, vectores adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores alfavirales, vectores herpesvirales, vectores derivados de coronavirus, etc. Vectores de tipo no viral apropiados para poner en práctica esta realización de la invención incluyen, pero no se limitan a ADN desnudo, liposomas, poliaminas, dendrímeros, glicopolímeros catiónicos, complejos liposoma-policatión, proteínas, sistemas de transferencia génica mediados por receptor, etc. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una secuencia de ADN proporcionada por esta invención, o con una construcción de ADN proporcionada por esta invención, o con un vector proporcionado por esta invención, o con una célula hospedadora proporcionada por esta invención, para el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con la expresión de IL-IO, en particular, con una expresión elevada de IL-IO. En una realización particular, dicha condición clínica o alteración patológica es una condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10. En una realización particular, dicha condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10, comprende condiciones clínicas en las que la respuesta celular ThI se encuentra inhibida. Ejemplos ilustrativos de dichas condiciones clínicas o alteraciones patológicas que pueden ser tratadas incluyen infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones füngicas, infecciones parasitarias, tumores, cánceres o situaciones de daño agudo tal como se ha mencionado anteriormente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de condiciones clínicas y alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular con una expresión elevada de IL-10. De acuerdo con este aspecto de la invención, dicha secuencia o construcción de ADN se ponen en contacto con un vector de transferencia génica, tal como un vector viral o no viral. Vectores virales apropiados para poner en práctica esta realización de la invención incluyen, pero no están limitados a, vectores adenovirales, vectores adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores alfavirales, vectores herpesvirales, vectores derivados de coronavirus, etc. Vectores de tipo no viral apropiados para poner en práctica esta realización de la invención incluyen, pero no se limitan a ADN desnudo, liposomas, poliaminas, dendrímeros, glicopolímeros canónicos, complejos liposoma-policatión, proteínas, sistemas de transferencia génica mediados por receptor, etc.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido de la invención que comprende crecer una célula hospedadora que comprende la secuencia, construcción de ADN o vector proporcionados por esta invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido de la invención y, si se desea, recuperar dicho péptido de la invención. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula hospedadora dependerán de la célula hospedadora utilizada. Si se desea, el procedimiento para producir el péptido de la invención incluye, además, el aislamiento y purificación de dicho péptido.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1 Selección de péptidos que se unen a la IL-IO mediante librería de fagos
Para la obtención de péptidos de 15 aminoácidos capaces de unirse con alta afinidad a IL-10 y con posible actividad inhibitoria de la actividad biológica de esta citoquina, se utilizó una técnica de selección in vitro basada en la tecnología desarrollada a partir de las librerías de fagos. Estas librerías constan de bacteriófagos filamentosos (M 13) que contienen un péptido genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del virus, en este caso unido al extremo N-terminal de la proteína de cubierta pIII (Figura 1). De esta forma, el fago presenta sobre su superficie un péptido de 15 aminoácidos en cada una de las 5 moléculas de esta proteína que presenta el fago en su superficie, mientras que en su interior contiene el ADN que codifica dicho péptido. En las librerías de fagos, la secuencia codificante del péptido proviene de una secuencia degenerada en cada una de las 15 posiciones con los 20 aminoácidos naturales. Esto permite la presentación de 1,IxIO12 secuencias posibles de 15 aminoácidos en diferentes fagos. La relación física, I a I, entre la secuencia peptídica y el ADN que lo codifica en el bacteriófago permite seleccionar, de entre un gran número de variantes, aquellas secuencias que se unen específicamente a IL-10. Este proceso se realiza mediante un protocolo de selección in vitro denominado "biopanning". La librería de fagos utilizada para la realización de este ejemplo contiene 2 x 108 clones distintos y ha sido cedida por el laboratorio de George P. Smith (University of Missouri, EE.UU.) Información adicional sobre esta tecnología puede encontrarse en la siguiente página web: http://www.biosci.missouri.edu/sniithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDisplayWebsiteIndex.htm I
Técnica de selección (Biopanning) En primer lugar, antes del "biopanning", 10 μl de la librería de fagos fueron amplificados empleando como cepa huésped la cepa Escherichia coli K91Kan
(suministrada por G.P. Smith, División of Biological Sciences Tucker Hall. University of Missouri) y posteriormente purificados mediante dos precipitaciones con polietilenglicol (PEG)/NaCl y una centrifugación en gradiente de CsCl.
El título de la suspensión de fagos calculada por espectrometría fue de 3,82 x 1014 viriones/ml y el número de partículas infecciosas fue de 1,3 x 1013 TU/ml. Antes de comenzar con el ensayo de selección, una fracción de esta suspensión de fagos fue secuenciada para comprobar que la amplificación no había afectado a la diversidad de los clones.
La técnica "biopanning" consiste en la incubación de un conjunto de fagos, representantes (a efectos prácticos) de todas las variantes de 15 aminoácidos, en una placa bloqueada con estreptavidina (10 μg/ml en NaHCO3 0,1 M, 2 horas a temperatura ambiente) a la que se le añade IL-IO biotinilada. La IL-10 biotinilada queda anclada a la placa a través de la interacción biotina-estreptavidina, con lo que queda correctamente presentada para su interacción con los péptidos portados por los fagos. La IL-10 se pone en contacto con los péptidos portados por los fagos a una concentración de 3x104 virus/ml y se deja incubar durante 12 horas aproximadamente. Tras la incubación, se eliminan los fagos no unidos mediante 5 lavados con PBS/Tween (tampón fosfato salino/polioxialquilen derivados de esteres de ácidos grasos de sorbitano) y posteriormente se eluyen los fagos unidos específicamente, mediante un descenso de pH (buffer de elución) que rompe las interacciones moleculares entre la IL-10 y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos eluidos son, entonces, amplificados mediante infección en una cepa bacteriana (E. coli K91Kan). El proceso se repite un total de 3 rondas, de manera que el contenido de fagos que se unen específicamente y con alta afinidad a IL-10 se va enriqueciendo (Figura 3). La concentración de IL- 10 biotinilada utilizada para bloquear las placas se va reduciendo progresivamente en cada ronda de 2,5 μg/ml a 0,02 μg/ml, y, finalmente, a 0,002 μg/ml. De este modo, los fagos seleccionados en cada ronda presentan cada vez mayor grado de afinidad por la IL-10. Al final del proceso, los fagos que han sido seleccionados por su afinidad por la IL-10 son secuenciados con cebadores, tras ser aislados mediante resistencia a tetraciclina que confieren los fagos modificados genéticamente tras infectar células de E. coli. Esto permite obtener las secuencias de los péptidos presentados en los fagos de un número de clones obtenido de colonias aisladas. El número de veces que se repite una secuencia, correspondiente a un péptido de 15 aminoácidos portado por cada clon, del total de clones secuenciados da una idea del grado de afinidad relativa que tiene dicho péptido de 15 aminoácidos por la IL-IO.
Secuencias de los péptidos
Para la obtención de clones de los fagos, obtenidos a partir del "biopanning", se realiza una selección en presencia de un antibiótico de colonias bacterianas infectadas por estos fagos, cuya resistencia viene dada por un gen de resistencia a tetraciclina presente en el genoma de los fagos. Con este método únicamente crecen colonias infectadas por bacteriófagos. Así, cada colonia contiene el genoma de un único fago al que le corresponde la secuencia de un solo péptido presentado en su superficie.
A partir de colonias de bacterias infectadas por fagos, derivados de la última ronda de selección por "biopanning", se extrajo su ADN y se secuenció la porción del genoma que engloba la región correspondiente a los péptidos presentados en la proteína pIII del fago utilizando el cebador específico que híbrida cerca de esta región identificado mediante la SEQ ID NO: 27. De este modo se obtuvieron las secuencias que se muestran en la Tabla 1 donde se indican además el número de colonias (clones) que portaban dichas secuencias.
Tabla 1 Secuencias de aminoácidos procedentes de los fagos que interactúan con IL-IO
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El número de clones (colonias) de cada secuencia da una idea relativa del grado de afinidad entre los péptidos y la IL-10, es decir, a mayor número de clones mayor afinidad de unión. Sin embargo, el grado de afinidad no se corresponde con la capacidad de bloquear la actividad de la IL-10 puesto que algunos de los péptidos más activos, e.g., los péptidos identificados como SEQ ID NO: 6 (P9) y SEQ ID NO: 17 (P23), proporcionan 3 y 1 clones, respectivamente, mientras que el péptido identificado como
SEQ ID NO: 2, que proporciona 29 clones, es mucho menos activo en el ensayo de inhibición (Ejemplo 3). Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, esta cuestión podría ser explicada sobre la base de que el péptido más activo bloquearía probablemente la unión de la IL-IO a su receptor.
Comparación de las secuencias peptídicas
Las secuencias obtenidas fueron analizadas con el programa "transíate tool" disponible en internet http://www.expasy.org/tools/dna.html que permite deducir las secuencias de aminoácidos con las que se trabajó posteriormente. Se secuenciaron un total de 143 clones, lo que permitió identificar 35 péptidos diferentes (P1-P35), de los cuales 9 de dichos péptidos (P3, P4, P6, Pl 1, P 12, P 17, P27, P28 y P30) se encontraron también en otros ensayos de "biopanning " con otras proteínas, por lo que se consideró que no eran específicos de la unión a IL-IO y, en consecuencia, podían ser descartados. Estas uniones inespecíficas pueden ser debidas a interacciones con algunos de los componentes presentes durante el proceso de selección (plástico, biotina, estreptavidina, etc.) y/o a proteínas de superficie de los fagos.
EJEMPLO 2 Diseño de péptidos en base a la estructura del complejo entre la IL-10 humana
ChIL-IO) y su receptor
En este caso, se desarrollaron inhibidores de la IL-10 humana (hIL-10) teniendo en cuenta la estructura del complejo (hΙL-lO)-(Receptor de hIL-10). En dicha estructura existen dos zonas de alfa hélice en la estructura primaria de la hIL-10 (aminoácidos 19- 35 y aminoácidos 86-110) que están orientadas en forma antiparalela y que podrían ser de relevancia en su interacción con el receptor. Las secuencias de estos péptidos se señalan a continuación: (SEQ ID NO: 28) Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser
Arg Val Lys Thr (aminoácidos 19-35 de hIL-10) (SEQ ID NO: 29) Asp lie Lys Ala His Val Asn Ser Leu GIy GIu Asn Leu
Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg (aminoácidos 86-110 de hIL-10)
En base a estas secuencias, los inventores especularon que los péptidos que se indican a continuación en la Tabla 2 y que tienen una modificación en su extremo C- terminal (dicho extremo está anudado), podrían unirse a zonas de la hIL-10 (o a zonas del receptor de la hIL-10) e impedir la interacción entre la hIL-10 y su receptor. Así, se predijo que los péptidos mostrados en la Tabla 2 e identificados como SEQ ID NO: 30,
SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 se unirían al receptor de la hIL-10 mientras que los péptidos identificados como SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 se unirían a la hIL- 10. Tabla 2 Péptidos predichos como potenciales inhibidores de la hIL-10
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inv: la secuencia del péptido es leída en sentido inverso; y comp: la secuencia tiene residuos que son complementarios, o sea que pueden interactuar positivamente con los residuos de la secuencia pariente.
Así, por ejemplo, el péptido definido como "comp 99-107" (SEQ ID NO: 35) cuya secuencia de aminoácidos es complementaria a la secuencia de aminoácidos del fragmento de la hIL-10 comprendido entre el aminoácido 99 y el aminoácido 107 (péptido 99-107) ya que los aminoácidos Lys y Arg presentes en dicho péptido 99-107 (indicados en negrilla más abajo) podrían interactuar con los aminoácidos Asp (también indicados en negrilla) del péptido predicho y que se ha designado como "comp 99-107":
99- 107 Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg comp 99-107 Asp Thr Leu Asp Leu Asp Leu Asp Asp (SEQ ID NO: 35)
EJEMPLO 3
Inhibición de la actividad biológica in vitro de la IL-IO mediante péptidos en ensayos de proliferación con células MC/9 La línea celular MC/9 (CRL-8306, American Type CeIl Culture (ATCC),
Virginia, Estados Unidos) son mastocitos que derivan del hígado de ratón, crecen en suspensión y su proliferación es inducida por la presencia de IL-IO agregada de forma exógena al medio de cultivo. Por este motivo, la inhibición del efecto de la IL-10 exógena mediante péptidos sintéticos inhibidores de dicha citoquina, reduce el crecimiento de las células MC/9, lo que permite medir in vitro la actividad inhibidora de IL-IO de dichos péptidos. En este ensayo, la proliferación se mide indirectamente como la incorporación de timidina tritiada durante la síntesis de ADN.
Las condiciones más adecuadas para la realización de este ensayo, tanto cuando se desea evaluar la inhibición de la IL-IO humana (hIL-10) como la de la IL-IO de ratón (mIL-10) son las siguientes. Las células MC/9 se añaden a placas de 96 pocilios a una densidad inicial de 20.000 células/pocilio en medio completo: DMEM (BE-12-604F BioWhittaker) con 10% de SFB (10270-106 Gibco), 50 μg/mL de estreptomicina y 50 LVmL de penicilina (15140-122 Gibco), glutamina 2 mM (BE17-605E BioWhittaker) y 2-mercaptoetanol suplementado con 5% de RAT-STIM (354115 Becton Dickinson) junto con 0,5 ng/mL de IL-4 de ratón (Preprotech EC, London, Reino Unido) y 1,25 ng/mL de hIL-10 (e-Bioscience) o de mIL-10 (e-Bioscience) según el caso, y se incuban a 37°C y 5% de CO2, durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, se añade 1 μCi de metil-3 H- timidina (Amersham Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) por pocilio y se incuba la placa 12 horas adicionales en las mismas condiciones. Finalmente, se cosechan las células transfiriéndose la timidina tritiada, incorporada en la síntesis de ADN, a placas (UniFilter-96 GF/C®, Perkin Elmer) y la radiactividad se cuantifica, tras adición de líquido de centelleo, en un contador de centelleo (Top Count, Microplate Scintillation Counter, Packard) y se cuantifica midiendo la emisión de cuentas por minuto (cpm) de cada pocilio. La capacidad de inhibición de los péptidos se determina empleando distintas concentraciones (150, 100 y 50 μg/ml) de cada péptido a ensayar. Las soluciones de péptido se incuban durante 2 horas con 1,25 ng/ml de hIL-10 o de mIL-10 según el caso, y luego se añaden las células MC/9 junto con la IL-4 de ratón, de modo que la concentración final de IL-4 sea de 0,5 ng/ml. El control negativo de proliferación consiste en las células incubadas con la IL-4 de ratón mientras que el control positivo de proliferación consiste en las células incubadas con IL-4 de ratón e IL-10. Como control de la inhibición se emplea un anticuerpo anti-IL-10 humana (e-Bioscience) o anti-IL-10 de ratón (e-Bioscience) según el caso (3 ng/ml). Cada péptido se analiza por triplicado. Los resultados se expresan como el porcentaje de inhibición calculado mediante la siguiente fórmula:
% Inhibición = (cpm máx - cpm exp) / (cpm máx - cpm mín) x 100 donde:
"cpm máx" son las cuentas por minuto máximas; "cpm exp" son las cuentas por minuto experimentales con péptido; y "cpm mín" son las cuentas por minuto básales.
Los péptidos ensayados (Figura 4) fueron obtenidos mediante síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154) utilizando la variante Fmoc de Atherton (Atherton, E., Logan, J. C. and Sheppard, R. C. 1989. Peptide synthesis II. Procedures for solid phase synthesis using N-fluorenyl methoxycarbonyl aminoacids on polyamide supports. Síntesis of substance P and of acyl carrier protein 65-74 decapeptide. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:538). La pureza de los péptidos se determinó mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de fase inversa y/o espectrometría de masas. Sólo aquellos péptidos con una pureza igual o superior al 80% fueron probados en cuanto a su capacidad de inhibir la actividad de la IL-10.
Para poder medir la capacidad de los péptidos de inhibir a la IL-10 es necesario que éstos se encuentren en solución en el medio de cultivo en el que se realiza el ensayo de proliferación con las células MC/9. Para ello, en primer lugar, se intentó disolver los péptidos en medio completo a la concentración de 1 mg/mL. Debido a que, de los 26 péptidos de la Tabla 1, sólo 10 fueron solubles y 2 parcialmente solubles en esas condiciones (Tabla 3), fue necesario mejorar la solubilidad del resto de péptidos adicionando diferentes proporciones de dimetilsulfóxido (DMSO) o bien urea. También se probaron otros agentes solubilizantes, tales como hidrocloruro de guanidina, etanol, metanol, isopropanol, dimetilformamida (DMF), acetona, acetonitrilo, amoníaco y ácido acético, pero debido a que fueron poco eficaces o tóxicos para las células, se descartó su utilización. Con el fin de limitar al máximo la toxicidad del DMSO o de la urea, la concentración de ambos agentes en el medio de cultivo se mantuvo lo más baja posible compatible con el ensayo in vitro. Así, primero se determinó la concentración máxima de agente solubilizante a agregar que permitiera realizar el ensayo de proliferación de las células MC/9 in vitro. Como se indicó más arriba, se probó el ácido acético, amoníaco, DMSO, DMF, acetona, acetonitrilo, isopropanol, metanol y etanol al 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 y 0,001% y urea e hidrocloruro de guanidina al 2, 1, 0,5, 0,250, 0,125, 0,062 y 0,03 I M.
El hidrocloruro de guanidina resultó ser muy tóxico en todas las concentraciones probadas. La concentración final máxima, compatible con el ensayo, de ácido acético, DMSO y DMF fue de 0,01 ó 0,005%, concentraciones que no permiten solubilizar los péptidos. En el caso de la urea, la concentración límite fue de 125 raM, y del amoníaco 0,2% (máximo probado). En cuanto a los alcoholes, fueron compatibles hasta al 1% (máximo) y la acetona y el acetonitrilo parecían inducir la proliferación de las células MC/9. DMSO:
Se probó a resuspender los péptidos identificados como SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 con DMSO (2% del volumen final del stock a 1 mg/mL) y medio limpio. Tras someterlos a sonicación, a excepción del péptido identificado como SEQ ID NO: 16, todos siguieron turbios.
METANOL/ETANOL
Para poder disolver los péptidos empleando estos alcoholes hace falta emplearlos al 100% y a esta concentración son tóxicos para las células MC/9. Son tóxicos incluso al 70%. UREA
Los péptidos identificados como SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20 se disolvieron en urea 8 M (concentración final 0,8 M en 1 mg/mL) y medio completo. La urea es relativamente tóxica (cpm sin urea 1.128, con 120 mM urea 109, con 80 raM 308 y con 20 mM 800, pero la ventana se mantiene).
En la Tabla 3 se resumen las condiciones empleadas para solubilizar los péptidos. Del total de 39 péptidos indicados, 1 1 (en negrilla) no pudieron ser solubilizados con ninguna de las condiciones indicadas por lo que no pudieron ser probados en el ensayo in vitro.
Tabla 3 Condiciones empleadas para solubilizar los péptidos a 1 mg/mL
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En negrilla se indican aquellos péptidos que no pudieron solubilizarse con ninguna de las condiciones probadas, pare S: parcialmente soluble; S: soluble; I: insoluble
La adición de péptidos con capacidad de inhibir la actividad de la IL-10 al cultivo de células MC/9, al que se ha agregado IL-10 exógena, tiene el efecto de inhibir la proliferación de estas células debido a que la IL-10 promueve la proliferación de éstas. Sin embargo, la adición de un péptido o algún componente al cultivo (empleado para mejorar la solubilidad del péptido) que fuera tóxico para las células MC/9, tendría también el efecto de inhibir la proliferación celular. Por este motivo, para asegurarse de que un péptido inhibe realmente la IL-10, y no la proliferación debido a toxicidad sobre las células, es necesario demostrar que el péptido u otro agente que se agregue al cultivo no es tóxico para las células. Para este efecto, se realizó un ensayo en paralelo de los péptidos empleando factor estimulador de colonias de monocitos y granulocitos de ratón (mGM-CSF) (que también promueve la proliferación de las células MC/9) en lugar de IL-10. La concentración de mGM-CSF empleada fue de 0,01 ng/mL. En este caso no se empleó IL-4 como co-estímulo. La toxicidad se expresó como el porcentaje de inhibición de la proliferación inducida por mGM-CSF.
En el caso de los péptidos disueltos en urea, a la hora de analizar tanto la inhibición de la IL-10 como la toxicidad, se incluyeron controles negativos, positivos y con anticuerpo con las concentraciones de urea presentes en las muestras de péptidos (120 mM, 80 mM y 20 mM) así como controles sin urea. El porcentaje de inhibición a cada concentración de péptido se calculó comparando los valores de cpm de la muestra con los valores de los controles que contenían la misma concentración de urea.
Al tomar en cuenta el porcentaje de inhibición de la IL-IO por los péptidos indicados en la Figura 4 [Pl (SEQ ID NO: 1), P2 (SEQ ID NO: 2), P7 (SEQ ID NO: 4), P9 (SEQ ID NO: 6), P 10 (SEQ ID NO: 7), P 13 (SEQ ID NO: 8), P 15 (SEQ ID NO: 10),
P16 (SEQ ID NO: 1 1), P19 (SEQ ID NO: 13), P20 (SEQ ID NO: 14), P22 (SEQ ID
NO: 16), P23 (SEQ ID NO: 17), P23-3 (SEQ ID NO: 43), P23-4 (SEQ ID NO: 44), P24
(SEQ ID NO: 18), P25 (SEQ ID NO: 19), P26 (SEQ ID NO: 20), P31 (SEQ ID NO:
22), P32 (SEQ ID NO: 23), P33 (SEQ ID NO: 24), P34 (SEQ ID NO: 25), P35 (SEQ ID NO: 26), F24 (SEQ ID NO: 30), F25 (SEQ ID NO: 31), F27 (SEQ ID NO: 33), F28
(SEQ ID NO: 34), F29 (SEQ ID NO: 35) y F30 (SEQ ID NO: 36)], conjuntamente con su toxicidad se observa que:
- de los 12 péptidos de la Tabla 3 que fueron solubles o parcialmente solubles en medio completo, los péptidos identificados como P7 (SEQ ID NO: 4), PlO (SEQ ID NO: 7) y P20 (SEQ ID NO: 14) (Figura 4) no presentaron actividad inhibitoria ni de hIL-10 ni de mIL-10 significativa (valores alrededor del 10%-20% de inhibición); el resto de péptidos presentó actividades inhibitorias de IL-IO comprendidas entre el 30% y el 50%, siendo los péptidos identificados como Pl 5 (SEQ ID NO: 10), P19 (SEQ ID NO: 13), P25 (SEQ ID NO: 19) y P34 (SEQ ID NO: 25) los más activos; - en cuanto a los péptidos que fueron disueltos con la ayuda de urea [los péptidos identificados como P9 (SEQ ID NO: 6), P22 (SEQ ID NO: 16), P23 (SEQ ID NO: 17), P23-3 (SEQ ID NO: 43), P23-4 (SEQ ID NO: 44), P24 (SEQ ID NO: 18) y P26 (SEQ ID NO: 20)], los péptidos identificados como P9 (SEQ ID NO: 6) y P22 (SEQ ID NO: 16) resultaron muy activos, con actividades inhibitorias de IL-IO de alrededor del 60%; el resto de péptidos de este grupo no fueron activos, y, los péptidos identificados como P24 (SEQ ID NO: 18) y P26 (SEQ ID NO: 20) fueron parcialmente tóxicos para las células MC/9; y
- en el grupo de los péptidos predichos en base a consideraciones de "complementaridad" con regiones de la secuencia de la IL-IO (Ejemplo 2) [los péptidos identificados como F24 (SEQ ID NO: 30), F25 (SEQ ID NO: 31), F27 (SEQ ID NO: 33), F28 (SEQ ID NO: 34), F29 (SEQ ID NO: 35) y F30 (SEQ ID NO: 36)], los péptidos identificados como F28 (SEQ ID NO: 34), F29 (SEQ ID NO: 35) y F30 (SEQ ID NO: 36) también muestran algo de actividad inhibitoria de IL-IO. EJEMPLO 4
Inhibición de la actividad biológica in vitro de las células T reguladoras Karpas mediante péptidos con capacidad de unión a la IL-IO en ensayos de inhibición de la respuesta mixta linfocitaria (MLR)
Recientemente se ha descrito en la literatura la existencia de la línea celular Karpas 299 (DSMZ ACC 31), derivada de un linfoma humano, con perfil de células T reguladoras y productoras de IL-IO. Con estas células se realizó un ensayo de "reacción mixta linfocitaria" o MLR. Esta técnica se basa en la producción de IFN-γ en el co- cultivo de linfocitos de diferente origen, con histocompatibilidades diferentes, que se reconocerán entre sí como extraños. Esta reacción hace que los linfocitos proliferen secretando citoquinas, entre ellas el IFN-γ. Para este ensayo se cultivaron, en placa de 96 pocilios, 100.000 células de cada donante (control positivo de la MLR) solas o con cantidades crecientes de células Karpas 299 (0-100.000 Karpas 299). Para medir la actividad de los péptidos, se añadieron 100 μg/mL de cada péptido por pocilio. A las 48 horas se retiraron alícuotas de los sobrenadantes para medir el IFN-γ. No fue posible medir, en este caso, la proliferación celular debido a que la existencia de la línea celular Karpas 299 enmascara cualquier posible efecto en la proliferación de la MLR. Los resultados de la medida del IFN-γ se muestran en la Figura 5. En este ensayo destacaron como inhibidores de la actividad de la IL-10 los péptidos Pl (SEQ ID NO: 1), P13 (SEQ ID NO: 8), Pl 5 (SEQ ID NO: 10), P19 (SEQ ID NO: 13), P20 (SEQ ID NO: 14), F24 (SEQ ID NO: 30), F25 (SEQ ID NO: 31), F28 (SEQ ID NO: 34) y F29 (SEQ ID NO: 35).
EJEMPLO 5
Efecto de los péptidos con capacidad de unión a la IL-IO ÍP9 (SEO ID NO: 6) y P13
(SEO ID NO: 8)1 sobre la inducción de respuestas ThI in vitro tras la inmunización con determinantes ThO. mediante cuantificaeión de interferón-gamma (IFN-y) producido en sobrenadantes tras la re-estimulación in vitro de linfocitos La inducción de respuestas del sistema inmunitario mediante péptidos
(antígenos) genera perfiles de citoquinas concretos en función de las características de la secuencia. Los péptidos determinates "helper" inducen respuestas ThO que derivan en un perfil ThI (respuesta citotóxica) o Th2 (respuesta humoral), cada uno caracterizado por su perfil concreto de citoquinas. Un perfil Th2 óptimo (definido por la presencia de IL-4) está favorecido por la presencia de IL-IO que inhibe el perfil ThI y dirige la respuesta inmunitaria hacia un perfil Th2. En este contexto, el tratamiento con inhibidores de IL-10 durante la inducción de respuesta tipo ThO, tendría un efecto inductor de citoquinas de perfil ThI (IFN-γ).
Para este estudio se han escogido como determinantes ThO, 6 péptidos optimizados, 3 derivados de la ovoalbúmina (OVA) y 3 de la mioglobina (MIO) de cachalote (FISEA) (Tabla 4).
Tabla 4 Péptidos derivados de OVA y de FISEA determinantes ThO
Figure imgf000035_0001
Los péptidos inhibidores de IL-IO utilizados para llevar a cabo este ensayo fueron los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6), insoluble, y Pl 3 (SEQ ID NO: 8), soluble. Brevemente, se inmunizaron subcutáneamente ratones hembra BALB/c de 4 a 6 semanas con 200 μL de una emulsión 1 :1 de adyuvante incompleto de Freund y una solución acuosa que contiene 50 nmoles del correspondiente péptido determinante ThO. Diez días después de la inmunización, se sacrificaron los animales y se les extrajeron los nodulos linfáticos poplietales inguinales, periaórticos, así como los bazos. Los linfocitos extraídos fueron cultivados durante 48 horas en una placa de 96 pocilios de fondo en U, en presencia o ausencia del péptido utilizado en la inmunización a una concentración de 30 mg/ml, y en presencia o ausencia de los péptidos inhibidores de IL- 10 [P9 (50 mg/ml) y P13 (100 mg/ml)] en un volumen final de 200 μl de medio completo (MC; RPMI 1640, SFB 10%; glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina; 100 μg/mL de estreptomicina; 5x105 M de 2 β-mercaptoetanol; Hepes 25 mM y 0,5% (v/v) de piruvato sódico). Tras 48 horas de cultivo a 37°C y con 5% de CO2 se recogieron 100 μL de sobrenadante por pocilio (50 μL para cuantificar IFN-γ + 50 μL para cuantificar IL-IO). Los sobrenadantes se congelaron a una temperatura de -200C hasta la determinación de las citoquinas mediante la técnica ELISA.
En este ensayo, se ha encontrado que los linfocitos procedentes de aquellos animales inmunizados con el péptido FISEA G (SEQ ID NO: 38), tras ser re- estimulados in vitro con ese péptido, produjeron los mayores niveles de IFN-γ respecto al resto de los péptidos probados (Figura 6). Además, esos niveles de IFN-γ se incrementaban claramente en presencia de los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y Pl 3 (SEQ ID NO: 8) por un mecanismo compatible con la inhibición de IL-IO (Figura 6). De hecho, ese péptido [FISEA G (SEQ ID NO: 38)] ha sido el único que ha inducido niveles detectables de IL-IO (70 pg/mL) en los sobrenadantes.
EJEMPLO 6
Efecto de los péptidos con capacidad de unión a la IL-IO ÍP9 (SEO ID NO: 6) v P13 (SEO ID NO: 8)1 sobre Ia inducción de respuestas antitumorales tras la inoculación subcutánea de células CT26
La IL-IO es una citoquina de potente efecto inmunosupresor relacionada con el crecimiento tumoral. Es, por tanto, una citoquina generada por muchos tumores como mecanismo para evitar una respuesta inmunológica eficaz. En este ejemplo se ha probado el efecto de los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y
Pl 3 (SEQ ID NO: 8) en un modelo de crecimiento tumoral tras la inoculación subcutánea de células CT26 [una línea celular de adenocarcinoma de colon de ratón (Fearon, E.R., Vogelstein, B. 1990. A genetic model for colorectal tumorigenesis. CeIl 61:759], en presencia o ausencia de inmunoterapia intratumoral con adyuvantes: ácido poliinosínico-policitidílico (poli I:C) y un anticuerpo agonista anti-CD40 para la activación de células dendríticas, NK y linfocitos T, y posterior inducción de una respuesta citotóxica antitumoral.
En este ensayo se desafiaron ratones Balb/C con 5 x 105 células tumorales CT26 inoculadas subcutáneamente con 200 μL de PBS, divididos en 4 grupos: (1) Grupo control: ratones inoculados con células CT26.
(2) Grupo adyuvantes: ratones tratados con 50 μg de poliLC y 50 μg anti-CD40 por vía intratumoral en 100 μL de PBS a días 0, 7 y 14. (3) Grupo inhibidores: ratones tratados sólo con inhibidores de IL-IO, 50 μg de P9 (SEQ ID NO: 6) por vía intratumoral y 50 μg de Pl 3 (SEQ ID NO: 8) por vía intraperitoneal por ratón, tres veces por semana en PBS, durante 3 semanas.
(4) Grupo completo: ratones tratados con los adyuvantes más los inhibidores de IL-IO.
Se consideró día "0" cuando el tumor alcanzó un diámetro de 5-6 mm.
El tratamiento con los péptidos inhibidores de IL-IO fue capaz de proteger a un 6,6% de los animales y de generar un retraso considerable en el crecimiento tumoral (Figura 7). Los adyuvantes protegieron a un 53% de los animales y redujeron drásticamente el promedio de crecimiento tumoral (Figura 7). La combinación de adyuvantes e inhibidores de IL-10 retrasó ligeramente el promedio de crecimiento tumoral respecto al grupo tratado sólo con adyuvantes (Figura 7), pero aumentó el porcentaje de protección frente al tumor hasta un 76,6%.
Este ejemplo evidencia la aplicabilidad de péptidos inhibidores de IL-10 en el contexto de la inmunosupresión que media este factor en el desarrollo tumoral.
EJEMPLO 7 Interacción biomolecular entre la IL-IO humana y los péptidos con capacidad de unión a la IL-IO IP9 (SEO ID NO: 6) v P13 TSEO ID NO: 8)1 v sus derivados determinada mediante análisis de resonancia de plasmones de superficiel
Mediante un análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR), se midió la interacción biomolecular entre la IL-IO humana y los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y Pl 3 (SEQ ID NO: 8), así como de las siguientes formas truncadas y/o modificadas de P9: Tabla 5
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
*) Nomenclatura de aminoácidos en código de una letra
Como puede apreciarse en la Tabla 5: el péptido SEQ ID NO: 45 [P9(2-15)] es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 2- 15 del péptido P9 (SEQ ID NO: 6); el péptido SEQ ID NO: 46 [P9(l-14)] es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 1-14 del péptido P9 (SEQ ID NO: 6); el péptido SEQ ID NO: 47 [P9(l-13)] es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 1-13 del péptido P9 (SEQ ID NO: 6); el péptido SEQ ID NO: 48 [P9(2-14)] es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 2-14 del péptido P9 (SEQ ID NO: 6); el péptido SEQ ID NO: 49 [P9(2-13)] es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 2-13 del péptido P9 (SEQ ID NO: 6); el péptido SEQ ID NO: 50 [P9(3-14)] es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 3-14 del péptido P9 (SEQ ID NO: 6); el péptido SEQ ID NO: 51 [P9(15 AIa)] es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos del péptido P9 (SEQ ID NO: 6) en el que se ha reemplazado el aminoácido presente en la posición 15 (Phe) por una Ala; el péptido SEQ ID NO: 52 [P9(14 AIa)] es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos del péptido P9 (SEQ ID NO: 6) en el que se ha reemplazado el aminoácido presente en la posición 14 (Val) por una Ala; y el péptido SEQ ID NO: 53 [(1-13; 1 Ser)] es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 1-13 del péptido P9 (SEQ ID NO: 6) y en el que el aminoácido presente en la posición 13 (Ala) ha sido reemplazado por una Ser. Para realizar este ensayo se utilizó el Biosensor BIAcore X (BIAcore, AB,
Uppsala, Suecia). Brevemente, la proteína IL-IO recombinante humana (R & D
Systems, cat N0 217-IL/CF) fue inmovilizada covalentemente en la superficie de la celda de flujo 2 (FC2) de un chip CM5 (BIAcore) tal como se describe en De Crescenzo et al. 2001 (JBC, VoI 276; 29632-29643). La celda de flujo 1 (FCl), en cuya superficie no se inmoviliza IL-IO, se usó como celda de flujo de referencia. Las soluciones de péptido (10 μM) fueron inyectadas al menos 2 veces en un tampón Hepes 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween 20 (Polioxietilen-Sorbitan Monolaurato) 0,005% a un flujo de 30 μl/min. Las curvas de unión fueron procesadas mediante la sustracción de la respuesta en FCl de la obtenida en FC2. La respuesta en equilibrio fue comparada entre el péptido problema y un péptido control irrelevante de la misma longitud. El péptido control utilizado fue el péptido P301 (SEQ ID NO: 54) (derivado de la envuelta del HIV- 1, gpl20 (301-315): NNTRKRIRIQRGPGR). Cada respuesta fue multiplicada por un factor de corrección de masa: MW(PX)/MW(P), donde MW(PX) es el peso molecular del péptido P problema y MW(P) el del péptido control (P301). Se observó que los distintos péptidos probados daban una señal positiva, lo que ponía de manifiesto su capacidad de unirse específicamente a la IL- 10.
La Figura 8 muestra un ejemplo del perfil de la interacción biomolecular, obtenido mediante un análisis de SPR, que se produce entre la IL-10 y el péptido P9 (SEQ ID NO: 6), así como el obtenido con el péptido control [P301 (SEQ ID NO: 54)]. En la Figura 9 se muestran los resultados obtenidos de la interacción biomolecular, medida mediante un análisis de SPR, que se produce entre la IL-10 y los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6), P13 (SEQ ID NO: 8) y sus formas truncadas y/o modificadas: P9(2-15) (SEQ ID NO: 45), P9(l-14) (SEQ ID NO: 46), P9(l-13) (SEQ ID NO: 47), P9(2-14) (SEQ ID NO: 48), P9(2-13) (SEQ ID NO: 49), P9(3-14) (SEQ ID NO: 50), P9(15 Ala) (SEQ ID NO: 51), P9(l4 Ala) (SEQ ID NO: 52), P9(l-13; 1 Ser) (SEQ ID NO: 53).
En general, se encontró una buena interacción entre IL-IO y los péptidos ensayados. Al analizar los péptidos derivados de P9 (SEQ ID NO: 6), se observó que la modificación de algún aminoácido en el extremo carboxilo terminal no afectaba a su capacidad de unión a la IL-IO; sin embargo, en el caso de los péptidos truncados en su extremo amino o carboxilo terminal se encontró una mejora en la capacidad de unión del péptido a la IL-IO.
EJEMPLO 8
Efecto inhibidor de los péptidos P9 (SEO ID NO: 6) v P13 (SEO ID NO; 8) con capacidad de unión a la IL-IO sobre la fosforilación del factor de transcripción STAT3 inducida por la unión de IL-IO a su receptor de membrana
La actividad de la IL-IO es mediada por la unión a un receptor específico de membrana, IL-IOR, que es expresado en una gran variedad de células inmunes. La interacción IL- 10/IL- 1 OR atrae y capta a 2 kinasas (Jakl y Tyk2), que fosforilan y activan al factor de transcripción STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3), que se encuentra en forma inactiva en el citoplasma y es esencial para todas las funciones conocidas de la IL-IO (Donnelly et al., Journal of Interferon & Cytokine Research. June 1, 1999, 19(6): 563-573).
Se ha probado la capacidad de los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y P13 (SEQ ID NO: 8) con capacidad de unión a la IL-IO para inhibir la fosforilación de STAT3 inducida por IL-IO. El ensayo se llevó a cabo utilizando células MC/9 (CRL-8306, American Type CeIl Culture (ATCC), Virginia, Estados Unidos) que responden a IL-IO tanto humana como murina. En una placa de 96 pocilios con fondo en U (TPP, 92097) y antes de entrar en contacto con las células se incubaron los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y P13 (SEQ ID NO: 8), a una concentración de 50 μg/ml, con una concentración de 0,15 ng/ml de IL-IO durante dos horas a 37°C y 5% de CO2 en un volumen de 100 μl de medio completo (RPMI 1640, suero fetal bovino (SFB) 10%; glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina; 100 μg/mL de estreptomicina; 5x105 M de β-mercaptoetanol; Hepes 25 mM y 0,5% (v/v) de piruvato sódico). A continuación, se añadieron 2 x 105 células/pocilio y se incubaron durante otras dos horas a 37°C y 5% de CO2 en un volumen final de 200 μl/pocillo. Tras centrifugar las células a 1.500 rpm durante 5 minutos y desechar el sobrenadante, se resuspendió el pellet en 150 mi de tampón de carga para electroforesis (10% glicerol, 5% 2-mercaptoetanol, 2% dodecil sulfato de sodio, Tris-HCl 62,5 mM [pH 6,8], 0,006% azul de bromofenol) y se congelaron las muestras a -800C. A partir de estas muestras se realizó un Western Blot para determinar la cantidad de STAT-3 fosforilada en las distintas condiciones ensayadas, incluyendo un control negativo (sólo células) y un control positivo (células + IL-10). Como control del análisis también se determinó la cantidad de actina en cada muestra. Las bandas obtenidas en el Western Blot fueron analizadas en un densitómetro para cuantificar el contenido de cada una de ellas. Las lecturas del densitómetro obtenidas para cada muestra fueron corregidas con el correspondiente control de actina.
La Figura 10 muestra el efecto inhibidor de los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y P13 (SEQ ID NO: 8) sobre la fosforilación de STAT3 inducida por IL-10. La expresión de STAT3 -fosforilada se analizó mediante Western Blot (Figura 10A). En la Figura 10B se representa el cociente entre el contenido de las bandas de STAT3-fosforilada, cuantificadas mediante densitometría, y el obtenido en el control de actina para cada muestra.
EJEMPLO 9 Efecto de los péptidos inhibidores de IL-IO en ensayos de proliferación con células tumorales B16-F10
El efecto inmunosupresor de la IL-IO se ha relacionado con el crecimiento tumoral, siendo ésta una citoquina generada por muchos tumores para evadir una respuesta inmunológica eficaz. De hecho, ciertas líneas tumorales secretan de forma constitutiva IL-10, que resulta esencial para la proliferación de las células malignas habiéndose demostrado que su neutralización disminuye su crecimiento. Este es el caso de la línea tumoral de melanoma murino B16-F10 (B 16) que secreta considerables cantidades de IL-10 y cuya proliferación se ve inhibida en presencia de un anticuerpo neutralizante de IL-10. En este ensayo se ha probado la actividad de péptidos inhibidores de la IL-10 sobre la proliferación de las células Bl 6 que precisan de esta citoquina para su crecimiento. Para llevar a cabo el ensayo se cultivaron en una placa de 96 pocilios (Tissue Culture Píate, 96 W, Fiat Bottom, with Lid, Sterile, CELLSTAR N°655180) 5.000 células por pocilio en medio RPMI suplementado con SFB al 2%, en presencia o ausencia de los péptidos: P9 (SEQ ID NO: 6), P13 (SEQ ID NO: 8), P15 (SEQ ID NO: 10), P16 (SEQ ID NO: 11), P31 (SEQ ID NO: 22) y P34 (SEQ ID NO: 25); como control negativo se utilizó el péptido P301 (SEQ ID NO: 54). La concentración de péptido ensayada fue 200 μg/ml. Las células se incubaron así durante 24 horas a 37°C y 5% de CO2. Transcurrido ese tiempo las células fueron teñidas con cristal violeta y la cuantificación del colorante se llevó a cabo mediante lavado con ácido acético al 10% y medida en el lector de ELISA a 570 nm. Todos los péptidos fueron probados a una concentración de 200 μg/ml. Los resultados obtenidos se recogen en la Figura 11 y corresponden a la media y desviaciones dé dos ensayos realizados por triplicado.
EJEMPLO 10
Efecto del péptido P13 (SEO ID NO: 8) sobre la actividad inhibidora de la proteína de la nucleocápside del virus de la hepatitis C (HCV core) en la producción de
IFN- α en un cultivo de células mononucleares de sangre periférica La producción de IFN-α por las células dendríticas plasmacitoides (pDCs) es crítica en la respuesta inmune antiviral. En el caso del virus de la hepatitis C (HCV), que tiene una alta tendencia a la cronicidad, uno de los mecanismos de escape a esta repuesta podría estar mediada por la activación de los monocitos tras su unión con la proteína HCV core a través del receptor TLR2 (del inglés, Toll-Like Receptor 2), lo que estimula la producción de citoquinas tales como IL-IO, que a su vez inhiben la producción de IFN-α por parte de las pDCs (Dolganiuc et al., The Journal of Immunology, 2006, 177:6758-6768). La estimulación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con un ligando de TLR9 induce la producción de IFN-α por parte de las pDCs y la presencia de HCV core inhibe la producción de IFN-α. Esta inhibición está mediada, al menos en parte, por la producción de IL-10 por los monocitos, por lo que se decidió probar el efecto de los péptidos con capacidad de unión a la IL-10 proporcionados por esta invención en este sistema. Para ello, se obtuvieron muestras de sangre de distintos donantes sanos, a partir de las cuales se aislaron los PBMCs mediante gradiente de Ficoll (GE Healthcare, 17-1440-03). En una placa de 96 pocilios con fondo en U (TPP, 92097) y añadiendo 2 x 105 células por pocilio, se incubaron las células en medio RPMI suplementado con SFB 10% junto con el ligando de TLR9 CpG (Genosys, ODN2216) a una concentración de 5 μg/ml, HCV core recombinante (BioDesign, R8A115) a una concentración de 2,5 μg/ml y el péptido P13 (SEQ ID NO: 8). Como control positivo se utilizó un anticuerpo anti-IL-10 (eBioscience, 16-7108-81) a una concentración de 1 μg/ml. Se incubaron las células durante 48 horas a 37°C y CO2 al 5%. Transcurrido ese tiempo se recogieron sobrenadantes de cada pocilio y se midió la producción de IFN-α mediante la técnica de ELISA, utilizando un kit comercial (MabTech, 3424- 1H-6). La Figura 12 muestra en un diagrama de barras el efecto del péptido Pl 3 (SEQ
ID NO: 8) sobre la producción de IFN-α en un cultivo de PBMCs estimulado con CpG y en presencia de HCV core, tal como se ha descrito previamente. Los resultados mostrados son representativos de cuatro experimentos con resultados similares.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un péptido con capacidad de unirse a IL-IO seleccionado entre: a) un péptido cuya secuencia de aminoácidos se selecciona entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, b) una variante de un péptido definido en a); y c) un fragmento de un péptido definido en a) o de una variante definida en b), que comprende entre 5 y 15 aminoácidos consecutivos; y sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. Péptido según la reivindicación 1, seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados como SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
3. Péptido según la reivindicación 1, en el que dicho péptido tiene la capacidad de inhibir la actividad biológica de IL-IO in vitro y/o in vivo.
4. Péptido según la reivindicación 3, seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID
NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 25, una variante o un fragmento de los mismos, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Una construcción génica que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 5.
7. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 5, o una construcción génica según la reivindicación 6.
8. Una célula hospedadora que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 5, o una construcción génica según la reivindicación 6, o un vector según la reivindicación 7.
9. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable; o una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 5, o una construcción génica según la reivindicación 6, o un vector según la reivindicación 7, o una célula hospedadora según la reivindicación 8, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, que comprende, al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, junto con, opcionalmente, uno o más, compuestos inhibidores de IL-10 diferentes.
11. Un producto seleccionado entre un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 5, una construcción génica según la reivindicación 6, un vector según la reivindicación 7, y una célula hospedadora según la reivindicación 8, para el tratamiento de una condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10.
12. Producto según la reivindicación 11, para el tratamiento de una condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10 que comprende condiciones clínicas o alteraciones patológicas en las que la respuesta celular ThI se encuentra inhibida.
13. Producto según la reivindicación 11, para el tratamiento de una condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-IO seleccionada entre una enfermedad infecciosa, un tumor, un cáncer y una situación de daño agudo.
14. Producto según la reivindicación 13, para el tratamiento de una infección causada por Mycobacterium leprae, Mycobasterium tuberculosis, Yersinia pestis, Helicobacter pylori, Candida albicans, Trichophyton rubrum, Aspergillium sp., o por Plasmodium falciparum, leishmaniasis, toxoplasmosis; o para el tratamiento de un linfoma de Hodgkin, cáncer de cuello y cabeza, melanoma, o basoliomas y espinoliomas desarrollados a partir de queratinocitos mutados por radiación UV; o para el tratamiento de quemaduras y sepsis asociada.
15. Un procedimiento para producir un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende crecer una célula hospedadora según la reivindicación 8, bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido, y, si se desea, recuperar dicho péptido.
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