KR20230005241A - mRNA 치료 나노입자 - Google Patents

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KR20230005241A
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KR
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mrna
tumor
delivery vehicle
encoding
immunomodulatory agent
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Application number
KR1020227040475A
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사무엘 도이치
니콜 페이
다니엘 프리만손
올레 하베스
콜린 맥킨레이
Original Assignee
넛크래커 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

mRNA 치료 나노입자의 예 및 환자를 치료하기 위해 이들을 사용하는 방법이 본원에 제공된다. mRNA 치료 나노입자는 종양-특이적 항원 및 면역조절제를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA; 및 하나 이상의 mRNA를 캡슐화하는 전달 비히클 분자를 포함할 수 있다.

Description

mRNA 치료 나노입자
관련 출원에 대한 교차 참조
[0001] 본 특허는 "MRNA THERAPIES"를 제목으로 하고 2020년 4월 22일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/014,074호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
참조에 의한 포함
[0002] 본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
[0003] mRNA-기반 백신은 DNA 백신으로부터의 유전체 통합의 잠재적 위험 또는 펩티드 백신으로부터의 항원 선택의 제한 없이 강력한 항암 면역을 촉발시키는 이점이 있다. 불행히도, 통상적인 mRNA 백신은 항원-제시 세포에 의해 효과적으로 내재화되지 않으며, 혈장 및 조직 효소에 의한 분해로부터 mRNA 분자에 대한 충분한 보호를 제공하지 않을 수 있다. mRNA는 항체 유전자 전달을 위한 신흥 플랫폼이지만, mRNA 기반 mAb의 추가 개발은 안전하고 효과적인 전달 시스템의 필요성에 의해 제한된다.
[0004] 또한, mRNA는 단지 자연적인 번역 후 변형을 갖는 Ab를 유도할 수 있으며, 이는 (예를 들어, PEG화에 의한) 혈청 반감기를 증가시키기 위한 컨쥬게이트 및 변형이 mRNA에 의해 인코딩된 Ab에 대해 통상적으로 가능하지 않음을 의미한다. 수동 면역화의 경우, 매우 높은 안전성 프로파일이 요구된다. 지난 수십 년 동안, 세포 RNA 센서에 의해 유도된 원치 않는 면역 활성화 및 사이토카인 유도를 피하기 위해 IVT mRNA에 대해 상이한 최적화가 설명되었다. IVT mRNA에 대한 상기 설명된 적응에도 불구하고, ADA(항-약물 항체) 반응 및 일시적인 사이토카인의 출현은, 특히 mRNA가 여러 번 투여되어야 하는 경우, 일부 예에서 보체 활성화-관련 위알레르기(CARPA)의 유도로 이어지는 것과 같이 mRNA-약물의 임상 적용성을 방해하였다.
[0005] 이러한 문제를 해결할 수 있는 방법 및 조성물(키트 포함)이 본원에 설명된다. 암을 치료하는 방법, 및 특히, mRNA (치료) 나노입자를 제조하는 방법, 이러한 mRNA 나노입자(예를 들어, mRNA 백신 포함)를 사용하여 환자를 치료하는 방법의 예가 본원에 제공된다. 특히, 이를 필요로 하는 환자에게 투여되는 mRNA 치료제가 본원에 설명된다. 환자는 포유동물, 예를 들어, 인간일 수 있다. 환자는 본원에 설명된 종양 중 임의의 것(또는 일부 경우에 암)을 가질 수 있고, 따라서 일부 경우에는 본원에 설명된 요법 또는 치료를 필요로 할 수 있다. mRNA 요법은 (환자 또는 환자의 부위에) mRNA(치료) 나노입자, 예를 들어, 하나 이상의 환자-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 투여하는 것, 뿐만 아니라 환자-특이적 mRNA 치료제를 만들기 위한 장치 및 방법을 포함한다.
[0006] 특히, mRNA 백신을 포함하는 mRNA 치료, 이러한 mRNA 치료를 사용하여 본원에서 양성이 아닌 종양, 또는 양성 또는 암성일 수 있는 종양을 지칭하는 암을 치료하기 위한 방법, 및 이러한 mRNA 치료를 형성하는 방법이 본원에 설명된다. 예를 들어, 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 치료 나노입자, 및 면역조절제를 인코딩하는 mRNA의 종양 내 주사를 포함하는 방법이 본원에 설명되고, 여기서 종양-특이적 항원 및 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 전달 비히클 분자, 예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드에 의해 함께 캡슐화된다. 주사는 종양 내일 수 있지만, 본원의 일부 예에서 제공되는 바와 같이, 다른 투여 경로가 또한 가능하다.
[0007] 본원에 설명된 방법 중 임의의 방법은 암을 치료하는(예를 들어, 종양을 감소시키거나 일부 경우에 제거하는) 방법을 포함하는 치료 방법일 수 있다.
[0008] 본원에 설명된 방법은 종양-특이적 항원 및 면역조절제를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA; 및 하나 이상의 mRNA를 캡슐화하는 전달 비히클 분자를 포함하는 mRNA 치료 나노입자를 주사하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 종양-특이적 항원 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA; 및 하나 이상의 mRNA를 캡슐화하는 전달 비히클 분자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 방법은 종양-특이적 항원 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA(여기서, 적어도 하나 이상의 면역조절제는 체크포인트 억제제임); 및 하나 이상의 mRNA를 캡슐화하는 전달 비히클 분자를 포함하는 mRNA 치료 나노입자를 종양 내 주사하는 것을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 방법은 종양-특이적 항원, 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA; 및 하나 이상의 mRNA를 캡슐화하는 전달 비히클 분자를 포함하는 mRNA 치료 나노입자를 종양 내 주사하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 전달 비히클 분자는 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클을 포함한다.
[0009] 예를 들어, 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA(예를 들어, mRNA 백신) 및 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 치료 나노입자를 주사하는 것을 포함하는 방법이 본원에 설명되고, 여기서 종양-특이적 항원 및 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 동일한 전달 비히클 분자로 캡슐화된다. 예를 들어, 상기 방법은 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 치료 나노입자를 종양 내 주사하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 mRNA 백신 및 면역조절제는 동일한 나노입자 전달로 캡슐화된다.
[0010] 상기 방법은 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA(예를 들어, mRNA 백신) 및 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 치료 나노입자를 종양 내 주사하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 2개 이상의 면역조절제 중 적어도 하나는 체크포인트 억제제이고, 추가로, 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 및 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 동일한 전달 비히클 분자로 캡슐화된다.
[0011] 일부 변형에서, 상기 방법은 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA(예를 들어, mRNA 백신) 및 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 치료 나노입자를 종양 내 주사하는 것을 포함하며, 여기서 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 및 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클을 포함하는 전달 비히클 분자로 캡슐화된다.
[0012] 이러한 방법 또는 조성물(예를 들어, mRNA 치료제) 중 임의의 것은 하나 이상의 면역조절제 siRNA를 포함하는 하나 이상의 siRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA, 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA, 및 하나 이상의 면역조절 siRNA를 포함하는 mRNA 치료 나노입자를 종양 내 주사하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA, 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA 및 하나 이상의 siRNA는 동일한 전달 비히클 분자로 캡슐화된다.
[0013] 임의의 적절한 전달 비히클이 사용될 수 있다. 예를 들어, 전달 비히클 분자는 지질 기반 비히클(예를 들어, 지질 나노입자) 또는 중합체-기반 나노입자일 수 있다. 특히, 전달 비히클(DV) 분자는 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클일 수 있다. 이러한 방법 중 임의의 방법에서, 전달 비히클 분자는 아미노-지질화된 펩토이드를 포함할 수 있다. 일 예에서, 전달 비히클 분자는 적어도 하나의 펩토이드를 포함하며, 이는 본원에 설명된 임의의 유형의 펩토이드일 수 있다. 또 다른 예에서, 전달 비히클 분자는 하나 초과의 펩토이드를 포함하며, 이는 본원에 설명된 임의의 유형의 펩토이드일 수 있다.
[0014] 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA는 환자-특이적 항원(또는 다수의 환자-특이적 항원)을 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, mRNA 치료(예를 들어, mRNA 백신)는 복수의 환자-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA는 공유된 종양 항원을 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다.
[0015] 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 체크포인트 억제제, 면역억제 길항제, 염증촉진성 제제, 또는 이들의 조합을 인코딩한다. 예를 들어, 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 항-CTLA-4를 인코딩한다. 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 TGF-베타 길항제를 인코딩할 수 있다. 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 단일 사슬 인터루킨-12(IL-12)를 인코딩할 수 있다.
[0016] mRNA 치료제 및 이들을 제조하거나 사용하는 방법 중 임의의 것은 mRNA 치료에 포함될 수 있는 하나 이상의 애쥬번트의 첨가를 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 전달 비히클 분자는 추가의 애쥬번트와 혼합되고/되거나, 이를 포함하고/하거나 이를 캡슐화할 수 있다. 일부 변형에서, 추가의 애쥬번트는 치료 mRNA(예를 들어, 종양-특이적 mRNA 및 하나 이상의 면역조절제 mRNA)를 캡슐화하는 나노입자를 포함하는 용액과 조합될 수 있다. 예를 들어, 이들 mRNA 치료제 중 임의의 것은 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역자극제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
[0017] 사용시, 이들 방법 중 임의의 것은 치료 사이에 1-7일의 대기와 함께 주사 치료를 1회 이상 반복하는 것을 포함할 수 있다. 언급된 바와 같이, 주사는 종양 내일 수 있다(비제한적으로). 일부 변형에서, 주사는 종양 내 및/또는 다른 수단(피하 등) 둘 모두에 의해 이루어질 수 있다.
[0018] 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 및 면역조절제(들)를 인코딩하는 mRNA는 단일 mRNA 가닥 상에, 또는 별도의 mRNA 가닥 상에 있을 수 있다.
[0019] 일반적으로, 이러한 방법은, 예를 들어, 종양 크기를 감소시키기 위해 종양을 치료하는 방법일 수 있다. 종양은 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 초과, 약 15% 초과, 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과 등만큼 감소될 수 있다.
[0020] 임의의 적절한 암 또는 종양은 본원에 설명된 바와 같이 치료될 수 있다. 예를 들어, 이들 방법은 림프종을 치료하는 방법일 수 있다. 본원에 설명된 방법은 자궁경부암을 치료하는 방법일 수 있다.
[0021] 또한, mRNA 치료 나노입자(예를 들어, mRNA 백신 나노입자)를 포함하는 mRNA 치료제가 본원에 설명된다. 일반적으로, mRNA 치료 나노입자는 종양-특이적 항원 및 면역조절제를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA; 및 전달 비히클 분자를 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 mRNA는 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화된다. mRNA 치료 나노입자는 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA(예를 들어, mRNA 백신); 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 캡슐화하는 전달 비히클 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, mRNA 백신 나노입자는 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA; 체크포인트 억제제를 포함하는 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 제2 면역조절제를 인코딩하는 제3 mRNA; 및 제1 mRNA, 제2 mRNA 및 제3 mRNA를 캡슐화하는 전달 비히클 분자를 포함할 수 있다.
[0022] mRNA 치료 나노입자는 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA; 체크포인트 억제제를 포함하는 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 제2 면역조절제를 인코딩하는 제3 mRNA; 및 제1 mRNA, 제2 mRNA 및 제3 mRNA를 캡슐화하는 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클을 포함하는 전달 비히클 분자를 포함할 수 있다.
[0023] 이러한 mRNA 치료 백신 중 임의의 것은 면역조절 siRNA를 포함하는 하나 이상의 siRNA를 포함할 수 있다.
[0024] 상기 언급된 바와 같이, 임의의 적절한 전달 비히클 분자가 사용될 수 있다. 예를 들어, 전달 비히클 분자는 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클을 포함할 수 있다.
[0025] 제1 mRNA는 환자-특이적 항원을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 제1 mRNA는 복수의 환자-특이적 항원을 인코딩할 수 있다. 제1 mRNA는 공유된 종양 항원을 인코딩할 수 있다. 제2 mRNA는 체크포인트 억제제, 면역억제 길항제, 염증촉진성 제제, 또는 이들의 조합을 인코딩할 수 있다. 제2 mRNA는 항-CTLA-4를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 제2 mRNA는 항-CTLA-4를 인코딩할 수 있고, 이는 SEQ ID No: 1 또는 SEQ ID NO: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 50%(예를 들어, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 그 초과) 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 예에서, 제2 mRNA는 SEQ ID No: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 폴리펩티드 서열과 적어도 약 50%(예를 들어, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 그 초과) 동일한 항-CTLA-4를 인코딩할 수 있다. 제2 mRNA는 TNFSF14(종양 괴사 인자 수용체 상과 구성원 14 아이소형1 전구체, 또는 LIGHT)를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 제2 mRNA는 TNFSF14를 인코딩할 수 있고, 이는 SEQ ID No: 11의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 50%(예를 들어, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 그 초과) 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 예에서, 제2 mRNA는 SEQ ID No: 12의 폴리펩티드 서열과 적어도 약 50%(예를 들어, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 그 초과) 동일한 TNFSF14를 인코딩할 수 있다. 제3 mRNA는 TGF-베타 길항제를 인코딩할 수 있다. 제3 mRNA는 TGF-베타 길항제를 인코딩할 수 있고, 이는 SEQ ID No: 7 또는 SEQ ID NO: 9의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 50%(예를 들어, 적어도 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 그 초과) 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 제3 mRNA는 SEQ ID No: 8 또는 SEQ ID NO: 10의 폴리펩티드 서열과 적어도 약 50%(예를 들어, 적어도 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 그 초과) 동일한 TGF-베타 길항제를 인코딩할 수 있다. 제3 mRNA는 단일 사슬 인터루킨-12를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 제3 mRNA는 단일 사슬 인터루킨-12를 인코딩할 수 있고, 이는 SEQ ID No: 5의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 50%(예를 들어, 적어도 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 그 초과) 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 제3 mRNA는 SEQ ID No: 6의 폴리펩티드 서열과 적어도 약 50%(예를 들어, 적어도 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 그 초과) 동일한 단일 사슬 인터루킨-12를 인코딩할 수 있다.
[0026] mRNA 치료 나노입자는 mRNA 치료 나노입자에 이미 있는 다른 면역조절제와 상이한 또 다른 면역조절제를 인코딩하는 추가적인 mRNA를 포함할 수 있다. 본원에 설명된 바와 같이, 3개 이상의 별개의 면역조절 mRNA는 이러한 mRNA 치료제 중 임의의 것에서 종양-특이적 mRNA와 함께 포함될 수 있다.
[0027] 본원에 설명된 mRNA 치료 나노입자는 상기 설명된 바와 같은 하나 이상의 면역조절제를 포함하고/하거나 이와 조합될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 mRNA 치료 나노입자는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드와 같은 면역자극제를 포함하고/하거나 이와 조합될 수 있다.
[0028] 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 및 면역조절제를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA의 전부 또는 일부는 단일 mRNA 가닥의 일부일 수 있다. 구체적으로, 이들 mRNA(또는 이들 중 일부)는, 예를 들어, 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 및 면역조절제(들)를 인코딩하는 mRNA(들)가 단일 연속 mRNA 내에서 종양-특이적 항원의 2개 이상의 오픈 리딩 프레임 및 면역조절제(들)를 인코딩하는 mRNA(들)를 조합하는 단일 mRNA일 수 있도록 조합될 수 있다. 예를 들어, 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA 및 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA는 제1 mRNA(종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA) 및 제2 mRNA(면역조절제를 인코딩함)에 대한 ORF를 포함하는 단일 mRNA 가닥일 수 있다. 대안적으로, 제1 mRNA 및 제2 mRNA는 상이한 mRNA 가닥의 일부일 수 있다.
[0029] 또한, 본원에 설명된 mRNA 치료제(예를 들어, mRNA 치료 나노입자)를 제조하는 방법(예를 들어, 제작 방법, 제조 방법, 합성 방법 등)이 본원에 설명된다. 예를 들어, (예를 들어, mRNA 치료 나노입자를 제조하는) 방법은 미세유체 경로 장치에서 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 미세유체 경로 장치에서 제1 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 미세유체 경로 장치에서 제1 및 제2 mRNA를 정제하고; 미세유체 경로 장치에서 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 조합하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키는 것을 포함할 수 있다.
[0030] 일부 예에서, 상기 방법은 폐쇄-경로 미세유체 경로 장치에서 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 미세유체 경로 장치에서 제1 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 미세유체 경로 장치에서 제1 및 제2 mRNA를 정제하고; 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 미세유체 경로 장치에서 전달 비히클 분자와 조합하는 것을 포함할 수 있다.
[0031] mRNA 치료 나노입자를 제조하는 방법은 폐쇄-경로 미세유체 경로 장치에서 주형으로부터 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 제1 mRNA를 정제하고; 미세유체 경로 장치에서 제1 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 미세유체 경로 장치에서 제2 mRNA를 정제하고; 미세유체 경로 장치에서 제1 mRNA 및 제2 mRNA 둘 모두를 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키는 것을 포함할 수 있다.
[0032] (예를 들어, mRNA 치료 나노입자를 제조하는) 방법으로서, 상기 방법은 (예를 들어, 폐쇄-경로) 미세유체 경로 장치의 제1 챔버에서 주형으로부터 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 제1 mRNA를 정제하고; 미세유체 경로 장치의 제2 챔버에서 제1 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 미세유체 경로 장치에서 제2 mRNA를 정제하고; 미세유체 경로 장치의 제3 챔버에서 제2 면역조절제를 인코딩하는 제3 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 미세유체 경로 장치에서 제3 mRNA를 정제하고; 미세유체 경로 장치에서 제1 mRNA, 제2 mRNA 및 제3 mRNA를 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키는 것을 포함한다.
[0033] 제1, 제2 및 제3 mRNA를 정제하는 것은 미세유체 경로 장치 상의 하나 이상의 반응기에서 제1, 제2 또는 제3 mRNA를 정제하는 것을 포함할 수 있다. mRNA를 정제하기 위한 하나 이상의 반응기는 이중 가닥 mRNA를 제거하기 위해 하나 이상의 반응기 내에 셀룰로스와 같은 이중-가닥 mRNA 결합 물질을 포함할 수 있다.
[0034] 미세유체 경로 장치는 하나 이상의 주형으로부터 제1 및 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 제1 및 제2 mRNA(및 제3, 제4 등)를 정제하고, mRNA를 전달 비히클 분자와 조합하는 공정을 자동으로 및 연속적으로 수행하도록 구성된 폐쇄-경로 시스템을 포함할 수 있다. 폐쇄-경로 시스템은 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클 분자와 조합하는 것을 공압적으로 제어할 수 있다.
[0035] 폐쇄-경로 시스템은 미세유체 경로 장치 내의 하나 이상의 막을 편향시킴으로써 주형으로부터 제1 및 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 제1 및 제2 mRNA를 정제하고, 제1 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 조합하는 것을 공압적으로 제어할 수 있다. 폐쇄-경로 시스템은 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 조합하는 공정을 5일 미만 내에 자동으로 및 연속적으로 수행할 수 있다. 상기 방법은 치료 현장에서 수행될 수 있다. mRNA를 전달 비히클과 조합하는 것은 미세유체 경로 장치에서 mRNA 치료 나노입자 조성물을 투석하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
[0036] 이들을 수행하기 위한 이러한 방법 및 시스템 중 임의의 것은 미세유체 경로 장치에서 mRNA 치료 나노입자를 농축시키는 것을 포함할 수 있다.
[0037] 언급된 바와 같이, 전달 비히클 분자는 양친매성 나노입자(예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드)를 포함하는 임의의 적절한 전달 비히클일 수 있다. 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA는 환자-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 제1 mRNA는 복수의 환자-특이적 항원을 인코딩할 수 있다. 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA는 공유된 종양 항원을 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA는 체크포인트 억제제, 면역억제 길항제, 염증촉진성 제제, 또는 이들의 조합을 인코딩할 수 있다. 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA는 항-CTLA-4를 인코딩할 수 있다. 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA는 TGF-베타 길항제를 인코딩할 수 있다. 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA는 단일 사슬 인터루킨-12(IL-12)를 인코딩할 수 있다. mRNA(예를 들어, 제1 및 제2 mRNA, 제3 mRNA 등)를 조합하는 것은 mRNA 치료 나노입자가 미세유체 경로 장치에 있는 동안 mRNA 치료 나노입자에 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드와 같은 면역자극제를 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
[0038] 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 치료 나노입자 및 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 종양 내 주사하는 것을 포함하는 방법이 본원에 설명되며, 여기서 2개 이상의 면역조절제 중 적어도 하나는 체크포인트 억제제이고, 추가로 여기서 mRNA 백신 및 면역조절제는 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클과 같은 단일 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화된다.
[0039] 예를 들어, 치료 방법이 본원에 설명된다. 이러한 방법은 mRNA 백신, 특히 암의 치료에 대해 개선된 효능을 가질 수 있다. 종양-특이적 mRNA를 인코딩하는 mRNA 및 면역조절제(들)를 인코딩하는 mRNA(들) 둘 모두를 전달 비히클과 함께 캡슐화하는 것은 백신접종의 효능을 향상시킬 수 있다. mRNA 백신을 종양 내 주사하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 방법 중 임의의 것은 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 백신 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 종양 내 주사하는 것을 포함할 수 있고; 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클과 함께 캡슐화될 수 있다.
[0040] 치료 방법(예를 들어, 암의 치료)은 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 백신 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 종양 내 주사하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 mRNA 치료 나노입자는 종양-특이적 mRNA 항원 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA 둘 모두에 대한 단일 전달 비히클과 함께 캡슐화된다.
[0041] 이러한 방법 및 조성물은 mRNA 치료 나노입자의 일부로서, 종양-특이적 항원이 mRNA 치료 나노입자가 주사되는 종양에 의해 발현되는 종양-특이적 항원을 포함하도록 지시된 mRNA를 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 종양-특이적 항원은 mRNA 치료 나노입자가 주사되는 종양에 특이적이다.
[0042] 이러한 방법 및 조성물 중 임의의 것에서, 종양-특이적 항원은 하나 이상의 환자-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA일 수 있다. 환자-특이적 항원은 비정상 단백질(예를 들어, 상응하는 체세포 단백질과 비교하여 변형되고/되거나 비-암성 환자 세포와 비교하여 비정상적으로 발현되는 단백질)을 확인함으로써 확인될 수 있다. 일부 변형예에서, mRNA 치료 나노입자는 복수의 환자-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA를 포함한다. mRNA 치료 나노입자는 공유된 종양 항원을 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 변형에서, mRNA는 환자로부터 분리되지 않은 유사한 종양으로부터 확인된 항원(예를 들어, 펩티드)을 인코딩할 수 있다.
[0043] 종양-특이적 항원의 폴리뉴클레오티드 서열은 환자(예를 들어, 종양)에 존재하는 서열과 비교하여 변형될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 mRNA 발현을 향상시키고/시키거나 mRNA 분해를 방지하기 위해 변형될 수 있다. 일부 변형에서, 종양-특이적 항원을 포함하는 mRNA는 면역 반응을 유발하기 위해 종양-특이적 항원(들)의 제시를 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 종양-특이적 항원은 제시를 향상시키는 mRNA 스캐폴드의 일부일 수 있다.
[0044] 일반적으로, 본원에 설명된 mRNA 치료제는 유리하게는 2개 이상의 추가적인 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있고; 이러한 면역조절제는 서로 상이할 수 있다. 본원에서 사용되는 면역조절제는 체크포인트 억제제(예를 들어, 체크포인트 억제제 단백질, 예를 들어, 항-PD-1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-CTLA4 등), 면역억제 길항제, 염증촉진성 제제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
[0045] 체크포인트 억제제의 예는 하나 이상의 면역계 체크포인트 단백질을 표적화하고 억제하는 단백질, 예를 들어, CTLA4, PD-1 및 PD-L1 중 하나 이상을 억제하는 단백질을 포함한다. 일부 변형에서, 체크포인트 억제제는 CTLA-4를 억제하는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 체크포인트 억제제 단백질은 CTLA-4에 결합하는 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항원-결합 단편(Fab), 단일 사슬 가변 단편(scFv), 압타머 등을 포함할 수 있다. 항-CTLA-4 단백질(예를 들어, 항체, scFv 등)의 예는 본원에 설명된다. 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 항-PD-L1 항체(예를 들어, 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 또는 두르발루맙(durvalumab)); 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 트레멜리무맙(tremelimumab) 또는 이필리무맙(ipilimumab)); 항-PD1 항체(예를 들어, 니볼루맙(nivolumab) 또는 펨브롤리주맙(pembrolizumab)), 또는 이들의 조합을 인코딩한다. 예를 들어, 일부 변형에서, 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 항-CTLA-4 결합제를 인코딩한다.
[0046] 면역억제 길항제는 면역억제를 예방하거나 제한하여 면역계의 억제를 위한 경로를 차단하는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전환 성장 인자 베타에 대한 길항제(TGF-β-RII)는 면역억제 길항제로서 작용할 수 있는 사이토카인이다. 염증촉진성 제제는 통상적으로 염증 반응 자체를 유도하고 국소 염증을 유발할 수 있다. 예를 들어, IL-12는 염증촉진성 분자이다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 면역조절제(immunomodulatory agent)(면역조절제(immunomodulator))는 인터루킨(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-12) 및 다른 사이토카인(인터페론, GM-CSF), 케모카인(CCL3, CCL26, CXCL-7) 등을 포함할 수 있다.
[0047] 특히, TGF-β 길항제(예를 들어, TGF-β RII)를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 방법 및 조성물이 본원에 설명된다. 일부 변형에서, 면역조절제를 인코딩하는 mRNA는 단일 사슬 인터루킨-12(IL-12)를 인코딩한다.
[0048] 본원에 설명된 이러한 방법 및 조성물 중 임의의 것에서, mRNA 치료 나노입자는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드와 같은 면역자극제를 포함할 수 있다. 면역자극제는 본원에 설명된 바와 같은 면역조절제와 상이할 수 있다. 면역자극제는 비-단백질 면역자극제를 지칭할 수 있는 반면, 본원에서 지칭되는 면역조절제는 mRNA 백신의 일부로서 mRNA로서 인코딩될 수 있는 단백질(예를 들어, 펩티드-기반) 면역조절제이다.
[0049] 종양-특이적 항원(들) 및 면역조절제 둘 모두에 대한 mRNA의 사용은 종양 내 주사될 때 수많은 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 바와 같이 신체(종양 내로 포함)로 직접 주사되는 경우 mRNA는 약 3일의 반감기를 가질 수 있지만, 본원에 더 상세히 설명된 바와 같이 실질적이고 특정한 면역 반응을 유발하기에 충분한 상당한 양의 전사를 제공한다.
[0050] 본원에 설명된 방법은 치료 기간에 걸쳐 1회 또는 1회 초과의 주사를 포함할 수 있는 종양 내 주사 치료의 일부로서 수행될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 방법은 종양 내 주사 치료를 치료 사이에 약 1 내지 약 30일의 대기(예를 들어, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 5일, 약 1일 내지 7일, 약 1일 내지 8일, 약 1일 내지 10일, 약 1일 내지 15일, 약 1일 내지 20일, 약 1일 내지 30일 등의 대기)와 함께 1회 이상(예를 들어, 약 1x, 약 2x, 약 3x, 약 4x, 약 5x, 약 6x, 약 7x, 또는 그 초과) 반복하는 것을 포함할 수 있다. 일 예에서, 대기 시간은 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 또는 약 14일일 수 있고; 상기 언급된 범위 중 임의의 범위 내의 다른 적합한 값이 가능하다. 단일 치료는 단일 종양의 하나 이상의 부위 또는 다수의 종양의 하나 이상의 부위로의 주사를 포함하는 하나 이상의 주사를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 방법은 주요 종양으로의 주사를 포함할 수 있다. 주사는 종양의 본체, 및/또는 종양을 둘러싼 조직으로 이루어질 수 있다. 일부 변형에서, 주사는 종양에 공급하는 관(예를 들어, 혈관 등)을 통해 이루어질 수 있다.
[0051] 본원에 설명된 방법은 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 급성 골수성 백혈병(AML); 부신피질암; 항문암; 충수암; 별아교세포종; 비정형 기형/횡문근양 종양; 비정형 기형/횡문근양 종양; 피부의 기저 세포 암종; 담관암; 방광암; 골암(유잉 육종 및 골육종 및 악성 섬유성 조직구종 포함); 뇌종양; 유방암; 기관지 종양(폐암); 버킷 림프종; 카르시노이드 종양(위장); 심장(심장) 종양; 자궁경부암; 소아기 두개외 생식세포 종양; 소아기 횡문근육종(연조직 육종); 소아 혈관 종양(연조직 육종); 담관암종; 척삭종; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 만성 골수성 백혈병(CML); 만성 골수증식성 신생물; 결장직장암; 두개인두종; 피부 T 세포 림프종; 관상피내암(DCIS); 배아 종양, 수모세포종; 자궁내막암(자궁암); 뇌실막종; 식도암; 감각신경모세포종(두경부암); 유잉 육종(뼈암); 유잉 육종(뼈암); 두개외 생식 세포 종양; 생식선 외 생식 세포 종양; 생식선 외 생식 세포 종양; 안암; 나팔관암; 뼈의 섬유성 조직구종, 악성, 및 골육종; 담낭암; 위(위)암; 위장 카르시노이드 종양; 위장 기질 종양(GIST)(연조직 육종); 생식 세포 종양; 생식 세포 종양; 임신영양막병; 털세포 백혈병; 두경부암; 간세포(간)암; 조직구증, 랑게르한스 세포; 호지킨 림프종; 인두암; 인두암(두경부암); 안내 흑색종; 안내 흑색종; 섬 세포 종양, 췌장 신경내분비 종양; 카포시 육종(연조직 육종); 카포시 육종(연조직 육종); 신장(신세포) 암; 랑게르한스 세포 조직구증; 후두암(두경부암); 백혈병; 입술 및 구강암(두경부암); 간암; 폐암(비소세포, 소세포, 흉막폐 모세포종 및 기관기관지종양); 림프종; 뼈의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종; 수모세포종 및 기타 CNS 배아 종양; 흑색종; 메르켈 세포 암종(피부암); 악성 중피종; 전이성 암; 잠복 원발성을 동반한 전이성 편평 경부암(두경부암); 구강암(두경부암); 다발성 내분비 신생물 증후군; 다발성 골수종/형질 세포 신생물; 균상식육종(림프종); 골수형성이상 증후군, 골수형성이상/골수증식성 신생물; 골수성 백혈병, 만성(CML); 골수성 백혈병, 급성(AML); 골수증식성 신생물, 만성; 비강 및 부비동암(두경부암); 비인두암; 비인두암(두경부암); 신경모세포종; 비-호지킨 림프종; 비소세포폐암; 구강암, 입술 및 구강암 및 구강인두암(두경부암); 구강인두암; 골육종(뼈암); 뼈의 골육종 및 악성 섬유성 조직구종; 난소암; 난소 생식 세포 종양; 췌장암; 췌장 신경내분비 종양(섬 세포 종양); 유두종증(소아기 후두); 부신경절종; 부비동 및 비강암(두경부암); 부갑상선암; 음경암; 인두암(두경부암); 크롬친화세포종; 뇌하수체 종양; 형질 세포 신생물/다발골수종; 흉막폐모세포종(폐암); 원발성 CNS 림프종; 원발성 복막암; 전립선암; 직장암; 신장 세포(신장) 암; 망막모세포종; 망막모세포종; 횡문근육종, 소아기(연조직 육종); 침샘암(두경부암); 육종; 세자리 증후군(림프종); 피부암; 소세포폐암; 소장암; 연조직 육종; 연조직 육종; 피부의 편평 세포 암종 - 피부암 참조; 잠복 원발성, 전이성 편평 경부암(두경부암); 위(위)암; 고환암; 인후암(두경부암); 흉선종 및 흉선 암종; 갑상선암; 기관지 종양(폐암); 신우 및 요관의 이행세포암(신장(신세포)암); 요도암; 자궁암, 자궁내막; 자궁 육종; 자궁 육종; 질암; 및 외음부암 중 하나 이상과 관련된 종양 또는 전-종양 병변을 포함하는 임의의 적절한 종양 유형으로의 주사를 포함할 수 있다.
[0052] 예를 들어, 본원에 설명된 방법은 림프종을 치료하기 위한 방법일 수 있다. 일부 변형에서, 본원에 설명된 방법은 전암성 징후(예를 들어, 자궁경부 이형성증)를 포함하는 자궁경부암을 치료하는데 사용될 수 있다.
[0053] 본원에 설명된 방법 중 임의의 방법에서, 상기 방법은 단일 전달 비히클 분자(예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클)에 의해 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA와 함께 캡슐화된 하나 이상의 면역조절제 둘 모두를 인코딩하는 mRNA 치료 나노입자를 주사하는 것을 포함할 수 있다. 일 예에서, mRNA 치료 나노입자는 종양 내 주사될 수 있고; 대안적으로 또는 추가로, mRNA 치료 나노입자는 종양 근처 또는 종양-공급 관에 전신 또는 국소적으로 주사될 수 있다. 전신 주사는 정맥 내 주사, 피하 주사, 복강 내 주사, 근육 내 주사 등을 포함할 수 있다.
[0054] 일반적으로, 본원에 설명된 전달 비히클은, 예를 들어, 양친매성 나노입자를 포함하는 임의의 적절한 전달 비히클일 수 있다. 특히, 양친매성 나노입자는 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 전달 비히클은 순환 동안 mRNA 카고의 패키징 및 보호를 제공하고, 면역 인식을 피하고, 세포 흡수 및 방출을 촉진할 수 있는 지질-함유 양친매성 전달 비히클일 수 있다. 이러한 전달 비히클의 예는 "LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS COMPRISING LIPIDATED CATIONIC PEPTIDE COMPOUNDS FOR NUCLEIC ACID DELIVERY"을 제목으로 하고 2019년 9월 27일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US19/53661호, 및 "TERTIARY AMINO LIPIDATED CATIONIC PEPTIDES FOR NUCLEIC ACID DELIVERY"를 제목으로 하고 2019년 9월 27일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US19/53655호에서 발견될 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 다수의 유형의 전달 비히클 분자가 사용될 수 있고, 각각의 유형은 본원에 설명된 바와 같은 하나 이상의 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA 둘 모두로 로딩될 수 있다(예를 들어, 이들을 캡슐화 등의 작용을 할 수 있다).
[0055] 펩토이드-기반 지질 제형은 양이온성 기 및 지질 모이어티 둘 모두를 N-치환된 펩티드(즉, 펩토이드) 백본 상에 혼입할 수 있다. 전달 비히클 성분은 상업적으로 이용 가능한 단분산되고, 완전히 특성화될 수 있는 화학적 독립체일 수 있다. 전달 비히클(DV) 성분은 제어된 비율로 mRNA와 비교적 빠르게 혼합된다. 수용액에 대한 DV 성분의 노출 및 양이온성(+) 지질과 음이온성(-) mRNA 사이의 상호작용은 입자 형성을 촉발할 수 있다. 이 공정은 미세유체 장치를 사용하여 (입자 크기 및 균일성을 제어하기 위해) 수행될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 이의 양이온 전하를 담당하는 전달 비히클 상의 염기성 작용기(예를 들어, 아민)의 완전한 양성자화를 보장하는 것을 도울 수 있는 산성 완충제(pH 약 3-5)에 용해될 수 있다. 전달 비히클은 수성-혼화성 유기 용매(예를 들어, 에탄올)에 용해될 수 있고, 이는 수성 카고 용액에 노출시 나노-크기 입자의 형성을 촉진한다. 혼합 직후, 용액 pH는 중성 완충제에 의해 안정화될 수 있다. 생성된 제형은 기능의 명백한 손실 없이 수주 이상 동안 약 4℃ 내지 약 8℃에서 저장될 수 있다. 대안적으로, 제형화 공정은 적시에 및 치료 현장에서 수행될 수 있다.
[0056] 본 발명의 개시는 암의 치료를 위한 mRNA 치료제를 제공한다. 본 발명의 개시의 mRNA 치료제는 상기 기술이 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드(예를 들어, 면역-종양학("IO")에 유용한 체크포인트 억제제, 염증촉진성 제제 및 면역억제의 길항제 등을 포함하는 종양학-관련 폴리펩티드)를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA 둘 모두의 전달을 제공하여 표적 세포 내, 예를 들어, 종양의 표적 세포 내에서 기능성 단백질의 새로운 합성을 가능하게 하기 때문에 암의 치료에 특히 매우 적합하다. 이러한 치료 mRNA는 원치 않는 면역 활성화(예를 들어, 외래 핵산의 생체 내 도입과 관련된 선천 면역 반응)를 최소화하고 mRNA의 단백질로의 번역 효율을 최적화하기 위해 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 본 발명의 개시의 예시적인 양태는, 특히, 단백질 발현을 향상시키기 위해 면역 조절 폴리펩티드를 인코딩하는 치료 mRNA의 오픈 리딩 프레임(ORF) 내에 선천 면역 반응 및 서열 최적화를 감소시키기 위한 뉴클레오티드 변형의 조합을 갖는 치료 mRNA를 특징으로 한다.
[0057] 본원에 설명된 mRNA 치료 나노입자 조성물은 지질 나노입자(LNP) 전달 시스템을 통한, 특히 단일 전달 비히클 분자(예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클) 내에 캡슐화된 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA 둘 모두를 인코딩하는 mRNA(들)의 전달을 특징으로 한다. 예를 들어, 본원에 설명된 mRNA 치료제 기술은 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA의 종양으로의 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클의 전달을 특징으로 한다. 본원에 설명된 제형은 생체 내 투여와 관련된 감소된 면역원성을 가질 수 있다.
[0058] 본 발명의 개시는 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물, 특히, 면역요법 방법 및 조성물을 특징으로 한다. 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA 둘 모두를 사용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 특징으로 한다.
[0059] 일부 양태에서, 본 발명의 개시는, 예를 들어, 전달 비히클 분자(예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클)과 함께 캡슐화된 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA를 종양 내 투여함으로써 종양의 크기를 줄이거나 감소시키거나 종양 성장을 억제할 필요가 있는 대상체에서 종양의 크기를 줄이거나 감소시키거나 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
[0060] 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드는 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0061] 일부 양태에서, 조성물은 또 다른 암 요법과 조합하여 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA는 적어도 부분적으로 (a) 수지상 세포 프라이밍; (b) 수지상 세포 성숙의 촉진; (c) 항원 제시 세포 사이토카인 및/또는 케모카인 생산의 촉진; (d) Th17 세포의 확장 또는 유지; (e) Th1 및/또는 Th9 분화의 향상; (f) (a)-(f)의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 갖도록 작용할 수 있다.
[0062] 일반적으로, 본원에 설명된 mRNA 나노입자 중 임의의 것의 치료적 용도는 적어도 mRNA 나노입자를 사용하는 것을 포함하는 mRNA 치료 나노입자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
[0063] 본 발명의 개시는 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위한 의약의 제조에서 본원에 설명된 바와 같은 동일한 나노입자(예를 들어, 지질 나노입자, 예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클)에 캡슐화된 전술한 또는 선행하는 조성물(예를 들어, 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA) 중 임의의 것의 용도를 제공할 수 있으며, 상기 의약은 조성물 또는 지질 나노입자 및 선택적인 약학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 상기 치료는 의약 및 선택적인 약학적으로 허용되는 담체의 투여를 포함한다.
[0064] 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 설명된 바와 같은 전달 비히클 분자(예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클)에 의해 둘 모두 캡슐화된 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA) 조성물을 포함하는 용기, 및 선택적인 약학적으로 허용되는 담체, 및 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 조성물의 종양 내 투여(예를 들어, 주사)에 대한 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 패키지 삽입물은 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 또 다른 부위에서의 주사(예를 들어, 전신 주사)와 조합된 종양 내 주사에 의한 조성물의 투여에 대한 설명서를 추가로 포함한다.
[0065] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 본원에 설명된 바와 같은 전술한 또는 선행하는 조성물 중 임의의 것을 포함하는 의약 및 선택적인 약학적으로 허용되는 담체, 및 약물 단독 또는 제2(예를 들어, 전신) 위치에서의 주사와 조합된 약물의 종양 내 투여를 위한 설명서를 포함하는 패키지 삽입물, 및 선택적인 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 키트는 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 의약의 투여를 위한 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 추가로 포함한다.
[0066] 본 발명의 개시의 다른 양태는 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 본원에 설명된 바와 같은 단일 지질 나노입자(예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클)에서 함께 캡슐화된 전술한 또는 선행하는 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA 중 임의의 것 및 선택적인 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 치료는 제2 조성물과 조합된 동일한 지질 나노입자 내의 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA의 종양 내 투여를 포함하고, 상기 제2 조성물은 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA 및 전달 비히클 분자(예를 들어, 하나 이상의 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클)를 포함한다. 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA는 체크포인트 억제제 폴리펩티드(예를 들어, 항-PD-1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-CTLA4 항체, 또는 이들의 조합), 및 선택적인 약학적으로 허용되는 담체일 수 있다. 일부 양태에서, 체크포인트 억제제 폴리펩티드는 PD1, PD-L1, CTLA4, 또는 이들의 조합을 억제한다. 일 예에서, 체크포인트 억제제 폴리펩티드는 항체 또는 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 일 예에서, 항체는 CTLA4에 특이적으로 결합하는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편, PD1에 특이적으로 결합하는 항-PD1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 이들의 조합이다. 일 예에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 또는 두르발루맙이다. 일 예에서, 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙 또는 이필리무맙이다. 일 예에서, 항-PD1 항체는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙이다.
[0067] mRNA(예를 들어, 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA)는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다. 일 예에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2'-O-메틸 우리딘으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, mRNA는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드는 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드는 N1-메틸슈도우리딘이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 완전히 변형된 N1-메틸슈도우리딘 mRNA이다. 추가적인 화학적 변형이 본원에 개시된다.
[0068] 조성물은 지질 나노입자 담체, 특히 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클에서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 바와 같은 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA를 포함하는 조성물은 조성물 내의 모든 폴리뉴클레오티드가 동일한 지질 나노입자 담체에 의해 운반되도록 제형화될 수 있다. 종양-특이적 항원 mRNA 및 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA의 비율은, 예를 들어, 약 1:1(예를 들어, 대략 등몰)이 되도록 선택될 수 있거나, 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA에 비한 과량의 종양-특이적 항원 mRNA(예를 들어, > 약 1:1 내지 약 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 등 또는 종양-특이적 항원 mRNA:면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 종양-특이적 항원 mRNA에 비해 과량의 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA(예를 들어, > 약 1:1 내지 약 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 등의 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA:종양-특이적 항원 mRNA)를 포함할 수 있다. 다수의 면역조절제 폴리펩티드(예를 들어, 하나 초과의 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA)가 사용되는 변형에서, 모든 성분은 대략 등몰(예를 들어, 종양-특이적 항원 mRNA에 비해 약 1:1:1, 또는 약 1:1:1:1 등)일 수 있거나 하나 이상의 성분이 과량일 수 있다(예를 들어, 종양-특이적 항원 mRNA가 과량일 수 있고, 대안적으로 하나 이상의 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA가 과량일 수 있다).
[0069] 또 다른 양태에서, 본원에 설명된 방법은 본원에 설명된 mRNA 치료 나노입자 조성물 중 임의의 것을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 종양의 크기를 줄이거나 감소시키거나 종양 성장을 억제하는 것을 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 줄이거나 감소시키거나 종양 성장을 억제하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 조성물은 종양 내 투여된다. 또 다른 예에서, 조성물(또는 하나 이상의 면역조절제 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 및 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클을 포함하는 제2 조성물)은 국소적으로(예를 들어, 종양이 성장하는 영역으로, 예를 들어, 조성물은 복강의 종양에 대해 복강 내로 투여됨) 및/또는 전신으로 투여될 수 있다. 일 예에서, 종양은 림프종이다. 일부 다른 예에서, 종양은 간세포 암종이다. 또 다른 예에서, 종양은 난소 종양, 결장 종양 또는 파종성 위 종양이다. 치료를 위한 다른 적합한 종양 및 암이 본원에 개시된다.
[0070] 예를 들어, 상기 방법은 (i) 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA; (ii) 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및 (iii) 전달 비히클 분자를 포함하는 mRNA 나노입자를 종양 내 주사하는 것을 포함하며, 여기서 제1 mRNA 및 제2 mRNA는 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화된다.
[0071] 종양-특이적 항원은 바이러스 항원을 포함할 수 있다. 바이러스 항원은 인간 유두종바이러스(HPV), 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스(KSHV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 메르켈 세포 폴리오마바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV), 또는 이들의 임의의 조합과 관련될 수 있다. 종양-특이적 항원은 네오-에피토프를 포함할 수 있다. 종양-특이적 항원은 환자-특이적 항원을 포함할 수 있다. 종양-특이적 항원은 복수의 환자-특이적 항원을 포함할 수 있다. 종양-특이적 항원은 공유된 종양 항원을 포함할 수 있다.
[0072] 전달 비히클 분자는 아미노-지질화된 펩토이드를 포함할 수 있다. mRNA 나노입자는 제2 면역조절제를 인코딩하는 제3 mRNA를 추가로 포함할 수 있다. mRNA 나노입자는 면역조절 siRNA를 추가로 포함할 수 있다.
[0073] 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA는 체크포인트 억제제, 면역억제 길항제, 염증촉진성 제제, 또는 이들의 조합을 인코딩할 수 있다. 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA는 염증촉진성 사이토카인을 인코딩할 수 있다. 염증촉진성 사이토카인은 (IL), IL-1, IL-2, IL-12, IL-17, IL-18, IFN-γ, 및 TNF-α 중 하나일 수 있다. 염증촉진성 사이토카인은 인터루킨-12(IL-12)일 수 있다.
[0074] 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA는 종양 괴사 인자 상과 구성원 14(TNFSF14)를 인코딩할 수 있다. 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA는 항-CTLA-4를 인코딩할 수 있다. 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA는 TGF-베타 길항제를 인코딩할 수 있다.
[0075] mRNA 나노입자는 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다. mRNA 나노입자는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 방법 중 임의의 방법은 주사 사이의 대기와 함께 종양 내 주사를 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 대기는 약 1 내지 약 14일이다.
[0076] 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA 및 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA는 단일 mRNA 가닥 상에 있을 수 있다. 상기 방법은 림프종을 갖는 환자를 치료하는 방법일 수 있다. 상기 방법은 자궁경부암을 갖는 환자를 치료하는 방법일 수 있다.
[0077] 또한, 방법이 본원에 설명되며, 상기 방법은 mRNA 나노입자를 이를 필요로 하는 환자에게 종양 내 주사하는 것을 포함하고, 상기 mRNA 나노입자는 (i) 자궁경부암에 특이적인 항원을 인코딩하는 제1 mRNA; (ii) 염증촉진성 사이토카인을 포함하는 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및 (iii) 전달 비히클 분자를 포함하고, 상기 제1 mRNA 및 제2 mRNA는 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화된다.
[0078] 또한, mRNA 치료 나노입자가 본원에 설명되며, 상기 나노입자는 (i) 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA; (ii) 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및 (iii) 전달 비히클 분자를 포함하고, 상기 제1 mRNA 및 제2 mRNA는 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화된다.
[0079] mRNA 치료 나노입자로서, 상기 나노입자는 (i) 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA; (ii) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및 (iii) 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클을 포함하는 전달 비히클 분자를 포함할 수 있으며, 상기 제1 mRNA 및 제2 mRNA는 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화된다.
[0080] 일부 예에서, mRNA 치료 나노입자로서, 상기 나노입자는 (i) 자궁경부암에 특이적인 항원을 인코딩하는 제1 mRNA; (ii) 염증촉진성 사이토카인을 포함하는 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및 (iii) 전달 비히클 분자를 포함할 수 있고, 상기 제1 mRNA 및 제2 mRNA는 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화된다.
[0081] 전달 비히클 분자는 아미노-지질화된 펩토이드를 포함할 수 있다. 제1 mRNA는 환자-특이적 항원을 인코딩할 수 있다. 제1 mRNA는 복수의 환자-특이적 항원을 인코딩할 수 있다. 제1 mRNA는 공유된 종양 항원을 인코딩할 수 있다. 제2 mRNA는 체크포인트 억제제, 면역억제 길항제, 염증촉진성 제제, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩할 수 있다. 제2 mRNA는 항-CTLA-4를 인코딩할 수 있다. 제2 mRNA는 SEQ ID No: 1 또는 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 항-CTLA-4를 인코딩할 수 있다.
[0082] 이러한 mRNA 치료 나노입자 중 임의의 것은 종양 괴사 인자 상과 구성원 14(TNFSF14)를 인코딩하는 제3 mRNA를 추가로 포함할 수 있다.
[0083] mRNA 치료 나노입자는 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 TGF-베타 길항제를 인코딩하는 제3 mRNA를 추가로 포함할 수 있다. 제2 mRNA는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 인터루킨-12를 인코딩할 수 있다. mRNA 치료 나노입자는 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다. 면역자극제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
[0084] mRNA 치료 나노입자 중 임의의 것에서, 종양-특이적 항원 및 면역조절제의 각각의 오픈 리딩 프레임(ORF)은 단일 mRNA 가닥의 일부일 수 있다. 종양-특이적 항원 및 면역조절제의 각각의 오픈 리딩 프레임(ORF)은 상이한 mRNA 가닥의 일부일 수 있다.
[0085] 또한, 방법이 본원에 설명되며, 상기 방법은 미세유체 경로 장치에서 주형으로부터 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 제1 mRNA를 정제하고; 미세유체 경로 장치에서 제1 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 미세유체 경로 장치에서 제2 mRNA를 정제하고; 미세유체 경로 장치에서 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키는 것을 포함한다.
[0086] 예를 들어, 방법이 본원에 설명되며, 상기 방법은 미세유체 경로 장치의 제1 챔버에서 주형으로부터 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 제1 mRNA를 정제하고; 미세유체 경로 장치의 제2 챔버에서 제1 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 미세유체 경로 장치에서 제2 mRNA를 정제하고; 미세유체 경로 장치의 제3 챔버에서 제2 면역조절제를 인코딩하는 제3 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고; 미세유체 경로 장치에서 제3 mRNA를 정제하고; 미세유체 경로 장치에서 제1 mRNA, 제2 mRNA 및 제3 mRNA를 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키는 것을 포함한다.
[0087] 제1 mRNA를 정제하고, 제2 mRNA를 정제하고, 제3 mRNA를 정제하는 것 각각은 미세유체 경로 장치 상의 하나 이상의 반응기에서 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
[0088] 하나 이상의 반응기에서 정제하는 것은 하나 이상의 반응기 내에서 셀룰로스를 사용하여 이중 가닥 mRNA를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 미세유체 경로 장치는 자동으로 및 연속적으로 제1 mRNA 및 제2 mRNA 각각의 시험관 내 전사를 수행하고, 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 정제하고, 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 조합하기 위한 폐쇄-경로 시스템을 포함할 수 있다. 폐쇄-경로 시스템은 제1 및 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 제1 및 제2 mRNA를 정제하고, 제1 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 조합하는 것을 공압적으로 제어할 수 있다.
[0089] 폐쇄-경로 시스템은 미세유체 경로 장치 내의 하나 이상의 막을 편향시킴으로써 제1 mRNA 및 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 정제하고, 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 조합하는 것을 공압적으로 제어할 수 있다.
[0090] 폐쇄-경로 시스템은 총체적으로 약 5일 미만 내에 자동으로 및 연속적으로 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 조합할 수 있다. 상기 방법은 치료 현장에서 수행될 수 있다. mRNA를 전달 비히클과 조합하는 것은 미세유체 경로 장치에서 mRNA 치료 나노입자를 투석하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이들 방법 중 임의의 방법은 미세유체 경로 장치에서 mRNA 치료 나노입자를 농축시키는 것을 포함할 수 있다.
[0091] 전달 비히클 분자는 양친매성 분자를 포함할 수 있다. 양친매성 분자는 아미노-지질화된 펩토이드를 포함할 수 있다. 제1 mRNA는 환자-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 종양-특이적 항원을 인코딩할 수 있다. mRNA는 복수의 환자-특이적 항원을 인코딩할 수 있다. 제2 mRNA는 체크포인트 억제제, 면역억제 길항제, 염증촉진성 제제, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 면역조절제를 인코딩할 수 있다. 제2 mRNA는 항-CTLA-4를 인코딩하는 면역조절제를 인코딩할 수 있다. 제2 mRNA는 TGF-베타 길항제를 인코딩하는 면역조절제를 인코딩할 수 있다. 제2 mRNA는 단일 사슬 인터루킨-12(IL-12)를 인코딩하는 면역조절제를 인코딩할 수 있다.
[0092] 이러한 방법 중 임의의 방법은 제1 mRNA와 제2 mRNA를 조합하는 것을 포함할 수 있으며, 이는 미세유체 경로 장치에 면역자극제를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 면역자극제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
[0093] 또한 본원에는 제1 표면과 제2 표면 사이에 샌드위치된 탄성 층; 제1 표면과 제2 표면 사이에 형성된 주형 시험관 내 전사(IVT) 챔버로서, 탄성 층의 일부가 주형 IVT 챔버를 제2 표면의 유체-접촉면 및 제1 표면의 압력-수용면으로 분할하고, 주형 IVT 챔버의 유체-접촉면이 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 주형의 공급원과 유체 소통하는, 주형 IVT 챔버; 주형 IVT 챔버의 유체-접촉면과 유체 소통하는 제1 반응기로서, 제1 반응기가 이중 가닥 mRNA를 제거하기 위해 제1 반응기 내에 이중-가닥 mRNA 결합 물질을 포함하는, 제1 반응기; 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화하여 mRNA 처리 나노입자를 형성시키기 위해 제1 반응기, 제1 면역조절제 mRNA의 공급원, 및 전달 비히클 분자의 공급원에 커플링되는 전달 비히클 포트와 유체 소통하는 혼합 조립체; 및 각각이 하나 이상의 압력 포트로부터 제1 표면 및 탄성 층을 통해 제2 표면으로 그리고 다시 탄성 층을 통해 제1 표면으로 연장되는 복수의 압력 채널로서, 복수의 압력 채널의 각각의 압력 채널이 주형 IVT 챔버의 압력-수용면과 유체적으로 연결되고, 추가로 주형 IVT 챔버의 유체-접촉면의 부피가 미세유체 경로 장치를 통해 유체를 구동시키기 위한 압력 포트 중 하나 이상으로부터 압력을 가함으로써 조정되어 mRNA 치료 나노입자를 형성시킬 수 있는, 복수의 압력 채널을 포함하는 미세유체 경로 장치가 설명된다.
[0094] 또한 본원에는 제1 표면과 제2 표면 사이에 샌드위치된 탄성 층; 제1 표면과 제2 표면 사이에 형성된 주형 시험관 내 전사(IVT) 챔버로서, 탄성 층의 일부가 주형 IVT 챔버를 제2 표면의 유체-접촉면 및 제1 표면의 압력-수용면으로 분할하고, 주형 IVT 챔버의 유체-접촉면이 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA 주형의 공급원과 유체 소통하는, 주형 IVT 챔버; 주형 IVT 챔버의 유체-접촉면과 유체 소통하는 제1 반응기로서, 제1 반응기가 이중 가닥 mRNA를 제거하기 위해 제1 반응기 내에 이중-가닥 mRNA 결합 물질을 포함하는, 제1 반응기; 제1 표면과 제2 표면 사이에 형성된 제1 면역조절제 IVT 챔버로서, 탄성 층의 일부가 제1 면역조절제 IVT 챔버를 제2 표면의 유체-접촉면 및 제1 표면의 압력-수용면으로 분할하고, 제1 면역조절제 IVT 챔버의 유체-접촉면이 제1 면역조절제를 인코딩하는 제1 면역조절제 주형의 공급원과 유체 소통하는, 제1 면역조절제 IVT 챔버; 제1 면역조절제 IVT 챔버의 유체-접촉면과 유체 소통하는 제2 반응기로서, 제2 반응기가 이중 가닥 mRNA를 제거하기 위해 제1 반응기 내에 이중-가닥 mRNA 결합 물질을 포함하는, 제2 반응기; 제1 반응기 및 제2 반응기와 유체 소통하는 제1 혼합 챔버; 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키기 위해 제1 혼합 챔버의 산출물 및 전달 비히클 분자의 공급원에 커플링되는 전달 비히클 포트와 유체 소통하는 제2 혼합 챔버; 및 각각이 하나 이상의 압력 포트로부터 제1 표면 및 탄성 층을 통해 제2 표면으로 그리고 다시 탄성 층을 통해 제1 표면으로 연장되는 복수의 압력 채널로서, 복수의 압력 채널의 각각의 압력 채널이 주형 IVT 챔버 및 제1 면역조절제 IVT 챔버의 압력-수용면과 유체적으로 연결되고, 추가로 주형 IVT 챔버의 유체-접촉면 및 제1 면역조절제 IVT 챔버의 유체-접촉면의 부피가 압력 포트 중 하나 이상으로부터 압력을 가함으로써 조정될 수 있는, 복수의 압력 채널을 포함하는 미세유체 경로 장치가 설명된다.
[0095] 또한, 방법이 본원에 설명되며, 상기 방법은 (ii) 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA; (ii) 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및 (iii) 전달 비히클 분자를 포함하는 mRNA 나노입자를 주사하는 것을 포함하며, 여기서 제1 mRNA 및 제2 mRNA는 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화된다.
[0096] 예를 들어, 상기 방법은 mRNA 나노입자를 이를 필요로 하는 환자에게 주사하는 것을 포함할 수 있고, 상기 mRNA 나노입자는 (i) 자궁경부암에 특이적인 항원을 인코딩하는 제1 mRNA; (ii) 염증촉진성 사이토카인을 포함하는 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및 (iii) 전달 비히클 분자를 포함하고, 상기 제1 mRNA 및 제2 mRNA는 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화된다. 주사는 종양 내 주사로 제한되지 않으며, 예를 들어, 근육 내 주사를 포함할 수 있다.
[0097] 전술한 개념 및 하기에서 더 상세히 논의되는 추가 개념의 모든 조합(이러한 개념이 상호 모순되지 않는 한)은 본원에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려되며 본원에 설명된 이점을 달성하기 위해 이용될 수 있음이 이해되어야 한다.
[0098] 본원에 설명된 방법 및 장치의 특징 및 이점의 더 나은 이해는 예시적인 예를 제시하는 하기 상세한 설명, 및 이의 첨부 도면을 참조함으로써 획득될 것이다:
[0099] 도 1a는 본원에 설명된 바와 같은 mRNA 치료 나노입자의 일부로서 사용될 수 있는 mRNA의 일 예에 대한 개략적 예시이다.
[0100] 도 1b는 본원에 설명된 바와 같은 mRNA 치료 나노입자를 형성하기 위한 방법의 일 예를 개략적으로 예시한다.
[0101] 도 1c는 종양-특이적 항원 및 다수의 면역조절제 mRNA를 둘러싸는 다수의 mRNA 오픈 리딩 프레임을 포함하는 mRNA의 일 예를 개략적으로 예시한다.
[0102] 도 2는 암의 치료에서 본원에 설명된 mRNA 백신의 개선된 효능을 나타내는 그래프이다. 동계 마우스 암 모델은 본원에 기재된 바와 같이 치료되었다. 도 2는 음성 대조군(G1), 면역조절제(항-CTLA-4)를 인코딩하는 mRNA의 종양 내 주사와 동시에 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클 내의 종양-특이적 항원의 mRNA의 피하 주사(G5), 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클 내의 종양-특이적 항원의 mRNA 및 면역조절제(항-CTLA-4)를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 백신의 종양 내 주사(G6), 및 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클 내의 종양-특이적 항원의 mRNA 및 2개의 면역조절제(항-CTLA-4 및 TGF-β)를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 백신(G7)에 대한 카플란 마이어 생존 곡선을 제시한다.
[0103] 도 3는 암의 치료에서 본원에 설명된 또 다른 mRNA 백신의 개선된 효능을 제시하는 그래프이다. 도 3은 음성 대조군(G2), 아미노-지질화된 펩토이드 전달에서 종양-특이적 항원(m4)의 mRNA의 피하 주사(G7), 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클 내의 종양 특이적 항원(m4)의 mRNA 및 면역조절제(항-CTLA-4)를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 백신의 종양 내 주사(G9), 및 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클 내의 종양-특이적 항원(m4)의 mRNA 및 3개의 면역조절제(항-CTLA-4 및 TGF-β 및 단일 사슬 IL-12)를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 백신의 종양 내 주사(G10)를 비교하는 마우스 종양 모델에 대한 카플란 마이어 생존 곡선을 제시한다.
[0104] 도 4는 대조군 (1)을 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클 내의 종양 특이적 항원의 mRNA 및 면역조절제(항-CTLA-4)를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 백신의 종양 내 주사(6)와 비교하는, 마우스 암 모델의 치료에서 본원에 설명된 바와 같은 mRNA 백신의 개선된 효능을 제시하는 또 다른 예이다.
[0105] 도 5는 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클 내의 종양 특이적 항원의 mRNA 및 면역조절제(항-CTLA-4)를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 백신(n=6)의 종양 내 주사의 림프종 동물 모델(음성 대조군과 비교하여, n=6)에서의 개선된 생존에서의 효능을 제시하는, 본원에 설명된 바와 같은 mRNA 백신접종의 개선된 효능을 제시한다.
[0106] 도 6은 림프종 동물 모델(음성 대조군에 비함)에서 생존에 대한 mRNA 백신의 피하 주사의 효과를 제시하는 그래프이다. 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클과 함께 mRNA 백신(G3, 면역조절제를 인코딩하는 mRNA 포함)의 피하 주사는 대조군 동물과 비교하여 종양 부피의 감소(대략 50%)를 나타내었다.
[0107] 도 7은 림프종 동물 모델(음성 대조군과 비교)에서 생존에 대한 mRNA 백신(도 6에 사용된 것과 유사함)의 종양 내 주사의 효과를 제시하는 그래프이다. 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클과 함께 mRNA 백신(G7, 종양-특이적 항원, 및 2개의 면역조절제, 항-CTLA-4 및 TGF-β-PLD1을 인코딩하는 mRNA 포함)의 피하 주사는 대조군 동물과 비교하여 종양 부피에서 큰 감소(대략 80% 초과)를 나타내었다.
[0108] 도 8a 및 8b는 본원에 설명된 mRNA 백신접종 후 장기 생존자인 대상체(마우스 동물 모델로부터)가 강하고 지속적인 CD8+ 효과기 T-세포 암 면역을 발달시키고 추가 종양 공격에 내성이 있음을 예시한다. 도 8a는 3x105 비장세포/웰 및 자극제로서 사용된 종양 세포(EG.7, 1x106)로 수행된 EliSpot 검정의 예를 제시한다. PMA/이오노마이신이 비특이적 자극제로 사용되었다. 세포는 분석 전에 18시간 동안 인큐베이션되었다. 도 8b는 종양 항원에 특이적인 CD8+ 효과기 T-세포를 카운팅하는 본 검정의 정량화를 제시하는 그래프이다. OTI(양성 대조군)는 음성 대조군(#596) 및 2마리의 생존 마우스(마우스 #662 및 마우스 #670)와 비교된다.
[0109] 도 9는 본원에 설명된 바와 같은 림프종 종양 모델에서 시험된 시험 그룹을 제시하는 표(표 1)이다.
[0110] 도 10a-10g는 11일에 마우스 림프종 종양 모델에 근육 내 주사된 상이한 나노입자 조성물(도 9에 설명된 바와 같음)의 결과를 예시한다.
[0111] 도 11a-11f는 28일에 마우스 림프종 종양 모델에 근육 내 주사된 상이한 나노입자 조성물(도 9에 설명된 바와 같음)의 결과를 예시한다.
[0112] 도 12a-12g는 11일에 마우스 림프종 종양 모델에 종양 내 주사된 상이한 나노입자 조성물(도 9에 설명된 바와 같음)의 결과를 예시한다.
[0113] 도 13a-13f는 28일에 마우스 림프종 종양 모델에 종양 내 주사된 상이한 나노입자 조성물(도 9에 설명된 바와 같음)의 결과를 예시한다.
[0114] 도 14는 상이한 나노입자 조성물이 근육 내 주사된 마우스 림프종 종양 모델에서 생존 확률을 제시하는 그래프이다.
[0115] 도 15는 상이한 나노입자 조성물이 종양 내 주사된 마우스 림프종 종양 모델에서 생존 확률을 제시하는 그래프이다.
[0116] 도 16은 대조군(미처리) PBS 용액, 또는 종양 특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역자극제(CpG)를 근육 내 주사한 마우스에서 림프종 종양에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 예시한다.
[0117] 도 17은 대조군 용액(PBS), 또는 종양-특이적 항원(OVA) mRNA + 면역조절제(IL-12) mRNA 둘 모두를 함유하는 나노입자 조성물을 근육 내 주사한 마우스에서 림프종 종양에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 예시한다.
[0118] 도 18은 종양 특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역자극제(CpG), 또는 면역자극제(CpG) 단독(종양 항원 mRNA 없이)을 근육 내 주사한 마우스에서 림프종 종양에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 예시한다.
[0119] 도 19는 동일한 전달 비히클 내의 종양-특이적 항원(OVA) mRNA + 면역조절제(IL-12) mRNA의 나노입자 조성물, 또는 면역조절제(IL-12) mRNA 단독(종양 항원 mRNA 없음)을 근육내 주사한 마우스에서 림프종 종양에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 예시한다.
[0120] 도 20은 종양 특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역자극제(CpG)의 나노입자 조성물 또는 면역자극제(CpG) 단독(종양 항원 mRNA 없음)을 근육 내 주사한 마우스에서 림프종 종양에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 예시한다.
[0121] 도 21은 종양 항원 및 면역조절제(예를 들어, IL-12)의 나노입자 조성물의 종양 내 주사에 의해 치료된 종양("근위" 종양)과 나노입자 조성물로 종양 내 주사되지 않은 동일한 동물로부터의 종양("원위" 종양) 사이의 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 비교한 그래프이다.
[0122] 도 22는 단지 면역조절제(예를 들어, IL-12)의 나노입자 조성물의 종양 내 주사에 의해 치료된 종양("근위" 종양)과 나노입자 조성물로 종양 내 주사되지 않은 동일한 동물로부터의 종양("원위" 종양) 사이의 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 비교한 그래프이다.
[0123] 도 23은 종양 항원 및 면역자극제(예를 들어, CpG)의 나노입자 조성물의 종양 내 주사에 의해 치료된 종양("근위" 종양)과 나노입자 조성물로 종양 내 주사되지 않은 동일한 동물로부터의 종양("원위" 종양) 사이의 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 비교한 그래프이다.
[0124] 도 24는 단지 면역자극제(예를 들어, CpG)의 나노입자 조성물의 종양 내 주사에 의해 치료된 종양("근위" 종양)과 나노입자 조성물로 종양 내 주사되지 않은 동일한 동물로부터의 종양("원위" 종양) 사이의 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 비교한 그래프이다.
[0125] 도 25는 EG.7 종양의 반응률을 요약한 표(표 2)이다.
[0126] 도 26은 MC38 종양 세포의 종양 부피에 대한 다양한 면역조절제(예를 들어, 효과기)의 효과를 예시하는 그래프이다.
[0127] 도 27은 본원에 설명된 바와 같은 다양한 면역조절제로 치료된 종양에서 CD8 T 세포의 빈도를 요약한 그래프이다.
[0128] 도 28은 본원에 설명된 바와 같은 다양한 면역조절제로 치료한 후의 항원-제시 세포의 수의 그래프이다.
[0129] 도 29는 본원에 설명된 바와 같은 나노입자 조성물의 효과를 시험하는데 사용될 수 있는 연구 타임라인의 일 예를 예시한다.
[0130] 도 30a-30f는 각각 C3.43 종양에 본원에 설명된 나노입자 조성물 중 하나를 종양 내 주사한 후 종양 성장의 시간 경과를 예시한다. 도 30a는 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA를 갖는 종양-특이적 항원(HPV16 E6E7) mRNA의 나노입자 조성물의 효과를 제시한다. 도 30b는 종양-특이적 항원(HPV16) mRNA, 제1 면역조절제(TNFSF14) mRNA 및 제2 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA의 나노입자 조성물의 효과를 제시한다. 도 30c는 종양-특이적 항원(HPV16) mRNA 및 면역자극제(CpG)의 나노입자 조성물의 효과를 제시한다. 도 30d는 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA 단독(종양 항원 없음)의 나노입자 조성물의 효과를 제시한다. 도 30e는 제1 면역조절제(TNFSF14) mRNA 및 제2 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA(종양 항원 없음)의 나노입자 조성물의 효과를 제시한다. 도 30f는 면역자극제(CpG) 단독(종양 항원 없음)의 효과를 제시한다.
[0131] 도 31a-31b는 C3.43 종양에 본원에 설명된 나노입자 조성물 중 하나를 근육 내 주사한 후 종양 성장의 시간 경과를 제시한다. 도 31a는 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA를 갖는 종양-특이적 항원(HPV16 E6E7) mRNA의 나노입자 조성물의 효과를 제시한다. 도 31b는 대조군(미처리) 효과를 제시한다.
[0132] 도 32는 본원에 설명된 바와 같은 나노입자 조성물로의 치료(예를 들어, 종양 내 또는 근육 내 주사) 후 C3.43 종양을 갖는 마우스의 생존 확률의 그래프이다.
[0133] 도 33은 본원에 설명된 바와 같은 특정 나노입자 조성물의 종양 내 주사가 치료된 동물의 순환에서 CD3+/CD8+/사량체+ 세포의 백분율의 증가를 초래함을 제시하는 그래프이다.
[0134] 도 34a는 본원에 설명된 바와 같은 미세유체 경로 장치 제어 시스템의 일 예를 예시한다.
[0135] 도 34b는 본원에 설명된 바와 같이 사용될 수 있는 미세유체 경로 장치 제어 시스템의 예를 개략적으로 예시한다.
[0136] 도 35a-35c는 본원에 설명된 바와 같은 미세유체 경로 장치의 예를 예시한다.
[0137] 도 35d는 본원에 설명된 바와 같은 미세유체 경로 장치의 일 예의 일부를 통한 단면도이다.
[0138] 본원에 설명된 방법 및 조성물은 암을 포함하는 질병 또는 장애의 치료를 위한 개선된 요법을 제공한다. 본원에 설명된 치료제는 종양-특이적 항원을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 면역조절제를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 mRNA와 같은 RNA일 수 있다. 예를 들어, 치료에 사용될 수 있는 mRNA 치료제, 이들을 형성하는 방법, 및 이들을 사용하는 방법이 본원에 설명된다. 본원에 설명된 mRNA 치료제 중 임의의 것은 mRNA 백신일 수 있다. 이러한 방법은 각각 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA를 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA와 함께 포함하는 mRNA 치료 나노입자를 포함하는 mRNA 치료 나노입자를 종양 내 주사하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 종양-특이적 항원에 대한 mRNA 및 하나 이상의 면역조절제(들)에 대한 mRNA는 단일 전달 비히클 분자, 예를 들어(비제한적으로), 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클과 함께 캡슐화된다. 종양-특이적 항원은 환자-특이적 항원 및/또는 공유된 종양 항원에 대해 지시될 수 있다. 일 예에서, 이러한 개선된 백신접종은 지속적인 종양 퇴행 및 장기 CD8+ T-세포 매개 암 면역을 초래할 수 있다. 하나 이상의 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클 단독을 갖는 mRNA 백신은 치료 효과를 가질 수 있지만, 면역조절 분자의 첨가는 치료 효능을 향상시킨다.
[0139] 본원에 더 상세히 설명된 바와 같이, 종양 특이적 항원에 대한 백신접종은 종양 퇴행을 초래할 수 있는 반면, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클 내에 캡슐화된 종양 특이적 항원의 mRNA + 면역조절 분자(예를 들어, 체크포인트 억제제 항체)를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA을 포함하는 mRNA 치료 나노입자의 단일 종양 내 주사는 생존을 개선시킬 수 있다. 면역조절 분자의 예는 mRNA로서 인코딩된 항-CTLA-4 시약과 같은 체크포인트 억제제 항체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
[0140] 추가적인 mRNA 인코딩된 면역조절제의 포함은 장기 생존을 개선시킬 수 있다. 이는 동계 마우스 암 모델에 대해 하기에 상세히 설명되어 있다(예를 들어, 도 2-7 참조). 이러한 실험에서 사용된 mRNA-인코딩된 면역조절제는 일부 경우에 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-CTLA-4)에 추가하여 TGF-베타 길항제 및 단일 사슬 인터루킨-12를 포함하였다. 이러한 실험에서, 장기 생존자인 마우스는 강력하고 지속적인 CD8+ 효과기 T-세포 암 면역을 발달시키고 추가 종양 공격에 내성을 갖는다.
[0141] 일반적으로, mRNA-기반 효과기 분자와 조합된 mRNA-기반 종양 백신접종은 하나 이상의 네오-에피토프를 사용하는 것과 같이 환자-특이적 종양 항원에 대해 수행될 수 있다. 네오-에피토프는, 예를 들어, 종양(예를 들어, 일 예에서, MC38 종양)을 시퀀싱함으로써 확인될 수 있고, 따라서 네오-에피토프는 종양-특이적 항원이다. 임의의 환자-특이적 암 네오-에피토프가 사용될 수 있다.
[0142] mRNA-기반 효과기 분자(예를 들어, 면역조절제)와 조합된 mRNA 기반 종양 백신접종은 공유된 항원, 예를 들어, 상이한 환자로부터의 종양에서 과발현되고 HLA-제시되는 항원에 대해 수행될 수 있다. 본원에 설명된 바와 같은 mRNA 백신은 하나 이상의 아미노-지질화된 펩토이드를 사용하여 나노입자로 제형화될 수 있다. 본원에서 "나노입자"는 가장 큰 치수를 참조하여 나노미터 범위의 크기를 갖는 입자를 지칭할 수 있다. 나노입자는 구체, 타원형, 입방체, 또는 규칙적 또는 불규칙한 기하학적 형상을 포함하는 임의의 적합한 기하학적 형상을 가질 수 있다. 기하학적 형상에 따라, 치수는 길이, 폭, 직경 등을 지칭할 수 있다. 나노입자는 약 1000 nm 미만, 예를 들어, 약 500 nm, 약 300 nm, 약 200 nm, 약 100 nm, 약 80 nm, 약 50 nm, 약 40 nm, 약 30 nm, 약 20 nm 미만, 또는 더 작은 크기를 가질 수 있다. 일 예에서, 나노입자는 약 1 nm 내지 약 1000 nm, 예를 들어, 약 5 nm 내지 약 800 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 15 nm 내지 약 300 nm, 약 20 nm 내지 약 200 nm, 약 30 nm 내지 약 100 nm, 약 40 nm 내지 약 80 nm, 약 50 nm 내지 약 70 nm 등의 크기를 갖는다. 일 예에서, 나노입자는 약 40 nm 내지 약 70 nm의 크기를 갖는다. 다른 적합한 입자 크기가 또한 가능하다. 아미노-지질화된 펩토이드는 전달 비히클로서 작용할 수 있고, mRNA 백신과 조합하여 종양 미세환경에서 고-발현을 제공할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 본원에 설명된 mRNA 백신은 단일 나노입자로 공동-제형화되어 놀랍게도 높은 발현 수준 및 높은 백신접종 효능을 야기할 수 있다. 이들 치료 중 임의의 것은 높은 백신접종 효능에 최적화된 전달 비히클(예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드)을 갖는 나노입자로 제형화된 mRNA 백신을 포함할 수 있다. 언급된 바와 같이, 본원에 설명된 치료 mRNA는 종양-특이적 항원 mRNA 및 하나 이상의 면역조절제 mRNA를 포함할 수 있고; 특정 면역조절제 mRNA는 동일한 전달 비히클에서 종양-특이적 항원 mRNA와 함께 캡슐화될 수 있다.
[0143] 일반적으로, mRNA 백신에 포함된 mRNA는 항원 제시를 돕는 작제물 또는 스캐폴드에 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 도 1a는 일반 mRNA 스캐폴드의 일 예를 개략적으로 예시한다. 도 1a에서, mRNA는 5'에서 3'으로 캡 구조, 5'UTR, 코딩 영역(이는 잠재적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있음), 3' UTR 및 폴리-A 꼬리의 다양한 시스-작용 요소로 구성된다. 이 예에서, mRNA의 시험관 내 전사를 위한 주형은 시스-작용 구조적 요소, 즉, 5'에서 3' 말단으로 (i) 캡 구조, (ii) 5' 비번역 영역(UTR), (iii) 코딩(예를 들어, 최적화된 코돈) 서열, (iv) 3' UTR 및 (v) 반복된 아데닌 뉴클레오티드의 스트레치(폴리A 꼬리)로 구성된다. 캡 구조 및 폴리-A 꼬리 길이는 최적화될 수 있다. 이러한 시스-작용 구조적 요소는 항원 제시를 위해 최적화될 수 있다. 폴리-A-꼬리 및 캡 구조는 mRNA의 효율적인 번역 및 붕괴에 대해 mRNA를 안정화시키는 데 중요하지만, 일부 경우에 UTR은 mRNA의 번역 및 반감기를 제어한다. 순도 및 변형된 뉴클레오시드(예를 들어, 5' 메톡시 우리딘, 5moU)의 혼입과 같은 일반적인 생산 특이성은 mRNA 자체의 면역원성을 변경시킬 수 있고 번역 효율을 유의하게 증가시킬 수 있다. 도 1c는 mRNA 가닥이 종양-특이적 항원 mRNA(예를 들어, 하나 이상의 카피, 및/또는 하나 이상의 종양-특이적 항원) 및 하나 이상의 면역조절제 mRNA ORF 둘 모두를 포함하는 예를 제시한다.
[0144] 도 1b는 암의 치료에서 mRNA 백신의 효능을 개선시키기 위한 방법의 일 예를 개략적으로 예시한다. 도 1b에서, 상기 방법은 단일 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화된 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 백신(예를 들어, 항원 제시를 향상시키는 스캐폴드에서) 및 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA(예를 들어, 제1 면역조절제 mRNA 및 제2 면역조절제 mRNA)를 종양 내 주사하는 것을 포함한다. 예를 들어, 2개(또는 그 초과)의 면역조절제 중 적어도 하나는 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-CTLA-4 mRNA)일 수 있다. mRNA 백신 및 면역조절제는, 예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클일 수 있는 전달 비히클과 함께 캡슐화된다.
[0145] 도 1c는 단일 mRNA 가닥이 종양-특이적 mRNA 및 하나 이상의 면역조절제(예를 들어, 제1 면역조절제, 제2 면역조절제, 제3 면역조절제)를 인코딩하는 mRNA를 포함하여, mRNA 오픈 리딩 프레임(ORF)이 종양-특이적 mRNA 및 면역조절제에 대한 mRNA를 인코딩하는 대안적 예를 제시한다. 이러한 단일 mRNA 가닥은 전달 비히클 분자 내에 캡슐화될 수 있다.
[0146] 면역 반응을 자극하는 물질에 의한 질병의 예방 또는 치료는 일반적으로 면역요법으로 지칭된다. 때때로 면역종양학으로도 지칭되는 면역요법은 종양이 아니라 숙주 면역계를 표적으로 하는 요법을 도입한다. 이러한 요법은 독특한 약리학적 반응 프로파일을 가질 수 있고, 따라서 많은 별개의 유형의 암을 치료할 수 있는 요법을 나타낸다. 일 예에서, 폐, 신장, 방광 및 피부의 암은 특히 흑색종과 마찬가지로, 생존 또는 종양 반응의 관점에서 면역종양학으로의 치료로부터 실질적인 효능을 유도하는 것들에 속한다. 면역요법은 종종 체크포인트 억제제 항체로 공지된 생물학적 약물에 의한 체크포인트 억제제 치료를 특징으로 한다.
[0147] 본 발명의 개시는 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물, 특히, 면역요법적 방법 및 조성물을 개선 또는 향상시키기 위한 방법 및 조성물을 특징으로 한다. 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 단일 전달 비히클 분자로 캡슐화된 (1) 특히 환자-특이적 종양 항원(또는 항원들)을 포함하는 종양-특이적 항원 및 (2) 하나 이상의 면역조절제(예를 들어, 일부 변형에서 체크포인트 억제제 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함함)를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA를 인코딩하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)를 사용하여 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물을 특징으로 한다. 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 단일 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화된 환자-특이적 종양 항원, 및 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역조절 조성물의 향상을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 단일 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화된 환자-특이적 종양 항원, 및 2개 이상의 면역조절제(예를 들어, 항-CTLA-4, 및 TGF-베타 길항제 및 단일 사슬 인터루킨-12 중 하나 또는 둘 모두)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역조절 조성물을 제공한다. mRNA 백신은 이러한 성분들의 혼합물을 임의의 적절하고 효과적인 비율로 포함할 수 있다.
[0148] 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 단일 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화된 환자-특이적 종양 항원의 mRNA, 및 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 사용하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이론에 구속되지 않고, 이러한 mRNA 백신을 투여하고, 특히 종양 내 투여하는 것은, 예를 들어, T-세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 및/또는 수지상 세포를 자극할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 면역 치료 방법은 (1) 종양 미세환경(TME)을 전환시켜 면역원성을 최적화하고/하거나 (2) T 세포 반응을 향상시켜 압스코팔(abscopal) 제어 및 항암 기억을 유도할 수 있다.
[0149] 본 발명의 개시의 다른 양태는 단일 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화된 환자-특이적 종양 항원을 인코딩하는 mRNA, 및 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 유효량의 조합물을 대상체에 투여함으로써 종양의 크기를 줄이거나 감소시키거나 종양의 성장을 억제하는 것을 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 줄이거나 감소시키거나 종양의 성장을 억제하는 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 전달 비히클 분자는, 예를 들어, 2019년 9월 27일에 출원된 "LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS COMPRISING LIPIDATED CATIONIC PEPTIDE COMPOUNDS FOR NUCLEIC ACID DELIVERY"을 제목으로 하는 PCT 출원, PCT/US19/53661호, 및 2019년 9월 27일에 출원된 "TERTIARY AMINO LIPIDATED CATIONIC PEPTIDES FOR NUCLEIC ACID DELIVERY"을 제목으로 하는 PCT/US19/53655호에 설명된 것들 중 임의의 것과 같은 3차 아미노 지질화된 양이온성 펩티드를 포함할 수 있는 아미노 지질화된 펩티드일 수 있으며, 상기 출원 둘 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
[0150] 이러한 전달 비히클 분자는 추가적인 지질/성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노 지질화된 펩티드는 하나 이상의 인지질, 예를 들어, 1-미리스토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MSPC) 또는 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)을 포함할 수 있다. 지질 조성물은 또한 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸-설페이트(DOTAP)와 같은 4차 아민 화합물을 포함할 수 있다.
[0151] 본원에 제공된 표제는 명세서 전체를 참조하여 정의될 수 있는 본 발명의 개시의 다양한 양태 또는 양태들의 제한이 아니다. 따라서, 바로 하기에서 정의되는 용어는 그 전체가 명세서를 참조하여 보다 완전히 정의된다. 본 발명의 개시를 상세히 설명하기 전에, 본 발명의 개시는 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한되지 않으며, 그와 같이 다양할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
[0152] I. 정의
[0153] 본 발명의 개시가 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 달리 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 하기 용어 각각은 하기에 기재된 의미를 가질 것이다. 추가 정의는 출원 전반에 걸쳐 제시된다.
[0154] 본 발명의 개시는 그룹의 정확히 하나의 구성원이 제공된 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이에 사용되거나, 달리 이와 관련이 있는 예를 포함한다. 본 발명의 개시는 그룹 구성원 중 하나 초과의, 또는 전부가 제공된 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이에 사용되거나, 달리 이와 관련이 있는 예를 포함한다.
[0155] 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 용어 "하나"(또는 "하나의") 뿐만 아니라 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 용어 "하나" 또는 "하나의"는 "단일"을 의미한다. 다른 양태에서, 용어 "하나"는 "하나의"는 "2개 이상" 또는 "다수"를 포함한다.
[0156] 또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2개의 특정 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 하기 양태들 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
[0157] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 개시가 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]는 본 발명의 개시에서 사용되는 많은 용어의 일반 사전을 당업자에게 제공한다.
[0158] 양태가 본원에서 "포함하는"이라는 언어로 설명될 때마다, "~로 구성된" 및/또는 "필수적 요소로 하여 구성되는(consisting essentially of)"과 관련하여 설명된 달리 유사한 양태가 또한 제공된다.
[0159] 단위, 접두사 및 기호는 이들의 국제단위계(Systeme International de Unites; SI) 허용 형태로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 값의 범위가 언급되는 경우, 그 범위의 언급된 상한과 하한 사이의 각각의 개재하는 정수 값, 및 이의 각 분획이 또한 이러한 값 사이의 각각의 하위 범위와 함께 구체적으로 개시되는 것으로 이해되어야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 이로부터 배제될 수 있고, 어느 하나의 한계가 포함되거나, 한계 둘 모두가 포함되지 않거나, 한계 둘 모두가 포함된 각각의 범위는 또한 본 발명의 개시 내에 포함된다. 값이 명시적으로 인용되는 경우, 인용된 값과 대략 동일한 수량 또는 양인 값도 본 발명의 개시의 범위 내에 있는 것으로 이해되어야 한다. 조합이 개시되는 경우, 그 조합의 요소들의 각각의 하위조합이 또한 구체적으로 개시되며, 이는 본 발명의 개시의 범위 내에 있다. 반대로, 상이한 요소 또는 요소의 그룹이 개별적으로 개시되는 경우, 이들의 조합이 또한 개시된다. 본 발명의 개시의 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시되는 경우, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과의 임의의 조합으로 배제되는 본 발명의 개시의 예가 또한 본원에 개시되며; 본 발명의 개시의 하나 초과의 요소는 이러한 배제를 가질 수 있고, 이러한 배제를 갖는 요소의 모든 조합이 본원에 개시된다.
[0160] 뉴클레오티드는 이들의 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 지칭된다. 달리 지시되지 않는 한, 핵산은 5'에서 3' 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 뉴클레오티드는 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회에 의해 권장되는 이들의 일반적으로 알려진 1-문자 기호로 본원에서 지칭된다. 따라서, A는 아데닌을 나타내고, C는 시토신을 나타내고, G는 구아닌을 나타내고, T는 티민을 나타내고, U는 우라실을 나타낸다.
[0161] 아미노산은 본원에서 이들의 일반적으로 공지된 3개의 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 1개의 문자 기호로 지칭된다. 달리 지시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다.
[0162] 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 수치 값과 관련하여 사용되는 용어 "실질적으로, "약", 및 "대략"은 작은 변동을 고려한 정확도의 간격을 나타낸다. 일반적으로, 이러한 정확도 간격은 +10%이다. 예를 들어, 이들은 ±10% 이하, 예를 들어, ±5% 이하, 예를 들어, ±1% 이하, 예를 들어, ±0.5% 이하, 예를 들어, ±0.2% 이하, 예를 들어, ±0.1% 이하, 예를 들어, ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다. 일 예에서, 이러한 용어는 변동 없음, ±0을 포함한다.
[0163] 범위가 제공되면, 종점이 포함된다. 또한, 당업자의 맥락 및 이해로부터 달리 나타내거나 달리 명백하지 않는 한, 범위로서 표현되는 값은 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 범위의 하한의 단위의 1/10까지 본 발명의 개시의 상이한 실시예에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위범위를 가정할 수 있다.
[0164] 조합하여 투여되는: 본원에서 사용되는 용어 "조합하여 투여되는", "동시 투여", "조합 투여", 또는 "조합 요법"은 2개 이상의 제제가 동시에 또는 환자에 대한 각각의 제제의 효과가 중첩될 수 있도록 하는 간격 내에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 일부 예에서, 이들은 서로 약 60분 이하, 예를 들어, 약 30분, 약 15분, 약 10분, 약 5분 또는 약 1분 이하 또는 그 미만 내에 투여된다. 일부 예에서, 제제의 투여는 조합(예를 들어, 상승작용적) 효과가 달성되도록 함께 충분히 가깝게 간격을 둔다.
[0165] 용어 "아미노산 치환"은 모 또는 참조 서열(예를 들어, 야생형 서열)에 존재하는 아미노산 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 아미노산은, 예를 들어, 화학적 펩티드 합성을 통해 또는 당 분야에 공지된 재조합 방법을 통해 모 또는 참조 서열(예를 들어, 야생형 폴리펩티드 서열)에서 치환될 수 있다. 따라서, "위치 X에서의 치환"에 대한 언급은 위치 X에 존재하는 아미노산의 대안적인 아미노산 잔기로의 치환을 지칭한다. 일부 양태에서, 치환 패턴은 도식 AnY에 따라 설명될 수 있고, 여기서 A는 위치 n에 자연적으로 또는 원래 존재하는 아미노산에 상응하는 단일 문자 코드이고, Y는 치환 아미노산 잔기이다. 다른 양태에서, 치환 패턴은 도식 An(YZ)에 따라 설명될 수 있고, 여기서 A는 위치 X에 자연적으로 또는 원래 존재하는 아미노산을 치환하는 아미노산 잔기에 상응하는 단일 문자 코드이고, Y 및 Z는 대안적인 치환 아미노산 잔기이다.
[0166] 본 발명의 개시의 맥락에서, 치환(심지어 아미노산 치환으로 지칭되는 경우에도)은 핵산 수준에서 수행되며, 즉, 아미노산 잔기를 대안적인 아미노산 잔기로 치환하는 것은 제1 아미노산을 인코딩하는 코돈을 제2 아미노산을 인코딩하는 코돈으로 치환함으로써 수행된다.
[0167] 동물: 본원에서 사용되는 용어 "동물"은 동물 계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 예에서, "동물"은 발달의 임의의 단계에 있는 인간을 지칭한다. 일부 예에서, "동물"은 임의의 발달 단계의 비인간 동물을 지칭한다. 특정 예에서, 비-인간 동물은 포유동물(예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류, 또는 돼지)이다. 일부 예에서, 동물은 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 및 벌레를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 동물은 트랜스제닉 동물, 유전적으로 공학처리된 동물, 또는 클론이다.
[0168] 관련된: 질병과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "~와 관련된"은 당해 증상, 측정, 특징, 또는 상태가 해당 질병의 진단, 발달, 존재 또는 진행과 연관됨을 의미한다. 관련성은 질병과 인과적으로 연관될 수 있지만, 그럴 필요는 없다.
[0169] 2개 이상의 모이어티와 관련하여 사용될 때, 용어 "~와 관련된", "컨쥬게이션된", "연결된", "부착된", 및 "테더링된"은 2개 이상의 모이어티와 관련하여 사용될 때, 모이어티가 직접적으로 또는 연결제로서 작용하는 하나 이상의 추가의 모이어티를 통해 서로 물리적으로 회합되거나 연결되어, 모이어티가 구조가 사용되는 조건, 예를 들어, 생리학적 조건 하에 물리적으로 회합된 상태로 유지되도록 충분히 안정한 구조를 형성하는 것을 의미한다. "회합"은 엄밀하게는 직접적인 공유 화학 결합을 통해 이루어질 필요는 없다. 이는 또한 "회합된" 독립체가 물리적으로 회합된 상태로 유지되도록 충분히 안정한 이온성 또는 수소 결합 또는 혼성화 기반 연결성을 시사할 수 있다.
[0170] 생체적합성: 본원에서 사용되는 용어 "생체적합성"은 면역계에 의한 손상, 독성 또는 거부의 위험이 거의 또는 전혀 없는 살아있는 세포, 조직, 기관 또는 시스템과의 상용성을 의미한다.
[0171] 생분해성: 본원에서 사용되는 용어 "생분해성"은 생물의 작용에 의해 무해한 생성물로 분해될 수 있는 것을 의미한다.
[0172] 서열 최적화: 용어 "서열 최적화"는 참조 핵산 서열의 핵염기가 대안적인 핵염기로 대체되어, 개선된 특성, 예를 들어, 개선된 단백질 발현 또는 면역원성을 갖는 핵산 서열을 생성시키는 과정 또는 일련의 과정을 지칭한다.
[0173] 일반적으로, 서열 최적화의 목표는 참조 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 것보다 동의어 뉴클레오티드 서열을 생산하는 것이다. 따라서, 참조 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 관련하여 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에는 (코돈 최적화의 결과로서) 아미노산 치환이 없다.
[0174] 코돈 치환: 서열 최적화와 관련하여 용어 "코돈 치환" 또는 "코돈 대체"는 참조 핵산 서열에 존재하는 코돈을 또 다른 코돈으로 대체하는 것을 지칭한다. 코돈은, 예를 들어, 화학적 펩티드 합성을 통해 또는 당 분야에 공지된 재조합 방법을 통해 참조 핵산 서열에서 치환될 수 있다. 따라서, 핵산 서열(예를 들어, mRNA) 또는 핵산 서열(예를 들어, mRNA)의 특정 영역 또는 하위서열 내의 특정 위치에서의 "치환" 또는 "대체"에 대한 언급은 이러한 위치 또는 영역의 코돈의 대안적인 코돈에 의한 치환을 지칭한다.
[0175] 본원에서 사용되는 용어 "코딩 영역" 및 "인코딩하는 영역" 및 이의 문법적 변형은 발현시 폴리펩티드 또는 단백질을 생성하는 폴리뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 지칭한다.
[0176] "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신 또는 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 또는 히스티딘)를 포함하는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당 분야에 정의되어 있다. 따라서, 폴리펩티드의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산으로 대체되는 경우, 아미노산 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 또 다른 양태에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
[0177] 비보존적 아미노산 치환은 (i) 전기양성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Arg, His 또는 Lys)가 전기음성 잔기(예를 들어, Glu 또는 Asp)를 치환하거나 이에 의해 치환되거나, (ii) 친수성 잔기(예를 들어, Ser 또는 Thr)가 소수성 잔기(예를 들어, Ala, Leu, Ile, Phe 또는 Val)를 치환하거나 이에 의해 치환되거나, (iii) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기를 치환하거나 이에 의해 치환되거나, (iv) 부피가 큰 소수성 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Val, His, Ile 또는 Trp)가 작은 측쇄를 갖거나(예를 들어, Ala 또는 Ser) 측쇄를 갖지 않는(예를 들어, Gly) 것을 치환하거나 이에 의해 치환되는 것들을 포함한다.
[0178] 다른 적합한 아미노산 치환이 또한 가능하다. 예를 들어, 아미노산 알라닌의 경우, D-알라닌, 글리신, 베타-알라닌, L-시스테인 및 D-시스테인 중 어느 하나로부터 치환이 이루어질 수 있다. 리신의 경우, 대체물은 D-리신, 아르기닌, D-아르기닌, 호모-아르기닌, 메티오닌, D-메티오닌, 오르니틴 또는 D-오르니틴 중 어느 하나일 수 있다. 일반적으로, 분리된 폴리펩티드의 특성의 변화를 유도할 것으로 예상될 수 있는 기능적으로 중요한 영역에서의 치환은 (i) 극성 잔기, 예를 들어, 세린 또는 트레오닌이 소수성 잔기, 예를 들어, 류신, 이소류신, 페닐알라닌 또는 알라닌을 치환하거나(또는 이에 의해 치환되거나); (ii) 시스테인 잔기가 임의의 다른 잔기를 치환하거나(또는 이에 의해 치환되거나); (iii) 전기양성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘이 전기음성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 글루탐산 또는 아스파르트산을 치환하거나(또는 이에 의해 치환되거나); (iv) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 것, 예를 들어, 글리신을 치환하는(또는 이에 의해 치환되는) 것들이다. 전술한 비-보존적 치환 중 하나가 단백질의 기능적 특성을 변경할 수 있는 가능성은 또한 단백질의 기능적으로 중요한 영역에 대한 치환의 위치와 상관관계가 있으며: 일부 비-보존적 치환은 따라서 생물학적 특성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 수 있다.
[0179] 보존된: 본원에서 사용되는 용어 "보존된"은 비교되는 2개 이상의 서열의 동일한 위치에서 변경되지 않고 발생하는 것들인 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 각각 지칭한다. 비교적 보존된 뉴클레오티드 또는 아미노산은 서열의 다른 곳에서 나타나는 뉴클레오티드 또는 아미노산보다 더 관련된 서열 사이에 보존된 것들이다.
[0180] 일부 예에서, 2개 이상의 서열은 이들이 서로 100% 동일한 경우 "완전히 보존된" 것으로 언급된다. 일부 예에서, 2개 이상의 서열은 이들이 서로 적어도 약 70% 동일하거나, 예를 들어, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 그 초과로 동일한 경우 "매우 보존된" 것으로 언급된다. 일부 예에서, 2개 이상의 서열은 이들이 서로 약 70% 동일하거나, 약 80% 동일하거나, 약 90% 동일하거나, 약 95%, 약 98%, 또는 약 99%, 또는 그 초과로 동일한 경우 "매우 보존된" 것으로 언급된다. 일부 예에서, 2개 이상의 서열은 이들이 서로 적어도 약 30% 동일하거나, 적어도 약 40% 동일하거나, 적어도 약 50% 동일하거나, 적어도 약 60% 동일하거나, 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일한 경우 "보존된" 것으로 언급된다. 일부 예에서, 2개 이상의 서열은 이들이 서로 약 30% 동일하거나, 약 40% 동일하거나, 약 50% 동일하거나, 약 60% 동일하거나, 약 70% 동일하거나, 약 80% 동일하거나, 약 90% 동일하거나, 약 95% 동일하거나, 약 98% 동일하거나, 약 99% 동일한 경우 "보존된" 것으로 언급된다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이에 적용될 수 있거나 이의 일부, 영역 또는 특징에 적용될 수 있다.
[0181] 접촉하는: 본원에서 사용되는 용어 "접촉하는"은 2개 이상의 독립체 사이에 물리적 연결을 확립하는 것을 의미한다. 예를 들어, 포유동물 세포를 나노입자 조성물과 접촉시키는 것은 포유동물 세포와 나노입자가 물리적 연결을 공유하도록 만들어진다는 것을 의미한다. 생체 내 및 생체 외 둘 모두에서 세포를 외부 독립체와 접촉시키는 방법은 생물학 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 나노입자 조성물과 포유동물 내에 배치된 포유동물 세포의 접촉은 다양한 투여 경로(예를 들어, 정맥 내, 근육 내, 피내 및 피하)에 의해 수행될 수 있고, 다양한 양의 나노입자 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 하나 초과의 포유동물 세포는 나노입자 조성물에 의해 접촉될 수 있다.
[0182] 제어 방출: 본원에서 사용되는 용어 "제어 방출"은 치료 결과에 영향을 미치는 특정 방출 패턴을 따르는 약학적 조성물 또는 화합물 방출 프로파일을 지칭한다.
[0183] 공유 유도체: 폴리펩티드를 언급할 때 용어 "공유 유도체"는 유기 단백질성 또는 비-단백질성 유도체화제에 의한 고유 또는 출발 단백질의 변형, 및/또는 번역후 변형을 포함한다. 공유 변형은 전통적으로 단백질의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키거나, 선택된 재조합 숙주 세포에서 기능하는 번역-후 변형의 메커니즘을 이용함으로써 도입된다. 생성된 공유 유도체는 생물학적 활성, 면역검정, 또는 재조합 당단백질의 면역친화성 정제를 위한 항-단백질 항체의 제조에 중요한 잔기를 확인하기 위한 프로그램에 유용하다. 이러한 변형은 당 분야의 통상적인 기술 범위 내에 있으며 과도한 실험 없이 수행된다.
[0184] 사이클릭 또는 고리화된: 본원에서 사용되는 용어 "사이클릭"은 연속 루프의 존재를 지칭한다. 사이클릭 분자는 원형일 필요는 없으며, 단지 연결되어 서브유닛의 파손되지 않은 사슬을 형성한다. 조작된 RNA 또는 mRNA와 같은 사이클릭 분자는 단일 단위 또는 다량체일 수 있거나, 복합체 또는 고차 구조의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
[0185] 세포독성: 본원에서 사용되는 "세포독성"은 세포(예를 들어, 포유동물 세포(예를 들어, 인간 세포)), 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물, 기생충, 프리온, 또는 이들의 조합을 사멸시키거나 이에 대해 유해한, 독성 또는 치명적인 효과를 야기하는 것을 지칭한다.
[0186] 전달하는: 본원에서 사용되는 용어 "전달하는"은 독립체를 목적지에 제공하는 것을 의미한다. 예를 들어, 대상체에게 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 나노입자 조성물을 대상체에게 (예를 들어, 정맥 내, 근육 내, 피내, 또는 피하 경로에 의해) 투여하는 것을 포함할 수 있다. 포유동물 또는 포유동물 세포에 나노입자 조성물을 투여하는 것은 하나 이상의 세포를 나노입자 조성물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
[0187] 전달 비히클: 본원에서 사용되는 "전달 비히클"은 표적화된 세포 또는 조직(예를 들어, 종양 등)으로의 폴리뉴클레오티드의 생체 내, 시험관 내, 또는 생체 외 전달을 적어도 부분적으로 촉진하는 임의의 물질을 지칭한다. 전달 비히클로서 무언가를 언급하는 것은 그것이 또한 치료 효과를 갖지 않을 수 있음을 의미하지 않는다.
[0188] 불안정화된: 본원에서 사용되는 용어 "불안정한", "불안정화" 또는 "불안정화 영역"은 동일한 영역 또는 분자의 출발, 야생형 또는 고유 형태보다 덜 안정한 영역 또는 분자를 의미한다.
[0189] 검출 가능한 표지: 본원에서 사용되는 "검출 가능한 표지"는 방사선촬영술, 형광, 화학발광, 효소적 활성, 흡광도 등을 포함하는 당 분야에 공지된 방법에 의해 용이하게 검출되는 또 다른 독립체와 부착, 혼입 또는 회합된 하나 이상의 마커, 신호, 또는 모이어티를 지칭한다. 검출 가능한 표지는 방사성동위원소, 형광단, 발색단, 효소, 염료, 금속 이온, 리간드, 예를 들어, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 및 합텐, 양자점 등을 포함한다. 검출 가능한 표지는 본원에 개시된 펩티드 또는 단백질의 임의의 위치에 위치할 수 있다. 이들은 아미노산, 펩티드, 또는 단백질 내에 있거나, N- 또는 C-말단에 위치할 수 있다.
[0190] 부분입체 이성질체: 본원에서 사용되는 용어 "부분입체 이성질체"는 서로의 거울상이 아니고 서로 중첩될 수 없는 입체이성질체를 의미한다.
[0191] 소화: 본원에서 사용되는 용어 "소화"는 더 작은 조각 또는 성분으로 분해되는 것을 의미한다. 폴리펩티드 또는 단백질을 언급할 때, 소화는 펩티드의 생산을 초래한다.
[0192] 원위: 본원에서 사용되는 용어 "원위"는 중심으로부터 멀리 또는 관심 지점 또는 영역으로부터 멀리 위치하는 것을 의미한다.
[0193] 도메인: 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드를 언급할 때, 용어 "도메인"은 하나 이상의 식별 가능한 구조적 또는 기능적 특징 또는 특성(예를 들어, 결합 능력, 단백질-단백질 상호작용을 위한 부위로서 작용함)을 갖는 폴리펩티드의 모티프를 지칭한다.
[0194] 투여 요법: 본원에서 사용되는 "투여 요법" 또는 "투여 요법"은 투여 스케줄 또는 의사 결정 치료, 예방, 또는 완화 치료 요법이다.
[0195] 유효량: 본원에서 사용되는 용어 제제의 "유효량"은 유익한 또는 원하는 결과, 예를 들어, 임상 결과에 영향을 미치기에 충분한 양이며, 따라서 "유효량"은 그것이 적용되는 상황에 좌우된다. 예를 들어, 종양을 치료하는 제제를 투여하는 맥락에서, 제제의 유효량은, 예를 들어, 제제의 투여 없이 획득된 반응에 비해 종양의 크기를 줄이거나 감소시키거나 종양 성장을 억제하기에 충분한 양이다. 용어 "유효량"은 "유효 용량", "치료 유효량" 또는 "치료 유효 용량"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
[0196] 거울상 이성질체: 본원에서 사용되는 용어 "거울상 이성질체"는 적어도 약 80%의 광학 순도 또는 거울상 이성질체 과잉(당 분야의 표준 방법에 의해 결정됨)(즉, 적어도 약 90%의 하나의 거울상 이성질체 및 최대 약 10%의 다른 거울상 이성질체), 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 98%, 또는 그 초과의 광학 순도 또는 거울상 이성질체 과잉을 갖는 본 발명의 개시의 화합물의 각각의 개별적인 광학적으로 활성인 형태를 의미한다.
[0197] 캡슐화하다: 본원에서 사용되는 용어 "캡슐화하다"는 mRNA와 상호작용하는 전달 비히클과 관련하여 완전히 또는 부분적으로 둘러싸거나 엔케이싱하는 것을 의미하며; 이는 mRNA를 분해로부터 보호하고 세포 흡수를 촉진할 수 있다. 이는 캡슐화 전달 비히클에 의해 mRNA를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "함께 캡슐화된"은 동일한 전달 비히클 분자에 의해 캡슐화된 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 같은 2개 이상의 분자를 지칭한다. 제1 mRNA 및 제2 mRNA는 상이한 폴리뉴클레오티드 가닥 상에 인코딩될 수 있거나, 이들은 동일한 가닥의 일부일 수 있다. 일부 예에서, 동일한 유형의 다수의 mRNA는 결정된 화학량론(예를 들어, 1:1, 1:2, 2:1 등)으로 동일한 전달 비히클 분자에 함께 캡슐화될 수 있다.
[0198] 캡슐화 효율: 본원에서 사용되는 "캡슐화 효율"은 나노입자 조성물의 제조에 사용된 폴리뉴클레오티드의 초기 총량에 비한, 나노입자 조성물의 일부가 되는 폴리뉴클레오티드의 양을 지칭한다. 예를 들어, 초기에 조성물에 제공된 총 100 mg의 폴리뉴클레오티드 중에서 97 mg의 폴리뉴클레오티드가 나노입자 조성물에 캡슐화되는 경우, 캡슐화 효율은 97%로 제공될 수 있다. 본원에서 사용되는 "캡슐화"는 완전한, 실질적인 또는 부분적인 동봉(enclosure), 제한(confinement), 둘러쌈(surrounding), 또는 엔케이싱(encasement)을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 캡슐화는 약 80% 이상 캡슐화, 약 85% 이상 캡슐화, 약 90% 이상 캡슐화, 약 95% 이상 캡슐화, 또는 완전히 캡슐화되는 것을 지칭할 수 있다.
[0199] 인코딩된 단백질 절단 신호: 본원에서 사용되는 "인코딩된 단백질 절단 신호"는 단백질 절단 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
[0200] 조작된: 본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 개시의 예는 출발점, 야생형 또는 고유 분자로부터 다양한 구조적이거나 화학적이건 간에 특징 또는 특성을 갖도록 설계될 때 "조작된" 것이다.
[0201] 향상된 전달: 본원에서 사용되는 용어 "향상된 전달"은 관심 표적 조직으로의 대조군 나노입자에 의한 폴리뉴클레오티드의 전달 수준과 비교하여 관심 표적 조적(예를 들어, 포유동물 간 조직)으로의 나노입자에 의한 보다 많은(예를 들어, 적어도 약 1.5배 이상, 예를 들어, 적어도 약 2배 이상, 적어도 3배 이상, 적어도 4배 이상, 적어도 5배 이상, 적어도 6배 이상, 적어도 7배 이상, 적어도 8배 이상, 적어도 9배 이상, 적어도 10배 이상, 또는 그 초과) 폴리뉴클레오티드의 전달을 의미한다. 특정 조직으로의 나노입자의 전달 수준은 조직에서 생산된 단백질의 양을 상기 조직의 중량과 비교하거나, 조직에서의 폴리뉴클레오티드의 양을 상기 조직의 중량과 비교하거나, 조직에서 생산된 단백질의 양을 상기 조직에서의 총 단백질의 양과 비교하거나, 조직에서의 폴리뉴클레오티드의 양을 상기 조직에서의 총 폴리뉴클레오티드의 양과 비교함으로써 측정될 수 있다. 표적 조직으로의 나노입자의 향상된 전달은 치료되는 대상체에서 결정될 필요는 없으며, 동물 모델(예를 들어, 래트 모델)과 같은 대리에서 결정될 수 있음이 이해될 것이다.
[0202] 엑소좀: 본원에서 사용되는 "엑소좀"은 포유동물 세포에 의해 분비되는 소포 또는 RNA 분해에 관여하는 복합체이다.
[0203] 발현: 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"은 하기 사건 중 하나 이상을 지칭한다: (1) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생산(예를 들어, 전사에 의함); (2) RNA 전사체의 처리(예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성, 및/또는 3' 말단 처리에 의함); (3) RNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; 및 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역-후 변형.
[0204] 생체외: 본원에서 사용되는 용어 "생체 외"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물, 또는 미생물 또는 이의 세포 또는 조직) 외부에서 발생하는 사건을 지칭한다. 생체외 사건은 자연(예를 들어, 생체 내) 환경으로부터 최소한으로 변경된 환경에서 일어날 수 있다.
[0205] 특징: 본원에서 사용되는 "특징"은 특성, 성질, 또는 구별되는 요소를 지칭한다. 폴리펩티드를 언급할 때, "특징"은 분자의 별개의 아미노산 서열-기반 성분으로서 정의된다. 본 발명의 개시의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 특징은 표면 발현, 국소 입체형태적 형상, 접힘, 루프, 반-루프, 도메인, 반-도메인, 부위, 말단 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
[0206] 제형: 본원에서 사용되는 "제형"은 적어도 폴리뉴클레오티드, 및 담체, 부형제 및 전달제 중 하나 이상을 포함한다.
[0207] 단편: 본원에서 사용되는 "단편"은 일부를 지칭한다. 예를 들어, 단백질의 단편은 배양된 세포로부터 분리된 전장 단백질을 분해함으로써 획득된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 단편은 N-말단, 및/또는 C-말단, 및/또는 내부 하위서열이 결실된 전장 단백질의 하위서열(예를 들어, IL-23의 서브유닛 중 하나)이다. 본 발명의 개시의 일부 양태에서, 본 발명의 개시의 단백질의 단편은 기능성 단편이다.
[0208] 기능성: 본원에서 사용되는 "기능성" 생물학적 분자는 이것이 특징화되는 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태의 생물학적 분자이다. 따라서, 본 발명의 개시의 폴리뉴클레오티드의 기능성 단편은 기능성 인터루킨 단편을 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. 본원에서 사용되는 인터루킨의 기능적 단편은 야생형 인터루킨의 단편(즉, 인터루킨의 자연 발생 형태의 단편), 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체를 지칭하며, 여기서 단편은 상응하는 전장 단백질의 생물학적 활성의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%를 보유한다.
[0209] 상동성: 본원에서 사용되는 용어 "상동성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어, 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일반적으로, 용어 "상동성"은 2개의 분자 사이의 진화적 관계를 의미한다. 따라서, 상동성인 2개의 분자는 공통의 진화적 조상을 가질 것이다. 본 발명의 개시의 맥락에서, 용어 상동성은 동일성 및 유사성 둘 모두를 포함한다.
[0210] 일부 예에서, 중합체 분자는 분자 내의 단량체의 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 동일하거나(정확히 동일한 단량체) 유사한(보존적 치환) 경우에 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. 용어 "상동성"은 반드시 적어도 2개의 서열(폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열) 사이의 비교를 지칭한다.
[0211] 동일성: 본원에서 사용되는 용어 "동일성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 단량체 보존을 지칭한다. 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 동일성 백분율의 계산은, 예를 들어, 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 갭이 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있고, 동일하지 않은 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 특정 예에서, 비교 목적으로 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%이다. 이후, 상응하는 뉴클레오티드 위치의 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 동일성 백분율은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민(T) 및 우라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다.
[0212] 적합한 소프트웨어 프로그램은 단백질 및 뉴클레오티드 서열 둘 모두의 정렬을 위해 다양한 공급원으로부터 이용 가능하다. 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 하나의 적합한 프로그램은 미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 입수 가능한 BLAST 프로그램 세트의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 2개의 서열 사이의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는데 사용되는 반면, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은, 예를 들어, 생물정보학 프로그램의 EMBOSS 세트의 일부이고 또한 유럽 생물정보학 연구소(European Bioinformatics Institute; EBI)로부터 입수 가능한 Needle, Stretcher, Water 또는 Matcher이다.
[0213] 서열 정렬은 MAFFT, Clustal(ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE 등과 같은 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
[0214] 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 정렬되는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 이들의 고유한 서열 동일성 백분율을 가질 수 있다. 서열 동일성 백분율 값은 가장 가까운 10분의 1로 반올림됨을 유의한다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13 및 80.14는 80.1로 반올림되는 반면, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 및 80.19는 80.2로 반올림된다. 길이 값은 항상 정수일 것임을 또한 유의한다.
[0215] 특정 양태에서, 제2 아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 대한 제1 아미노산 서열(또는 핵산 서열)의 동일성 백분율 "% ID"는 % ID = 100x(Y/Z)로서 계산되며, 여기서 Y는 제1 및 제2 서열의 정렬(시각 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨)에서 동일한 매치로서 스코어링된 아미노산 잔기(또는 핵염기)의 수이고, Z는 제2 서열에서 잔기의 총 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 긴 경우, 제2 서열에 대한 제1 서열의 동일성 백분율은 제1 서열에 대한 제2 서열의 동일성 백분율보다 높을 것이다.
[0216] 서열 동일성 백분율의 계산을 위한 서열 정렬의 생성은 일차 서열 데이터에 의해 독점적으로 구동되는 이원 서열-서열 비교에 제한되지 않는다. 또한, 서열 정렬은 구조 데이터(예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능 데이터(예를 들어, 돌연변이의 위치), 또는 계통 발생 데이터와 같은 이종 공급원으로부터의 데이터와 서열 데이터를 통합함으로써 생성될 수 있음이 이해될 것이다. 이종 데이터를 통합하여 다중 서열 정렬을 생성하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 이용 가능한 T-Coffee이고, 대안적으로, 예를 들어, EBI로부터 이용 가능하다. 서열 동일성 백분율을 계산하는데 사용되는 최종 정렬은 자동으로 또는 수동으로 큐레이트(curate)될 수 있음이 또한 이해될 것이다.
[0217] 면역 체크포인트 억제제: "면역 체크포인트 억제제" 또는 간단히 "체크포인트 억제제"는 면역 세포가 암 세포에 의해 꺼지는 것을 방지하는 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 체크포인트 억제제는 억제성 체크포인트 분자, 예를 들어, 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4), 프로그래밍된 사멸 1 수용체(PD-1) 또는 PD-1 리간드 1(PD-L1)를 중화시키거나 억제하는 폴리펩티드(예를 들어, 항체) 또는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)를 지칭한다.
[0218] 면역 반응: 용어 "면역 반응"은 침입하는 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적 손상, 이들의 파괴, 또는 이들의 인체로부터의 제거를 초래하는, 예를 들어, 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생성된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체를 포함함)의 작용을 지칭한다.
[0219] 염증 반응: "염증 반응"은 특이적 및 비특이적 방어 시스템을 포함하는 면역 반응을 지칭한다. 특정 방어 시스템 반응은 항원에 대한 특정 면역계 반응이다. 특정 방어 시스템 반응의 예는 항체 반응을 포함한다. 비특이적 방어 시스템 반응은 일반적으로 면역학적 기억이 불가능한 백혈구, 예를 들어, 대식세포, 호산구 및 호중구에 의해 매개되는 염증 반응이다. 일부 양태에서, 면역 반응은 염증성 사이토카인의 분비를 포함하여, 상승된 염증성 사이토카인 수준을 초래한다.
[0220] 염증성 사이토카인: 용어 "염증성 사이토카인"은 염증 반응에서 상승되는 사이토카인을 지칭한다. 염증성 사이토카인의 예는 인터루킨-6(IL-6), CXCL1(케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1; GROc로도 알려져 있음, 인터페론-γ(IFNγ), 종양 괴사 인자 α(TNFα), 인터페론 γ-유도된 단백질 10(IP-10), 또는 과립구-집락 자극 인자(G-CSF)를 포함한다. 용어 염증성 사이토카인은 또한 당 분야에 공지된 염증 반응과 관련된 다른 사이토카인, 예를 들어, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-12(L-12), 인터루킨-13(IL-13), 인터페론 α(IFN-α) 등을 포함한다.
[0221] 시험관 내: 본원에서 사용되는 용어 "시험관 내"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물 또는 미생물) 내보다는 인공 환경, 예를 들어, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양물, 페트리 디쉬 등에서 발생하는 사건을 지칭한다.
[0222] 생체 내: 본원에서 사용되는 용어 "생체 내"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물, 또는 미생물 또는 이의 세포 또는 조직) 내에서 발생하는 사건을 지칭한다.
[0223] 삽입 및 결실 변이체: 폴리펩티드를 언급할 때 "삽입 변이체"는 고유 또는 출발 서열의 특정 위치에서 아미노산에 바로 인접하여 삽입된 하나 이상의 아미노산을 갖는 것들이다. 아미노산에 "바로 인접한"은 아미노산의 알파-카르복시 또는 알파-아미노 작용기에 연결된 것을 의미한다. 폴리펩티드를 언급할 때 "결실 변이체"는 고유 또는 출발 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것들이다. 일반적으로, 결실 변이체는 분자의 특정 영역에서 결실된 하나 이상의 아미노산을 가질 것이다.
[0224] 온전한: 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 맥락에서, 용어 "온전한"은 야생형 단백질에 상응하는 아미노산을 보유하는, 예를 들어, 야생형 아미노산을 돌연변이시키거나 치환하지 않는 것을 의미한다. 반대로, 핵산의 맥락에서, 용어 "온전한"은 야생형 핵산에 상응하는 핵염기를 보유하는, 예를 들어, 야생형 핵염기를 돌연변이시키거나 치환하지 않는 것을 의미한다.
[0225] 분리된: 본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 (자연에서 또는 실험 환경에서) 관련된 성분의 적어도 일부로부터 분리된 물질 또는 독립체를 지칭한다. 분리된 물질(예를 들어, 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 서열)은 이들이 회합된 물질과 관련하여 다양한 수준의 순도를 가질 수 있다. 분리된 물질 및/또는 독립체는 이들이 처음에 회합되었던 다른 성분의 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 그 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 예에서, 분리된 제제는 약 80% 초과, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 순수하다. 본원에서 사용되는 물질은 다른 성분이 실질적으로 없는 경우 "순수한" 것이다. 용어 "실질적으로 분리된"은 화합물이 그것이 형성되거나 검출된 환경으로부터 실질적으로 분리됨을 의미한다. 부분 분리는, 예를 들어, 본 발명의 개시의 화합물이 풍부한 조성물을 포함할 수 있다. 실질적인 분리는 본 발명의 개시의 화합물 또는 이의 염의 적어도 약 50 중량%, 적어도 약 60 중량%, 적어도 약 70 중량%, 적어도 약 80 중량%, 적어도 약 90 중량%, 적어도 약 95 중량%, 적어도 약 97 중량%, 또는 적어도 약 99 중량%를 함유하는 조성물을 포함할 수 있다.
[0226] "분리된" 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드, 세포, 또는 임의의 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드, 세포, 또는 조성물이다. 분리된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드, 또는 조성물은 이들이 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 분리된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
[0227] 이성질체: 본원에서 사용되는 용어 "이성질체"는 본 발명의 개시의 임의의 화합물의 임의의 호변이성질체, 입체이성질체, 거울상 이성질체, 또는 부분입체 이성질체를 의미한다. 본 발명의 개시의 화합물은 하나 이상의 키랄 중심 및/또는 이중 결합을 가질 수 있고, 따라서 이중-결합 이성질체(즉, 기하 E/Z 이성질체) 또는 부분입체 이성질체(예를 들어, 거울상 이성질체(즉, (+) 또는 (-)) 또는 시스/트랜스 이성질체)와 같은 입체 이성질체로 존재할 수 있는 것으로 인식된다. 본 발명의 개시에 따르면, 본원에 도시된 화학 구조, 및 따라서, 본 발명의 개시의 화합물은 모든 상응하는 입체이성질체, 즉, 입체이성질체적으로 순수한 형태(예를 들어, 기하학적으로 순수한, 거울상 이성질체적으로 순수한, 또는 부분입체 이성질체적으로 순수한) 및 거울상 이성질체 및 입체이성질체 혼합물, 예를 들어, 라세미체 둘 모두를 포함한다. 본 발명의 개시의 화합물의 거울상 이성질체 및 입체 이성질체 혼합물은 통상적으로 널리 공지된 방법, 예를 들어, 키랄-상 기체 크로마토그래피, 키랄-상 고성능 액체 크로마토그래피, 키랄 염 복합체로서 화합물 결정화, 또는 키랄 용매에서 화합물 결정화에 의해 이들의 구성요소 거울상 이성질체 또는 입체 이성질체로 분해될 수 있다. 거울상 이성질체 및 입체 이성질체는 또한 널리 공지된 비대칭 합성 방법에 의해 입체 이성질체적으로 또는 거울상 이성질체적으로 순수한 중간체, 시약, 및 촉매로부터 획득될 수 있다.
[0228] 링커: 본원에서 사용되는 "링커"는 원자의 기, 예를 들어, 약 10-1,000개의 원자를 지칭하고, 비제한적인 예로, 탄소, 아미노, 알킬아미노, 산소, 황, 설폭사이드, 설포닐, 카르보닐, 및 이민과 같은 원자 또는 기를 포함할 수 있다. 링커는 제1 말단에서 핵염기 또는 당 모이어티 상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 부착될 수 있고, 제2 말단에서 페이로드, 예를 들어, 검출가능한 제제 또는 치료제에 부착될 수 있다. 링커는 핵산 서열로의 혼입을 방해하지 않는 충분한 길이일 수 있다. 링커는 임의의 유용한 목적, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 멀티머(예를 들어, 2개 이상의 키메라 폴리뉴클레오티드 분자 또는 IVT 폴리뉴클레오티드의 연결을 통해) 또는 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트를 형성할 뿐만 아니라 본원에 설명된 바와 같은 페이로드를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 링커에 혼입될 수 있는 화학적 기의 예는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아미도, 아미노, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 알킬렌, 헤테로알킬렌, 아릴, 또는 헤테로사이클릴을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 선택적으로 본원에 설명된 바와 같이 치환될 수 있다. 링커의 예는 불포화 알칸, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜 단량체 단위, 예를 들어, 디에틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 또는 테트라에틸렌 글리콜), 및 덱스트란 중합체 및 이의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 예는 링커 내의 절단 가능한 모이어티, 예를 들어, 환원제 또는 광분해를 사용하여 절단될 수 있는 디설파이드 결합(―S―S―) 또는 아조 결합(―N=N―)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 선택적으로 절단 가능한 결합의 비제한적인 예는, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 또는 다른 환원제의 사용, 및/또는 광분해에 의해 절단될 수 있는 아미도 결합 뿐만 아니라, 예를 들어, 산성 또는 염기성 가수분해에 의해 절단될 수 있는 에스테르 결합을 포함한다.
[0229] 투여 방법: 본원에서 사용되는 "투여 방법"은 정맥 내, 근육 내, 피내, 피하, 또는 대상체에게 조성물을 전달하는 다른 방법을 포함할 수 있다. 투여 방법은 신체의 특정 영역 또는 시스템으로의 전달을 표적화(예를 들어, 특이적으로 전달)하도록 선택될 수 있다. 특히, 종양 내 주사(예를 들어, 하나 이상의 종양으로 또는 종양에 바로 인접한 조직으로의 주사)가 본원에 설명된다.
[0230] 변형된: 본원에서 사용되는 "변형된"은 본 발명의 개시의 분자의 변경된 상태 또는 구조를 지칭한다. 분자는 화학적으로, 구조적으로, 및 기능적으로를 포함하는 많은 방식으로 변형될 수 있다. 일부 예에서, 본 발명의 개시의 mRNA 분자는, 예를 들어, 천연 리보뉴클레오티드 A, U, G 및 C와 관련하여 비-천연 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드의 도입에 의해 변형된다. 캡 구조와 같은 비정규 뉴클레오티드는 A, C, G, U 리보뉴클레오티드의 화학 구조와 상이하지만 "변형된" 것으로 간주되지 않는다.
[0231] 자연 발생: 본원에서 사용되는 "자연 발생"은 인공적인 도움 없이 자연에 존재하는 것을 의미한다.
[0232] 비-인간 척추동물: 본원에서 사용되는 "비-인간 척추동물"은 야생 및 가축 종을 포함하는 호모 사피엔스를 제외한 모든 척추동물을 포함한다. 비-인간 척추동물의 예는 알파카, 반텡, 들소, 낙타, 고양이, 소, 사슴, 개, 당나귀, 가얄, 염소, 기니피그, 말, 라마, 노새, 돼지, 토끼, 순록, 양, 물소, 및 야크와 같은 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0233] 용어 "핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"("폴리뉴클레오티드 서열"의 예)은 상호교환적으로 사용되며 인접한 핵산 서열을 지칭한다. 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 예를 들어, mRNA일 수 있다.
[0234] 가장 넓은 의미의 용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 이러한 중합체는 종종 폴리뉴클레오티드로 지칭된다. 본 발명의 개시의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드의 예는 리보핵산(RNA), 데옥시리보핵산(DNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(β-D-리보 구성을 갖는 LNA, α-L-리보 구성을 갖는 α-LNA(LNA의 부분입체 이성질체)), 2'-아미노 작용기화를 갖는 2'-아미노-LNA, 및 2'-아미노 작용기화를 갖는 2'-아미노-α-LNA를 포함하는 LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 사이클로헥세닐 핵산(CeNA) 또는 이들의 하이브리드 또는 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0235] 어구 "~을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA 또는 DNA 분자) 코딩 서열을 지칭한다. 코딩 서열은 프로모터를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호 및 핵산이 투여되는 개체 또는 포유동물의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함할 수 있다. 코딩 서열은 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.
[0236] 표적 외: 본원에서 사용되는 "표적 외"는 임의의 하나 이상의 표적, 유전자 또는 세포 전사체에 대한 임의의 의도하지 않은 효과를 지칭한다.
[0237] 오픈 리딩 프레임: 본원에서 사용되는 "오픈 리딩 프레임" 또는 "ORF"는 제공된 리딩 프레임에 정지 코돈을 함유하지 않는 서열을 지칭한다.
[0238] 작동 가능하게 연결된: 본원에서 사용되는 어구 "작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 분자, 작제물, 전사체, 독립체, 모이어티 등 사이의 기능적 연결을 지칭한다.
[0239] 선택적으로 치환된: 본원에서 "선택적으로 치환된 X"(예를 들어, 선택적으로 치환된 알킬) 형태의 어구는 "X, 여기서 X는 선택적으로 치환됨"(예를 들어, "알킬, 여기서 상기 알킬은 선택적으로 치환됨)"과 동등한 것으로 의도된다. 특징 "X"(예를 들어, 알킬) 자체가 선택적임을 의미하는 것은 아니다.
[0240] 부분: 본원에서 사용되는 폴리뉴클레오티드의 "부분" 또는 "영역"은 폴리뉴클레오티드의 전체 길이보다 짧은 폴리뉴클레오티드의 임의의 일부로서 정의된다.
[0241] 환자: 본원에서 사용되는 "환자"는 치료를 원하거나 필요로 하거나, 치료를 요구하거나, 치료를 받고 있거나, 치료를 받을 대상체, 또는 특정 질병 또는 질환에 대해 훈련된 전문가의 관리 하에 있는 대상체를 지칭한다.
[0242] 약학적으로 허용되는: 어구 "약학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
[0243] 약학적으로 허용되는 부형제: 본원에서 사용되는 어구 "약학적으로 허용되는 부형제"는 환자에서 실질적으로 비독성이고 비-염증성인 특성을 갖는 본원에 설명된 화합물 이외의 임의의 성분(예를 들어, 활성 화합물을 현탁시키거나 용해시킬 수 있는 비히클)을 지칭한다. 부형제는, 예를 들어, 부착방지제, 산화방지제, 결합제, 코팅, 압축 보조제, 붕해제, 염료(색소), 연화제, 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅, 향미제, 방향제, 활택제(유동 증진제), 윤활제, 보존제, 인쇄 잉크, 흡수제, 현탁제 또는 분산제, 감미제, 및 수화수를 포함할 수 있다. 예시적인 부형제는 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트(이염기성), 칼슘 스테아레이트, 크로스카르멜로스, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로스, 메틸 파라벤, 미세결정질 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 전호화 전분, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 셸락, 이산화규소, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소듐 시트레이트, 소듐 전분 글리콜레이트, 소르비톨, 전분(옥수수), 스테아르산, 수크로스, 탈크, 티탄 디옥사이드, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 및 자일리톨을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0244] 약학적으로 허용되는 염: 본 발명의 개시는 또한 본원에 설명된 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물이 기존의 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환시킴으로써(예를 들어, 유리 염기 기를 적합한 유기산과 반응시킴으로써) 변형된 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 약학적으로 허용되는 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산 또는 유기산 염; 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대표적인 산 부가 염은 아세테이트, 아세트산, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤젠 설폰산, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등 뿐만 아니라 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온, 비제한적인 예로, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함한다. 본 발명의 개시의 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 비독성 무기 또는 유기 산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 비독성 염을 포함한다. 본 발명의 개시의 약학적으로 허용되는 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 물 또는 유기 용매, 또는 둘의 혼합물에서 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있고; 일반적으로, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 사용된다. 적합한 염의 목록은 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, 및 Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977)]에서 발견된다.
[0245] 약학적으로 허용되는 용매화물: 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 용매화물"은 적합한 용매의 분자가 결정 격자에 혼입된 본 발명의 개시의 화합물을 의미한다. 적합한 용매는 투여되는 투여량에서 생리학적으로 허용된다. 예를 들어, 용매화물은 유기 용매, 물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 용액으로부터 결정화, 재결정화, 또는 침전에 의해 제조될 수 있다. 적합한 용매의 예는 에탄올, 물(예를 들어, 일수화물, 이수화물, 및 삼수화물), N-메틸피롤리디논(NMP), 디메틸 설폭사이드(DMSO), N,N'-디메틸포름아미드(DMF), N,N'-디메틸아세트아미드(DMAC), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논(DMEU), 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2-(1H)-피리미디논(DMPU), 아세토니트릴(ACN), 프로필렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 2-피롤리돈, 벤질 벤조에이트 등이다. 물이 용매인 경우, 용매화물은 "수화물"로 지칭된다.
[0246] 약동학: 본원에서 사용되는 "약동학"은 살아있는 유기체에 투여되는 물질의 운명의 결정과 관련하여 분자 또는 화합물의 임의의 하나 이상의 특성을 지칭한다. 약동학은 흡수, 분포, 대사 및 배설의 정도 및 속도를 포함하는 여러 영역으로 나뉜다. 이는 일반적으로 ADME로서 지칭되며, 여기서: (A) 흡수는 혈액 순환에 들어가는 물질의 과정이고; (D) 분포는 신체의 체액 및 조직 전반에 걸친 물질의 분산 또는 살포이고; (M) 대사(또는 생체내변환)는 모 화합물의 딸 대사산물로의 비가역적 변환이고; (E) 배설(또는 제거)은 신체로부터 물질의 제거를 지칭한다. 드문 경우지만, 일부 약물은 신체 조직에 비가역적으로 축적된다.
[0247] 물리화학적. 본원에서 사용되는 "물리화학적"은 물리적 및/또는 화학적 특성을 의미하거나 이와 관련된다.
[0248] 폴리뉴클레오티드: 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이들의 유사체, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 분자의 일차 구조를 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 삼중-가닥, 이중-가닥 및 단일-가닥 데옥시리보핵산("DNA") 뿐만 아니라 삼중-가닥, 이중-가닥 및 단일-가닥 리보핵산("RNA")을 포함한다. 이는 또한 폴리뉴클레오티드의, 예를 들어, 알킬화에 의해, 및/또는 캡핑에 의해 변형된 형태, 및 비변형된 형태를 포함한다. 보다 특히, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(2-데옥시-D-리보스를 함유함), 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않았건 간에 tRNA, rRNA, hRNA, siRNA 및 mRNA를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스를 함유함), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드, 및 노르뮤클레오티딕 백본(normucleotidic backbone), 예를 들어, 폴리아미드(예를 들어, 펩티드 핵산 "PNA") 및 폴리모르폴리노 중합체를 함유하는 다른 중합체, 및 DNA 및 RNA에서 발견되는 것과 같이 염기 쌍형성 및 염기 스태킹을 허용하는 구성으로 중합체가 핵염기를 함유하는 조건의 다른 합성 서열-특이적 핵산 중합체를 포함한다. 특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 mRNA를 포함한다. 다른 양태에서, mRNA는 합성 mRNA이다. 일부 양태에서, 합성 mRNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 양태에서, 특정 부류의 모든 핵염기는 비천연 핵염기로 대체되었다(예를 들어, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 모든 우리딘은 비천연 핵염기, 예를 들어, 5-메톡시우리딘으로 대체될 수 있다). 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 합성 RNA 또는 합성 DNA)는 천연 핵염기만, 즉, 합성 DNA의 경우 A, C, T 및 U, 또는 합성 RNA의 경우 U를 포함한다.
[0249] 당업자는 본원에 개시된 코돈 지도의 T 염기가 DNA에 존재하는 반면, T 염기는 상응하는 RNA에서 U 염기로 대체될 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, DNA 형태의 본원에 개시된 코돈-뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 벡터 또는 시험관 내 번역(IVT) 주형은 이의 상응하는 전사된 mRNA에 기반하여 U로서 전사된 이의 T 염기를 가질 것이다. 이와 관련하여, 코돈-최적화된 DNA 서열(T 포함) 및 이들의 상응하는 RNA 서열(U 포함) 둘 모두는 본 발명의 개시의 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열로 간주된다. 당업자는 또한 하나 이상의 염기를 비-천연 염기로 대체함으로써 동등한 코돈-맵이 생성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, TTC 코돈(DNA 맵)은 UUC 코돈(RNA 맵)에 상응할 것이고, 이는 차례로 'P'C 코돈(U가 슈도우리딘으로 대체된 RNA 맵)에 상응할 것이다.
[0250] 표준 A-T 및 G-C 염기쌍은 티미딘의 N3-H 및 C4-옥시와 아데노신의 각각 N1 및 C6-NH2 사이 및 시티딘의 C2-옥시, N3 및 C4-NH2와 구아노신의 각각 C2-NH2, N'-H 및 C6-옥시 사이의 수소 결합의 형성을 허용하는 조건하에 형성된다. 따라서, 예를 들어, 구아노신(2-아미노-6-옥시-9-β-D-리보푸라노실-퓨린)은 변형되어 이소구아노신(2-옥시-6-아미노-9-β-D-리보푸라노실-퓨린)을 형성할 수 있다. 이러한 변형은 시토신과 더 이상 효과적으로 표준 염기쌍을 형성하지 않을 뉴클레오시드 염기를 생성한다. 그러나, 이소시토신(1-β-D-리보푸라노실-2-아미노-4-옥시-피리미딘-)을 형성하기 위한 시토신(1-β-D-리보푸라노실-2-옥시-4-아미노-피리미딘)의 변형은 구아노신과 효과적으로 염기쌍을 형성하지는 않지만 이소구아노신과 염기쌍을 형성할 변형된 뉴클레오티드를 초래한다(미국 특허 번호 5,681,702호(Collins et al.)). 이소시토신은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)로부터 입수 가능하고; 이소시티딘은 문헌[Switzer et al. (1993) Biochemistry 32:10489-10496] 및 이에 인용된 참고문헌에 설명된 방법에 의해 제조될 수 있고; 2'-데옥시-5-메틸-이소시티딘은 문헌[Tor et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467] 및 이에 인용된 참고문헌의 방법에 의해 제조될 수 있고; 이소구아닌 뉴클레오티드는 문헌[Switzer et al., 1993, 상기, 및 Mantsch et al. (1993) Biochem. 14:5593-5601]에 설명된 방법을 사용하거나 미국 특허 번호 5,780,610호(Collins et al)에 설명된 방법에 의해 제조될 수 있다. 다른 비천연 염기쌍은 2,6-디아미노피리미딘 및 이의 상보체(1-메틸피라졸로-[4,3]피리미딘-5,7-(4H,6H)-디온의 합성을 위해 문헌[Piccirilli et al. (1990) Nature 343:33-37]에 설명된 방법에 의해 합성될 수 있다. 문헌[Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683 및 Switzer et al., 상기]에 설명된 것과 같은 독특한 염기쌍을 형성하는 다른 상기 변형된 뉴클레오티드 단위가 공지되어 있다.
[0251] 용어 "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되며, 인접한 핵산 서열을 지칭한다. 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 예를 들어, mRNA일 수 있다.
[0252] 어구 "~을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열" 및 이의 변형은 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 서열을 코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA 또는 DNA 분자)을 지칭한다. 코딩 서열은 프로모터를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호 및 핵산이 투여되는 개체 또는 포유동물의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함할 수 있다. 코딩 서열은 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.
[0253] 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입, 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지화 성분과의 컨쥬게이션과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 정의 내에, 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산, 예를 들어, 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산, 및 크레아틴 포함), 뿐만 아니라 당 분야에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다.
[0254] 본원에서 사용되는 용어는 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 유전자 생성물, 천연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 상동체, 오르토로그(ortholog), 파라로그(paralog), 단편, 및 전술한 것의 다른 등가물, 변이체 및 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드일 수 있거나, 이량체, 삼량체 또는 사량체와 같은 다분자 복합체일 수 있다. 이들은 또한 단일 사슬 또는 다중사슬 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 가장 일반적으로 디설파이드 연결은 다중쇄 폴리펩티드에서 발견된다. 용어 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용될 수 있다. 일부 예에서, "펩티드"는 약 50개 이하의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다.
[0255] 본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드 변이체"는 고유 또는 참조 서열과 아미노산 서열이 상이한 분자를 지칭한다. 아미노산 서열 변이체는 고유 또는 참조 서열과 비교하여 아미노산 서열 내의 특정 위치에서 치환, 결실 및/또는 삽입을 가질 수 있다. 일반적으로, 변이체는 고유 또는 참조 서열과 적어도 약 50%의 동일성, 적어도 약 60%의 동일성, 적어도 약 70%의 동일성, 적어도 약 80%의 동일성, 적어도 약 90%의 동일성, 적어도 약 95%의 동일성, 적어도 약 99%의 동일성을 가질 것이다. 일부 예에서, 이들은 고유 또는 참조 서열과 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 동일할 것이다.
[0256] 본원에서 사용되는 바와 같이, 단위 약물 당 폴리펩티드(PUD) 또는 단위 약물 당 생성물은 체액에서의 측정치로 나누어진 pmol/mL, mmol/mL 등과 같은 농도로 일반적으로 정의된, 총 일일 용량의 세분화된 부분, 일반적으로 체액 또는 조직에서 측정된 바와 같은 생성물(예를 들어, 폴리펩티드)의 1 mg, pg, kg 등으로 정의된다.
[0257] 본원에서 사용되는 용어 "예방하는"은 감염, 질병, 장애 및/또는 질환의 발병을 완전히를 포함하여 적어도 부분적으로 지연시키고/시키거나; 특정 감염, 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 이상의 증상, 특징 또는 임상 징후의 발병을 적어도 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/시키거나; 특정 감염, 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 이상의 증상, 특징 또는 징후의 발병을 적어도 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/시키거나; 감염, 특정 질병, 장애 및/또는 질환으로부터의 진행을 적어도 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/시키거나; 감염, 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 병리 발생의 위험을 감소시키는 것을 지칭한다.
[0258] 본 발명의 개시는 또한 본원에 설명된 화합물의 프로드러그를 포함한다. 본원에서 사용되는 "프로드러그"는은 화학적 또는 물리적 변경시 치료제로서 작용하는 물질, 분자 또는 독립체에 대한 술어 형태인 임의의 물질, 분자 또는 독립체를 지칭한다. 프로드러그는 어떤 방식으로든 공유 결합되거나 격리될 수 있고, 이를 필요로 하는 포유동물 대상체에게 투여되기 전, 투여시 또는 투여 후에 활성 약물 모이어티로 방출되거나 전환된다. 프로드러그는 통상적인 조작으로 또는 생체 내에서 변형이 모 화합물로 절단되는 방식으로 화합물에 존재하는 작용기를 변형시킴으로써 제조될 수 있다. 프로드러그는 하이드록실, 아미노, 설프히드릴 또는 카르복실 기가 포유동물 대상체에 투여될 때 절단되어 각각 유리 하이드록실, 아미노, 설프히드릴 또는 카르복실 기를 형성하는 임의의 기에 결합된 화합물을 포함한다. 프로드러그의 제조 및 사용은 문헌[T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, 및 Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에 논의되어 있으며, 이들 둘 모두는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
[0259] 증식하다: 본원에서 사용되는 용어 "증식하다"는 성장시키거나, 팽창시키거나, 증가시키거나, 빠르게 성장, 팽창 또는 증가하게 하는 것을 의미한다. "증식성"은 증식하는 능력을 갖는 것을 의미한다. "항-증식성"은 증식성 특성과 상반되거나 부적절한 특성을 갖는 것을 의미한다.
[0260] 예방적: 본원에서 사용되는 "예방적"은 질병의 확산을 예방하기 위해 사용되는 치료제 또는 작용 과정을 지칭한다.
[0261] 예방: 본원에서 사용되는 "예방"은 건강을 유지하고 질병의 확산을 방지하기 위해 취해진 조치를 지칭한다. "면역 예방"은 질병의 확산을 방지하기 위해 능동 또는 수동 면역을 생성하기 위한 조치를 지칭한다.
[0262] 단백질 절단 부위: 본원에서 사용되는 "단백질 절단 부위"는 아미노산 사슬의 제어된 절단이 화학적, 효소적 또는 광화학적 수단에 의해 달성될 수 있는 부위를 지칭한다.
[0263] 단백질 절단 신호: 본원에서 사용되는 "단백질 절단 신호"는 절단을 위해 폴리펩티드에 플래그를 지정하거나 표시하는 적어도 하나의 아미노산을 지칭한다.
[0264] 관심 단백질: 본원에서 사용되는 용어 "관심 단백질" 또는 "요망되는 단백질"은 본원에 제공된 것들 및 이의 단편, 돌연변이체, 변이체, 및 변경을 포함한다.
[0265] 근위: 본원에서 사용되는 용어 "근위"는 중심 또는 관심 지점 또는 영역에 더 가깝게 위치하는 것을 의미한다.
[0266] 슈도우리딘: 본원에서 사용되는 슈도우리딘은 뉴클레오시드 우리딘의 C-글리코시드 이성질체를 지칭한다. "슈도우리딘 유사체"는 슈도우리딘의 임의의 변형, 변이체, 아이소형 또는 유도체이다. 예를 들어, 슈도우리딘 유사체는 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘, 1-메틸슈도우리딘(m1ψ), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘(m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘(m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘(acp3ψ), 및 2'-O-메틸-슈도우리딘(xm)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0267] 정제된: 본원에서 사용되는 "정제하다", "정제된", "정제"는 원치 않는 성분, 물질 오염, 혼합물 또는 불완전성으로부터 실질적으로 순수하거나 깨끗하게 만드는 것을 의미한다.
[0268] 참조 핵산 서열: 용어 "참조 핵산 서열" 또는 "참조 핵산" 또는 "참조 뉴클레오티드 서열" 또는 "참조 서열"은 서열 최적화될 수 있는 출발 핵산 서열(예를 들어, RNA, 예를 들어, mRNA 서열)을 지칭한다. 일부 예에서, 참조 핵산 서열은 야생형 핵산 서열, 이의 단편 또는 변이체이다. 일부 예에서, 참조 핵산 서열은 사전에 서열 최적화된 핵산 서열이다.
[0269] 염: 일부 양태에서, 본원에 개시된 종양 내 전달을 위한 약학적 조성물은 이들의 지질 구성요소 중 일부의 염을 포함한다. 용어 "염"은 임의의 음이온성 및 양이온성 복합체를 포함한다. 음이온의 비제한적인 예는 무기 및 유기 음이온, 예를 들어, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 옥살레이트(예를 들어, 헤미옥살레이트), 포스페이트, 포스포네이트, 하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 옥사이드, 카르보네이트, 바이카르보네이트, 니트레이트, 니트라이트, 니트라이드, 바이설파이트, 설파이드, 설파이트, 바이설페이트, 설페이트, 티오설페이트, 하이드로겐 설페이트, 보레이트, 포르메이트, 아세테이트, 벤조에이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 아크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 푸마레이트, 말레에이트, 이타코네이트, 글리콜레이트, 글루코네이트, 말레이트, 만델레이트, 티글레이트, 아스코르베이트, 살리실레이트, 폴리메타크릴레이트, 퍼클로레이트, 클로레이트, 클로라이트, 하이포클로라이트, 브로메이트, 하이포브로마이트, 아이오데이트, 알킬설포네이트, 아릴설포네이트, 아르세네이트, 아세나이트, 크로메이트, 디크로메이트, 시아나이드, 시아네이트, 티오시아네이트, 하이드록사이드, 퍼옥사이드, 퍼망가네이트, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
[0270] 샘플: 본원에서 사용되는 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 이의 조직, 세포 또는 구성요소 부분(예를 들어, 혈액, 점액, 림프액, 활액, 뇌척수액, 타액, 양수, 양수 제대혈, 소변, 질액 및 정액을 포함하나 이에 제한되지 않는 체액)의 서브셋을 지칭한다. 샘플은 전체 유기체 또는, 예를 들어, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부의 외부 섹션, 호흡기, 장, 및 비뇨생식기, 눈물, 타액, 밀크, 혈액 세포, 종양, 기관을 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 조직, 세포 또는 구성요소 부분의 서브셋, 또는 이의 분획 또는 일부로부터 제조된 균질액, 용해질 또는 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 샘플은 추가로 단백질 또는 핵산 분자와 같은 세포 성분을 함유할 수 있는 영양 브로쓰 또는 겔과 같은 배지를 지칭한다.
[0271] 신호 서열: 본원에서 사용되는 어구 "신호 서열", "신호 펩티드", 및 "전이 펩티드"는 상호교환적으로 사용되며, 특정 소기관, 세포 구획, 또는 세포외 수출로의 단백질의 수송 또는 국소화를 지시할 수 있는 서열을 지칭한다. 상기 용어는 신호 서열 폴리펩티드 및 신호 서열을 인코딩하는 핵산 서열 둘 모두를 포함한다. 따라서, 핵산과 관련하여 신호 서열에 대한 언급은 실제로 신호 서열 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
[0272] 신호 전달 경로: "신호 전달 경로"는 세포의 한 부분으로부터 세포의 다른 부분으로의 신호 전달에서 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 본원에서 사용되는 어구 "세포 표면 수용체"는, 예를 들어, 신호 및 세포의 원형질막을 통한 이러한 신호의 전달을 수용할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
[0273] 유사성: 본원에서 사용되는 용어 "유사성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 서로에 대한 중합체 분자의 유사성 백분율 계산은 유사성 백분율의 계산이 당 분야에서 이해되는 바와 같이 보존적 치환을 고려하는 것을 제외하고는 동일성 백분율의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있다.
[0274] 특이적 전달: 본원에서 사용되는 용어 "특이적 전달", "특이적으로 전달하다", 또는 "특이적으로 전달하는"은 표적 외 조직(예를 들어, 포유동물 비장)에 비해 관심 표적 조직(예를 들어, 포유동물 간)으로의 나노입자에 의한 폴리뉴클레오티드의 보다 많은(예를 들어, 적어도 약 1.5배 이상, 적어도 약 2배 이상, 적어도 약 3배 이상, 적어도 약 4배 이상, 적어도 약 5배 이상, 적어도 약 6배 이상, 적어도 약 7배 이상, 적어도 약 8배 이상, 적어도 약 9배 이상, 적어도 약 10배 이상)의 전달을 의미한다. 특정 조직으로의 나노입자의 전달 수준은 조직에서 생산된 단백질의 양을 상기 조직의 중량과 비교하거나, 조직에서의 폴리뉴클레오티드의 양을 상기 조직의 중량과 비교하거나, 조직에서 생산된 단백질의 양을 상기 조직에서의 총 단백질의 양과 비교하거나, 조직에서의 폴리뉴클레오티드의 양을 상기 조직에서의 총 폴리뉴클레오티드의 양과 비교함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 신혈관 표적화의 경우, 폴리뉴클레오티드의 전신 투여 후 간 또는 비장으로 전달된 것과 비교하여 조직 1 g 당 약 1.5배, 2배, 3배, 5배, 10배, 15배 또는 20배 이상의 폴리뉴클레오티드가 신장에 전달되는 경우 폴리뉴클레오티드는 간 및 비장에 비해 포유동물 신장에 특이적으로 제공된다. 표적 조직에 특이적으로 전달하는 나노입자의 능력은 치료되는 대상체에서 결정될 필요는 없으며, 동물 모델(예를 들어, 래트 모델)과 같은 대리에서 결정될 수 있음이 이해될 것이다.
[0275] 안정한: 본원에서 사용되는 "안정한"은 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도로 분리를 생존시키기에 충분히 강건하고, 일부 경우에 효과적인 치료제로 제형화될 수 있는 화합물을 지칭한다.
[0276] 안정화된: 본원에서 사용되는 용어 "안정화하다", "안정화된", "안정화된 영역"은 안정화시키거나 안정하게 되는 것을 의미한다.
[0277] 입체 이성질체: 본원에서 사용되는 용어 "입체 이성질체"는 화합물이 가질 수 있는 모든 가능한 상이한 이성질체 뿐만 아니라 입체형태적 형태(예를 들어, 본원에 설명된 임의의 화학식의 화합물), 특히 기본 분자 구조의 모든 가능한 입체화학적 및 입체형태적 이성질체 형태, 모든 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체 및/또는 컨포머(conformer)를 지칭한다. 본 발명의 개시의 일부 화합물은 상이한 호변이성질체 형태로 존재할 수 있고, 후자의 모두는 본 발명의 개시의 범위 내에 포함된다.
[0278] 대상체: "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 요법이 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 애완용 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 축우, 소; 유인원, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지와 같은 영장류; 개 및 늑대와 같은 개과; 고양이, 사자 및 호랑이와 같은 고양이과; 말, 당나귀 및 얼룩말과 같은 말과; 곰, 소, 돼지 및 양과 같은 식용 동물; 사슴 및 기린과 같은 유제류; 마우스, 래트, 햄스터 및 기니피그와 같은 설치류 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 예에서, 포유동물은 인간 대상체이다. 다른 예에서, 대상체는 인간 환자이다. 특정 예에서, 대상체는 암 치료를 필요로 하는 인간 환자이다.
[0279] 본원에서 사용되는 문맥 내에서, 용어 "실질적으로"는 관심 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 지칭한다. 생물학 분야의 통상의 기술자는 생물학적 및 화학적 현상이 혹시라도 거의 완료되지 않고/않거나 완전하게 진행되거나 절대적인 결과를 달성하거나 회피한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 고유한 완전성의 잠재적인 결여를 포착하기 위해 본원에서 사용된다. 용량 사이의 시간 차이와 관련하여 본원에서 사용되는 실질적으로 동일하다는 것은 +/- 2%를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 그리고 복수의 용량과 관련하여 실질적으로 동시는 수(예를 들어, 2) 초 이내를 의미한다.
[0280] 질병, 장애 및/또는 질환을 "겪고 있는" 개인은 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 이상의 증상으로 진단되거나 이를 나타낸다.
[0281] 질병, 장애 및/또는 질환에 "민감한" 개체는 질병, 장애 및/또는 질환으로 진단되지 않았고/않았거나 이들의 증상을 나타내지 않을 수 있지만, 질병 또는 이의 증상을 발달시키는 경향을 갖는다. 일부 예에서, 질병, 장애 및/또는 질환(예를 들어, 암)에 민감한 개체는 하기 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다: (1) 질병, 장애 및/또는 질환의 발달과 관련된 유전적 돌연변이; (2) 질병, 장애 및/또는 질환의 발달과 관련된 유전적 다형성; (3) 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 단백질 및/또는 핵산의 증가된 및/또는 감소된 발현 및/또는 활성; (4) 질병, 장애 및/또는 질환의 발달과 관련된 습관 및/또는 생활양식; (5) 질병, 장애 및/또는 질환의 가족력; 및 (6) 질병, 장애 및/또는 질환의 발달과 관련된 미생물에 대한 노출 및/또는 감염. 일부 예에서, 질병, 장애 및/또는 질환에 민감한 개체는 질병, 장애 및/또는 질환을 발달시킬 것이다. 일부 예에서, 질병, 장애 및/또는 질환에 민감한 개체는 질병, 장애 및/또는 질환을 발달시키지 않을 것이다.
[0282] 본원에서 사용되는 용어 "서방형"은 특정 기간에 걸친 방출 속도에 부합하는 약학적 조성물 또는 화합물 방출 프로파일을 지칭한다.
[0283] 용어 "합성"은 사람의 손에 의해 생산, 제조, 및/또는 제작되는 것을 의미한다. 본 발명의 개시의 폴리뉴클레오티드 또는 다른 분자의 합성은 화학적 또는 효소적일 수 있다.
[0284] 본원에서 사용되는 "표적화된 세포"는 임의의 하나 이상의 관심 세포를 지칭한다. 세포는 시험관 내, 생체 내, 동일 반응계에서, 또는 유기체의 조직 또는 기관에서 발견될 수 있다. 유기체는 동물, 예를 들어, 인간을 포함하는 포유동물일 수 있다.
[0285] 표적 조직: 본원에서 사용되는 "표적 조직"은 폴리뉴클레오티드의 전달이 요망되는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 초래할 임의의 하나 이상의 관심 조직 유형을 지칭한다. 관심 표적 조직의 예는 특정 조직, 기관, 및 이들의 시스템 또는 그룹을 포함한다. 특정 적용에서, 표적 조직은 신장, 폐, 비장, 혈관 내의 혈관 내피(예를 들어, 관상동맥내 또는 대퇴골내), 또는 종양 조직(예를 들어, 종양 내 주사를 통함)일 수 있다. "표적 외 조직"은 인코딩된 단백질의 발현이 요망되는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 초래하지 않는 임의의 하나 이상의 조직 유형을 지칭한다. 특정 적용에서, 표적 외 조직은 간 및 비장을 포함할 수 있다.
[0286] 표적화 서열: 본원에서 사용되는 어구 "표적화 서열"은 단백질 또는 폴리펩티드의 수송 또는 국소화를 지시할 수 있는 서열을 지칭한다.
[0287] 말단: 본원에서 사용되는 용어 "말단들" 또는 "말단"은 폴리펩티드를 지칭할 때 펩티드 또는 폴리펩티드의 말단을 지칭한다. 이러한 말단은 펩티드 또는 폴리펩티드의 첫 번째 또는 최종 부위에만 제한되지 않으며, 말단 영역에 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 개시의 폴리펩티드 기반 분자는 N-말단(유리 아미노 기(NH2)를 갖는 아미노산에 의해 종결됨) 및 C-말단(유리 카르복실 기(COOH)을 갖는 아미노산에 의해 종결됨) 둘 모두를 갖는 것으로 특징화될 수 있다. 본 발명의 개시의 단백질은 일부 경우에 디설파이드 결합 또는 비공유적 힘에 의해 함께 결합된 다수의 폴리펩티드 사슬(멀티머, 올리고머)로 구성된다. 이러한 종류의 단백질은 다수의 N- 및 C-말단을 가질 것이다. 대안적으로, 폴리펩티드의 말단은 경우에 따라 유기 컨쥬게이트와 같은 비-폴리펩티드 기반 모이어티로 시작하거나 끝나도록 변형될 수 있다.
[0288] 치료제: 용어 "치료제"는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 치료, 진단 및/또는 예방 효과를 갖고/갖거나 요망되는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 유발하는 제제를 지칭한다. 예를 들어, 일부 예에서, IL-36-감마 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA는 치료제일 수 있다.
[0289] 치료적 유효량: 본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 감염, 질병, 장애 및/또는 질환으로 고통받거나 이에 민감한 대상체에 투여될 때 감염, 질병, 장애 및/또는 질환을 치료하고/하거나, 이들의 증상을 개선시키고/시키거나, 이들을 진단하고/하거나, 이들을 예방하고/하거나, 이들의 발병을 지연시키기에 충분한 전달될 제제(예를 들어, 핵산, 약물, 치료제, 진단제, 예방제 등)의 양을 의미한다.
[0290] 치료적으로 효과적인 결과: 본원에서 사용되는 용어 "치료적으로 효과적인 결과"는 감염, 질병, 장애 및/또는 질환을 앓거나 이에 민감한 대상체에서 감염, 질병, 장애 및/또는 질환을 치료하고/하거나, 이들의 증상을 개선시키고/시키거나, 이들을 진단하고/하거나, 이들을 예방하고/하거나, 이들의 발병을 지연시키기에 충분한 결과를 의미한다.
[0291] 총 1일 용량: 본원에서 사용되는 "총 1일 용량"은 24시간의 기간 내에 제공되거나 처방되는 양이다. 총 1일 용량은 단일 단위 용량 또는 분할 용량으로 투여될 수 있다.
[0292] 전사 인자: 본원에서 사용되는 용어 "전사 인자"는, 예를 들어, 전사의 활성화 또는 억제에 의해 DNA의 RNA로의 전사를 조절하는 DNA-결합 단백질을 지칭한다. 일부 전사 인자는 단독으로 전사의 조절에 영향을 미치는 반면, 다른 것은 다른 단백질과 함께 작용한다. 일부 전사 인자는 특정 조건에서 전사를 활성화 및 억제할 수 있다. 일반적으로, 전사 인자는 표적 유전자의 조절 영역에서 특정 컨센서스 서열과 매우 유사한 특정 표적 서열 또는 서열들에 결합한다. 전사 인자는 단독으로 또는 다른 분자와의 복합체로 표적 유전자의 전사를 조절할 수 있다.
[0293] 전사: 본원에서 사용되는 용어 "전사"는 외인성 핵산을 세포 내로 도입하는 방법을 지칭한다. 형질감염 방법은 화학적 방법, 물리적 처리 및 양이온성 지질 또는 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
[0294] 형질감염: 본원에서 사용되는 "형질감염"은 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 발현되거나(예를 들어, mRNA), 폴리펩티드가 세포 기능을 조절하는(예를 들어, siRNA, miRNA) 세포로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 지칭한다. 본원에서 사용되는 핵산 서열의 "발현"은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역 및/또는 폴리펩티드 또는 단백질의 번역-후 변형을 지칭한다.
[0295] 치료하는, 치료, 요법: 본원에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "요법"은 과-증식성 질병, 예를 들어, 암의 하나 이상의 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전히 완화시키고/시키거나, 개량하고/하거나, 개선시키고/시키거나, 경감시키고/시키거나, 이들의 발병을 지연시키고/시키거나, 이들의 진행을 억제하고/하거나, 이들의 중증도를 감소시키고/시키거나, 이들의 발병률을 감소시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 암을 "치료하는"은 종양의 생존, 성장 및/또는 확산을 억제하는 것을 지칭할 수 있다. 치료는 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 병리가 발달할 위험을 감소시키기 위한 목적으로 질병, 장애 및/또는 질환의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질병, 장애 및/또는 질환의 초기 징후만을 나타내는 대상체에 투여될 수 있다.
[0296] 종양 미세환경": 본원에서 사용되는 "종양 미세환경"은 침윤성 면역 및/또는 염증 세포의 존재 또는 부재 뿐만 아니라 종양 내의 이러한 세포의 유형(들)과 관련하여 종양 내의 세포 조성물을 지칭한다. 일 양태에서, 종양 미세환경은 "염증 종양 미세환경"이며, 이는 종양 내로 침윤된 면역 및/또는 염증 세포의 존재를 지칭하며, 우세한 세포 유형은 과립구이다. 또 다른 양태에서, 종양 미세환경은 "면역억제성 종양 미세환경"이며, 이는 종양 내로 침윤된 면역 및/또는 염증 세포의 존재를 지칭하며, 우세한 세포 유형은 단핵구 세포 및 대식세포이다. 또 다른 양태에서, 종양 미세환경은 "면역학적으로 불모의 종양 미세환경"이며, 이는 면역 및/또는 염증 세포의 종양으로의 유의한 침윤의 부재를 지칭한다.
[0297] 비변형된: 본원에서 사용되는 "비변형된"은 임의의 방식으로 변경되기 전의 임의의 물질, 화합물 또는 분자를 지칭한다. 비변형은 생체분자의 야생형 또는 고유 형태를 지칭할 수 있지만, 항상 그런 것은 아니다. 분자는 일련의 변형을 겪을 수 있고, 이에 의해 각각의 변형된 분자는 후속 변형을 위한 "비변형된" 출발 분자로서 작용할 수 있다.
[0298] 우라실: 우라실은 RNA의 핵산에 있는 4개의 핵염기 중 하나이며, 이는 문자 U로 표시된다. 우라실은 β-N1-글리코시드 결합을 통해 리보스 고리, 또는 보다 구체적으로 리보푸라노스에 부착되어 뉴클레오시드 우리딘을 생성할 수 있다. 뉴클레오시드 우리딘은 또한 일반적으로 이의 핵염기의 한 글자 코드, 즉, U에 따라 약칭된다. 따라서, 본 발명의 개시의 맥락에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 단량체가 U인 경우, 이러한 U는 "우라실" 또는 "우리딘"으로 상호교환적으로 지정된다.
[0299] 우리딘 함량: 용어 "우리딘 함량" 또는 "우라실 함량"은 상호교환가능하고, 특정 핵산 서열에 존재하는 우라실 또는 우리딘의 양을 지칭한다. 우리딘 함량 또는 우라실 함량은 절대 값(서열에서 우리딘 또는 우라실의 총 수) 또는 상대적(핵산 서열에서 핵염기의 총 수에 대한 우리딘 또는 우라실 백분율)로 표현될 수 있다.
[0300] 우리딘-변형된 서열: 용어 "우리딘-변형된 서열"은 후보 핵산 서열의 우리딘 함량 및/또는 우리딘 패턴과 관련하여 상이한 전체 또는 국소 우리딘 함량(더 높거나 더 낮은 우리딘 함량) 또는 상이한 우리딘 패턴(예를 들어, 구배 분포 또는 클러스터링)을 갖는 서열 최적화된 핵산(예를 들어, 합성 mRNA 서열)을 지칭한다. 본 발명의 개시의 내용에서, 용어 "우리딘-변형된 서열" 및 "우라실-변형된 서열"은 동등하고 상호교환 가능한 것으로 간주된다.
[0301] "높은 우리딘 코돈"은 2개 또는 3개의 우리딘을 포함하는 코돈으로 정의되고, "낮은 우리딘 코돈"은 하나의 우리딘을 포함하는 코돈으로 정의되고, "우리딘 코돈 없음"은 임의의 우리딘이 없는 코돈이다. 일부 예에서, 우리딘-변형된 서열은 높은 우리딘 코돈의 낮은 우리딘 코돈으로의 치환, 높은 우리딘 코돈의 우리딘이 없는 코돈으로의 치환, 낮은 우리딘 코돈의 높은 우리딘 코돈으로의 치환, 낮은 우리딘 코돈의 우리딘이 없는 코돈으로의 치환, 우리딘이 없는 코돈의 낮은 우리딘 코돈으로의 치환, 우리딘이 없는 코돈의 높은 우리딘 코돈으로의 치환, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 예에서, 높은 우리딘 코돈은 또 다른 높은 우리딘 코돈으로 대체될 수 있다. 일부 예에서, 낮은 우리딘 코돈은 또 다른 낮은 우리딘 코돈으로 대체될 수 있다. 일부 예에서, 우리딘이 없는 코돈은 또 다른 우리딘이 없는 코돈으로 대체될 수 있다. 우리딘-변형된 서열은 우리딘 농축 또는 우리딘 희박화될 수 있다.
[0302] 우리딘 농축: 본원에서 사용되는 용어 "우리딘 농축" 및 문법적 변형은 상응하는 후보 핵산 서열의 우리딘 함량과 관련하여 서열 최적화된 핵산(예를 들어, 합성 mRNA 서열)에서의 우리딘 함량(절대 값 또는 백분율 값으로 표현됨)의 증가를 지칭한다. 우리딘 농축은 후보 핵산 서열에서의 코돈을 더 적은 우리딘 핵염기를 함유하는 동의어 코돈으로 치환함으로써 구현될 수 있다. 우리딘 농축은 전체적(즉, 후보 핵산 서열의 전체 길이에 비해) 또는 국소적(즉, 후보 핵산 서열의 하위서열 또는 영역에 비해)일 수 있다.
[0303] 우리딘 희박화: 본원에서 사용되는 용어 "우리딘 희박화" 및 문법적 변형은 상응하는 후보 핵산 서열의 우리딘 함량과 관련하여 서열 최적화된 핵산(예를 들어, 합성 mRNA 서열)에서의 우리딘 함량(절대 값 또는 백분율 값으로 표현됨)의 감소를 지칭한다. 우리딘 희박화는 후보 핵산 서열에서의 코돈을 더 적은 우리딘 핵염기를 함유하는 동의어 코돈으로 치환함으로써 구현될 수 있다. 우리딘 희박화는 전체적(즉, 후보 핵산 서열의 전체 길이에 비해) 또는 국소적(즉, 후보 핵산 서열의 하위서열 또는 영역에 비해)일 수 있다.
[0304] 변이체: 본 발명의 개시에서 사용되는 용어 변이체는 천연 변이체(예를 들어, 다형성, 아이소형 등) 및 고유 또는 출발 서열(예를 들어, 야생형 서열)에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 동일한 위치에서 그 자리에 상이한 아미노산이 삽입된 인공 변이체 둘 모두를 지칭한다. 이러한 변이체는 "치환적 변이체"로 설명될 수 있다. 치환은 분자에서 단지 하나의 아미노산이 치환된 단일 치환일 수 있거나, 이들은 동일한 분자에서 2개 이상의 아미노산이 치환된 다중 치환일 수 있다. 아미노산이 삽입되거나 결실되는 경우, 생성된 변이체는 각각 "삽입 변이체" 또는 "결실 변이체"일 것이다.
[0305] 백신: 본원에서 사용되는 백신은 신체가 암과 싸우는 것을 돕는 요법일 수 있다. 구체적으로, 본원에 설명된 백신은 암을 치료할 수 있다. 본원에 설명된 백신은 질병(예를 들어, 암)의 예방으로 제한되지 않지만, 종양 또는 종양들을 포함하는 기존의 암을 치료할 수 있다.
[0306] 본원에 설명된 mRNA 백신은 임의의 적절한 전달 비히클 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전달 비히클 분자는 지질 기반 비히클(예를 들어, 지질 나노입자) 또는 중합체-기반 나노입자일 수 있다. 특히, 전달 비히클(DV) 분자는 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클일 수 있다.
[0307] 일반적으로, 전달 비히클 분자는 RNase 분해로부터 mRNA(들)를 보호하고, 이들의 세포 흡수를 증가시키고, 엔도솜 탈출을 촉진하여, 세포질에서 기능성 단백질을 발현시킨다. 이러한 속성은 환자에 대한 mRNA의 생체 내 전달에 대한 기술적 과제를 해결하는 것을 가능하게 한다.
[0308] 따라서, 본원에 설명된 바와 같이, 본원에 설명된 mRNA 백신은 동일한 전달 비히클 분자와 공동-제형화된 하나 이상의 종양-특이적 항원 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 전달 비히클 분자는, 예를 들어, 지질 나노입자(LNP)일 수 있다. LNP 제형은 다중음이온성 mRNA를 캡슐화하기 위해 3차 또는 4차 아민을 함유하는 이온화 가능한 또는 양이온성 지질 또는 중합체 물질; 세포 막에서 지질과 유사한 쯔비터이온성 지질(예를 들어, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민); LNP의 지질 이중층을 안정화시키기 위한 콜레스테롤; 및 나노입자에 수화 층을 제공하고, 콜로이드 안정성을 개선하고, 단백질 흡수를 감소시키기 위한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-지질로 구성될 수 있다.
[0309] 다성분 LNP는 세포내이입에 의해 흡수될 수 있고, 역전된 비-이중층 지질 상을 사용하여 세포막에 정전기적으로 부착되고 융합될 수 있다. 일단 세포 내부로 들어가면, LNP는 초기 엔도솜, 이어서 후기 엔도솜, 및 마지막으로 mRNA 내용물이 효소적으로 분해되는 리소좀으로 라우팅될 수 있다.
[0310] 전달 비히클 분자의 한 부류는 양이온성 또는 이온화 가능한 지질 및 지질-유사 물질을 포함한다. 양이온성 지질은 알킬화된 4차 암모늄 기를 보유하고 pH-독립적 방식으로 이들의 양이온성 성질을 유지하는 반면, 이온화 가능한 지질은 pH가 낮아짐에 따라 유리 아민의 양성자화에 의해 양전하를 획득한다. 지질-유사 물질은 천연 지질보다 더 많은 소수성 측쇄를 갖는다. 양이온성 지질, 예를 들어, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)가 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, pH-의존성 이온화 가능한 물질이 사용될 수 있다. Dlin-MC3-DMA(MC3)로 명명된 이온화 가능한 지질은 또한 치료 단백질을 발현시키기 위해 mRNA를 형질감염시키는데 사용될 수 있다.
[0311] 중합체 물질은 치료 mRNA의 전달을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 지방 사슬로 변형된 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI)은 고분자량 PEI의 독성을 감소시키기 위해 siRNA 및 mRNA 전달에 사용될 수 있다. 지방 사슬로 변형된 폴리(글리코아미도아민) 중합체(예를 들어, 타르트레이트 백본을 포함하는 일부 변형에서)는 mRNA를 전달하는 것으로 나타났다. 폴리(β-아미노)에스테르(PBAE)는 이들의 혈청 안정성을 증가시키기 위해 PEG-지질로 제형화된 PBAE를 포함하는 핵산 전달에 사용될 수 있는 생분해성 중합체이다. 과분지형 PBAE는 mRNA 전달에 사용될 수 있다.
[0312] 아민-보유 측쇄를 갖는 폴리메타크릴레이트, 올리고아미노에틸렌 측쇄를 갖는 폴리아스파르트아미드, 및 교대 에틸-프로필-에틸 스페이서를 갖는 테트라민으로 아미드화된 폴리아크릴산은 mRNA를 형질감염시키는 것으로 보고되었으며, 전달 비히클 분자로서 사용될 수 있다. 자가-희생 폴리카르보네이트-블록-폴리(α-아미노)에스테르는 재배열시 mRNA를 방출한 후 pH 7.4에서 분해가 후속되어 엔도솜 탈출을 용이하게 할 수 있다. 생분해성 아미노 폴리에스테르(APE)는 다양한 락톤의 개환 중합에서 개시제로서 3차 아미노 알코올로부터 낮은 분산도로 합성될 수 있고, 조직-선택적 mRNA 전달이 가능할 수 있다. 생체적합성 분해 생성물 및 향상된 엔도솜 탈출 능력을 갖는 다른 생분해성 중합체가 mRNA 전달에 사용될 수 있다.
[0313] 일부 변형에서, 전달 비히클 분자는 덴드리머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리아미도아민(PAMAM) 또는 폴리프로필렌이민-기반 덴드리머는 유전자 전달에 대해 광범위하게 연구되었다. 지방 사슬-변형된 PAMAM 덴드리머, 및/또는 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 및 세라마이드-PEG와 공동-제형화된 변형된 PAMAM 덴드리머는 전달 비히클 분자로서 사용될 수 있다.
[0314] 대안적으로, 일부 변형에서 세포-침투 펩티드(CPP)는 전달 비히클 분자로서 사용될 수 있다. CPP는 세포 표면에서 음으로 하전된 글리코사미노글리칸의 클러스터링을 촉진할 수 있으며, 이는 차례로 거대음세포작용 및 측면 확산을 촉발하거나 지질 이중층을 직접 파괴한다. 아르기닌-풍부 양친매성 RALA 서열 반복부를 갖는 CPP가 사용될 수 있다. 일부 변형에서, 전달 비히클 분자는 양이온성 및 헬퍼 지질("쯔비터이온성 아미노 지질" 또는 ZAL)을 연상시키는 양이온성 및 쯔비터이온성 지질의 조합일 수 있다.
[0315] 특히, 본원에 설명된 전달 비히클 분자는 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클일 수 있다. 예를 들어, 이러한 전달 비히클은 순환 동안 mRNA 카고의 패키징 및 보호를 제공하고, 면역 인식을 피하고, 세포 흡수 및 방출을 촉진할 수 있는 지질-함유 양친매성 전달 비히클일 수 있다. 이러한 전달 비히클의 예는 "LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS COMPRISING LIPIDATED CATIONIC PEPTIDE COMPOUNDS FOR NUCLEIC ACID DELIVERY"을 제목으로 하고 2019년 9월 27일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US19/53661호, 및 "TERTIARY AMINO LIPIDATED CATIONIC PEPTIDES FOR NUCLEIC ACID DELIVERY"를 제목으로 하고 2019년 9월 27일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US19/53655호에서 발견될 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 다수의 유형의 전달 비히클 분자가 사용될 수 있고, 각각의 유형은 본원에 설명된 바와 같은 하나 이상의 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA 둘 모두와 함께 캡슐화될 수 있다.
[0316] 일반적으로, 본원에 설명된 방법 및 조성물은 암의 치료 방법을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 백신 및 하나 이상의 면역조절제를 인코딩하는 mRNA를 종양 내 주사하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 mRNA 백신 및 면역조절제는 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화된다. 특히, 종양-특이적 항원은, 예를 들어, 간 종양 조직 등과 비교한 간 조직과 같이 고유 환자 조직, 및 특히 동일한 분화 계통을 갖는 고유 환자 조직과 비교하여 하나 이상의 유전자 및/또는 단백질의 서열 및/또는 하나 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현에서의 변화(에를 들어, 결실, 첨가 등을 포함하는 돌연변이)로서 확인될 수 있는 환자-특이적 종양 항원일 수 있다.
[0317] 예를 들어, 환자-특이적 종양 항원은 네오-에피토프(네오-항원으로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 본원에 설명된 방법 및 조성물은 네오-에피토프를 사용하여 mRNA 백신의 효능을 개선시킬 수 있다.
[0318] 네오-에피토프는 비-동의어 돌연변이, 보유된 인트론, 아미노산을 변경시키는 번역-후 변형, 유전자 융합 및 프레임시프트 in/del 변이체를 포함하는 임의의 유전체 돌연변이 변경 단백질 서열로부터 발생할 수 있다. 차세대 시퀀싱(NGS)은 질량 분광법과 같은 기술에 의해 검출될 수 있는 번역 후 변형을 제외한 이러한 유형의 변이체 각각을 확인하는데 사용될 수 있다.
[0319] 종양-특이적 항원은 체세포 돌연변이일 수 있고, 임의의 적절한 방식으로 확인될 수 있다.
[0320] 대규모 병렬 NGS는 개별 cDNA 라이브러리 스크리닝을 필요로 하지 않고 네오-에피토프를 확인하는데 사용될 수 있다. 전체 엑솜/유전체 시퀀싱은 네오-에피토프 예측을 용이하게 하는 높은 처리량 방식으로 단백질 코딩 영역을 신속하게 변경하는 종양-특이적 유전자 돌연변이를 확인하는데 사용될 수 있다. 질량 분광법은 또한 세포 표면의 MHC 분자에 결합된 펩티드를 확인하는데 사용될 수 있다. 암 세포에 특이적인 단백질 변경 돌연변이를 확인하기 위해 생식계열 및 종양 DNA에 대해 NGS를 수행하는 정방향 접근 후, 인 실리코(in silico) 알고리즘을 통한 에피토프 예측이 사용될 수 있다.
[0321] 예를 들어, 종양 샘플은 환자로부터 추출되고(및/또는 단기 배양을 포함하여 배양됨), 전체-엑솜 시퀀싱(또는 다른 엑솜 시퀀싱)에 의해 검사되어 환자-특이적인 돌연변이 유래된 네오-에피토프를 확인한다. 예를 들어, DNA 및 RNA는 환자 종양 세포로부터 추출될 수 있고, DNA 시퀀싱을 위한 엑솜 포획이 수행될 수 있다(예를 들어, Agilent 인간 전체-엑솜 SureSelect 검정을 사용함). RNA-seq 라이브러리가 제조되었다(예를 들어, Illumina mRNA-seq 프로토콜을 사용함). 라이브러리는 (예를 들어, Illumina HiSeq2500 상에서) 시퀀싱되어 뉴클레오티드 판독을 생성할 수 있다. RNA 판독은 인간 참조 유전체에 정렬되고 전사물로 조립될 수 있다(예를 들어, Bowtie-TopHat-Cufflinks, 오픈 소스 Tuxedo Suite 소프트웨어(Trapnell, C. et al., Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012))를 사용함). WES 데이터는 참조 유전체에 맵핑될 수 있고(예를 들어, BWA, Burrows-Wheeler Aligner에 의함, http://bio-bwa.sourceforge.net/), 이후 체세포 돌연변이를 검출하기 위해 처리될 수 있다(예를 들어, 매우 민감하고 특이적인 돌여변이-호출 알고리즘인 MuTect을 사용함, Cibulskis, K. et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31, 213-219 (2013)). 따라서, 환자-특이적 대립유전자가 결정될 수 있다(예를 들어, Seq2HLA를 사용함, Boegel, S. et al. HLA typing from RNA-Seq sequence reads. Genome Med. 4, 102 (2012)). 확인된 돌연변이는, 예를 들어, RNA 서열 데이터를 사용하여 종양 발현 수준에 의해 추가로 필터링될 수 있는 추정상의 후보 항원성 펩티드일 수 있다. 후보 펩티드(예를 들어, 8-11개 초과의 문자 길이)는, 예를 들어, 인 실리코 수행된 펩티드-MHC 결합 친화성 예측(IC50nM)에 기반하여 순위화될 수 있다(예를 들어, NetMHCpan을 사용함, 예를 들어, http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/). 상기 설명된 소프트웨어 중 임의의 것은 단지 예시적이며, 다른 소프트웨어가 사용될 수 있다.
[0322] 네오-에피토프의 예측은 유전체 데이터의 인 실리코 처리에 의존할 수 있고, 공여자 HLA 유형, 종양 mRNA 발현, 생식계열 DNA 및 종양 DNA의 지식을 사용할 수 있다. 전체 유전체 마이크로어레이 또는 RNA-seq와 같은 종양 mRNA 발현 데이터는 전사된 유전자에서 변이체를 확인하기 위해 종양-특이적 암 돌연변이 정보에 오버레이될 수 있다. 이후, 이러한 변이체는 에피토프 예측 알고리즘을 통해 실행되어, 개체-특이적 HLA-대립유전자에 잠재적으로 결합하는 펩티드 서열을 확인할 수 있다. SYFPEITHI(Schuler et al. 2007), RANKPEP(Reche et al. 2002), NetMHCpan(Jurtz et al. 2017), NetMHCcons(Karosiene et al. 2012), PickPocket(Zhang et al. 2009), MHCflurry(pre-print, 10.1101/174243), ANN(Singh and Mishra 2008) 및 SMM(Peters and Sette 2005)을 포함하는 많은 에피토프 예측 알고리즘이 이용 가능하다. 이러한 알고리즘은 상이한 예측 모델을 사용할 수 있지만, 모두 특성화된 에피토프/MHC 조합을 사용하여 훈련되어, 제공된 HLA-대립유전자에 짧은 펩티드 서열이 결합할 가능성의 예측을 초래한다. 전체 유전체/엑솜 시퀀싱 데이터를 사용하고 HLA-대립유전자 타이핑, mRNA 발현 데이터, 펩티드 처리 예측 및 야생형 및 돌연변이된 펩티드에 대한 HLA-대립유전자 결합을 포함되도록 분석을 통합하는 생물정보학 파이프라인이 생성되었다. 이들은 pVAC-seq(Hundal et al. 2016), MuPeXi(Bjerregaard et al. 2017), Cloudneo(Bais et al. 2017) 및 TIminer(Tappeiner et al. 2017)를 포함할 수 있다. 계산 도구(예를 들어, LOHHLA, 인간 백혈구 항원에서 이형접합성의 손실)는 차세대 시퀀싱 데이터로부터 HLA 유전자좌의 대립유전자-특이적 카피 수 추정을 가능하게 하기 위해 사용될 수 있다.
[0323] 본원에 설명된 mRNA 백신 및 방법 중 임의의 것에서, 하나 이상, 및 일부 경우에 다수(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 등)가, 예를 들어, 함께 인코딩된 단일 mRNA(또는 다수의 mRNA)로 조합될 수 있다. 이러한 조합된 네오-에피토프 mRNA는 본원에 설명된 바와 같이 성공적으로 사용될 수 있다.
[0324] 대안적으로 또는 추가로, mRNA 기반 종양 백신접종은 종양 공유 항원, 즉, 상이한 환자로부터의 많은 종양에서 과발현되고 HLA-제시되는 항원을 포함할 수 있다.
비제한적인 실시예
[0325] 일부 예에서, 동계 마우스 암 모델은 본원에 설명된 mRNA 백신접종 방법이 종양 항원에 대해 사용될 수 있고 마우스의 분획에서 지속적인 종양 퇴행 및 장기 CD8+ T-세포 매개 암 면역을 초래할 수 있음을 나타내기 위해 사용되었다.
실시예 1: 종양 모델
[0326] 도 2는 마우스에 종양 세포주(EG.7)를 이식하고 종양 성장을 모니터링하는 데 사용된 동계 마우스 모델의 일 예를 예시한다. 종양 라인은 공유된 종양-특이적 항원인 오브알부민을 발현하도록 조작되었다. 미리 설정된 종양 성장 부피 후에 마우스를 희생시켰다. 도 2는 본원에 설명된 바와 같은 다양한 mRNA 백신 및 치료 방법의 결과를 예시한다. 도 2에서, 음성 대조군 마우스(G1)는 이식 후 25일(DPI)까지 사전-설정된 종양 부피 한계를 초과하였다. 대조적으로, 종양 성장의 유의한 둔화는 공유된 종양-특이적 항원의 mRNA의 피하 주사(예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클에서) 뿐만 아니라 또한 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클과 조합된 면역조절제(항-CTLA-4)를 인코딩하는 mRNA("G5")의 종양 내 주사로 치료된 마우스에서 관찰되었다. G5를 사용한 결과와 비교하여, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클 내에 종양-특이적 항원의 mRNA 및 면역조절제(항-CTLA-4)를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 백신("G6")의 종양 내 주사로 종양 성장 둔화 또는 감소에서의 유사하지만 약간 더 우수한 개선이 관찰되었다. 그러나, 놀랍게도, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클 내의 종양-특이적 항원의 mRNA 및 2개의 면역조절제(항-CTLA-4 및 TGF-β 둘 모두)를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 백신("G7")으로 치료된 동물에서 훨씬 더 큰 생존이 관찰되었다. 항-CTLA-4에 대한 DNA 서열은 SEQ ID NO: 1(중쇄) 및 SEQ ID NO: 3(경쇄)에 제공된다. TGF-β에 대한 예시적인 서열은 SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 9에 제시되어 있다. 도 2에서, 전장 IgG 항-CTLA4는 mRNA 백신에서 mRNA에 의해 인코딩되었다. 상기 설명된 치료 모두에서, 면역자극제 CpG가 mRNA 백신에 포함되었다. 동일한 아미노-지질화된 펩토이드를 종양 내 주사 모두에 사용하였다.
[0327] 도 2에 제시된 바와 같이, 하나 또는 (더욱 바람직하게는) 그 초과의 면역조절제(예를 들어, aCTLA4 및 aTGF-β)와 조합된 종양-특이적 항원에 대한 mRNA의 종양 내 주사는 mRNA 백신접종의 효능을 극적으로 증가시켰다.
[0328] 상이한 종양 세포주(MC38)가 사용된 동계 마우스 모델을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 이는 도 3에 제시되어 있다. 이 실시예에서, MC38 종양 및 네오-에피토프를 시퀀싱함으로써 확인된 종양-특이적 항원을 포함하는 mRNA 백신이 확인되었다. 7개의 에피토프를 확인하고 사슬화하여 7개의 종양-특이적 항원 모두를 인코딩하는 단일 mRNA를 형성시켰고; 에피토프의 서열은 제시를 향상시키기 위해 맞춤 스캐폴드에서 발현되었다.
[0329] 도 3에서, 대조군 동물("G2")에 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클과 함께 비-코딩 mRNA 및 CpG를 주사하였다. 단지 종양-특이적 mRNA 및 아미노-지질화된 펩토이드 전달을 포함하는 mRNA 백신("G7")의 피하 주사는 대조군 동물과 비교하여 종양 성장에 유의한 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, 아미노-지질화된 펩토이드와 조합된 종양 특이적 mRNA 및 항-CTLA-4 mRNA 둘 모두("G9")를 종양 내 주사한 동물은 종양 성장에서 유의한 둔화 또는 감소 및 이에 따른 생존을 나타내었다. 가장 유의하게는, 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클과 함께 종양-특이적 항원의 mRNA 및 3개의 면역조절제(항-CTLA-4 및 TGF-β 및 단일 사슬 IL-12)를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 mRNA 백신("다중-효과기 칵테일"을 나타내는 "G10")의 종양 내 주사는 종양 성장의 극적인 둔화 또는 감소를 초래하였다. 이 예에서, mRNA 백신접종은 또한 모두 CpG를 포함하였다.
[0330] 도 4는 종양 내 주사만을 사용한 투여에 대해 동계 마우스 모델을 시험한 또 다른 예의 결과를 제시한다. 도 7에서, 종양-특이적 항원 및 아미노-지질화된 펩토이드 단독을 갖는 mRNA 백신("1")은 항-CTLA-4 및 아미노 지질화된 펩토이드와 조합된 종양-특이적 항원의 mRNA 및 아미노-지질화된 펩토이드를 포함하는 mRNA 백신("6")과 비교된다. 제시된 바와 같이, 단일 면역조절제(이 경우, 항-CTLA-4)의 사용은 생존을 극적으로 증가시켰다(예를 들어, 종양의 성장을 늦추거나 감소시킴에 의함).
[0331] 도 5는 항-CTLA-4 및 아미노-지질화된 펩토이드와 조합된 종양-특이적 항원의 mRNA 및 아미노-지질화된 펩토이드를 포함하는 mRNA 백신("6")과 비교한 종양-특이적 항원 및 아미노-지질화된 펩토이드 단독의 mRNA("1")의 종양 내 주사(IT) 후 도 4에 요약된 동물 대상체에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피에 대한 효과를 그래프로 예시한다. 종양 부피가 3000 mm3를 초과할 때 통상적으로 동물을 희생시켰다. 종양-특이적 항원 및 항-CTLA-4 mRNA와 함께 아미노-지질화된 펩토이드로 치료된 사실상 모든 동물에서 종양 성장의 지연을 나타낸 반면, 일부는 종양 부피의 감소 또는 차단을 나타내었다.
[0332] 도 6은 피하 주사에 의해 치료된 동계 마우스에서 유사한 결과가 관찰되었음을 제시하며, 이는 종양(예를 들어, 대조군 "G1"과 비교하여 시간 경과에 따른 종양의 성장 방지) 동물의 대략 50% 제어를 나타낸다. 도 7에서 대조적으로, 치료 마우스에 종양-특이적 항원 뿐만 아니라 항-CTLA-4 mRNA 및 TGF-B-PDL1 mRNA와 함께 아미노-지질화된 펩토이드를 포함하는 2 μg의 mRNA 백신이 주사되었고, 이는 대략 80%의 종양 제어를 나타낸다. 모든 마우스는 종양 성장의 둔화를 나타내었고, 대부분은 시간이 지남에 따라 종양 부피의 감소를 나타내었다.
[0333] 상기 설명된 결과는 모두 mRNA 백신을 이용한 대상체 동물의 다중 투여를 포함하였다. 일반적으로, mRNA 백신의 종양 내 주사의 다중 용량을 제공하는 것이 유리할 수 있지만, 필수적인 것은 아니다. 예를 들어, 주사는 약 4일 이상(예를 들어, 격주)으로 간격을 둘 수 있다. 일부 변형에서, 단지 2개 또는 최대 3개의 주사가 사용된다.
[0334] 놀랍게도, 상기 설명된 실험으로부터, 장기 생존자인 마우스는 강하고 지속적인 CD8+ 효과기 T-세포 암 면역을 발달시켰고 추가 종양 공격에 내성이 있는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 도 8a 및 8b는 본원에 설명된 mRNA 백신접종 방법으로부터 초래되는 효율적인 T-세포 반응을 예시한다. 웰 당 3x105개의 비장세포로 Elispot 검정을 수행하고 종양 세포(예를 들어, 1x106개의 EG7 세포)를 자극제로서 사용하였다. 도 8a에서, 양성 대조군(OTI) 및 음성 대조군(#596)으로부터의 세포를 오래 생존한 마우스 중 2마리(#662 및 #670)와 비교하였고, 이는 종양 노출에 반응하여 인터페론 감마를 분비하는 T-세포의 수를 나타낸다. 마지막 치료 2개월 후에 순환 혈액 또는 비장으로부터 세포를 채취하였다.
[0335] 도 8b는 유의한 반응(사용된 오브알부민 종양-특이적 마커에 반응하도록 조작된 양성 대조군 마우스 OTI와 비슷하거나 우수함)을 나타내는 이 데이터를 정량화한다. 따라서, 본원에 설명된 바와 같이 면역화된 마우스는 종양을 계속 인식한 것으로 관찰되었고, 이는 유의한 강력하고 지속적인 면역성을 나타내고, 이들 마우스에서 본원에 설명된 방법의 효과를 나타내고, 심지어 단일 치료로부터의 장기 효과를 시사하는 것으로 관찰되었다.
실시예 2: EG7-OVA 림프종 모델
[0336] 본 실시예에서, 마우스를 EG7 마우스(EG7-OVA 림프종 모델)에 종양 내(IT) 또는 근육 내(IM) 주사하였다. IT 주사는 양측이었고, 효과기가 있거나 없는 OVA-mRNA를 주사하였다. IT 주사는 효과기가 있거나 없는 동일한 OVA-mRNA의 편측 주사였다. 표 1(도 9에 제시됨)은 항원 mRNA("OVA")(그룹 1, 2, 5, 6, 7 및 10) 또는 비-코딩 항원 mRNA("비-코딩 mRNA")(그룹 3, 4, 8 및 9)와 함께 CpG(그룹 1, 3, 6 및 8), IL-12(그룹 2, 4, 7 및 9), 또는 둘 모두의 항원 mRNA, 비코딩 항원 mRNA 및 CM-CSG가 주사된 다양한 시험된 그룹을 예시한다. 그룹 1-10 각각에 대해, 10마리의 마우스에 주사하고, 총 3회의 주사를 수행하였다. 초기 주사는 종양 크기가 대략 75 mm에 도달한 4일에 수행되었고; 두 번째 및 세 번째 주사(부스트)는 초기 주사 1주 및 2주 후에 수행되었다. 대조군 동물(그룹 11 및 12의 마우스)은 전달 비히클 또는 mRNA를 투여받지 않았다. 종양이 1500 mm3 초과가 된 후 또는 60일 후에 마우스를 희생시켰다. 비장 및 혈청을 검사하고 CD8+ T 세포에 대해 등급을 매겼다.
[0337] CD8 T-세포 반응을 흐름세포측정법을 사용하여 측정하였다. 사량체 양성 CD8 T 세포 백분율은 종양-특이적 면역을 유도하는 치료적 개입의 능력에 대한 바이오마커를 제공한다. 공격 후 11일 및 28일에 개별 마우스를 채혈하였다. 순환 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 단일-세포 현탁액을 1:100 희석된 항-CD3 항체, 및 1:100 희석된 항-CD8 항체(Thermo Scientific) 내에서 0.5 μg/mL 사량체(OVA 펩티드를 함유하는 H-2Db 사량체, SIINFEKL)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 2% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 적어도 100,000개의 세포를 Beckman Coulter FC 500 흐름세포측정기에서 획득하고 CXP 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. CD8+ 세포에서 게이팅을 수행하고, CD3+/CD8+/사량체+ 세포의 백분율을 결정하였다.
[0338] 도 10a-10g 및 11a-11f는 근육 내 주사의 결과를 제시한다. OVA 펩티드(SIINFEKL)를 사용하여 순환 중인 OVA-특이적 T-세포를 측정하기 위해 흐름세포측정법을 사용하였다. 혈액으로부터 1회 용량 후(11일) 및 3회 용량 후(28일)에 측정을 수행하였다. 도 10a-10g는 제1 용량 후 11일에 상기 설명된 바와 같은 근육 내(IM) 주사의 결과를 예시한다. 도 10a는 그룹 6(OVA+CpG, 근육 내)에 상응하고, 도 10b는 그룹 7(OVA+IL-12, 근육 내)에 상응하고, 도 10c는 그룹 8(비-코딩 mRNA+CpG, 근육 내)에 상응하고, 도 10d는 그룹 9(비-코딩 mRNA+IL-12, 근육 내)에 상응하고, 도 10e는 그룹 10(OVA+IL-12+GM-CSF, 근육 내)에 상응한다. 도 10f 및 10g는 대조군을 제시한다.
[0339] 유사하게, 도 11a-11g는 제3 IM 용량 후(28일에) SIINFEKL 사량체를 사용하여 순환 중인 OVA-특이적 T-세포에 대한 흐름세포측정법 결과를 제시한다. 도 11a는 그룹 6(OVA+CpG, 근육 내)에 상응하고, 도 11b는 그룹 7(OVA+IL-12, 근육 내)에 상응하고, 도 11c는 그룹 8(비-코딩 mRNA+CpG, 근육 내)에 상응하고, 도 11d는 그룹 9(비-코딩 mRNA+IL-12, 근육 내)에 상응하고, 도 11e는 그룹 10(OVA+IL-12+GM-CSF, 근육 내)에 상응한다. 도 11f는 대조군을 제시한다.
[0340] 도 10a-10g 및 11a-11f에 제시된 바와 같이, 효과기 단독은 종양-특이적 CD8+ T-세포 집단의 강력한 확장을 유도하지 않았다(예를 들어, 도 10c-10d 및 11c-11d 참조). 그러나, 항원이 항원 및 면역조절제에 대한 mRNA와 동일한 전달 비히클에서, 예를 들어, 조합에 의해 면역조절제(예를 들어, IL-12와 같은 염증촉진성 사이토카인) 및/또는 CpG와 같은 면역자극제와 조합될 때, 순환하는 CD8+ T-세포의 약 25%는 28일까지 종양 특이적이었다. 이 실시예에서, IL-12 및 CpG 둘 모두는 종양-특이적 CD8 T 세포의 유사한 확장을 나타내었다.
[0341] 도 12a-12g 및 13a-13f는 종양 내(IT) 주사의 결과를 제시한다. OVA 펩티드(SIINFEKL)를 사용하여 순환 중인 OVA-특이적 T-세포를 측정하기 위해 흐름세포측정법을 사용하였다. 혈액으로부터 1회 용량 후(11일) 및 3회 용량 후(28일)에 측정을 수행하였다. 도 12a-12g는 제1 용량 후 11일에 상기 설명된 바와 같은 종양 내 주사의 결과를 예시한다. 도 12a는 그룹 1(OVA+CpG, 근육 내)에 상응하고, 도 12b는 그룹 2(OVA+IL-12, 근육 내)에 상응하고, 도 12c는 그룹 3(비-코딩 mRNA+CpG, 근육 내)에 상응하고, 도 12d는 그룹 4(비-코딩 mRNA+IL-12, 근육 내)에 상응하고, 도 12e는 그룹 5(OVA+IL-12+GM-CSF, 근육 내)에 상응한다. 도 12f 및 12g는 대조군을 제시한다.
[0342] 도 13a-13g는 제3 IT 용량 후(28일에) SIINFEKL 사량체를 사용하여 순환 중인 OVA-특이적 T-세포에 대한 흐름세포측정법 결과를 제시한다. 도 13a는 그룹 1(OVA+CpG, 근육 내)에 상응하고, 도 13b는 그룹 2(OVA+IL-12, 근육 내)에 상응하고, 도 13c는 그룹 3(비-코딩 mRNA+CpG, 근육 내)에 상응하고, 도 13d는 그룹 4(비-코딩 mRNA+IL-12, 근육 내)에 상응하고, 도 13e는 그룹 5(OVA+IL-12+GM-CSF, 근육 내)에 상응한다. 도 13f는 대조군(미처리) 그룹을 제시한다.
[0343] 도 13a-13b 및 13e에 제시된 바와 같이, 항원-특이적 mRNA와 조합된 항원 및 면역조절제, 예를 들어, 염증촉진성 사이토카인(예를 들어, IL-12) 또는 면역자극제, 예를 들어, CpG의 종양 내(IT) 주사는 근육 내(IM) 주사와 비교하여 더 강한 종양-특이적 CD8 반응을 초래하였다. 예를 들어, 동일한 전달 비히클 상의 염증촉진성 사이토카인(예를 들어, IL-12)과 조합된 종양-특이적 항원의 종양 내 주사는 근육 내 주사된 동일한 조성물보다 더 강력한 반응을 초래하였다. 종양 항원 mRNA 및 면역조절제 또는 면역자극제(동일한 전달 비히클과 함께 조합됨)의 사용은 순환 CD8+ T 세포의 약 25%가 28일에 종양-특이적이도록 하였다. 본 실시예에서, 면역자극제(CpG) 및 면역조절제(염증촉진성 면역조절제, IL12) 둘 모두는 종양-특이적 CD8 T 세포의 유사한 확장을 초래하였다. 근육 내 주사 및 종양 내 주사 효과기(예를 들어, 면역조절제, 면역자극제 등) 둘 모두의 경우, 도 13c 및 13d에서 IT 주사에 대해 제시된 바와 같이 단독으로는 종양-특이적 CD8+ T 세포 집단의 강력한 확장을 유도하지 않았다.
실시예 3: 종양 이식, 치료 및 감시
[0344] 동일한 면역조절제 mRNA(예를 들어, IL-12와 같은 염증촉진성 면역조절제) 또는 면역억제제(예를 들어, CpG)와 조합된 종양-특이적 항원 mRNA를 사용한 종양 내 주사의 치료적 용도를 또한 동물 모델에서 시험하였다.
[0345] 10마리의 8주령 암컷 C57BL/6 마우스의 그룹을 PBS 중 1 × 105개의 EG.7 종양 세포로 우측 옆구리에 피하(s.c.)로 공격하였다. 실험 기간 전체에 걸쳐, 종양 성장을 2차원의 캘리퍼로 주당 2 내지 3회 모니터링하였다. 종양 부피가 1,500 mm3를 초과하거나 궤양이 생겼을 때 마우스를 안락사시켰다. 종양 내 및 근육 내 주사 둘 모두를 수행하였다. 예를 들어, 20 ul의 mRNA로 제형화된 2 μg의 나노입자로 종양 내 치료 백신접종을 종양 공격 후 7, 14 및 28일에 주사하였다. 6개의 변이체가 사용되었다: (1) 종양-특이적 항원(OVA) mRNA + 면역조절제(IL-12) mRNA; (2) 종양-특이적 항원(OVA) mRNA, 면역조절제(IL-12) mRNA, 및 제2 면역조절제(GM-CSF) mRNA; (3) 종양 특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역자극제(CpG); (4) 면역조절제(IL-12) mRNA 단독(종양 항원 mRNA 없음); (5) 면역자극제(CpG) 단독(종양 항원 mRNA 없음); 및 (6) PBS. 종양 내 및 근육 내 실험 둘 모두로 동일한 6개의 변이체를 시험하였다. 근육 내 주사를 위해, 종양 공격 후 7, 14 및 28일에 20 ul의 2 ug 나노입자 제형화된 RNA로 치료적 백신접종을 또한 수행하였다. 이러한 실험에서 치료-관련 독성은 관찰되지 않았으며, 종양 성장을 60일 동안 모니터링하였다.
[0346] 도 14는 상기 설명된 6개의 변이체 중 하나로 근육 내(IM) 주사에 의해 치료될 때 종양 주사 후 생존 확률에 대한 결과를 요약한 것이다. 제시된 바와 같이, 대조군 동물은 단지 면역자극 주사(CpG)로 처리된 동물과 마찬가지로 40일 전에 모두 사망하였다. 60일(종점)까지의 생존 확률은 종양 특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역자극제(CpG)로 면역화된 동물에 대해 가장 높았고, 면역조절제(IL-12) mRNA 단독(종양 항원 mRNA 없이)이 그 뒤를 이었고, 이어서 종양-특이적 항원(OVA) mRNA, 면역조절제(IL-12) mRNA 및 제2 면역조절제(GM-CSF) mRNA, 그리고 종양-특이적 항원(OVA) mRNA + 면역조절제(IL-12) mRNA가 그 뒤를 이었다.
[0347] 도 15는 상기 설명된 이러한 동일한 변이체의 종양 내 주사에 대한 결과를 제시한다. 본 실시예에서, 대조군(PBS) 또는 면역조절제(IL-12) mRNA 단독(종양 항원 없음)으로 면역화된 종양을 갖는 동물은 40일까지 생존하지 않았다. 종양-특이적 항원(OVA) mRNA + 면역조절제(IL-12) mRNA로 면역화된 동물의 전체 생존율이 가장 높았고(40%), 종양-특이적 항원(OVA) mRNA, 면역조절제(IL-12) mRNA 및 제2 면역조절제(GM-CSF) mRNA로 면역화된 동물이 그 뒤를 이었고(30%), 이후 종양 특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역자극제(CpG) 또는 면역자극제(CpG) 단독(종양 항원 mRNA가 없음)으로 면역화된 동물이 그 뒤를 이었다(둘 모두 20%).
[0348] 도 16-20은 상기 시험된 근육 내 치료 그룹 각각에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피 변화를 나타내는 그래프이다. 예를 들어, 도 16은 대조군(미처리) PBS 용액, 또는 종양 특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역자극제(CpG)를 포함하는 나노입자 조성물로 주사된 마우스의 종양에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 제시하는 그래프이다. 면역자극제(CpG)와 조합된 종양 특이적 항원(OVA) mRNA가 주사된 마우스는 유의한 종양 부피를 나타내지 않았거나(예를 들어, 종양이 성장하지 않음) 더 느리게 성장하였다.
[0349] 도 17은 대조군 용액(PBS), 또는 종양-특이적 항원(OVA) mRNA + 면역조절제(IL-12) mRNA 둘 모두를 함유하는 전달 비히클로 근육 내(IM) 주사된 마우스의 종양에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 제시한다. 도 17에 제시된 바와 같이, 일부 종양은 성장하지 않은 반면, 종양-특이적 항원(OVA) mRNA + 면역조절제(IL-12) mRNA로 치료된 마우스에서 종양의 대부분은 더 천천히 성장하였다.
[0350] 도 18은 종양 특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역자극제(CpG)를 근육 내(IM) 주사한 마우스, 및 면역자극제(CpG) 단독(종양 항원 mRNA 없음)으로 주사된 마우스로부터의 종양에 대한 종양 부피의 변화를 제시한다. 이들 2개 그룹 사이에는 시간 경과에 따른 종양 부피에 상당한 중첩이 존재한다.
[0351] 도 19는 전달 비히클 내에 종양-특이적 항원(OVA) mRNA + 면역조절제(IL-12) mRNA를 포함하는 나노입자 조성물 및 면역조절제(IL-12) mRNA 단독(종양 항원 mRNA 없음)을 포함하는 나노입자 조성물을 이용한 근육 내 주사에 의해 치료된 마우스 사이의 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 제시한다.
[0352] 도 20은 종양 특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역자극제(CpG) 또는 면역자극제(CpG) 단독(종양 항원 mRNA 없음)에 의해 근육 내(IM) 주사된 마우스의 종양 부피 사이의 비교이다.
[0353] 일부 실험에서, 동일한 동물은 다수의 유도된 종양을 포함할 수 있고, 이들 중 일부는 종양 내 주사에 의해 치료될 수 있거나("근위" 종양) 동일한 동물에서 치료되지 않을 수 있다("원위"). 도 21은 종양으로의 종양 내 주사를 투여받지 않은 동일한 동물의 종양과 비교하여 종양-특이적 항원(OVA) mRNA + 면역조절제(IL-12) mRNA의 종양 내 주사를 투여받은 종양에 대한 종양 부피의 변화를 제시한다. 도 22는 동일한 동물로부터의 근위 종양에 면역조절제(IL-12) mRNA를 단독으로(종양 항원 mRNA 없음) 주사할 때 근위 및 원위 종양 사이의 종양 부피의 변화를 제시한다.
[0354] 도 23은 또한 종양 특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역자극제(CpG)가 주사된 동일한 동물에서 치료된(근위) 및 치료되지 않은(원위) 마우스에 대한 종양 부피의 변화를 제시한다. 근위 종양은 종양 내로 주사를 투여받은 반면, 원위 종양은 동일한 동물에 있었지만 전달 비히클 및 CpG를 갖는 OVA mRNA의 종양 내 주사를 투여받지 않았다. 종양 특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역자극제(CpG)로 치료된 종양의 일부는 원위(주사되지 않은) 종양과 비교하여 더 느리게 성장하거나 성장하지 않았다.
[0355] 도 24에서, 종양 내 주사(본 실시예에서: 면역자극제(CpG) 단독)를 투여받은 근위 종양 대부분은 성장을 늦추거나 역전시킨 반면, 원위 종양은 동일한 마우스에서 대부분 계속 성장하였다. 도 25는 도 16-24와 관련된 데이터의 결과를 요약한 표(표 2)이다. 제시된 바와 같이, 종양-특이적 항원(OVA) mRNA 및 면역조절제(IL-12) mRNA 둘 모두를 함유하는 전달 비히클의 종양 내 주사는 원위 종양 효과(50%)를 유지하면서 주사된 종양에 대해 가장 강력한 반응률(예를 들어, 70%)을 가졌다. 이들 동물에서 근위(주사) 및 원위(비주사, 근위와 동일한 동물) 둘 모두의 전체 반응은 약 40%였다. 동일한 검정은 면역조절제(예를 들어, 염증성 사이토카인, IL-12)에 대한 반응률에서 유의한 효과를 발견하지 못했다. 효과는 또한 면역자극성 CpG를 갖는 종양-특이적 항원(OVA) mRNA로 관찰되었다(예를 들어, 근위 종양의 50% 반응률, 및 원위 종양의 경우 50%). 종양-특이적 항원(OVA) mRNA + 면역자극제(CpG)에 대한 근위 및 원위 종양 둘 모두의 전체 반응은 약 20%였다. CpG 단독의 종양 내 주사는 더 작은 효과를 갖는다(예를 들어, 30% 근위, 20% 원위 및 20% 전체).
[0356] 본원에서 사용되는 바와 같이, 반응은 종양이 종점 부피에 도달할 때 반대측 종양의 종양 부피와 비교하여 <5%의 종점 종양 부피이다. 예를 들어, 동일한 마우스에서 2개의 종양 중 하나가 종점 부피에 도달하고(예를 들어, 종양 1은 1500 mm3임), 반대쪽 종양(종양 2)은 단지 75 mm3일 때, 이는 종양 2에서 반응으로 간주된다.
실험 4: MC38 결장 암종 피하 종양
[0357] MC38 결장암 종양을 시험 동물(마우스)에서 확립하고, 나노입자로 처리하여 종양-특이적 항원의 부재를 포함하는 효과기(예를 들어, 면역조절제 및 면역자극제)의 효과를 결정하였다.
[0358] 종양 이식 후 6일 및 10일에 면역조절제 및 면역자극성 mRNA로 제형화된 나노입자로 종양을 처리하였다. 나노입자는 하나 이상의 면역조절제, 면역자극제 및/또는 종양-특이적 항원을 포함하는 전달 비히클이다. 예를 들어, 도 26-28은 유도된 MC38 종양 및 이러한 종양을 갖는 마우스에 대한 비-코딩 RNA 대조군, 분비된 LIGTH(예를 들어, TNFRSF14), 고유 LIGHT, 면역조절제 GM-CSF, 및/또는 면역조절제(예를 들어, 염증촉진성 사이토카인 IL-12)를 포함하는 나노입자의 효과를 예시한다. 주사된 동물은 면역조절제 및/또는 면역자극제에 의해 유도된 종양 미세환경의 변화에 대해 분석된 종양 및 종양-배출 림프절을 가졌다. LIGHT는 CD258로도 언급되는 종양 괴사 인자 상과 구성원 14(TNFSF14)를 지칭하며, 이는 본원에 설명된 바와 같은 면역조절제의 또 다른 예이다.
[0359] 프로토콜의 일부로서, 5-10마리의 8주령 암컷 C57BL/6 마우스의 그룹을 PBS 중 1 × 105개의 MC38 종양 세포로 우측 옆구리에 피하(s.c.)로 공격하였다. 20 ul의 2 μg 나노입자 제형화된 RNA로 종양 내 치료 백신접종을 종양 공격 후 7일 및 11일에 제공하였다. 시험된 조성물은 면역조절제(예를 들어, 염증촉진성 사이토카인, IL-12) mRNA, GM-CSF 면역조절 mRNA, 면역조절성의 분비된 LIGHT mRNA, 면역조절성 고유 LIGHT mRNA, 및 대조군 PBS의 나노입자를 포함하였다. 종양 배액 림프절과 마찬가지로 마우스의 예정된 안락사 후에 종양을 수확하였다. 종양 면역 세포 침윤물 및 면역 활성화의 흐름세포측정법 분석을 흐름세포측정법에 의해 평가하였다. 치료-관련 독성은 관찰되지 않았다. 종양 성장을 60일 동안 모니터링하였다.
[0360] 도 26은 MC38 종양 세포의 종양 부피에 대한 다양한 면역조절제(예를 들어, 효과기)의 효과를 제시한다. 도 26에서, 대조군(비-코딩 mRNA) 또는 면역조절제(분비된 LIGHT, LIGTH, GM-CSF 또는 IL-12)를 포함하는 전달 비히클의 종양 내 주사의 효과는 공격 후 D1 및 7일에 제시된다. IL-12 그룹(그룹 6)은 대조군과 비교하여 차이를 나타내었다.
[0361] 도 27에 제시된 바와 같이, IL-12의 종양 내 주사에 의해 치료된 동물로부터의 종양에서 CD8 T 세포 빈도가 증가하였다. 본 실시예에서, 종양 공격 후 7일에 CD4 및 CD8 둘 모두에 대해 양성인 살아있는 T 세포의 빈도는 IL-12를 포함하는 전달 비히클이 종양 내 주사된 종양에서 유의하게 더 컸다. 일반적으로, 도 28에 제시된 바와 같이, 7일까지 다른 면역조절제 및 대조군과 비교하여, 단핵구, B-세포, 수지상 세포 및 대식세포에서 IL-12의 종양 내 주사 후 항원-제시 세포가 유의하게 증가하였다. 따라서, IL-12와 같은 염증촉진성 사이토카인은 종양 내 주사될 때(및 상기 나타낸 바와 같이, 특히 종양-특이적 항원과 동일한 전달 비히클에서 조합될 때) 다른 면역조절제와 비교해서도 항-종양 반응을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
실시예 5: C3.43 종양 세포
[0362] C3.43은 HPV16-형질전환된 종양 모델이다. 종양-특이적 항원(HPV 16 종양단백질 E6 및 E7)은 C3.43 종양과 함께 사용될 수 있다. 이 모델은 또한 염증촉진성 사이토카인(예를 들어, IL-12)과 같은(비제한적으로) 하나 이상의 면역조절제 mRNA와 동일한 전달 비히클에서 조합된 종양-특이적 항원 mRNA의 효과를 나타내기 위해 사용되었다.
[0363] 10마리의 8주령 암컷 C57BL/6 마우스의 그룹을 PBS 중 5 × 105개의 C3.43 종양 세포로 우측 옆구리에 s.c. 공격하였다. 실험 기간 전체에 걸쳐, 종양 성장을 3차원의 캘리퍼로 주당 2 내지 3회 모니터링하였다. 종양 부피가 1,500 mm3를 초과하거나 궤양이 생겼을 때 마우스를 안락사시켰다. 종양 공격 후 18, 25 및 32일에 20 μl의 2 μg 나노입자 제형화된 RNA를 사용한 종양 내 치료 백신접종. 6개의 상이한 나노입자 제형을 시험하였다: (1) 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA와 함께 종양-특이적 항원(HPV16 E6E7) mRNA; (2) 종양-특이적 항원(HPV16) mRNA, 제1 면역조절제(LIGHT) mRNA 및 제2 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA; (3) 종양-특이적 항원(HPV16) mRNA 및 면역자극제(CpG); (4) 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA; (5) 제1 면역조절제(LIGHT) mRNA 및 제2 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA; (6) 면역자극제(CpG); (7) 대조군(PBS). 제1 나노입자 용액, 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA를 갖는 종양-특이적 항원(HPV16 E6E7) mRNA를 또한 근육 내 주사하였다. 치료-관련 독성은 관찰되지 않았다. 종양 성장을 60일 동안 모니터링하였다.
[0364] 도 29는 본원에 설명된 바와 같은 나노입자 조성물의 효과를 시험하는데 사용될 수 있는 연구 타임라인의 일 예를 예시한다. 이 타임라인은 상기 실시예 2-4에 설명된 실험에 사용된 타임라인과 유사하다. 마우스(예를 들어, C57BL6 암컷 마우스, 6-8주령)는 0일에 100 μL HBSS 중 1x105개의 종양 세포(예를 들어, 본 실시예에서, C3.43 종양 세포)로 오른쪽 뒷다리에서 s.c.에 의해 편측 공격된다. 투여 주사는 우측 뒷다리 또는 IT에서 편측 i.m.에 의해 수행되었다. 10개 그룹의 경우, n=10마리 마우스/그룹. 마우스를 종양 성장, 유의한 체중 감소(매주 측정), 및 고통의 외부 징후(인도적 종점)에 대해 모니터링하였다.
[0365] 도 30a-30f는 각각 도 29에 제시된 것과 같은 프로토콜을 사용하여 상기 설명된 나노입자 용액 중 하나가 종양 내 주사된 개별 종양에 대한 결과를 제시한다. 예를 들어, 도 30a는 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA와 함께 종양-특이적 항원(HPV16 E6E7) mRNA를 포함하는 제1 나노입자 용액의 C3.43 종양에서의 종양 내 주사의 효과를 제시하며, 이는 시험된 거의 모든 종양에 대한 평균 종양 부피의 감소를 나타낸다. 도 30b는 종양-특이적 항원(HPV16) mRNA, 제1 면역조절제(LIGHT) mRNA 및 제2 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA를 포함하는 제2 나노입자 용액의 종양 내 주사의 효과를 제시하며, 이는 평균 종양 부피에서 거의 완전한 감소를 나타낸다. 도 30c는 제3 나노입자 용액, 종양-특이적 항원(HPV16) mRNA 및 면역자극제(CpG)의 더 작은 효과를 제시한다.
[0366] 도 30d는 평균 종양 부피에 대한 종양-특이적 항원 없이 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA를 포함하는 나노입자 용액의 종양 내 주사의 효과를 제시한다. 도 30e는 제1 면역조절제(LIGHT) mRNA 및 제2 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA를 포함하는 나노입자 용액(또한, 종양 항원 없음)의 평균 종양 부피에 대한 종양 내 주사의 효과를 제시한다. 도 30f는 단지 면역자극제(CpG)에 대한 평균 종양 부피에 대한 종양 내 주사의 효과를 제시한다.
[0367] 도 31a 및 31b는 면역조절제(염증촉진성 사이토카인 IL-12) mRNA와 함께 종양-특이적 항원(HPV16 E6E7) mRNA를 포함하는 제1 나노입자 용액의 근육 내 주사의 결과를 제시한다. 동일한 조성물의 종양 내 주사와 대조적으로, 근육 내 주사는 평균 종양 부피의 감소를 초래하지 않았다. 도 31b는 평균 종양 부피의 시간-의존적 증가를 나타내는 대조군 치료(예를 들어, PBS)의 결과를 제시한다.
[0368] 도 32는 상기 설명된 다양한 나노입자 조성물에 대한 생존 확률의 비교이다. 종양 항원(예를 들어, 이 모델에서 HPV16 E6E7) 및 적어도 하나의 면역조절제, 및 특히 염증촉진성 사이토카인 면역조절제, 예를 들어, IL-12, 또는 제2 면역조절제, 예를 들어, LIGHT와 함께 IL-12 둘 모두를 포함하는 나노입자는 종양 내 주사될 때 완전한 또는 거의 완전한 생존을 나타내었다. 종양 항원 및 IL-12의 동일한 조합의 근육 내 주사는 60일 초과의 생존을 초래하지 않았다.
[0369] 본원에 설명된 다양한 나노입자 조성물에 대한 CD8 T-세포 반응을 시험하였다. HPV16 E7(49-57) 펩티드를 함유하는 H-2Db 사량체를 사용하였다. 개별 마우스를 공격 후 39일에 채혈하였다. 순환하는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 단일-세포 현탁액을 0.5 μg/mL 사량체, 1:100 희석된 항-CD3 항체, 및 1:100 희석된 항-CD8 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 2% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 적어도 100,000개의 세포를 Beckman Coulter FC 500 흐름세포측정기에서 획득하고 CXP 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. CD8+ 세포에서 게이팅을 수행하고, CD3+/CD8+/사량체+ 세포의 백분율을 결정하였다. 사량체 양성 CD8 T 세포 백분율은 종양-특이적 면역을 유도하는 치료적 개입의 능력에 대한 바이오마커를 제공한다.
[0370] 도 33은 결과를 그래프로 예시한 것으로, 종양 항원(본 실시예에서, HPV16 E6E7)이 면역조절제 또는 면역자극제와 함께 나노입자에 조합되었고, CD3+/CD8+/사량체+ 세포의 유의한 백분율이 마우스로부터 확인된 종양 내 주사된 나노입자를 제시한다. 사량체 양성 CD8 T 세포의 백분율은 종양-특이적 면역을 유도하는 치료적 개입의 능력에 대한 바이오마커를 제공한다.
[0371] 도 33에서, 빈 원은 제1 및 제2 나노입자 용액 둘 모두에서 발생한, 제3 주사에서 종양이 작거나 전혀 존재하지 않은 종양을 나타낸다. 도 37에 제시된 바와 같이, 종양 항원 mRNA 및 면역조절제(예를 들어, IL-12 또는 LIGHT를 갖는 IL-12) 또는 면역자극제(예를 들어, CpG) 둘 모두를 갖는 나노입자는 순환에서 종양-특이적 T-세포의 강력한 활성화를 초래하였다.
mRNA 치료 나노입자의 제조(예를 들어, 제작, 합성) 방법
[0372] 본원에 설명된 mRNA 치료제 중 임의의 것(mRNA 치료 나노입자 중 임의의 것을 포함함)은 폐쇄-경로 시스템을 사용하여 제작될 수 있고; 폐쇄-경로 시스템은 mRNA 치료 나노입자(예를 들어, mRNA 백신)를 빠르고 정확하게 합성하기 위해 밀봉되고, 멸균되고, 폐쇄된 환경에서 작동될 수 있는 바이오칩(예를 들어, 미세유체 경로 장치)을 포함할 수 있다. 예를 들어, mRNA 치료제를 제조하기 위한 방법 및 장치(예를 들어, 시스템, 장치 등)가 본원에 설명된다. 하나의 비제한적인 예에서, 본원에 설명된 방법 및 장치는 피부 T-세포 림프종에서 활성인 암-특이적 항원에 대한 치료적 mRNA 치료 나노입자를 생산하는데 사용될 수 있다.
[0373] 따라서, 일반적으로, 선택적으로 현장 치료에 배치되는 mRNA 치료제를 위한 자동화된 고수율 제조 방법이 본원에 설명된다.
[0374] 예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 폐쇄-경로 시스템을 사용하여 mRNA 치료 나노입자 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기 및 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 DNA 주형을 형성하고, 주형으로부터의 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 조합하는 공정 각각을 수행하는 것을 포함한다.
[0375] 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 폐쇄-경로 시스템을 사용하여 mRNA 치료 나노입자를 제조하는 방법(여기서 하나 이상의 미세유체 경로 장치는 복수의 반응기를 포함함)은 주형 전구체 물질을 하나 이상의 보관 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기 영역에 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하고; 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기 영역에 이송하고, 시험관 내 전사에 의해 주형을 처리하여 치료 mRNA를 형성하고; 치료 mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기 영역에 이송하고, 치료 mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 물질은 주형 전구체 물질을 포함하며, 전달 비히클은 대기 접촉 없이 보관 저장소로부터 복수의 반응기로 전달된다.
[0376] 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하는 복수의 보관 저장소를 포함하는 폐쇄-경로 시스템을 사용하여 mRNA 치료 나노입자(본원에서 일반적으로 mRNA 치료 나노입자 조성물로 지칭됨)를 제조하는 방법(여기서 하나 이상의 미세유체 경로 장치는 복수의 반응기를 포함함)은 주형 전구체 물질을 하나 이상의 보관 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기 영역에 전달도록 유체 흐름을 유도하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하고; 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기 영역에 전달하고, 시험관 내 전사에 의해 주형을 처리하여 mRNA를 형성시키고; mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기 영역에 이송하고, mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키고; mRNA 생성물을 하나 이상의 보관 저장소의 저장소에 이송하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 물질은 보관 저장소로부터 미세유체 경로 장치의 반응기로 서브마이크로리터 정밀도로 대기 접촉 없이 전달된다. 본원에 설명된 방법 중 임의의 방법에서, 공정 중 임의의 공정은 공압에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 유체 흐름은 공압에 의해 유도될 수 있으며, 유체는 공압 등에 의해 전달될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 유체는 기계식, 유압식 등에 의해 구동될 수 있다.
[0377] 이들 방법 중 임의의 방법(및 이를 수행하기 위한 장치)에서, 폐쇄-경로 시스템은 주형을 형성하고, 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA와 전달 비히클을 조합하는 공정을 위한 구성요소를 자동으로 및 연속적으로 수행할 수 있다. 폐쇄-경로 시스템은 주형을 형성하고, 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 조합하는 수행을 공압에 의해 제어할 수 있다. 일부 변형에서, 폐쇄-경로 시스템은 하나 이상의 미세유체 경로 장치 내에서 하나 이상의 막을 편향시킴으로써 주형을 형성하고, 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 조합하는 공정의 수행을 공압에 의해 제어한다.
[0378] 본원에 설명된 방법 및 장치 중 임의의 것은 병원, 클리닉 등과 같은 치료 현장에서 설정 및 작동하도록 구성될 수 있다. 이를 통해 즉각적인/주문형, 환자별 치료제가 특정 환자에 맞춤형으로 제조될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 특정 환자에 특정하지 않은 치료학적 분자는 "환자-개별화" 방식으로 전달 비히클과 제형화될 수 있다. 본원에 설명된 방법 및 장치로 인해 이러한 방법 중 임의의 방법이 매우 빠르게 수행될 수 있다. 예를 들어, 폐쇄-경로 시스템은 주형을 형성하고, 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA와 전달 비히클을 5일 미만 내에 조합하는 공정을 자동으로 및 연속적으로 수행할 수 있다. 대안으로, 시스템은 미리 만들어진 주형을 투입물로서 사용하고, 더 짧은 시간에 나머지 공정을 수행할 수 있다.
[0379] mRNA를 전달 비히클과 조합하는 것(치료제를 제형화함)은 mRNA 치료 나노입자 조성물을 정제하기 위해 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 mRNA 치료 나노입자 조성물을 투석하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
[0380] 이들 방법 중 임의의 방법은 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 mRNA 치료 나노입자 조성물을 농축시키고/시키거나 치료제를 투석하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
[0381] 예를 들어, 양친매성 전달 비히클 분자를 포함하는 임의의 적절한 전달 비히클이 사용될 수 있다. 예를 들어, 양친매성 전달 비히클 분자는 아미노-지질화된 펩토이드를 포함할 수 있다.
[0382] 대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 설명된 방법 및 장치 중 임의의 것에서, mRNA는 미리 만들어지고 일정 시간 동안 (예를 들어, 약 10℃, 4℃, 0℃, -10℃ 등에서) 저장될 수 있다. 예를 들어, 이를 수행하기 위한 이들 방법 및 장치 중 임의의 것은 개별적으로 또는 집합적으로(예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6개 등 또는 그 초과의 개별적 치료 mRNA가 조합될 수 있고) 함께 캡슐화되어 mRNA 치료 나노입자 조성물을 형성할 수 있는 치료 mRNA의 라이브러리를 포함할 수 있다. 본원에 설명된 바와 같이, mRNA 치료 나노입자 조성물은 따라서 요구에 따라 제조될 수 있고, 단일 또는 다중 mRNA 치료 나노입자 조성물 "칵테일"로 적시에 제형화될 수 있다.
[0383] 주형(예를 들어, DNA 주형)을 형성하는 방법이 본원에 또한 설명되어 있다. 예를 들어, 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통되어 복수의 보관 저장소를 포함하는 폐쇄-경로 시스템을 사용하여 시험관 내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법은 합성 관심 유전자를 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트와 결합시켜 합성 원형의 라이게이션된 생성물을 생성하고; 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트를 합성 원형의 라이게이션된 생성물로부터 제거하고; 원형의 라이게이션된 생성물을 증폭하여 분지형 또는 원형의 증폭된 DNA를 생성하고; 분지형의 증폭된 DNA 라이게이션된 생성물을 선형화시켜 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 결합, 제거, 증폭 및 선형 공정 각각은 폐쇄-경로 시스템에 의해 미세유체 경로 장치에서 수행된다.
[0384] 예를 들어, 시험관 내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 고효율 자동화 방법은 합성 관심 유전자 및 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트 각각을 미세유체 경로 장치와 유체 소통하는 복수의 보관 저장소의 하나 이상의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 장치의 라이게이션 반응기에 공압에 의해 전달하여, 합성 관심 유전자를 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트와 결합시킴으로써 합성 원형 라이게이션된 생성물을 생성시키고; 하나 이상의 엑소뉴클레아제 제제를 복수의 보관 저장소의 하나 이상의 보관 저장소로부터 라이게이션 반응기에 공압에 의해 도입하여 합성 원형 라이게이션된 생성물로부터 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트를 제거하고; 합성 원형의 라이게이션된 생성물을 미세유체 경로 장치의 다중 변위 증폭(MDA) 반응기에 공압에 의해 전달하여 원형의 라이게이션된 생성물을 증폭시키기 위한 하나 이상의 증폭제와 조합하여 분지형 또는 원형의 증폭된 DNA를 생성시키고; 분지형의 증폭된 DNA 라이게이션된 생성물을 미세유체 경로 장치의 분해 반응기에 공압에 의해 이송하여 분지형의 증폭된 DNA 라이게이션된 생성물을 선형화시킴으로써 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 것을를 포함할 수 있으며, 여기서 라이게이션 반응기, MDA 반응기 및 분해 반응기 및 복수의 보관 저장소는 폐쇄-경로 및 밀봉 환경을 형성한다.
[0385] (하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 폐쇄-경로 시스템을 사용하여) mRNA 치료 나노입자 조성물을 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 위한 주형을 형성하는 것을 포함할 수 있다.
[0386] 일반적으로, 본원에 설명된 방법 및 장치는 박테리아 DNA 비함유 및/또는 내독소 비함유일 수 있는 이중 가닥 DNA 주형을 생성할 수 있다. 본원에 설명된 주형 생성 방법 및 장치는 박테리아 배양물을 포함하지 않을 수 있다. 또한, 본원에 설명된 바와 같이 제조된 치료 mRNA는 박테리아 폴리뉴클레오티드를 사용하지 않고 주형으로부터 합성될 수 있다. 따라서, 본원에 설명된 방법 중 임의의 방법은 박테리아 DNA 사용 없이 및/또는 내독소로부터 분리된 치료 mRNA를 생성하는 방법일 수 있다. 특히, 박테리아 DNA 및/또는 내독소 비함유 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법이 본원에 설명되어 있다. 본원에 설명된 방법 중 임의의 방법은 무균 제조 방법일 수 있다.
[0387] 이들 방법 중 임의의 방법은 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트를 타입 IIS 제한 효소로 분해하는 것을 포함할 수 있다. 결합은 DNA 리가제로의 라이게이션을 포함할 수 있다. 제거는 엑소뉴클레아제에 의한 선형 DNA 분해를 포함할 수 있다. 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 V를 포함할 수 있다. 증폭은 다중 변위 증폭(MDA)을 포함할 수 있다. 증폭은 Φ29 DNA 중합효소를 이용한 증폭을 포함할 수 있다. 증폭은 분지된 증폭된 DNA를 생성하는 것을 포함할 수 있다.
[0388] 선형화는 타입 II 제한 효소를 이용한 분해를 포함할 수 있다. 선형화는 BsaI 제한 효소를 이용한 분해를 포함할 수 있다. 합성 관심 유전자는 선형일 수 있다. 일부 변형에서, 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트는 프로모터; 5' UTR; 절단 가능한 링커; 3' UTR; 및 연속적으로 적어도 약 200개의 아데닌 잔기 또는 약 200개의 티미딘 잔기를 포함하는 폴리A 영역을 인코딩하는 부분을 포함하는 이중 가닥 DNA 주형을 포함한다. 폴리A 영역을 인코딩하는 부분은 길이가 적어도 약 300 bp일 수 있다. 일부 변형에서, 폴리A 영역을 인코딩하는 부분은 길이가 적어도 약 350 bp일 수 있다.
[0389] 합성 관심 유전자는 T-세포 수용체의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 합성 관심 유전자는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다.
[0390] 시험관 내 전사 촉진제 카세트의 길이는 2 kb 미만일 수 있다. 시험관 내 전사 촉진제 카세트는 길이가 1 kb 미만일 수 있다. 시험관 내 전사 촉진제 카세트의 길이는 약 700 염기쌍 미만일 수 있다. 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트는 항생제 내성 유전자를 인코딩하지 않을 수 있다.
[0391] 합성 원형 라이게이션 생성물은 복제 기점(ORI)을 갖지 않을 수 있다. 시험관 내 전사 촉진제 카세트에는 복제 기점(ORI)을 갖지 않을 수 있다.
[0392] 언급된 바와 같이, 본원에 설명된 방법 중 임의의 방법의 공정은 폐쇄-경로 미세유체 경로 장치 및/또는 폐쇄 시스템에서 수행될 수 있다. 공정는 폐쇄-경로 미세유체 경로 장치에서 수행될 수 있으며, 결합 단계는 증폭 단계와 상이한 모듈(예를 들어, 상이한 미세유체 경로 장치)로 수행될 수 있으며, 증폭 단계는 선형화 단계와 상이한 모듈에서 수행될 수 있다.
[0393] 이들 방법 중 임의의 방법은 하나 이상의 미세유체 경로 장치의 폐쇄된 경로에서 주형을 정제하는 것을 포함할 수 있다.
[0394] 본원에 설명된 폐쇄-경로 방법 및 장치를 사용하는 시험관 내 전사를 수행하는 방법이 또한 본원에 설명된다. 예를 들어, (예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는) 폐쇄-경로 시스템을 사용하여 시험관 내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 주형으로부터의 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하는 것을 포함할 수 있다.
[0395] 시험관 내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법은 복수의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 장치의 제1 반응기에 안내된 유체 흐름을 통한 DNA 주형, 중합효소 및 뉴클레오티드를 서브마이크로리터 정밀도로 계량된 양으로 자동으로 전달하고; 제1 반응기에서 주형 물질 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료 mRNA를 형성시키고; 제1 반응기로부터 미세유체 경로 장치를 통해 치료 mRNA를 공압에 의해 이송하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 미세유체 경로 장치 및 복수의 보관 저장소는 폐쇄-경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
[0396] 폐쇄-경로 시스템은 자동으로 및 연속적으로 작동할 수 있다. 폐쇄-경로 시스템은 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사의 성능을 공압에 의해 제어할 수 있다.
[0397] 이들 방법 중 임의의 방법은 또한 하나 이상의 미세유체 장치에서 치료 mRNA를 정제하는 것을 포함할 수 있다. 시약 수송은 복수의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 장치의 제1 반응기에 시약을 수송하는 것을 포함할 수 있다.
[0398] 또한, 치료 mRNA를 제형화(예를 들어, 전달 비히클과 조합)하는 방법이 본원에 설명된다. 예를 들어, (예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 폐쇄-경로 시스템을 사용하여) mRNA 치료 나노입자 조성물을 제조하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄 유체 경로의 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 전달 비히클과 치료 mRNA를 조합함으로써 mRNA 치료 나노입자 조성물을 제형화하는 것을 포함할 수 있다. 폐쇄-경로 시스템은 mRNA와 전달 비히클을 자동으로 및 연속적으로 조합할 수 있다. 폐쇄-경로 시스템은 mRNA를 전달 비히클과 조합하는 것을 공압에 의해 제어할 수 있다. 예를 들어, 폐쇄-경로 시스템은 하나 이상의 미세유체 경로 장치 내에서 하나 이상의 막을 편향시킴으로써 전달 비히클과 mRNA를 조합하는 것을 공압에 의해 제어할 수 있다.
[0399] mRNA를 전달 비히클과 조합하는 것은 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 mRNA 치료 나노입자 조성물을 투석하여 mRNA 치료 나노입자 조성물을 정제하고/하거나 하나 이상의 미세유체 경로 장치 상의 mRNA 치료 나노입자 조성물을 농축하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
[0400] 예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 mRNA를 제조하는 방법이 본원에 설명된다. 이들 방법 중 임의의 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 주형을 형성하고, 주형으로부터 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, mRNA를 정제하는 공정 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
[0401] 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료 mRNA 조성물을 제조하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 주형을 형성하고, 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 제형화시키는 공정 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
[0402] 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료 mRNA 조성물을 제조하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 주형을 형성하고, 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 제형화시키고, 제형화된 치료 mRNA의 투석 및 농축을 수행하는 공정 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
[0403] 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료 mRNA 조성물을 제조하는 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에 인코딩되는 치료 mRNA를 형성하는 일련의 공정을 따르는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 공정은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 주형을 형성하고, 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 조합시키는 공정 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함한다.
[0404] 또한, 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료 mRNA 조성물을 제조하는 방법이 본원에 설명되며, 방법은 미세유체 경로 장치 상의 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 미세유체 경로 장치 상의 하나 이상의 유체 연결된 반응기에서 치료 mRNA를 정제하는 것을 포함한다.
[0405] 또한, 특히 mRNA 치료제를 포함하는 이들 방법 중 임의의 방법에 의해 제조된 치료제가 본원에 설명된다. 예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 제조된 치료 mRNA가 본원에 설명되며, mRNA는 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 주형을 형성하고, 주형으로부터 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, mRNA를 정제하는 공정 중 하나 이상을 수행함으로써 제조된다.
[0406] 예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 제조된 치료 mRNA가 본원에 설명되며, mRNA는 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 주형을 형성하고, 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 제형화시키는 공정 중 하나 이상을 수행함으로써 제조된다.
[0407] 예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 제조된 치료 mRNA이 본원에 설명되며, mRNA는 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기 및 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 주형을 형성시키고, 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 제형화시키고, 제형화된 치료 mRNA의 투석 및 농축을 수행하는 공정 중 하나 이상을 수행함으로써 제조된다.
[0408] 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에 인코딩되는 치료 mRNA를 형성하는 일련의 공정에 따라 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 형성된 치료 mRNA 조성물이 본원에 설명되며, 여기서 공정은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 주형을 형성하고, 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 조합시키는 공정 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함한다. 예를 들어, 치료 mRNA는 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 형성된 치료 mRNA 조성물일 수 있으며, 상기 방법은 미세유체 경로 장치 상의 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 미세유체 경로 장치 상의 하나 이상의 유체 연결된 반응기에서 치료 mRNA를 정제하는 것을 포함한다.
[0409] 본원에 설명된 시스템 중 임의의 시스템은 이러한 방법 중 임의의 방법을 수행하도록 구성된 제어기를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 설명된 방법 중 임의의 방법을 수행하도록 구성된 소프트웨어, 펌웨어 또는 하드웨어가 또한 본원에 설명된다. 예를 들어, mRNA를 제조하기 위한 명령을 구현하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체가 본원에 설명되며, 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템의 제어기에 의해 실행되는 경우, 제어기로 하여금 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 주형을 형성하고, 주형으로부터 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, mRNA를 정제하는 공정 중 하나 이상을 수행하는 방법을 수행하게 한다.
[0410] 예를 들어, 치료 mRNA 조성물을 포함하는 mRNA를 제조하기 위한 명령을 구현하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체가 본원에 설명되며, 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템의 제어기에 의해 실행되는 경우 제어기로 하여금 본원에 설명된 방법 중 임의의 방법을 수행하게 한다.
[0411] 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 폐쇄-경로 시스템을 사용하여 mRNA를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법이 또한 본원에 설명되며, 이는 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 시약을 조합하고; 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 위한 주형을 형성하는 것을 포함할 수 있다.
[0412] 예를 들어, 폐쇄-경로 시스템을 사용하여 mRNA 시험관 내 전사 반응으로의 유입물로서 사용하기 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법은 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함할 수 있으며, 상기 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하고; 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 위한 주형을 형성시키는 것을 포함한다.
[0413] 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 mRNA 조성물을 제조하는 방법으로서, 여기서 하나 이상의 미세유체 경로 장치는 복수의 반응기를 포함하며, 상기 방법은 주형 전구체 물질을 하나 이상의 보관 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기 영역에 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하고; 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기 영역에 이송하고, 주형을 시험관 내 전사에 의해 처리하여 mRNA를 형성시키고; mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기 영역에 이송하고, mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 mRNA 조성물을 형성시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 물질은 주형 물질을 포함하며, 전달 비히클은 대기 접촉 없이 보관 저장소로부터 복수의 반응기로 전달된다.
[0414] 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하는 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 mRNA 조성물을 제조하는 방법으로서, 여기서 하나 이상의 미세유체 경로 장치는 복수의 반응기를 포함하며, 상기 방법은 주형 전구체 물질을 하나 이상의 보관 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기 영역에 공압에 의해 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하고; 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기 영역에 공압에 의해 이송하고, 주형을 시험관 내 전사에 의해 처리하여 mRNA를 형성시키고; mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기 영역에 공압에 의해 이송하고, mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 치료 mRNA 조성물을 형성시키고; mRNA 생성물을 하나 이상의 보관 저장소에 이송하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 물질은 보관 저장소로부터 미세유체 경로 장치의 반응기로 서브마이크로리터 정밀도로 대기 접촉 없이 전달된다.
[0415] 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통되어 복수의 보관 저장소를 포함하는 폐쇄-경로 시스템을 사용하여 시험관 내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법은 합성 관심 유전자를 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트와 결합시켜 합성 원형의 라이게이션된 생성물을 생성시키고; 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트를 합성 원형의 라이게이션된 생성물로부터 제거하고; 원형의 라이게이션된 생성물을 증폭하여 분지형 또는 원형의 증폭된 DNA를 생성시키고; 분지형의 증폭된 DNA 라이게이션된 생성물을 선형화시켜 이중 가닥 DNA 주형을 생성시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 결합, 제거, 증폭 및 선형 공정 각각은 폐쇄-경로 시스템에 의해 미세유체 경로 장치에서 수행된다.
[0416] 이들 방법 중 임의의 방법은 시험관 내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 고효율의 자동화된 방법을 포함하는 고효율의 자동화된 방법일 수 있다. 예를 들어, 방법은 합성 관심 유전자 및 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트 각각을 미세유체 경로 장치와 유체 소통하는 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 장치의 라이게이션 반응기에 공압에 의해 전달하여 합성 관심 유전자를 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트와 결합시킴으로써 합성 원형 라이게이션된 생성물을 생성시키고; 하나 이상의 엑소뉴클레아제 제제를 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소로부터 라이게이션 반응기에 공압에 의해 도입하여 합성 원형 라이게이션된 생성물로부터 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트를 제거함으로써 미반응 물질을 제거하고; 합성 원형의 라이게이션된 생성물을 미세유체 경로 장치의 다중 변위 증폭 (MDA) 반응기에 공압에 의해 전달하여 원형의 라이게이션된 생성물을 증폭시키기 위한 하나 이상의 증폭 제제와 조합하여 분지형 또는 원형의 증폭된 DNA를 생성시키고; 분지형의 증폭된 DNA 라이게이션된 생성물을 미세유체 경로 장치의 분해 반응기에 공압에 의해 이송하여 분지형의 증폭된 DNA 라이게이션된 생성물을 선형화시킴으로써 이중 가닥 DNA 주형을 생성시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 라이게이션 반응기, MDA 반응기 및 분해 반응기 및 복수의 보관 저장소는 폐쇄-경로 및 밀봉 환경을 형성한다.
[0417] 시험관 내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법으로서, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에서 인코딩되는 일련의 공정을 따르는 것을 포함하며, 합성 관심 유전자 및 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트 각각을 미세유체 경로 장치와 유체 소통하는 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 장치의 라이게이션 반응기에 전달하여 합성 관심 유전자를 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트와 결합시킴으로써 합성 원형 라이게이션된 생성물을 생성시키고; 하나 이상의 엑소뉴클레아제 제제를 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소로부터 라이게이션 반응기에 도입하여 합성 원형 라이게이션된 생성물로부터 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관 내 전사 촉진제 카세트를 제거함으로써 미반응된 물질을 제거하고; 합성 원형의 라이게이션된 생성물을 미세유체 경로 장치의 다중 변위 증폭 (MDA) 반응기에 전달하여 원형의 라이게이션된 생성물을 증폭시키기 위한 하나 이상의 증폭 제제와 조합하여 분지형 또는 원형의 증폭된 DNA를 생성시키고; 분지형의 증폭된 DNA 라이게이션된 생성물을 미세유체 경로 장치의 분해 반응기에 이송하여 분지형의 증폭된 DNA 라이게이션된 생성물을 선형화시킴으로써 이중 가닥 DNA 주형을 생성시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 라이게이션 반응기, MDA 반응기 및 분해 반응기 및 복수의 보관 저장소는 폐쇄-경로 및 밀봉 환경을 형성한다.
[0418] 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 시험관 내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 주형으로부터의 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하는 것을 포함할 수 있다.
[0419] 또한, 시험관 내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법이 본원에 설명되며, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에서 인코딩되는 일련의 공정을 따르는 것을 포함하며, 여기서 공정은 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 반응 중 언제든지 서브마이크로리터 정밀도로 계량되는 양으로 복수의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 장치의 제1 반응기에 공압에 의해 전달하고; 제1 반응기에서 주형 물질 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료 mRNA를 형성시키고; 제1 반응기로부터 미세유체 경로 장치를 통해 치료 mRNA를 공압에 의해 이송하는 것을 포함하며, 여기서 제1 미세유체 경로 장치 및 복수의 보관 저장소는 폐쇄-경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
[0420] 또한, 시험관 내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법이 본원에 설명되며, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에서 인코딩되는 일련의 공정을 따르는 것을 포함하며, 여기서 공정은 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 복수의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 장치 내로 일련의 공정에 따라 제어기에 의해 제어된 양으로 유도된 유체 흐름에 의해 전달하고; 주형 물질 및 뉴클레오티드를 하나 이상의 반응기에서 처리하여 치료 mRNA를 형성시키고; 치료 mRNA를 하나 이상의 반응기로부터 미세유체 경로 장치를 통해 전달하는 것을 포함하며, 여기서 제1 미세유체 경로 장치 및 복수의 보관 저장소는 폐쇄-경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
[0421] 또한, 시험관 내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법이 본원에 설명되며, 방법은 사전 프로그래밍된 소프트웨어 명령에 의해 제어되는 양으로 복수의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 장치 내로 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 유도된 유체 흐름에 의해 전달하고; 미세유체 경로 장치의 제1의 하나 이상의 반응기에서 주형 물질 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료 mRNA를 형성시키고; 치료 mRNA를 제1의 하나 이상의 반응기로부터 미세유체 경로 장치를 통해 mRNA의 정제에 적합화된 제2의 하나 이상의 반응기 내에 이송하는 것을 포함하며, 여기서 미세유체 경로 장치 및 복수의 보관 저장소는 폐쇄-경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
[0422] 또한, 시험관 내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법이 본원에 설명되며, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에서 인코딩되는 일련의 공정을 따르는 것을 포함하며, 여기서 공정은 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 복수의 보관 저장소로부터 제1 미세유체 경로 장치의 제1의 하나 이상의 반응기에 일련의 공정에 의해 제어되는 양으로 유도된 유체 흐름에 의해 전달하고; 주형 물질 및 뉴클레오티드를 제1의 하나 이상의 반응기에서 처리하여 치료 mRNA를 형성시키고; 치료 mRNA를 제1의 하나 이상의 반응기로부터 제1의 미세유체 경로 장치를 통해 mRNA의 정제에 적합화된 제2의 하나 이상의 반응기에 이송하고; mRNA 치료 나노입자의 제형화를 완료하기 위해 이렇게 정제된 mRNA를 이송하는 것을 포함하며, 여기서 제1 미세유체 경로 장치 및 복수의 보관 저장소는 폐쇄-경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
[0423] 또한, 시험관 내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법이 본원에 설명되며, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에 인코딩되는 일련의 공정을 따르는 것을 포함하며, 여기서 공정은 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 복수의 보관 저장소로부터 제1 미세유체 경로 장치의 제1의 하나 이상의 반응기에 공압에 의해 전달하고; 주형 물질 및 뉴클레오티드를 제1의 하나 이상의 반응기에서 처리하여 치료 mRNA를 형성시키고; 치료 mRNA를 제1의 하나 이상의 반응기로부터 제1의 미세유체 경로 장치를 통해 mRNA의 정제에 적합화된 제2의 하나 이상의 반응기에 이송하고; 정제된 mRNA를 제3의 하나 이상의 반응기에 이송하여 정제된 mRNA를 하나 이상의 전달 비히클과 조합하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키는 것을 포함하며, 여기서 제1 미세유체 경로 장치 및 복수의 보관 저장소는 폐쇄-경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
[0424] 예를 들어, 시험관 내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법이 또한 본원에 설명되며, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에서 인코딩되는 일련의 공정을 따르는 것을 포함하며, 여기서 공정은 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 복수의 보관 저장소로부터 제1 미세유체 경로 장치의 제1의 하나 이상의 반응기에 공압에 의해 전달하고; 주형 물질 및 뉴클레오티드를 제1의 하나 이상의 반응기에서 처리하여 치료 mRNA를 형성시키고; 치료 mRNA를 제1의 하나 이상의 반응기로부터 제1의 미세유체 경로 장치를 통해 셀룰로스를 포함하며, mRNA의 정제에 적합화된 제2의 하나 이상의 반응기에 이송하고; 정제된 mRNA를 제3의 하나 이상의 반응기에 이송하여 정제된 mRNA를 하나 이상의 전달 비히클과 조합하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키는 것을 포함하며, 여기서 제1 미세유체 경로 장치 및 복수의 보관 저장소는 폐쇄-경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
[0425] 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료 mRNA 조성물을 제조하는 방법이 또한 본원에 설명되며, 상기 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 하나 이상의 치료 mRNA를 전달 비히클과 조합함으로써 치료 mRNA 조성물을 제형화하는 것을 포함한다.
[0426] 하나 이상의 미세유체 경로 장치와 밀봉된 유체 소통하도록 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 주문형 치료 mRNA 조성물을 제조하는 방법은 주형을 형성하고, 주형으로부터 치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 함께 제형화하는 공정 중 하나 이상을 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 수행하기 위해 대기 접촉으로부터 보호되는 폐쇄된 유체 경로 내의 하나 이상의 미세유체 장치 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 저장소 사이에 시약을 수송하는 것을 포함할 수 있다.
[0427] 이러한 방법 및 장치 중 임의의 것은 치료 현장에서 작동될 수 있다(예를 들어, 치료 mRNA가 제조된다). 이러한 방법 및 장치 중 임의의 것은 신속하고 연속적으로 수행될 수 있고, 예를 들어, 치료제는 72시간 미만 내에 제조된다.
[0428] 예를 들어, 완전 자동화된 소프트웨어-제어된 미세유체의 사용을 포함할 수 있는 mRNA 치료제를 제조하기 위한 방법 및 장치가 본원에 설명된다. 이들 방법 및 장치는 개인화 또는 개별화된 치료에 사용될 수 있다. 또한, 주형을 형성하고, 시험관 내 전사하고, 치료 mRNA를 정제하고, mRNA를 농축하고, mRNA(들)를 하나 이상의 전달 비히클과 배합하는 것을 포함하는 본원에 설명된 제조 공정 중 임의의 제조 공정을 소프트웨어 제어하는 것을 포함하는 장치(예를 들어, 시스템, 장치 등) 및 방법이 본원에 설명된다. 소프트웨어 제어는 이러한 방법을 자동화하여 하나 이상의 치료 mRNA를 제조하기 위한 이러한 공정 중 일부 또는 모두가 정확하고 정밀하게 신속히 수행될 수 있도록 할 수 있다. 소프트웨어 제어와 반응 성분의 미세 유체 정밀 전달 및 이송은 공정 제어, 효율성 및 재현성을 높이는 동시에 수동 조작을 크게 줄이거나 없애고, 시설 요구 사항을 줄이며 생산 주기 시간을 단축하여 궁극적으로 적절한 경우 제 시간에 생성되는 치료제의 비용을 절감하는 기회를 제공한다.
[0429] 본원에 설명된 장치 중 일부 장치(예를 들어, 시스템, 장치 등)에서, 치료 물질의 각 배치(batch)는 미세유체 경로 장치 제어 시스템(또한 제어 시스템으로서 본원에서 지칭됨) 내부에 수용될 수 있는 전용, 단회용, 일회용 미세유체 경로 장치(또한 본원에서 바이오칩으로 지칭됨)에서 생성될 수 있다. 전체 생산은 대기와 접촉하지 않고 설계에 따라 무균된 폐쇄-경로 공정으로 진행될 수 있다. 모든 생산 공정은 자동화될 수 있으며, 시스템을 수용하는 시설의 속성에 무관하게 완벽하게 복제된 공정을 달성하기 위해 제어 시스템에 의해 제어될 수 있다. 생산 파라미터, 원료 및 환경 데이터(완전 육안 기록 포함)는 클라우드에서 보호되고 각 생산 진행과 연결된 광범위하고 암호화된 전자 파일의 일부가 될 수 있다. 또한, 반도체 산업에서 개발된 공정 제어 개념을 통해 정제 공정 및 여러 QC 검정은 단일 유체 흐름에서 생산 공정 중 인-라인으로 수행되어 초기 단계에서 이상 징후가 감지될 수 있게 한다. 제조에 완전히 자동화되고 소프트웨어로 제어되는 접근 방식을 활용함으로써 개인화되고 개별화된 mRNA 치료제가 환자의 이익을 위해 비용 효율적인 방식으로 제조될 수 있다.
[0430] 특히, 이러한 방법 및 장치는 시험관 내 전사(IVT)로 공지된 합성 기술을 통해 인체 외부에서 합성적으로 mRNA 치료제를 생산할 수 있다. 일부 예에서, 네이키드 mRNA 분자는 세포막을 통과하지 않고 생체 내에서 세포 외 뉴클레아제에 의해 빠르게 분해되는 큰 다중음이온성 분자이다. 본원에 설명된 방법 및 장치는 mRNA를 표적(조직, 신체, 조직의 영역 등)으로 수송하도록 설계된 하나 이상의 전달 비히클을 갖는 mRNA 분자의 제형을 생산할 수 있다. 예를 들어, 일부 변형에서, 전달 비히클은 순환 동안 mRNA 카고의 패키징 및 보호를 제공하고, 면역 인식을 피하고, 세포 흡수 및 방출을 촉진할 수 있는 지질-함유 양친매성 전달 비히클일 수 있다.
[0431] 일반적으로, 본원에 더 상세히 설명될 바와 같이, 일부 변형에서, 주형 합성, IVT, 정제, 및 전달 비히클을 이용한 제형화를 포함하는 생산 공정의 전부 또는 일부는 하나 이상의 미세유체 경로 장치의 고도로 제어된 환경에서 수행될 수 있으며, 이는 견고하고, 고품질이고, 재현성이 높은 제조 공정의 최적화를 가능하게 한다.
[0432] mRNA 치료제와 같은 치료제는 mRNA 백신접종에 사용될 수 있다. 이들의 높은 역가 외에도, mRNA 치료제는 또한 이들의 빠른 발달 주기, 표준화된 제조, 일시적 발현 및 유전체 통합의 낮은 위험과 관련된 중요한 이점을 갖는다.
[0433] 일부 변형에서, 본원에 설명된 mRNA 치료제는 최종 약물 제품에서 활성 성분으로서 관심 항원 또는 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. mRNA의 강력한 번역은 기능적인 5' 캡 구조를 필요로 한다. 5' 캡(또는 7-메틸구아노신 캡)은 5'-5'-트리포스페이트 결합을 통해 제1 전사된 뉴클레오티드에 연결된 말단 7-메틸구아노신 잔기로 구성된다. 이의 존재는 리보솜에 의한 mRNA의 인식 및 RNAse로부터의 보호에 중요하다. 폴리(A) 꼬리는 진핵생물 번역 개시 인자 eIF4G와 상호작용하고, 차례로 eIF4E와 복합체를 형성하는 폴리(A) 결합 단백질(PABP)에 결합함으로써 m7G 캡과 함께 mRNA 안정성 및 번역 개시를 상승적으로 조절한다. 폴리(A) 꼬리의 길이는 mRNA에서 단백질로의 번역 과정의 효율에 영향을 미칠 수 있다.
[0434] 본원에 설명된 방법 및 장치는 반복 투여를 제한할 수 있는 독성 또는 면역원성 우려를 피하면서 순환 동안 mRNA 카고의 패키징 및 보호를 제공하고, 면역 인식을 회피하고, 원하는 조직에서 약물 생성물을 국소화하고, 세포 흡수 및 방출을 촉진하도록 mRNA 치료 나노입자를 제형화할 수 있다.
[0435] 일반적으로, mRNA 치료 나노입자(환자-특이적 T-세포 림프종 백신 약물 제품을 포함하나 이에 제한되지 않음)를 제조하는 방법은 표적 단백질의 확인 및 mRNA 서열의 설계, 표적 서열에 관한 이중 가닥 DNA 주형의 제조를 포함할 수 있다. 이 서열은 mRNA를 합성하기 위해 시험관 내 전사(IVT) 반응을 위한 mRNA를 생성하는데 사용될 수 있다. 이 치료 mRNA는 이후 공정 불순물을 제거하기 위해 정제되고 약물 물질을 생성하기 위해 여과될 수 있다. 치료 mRNA는 이후 전달 비히클(일부 변형에서는 양친매성 나노입자를 형성하기 위한 애쥬번트 및 전달 비히클 성분을 포함함)과 함께 제형화될 수 있다. 이후, 제형은 가공되고 정제되어 환자에게 전달되는 데 사용될 수 있는 약물 제품을 생성할 수 있다.
[0436] 한 변형의 특정 예로서, 환자-특이적 T-세포 림프종 백신 약물 제품을 제조하기 위한 예시적인 공정은 림프종 세포에 의해 발현되는 클론적으로 확장된 TCR 서열(이디오타입)의 확인을 포함할 수 있다. 공정은 또한 mRNA 백신 서열을 설계하고, IVT 반응을 위한 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 주형은 mRNA를 합성하기 위한 IVT 반응에 사용될 수 있고, 이러한 치료 mRNA는 공정 불순물을 제거하기 위해 정제될 수 있고, 여과는 약물 물질로서 치료 mRNA를 제조할 수 있다. 치료 mRNA는 이후 면역조절제 및 전달 비히클 성분과 함께 제형화되어 양친매성 나노입자를 형성할 수 있다. 이후, 제형화-후 처리를 수행하여 치료 mRNA 치료 나노입자와 같은 약물 생성물을 생성할 수 있다.
[0437] 이러한 제조 공정 중 임의의 공정은 본원에 설명된 바와 같은 자동화된 미세유체 경로 장치 제어 시스템을 사용하여 수행되도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, DNA 주형 생산은 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 일어날 수 있고; 주형 미세유체 경로 장치(예를 들어, 주형 바이오칩)가 사용될 수 있다. 이 예에서, mRNA의 시험관 내 전사 및 약물 물질을 생성하기 위한 상기 물질의 정제의 공정은 IVT 미세유체 경로 장치(예를 들어, IVT 바이오칩)에서 수행될 수 있고, 약물 제품 제형화 공정은 제형화 미세유체 경로 장치(예를 들어, 제형화 바이오칩)에서 수행될 수 있다. 이러한 미세유체 경로 장치는 제조 공정에서 각 공정을 수행하는데 필요한 입력 포트, 계량 밸브, 반응 챔버, 및 정제 구조를 함유할 수 있다.
장치
[0438] 본원에 설명된 방법은 일반적으로 하나 이상의 미세유체 경로 장치(예를 들어, 바이오칩), 및 미세유체 경로 장치에서의 작업을 제어하도록 구성된 미세유체 경로 장치 제어 시스템을 포함할 수 있는 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 미세유체 경로 장치는 미세유체 경로 장치 제어 시스템(본원에서 제조 시스템으로 지칭될 수 있음) 내에 배치되고 유지될 수 있으며, 이는 일부 또는 더욱 바람직하게는 거의 모든 또는 모든 제조 구성요소의 구성요소 부분의 대기에 대한 노출을 방지하는 폐쇄 경로 방식으로 작동할 수 있다. 도 34a는 미세유체 경로 장치 관리 시스템으로도 지칭될 수 있는 미세유체 경로 장치 제어 시스템(903)의 일 예를 제시하며, 이는 미세유체 경로 장치를 유지하고/하거나, 미세유체 경로 장치에서 미세유체 작업을 수행하기 위해 양압/음압을 가하고/가하거나, 미세유체 경로 장치의 전체 또는 영역을 가열/냉각시키고/시키거나, 미세유체 경로 장치로부터 하나 이상의 특징을 검출하고/하거나 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 수행된 작업을 기록하기 위한 하드웨어를 포함할 수 있다. 미세유체 경로 장치 제어 시스템은 또한 하나 이상의 프로세서(예를 들어, 제어기, 제시되지 않음), 및 온도-제어되는(예를 들어, 냉장된) 용기(905)(예를 들어, ISO 클래스 5 캐비닛)를 포함할 수 있다. 이 시스템이 사용될 수 있거나 하나 이상의 미세유체 경로 장치(901)를 포함할 수 있다. 미세유체 경로 장치 제어 시스템은 하나 이상의 미세유체 경로 장치(예를 들어, 카트리지)(901)를 해제 가능하게 유지하기 위한 안착 마운트(932)를 포함할 수 있다. 미세유체 경로 장치 제어 시스템은 또한 안착될 때 미세유체 경로 장치를 냉각/가열하기 위한 열 제어기를 포함할 수 있으며, 이는 안착 마운트 아래에 있거나 이와 커플링될 수 있다. 유체 인터페이스 조립체(939)는 하나 이상의 카트리지가 안착 마운트에 로딩될 수 있도록 안착 마운트의 (위로 및/또는 측면으로) 들어 올려질 수 있다. 유체 인터페이스 조립체는 안착 마운트에 보유된 미세유체 경로 장치 상에 적용되도록 구성된 복수의 유체 접촉부를 포함할 수 있다. 유체 접촉부는 미세유체 경로 장치의 수용 포트에 대한 밀봉을 개선하기 위해, 예를 들어, 스프링 등에 의해 미세유체 경로 장치에 대해 편향될 수 있다. 시약 보관 프레임(943)은 안착 마운트 및 유체 인터페이스 조립체의 위에 또는 측면에 위치될 수 있다. 시약 보관 프레임은 복수의 보관 저장소(967)를 포함할 수 있다. 유체 인터페이스 조립체는 중간, 예를 들어, 안착 마운트에 안착될 때 미세유체 경로 장치 바로 위의 영역에서 개방될 수 있다. 이러한 개방은 모니터링 및 추적을 위한 미세유체 경로 장치를 통한 시각화를 가능하게 할 수 있고 또한 접근을 가능하게 할 수 있다. 도 34a에서, 복수의 센서(예를 들어, 카메라)는, 예를 들어, 압력 공급원(제시되지 않음)을 사용하여 유체가 구동될 때 미세유체 경로 장치 제어 시스템의 작동을 관찰하기 위해, 미세유체 경로 장치 제어 시스템의 둘레 주위 및 중앙 영역 위에, 안착 마운트 위에 위치한다.
[0439] 도 34b는 본원에 설명된 바와 같이 사용될 수 있는 미세유체 경로 장치 제어 시스템의 일 예의 개략적 예시이다. 이 예에서, 장치는 단일 용도 장치일 수 있는 하나 이상의 미세유체 경로 장치(911)를 보유할 수 있는 안착 마운트(915)를 둘러싸는 하우징(933)을 포함한다. 하우징은 덮개 또는 개구를 포함할 수 있는 챔버, 엔클로저 등일 수 있고; 폐쇄되는 경우 밀봉될 수 있다. 하우징은 열 조절기를 둘러쌀 수 있고/있거나 열 조절된 환경(예를 들어, 냉장 유닛 등)에 둘러싸이도록 구성될 수 있다. 하우징은 무균 장벽을 형성할 수 있다. 일부 변형에서, 하우징은 가습 또는 습도 제어 환경을 형성할 수 있다.
[0440] 안착 마운트(915)는 고정되고 미리 정의된 배향으로 미세유체 경로 장치를 보유하도록 구성된 하나 이상의 핀 또는 다른 구성요소를 사용하여 미세유체 경로 장치를 고정하도록 구성될 수 있다.
[0441] 일부 변형에서, 열 제어부(913)는 하나 이상의 미세유체 경로 장치(911)에 대한 온도를 조절하기 위해 안착 마운트(915)에 인접하게 위치될 수 있다. 열 제어부는 미세유체 경로 장치의 전부 또는 일부의 온도를 제어하기 위한 열전 구성요소(예를 들어, 펠티에 소자) 및/또는 하나 이상의 열 싱크를 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 미세유체 경로 장치의 하나 이상의 영역의 온도를 개별적으로 조절하기 위해 하나 초과의 열 제어부가 포함될 수 있다. 열 제어부는 미세유체 경로 장치의 피드백 제어 및/또는 열 제어에 사용될 수 있는 하나 이상의 열 센서(예를 들어, 열전대 등)를 포함할 수 있다.
[0442] 도 34b에서, 유체 인터페이스 조립체(909)는 액체 시약 및/또는 압력(예를 들어, 기체)을 안착 마운트(915)에 보유된 미세유체 경로 장치(911)와 결합시키고, 압력 공급원(917)으로부터 미세유체 경로 장치(911)의 내부로의 유체 물질뿐만 아니라 기체 양압/음압의 전달을 도울 수 있다. 유체 인터페이스 조립체는 하기에서 더 상세히 설명되는 바와 같이 미세유체 경로 장치(들)를 고정하는 것을 선택적으로 도울 수 있다. 유체 인터페이스 조립체는 사용 사이의 멸균을 위해 장치에 제거 가능하게 결합(및 제거될 수 있거나 일부 제거될 수 있음)될 수 있다.
[0443] 시약 보관 프레임(907)은 복수의 유체 샘플 홀더를 함유하도록 구성되며, 이들 각각은 미세유체 장치(911)로의 전달을 위해 시약(예를 들어, 뉴클레오티드, 용매, 물 등)을 보유하도록 구성된 유체 바이알을 보유할 수 있거나, 대안적으로 유체 바이알은 미세유체 경로 장치(911)의 내부로부터 생성물을 수용하도록 구성될 수 있다. 시약 보관 프레임은 시약 랙(rack)으로 지칭될 수 있다. 일부 변형에서, 시약 랙은 하나 이상의 압력 공급원(917)을 독립적으로 또는 집합적으로(하위 조합으로) 제어될 수 있는 미세유체 경로 장치에 적용될 수 있는 복수의 압력 라인으로 나누도록 구성된 복수의 압력 라인 및/또는 매니폴드를 포함한다. 대안적으로, 유체 저장소(바이알 등)는 미세유체 경로 장치(들)에 대해 직접적으로 고정되고 밀봉되도록 구성될 수 있다.
[0444] 유체 인터페이스 조립체는 복수의 유체 라인 및/또는 압력 라인을 포함할 수 있고, 안착 마운트(915)에 보유되는 경우 미세유체 경로 장치로 각각의 유체 및/또는 압력 라인을 개별적으로 그리고 독립적으로 구동시키는 편향된(예를 들어, 스프링 로딩된) 홀더 또는 팁을 포함할 수 있다 (또는 언급된 바와 같이, 대안적으로 장치는 직접적으로 스프링 탑재될 수 있다). 미세유체 경로는 제어 시스템 내에서 유지 및 고정될 수 있으므로, 미세유체 경로 장치는 다른 구성요소(예를 들어, 관류)에 안정적으로 연결된다. 관류, 예를 들어, 유체 라인 및/또는 압력 라인은 유체 인터페이스 조립체의 일부일 수 있고/있거나 유체 인터페이스 조립체에 연결될 수 있다. 일부 변형에서, 유체 라인은 잠금 연동(예를 들어, 페룰) 및 미세유체 경로 장치에서 바이알을 관류에 결합시키는 커넥터를 통해 시약 보관 프레임 사이를 연결하는 가요성 관류를 포함한다. 유체 경로의 단부, 일부 변형에서, 유체 라인/압력 라인의 단부는, 예를 들어, 본원에 설명된 바와 같이 미세유체 경로 장치에 형성된 예를 들어, 밀봉 포트에서 미세유체 경로 장치에 대해 밀봉되도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 유체 라인의 단부는 절단되거나, 평평하게(측면에서 수직)되도록 형성될 수 있다. 바이알은 압력 공급원에 또한 연결될 수 있는 커넥터를 통해 가압될 수 있다(예를 들어, > 1 atm 압력, 예를 들어, 2 atm, 3 atm, 5 atm 등). 예를 들어, 유체 바이알은 약 6.9 kPa 내지 138 kPa(예를 들어, 약 34.5 kPa - 138 kPa, 약 69 kPa 등)로 가압될 수 있다. 음압 또는 양압이 적용될 수 있고; 예를 들어, 진공(예를 들어, 약 -48.2 kPa 또는 48.2 kPa)이 적용되어 공정의 종료시에 바이알(예를 들어, 저장소)로 유체를 다시 끌어들일 수 있다. 일반적으로, 유체 바이알은 공압 밸브보다 낮은 압력에서 구동될 수 있으며, 이는 누출을 방지하거나 감소시킬 수 있다. 일부 변형에서, 유체 및 공압 밸브 사이의 압력 차이는 약 34.5 kPa(예를 들어, 약 48.3 kPa, 68.9 kPa, 82.7 kPa, 103.4 kPa, 137.9 kPa 등), 예를 들어, 약 34.5 kPa - 275.7 kPa(예를 들어, 약 34.5 kPa - 206.8 kPa, 약 34.5 kPa - 137.9 kPa, 약 48.2 kPa - 275.8 kPa, 약 48.2 kPa - 137.9 kPa 등)일 수 있다.
[0445] 각각의 바이알은 코딩될 수 있다(예를 들어, 하기 설명되는 바와 같이 하나 이상의 센서에 의해 판독될 수 있는 식별자에 의함). 제어기는 유체 수준 및 따라서 유체 인터페이스 조립체에서의 각각의 물질의 양을 모니터링할 수 있다.
[0446] 장치는 또한 미세유체 경로 장치(911)의 영역에서 자기장을 생성하도록 구성될 수 있는 자기장 어플리케이터(919)를 포함할 수 있다. 광 센서일 수 있는 하나 이상의 센서(905)는 장치의 일부일 수 있고, 바코드, 시약 보관 프레임 내에 보유된 유체 바이알 내의 유체 수준, 및 장치가 장착 시트(915) 내에 장착되는 경우 미세유체 경로 장치(911) 내의 유체 이동 중 하나 이상을 감지할 수 있다.
[0447] 센서는, 예를 들어, 광학 지표를 측정함으로써 장치 상의 공정을 측정할 수 있다. 일부 변형에서, 수율을 추정하기 위해 시각/광학 마커가 사용될 수 있다. 예를 들어, 형광은 형광단으로 태깅함으로써 공정 수율 또는 잔류 물질을 검출하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 동적 광 산란은 미세유체 경로 장치의 일부(예를 들어, 혼합 부분) 내의 입자 크기 분포를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 변형에서, 센서 측정은 광(예를 들어, 레이저 광)을 전달하고 나오는 광 신호를 검출하기 위해 1개 또는 2개의 광섬유를 사용하여 수행될 수 있다. 기기 패키지는 장치에서 원격으로 장착될 수 있다. 상기 비-접촉 감지가 이로울 수 있다.
[0448] 본원에 설명된 방법 및 장치 중 임의의 것에서, 센서(예를 들어, 비디오 센서)는 미세유체 경로 장치(예를 들어, 칩 또는 카트리지) 상에서의 모든 활동을 기록할 수 있다. 예를 들어, 물질(예를 들어, 치료 RNA)을 합성하고/하거나 처리하기 위한 전체 실행은, 예를 들어, 위에서부터 미세유체 경로 장치를 시각화할 수 있는 비디오 센서를 포함하는 하나 이상의 비디오 센서에 의해 기록될 수 있다. 미세유체 경로 장치 상에서의 처리는 시각적으로 추적될 수 있으며, 이러한 기록은 이후의 품질 관리 및/또는 처리를 위해 유지될 수 있다. 따라서, 처리의 비디오 기록은 후속 검토 및/또는 분석을 위해 저장되고/되거나, 보관되고/되거나, 전송될 수 있다.
[0449] 예를 들어, 하우징(933) 내의 장치의 내부 부분은 살균 가능하도록 추가로 구성될 수 있다. 특히, 장치의 일부는 분리되어 개별적으로 살균될 수 있다. 살균은, 예를 들어, UV 조사, 또는 오염을 제한하거나 규제 요건을 충족시키기 위해 필요할 수 있는 임의의 다른 살균 방법에 의해 수행될 수 있다. 하우징을 포함하는 장치는 고효율 미립자 공기(HEPA) 여과된 환경 내에 수용될 수 있다. 하우징을 포함하는 장치는 온도 제어 인클로저 내에 수용될 수 있다. 또한, 장치 자체가 온도 제어되는 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다. 본원에 설명된 장치 중 임의의 장치에서, 장치는, 예를 들어, 저장 온도(예를 들어, 약 -10℃ 내지 약 20℃의 온도, 예컨대 약 10℃, 약 4℃, 약 -10℃ 등)에서 시약을 저장하고/하거나 mRNA(예를 들어, 치료 mRNA)를 저장하기 위한 온도 제어 영역을 (예를 들어, 하우징 내) 포함할 수 있다. 이들 장치 중 임의의 것은 개별적으로 또는 하나 이상의 추가적인 mRNA 및 전달 비히클과 조합되어 사용될 수 있는 제조된 mRNA의 라이브러리를 포함할 수 있다.
[0450] 상기 언급된 바와 같이, 미세유체 경로 장치 제어기 시스템은 적어도 유체 이동을 구동시키기 위해 미세유체 경로 장치(911)를 통해 압력을 가하는 것을 포함하여 제어기(921)에 의해 제어될 수 있다. 제어기는 적어도 부분적으로, 일부 경우에 완전히 하우징 외부에 있을 수 있다. 제어기는 사용자 입력/출력을 포함하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 시스템의 사용자 인터페이스(923)는 장치 및 미세유체 경로 장치(들)의 용이한 작동 및 지시를 허용할 수 있다.
[0451] 본원에 설명된 장치 중 임의의 장치는 도 34b에 도시된 구성요소의 전부 또는 일부를 포함할 수 있으며; 모든 구성요소가 필요한 것은 아니다. 도 34b에서, 구성요소 사이의 연결 중 일부만 제시되며; 추가의(또는 대안적인) 연결이 사용될 수 있다.
[0452] 미세유체 경로 장치 제어 시스템은 시약의 공급, 유체 제어, 온도 제어, 혼합, 정제 및 공정 모니터링과 같은 미세유체 경로 장치 내부의 생산 활동을 모두 지원할 수 있다. 미세유체 경로 장치 제어 시스템에 대한 제조 활동은 적용 소프트웨어를 통해 접근하고 제어될 수 있다.
[0453] 미세유체 경로 장치는 치료(예를 들어, 치료 mRNA) 물질을 정밀하게 제조하기 위해 수행되는 제조 공정을 위한 하나 이상의 반응기를 포함하도록 구성될 수 있다. 동일한 미세유체 경로 장치는 직렬 및/또는 병렬로 미세유체 경로 장치 제어 시스템의 연속 경로 특성을 방해하지 않으면서 하나 이상의 미세유체 경로 장치에서 작동할 수 있다. 예를 들어, 다중 미세유체 경로 장치를 사용하여 다중 반응기에서 수행된 다중 처리 공정을 사용하여 치료 물질을 제조할 경우, 하나의 미세유체 경로 장치로부터의 부분 생성물을 포함하는 유체 생성물(들)은 미세유체 경로 장치 제어 장치의 보관 저장소 부분으로 미세유체 경로 장치 생성물(들)을 함유하는 유체를 이동함에 의한 것을 포함하여, 장치에 의해 폐쇄-경로 방식으로 하나 이상의 추가적인 미세유체 경로 장치에 전달될 수 있다.
[0454] 각각의 미세유체 경로 장치는 제조 공정 동안 처리하기 위한 하나 이상의 반응기를 포함하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 도 35a-35c는 미세유체 경로 장치의 3가지 예를 예시한다. 이들 예는 3가지 구별되는 유형의 미세유체 경로 장치를 예시한다: 주형 미세유체 경로 장치(도 35a), 시험관 내 전사(IVT) 미세유체 경로 장치(도 35b) 및 제형화 미세유체 경로 장치(도 35c). 이들 미세유체 경로 장치 예 각각은 제어되고 고도로 재현가능한 방식으로 일련의 단위 작업을 수행하기 위한 특징을 포함하도록 구성될 수 있다.
[0455] 일부 변형에서, 미세유체에 경로 장치는 2개의 융기된 층 사이에 샌드위치된 가요성 막과 2개 초과의 강성 층으로 구성된 다중층 구조로서 구성될 수 있다. 도 35d는 본원에 설명된 바와 같은 치료제를 처리하기 위한 반응기를 형성하는 다중 층을 갖는 다중유체 경로 장치의 한 예를 통한 단면도(미세유체 경로 장치의 평면을 가로지름)를 예시한다. 반응기는 다중층으로부터 형성된 펌핑 챔버를 포함하는 밀봉부, 채널, 밸브 및 챔버를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미세유체 경로 장치는 2개 이상의 강성 또는 반-강성 플레이트(1103, 1105) 및 적어도 하나의 탄성 층(1107)으로 형성될 수 있다. 탄성 층(1107)은 액체-투과성인 탄성 물질의 시트일 수 있다. 다양한 영역을 포함하는 탄성 층은 다소 기체 투과성일 수 있거나, 다소 기체 투과성으로 처리될 수 있다. 탄성 물질의 단일 연속 시트가 사용될 수 있지만, 일부 변형에서 다중 탄성 물질 시트가 사용되거나, '시트'는 다중 시트의 섹션으로 형성될 수 있다. 층 및 탄성 시트는 함께 적층될 수 있다. 일반적으로, 유체를 유지, 밸브 처리 및/또는 펌핑하기 위한 챔버는 탄성 층의 어느 한쪽 측 상의 플레이트에 형성되어 탄성 층이 챔버를 액체 함유 측 및 압력(예를 들어, 기체) 인가측으로 이등분할 수 있다. 챔버(들)의 전체 부피는 일정할 수 있으며, 제1(예를 들어, 상부) 플레이트와 제2(예를 들어, 하부) 플레이트 둘 모두 안으로 형성될 수 있지만, 이 부피는 압력측 및 액체측으로 분할될 수 있다. 압력 측으로 양압 또는 음압을 가함으로써 탄성 시트는 액체 함유 측의 부피를 감소시키거나(영으로 낮추고 챔버를 폐쇄시킴) 액체 함유 측의 부피를 (소정의 최대 부피로) 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 챔버의 압력 인가측은, 예를 들어, 하나 이상의 챔버의 압력 수용 측(1119)에 음압 또는 양압을 인가하기 위해, 예를 들어 압력 채널(1147)에 연결되는 상부 플레이트(1103)의 압력 포트(1143)를 통해 연결될 수 있다. 각 챔버의 압력 인가측 반대편의 액체 함유 측(1117)은 유체 채널(1121)을 통해 유체 포트(1123)에 연결될 수 있다. 유체 포트와 압력 포트 둘 모두는 상부 플레이트(1103)와 탄성 층(1107)으로의 개구에 의해 형성될 수 있으며, 이는 압력 라인이 반대쪽 강성 또는 반강성 층(들)(1105, 1109)에 의해 포트의 밑면 상에 지지되는 탄성 층(1107) 내로 밀려가기 때문에 여러 개의 다른 입력 라인이 존재하는 경우 대기로부터 분리되는 밀봉된 연결을 허용한다.
[0456] 전술한 개념의 모든 조합은 본원에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려되며 본원에 설명된 이점을 달성하기 위해 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
[0457] 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 예를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 것이 아니다. 용어 "제1" 및 "제2"는 다양한 특징/요소(단계 포함)를 설명하기 위해 본원에서 사용될 수 있지만, 문맥이 달리 지시하지 않는 한 이러한 특징/요소는 이러한 용어에 의해 제한되지 않아야 한다. 이러한 용어는 하나의 특징/요소를 다른 특징/요소와 구별하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 개시의 교시로부터 벗어남이 없이 하기 논의되는 제1 특징/요소는 제2 특징/요소로 명명될 수 있고, 유사하게, 하기 논의되는 제2 특징/요소는 제1 특징/요소로 명명될 수 있다.
[0458] 본원에 제공된 임의의 수치 값은 또한 문맥이 달리 지시하지 않는 한 약 또는 대략 그 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면, "약 10"도 개시된다. 본원에 언급된 임의의 수치 범위는 그 안에 포함된 모든 하위-범위를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 값이 개시될 때 당업자에 의해 적절하게 이해되는 바와 같이 "값보다 작거나 같은", "값보다 크거나 같은" 및 값들 사이의 가능한 범위가 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값이 개시되면, "값보다 작거나 같은" 뿐만 아니라 "값보다 크거나 같은"도 개시된다. 또한, 출원 전반에 걸쳐, 데이터는 다수의 상이한 포맷으로 제공되고, 이러한 데이터는 종점 및 출발점, 및 데이터 포인트의 임의의 조합에 대한 범위를 나타내는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 "15"가 개시되는 경우, 10 및 15보다 크거나, 10 및 15보다 크거나 같거나, 10 및 15보다 작거나, 10 및 15보다 작거나 같거나, 10 및 15과 동일한 것뿐만 아니라 10 내지 15가 개시된 것으로 이해된다. 또한, 2개의 특정 단위 사이의 각각의 단위가 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 개시되면, 11, 12, 13 및 14가 또한 개시된다.
SEQUENCE LISTING <110> Nutcracker Therapeutics, Inc <120> mRNA TREATMENT NANOPARTICLES <130> 14711-703.600 <140> TW 110114423 <141> 2021-04-21 <150> US 63/014,074 <151> 2020-04-22 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aCTLA4_HC (Heavy chain)- NTX-PMD-059 <400> 1 atggactgga cctggcggtt cctgtttgtg gtggctgctg ctacaggcgt gcagtctgag 60 gtccagctgc aacagtctgg ccctgtgctt gtgaagcctg gcgcctctgt gaagatgagc 120 tgtaaagcca gcggctacac cttcaccgac tactacatga actgggtcaa gcagagccac 180 ggcaagagcc tggaatggat cggcgtgatc aacccctaca acggcgacac cagctacaac 240 cagaagttca agggcaaagc cacactgacc gtggacaaga gcagcagcac cgcctacatg 300 gaactgaaca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag atattacggc 360 agttggttcg cctattgggg ccagggcaca ctggtcaccg tgtccagcgc caagacaaca 420 gcccctagcg tgtaccctct ggctcctgtg tgtggcgata caacaggcag ctctgtgacc 480 ctgggctgtc tggtcaaggg ctactttccc gagcctgtga ctctgacctg gaacagcgga 540 tctctgtcta gcggcgtgca cacctttcca gccgttctgc 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Val Asn Asn Asp 485 490 495 Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys 500 505 510 Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys 515 520 525 Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val 530 535 540 Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr 545 550 555 560 Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp 565 570 575 Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu 580 585 590 Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile 595 600 605 Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 610 615 620 <210> 9 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF_beta_Trap_LC- NTX-PMD-070 <400> 9 atgtaccgga tgcagctgct gagctgtatc gccctgtctc tggccctggt cacaaacagc 60 cagtctgccc tgacacagcc tgcctctgtg tctggatctc ctggccagag catcaccatc 120 agctgtaccg gcacaagctc tgacgtcggc ggctacaatt acgtgtcctg gtatcagcag 180 caccccggca aggctcccaa gctgatgatc tacgacgtgt ccaacagacc cagcggcgtg 240 tccaatagat tctccggcag caagagcggc aacaccgcca gtctgacaat cagcggactg 300 caggctgagg acgaggccga ctactactgt agcagctaca ccagctccag caccagagtg 360 ttcggcaccg gcaccaaagt gacagtgctg ggacagccca aggctaaccc taccgtgaca 420 ctgttccctc caagcagcga agaactgcag gccaacaagg ccacactcgt gtgcctgatc 480 agcgacttct atcctggcgc cgtgacagtg gcctggaagg ctgatggatc tccagtgaag 540 gctggcgtgg aaaccaccaa gcctagcaag cagagcaaca acaaatacgc cgccagcagc 600 tatctgagcc tgacacctga gcagtggaag tcccacagat cctacagctg ccaagtgacc 660 cacgagggca gcaccgtgga aaagacagtg gctcctaccg agtgcagctg a 711 <210> 10 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF_beta_Trap_LC- NTX-PMD-070 <400> 10 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp 35 40 45 Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser 100 105 110 Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr 115 120 125 Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile 145 150 155 160 Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly 165 170 175 Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser 180 185 190 Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln 195 200 205 Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser 210 215 220 Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 11 <211> 846 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFSF14/LIGHT <400> 11 gagcctcctg gagactgggg gcctcctccc tggagatcca cccccaaaac cgacgtcttg 60 aggctggtgc tgtatctcac cttcctggga gccccctgct acgccccagc tctgccgtcc 120 tgcaaggagg acgagtaccc agtgggctcc gagtgctgcc ccaagtgcag tccaggttat 180 cgtgtgaagg aggcctgcgg ggagctgacg ggcacagtgt gtgaaccctg ccctccaggc 240 acctacattg cccacctcaa tggcctaagc aagtgtctgc agtgccaaat gtgtgaccca 300 gccatgggcc tgcgcgcgag ccggaactgc tccaggacag agaacgccgt gtgtggctgc 360 agcccaggcc acttctgcat cgtccaggac ggggaccact gcgccgcgtg ccgcgcttac 420 gccacctcca gcccgggcca gagggtgcag aagggaggca ccgagagtca ggacaccctg 480 tgtcagaact gccccccggg gaccttctct cccaatggga ccctggagga atgtcagcac 540 cagaccaagt gcagctggct ggtgacgaag gccggagctg ggaccagcag ctcccactgg 600 gtatggtggt ttctctcagg gagcctcgtc atcgtcattg tttgctccac agttggccta 660 atcatatgtg tgaaaagaag aaagccaagg ggtgatgtag tcaaggtgat cgtctccgtc 720 cagcggaaaa gacaggaggc agaaggtgag gccacagtca ttgaggccct gcaggcccct 780 ccggacgtca ccacggtggc cgtggaggag acaataccct cattcacggg gaggagccca 840 aaccac 846 <210> 12 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFSF14/LIGHT <400> 12 Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro Lys 1 5 10 15 Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala Pro 20 25 30 Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val 35 40 45 Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu 50 55 60 Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly 65 70 75 80 Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln 85 90 95 Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg 100 105 110 Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile Val 115 120 125 Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser Ser 130 135 140 Pro Gly Gln Arg Val Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr Leu 145 150 155 160 Cys Gln Asn Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu Glu 165 170 175 Glu Cys Gln His Gln Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala Gly 180 185 190 Ala Gly Thr Ser Ser Ser His Trp Val Trp Trp Phe Leu Ser Gly Ser 195 200 205 Leu Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr Val Gly Leu Ile Ile Cys Val 210 215 220 Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val Ser Val 225 230 235 240 Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile Glu Ala 245 250 255 Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu Thr Ile 260 265 270 Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His 275 280 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA peptide <400> 13 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5

Claims (66)

  1. (i) 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA;
    (ii) 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및
    (iii) 전달 비히클 분자로서, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 상기 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화되는, 전달 비히클 분자를 포함하는,
    mRNA 나노입자를 종양 내 주사하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 종양-특이적 항원이 바이러스 항원을 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스 항원이 인간 유두종바이러스(HPV), 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스(KSHV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 메르켈 세포 폴리오마바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV), 또는 이들의 임의의 조합과 관련된 방법.
  4. 제1항에 있어서, 종양-특이적 항원이 네오-에피토프를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 종양-특이적 항원이 환자-특이적 항원을 포함하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 종양-특이적 항원이 복수의 환자-특이적 항원을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 종양-특이적 항원이 공유된 종양 항원을 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클 분자가 아미노-지질화된 펩토이드를 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 나노입자가 제2 면역조절제를 인코딩하는 제3 mRNA를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 나노입자가 면역조절 siRNA를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA가 체크포인트 억제제, 면역억제 길항제, 염증촉진성 제제, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA가 염증촉진성 사이토카인을 인코딩하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 염증촉진성 사이토카인이 (IL), IL-1, IL-2, IL-12, IL-17, IL-18, IFN-γ 및 TNF-α 중 하나인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 염증촉진성 사이토카인이 인터루킨-12(IL-12)인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA가 종양 괴사 인자 상과 구성원 14(TNFSF14)를 인코딩하는 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA가 항-CTLA-4를 인코딩하는 방법.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA가 TGF-베타 길항제를 인코딩하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 나노입자가 면역조절제를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 나노입자가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 면역자극제를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 사이의 대기와 함께 종양 내 주사를 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하고, 상기 대기가 약 1 내지 약 14일인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA 및 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA가 단일 mRNA 가닥 상에 있는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 림프종을 갖는 환자를 치료하는 방법인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 자궁경부암을 갖는 환자를 치료하는 방법인 방법.
  24. mRNA 나노입자를 이를 필요로 하는 환자에게 종양 내 주사하는 것을 포함하는 방법으로서, 상기 mRNA 나노입자가,
    (i) 자궁경부암에 특이적인 항원을 인코딩하는 제1 mRNA;
    (ii) 염증촉진성 사이토카인을 포함하는 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및
    (iii) 전달 비히클 분자로서, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 상기 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화되는, 전달 비히클 분자를 포함하는,
    방법.
  25. (i) 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA;
    (ii) 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및
    (iii) 전달 비히클 분자로서, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 상기 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화되는, 전달 비히클 분자를 포함하는,
    mRNA 치료 나노입자.
  26. (i) 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA;
    (ii) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및
    (iii) 아미노-지질화된 펩토이드 전달 비히클을 포함하는 전달 비히클 분자로서, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 상기 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화되는, 전달 비히클 분자를 포함하는,
    mRNA 치료 나노입자.
  27. (i) 자궁경부암에 특이적인 항원을 인코딩하는 제1 mRNA;
    (ii) 염증촉진성 사이토카인을 포함하는 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및
    (iii) 전달 비히클 분자로서, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 상기 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화되는, 전달 비히클 분자를 포함하는,
    mRNA 치료 나노입자.
  28. 제25항 또는 제27항에 있어서, 전달 비히클 분자가 아미노-지질화된 펩토이드를 포함하는 mRNA 치료 나노입자.
  29. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 mRNA가 환자-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 치료 나노입자.
  30. 제29항에 있어서, 제1 mRNA가 복수의 환자-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 치료 나노입자.
  31. 제25항 또는 제26항에 있어서, 제1 mRNA가 공유된 종양 항원을 인코딩하는 mRNA 치료 나노입자.
  32. 제25항에 있어서, 제2 mRNA가 체크포인트 억제제, 면역억제 길항제, 염증촉진성 제제, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 mRNA 치료 나노입자.
  33. 제25항에 있어서, 제2 mRNA가 항-CTLA-4를 인코딩하는 mRNA 치료 나노입자.
  34. 제25항에 있어서, 제2 mRNA가 SEQ ID No: 1 또는 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 항-CTLA-4를 인코딩하는 mRNA 치료 나노입자.
  35. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 괴사 인자 상과 구성원 14(TNFSF14)를 인코딩하는 제3 mRNA를 추가로 포함하는 mRNA 치료 나노입자.
  36. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 TGF-베타 길항제를 인코딩하는 제3 mRNA를 추가로 포함하는 mRNA 치료 나노입자.
  37. 제25항에 있어서, 제2 mRNA가 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 인터루킨-12를 인코딩하는 mRNA 치료 나노입자.
  38. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 치료 나노입자가 면역자극제를 추가로 포함하는 mRNA 치료 나노입자.
  39. 제38항에 있어서, 면역자극제가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 치료 나노입자.
  40. 제25항에 있어서, 종양-특이적 항원 및 면역조절제의 각각의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 단일 mRNA 가닥의 일부인 mRNA 치료 나노입자.
  41. 제25항에 있어서, 종양-특이적 항원 및 면역조절제의 각각의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 상이한 mRNA 가닥의 일부인 mRNA 치료 나노입자.
  42. 미세유체 경로 장치에서 주형으로부터 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고;
    제1 mRNA를 정제하고;
    미세유체 경로 장치에서 제1 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고;
    미세유체 경로 장치에서 제2 mRNA를 정제하고;
    미세유체 경로 장치에서 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키는 것을 포함하는,
    방법.
  43. 미세유체 경로 장치의 제1 챔버에서 주형으로부터 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고;
    제1 mRNA를 정제하고;
    미세유체 경로 장치의 제2 챔버에서 제1 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고;
    미세유체 경로 장치에서 제2 mRNA를 정제하고;
    미세유체 경로 장치의 제3 챔버에서 제2 면역조절제를 인코딩하는 제3 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고;
    미세유체 경로 장치에서 제3 mRNA를 정제하고;
    미세유체 경로 장치에서 제1 mRNA, 제2 mRNA 및 제3 mRNA를 전달 비히클 분자와 함께 함께 캡슐화하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키는 것을 포함하는,
    방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 제1 mRNA를 정제하고, 제2 mRNA를 정제하고, 제3 mRNA를 정제하는 것 각각이 미세유체 경로 장치 상의 하나 이상의 반응기에서 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 하나 이상의 반응기에서 정제하는 것이 하나 이상의 반응기 내에서 셀룰로스를 사용하여 이중 가닥 mRNA를 제거하는 것을 포함하는 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 미세유체 경로 장치가 자동으로 및 연속적으로 제1 mRNA 및 제2 mRNA 각각의 시험관 내 전사를 수행하고, 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 정제하고, 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 전달 비히클 분자를 조합하기 위한 폐쇄-경로 시스템을 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 폐쇄-경로 시스템이 제1 및 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고, 제1 및 제2 mRNA를 정제하고, 제1 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 조합하는 것을 공압적으로 제어하는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 폐쇄-경로 시스템이 미세유체 경로 장치 내에서 하나 이상의 막을 편향시킴으로써,
    제1 mRNA 및 제2 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고,
    제1 mRNA 및 제2 mRNA를 정제하고,
    제1 mRNA 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 조합하는 것을 공압적으로 제어하는, 방법.
  49. 제46항에 있어서, 폐쇄-경로 시스템이 총체적으로 약 5일 미만 내에 자동으로 및 연속적으로,
    치료 mRNA의 시험관 내 전사를 수행하고,
    치료 mRNA를 정제하고,
    mRNA를 전달 비히클과 조합하는, 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 치료 현장에서 수행되는 방법.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA를 전달 비히클과 조합하는 것이 미세유체 경로 장치에서 mRNA 치료 나노입자를 투석하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  52. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 미세유체 경로 장치에서 mRNA 치료 나노입자를 농축시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 비히클 분자가 양친매성 분자를 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 양친매성 분자가 아미노-지질화된 펩토이드를 포함하는 방법.
  55. 제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA가 환자-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 제1 mRNA가 복수의 환자-특이적 항원을 인코딩하는 방법.
  57. 제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA가 체크포인트 억제제, 면역억제 길항제, 염증촉진성 제제, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 방법.
  58. 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA가 항-CTLA-4를 인코딩하는 방법.
  59. 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA가 TGF-베타 길항제를 인코딩하는 방법.
  60. 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA가 단일 사슬 인터루킨-12(IL-12)를 인코딩하는 방법.
  61. 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 mRNA와 제2 mRNA를 조합하는 것이 미세유체 경로 장치에 면역자극제를 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 면역자극제가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  63. 제1 표면과 제2 표면 사이에 샌드위치된 탄성 층;
    제1 표면과 제2 표면 사이에 형성된 주형 시험관 내 전사(IVT) 챔버로서, 탄성 층의 일부가 상기 주형 IVT 챔버를 상기 제2 표면의 유체-접촉면 및 상기 제1 표면의 압력-수용면으로 분할하고, 상기 주형 IVT 챔버의 유체-접촉면이 종양-특이적 항원을 인코딩하는 mRNA 주형의 공급원과 유체 소통하는, 주형 IVT 챔버;
    주형 IVT 챔버의 유체-접촉면과 유체 소통하는 제1 반응기로서, 상기 제1 반응기가 이중 가닥 mRNA를 제거하기 위해 상기 제1 반응기 내에 이중-가닥 mRNA 결합 물질을 포함하는, 제1 반응기;
    제1 mRNA 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키기 위해 제1 반응기, 제1 면역조절제 mRNA의 공급원, 및 전달 비히클 분자의 공급원에 커플링되는 전달 비히클 포트와 유체 소통하는 혼합 조립체; 및
    각각이 하나 이상의 압력 포트로부터 제1 표면 및 탄성 층을 통해 제2 표면으로 그리고 다시 탄성 층을 통해 제1 표면으로 연장되는 복수의 압력 채널로서, 상기 복수의 압력 채널의 각각의 압력 채널이 주형 IVT 챔버의 압력-수용면과 유체적으로 연결되고, 추가로 주형 IVT 챔버의 유체-접촉면의 부피가 미세유체 경로 장치를 통해 유체를 구동시키기 위한 압력 포트 중 하나 이상으로부터 압력을 가함으로써 조정되어 mRNA 치료 나노입자를 형성시킬 수 있는, 복수의 압력 채널을 포함하는,
    미세유체 경로 장치.
  64. 제1 표면과 제2 표면 사이에 샌드위치된 탄성 층;
    제1 표면과 제2 표면 사이에 형성된 주형 시험관 내 전사(IVT) 챔버로서, 탄성 층의 일부가 상기 주형 IVT 챔버를 상기 제2 표면의 유체-접촉면 및 상기 제1 표면의 압력-수용면으로 분할하고, 상기 주형 IVT 챔버의 유체-접촉면이 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA 주형의 공급원과 유체 소통하는, 주형 IVT 챔버;
    주형 IVT 챔버의 유체-접촉면과 유체 소통하는 제1 반응기로서, 상기 제1 반응기가 이중 가닥 mRNA를 제거하기 위해 상기 제1 반응기 내에 이중-가닥 mRNA 결합 물질을 포함하는, 제1 반응기;
    제1 표면과 제2 표면 사이에 형성된 제1 면역조절제 IVT 챔버로서, 탄성 층의 일부가 상기 제1 면역조절제 IVT 챔버를 상기 제2 표면의 유체-접촉면 및 상기 제1 표면의 압력-수용면으로 분할하고, 상기 제1 면역조절제 IVT 챔버의 유체-접촉면이 제1 면역조절제를 인코딩하는 제1 면역조절제 주형의 공급원과 유체 소통하는, 제1 면역조절제 IVT 챔버;
    제1 면역조절제 IVT 챔버의 유체-접촉면과 유체 소통하는 제2 반응기로서, 상기 제2 반응기가 이중 가닥 mRNA를 제거하기 위해 제1 반응기 내에 이중-가닥 mRNA 결합 물질을 포함하는, 제2 반응기;
    제1 반응기 및 제2 반응기와 유체 소통하는 제1 혼합 챔버;
    제1 mRNA 및 제2 mRNA를 전달 비히클 분자와 함께 캡슐화하여 mRNA 치료 나노입자를 형성시키기 위해 제1 혼합 챔버의 산출물 및 전달 비히클 분자의 공급원에 커플링되는 전달 비히클 포트와 유체 소통하는 제2 혼합 챔버; 및
    각각이 하나 이상의 압력 포트로부터 제1 표면 및 탄성 층을 통해 제2 표면으로 그리고 다시 탄성 층을 통해 제1 표면으로 연장되는 복수의 압력 채널로서, 상기 복수의 압력 채널의 각각의 압력 채널이 주형 IVT 챔버 및 제1 면역조절제 IVT 챔버의 압력-수용면과 유체적으로 연결되고, 추가로 주형 IVT 챔버의 유체-접촉면 및 제1 면역조절제 IVT 챔버의 유체-접촉면의 부피가 압력 포트 중 하나 이상로부터 압력을 가함으로써 조정될 수 있는 복수의 압력 채널을 포함하는,
    미세유체 경로 장치.
  65. (iv) 종양-특이적 항원을 인코딩하는 제1 mRNA;
    (v) 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및
    (vi) 전달 비히클 분자로서, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 상기 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화되는, 전달 비히클 분자를 포함하는 mRNA 나노입자를 주사하는 것을 포함하는,
    방법.
  66. mRNA 나노입자를 이를 필요로 하는 환자에게 주사하는 것을 포함하는 방법으로서, 상기 mRNA 나노입자가,
    (iv) 자궁경부암에 특이적인 항원을 인코딩하는 제1 mRNA;
    (v) 염증촉진성 사이토카인을 포함하는 면역조절제를 인코딩하는 제2 mRNA; 및
    (vi) 전달 비히클 분자로서, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 상기 전달 비히클 분자에 의해 함께 캡슐화되는, 전달 비히클 분자를 포함하는,
    방법.
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