CN115956003A - mRNA治疗纳米颗粒 - Google Patents

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S.多伊奇
N.费
D.弗里曼森
O.哈贝思
C.麦克金雷
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Nutcracker Therapeutics Inc
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Abstract

本文提供了mRNA治疗纳米颗粒的实例以及使用它们来治疗患者的方法。mRNA治疗纳米颗粒可以包含编码肿瘤特异性抗原和免疫调节剂的一种或多种mRNA；以及包囊该一种或多种mRNA的递送媒介物分子。

Description

mRNA治疗纳米颗粒
对相关申请的交叉引用
该专利要求名称为“MRNA疗法”并于2020年04月22日提交的美国临时专利申请号63/014,074的优先权，其通过引用其整体并入本文。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用以其整体并入本文，其与各单独出版物或专利申请均具体并单独指出将通过引用并入的程度相同。
发明背景
基于mRNA的疫苗具有触发稳健的抗癌免疫的益处，而没有DNA疫苗的基因组整合的潜在危险或肽疫苗的抗原选择的限制。不幸的是，常规mRNA疫苗不能被抗原呈递细胞有效内化，并且可能不为mRNA分子提供免于被血浆和组织酶降解的足够保护。尽管mRNA是抗体基因转移的新兴平台，但基于mRNA的mAb的进一步开发受到对安全且有效的递送系统的需求的限制。
此外，mRNA可能仅导致具有天然翻译后修饰的Ab，这意味着缀合物和修饰以增加血清半衰期(例如通过PEG化)对于mRNA编码的Ab通常是不可能的。对于被动免疫，需要非常高的安全性概况。在过去的几十年里，已经描述IVT mRNA的不同优化以避免细胞RNA传感器诱导的不必要的免疫激活和细胞因子诱导。尽管对IVTmRNA进行上述适应，但ADA(抗药抗体)应答和瞬时细胞因子的出现已阻碍mRNA药物的临床适用性，尤其是当mRNA必须多次施用时，在一些情况下导致诱导补体激活相关的假性过敏(CARPA)。
发明概述
本文描述了可能解决这些问题的方法和组合物(包括试剂盒)。本文提供了用于治疗癌症的实例方法，特别是用于制备mRNA(治疗)纳米颗粒的方法、使用这些mRNA纳米颗粒(例如，包括mRNA疫苗)治疗患者的方法。特别是，本文描述了施用于有此需要的患者的mRNA疗法。患者可以是哺乳动物，例如人。患者可以患有本文所述的肿瘤中的任一种(或在某一情况下患有癌症)，并因此在一些情况下需要本文所述的疗法或治疗。mRNA治疗包括(向患者或患者的部位)施用mRNA(治疗)纳米颗粒，包括编码一种或多种患者特异性抗原的mRNA和编码一种或多种免疫调节剂的mRNA，以及制备患者特异性mRNA疗法的器械和方法。
特别地，本文描述了mRNA治疗，包括mRNA疫苗，使用这些mRNA治疗治疗癌症(其在本文中是指非良性的肿瘤，或可以是良性或癌性的肿瘤)的方法，以及形成这些mRNA治疗的方法。例如，本文描述了方法，其包括瘤内注射编码肿瘤特异性抗原的mRNA治疗纳米颗粒和编码免疫调节剂的mRNA，其中编码肿瘤特异性抗原和免疫调节剂的mRNA由递送媒介物分子(例如氨基脂化类肽)包囊在一起。虽然注射可以是瘤内的，如本文一些实例所提供，其他施用途径也是可能的。
本文所述的任何方法均可以是治疗方法，包括治疗癌症的方法(例如，减少或在一些情况下消除肿瘤)。
本文所述的方法可以包括：注射mRNA治疗纳米颗粒，其包含：编码肿瘤特异性抗原和免疫调节剂的一种或多种mRNA；以及包囊一种或多种mRNA的递送媒介物分子。例如，该方法可以包括：编码肿瘤特异性抗原和一种或多种免疫调节剂的一种或多种mRNA；以及包囊一种或多种mRNA的递送媒介物分子。在一些实例中，该方法可以包括瘤内注射mRNA治疗纳米颗粒，其包含编码肿瘤特异性抗原和一种或多种免疫调节剂的一种或多种mRNA，其中至少一种或多种免疫调节剂是检查点抑制剂；以及包囊一种或多种mRNA的递送媒介物分子。在一些实例中，该方法可以包括：瘤内注射mRNA治疗纳米颗粒，其包含：编码肿瘤特异性抗原、两种或更多种免疫调节剂的一种或多种mRNA；以及包囊一种或多种mRNA的递送媒介物分子，其中递送媒介物分子包括氨基脂化类肽递送媒介物。
例如，本文所述的方法包括：注射mRNA治疗纳米颗粒，其包含编码肿瘤特异性抗原的mRNA(例如mRNA疫苗)和编码免疫调节剂的mRNA，其中编码肿瘤特异性抗原和免疫调节剂的mRNA用相同的递送媒介物分子包囊。例如，该方法可以包括：瘤内注射mRNA治疗纳米颗粒，其包含编码肿瘤特异性抗原的mRNA和编码一种或多种免疫调节剂的mRNA，其中mRNA疫苗和免疫调节剂用相同的纳米颗粒递送包囊。
方法可以包括：瘤内注射mRNA治疗纳米颗粒，其包含编码肿瘤特异性抗原的mRNA(例如mRNA疫苗)和编码两种或更多种免疫调节剂的mRNA，其中两种或更多种免疫调节剂中的至少一种是检查点抑制剂，进一步地其中编码肿瘤特异性抗原的mRNA和编码免疫调节剂的mRNA用相同的递送媒介物分子包囊。
在一些变化中，方法包括：瘤内注射mRNA治疗纳米颗粒，其包含编码肿瘤特异性抗原的mRNA(例如，mRNA疫苗)和编码两种或更多种免疫调节剂的mRNA，其中编码肿瘤特异性抗原的mRNA和编码两种或更多种免疫调节剂的mRNA用包含氨基脂化类肽递送媒介物的递送媒介物分子包囊。
这些方法或组合物(例如，mRNA疗法)中的任何一种均可以包括一种或多种siRNA，包括一种或多种免疫调节剂siRNA。例如，方法可以包括：瘤内注射mRNA治疗纳米颗粒，其包含编码肿瘤特异性抗原的mRNA、编码一种或多种免疫调节剂的mRNA和一种或多种免疫调节剂siRNA组成，其中编码肿瘤特异性抗原的mRNA、编码一种或多种免疫调节剂的mRNA和一种或多种siRNA用相同的递送媒介物分子包囊。
可以使用任何适当的递送媒介物。例如，递送媒介物分子可以是基于脂质的媒介物(如脂质纳米颗粒)或基于聚合物的纳米颗粒。特别地，递送媒介物(DV)分子可以是氨基脂化类肽递送媒介物。在这些方法中的任何一种中，递送媒介物分子可以包括氨基脂化类肽。在一个实例中，递送媒介物分子包含至少一种类肽，其可以是本文所述的任何类型的类肽。在另一个实例中，递送媒介物分子包含超过一种类肽，其可以是本文所述的任何类型的类肽。
编码肿瘤特异性抗原的mRNA可以包含编码患者特异性抗原(或多种患者特异性抗原)的mRNA。例如，mRNA治疗(例如，mRNA疫苗)可以包含编码多种患者特异性抗原的mRNA。编码肿瘤特异性抗原的mRNA可以包含编码共享肿瘤抗原的mRNA。
编码免疫调节剂的mRNA编码：检查点抑制剂、免疫抑制拮抗剂、促炎剂或其组合。例如，编码免疫调节剂的mRNA编码抗CTLA-4。编码免疫调节剂的mRNA可以编码TGF-β拮抗剂。编码免疫调节剂的mRNA可以编码单链白细胞介素-12(IL-12)。
任何mRNA疗法和制备或使用它们的方法可以包括添加一种或多种佐剂，其可以包括在mRNA疗法中。在一些变化中，递送媒介物分子可以与另外的佐剂混合、包括另外的佐剂和/或包囊另外的佐剂。在一些变化中，另外的佐剂可以与溶液组合，该溶液包含包囊治疗性mRNA(例如，肿瘤特异性mRNA和一种或多种免疫调节剂mRNA)的纳米颗粒。例如，这些mRNA疗法中的任何一种均可以进一步包含免疫刺激剂。例如，免疫刺激剂可以包含CpG寡脱氧核苷酸。
在使用中，这些方法可以包括重复注射治疗一次或多次，治疗之间等待1-7天。如所提及，注射可以是(但不限于)瘤内注射。在一些变化中，注射可以是瘤内和/或通过其他手段(皮下等)。
编码肿瘤特异性抗原的mRNA和编码免疫调节剂的mRNA可以在单个mRNA链上或在分开的mRNA链上。
一般而言，这些方法可以是治疗肿瘤的方法，例如减小肿瘤大小。肿瘤可以减小约10％至约100％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、大于约10％、大于约15％、大于约20％、大于约25％、大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约75％等。
任何适当的癌症或肿瘤均可以如本文所述进行治疗。例如，这些方法中的任何一种可以是治疗淋巴瘤的方法。本文所述的方法可以是治疗宫颈癌的方法。
本文还描述了mRNA疗法，其包括mRNA治疗纳米颗粒作为(例如，mRNA疫苗纳米颗粒)。一般而言，mRNA治疗纳米颗粒可以包含：编码肿瘤特异性抗原和免疫调节剂的一种或多种mRNA；和递送媒介物分子，其中一种或多种mRNA由递送媒介物分子包囊在一起。mRNA治疗纳米颗粒可以包含：编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA(例如mRNA疫苗)；编码免疫调节剂的第二mRNA；以及包囊第一mRNA和第二mRNA的递送媒介物分子。例如，mRNA疫苗纳米颗粒可以包含：编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；编码免疫调节剂(包括检查点抑制剂)的第二mRNA；编码第二免疫调节剂的第三mRNA；以及包囊第一mRNA、第二mRNA和第三mRNA的递送媒介物分子。
mRNA治疗纳米颗粒可以包含：编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；编码免疫调节剂(包括检查点抑制剂)的第二mRNA；编码第二免疫调节剂的第三mRNA；和包含氨基脂化类肽递送媒介物的递送媒介物，其包囊第一mRNA、第二mRNA和第三mRNA。
这些mRNA治疗疫苗中的任何一种均可以包含一种或多种siRNA，包括免疫调节siRNA。
如上所述，可以使用任何适当的递送媒介物分子。例如，递送媒介物分子可以包括氨基脂化类肽递送媒介物。
第一mRNA可以编码患者特异性抗原。例如，第一mRNA可以编码多种患者特异性抗原。第一mRNA可以编码共享肿瘤抗原。第二mRNA可以编码：检查点抑制剂、免疫抑制拮抗剂、促炎剂或其组合。第二mRNA可以编码抗CTLA-4。例如，第二mRNA可以编码抗CTLA-4并且可以具有与SEQ ID No:1或SEQ ID NO:3的多核苷酸序列至少约50％(例如，约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或更多)相同的多核苷酸序列。在一些实例中，第二mRNA可以编码抗CTLA-4，其与SEQ ID No:2或SEQ ID NO:4的多肽序列至少约50％(例如，约60％、约65％、约70％、约75％)的。约80％、约85％、约90％或更多)相同。第二mRNA可以编码TNFSF14(肿瘤坏死因子受体超家族成员14同等型1前体，或LIGHT)。例如，第二mRNA可以编码TNFSF14并且可以具有与SEQ ID No:11的多核苷酸序列至少约50％(例如，约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或更多)相同的多核苷酸序列。在一些实例中，第二mRNA可以编码TNFSF14，其与SEQ ID No:12的多肽序列至少约50％(例如，约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或更多)相同。第三mRNA可以编码TGF-β拮抗剂。第三mRNA可以编码TGF-β拮抗剂并且可以具有与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的多核苷酸序列至少约50％(例如，至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或更多)相同的多核苷酸序列。第三mRNA可以编码TGF-β拮抗剂，其与SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:10的多肽序列至少约50％(例如，至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或更多)相同。第三mRNA可以编码单链白细胞介素-12。例如，第三mRNA可以编码单链白细胞介素-12并且可以具有与SEQ ID NO:5的多核苷酸序列至少约50％(例如，至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或更多)相同的多核苷酸序列。第三mRNA可以编码单链白细胞介素-12，其与SEQ ID NO:6的多肽序列至少约50％(例如，至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或更多)相同。
mRNA治疗纳米颗粒可以包含编码另一种免疫调节剂的另外mRNA，该免疫调节剂与mRNA治疗纳米颗粒中已经存在的其他免疫调节剂不同。如本文所述，在这些mRNA疗法中的任何一种中，三种或更多种不同的免疫调节mRNA可以包含在肿瘤特异性mRNA内。
本文所述的mRNA治疗纳米颗粒可以包含和/或与一种或多种免疫调节剂组合，如上所述。例如，本文所述的mRNA治疗纳米颗粒可以包含和/或与免疫刺激剂，如CpG寡脱氧核苷酸组合。
编码肿瘤特异性抗原的mRNA和编码免疫调节剂的一种或多种mRNA的所有或一些可以是单个mRNA链的部分。具体地，这些mRNA(或其中的一些)可以组合，使得例如，编码肿瘤特异性抗原的mRNA和编码免疫调节剂的mRNA可以是单个mRNA，其在单个连续mRNA内将肿瘤特异性抗原的两个或更多个开放阅读框和编码免疫调节剂的mRNA组合。例如，编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA和编码免疫调节剂的第二mRNA可以是单个mRNA链，其包含第一mRNA(编码肿瘤特异性抗原的mRNA)和第二mRNA(编码免疫调节剂)的ORF。替代地，第一mRNA和第二mRNA可以是不同mRNA链的部分。
本文还描述了制备本文所述mRNA疗法(例如，mRNA治疗纳米颗粒)的方法(例如，装配方法、制造方法、合成方法等)。例如，(例如，制备mRNA治疗纳米颗粒的)方法可以包括：在微流控路径装置中执行编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA的体外转录；在微流控路径装置中执行编码第一免疫调节剂的第二mRNA的体外转录；在微流控路径装置中纯化第一和第二mRNA；以及在微流控路径装置中将第一mRNA和第二mRNA与递送媒介物分子组合以形成mRNA治疗纳米颗粒。
在一些实例中，该方法可以包括：在闭路微流控路径装置中执行编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA的体外转录；在微流控路径装置中执行编码第一免疫调节剂的第二mRNA的体外转录；在微流控路径装置中纯化第一和第二mRNA；以及在微流控路径装置中将第一mRNA和第二mRNA与递送媒介物分子组合。
制备mRNA治疗纳米颗粒的方法可以包括：在闭路微流控路径装置中从模板执行编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA的体外转录；纯化第一mRNA；在微流控路径装置中执行编码第一免疫调节剂的第二mRNA的体外转录；在微流控路径装置中纯化第二mRNA；以及在微流控路径装置中将第一mRNA和第二mRNA两者与递送媒介物分子包囊在一起以形成mRNA治疗纳米颗粒。
(例如，制备mRNA治疗纳米颗粒的)方法，该方法包括：在(例如，闭路)微流控路径装置的第一室中从模板执行编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA的体外转录；纯化第一mRNA；在微流控路径装置的第二室中执行编码第一免疫调节剂的第二mRNA的体外转录；在微流控路径装置中纯化第二mRNA；在微流控路径装置的第三室中执行编码第二免疫调节剂的第三mRNA的体外转录；在微流控路径装置中纯化第三mRNA；以及在微流控路径装置中将第一mRNA、第二mRNA和第三mRNA与递送媒介物分子包囊在一起以形成mRNA治疗纳米颗粒。
纯化第一、第二和第三mRNA可以包括在微流控路径装置上的一个或多个反应器中纯化第一、第二或第三mRNA。用于纯化mRNA的一个或多个反应器可以包含一个或多个反应器内的双链mRNA结合材料，如纤维素，以除去双链mRNA。
微流控路径装置可以包括闭路系统，其配置为自动且连续地执行以下过程：从一个或多个模板执行第一和第二mRNA的体外转录，纯化第一和第二mRNA(和第三、第四等)，以及将mRNA与递送媒介物分子组合。闭路系统可以气动控制执行mRNA的体外转录，纯化mRNA，以及将mRNA与递送媒介物分子组合。
闭路系统可以气动控制从模板执行第一和第二mRNA的体外转录，纯化第一和第二mRNA，并通过偏转在微流控路径装置内的一个或多个膜将第一和第二mRNA与递送媒介物分子组合。闭路系统可以在少于5天中自动且连续地执行以下过程：从模板执行治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗性mRNA以及将mRNA与递送媒介物组合。该方法可以在医疗保健单位执行。将mRNA与递送媒介物组合可以进一步包括在微流控路径装置中透析mRNA治疗纳米颗粒组合物。
用于执行进行它们的这些方法和系统中的任何一种均可以包括将mRNA治疗纳米颗粒浓缩在微流控路径装置上。
如上所述，递送媒介物分子可以是任何适当的递送媒介物，包括两亲性纳米颗粒(例如，氨基脂化类肽)。编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA可以包括编码患者特异性抗原的mRNA。第一mRNA可以编码多种患者特异性抗原。编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA可以包括编码共享肿瘤抗原的mRNA。编码免疫调节剂的第二mRNA可以编码：检查点抑制剂、免疫抑制拮抗剂、促炎剂或其组合。编码免疫调节剂的第二mRNA可以编码抗CTLA-4。编码免疫调节剂的第二mRNA可以编码TGF-β拮抗剂。编码免疫调节剂的第二mRNA可以编码单链白细胞介素-12(IL-12)。将mRNA(例如，第一和第二mRNA、第三mRNA等)组合可以包括当mRNA治疗纳米颗粒在微流控路径装置中的时候添加免疫刺激剂至mRNA治疗纳米颗粒，如CpG寡脱氧核苷酸。
本文描述了方法，其包括瘤内注射编码肿瘤特异性抗原的mRNA治疗纳米颗粒和编码两种或更多种免疫调节剂的mRNA，其中两种或更多种免疫调节剂中的至少一种是检查点抑制剂，进一步地其中mRNA疫苗和免疫调节剂由单一递送媒介物分子(如氨基脂化类肽递送媒介物)包囊在一起。
例如，本文描述了治疗方法。这些方法可以具有改善的mRNA疫苗的功效，特别是对于癌症治疗。将编码肿瘤特异性mRNA的mRNA和编码免疫调节剂的mRNA用递送媒介物包囊在一起可以增强疫苗接种的功效。这对于瘤内注射mRNA疫苗可能是有益的。这些方法中的任何一种可以包括瘤内注射编码肿瘤特异性抗原的mRNA疫苗和编码一种或多种免疫调节剂的mRNA；编码肿瘤特异性抗原的mRNA和编码一种或多种免疫调节剂的mRNA可以用氨基脂化类肽递送媒介物包囊在一起。
治疗(例如，癌症治疗)方法可以包括瘤内注射编码肿瘤特异性抗原的mRNA疫苗和编码一种或多种免疫调节剂的mRNA，其中将mRNA治疗纳米颗粒与用于肿瘤特异性mRNA抗原和编码一种或多种免疫调节剂的mRNA的单一递送媒介物一起包囊。
这些方法和组合物可以包括，作为mRNA治疗纳米颗粒的部分，包括肿瘤特异性抗原的定向mRNA，其中肿瘤特异性抗原由正在注射mRNA治疗纳米颗粒的肿瘤表达。在一些变化中，肿瘤特异性抗原对正在注射mRNA治疗纳米颗粒的肿瘤具有特异性。
在这些方法和组合物中的任何一种中，肿瘤特异性抗原可以是编码一种或多种患者特异性抗原的mRNA。患者特异性抗原可以通过鉴定异常蛋白来鉴定(例如，其与相应的体细胞蛋白相比经修饰，和/或非癌患者细胞相比异常表达的蛋白质)。在一些变化中，mRNA治疗纳米颗粒包含编码多种患者特异性抗原的mRNA。mRNA治疗纳米颗粒可以包括编码共享肿瘤抗原的mRNA。例如，在一些变化中，mRNA可以编码从未从患者分离的类似肿瘤中鉴定的抗原(如肽)。
与患者中(例如，肿瘤中)存在的序列相比，肿瘤特异性抗原的多核苷酸序列可以经修饰。可以修饰多核苷酸序列以增强mRNA表达和/或防止mRNA降解。在一些变化中，包括肿瘤特异性抗原的mRNA可以经修饰以增强肿瘤特异性抗原的呈递，从而激发免疫应答。例如，肿瘤特异性抗原可以是增强呈递的mRNA支架的部分。
一般而言，本文所述的mRNA疗法可以有利地包括编码两种或更多种另外免疫调节剂的mRNA；这些免疫调节剂可以彼此不同。如本文所用，免疫调节剂可以包括：检查点抑制剂(例如，检查点抑制剂蛋白，如抗PD-1抗体、抗PDL-1抗体、抗CTLA4抗体等)、免疫抑制拮抗剂、促炎剂或其组合。
检查点抑制剂的实例包括靶向和抑制一种或多种免疫系统检查点蛋白的蛋白质，例如抑制CTLA4、PD-1和PD-L1中的一种或多种的蛋白质。在一些变化中，检查点抑制剂是指抑制CTLA-4的蛋白质。例如，检查点抑制剂蛋白可以包括与CTLA-4结合的蛋白质，如抗体或抗体片段，例如抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、适体等。本文描述了抗CTLA-4蛋白的实例(例如抗体、scFv等)。编码免疫调节剂的mRNA编码：抗PD-L1抗体(如阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)或德瓦鲁单抗(durvalumab))；抗CTLA-4抗体(如替西木单抗(tremelimumab)或伊匹单抗(ipilimumab))；抗PD1抗体(如纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab))或其组合。例如，在一些变化中，编码免疫调节剂的mRNA编码抗CTLA-4结合剂。
免疫抑制拮抗剂可以包括阻止或限制免疫抑制、阻断免疫系统抑制途径的蛋白质。例如，针对转化生长因子β的拮抗剂(TGF-β-RII)是可以充当免疫抑制拮抗剂的细胞因子。促炎剂通常诱导自身炎症应答，并且可以引起局部炎症。例如，IL-12是促炎性分子。因此，如本文所用，免疫调节剂(免疫调节剂)可以包括白细胞介素(例如IL-2、IL-7、IL-12)和其他细胞因子(干扰素、GM-CSF)、趋化因子(CCL3、CCL26、CXCL-7)或类似物质。
特别地，本文描述了方法和组合物，其包括编码TGF-β拮抗剂(例如TGF-βRII)的mRNA。在一些变化中，编码免疫调节剂的mRNA编码单链白细胞介素-12(IL-12)。
在本文所述的这些方法和组合物中的任何一种中，mRNA治疗纳米颗粒可以包含免疫调节剂，如CpG寡脱氧核苷酸。如本文所述，免疫刺激剂可以与免疫调节剂不同。免疫刺激剂可以是指非蛋白免疫刺激剂，而本文提到的免疫调节剂是蛋白(例如基于肽)免疫调节剂，其可以编码为mRNA作为mRNA疫苗的部分。
当瘤内注射时，使用mRNA作为肿瘤特异性抗原和免疫调节剂，可以提供许多益处。例如，尽管mRNA如本文所述直接注射到体内(包括到肿瘤中)时，具有约3天的半衰期，提供了大量的转录，足以引起实质性和特异性的免疫应答，如本文更详细的描述。
本文所述的方法可以作为瘤内注射治疗的部分执行，其可以包括治疗期间内的一次或多次注射。例如，本文所述的方法可以包括重复瘤内注射治疗一次或多次(例如，约1x、约2x、约3x、约4x、约5x、约6x、约7x或更多次)，治疗之间具有约1至约30天的等待(例如，约1天至约3天、约1天至5天、约1天至7天、约1天至8天、约1天至10天、约1天至15天、约1天至20天、约1天至30天等的等待)。在一个实例中，等待时间可以为约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天；在上述范围中的任何一项内的其他适用值是可能的。单个治疗可以包括一次或多次注射，包括注射至单个肿瘤的一个或多个部位或多个肿瘤的一个或多个部位中。例如，本文所述方法可以包括注射至主要肿瘤中。注射可以是到肿瘤体和/或肿瘤周围组织中。在一些变化中，注射可以通过供养肿瘤的管(例如血管等)。
本文所述的方法可以包括注射到任何适当的肿瘤类型，包括与以下的一种或多种相关联的肿瘤或肿瘤前病变：急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓系白血病(AML)；肾上腺皮质癌；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤；非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤；皮肤基底细胞癌；胆管癌；膀胱癌；骨癌(包括尤文肉瘤和骨肉瘤以及恶性纤维组织细胞瘤)；脑肿瘤；乳腺癌；支气管肿瘤(肺癌)；伯基特淋巴瘤；类癌瘤(胃肠道)；心脏(心)肿瘤；宫颈癌；儿童颅外生殖细胞肿瘤；儿童横纹肌肉瘤(软组织肉瘤)；儿童血管肿瘤(软组织肉瘤)；胆管癌；脊索瘤；慢性淋巴细胞淋巴瘤(CLL)；慢性粒细胞白血病(CML)；慢性骨髓增生性赘生物；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；原位导管癌(DCIS)；胚胎性肿瘤，髓母细胞瘤；子宫内膜癌(子宫癌)；室管膜瘤；食道癌；食管神经母细胞瘤(头颈癌)；尤文肉瘤(骨癌)；尤文肉瘤(骨癌)；颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；眼部癌症；输卵管癌；骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；胆囊癌；胃部(胃)癌症；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质瘤(GIST)(软组织肉瘤)；生殖细胞肿瘤；生殖细胞肿瘤；妊娠滋养细胞疾病；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌；组织细胞增多，朗格汉斯细胞；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下咽癌(头颈癌)；眼内黑色素瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；胰腺神经内分泌肿瘤；Kaposi肉瘤(软组织肉瘤)；Kaposi肉瘤(软组织肉瘤)；肾(肾细胞)癌；朗格汉斯细胞组织细胞增多；喉癌(头颈癌)；白血病；唇和口腔癌(头颈癌)；肝癌；肺癌(非小细胞、小细胞、胸膜肺母细胞瘤和气管支气管肿瘤)；淋巴瘤；骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；成神经管细胞瘤和其他CNS胚胎性肿瘤；黑色素瘤；Merkel细胞癌(皮肤癌)；恶性间皮瘤；转移性癌症；隐匿性原发性转移性鳞颈癌(头颈癌)；口癌(头颈癌)；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物；蕈样肉芽肿(淋巴瘤)；骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增生性赘生物；慢性骨髓性白血病(CML)；急性髓系白血病(AML)；慢性骨髓增生性赘生物；鼻腔和副鼻窦癌(头颈癌)；鼻咽癌；鼻咽癌(头颈癌)；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；口部癌症，唇和口腔癌和口咽癌(头颈癌)；口咽癌；骨肉瘤(骨癌)；骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢生殖细胞肿瘤；胰腺癌；胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞瘤)；乳头瘤病(儿童喉)；副神经节瘤；副鼻窦和鼻腔癌(头颈癌)；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌(头颈癌)；嗜铬细胞瘤；垂体肿瘤；浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤(肺癌)；原发性CNS淋巴瘤；原发性腹膜癌；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；成视网膜细胞瘤；成视网膜细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤(软组织肉瘤)；唾液腺癌(头颈癌)；肉瘤；Sézary综合征(淋巴瘤)；皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；软组织肉瘤；皮肤鳞状细胞癌-参见皮肤癌；隐匿性原发性转移性鳞状细胞癌(头颈癌)；胃部(胃)癌；睾丸癌；喉癌(头颈癌)；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；气管支气管肿瘤(肺癌)；肾盂和输尿管移行细胞癌(肾(肾细胞)癌)；尿道癌；子宫癌；子宫内膜癌；子宫肉瘤；子宫肉瘤；阴道癌；和外阴癌。
例如，本文所述的方法可以是治疗淋巴瘤的方法。在一些变化中，本文所述的方法可以用于治疗宫颈癌，包括癌前适应症(例如，宫颈发育异常)。
在本文所述的任何方法中，该方法可以包括通过单一递送媒介物分子(例如，氨基脂化类肽递送媒介物)注射与编码肿瘤特异性抗原的mRNA一起包囊的编码一种或多种免疫调节剂的mRNA治疗纳米颗粒。在一个实例中，mRNA治疗纳米颗粒可以瘤内注射；替代地或另外地，mRNA治疗纳米颗粒可以全身或局部注射到肿瘤附近或肿瘤供养血管中。全身注射可以包括静脉内注射、皮下注射、腹腔注射、肌内注射等。
一般而言，本文所述的递送媒介物可以是任何适当的递送媒介物，包括例如两亲性纳米颗粒。特别地，两亲性纳米颗粒可以包括氨基脂化类肽递送媒介物。例如，这些递送媒介物可以是含脂质的两亲性递送媒介物，在循环过程中提供mRNA货物的包装和保护，避免免疫识别，并可以促进细胞摄取和释放。这些递送媒介物的实例可以在于2019年09月27日提交、标题为“LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS COMPRISING LIPIDATED CATIONICPEPTIDE COMPOUNDS FOR NUCLEIC ACID DELIVERY”的国际专利申请PCT/US19/53661，和于2019年09月27日提交、标题为“TERTIARY AMINO LIPIDATED CATIONIC PEPTIDES FORNUCLEIC ACID DELIVERY”的国际专利申请PCT/US19/53655中找到，其每篇引用其整体并入本文。可以使用多种类型的递送媒介物分子，并且每种类型均可以装载有(例如，可以包囊，等)如本文所述的编码一种或多种肿瘤特异性抗原的mRNA和编码一种或多种免疫调节剂的mRNA。
基于类肽的脂质配制剂可以将阳离子基团和脂质部分掺入到N-取代肽(即类肽)主链上。递送媒介物组分可以是市售的单分散、充分表征的化学实体。递送媒介物(DV)组分以受控比率与mRNA相对快速混合。DV组分暴露于水性溶液以及阳离子(+)脂质和阴离子(-)mRNA之间的相互作用可以触发颗粒形成。该过程可以通过使用微流控装置进行(以控制粒度和均匀度)。例如，mRNA可以溶解于酸性缓冲液(pH为约3-5)中，这可能有助于确保递送媒介物上负责其阳离子电荷的碱性官能团(如胺)的完全质子化。递送媒介物可以溶解于水性混溶性有机溶剂(例如乙醇)中，这促进在暴露于水性货物溶液时形成纳米大小的颗粒。混合后立即用中性缓冲液稳定溶液pH。所得配制剂可以在约4℃至约8℃下贮存数周或更长时间，而无明显功能损失。替代地，可以即时和在护理点执行配制过程。
本公开提供了治疗癌症的mRNA疗法。本公开的mRNA疗法特别适用于癌症的治疗，因为该技术提供了肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA的递送(例如，肿瘤学相关多肽，包括检查点抑制剂、促炎剂和免疫抑制拮抗剂等，其在免疫肿瘤学(“IO”)中有用)，允许在靶细胞内(例如，肿瘤中的靶细胞内)从头合成功能性蛋白质。这些治疗性mRNA可以具有修饰的核苷酸以最小化不必要的免疫激活(例如，与体内引入外来核酸相关联的先天性免疫应答)，并优化mRNA到蛋白质的翻译效率。本公开的示例性方面的特征是治疗性mRNA，其具有减少先天性免疫应答的核苷酸修饰和特别地在编码免疫调节多肽的治疗性mRNA的开放阅读框(ORF)内以增强蛋白质表达的序列优化的组合。
本文所述的mRNA治疗纳米颗粒组合物的特征是经由脂质纳米颗粒(LNP)递送系统递送编码肿瘤特异性抗原mRNA的mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA，并且特别是包囊在单一递送媒介物分子(例如，氨基脂化类肽递送媒介物)中。例如，本文所述的mRNA治疗技术的特征是经由氨基脂化类肽递送媒介物将肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA递送至肿瘤中。本文所述的配制剂可以具有降低的与体内施用相关联的免疫原性。
本公开的特征是用于治疗癌症的方法和组合物，特别是免疫治疗方法和组合物。在一些方面，本公开的特征是使用肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA治疗癌症的方法和组合物。
在一些方面，本公开提供了通过瘤内施用肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA(例如，用递送媒介物分子(例如，氨基脂化类肽递送媒介物)包囊在一起)来减小或降低有此需要的受试者的肿瘤大小或抑制肿瘤生长的方法。
肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA可以包含至少一种化学修饰的核苷。在一些实例中，至少一种化学修饰的核苷选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其组合。
在一些方面，将该组合物联合另一种癌症治疗施用于有此需要的受试者。肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA可以至少部分地具有选自下组的一种或多种活性：(a)引发树突状细胞；(b)促进树突状细胞成熟；(c)促进抗原递呈细胞细胞因子和/或趋化因子的产生；(d)扩增或维持Th17细胞；(e)增强Th1和/或Th9分化；和(f)(a)-(f)的任何组合。
一般而言，本文所述的任何mRNA纳米颗粒的治疗用途可以包括将mRNA治疗纳米颗粒，包括使用至少mRNA纳米颗粒，施用于有此需要的受试者。
本公开可以提供如本文所述包囊在相同纳米颗粒(例如脂质纳米颗粒，如氨基脂化类肽递送媒介物)中的任何前述或先前组合物(例如肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA)在制造用于治疗或延迟个体的癌症进展的药物中的用途，其中药物包含组合物或脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中治疗包括药物的施用和任选的药学上可接受的载体。
在一些方面，本公开提供了试剂盒，其包括包含如本文所述由递送媒介物分子(例如氨基脂化类肽递送媒介物)包囊的肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA的多核苷酸(例如mRNA)组合物和任选的药学上可接受的载体的容器，以及包含用于治疗或延迟个体的癌症进展的组合物的瘤内施用(例如注射)的说明的包装说明书。在一些方面，药品说明书进一步包含用于治疗或延迟个体的癌症进展的通过瘤内注射联合另一个部位注射(例如，全身注射)的组合物的施用的说明。
在其他方面，本公开提供了试剂盒，其包括包含本文所述的任何前述或先前组合物和任选的药学上可接受的载体的药物，以及包含药物单独或联合在第二(例如全身)位置的注射的药物的瘤内施用的说明的包装说明书，以及任选的药学上可接受的载体，其用于治疗或延迟个体的癌症进展。在一些方面，该试剂盒进一步包括包装说明书，其包含用于治疗或延迟个体的癌症进展的药物的施用的说明。
本公开的其他方面涉及组合物，其包含本文所述的在单个脂质纳米颗粒中(例如氨基脂化类肽递送媒介物)中包囊在一起的任何前述或先前的肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA，以及任选的药学上可接受的载体，用于治疗或延缓个体癌症进展，其中治疗包括瘤内施用在相同的脂质纳米颗粒中的肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA联合第二组合物，其中第二组合物包括编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA和递送媒介物分子(例如一种或多种氨基脂化类肽递送媒介物)。编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA可以是检查点抑制剂多肽(例如抗PD-1抗体、抗PDL-1抗体、抗CTLA4抗体或其组合)和任选的药学上可接受的载体。在一些方面，检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4或其组合。在一个实例中，检查点抑制剂多肽是抗体或编码抗体的多核苷酸。例如，该抗体是特异性结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，及其组合。在一个实例中，抗PD-L1抗体是阿替利珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗。在一个实例中，抗CTLA-4抗体是替西木单抗或伊匹单抗。在一个实例中，抗PD1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
mRNA(例如，肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA)包含至少一种化学修饰。在一个实例中，化学修饰选自下组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧尿苷和2’-O-甲基尿苷。在一些方面，mRNA包含至少一种化学修饰的核苷，其中至少一种化学修饰的核苷选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶及其组合。在一些方面，至少一种化学修饰的核苷是N1-甲基假尿苷。在一些方面，多核苷酸是完全修饰的N1-甲基假尿苷mRNA。本文公开了其他化学修饰。
该组合物可以在脂质纳米颗粒载体中配制，并且特别是在氨基脂化类肽递送媒介物中。例如，包含肿瘤特异性抗原mRNA和编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA的组合物，如本文所述，可以配制成使得组合物中的所有多核苷酸由相同的脂质纳米颗粒载体携带。可以选择肿瘤特异性抗原mRNA与编码免疫调节剂多肽的一种或多种mRNA的比率为，例如约1:1(例如，近似等摩尔)，或者可以包含相对于编码免疫调节剂多肽的mRNA过量的肿瘤特异性抗原mRNA(例如，在>约1:1和约1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1等之间或肿瘤特异性抗原mRNA:编码免疫调节剂多肽的mRNA)。替代地，，组合物可以包含相对于肿瘤特异性抗原mRNA过量的编码免疫调节剂多肽的mRNA(例如，编码免疫调节剂多肽的mRNA：肿瘤特异性抗原mRNA在>约1:1和约1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1等之间)。在使用多种免疫调节剂多肽(例如，多于一种编码免疫调节剂多肽的mRNA)的变化中，所有组分可以近似等摩尔(例如，相对于肿瘤特异性抗原mRNA，为约1:1:1或约为1:1:1:1等)或一种或多种组分可以过量(例如，肿瘤特异性抗原mRNA可以过量，替代地，编码一种或多种免疫调节剂多肽的mRNA可以过量)。
在另一个方面，本文所述的方法包括在有此需要的受试者中减小或减低肿瘤尺寸或抑制肿瘤生长的方法，其包括向受试者施用本文所述的任何mRNA治疗纳米颗粒组合物。一般而言，该组合物经瘤内施用。在另一个实例中，组合物(或第二组合物，其包含编码一种或多种免疫调节剂多肽的mRNA和氨基脂化类肽递送媒介物)可以区域性施用(例如进入肿瘤生长的区域，例如腹膜腔内的肿瘤可以腹腔内施用)和/或全身施用。在一个实例中，肿瘤是淋巴瘤。在其他一些实例中，肿瘤是肝细胞癌。在另一个实例中，肿瘤是卵巢肿瘤、结肠肿瘤或播散性胃肿瘤。本文公开了其他适用于治疗的肿瘤和癌症。
例如，本文描述了方法，该方法包括：瘤内注射mRNA纳米颗粒，其包含：(i)编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA；和(iii)递送媒介物分子，其中第一mRNA和第二mRNA由递送媒介物分子包囊在一起。
肿瘤特异性抗原可以包括病毒抗原。病毒抗原可以与人乳头瘤病毒(HPV)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、Epstein–Barr病毒(EBV)、Merkel细胞多瘤病毒、人巨细胞病毒(CMV)或其任何组合相关联。肿瘤特异性抗原可以包括新表位。肿瘤特异性抗原可以包括患者特异性抗原。肿瘤特异性抗原可以包括多种患者特异性抗原。肿瘤特异性抗原可以包括共享肿瘤抗原。
递送媒介物分子可以包括氨基脂化类肽。mRNA纳米颗粒可以进一步包含编码第二免疫调节剂的第三mRNA。mRNA纳米颗粒可以进一步包含免疫调节siRNA。
编码免疫调节剂的第二mRNA可以编码：检查点抑制剂、免疫抑制拮抗剂、促炎剂或其任何组合。编码免疫调节剂的第二mRNA可以编码促炎性细胞因子。促炎细胞因子可以是以下之一：(IL)、IL-1、IL-2、IL-12、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α。促炎细胞因子可以是白细胞介素-12(IL-12)。
编码免疫调节剂的第二mRNA可以编码肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)。编码免疫调节剂的第二mRNA可以编码抗CTLA-4。编码免疫调节剂的第二mRNA可以编码TGF-β拮抗剂。
mRNA纳米颗粒可以进一步包含免疫刺激剂。mRNA纳米颗粒可以进一步包括包含含有CpG寡脱氧核苷酸的免疫刺激剂。这些方法中的任何一种均可以进一步包括重复瘤内注射一次或多次，两次注射之间具有等待，其中等待在约1至14天之间。
编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA和编码免疫调节剂的第二mRNA可以在单个mRNA链上。该方法可以是治疗婚患有淋巴瘤的患者的方法。该方法可以是治疗患有宫颈癌的患者的方法。
本文还描述了方法，该方法包括：将mRNA纳米颗粒瘤内注射到有此需要的患者体内，mRNA纳米颗粒包含：(i)编码宫颈癌特异性抗原的第一mRNA；(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA，该免疫调节剂包括：促炎性细胞因子；和(iii)递送媒介物分子，其中第一mRNA和第二mRNA由递送媒介物分子包囊在一起。
本文还描述了mRNA治疗纳米颗粒，纳米颗粒包含：(i)编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA；和(iii)递送媒介物分子，其中第一mRNA和第二mRNA由递送媒介物分子包囊在一起。
mRNA治疗纳米颗粒，该纳米颗粒可以包含：(i)编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA，其与SEQ ID NO:5的核苷酸序列至少约80％相同；和(iii)递送媒介物分子，其包含氨基脂化类肽递送媒介物，其中第一mRNA和第二mRNA由递送媒介物分子包囊在一起。
在一些实例中，mRNA治疗纳米颗粒，该纳米颗粒可以包含：(i)编码宫颈癌特异性抗原的第一mRNA；(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA，该免疫调节剂包括：促炎性细胞因子；和(iii)递送媒介物分子，其中第一mRNA和第二mRNA由递送媒介物分子包囊在一起。
递送媒介物分子可以包括氨基脂化类肽。第一mRNA可以编码患者特异性抗原。第一mRNA可以编码多种患者特异性抗原。第一mRNA可以编码共享肿瘤抗原。第二mRNA可以编码：检查点抑制剂、免疫抑制拮抗剂、促炎剂或其任何组合。第二mRNA可以编码抗CTLA-4。第二mRNA可以编码抗CTLA-4，该第二mRNA与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列至少约80％相同。
这些mRNA治疗纳米颗粒中的任何一种均可以进一步包含编码肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)的第三mRNA。
mRNA治疗纳米颗粒可以进一步包含编码TGF-β拮抗剂的第三mRNA，其与SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:9的核苷酸序列至少约80％相同。第二mRNA可以编码白细胞介素-12，该第二mRNA与SEQ ID NO:5的核苷酸序列至少约80％相同。mRNA治疗纳米颗粒可以进一步包含免疫刺激剂。免疫刺激剂可以包括CpG寡脱氧核苷酸。
在mRNA治疗纳米颗粒中的任何一种中，肿瘤特异性抗原和免疫调节剂的各自开放阅读框(ORF)可以是单个mRNA链的部分。肿瘤特异性抗原和免疫调节剂的各自开放阅读框(ORF)可以是不同mRNA链的部分。
本文还描述了方法，该方法包含：在微流控路径装置中从模板执行编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA的体外转录；纯化第一mRNA；在微流控路径装置中执行编码第一免疫调节剂的第二mRNA的体外转录；在微流控路径装置中纯化第二mRNA；在微流控路径装置中将第一mRNA和第二mRNA与递送媒介物分子包囊在一起以形成mRNA治疗纳米颗粒。
例如，本文描述了方法，该方法包括：在微流控路径装置的第一室中从模板执行编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA的体外转录；纯化第一mRNA；在微流控路径装置的第二室中执行编码第一免疫调节剂的第二mRNA的体外转录；在微流控路径装置中纯化第二mRNA；在微流控路径装置的第三室中执行编码第二免疫调节剂的第三mRNA的体外转录；在微流控路径装置中纯化第三mRNA；在微流控路径装置中将第一mRNA、第二mRNA和第三mRNA与递送媒介物分子包囊在一起以形成mRNA治疗纳米颗粒。
纯化第一mRNA、纯化第二mRNA和纯化第三mRNA中的每一项可以进一步包括在微流控路径装置上的一个或多个反应器中纯化。
在一个或多个反应器中纯化可以包括在一个或多个反应器中使用纤维素除去双链mRNA。微流控路径装置可以包括闭路系统以自动且连续地执行第一mRNA和第二mRNA中的每一个的体外转录，纯化第一mRNA和第二mRNA，并将第一mRNA和第二mRNA与递送媒介物分子组合。闭路系统可以气动控制执行第一和第二mRNA的体外转录，纯化第一和第二mRNA，并将第一和第二mRNA与递送媒介物分子组合。
闭路系统可以气动控制：执行第一mRNA和第二mRNA的体外转录，纯化第一mRNA和第二mRNA，并且通过在微流控路径装置内偏转一个或多个膜，将第一mRNA和第二mRNA与递送媒介物分子组合。
闭路系统可以自动且连续地：在总共少于约5天的时间内，执行治疗性mRNA的体外转录，纯化治疗性mRNA，并将mRNA与递送媒介物组合。该方法可以在医疗保健单位执行。将mRNA与递送媒介物组合可以进一步包括在微流控路径装置中透析mRNA治疗纳米颗粒。这些方法中的任何一种均可以包括将mRNA治疗纳米颗粒集中在微流控路径装置上。
递送媒介物分子可以包括两亲性分子。两亲性分子可以包括氨基脂化类肽。第一mRNA可以编码肿瘤特异性抗原，包括编码患者特异性抗原的mRNA。mRNA可以编码多种患者特异性抗原。第二mRNA可以编码免疫调节剂：检查点抑制剂、免疫抑制拮抗剂、促炎剂或其任何组合。第二mRNA可以编码免疫调节剂编码抗CTLA-4。第二mRNA可以编码免疫调节剂编码TGF-β拮抗剂。第二mRNA可以编码免疫调节剂编码单链白细胞介素-12(IL-12)。
这些方法中的任何一种均可以包括将第一mRNA和第二mRNA组合，其包括在微流控路径装置中添加免疫刺激剂。免疫刺激剂可以CpG寡脱氧核苷酸。
本文还描述了微流控路径装置，其包括：夹在第一表面和第二表面之间的弹性层；在第一表面和第二表面之间形成的模板体外转录(IVT)室，其中弹性层的一部分将模板IVT室分隔为第二表面中的流体接触侧和第一表面中的压力接收侧，其中模板IVT室的流体接触侧与编码肿瘤特异性抗原的mRNA模板的源流体连通；与模板IVT室的流体接触侧流体连通的第一反应器，第一反应器包括第一反应器内的双链mRNA结合材料以除去双链mRNA；与第一反应器、与第一免疫调节剂mRNA的源，并且与耦合至递送媒介物分子的源的递送媒介物端口流体连通，以将第一mRNA和第二mRNA与递送媒介物分子包囊在一起以形成mRNA治疗纳米颗粒的混合组件；以及各自从一个或多个压力端口延伸的多个压力通道，通过第一表面和弹性层，进入第二表面并通过弹性层返回到第一表面，其中多个压力通道的每个压力通道与模板IVT腔的压力接收侧流体连接，进一步地其中模板IVT腔的流体接触侧的体积可以通过从压力端口中的一个或多个中施加压力来来调节，以驱动流体通过微流控路径装置以形成mRNA治疗纳米颗粒。
本文还描述了微流控路径装置，其包括：夹在第一表面和第二表面之间的弹性层；在第一表面和第二表面之间形成的模板体外转录(IVT)室，其中弹性层的一部分将模板IVT室分隔为第二表面中的流体接触侧和第一表面中的压力接收侧，其中模板IVT室的流体接触侧与编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA模板的源流体连通；与模板IVT室的流体接触侧流体连通的第一反应器，第一反应器包括第一反应器内的双链mRNA结合材料以除去双链mRNA；在第一表面和第二表面之间形成的第一免疫调节剂IVT室，其中弹性层的一部分将第一免疫调节剂IVT室分隔为第二表面中的流体接触侧和第一表面中的压力接收侧，其中第一免疫调节剂IVT室的流体接触侧与编码第一免疫调节剂的第一免疫调节剂模板的源流体连通；与第一免疫调节剂IVT室的流体接触侧流体连通的第二反应器，第二反应器包括在第一反应器内的双链mRNA结合材料以除去双链mRNA；与第一反应器和第二反应器流体连通的第一混合室；与第一混合室的输出和耦合至递送媒介物分子的源的递送媒介物端口流体连通，以将第一mRNA和第二mRNA与递送媒介物分子包囊在一起以形成mRNA治疗纳米颗粒的第二混合室；各自从一个或多个压力端口延伸的多个压力通道，通过第一表面和弹性层，进入第二表面并通过弹性层返回进入第一表面，其中多个压力通道的每个压力通道与模板IVT室和第一免疫调节剂IVT室的压力接收侧流体连接，进一步地其中模板IVT室的流体接触侧和第一免疫调节剂IVT室的流体接触侧的体积可以通过从压力端口中的一个或多个中施加压力来调节。
本文还描述了方法，该方法包括：注射mRNA纳米颗粒，其包含：(ii)编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA；和(iii)递送媒介物分子，其中第一mRNA和第二mRNA由递送媒介物分子包囊在一起。
例如，方法可以包括：将mRNA纳米颗粒注射到有此需要的患者中，mRNA纳米颗粒包含：(i)编码宫颈癌特异性抗原的第一mRNA；(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA，该免疫调节剂包括：促炎性细胞因子；和(iii)递送媒介物分子，其中第一mRNA和第二mRNA由递送媒介物分子包囊在一起。注射不限于瘤内注射，并且可以包括肌内注射等。
应当认识到，上述概念和下文更详细讨论的其他概念的所有组合(前提是这些概念并不相互矛盾)被视为本文公开的发明主题的一部分，并且可以用于实现本文所述的益处。
附图简述
通过参考以下陈述说明性实例的详细描述和其附图，将获得对本文所述方法和装置的特征和优点的更好的理解：
图1A是可以用作如本文所述的mRNA治疗纳米颗粒的部分的mRNA的一个实例的示意性图示。
图1B示意性例示了用于形成如本文所述的mRNA治疗纳米颗粒的方法的一个实例。
图1C示意性例示了包括包围肿瘤特异性抗原和多个免疫调节剂mRNA的多个mRNA开放阅读框的mRNA的一个实例。
图2是显示本文所述的mRNA疫苗在癌症治疗中的改善功效的图。如本文所指示处理同系小鼠癌症模型。图2显示了阴性对照(G1)、皮下注射在氨基脂化类肽递送媒介物中的肿瘤特异性抗原的mRNA同时瘤内注射编码免疫调节剂(抗CTLA-4)的mRNA(G5)、瘤内注射包含在氨基脂化类肽递送媒介物中的肿瘤特异性抗原的mRNA和编码免疫调节剂(抗CTLA-4)的mRNA的mRNA疫苗(G6)，以及包含在氨基脂化类肽递送媒介物中的肿瘤特异性抗原的mRNA和编码两种免疫调节剂(抗CTLA-4和TGF-β)的mRNA的mRNA疫苗(G7)的KaplanMeier生存曲线。
图3是显示本文所述的另一种mRNA疫苗在癌症治疗中的改善功效的图。图3显示了小鼠肿瘤模型的KaplanMeier生存曲线，比较了阴性对照(G2)，皮下注射在氨基脂化类肽递送中的肿瘤特异性抗原(m4)的mRNA(G7)，瘤内注射包含在氨基脂化类肽递送媒介物中的肿瘤特异性抗原(m4)的mRNA和编码免疫调节剂(抗CTLA-4)的mRNA的mRNA疫苗(G9)，和瘤内注射包含在氨基脂化类肽递送媒介物中的肿瘤特异性抗原(m4)的mRNA和编码三种免疫调节剂(抗CTLA-4和TGF-β以及单链IL-12，G10)的mRNA疫苗。
图4是显示了如本文所述的mRNA疫苗在小鼠癌症模型治疗中的改善功效的另一个实例，比较了对照(1)与瘤内注射包含在氨基脂化类肽递送媒介物中的肿瘤特异性抗原的mRNA和编码免疫调节剂(抗CTLA-4)的mRNA的mRNA疫苗(6)。
图5显示了如本文所述的mRNA疫苗接种的改善功效，显示了在淋巴瘤动物模型中(与阴性对照相比，n＝6)瘤内注射包含氨基脂化类肽递送媒介物中的肿瘤特异性抗原的mRNA和编码免疫调节剂(抗CTLA-4)的mRNA的mRNA疫苗(n＝6)在改善生存中的功效。
图6是显示在淋巴瘤动物模型中皮下注射mRNA疫苗对生存的作用的图(与阴性对照相比)。与对照动物相比，皮下注射mRNA疫苗(G3，包含编码免疫调节剂的mRNA)与氨基脂化类肽递送媒介物显示肿瘤体积减小(约50％)。
图7是显示在淋巴瘤动物模型中瘤内注射mRNA疫苗(与图6中使用的类似)对生存的作用的图(与阴性对照相比)。与对照动物相比，皮下注射mRNA疫苗(G7，包含编码肿瘤特异性抗原和两种免疫调节剂抗CTLA-4和TGF-β-PLD1的mRNA)与氨基脂化类肽载体显示肿瘤体积大幅减小(大于约80％)。
图8A和8B说明，在本文所述的mRNA疫苗接种后作为长期生存者的受试者(来自小鼠动物模型)发展强烈和持久的CD8+效应T细胞癌症免疫，并对进一步的肿瘤攻击有抗性。图8A显示了使用3x105脾细胞/孔和用作刺激物的肿瘤细胞(EG.7，1x106)运行的EliSpot测定的实例。PMA/离子霉素用作非特异性刺激物。分析前温育细胞18小时。图8B是显示该测定的定量的图，计数肿瘤抗原特异性CD8+效应T细胞。将OTI(阳性对照)与阴性对照(#596)和2只存活小鼠(小鼠#662和小鼠#670)进行比较。
图9是显示了在淋巴瘤肿瘤模型中测试的测试组的表(表1)，如本文所述。
图10A-10G例示了第11天在小鼠淋巴瘤肿瘤模型中肌内注射的不同纳米颗粒组合物(如图9所述)的结果。
图11A-11F例示了第28天在小鼠淋巴瘤肿瘤模型中肌内注射的不同纳米颗粒组合物(如图9所述)的结果。
图12A-12G例示了第11天在小鼠淋巴瘤肿瘤模型中瘤内注射的不同纳米颗粒组合物(如图9所述)的结果。
图13A-13F例示了第28天在小鼠淋巴瘤肿瘤模型中瘤内注射的不同纳米颗粒组合物(如图9所述)的结果。
图14是显示了用不同纳米颗粒组合物肌内注射的小鼠淋巴瘤肿瘤模型中的生存概率的图。
图15是显示了用不同纳米颗粒组合物瘤内注射的小鼠淋巴瘤肿瘤模型中的生存概率的图。
图16例示了用对照(未处理)PBS溶液或用肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫调节剂(CpG)肌内注射的小鼠中淋巴瘤的肿瘤体积随时间的变化。
图17例示了用对照溶液(PBS)或用含有肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA加免疫调节剂(IL-12)mRNA的纳米颗粒组合物肌内注射的小鼠中淋巴瘤的肿瘤体积随时间的变化。
图18例示了用肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫调节剂(CpG)或用单独的免疫调节剂(CpG)(无肿瘤抗原mRNA)肌内注射的小鼠中淋巴瘤的肿瘤体积随时间的变化。
图19例示了用在相同递送媒介物中的肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA加免疫调节剂(IL-12)mRNA的纳米颗粒组合物或用单独的免疫调节剂(IL-12)mRNA(无肿瘤抗原mRNA)肌内注射的小鼠中淋巴瘤的肿瘤体积随时间的变化。
图20例示了用肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫调节剂(CpG)的纳米颗粒组合物或用单独的免疫调节剂(CpG)(无肿瘤抗原mRNA)肌内注射的小鼠中淋巴瘤的肿瘤体积随时间的变化。
图21是比较了通过瘤内注射(“近端”肿瘤)肿瘤抗原和免疫调节剂(例如IL-12)的纳米颗粒组合物来处理的肿瘤与未瘤内注射纳米颗粒组合物的来自相同动物的肿瘤(“远端”肿瘤)之间肿瘤体积随时间变化的图。
图22是比较了通过瘤内注射(“近端”肿瘤)仅免疫调节剂(例如IL-12)的纳米颗粒组合物来处理的肿瘤与未瘤内注射纳米颗粒组合物的来自相同动物的肿瘤(“远端”肿瘤)之间肿瘤体积随时间变化的图。
图23是比较了通过瘤内注射(“近端”肿瘤)肿瘤抗原和免疫调节剂(例如CpG)的纳米颗粒组合物来处理的肿瘤与未瘤内注射纳米颗粒组合物的来自相同动物的肿瘤(“远端”肿瘤)之间肿瘤体积随时间变化的图。
图24是比较了通过瘤内注射(“近端”肿瘤)仅免疫调节剂(例如CpG)的纳米颗粒组合物来处理的肿瘤与未瘤内注射纳米颗粒组合物的来自相同动物的肿瘤(“远端”肿瘤)之间肿瘤体积随时间变化的图。
图25是汇总EG.7肿瘤的响应率的表(表2)。
图26是例示了各种免疫调节剂(例如效应器)对MC38肿瘤细胞的肿瘤体积的作用的图。
图27是汇总用如本文所述的各种免疫调节剂处理的肿瘤中CD8 T细胞的频率的图。
图28是用如本文所述的各种免疫调节剂处理后抗原呈递细胞的数量的图。
图29例示了可以用于检查如本文所述的纳米颗粒组合物的作用的研究时间线的一个实例。
图30A-30F各自例示了在C3.43肿瘤上用本文所述的纳米颗粒组合物之一进行瘤内注射后肿瘤生长的时间过程。图30A显示了肿瘤特异性抗原(HPV16 E6E7)mRNA与免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA的纳米颗粒组合物的作用。图30B显示了肿瘤特异性抗原(HPV16)mRNA、第一免疫调节剂(TNFSF14)mRNA和第二免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA的纳米颗粒组合物的作用。图30C显示了肿瘤特异性抗原(HPV16)mRNA和免疫刺激剂(CpG)的纳米颗粒组合物的作用。图30D显示了单独的免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA(不含肿瘤抗原)的纳米颗粒组合物的作用。图30E显示了第一免疫调节剂(TNFSF14)mRNA和第二免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA(不含肿瘤抗原)的纳米颗粒组合物的作用。图30F显示了单独的免疫刺激剂(CpG)(不含肿瘤抗原)的作用。
图31A-31B显示了在C3.43肿瘤上用本文所述的纳米颗粒组合物之一进行肌内注射后肿瘤生长的时间过程。图31A显示了肿瘤特异性抗原(HPV16E6E7)mRNA与免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA的纳米颗粒组合物的作用。图31B显示对照(未处理)作用。
图32是用如本文所述的纳米颗粒组合物处理(例如，瘤内或肌内注射)后具有C3.43肿瘤的小鼠的生存概率的图。
图33是显示瘤内注射如本文所述的某些纳米颗粒组合物导致经处理动物循环中CD3+/CD8+/四聚体+细胞的百分比增加的图。
图34A例示了如本文所述的微流控路径装置控制系统的一个实例。
图34B示意性例示了可以如本文所述使用的微流控路径装置控制系统的实例。
图35A-35C例示了如本文所述的微流控路径装置的实例。
图35是通过如本文所述的微流控路径装置的一个实例的一部分的剖面图。
发明详述
本文所述的方法和组合物为疾病或病症(包括癌症)的治疗提供了改进的疗法。本文所述的疗法可以包括编码肿瘤特异性抗原的一种或多种多核苷酸和编码免疫调节剂的一种或多核苷酸。多核苷酸可以是RNA，如mRNA。例如，本文描述了可以用于治疗的mRNA疗法、形成其的方法和使用其的方法。本文所述的任何mRNA疗法均可以是mRNA疫苗。这些方法可以包括瘤内注射包含mRNA治疗纳米颗粒的mRNA治疗纳米颗粒，各自包含编码肿瘤特异性抗原的mRNA以及编码一种或多种免疫调节剂的mRNA，其中肿瘤特异性抗原的mRNA和一种或多种免疫调节剂的mRNA用单一递送媒介物分子，如(但不限于)氨基脂化类肽递送媒介物包囊在一起。肿瘤特异性抗原可能针对患者特异性抗原和/或共享肿瘤抗原。在一个实例中，这些改进的疫苗接种可能导致持久的肿瘤消退和长期CD8+T细胞介导的癌症免疫。尽管单独的mRNA疫苗与一种或多种氨基脂化类肽媒介物可能具有治疗作用，但添加免疫调节分子增强治疗功效。
如本文更详细的描述，尽管针对肿瘤特异性抗原的疫苗接种可以导致肿瘤消退，但包囊在氨基脂化类肽递送媒介物内的包含肿瘤特异性抗原的mRNA的mRNA治疗纳米颗粒，加上一种或多种mRNA编码的免疫调节分子(例如，检查点抑制剂抗体)的单次瘤内注射，可以改善生存。免疫调节分子的实例可以包括但不限于检查点抑制剂抗体，如编码为mRNA的抗CTLA-4试剂。
纳入另外的mRNA编码的免疫调节剂可能改善长期生存。这在下文中进行了详细描述(参见，例如图2-7)用于同系小鼠癌症模型。这些实验中使用的mRNA编码的免疫调节剂包括TGF-β拮抗剂和单链白细胞介素-12，在一些情况下还有检查点抑制剂(例如抗CTLA-4)。在这些实验中，长期存活的小鼠发展出强大且持久的CD8+效应T细胞癌症免疫，并对进一步的肿瘤攻击有抗性。
一般而言，基于mRNA的肿瘤疫苗接种联合基于mRNA的效应分子可以针对患者特异性肿瘤抗原，如使用一个或多个新表位进行。例如，可以通过对肿瘤(例如，在一个实例中，MC38肿瘤)进行测序来鉴定新表位，并因此新表位是肿瘤特异性抗原。可以使用任何患者特异性癌症新表位。
基于mRNA的肿瘤疫苗接种联合基于mRNA的效应分子(如免疫调节剂)可以针对共享抗原，如在不同患者的肿瘤中过表达和HLA呈递的抗原进行。本文所述的mRNA疫苗可以使用一种或多种氨基脂化类肽配制成纳米颗粒。本文的“纳米颗粒”可以是指具有纳米范围内的大小的颗粒，指其最大尺寸。纳米颗粒可能具有任何合适的几何形状，包括球体、椭圆、立方体，或规则或不规则的几何形状。根据几何构造，尺寸可以是指长度、宽度、直径等。纳米颗粒可以具有小于约1000nm-例如，小于约500nm、约300nm、约200nm、约100nm、约80nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm或更小的大小。在一个实例中，纳米颗粒具有在约1nm和约1000nm之间-例如，在约5nm和约800nm之间、约10nm和约500nm之间、约15nm和约300nm之间、约20nm和约200nm之间、约30nm和约100nm之间、约40nm和约80nm之间、约50nm和约70nm之间等的大小。在一个实例中，纳米颗粒具有在约40nm到约70nm之间的大小。其他合适的粒度是有可能的。氨基脂化类肽可能充当递送媒介物，并联合mRNA疫苗可能在肿瘤微环境中提供高表达。因此，本文所述的mRNA疫苗(包括编码一种或多种肿瘤特异性抗原的mRNA和编码一种或多种免疫调节剂的mRNA)可以共同配制成单个纳米颗粒，导致令人惊讶的高表达水平和高疫苗接种功效。这些治疗中的任何一种均可以包括将mRNA疫苗配制成纳米颗粒，具有针对高疫苗接种功效优化的递送媒介物(例如，氨基脂化类肽)。如所提及，本文所述的治疗性mRNA可以包括肿瘤特异性抗原mRNA和一种或多种免疫调节剂mRNA；特定的免疫调节剂mRNA可以与肿瘤特异性抗原mRNA一起包囊在相同的递送媒介物中。
一般而言，mRNA疫苗中包含的mRNA可能在帮助递呈抗原的构建体或支架中编码。例如，图1A示意性例示了通用mRNA支架的一个实例。在图1A中，mRNA由从5’至3’的不同顺式作用元件组成：帽结构、5’UTR、编码区(其可以潜在包括修饰的核苷酸)、3’UTR和poly-A尾。在这个实例中，mRNA体外转录的模板由顺式作用的结构元件组成，即从5’到3’末端：(i)帽结构，(ii)5’非翻译区(UTR)，(iii)编码(例如，优化密码子)序列，(iv)3’UTR和(v)一段重复的腺嘌呤核苷酸(polyA尾)。可以优化帽结构和poly-A尾长度。这些顺式作用结构元件可以针对抗原呈递进行优化。poly-A尾和帽结构对于mRNA的高效翻译和稳定mRNA抵抗衰变非常重要，而UTR在一些情况下控制mRNA的翻译和半衰期。一般生产特异性，如纯度和修饰核苷(如5’甲氧基尿苷，5moU)的掺入，可能改变mRNA本身的免疫原性，并可以显著增加翻译效率。图1C显示了其中mRNA链包括肿瘤特异性抗原mRNA(例如，一个或多个拷贝，和/或一个或多个肿瘤特异性抗原)和一种或多种免疫调节剂mRNAORF的实例。
图1B示意性例示了提高mRNA疫苗治疗癌症功效的方法的一个实例。在图1B中，该方法包括瘤内注射编码肿瘤特异性抗原(例如，在增强抗原呈递的支架中)的mRNA疫苗和编码两种或更多种免疫调节剂(例如，第一免疫调节剂mRNA和第二免疫调节剂mRNA)的mRNA，由单一递送媒介物分子包囊在一起。例如，两种(或更多种)免疫调节剂中的至少一种可能是检查点抑制剂(例如，抗CTLA-4mRNA)。mRNA疫苗和免疫调节剂用递送媒介物，例如，可能是氨基脂化类肽递送媒介物包囊在一起。
图1C显示了替代实例，其中单个mRNA链包括肿瘤特异性mRNA和编码一种或多种免疫调节剂(例如，第一免疫调节剂、第二免疫调节剂、第三免疫调节剂)的mRNA，因此mRNA开放阅读框(ORF)编码肿瘤特异性mRNA和免疫调节剂的mRNA。该单个mRNA链可以包囊在递送媒介物分子内。
用刺激免疫应答的物质预防或治疗疾病一般称为免疫疗法。免疫疗法，有时也称为免疫肿瘤学，引入不靶向肿瘤而是靶向宿主免疫系统的疗法，。这些疗法可能具有独特的药理学响应特征，并因此代表可能治愈多种不同类型癌症的疗法。在一个实例中，肺、肾、膀胱和皮肤的癌症，与特别是黑色素瘤一样，在生存或肿瘤响应方面从免疫肿瘤学治疗中获得显著功效。免疫疗法的特征通常是用被称为检查点抑制剂抗体的生物药物的检查点抑制剂治疗。
本公开的特征是用于治疗癌症的方法和组合物，特别是用于改进或增强免疫治疗方法和组合物的方法和组合物。在一些方面，本公开的特征是使用用单一递送媒介物分子包囊的编码(1)肿瘤特异性抗原，包括特别是患者特异性肿瘤抗原(或多种抗原)的两种或更多种多核苷酸(例如，mRNA)和(2)编码一种或多种免疫调节剂的一种或多种mRNA(例如，在一些变化中，包括包含检查点抑制剂多肽的多肽)，用于治疗或预防癌症的方法和组合物。在一些方面，本公开提供了包含用单一递送媒介物分子包囊在一起的编码患者特异性肿瘤抗原的多核苷酸和两种或更多种免疫调节剂的免疫调节组合物的增强。在其他方面，本公开提供了包含用单一递送媒介物分子包囊在一起的编码患者特异性肿瘤抗原的多核苷酸和两种或更多种免疫调节剂(例如，抗CTLA-4和一种或两种：TGF-β拮抗剂和单链白介素-12)的免疫调节组合物。mRNA疫苗可以包括任何适当和有效比率的这些组分的混合物。
在一些方面，本公开涉及使用用单一递送媒介物分子包囊在一起的患者特异性肿瘤抗原的mRNA和编码两种或更多种免疫调节剂的mRNA治疗癌症的方法。在不受理论约束的情况下，施用和特异性瘤内施用这些mRNA疫苗可能刺激，例如T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞。在一些方面，本文公开的免疫治疗方法可以(1)转化肿瘤微环境(TME)以优化免疫原性，和/或(2)增强T细胞应答以引起远位控制和抗癌记忆。
本公开的其他方面的特征是，通过向受试者施用有效量的组合(包含用单一递送媒介物分子包囊在一起的编码患者特异性肿瘤抗原的mRNA和编码两种或更多种免疫调节剂的mRNA)来在有此需要的受试者中减小或减低肿瘤大小或抑制肿瘤生长的组合物和方法。例如，递送媒介物分子可以是氨基脂化肽，其可能包括三级氨基脂化阳离子肽，如，于2019年09月27日提交、标题为“LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS COMPRISINGLIPIDATED CATIONIC PEPTIDE COMPOUNDS FOR NUCLEIC ACID DELIVERY”的PCT申请PCT/US19/53661，以及于2019年09月27日提交、标题为“TERTIARY AMINO LIPIDATED CATIONICPEPTIDES FOR NUCLEICACID DELIVERY”的PCT/US19/53655中描述的那些的任何一种；这两种申请均通过引用并入本文。
这些递送媒介物分子可能包含另外的脂质/组分。例如，氨基脂化肽可以包括一种或多种磷脂，例如1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MSPC)或二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。脂质组合物还可以包括季胺化合物，如N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基硫酸盐(DOTAP)。
本文提供的标题不是本公开的各个方面或方面的限制，这可以参考整个说明书来定义。因此，下文紧接定义的术语通过整体参考说明书得到更全面的定义。在详细描述本公开之前，应理解本公开不限于具体组合物或过程步骤，因此可以变化。
I.定义
为了更容易理解本公开，首先定义了某些术语。如本申请中所用，除非本文另有明确规定，以下术语中的每一项应具有下文所列的含义。在整篇申请中规定了其他定义。
本公开包括组的恰好一个成员存在于、采用于或以其他方式与给定产品或过程相关的实例。本公开包括超过一名或所有组成员存在于、采用于或以其他方式与给定产品或过程相关的实例。
在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。术语“一个”(或“一种”)以及术语“一个或多个”和“至少一个”可以在本文中互换使用。在某些方面，术语“一个”或“一种”是指“的单个”。在其他方面，术语“一个”或“一种”包括“两个或更多个”或“多个”。
此外，本文中使用的“和/或”将被视为两个具体特征或组件(具有或不具有另一个)中的每一个的特定公开。因此，短语中使用的术语“和/或”，如本文中“A和/或B”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，短语中使用的术语“和/或”，如“A、B和/或C”旨在涵盖以下方面中的每一项：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另有规定，否则本文中使用的所有技术和科学术语与本公开相关的本领域技术人员通常理解的含义相同。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine andMolecularBiology,Juo,Pei-Show,2nd ed.,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,3rd ed.,1999,Academic Press；and the Oxford DictionaryOf Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford UniversityPress，为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
本文所述的任何方面均使用“包含”一词，另外还提供了以属于“由……组成”和/或“基本上由……组成”一词描述的类似方面。
单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)接受的形式表示。数字范围包括定义范围的数字。在列举值的范围的情况下，应当理解的是，在该范围的所列举上限和下限之间的每个中间整数值及其每个分数，以及此类值之间的每个子范围也被具体公开。任何范围的上限和下限均可以单独包括在范围内或从范围内排除，并且包括任一个、无一个或两个限度的任何范围也涵盖在本公开内。在明确列举值的情况下，则应理解为与背诵值数量或数量大致相同的值也在公开范围内。在公开组合的情况下，该组合的元素的每个子组合也具体公开并且在本公开的范围内。相反，当单独公开不同元素或元素组时，也公开其组合。在本公开的任何元素被公开为具有多种替代物的情况下，还在此公开个别地或与其他替代物组合排除每种替代物的该公开的实例；公开的超过一个元素可以具有此类排除，并且具有此类排除的元素的所有组合在此公开。
核苷酸由其普遍接受的单字母代码来提及。除非另有说明，核酸以5’至3’方向从左到右书写。本文通过IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的常见单字母符号提及核苷酸。相应地，A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，T代表胸腺嘧啶，和U代表尿嘧啶。
氨基酸在本文中通过其常见的三个字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的一个字母符号提及。除非另有说明，氨基酸序列以氨基到羧基方向从左到右书写。
与整个说明书和声明中的数值相关的术语“基本上”、“约”和“大约”表示精确度区间，解释了微小波动。一般而言，此类精确度区间为+10％。例如，它们可以是指小于或等于±10％，如小于或等于±5％，如小于或等于±1％，如小于或等于±0.5％，如小于或等于±0.2％，如小于或等于±0.1％，如小于或等于±0.05％。在一个实例中，这些术语涵盖无波动，±0。
在给出范围的情况下，包括终点。此外，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解可以明显看出，否则表示为范围的值可以假设本公开的不同实例中的规定范围内的任何具体值或子范围，至范围下限的十分之一单位，除非上下文另有明确规定。
联合施用：本文中使用的术语“联合施用”、“并行施用”、“组合施用”或“联合疗法”是指在同一时间或间隔内向受试者施用两种或更多种药剂，使得每种药剂对患者的作用可以是重叠的。在一些实例中，它们在小于或等于约60分钟内施用-例如，彼此小于或等于约30、约15、约10、约5或约1分钟或更短时间。在一些实例中，药剂的施用间隔足够紧密，以便实现组合(例如，协同)效应。
术语“氨基酸取代”是指用另一个氨基酸残基替换存在于亲本或参考序列(例如野生型序列)中的氨基酸残基。氨基酸可以在亲本或参考序列(例如野生型多肽序列)中取代，例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法。因此，“在位置X的取代”是指在位置X的氨基酸由替代氨基酸残基取代。在一些方面，取代模式可以根据模式AnY来描述，其中A是对应于天然或最初存在于位置n的氨基酸的单字母代码，并且Y是取代的氨基酸残基。在其他方面，取代模式可以根据模式An(YZ)来描述，其中A是对应于取代天然或最初存在于位置X的氨基酸的氨基酸残基的单字母代码，并且Y和Z是替代取代氨基酸残基。
在本公开的上下文中，在核酸水平进行取代(即使它们被称为氨基酸取代)，即通过将编码第一氨基酸的密码子取代为编码第二氨基酸的密码子来将氨基酸残基取代为替代氨基酸残基。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实例中，“动物”是指在任何发育阶段的人。在一些实例中，“动物”是指在任何发育阶段的非人动物。在某些实例中，非人动物是哺乳动物(例如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物或猪)。在一些实例中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和蠕虫。在一些实例中，动物是转基因动物、基因工程化动物或克隆。
相关联：如本文所用，提及疾病，术语“相关联”是指相关症状、测量、特征或状态与该疾病诊断、发生、存在或进展相关。因为关联可能(但不一定)与疾病存在因果关系。
当用于两个或更多个部分时，术语“缔合”、“缀合”、“连接”、“附接”和“拴系”，当用于提及两个或更多个部分时，是指部分在物理上相互缔合或连接，直接或经由充当连接剂的一个或多个另外部分以形成足够稳定的结构，以便部分在使用结构的条件下保持物理上缔合，例如生理条件。“缔合”不需要严格通过直接共价化学键键合。这也可能表明离子或氢键键合或基于杂交的连接足够稳定，使得“缔合”实体保持物理上缔合。
生物相容性：如本文所用，术语“生物相容性”是指与活细胞、组织、器官或系统相容，几乎没有或没有由免疫系统的损伤、毒性或排斥风险。
生物可降解：如本文所用，术语“生物可降解”是指能够通过生物的作用分解成无害的产品。
序列优化：术语“序列优化”是指通过参考核酸序列中的核碱基由替代核碱基取代，导致具有改善的性质(例如，改善的蛋白质表达或免疫原性)的核酸序列的过程或一系列过程。
一般而言，序列优化的目标是产生同义核苷酸序列，其编码与由参考核苷酸序列所编码的相同多肽序列。因此，相对于参考核苷酸序列编码的多肽，密码子优化核苷酸序列编码的多肽中不存在氨基酸取代(密码子优化的结果)。
密码子取代：在序列优化的上下文中，术语“密码子取代”或“密码子替换”是指用另一个密码子替换参考核酸序列中存在的密码子。密码子可以在参考核酸序列中被取代，例如，经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法。相应地，提及核酸序列中的某个位置(例如，mRNA)或核酸序列的某个区域或子序列(例如，mRNA)内的“取代”或“替换”是指用替代密码子取代在此类位置或区域的密码子。
如本文所用，术语“编码区”和“区编码”及其语法变体是指多核苷酸中的开放阅读框(ORF)，表达时产生多肽或蛋白质。
“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基由具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸或谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或组氨酸)。因此，如果多肽中的一个氨基酸由来自同一侧链家族的另一个氨基酸替换，则认为氨基酸取代是保守的。在另一个方面，可以用在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的结构相似的串保守地替换一串氨基酸。
非保守氨基酸取代包括以下那些：(i)具有电正性侧链的残基(例如Arg、His或Lys)取代或取代为电负性残基(例如Glu或Asp)，(ii)亲水性残基(例如Ser或Thr)取代或取代为疏水性残基(例如Ala、Leu、Ile、Phe或Val)，(iii)半胱氨酸或脯氨酸取代或取代为任何其他残基，或(iv)具有大的疏水性或芳香族侧链的残基(例如Val、His、Ile或Trp)取代或取代为具有较小侧链(例如Ala或Ser)或无侧链(例如Gly)的残基。
其他合适的氨基酸取代也是有可能的。例如，对于氨基酸丙氨酸，可以从D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸中的任何一种进行取代。对于赖氨酸，取代可以是D-赖氨酸、精氨酸、D-精氨酸、高精氨酸、甲硫氨酸、D-甲硫氨酸、鸟氨酸或D-鸟氨酸中的任何一种。一般而言，预期诱导分离多肽的性质变化的功能重要区域中的取代是指其中(i)极性残基，例如丝氨酸或苏氨酸，取代(或由)疏水性残基，例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代；(ii)半胱氨酸残基被(或由)任何其他残基取代；(iii)具有电正性侧链的残基，例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸，被(或由)具有电负性侧链的残基，例如谷氨酸或天冬氨酸取代；或(iv)具有大侧链的残基，例如苯丙氨酸，取代(或由)不具有此类侧链的残基，例如甘氨酸取代。上述非保守取代之一改变蛋白质功能特性的可能性也与取代相对于蛋白质功能重要区域的位置相关：一些非保守取代相应地对生物学特性几乎没有影响。
保守：如本文所用，术语“保守”分别是指多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基，是指在比较的两个或更多个序列的相同位置中发生不变的核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸是指在比序列中其他地方出现的核苷酸或氨基酸更相关的序列中保守的核苷酸或氨基酸。
在一些实例中，如果两个或更多个序列彼此100％相同，则称其为“完全保守”。在一些实例中，如果两个或更多个序列彼此至少约70％相同-例如，至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同或更多，则称其为“高度保守的”。在一些实例中，如果两个或更多个序列彼此约70％相同、约80％相同、约90％相同、约95％、约98％或约99％或更多相同，则称其为“高度保守的”。在一些实例中，如果两个或更多个序列彼此至少约30％相同、至少约40％相同、至少约50％相同、至少约60％相同、至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同或至少约95％相同，则称其为“保守的”。在一些实例中，如果两个或更多序列彼此约30％相同、约40％相同、约50％相同、约60％相同、约70％相同、约80％相同、约90％相同、约95％相同、约98％相同或约99％相同，则称其为“保守的”。序列的保守性可以适用于多核苷酸或多肽的整个长度，也可以适用于其部分、区域或特征。
接触：如本文所用，术语“接触”是指在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，将哺乳动物细胞与纳米颗粒组合物接触意味着哺乳动物细胞和纳米颗粒被制造成共享物理连接。在体内和离体使细胞与外部实体接触的方法在生物学领域是众所周知的。例如，使纳米颗粒组合物和置于哺乳动物内的细胞接触可以通过不同的施用途径(例如静脉内、肌内、皮内和皮下)进行，并且可能涉及不同数量的纳米颗粒组合物。而且，超过一种哺乳动物细胞可能由纳米颗粒组合物接触。
控制释放：如本文所用，术语“控制释放”是指符合实现治疗结果的特定释放模式的药物组合物或化合物释放概况。
共价衍生物：当提到多肽时，术语“共价衍生物”包括用有机蛋白质或非蛋白质衍生剂对天然或起始蛋白质的修饰，和/或翻译后修饰。共价修饰传统上是通过蛋白质的靶向氨基酸残基与能够与选定侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，或通过利用在选定重组宿主细胞中发挥功能的翻译后修饰的机制引入的。所得共价衍生物在旨在鉴定对生物活性、免疫测定或制备用于重组糖蛋白免疫亲和纯化的抗蛋白抗体重要的残基的规程中有用。此类修饰在本领域普通技术内，并且是在没有不适当的实验的情况下进行的。
环或环化：如本文所用，术语“环”是指存在连续的环。环状分子不需要是环状的，仅是连接形成未断裂的亚基链。环状分子(如工程化RNA或mRNA)可以是单个单元或多聚体，也包含复杂或高级结构的一个或多个组分。
细胞毒性：如本文所用，“细胞毒性”是指对细胞(例如哺乳动物细胞(例如人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生物、朊病毒或其组合进行杀伤造成损伤性、毒性或致命效应。
递送：如本文所用，术语“递送”指向目的地提供实体。例如，向受试者递送多核苷酸可能涉及向受试者施用包含多核苷酸的纳米颗粒组合物(例如，通过静脉内、肌内、皮内或皮下途径)。将纳米颗粒组合物施用哺乳动物或哺乳动物细胞可能涉及使一个或多个细胞与纳米颗粒组合物接触。
递送媒介物：如本文所用，“递送媒介物”是指至少部分促进多核苷酸在体内、体外或离体递送至靶向细胞或组织(例如肿瘤等)的任何物质。将某物称为递送媒介物并不意味着它也可能不具有治疗作用。
去稳定化：如本文所用，术语“可破坏的”、“不稳定的”或“不稳定区”是指稳定性低于同一区或分子的起始、野生型或天然形式的区或分子。
可检测标记物：如本文所用，“可检测标记物”是指一个或多个标志物、信号或部分，其附接、掺入或缔合至另一个实体，可以通过本领域已知的方法，包括射线照相术、荧光、化学发光、酶活性、吸光度等轻易检测到。可检测标记物包括放射性同位素、荧光团、发色团、酶、染料、金属离子、配体如生物素、亲和素、链霉亲和素和半抗原、量子点等。可检测标记物可以位于本文公开的肽或蛋白质中的任何位置。它们可以在氨基酸、肽或蛋白质内，或位于N或C端。
非对映异构体：如本文所用，术语“非对映异构体”是指彼此不是镜像并且彼此之间不可叠加的立体异构体。
消化：如本文所用，术语“消化”是指分解为更小的片或组分。当涉及多肽或蛋白质时，消化导致肽的产生。
远端：如本文所用，术语“远端”是指远离中心或远离感兴趣的点或区。
结构域：如本文所用，当涉及多肽时，术语“结构域”是指具有一个或多个可鉴定的结构或功能特征或性质(例如，结合能力，充当蛋白质-蛋白质相互作用的位点)的多肽的基序。
给药方案：如本文所用，“给药方案”或“给药方案”是施用时间表或医生确定的治疗、防治或姑息护理方案。
有效量：如本文所用，术语药剂的“有效量”是足以引起有益或期望结果(例如，临床结果)的量，并且因此，“有效量”取决于应用其的背景。例如，在施用治疗肿瘤的药剂时，与未施用药剂时获得的响应相比，药物的有效量是，例如，足以减少或降低肿瘤体积或抑制肿瘤生长的量。术语“有效量”可以与“有效剂量”、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”互换使用。
对映异构体：如本文所用，术语“对映异构体”是指本公开的化合物的每种个体光学活性形式，其具有超过(通过本领域的方法标准测定)至少约80％(即，至少约90％的一种对映异构体和最多约10％的另一种对映异构体)、至少约90％或至少约98％或更高的光学纯度或对映异构体。
包囊：如本文所用，术语“包囊”是指，当提及mRNA相互作用的递送媒介物，是指完全或部分包围或包裹；这可能保护mRNA免于降解并促进细胞摄取。这可能包括通过包囊递送媒介物的mRNA。如本文所用，“包囊在一起”是指两个或更多个分子，如第一mRNA和第二mRNA由相同的递送媒介物分子包囊。第一mRNA和第二mRNA可能在不同的多核苷酸链上编码，也可能是同一链的部分。在一些实例中，相同类型的多种mRNA可能以确定的化学计量(如1:1、1:2、2:1等)包囊在相同的递送媒介物分子中。
包囊率：如本文所用，“包囊率”是指相对于制备纳米颗粒组合物中使用的多核苷酸的初始总量，成为纳米颗粒组合物的部分的多核苷酸的量。例如，如果在最初提供给该组合物的总计100mg多核苷酸中，将97mg多核苷酸包囊在纳米颗粒组合物中，则包囊率可以表示为97％。如本文所用，“包囊”是指完整、实质性或部分的包围、约束、周围或包装。例如，包囊可能是指约80％或更多包囊，约85％或更多包囊，约90％或更多包囊，约95％或更多包囊，或完全包囊。
所编码的蛋白切割信号：如本文所用，“所编码的蛋白切割信号”是指编码蛋白切割信号的核苷酸序列。
工程化的：如本文所用，本公开的实例被设计为具有不同于起始点、野生型或天然分子的特征或性质(无论是结构的还是化学的)时，它们是“工程的”。
增强递送：如本文所用，术语“增强递送”是指，与对照纳米颗粒将多核苷酸递送至目标组织的水平相比，通过纳米颗粒将更多(例如，多至少约1.5倍或-例如，多至少约2倍、多至少3倍、多至少4倍、多至少5倍、多至少6倍、多至少7倍、多至少8倍、多至少9倍、多至少10倍或更高)的多核苷酸递送至感兴趣的组织(例如，哺乳动物肝组织)。纳米颗粒递送到特定组织的水平可以通过比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织的重量、比较组织中的多核苷酸的量与所述组织的重量、比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织中的总蛋白质的量或比较组织中的多核苷酸的量与所述组织中的总多核苷酸的量来测量。可以理解的是，纳米颗粒向靶组织的增强递送不需要在受治疗的受试者中确定，其可以在替代物，例如动物模型(例如，大鼠模型)中确定。
外泌体：如本文所用，“外泌体”是由哺乳动物细胞分泌的囊泡或参与RNA降解的复合物。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一项多项：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’末端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
离体：如本文所用，术语“离体”是指发生在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)外的事件。离体事件可能发生在与天然(例如体内)环境变化极小的环境中。
特征：如本文所用，“特征”是指特征、性质或独特的元素。当提到多肽时，“特征”被定义为分子中基于氨基酸序列的不同组分。由本公开的多核苷酸编码的多肽的特征包括表面表现、局部构象形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端或其任何组合。
配制剂：如本文所用，“配制剂”包括至少一种多核苷酸和一种或多种载体、赋形剂和递送剂。
片段：如本文所用，“片段”是指一部分。例如，蛋白质的片段可以包括通过消化从培养细胞中分离的全长蛋白质获得的多肽。在一些实例中，片段是全长蛋白的子序列(例如，IL-23的亚基之一)，其中N端和/或C端和/或内部子序列已被删除。在本公开的一些方面，本公开的蛋白质的片段是功能性片段。
功能性：如本文所用，“功能性”生物分子是生物分子，其为表现出表征其的性质和/或活性的形式。因此，本公开的多核苷酸的功能片段是能够表达功能性白细胞介素片段的多核苷酸。如本文所用，白细胞介素的功能性片段是指野生型白细胞介素的片段(即天然存在的白细胞介素形式的片段)，或其突变体或变体，其中该片段保留相应全长蛋白的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％，或至少约95％的生物活性。
同源性：如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。通常，术语“同源性”意味着两个分子之间的进化关系。因此，两个同源的分子将具有共同的进化祖先。在本公开的上下文中，术语同源性包括同一性和相似性两者。
在一些实例中，如果分子中至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的单体相同(完全相同的单体)或相似(保守取代)，则认为聚合物分子彼此“相同”。术语“同源”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体单体保守性。例如，可以通过比对两个序列用于最佳比较目的来进行两个多核苷酸序列的同一性百分比的计算(例如，为了最佳比对，可以在第一个和第二个核酸序列的一个或两个中引入间隙，并且为了比较目的可以忽略不完全相同的序列)。在某些实例中，为了比较而对齐的序列长度为参考序列长度的至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％，或约100％。然后比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中相应位置相同的核苷酸占据时，那么分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数量的函数，考虑间隙的数量和每个间隙的长度，需要引入这两个序列进行最佳比对。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法完成。当比较DNA和RNA时，可以认为胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)等同。
合适的软件程序可从各种来源获得，并用于蛋白质和核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的一个合适程序是bl2seq，它是美国政府国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)可获得的BLAST程序套件的部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法执行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适的程序，例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，是EMBOSS生物信息学程序套件的部分，也可从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。
序列比对可以使用本领域中已知的方法进行，如MAFFT、Clustal(ClustalW、ClustalX或Clustal Omega)、MUSCLE等。
单个多核苷酸或多肽靶序列内与多核苷酸或多肽参考序列比对的不同区域可以各自具有它们自己的百分比序列同一性。值得注意的是，百分比序列同一性四舍五入至最接近的十分之一。例如，80.11、80.12、80.13和80.14四舍五入至80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19四舍五入至80.2。还应注意的是，长度值将始终是整数。
在某些方面，第一氨基酸序列(或核酸序列)与第二氨基酸序列(或核酸序列)的百分比同一性“％ID”计算为％ID＝100×(Y/Z)，其中Y是在第一和第二序列的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基(或核碱基)数量(通过目视检查或特定序列比对程序比对)，并且Z是第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。
用于计算序列同一性百分比的序列比对的生成不限于仅由一级序列数据驱动的二元序列-序列比较。还将认识到，通过将序列数据与来自异构源的数据，如结构数据(例如晶体学蛋白质结构)、功能数据(例如突变位置)或系统发育数据集成，可以生成序列比对。集成异构数据以生成多序列比对的合适程序是T-Coffee，可在www.tcoffee.org获得并且可替代地获得自，例如EBI。还将认识到，用于计算百分比序列同一性的最终比对可以自动或手动的。
免疫检查点抑制剂：“免疫检查点抑制剂”或简称“检查点抑制剂”是指阻止免疫细胞被癌细胞关闭的分子。如本文所用，术语检查点抑制剂是指中和或抑制抑制性检查点分子，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性死亡受体1(PD-1)或PD-1配体1(PD-L1)的多肽(例如抗体)或编码此类多肽(例如mRNA)的多核苷酸。
免疫应答：术语“免疫应答”是指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏(包括抗体、细胞因子和补体)产生的可溶性大分子的作用，其导致人体对入侵的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或在自身免疫或病理性炎症的情况下对正常人体细胞或组织的选择性损伤、破坏或消除。
炎症应答：“炎症应答”是指涉及特异性和非特异性防御系统的免疫应答。特异性防御系统反应是对抗原的特异性免疫系统反应。特异性防御系统反应的实例包括抗体应答。非特异性防御系统反应是由通常不能进行免疫记忆的白细胞(例如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞)介导的炎症应答。在一些方面，免疫应答包括炎性细胞因子的分泌，导致炎性细胞因子水平升高。
炎性细胞因子：术语“炎性细胞因子”是指在炎症应答中升高的细胞因子。炎性细胞因子的实例包括白细胞介素-6(IL-6)、CXCL1(趋化因子(C—X—C基序)配体1；也称为GROc、干扰素-γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。术语炎性细胞因子还包括与本领域已知的炎症应答相关的其他细胞因子，例如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-12(L-12)、白细胞介素-13(IL-13)、干扰素α(IFN-α)等。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中发生的事件，例如在试管或反应容器、细胞培养、皮氏培养皿等中，而不是在生物体内(例如动物、植物或微生物)。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
插入和缺失变体：当涉及多肽时，“插入变体”是指在天然或起始序列的特定位置与氨基酸紧邻插入一个或多个氨基酸的变体。与氨基酸“紧邻”是指与氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团相连。当涉及多肽时，“缺失变体”是指天然或起始氨基酸序列中除去一个或多个氨基酸的变体。通常，缺失变体在分子的特定区域具有一个或多个氨基酸缺失。
完整：如本文所用，在多肽的上下文中，术语“完整”是指保留对应于野生型蛋白质的氨基酸，例如，不突变或替代野生型氨基酸。相反，在核酸的上下文中，术语“完整”是指保留与野生型核酸相对应的核碱基，例如，不突变或替代野生型核碱基。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是指已与其相关联的组分中的至少一些分离的物质或实体(无论是在自然界中还是在实验环境中)。分离的物质(例如核苷酸序列或蛋白质序列)相对于其相关的物质可能具有不同的纯度水平。分离出的物质和/或实体至少可以与它们最初相关联的其他组分的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多分离。在一些实例中，分离的药剂是超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过99％纯的。如本文所用，如果物质基本上不含其他成分，则它是“纯的”。术语“基本分离”是指化合物与形成或检测到该化合物的环境基本分离。部分分离可以包括，例如，在本公开的化合物中富集的组合物。基本分离包括含有本公开的化合物或其盐的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％(按重量计)的组合物。
本文公开的“分离的”多核苷酸、载体、多肽、细胞或任何组合物是指为自然界中未发现的形式的多核苷酸、载体、多肽、细胞或组合物。分离的多核苷酸、载体、多肽或组合物包括已被纯化到不再以其在自然界中发现的形式存在的多核苷酸、载体、多肽或组合物。在一些方面，分离的多核苷酸、载体、多肽或组合物是基本上纯的。
异构体：如本文所用，术语“异构体”是指本公开的任何化合物的任何互变异构体、立体异构体、对映异构体或非对映异构体。认识到本公开的化合物可能具有一个或多个手性中心和/或双键，因此存在作为立体异构体，如双键异构体(即几何E/Z异构体)或非对映异构体(例如对映异构体(即(+)或(-))或顺式/反式异构体)。根据本公开，本文描绘的化学结构以及因此的本公开化合物涵盖所有相应的立体异构体，即立体异构体纯形式(例如几何纯、对映异构纯或非对映异构纯)以及对映异构和立体异构体混合物，例如外消旋体。本公开的化合物的对映异构体和立体异构体混合物通常可以通过众所周知的方法，例如手性气相色谱法、手性高效液相色谱法、将化合物结晶为手性盐复合物或将化合物在手性溶剂中结晶，分离成其组分对映异构体或立体异构体。对映异构体和立体异构体也可以通过众所周知的不对称合成方法从立体或对映异构纯的中间体、试剂和催化剂中获得。
接头：如本文所用，“接头”是指例如约10-1000个原子的一组原子，并且可以由以下原子或基团组成，如但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺。接头可以在第一末端附接到核碱基或糖部分上的修饰核苷或核苷酸上，在第二末端附接到有效载荷，例如可检测或治疗剂上。接头的长度可以足够长以免干扰其掺入核酸序列。如本文所述，接头可用于任何有用的目的，如形成多核苷酸多聚体(例如，通过两个或更多个嵌合多核苷酸分子或IVT多核苷酸的键联)或多核苷酸缀合物，以及施用有效载荷。可以掺入到接头中的化学基团的实例包括但不限于烷基、烯烃基、炔基、酰胺基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂烷基、芳基或杂环基，如本文所述，每种均可以任选地取代。接头的实例包括但不限于不饱和烷烃、聚乙二醇(例如，乙烯或丙二醇单体单元，例如，二甘醇、二丙二醇、三甘醇、三丙二醇、四甘醇或四甘醇)以及右旋糖聚合物及其衍生物。其他实例包括但不限于接头内的可切割部分，例如二硫键(—S—S—)或偶氮键(—NN—)，可以使用还原剂切割或光解。选择性可切割键的非限制性实例包括可通过使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其他还原剂切割和/或光解的酰胺键，以及可通过酸性或碱性水解切割的酯键。
施用方法：如本文所用，“施用方法”可能包括静脉内、肌内、皮内、皮下或向受试者递送组合物的其他方法。可以选择一种施用方法以将药物靶向递送(例如，特异性递送)至身体的特定区域或系统。特别地，本文所述的是瘤内注射(例如，注射到一个或多个肿瘤或紧邻肿瘤的组织中)。
修饰的：如本文所用，“修饰的”是指本公开的分子的改变状态或结构。分子可以以多种方式，包括化学、结构和功能来进行修饰。在一些实例中，本公开的mRNA分子通过引入非天然核苷和/或核苷酸，例如其与天然核糖核苷酸A、U、G和C相关进行修饰。非典型核苷酸(如帽结构)不被视为“修饰”，尽管它们与A、C、G、U核糖核苷酸的化学结构不同。
天然存在：如本文所用，“天然存在”是指在没有人工辅助的情况在自然界中存在。
非人脊椎动物：如本文所用，“非人脊椎动物”包括除智人以外的所有脊椎动物，包括野生和驯化物种。非人脊椎动物的实例包括但不限于哺乳动物，如羊驼、爪哇野牛、野牛、骆驼、猫、牛、鹿、犬、驴、大额牛、山羊、豚鼠、马、骆驼、骡、猪、兔、驯鹿、绵羊、水牛和牦牛。
术语“核酸序列”和“核苷酸序列”(“多核苷酸序列”的实例)可互换使用，并且是指连续的核酸序列。该序列可以是单链或双链DNA或RNA，例如mRNA。
广义上，术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物通常被称为多核苷酸。本公开的核酸或多核苷酸的实例包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2’-氨基官能团化的2’-氨基-LNA和具有2’-氨基官能团化的2’-氨基-α-LNA)、乙烯核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)或其杂交体或组合。
短语“核苷酸序列编码”是指编码多肽的核酸(例如，mRNA或DNA分子)编码序列。编码序列还可以进一步包括与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，包括启动子和多聚腺苷酸化信号，其能够指导在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中的表达。编码序列可以进一步包括编码信号肽的序列。
脱靶：如本文所用，“脱靶”是指对任何一个或多个靶标、基因或细胞转录物的任何非预期影响。
开放阅读框：如本文所用，“开放阅读框”或“ORF”是指在给定阅读框中不包含终止密码子的序列。
可操作连接：如本文所用，短语“可操作连接”是指两个或更多个分子、结构、转录物、实体、部分或类似物之间的功能连接。
任选取代的：本文中“任选取代的X”(例如，任选取代的烷基)意在等同于“X，其中X是任选取代的”(例如，“烷基，其中所述烷基是任选取代的”)。这并不意味着特征“X”(例如，烷基)本身是任选的。
部分：如本文所用，多核苷酸的“部分”或“区域”被定义为多核苷酸中小于多核苷酸全长的任何部分。
患者：如本文所用，“患者”是指可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或由经过培训的专业人员治疗特定疾病或状况的受试者。
药学上可接受的：如本文所用，短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触使用，而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的受益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的赋形剂：本文所用的短语“药学上可接受的赋形剂”是指本文所述的化合物(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)以外并且在患者中具有基本上无毒和无炎症的特性的任何成分。赋形剂可以包括，例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、涂层、压片助剂、崩解剂、染料(颜料)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或涂层、香料、香水、助滑剂(增流剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸氢钙(二碱)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、尼泊金甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、尼泊金丙酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羧甲基淀粉钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石粉、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
药学上可接受的盐：本公开还包括本文所述化合物的药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式进行改性(例如，通过将游离碱基团与合适的有机酸反应)。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的矿物质或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱或有机盐；以及等等。代表性酸加成盐包括醋酸盐、乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫酸盐、甲苯磺酸盐、十一烯酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开中药学上可接受的盐包括母体化合物的传统无毒盐，例如由无毒无机酸或有机酸形成。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在水或有机溶剂或两者的混合物中反应来制备；通常，使用非水性介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适盐的列表见Remington'sPharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,andUse,P.H.Stahl andC.G.Wermuth(eds.),Wiley-VCH,2008，和Berge et al.,Journal of PharmaceuticalScience,66,1-19(1977)，每篇均通过整体引用并入本文。
药学上可接受的溶剂化物：如本文所用，术语“药学上可接受的溶剂化物”是指本公开的化合物，其中在晶格中掺入适当溶剂分子。合适的溶剂在施用的剂量处是生理上可耐受的。例如，可以通过从包含有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀来制备溶剂化物。合适溶剂的实例包括乙醇、水(例如，单水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N’-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当溶剂为水时，将溶剂化物称为“水合物”。
药代动力学：如本文所用，“药代动力学”是指分子或化合物的任何一种或多种性质，因为它与施用至活体生物体的物质命运的确定有关。药代动力学分为若干方面，包括吸收、分布、代谢和排泄的程度和速率。这通常被称为ADME，其中：(A)吸收是物质进入血液循环的过程；(D)分布是物质在体液和组织中的分散或播散；(M)代谢(或生物转化)是母体化合物至子代谢物的不可逆转化；(E)排泄(或消除)是指物质从体内的消除。在极少数情况下，一些药物在身体组织中不可逆地累积。
物理化学：如本文所用，“物理化学”是指物理和/或化学性质或与物理和/或化学性质相关的。
多核苷酸：如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。该术语是指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。它还包括修饰(例如通过烷基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。更特别地，术语“多核苷酸”包括多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA和mRNA(剪接或未剪接)、任何其他类型的多核苷酸(嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷)和含有正常核苷酸主链的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸“PNA”)和聚吗啉聚合物，以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是聚合物含有为允许碱基配对和碱基堆积的构型的核碱基，如在DNA和RNA中发现的。在特定的方面，多核苷酸包含mRNA。在其他方面，mRNA是合成的mRNA。在一些方面，合成的mRNA包括至少一个非天然的核碱基。在一些方面，某类的所有核碱基均已被非天然的核碱基取代(例如，本文公开的多核苷酸中的所有尿苷均可以被非天然的核碱基取代，例如5-甲氧基尿苷)。在一些方面，多核苷酸(例如，合成RNA或合成DNA)包括仅天然核碱基，即合成DNA情况下的A、C、T和U，或合成RNA情况下的A、C、T和U。
技术人员将理解，本文公开的密码子图谱中的T碱基存在于DNA中，而在相应的RNA中T碱基将由U碱基取代。例如，来自例如载体或体外翻译(IVT)模板的DNA中的本文公开的密码子-核苷酸序列，将其T碱基根据其相应的转录mRNA转录为U。在这方面，密码子优化的DNA序列(包括T)及其相应的RNA序列(包括U)均被视为本公开的密码子优化的核苷酸序列。技术人员也将理解，等效的密码子图谱可以通过用非天然碱基替换一个或多个碱基来生成。因此，例如，TTC密码子(DNA图谱)将对应于UUC密码子(RNA图谱)，进而对应于‘P’C密码子(U已被假尿苷取代的RNA图谱)。
分别在允许胸苷的N3-H和C4-氧基与腺苷的N1和C6-NH2之间以及分别在胞苷的C2-氧基、N3和C4-NH2与鸟苷的C2-NH2、N’—H和C6-氧基之间形成氢键的条件下，形成标准的A-T和G-C碱基对。因此，例如鸟苷(2-氨基-6-氧代-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)可以被修饰形成异鸟苷(2-氧代-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。此类修饰导致核苷碱基不再与胞嘧啶有效地形成标准碱基对。然而，对胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧代-4-氨基-嘧啶)进行修饰以形成异胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧代-嘧啶-)，导致修饰后的核苷酸不与鸟苷有效地形成碱基对，但将与异鸟苷形成碱基对(Collin等人的美国专利号5,681,702)。异胞嘧啶可从Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)获得；异胞苷可以由Switzer etal.(1993)Biochemistry 32:10489-10496及其中引用的参考文献描述的方法制备；2’-脱氧-5-甲基-异胞苷可以由Tor et al.(1993)J.Am.Chem.Soc.115:4461-4467和其中引用的参考文献的方法制备；并且异鸟嘌呤核苷酸可以使用Switzer et al.,1993，同上，和Mantsch et al.(1993)Biochem.14:5593-5601描述的方法或美国专利号5,780,610中描述的方法制备。其它非天然碱基对可以由Piccirilli et al.(1990)Nature 343:33-37中描述，用于合成2，6-二氨基嘧啶及其补体(1-甲基吡唑并[4,3]嘧啶-5，7-(4H,6H)-二酮的方法合成。形成独特碱基对的其他此类修饰核苷酸单元是已知的，如Leach et al.(1992)J.Am.Chem.Soc.114:3675-3683and Switzer et al.，同上所描述的。
术语“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸”可互换使用并且是指连续的核酸序列。该序列可以是单链或双链DNA或RNA，例如mRNA。
短语“核苷酸序列编码”及其变体是指包含编码本文所述多肽或其功能片段的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA或DNA分子)编码序列。编码序列还可进一步包括与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，包括启动子和多腺苷酸化信号，其能够指导施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中的表达。编码序列可以进一步包括编码信号肽的序列。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以包括修饰的氨基酸。这些术语还涵盖天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分的缀合。定义中还包括，例如，含有氨基酸的一种或多种类似物的多肽(包括，例如，非天然氨基酸，如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰苯丙氨酸、D-氨基酸和肌酸)，以及本领域已知的其他修饰。
如本文所用，术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽包括基因产物、天然多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单个多肽，也可以是多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包括单链或多链多肽。最常见的二硫键联存在于多链多肽中。术语多肽也适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学类似物。在一些实例中，“肽”可以小于或等于约50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
如本文所用，术语“多肽变体”是指其氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体在氨基酸序列内的某些位置具有替换、缺失和/或插入。通常，变体将与天然或参考序列具有至少约50％同一性、至少约60％同一性、至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约99％同一性。在一些实例中，它们将与天然或参考序列至少约80％，或至少约90％。
如本文所用，单位药物的多肽(PUD)或单位药物的产品，定义为体液或组织中测定的产品(如多肽)每日总剂量的细分部分，通常为1mg、pg、kg等，通常定义为浓度(如pmol/mL、mmol/mL等)除以体液中的测量值。
如本文所用，术语“预防”是指至少部分(包括完全)延迟感染、疾病、病症和/或状况的发作；至少部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或状况的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；至少部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或状况的一种或多种症状、特征或表现的发作；至少部分或完全延迟感染、特定疾病、病症和/或状况的进展；和/或降低发生与感染、疾病、病症和/或状况相关联的病理的风险。
本公开还包括本文所述化合物的前药。如本文所用，“前药”是指与该物质、分子或实体在化学或物理变化后作为治疗药物的形式等同的任何物质、分子或实体。前药可以通过共价键键合或以某种方式隔离，并在对有此需要的哺乳动物受试者施用前、施用时或施用后释放或转化为活性药物部分。前药可以通过修饰化合物中存在的官能团，使修饰在常规操作或体内切割为母体化合物来制备。前药包括化合物，其中羟基、氨基、巯基或羧基与任何基团键合，在施用于哺乳动物受试者时切割分别形成游离羟基、氨基、巯基或羧基。前药的制备和使用在T.Higuchi and V.Stella,“Pro-drugs as Novel Delivery Systems,”Vol.14ofthe A.C.S.Symposium Series，和在Bioreversible Carriers in Drug Design,ed.Edward B.Roche,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中讨论，这两者在此通过引用其整体并入本文。
增殖：如本文所用，术语“增殖”是指生长、扩增或增加或导致快速生长、扩增或增加。“增殖性”是指具有增殖能力。“抗增殖性”是指具有与增殖性质相反或与增殖性质不相适应的性质。
防治性：如本文所用，“防治性”是指用于预防疾病传播的治疗或作用过程。
防治：如本文所用，“防治”是指为维持健康和预防疾病传播而采取的措施。“免疫防治”是指产生主动或被动免疫以预防疾病传播的措施。
蛋白质切割位点：如本文所用，“蛋白质切割位点”是指可以通过化学、酶或光化学手段完成氨基酸链受控切割的位点。
蛋白质切割信号：如本文所用，“蛋白质切割信号”是指至少一个标记或标示用于切割的多肽的氨基酸。
感兴趣的蛋白：如本文所用，术语“感兴趣的蛋白”或“期望蛋白”包括本文提供的蛋白质以及其片段、突变体、变体和变化。
近端：如本文所用，术语“近端”是指位于中心或感兴趣点或区域附近。
假尿苷：如本文所用，假尿苷是指核苷尿苷的C-糖苷异构体。“假尿苷类似物”是假尿苷的任何修饰、变体、异构体或衍生物。例如，假尿苷类似物包括但不限于1-羧甲基-假尿苷、1-丙炔基-假尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、1-甲基假尿苷(m1ψ)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、和2’-O-甲基-假尿苷(xm)。
纯化的：如本文所用，“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”、“纯化(purification)”是指从不需要的组分、材料污迹、混合物或瑕疵中得到基本上纯或澄清。
参考核酸序列：术语“参考核酸序列”或“参考核酸”或“参考核苷酸序列”或“参考序列”是指可以进行序列优化的起始核酸序列(例如RNA，例如mRNA序列)。在一些实例中，参考核酸序列是野生型核酸序列、片段或其变体。在一些实例中，参考核酸序列是先前序列优化的核酸序列。
盐：在一些方面，本文公开了用于瘤内递送的药物组合物，并包括其脂质成分中的一些的盐。术语“盐”包括任何阴离子和阳离子复合物。阴离子的非限制性实例包括无机和有机阴离子，例如氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、草酸盐(例如半草酸盐)、磷酸盐、膦酸酯、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、硝酸盐、亚硝酸盐、氮化物、重亚硫酸盐、硫化物、亚硫酸盐、硫酸氢盐、硫酸盐、硫代硫酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、甲酸盐、醋酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、富马酸盐、马来酸盐、衣康酸盐、乙醇酸盐、葡萄糖酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、硫代酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、聚甲基丙烯酸酯、高氯酸盐、氯酸盐、亚氯酸盐、次氯酸盐、溴酸盐、次溴酸盐、碘酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、砷酸盐、亚砷酸盐、铬酸盐、重铬酸盐、氰化物、氰酸盐、硫氰酸盐、氢氧化物、过氧化物、高锰酸盐及其混合物。
样品：如本文所用，术语“样品”或“生物样品”是指其组织、细胞或组成部份的子集(例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)。样品还可以包括从整个生物体或其组织、细胞或组成部份的子集，或其级分或部分制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于，例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部部分、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官。样品进一步是指培养基，如营养肉汤或凝胶，其可能含有细胞组分，如蛋白质或核酸分子。
信号序列：如本文所用，短语“信号序列”、“信号肽”和“转运肽”可互换使用并且是指可以将蛋白质转运或定位至某种细胞器、细胞区室或细胞外输出的序列。该术语涵盖信号序列多肽和编码信号序列的核酸序列。因此，在核酸的上下文中提及信号序列实际上是指编码信号序列多肽的核酸序列。
信号转导途径：“信号转导途径”是指在信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。如本文所用，短语“细胞表面受体”包括，例如，能够接收信号并传递此类穿过细胞质膜的分子和分子复合物。
相似性：如本文所用，术语“相似性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合物分子彼此之间的百分比相似性的计算可以以与百分比同一性的计算相同的方式进行，除了百分比相似性计算考虑本领域理解的保守取代。
特异性递送：如本文所用，术语“特异性递送(specific delivery)”、“特异性递送(specifically deliver)”或“特异性递送(specifically delivering)”是指与脱靶组织(例如，哺乳动物脾脏)相比，通过纳米粒子向感兴趣的靶组织(例如，哺乳动物肝脏)递送更多(例如，多至少约1.5倍、多至少约2倍、多至少约3倍、多至少约4倍、多至少约5倍、多至少约6倍、多至少约7倍、多至少约8倍、多至少约9倍、多至少约10倍)的多核苷酸。纳米颗粒递送到特定组织的水平可以通过比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织的重量、比较组织中的多核苷酸的量与所述组织的重量、比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织中的总蛋白质的量或比较组织中的多核苷酸的量与所述组织中的总多核苷酸的量来测量。例如，对于肾血管靶向，如果与全身施用多核苷酸后递送至肝脏或脾脏的组织相比，每1g组织递送至肾脏的多核苷酸多约1.5、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍或20倍，则与肝脏和脾脏相比，特异性为哺乳动物肾脏提供多核苷酸。可以理解的是，纳米颗粒特异性递送至靶组织的能力不需要在正在接受治疗的受试者中确定，其可以在替代物中，如动物模型(例如，大鼠模型)确定。
稳定：如本文所用，“稳定”是指在从反应混合物中分离至有用纯度时足够稳健的化合物，并且在某些情况下能够配制成有效的治疗剂。
稳定化：如本文所用，术语“使稳定”、“稳定化”、“稳定化区”是指使得稳定或变得稳定。
立体异构体：如本文所用，术语“立体异构体”是指化合物可能具有的所有可能的不同异构体和构象形式(例如，本文所述的任何分子式的化合物)，特别是所有可能的立体化学和构象异构体形式、所有非对映异构体、对映异构体和/或基本分子结构的构象异构体。本公开的一些化合物可能以不同的互变异构体形式存在，所有后者均包含在本公开的范围内。
受试者：“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家畜、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物，如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类动物，如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物，如犬和狼；猫科动物，如猫、狮子和老虎；马科动物，如马、驴和斑马；熊、食用动物如牛、猪和绵羊；有蹄类动物，如鹿和长颈鹿；啮齿类动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。在某些实例中，哺乳动物是人受试者。在其他实例中，受试者是人患者。在特定的实例中，受试者是需要癌症治疗的人患者。
在本文中使用的上下文中，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或性质的全部或接近全部范围或程度的定性条件。生物领域技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)去完成和/或进行到完整或实现或避免绝对结果。因此，本文使用的术语“基本上”来捕捉许多生物和化学现象固有的完整性的潜在缺乏。基本上相等，如本文所用，在涉及到剂量之间的时间差异时，意指平均值正负2％。基本上同时，如本文所用并在涉及多个剂量时，意指在几秒(例如2秒)内。
“患有”疾病、病症和/或状况的个体已被诊断为患有或表现出该疾病、病症和/或状况的一种或多种症状。
“易患”疾病、病症和/或状况的个体尚未被诊断为和/或可能未表现出疾病、病症和/或状况的症状，但拥有发生疾病或其症状的倾向。在一些实例中，易患疾病、病症和/或状况(例如癌症)的个体可以通过以下的一项或多项来表征：(1)与疾病、病症和/或状况发生相关的基因突变；(2)与疾病、病症和/或状况发生相关的遗传多态性；(3)与疾病、病症和/或状况相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性增加和/或降低；(4)与疾病、病症和/或状况发生相关的习惯和/或生活方式；(5)疾病、病症和/或状况的家族史；和(6)与疾病、病症和/或状况发生相关的微生物暴露和/或感染。在一些实例中，易患疾病、病症和/或状况的个体将发生疾病、病症和/或状况。在一些实例中，易患疾病、病症和/或状况的个体不发生疾病、病症和/或状况。
如本文所用，术语“缓释”是指在特定时期内符合释放速率的药物组合物或化合物释放曲线。
术语“合成”是指由人手工生产、制备和/或制造的产品。本公开的多核苷酸或其他分子的合成可以是化学的或酶的。
如本文所用，“靶定细胞”是指任何一个或多个靶细胞。细胞可以在体外、体内、原位或生物体的组织或器官中发现。生物体可以是动物，例如哺乳动物，包括人。
靶组织：如本文所用，“靶组织”是指其中递送多核苷酸将产生期望生物学和/或药理学效应的任何一种或多种感兴趣组织类型。感兴趣的靶组织的实例包括特定组织、器官和系统或其组。在特定应用中，靶组织可以是肾脏、肺脏、脾脏、血管中的血管内皮(例如冠状动脉内或股动脉内)或肿瘤组织(例如，经由瘤内注射)。“脱靶组织”是指其中所编码蛋白的表达未产生期望生物学和/或药理学效应的任何一种或多种组织类型。特别是在应用中，脱靶组织可以包括肝脏和脾脏。
靶向序列：如本文所用，短语“靶向序列”是指可以指导蛋白质或多肽的转运或定位的序列。
端：如本文所用，术语“末端”或“端”，当提到多肽时，是指肽或多肽的末端。此类末端不仅限于肽或多肽的首个或最后一个位点，还可以包括末端区域的另外氨基酸。本公开的基于多肽的分子可以表征为具有N端(由具有游离氨基(NH2)的氨基酸终止)和C端(由具有游离羧基(COOH)的氨基酸终止)。在一些情况下，本公开的蛋白质由通过二硫键或非共价力(多聚体、低聚物)结合在一起的多个多肽链构成。这类蛋白质将具有多个N和C末端。替代地，可以对多肽的末端进行修饰，使其以非多肽基部分，如有机缀合物开始或结束(视情况而定)。
治疗剂：术语“治疗剂”是指当施用于有此需要的受试者时具有治疗、诊断和/或防治作用和/或引发期望生物学和/或药理学作用的药剂。例如，在一些实例中，编码IL-36-γ多肽的mRNA可以是治疗剂。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”是指当施用于患有或易患感染、疾病、病症和/或状况的受试者时，足以治疗、改善症状、诊断、预防和/或延迟发作感染、疾病、病症和/或状况的待递送药物的量(例如核酸、药物、治疗剂、诊断剂、防治剂等)。
治疗有效结果：如本文所用，术语“治疗有效结果”是指足以在患有或易患感染、疾病、病症和/或状况的受试者中治疗、改善症状、诊断、预防和/或延迟发作感染、疾病、病症和/或状况的结果。
每日总剂量：如本文所用，“每日总剂量”是24hr内给予或开处方的量。周期。每日总剂量可以作为单一单位剂量或分次剂量施用。
转录因子：如本文所用，术语“转录因子”是指，例如通过激活或阻遏转录，调节DNA转录为RNA的DNA结合蛋白。一些转录因子单独影响转录的调控，而另一些则与其他蛋白协同作用。一些转录因子在某些条件下激活和阻遏转录。一般而言，转录因子结合特定靶序列或与靶基因的调控区中特定共有序列高度相似的序列。转录因子可能单独或与其他分子复合调节靶基因的转录。
转录：如本文所用，术语“转录”是指将外源性核酸引入细胞的方法。转染的方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。
转染：如本文所用，“转染”是指将多核苷酸引入细胞中，其中表达由多核苷酸编码的多肽(例如mRNA)或多肽调节细胞功能(例如siRNA、miRNA)。如本文所用，核酸序列的“表达”是指多核苷酸(例如mRNA)翻译成多肽或蛋白质和/或多肽或蛋白质的翻译后修饰。
处理、治疗、疗法：如本文所用，术语“处理”或“治疗”或“疗法”是指过度增殖性疾病(例如癌症)的一种或多种症状或特征的部分或完全缓和、减轻、改善、缓解、延迟发作、抑制进展、降低严重程度和/或降低发生率。例如，“处理”癌症可以是指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。可以施用治疗于未表现出疾病、病症和/或状况的体征的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或状况的早期体征的受试者，用于降低发生与疾病、病症和/或状况相关联的病理学风险的目的。
肿瘤微环境”：如本文所用，“肿瘤微环境”是指肿瘤内关于浸润免疫和/或炎症细胞存在与否的细胞组成，以及肿瘤内此类细胞的类型。在一方面，肿瘤微环境是“发炎的肿瘤微环境”，是指存在浸润到肿瘤中的免疫和(或)炎性细胞，主要细胞类型是粒细胞。在另一个方面，肿瘤微环境是“免疫抑制性肿瘤微环境”，是指存在浸润到肿瘤中的免疫和(或)炎性细胞，主要细胞类型是单核细胞和巨噬细胞。在另一个方面，肿瘤微环境是“免疫抑制性肿瘤微环境”，是指不存在到免疫和(或)炎症细胞肿瘤中的显著浸润。
未修饰：如本文所用，“未修饰”是指以任何方式改变之前的任何物质、化合物或分子。未修饰可以，但并不总是指生物分子的野生型或天然形式。分子可以经历一系列修饰，由此每个修饰分子可以充当后续修饰的“未修饰”起始分子。
尿嘧啶：尿嘧啶是RNA核酸中的四种核碱基之一，并且它以字母U表示。尿嘧啶可以附接到核糖环上，或者更具体地，经由β-N1-糖苷键到核糖呋喃糖上，以产生核苷尿苷。核苷尿苷也通常根据其核碱基的一个字母代码缩写，即U。因此，在本公开的上下文中，当多核苷酸序列中的单体为U时，此类U可互换指定为“尿嘧啶”或“尿苷”。
尿苷含量：术语“尿苷含量”或“尿嘧啶含量”可互换，并且是指某些核酸序列中存在的尿嘧啶或尿苷的量。尿苷含量或尿嘧啶含量可以表示为绝对值(序列中尿苷或尿嘧啶的总数)或相对值(相对于核酸序列中核碱基总数的尿苷或尿嘧啶百分比)。
尿苷修饰序列：术语“尿苷修饰序列”是指相对于候选核酸序列的尿苷含量和/或尿苷模式的具有不同总体或局部尿苷含量(尿苷含量较高或较低)或具有不同尿苷模式(例如梯度分布或聚类)的序列优化核酸(例如合成mRNA序列)。在本公开的上下文中，术语“尿苷修饰序列”和“尿嘧啶修饰序列”被认为是等同和可互换的。
“高尿苷密码子”是指包含2个或3个尿苷的密码子，“低尿苷密码子”是指包含1个尿苷的密码子，并且“无尿苷密码子”是指无任何尿苷的密码子。在一些实例中，尿苷修饰的序列包括用低尿苷密码子取代高尿苷密码子、用无尿苷密码子取代高尿苷密码子、用高尿苷密码子取代低尿苷密码子、用无尿苷密码子取代低尿苷密码子、用无尿苷密码子取代低尿苷密码子、用无尿苷密码子取代高尿苷密码子替换及其组合。在一些实例中，高尿苷密码子可以被另一个高尿苷密码子替换。在一些实例中，低尿苷密码子可以被另一个低尿苷密码子替换。在一些实例中，无尿苷密码子可以被另一个无尿苷密码子替换。尿苷修饰的序列可以是尿苷富集或尿苷稀疏的。
尿苷富集：如本文所用，术语“尿苷富集”和语法变体是指相对于相应候选核酸序列的尿苷含量，序列优化核酸(例如合成mRNA序列)中的尿苷含量增加(以绝对值或百分比值表示)。尿苷富集可以通过用含有较少尿苷核碱基的同义密码子取代候选核酸序列中的密码子来实现。尿苷富集可以是整体的(即相对于候选核酸序列的整个长度)或局部的(即相对于候选核酸序列的子序列或区域)。
尿苷稀疏：如本文所用，术语“尿苷稀疏”和语法变体是指相对于相应候选核酸序列的尿苷含量，序列优化核酸(例如合成mRNA序列)中的尿苷含量降低(以绝对值或百分比值表示)。尿苷稀疏可以通过用含有较少尿苷核碱基的同义密码子取代候选核酸序列中的密码子来实现。尿苷稀疏可以是整体的(即相对于候选核酸序列的整个长度)或局部的(即相对于候选核酸序列的子序列或区域)。
变体：本公开中使用的术语变体是指天然变体(例如，多态性、异构体等)和人工变体，并且其中天然或起始序列(例如，野生型序列)中的至少一个氨基酸残基已被除去，并且在其相同位置插入不同的氨基酸。这些变体可以描述为“取代变体”，取代可以是单个的，其中分子中仅一个氨基酸被取代，或者它们可以是多个的，其中在同一分子中两个或更多个氨基酸已被取代。如果插入或删除氨基酸，所得的变体将分别为“插入变体”或“缺失变体”。
疫苗：如本文所用，疫苗可能是帮助身体对抗癌症的疗法。具体地，本文所述的疫苗可能治疗癌症。本文所述疫苗不仅限于预防疾病(例如，癌症)，还可以治疗现有癌症，包括一种或多种肿瘤。
本文所述的mRNA疫苗可能包括任何适当的递送媒介物分子。例如，递送媒介物分子可能是基于脂质的载体(如脂质纳米颗粒)或基于聚合物的纳米颗粒。特别是递送媒介物(DV)分子可能是氨基脂化类肽递送媒介物。
一般而言，递送媒介物分子可保护mRNA免受RNase降解，增加其细胞摄取，并促进内体逃逸，从而在细胞溶质中表达功能性蛋白。这些属性使得解决患者体内递送mRNA的技术挑战变得可行。
因此，如本文所述，本文所述的mRNA疫苗可能包括与相同递送媒介物分子共同配制的编码一种或多种肿瘤特异性抗原的mRNA和一种或多种免疫调节剂。例如，递送媒介物分子可能是脂质纳米颗粒(LNP)。LNP制剂可能由可电离或阳离子脂质或聚合物材料构成，携带叔胺或季胺以包囊聚阴离子mRNA；两性离子脂质(例如，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，其与细胞膜中的脂质相似；胆固醇以稳定LNP的脂质双层；聚乙二醇(PEG)脂质以使纳米颗粒具有水合层，改善胶体稳定性并减少蛋白质吸收。
多组分LNP可能被内吞作用摄取，可以使用倒置的非双层脂相与细胞膜静电附接并融合。一旦进入细胞内，LNP可能被送入到早期内体中，然后是晚期内体，最后是其中mRNA含量被酶降解的溶酶体。
一类递送媒介物分子包括阳离子或可电离脂质和脂质样材料。阳离子脂质携带烷基化季铵基团，并以pH非依赖性方式保留其阳离子性质，而随着pH降低，可电离脂质通过游离胺质子化获得正电荷。脂质样材料比天然脂质携带更多的疏水性侧链。可以使用阳离子脂质，如N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。替代地或另外地，也可以使用pH依赖性可电离材料。名为Dlin-MC3-DMA(MC3)的可电离脂质也可以用于转染mRNA，以便表达治疗性蛋白。
聚合物材料可以用于递送治疗性mRNA。例如，用脂肪链修饰的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)可能用于siRNA和mRNA递送，以降低高分子量PEI的毒性。已证明用脂肪链修饰的聚(甘氨酰氨基)聚合物(例如，在一些变化中，包括酒石酸酯主链)递送mRNA。聚β-氨基酯(PBAE)是可以用于核酸递送的可生物降解的聚合物，包括用PEG-脂质配制的PBAE，以增加其血清稳定性。超支化PBAE可以用于mRNA递送。
据报道，具有携带胺的侧链的聚甲基丙烯酸酯、具有寡氨基乙烯侧链的聚天冬酰胺和有交替乙基-丙基-乙基间隔物的与羟化四甲铵酰胺酰胺化的聚丙烯酸转染mRNA，并可以用作递送媒介物分子。自降解(self-immolative)聚碳酸酯-嵌段-聚(α-氨基)酯可能在重排后释放mRNA，然后在pH 7.4下降解，以促进内体逃逸。生物可降解的氨基聚酯(APE)，可以从叔胺醇作为各种内酯开环聚合的引发剂以低分散性合成，并且可能能够组织选择性的mRNA递送。其他具有生物相容性降解产物和增强内体逃逸能力的生物可降解聚合物可用于mRNA递送。
在一些变化中，递送媒介物分子可能包括树状聚合物。例如，聚酰胺胺(PAMAM)或基于聚丙烯亚胺的树状聚合物已被广泛研究用于基因传递。脂肪链修饰的PAMAM树状聚合物和/或与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和神经酰胺-PEG共同配制的改性PAMAM树状聚合物可以用作递送媒介物分子。
替代地，在一些变化中，细胞穿透肽(CPP)可以用作递送媒介物分子。CPP可能促进细胞表面带负电荷的糖胺聚糖的聚集，其进而触发巨胞饮和侧向扩散或直接破坏脂质双层。可以使用具有富含精氨酸的两亲性RALA序列重复的CPP。在一些变化中，递送媒介物分子可能是阳离子和两性离子脂质的组合，联想到阳离子和辅助脂质(“两性离子氨基脂质”或ZAL)。
特别地，本文所述的递送媒介物分子可能是氨基脂化类肽递送媒介物。例如，这些递送媒介物可能是含脂质的两亲性递送媒介物，在循环过程中提供mRNA货物的包装和保护，避免免疫识别，并可能促进细胞摄取和释放。这些递送媒介物的实例可以在国际专利申请PCT/US19/53661(标题为“LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS COMPRISING LIPIDATEDCATIONIC PEPTIDE COMPOUNDS FORNUCLEICACID DELIVERY”并于2019年09月27日提交)和国际专利申请PCT/US19/53655(标题为“TERTIARY AMINO LIPIDATED CATIONIC PEPTIDESFOR NUCLEIC ACID DELIVERY”并于2019年09月27日提交)，每篇通过引用其整体并入本文。可以使用多种类型的递送媒介物分子，并且每种类型可以与如本文所述的编码一种或多种肿瘤特异性抗原的mRNA和编码一种或多种免疫调节剂的mRNA一起包囊。
一般而言，本文所述方法和组合物可能包括癌症治疗的方法。这些方法可以包括瘤内注射编码肿瘤特异性抗原的mRNA疫苗和编码一种或多种免疫调节剂的mRNA，其中mRNA疫苗和免疫调节剂用递送媒介物分子包囊在一起。特别是，肿瘤特异性抗原可能是患者特异性肿瘤抗原，其可以鉴别为与天然患者组织相比的一个或多个基因和/或蛋白质的序列和/或一个或多个基因和/或蛋白的表达的变化(例如突变，包括缺失、添加等)，并且特别地具有相同分化谱系的天然患者组织；例如，与肝肿瘤组织相比的肝组织等。
例如，患者特异性肿瘤抗原可能包括新表位(也称为新抗原)。本文所述方法和组合物可以提高使用新表位的mRNA疫苗的功效。
新表位可以起因于改变蛋白质序列的任何基因组突变，包括非同义突变、保留的内含子、改变氨基酸的翻译后修饰、基因融合和插入/缺失变体的移码。下一代测序(NGS)可以用于鉴定这些类型的变体，翻译后修饰除外，其可以通过质谱等技术检测。
肿瘤特异性抗原可能是体细胞突变，并且可以通过任何适当的方式进行鉴定。
大规模并行NGS可以用于鉴定新表位，而不需要单个cDNA文库筛选。全外显子组/基因组测序可以用于鉴定肿瘤特异性基因突变，以高通量的方式快速改变蛋白编码区，有利于新表位预测。质谱也可以用于鉴定与细胞表面上的MHC分子结合的多肽。可以使用对生殖系和肿瘤DNA进行NGS以鉴定癌细胞特异性蛋白改变突变的前向方法，然后通过计算机算法进行表位预测。
例如，从患者(和/或培养物，包括短期培养物)中提取肿瘤样品，并通过全外显子组测序(或其他外显子组测序)进行检查，以鉴定患者特异性的突变衍生的新表位。例如，可以从患者肿瘤细胞中提取DNA和RNA，并进行外显子组捕获进行DNA测序(例如，使用Agilent人全外显子组SureSelect检测)。制备RNA-seq文库(例如，使用IlluminamRNA-seq方案)。可以对文库进行测序(例如，在IlluminaHiSeq2500上)，以生成核苷酸读数。RNA读段可以与人参考基因组比对，并组装成转录物(例如，使用Bowtie-TopHat-Cufflinks，开源TuxedoSuite软件，Trapnell，C.et al.,Nat.Protoc.7,562-578(2012))。WES数据可能定位到参考基因组(例如，通过BWA，Burrows-WheelerAligner，http://bio-bwa.sourceforge.net/)，然后进行处理以检测体细胞突变(例如，使用高灵敏度和特异性的突变识别算法MuTect，Cibulskis,K.et al.Sensitive detection ofsomatic pointmutations in impureandheterogeneous cancer samples.Nat.Biotechnol.31,213-219(2013))。可以因此确定患者特异性等位基因(例如，使用Seq2HLA，Boegel,S.et al.HLA typing from RNA-Seqsequence reads.GenomeMed.4,102(2012))。鉴定出的突变可能是推定的候选抗原肽，可能通过肿瘤表达水平进一步过滤，例如使用RNA序列数据。候选肽(例如，长度大于8-11个字符)可以根据，例如，通过计算机中进行的肽-MHC结合亲和力预测(IC50nM)进行排序(例如，使用NetMHCpan，例如，http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)。以上描述的软件中的任何一种均是示例性的，并且可以使用其他软件。
新表位的预测可能依赖于基因组数据的计算机处理，并可能使用供体HLA类型、肿瘤mRNA表达、生殖系DNA和肿瘤DNA的知识。肿瘤mRNA表达数据如全基因组微阵列或RNA-seq可能叠加在肿瘤特异性癌症突变信息上，以鉴定转录基因的变体。然后，这些变体可以通过表位预测算法运行，以鉴定可能与个体特异性HLA等位基因结合的肽序列。有许多可用的表位预测算法，包括SYFPEITHI(Schuler et al.2007)、RANKPEP(Reche et al.2002)、NetMHCpan(Jurtz et al.2017)、NetMHCcons(Karosiene et al.2012)、PickPocket(Zhanget al.2009)、MHCflurry(pre-print,10.1101/174243)、ANN(Singh and Mishra 2008)和SMM(Peters and Sette 2005)。此类算法可能使用不同的预测模型，但均使用表征的表位/MHC组合进行培训，从而预测短肽序列与给定HLA等位基因结合的可能性。已经创建使用全基因组/外显子测序数据并整合分析的生物信息学管道，包括野生型和突变肽的HLA等位基因分型、mRNA表达数据、肽加工预测和HLA等位基因结合。这些可能包括pVAC-seq(Hundalet al.2016)、MuPeXi(Bjerregaard et al.2017)、Cloudneo(Bais et al.2017)和TIminer(Tappeiner et al.2017)。计算工具(例如，LOHHLA，人白细胞抗原杂合性缺失)可以用于根据下一代测序数据估计HLA基因座的等位基因特异性拷贝数。
在本文所述的任何mRNA疫苗和方法中，一个或多个，并在一些情况下多个(例如，2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多等)可以组合成单个mRNA(或多个mRNA)，例如一起编码。这些组合的新表位mRNA可以成功地使用，如本文所述。
替代地或另外地，基于mRNA的肿瘤疫苗接种可以包括肿瘤共享抗原，即在来自不同患者的许多肿瘤中过表达和HLA呈递的抗原。
非限制性实施例
在一些实施例中，使用同系小鼠癌症模型说明本文描述的mRNA疫苗接种方法可以针对肿瘤抗原使用，并且可以在一部分小鼠中产生持久的肿瘤消退和长期CD8+T细胞介导的癌症免疫。
实施例1：肿瘤模型
图2例示了所使用的同系小鼠模型的一个实例，其中小鼠植入了肿瘤细胞系(EG.7)并且监测肿瘤生长。肿瘤细胞系经工程化改造以表达共享肿瘤特异性抗原卵清蛋白。在预设肿瘤生长体积后处死小鼠。图2例示了如本文所述的各种mRNA疫苗和处理方法的结果。图2中，阴性对照小鼠(G1)在植入后(DPI)25天超过预设的肿瘤体积限值。相反，在用皮下注射共享肿瘤特异性抗原的mRNA(例如，在氨基脂化类肽递送媒介物中)以及用瘤内注射编码免疫调节剂(抗CTLA-4)的mRNA同时组合氨基脂化类肽递送媒介物(“G5”)处理的小鼠中观察到肿瘤生长显著减慢。与使用G5的结果相比，瘤内注射包括氨基脂化类肽递送媒介物中的肿瘤特异性抗原的mRNA和编码免疫调节剂(抗CTLA-4)的mRNA的mRNA疫苗(“G6”)在减慢或减少肿瘤生长方面观察到尽管相似但略好的改善。然而，令人惊讶的是，在用包括氨基脂化类肽递送媒介物中的肿瘤特异性抗原的mRNA和编码两种免疫调节剂(抗CTLA-4和TGF-β两者)的mRNA的mRNA疫苗(“G7”)处理的动物中观察到明显更高的生存。抗CTLA-4的DNA序列在SEQ ID NO:1(重链)和SEQ ID NO:3(轻链)中提供。TGF-β的示例序列如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:9中所示。图2中，mRNA疫苗中的mRNA编码全长IgG抗CTLA4。在上述所有处理中，mRNA疫苗中包含免疫调节剂CpG。对于所有瘤内注射均使用相同的氨基脂化类肽。
如图2中所示，瘤内注射肿瘤特异性抗原的mRNA，组合一种或(更优选)多种免疫调节剂(如aCTLA4和aTGF-β)导致mRNA疫苗接种的功效急剧增加。
使用其中使用不同肿瘤细胞系(MC38)的同系小鼠模型进行了相似的实验。如图3所示。在此实施例中，鉴定了mRNA疫苗，其包括通过测序MC38肿瘤和新表位鉴定的肿瘤特异性抗原。鉴定出7个表位并对其链化以形成编码所有7种肿瘤特异性抗原的单个mRNA；表位的序列在自定义的支架中表达以增强呈递。
图3中，对照动物(“G2”)注射非编码mRNA和CpG，伴随氨基脂化类肽递送媒介物。与对照动物相比，皮下注射仅包括肿瘤特异性mRNA和氨基脂化类肽递送媒介物的mRNA疫苗(“G7”)未显著影响肿瘤生长。相反，瘤内注射肿瘤特异性mRNA和抗CTLA-4mRNA组合氨基脂化类肽的动物(“G9”)显示肿瘤生长显著减慢或减少，从而能够存活。最重要的是，肿瘤内注射包括肿瘤特异性抗原的mRNA和编码三种免疫调节剂(抗CTLA-4和TGF-β和单链IL-12)的mRNA与氨基脂化类肽递送媒介物的mRNA疫苗(“G10”，显示“多效应混合物”)导致肿瘤生长急剧的减慢或减少。在此实施例中，mRNA疫苗接种也均包括CpG。
图4显示了另一实施例的结果，其中检查了同系小鼠模型使用单独的瘤内注射给药的情况。图7中将具有单独的肿瘤特异性抗原和氨基脂化类肽的mRNA疫苗(“1”)与包括肿瘤特异性抗原的mRNA和氨基脂化类肽组合抗CTLA-4和氨基脂化类肽的mRNA疫苗(“6”)进行比较。如图所示，使用单一免疫调节剂(在这种情况下，抗CTLA-4)急剧地增加生存(例如，通过减慢或减少肿瘤的生长)。
图5以图形方式例示了与包括肿瘤特异性抗原的mRNA和氨基脂化类肽结合抗CTLA-4和氨基脂化类肽的mRNA疫苗(“6”)相比，在瘤内注射(IT)单独的肿瘤特异性抗原的mRNA和氨基脂化类肽(“1”)后，图4中总结的对于动物受试者对肿瘤体积随时间的作用。通常当其肿瘤体积超过3000mm3时处死动物。在几乎所有用肿瘤特异性抗原和抗CTLA-4mRNA与氨基脂化类肽处理的动物中，显示肿瘤生长的延迟，而一些则显示肿瘤体积的减少或阻断。
图6显示在通过皮下注射处理的同系小鼠中观察到相似的结果，显示约50％的肿瘤控制(例如，与对照“G1”相比，随时间阻止肿瘤生长)动物。相反地在图7中，处理小鼠注射2μg的包括肿瘤特异性抗原，以及抗CTLA-4mRNA和TGF-B-PDL1 mRNA与氨基脂化类肽的mRNA疫苗，显示约80％的肿瘤控制。所有小鼠均显示肿瘤生长减慢，且大多数显示肿瘤体积随时间减小。
上述结果均包括用mRNA疫苗对动物受试者多次给药。一般而言，提供多次剂量的mRNA疫苗瘤内注射可能是有益的，但不是必要的。例如，注射可以间隔4天或更长时间(例如，每两周一次)。在一些变化中，仅使用两次或最多三次注射。
令人惊讶的是，从上述实验中观察到作为长期生存者的小鼠发展了强烈和持续的CD8+效应T细胞癌症免疫，并对进一步的肿瘤攻击具有抗性。例如，图8A和8B例示了本文所述mRNA疫苗接种方法产生的有效的T细胞应答。使用3x105个脾细胞/孔运行Elispot测定，并使用肿瘤细胞(如1x106个EG7细胞)作为刺激物。图8中将来自阳性对照(OTI)和阴性对照(#596)的细胞与长时间生存的小鼠中的两只(#662和#670)进行比较，显示响应于肿瘤暴露分泌干扰素γ的T细胞的计数。末次处理后2个月，从循环血液或脾脏中采集细胞。
图8B定量该数据，显示显著反应(与阳性对照小鼠OTI相当或更优，OTI经工程化改造以对所使用的卵清蛋白肿瘤特异性标志物产生应答)。因此，观察到如本文所述免疫的小鼠继续识别肿瘤，显示出显著的强且持久的免疫，显示了本文所述方法在这些小鼠中的有效性，并表明即使是单次处理也具有长期效果。
实施例2：EG7-OVA淋巴瘤模型
在此实施例中，小鼠瘤内(IT)或肌内(IM)注射到EG7小鼠(EG7-OVA淋巴瘤模型)中。IT注射为双侧且注射含或不含效应物的OVA-mRNA。IT注射是单侧注射相同的含或不含效应物的OVA-mRNA。表1(如图9中所示)例示了各种受试组，其注射抗原mRNA(“OVA”)(第1、2、5、6、7和10组)或非编码抗原mRNA(“非编码mRNA”)(第3、4、8和9组)与CpG(第1、3、6和8组)、IL-12(第2、4、7和9组)，或同时注射抗原mRNA，非编码抗原mRNA和CM-CSG。对于第1-10组的每一组，注射10只小鼠，其进行共3次注射。在第4天当肿瘤大小达到约75mm时进行初次注射；在初次注射后1周和2周进行第二次和第三次注射(加强)。对照动物(第11组和第12组中的小鼠)没有接受递送媒介物或mRNA给药。肿瘤大于1500mm3后或60天后处死小鼠。检查脾脏和血清，并在CD8+T细胞上进行分级。
使用流式细胞术测定CD8 T细胞应答。四聚体阳性CD8 T细胞百分比为治疗干预诱导肿瘤特异性免疫的能力提供了生物标志物。在攻击后第11天和第28天对个体小鼠采血。将循环外周血单个核细胞(PBMC)的单细胞悬液与0.5μg/mL四聚体(含有OVA肽SIINFEKL的H-2Db四聚体)在1:100稀释的抗CD3抗体和1:100稀释的抗CD8抗体(ThermoScientific)中在4℃下温育30min。清洗细胞两次，并在2％多聚甲醛中固定。在Beckman CoulterFC 500流式细胞仪上采集至少100,000个细胞，并使用CXP软件进行分析。对CD8+细胞进行设门，并测定CD3+/CD8+/四聚体+细胞的百分比。
图10A-10G和11A-11F显示了肌内注射的结果。使用OVA肽(SIINFEKL)，使用流式细胞术测量循环中的OVA特异性T细胞。1剂(第11天)后和3剂(第28天)后，从血液中进行测量。图10A-10G例示了如上所述，在第一剂后第11天肌内(IM)注射的结果。图10A对应第6组(OVA+CpG，肌内)，图10B对应第7组(OVA+IL-12，肌内)，图10C对应第8组(非编码mRNA+CpG，肌内)，图10D对应第9组(非编码mRNA+IL-12，肌内)以及图10E对应第10组(OVA+IL-12+GM-CSF，肌内)。图10F和10G显示了对照。
类似地，图11A-11G显示了在第三次IM给药(第28天)后，使用SIINFEKL四聚体，循环中OVA特异性T细胞的流式细胞术结果。图11A对应第6组(OVA+CpG，肌内)，图11B对应第7组(OVA+IL-12，肌内)，图11C对应第8组(非编码mRNA+CpG，肌内)，图11D对应第9组(非编码mRNA+IL-12，肌内)以及图11E对应第10组(OVA+IL-12+GM-CSF，肌内)。图11F显示了对照。
如图10A-10G和11A-11F所示，单独的效应物并不能驱动肿瘤特异性CD8+T细胞群的强烈扩增(参见，例如图10C-10D和11C-11D)。然而，当抗原与免疫调节剂(例如，促炎细胞因子，如IL-12)和/或免疫刺激剂(如CpG)组合时，例如通过在相同的递送媒介物中将抗原和免疫调节剂的mRNA组合时，到第28天，约25％的循环CD8+T细胞具有肿瘤特异性。在此实施例中，IL-12和CpG都表现出类似的肿瘤特异性CD8 T细胞的扩增。
图12A-12G和13A-13F显示了瘤内(IT)注射的结果。使用OVA肽(SIINFEKL)，使用流式细胞术测量循环中的OVA特异性T细胞。1剂(第11天)后和3剂(第28天)后，从血液中进行测量。图12A-12G例示了如上所述，在第一剂后在第11天瘤内注射的结果。图12A对应第1组(OVA+CpG，肌内)，图12B对应第2组(OVA+IL-12，肌内)，图12C对应第3组(非编码mRNA+CpG，肌内)，图12D对应第4组(非编码mRNA+IL-12，肌内)以及图12E对应第5组(OVA+IL-12+GM-CSF，肌内)。图12F和12G显示了对照组。
图13A-13G显示了第三次IT给药(第28天)后，使用SIINFEKL四聚体，循环中OVA特异性T细胞的流式细胞术结果。图13A对应第1组(OVA+CpG，肌内)，图13B对应于第2组(OVA+IL-12，肌内)，图13C对应第3组(非编码mRNA+CpG，肌内)，图13D对应第4组(非编码mRNA+IL-12，肌内)以及图13E对应第5组(OVA+IL-12+GM-CSF，肌内)。图13F显示了对照(未处理)组。
如图13A-13B和13E所示，与肌内(IM)注射相比，瘤内(IT)注射抗原和免疫调节剂如促炎细胞因子(例如IL-12)，或免疫刺激剂如CpG，组合抗原特异性mRNA产生更强的肿瘤特异性CD8应答。例如，瘤内注射在同一递送媒介物上的肿瘤特异性抗原组合促炎细胞因子(例如IL-12)比肌内注射相同的组合物产生更强烈的反应。使用肿瘤抗原mRNA和免疫调节剂或免疫刺激剂(与相同的递送媒介物组合)导致在第28天约25％的循环CD8+T细胞具有肿瘤特异性。在这此实施例中，免疫刺激剂(CpG)和免疫调节剂(促炎免疫调节剂，IL12)都导致了类似的肿瘤特异性CD8 T细胞的扩增。如图13C和13D中IT注射所示，肌内和瘤内注射单独的效应物(例如，免疫调节剂、免疫刺激剂等)并不能驱动肿瘤特异性CD8+T细胞群的强烈扩增。
实施例3：肿瘤植入、处理和监测
在动物模型中还检查了使用肿瘤特异性抗原mRNA组合相同免疫调节剂mRNA(例如，促炎性免疫调节剂，如IL-12)或免疫抑制剂(例如，CpG)进行瘤内注射的治疗用途。
10只8周龄雌性C57BL/6小鼠的组在右胁腹部用PBS中1×105个EG.7肿瘤细胞皮下(s.c.)攻击。在整个实验期间，每周用卡尺二维监测肿瘤生长2-3次。当肿瘤体积超过1,500mm3时或溃烂时，使小鼠安乐死。进行瘤内和肌内注射。例如，在肿瘤攻击后第7、14和28天，注射20μl中具有用mRNA配制的2μg的纳米颗粒的瘤内治疗性疫苗接种。使用了6种变型：(1)肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA加免疫调节剂(IL-12)mRNA；(2)肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA、免疫调节剂(IL-12)mRNA和第二免疫调节剂(GM-CSF)mRNA；(3)肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫刺激剂(CpG)；(4)单独的免疫调节剂(IL-12)mRNA(没有肿瘤抗原mRNA)；(5)单独的免疫刺激剂(CpG)(没有肿瘤抗原mRNA)；(6)PBS。用瘤内和肌内实验检查了相同的6种变体。对于肌肉注射，在肿瘤攻击后第7、14和28天，用20μl中2μg纳米颗粒配制的RNA进行治疗性疫苗接种。在这些实验中未观察到处理相关毒性，并监测肿瘤生长60天。
图14总结了当通过用上述6种变型之一进行肌内(IM)注射来处理时，肿瘤注射后的生存概率的结果。如图所示，对照动物在第40天前全部死亡，仅用免疫刺激注射(CpG)处理的动物也是如此。对于用肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫刺激剂(CpG)免疫的动物，第60天(终点)的生存概率最高，其次是单独的免疫调节剂(IL-12)mRNA(没有肿瘤抗原mRNA)，然后是肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA、免疫调节剂(IL-12)mRNA和第二免疫调节剂(GM-CSF)mRNA，以及肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA加免疫调节剂(IL-12)mRNA。
图15显示了上述这些相同变型的瘤内注射的结果。在此实施例中，用对照(PBS)或用单独的免疫调节剂(IL-12)mRNA(没有肿瘤抗原)免疫的肿瘤动物未生存至40天。用肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA加免疫调节剂(IL-12)mRNA免疫的动物总体生存率最高(40％)，其次是用肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA、免疫调节剂(IL-12)mRNA和第二免疫调节剂(GM-CSF)mRNA免疫的动物(30％)，然后用肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫刺激剂(CpG)或单独的免疫调节剂(CpG)(没有肿瘤抗原mRNA)免疫的动物(均为20％)。
图16-20是显示了对于上述检查的肌内处理组的每一个，肿瘤体积随时间变化的图。例如，图16显示了用对照(未处理)PBS溶液，或用包含肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫刺激剂(CpG)的纳米颗粒组合物注射的小鼠的肿瘤随时间肿瘤体积变化的图。注射肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA组合免疫刺激剂(CpG)的小鼠未显示明显的肿瘤体积(如肿瘤未生长)，或生长较慢。
图17显示了肌内(IM)注射对照溶液(PBS)或注射同时含有肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA加免疫调节剂(IL-12)mRNA的递送媒介物的小鼠的肿瘤随时间肿瘤体积的变化。如图17所示，一些肿瘤不生长，而用肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA加免疫调节剂(IL-12)mRNA处理的小鼠中肿瘤多数生长较慢。
图18显示了接受肌内(IM)注射肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫刺激剂(CpG)的小鼠和来自注射单独的免疫刺激剂(CpG)(没有肿瘤抗原mRNA)的小鼠的肿瘤的肿瘤体积的变化。这两组之间，随时间的肿瘤体积存在大量重叠。
图19显示了通过肌内注射包括递送媒介物中的肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA加免疫调节剂(IL-12)mRNA的纳米颗粒组合物，以及包括单独的免疫调节剂(IL-12)mRNA(没有肿瘤抗原mRNA)的纳米颗粒组合物处理的小鼠之间肿瘤体积随时间的变化。
图20是肌肉注射(IM)肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫刺激剂(CpG)或单独的免疫刺激剂(CpG)(没有肿瘤抗原mRNA)的小鼠的肿瘤体积之间的比较。
在一些实验中，相同动物可以包括多个诱导肿瘤，相同动物中，其中一些肿瘤可通过瘤内注射处理(“近端”肿瘤)或不处理(“远端”)。图21显示了与同一动物中肿瘤中未接受瘤内注射的肿瘤相比，接受肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA加免疫调节剂(IL-12)mRNA的瘤内注射的肿瘤的肿瘤体积的变化。图22显示了当同一动物的近端肿瘤注射单独的免疫调节剂(IL-12)mRNA(没有肿瘤抗原mRNA)时，近端和远端肿瘤之间的肿瘤体积变化。
图23还显示了注射肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫调节剂(CpG)的相同动物中，处理(近端)和未处理(远端)小鼠的肿瘤体积的变化。近端肿瘤接受注射到肿瘤中，而远端肿瘤在相同动物中，但未接受瘤内注射递送媒介物和OVAmRNA与CpG。与远端(未注射)肿瘤相比，用肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫刺激剂(CpG)处理的肿瘤的一部分生长较慢或不生长。
图24中，接受瘤内注射的大多数近端肿瘤(在此实施例中：单独的免疫刺激剂(CpG))具有减慢或逆转的生长，而在相同小鼠中的远端肿瘤大部分继续生长。图25是总结与图16-24相关数据的结果的表(表2)。如图所示，瘤内注射含有肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA和免疫调节剂(IL-12)mRNA两者的递送媒介物具有对注射肿瘤最强烈的响应率(如70％)，同时维持远端肿瘤效应(50％)。这些动物中近端(注射)和远端(未注射，和近端相同动物)总体响应约为40％。相同的测定发现，对于仅免疫调节剂(例如，炎性细胞因子IL-12)，响应率无显著作用。肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA与免疫刺激剂CpG也观察到了作用(例如，近端肿瘤的50％响应率，远端肿瘤的50％响应率)。对于肿瘤特异性抗原(OVA)mRNA加免疫刺激剂(CpG)，近端和远端肿瘤两者的总体响应约为20％。瘤内注射单独的CpG具有更小的作用(例如，30％近端，20％远端以及20％总体)。
如本文中所用，与肿瘤达到终点体积时对侧肿瘤的肿瘤体积相比，响应是<5％的终点肿瘤体积。例如，当相同小鼠的两个肿瘤中的一个达到终点体积(例如，肿瘤1为1500mm3)，而对侧肿瘤(肿瘤2)仅为75mm3时，则认为是肿瘤2中响应。
实施例4：MC38结肠癌皮下肿瘤
在受试动物(小鼠)中建立MC38结肠癌肿瘤，并用纳米颗粒处理，以确定效应物(例如免疫调节剂和免疫刺激剂)的作用，包括在不存在肿瘤特异性抗原的情况下。
在植入肿瘤后第6天和第10天，用免疫调节剂和免疫刺激mRNA配制的纳米颗粒处理肿瘤。纳米颗粒是包括一种或多种免疫调节剂、免疫刺激剂和/或肿瘤特异性抗原的递送媒介物。例如图26-28例示了包括非编码RNA对照、分泌的LIGTH(例如TNFRSF14)、天然LIGHT、免疫调节剂GM-CSF和/或免疫调节剂(例如促炎细胞因子IL-12)的纳米颗粒对诱导的MC38肿瘤和具有此类肿瘤的小鼠的作用。对注射动物分析肿瘤和肿瘤引流淋巴结中由免疫调节剂和/或免疫刺激剂诱导的肿瘤微环境的变化。LIGHT是指肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)，也称为CD258，其也作为本文所述免疫调节剂的另一示例。
作为方案的一部分，用PBS溶液中1×105个MC38肿瘤细胞在右胁腹部皮下(s.c.)攻击5-10只8周龄雌性C57BL/6小鼠的组。在肿瘤攻击后第7天和第11天，给予20μl中具有2μg纳米颗粒配制的RNA的瘤内治疗性疫苗接种。检测的组合物包括免疫调节剂(例如，促炎细胞因子IL-12)mRNA、GM-CSF免疫调节mRNA、免疫调节分泌的LIGHT mRNA、免疫调节天然LIGHTmRNA和对照PBS的纳米颗粒。按计划安乐死小鼠后收获肿瘤，以及肿瘤引流淋巴结。通过流式细胞术评估肿瘤免疫细胞浸润和免疫活化的流式细胞术分析。未观察到处理相关毒性。监测肿瘤生长60天。
图26显示了各种免疫调节剂(例如效应物)对MC38肿瘤细胞的肿瘤体积的作用。图26中，在攻击后D1和第7天显示瘤内注射包括对照(非编码mRNA)或免疫调节剂(分泌的LIGHT、LIGTH、GM-CSF或IL-12)的递送媒介物的作用。IL-12组(第6组)与对照组相比显示出差异。
如图27所示，通过瘤内注射IL-12处理的动物的肿瘤中CD8 T细胞频率存在增加。在该实施例中，在瘤内注射包括IL-12的递送媒介物的肿瘤中，肿瘤攻击后第7天对CD4和CD8两者呈阳性的活T细胞频率显著更高。一般而言，与其他免疫调节剂和对照相比，第7天瘤内注射IL-12后，在单核细胞、B细胞、树突状细胞和巨噬细胞中抗原呈递细胞显著增加，如图28所示。因此，当瘤内注射促炎细胞因子(如IL-12)时(如上所示，特别是当与肿瘤特异性抗原在相同的递送媒介物中组合时)，发现即使与其他免疫调节剂相比，也可增强抗肿瘤反应。
实施例5：C3.43肿瘤细胞
C3.43是HPV16转化的肿瘤模型。肿瘤特异性抗原(HPV16癌蛋白E6和E7)可以与C3.43肿瘤一起使用。该模型还用于显示肿瘤特异性抗原mRNA在相同递送媒介物中组合一种或多种免疫调节剂mRNA，如(但不限于)促炎细胞因子(如IL-12)的有效性。
10只8周龄雌性C57BL/6小鼠的组在右胁腹部用PBS中5×105个C3.43肿瘤细胞s.c.攻击。在整个实验期间，每周用卡尺三维监测肿瘤生长2-3次。当肿瘤体积超过1,500mm3时或溃烂时，使小鼠安乐死。在肿瘤攻击后第18、25和32天，用20μl中2μg的纳米颗粒配制的mRNA进行瘤内治疗性疫苗接种。检查了6种不同的纳米颗粒配制剂：(1)肿瘤特异性抗原(HPV16 E6E7)mRNA与免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA；(2)肿瘤特异性抗原(HPV16)mRNA，第一免疫调节剂(LIGHT)mRNA和第二免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA；(3)肿瘤特异性抗原(HPV16)mRNA和免疫刺激剂(CpG)；(4)免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA；(5)第一免疫调节剂(LIGHT)mRNA和第二免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA；(6)免疫刺激剂(CpG)；(7)对照(PBS)。还肌内注射了第一纳米颗粒溶液，肿瘤特异性抗原(HPV16 E6E7)mRNA与免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA。未观察到处理相关毒性。监测肿瘤生长60天。
图29例示了可用于检查本文所述纳米颗粒组合物的作用的研究时间线。该时间线与上述实施例2-4中所述的实验所用时间线相似。第0天，通过蛹100μLHBSS中的1x105个肿瘤细胞(例如，在本实施例中为C3.43肿瘤细胞)在右后肢s.c.对小鼠(例如，C57BL6雌性小鼠，6-8周龄)进行单侧攻击。通过右后肢单侧i.m.或IT进行给药注射。对于10组，n＝10只小鼠/组。监测小鼠的肿瘤生长、显著体重减轻(每周测量一次)和外部痛苦体征(人道终点)。
图30A-30F各自显示，使用如图29中所示的方案瘤内注射上述纳米颗粒溶液之一的各个肿瘤的结果。例如，图30A显示了在C3.43肿瘤中瘤内注射第一纳米颗粒溶液的作用，所述第一纳米颗粒溶液包括肿瘤特异性抗原(HPV16 E6E7)mRNA与免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA，其显示几乎所有检查的肿瘤的平均肿瘤体积减少。图30B显示了瘤内注射第二纳米颗粒溶液的作用，所述第二纳米颗粒溶液包括肿瘤特异性抗原(HPV16)mRNA、第一免疫调节剂(LIGHT)mRNA和第二免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA，其显示平均肿瘤体积几乎完全减小。图30C显示第三纳米颗粒溶液，肿瘤特异性抗原(HPV16)mRNA和免疫刺激剂(CpG)较小的作用。
图30D显示了瘤内注射包括免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA，无肿瘤特异性抗原的纳米颗粒溶液对平均肿瘤体积的作用。图30E显示了瘤内注射包括第一免疫调节剂(LIGHT)mRNA和第二免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA(也无肿瘤抗原)的纳米颗粒溶液对平均肿瘤体积的作用。图30F显示了仅瘤内注射免疫刺激剂(CpG)对平均肿瘤体积的作用。
图31A和31B显示了肌内注射第一纳米颗粒溶液的结果，所述第一纳米颗粒溶液包括肿瘤特异性抗原(HPV16 E6E7)mRNA与免疫调节剂(促炎细胞因子IL-12)mRNA。与瘤内注射相同组合物相比，肌内注射未导致平均肿瘤体积减小。图31B显示对照处理(如PBS)的结果，其显示平均肿瘤体积呈时间依赖性增加。
图32是对于上述各种纳米颗粒组合物的生存概率的比较。当瘤内注射时，包括肿瘤抗原(例如，该模型中的HPV16 E6E7)和至少一种免疫调节剂，尤其是促炎细胞因子免疫调节剂(如IL-12)或IL-12与第二免疫调节剂(如LIGHT)的纳米颗粒显示完全或几乎完全的生存。肌内注射肿瘤抗原和IL-12的相同组合则导致生存期不超过60天。
检查了CD8 T细胞对本文所述的各种纳米颗粒组合物的响应。使用含有HPV16 E7(49-57)肽的H-2Db四聚体。在攻击后第39天对个体小鼠采血。将循环外周血单个核细胞(PBMC)的单细胞悬液与0.5μg/mL四聚体、1:100稀释的抗CD3抗体和1:100稀释的抗CD8抗体在4℃下温育30min。清洗细胞两次，并在2％多聚甲醛中固定。在Beckman CoulterFC 500流式细胞仪上采集至少100,000个细胞，并使用CXP软件进行分析。对CD8+细胞进行设门，并测定CD3+/CD8+/四聚体+细胞的百分比。四聚体阳性CD8 T细胞百分比为治疗干预诱导肿瘤特异性免疫的能力提供了生物标志物。
图33以图形的方式例示了结果，其显示瘤内注射纳米颗粒，从小鼠中鉴定出显著百分比的CD3+/CD8+/四聚体+细胞，所述纳米颗粒中肿瘤抗原(此实施例中，HPV16 E6E7)与免疫调节剂或免疫刺激剂在纳米颗粒中组合。四聚体阳性CD8 T细胞的百分比为治疗干预诱导肿瘤特异性免疫的能力提供了生物标志物。
图33中，空心圆圈代表第三次注射时存在小肿瘤或无肿瘤，这发生在第一和第二纳米颗粒溶液中。如图37所示，具有肿瘤抗原mRNA和免疫调节剂(如IL-12，或IL-12与LIGHT)或免疫刺激剂(如CpG)两者的纳米颗粒导致循环中肿瘤特异性T细胞的强烈活化。
制备(如制造、合成)mRNA治疗纳米颗粒的方法
本文描述的任何mRNA疗法(包括任何mRNA治疗纳米颗粒)都可以使用闭路系统制造；闭路系统可以包括生物芯片(例如微流体路径装置)，其可以在密封、无菌、和密闭环境操作以快速准确地合成mRNA治疗纳米颗粒(例如mRNA疫苗)。例如，本文描述了用于进行mRNA疗法的方法和设备(例如，系统、装置等)。在一个非限制性实例中，本文所述的方法和设备可用于生产针对皮肤T细胞淋巴瘤中活性癌症特异性抗原的治疗性mRNA治疗纳米颗粒。
因此，一般而言，本文描述了mRNA疗法的自动化、高产的制造方法，任选地在护理点处开展。
例如，使用闭路系统制造mRNA治疗纳米颗粒组合物的方法，该系统包括多个贮存库贮存库配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库，该方法包括：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，以在一个或多个微流控路径装置中进行以下过程中的每一个：形成DNA模板，进行从模板的治疗性mRNA的体外转录，纯化治疗性mRNA，以及将mRNA与递送媒介物组合。
使用闭路系统制造mRNA治疗纳米颗粒组合物的方法，该闭路系统包括贮存库贮存库配置为固定与一个或多个微流控路径装置(其中，所述一个或多个微流控路径装置包括多个反应器)以密封的流体连通的多个贮存库，该方法可以包括：将模板前体材料从一个或多个贮存库递送到多个反应器的第一反应器区域，并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；将模板转移到多个反应器的第二反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成治疗性mRNA；将治疗性mRNA转移到多个反应器的第三反应器区域，并处理治疗性mRNA以将其与递送媒介物组合以形成mRNA治疗纳米颗粒组合物，其中包括模板前体材料和递送媒介物的材料从贮存库递送到多个反应器中而不与大气接触。
使用闭路系统制造mRNA治疗纳米颗粒(在本文中通常称为mRNA治疗纳米颗粒组合物)的方法，所述闭路系统包括与一个或多个微流控路径装置(例如，其中一个或多个微流控路径装置包括多个反应器)以密封的流体连通的多个贮存库，该方法可以包括：诱导流体流动以将模板前体材料从一个或多个贮存库递送至多个反应器的第一个反应器区域，并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；将模板转移到多个反应器的第二反应器区域，并通过体外转录处理模板形成mRNA；将mRNA转移到多个反应器的第三反应器区域，并处理mRNA使其与递送媒介物组合，以形成mRNA治疗纳米颗粒组合物；并转移一个或多个贮存库的mRNA产物库，其中材料以亚微升的精度且在没有大气接触的情况下从贮存库递送到微流控路径装置的反应器中。在本文所述的任何方法中，任何过程都可以气动进行，例如，流体流可以气动诱导，流体可以气动转移等。可替代地或者另外地，通过机械、液压等方式驱动流体。
在任何这些方法(和用于执行它们的设备)中，闭路系统可以自动地和连续地执行用于形成模板、执行从模板体外转录治疗性mRNA、纯化治疗性mRNA以及将mRNA与递送媒介物组合的过程的组成部分。闭路系统可以气动地控制形成模板、执行从模板体外转录治疗性mRNA、纯化治疗性mRNA以及将mRNA与递送媒介物组合的过程的执行。在一些变型中，闭路系统气动地控制形成模板、执行从模板体外转录治疗性mRNA、纯化治疗性mRNA以及通过偏转一个或多个微流控路径装置内的一个或多个膜将mRNA与递送媒介物结合的过程的执行。
本文所述的任何方法和设备均可以经配置以在医疗保健单位如医院、诊所等进行设置和操作。这可以允许为特定患者定制即时/按需、患者特异性的疗法。可替代地或者另外地，对特定患者非特异性的治疗型分子可以以“患者个体化”方式与递送媒介物配制。由于本文方法和设备，这些方法中的任何一种都可以非常快速地进行。例如，闭路系统可以自动且连续地在少于5天的时间内进行形成模板、执行从模板体外转录治疗性mRNA、纯化治疗性mRNA和将mRNA与递送媒介物组合的过程。或者，系统可以使用预制模板作为输入，并在更短的时间内执行剩余的过程。
将mRNA与递送媒介物组合(配制治疗药物)可进一步包括在一个或多个微流控路径装置中透析mRNA治疗纳米颗粒组合物以纯化mRNA治疗纳米颗粒组合物。
这些方法中的任何一种都可进一步包括将mRNA治疗纳米颗粒组合物在一个或多个微流控路径装置上浓缩，和/或透析治疗药物。
可以使用任何适当的递送媒介物，包括，例如两亲性递送媒介物分子。例如，两亲性递送媒介物分子可包括氨基脂化类肽。
可替代地或另外地，本文所述的任何方法和设备中，mRNA可以预制和储存(例如，在约10℃、4℃、0℃、-10℃等)一段时间。例如，这些方法和执行方法的设备中的任何一种可包括治疗性mRNA的文库，其可以单独地或共同地(例如，约2、3、4、5、6等或更多的单个治疗性mRNA可以组合在一起)包囊在一起以形成mRNA治疗纳米颗粒组合物。如上所述，mRNA治疗纳米颗粒组合物可因此按需生产，并可在单个或多个mRNA治疗纳米颗粒组合物“混合物”(“cocktail”)中即时配制。
本文还描述了用于形成模板(例如，DNA模板)的方法。例如，使用闭路系统制备用于体外转录的合成双链DNA模板的方法，所述闭路系统包括多个贮存库贮存库与微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库，该方法可包括：将合成的感兴趣的基因与合成的体外转录易化物盒(facilitator cassette)连接，以创建合成的环状连接产物；将未反应的合成的感兴趣的基因和未反应的合成的体外转录易化物盒从合成的环状连接产物去除；扩增环状连接产物以生成分支或环状扩增的DNA；并将分支扩增的DNA连接产物线性化以生成双链DNA模板，其中在微流控路径装置中通过闭路系统分别进行连接、去除、扩增和线性化过程的每一个。
例如，高效、自动化的制备用于体外转录的合成双链DNA模板的方法可包括：将以下的每一个：合成的感兴趣的基因和合成的体外转录易化物盒从与微流控路径装置流体连通的多个贮存库的一个或多个贮存库中气动递送到微流控路径装置的连接反应器中，以通过将合成的感兴趣的基因与和合成的体外转录易化物盒连接创建合成的环状连接产物贮存库；将一个或多个外切核酸酶试剂从多个贮存库的一个或多个贮存库中气动引入连接反应器中，以通过将未反应的合成的感兴趣的基因和未反应的合成的体外转录易化物盒从合成的环状连接产物去除来去除微反应的材料；将合成的环状连接产物气动递送至微流控路径装置的多重置换扩增(MDA)反应器中以与一种或多种扩增剂组合，用于扩增环状连接产物，以生成分支或环状扩增的DNA；并将分支扩增的DNA连接产物气动转移到微流控路径装置的消化反应器中，以通过使分支扩增的DNA连接产物线性化来生成双链DNA模板，其中连接反应器、MDA反应器和消化反应器以及多个贮存库形成闭路和密封的环境。
制备用于mRNA治疗纳米颗粒组合物的合成双链DNA模板贮存库闭路贮存库的方法(使用包括多个贮存库的闭路系统，其配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通)可包括：在一个或多个微流控路径装置中，在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂：形成用于体外转录治疗性mRNA的模板。
一般而言，本文所述的方法和设备可以产生双链DNA模板，其可以不含细菌DNA和/或不含内毒素。本文所述的模板生成方法和设备可以不涉及细菌培养。此外，如本文所述制造的治疗性mRNA可以在不使用细菌多核苷酸的情况下从模板合成。因此，本文所述的任何方法可以是在不使用细菌DNA，和/或与内毒素分离的情况下产生治疗性mRNA的方法。特别地，本文描述了制造不含细菌DNA和/或内毒素的双链DNA模板的方法。本文所述的任何方法可以是无菌制造方法。
任何这些方法可包括用IIS型限制酶消化合成的体外转录易化物盒。连接可包括用DNA连接酶连接。去除可包括用外切核酸酶消化线性DNA。外切核酸酶可包含外切核酸酶V。扩增可包括多重置换扩增(MDA)。扩增可包括用Φ29DNA聚合酶扩增。扩增可包括产生分支扩增的DNA。
线性化可包括用IIs型限制酶消化。线性化可包括用BsaI限制酶消化。合成的感兴趣的基因可以是线性的。在一些变型中，合成的体外转录易化物盒包括双链DNA模板，其包含启动子；5’UTR；可切割的接头；3’UTR；和编码连续包含至少约200个腺嘌呤残基或约200个胸苷残基的polyA区域的部分。编码polyA区域的部分可至少长约300bp。在一些变型中，编码polyA区域的部分可以至少长约350bp。
合成的感兴趣的基因可至少包含T细胞受体的一部分。合成的感兴趣的基因可包括互补决定区(CDR)。
体外转录易化物盒的长度可小于2kb。体外转录易化物盒的长度可以小于1kb。体外转录易化物盒的长度可以小于约700个碱基对。合成的体外转录易化物盒可以不编码抗生素抗性基因。
合成的环状连接产物可以不具有复制起点(ORI)。体外转录易化物盒可以不具有复制起点(ORI)。
如上所述，本文所述的任何方法的过程均可在闭路微流控路径装置和/或封闭系统内进行。这些过程可以在闭路的微流控路径装置中进行，并且连接步骤可以在与扩增步骤不同的模块(例如，不同的微流控路径装置)中进行，且扩增步骤在与线性化步骤不同的模块中进行。
这些方法中的任何一种都可包括在一个或多个微流控路径装置的闭路中纯化模板。
本文还描述了使用本文所述的闭路方法和设备进行体外转录的方法。例如，使用闭路系统(例如，包括多个贮存库，贮存库其经配置固定为与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通)进行体外转录(IVT)反应的方法可包括：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，以在一个或多个微流控路径装置中进行从模板体外转录治疗性mRNA。
进行体外转录(IVT)反应的方法可包括：以亚微升精度计量的数量通过定向流体流动将DNA模板、聚合酶和核苷酸从多个贮存库自动递送到贮存库微流控路径装置的第一反应器中；在第一反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并通过微流控路径装置从第一反应器中气动转移治疗性mRNA，其中第一微流控路径装置和多个贮存库形成闭路且密封的环境以防止暴露于大气中。
闭路系统可自动且连续操作。闭路系统可气动控制从模板体外转录治疗性mRNA的执行。
这些方法中的任何一种也可包括在一个或多个微流控装置中纯化治疗性mRNA。运输试剂可包括将试剂从多个贮存库运输至微流控路径装置的第一反应器中。
本文还描述了配制(例如，与递送媒介物组合)治疗性mRNA的方法。例如，制造mRNA治疗纳米颗粒组合物的方法(例如使用闭路系统，其包括多个贮存库经贮存库配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库)可包括：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，以在一个或多个微流体路径装置中通过将治疗性mRNA与递送媒介物组合来配制mRNA治疗纳米颗粒组合物。闭路系统可以自动且连续地将mRNA与递送媒介物组合。闭路系统可气动控制mRNA与递送媒介物的组合。例如，闭路系统可以通过偏转一个或多个微流控路径装置内的一个或多个膜，气动控制mRNA与递送媒介物的组合。
将mRNA与递送媒介物组合可进一步包括，在一个或多个微流控路径装置中透析mRNA治疗纳米颗粒组合物以纯化mRNA治疗纳米颗粒组合物，和/或将mRNA治疗纳米颗粒组合物在一个或多个微流控路径装置上浓缩。
例如，本文描述了使用包括多个经配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统来制备mRNA的方法贮存库。这些方法的任何一种可包括：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，以在一个或多个微流控路径装置中进行以下过程的一个或多个：形成模板，进行从模板体外转录mRNA，和纯化mRNA。
使用包括多个经配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统来贮存库制备治疗性mRNA组合物的方法贮存库可包括：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，以在一个或多个微流控路径装置中进行以下过程的一个或多个：形成模板，进行从模板体外转录治疗性mRNA，纯化治疗性mRNA，并用递送媒介物配制mRNA。
使用包括多个经配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统来贮存库制备治疗性mRNA组合物的方法贮存库可包括：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，在一个或多个微流控路径装置中进行以下过程的一个或多个：形成模板，进行从模板体外转录治疗性mRNA，纯化治疗性mRNA，用递送媒介物配制mRNA，并对配制的治疗性mRNA进行透析和浓缩。
使用包括多个经配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统来贮存库制备治疗性mRNA组合物的方法贮存库可包括：遵循在非瞬时、计算机可读介质中编码的用于形成治疗性mRNA组合物的一系列过程，其中过程包括：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，以在一个或多个微流控路径装置中进行以下过程的一个或多个：形成模板，进行从模板体外转录治疗性mRNA，纯化治疗性mRNA，并将mRNA与递送媒介物组合。
本文还描述了使用包括多个经配置为固定与微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统来制备治疗性mRNA组合物的方法，贮存库该方法包括：在微流控路径装置上进行从模板体外转录治疗性mRNA，并在微流控路径装置上的一个或多个流体连接的反应器中纯化治疗性mRNA。
本文还描述了通过这些方法中的任何一种制备的治疗药物，尤其包括mRNA治疗药物。例如，本文描述了使用包括多个经配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统来制备的治疗性mRNA贮存库，mRNA通过如下制备：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，以在一个或多个微流控路径装置中进行以下过程的一个或多个：形成模板，进行从模板体外转录mRNA，以及纯化mRNA。
例如，本文描述了使用包括多个经配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统来贮存库制备的治疗性mRNA贮存库，mRNA通过如下制备：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，以在一个或多个微流控路径装置中进行以下过程的一个或多个：形成模板，进行从模板体外转录治疗性mRNA，纯化治疗性mRNA，并用递送媒介物配制mRNA。
例如，本文描述了使用包括多个经配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统来贮存库制备的治疗性mRNA，贮存库mRNA通过如下制备：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，以在一个或多个微流控路径装置中进行以下过程的一个或多个：形成模板，进行从模板体外转录治疗性mRNA，纯化治疗性mRNA，用递送媒介物配制mRNA，并对配制的治疗性mRNA进行透析和浓缩。
本文描述了使用包括多个经配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统来贮存库制备的治疗性mRNA组合物，贮存库通过如下制备：遵循在非瞬时、计算机可读介质中编码的用于形成治疗性mRNA组合物的一系列过程，其中过程包括：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，以在一个或多个微流控路径装置中进行以下过程的一个或多个：形成模板，进行从模板体外转录治疗性mRNA，纯化治疗性mRNA，并将mRNA与递送媒介物组合。例如，治疗性mRNA可以是使用包括多个经配置为固定与微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统来贮存库制备的治疗性mRNA组合物，方法包括在微流控路径装置上进行从模板体外转录治疗性mRNA，并在微流控路径装置上的一个或多个流体连接的反应器中纯化治疗性mRNA。
本文中的任何系统可包括经配置以执行这些方法的任何一种的控制器。因此，本文还描述了经配置以执行这些方法的任何一种的软件、固件或硬件。例如，本文描述了包含用于制备mRNA的指令的非瞬时计算机可读介质，当由包含多个经配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统的控制器执行时，贮存库其导致控制器执行以下方法：在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间，在被保护不受大气接触的封闭的流体路径中运输试剂，以在一个或多个微流控路径装置中进行以下过程的一个或多个：形成模板，进行从模板体外转录mRNA，并纯化mRNA。
例如，本文描述了包含用于制造mRNA(包括治疗性mRNA组合物)的指令的非瞬时计算机可读介质，当由包含多个经配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统的控制器贮存库执行时，贮存库其导致控制器执行本文所述的任何方法。
本文还描述了使用包括多个配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的闭路系统制备用于mRNA的合成双链DNA模板的方法，其可以包括：在保护免于大气接触的封闭流体路径中，在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间运输试剂，以将试剂组合；和形成用于体外转录治疗性mRNA的模板。
例如，使用可包括多个配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的闭路系统制备合成双链DNA模板的方法，合成双链DNA模板用于在mRNA体外转录反应中作于输入，方法包括：在保护免于大气接触的封闭流体路径中，在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间运输试剂；并形成治疗性mRNA体外转录的模板。
使用包括多个配置为固定与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统制备mRNA组合物的方法，其中一个或多个微流控路径装置包括多个反应器，方法可包括：将模板前体材料从一个或多个贮存库运送到多个反应器的第一反应器区域，并处理模板前体材料，以从模板前体材料制备模板；将模板转移到多个反应器的第二反应器区域，通过体外转录处理模板形成mRNA；并将mRNA转移到多个反应器的第三反应器区域，处理mRNA使其与递送媒介物结合形成mRNA组合物，其中，将包括模板材料和递送媒介物的材料从贮存库递送到多个反应器中，而不与大气接触。
一种使用包括多个配置为与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统制备mRNA组合物的方法，其中一个或多个微流控路径装置包括多个反应器，方法可包括：将模板前体材料从一个或多个贮存库气动输送至多个反应器的第一反应器区域，并处理模板前体材料，以从模板前体材料制备模板；将模板气动转移到多个反应器的第二反应器区域，通过体外转录处理模板，形成mRNA；将mRNA气动转移到多个反应器的第三反应器区域，并处理mRNA使其与递送媒介物结合，形成治疗性mRNA组合物；并将mRNA产物转移到一个或多个贮存库，其中材料从贮存库输送到微流控路径装置的反应器中，具有亚微升精度，且不与大气接触。
一种使用包括多个配置为与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的闭路系统制作用于体外转录的合成双链DNA模板的方法，该方法可包括：将合成的感兴趣的基因与合成的体外转录易化物盒连接，创建合成的环状连接产物；去除远离合成的环状连接产物的未反应的合成的感兴趣的基因和未反应的合成的体外转录易化物盒；扩增环状连接产物，得到分支或环状扩增的DNA；将分支扩增的DNA连接产物线性化，得到双链DNA模板，在微流控路径装置中通过闭路系统分别进行连接、去除、扩增和线性化过程。
这些方法中的任何一种都可以是高效、自动化的方法，包括制作用于体外转录的合成双链DNA模板的高效、自动化方法，例如，方法可包括：通过连接合成的感兴趣的基因和合成的体外转录易化物盒，将合成的感兴趣的基因和合成的体外转录易化物盒从多个贮存库的一个或多个贮存库中气动递送到微流控路径装置的连接反应器中，以创建合成的环状连接产物，多个贮存库与微流控路径装置进行流体连通；从多个贮存库的一个或多个贮存库中气动引入一个或多个核酸外切酶试剂至连接反应器中以去除未反应的物质，去除远离合成的环状连接产物的未反应的合成的感兴趣的基因和未反应的合成的体外转录易化物盒；将合成的环状连接产物气动递送至微流控路径装置的多重置换扩增(MDA)反应器中，与一种或多种扩增剂结合，用于扩增环状连接产物，生成分支或环状扩增的DNA；并将分支扩增的DNA连接产物气动转移到微流控路径装置的消化反应器中，通过使分支扩增的DNA连接产物线性化，生成双链DNA模板，其中连接反应器，MDA反应器和酶切反应器以及多个贮存库形成闭路和密封的环境。
一种制备用于体外转录的合成双链DNA模板的方法，该方法包括：遵循在非瞬时、计算机可读介质中编码的一系列过程，过程可包括：气动递送到微流控路径装置的连接反应器中，以创建合成的环状连接产物，多个贮存库与微流控路径装置进行流体连通；从多个贮存库的一个或多个贮存库中气动引入一个或多个核酸外切酶试剂至连接反应器中以去除未反应的物质，去除远离合成的环状连接产物的未反应的合成的感兴趣的基因和未反应的合成的体外转录易化物盒；将合成的环状连接产物气动递送至微流控路径装置的多重置换扩增(MDA)反应器中，与一种或多种扩增剂结合，用于扩增环状连接产物，生成分支或环状扩增的DNA；并将分支扩增的DNA连接产物气动转移到微流控路径装置的酶切反应器中，通过使分支扩增的DNA连接产物线性化，生成双链DNA模板，其中连接反应器，MDA反应器和消化反应器以及多个贮存库形成闭路和密封的环境。
一种使用包括多个与一个或多个微流控路径装置以密封的流体连通的贮存库的系统进行体外转录(IVT)反应的方法，该方法可包括：在保护免于大气接触的封闭流体路径中，在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间运输试剂，以从一个或多个微流控路径装置中的模板执行治疗性mRNA的体外转录。
本文还描述了执行体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括遵循在非瞬时、计算机可读介质中编码的一系列过程，其中过程包括：在反应过程中的任何时间，以亚微升精度计量的量将模板材料、聚合酶和核苷酸从多个贮存库气动递送到微流控路径装置的第一反应器中；在第一反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并通过微流控路径装置将治疗性mRNA气动转移出第一反应器，其中第一微流控路径装置和多个贮存库形成闭路和密封环境以防止大气暴露。
本文还描述了执行体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括遵循在非瞬时、计算机可读介质中编码的一系列过程，其中过程包括：通过诱导流体流动，遵循一系列过程以由控制器控制的量将模板材料、聚合酶和核苷酸从多个贮存库递送到微流控路径装置中；在一个或多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并通过微流控路径装置将治疗性mRNA转移出一个或多个反应器，其中第一微流控路径装置和多个贮存库形成闭路和密封环境以防止大气暴露。
本文还描述了执行体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括：通过诱导流体流动，以由预编程的软件命令控制的量将模板材料、聚合酶和核苷酸从多个贮存库递送到微流控路径装置中；在微流控路径装置的第一一个或多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并通过微流控路径装置将治疗性mRNA从第一一个或多个反应器转移到适于纯化mRNA的第二反应器中，其中微流控路径装置和多个贮存库形成闭路和密封环境以防止大气暴露。
本文还描述了执行体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括遵循在非瞬时、计算机可读介质中编码的一系列过程，其中过程包括：通过诱导流体流动，以由该一系列过程控制的量将模板材料、聚合酶、和核苷酸从多个贮存库递送到第一微流控路径装置的第一一个或多个反应器中；在第一一个或多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并通过第一微流控路径装置将治疗性mRNA从第一一个或多个反应器转移到适于纯化mRNA的第二一个或多个反应器中；并转移由此纯化的mRNA用于完成mRNA治疗纳米颗粒的配制，其中第一微流控路径装置和多个贮存库形成闭路和密封环境以防止大气暴露。
本文还描述了执行体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括遵循在非瞬时、计算机可读介质中编码的一系列过程，其中过程包括：将模板材料、聚合酶和核苷酸从多个贮存库气动递送到第一微流控路径装置的第一一个或多个反应器；在第一一个或多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并通过第一微流控路径装置将治疗性mRNA从第一一个或多个反应器转移到适于纯化mRNA的第二一个或多个反应器中；并转移纯化的mRNA至第三一个或多个反应器中，以将纯化的mRNA与一个或多个递送媒介物组合，从而形成mRNA治疗纳米颗粒，其中第一微流控路径装置和多个贮存库形成闭路和密封环境以防止大气暴露。
例如，本文还描述了执行体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括遵循在非瞬时、计算机可读介质中编码的一系列过程，其中过程可包括：将模板材料、聚合酶和核苷酸从多个贮存库气动递送到第一微流控路径装置的第一一个或多个反应器；在第一一个或多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并通过第一微流控路径装置将治疗性mRNA从第一一个或多个反应器转移到包含纤维素并适于纯化mRNA的第二一个或多个反应器中；并转移纯化的mRNA至第三一个或多个反应器中，以将纯化的mRNA与一个或多个递送媒介物组合，从而形成mRNA治疗纳米颗粒，其中第一微流控路径装置和多个贮存库形成闭路和密封环境以防止大气暴露。
本文还描述了使用包含多个贮存库的系统制造治疗性mRNA组合物的方法，该多个贮存库配置为与一个或多个微流控路径装置以密封流体连通相固定，该方法包括：在保护免于大气接触的封闭流体路径中，在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间运输试剂，以通过在一个或多个微流控路径装置中将一个或多个治疗性mRNA与递送媒介物结合来配制治疗性mRNA组合物。
使用包含多个贮存库的系统按需制造治疗性mRNA组合物的方法，该多个贮存库配置为与一个或多个微流控路径装置以密封流体连通相固定，该方法包括：在保护免于大气接触的封闭流体路径中，在多个贮存库的一个或多个贮存库和一个或多个微流控装置上的多个反应器之间运输试剂，以在一个或多个微流控路径装置中执行以下一个或多个过程：形成模板，从模板执行治疗性mRNA的体外转录，纯化治疗性mRNA，并用递送媒介物配制mRNA。
这些方法和仪器中的任何一种均可以在护理点进行操作(例如，生产治疗性mRNA)。这些方法和仪器中的任何一种均可以快速且连续地进行，例如，在不到72小时中制造治疗剂。
例如，本文描述了用于制造mRNA疗法的方法和仪器，其可以包括使用全自动、软件控制的微流控。这些方法和仪器可以用于个性化或个体化的疗法。本文还描述了仪器(例如，系统、装置等)和方法，其包括本文所述任何制造过程的软件控制，包括模板形成、体外转录、治疗性mRNA纯化、mRNA浓缩、以及将mRNA与一种或多种递送媒介物复合。软件控制可以允许这些方法自动化，从而使用于制造一种或多种治疗性mRNA的任何、一些或所有过程可以准确和精确地快速执行。软件控制和微流控精确递送和转移反应成分提供了提高过程控制、效率和重现性的机率，同时大幅减少或消除手动操作，降低了设施需求并缩短生产周期时间，最终导致更低成本的即时生产的疗法，如果适用。
在本文所述的仪器(例如，系统、装置等)的一些中，每批治疗材料均可以在专用的、一次性、可丢弃微流控路径装置(本文也称为生物芯片)中生产，微流控路径装置可以容纳在微流体路径设备控制系统(在本文中也称为控制系统)内。整个生产可以作为无菌设计、闭路过程进行，不与大气接触。所有生产过程均可以是自动化的，由控制系统控制以实现精确复制的过程，而不考虑容纳该系统的设施的属性。生产参数、原材料和环境数据(包括完整的视觉记录)可以成为云中加密并与每次生产运行相关联的广泛电子文件的一部分。此外，在生产过程中，纯化过程和大量的QC测定可以在单一的流体流中在线进行，通过在半导体行业开发的过程控制概念，允许在早期阶段检测到异常。通过利用全自动、软件控制的方法来制造，个性化和个体化的mRNA疗法可以以经济有效的方式制造，从而使患者受益。
特别是，这些方法和装置可以通过被称为体外转录(IVT)的合成技术在人体外合成产生mRNA疗法。在一些实例中，裸mRNA分子是大的、不穿过细胞膜的聚阴离子分子，并在体内被细胞外核酸酶迅速降解。本文所述的方法和仪器可以生产mRNA分子与一种或多种递送媒介物的制剂，该递送媒介物旨在将mRNA转运至靶标(组织、身体、组织区域等)。例如，在一些变化中，递送媒介物可以是含脂质的两亲性递送媒介物，在循环过程中提供对mRNA的包装和保护，避免免疫识别，并可以促进细胞摄取和释放。
一般而言，正如本文将更详细描述的，在一些变化中，生产过程的所有或一些，包括模板合成、IVT、纯化和用递送媒介物配制，均可以在一个或多个微流控路径装置的高度受控环境中执行，允许对稳健、高质量和高重现性的生产过程的优化。
疗法如mRNA疗法可以用于mRNA疫苗接种。除了其高效力外，mRNA疗法还具有与其快速开发周期、标准化制造、瞬时表达和低基因组整合风险相关的重要优势。
在一些变化中，本文所述的mRNA疗法可以包含在最终药物产品中作为活性成分，编码感兴趣的抗原或蛋白质的mRNA。mRNA的稳健翻译需要功能性5’帽结构。5’帽(或7-甲基鸟苷帽)由末端7-甲基鸟苷残基组成，末端7-甲基鸟苷残基通过5’-5’-三磷酸键与第一个转录的核苷酸连接。5’帽的存在对于核糖体识别mRNA和保护免于RNA酶至关重要。poly(A)尾通过结合与真核翻译起始因子eIF4G相互作用并进而与eIF4E形成复合物的poly(A)结合蛋白(PABP)，与m7G帽协同调节mRNA稳定性和翻译起始。poly(A)尾的长度可以影响mRNA到蛋白质翻译过程的效率。
本文所述的方法和仪器可以配制mRNA治疗纳米颗粒，在循环过程中对mRNA提供包装和保护，避免免疫识别，将药物产品定位在需要的组织中，并促进细胞摄取和释放，同时避免可能限制重复给药的毒性或免疫原性问题。
一般而言，生产mRNA治疗纳米颗粒(包括但不限于患者特异性T细胞淋巴瘤疫苗药物产品)的方法可包括，鉴定靶蛋白和设计mRNA序列、制备关于靶序列的双链DNA模板。该序列可用于生成用于体外转录(IVT)反应的mRNA，以合成mRNA。然后可以纯化该治疗性mRNA以除去过程杂质，并过滤以生成药物物质。然后可以用递送媒介物配制治疗性mRNA(包括在一些变化中用佐剂和递送媒介物组分配制以形成两亲性纳米颗粒)。随后可对制剂进行加工和纯化，以生成可用于递送至患者的药物产品。
作为一个变化的具体实例，制造患者特异性T细胞淋巴瘤疫苗药物产品的示例性过程可以包括，鉴定淋巴瘤细胞表达的克隆扩增TCR序列(个体基因型)。该过程还可以包括设计mRNA疫苗序列和制备用于IVT反应的双链DNA模板。模板可用于IVT反应以合成mRNA，并且可以纯化该治疗性mRNA以除去过程杂质并过滤制备治疗性mRNA作为药物物质。然后可以用免疫调节剂和递送媒介物组分配制治疗性mRNA以形成两亲性纳米颗粒。可以进行配制后加工以产生药物产品，如治疗性mRNA治疗纳米颗粒。
可以使用本文所述的自动化微流控路径装置控制系统来执行优化这些生产过程中的任何一个。例如，DNA模板生产可以在一个或多个微流控路径装置中进行；可以使用模板微流控路径装置(例如模板生物芯片)。在本实例中，可以在IVT微流控路径装置(例如，IVT生物芯片)上执行mRNA的体外转录和该材料的纯化以生成药物物质的过程，并且可以在制剂微流控路径装置(例如，制剂生物芯片)上完成制剂配制过程。这些微流控通道装置可能包含生产过程中执行每个过程所需的输入端口、计量阀、反应室和纯化结构。
仪器
本文所述的方法一般可以使用仪器来执行，该仪器可以包括一个或多个微流控路径装置(例如，生物芯片)，和微流控路径装置控制系统，其配置为控制微流控路径装置中的操作。这些微流控路径装置可以置于并保持在微流控路径装置控制系统(其在本文中可以被称为制造系统)内，微流控路径装置控制系统可以以闭路方式操作，该闭路能够防止一些、或更优选地几乎全部或全部制造部件暴露于大气中。图34A示出了微流控路径装置控制系统903的一个示例，该系统也可称为微流控路径装置管理系统，并且可包括：用于保持微流控路径装置的硬件、施加正/负压以操作微流控路径装置中的微流体操作，加热/冷却微流控路径装置的全部或区域、检测来自微流控路径装置的一个或多个特征和/或记录在一个或多个微流控路径装置上执行的操作。微流控路径装置控制系统还可包括一个或多个处理器(例如，控制器，未显示)和温控(例如，冷藏)容器905(例如，ISO 5级柜)。这种系统可以被使用或者可以包括一个或多个微流控路径装置901。微流控路径装置控制系统可包括基座932，以可释放地固定一个或多个微流控路径装置(例如，盒)901。微流控路径装置控制系统还可以包括用于在安装时冷却/加热微流控路径装置的热控制器，其可以在基座下面或与之耦合。流体接口组件939可被抬离(向上和/或向侧面)基座，以使一个或多个盒装载到基座中。流体接口组件可包括配置为应用到固定在基座中的微流控路径装置上的多个流体触点。流体触点可以偏向于微流控路径装置，例如，通过弹簧或类似物，以改善对微流控路径装置上的接收端口的密封。试剂贮存架943可置于基座和流体接口组件的上方或侧面。试剂贮存架可包括多个贮存库967。流体接口组件可以在例如当安装在基座中时紧邻在微流控路径装置上方的区域的中间开口。这种开口允许通过微流控路径装置进行可视化，以便进行监测和跟踪，并且也可以允许进入。图34A中多个传感器(例如相机)位于微流控路径装置控制系统的周边附近和中心区域上方，在基座之上，用于在例如使用压力源(未显示)驱动流体时，观察微流控路径装置控制系统的操作。
图34B是可以如本文所述使用的微流控路径装置控制系统示例的示意性例示。在本实例中，该装置包括包围基座915的外壳933，该基座915可以固定可以是一次性装置的一个或多个微流控路径装置911。该外壳可以是室、围护或类似装置，其中可包括盖或开口；关闭时，可以是密封的。外壳可封闭热调节器和/或可以配置为封闭在热调节环境(如制冷单元等)中。外壳可形成无菌屏障。在一些变化中，外壳可形成湿润或湿度受控的环境。
基座915配置为使用一个或多个销或其他组件来固定微流控路径装置，该一个或多个销或其他组件配置为以固定和预定的方向来固定微流控路径装置。
在一些变化中，热控制913可位于基座915附近，以调节一个或多个微流控路径装置911的温度。热控制可包括热电元件(例如珀耳帖(Peltier)装置)和/或一个或多个散热器，用于控制微流控路径装置中的全部或部分的温度。在一些变化中，可以包括一个以上的热控制，用于分别调节微流控路径装置的一个或多个区域的温度。热控制可以包括一个或多个热传感器(例如，热电偶等)，其可用于微流控路径装置的反馈控制和/或热控制。
如图34B所示，流体接口组件909将液体试剂和/或压力(例如，气体)与固定在基座915中的微流控路径装置911耦合，并且可以协助将流体材料以及正/负气体压力从压力源917输送至微流控路径装置911的内部。流体接口组件可以任选地帮助固定微流控路径装置，如下文所更详细描述。流体接口组件可以与装置可拆卸地耦合(也可以拆卸或部分拆卸)，以便在使用之间进行灭菌。
试剂贮存架907可以配置成包含多个流体样品架，每个样品架可以容纳流体小瓶，该流体小瓶配置为容纳试剂(例如核苷酸、溶剂、水等)，用于递送至微流控装置911，或替代地，流体小瓶可以配置为从微流控路径装置911的内部接收产物。试剂贮存架可称为试剂架。在一些变化中，试剂架包括多个压力线和/或歧管，其用于将一个或多个压力源917分成多个压力线，这些压力线可应用于，并且可被单独或集合(在子组合中)受控。或者，流体库(小瓶等)可以配置为直接固定并针对微流控路径装置密封。
流体接口组件可包括多个流体线和/或压力线并且可包括偏置的(例如，弹簧承载的)固定器或尖端，当微流控路径装置固定在基座915时(或，如上所述，替代地，该器械可以直接弹簧安装)，其可以单独或独立地驱动流体线和/或压力线到微流控路径装置中。微流体路径可以在控制系统内保持和固定，从而使微流控路径装置与其他组件(例如管路)稳定连接。管路，例如流体线和/或压力线，可以是流体接口组件的一部分，或可以连接到流体接口组件。在一些变化中，流体线包括柔性管路，通过连接器连接在试剂贮存架和微流控路径装置之间，该连接器以锁定接合(例如，套圈)将小瓶与管路耦合。流体路径的末端，在一些变化中流体线/压力线的末端，可以配置为针对微流控路径装置密封，例如，如本文所述，在微流控路径装置中形成的密封端口处。例如，流体线末端可能被切割或成形为扁平(侧视图中垂直)形状。小瓶可以经由连接器加压(例如>1个大气压的压力，如2个大气压、3个大气压、5个大气压等)，该连接器也可以连接到压力源。例如，流体小瓶可被加压至约6.9kPa至138kPa之间(例如约34.5kPa–138kPa，约69kPa等)。可以施加负压或正压；例如，可以施加真空(例如，约-48.2kPa或48.2kPa)以在处理结束时将流体抽回小瓶(例如，库)。一般而言，流体小瓶可以在比气动阀更低的压力下被驱动，这可以防止或减少泄漏。在一些变化中，流体和气动阀之间的压力差可为约34.5kPa(例如约48.3kPa、68.9kPa、82.7kPa、103.4kPa、137.9kPa等)，例如约34.5kPa-275.7kPa之间(例如约34.5kPa–206.8kPa、约34.5kPa–137.9kPa、约48.2kPa–275.8kPa、约48.2kPa–137.9kPa等)。
每个小瓶可以被编码(例如通过可由一个或多个传感器读取的标识符，如下所述)。控制器可监测流体水平以及从而检测流体接口组件中的每种材料的量。
该仪器还可包括磁场施加器919，其配置为在微流控路径装置911的区域产生磁场。一个或多个传感器905，其可以是光学传感器，可以是该仪器的一部分，并且当该装置安装在基座915内时，一个或多个传感器905可以感知一个或多个条形码、试剂贮存架内的流体小瓶内的流体水平和微流控路径装置911内的流体运动。
传感器可以进行装置上的过程测量，例如通过测量光学指示器。在一些变化中，可使用视觉/光学标志物预估收率。例如，荧光可通过用荧光团加标签来检测过程产率或残留物质。可替代地或者另外地，动态光散射可用于测量微流控路径装置的一部分(例如，混合部分)内的粒度分布。在一些变化中，可以使用一根或两根光纤进行传感器测量，以将光传输进入(例如激光)并检测发出的光学信号。可以在装置远程安装仪器包。这种非接触传感可能是有益的。
在本文所述的任何方法和装置中，传感器(例如视频传感器)可记录微流控路径装置(例如芯片或盒)上的所有活动。例如，合成和/或处理材料(如治疗性RNA)的整个运行可以通过一个或多个视频传感器记录，包括可以可视化微流控路径装置的视频传感器，例如从上方。可对微流控路径装置上的过程进行目视跟踪，并可保留该记录用于后续质量控制和/或处理。因此，可以保存、储存和/或传输处理过程的视频记录，以便进行后续检查和/或分析。
装置的内部部分，例如外壳933内，可进一步配置为可灭菌的。特别地，可移出部分装置并单独灭菌。可以例如通过UV照射，或限制污染或满足法规要求所需的任何其他灭菌方法，进行灭菌。包括外壳在内的仪器可安置在高效微粒空气(HEPA)过滤环境中。可将包括外壳在内的仪器安置在温度受控的环境中。此外，该仪器本身可包括一个或多个温度控制区域。在本文所述的任何仪器中，该仪器可包括(例如，在壳体内)温度控制区域，用于例如，在贮存温度下(例如，温度在约-10℃至约20℃之间，例如约10℃、约4℃，约-10℃等)，贮存试剂和/或贮存mRNA(例如，治疗性mRNA)。这些仪器中的任何一个都可包括制造的mRNA的文库，其可以单独使用，也可以与一个或多个另外的mRNA和递送媒介物组合使用。
如上所述，微流控路径装置控制器系统可由控制器921控制，包括通过微流控路径装置911施加压力到至少驱动流体运动。在一些情况下，控制器可至少部分位于外壳外部。可对控制器进行配置，以使其包括用户输入/输出。例如，系统的用户界面923可以使仪器和微流控路径装置易于操作和指导。
本文所述的任何仪器可包括图34B中所示的全部或部分组件；可能并不是所有组件都是必要的。图34B中，仅显示组件之间的部分连接；也可以使用另外(或替代)连接。
微流控路径装置控制系统可以支持微流控路径装置内部的所有生产活动，如试剂供应、流体控制、温度控制、混合、纯化和过程监控。可通过应用软件访问并控制微流控路径装置控制系统的生产活动。
微流控路径系统可配置为包括用于生产过程的一个或多个反应器，执行该生产过程以精确制备治疗(例如，治疗性mRNA)材料。相同的微流控路径装置可以在一个或多个微流控路径装置上串联和/或并联运行，并且不会中断微流控路径装置控制系统的连续路径性质。例如，当使用在使用多个微流控路径装置的多个反应器中执行的多个处理过程制造治疗材料时，流体产物，包括来自一个微流控路径装置的部分产物，可由该装置以闭路的方式转移到一个或多个另外的微流控路径装置，包括通过将包含微流控路径装置产物的流体移动到微流控路径装置控制装置的贮存库部分。
每个微流控路径装置可配置为包括一个或多个反应器，以便在生产过程中进行处理。例如，图35A-35C说明了微流控路径装置的三个示例。这些示例说明了三种不同类型的微流控路径装置：模板微流控路径装置(图35A)、体外转录(IVT)微流控路径装置(图35B)和配制微流控路径装置(图35C)。这些微流控路径装置示例中的每一种都可以配置为包括以受控和高重现的方式执行一组单元操作的功能。
在一些变化中，微流控路径装置可以配置为由两个更刚性的层和两个刚性层之间夹的柔性膜构成的多层结构。图35通过微流控路径装置的一个示例说明了剖面图(横向于微流控路径装置的平面)，该微流控路径装置具有形成处理本文所述治疗的反应器的多层。反应器可包括密封件、通道、阀门和室，包括由多层形成的增压室。例如，微流控路径装置可以由两个或多个刚性或半刚性板1103、1105和至少一个弹性层1107形成。弹性层1107可以是不渗透流体的弹性材料片。弹性层，包括在不同区域的弹性层，可具有一定的透气性，或者可以被处理具有或多或少的透气性。虽然可以使用单个连续的弹性材料片，但在某些变型中，可以使用多个弹性材料片，或者“片”可以由多个片的部分形成。可将各层和弹性层压在一起。一般而言，在弹性层两侧的板中可形成用于固定、装阀和/或泵送液体的室，因此弹性层将室分为含有液体的侧和施加压力(例如气体)的侧。室的总体积可以是恒定的，并且可以形成第一(例如上面)板和第二(例如下面)板，但该体积可以分为压力侧和液体侧。在压力侧施加正压力或负压，使弹性片变形，以减小(降至零，关闭室)含液体侧的体积或增加含液体侧的体积(达到预定的最大值)。可以连接室的压力施加侧，例如，通过连接至压力通道1147的上板1103中的压力端口1143，用于对一个或多个室的压力接收侧1119施加负压或正压。可通过液体通道1121将每个室的压力施加侧对面的含液体侧1117连接到液体端口1123。液体端口和压力端口都可以通过由进入上板1103和弹性层1107的开口形成，允许隔绝大气的密封连接，即使当压力线被推入弹性层1107时存在多个不同的输入线，弹性层1107由相对刚性或半刚性层1105、1109支撑在端口的下面。
应当理解的是，上述概念的所有组合均被视为本文披露的发明主题的一部分，并且可用于实现本文所述的益处。
本文使用的术语仅用于描述特定实例，并不意图限制本文。尽管本文中的术语“第一”和“第二”可用于描述各种特征/元素(包括步骤)，但除非上下文另有说明，否则这些特征/元素不应受这些术语限制。这些术语可用于区分一个特征/元素与另一个特征/元素。因此，下面讨论的第一特征/元素可以称为第二特征/元素，同样，下面讨论的第二特征/元素可以称为第一特征/元素，而不偏离本公开的教导。
除非上下文另有说明，本文给出的任何数值也应理解为包括约或近似该值。例如，如果公开值“10”，那么应视为也公开“约10”。此处列举的任何数字范围旨在包括其中包含的所有子范围。还应理解，如同本领域技术人员所理解的，当公开值时，应视为“小于或等于”该值、“大于或等于该值”和该值之间的可能范围也被公开。例如，如果公开值，那么“小于或等于”该值，以及“大于或等于”该值也被公开。还可以理解的是，在整个申请中，数据以多种不同的格式提供，并且该数据代表终点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应理解为大于、大于等于、小于、小于等于和等于10和15以及在10和15之间被视为公开。还应理解公开两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开10和15，那么也公开11、12、13和14。
序列表
<110> 胡桃钳医疗公司
Deutsch, Samuel
Fay, Nicole
Frimannsson, Daniel
Haabeth , Ole
McKinlay, Colin
<120> mRNA治疗纳米颗粒
<130> 14711-703.600
<140> PCT/US2021/028312
<141> 2021-04-21
<150> 63/014,074
<151> 2020-04-22
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gaactgaaca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag atattacggc 360
agttggttcg cctattgggg ccagggcaca ctggtcaccg tgtccagcgc caagacaaca 420
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tctctgtcta gcggcgtgca cacctttcca gccgttctgc agagcgacct gtacaccctg 600
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<213> 人工序列
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<223> aCTLA4_HC (重链)
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Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly Val
1               5                   10                  15
Gln Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro
            20                  25                  30
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
        35                  40                  45
Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu
    50                  55                  60
Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln
65                  70                  75                  80
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr
                85                  90                  95
Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
    130                 135                 140
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
145                 150                 155                 160
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
                165                 170                 175
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
            180                 185                 190
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
        195                 200                 205
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
    210                 215                 220
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
            260                 265                 270
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
        275                 280                 285
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
    290                 295                 300
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
305                 310                 315                 320
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
                325                 330                 335
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
            340                 345                 350
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
        355                 360                 365
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
    370                 375                 380
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
385                 390                 395                 400
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
                405                 410                 415
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
            420                 425                 430
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
        435                 440                 445
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
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Lys
465
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<212> DNA
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<223> aCTLA4_LC (轻链)- NTX-PMD-045
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atggacatga gagtgcccgc tcaactgctg ggactgctgc tgctttggct gagcggagcc 60
agatgcgaca ttcggagagc cgacatcgtg atgacccaga ccacactgag cctgcctgtg 120
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<212> PRT
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<223> aCTLA4_LC (轻链)
<400> 4
Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu
1               5                   10                  15
Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Arg Arg Ala Asp Ile Val Met Thr Gln
            20                  25                  30
Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
        35                  40                  45
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
65                  70                  75                  80
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
                85                  90                  95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
            100                 105                 110
Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
        115                 120                 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
    130                 135                 140
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
                165                 170                 175
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
            180                 185                 190
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
        195                 200                 205
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
    210                 215                 220
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
225                 230                 235                 240
Asn Arg Asn Glu Cys
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 5
atgtgtcccc agaagctgac catcagttgg ttcgccatcg tgctgctggt gtccccactg 60
atggccatgt gggaactcga gaaggacgtg tacgtggtgg aagtggactg gacccctgat 120
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accagcgatc agagacacgg cgtgatcggc tctggcaaga ccctgacaat taccgtgaaa 240
gagttcctgg acgccggcca gtacacctgt cacaaaggcg gagagacact gagccactct 300
catctgctgc tgcacaagaa agagaacggc atctggtcca ccgagatcct gaagaacttc 360
aagaacaaga ccttcctgaa gtgcgaggcc cctaactaca gcggcagatt cacctgtagc 420
tggctggtgc agcggaacat ggacctgaag ttcaacatca agtcctccag cagcagcccc 480
gacagcagag ctgtgacatg tggcatggct agcctgagcg ccgagaaagt gaccctggat 540
cagcgggact acgagaagta cagcgtgtcc tgccaagagg acgtgacctg tcctaccgcc 600
gaggaaacac tgcctattga gctggccctg gaagcccggc agcagaacaa atacgagaac 660
tactccacca gctttttcat ccgggacatc atcaagcccg atcctccaaa gaacctgcag 720
atgaagcctc tgaagaacag ccaggtcgag gtgtcctggg agtaccccga tagctggtct 780
acccctcaca gctacttcag cctgaaattc ttcgtgcgga tccagcgcaa gaaagaaaag 840
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<223> scIL-12 - NTX-PMD-063
<400> 6
Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu Val
1               5                   10                  15
Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val
            20                  25                  30
Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu Thr
        35                  40                  45
Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Arg
    50                  55                  60
His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys Glu
65                  70                  75                  80
Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr Leu
                85                  90                  95
Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser
            100                 105                 110
Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu
        115                 120                 125
Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln Arg
    130                 135                 140
Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Asp
145                 150                 155                 160
Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val
                165                 170                 175
Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln Glu
            180                 185                 190
Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Ala
        195                 200                 205
Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser Phe
    210                 215                 220
Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Met
225                 230                 235                 240
Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp
                245                 250                 255
Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val Arg
            260                 265                 270
Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys Asn
        275                 280                 285
Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln Cys
    290                 295                 300
Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Gly Gly
                325                 330                 335
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Ile
            340                 345                 350
Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu
        355                 360                 365
Lys Thr Thr Asp Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His
    370                 375                 380
Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp
385                 390                 395                 400
Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn
                405                 410                 415
Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser
            420                 425                 430
Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly
        435                 440                 445
Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile
    450                 455                 460
Asn Ala Ala Leu Gln Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys
465                 470                 475                 480
Gly Met Leu Val Ala Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn
                485                 490                 495
Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr
            500                 505                 510
Arg Val Lys Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg
        515                 520                 525
Val Val Thr Ile Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala
    530                 535                 540
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> TGF_beta_Trap_HC- NTX-PMD-069
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atgtaccgga tgcagctgct gagctgtatc gccctgtctc tggccctggt cacaaactct 60
gaggtccagc tgctggaatc tggcggagga cttgttcagc ctggcggctc tctgagactg 120
tcttgtgctg ccagcggctt caccttcagc agctatatca tgatgtgggt ccgacaggcc 180
cctggcaaag gactggaatg ggtgtccagc atctacccct ctggcggcat cacattctac 240
gccgacacag tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acagcaagaa caccctgtac 300
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatcaag 360
ctgggcaccg tgaccacagt ggactactgg ggacagggaa cactggtcac agtgtccagc 420
gcctctacaa agggccctag cgttttccca ctggctccca gcagcaagtc tacaagcgga 480
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ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcctagca gctctctggg cacccagacc 660
tacatctgca atgtgaacca caagcctagc aacaccaagg tggacaagag agtggaaccc 720
aagagctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgtcctg ctccagaact gctcggcgga 780
ccttccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatcag cagaacccct 840
gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct cacgaggacc ccgaagtgaa gttcaattgg 900
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 960
agcacctaca gagtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 1020
gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgaaaa gaccatcagc 1080
aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtttacacac tgcctccaag cagagaagag 1140
atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctcgtgaagg gcttctaccc ttccgatatc 1200
gccgtggaat gggagagcaa tggccagcca gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 1260
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gtccagatgg 1320
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1380
cagaagtctc tgtctctgtc ccctggaaaa ggcggcggag gaagcggagg cggaggatcc 1440
ggtggtggcg gatctacaat tcctccacac gtgcagaaaa gcgtgaacaa cgacatgatc 1500
gtgaccgaca acaacggggc cgtgaagttc cctcagctgt gcaagttctg cgacgtgcgg 1560
ttcagcacct gtgacaacca gaaaagctgc atgagcaact gcagcatcac cagcatctgc 1620
gagaagcccc aagaagtgtg cgtcgccgtt tggagaaaga acgacgagaa catcaccctg 1680
gaaaccgtgt gtcacgaccc caagctgccc taccacgact tcatcctgga agatgccgcc 1740
tctcctaagt gcatcatgaa ggaaaagaag aagcccggcg agacattctt catgtgcagc 1800
tgtagcagcg acgagtgcaa cgacaacatc atcttcagcg aagagtataa cacgagcaac 1860
cccgactga 1869
<210> 8
<211> 620
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGF_beta_Trap_HC- NTX-PMD-069
<400> 8
Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu Val
1               5                   10                  15
Thr Asn Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
    210                 215                 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                245                 250                 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            260                 265                 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        275                 280                 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    290                 295                 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                325                 330                 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            340                 345                 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        355                 360                 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    370                 375                 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                405                 410                 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            420                 425                 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        435                 440                 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
465                 470                 475                 480
Gly Gly Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp
                485                 490                 495
Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys
            500                 505                 510
Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys
        515                 520                 525
Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val
    530                 535                 540
Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr
545                 550                 555                 560
Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp
                565                 570                 575
Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu
            580                 585                 590
Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile
        595                 600                 605
Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
    610                 615                 620
<210> 9
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGF_beta_Trap_LC- NTX-PMD-070
<400> 9
atgtaccgga tgcagctgct gagctgtatc gccctgtctc tggccctggt cacaaacagc 60
cagtctgccc tgacacagcc tgcctctgtg tctggatctc ctggccagag catcaccatc 120
agctgtaccg gcacaagctc tgacgtcggc ggctacaatt acgtgtcctg gtatcagcag 180
caccccggca aggctcccaa gctgatgatc tacgacgtgt ccaacagacc cagcggcgtg 240
tccaatagat tctccggcag caagagcggc aacaccgcca gtctgacaat cagcggactg 300
caggctgagg acgaggccga ctactactgt agcagctaca ccagctccag caccagagtg 360
ttcggcaccg gcaccaaagt gacagtgctg ggacagccca aggctaaccc taccgtgaca 420
ctgttccctc caagcagcga agaactgcag gccaacaagg ccacactcgt gtgcctgatc 480
agcgacttct atcctggcgc cgtgacagtg gcctggaagg ctgatggatc tccagtgaag 540
gctggcgtgg aaaccaccaa gcctagcaag cagagcaaca acaaatacgc cgccagcagc 600
tatctgagcc tgacacctga gcagtggaag tcccacagat cctacagctg ccaagtgacc 660
cacgagggca gcaccgtgga aaagacagtg gctcctaccg agtgcagctg a 711
<210> 10
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGF_beta_Trap_LC- NTX-PMD-070
<400> 10
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1               5                   10                  15
Val Thr Asn Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly
            20                  25                  30
Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp
        35                  40                  45
Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser
            100                 105                 110
Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
        115                 120                 125
Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro
    130                 135                 140
Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile
145                 150                 155                 160
Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly
                165                 170                 175
Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser
            180                 185                 190
Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln
        195                 200                 205
Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser
    210                 215                 220
Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                 235
<210> 11
<211> 846
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFSF14/LIGHT
<400> 11
gagcctcctg gagactgggg gcctcctccc tggagatcca cccccaaaac cgacgtcttg 60
aggctggtgc tgtatctcac cttcctggga gccccctgct acgccccagc tctgccgtcc 120
tgcaaggagg acgagtaccc agtgggctcc gagtgctgcc ccaagtgcag tccaggttat 180
cgtgtgaagg aggcctgcgg ggagctgacg ggcacagtgt gtgaaccctg ccctccaggc 240
acctacattg cccacctcaa tggcctaagc aagtgtctgc agtgccaaat gtgtgaccca 300
gccatgggcc tgcgcgcgag ccggaactgc tccaggacag agaacgccgt gtgtggctgc 360
agcccaggcc acttctgcat cgtccaggac ggggaccact gcgccgcgtg ccgcgcttac 420
gccacctcca gcccgggcca gagggtgcag aagggaggca ccgagagtca ggacaccctg 480
tgtcagaact gccccccggg gaccttctct cccaatggga ccctggagga atgtcagcac 540
cagaccaagt gcagctggct ggtgacgaag gccggagctg ggaccagcag ctcccactgg 600
gtatggtggt ttctctcagg gagcctcgtc atcgtcattg tttgctccac agttggccta 660
atcatatgtg tgaaaagaag aaagccaagg ggtgatgtag tcaaggtgat cgtctccgtc 720
cagcggaaaa gacaggaggc agaaggtgag gccacagtca ttgaggccct gcaggcccct 780
ccggacgtca ccacggtggc cgtggaggag acaataccct cattcacggg gaggagccca 840
aaccac 846
<210> 12
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFSF14/LIGHT
<400> 12
Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro Lys
1               5                   10                  15
Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala Pro
            20                  25                  30
Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val
        35                  40                  45
Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu
    50                  55                  60
Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln
                85                  90                  95
Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg
            100                 105                 110
Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile Val
        115                 120                 125
Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser Ser
    130                 135                 140
Pro Gly Gln Arg Val Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr Leu
145                 150                 155                 160
Cys Gln Asn Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu Glu
                165                 170                 175
Glu Cys Gln His Gln Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala Gly
            180                 185                 190
Ala Gly Thr Ser Ser Ser His Trp Val Trp Trp Phe Leu Ser Gly Ser
        195                 200                 205
Leu Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr Val Gly Leu Ile Ile Cys Val
    210                 215                 220
Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val Ser Val
225                 230                 235                 240
Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile Glu Ala
                245                 250                 255
Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu Thr Ile
            260                 265                 270
Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
        275                 280

Claims (66)

1.方法，所述方法包括：
瘤内注射mRNA纳米颗粒，所述mRNA纳米颗粒包含
(i)编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；
(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA；和
(iii)递送媒介物分子，其中所述第一mRNA和所述第二mRNA由所述递送媒介物分子包囊在一起。
2.权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤特异性抗原包括病毒抗原。
3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述病毒抗原与人乳头瘤病毒(HPV)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、Epstein–Barr病毒(EBV)、Merkel细胞多瘤病毒、人巨细胞病毒(CMV)或其任何组合相关联。
4.权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤特异性抗原包括新表位。
5.权利要求4所述的方法，其中所述肿瘤特异性抗原包括患者特异性抗原。
6.权利要求4所述的方法，其中所述肿瘤特异性抗原包括多种患者特异性抗原。
7.权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤特异性抗原包括共享肿瘤抗原。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述递送媒介物分子包括氨基脂化类肽。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述mRNA纳米颗进一步包含编码第二免疫调节剂的第三mRNA。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述mRNA纳米颗粒进一步包含免疫调节性siRNA。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述编码免疫调节剂的第二mRNA编码：检查点抑制剂、免疫抑制拮抗剂、促炎剂或其任何组合。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述编码免疫调节剂的第二mRNA编码促炎细胞因子。
13.权利要求12所述的方法，其中所述促炎细胞因子是以下之一：(IL)、IL-1、IL-2、IL-12、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α。
14.权利要求12所述的方法，其中所述促炎细胞因子是白细胞介素-12(IL-12)。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述编码免疫调节剂的第二mRNA编码肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)。
16.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述编码免疫调节剂的第二mRNA编码抗CTLA-4。
17.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述编码免疫调节剂的第二mRNA编码TGF-β拮抗剂。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述mRNA纳米颗粒进一步包含免疫刺激剂。
19.权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述mRNA纳米颗粒进一步包含含有CpG寡脱氧核苷酸的免疫刺激剂。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法，其进一步包括重复所述瘤内注射一次或多次，在注射之间具有等待，其中所述等待在约1至约14天之间。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA和所述编码免疫调节剂的第二mRNA在单个mRNA链上。
22.权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述方法是治疗患有淋巴瘤的患者的方法。
23.权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述方法是治疗患有宫颈癌的患者的方法。
24.方法，所述方法包括：
将mRNA纳米颗粒瘤内注射到有此需要的患者中，所述mRNA纳米颗粒包含
(i)编码宫颈癌特异性抗原的第一mRNA；
(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA，所述免疫调节剂包括：促炎细胞因子；和
(iii)递送媒介物分子，其中所述第一mRNA和所述第二mRNA由所述递送媒介物分子包囊在一起。
25.mRNA治疗纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
(i)编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；
(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA；和
(iii)递送媒介物分子，其中所述第一mRNA和所述第二mRNA由所述递送媒介物分子包囊在一起。
26.mRNA治疗纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
(i)编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；
(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA，其与SEQ ID NO:5的核苷酸序列至少约80％相同；和
(iii)递送媒介物分子，其包含氨基脂化类肽递送媒介物，其中所述第一mRNA和所述第二mRNA由所述递送媒介物分子包囊在一起。
27.mRNA治疗纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
(i)编码宫颈癌特异性抗原的第一mRNA；
(ii)编码免疫调节剂的第二mRNA，所述免疫调节剂包含：促炎细胞因子；和
(iii)递送媒介物分子，其中所述第一mRNA和所述第二mRNA由所述递送媒介物分子包囊在一起。
28.权利要求25或27所述的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述递送媒介物分子包括氨基脂化类肽。
29.权利要求25-27所述的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述第一mRNA编码患者特异性抗原。
30.权利要求29所述的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述第一mRNA编码多种患者特异性抗原。
31.权利要求25-26中任一项所述的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述第一mRNA编码共享肿瘤抗原。
32.权利要求25所述的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述第二mRNA编码：检查点抑制剂、免疫抑制拮抗剂、促炎剂或其任何组合。
33.权利要求25所述的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述第二mRNA编码抗CTLA-4。
34.权利要求25中任一项所述的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述第二mRNA编码抗CTLA-4，所述第二mRNA与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列至少约80％相同。
35.权利要求25-27中任一项所述的mRNA治疗纳米颗粒，其进一步包含编码肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)的第三mRNA。
36.权利要求25-27中任一项所述的mRNA治疗纳米颗粒，其进一步包含编码TGF-β拮抗剂的第三mRNA，其与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的核苷酸序列至少约80％相同。
37.权利要求25的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述第二mRNA编码白细胞介素-12，所述第二mRNA与SEQ ID NO:5的核苷酸序列至少约80％相同。
38.权利要求25-27中任一项所述的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述mRNA治疗纳米颗粒进一步包含免疫刺激剂。
39.权利要求38所述的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述免疫刺激剂包括CpG寡脱氧核苷酸。
40.权利要求25所述的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述肿瘤特异性抗原和所述免疫调节剂的各自开放阅读框(ORF)是单个mRNA链的部分。
41.权利要求25所述的mRNA治疗纳米颗粒，其中所述肿瘤特异性抗原和所述免疫调节剂的各自开放阅读框(ORF)是不同mRNA链的部分。
42.方法，所述方法包括：
在微流控路径装置中执行从模板体外转录编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；
纯化所述第一mRNA；
在所述微流控路径装置中执行编码第一免疫调节剂的第二mRNA的体外转录；
在所述微流控路径装置中纯化所述第二mRNA；和
在所述微流控路径装置中将所述第一mRNA和所述第二mRNA与递送媒介物分子包囊在一起以形成mRNA治疗纳米颗粒。
43.方法，所述方法包括：
在微流控路径装置的第一室中执行从模板体外转录编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；
纯化所述第一mRNA；
在所述微流控路径装置的第二室中执行编码第一免疫调节剂的第二mRNA的体外转录；
在所述微流控路径装置中纯化所述第二mRNA；
在所述微流控路径装置的第三室中执行编码第二免疫调节剂的第三mRNA的体外转录；
在所述微流控路径装置中纯化所述第三mRNA；和
在所述微流控路径装置中将所述第一mRNA、所述第二mRNA和所述第三mRNA与递送媒介物分子包囊在一起以形成mRNA治疗纳米颗粒。
44.权利要求42-43中任一项所述的方法，其中所述纯化所述第一mRNA、所述纯化所述第二mRNA和所述纯化所述第三mRNA中的每一项进一步包括所述在所述微流控路径装置上的一个或多个反应器中纯化。
45.权利要求44所述的方法，其中所述在一个或多个反应器中纯化包括在所述一个或多个反应器内使用纤维素除去双链mRNA。
46.权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述微流控路径装置包括闭路系统以自动且连续地执行所述第一mRNA和所述第二mRNA中的每一个的体外转录，纯化所述第一mRNA和所述第二mRNA，并将所述第一mRNA和所述第二mRNA与所述递送媒介物分子组合。
47.权利要求46所述的方法，其中所述闭路系统气动控制执行所述第一和所述第二mRNA的体外转录，纯化所述第一和所述第二mRNA，并将所述第一和所述第二mRNA与所述递送媒介物分子组合。
48.权利要求46所述的方法，其中所述闭路系统气动控制：
执行所述第一mRNA和所述第二mRNA的体外转录，
纯化所述第一mRNA和所述第二mRNA，以及
通过偏转所述微流控路径装置内的一个或多个膜，将所述第一mRNA和所述第二mRNA与所述递送媒介物分子组合。
49.权利要求46所述的方法，其中所述闭路系统自动且连续地：
在总共少于约5天的时间内，
执行治疗性mRNA的体外转录，
纯化所述治疗性mRNA，以及
将所述mRNA与递送媒介物组合。
50.权利要求42-49中任一项所述的方法，其中所述方法在医疗保健单位执行。
51.权利要求42-50中任一项所述的方法，其中将所述mRNA与所述递送媒介物组合进一步包括在所述微流控路径装置中透析所述mRNA治疗纳米颗粒。
52.权利要求42-50中任一项所述的方法，其进一步包括将所述mRNA治疗纳米颗粒集中在所述微流控路径装置上。
53.权利要求42-52中任一项所述的方法，其中所述递送媒介物分子包括两亲性分子。
54.权利要求53所述的方法，其中所述两亲性分子包括氨基脂化类肽。
55.权利要求42-54中任一项所述的方法，其中所述编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA包括编码患者特异性抗原的mRNA。
56.权利要求55所述的方法，其中所述第一mRNA编码多种患者特异性抗原。
57.权利要求42-56中任一项所述的方法，其中所述编码免疫调节剂的第二mRNA编码：检查点抑制剂、免疫抑制拮抗剂、促炎剂或其任何组合。
58.权利要求42-57中任一项所述的方法，其中所述编码免疫调节剂的第二mRNA编码抗CTLA-4。
59.权利要求42-57中任一项所述的方法，其中所述编码免疫调节剂的第二mRNA编码TGF-β拮抗剂。
60.权利要求42-57中任一项所述的方法，其中所述编码免疫调节剂的第二mRNA编码单链白细胞介素-12(IL-12)。
61.权利要求42-57中任一项所述的方法，其中将所述第一mRNA和所述第二mRNA组合包括在所述微流控路径装置中添加免疫刺激剂。
62.权利要求61所述的方法，其中所述免疫刺激剂包括CpG寡脱氧核苷酸。
63.微流控路径装置，其包括：
弹性层，其夹在第一表面和第二表面之间；
模板体外转录(IVT)室，其在所述第一表面和所述第二表面之间形成，其中所述弹性层的一部分将所述模板IVT室分隔为所述第二表面中的流体接触侧和所述第一表面中的压力接收侧，其中所述模板IVT室的流体接触侧与编码肿瘤特异性抗原的mRNA模板的源流体连通；
第一反应器，其与所述模板IVT室的流体接触侧流体连通，所述第一反应器包括所述第一反应器内的双链mRNA结合材料以除去双链mRNA；
混合组件，其与所述第一反应器、与第一免疫调节剂mRNA的源，并且与耦合至递送媒介物分子的源的递送媒介物端口流体连通，以将所述第一mRNA和所述第二mRNA与所述递送媒介物分子包囊在一起以形成mRNA治疗纳米颗粒；和
多个压力通道，其各自从一个或多个压力端口延伸，通过所述第一表面和所述弹性层，进入所述第二表面并通过所述弹性层返回进入所述第一表面，其中所述多个压力通道的每个压力通道与所述模板IVT室的压力接收侧流体连接，进一步地，其中所述模板IVT室的流体接触侧的体积可以通过从所述压力端口中的一个或多个中施加压力来调节，以驱动流体通过所述微流控路径装置以形成所述mRNA治疗纳米颗粒。
64.微流控路径装置，其包括：
弹性层，其夹在第一表面和第二表面之间；
模板体外转录(IVT)室，其在所述第一表面和所述第二表面之间形成，其中所述弹性层的一部分将所述模板IVT室分隔为所述第二表面中的流体接触侧和所述第一表面中的压力接收侧，其中所述模板IVT室的流体接触侧与编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA模板的源流体连通；
第一反应器，其与所述模板IVT室的流体接触侧流体连通，所述第一反应器包括所述第一反应器内的双链mRNA结合材料以除去双链mRNA；
第一免疫调节剂IVT室，其在所述第一表面和所述第二表面之间形成，其中所述弹性层的一部分将所述第一免疫调节剂IVT室分隔为所述第二表面中的流体接触侧和所述第一表面中的压力接收侧，其中所述第一免疫调节剂IVT室的流体接触侧与编码第一免疫调节剂的第一免疫调节剂模板的源流体连通；
第二反应器，其与所述第一免疫调节剂IVT室的流体接触侧流体连通，所述第二反应器包括所述第一反应器内的双链mRNA结合材料以除去双链mRNA；
第一混合室，其与所述第一反应器和所述第二反应器流体连通；
第二混合室，其与所述第一混合室的输出和耦合至递送媒介物分子的源的递送媒介物端口流体连通，以将所述第一mRNA和所述第二mRNA与所述递送媒介物分子包囊在一起以形成mRNA治疗纳米颗粒；和
多个压力通道，其各自从一个或多个压力端口延伸，通过所述第一表面和所述弹性层，进入所述第二表面并通过所述弹性层返回进入所述第一表面，其中所述多个压力通道的每个压力通道与所述模板IVT室和所述第一免疫调节剂IVT室的压力接收侧流体连接，
进一步地，其中所述模板IVT室的流体接触侧和所述第一免疫调节剂IVT室的流体接触侧的体积可以通过从所述压力端口中的一个或多个中施加压力来调节。
65.方法，所述方法包括：
注射mRNA纳米颗粒，所述mRNA纳米颗粒包含
(iv)编码肿瘤特异性抗原的第一mRNA；
(v)编码免疫调节剂的第二mRNA；和
(vi)递送媒介物分子，其中所述第一mRNA和所述第二mRNA由所述递送媒介物分子包囊在一起。
66.方法，所述方法包括：
将mRNA纳米颗粒注射到有此需要的患者中，所述mRNA纳米颗粒包含
(iv)编码宫颈癌特异性抗原的第一mRNA；
(v)编码免疫调节剂的第二mRNA，所述免疫调节剂包括：促炎细胞因子；和
(vi)递送媒介物分子，其中所述第一mRNA和所述第二mRNA由所述递送媒介物分子包囊在一起。
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