BR112020002272A2 - conjugados de citocina para o tratamento de doenças autoimunes - Google Patents

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Abstract

São revelados no presente documento conjugados de interleucina (IL) (por exemplo, conjugados de IL-2) e uso no tratamento de uma ou mais indicações. Também são descritos no presente documento composições e kits farmacêuticos que compreendem um ou mais dos conjugados de interleucina (por exemplo, conjugados de IL-2).

Description

“CONJUGADOS DE CITOCINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTOIMUNES” REFERÊNCIA CRUZADA
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US no 62/540.781, depositado em 3 de agosto de 2017, que é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e que é incorporada no presente documento por referência na sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em sexta-feira, 3 de agosto de 2018, é denominada 46085-710_602_SL.txt e tem 3.703 bites de tamanho.
ANTECEDENTES DA REVELAÇÃO
[0003] Populações distintas de células T modulam o sistema imunológico para manter homeostase e tolerância imunológica. Por exemplo, as células T regulatórias (Treg) impedem respostas impróprias pelo sistema imunológico impedindo a autorreatividade patológica enquanto as células T citotóxicas alvejam e destroem células infectadas e/ou células cancerosas. Em alguns exemplos, a modulação das populações diferentes de células T fornece uma opção para tratamento de uma doença ou uma indicação.
SUMÁRIO DA REVELAÇÃO
[0004] São revelados no presente documento, em determinadas modalidades, conjugados de citocina e uso no tratamento de uma ou mais indicações. Em algumas modalidades, também são descritos no presente documento conjugados de interleucina 2 (IL-2) e uso no tratamento de uma ou mais indicações. Em alguns exemplos, as uma ou mais indicações compreendem uma doença autoimune. Em alguns casos, são descritos no presente documento conjugados de IL-2 para modular a interação entre IL-2 e receptor de IL-2 para estimular ou expandir especificamente populações de células T regulatórias (célula Treg). Em alguns casos, são descritos no presente documento conjugados de IL-2 com meia-vida in vivo estendida, toxicidade reduzida e/ou janelas terapêuticas expandidas. Em casos adicionais, são descritos no presente documento composições e kits farmacêuticos que compreendem um ou mais conjugados de interleucina (por exemplo, conjugados de IL-2) descritos no presente documento.
[0005] É revelado no presente documento, em determinadas modalidades, um polipeptídeo de interleucina 2 (IL-2) isolada e modificada que compreende pelo menos um aminoácido não natural em uma posição que reduz a potência de sinalização de receptor para receptor βγ de interleucina 2 (IL-2Rβγ) ou reduz um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ, mas retém ativação significativa de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ), em que a potência de sinalização de receptor reduzida é comparada à potência de sinalização de receptor entre um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem e IL-2Rβγ, e em que o recrutamento é comparado a um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ por um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20,
Q22, M23, N26, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, R81, P82, R83, D84, S87, N88, N89, V91, I92, L94, E95, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, T113, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, R81, D84, S87, N88, V91, I92, L94, E95, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, P82, R83, N89, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, e T113, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, D84, N88, E95, e Q126, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, e H16, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de Q22, N26, N88, e Q126, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de E15, D20, D84, e E95, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de L12, L19, e M23, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de Q22 e N26, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural: é um análogo de lisina; é um análogo de cisteína ou um análogo de histidina; compreende uma cadeia lateral aromática; compreende um grupo azido; compreende um grupo alcino; ou compreende um grupo aldeído ou cetona.
Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural não compreende uma cadeia lateral aromática.
Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural compreender N6-azidoetoxi-L-lisina(AzK), N6-propargiletoxi- L-lisina (PraK), BCN-L-lisina, lisina de norborneno, TCO- lisina, lisina de metiltetrazina, aliloxicarbonilisina, ácido 2-amino-8-oxononanoico, ácido 2-amino-8-oxo- octanoico, p-acetil-L-fenilalanina, p-azidometil-L- fenilalanina (pAMF), p-iodo-L-fenilalanina, m- acetilfenilalanina, ácido 2-amino-8-oxononanoico, p- propargiloxifenilalanina, p-propargil-fenilalanina, 3- metil-fenilalanina, L-Dopa, fenilalanina fluorada,
isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-acil-L- fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, p- bromofenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, isopropil-L- fenilalanina, O-aliltirosina, O-metil-L-tirosina, O-4-alil- L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, fosfonotirosina, tri-O- acetil-GlcNAcp-serina, L-fosfosserina, fosfonosserina, L-3- (2-naftil)alanina, ácido 2-amino-3-((2-((3-(benziloxi)-3- oxopropil)amino)etil)selanil)propanoico, 2-amino-3- (fenilselanil)propanoico, ou selenocisteína.
Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural é incorporado no polipeptídeo de IL-2 modificada por um par de tRNA sintetase/tRNA ortogonal.
Em algumas modalidades, o tRNA ortogonal do par sintetase/tRNA ortogonal compreende pelo menos uma nucleobase não natural.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada é covalentemente fixado a uma fração de conjugação através do pelo menos um aminoácido não natural.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação compreende um polímero solúvel em água, um lipídeo, uma proteína ou um peptídeo.
Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende polietileno glicol (PEG), poli(propileno glicol) (PPG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, poliol poli(oxietilado), álcool poli(olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacarídeos), ácido poli(α-hidróxi), álcool poli(vinila), polifosfazeno, polioxazolinas (POZ), poli(N-acriloilmorfolina), ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma molécula de PEG.
Em algumas modalidades, a molécula de PEG é um PEG linear.
Em algumas modalidades, a molécula de PEG é um PEG ramificado.
Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende um polissacarídeo.
Em algumas modalidades, o polissacarídeo compreende dextrano, ácido polissiálico (PSA), ácido hialurônico (HA), amilose, heparina, sulfato de heparano (HS), dextrina, ou amido de hidroxietila (HES). Em algumas modalidades, o lipídeo compreende um ácido graxo.
Em algumas modalidades, o ácido graxo compreende de cerca de 6 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 24 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 22 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 20 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 18 átomos de carbono, de cerca de 20 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 24 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 22 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 20 átomos de carbono, ou de cerca de 12 a cerca de 18 átomos de carbono.
Em algumas modalidades, o ácido graxo é um ácido graxo saturado.
Em algumas modalidades, a proteína compreende uma albumina, uma transferrina ou uma transtiretina.
Em algumas modalidades, a proteína compreende um anticorpo ou seus fragmentos de ligação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o anticorpo ou seus fragmentos de ligação dos mesmos compreendem uma porção de Fc de um anticorpo.
Em algumas modalidades, o peptídeo compreende um peptídeo de XTEN, um polímero de homoaminoácido rico em glicina (HAP), um polipeptídeo de PAS, um polipeptídeo semelhante à elastina (ELP), um peptídeo de CTP, ou um polímero de proteína semelhante à gelatina.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação é indiretamente ligada ao pelo menos um aminoácido não natural da IL-2 modificada através de um ligante.
Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante homobifuncional, um ligante heterobifuncional, um ligante de comprimento zero, um ligante dipeptídeo clivável ou um não clivável, um grupo maleimida, um espaçador, ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada tem uma diminuição em potência de sinalização de receptor para IL- 2Rβγ, e a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais para IL-2Rβγ com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada é: um fragmento funcionalmente ativo de um polipeptídeo de IL-2 de comprimento completo; um polipeptídeo de IL-2 recombinante; ou um polipeptídeo de IL-2 humana recombinante.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL- 2 modificada compreende uma deleção N-terminal, uma deleção C-terminal, ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, a deleção N-terminal compreende uma deleção dos primeiros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 ou 30 resíduos do N-terminal, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a deleção C-terminal compreende a deleção dos últimos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ou mais resíduos do C-terminal, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 10-133, 20- 133, 30-133, 10-130, 20-130, 30-130, 10-125, 20-125, 30- 125, 1-130, ou 1-125, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada compreende cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada com uma diminuição em potência de sinalização de receptor para IL- 2Rβγ tem a capacidade para expandir células T regulatórias CD4+ (Treg). Em algumas modalidades, a fração de conjugação prejudica ou bloqueia a potência de sinalização de receptor de IL-2 com IL-2Rβγ, ou reduz o recrutamento da subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ.
Em algumas modalidades, a proliferação de célula Treg CD4+ pelo complexo de IL-2/IL-2Rαβγ modificada é equivalente ou maior que aquela de um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, o complexo de IL-2/IL-2Rαβγ modificada induz a proliferação das células Treg CD4+ para uma população que é suficiente para modular um curso de doença em um modelo animal.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada exibe uma primeira potência de sinalização de receptor para IL-2Rβγ e uma segunda potência de sinalização de receptor para IL-2Rαβγ, em que a primeira potência de sinalização de receptor é pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou menor que a segunda potência de sinalização de receptor.
Em algumas modalidades, a primeira potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 modificada é menor que uma potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem para IL-2Rβγ. Em algumas modalidades, a segunda potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 modificada é menor que uma potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem para IL- 2Rαβγ. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada fornece adicionalmente um aumento em um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rα para o polipeptídeo de IL-2 que resulta em ativação de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ), em que o aumento em recrutamento é comparado a um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rα por um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada fornece adicionalmente uma diminuição em um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ, em que o recrutamento reduzido é comparado a um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ e/ou subunidade de IL-2Rβ por um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
[0006] É revelado no presente documento, em algumas modalidades, um polipeptídeo de interleucina 2 (IL-2) isolada e modificada que compreende pelo menos um aminoácido não natural em uma posição que aumenta um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rα para o polipeptídeo de IL-2 que resulta na ativação de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ), em que o aumento no recrutamento é comparado a um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rα por um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de P2, T3,
S4, S5, S6, T7, K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, R81, P82, R83, D84, S87, N88, N89, V91, I92, L94, E95, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, T113, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, R81, D84, S87, N88, V91, I92, L94, E95, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, P82, R83, N89, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, e T113, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, D84, N88, E95, e Q126, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, e H16, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1.
Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de Q22, N26, N88, e Q126, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de E15, D20, D84, e E95, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de L12, L19, e M23, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de Q22 e N26, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural: é um análogo de lisina; é um análogo de cisteína ou um análogo de histidina; compreende uma cadeia lateral aromática; compreende um grupo azido; compreende um grupo alcino; ou compreende um grupo aldeído ou cetona.
Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural não compreende uma cadeia lateral aromática.
Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural compreender N6-azidoetoxi-L-lisina(AzK), N6-propargiletoxi- L-lisina (PraK), BCN-L-lisina, lisina de norborneno, TCO- lisina, lisina de metiltetrazina, aliloxicarbonilisina, ácido 2-amino-8-oxononanoico, ácido 2-amino-8-oxo- octanoico, p-acetil-L-fenilalanina, p-azidometil-L- fenilalanina (pAMF), p-iodo-L-fenilalanina, m- acetilfenilalanina, ácido 2-amino-8-oxononanoico, p- propargiloxifenilalanina, p-propargil-fenilalanina, 3-
metil-fenilalanina, L-Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-acil-L- fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, p- bromofenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, isopropil-L- fenilalanina, O-aliltirosina, O-metil-L-tirosina, O-4-alil- L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, fosfonotirosina, tri-O- acetil-GlcNAcp-serina, L-fosfosserina, fosfonosserina, L-3- (2-naftil)alanina, ácido 2-amino-3-((2-((3-(benziloxi)-3- oxopropil)amino)etil)selanil)propanoico, 2-amino-3- (fenilselanil)propanoico, ou selenocisteína.
Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural é incorporado no polipeptídeo de IL-2 modificada por um par de tRNA sintetase/tRNA ortogonal.
Em algumas modalidades, o tRNA ortogonal do par sintetase/tRNA ortogonal compreende pelo menos uma nucleobase não natural.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada é covalentemente fixado a uma fração de conjugação através do pelo menos um aminoácido não natural.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação compreende um polímero solúvel em água, um lipídeo, uma proteína ou um peptídeo.
Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende polietileno glicol (PEG), poli(propileno glicol) (PPG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, poliol poli(oxietilado), álcool poli(olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacarídeos), ácido poli(α-hidróxi), álcool poli(vinila), polifosfazeno, polioxazolinas (POZ), poli(N-acriloilmorfolina), ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma molécula de PEG.
Em algumas modalidades, a molécula de PEG é um PEG linear.
Em algumas modalidades, a molécula de PEG é um PEG ramificado.
Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende um polissacarídeo.
Em algumas modalidades, o polissacarídeo compreende dextrano, ácido polissiálico (PSA), ácido hialurônico (HA), amilose, heparina, sulfato de heparano (HS), dextrina, ou amido de hidroxietila (HES). Em algumas modalidades, o lipídeo compreende um ácido graxo.
Em algumas modalidades, o ácido graxo compreende de cerca de 6 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 24 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 22 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 20 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 18 átomos de carbono, de cerca de 20 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 24 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 22 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 20 átomos de carbono, ou de cerca de 12 a cerca de 18 átomos de carbono.
Em algumas modalidades, o ácido graxo é um ácido graxo saturado.
Em algumas modalidades, a proteína compreende uma albumina, uma transferrina ou uma transtiretina.
Em algumas modalidades, a proteína compreende um anticorpo ou seus fragmentos de ligação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o anticorpo ou seus fragmentos de ligação dos mesmos compreendem uma porção de Fc de um anticorpo.
Em algumas modalidades, o peptídeo compreende um peptídeo de XTEN, um polímero de homoaminoácido rico em glicina (HAP), um polipeptídeo de PAS, um polipeptídeo semelhante à elastina (ELP), um peptídeo de CTP, ou um polímero de proteína semelhante à gelatina.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação é indiretamente ligada ao pelo menos um aminoácido não natural da IL-2 modificada através de um ligante.
Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante homobifuncional, um ligante heterobifuncional, um ligante de comprimento zero, um ligante dipeptídeo clivável ou um não clivável, um grupo maleimida, um espaçador, ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada tem uma diminuição em potência de sinalização de receptor para IL- 2Rβγ, e a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais para IL-2Rβγ com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada é: um fragmento funcionalmente ativo de um polipeptídeo de IL-2 de comprimento completo; um polipeptídeo de IL-2 recombinante; ou um polipeptídeo de IL-2 humana recombinante.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL- 2 modificada compreende uma deleção N-terminal, uma deleção C-terminal, ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, a deleção N-terminal compreende uma deleção dos primeiros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 ou 30 resíduos do N-terminal, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a deleção C-terminal compreende a deleção dos últimos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ou mais resíduos do C-terminal, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 10-133, 20- 133, 30-133, 10-130, 20-130, 30-130, 10-125, 20-125, 30- 125, 1-130, ou 1-125, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada compreende cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada com uma diminuição em potência de sinalização de receptor para IL- 2Rβγ tem a capacidade para expandir células T regulatórias CD4+ (Treg). Em algumas modalidades, a fração de conjugação prejudica ou bloqueia a potência de sinalização de receptor de IL-2 com IL-2Rβγ, ou reduz o recrutamento da subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ.
Em algumas modalidades, a proliferação de célula Treg CD4+ pelo complexo de IL-2/IL-2Rαβγ modificada é equivalente ou maior que aquela de um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, o complexo de IL-2/IL-2Rαβγ modificada induz a proliferação das células Treg CD4+ para uma população que é suficiente para modular um curso de doença em um modelo animal.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada exibe uma primeira potência de sinalização de receptor para IL-2Rβγ e uma segunda potência de sinalização de receptor para IL-2Rαβγ, em que a primeira potência de sinalização de receptor é pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou menor que a segunda potência de sinalização de receptor.
Em algumas modalidades, a primeira potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 modificada é menor que uma potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem para IL-2Rβγ. Em algumas modalidades, a segunda potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 modificada é menor que uma potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem para IL- 2Rαβγ. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada fornece adicionalmente um aumento em um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rα para o polipeptídeo de IL-2 que resulta em ativação de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ), em que o aumento em recrutamento é comparado a um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rα por um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada fornece adicionalmente uma diminuição em um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ, em que o recrutamento reduzido é comparado a um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ e/ou subunidade de IL-2Rβ por um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
[0007] É revelado no presente documento, em determinadas modalidades, um polipeptídeo de interleucina 2 (IL-2) isolada e modificada que compreende pelo menos um aminoácido não natural em uma posição que reduz a ligação entre o polipeptídeo de IL-2 modificada e receptor βγ de interleucina 2 (IL-2Rβγ) ou reduz um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ, mas não prejudica a ativação de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ), em que a ligação reduzida é comparada à ligação entre um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem e IL-2Rβγ, e em que o recrutamento reduzido é comparado a um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ por um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, R81, P82, R83, D84, S87, N88, N89, V91, I92, L94, E95, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, T113, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, R81, D84, S87, N88, V91, I92, L94, E95, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, P82, R83, N89, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, e T113, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, D84, N88, E95, e Q126, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, e H16, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de Q22, N26, N88, e Q126, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de E15, D20, D84, e E95, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de L12, L19, e M23, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de Q22 e N26, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural está em Q22, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural está em N26, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural: é um análogo de lisina; é um análogo de cisteína ou um análogo de histidina; compreende uma cadeia lateral aromática; compreende um grupo azido; ou compreende um grupo aldeído ou cetona.
Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural não compreende uma cadeia lateral aromática.
Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural compreender N6-azidoetoxi-L-lisina(AzK), N6-propargiletoxi- L-lisina (PraK), BCN-L-lisina, lisina de norborneno, TCO- lisina, lisina de metiltetrazina, aliloxicarbonilisina, ácido 2-amino-8-oxononanoico, ácido 2-amino-8-oxo- octanoico, p-acetil-L-fenilalanina, p-azidometil-L- fenilalanina (pAMF), p-iodo-L-fenilalanina, m- acetilfenilalanina, ácido 2-amino-8-oxononanoico, p- propargiloxifenilalanina, p-propargil-fenilalanina, 3- metil-fenilalanina, L-Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-acil-L- fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, p- bromofenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, isopropil-L- fenilalanina, O-aliltirosina, O-metil-L-tirosina, O-4-alil- L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, fosfonotirosina, tri-O- acetil-GlcNAcp-serina, L-fosfosserina, fosfonosserina, L-3- (2-naftil)alanina, ácido 2-amino-3-((2-((3-(benziloxi)-3- oxopropil)amino)etil)selanil)propanoico, 2-amino-3- (fenilselanil)propanoico, ou selenocisteína.
Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido não natural é incorporado no polipeptídeo de IL-2 modificada por um par de tRNA sintetase/tRNA ortogonal.
Em algumas modalidades, o tRNA ortogonal do par sintetase/tRNA ortogonal compreende pelo menos uma nucleobase não natural.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada é covalentemente fixado a uma fração de conjugação através do pelo menos um aminoácido não natural.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação compreende um polímero solúvel em água, um lipídeo, uma proteína ou um peptídeo.
Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende polietileno glicol (PEG), poli(propileno glicol) (PPG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, poliol poli(oxietilado), álcool poli(olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacarídeos), ácido poli(α-hidróxi), álcool poli(vinila), polifosfazeno, polioxazolinas (POZ), poli(N-acriloilmorfolina), ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma molécula de PEG.
Em algumas modalidades, a molécula de PEG é um PEG linear.
Em algumas modalidades, a molécula de PEG é um PEG ramificado.
Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende um polissacarídeo.
Em algumas modalidades, o polissacarídeo compreende dextrano, ácido polissiálico (PSA), ácido hialurônico (HA), amilose, heparina, sulfato de heparano (HS), dextrina, ou amido de hidroxietila (HES). Em algumas modalidades, o lipídeo compreende um ácido graxo.
Em algumas modalidades, o ácido graxo compreende de cerca de 6 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 24 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 22 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 20 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 18 átomos de carbono, de cerca de 20 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 24 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 22 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 20 átomos de carbono, ou de cerca de 12 a cerca de 18 átomos de carbono.
Em algumas modalidades, o ácido graxo é um ácido graxo saturado.
Em algumas modalidades, a proteína compreende uma albumina,
uma transferrina ou uma transtiretina.
Em algumas modalidades, a proteína compreende um anticorpo ou seus fragmentos de ligação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o anticorpo ou seus fragmentos de ligação dos mesmos compreendem uma porção de Fc de um anticorpo.
Em algumas modalidades, o peptídeo compreende um peptídeo de XTEN, um polímero de homoaminoácido rico em glicina (HAP), um polipeptídeo de PAS, um polipeptídeo semelhante à elastina (ELP), um peptídeo de CTP, ou um polímero de proteína semelhante à gelatina.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação é indiretamente ligada ao pelo menos um aminoácido não natural da IL-2 modificada através de um ligante.
Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante homobifuncional, um ligante heterobifuncional, um ligante de comprimento zero, um ligante dipeptídeo clivável ou um não clivável, um grupo maleimida, um espaçador, ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, a diminuição em ligação é de cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais diminuição em ligação à IL-2Rβγ com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, a diminuição em ligação é de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais para IL-2Rβγ com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, a diminuição em subunidade de IL-2Rβ recrutamento é de cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais diminuição com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, a diminuição em subunidade de IL-2Rβ recrutamento é de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada é: um fragmento funcionalmente ativo de um polipeptídeo de IL-2 de comprimento completo; um polipeptídeo de IL-2 recombinante; ou um polipeptídeo de IL-2 humana recombinante.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada compreende uma deleção N- terminal, uma deleção C-terminal, ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, a deleção N-terminal compreende uma deleção dos primeiros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 ou 30 resíduos do N- terminal, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a deleção C-terminal compreende a deleção dos últimos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ou mais resíduos do C-terminal, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 10-133, 20-133, 30-133, 10-130, 20-130, 30- 130, 10-125, 20-125, 30-125, 1-130, ou 1-125, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada compreende cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-
2 modificada com uma diminuição em afinidade de ligação à IL-2Rβγ tem a capacidade para expandir células T regulatórias CD4+ (Treg). Em algumas modalidades, a fração de conjugação prejudica ou bloqueia a ligação de IL-2 com IL-2Rβγ, ou reduz o recrutamento da subunidade de IL-2Rβ ao complexo de IL-2/IL-2Rβ. Em algumas modalidades, a proliferação de célula Treg CD4+ pelo complexo de IL-2/IL- 2Rαβγ modificada é equivalente ou maior que aquela de um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
[0008] É revelado no presente documento, em determinadas modalidades, um conjugado de interleucina 2 (IL-2) que compreende: um polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada; e uma fração de conjugação que se liga ao polipeptídeo de IL- 2 isolada e purificada em um resíduo de aminoácido selecionado a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, R81, P82, R83, D84, S87, N88, N89, V91, I92, L94, E95, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, T113, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, R81, D84, S87, N88, V91, I92, L94, E95, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, P82, R83, N89, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, e T113, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, D84, N88, E95, e Q126, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a posição de aminoácido é selecionada a partir de K8, K9 e H16. Em algumas modalidades, a posição de aminoácido é selecionada a partir de Q22, N26, N88 e Q126. Em algumas modalidades, a posição de aminoácido é selecionada a partir de E15, D20, D84 e E95. Em algumas modalidades, a posição de aminoácido é selecionada a partir de L12, L19, M23 e F78. Em algumas modalidades, a posição de aminoácido é selecionada a partir de Q22 e N26. Em algumas modalidades, a posição de aminoácido está em Q22. Em algumas modalidades, a posição de aminoácido está em N26. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido selecionado a partir de K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, F78, D84, N88, E95 e Q126 é adicionalmente mutado para lisina, cisteína ou histidina.
Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido é mutado para cisteína.
Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido é mutado para lisina.
Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido selecionado a partir de K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, F78, D84, N88, E95 e Q126 é adicionalmente mutado para um aminoácido não natural.
Em algumas modalidades, o aminoácido não natural compreende p-acetil-L-fenilalanina, p-azidometil-L- fenilalanina (pAMF), p-iodo-L-fenilalamina, O-metil-L- tirosina, p-propargiloxifenilalanina, p- propargil- fenilalanina, L-3-(2-naftil)alanina, 3-metil-fenilalanina, O- 4-alil-L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, tri-O-acetil- GlcNAcp-serina, L-Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L- fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-acil-L- fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, L-fosfosserina, fosfonosserina, fosfonotirosina, p-bromofenilalanina, p- amino-L-fenilalanina, ou isopropil-L-fenilalanina.
Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido mutado adicional se liga a uma fração de conjugação adicional.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 tem uma afinidade diminuída para subunidade de receptor de IL-2 β (IL-2Rβ), subunidade de receptor de IL-2 γ (IL-2Rγ), ou uma combinação dos mesmos, com relação a um polipeptídeo de IL- 2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, a afinidade diminuída é de cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, ou 60 % de diminuição em afinidade de ligação para IL-2Rβ, IL- 2Rγ, ou uma combinação dos mesmos, com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, a afinidade diminuída é de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, ou mais com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação prejudica ou bloqueia a ligação de IL-2 com IL-2Rβ, IL-2Rγ, ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação modula descendentemente o recrutamento da cadeia de IL-Rβ para o complexo de cadeia de IL-2/IL-2Rβ formado.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação estende a meia- vida sistêmica do polipeptídeo sem afetar sua afinidade com as cadeias α, β e γ do receptor de IL-2. Em algumas modalidades, a fração de conjugação compreende um polímero solúvel em água.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação adicional compreende um polímero solúvel em água.
Em algumas modalidades, cada um dentre os polímeros solúveis em água compreende, independentemente, polietileno glicol (PEG), poli(propileno glicol) (PPG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, poliol poli(oxietilado), álcool poli(olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacarídeos), ácido poli(α-hidróxi), álcool poli(vinila), polifosfazeno, polioxazolinas (POZ), poli(N-acriloilmorfolina), ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, cada um dentre os polímeros solúveis em água compreende independentemente PEG.
Em algumas modalidades, o PEG é um PEG linear ou um PEG ramificado.
Em algumas modalidades, cada um dentre os polímeros solúveis em água compreende independentemente um polissacarídeo.
Em algumas modalidades, o polissacarídeo compreende dextrano, ácido polissiálico (PSA), ácido hialurônico (HA), amilose, heparina, sulfato de heparano (HS), dextrina, ou amido de hidroxietila (HES). Em algumas modalidades, cada um dentre os polímeros solúveis em água compreende independentemente um glicano.
Em algumas modalidades, cada um dentre os polímeros solúveis em água compreende independentemente poliamina.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação compreende uma proteína.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação adicional compreende uma proteína.
Em algumas modalidades, cada uma dentre as proteínas compreende independentemente uma albumina, uma transferrina ou uma transtiretina.
Em algumas modalidades, cada uma dentre as proteínas compreende independentemente uma porção de Fc.
Em algumas modalidades, cada uma dentre as proteínas compreende independentemente uma porção de Fc de IgG.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação compreende um polipeptídeo.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação adicional compreende um polipeptídeo.
Em algumas modalidades, cada um dentre os polipeptídeos compreende independentemente um peptídeo de XTEN, um polímero de homoaminoácido rico em glicina (HAP), um polipeptídeo de PAS, um polipeptídeo semelhante à elastina (ELP), um peptídeo de CTP, ou um polímero de proteína semelhante à gelatina.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada é modificado por glutamilação.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação é diretamente ligada ao polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação é indiretamente ligada ao polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada através de um ligante.
Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante homobifuncional.
Em algumas modalidades, o ligante homobifuncional compreende reagente de Lomant ditiobis (succinimidilpropionato) DSP, 3′3′- ditiobis(sulfossuccinimidil proprionato) (DTSSP), suberato de dissuccinimidila (DSS), bis(sulfossuccinimidil)suberato (BS), tartrato de dissuccinimidila (DST), tartrato de dissulfossuccinimidila (sulfo DST), etileno glicobis(succinimidilsuccinato) (EGS), glutarato de dissuccinimidila (DSG), carbonato de N,N′-dissuccinimidila (DSC), adipimidato de dimetila (DMA), pimelimidato de dimetila (DMP), suberimidato de dimetila (DMS), dimetil- 3,3′-ditiobispropionimidato (DTBP), 1,4-di-(3′-(2′- piridilditio)propionamido)butano (DPDPB), bismaleimido- hexano (BMH), composto que contém haleto de arila (DFDNB), como, por exemplo, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno ou 1,3- difluoro-4,6-dinitrobenzeno, 4,4′-difluoro-3,3′- dinitrofenilsulfona (DFDNPS), bis-[β-(4- azidossalicilamido)etil]dissulfeto (BASED), formaldeído, glutaraldeído, 1,4-butanodiol diglicidil éter, di-hidrazida de ácido adípico, carbo-hidrazida, o-toluidina, 3,3′- dimetilbenzidina, benzidina, α,α′-p-diaminodifenil, ácido sulfônico de di-iodo-p-xileno, N,N′-etileno- bis(iodoacetamida), ou N,N′-hexametileno- bis(iodoacetamida). Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante heterobifuncional.
Em algumas modalidades, o ligante heterobifuncional compreende 3-(2- piridilditio)propionato de N-succinimidila (sPDP), 3-(2- piridilditio)propionato de N-succinimidila de cadeia longa (LC-sPDP), 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidila de cadeia longa solúvel em água (sulfo-LC-sPDP), succinimidiloxicarbonil-α-metil-α-(2-piridilditio)tolueno (sMPT), sulfossuccinimidil-6-[α-metil-α-(2- piridilditio)toluamido]hexanoato (sulfo-LC-sMPT), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (sMCC), sulfossuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo- hexano-1-carboxilato (sulfo-sMCC), éster de m-
maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBs), éster de m- maleimidobenzoil-N-hidroxissulfossuccinimida (sulfo-MBs), N-succinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (sIAB), sulfossuccinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (sulfo-sIAB), succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (sMPB), sulfossuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (sulfo- sMPB), éster de N-(γ-maleimidobutiriloxi)succinimida (GMBs), éster de N-(γ-maleimidobutiriloxi)sulfossuccinimida (sulfo-GMBs), 6-((iodoacetil)amino)hexanoato de succinimidila (sIAX), 6-[6- (((iodoacetil)amino)hexanoil)amino]hexanoato de succinimidila (sIAXX), 4-(((iodoacetil)amino)metil)ciclo- hexano-1-carboxilato de succinimidila (sIAC), 6-(((((4- iodoacetil)amino)metil)ciclo-hexano-1-carbonil)amino) hexanoato de succinimidila (sIACX), iodoacetato de p- nitrofenila (NPIA), reticuladores reativos a carbonila e reativos a sulfidrila como 4-hidrazida de ácido (4-N- maleimidofenil)butírico (MPBH), 4-(N-maleimidometil)ciclo- hexano-1-carboxil-hidrazida-8 (M2C2H), 3-(2- piridilditio)propionila hidrazida (PDPH), ácido N- hidroxissuccinimidil-4-azidossalicilico (NHs-AsA), ácido N- hidroxissulfossuccinimidil-4-azidossalicilico (sulfo-NHs- AsA), sulfossuccinimidil-(4-azidossalicilamido)hexanoato (sulfo-NHs-LC-AsA), sulfossuccinimidil-2-(ρ- azidossalicilamido)etil-1,3′-ditiopropionato (sAsD), N- hidroxissuccinimidil-4-azidobenzoato (HsAB), N- hidroxissulfossuccinimidil-4-azidobenzoato (sulfo-HsAB), N- succinimidil-6-(4′-azido-2′-nitrofenilamino)hexanoato (sANPAH), sulfossuccinimidil-6-(4′-azido-2′- nitrofenilamino)hexanoato (sulfo-sANPAH), N-5-azido-2-
nitrobenzoiloxisuccinimida (ANB-NOs), sulfossuccinimidil-2- (m-azido-o-nitrobenzamido)-etil-1,3′-ditiopropionato (sAND), N-succinimidil-4(4-azidofenil)1,3′-ditiopropionato (sADP), N-sulfossuccinimidil(4-azidofenil)-1,3′- ditiopropionato (sulfo-sADP), 4-(ρ-azidofenil)butirato de sulfossuccinimidila (sulfo-sAPB), 2-(7-azido-4- metilcoumarin-3-acetamida)etil-1,3′-ditiopropionato (sAED) de sulfossuccinimidila,, 7-azido-4-metilcoumain-3-acetato de sulfossuccinimidila (sulfo-sAMCA), diazopiruvato de ρ- nitrofenila (ρNPDP), ρ-nitrofenil-2-diazo-3,3,3- trifluoropropionato (PNP-DTP), 1-(ρ-Azidossalicilamido)-4- (iodoacetamido)butano (AsIB), N-[4-(ρ- azidossalicilamido)butil]-3′-(2′-piridilditio)propionamida (APDP), benzofenona-4-iodoacetamida, hidrazida de ρ- azidobenzoíla (ABH), 4-(ρ-azidossalicilamido)butilamina (AsBA), ou glioxal de ρ-azidofenila (APG). Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante clivável, que compreende opcionalmente um ligante de dipeptídeo.
Em algumas modalidades, o ligante de dipeptídeo compreende Val-Cit, Phe-Lys, Val-Ala ou Val-Lys.
Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante não clivável.
Em algumas modalidades, o ligante compreende um grupo maleimida, que compreende opcionalmente maleimidocaproíla (mc), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (sMCC), ou sulfossuccinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-sMCC). Em algumas modalidades, o ligante compreende adicionalmente um espaçador.
Em algumas modalidades, o espaçador compreende álcool de p-aminobenzila (PAB), p-aminobenzioxicarbonila (PABC), um derivado ou um análogo do mesmo.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação tem a capacidade para estender a meia-vida sérica do conjugado de IL-2. Em algumas modalidades, a fração de conjugação adicional tem a capacidade para estender a meia-vida sérica do conjugado de IL-2.
[0009] É revelado no presente documento, em determinadas modalidades, um conjugado de interleucina 2 (IL-2) que compreende: um polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada; e uma fração de conjugação; em que o conjugado de IL-2 tem uma afinidade diminuída com subunidade de receptor de IL-2 β (IL-2Rβ), subunidade de receptor de IL-2 γ (IL-2Rγ ou uma combinação dos mesmos, com relação a um polipeptídeo de IL- 2 do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a fração de conjugação é ligada a um resíduo de aminoácido que interage com IL-2Rβ ou IL-2Rγ. Em algumas modalidades, a fração de conjugação é ligada a um resíduo de aminoácido selecionado a partir de K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, R81, D84, S87, N88, V91, I92, L94, E95, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132 e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a fração de conjugação compreende um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, a fração de conjugação adicional compreende um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, cada um dentre os polímeros solúveis em água compreende, independentemente, polietileno glicol (PEG), poli(propileno glicol) (PPG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, poliol poli(oxietilado), álcool poli(olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida),
poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacarídeos), ácido poli(α-hidróxi), álcool poli(vinila), polifosfazeno, polioxazolinas (POZ), poli(N-acriloilmorfolina), ou uma combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, cada um dentre os polímeros solúveis em água compreende independentemente PEG.
Em algumas modalidades, o PEG é um PEG linear ou um PEG ramificado.
Em algumas modalidades, cada um dentre os polímeros solúveis em água compreende independentemente um polissacarídeo.
Em algumas modalidades, o polissacarídeo compreende dextrano, ácido polissiálico (PSA), ácido hialurônico (HA), amilose, heparina, sulfato de heparano (HS), dextrina, ou amido de hidroxietila (HES). Em algumas modalidades, cada um dentre os polímeros solúveis em água compreende independentemente um glicano.
Em algumas modalidades, cada um dentre os polímeros solúveis em água compreende independentemente poliamina.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação compreende uma proteína.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação adicional compreende uma proteína.
Em algumas modalidades, cada uma dentre as proteínas compreende independentemente uma albumina, uma transferrina ou uma transtiretina.
Em algumas modalidades, cada uma dentre as proteínas compreende independentemente uma porção de Fc.
Em algumas modalidades, cada uma dentre as proteínas compreende independentemente uma porção de Fc de IgG.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação compreende um polipeptídeo.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação adicional compreende um polipeptídeo.
Em algumas modalidades, cada um dentre os polipeptídeos compreende independentemente um peptídeo de XTEN, um polímero de homoaminoácido rico em glicina (HAP), um polipeptídeo de PAS, um polipeptídeo semelhante à elastina (ELP), um peptídeo de CTP, ou um polímero de proteína semelhante à gelatina.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada é modificado por glutamilação.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação é diretamente ligada ao polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada.
Em algumas modalidades, a fração de conjugação é indiretamente ligada ao polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada através de um ligante.
Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante homobifuncional.
Em algumas modalidades, o ligante homobifuncional compreende reagente de Lomant ditiobis (succinimidilpropionato) DSP, 3′3′- ditiobis(sulfossuccinimidil proprionato) (DTSSP), suberato de dissuccinimidila (DSS), bis(sulfossuccinimidil)suberato (BS), tartrato de dissuccinimidila (DST), tartrato de dissulfossuccinimidila (sulfo DST), etileno glicobis(succinimidilsuccinato) (EGS), glutarato de dissuccinimidila (DSG), carbonato de N,N′-dissuccinimidila (DSC), adipimidato de dimetila (DMA), pimelimidato de dimetila (DMP), suberimidato de dimetila (DMS), dimetil- 3,3′-ditiobispropionimidato (DTBP), 1,4-di-(3′-(2′- piridilditio)propionamido)butano (DPDPB), bismaleimido- hexano (BMH), composto que contém haleto de arila (DFDNB), como, por exemplo, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno ou 1,3- difluoro-4,6-dinitrobenzeno, 4,4′-difluoro-3,3′- dinitrofenilsulfona (DFDNPS), bis-[β-(4- azidossalicilamido)etil]dissulfeto (BASED), formaldeído, glutaraldeído, 1,4-butanodiol diglicidil éter, di-hidrazida de ácido adípico, carbo-hidrazida, o-toluidina, 3,3′-
dimetilbenzidina, benzidina, α,α′-p-diaminodifenil, ácido sulfônico de di-iodo-p-xileno, N,N′-etileno- bis(iodoacetamida), ou N,N′-hexametileno- bis(iodoacetamida). Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante heterobifuncional.
Em algumas modalidades, o ligante heterobifuncional compreende 3-(2- piridilditio)propionato de N-succinimidila (sPDP), 3-(2- piridilditio)propionato de N-succinimidila de cadeia longa (LC-sPDP), 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidila de cadeia longa solúvel em água (sulfo-LC-sPDP), succinimidiloxicarbonil-α-metil-α-(2-piridilditio)tolueno (sMPT), sulfossuccinimidil-6-[α-metil-α-(2- piridilditio)toluamido]hexanoato (sulfo-LC-sMPT), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (sMCC), sulfossuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo- hexano-1-carboxilato (sulfo-sMCC), éster de m- maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBs), éster de m- maleimidobenzoil-N-hidroxissulfossuccinimida (sulfo-MBs), N-succinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (sIAB), sulfossuccinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (sulfo-sIAB), succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (sMPB), sulfossuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (sulfo- sMPB), éster de N-(γ-maleimidobutiriloxi)succinimida (GMBs), éster de N-(γ-maleimidobutiriloxi)sulfossuccinimida (sulfo-GMBs), 6-((iodoacetil)amino)hexanoato de succinimidila (sIAX), 6-[6- (((iodoacetil)amino)hexanoil)amino]hexanoato de succinimidila (sIAXX), 4-(((iodoacetil)amino)metil)ciclo- hexano-1-carboxilato de succinimidila (sIAC), 6-(((((4- iodoacetil)amino)metil)ciclo-hexano-1-carbonil)amino)
hexanoato de succinimidila (sIACX), iodoacetato de p- nitrofenila (NPIA), reticuladores reativos a carbonila e reativos a sulfidrila como 4-hidrazida de ácido (4-N- maleimidofenil)butírico (MPBH), 4-(N-maleimidometil)ciclo- hexano-1-carboxil-hidrazida-8 (M2C2H), 3-(2- piridilditio)propionila hidrazida (PDPH), ácido N- hidroxissuccinimidil-4-azidossalicilico (NHs-AsA), ácido N- hidroxissulfossuccinimidil-4-azidossalicilico (sulfo-NHs- AsA), sulfossuccinimidil-(4-azidossalicilamido)hexanoato (sulfo-NHs-LC-AsA), sulfossuccinimidil-2-(ρ- azidossalicilamido)etil-1,3′-ditiopropionato (sAsD), N- hidroxissuccinimidil-4-azidobenzoato (HsAB), N- hidroxissulfossuccinimidil-4-azidobenzoato (sulfo-HsAB), N- succinimidil-6-(4′-azido-2′-nitrofenilamino)hexanoato (sANPAH), sulfossuccinimidil-6-(4′-azido-2′- nitrofenilamino)hexanoato (sulfo-sANPAH), N-5-azido-2- nitrobenzoiloxisuccinimida (ANB-NOs), sulfossuccinimidil-2- (m-azido-o-nitrobenzamido)-etil-1,3′-ditiopropionato (sAND), N-succinimidil-4(4-azidofenil)1,3′-ditiopropionato (sADP), N-sulfossuccinimidil(4-azidofenil)-1,3′- ditiopropionato (sulfo-sADP), 4-(ρ-azidofenil)butirato de sulfossuccinimidila (sulfo-sAPB), 2-(7-azido-4- metilcoumarin-3-acetamida)etil-1,3′-ditiopropionato (sAED) de sulfossuccinimidila,, 7-azido-4-metilcoumain-3-acetato de sulfossuccinimidila (sulfo-sAMCA), diazopiruvato de ρ- nitrofenila (ρNPDP), ρ-nitrofenil-2-diazo-3,3,3- trifluoropropionato (PNP-DTP), 1-(ρ-Azidossalicilamido)-4- (iodoacetamido)butano (AsIB), N-[4-(ρ- azidossalicilamido)butil]-3′-(2′-piridilditio)propionamida (APDP), benzofenona-4-iodoacetamida, hidrazida de ρ-
azidobenzoíla (ABH), 4-(ρ-azidossalicilamido)butilamina (AsBA), ou glioxal de ρ-azidofenila (APG). Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante clivável, que compreende opcionalmente um ligante de dipeptídeo. Em algumas modalidades, o ligante de dipeptídeo compreende Val-Cit, Phe-Lys, Val-Ala ou Val-Lys. Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligante não clivável. Em algumas modalidades, o ligante compreende um grupo maleimida, que compreende opcionalmente maleimidocaproíla (mc), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (sMCC), ou sulfossuccinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-sMCC). Em algumas modalidades, o ligante compreende adicionalmente um espaçador. Em algumas modalidades, o espaçador compreende álcool de p-aminobenzila (PAB), p-aminobenzioxicarbonila (PABC), um derivado ou um análogo do mesmo. Em algumas modalidades, a fração de conjugação tem a capacidade para estender a meia-vida sérica do conjugado de IL-2. Em algumas modalidades, a fração de conjugação adicional tem a capacidade para estender a meia-vida sérica do conjugado de IL-2.
[0010] É revelado no presente documento, em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica que compreende: um conjugado de IL-2 descrito acima; e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para administração parenteral.
[0011] É revelado no presente documento, em determinadas modalidades, um método para tratar uma doença ou um transtorno autoimune em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado de IL-2 descrita acima. Em algumas modalidades, a doença ou o transtorno autoimune compreende alopecia areata, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, dermatomiosite, diabetes tipo 1, artrite idiopática juvenil, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain- Barré, púrpura trombocitopênica idiopática, miastenia grave, esclerose múltipla, penfigo/penfigoide, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, polimiosite, cirrose biliar primária, psoríase, artrite reumatoide, escleroderma, síndrome de Sjögren, lúpus eritematoso sistêmico, tireoidite, uveíte, vitiligo, ou granulomatose de Wegener. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 e o agente terapêutico adicional são simultaneamente administrados. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 e o agente terapêutico adicional são sequencialmente administrados. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 é administrado antes do agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 é administrado após a administração do agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano.
[0012] É revelado no presente documento, em determinadas modalidades, um método para expandir população de célula T regulatória (Treg), que compreende: (a) colocar uma célula em contato com um conjugado de IL-2 descrito acima; e (b) interagir o conjugado de IL-2 com subunidades de IL-2Rα, IL-2Rβ e IL-2Rγ para formar um complexo de IL-2/IL-2Rαβγ;
em que o conjugado de IL-2 tem uma afinidade diminuída com subunidades de IL-2Rβ e/ou IL-2Rγ, ou modula descendentemente o recrutamento da subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ, ou retém potência similar como IL-2 em suas subunidades de receptor , β e β, mas estende sua meia-vida, e em que o complexo de IL-2/IL-2Rαβγ estimula a expansão de células Treg de modo similar ou mais potencialmente que IL-2 nativa.
[0013] É revelado no presente documento, em determinadas modalidades, um kit que compreende um conjugado de IL-2 descrito acima; ou uma composição farmacêutica que compreende um conjugado de IL-2 descrito acima. Em algumas modalidades, também é descrito no presente documento um kit que compreende uma molécula de ácido polinucleico que um polipeptídeo de IL-2 descrito acima.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0014] As características inovadoras da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Um melhor entendimento dos recursos e das vantagens da invenção serão obtidos com referência à seguinte descrição detalhada que define as modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são usados, e aos desenhos anexos, nos quais:
[0015] a Fig. 1 mostra aminoácidos não naturais exemplificativos. Essa figura é adaptada a partir da =Fig. 2 de Young et al., “Beyond the canonical 20 amino acids: expanding the genetic lexicon”, J. of Biological Chemistry 285(15): 11039-11044 (2010).
[0016] as Fig. 2A-Fig. 2B ilustram aminoácidos não naturais exemplificativos. A Fig. 2A ilustra derivados de lisina exemplificativos. A Fig. 2B ilustra derivados de fenilalanina exemplificativos.
[0017] As Fig. 3A-Fig. 3D ilustram aminoácidos não naturais exemplificativos. Esses aminoácidos não naturais (UAAs) foram geneticamente codificados em proteínas (Fig. 3A – UAA nº 1-42; Fig. 3B - UAA nº 43-89; Fig. 3C – UAA nº 90-128; Fig. 3D – UAA nº 129-167). As Figs. 3A-3D são adotadas a partir da Tabela 1 de Dumas et al., Chemical Science 2015, 6, 50-69.
[0018] As Fig. 4A-Fig. 4B mostram as curvas de resposta à dose de uma variante de IL-2 exemplificativa para sinalização de pSTAT5 em célula primária de LRS humano (Fig. 4A) e resposta à proliferação em populações de CTLL-2 de camundongo (Fig. 4B).
[0019] A Fig. 5 mostra perfil de PK aprimorado de uma molécula de IL-2 exemplificativa K35_30kD em duas concentrações diferentes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA REVELAÇÃO
[0020] As citocinas compreendem uma família de proteínas de sinalização celular como quimiocinas, interferons, interleucinas, linfocinas, fatores de necrose tumoral, e outros fatores de crescimento que desempenham papéis em homeostase de célula imunológica inata e adaptativa. As citocinas são produzidas por células imunológicas como macrófagos, B linfócitos, linfócitos T e mastócitos, células endoteliais, fibroblastos e células estromais diferentes. Em alguns exemplos, as citocinas modulam o equilíbrio entre respostas imunológicas com base humoral e celular.
[0021] As interleucinas são proteínas de sinalização que modula o desenvolvimento e a diferenciação de linfócitos T e B, célula da linhagem monocítica, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, megacariócitos e células hematopoiéticas. As interleucinas são produzidas por linfócitos T e B de CD4 auxiliador, monócitos, macrófagos, células endoteliais, e outros residentes de tecido. Em alguns casos, há cerca de 15 interleucinas, interleucinas 1-13, interleucina 15 e interleucina 17.
[0022] Interleucina 2 (IL-2) é uma citocina tipo 1 pleiotrópica cuja estrutura compreende um conjunto de quatro α-hélice de 15,5 kDa. A forma precursora de IL-2 é de 153 resíduos de aminoácido em comprimento, com os primeiros 20 aminoácidos formando um peptídeo de sinal e resíduos 21-153 formam a forma madura. IL-2 é produzida principalmente por células T CD4+ após estímulo de antígeno e em uma menor extensão, por células CD8+, células Exterminadoras Naturais (NK), e células T NK (NKT), células dendríticas ativadas (DCs) e mastócitos. A sinalização de IL-2 ocorre através de interação com combinações específicas de subunidades de receptor de IL-2 (IL-2R), IL- 2Rα (também conhecidas como CD25), IL-2Rβ (também conhecidas como CD122), e IL-2Rγ (também conhecidas como CD132). A interação de IL-2 com a IL-2Rα forma o complexo de receptor de IL-2 de “baixa afinidade” com um Kd de cerca de 10-8 M. A interação de IL-2 com IL-2Rβ e IL-2Rγ forma o complexo de receptor de IL-2 de “afinidade intermediária” com um Kd de cerca de 10-9 M. A interação de IL-2 com todas as três subunidades, IL-2Rα, IL-2Rβ e IL-2Rγ, forma o complexo de receptor de IL-2 de “alta afinidade” com um Kd de cerca de >10-11 M.
[0023] Em alguns exemplos, a sinalização de IL-2 por meio do complexo de IL-2Rαβγ de "alta afinidade” modula a ativação e a proliferação de células T regulatórias. Células T regulatórias, ou células T regulatórias CD4+CD25+Foxp3+ mediam a manutenção de homeostase imunológica pela supressão de células efetoras como células T CD8+, células auxiliadoras como células Th1, Th2 e Th17 CD4+, células B, células NK e células T NK. Em alguns exemplos, as células Treg são geradas a partir de timo (células tTreg) ou são induzidas a partir de células T naïve na periferia (células pTreg). Em alguns casos, as células Treg são consideradas como o mediador de tolerância periférica. De fato, em um estudo, a transferência de células T CD4+ periféricas depletadas por CD25 produziu uma variedade de doenças autoimunes em camundongos nus, enquanto a cotransferência de células T CD4+CD25+ suprimiu o desenvolvimento de autoimunidade (Sakaguchi, et al., “Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25)”, J. Immunol. 155(3): 1151-1164 (1995)). O aumento da população de célula Treg regula de modo descendente a proliferação de célula T efetora e suprime a autoimunidade e as respostas antitumorais de célula T.
[0024] É revelado no presente documento, em determinadas modalidades, um método para regular de modo ascendente seletivamente população(ões) distinta(s) de linfócitos (por exemplo, células T regulatórias) através de sinalização de citocina/receptor de citocina. Em alguns exemplos, a citocina compreende uma interleucina. Em alguns casos, a citocina é um conjugado de citocina, por exemplo, um conjugado de interleucina, um conjugado de interferon, ou um conjugado de fator de necrose tumoral. Em casos adicionais, a descrição no presente documento compreende composições e kits farmacêuticos que compreendem um ou mais conjugados de citocina descritos no presente documento.
[0025] Em algumas modalidades, também é descrito no presente documento um método para regular de modo ascendente seletivamente a população de Treg através de sinalização de IL-2/IL-2R. Em alguns exemplos, IL-2 é um conjugado de IL-2 tem uma interação de IL-2Rβ e IL-2Rγ enfraquecida no complexo de IL-2Rαβγ com relação a IL-2 do tipo selvagem, ou modula descendentemente o recrutamento da subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ, ou retém potência similar como IL-2 em suas subunidades de receptor , β e β, mas estende sua meia-vida. Em algumas modalidades, são descritos no presente documento adicionalmente métodos para tratar uma doença autoimune com o uso de um conjugado de IL-2 descrito no presente documento. Em modalidades adicionais, são descritos no presente documento composições e kits farmacêuticos que compreendem um ou mais conjugados de IL-2 descritos no presente documento. Conjugados de Citocina
[0026] Em algumas modalidades, são descritos no presente documento conjugados de citocina. Em alguns exemplos, a citocina compreende interleucinas, um fator de necrose tumoral, um interferon, uma quimiocina ou uma linfocina. Em alguns exemplos, a citocina é uma interleucina. Em alguns casos, a citocina é um interferon. Em casos adicionais, a citocina é um fator de necrose tumoral.
[0027] Em algumas modalidades, é descrito no presente documento um conjugado de interleucina. Interleucinas exemplificativas incluem, porém sem limitação, interleucina 1β (IL-1β), interleucina 2 (IL-2), interleucina 7 (IL-7), interleucina 10 (IL-10), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), interleucina 18 (IL-18) e interleucina 21 (IL-21). Em alguns exemplos, é descrito no presente documento um conjugado de interleucina, no qual a interleucina é selecionada a partir de IL-1β, IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21. Conjugados de IL-2
[0028] Em algumas modalidades, são descritos no presente documento conjugados de IL-2 modificadas em uma posição de aminoácido. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de IL-2 é um polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de IL-2 é uma IL-2 de mamífero, por exemplo, uma proteína de IL-2 de roedor ou uma proteína de IL-2 humana. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 é uma proteína de IL-2 humana. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 consiste na sequência de SEQ ID NO: 1. Em casos adicionais, o polipeptídeo de IL-2 compreende cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2. Em casos adicionais, o polipeptídeo de IL-2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 2. Em casos adicionais, o polipeptídeo de IL- 2 consiste na sequência de SEQ ID NO: 2.
[0029] Em alguns exemplos, o polipeptídeo de IL-2 é uma variante truncada.
Em alguns exemplos, o truncamento é uma deleção N-terminal.
Em outros exemplos, o truncamento é uma deleção C-terminal.
Em exemplos adicionais, o truncamento compreende tanto deleções N-terminal quanto C-terminal.
Por exemplo, o truncamento pode ser uma deleção de pelo menos ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ou mais resíduos a partir do N-terminal ou do C- terminal, ou de ambos os terminais.
Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende uma deleção N-terminal de pelo menos ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ou mais resíduos.
Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende uma deleção N-terminal de pelo menos ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos.
Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende uma deleção N-terminal de pelo menos ou cerca de 2 resíduos.
Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende uma deleção N-terminal de pelo menos ou cerca de 3 resíduos.
Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende uma deleção N-terminal de pelo menos ou cerca de 4 resíduos.
Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende uma deleção N-terminal de pelo menos ou cerca de 5 resíduos.
Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende uma deleção N-terminal de pelo menos ou cerca de 6 resíduos.
Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende uma deleção N-terminal de pelo menos ou cerca de 7 resíduos.
Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende uma deleção N-terminal de pelo menos ou cerca de 8 resíduos.
Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende uma deleção N-terminal de pelo menos ou cerca de
9 resíduos. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 compreende uma deleção N-terminal de pelo menos ou cerca de 10 resíduos.
[0030] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 é um fragmento funcionalmente ativo. Em alguns casos, o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 10-133, 20-133, 30-133, 10-130, 20-130, 30-130, 10-125, 20- 125, 30-125, 1-130 ou 1-125, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 10-133, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 20-133, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 30-133, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 10-125, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 20-125, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 1-130, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 1- 125, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1.
[0031] Em algumas modalidades, um conjugado de IL-2 descrito no presente documento compreende um polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada e uma fração de conjugação tem uma afinidade diminuída com subunidade de receptor de IL-2 β (IL-2Rβ), subunidade de receptor de IL-2 γ (IL-2Rγ) ou uma combinação dos mesmos, com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 tem um recrutamento de subunidade de IL-2Rβ reduzido para o complexo de IL-2/IL-2Rβ, com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em alguns casos, a fração de conjugação é ligada a um resíduo de aminoácido que interage com IL-2Rβ (por exemplo, na interface de IL- 2/IL-2Rβ), com IL-2Rγ (por exemplo, na interface de IL- 2/IL-2Rβ), ou uma combinação dos mesmos. Em alguns casos, a fração de conjugação é ligada a um resíduo de aminoácido que é proximal à interface de IL-2/IL-2Rβ, à interface de IL-2/IL-2Rβ ou à interface de IL-2Rβγ. Em alguns casos, o resíduo de aminoácido é de cerca de 5 Å, cerca de 10 Å, cerca de 15Å, ou cerca de 20 Å na direção oposta da interface de IL-2/IL-2Rβ, da interface de IL-2/IL-2Rβ ou da interface de IL-2Rβγ. Como usado no presente documento, os resíduos de IL-2 envolvidos na interface de IL-2/IL-2Rβ, na interface de IL-2/IL-2Rβ, ou na interface de IL-2Rβγ compreendem resíduos de IL-2 que formam interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio, ou interações iônicas com resíduos da subunidade de IL-2Rβ, da subunidade de IL- 2Rγ, ou resíduos na interface de IL-2Rβγ.
[0032] Em alguns exemplos, a fração de conjugação é ligada a um resíduo de aminoácido selecionado a partir de uma posição de aminoácido P2, T3, S4, S5, S6, T7, K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, G27, N29,
N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, R81, P82, R83, D84, S87, N88, N89, V91, I92, L94, E95, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, T113, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, R81, D84, S87, N88, V91, I92, L94, E95, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, P82, R83, N89, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, e T113. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, D84, N88, E95, e Q126. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de K8, K9, e H16. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de Q22, N26, N88, e Q126. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de E15, D20, D84, e E95. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de L12, L19, e M23. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de Q22 e N26. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em K8. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em K9. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em Q11. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em L12. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em E15. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em H16. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em L18. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em L19. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em D20. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em Q22. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em M23. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em N26. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em R81. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em D84. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em S87. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em N88. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em V91. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em I92. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em L94. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em E95. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em E116. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em N119. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em R120. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em T123. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em A125. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em Q126. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em S127. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em S130. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em T131. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em L132. Em alguns casos, a posição de aminoácido está em T133.
[0033] Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 compreende adicionalmente uma mutação adicional. Em tais casos, o aminoácido é conjugado a uma fração de conjugação adicional para o aumento em meia-vida sérica, estabilidade ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, o aminoácido é primeiro mutado para um aminoácido natural como lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina ou tirosina; ou em um aminoácido não natural antes da ligação à fração de conjugação adicional.
[0034] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 tem uma afinidade de ligação diminuída a subunidade de receptor de IL-2 β (IL-2Rβ), subunidade de receptor de IL-2 γ (IL- 2Rγ), ou uma combinação dos mesmos, do complexo de IL- 2Rαβγ, com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em alguns exemplos, a afinidade diminuída do conjugado de IL-2 com subunidade de receptor de IL-2 β (IL- 2Rβ), subunidade de receptor de IL-2 γ (IL-2Rγ) ou uma combinação dos mesmos, com relação a um polipeptídeo de IL- 2 do tipo selvagem, é de cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou maior que 99 %. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 10 %. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 20 %. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 40 %. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 50 %. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 60 %. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 80 %. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 90 %. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 99 %. Em alguns casos, a afinidade diminuída é maior que 99 %. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 80 %. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de
100 %.
[0035] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação diminuída do conjugado de IL-2 com a subunidade de receptor de IL-2 β (IL-2Rβ), subunidade de receptor de IL-2 γ (IL- 2Rγ), ou uma combinação dos mesmos, com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem, é de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes ou mais. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 1 vez. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 2 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 4 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 5 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 6 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 8 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 10 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 30 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 50 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 100 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 300 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 500 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é de cerca de 1000 vezes. Em alguns casos, a afinidade diminuída é maior que 1000 vezes.
[0036] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 tem um recrutamento de subunidade de IL-2Rβ reduzido para o complexo de IL-2/IL-2Rβ. Em alguns casos, o recrutamento reduzido é comparado a uma recrutamento de subunidade de IL-2Rβ por um polipeptídeo de IL-2 equivalente sem o aminoácido não natural (por exemplo, um polipeptídeo de IL- 2 do tipo selvagem). Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou maior que 99 % de diminuição com relação a um polipeptídeo de IL-2 equivalente sem a modificação de aminoácido não natural. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 10 %. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 20 %. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 40 %. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 50 %. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 60 %. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 70 %. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 80 %. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 90 %. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 99 %. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é maior que 99 %. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 100 %. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 tem adicionalmente um aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα.
[0037] Em algumas modalidades, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais com relação a um polipeptídeo de IL-2 equivalente sem a modificação de aminoácido não natural (por exemplo, um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem). Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 1 vez. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 2 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 4 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 5 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 6 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 8 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 10 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 30 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 50 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 100 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 300 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 500 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é de cerca de 1000 vezes. Em alguns casos, a diminuição em recrutamento de subunidade de IL-2Rβ é maior que 1000 vezes. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 tem adicionalmente um aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα.
[0038] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 tem um aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα para o polipeptídeo de IL-2. Em alguns casos, o recrutamento reduzido é comparado a uma recrutamento de subunidade de IL-2Rα por um polipeptídeo de IL-2 equivalente sem o aminoácido não natural (por exemplo, um polipeptídeo de IL- 2 do tipo selvagem). Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou maior que 99 % de aumento com relação a um polipeptídeo de IL-2 equivalente sem a modificação de aminoácido não natural.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 10 %. Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 20 %. Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 40 %. Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 50 %. Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 60 %. Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 70 %. Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 80 %. Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 90 %. Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 99 %. Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é maior que 99 %. Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 100 %. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 tem adicionalmente uma diminuição em recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ e/ou subunidade de IL-2Rβ.
[0039] Em algumas modalidades, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais com relação a um polipeptídeo de IL-2 equivalente sem a modificação de aminoácido não natural (por exemplo, um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem). Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 1 vez.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 2 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 4 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 5 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 6 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 8 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 10 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 30 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 50 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 100 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 300 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 500 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é de cerca de 1000 vezes.
Em alguns casos, o aumento em recrutamento de subunidade de IL-2Rα é maior que 1000 vezes. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 tem adicionalmente uma diminuição em recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ e/ou subunidade de IL-2Rβ.
[0040] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de IL-2 descrito no presente documento tem uma diminuição em potência de sinalização de receptor para IL-2Rβγ. Em alguns exemplos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais para IL-2Rβγ com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 2 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 5 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 10 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 20 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 30 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 40 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 50 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 100 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 200 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 300 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 400 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 500 vezes. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 1000 vezes.
[0041] Em alguns exemplos, a potência de sinalização de receptor é medida por um valor de EC50. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é um aumento em EC50. Em alguns exemplos, o aumento em EC50 é de cerca de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
[0042] Em alguns exemplos, a potência de sinalização de receptor é medida por um valor de ED50. Em alguns casos, a diminuição em potência de sinalização de receptor é um aumento em ED50. Em alguns exemplos, o aumento em ED50 é de cerca de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
[0043] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de IL-2 descrito no presente documento tem uma janela terapêutica expandida em comparação a uma janela terapêutica de um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em alguns exemplos, a janela terapêutica expandida é devido a uma diminuição em ligação entre o polipeptídeo de IL-2 e receptor βγ de interleucina 2 (IL-2Rβγ), uma diminuição em potência de sinalização de receptor para IL-2Rβγ, uma diminuição em recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ to o complexo de IL-2/IL-2Rβ, ou um aumento em recrutamento de uma subunidade de IL-2Rα to o polipeptídeo de IL-2. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de IL-2 não tem uma ativação prejudicada de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ).
[0044] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 modificada exibe uma primeira potência de sinalização de receptor para um complexo de sinalização de IL-2βγ e uma segunda potência de sinalização de receptor para um complexo de sinalização de IL-2αβγ, e em que uma diferença entre a primeira potência de sinalização de receptor e a segunda potência de sinalização de receptor é pelo menos de 1 vez. Em alguns exemplos, a diferença é de pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais. Em alguns exemplos, a primeira potência de sinalização de receptor é menor que a segunda potência de sinalização de receptor. Em alguns exemplos, a primeira potência de sinalização de receptor é pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou menor que a segunda potência de sinalização de receptor. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 modificada tem uma potência de sinalização de receptor inferior para um complexo de sinalização de IL-2βγ que uma segunda potência de sinalização de receptor para um complexo de sinalização de IL-2αβγ. Em alguns casos, a primeira potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 modificada é pelo menos 1 vez menor que uma potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em alguns casos, a primeira potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 modificada é pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, ou 500 vezes menor que uma potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em alguns casos, a primeira potência de sinalização de receptor e a segunda potência de sinalização de receptor são ambas menores que as respectivas potências do polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem, mas a primeira potência de sinalização de receptor é menor que a segunda potência de sinalização de receptor. Em alguns casos, a diferença entre a primeira potência de sinalização de receptor e a segunda potência de sinalização de receptor aumenta a janela terapêutica para o polipeptídeo de IL-2 modificada.
[0045] Em algumas modalidades, a fração de conjugação é ligada ao N-terminal ou ao C-terminal de um polipeptídeo de IL-2, direta ou indiretamente através de um peptídeo ligante. Em alguns casos, a fração de conjugação (por exemplo, um polímero, uma proteína ou um peptídeo) é geneticamente fusionada à IL-2, no N-terminal ou no C- terminal de IL-2, e direta ou indiretamente através de um peptídeo ligante. Em alguns exemplos, a fração de conjugação é ligada ao resíduo de aminoácido de N-terminal ou C-terminal. Em alguns exemplos, a fração de conjugação é ligada a um grupo reativo que é ligado ao resíduo de aminoácido de N-terminal ou C-terminal.
[0046] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias ou mais.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas ou mais.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 1 hora.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 2 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 3 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 4 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 5 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 6 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 7 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 8 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 9 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 10 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 12 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 18 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma maior que 24 horas.
[0047] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, ou mais. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas, 24 horas, ou mais. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 1 hora. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 2 horas. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 3 horas. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 4 horas. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 5 horas. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 6 horas. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 7 horas. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 8 horas. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 9 horas. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 10 horas. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 12 horas.
Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 18 horas. Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de pelo menos 24 horas.
[0048] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de cerca de 1 hora a cerca de 7 dias, de cerca de 12 horas a cerca de 7 dias, de cerca de 18 horas a cerca de 7 dias, de cerca de 24 horas a cerca de 7 dias, de cerca de 1 horas a cerca de 5 dias, de cerca de 12 horas a cerca de 5 dias, de cerca de 24 horas a cerca de 5 dias, de cerca de 2 dias a cerca de 5 dias, ou de cerca de 2 dias a cerca de 3 dias.
[0049] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma de cerca de 1 hora a cerca de 18 horas, de cerca de 1 hora a cerca de 12 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 12 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 12 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 8 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, ou de cerca de 8 horas a cerca de 10 horas.
[0050] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida de plasma que tem a capacidade para proliferar e/ou expandir uma célula Treg, mas não exerce um efeito prejudicial como apoptose.
[0051] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida estendida de plasma, por exemplo, por pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, ou mais com relação a uma IL-2 do tipo selvagem.
[0052] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida estendida de plasma, por exemplo, de cerca de 1 hora a cerca de 18 horas, de cerca de 1 hora a cerca de 12 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 12 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 12 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 8 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, ou de cerca de 8 horas a cerca de 10 horas com relação a uma IL-2 do tipo selvagem.
[0053] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida estendida de plasma com uma toxicidade reduzida. Em alguns exemplos, o conjugado de IL- 2 compreende uma meia-vida estendida de plasma de pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, ou mais com uma toxicidade reduzida. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida estendida de plasma de pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas,
4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas, 24 horas, ou mais com uma toxicidade reduzida. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 compreende uma meia-vida estendida de plasma de cerca de 1 hora a cerca de 18 horas, de cerca de 1 hora a cerca de 12 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 12 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 12 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 8 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, ou de cerca de 8 horas a cerca de 10 horas com uma toxicidade reduzida. Em alguns casos, a toxicidade reduzida é pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, ou mais reduzida com relação a uma IL2 do tipo selvagem. Em alguns casos, a toxicidade reduzida é pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, ou mais reduzida com relação a uma IL-2 do tipo selvagem.
[0054] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende uma fração de conjugação na qual o tamanho (por exemplo, o volume ou comprimento) da fração de conjugação melhora a estabilidade de plasma, mas não reduz a potência. Em alguns exemplos, o tamanho da fração de conjugação estende a meia-vida de plasma por pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, ou mais. Em alguns exemplos, o tamanho da fração de conjugação estende a meia-vida de plasma por pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas, 24 horas, ou mais. Em alguns exemplos, o tamanho da fração de conjugação estende a meia-vida de plasma de cerca de 1 hora a cerca de 18 horas, de cerca de 1 hora a cerca de 12 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 12 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 12 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 8 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, ou de cerca de 8 horas a cerca de 10 horas. Em alguns exemplos, o tamanho da fração de conjugação reduz a potência em menos que 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, ou menos com relação a uma IL-2 do tipo selvagem.
[0055] Em algumas modalidades, o conjugado de IL-2 compreende a fração de conjugação no qual o tamanho (por exemplo, o volume ou comprimento) da fração de conjugação melhora a estabilidade de plasma e a potência. Em alguns exemplos, o tamanho da fração de conjugação estende a meia- vida de plasma por pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, ou mais. Em alguns exemplos, o tamanho da fração de conjugação estende a meia- vida de plasma por pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas, 24 horas, ou mais. Em alguns exemplos, o tamanho da fração de conjugação estende a meia-vida de plasma de cerca de 1 hora a cerca de 18 horas, de cerca de 1 hora a cerca de 12 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 12 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 4 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 12 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 8 horas a cerca de 18 horas, de cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, ou de cerca de 8 horas a cerca de 10 horas. Em alguns exemplos, o tamanho da fração de conjugação melhora adicionalmente a potência em mais que 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, ou mais com relação a uma IL-2 do tipo selvagem.
[0056] Em alguns exemplos, a fração de conjugação prejudica ou bloqueia a potência de sinalização de receptor de IL-2 com IL-2Rβγ, ou reduz o recrutamento da subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ.
[0057] Em alguns exemplos, o polipeptídeo de IL-2 modificada com uma diminuição em potência de sinalização de receptor para IL-2Rβγ tem a capacidade para expandir células T regulatórias CD4+ (Treg).
[0058] Em algumas modalidades, a proliferação de célula Treg CD4+ pelo complexo de IL-2/IL-2Rαβγ modificada é equivalente ou maior que aquela de um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
[0059] Em algumas modalidades, o complexo de IL-2/IL- 2Rαβγ induz a proliferação das células Treg CD4+ para uma população que é suficiente para modular um curso de doença em um modelo animal.
[0060] Em algumas modalidades, é descrito no presente documento uma proteína de ligação de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ), em que a potência de sinalização de receptor para um receptor βγ de interleucina 2 (IL-2Rβγ) da dita proteína de ligação é menor que aquela de IL-2 humana do tipo selvagem (hIL-2), e em que a dita proteína de ligação compreende pelo menos um aminoácido não natural. Em alguns casos, a dita proteína de ligação é um polipeptídeo de IL-2 modificada ou um fragmento funcionalmente ativo do mesmo, em que o polipeptídeo de IL- 2 modificada compreende pelo menos um aminoácido não natural.
[0061] Em algumas modalidades, é descrito no presente documento uma proteína de ligação de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ), em que um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ to um complexo de IL-2/IL-2Rβ pela dita proteína de ligação é menor que aquela de IL-2 humana do tipo selvagem (hIL-2), e em que a dita proteína de ligação compreende pelo menos um aminoácido não natural. Em alguns casos, a dita proteína de ligação é um polipeptídeo de IL-2 modificada ou um fragmento funcionalmente ativo do mesmo, em que o polipeptídeo de IL-2 modificada compreende pelo menos um aminoácido não natural.
[0062] Em algumas modalidades, é descrito no presente documento uma proteína de ligação de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ), em que a afinidade de ligação para um receptor βγ de interleucina 2 (IL-2Rβγ) da dita proteína de ligação é menor que aquela de IL-2 humana do tipo selvagem (hIL-2), e em que a dita proteína de ligação compreende pelo menos um aminoácido não natural. Em tais casos, a dita proteína de ligação é um polipeptídeo de IL-2 modificada ou um fragmento funcionalmente ativo do mesmo, em que o polipeptídeo de IL-2 modificada compreende pelo menos um aminoácido não natural.
[0063] Em algumas modalidades, é descrito no presente documento um complexo de IL-2/IL-2Rαβγ que compreende um polipeptídeo de IL-2 modificada que compreende um aminoácido não natural e uma IL-2Rαβγ, em que o polipeptídeo de IL-2 modificada tem uma potência de sinalização de receptor reduzida para IL-2Rβγ, e em que a potência de sinalização de receptor reduzida é comparada a uma afinidade de ligação entre um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem e IL-2Rβγ. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 modificada compreende adicionalmente uma fração de conjugação covalentemente fixada ao aminoácido não natural.
[0064] Em algumas modalidades, é descrito no presente documento um complexo de IL-2/IL-2Rαβγ que compreende um polipeptídeo de IL-2 modificada que compreende um aminoácido não natural e uma IL-2Rαβγ, em que um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ para um complexo de IL-2/IL-2Rβ pelo dito polipeptídeo de IL-2 modificada é menor que aquele de um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 modificada compreende adicionalmente uma fração de conjugação covalentemente fixada ao aminoácido não natural.
[0065] Em algumas modalidades, é descrito no presente documento um complexo de IL-2/IL-2Rαβγ que compreende um polipeptídeo de IL-2 modificada que compreende um aminoácido não natural e uma IL-2Rαβγ, em que o polipeptídeo de IL-2 modificada tem uma afinidade de ligação reduzida para IL-2Rβγ, e em que a afinidade de ligação reduzida é comparada a uma afinidade de ligação entre um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem e IL-2Rβγ. Em algumas modalidades, é descrito no presente documento um complexo de IL-2/IL-2Rαβγ que compreende um polipeptídeo de IL-2 modificada que compreende um aminoácido não natural e uma IL-2Rαβγ, em que um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ para um complexo de IL-2/IL-2Rβ pelo dito polipeptídeo de IL-2 modificada é menor que aquele de um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de IL-2 modificada compreende adicionalmente uma fração de conjugação covalentemente fixada ao aminoácido não natural.
[0066] Em algumas modalidades, é descrito no presente documento a ativador de célula Treg CD4+ que expande seletivamente células Treg CD4+ em uma população celular, em que o dito ativador compreende um polipeptídeo de IL-2 modificada que compreende pelo menos um aminoácido não natural. Em alguns exemplos, o dito ativador expande a célula T efetora CD8+ e/ou células Exterminadoras Naturais em menos que 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 %, ou 0,1 % na população celular de CD3+ quando o dito ativador está em contato com a dita população celular de CD3+, com relação a uma expansão de célula T efetora CD8+ e/ou células
Exterminadoras Naturais na população celular de CD3+ em contato com um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em alguns exemplos, a dita população celular está em uma população celular in vivo. Em alguns exemplos, a dita população celular está em uma população celular in vitro. Em alguns exemplos, a dita população celular está em uma população celular ex vivo. Conjugados de IL-10
[0067] Em algumas modalidades, são descritos no presente documento conjugados de IL-10 modificados em uma posição de aminoácido. IL-10, também conhecido como fator inibitório de síntese de citocina ou CSIF, é uma citocina imunomodulatória que limita a respostas inflamatória contra patógenos, mas também foi identificada como uma citocina antitumoral devido a sua atividade imunoestimulante em células T CD8. IL-10 regula de modo descendente a expressão de citocinas de Th1, antígenos classe II de MHC, e moléculas coestimulatórias em macrófagos, e melhora adicionalmente sobrevivência de célula B, proliferação e produção de anticorpo. Adicionalmente, IL-10 pode estimular a proliferação de timócitos e a citotoxicidade de células T CD8. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-10 compreende um polipeptídeo IL-10 isolado e purificado e uma fração de conjugação. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-10 tem uma afinidade diminuída a um receptor de IL-10 com relação a um polipeptídeo IL-10 do tipo selvagem. Em alguns casos, a fração de conjugação é ligada a um resíduo de aminoácido que interage com o receptor de IL-10 (por exemplo, em uma interface de IL-10/IL-10R). Em alguns casos, a fração de conjugação é ligada a um resíduo de aminoácido que é proximal à interface de IL-10/IL-10R (por exemplo, cerca de 5 Å, cerca de 10 Å, cerca de 15 Å, ou cerca de 20 Å na direção oposta da interface de IL-10/IL-10R). Como usado no presente documento, os resíduos envolvidos na interface de IL-10/IL-10R compreendem resíduos de IL-10 que formam interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio ou interações iônicas com resíduos da IL-10R. Em alguns casos, a fração de conjugação é ligada ao N-terminal ou ao C- terminal de um polipeptídeo de IL-10, direta ou indiretamente através de um peptídeo ligante. Em casos adicionais, a fração de conjugação modula a interação entre IL-10 e IL-10R para potencializar sua atividade imunossupressora e reduziu sua atividade imunoestimulante. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-10 regula de modo ascendente população(ões) distinta(s) de linfócitos através de sinalização de IL-10/IL-10R. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-10 modula atividade imunológica. Conjugados de Citocina Adicionais
[0068] Em algumas modalidades, a descrição no presente documento inclui um ou mais conjugados de citocina adicionais modificados em uma posição de aminoácido. Citocinas exemplificativas incluem, porém sem limitação, IL-1β, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21. Em alguns exemplos, o conjugado de citocina compreende um polipeptídeo de citocina isolado e purificado e uma fração de conjugação. Em alguns exemplos, o conjugado de citocina tem uma afinidade diminuída com seu respectivo receptor com relação a uma citocina do tipo selvagem. Em alguns casos, a fração de conjugação é ligada a um resíduo de aminoácido que é proximal à interface de receptor (por exemplo, cerca de 5 Å, cerca de 10 Å, cerca de 15 Å, ou cerca de 20 Å na direção oposta da interface de receptor). Em alguns casos, a fração de conjugação é ligada ao N-terminal ou ao C- terminal de um polipeptídeo de citocina, direta ou indiretamente através de um peptídeo ligante. Em casos adicionais, a fração de conjugação modula a interação entre citocina e seu receptor para potencializar sua atividade imunossupressora e reduziu sua atividade imunoestimulante. Em alguns exemplos, o conjugado de citocina regula de modo ascendente população(ões) distinta(s) de linfócitos através de sua sinalização de receptor. Em alguns exemplos, o conjugado de citocina modula a atividade imunológica. Precursores de conjugado de citocinas
[0069] São descritos no presente documento precursores de conjugado de citocina, que compreende uma citocina mutante (como IL-2), em que um ou mais aminoácidos foram mutados a partir do aminoácido do tipo selvagem. Tais precursores são frequentemente usados com os métodos descritos no presente documento para o tratamento de doenças ou afecções. Em algumas modalidades, um precursor de citocina não é conjugado. Tais mutações compreendem variadamente adições, deleções ou substituições. Em algumas modalidades, a mutação compreende substituição para um aminoácido natural diferente. Em alguns exemplos, a citocina mutante compreende uma mutação na posição de aminoácido P2, T3, S4, S5, S6, T7, K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, R81, P82, R83, D84, S87, N88, N89, V91, I92, L94, E95, K97, G98, S99, E100,
T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, T113, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, R81, D84, S87, N88, V91, I92, L94, E95, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, P82, R83, N89, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, e T113. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, D84, N88, E95, e Q126. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de K8, K9, e H16. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de Q22, N26, N88, e Q126. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de E15, D20, D84, e E95. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de L12, L19, e M23. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de Q22 e N26. Em algumas modalidades, uma citocina mutante compreende uma fração de conjugação, em que a fração de conjugação é fixada a um sítio mutado na citocina mutante. Fusão de Proteína ou Peptídeo
[0070] Em algumas modalidades, um conjugado de citocina descrito no presente documento compreende uma citocina (por exemplo, IL-2, ou outra citocina) que é fusionada a um peptídeo ou proteína (fusão). Em algumas modalidades, o peptídeo ou proteína é um anticorpo ou fragmento de anticorpo.
Em algumas modalidades, um conjugado de citocina descrito no presente documento compreende uma citocina (por exemplo, IL-2, ou outra citocina) que é fusionada a um anticorpo, ou seus fragmentos de ligação do mesmo.
Em algumas modalidades, uma citocina é descrita no presente documento fusionada a múltiplas proteínas ou múltiplos peptídeos.
Em algumas modalidades, um conjugado de citocina compreende uma fusão de citocina a uma proteína ou um peptídeo, e pelo menos uma fração de conjugação.
Em alguns exemplos, um anticorpo ou seus fragmentos de ligação do mesmo compreende um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo murino ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo quimérico ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo, Fab’ monovalente, Fab2 divalente, fragmentos de F(ab)'3, fragmento variável de cadeia única (scFv), bis- scFv, (scFv)2, diacorpo, minicorpo, nanocorpo, triacorpo, tetracorpo, humacorpo, proteína de Fv estabilizada por dissulfeto (dsFv), anticorpo de domínio único (sdAb), NAR de Ig, anticorpo de camelídeo ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação do mesmo, ou um derivado quimicamente modificado do mesmo.
Tais proteínas de fusão em alguns exemplos são geradas diretamente através de tradução.
Em algumas modalidades, fusões são geradas com o uso de método de ligação química ou outra ligação enzimática.
Em algumas modalidades, um conjugado de citocina compreende um peptídeo ou uma proteína fusionada que é fixada por um ligante. Em algumas modalidades, o ligante é um peptídeo. Em algumas modalidades, um conjugado de citocina compreende uma fusão de peptídeo ou proteína de N-terminal. Em algumas modalidades, um conjugado de citocina compreende uma fusão de peptídeo ou proteína de C-terminal. Em alguns casos, a citocina fusionada ao peptídeo ou proteína é adicionalmente conjugada em uma ou mais frações de conjugação descritas abaixo.
[0071] Em alguns exemplos, o conjugado de citocina compreende uma fusão a uma fusão de scFv, bis-scFv, (scFv)2, dsFv ou sdAb. Em alguns casos, a fusão compreende um scFv. Em alguns casos, o conjugado de citocina compreende uma fusão a bis-scFv. Em alguns casos, o conjugado de citocina compreende uma fusão a (scFv)2. Em alguns casos, o conjugado de citocina compreende uma fusão a dsFv. Em alguns casos, o conjugado de citocina compreende uma fusão a sdAb. Em alguns casos, a citocina fusionada ao scFv, bis-scFv, (scFv)2, dsFv ou sdAb é adicionalmente conjugada em uma ou mais frações de conjugação descritas abaixo.
[0072] Em alguns exemplos, o conjugado de citocina compreende uma fusão a uma porção de Fc de um anticorpo, por exemplo, de IgG, IgA, IgM, IgE, ou IgD. Em alguns exemplos, o conjugado de citocina compreende uma fusão a uma porção de Fc de IgG (por exemplo, IgG1, IgG3, ou IgG4). Em alguns casos, a citocina fusionada à porção de Fc é adicionalmente conjugada as uma ou mais frações de conjugação descritas abaixo.
[0073] Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN, ou TNF) é fusionado a um anticorpo, ou seus fragmentos de ligação do mesmo. Em alguns casos, o polipeptídeo de citocina é fusionado a um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo murino ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo quimérico ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo, Fab’ monovalente, Fab2 divalente, fragmentos de F(ab)'3, fragmento variável de cadeia única (scFv), bis-scFv, (scFv)2, diacorpo, minicorpo, nanocorpo, triacorpo, tetracorpo, humacorpo, proteína de Fv estabilizada por dissulfeto (dsFv), anticorpo de domínio único (sdAb), NAR de Ig, anticorpo de camelídeo ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação do mesmo, ou um derivado quimicamente modificado do mesmo. Em casos adicionais, o polipeptídeo de citocina é fusionado a uma porção de Fc de um anticorpo. Em casos adicionais, o polipeptídeo de citocina é fusionado a uma porção de Fc de IgG (por exemplo, IgG1, IgG3, ou IgG4). Em alguns casos, a citocina fusionada ao anticorpo, ou seus fragmentos de ligação do mesmo são adicionalmente conjugados as uma ou mais frações de conjugação descritas abaixo.
[0074] Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é fusionado a um anticorpo, ou seus fragmentos de ligação do mesmo. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 é fusionado a um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo murino ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo quimérico ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo, Fab’ monovalente, Fab2 divalente, fragmentos de F(ab)'3,
fragmento variável de cadeia única (scFv), bis-scFv, (scFv)2, diacorpo, minicorpo, nanocorpo, triacorpo, tetracorpo, humacorpo, proteína de Fv estabilizada por dissulfeto (dsFv), anticorpo de domínio único (sdAb), NAR de Ig, anticorpo de camelídeo ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação do mesmo, ou um derivado quimicamente modificado do mesmo. Em casos adicionais, o polipeptídeo de IL-2 é fusionado a uma porção de Fc de um anticorpo. Em casos adicionais, o polipeptídeo de IL-2 é fusionado a uma porção de Fc de IgG (por exemplo, IgG1, IgG3, ou IgG4). Em alguns casos, o anticorpo ou seus fragmentos de ligação do mesmo fusionados ao polipeptídeo de IL-2 não impedirão a ligação do polipeptídeo de IL-2 à IL-2Rβγ. Em alguns casos, o anticorpo ou seus fragmentos de ligação do mesmo fusionados ao polipeptídeo de IL-2 bloqueiam parcialmente a ligação do polipeptídeo de IL-2 à IL-2Rβγ. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 fusionado ao anticorpo ou seus fragmentos de ligação do mesmo são adicionalmente conjugados as uma ou mais frações de conjugação descritas abaixo. Aminoácidos Naturais e Não Naturais
[0075] Em algumas modalidades, um resíduo de aminoácido descrito no presente documento (por exemplo, em uma citocina como IL-2) é mutado para lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina ou tirosina antes da ligação a (ou reação com) uma fração de conjugação. Por exemplo, a cadeia lateral de lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina ou tirosina pode se ligar a uma fração de conjugação descrita no presente documento. Em alguns exemplos, o resíduo de aminoácido é mutado para cisteína, lisina ou histidina. Em alguns casos, o resíduo de aminoácido é mutado para cisteína. Em alguns casos, o resíduo de aminoácido é mutado para lisina. Em alguns casos, o resíduo de aminoácido é mutado para histidina. Em alguns casos, o resíduo de aminoácido é mutado para tirosina. Em alguns casos, o resíduo de aminoácido é mutado para triptofano. Em algumas modalidades, um aminoácido não natural é não é conjugada com uma fração de conjugação. Em algumas modalidades, uma citocina descrita no presente documento compreende um aminoácido não natural, em que a citocina é conjugada para a proteína, em que o ponto de fixação não é o aminoácido não natural.
[0076] Em algumas modalidades, um resíduo de aminoácido descrito no presente documento (por exemplo, em uma citocina como IL-2) é mutada em um aminoácido não natural antes da ligação a uma fração de conjugação. Em alguns casos, a mutação para um aminoácido não natural impede ou minimiza uma resposta autoantígeno do sistema imunológico. Como usado no presente documento, o termo "aminoácido não natural" se refere a um aminoácido diferente dos 20 aminoácidos de ocorrência natural em proteína. Exemplos não limitantes de aminoácidos não naturais incluem: p-acetil-L- fenilalanina, p-iodo-L-fenilalanina, p-metoxifenilalanina, O-metil-L-tirosina, p-propargiloxifenilalanina, p- propargil-fenilalanina, L-3-(2-naftil)alanina, 3-metil- fenilalanina, O- 4-alil-L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, tri-O-acetil-GlcNAcp-serina, L-Dopa, fenilalanina fluorada,
isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-acil-L- fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, p- Boronofenilalanina, O-propargiltirosina, L-fosfosserina, fosfonosserina, fosfonotirosina, p-bromofenilalanina, selenocisteína, p-amino-L-fenilalanina, isopropil-L- fenilalanina, azido-lisina (AzK), um análogo não natural de um aminoácido de tirosina; um análogo não natural de um aminoácido de glutamina; um análogo não natural de um aminoácido de fenilalanina; um análogo não natural de um aminoácido de serina; um análogo não natural de um aminoácido de treonina; uma alquila, arila, acila, azido, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidroxila, alquenila, alquinila, éter, tiol, sulfonila, seleno, éster, tioácido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldeído, hidroxilamina, ceto ou aminoácido substituído por amino, ou uma combinação dos mesmos; um aminoácido com um reticulador fotoativável; um aminoácido identificado por fuso; um aminoácido fluorescente; um aminoácido de ligação a metal; um aminoácido que contém metal; um aminoácido radioativo; um aminoácido fotopreso e/ou fotoisomerizável; um aminoácido que contém biotina ou análogo de biotina; um aminoácido que contém ceto; um aminoácido que compreende polietileno glicol ou poliéter; um aminoácido substituído por átomo pesado; um aminoácido quimicamente clivável ou fotoclivável; um aminoácido com uma cadeia lateral alongada; um aminoácido que contém um grupo tóxico; um aminoácido substituído por açúcar; um aminoácido que contém açúcar ligado a carbono; um aminoácido redox-ativo; um ácido que contém a-hidróxi; um ácido amino tio; um aminoácido dissubstituído α, α; um β-
aminoácido; um aminoácido cíclico diferente de prolina ou histidina, e um aminoácido aromático diferente de fenilalanina, tirosina ou triptofano.
[0077] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural compreende um grupo reativo seletivo, ou um grupo reativo para etiquetagem de sítio seletivo de um polipeptídeo-alvo. Em alguns exemplos, a química é uma reação bio-ortogonal (por exemplo, reações biocompatíveis e seletivas). Em alguns casos, a química é uma reação que forma triazol de alcino-azida de Cu(I)-catalisado ou “isento de cobre”, a ligação de Staudinger, reação de Diels-Alder de demanda de elétron inverso (IEDDA), química de “fotoclique”, ou um processo mediado por metal, como metátese de olefina e acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura ou Sonogashira.
[0078] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural compreende um grupo fotorreativo, que se reticula, mediante a radiação com, por exemplo, UV.
[0079] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural compreende um aminoácido fotopreso.
[0080] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um derivado de aminoácido para-substituído, meta-substituído ou orto-substituído.
[0081] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende p-acetil-L-fenilalanina, p-iodo-L-fenilalanina, O-metil-L-tirosina, p-metoxifenilalanina, p- propargiloxifenilalanina, p-propargil-fenilalanina, L-3-(2- naftil)alanina, 3-metil-fenilalanina, O- 4-alil-L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, tri-O-acetil-GlcNAcp-serina, L-Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L- fenilalanina, p-acil-L-fenilalanina, p-benzoil-L-
fenilalanina, L-fosfosserina, fosfonosserina, fosfonotirosina, p-bromofenilalanina, p-amino-L- fenilalanina, ou isopropil-L-fenilalanina.
[0082] Em alguns casos, o aminoácido não natural é 3- aminotirosina, 3-nitrotirosina, 3,4-di-hidroxi- fenilalanina, ou 3-iodotirosina.
[0083] Em alguns casos, o aminoácido não natural é fenilselenocisteína.
[0084] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um derivado de fenilalanina que contém benzofenona, cetona, iodo, metóxi, acetila, benzoíla ou azida.
[0085] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um derivado de lisina que contém benzofenona, cetona, iodo, metóxi, acetila, benzoíla ou azida.
[0086] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende uma cadeia lateral aromática.
[0087] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural não compreende uma cadeia lateral aromática.
[0088] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um grupo azido.
[0089] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um grupo receptor de Michael. Em alguns exemplos, grupos receptores de Michael compreendem uma fração insaturada com a capacidade para formar uma ligação covalente através de uma reação de adição 1,2. Em alguns exemplos, grupos receptores de Michael compreendem alcenos ou alcinos deficientes de elétrons. Em alguns exemplos, grupos receptores de Michael incluem, porém sem limitação, alfa, beta insaturados: cetonas, aldeídos, sulfóxidos, sulfonas, nitrilos, iminas ou aromáticos.
[0090] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é de-hidroalanina.
[0091] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um grupo aldeído ou cetona.
[0092] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um derivado de lisina que compreende um grupo aldeído ou cetona.
[0093] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um derivado de lisina que compreende um ou mais átomos de O, N, Se ou S na posição beta, gama ou delta. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um derivado de lisina que compreende átomos de O, N, Se ou S na posição gama.
[0094] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um derivado de lisina em que o átomo épsilon N é substituído por um átomo de oxigênio.
[0095] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um derivado de lisina que não é |lisina pós-traducionalmente modifica de ocorrência natural.
[0096] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um aminoácido que compreende a cadeia lateral, em que o sexto átomo da posição alfa compreende um grupo carbonila. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um aminoácido que compreende a cadeia lateral, em que o sexto átomo da posição alfa compreende um grupo carbonila, e o quinto átomo da posição alfa é um nitrogênio. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um aminoácido que compreende a cadeia lateral, em que o sétimo átomo da posição alfa é um átomo de oxigênio.
[0097] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um derivado de serina que compreende selênio. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é selenosserina (ácido 2-amino-3-hidrosselenopropanoico). Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-3-((2-((3- (benziloxi)-3-oxopropil)amino)etil)selanil)propanoico. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino- 3-(fenilselanil)propanoico. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende selênio, em que a oxidação do selênio resulta na formação de um aminoácido não natural que compreende um alceno.
[0098] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um grupo ciclo-octinila.
[0099] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um grupo transcicloctenila.
[0100] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um grupo norbornenila.
[0101] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um grupo ciclopropenila.
[0102] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um grupo diazirina.
[0103] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um grupo tetrazina.
[0104] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um derivado de lisina, em que o nitrogênio de cadeia lateral é carbamilatado. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um derivado de lisina, em que o nitrogênio de cadeia lateral é acilatado. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-6-{[(terc- butoxi)carbonil]amino}hexanoico. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-6-{[(terc- butoxi)carbonil]amino}hexanoico. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-Boc-N6-metilisina.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-acetilisina.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é pirrolisina.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6- trifluoroacetilisina.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-6- {[(benziloxi)carbonil]amino}hexanoico.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-6-{[(p- iodobenziloxi)carbonil]amino}hexanoico.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-6-{[(p- nitrobenziloxi)carbonil]amino}hexanoico.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-prolilisina.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino- 6-{[(ciclopentiloxi)carbonil]amino}hexanoico.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6- (ciclopentanocarbonil)lisina.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-(tetra-hidrofuran-2- carbonil)lisina.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-(3-etiniltetra-hidrofuran-2-carbonil)lisina.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((prop-2- in-1-iloxi)carbonil)lisina.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-6-{[(2- azidociclopentiloxi)carbonil]amino}hexanoico.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((2- azidoetoxi)carbonil)lisina.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-6-{[(2- nitrobenziloxi)carbonil]amino}hexanoico.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-6-{[(2- ciclo-octiniloxi)carbonil]amino}hexanoico.
Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-(2-aminobut-3-
inoil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-6-((2-aminobut-3-inoil)oxi)hexanoico. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6- (aliloxicarbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-(butenil-4-oxicarbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-(pentenil-5- oxicarbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((but-3-in-1-iloxi)carbonil)-lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((pent-4-in-1- iloxi)carbonil)-lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-(tiazolidina-4-carbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-8- oxononanoico. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-8-oxo-octanoico. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-(2-oxoacetil)lisina.
[0105] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-propionilisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-butirilisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-(but-2-enoil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((biciclo[2.2.1]hept-5-en-2- iloxi)carbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((espiro[2.3]hex-1-en-5- ilmetoxi)carbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-(((4-(1-(trifluorometil)cicloprop-2-en-1- il)benzil)oxi)carbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((biciclo[2.2.1]hept-5-en-2- ilmetoxi)carbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é cisteinilisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((1-(6- nitrobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)etoxi)carbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((2-(3- metil-3H-diazirin-3-il)etoxi)carbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((3-(3-metil-3H- diazirin-3-il)propoxi)carbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((meta nitrobeniloxi)N6- metilcarbonil)lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6-((biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetoxi)carbonil)- lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é N6- ((ciclohept-3-en-1-iloxi)carbonil)-L-lisina.
[0106] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é ácido 2-amino-3- (((((benziloxi)carbonil)amino)metil)selanil)propanoico.
[0107] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é incorporado na citocina (por exemplo, o polipeptídeo de IL) por um códon de parada âmbar, opal ou ocre redirecionado.
[0108] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é incorporado na citocina (por exemplo, o polipeptídeo de IL) por um códon de 4 bases.
[0109] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é incorporado na citocina (por exemplo, o polipeptídeo de IL) por um códon de sentido raro redirecionado.
[0110] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é incorporado na citocina (por exemplo, o polipeptídeo de IL) por um códon sintético que compreende um ácido nucleico não natural. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é incorporado na citocina por um par sintetase/tRNA modificado ortogonal. Tais pares ortogonais compreendem uma sintetase não natural que tem a capacidade para carregar o tRNA não natural com o aminoácido não natural, enquanto minimiza a carga de a) outros aminoácidos endógenos no tRNA não natural e b) aminoácidos não naturais em outros tRNAs endógenos.
Tais pares ortogonais compreendem tRNAs que têm a capacidade para serem carregados pela sintetase não natural, enquanto evita ser carregado com a) outros aminoácidos endógenos por sintetases endógenas.
Em algumas modalidades, tais pares são identificados a partir de diversos organismos, como bactéria, levedura, Archaea ou fontes humanas.
Em algumas modalidades, um par sintetase/tRNA ortogonal compreende componentes de um organismo único.
Em algumas modalidades, um par sintetase/tRNA ortogonal compreende componentes de dois organismos diferentes.
Em algumas modalidades, um par sintetase/tRNA ortogonal que compreende componentes que antes da modificação, promove a tradução de dois aminoácidos diferentes.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma alanina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma arginina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma asparagina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é um ácido aspártico sintetase modificado.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma cisteína sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma glutamina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é um ácido glutâmico sintetase modificado.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma alanina glicina modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma histidina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma leucina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma isoleucina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma lisina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma metionina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma fenilalanina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma prolina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma serina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma treonina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é um triptofano sintetase modificado.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma tirosina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma valina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, uma sintetase ortogonal é uma fosfosserina sintetase modificada.
Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de alanina modificado.
Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de arginina modificado.
Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de asparagina modificado.
Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de ácido aspártico modificado.
Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de cisteína modificado.
Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de glutamina modificado.
Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é uma tRNA de ácido glutâmico modificado.
Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é uma alanina glicina modificada.
Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de histidina modificado.
Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de leucina modificado. Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de isoleucina modificado. Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de lisina modificado. Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de metionina modificado. Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de fenilalanina modificado. Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de prolina modificado. Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de serina modificado. Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de treonina modificado. Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de triptofano modificado. Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de tirosina modificado. Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de valina modificado. Em algumas modalidades, um tRNA ortogonal é um tRNA de fosfosserina modificado.
[0111] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é incorporado na citocina (por exemplo, o polipeptídeo de IL) por um par de aminoacila (aaRS ou RS)-tRNA e sintetase- tRNA. Pares de aaRS-tRNA incluem, porém sem limitação, pares de Metanococcus jannaschii (Mj-Tyr) aaRS/tRNA, pares de E. coli TyrRS (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus tRNACUA, pares de E. coli LeuRS (Ec-Leu)/B. stearothermophilus tRNACUA, e pares de pirrolisil-tRNA. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é incorporado na citocina (por exemplo, o polipeptídeo de IL) por um par de Mj-TyrRS/tRNA. UAAs exemplificativos que podem ser incorporados por um par de Mj-TyrRS/tRNA incluem, porém sem limitação, derivados de fenilalanina para-substituídos como p-aminofenilalanina e p-metoifenilalanina; derivados de tirosina meta-
substituídos como 3-aminotirosina, 3-nitrotirosina, 3,4-di- hidroxifenilalanina, e 3-iodotirosina; fenilselenocisteína; p-boronofeilalanina; e o-nitrobenziltirosina.
[0112] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é incorporado na citocina (por exemplo, o polipeptídeo de IL) por um par de Ec-Tyr/tRNACUA ou um par de Ec-Leu/tRNACUA. UAAs exemplificativos que podem ser incorporados por um par de Ec-Tyr/tRNACUA ou um par de Ec-Leu/tRNACUA incluem, porém sem limitação, derivados de fenilalanina que contêm benzofenona, cetona, iodo ou substituintes de azida; O- propargiltirosina; ácido α-aminocaprílico, O-metil tirosina, O-nitrobenzil cisteína; e ácido 3-(naftaleno-2- ilamino)-2-amino-propanoico.
[0113] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é incorporado na citocina (por exemplo, o polipeptídeo de IL) por um par de pirrolisil-tRNA. Em alguns casos, o PylRS é obtido a partir de uma archaebactéria, por exemplo, a partir de uma archaebactéria metanogênica. Em alguns casos, o PylRS é obtido a partir de Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei ou Methanosarcina acetivorans. UAAs exemplificativos que podem ser incorporados por um par de pirrolisil-tRNA incluem, porém sem limitação, lisinas substituídas por amida e carbamato como ácido 2-amino-6- ((R)-tetra-hidrofuran-2-carboxamido)hexanoico, N-ε-D- prolil-L-lisina, e N-ε-ciclopentiloxicarbonil-L-lisina; N- ε-Acriloil-L-lisina; N-ε-[(1-(6-nitrobenzo[d][1,3]dioxol-5- il)etoxi)carbonil]-L-lisina; e N-ε-(1-metilciclopro-2- enecarboxamido)lisina.
[0114] Em alguns exemplos, um aminoácido não natural é incorporado por uma citocina descrita no presente documento
(por exemplo, o polipeptídeo de IL) por uma sintetase revelada no documento nº US 9.988.619 e US9.938.516. UAAs exemplificativos que podem ser incorporados por tais sintetases incluem aminoácidos não naturais de para- metilazido-L-fenilalanina, aralquila, heterociclila, heteroaralquila e outros. Em algumas modalidades, tais UAAs compreendem piridila, pirazinila, pirazolila, triazolila, oxazolila, tiazolila, tiofenila ou outro heterociclo. Tais aminoácidos, em algumas modalidades, compreendem azidas, tetrazinas, ou outros grupos químicos com a capacidade para se conjugar a um parceiro de acoplamento, como uma fração solúvel em água. Em algumas modalidades, tais sintetases são expressas e usadas para incorporar UAAs em citocinas in-vivo. Em algumas modalidades, tais sintetases são usadas para incorporar UAAs em citocinas que usam um sistema de tradução livre de célula.
[0115] Em alguns exemplos, um aminoácido não natural é incorporado em uma citocina descrita no presente documento (por exemplo, o polipeptídeo de IL) por uma sintetase de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um aminoácido não natural é incorporado em uma citocina por um organismo que é auxotrófico para um ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, as sintetases que correspondem ao aminoácido auxotrófico têm a capacidade para carregar o tRNA correspondente com um aminoácido não natural. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é selenocisteína, ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é selenometionina, ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é um aminoácido aromático, em que o aminoácido aromático compreende um haleto de arila, como um iodo. Nas modalidades, o aminoácido não natural é estruturalmente similar ao aminoácido auxotrófico.
[0116] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um aminoácido não natural ilustrado na Fig. 1.
[0117] Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um derivado ou análogo de lisina ou fenilalanina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um derivado de lisina ou um análogo de lisina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende uma pirrolisina (Pyl). Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um derivado de fenilalanina ou um análogo de fenilalanina. Em alguns exemplos, o aminoácido não natural é um aminoácido não natural descrito em Wan, et al., “Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool“, Biocheim Biophys Aceta 1844(6): 1059-4070 (2014). Em alguns exemplos, o aminoácido não natural compreende um aminoácido não natural ilustrado na Fig. 2 (por exemplo, Fig. 2A e Fig. 2B).
[0118] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural compreende um aminoácido não natural ilustrado na Fig. 3A - Fig. 3D (adotado a partir da Tabela 1 de Dumas et al., Chemical Science 2015, 6, 50-69).
[0119] Em algumas modalidades, um aminoácido não natural incorporado em uma citocina descrito no presente documento (por exemplo, o polipeptídeo de IL) é revelado nos documentos nº US 9.840.493; US 9.682.934; US 2017/0260137; US 9.938.516; ou US 2018/0086734. UAAs exemplificativos que podem ser incorporados por tais sintetases incluem aminoácidos não naturais derivados de para-metilazido-L-
fenilalanina, aralquila, heterociclila e heteroaralquila e de lisina.
Em algumas modalidades, tais UAAs compreendem piridila, pirazinila, pirazolila, triazolila, oxazolila, tiazolila, tiofenila ou outro heterociclo.
Tais aminoácidos, em algumas modalidades, compreendem azidas, tetrazinas, ou outros grupos químicos com a capacidade para se conjugar a um parceiro de acoplamento, como uma fração solúvel em água.
Em algumas modalidades, um UAA compreende uma azida fixada a uma fração aromática por meio de um ligante de alquila.
Em algumas modalidades, um ligante de alquila é um ligante C1-C10. Em algumas modalidades, um UAA compreende uma tetrazina fixada a uma fração aromática por meio de um ligante de alquila.
Em algumas modalidades, um UAA compreende uma tetrazina fixada a uma fração aromática por meio de um grupo amino.
Em algumas modalidades, um UAA compreende uma tetrazina fixada a uma fração aromática via um grupo alquilamino.
Em algumas modalidades, um UAA compreende uma azida fixada ao nitrogênio terminal (por exemplo, N6 de um derivado de lisina, ou N5, N4, ou N3 de um derivado que compreende uma alquila cadeia lateral mais curta) de um aminoácido cadeia lateral por meio de uma cadeia de alquila.
Em algumas modalidades, um UAA compreende uma tetrazina fixada ao nitrogênio terminal de um aminoácido cadeia lateral por meio de uma cadeia de alquila.
Em algumas modalidades, um UAA compreende uma azida ou tetrazina fixada a uma amida por meio de um ligante de alquila.
Em algumas modalidades, o UAA é um carbamato ou uma amida que contém azida ou tetrazina de 3- aminoalanina, serina, lisina, ou derivado dos mesmos.
Em algumas modalidades, tais UAAs são incorporados em citocinas in-vivo. Em algumas modalidades, tais UAAs são incorporados em citocinas em um sistema de livre de células. Frações de Conjugação
[0120] Em determinadas modalidades, são revelados no presente documento frações de conjugação que são ligadas as uma ou mais citocinas (por exemplo, interleucinas, IFNs, ou TNFs) descritas acima. Em alguns exemplos, a fração de conjugação é uma molécula que perturba a interação de uma citocina com seu receptor. Em alguns exemplos, a fração de conjugação é qualquer molécula que quando ligada à citocina, permite que o conjugado de citocina module uma resposta imunológica. Em alguns exemplos, a fração de conjugação compreende um polímero solúvel em água. Em outros exemplos, a fração de conjugação compreende uma proteína ou um fragmento de ligação do mesmo. Em exemplos adicionais, a fração de conjugação compreende um peptídeo. Em exemplos adicionais, a fração de conjugação compreende um ácido nucleico. Em exemplos adicionais, a fração de conjugação compreende uma molécula pequena. Em alguns casos, a fração de conjugação aumenta a meia-vida sérica, e/ou aprimora a estabilidade. Em alguns casos, a fração de conjugação reduz a interação de citocina com um ou mais domínios ou subunidades de receptor de citocina. Em casos adicionais, a fração de conjugação bloqueia a interação de citocina de um ou mais domínios ou subunidades de citocina com seu(s) receptor(es) cognato(s). Em algumas modalidades, conjugados de citocina descritos no presente documento compreendem múltiplas frações de conjugação. Em algumas modalidades, a fração de conjugação é fixada a um aminoácido não natural ou natural no peptídeo de citocina. Em algumas modalidades, um conjugado de citocina compreende uma fração de conjugação fixada a um aminoácido natural. Em algumas modalidades, um conjugado de citocina é fixado a um aminoácido não natural no peptídeo de citocina. Em algumas modalidades, uma fração de conjugação é fixada ao aminoácido de N ou C terminal do peptídeo de citocina. Diversas combinações de sítios são reveladas no presente documento, por exemplo, uma primeira fração de conjugação é fixada a um aminoácido não natural ou natural no peptídeo de citocina, e uma segunda fração de conjugação é fixada ao aminoácido de N ou C terminal do peptídeo de citocina. Em algumas modalidades, uma única fração de conjugação é fixada a múltiplos resíduos do peptídeo de citocina (por exemplo, um grampo). Em algumas modalidades, uma fração de conjugação é fixada tanto a aminoácidos de N terminal quanto de C terminal do peptídeo de citocina. Polímeros Solúveis em Água
[0121] Em algumas modalidades, uma fração de conjugação descrita no presente documento é um polímero solúvel em água. Em alguns exemplos, o polímero solúvel em água é um não peptídico, não tóxico e biocompatível. Como usado no presente documento, uma substância é considerada biocompatível se os efeitos benéficos associados ao uso da substância por si só ou com outra substância (por exemplo, um agente ativo como uma fração de citocina) em conexão com tecidos vivos (por exemplo, administração a um paciente) compensa quaisquer efeitos prejudiciais como avaliados por um clínico, por exemplo, um médico, um toxicologista ou um especialista em desenvolvimento clínico. Em alguns exemplos, um polímero solúvel em água é adicionalmente não imunogênico. Em alguns exemplos, uma substância é considerada não imunogênica se o uso pretendido da substância in vivo não produzir uma resposta imunológica indesejada (por exemplo, a formação de anticorpos) ou, se uma resposta imunológica for produzida, que tal resposta é considerada clinicamente significativa ou importante, como avaliada por um clínico, por exemplo, um médico, um toxicologista ou um especialista em desenvolvimento clínico.
[0122] Em alguns exemplos, o polímero solúvel em água é caracterizado como tendo cerca de 2 a cerca de 300 terminais. Polímeros solúveis em água exemplificativos incluem, porém sem limitação, poli(alquileno glicóis) como polietileno glicol (“PEG”), poli(propileno glicol) (“PPG”), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol e similares, poliol poli(oxietilado), álcool poli(olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacarídeos), ácido poli(α-hidróxi), álcool poli(vinila) (PVA), poliacrilamida (PAAm), poli(N-(2-hidroxipropil) metacrilamida) (PHPMA), polidimetilacrilamida (PDAAm), polifosfazeno, polioxazolinas (“POZ”) (que são descritos no presente documento nº WO 2008/106186), poli(N-acriloilmorfolina), e combinações de qualquer um dos supracitados.
[0123] Em alguns casos, o polímero solúvel em água não é limitado a uma estrutura particular. Em alguns casos, o polímero solúvel em água é linear (por exemplo, uma extremidade capeada, por exemplo, PEG de alcóxi ou um PEG bifuncional), ramificado ou de múltiplos braços (por exemplo, PEG em garfo ou PEG fixado a um núcleo de poliol), uma arquitetura dendrítica (ou em estrela), cada um com ou sem uma ou mais ligações degradáveis. Além disso, a estrutura interna do polímero solúvel em água pode ser organizada em qualquer número de padrões de repetição diferentes e pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em homopolímero, copolímero alternante, copolímero aleatório, copolímero em bloco, tripolímero alternante, tripolímero aleatório e tripolímero em bloco.
[0124] Em algumas modalidades, o peso molecular ponderal médio do polímero solúvel em água no conjugado de IL-2 é de cerca de 100 Daltons a cerca de 150000 Daltons. Faixas exemplificativas incluem, por exemplo, pesos moleculares ponderais médios na faixa maior que 5000 Daltons a cerca de 100000 Daltons, na faixa de cerca de 6000 Daltons a cerca de 90000 Daltons, na faixa de cerca de 10000 Daltons a cerca de 85000 Daltons, na faixa maior que 10000 Daltons a cerca de 85000 Daltons, na faixa de cerca de 20000 Daltons a cerca de 85000 Daltons, na faixa de cerca de 53000 Daltons a cerca de 85000 Daltons, na faixa de cerca de 25000 Daltons a cerca de 120000 Daltons, na faixa de cerca de 29000 Daltons a cerca de 120000 Daltons, na faixa de cerca de 35000 Daltons a cerca de 120000 Daltons, e na faixa de cerca de 40000 Daltons a cerca de 120000 Daltons.
[0125] Pesos moleculares ponderais médios exemplificativos para o polímero solúvel em água incluem cerca de 100 Daltons, cerca de 200 Daltons, cerca de 300 Daltons, cerca de 400 Daltons, cerca de 500 Daltons, cerca de 600 Daltons, cerca de 700 Daltons, cerca de 750 Daltons, cerca de 800 Daltons, cerca de 900 Daltons, cerca de 1000
Daltons, cerca de 1500 Daltons, cerca de 2000 Daltons, cerca de 2200 Daltons, cerca de 2500 Daltons, cerca de 3000 Daltons, cerca de 4000 Daltons, cerca de 4400 Daltons, cerca de 4500 Daltons, cerca de 5000 Daltons, cerca de 5500 Daltons, cerca de 6000 Daltons, cerca de 7000 Daltons, cerca de 7500 Daltons, cerca de 8000 Daltons, cerca de 9000 Daltons, cerca de 10000 Daltons, cerca de 11000 Daltons, cerca de 12000 Daltons, cerca de 13000 Daltons, cerca de 14000 Daltons, cerca de 15000 Daltons, cerca de 20000 Daltons, cerca de 22500 Daltons, cerca de 25000 Daltons, cerca de 30000 Daltons, cerca de 35000 Daltons, cerca de 40000 Daltons, cerca de 45000 Daltons, cerca de 50000 Daltons, cerca de 55000 Daltons, cerca de 60000 Daltons, cerca de 65000 Daltons, cerca de 70000 Daltons, e cerca de 75000 Daltons. Versões ramificadas do polímero solúvel em água (por exemplo, um polímero solúvel em água ramificado de 40000 Dalton compreende dois polímeros de 20000 Dalton) que tem um peso molecular total de qualquer um dos acima também pode ser usado. Em uma ou mais modalidades, o conjugado não terá quaisquer frações de PEG fixada, direta ou indiretamente, com um PEG que tem um peso molecular ponderal médio menor que cerca de 6000 Daltons.
[0126] PEGs compreenderão tipicamente um número de monômeros (OCH2CH2) [ou monômeros (CH2CH2O), dependendo de como o PEG é definido]. Como usado no presente documento, o número de unidades de repetição é identificado pelo subscrito “n” em “(OCH2CH2)n.” Desse modo, o valor de (n) está tipicamente em uma ou mais dentre as seguintes faixas: de 2 a cerca de 3400, de cerca de 100 a cerca de 2300, de cerca de 100 a cerca de 2270, de cerca de 136 a cerca de
2050, de cerca de 225 a cerca de 1930, de cerca de 450 a cerca de 1930, de cerca de 1200 a cerca de 1930, de cerca de 568 a cerca de 2727, de cerca de 660 a cerca de 2730, de cerca de 795 a cerca de 2730, de cerca de 795 a cerca de 2730, de cerca de 909 a cerca de 2730, e de cerca de 1200 a cerca de 1900. Para qualquer polímero determinado no qual o peso molecular é conhecido, é possível determinar o número de unidades de repetição (isto é, “n”) dividindo-se o peso molecular ponderal médio total do polímero pelo peso molecular do monômero de repetição.
[0127] Em alguns exemplos, o polímero solúvel em água é um polímero de extremidade capeada, isto é, um polímero que tem pelo menos uma terminação capeada com um grupo relativamente inerte, como um grupo alcóxi C1-6 inferior, ou um grupo hidroxila. Quando o polímero for PEG, por exemplo, um metoxi-PEG (comumente denominado mPEG) pode ser usado, que é uma forma linear de PEG em que um terminal do polímero é um grupo metóxi (—OCH3), enquanto a outra terminação é uma hidroxila ou outro grupo funcional que pode ser opcionalmente modificado de modo químico.
[0128] Em algumas modalidades, os polímeros solúveis em água exemplificativos incluem, porém sem limitação, PEG discreto linear ou ramificado (dPEG) da Quanta Biodesign, Ltd; PEGs lineares, ramificados ou em garfo da Nektar Therapeutics; e derivados de PEG em formato de Y da JenKem Technology.
[0129] Em algumas modalidades, um peptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é descrito no presente documento conjugado a um polímero solúvel em água selecionado a partir de poli(alquileno glicóis) como polietileno glicol (“PEG”), poli(propileno glicol) (“PPG”), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol e similares, polio poli(oxietilado), álcool poli(olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacarídeos), ácido poli(α-hidróxi), álcool poli(vinil) (PVA), poliacrilamida (PAAm), polidimetilacrilamida (PDAAm), poli(N-(2- hidroxipropil) metacrilamida) (PHPMA), polifosfazeno, polioxazolinas (“POZ”), poli(N-acriloilmorfolina), e uma combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de citocina é conjugado a PEG (por exemplo, PEGilatado). Em alguns exemplos, o polipeptídeo de citocina é conjugado a PPG. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de citocina é conjugado a POZ. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de citocina é conjugado a PVP.
[0130] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de IL-2 é descrito no presente documento conjugado a um polímero solúvel em água selecionado a partir de poli(alquileno glicóis) como polietileno glicol (“PEG”), poli(propileno glicol) (“PPG”), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol e similares, poliol poli(oxietilado), álcool poli(oliefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacarídeos), ácido poli(α-hidróxi), álcool poli(vinil) (PVA), poliacrilamida (PAAm), polidimetilacrilamida (PDAAm), poli(N-(2- hidroxipropil) metacrilamida) (PHPMA), polifosfazeno, polioxazolinas (“POZ”), poli(N-acriloilmorfolina), e uma combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a PEG (por exemplo, PEGilatado). Em alguns exemplos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a PPG. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a POZ. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a PVP.
[0131] Em alguns exemplos, um polímero solúvel em água compreende um poliglicerol (PG). Em alguns casos, o poliglicerol é um PG hiper-ramificado (HPG) (por exemplo, como descrito por Imran, et al. “Influence of architecture of high molecular weight linear and branched polyglycerols on their biocompatibility and biodistribution”, Biomaterials 33:9135–9147 (2012)). Em outros casos, o poliglicerol é um PG linear (LPG). Em casos adicionais, o poliglicerol é um PG de funcionamento intermediário, um PG hiper-ramificado em blocos linear (por exemplo, como descrito por Wurm et. Al., “Squaric acid mediated synthesis and biological activity of a library of linear and hyperbranched poly(glycerol)−protein conjugates” Biomacromolecules 13:1161–1171 (2012)), ou um PG de cadeia lateral funcional PG (por exemplo, como descrito por Li, et. al., “Synthesis of linear polyol polyether derivatives as new materials for bioconjugation”, Bioconjugate Chem. 20:780–789 (2009).
[0132] Em alguns exemplos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é descrito no presente documento conjugado a um PG, por exemplo, um HPG, um LPG, um PG de funcionalmente intermediário, um PG hiper- ramificado em blocos linear ou um PG funcional de cadeia lateral. Em alguns exemplos, a citocina é um polipeptídeo de IL-2. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um PG, um PG de funcionalmente intermediário,
um PG hiper-ramificado em blocos linear.
[0133] Em algumas modalidades, um polímero solúvel em água é um PEG sintético degradável alternativo. PEGs sintéticos degradáveis alternativos exemplificativos incluem, porém sem limitação, poli[oligo(etileno glicol)metil metacrilato] (POEGMA); derivados de PEG modificados por estrutura principal gerados pela polimerização de macromonômeros à base de PEG telequélicos ou di-extremidades funcionalizadas; derivados de PEG que compreende comonômeros que compreende ligação degradável como poli[(etileno oxie)-co-(óxido de metileno etileno)][P(EO-co-MEO)], acetais de ceteno cíclico como 5,6-benzo-2-metileno-1,3-dioxepano (BMDO), 2-metileno-1,3- dioxepano (MDO), e 2-metileno-4-fenil-1,3-dioxolano (MPDL) copolimerizado com OEGMA; ou poli-(ε-caprolactona)-enxerto- poli(etileno óxido) (PCL-g-PEO).
[0134] Em alguns exemplos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN, ou TNF) é descrito no presente documento conjugado a um PEG sintético degradável alternativo, como por exemplo, POEGM; derivados de PEG modificados por estrutura principal gerados por polimerização de macromonômeros à base de PEG telequélicos ou di-extremidades funcionalizadas; P(EO-co-MEO); acetais de ceteno cíclico como BMDO, MDO, e MPDL copolimerizadas com OEGMA; ou PCL-g-PEO. Em alguns exemplos, a citocina é um polipeptídeo de IL-2. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um PEG sintético degradável alternativo, como por exemplo, POEGM; derivados de PEG modificados por estrutura principal gerados por polimerização de macromonômeros à base de PEG telequélicos ou di-
extremidades funcionalizadas; P(EO-co-MEO); acetais de ceteno cíclico como BMDO, MDO, e MPDL copolimerizado com OEGMA; ou PCL-g-PEO.
[0135] Em algumas modalidades, um polímero solúvel em água compreende a poli(zwittérions). Poli(zwitterions) exemplificativos incluem, porém sem limitação, poli(metacrilato de sulfobetaína) (PSBMA), poli(metacrilato de carboxibetaína) (PCBMA), e poli(2-metiacriloiloxietil fosforilcolina) (PMPC). Em alguns exemplos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é descrito no presente documento conjugado a um poli(zwittérion) como PSBMA, PCBMA ou PMPC. Em alguns casos, a citocina é um polipeptídeo de IL-2. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado em um poli(zwittérion) como PSBMA, PCBMA ou PMPC.
[0136] Em algumas modalidades, um polímero solúvel em água compreende a policarbonato. Policarbonos exemplificativos incluem, porém sem limitação, pentafluorofenil 5-metil-2-oxo-1,3-dioxano-5-carboxilato (MTC-OC6F5). Em alguns exemplos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é descrito no presente documento conjugado em um policarbonato como MTC-OC6F5. Em alguns casos, a citocina é um polipeptídeo de IL-2. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado em um policarbonato como MTC-OC6F5.
[0137] Em algumas modalidades, um polímero solúvel em água compreende um polímero híbrido, como por exemplo, um policarbonato/PEG polímero híbrido, um conjugado de peptídeo/polímero de proteína, ou um polímero derivado que contém hidroxila e/ou zwitteriônico (por exemplo, um polímero de PEG derivado que contém hidroxila e/ou zwitteriônico). Em alguns exemplos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é descrito no presente documento conjugado a um polímero híbrido como a policarbonato/PEG polímero híbrido, um conjugado de peptídeo/polímero de proteína, ou um polímero derivado que contém hidroxila e/ou zwitteriônico (por exemplo, um polímero de PEG derivado que contém hidroxila e/ou zwitteriônico). Em alguns casos, a citocina é um polipeptídeo de IL-2. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um polímero híbrido como a policarbonato/PEG polímero híbrido, um conjugado de peptídeo/polímero de proteína, ou um polímero derivado que contém hidroxila e/ou zwitteriônico (por exemplo, um polímero de PEG derivado que contém hidroxila e/ou zwitteriônico).
[0138] Em alguns exemplos, um polímero solúvel em água compreende um polissacarídeo. Polissacarídeos exemplificativos incluem, porém sem limitação, dextrano, ácido polissiálico (PSA), ácido hialurônico (HA), amilose, heparina, sulfato de heparano (HS), dextrina ou amido de hidroxietila (HES). Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a um polissacarídeo. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a dextrano. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a PSA. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a HA. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a amilose. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a heparina. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a HS. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a dextrina. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a HES.
[0139] Em alguns casos, um polímero solúvel em água compreende um glicano. Classes exemplificativas de glicanos incluem glicanos ligados a N, glicanos ligados a O, glicolipídeos, O-GlcNAc e glicosaminoglicanos. Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a um glicano. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a glicanos ligados a N. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a glicanos ligados a O. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a glicolipídeos. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a O- GlcNAc. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a glicosaminoglicanos.
[0140] Em algumas modalidades, um polímero solúvel em água compreende um polímero de polioxazolina. Um polímero de polioxazolina é um polímero sintético linear, e similar a PEG, compreende uma polidispersão baixa. Em alguns exemplos, um polímero de polioxazolina é um polímero de polioxazolina polidispersado, caracterizado por um peso molecular médio. Em alguns casos, o peso molecular médio de um polímero de polioxazolina inclui, por exemplo, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10000, 12000, 20000, 35000, 40000, 50000, 60000, 100000, 200000, 300.000, 400000 ou 500000 Da. Em alguns exemplos, um polímero de polioxazolina compreende poli(2-metil 2-oxazolina) (PMOZ), poli(2-etil 2-oxazolina) (PEOZ) ou poli(2-propil 2-oxazolina) (PPOZ). Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a um polímero de polioxazolina. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um polímero de polioxazolina. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a PMOZ. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a PEOZ. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a PPOZ.
[0141] Em alguns exemplos, um polímero solúvel em água compreende um polímero de ácido poliacrílico. Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a um polímero de ácido poliacrílico. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL- 2 é conjugado a um polímero de ácido poliacrílico.
[0142] Em alguns exemplos, um polímero solúvel em água compreende poliamina. Poliamina é um polímero orgânico que compreende dois ou mais grupos amino primários. Em algumas modalidades, uma poliamina inclui uma poliamina ramificada, uma poliamina linear ou poliamina cíclica. Em alguns casos, uma poliamina é uma poliamina linear de peso molecular baixo. Poliaminas exemplificativas incluem putrescina, cadaverina, espermidina, espermina, etileno diamina, 1,3- diaminopropano, hexametilenodiamina, tetraetilmetilenodiamina e piperazina. Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a uma poliamina. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a poliamina. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a putrescina, cadaverina, espermidina, espermina, etileno diamina, 1,3- diaminopropano, hexametilenodiamina, tetraetilmetilenodiamina ou piperazina.
[0143] Em alguns exemplos, um polímero solúvel em água é descrito nas Patentes nº US 7.744.861, 8.273.833 e
7.803.777. Em alguns exemplos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a um ligante descrito nas Patentes nº US 7.744.861, 8.273.833 ou 7.803.777. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um ligante descrito na Patente nº US 7.744.861,
8.273.833 ou 7.803.777. Proteínas
[0144] Em algumas modalidades, a fração de conjugação descrita no presente documento é uma proteína ou um fragmento de ligação do mesmo. Proteínas exemplificativas incluem albumina, transferrina ou transtiretina. Em alguns exemplos, a proteína ou um fragmento de ligação do mesmo compreende um anticorpo, ou seus fragmentos de ligação do mesmo. Em alguns casos, um conjugado de citocina compreende a proteína ou um fragmento de ligação do mesmo. Em alguns casos, um conjugado de IL-2 que compreende a proteína ou um fragmento de ligação do mesmo tem uma meia-vida sérica e/ou estabilidade aumentadas. Em alguns casos, um conjugado de IL-2 que compreende a proteína ou um fragmento de ligação do mesmo tem uma interação de IL-2 reduzida com uma ou mais subunidades de IL-2R. Em casos adicionais, a proteína ou um fragmento de ligação do mesmo bloqueia a interação de IL-2 com uma ou mais subunidades de IL-2R, ou afeta o conjunto da complexo de sinalização de IL-2Rββ.
[0145] Em algumas modalidades, a fração de conjugação é albumina. Albumina é uma família de proteínas globulares solúveis em água. Essa é comumente encontrada no plasma sanguíneo, que compreende cerca de 55-60 % de todas as proteínas de plasma. A albumina sérica humana (HSA) é um 585 polipeptídeo de aminoácido no qual a estrutura terciária é dividida em três domínios, domínio I (resíduos de aminoácido 1-195), domínio II (resíduos de aminoácido 196-383) e domínio III (resíduos de aminoácido 384-585). Cada domínio compreende adicionalmente um sítio de ligação, que pode interagir de modo reversível ou irreversível com ligantes endógenos como ácidos graxos de cadeia longa e média, bilirrubina ou hemina, ou compostos exógenos como compostos heterocíclicos ou aromáticos.
[0146] Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a albumina. Em alguns casos, o polipeptídeo de citocina é conjugado a albumina sérica humana (HSA). Em casos adicionais, o polipeptídeo de citocina é conjugado a um fragmento funcional de albumina.
[0147] Em alguns exemplos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a albumina. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a albumina sérica humana (HSA). Em casos adicionais, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um fragmento funcional de albumina.
[0148] Em algumas modalidades, a fração de conjugação é transferrina. Transferrina é um 679 polipeptídeo de aminoácido que é de cerca de 80 kDa em tamanho e compreende dois sítios de ligação de Fe3+ com um no domínio N-terminal e o outro no domínio C-terminal. Em alguns exemplos, a transferrina humana tem uma meia-vida de cerca de 7-12 dias.
[0149] Em alguns exemplos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a transferrina. Em alguns casos, o polipeptídeo de citocina é conjugado a transferrina humana. Em casos adicionais, o polipeptídeo de citocina é conjugado a um fragmento funcional de transferrina.
[0150] Em alguns exemplos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a transferrina. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a transferrina humana. Em casos adicionais, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um fragmento funcional de transferrina.
[0151] Em algumas modalidades, a fração de conjugação é transtiretina (TTR). Transtiretina é uma proteína transportadora localizada no soro e no fluido cerebrospinal que transporta a tiroxina de hormônio tireoide (T4) e proteína de ligação a retinol ligada a retinol.
[0152] Em alguns exemplos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a transtiretina (por meio de um de seus terminais ou por meio de uma região de articulação interna). Em alguns casos, o polipeptídeo de citocina é conjugado a um fragmento funcional de transtiretina.
[0153] Em alguns exemplos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a transtiretina (por meio de um de seus terminais ou por meio de uma região de articulação interna). Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um fragmento funcional de transtiretina.
[0154] Em algumas modalidades, a fração de conjugação é um anticorpo, ou seus fragmentos de ligação do mesmo. Em alguns exemplos, um anticorpo ou seus fragmentos de ligação do mesmo compreende um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo murino ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo quimérico ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo, Fab’ monovalente, Fab2 divalente, fragmentos de F(ab)'3, fragmento variável de cadeia única (scFv), bis- scFv, (scFv)2, diacorpo, minicorpo, nanocorpo, triacorpo, tetracorpo, humacorpo, proteína de Fv estabilizada por dissulfeto (dsFv), anticorpo de domínio único (sdAb), NAR de Ig, anticorpo de camelídeo ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação do mesmo, ou um derivado quimicamente modificado do mesmo.
[0155] Em alguns exemplos, a fração de conjugação compreende um scFv, bis-scFv, (scFv)2, dsFv, ou sdAb. Em alguns casos, a fração de conjugação compreende a scFv. Em alguns casos, a fração de conjugação compreende a bis-scFv. Em alguns casos, a fração de conjugação compreende a (scFv)2. Em alguns casos, a fração de conjugação compreende a dsFv. Em alguns casos, a fração de conjugação compreende a sdAb.
[0156] Em alguns exemplos, a fração de conjugação compreende uma porção de Fc de um anticorpo, por exemplo, de IgG, IgA, IgM, IgE ou IgD. Em alguns exemplos, a fração compreende uma porção de Fc de IgG (por exemplo, IgG1, IgG3 ou IgG4).
[0157] Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN, ou TNF) é conjugado a um anticorpo, ou seus fragmentos de ligação do mesmo. Em alguns casos, o polipeptídeo de citocina é conjugado a um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo murino ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo quimérico ou fragmento de ligação do mesmo,
anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo, Fab’ monovalente, Fab2 divalente, fragmentos de F(ab)'3, fragmento variável de cadeia única (scFv), bis-scFv, (scFv)2, diacorpo, minicorpo, nanocorpo, triacorpo, tetracorpo, humacorpo, proteína de Fv estabilizada por dissulfeto (dsFv), anticorpo de domínio único (sdAb), NAR de Ig, anticorpo de camelídeo ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação do mesmo, ou um derivado quimicamente modificado do mesmo. Em casos adicionais, o polipeptídeo de citocina é conjugado a uma porção de Fc de um anticorpo. Em casos adicionais, o polipeptídeo de citocina é conjugado a uma porção de Fc de IgG (por exemplo, IgG1, IgG3, ou IgG4).
[0158] Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um anticorpo, ou seus fragmentos de ligação do mesmo. Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo murino ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo quimérico ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo, Fab’ monovalente, Fab2 divalente, fragmentos de F(ab)'3, fragmento variável de cadeia única (scFv), bis-scFv, (scFv)2, diacorpo, minicorpo, nanocorpo, triacorpo, tetracorpo, humacorpo, proteína de Fv estabilizada por dissulfeto (dsFv), anticorpo de domínio único (sdAb), NAR de Ig, anticorpo de camelídeo ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação do mesmo, ou um derivado quimicamente modificado do mesmo. Em casos adicionais, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado para uma porção de Fc de um anticorpo. Em casos adicionais, o polipeptídeo de IL-2 é conjugado para uma porção de Fc de IgG (por exemplo, IgG1, IgG3, ou IgG4).
[0159] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um polímero solúvel em água (por exemplo, PEG) e um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo. Em alguns casos, o anticorpo ou seus fragmentos de ligação do mesmo compreende um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo murino ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo quimérico ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo, Fab’ monovalente, Fab2 divalente, fragmentos de F(ab)'3, fragmento variável de cadeia única (scFv), bis- scFv, (scFv)2, diacorpo, minicorpo, nanocorpo, triacorpo, tetracorpo, humacorpo, proteína de Fv estabilizada por dissulfeto (dsFv), anticorpo de domínio único (sdAb), NAR de Ig, anticorpo de camelídeo ou fragmento de ligação do mesmo, anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação do mesmo, ou um derivado quimicamente modificado do mesmo. Em alguns casos, o anticorpo ou fragmentos de ligação do mesmo compreendem um scFv, bis-scFv, (scFv)2, dsFv ou sdAb. Em alguns casos, o anticorpo ou fragmentos de ligação do mesmo compreendem um scFv. Em alguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo guia o conjugado de IL-2 a uma célula-alvo de interesse e o polímero solúvel em água melhora a estabilidade e/ou meia-vida sérica.
[0160] Em alguns exemplos, um ou mais polímeros solúvel em água de polipeptídeo de IL-2 (por exemplo, PEG) conjugados são adicionalmente ligados a um anticorpo ou fragmentos de ligação do mesmo. Em alguns exemplos, a razão do conjugado de IL-2 para o anticorpo é de cerca de 1:1,
2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1 ou 12:1. Em alguns casos, a razão do conjugado de IL-2 para o anticorpo é de cerca de 1:1. Em outros casos, a razão do conjugado de IL-2 para o anticorpo é de cerca de 2:1, 3:1, ou 4:1. Em casos adicionais, a razão do conjugado de IL-2 para o anticorpo é de cerca de 6:1 ou superior.
[0161] Em algumas modalidades, os um ou mais conjugados de polímero solúvel em água de polipeptídeo de IL-2 (por exemplo, PEG) são diretamente ligados ao anticorpo ou fragmentos de ligação do mesmo. Em outros exemplos, o conjugado de IL-2 é indiretamente ligado ao anticorpo ou fragmentos de ligação do mesmo com um ligante. Ligantes exemplificativos incluem ligantes homobifuncionais, ligantes heterobifuncionais, ligantes à base de maleimida, ligantes de traço zero, ligantes autoimolativos, espaçadores e similares.
[0162] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmentos de ligação do mesmo são ligados direta ou indiretamente à porção de polipeptídeo de IL-2 do conjugado de polímero solúvel em água de polipeptídeo de IL-2 (por exemplo, PEG). Em tais casos, o sítio de conjugação do anticorpo para o polipeptídeo de IL-2 está em um sítio que não impedirá a ligação do polipeptídeo de IL-2 com a IL-2Rβγ. Em casos adicionais, o sítio de conjugação do anticorpo ao polipeptídeo de IL-2 está em um sítio que bloqueia parcialmente a ligação do polipeptídeo de IL-2 à IL-2Rβγ. Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmentos de ligação do mesmo são ligados direta ou indiretamente à poção de polímero solúvel em água do conjugado de polímero solúvel em água de polipeptídeo de IL-2 (por exemplo, PEG).
Peptídeos
[0163] Em algumas modalidades, uma fração de conjugação descrita no presente documento é um peptídeo. Em alguns exemplos, o peptídeo é um peptídeo não estruturado. Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a um peptídeo. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 que compreende um peptídeo tem uma meia-vida sérica e/ou estabilidade aumentadas. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 que compreende um peptídeo tem uma interação de IL-2 reduzida com uma ou mais subunidades de IL-2R. Em casos adicionais, o peptídeo bloqueia a interação de IL-2 com uma ou mais subunidades de IL-2R.
[0164] Em alguns exemplos, a fração de conjugação é um peptídeo XTEN™ (Amunix Operating Inc.) e a modificação é denominada XTENilação. XTENilação é a fusão genética de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse com um ácido nucleico que codifica um peptídeo XTEN™ (Amunix Operating Inc.), a peptídeo hidrofílico não estruturado longo que compreende porcentagem diferente de seis aminoácidos: Ala, Glu, Gly, Ser e Thr. Em alguns exemplos, um peptídeo XTEN™ é selecionado com base em propriedades como expressão, estabilidade genética, solubilidade, resistência à agregação, meia-vida melhorada, potência aumentada e/ou atividade in vitro aumentada em combinação com um polipeptídeo de interesse. Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a um peptídeo de XTEN. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um peptídeo de XTEN.
[0165] Em alguns exemplos, a fração de conjugação é um polímero de homoaminoácido rico em glicina (HAP) e a modificação é denominada HAPilação. HAPilação é a fusão genética de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse com um ácido nucleico que codifica um polímero de homoaminoácido rico em glicina (HAP). Em alguns exemplos, o polímero de HAP compreende um motivo de repetição de (Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 3) e algumas vezes são de cerca de 50, 100, 150, 200, 250, 300, ou mais resíduos em comprimento. Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a HAP. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a HAP.
[0166] Em algumas modalidades, a fração de conjugação é um polipeptídeo de PAS e a modificação é denominada PASilação. PASilação é a fusão genética de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de PAS. Um polipeptídeo de PAS é um polipeptídeo não carregado hidrofílico que consiste em resíduos de Pro, Ala e Ser. Em alguns exemplos, o comprimento de um polipeptídeo de PAS é pelo menos de cerca de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos. Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a um polipeptídeo de PAS. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a um polipeptídeo de PAS.
[0167] Em algumas modalidades, a fração de conjugação é um polipeptídeo semelhante à elastina (ELP) e a modificação é denominada ELPilação. ELPilação é a fusão genética de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo semelhante à elastina (ELPs). Um ELP compreende um motivo de repetição de VPGxG (SEQ ID NO: 4) no qual x é qualquer aminoácido exceto prolina. Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, uma interleucina, IFN ou TNF) é conjugado a ELP. Em alguns casos, um polipeptídeo de IL-2 é conjugado a ELP.
[0168] Em algumas modalidades, a fração de conjugação é um peptídeo de CTP. Um peptídeo de CTP compreende a 31 resíduo de aminoácido peptídeo FQSSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ (SEQ ID NO: 5) em que o S* denota sítios de O-glicosilação (OPKO). Em alguns exemplos, um peptídeo de CTP é geneticamente fusionado a um polipeptídeo de citocina (por exemplo, um polipeptídeo de IL-2). Em alguns casos, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, um polipeptídeo de IL-2) é conjugado a um peptídeo de CTP.
[0169] Em algumas modalidades, a citocina (por exemplo, um polipeptídeo de IL-2) é modificado por glutamilação. Glutamilação (ou poliglutamilação) é uma modificação pós- tradução reversível de glutamato, no qual o grupo γ-carbóxi de glutamato forma uma ligação semelhante a peptídeo com o grupo amino de um glutamato livre no qual o grupo α-carbóxi se estende em uma cadeia de poliglutamato.
[0170] Em algumas modalidades, uma citocina (por exemplo, um polipeptídeo de IL-2) é modificada por um polímero de proteína semelhante à gelatina. Em alguns exemplos, o polímero de GLK compreende múltiplas repetições de Gly-Xaa-Yaa em que Xaa e Yaa compreendem primariamente prolina e 4-hidroxiprolina, respectivamente. Em alguns casos, o polímero de GLK compreende adicionalmente resíduos de aminoácido Pro, Gly, Glu, Qln, Asn, Ser e Lys. Em alguns casos, o comprimento do polímero de GLK é de cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150 resíduos ou mais longo. Frações de Conjugação Adicionais
[0171] Em alguns exemplos, a fração de conjugação compreende um biomarcador extracelular. Em alguns exemplos, o biomarcador extracelular é um antígeno de tumor. Em alguns exemplos, biomarcador extracelular exemplificativo compreende CD19, PSMA, B7-H3, B7-H6, CD70, CEA, CSPG4, EGFRvIII, EphA3, EpCAM, EGFR, ErbB2 (HER2), FAP, FRα, GD2, GD3, Lewis-Y, mesotelina, Muc1, Muc 16, ROR1, TAG72, VEGFR2, CD11, Gr-1, CD204, CD16, CD49b, CD3, CD4, CD8, e B220. Em alguns exemplos, a fração de conjugação é ligada ou conjugada à citocina (por exemplo, IL-2). Em alguns casos, a fração de conjugação é geneticamente fusionada, por exemplo, no N-terminal ou no C-terminal, da citocina (por exemplo, IL-2).
[0172] Em alguns exemplos, a fração de conjugação compreende uma molécula de uma modificação pós-tradução. Em alguns exemplos, exemplos de modificação pós-tradução incluem miristoilação, palmitoilação, isoprenilação (ou prenilação) (por exemplo, farnesilação ou geranilgeranilação), glipiação, acilação (por exemplo, O- acilação, N-acilação, S-acilação), alquilação (por exemplo, adição de grupos alquila, como grupos metila ou etila), amidação, glicosilação, hidroxilação, iodação, adição de nucleotídeo, oxidação, fosforilação, succinilação, sulfação, glicação, carbamilação, glutamilação ou desamidação. Em alguns exemplos, a citocina (por exemplo, IL-2) é modificado por uma modificação pós-tradução como miristoilação, palmitoilação, isoprenilação (ou prenilação) (por exemplo, farnesilação ou geranilgeranilação), glipiação, acilação (por exemplo, O-acilação, N-acilação, S-acilação), alquilação (por exemplo, adição de grupos alquila, como grupos metila ou etila), amidação, glicosilação, hidroxilação, iodação, adição de nucleotídeo, oxidação, fosforilação, succinilação, sulfação, glicação, carbamilação, glutamilação ou desamidação. Conjugação Ligantes
[0173] Em algumas modalidades, grupos reativos funcionais úteis para conjugação ou ligação de uma fração de conjugação a um polipeptídeo de citocina (por exemplo, um polipeptídeo de IL-2) descritos no presente documento incluem, por exemplo, ligantes zero ou de ordem superior. Em alguns exemplos, um aminoácido não natural incorporado em uma interleucina descrita no presente documento compreende um grupo reativo funcional. Em alguns exemplos, um ligante compreende um grupo reativo funcional que reage a um aminoácido não natural incorporado em uma interleucina descrita no presente documento. Em alguns exemplos, uma fração de conjugação compreende um grupo reativo funcional que reage com um aminoácido não natural incorporado em uma interleucina descrita no presente documento. Em alguns exemplos, a fração de conjugação compreende um grupo reativo funcional que reage com um ligante (opcionalmente pré-fixada a um peptídeo de citocina) descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um ligante compreende um grupo reativo que reage com um aminoácido natural em um peptídeo de citocina descrito no presente documento. Em alguns casos, ligantes de ordem superior compreendem ligantes bifuncionais, como ligantes homobifuncionais ou ligantes heterobifuncionais. Ligantes homobifuncionais exemplificativos incluem, porém sem limitação, reagente de Lomant ditiobis (succinimidilpropionato) DSP, 3′3′- ditiobis(sulfossuccinimidil proprionato) (DTSSP), suberato de dissuccinimidila (DSS), bis(sulfossuccinimidil)suberato (BS), tartrato de dissuccinimidila (DST), tartrato de dissulfossuccinimidila (sulfo DST), etileno glicobis(succinimidilsuccinato) (EGS), glutarato de dissuccinimidila (DSG), carbonato de N,N′-dissuccinimidila (DSC), adipimidato de dimetila (DMA), pimelimidato de dimetila (DMP), suberimidato de dimetila (DMS), dimetil- 3,3′-ditiobispropionimidato (DTBP), 1,4-di-(-3′-(2′- piridilditio)propionamido)butano (DPDPB), bismaleimido- hexano (BMH), composto que contém haleto de arila (DFDNB), como, por exemplo, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno ou 1,3- difluoro-4,6-dinitrobenzeno, 4,4′-difluoro-3,3′- dinitrofenilsulfona (DFDNPS), bis-[β-(4- azidossalicilamido)etil]dissulfeto (BASED), formaldeído, glutaraldeído, 1,4-butanodiol diglicidil éter, di-hidrazida de ácido adípico, carbo-hidrazida, o-toluidina, 3,3′- dimetilbenzidina, benzidina, α,α′-p-diaminodifenil, ácido sulfônico de di-iodo-p-xileno, N,N′-etileno- bis(iodoacetamida), ou N,N′-hexametileno- bis(iodoacetamida).
[0174] Em algumas modalidades, o ligante bifuncional compreende um ligante heterobifuncional. Ligante heterobifuncional exemplificativo inclui, porém sem limitação, reticuladores amina-reativos e sulfidrila como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidila (sPDP), 3- (2-piridilditio)propionato de N-succinimidila de cadeia longa (LC-sPDP), 3-(2-piridilditio)propionato de N- succinimidila de cadeia longa solúvel em água (sulfo-LC- sPDP), succinimidiloxicarbonil-α-metil-α-(2- piridilditio)tolueno (sMPT), sulfossuccinimidil-6-[α-metil- α-(2-piridilditio)toluamido]hexanoato (sulfo-LC-sMPT), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (sMCC), sulfossuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo- hexano-1-carboxilato (sulfo-sMCC), éster de m- maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBs), éster de m- maleimidobenzoil-N-hidroxissulfossuccinimida (sulfo-MBs), N-succinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (sIAB), sulfossuccinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (sulfo-sIAB), succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (sMPB), sulfossuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (sulfo- sMPB), éster de N-(γ-maleimidobutiriloxi)succinimida (GMBs), éster de N-(γ-maleimidobutiriloxi)sulfossuccinimida (sulfo-GMBs), 6-((iodoacetil)amino)hexanoato de succinimidila (sIAX), 6-[6- (((iodoacetil)amino)hexanoil)amino]hexanoato de succinimidila (sIAXX), 4-(((iodoacetil)amino)metil)ciclo- hexano-1-carboxilato de succinimidila (sIAC), 6-((((4- iodoacetil)amino)metil)ciclo-hexano-1- carbonil)amino)hexanoato de succinimidila (sIACX), iodoacetato de p-nitrofenila (NPIA), reticuladores reativos a carbonila e reativos a sulfidrila como 4-hidrazida de ácido de (4-N-maleimidofenil)butírico (MPBH), 4-(N-
maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxil-hidrazida-8 (M2C2H), hidrazida de 3-(2-piridilditio)propionila (PDPH), reticuladores amina-reativos e fotorreativos como ácido N- hidroxissuccinimidil-4-azidossalicilico (NHs-AsA), ácido N- hidroxissulfossuccinimidil-4-azidossalicilico (sulfo-NHs- AsA), sulfossuccinimidil-(4-azidossalicilamido)hexanoato (sulfo-NHs-LC-AsA), sulfossuccinimidil-2-(ρ- azidossalicilamido)etil-1,3′-ditiopropionato (sAsD), N- hidroxissuccinimidil-4-azidobenzoato (HsAB), N- hidroxissulfossuccinimidil-4-azidobenzoato (sulfo-HsAB), N- succinimidil-6-(4′-azido-2′-nitrofenilamino)hexanoato (sANPAH), sulfossuccinimidil-6-(4′-azido-2′- nitrofenilamino)hexanoato (sulfo-sANPAH), N-5-azido-2- nitrobenzoiloxisuccinimida (ANB-NOs), sulfossuccinimidil-2- (m-azido-o-nitrobenzamido)-etil-1,3′-ditiopropionato (sAND), N-succinimidil-4(4-azidofenil)1,3′-ditiopropionato (sADP), N-sulfossuccinimidil(4-azidofenil)-1,3′- ditiopropionato (sulfo-sADP), 4-(ρ-azidofenil)butirato de sulfossuccinimidila (sulfo-sAPB), 2-(7-azido-4- metilcoumarin-3-acetamida)etil-1,3′-ditiopropionato (sAED) de sulfossuccinimidila, 7-azido-4-metilcoumain-3-acetato de sulfossuccinimidila (sulfo-sAMCA), diazopiruvato de ρ- nitrofenila (ρNPDP), ρ-nitrofenil-2-diazo-3,3,3- trifluoropropionato (PNP-DTP), reticuladores sulfidril- reativos e fotorreativos, como 1-(ρ-Azidossalicilamido)-4- (iodoacetamido)butano (AsIB), N-[4-(ρ- azidossalicilamido)butil]-3′-(2′-piridilditio)propionamida (APDP), benzofenona-4-iodoacetamida, reticuladores carbonil-reativos e fotorreativos de benzofenona-4- maleimida como hidrazida de ρ-azidobenzoíla (ABH),
reticuladores carboxilato-reativos e fotorreativos como 4- (ρ-azidossalicilamido)butilamina (AsBA), e reticuladores arginina-reativos e fotorreativos como glioxal de ρ- azidofenila (APG).
[0175] Em alguns exemplos, o grupo funcional reativo compreende um grupo nucleofílico que é reativo a um grupo eletrofílico presente em uma fração de ligação (por exemplo, em uma fração de conjugação ou em IL-2). Grupos eletrofílicos exemplificativos incluem grupos carbonila — como aldeído, cetona, ácido carboxílico, éster, amida, enona, haleto de acila ou anidro ácido. Em algumas modalidades, o grupo funcional reativo é aldeído. Grupos nucleofílicos exemplificativos incluem hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiossemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e aril-hidrazida.
[0176] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante clivável. Em algumas modalidades, o ligante clivável é um ligante de dipeptídeo. Em algumas modalidades, o ligante de dipeptídeo é valina-citrulina (Val-Cit), fenilalanina- lisina (Phe-Lys), valina-alanina (Val-Ala) e valina-lisina (Val-Lys). Em algumas modalidades, o ligante de dipeptídeo é valina-citrulina.
[0177] Em algumas modalidades, o ligante é um peptídeo ligante que compreende, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais aminoácidos. Em alguns exemplos, o peptídeo ligante compreende no máximo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou menos aminoácidos. Em casos adicionais, o peptídeo ligante compreende cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos.
[0178] Em algumas modalidades, o ligante compreende a fração de ligante autoimolativo. Em algumas modalidades, a fração de ligante autoimolativo compreende álcool dep- aminobenzila (PAB), p-aminobenzioxicarbonila (PABC), ou derivados ou análogos dos mesmos. Em algumas modalidades, o ligante compreende uma fração de ligante de dipeptídeo e uma fração de ligante autoimolativo. Em algumas modalidades, a fração de ligante autoimolativo é como descrito na Patente nº US9089614 e no Pedido WIPO nº WO2015038426.
[0179] Em algumas modalidades, o ligante clivável é glucuronideo. Em algumas modalidades, o ligante clivável é um ligante clivável ácido. Em algumas modalidades, o ligante clivável ácido é hidrazina. Em algumas modalidades, o ligante clivável é um ligante reduzível.
[0180] Em algumas modalidades, o ligante compreende um grupo maleimida. Em alguns exemplos, o grupo maleimida também é denominado espaçador de maleimida. Em alguns exemplos, o grupo maleimida compreende adicionalmente um ácido caproico, que forma maleimidocaproíla (mc). Em alguns casos, o ligante compreende maleimidocaproíla (mc). Em alguns casos, ligante é maleimidocaproíla (mc). Em outros exemplos, o grupo maleimida compreende um grupo maleimidometila, como succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (sMCC) ou sulfossuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (sulfo-sMCC) descrito acima.
[0181] Em algumas modalidades, o grupo maleimida é uma maleimida autoestabilizante. Em alguns exemplos, a maleimida autoestabilizante utiliza ácido diaminopropiônico (DPR) para incorporar um grupo amino básico adjacente à maleimida para fornecer catálise intramolecular de hidrólise de anel tiosuccinimida, portanto, eliminando-se maleimida de passar por reação de eliminação através de uma reação retro-Michael. Em alguns exemplos, a maleimida autoestabilizante é um grupo maleimida descrita em Lyon, et al., “Self-hidrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates”, Nat. Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014). Em alguns exemplos, o ligante compreende uma maleimida autoestabilizante. Em alguns exemplos, o ligante é uma maleimida autoestabilizante. Química de Conjugação
[0182] Diversas reações de conjugação são usadas para conjugar ligantes, frações de conjugação e aminoácidos não naturais incorporados em peptídeos de citocina descritos no presente documento. Tais reações de conjugação são frequentemente compatíveis com condições aquosas, como reações “bio-ortogonais”. Em algumas modalidades, as reações de conjugação são mediadas por reagentes químicos como catalisadores, grupos químicos leves ou reativos encontrados em ligantes, frações de conjugação ou aminoácidos não naturais. Em algumas modalidades, reações de conjugação são mediados por enzimas. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação usada no presente documento é descrita em Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação usada no presente documento é descrita em Chen, X.; Wu. Y- W. Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 5417.
[0183] Em algumas modalidades descritas no presente documento, uma reação de conjugação compreende reação de uma cetona ou aldeído com um nucleófilo. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação compreende reação de uma cetona com um grupo aminóxi para formar uma oxima. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação compreende reação de uma cetona com um grupo arila ou heteroarila amina para formar uma imina. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação compreende reação de um aldeído com um grupo arila ou heteroarila amina para formar uma imina. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento resulta em peptídeo de citocina que compreende um ligante ou fração de conjugação fixada por meio de uma oxima. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação compreende uma reação de Pictet-Spengler de um aldeído ou uma cetona com um nucleófilo de triptamina. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação compreende uma reação de hidrazino-Pictet-Spengler. Em algumas modalidades, a reação de conjugação compreende uma ligação de Pictet-Spengler.
[0184] Em algumas modalidades descritas no presente documento, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de uma azida e uma fosfina (ligação de Staudinger). Em algumas modalidades, a fosfina é uma aril fosfina. Em algumas modalidades, a aril fosfina compreende um grupo orto éster. Em algumas modalidades, a fosfina compreende a estrutura 2-(difenilfosfaneil)benzoato de metila. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento resulta em peptídeo de citocina que compreende um ligante ou fração de conjugação fixada por meio de uma arilamida. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento resulta em peptídeo de citocina que compreende um ligante ou fração de conjugação fixada por meio de uma amida.
[0185] Em algumas modalidades descritas no presente documento, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende uma reação de cicloadição 1,3-dipolar. Em algumas modalidades, a reação de cicloadição 1,3-dipolar compreende reação de uma azida e uma fosfina (reação de “Clique”). Em algumas modalidades, a reação de conjugação é catalisada por cobre. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento resulta em peptídeo de citocina que compreende um ligante ou fração de conjugação fixada por meio de um triazol. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de uma azida com uma olefina tensa. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de uma azida com um alcino tenso. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de uma azida com um cicloalcino, por exemplo, OCT, DIFO, DIFBO, DIBO, BARAC, TMTH, ou outro cicloalcino tenso, em que as estruturas dessas são mostradas em Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123. Em algumas modalidades, uma reação de cicloadição 1,3- dipolar é catalisada por luz (“fotoclique”). Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de um grupo alila terminal com um tetrazol e luz. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de um grupo alquinila terminal com um tetrazol e luz. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de um aminoácido de O- alila com uma tetrazina e luz. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de O-alil tirosina com uma tetrazina e luz.
[0186] Em algumas modalidades descritas no presente documento, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende uma reação de cicloadição de demanda de elétron inverso que compreende um dieno e um dienófilo. Em algumas modalidades, o dieno compreende uma tetrazina. Em algumas modalidades, o dienófilo compreende um alceno. Em algumas modalidades, o dienófilo compreende um alcino. Em algumas modalidades, o alcino é um alcino tenso. Em algumas modalidades, o alceno é um dieno tenso. Em algumas modalidades, o alcino é um trans-ciclo-octino. Em algumas modalidades, o alcino é um ciclo-octeno. Em algumas modalidades, o alceno é um ciclopropeno. Em algumas modalidades, o alceno é um fluorociclopropeno. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento resulta na formação de um peptídeo de citocina fixado a um ligante ou fração de conjugação por meio de um heterociclo de anel de 6 membros que compreende dois átomos de nitrogênio no anel.
[0187] Em algumas modalidades descritas no presente documento, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende uma reação de metátese de olefina. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de um alceno e um alcino com um catalisador de rutênio. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de dois alcenos com um catalisador de rutênio. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de duas alcinos com um catalisador de rutênio. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de um alceno ou alcino com um catalisador de rutênio e um aminoácido que compreende um grupo alila. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de um alceno ou alcino com um catalisador de rutênio e um aminoácido que compreende um sulfeto de alila ou selenídeo. Em algumas modalidades, um catalisador de rutênio é catalisador Hoveda-Grubbs de 2ª geração. Em algumas modalidades, uma reação de metátese de olefina compreende reação de um ou mais alcenos ou alcinos tensos.
[0188] Em algumas modalidades descritas no presente documento, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende uma reação acoplamento cruzado. Em algumas modalidades, reação acoplamento cruzado compreendem catalisadores metálicos de transição, como irídio, ouro, rutênio, ródio, paládio, níquel, platina ou outro catalisador de metal de transição e um ou mais ligantes. Em algumas modalidades, catalisadores metálicos de transição são solúveis em água. Em algumas modalidades descritas no presente documento, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende uma reação acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura. Em algumas modalidades descritas no presente documento, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de um haleto de arila (ou triflato ou tosilato), um ácido borônico de arila ou alquenila, e um catalisador de paládio. Em algumas modalidades descritas no presente documento, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende uma reação acoplamento cruzado de Sonogashira. Em algumas modalidades descritas no presente documento, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de um haleto de arila (ou triflato ou tosilato), um alcino, e um catalisador de paládio. Em algumas modalidades, a reação acoplamento cruzado resulta em fixação de um ligante ou fração de conjugação a um peptídeo de citocina por meio de uma ligação carbono-carbono.
[0189] Em algumas modalidades descrita no presente documento, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende uma reação de desproteção ou “liberação” de um grupo reativo antes da conjugação. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende liberação de um grupo reativo com luz, seguida por uma reação de conjugação. Em algumas modalidades, um grupo reativo é protegido com uma fração de aralquila que compreende um ou mais grupos nitro. Em algumas modalidades, a liberação de um grupo reativo resulta em uma amina livre, sulfeto ou outro grupo reativo. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende liberação de um grupo reativo com um catalisador de metal de transição, seguido por uma reação de conjugação. Em algumas modalidades, o catalisador de metal de transição compreende paládio e um ou mais ligantes. Em algumas modalidades, um grupo reativo é protegido com uma fração de alila. Em algumas modalidades, um grupo reativo é protegido com um carbamato alílico. Em algumas modalidades, um grupo reativo é protegido com uma fração propargílica. Em algumas modalidades, um grupo reativo é protegido com um carbamato de propargila. Em algumas modalidades, um grupo reativo é protegido com um dienófilo, em que a exposição a um dieno (como uma tetrazina) resulta em desproteção do grupo reativo.
[0190] Em algumas modalidades descritas no presente documento, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende uma reação de ligante direcionado, em que um ligante (opcionalmente) fixado a um grupo reativo) facilita o sítio de conjugação entre i grupo reativo e o peptídeo de citocina. Em algumas modalidades, o ligante é clivado durante ou após a reação do peptídeo de citocina com o grupo reativo. Em algumas modalidades, o sítio de conjugação do peptídeo de citocina é um aminoácido natural. Em algumas modalidades, o sítio de conjugação do peptídeo de citocina é uma lisina, cisteína ou serina. Em algumas modalidades, o sítio de conjugação do peptídeo de citocina é um aminoácido não natural descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o grupo reativo compreende um grupo de saída, como um grupo arila ou heteroarila com elétrons insuficientes. Em algumas modalidades, o grupo reativo compreende um grupo de saída, como um grupo alquila com elétrons insuficientes que é deslocado pelo peptídeo de citocina. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende reação de um agente de aprisionamento de radical com uma espécie de radical. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende uma reação de adição de radical oxidativo. Em algumas modalidades, um agente de aprisionamento de radical é uma arilamina. Em algumas modalidades, uma espécie de radical é um radical tirosila. Em algumas modalidades, espécies de radical são geradas por um catalisador de rutênio (como [Ru(bpy)3]) e luz.
[0191] Reações enzimáticas são opcionalmente usadas para reações de conjugação descritas no presente documento. Conjugações enzimáticas exemplificativas incluem conjugação mediada por SortA, uma conjugação mediada por TGs ou uma conjugação mediada por FGE. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação descrita no presente documento compreende ligação de proteína nativa (NPL) de um grupo 1- amino-2-tio terminal com um tioéster para formar uma ligação de amida.
[0192] Diversas reações de conjugação são descritas no presente documento para reagir um ligante ou uma fração de conjugação com um peptídeo de citocina, em que a reação ocorre com um aminoácido natural (“canônico”) no peptídeo de citocina. Em algumas modalidades, o aminoácido natural é encontrado em uma posição de conjugação encontrado em uma sequência do tipo selvagem, ou alternativamente, a posição foi mutada. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação compreende a formação de uma ligação de dissulfeto em um resíduo de cisteína. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação compreende uma reação de adição de 1,4 Michael de uma cisteína ou lisina. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação compreende uma ligação de cianobenzotiazol de uma cisteína. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação compreende reticulação com uma fração de acetona, como 1,3-dicloro-2- propionona. Em algumas modalidades, uma reação de conjugação compreende uma adição de 1,4 Michael a uma de- hidroalanina, formada por reação de cisteína com O- mesitilenossulfonil-hidroxilamina. Em algumas modalidades uma reação de conjugação compreende reação de uma tirosina com uma triazolinadiona (TAD), ou derivado de TAD. Em algumas modalidades a reação de conjugação compreende reação de um triptofano com um carbenoide de ródio.
MÉTODOS DE USO Doença ou Transtorno Autoimune
[0193] Em algumas modalidades, também é descrito no presente documento um método para tratar uma doença ou um transtorno autoimune em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado de citocina (por exemplo, conjugado de IL-2) descrito no presente documento. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 compreende um polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada e uma fração de conjugação, em que o conjugado de IL-2 tem uma afinidade diminuída com a subunidade de receptor de IL- 2 β (IL-2Rβ), subunidade de receptor de IL-2 γ (IL-2Rγ) ou uma combinação dos mesmos, com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 que compreende: um polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada; e uma fração de conjugação que se liga ao polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada em um resíduo de aminoácido selecionado a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7,
K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, R81, P82, R83, D84, S87, N88, N89, V91, I92, L94, E95, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, T113, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos, o resíduo de aminoácido é selecionado a partir de K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, R81, D84, S87, N88, V91, I92, L94, E95, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133. Em alguns exemplos, o resíduo de aminoácido é selecionado a partir de K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, D84, N88, E95, e Q126. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 interage com um complexo de IL-2Rαβγ, mas com uma afinidade reduzida com as subunidades de IL-2Rβ e IL-2Rγ, ou diminuirão o recrutamento da subunidade de IL- 2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ.
Em alguns casos, o polipeptídeo de IL-2 modificada mantém a afinidade de ligação com IL-2Rα com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
Em tais casos, o complexo de IL-2/IL-2Rαβγ estimula ou melhora a expansão de células Treg CD4+. Em casos adicionais, o polipeptídeo de IL-2 modificada aumenta a dose exigida para a ativação das células Teff e/ou NK por meio do complexo de IL-2Rβγ, portanto, expandindo as faixas de dose para ativação de células Treg por meio do complexo de IL-2Rαβγ (ou expandindo a janela terapêutica da IL-2 para ativação de células Treg por meio do complexo de IL- 2Rαβγ).
[0194] Em alguns exemplos, a doença ou o transtorno autoimune compreende alopecia areata, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, dermatomiosite, diabetes tipo 1, artrite idiopática juvenil, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, púrpura trombocitopênica idiopática, miastenia grave, esclerose múltipla, penfigo/penfigoide, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, polimiosite, cirrose biliar primária, psoríase, artrite reumatoide, escleroderma, síndrome de Sjögren, lúpus eritematoso sistêmico, tireoidite, uveíte, vitiligo, ou granulomatose de Wegener.
[0195] Em alguns casos, um conjugado de citocina (por exemplo, interleucina, IFN ou TNF) é administrado a um indivíduo que tem alopecia areata, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, dermatomiosite, diabetes tipo 1, artrite idiopática juvenil, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, púrpura trombocitopênica idiopática, miastenia grave, esclerose múltipla, penfigo/penfigoide, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, polimiosite, cirrose biliar primária, psoríase, artrite reumatoide, escleroderma, síndrome de Sjögren, lúpus eritematoso sistêmico, tireoidite, uveíte, vitiligo, ou granulomatose de Wegener.
[0196] Em alguns casos, um conjugado de IL-2 é administrado a um indivíduo que tem alopecia areata, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, dermatomiosite, diabetes tipo 1, artrite idiopática juvenil, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain- Barré, púrpura trombocitopênica idiopática, miastenia grave, esclerose múltipla, penfigo/penfigoide, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, polimiosite, cirrose biliar primária, psoríase, artrite reumatoide, escleroderma, síndrome de Sjögren, lúpus eritematoso sistêmico, tireoidite, uveíte, vitiligo, ou granulomatose de Wegener. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 é administrado a um indivíduo que tem diabetes tipo 1. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 é administrado a um indivíduo que tem doença de Graves. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 é administrado a um indivíduo que tem esclerose múltipla. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 é administrado a um indivíduo que tem psoríase. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 é administrado a um indivíduo que tem artrite reumatoide. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 é administrado a um indivíduo que tem síndrome de Sjögren. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 é administrado a um indivíduo que tem lúpus eritematoso sistêmico. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 é administrado a um indivíduo que tem uveíte. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 é administrado a um indivíduo que tem granulomatose de Wegener.
[0197] Em alguns casos, um conjugado de citocina (por exemplo, um conjugado de IL-2) é administrado a um indivíduo para o tratamento de uma doença de Enxerto- versus-Hospedeiro (GVHD).
[0198] Em algumas modalidades, um agente terapêutico adicional é adicionalmente administrado ao indivíduo. Em alguns casos, o agente terapêutico adicional é administrado simultaneamente com um conjugado de citocina (por exemplo, conjugado de IL-2). Em outros casos, o agente terapêutico adicional e o conjugado de citocina (por exemplo, conjugado de IL-2) são sequencialmente administrados, por exemplo, o conjugado de citocina (por exemplo, conjugado de IL-2) é administrado antes do agente terapêutico adicional ou que o conjugado de citocina (por exemplo, conjugado de IL-2) é administrado após administração do agente terapêutico adicional.
[0199] Agentes terapêuticos adicionais exemplificativos para o tratamento de uma doença ou um transtorno autoimune incluem, porém sem limitação, corticosteroides como prednisona, budesonida ou prednisolona; inibidores de calcineurina como ciclosporina ou tacrolimo; inibidores de mTOR como sirolimo ou everolimo; inibidores de IMDH como azatioprina, leflunomida ou micofenolato; biológicos como abatacepte, adalimumabe, anakinra, certolizumabe, etanercepte, golimumabe, infliximabe, ixekizumabe, natalizumabe, rituximabe, secuquinumabe, tocilizumabe, ustekinumabe ou vedolizumabe; e anticorpos monoclonais como basiliximabe, daclizumabe ou muromonabe.
[0200] Em alguns casos, um conjugado de citocina (por exemplo, conjugado de IL-2) é administrado com um agente terapêutico adicional selecionado a partir de um corticosteroide como prednisona, budesonida ou prednisolona; um inibidor de calcineurina como ciclosporina ou tacrolimo; um inibidor de mTOR como sirolimo ou everolimo; um inibidor de como azatioprina, leflunomida ou micofenolato; um biológico como abatacepte, adalimumabe, anakinra, certolizumabe, etanercepte, golimumabe, infliximabe, ixekizumabe, natalizumabe, rituximabe, secuquinumabe, tocilizumabe, ustekinumabe ou vedolizumabe; e um anticorpo monoclonal como basiliximabe, daclizumabe ou muromonabe. Métodos de Expansão de População Celular
[0201] Em algumas modalidades, são adicionalmente descritos no presente documento métodos para expandir uma população de célula Treg. Em alguns exemplos, o método compreende colocar uma célula em contato com um conjugado de citocina descrito no presente documento, e interagir a citocina com um receptor de citocina para formar um complexo, em que o complexo estimula a expansão de uma população de linfócitos distinta.
[0202] Em algumas modalidades, o método para expandir população de célula T regulatória CD4+ (Treg) compreende colocar uma célula em contato com um polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada descrito acima por um período de tempo suficiente para induzir a formação de um complexo com uma IL-2Rαβγ estimulando, por meio disso, a expansão da população de célula Treg. Em algumas modalidades, o método para expandir a célula CD4+ população de Treg compreende (a) colocar uma célula em contato com um conjugado de IL-2 descrito no presente documento; e (b) interagir o conjugado de IL-2 com subunidades de IL-2Rα, IL-2Rβ e IL-2Rγ para formar um complexo de IL-2/IL-2Rαβγ; em que o conjugado de IL-2 tem uma afinidade diminuída com subunidades de IL-2Rβ e IL-2Rγ, ou diminui o recrutamento da subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ, e em que o complexo de IL- 2/IL-2Rαβγ estimula a expansão de células Treg. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 que compreende: um polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada; e uma fração de conjugação que se liga ao polipeptídeo de IL-2 isolada e purificada em um resíduo de aminoácido selecionado a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, R81, P82, R83, D84, S87, N88, N89, V91, I92, L94, E95, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, T113, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos, o resíduo de aminoácido é selecionado a partir de K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, R81, D84, S87, N88, V91, I92, L94, E95, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133. Em alguns exemplos, o resíduo de aminoácido é selecionado a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, P82, R83, N89, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, e T113. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, D84, N88, E95, e Q126. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de K8, K9, e H16. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de Q22, N26, N88, e Q126. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de E15, D20, D84, e E95. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de L12, L19, M23, e F78. Em alguns exemplos, a posição de aminoácido é selecionada a partir de Q22 e N26.
[0203] Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 expande células T regulatórias CD4+ (Treg) em pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais. Em alguns exemplos, o conjugado de IL-2 expande células T regulatórias CD4+ (Treg) por cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais.
[0204] Em alguns casos, o conjugado de IL-2 expande células T regulatórias CD4+ (Treg) em pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais. Em alguns casos, o conjugado de IL-2 expande células T regulatórias CD4+ (Treg) por cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais.
[0205] Em alguns exemplos, o tempo suficiente para induzir a formação de um complexo com uma IL-2Rαβγ é de pelo menos 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias ou 7 dias. Em alguns exemplos, to tempo suficiente para induzir a formação de um complexo com uma IL-2Rαβγ é de cerca de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, ou 7 dias.
[0206] Em algumas modalidades, o método é um método in vivo.
[0207] Em outras modalidades, o método é um método in vitro.
[0208] Em modalidades adicionais, o método é um método ex vivo. Produção de Polipeptídeo de Citocina
[0209] Em alguns exemplos, os polipeptídeos de citocina (por exemplo, interleucina, IFN, ou TNF) descritos no presente documento, contêm uma mutação de aminoácido natural ou uma mutação de aminoácido não natural, são gerados de modo recombinante ou são quimicamente sintetizados. Em alguns exemplos, os polipeptídeos de citocina (por exemplo, IL-2) são descritos no presente documento gerados de modo recombinante, por exemplo, por um sistema de célula hospedeira, ou em um sistema de livre de células.
[0210] Em alguns exemplos, os polipeptídeos de citocina (por exemplo, IL-2) são gerados de modo recombinante através de um sistema de célula hospedeira. Em alguns casos, a célula hospedeira é uma célula eucariota (por exemplo, células de mamíferos, células de inseto, células de levedura ou célula vegetal) ou uma célula procariota (por exemplo, bactéria gram-positiva ou uma bactéria gram- negativa). Em alguns casos, uma célula hospedeira eucariota é uma célula hospedeira de mamífero. Em alguns casos, uma célula hospedeira de mamífero é uma linhagem celular estável, ou uma linhagem celular que incorporou um material genético de interesse em seu próprio genoma e que tem a capacidade de expressar o produto do material genético após muitas gerações de divisão celular. Em outros casos, uma célula hospedeira de mamífero é uma linhagem celular transiente, ou uma linhagem celular que não incorporou um material genético de interesse em seu próprio genoma e que não tem a capacidade de expressar o produto do material genético após muitas gerações de divisão celular.
[0211] Células hospedeiras de mamífero exemplificativos incluem a linhagem celular 293T, a linhagem celular 293A, a linhagem celular 293FT, células 293F, células 293 H, células A549, células MDCK, células CHO DG44, células CHO- S, células CHO-K1, células Expi293F™, a linhagem celular Flp-In™ T-REx™ 293, a linhagem celular Flp-In™-293, a linhagem celular Flp-In™-3T3, a linhagem celular Flp-In™- BHK, a linhagem celular Flp-In™-CHO, a linhagem celular Flp-In™-CV-1, a linhagem celular Flp-In™-Jurkat, células FreeStyle™ 293-F, células FreeStyle™ CHO-S, a linhagem celular GripTite™ 293 MSR, a linhagem celular GS-CHO, células HepaRG™, a linhagem celular T-REx™ Jurkat, células Per.C6, a linhagem celular T-REx™-293, a linhagem celular T-REx™-CHO e a linhagem celular T-REx™-HeLa.
[0212] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucariota é uma célula hospedeira de inseto. Células hospedeiras de inseto exemplificativos incluem células de Drosophila S2, células SF9, células SF21, células High Five™ e células expresSF+®.
[0213] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucariota é uma célula hospedeira de levedura. Células hospedeiras de levedura exemplificativos incluem cepas da levedura Pichia pastoris tal como GS115, KM71H, SMD1168, SMD1168H e X-33 e a cepa da levedura Saccharomyces cerevisiae tal como INVSc1.
[0214] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucariota é uma célula hospedeira vegetal. Em alguns casos, as células vegetais compreendem uma célula de alga. Linhagens de células vegetais exemplificativas incluem cepas de Chlamydomonas reinhardtii 137c, ou Synechococcus elongatus PPC 7942.
[0215] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula hospedeira procariota. Células hospedeiras procariotas exemplificativos incluem BL21, Mach1™, DH10B™, TOP10, DH5α, DH10Bac™, OmniMax™, MegaX™, DH12S™, INV110, TOP10F’, INVαF, TOP10/P3, ccdB Survival, PIR1, PIR2, Stbl2™, Stbl3™ ou Stbl4™.
[0216] Em alguns exemplos, moléculas ou vetores de ácido polinucleico adequados para a produção de um polipeptídeo de IL-2 descrito no presente documento incluem quaisquer vetores adequados derivados de uma fonte eucariótica ou procariótica. Moléculas de ácido polinucleico ou vetores adequados incluem vetores bacterianos (por exemplo, Escherichia coli), insetos, leveduras (por exemplo, Pichia pastoris), algas ou de fontes de mamíferos. Vetores bacterianos incluem, por exemplo, pACYC177, pASK75, série de vetores pBAD, série de vetores pBADM, série de vetores pET, série de vetores pETM, série de vetores pGEX, pHAT, pHAT2, pMal-c2, pMal-p2, série de vetores pQE, pRSET A, pRSET B, pRSET C, série pTrcHis2, pZA31-Luc, pZE21-MCS-1, pFLAG ATS, pFLAG CTS, pFLAG MAC, pFLAG Shift-12c, pTAC-MAT- 1, pFLAG CTC, ou pTAC-MAT-2.
[0217] Vetores de insetos incluem, por exemplo, pFastBac1, pFastBac DUAL, pFastBac ET, pFastBac HTa,
pFastBac HTb, pFastBac HTc, pFastBac M30a, pFastBact M30b, pFastBac, M30c, pVL1392, pVL1393, pVL1393 M10, pVL1393 M11, pVL1393 M12, vetores FLAG tal como pPolh-FLAG1 ou pPolh-MAT 2, ou vetores MAT tal como pPolh-MAT1 ou pPolh-MAT2.
[0218] Vetores de levedura incluem, por exemplo, o vetor Gateway® pDEST™ 14, o vetor Gateway® pDEST™ 15, o vetor Gateway® pDEST™ 17, o vetor Gateway® pDEST™ 24, o vetor Gateway® pYES-DEST52, o vetor de destino pBAD-DEST49 Gateway®, o vetor de Pichia pAO815, o vetor de Pichi pastoris pFLD1, os vetores de Pichia pastoris pGAPZA, B, & C, o vetor de Pichia pPIC3.5K, o vetor de Pichia pPIC6 A, B, & C, o vetor de Pichia pPIC9K, pTEF1/Zeo, o vetor de levedura pYES2, o vetor de levedura pYES2/CT, o vetor de levedura pYES2/NT A, B, & C, ou o vetor de levedura pYES3/CT.
[0219] Vetores de algas incluem, por exemplo, o vetor pChlamy-4 ou o vetor MCS.
[0220] Vetores de mamíferos incluem, por exemplo, vetores de expressão transientes ou vetores de expressão estáveis. Vetores de expressão transientes exemplificativos de mamíferos incluem p3xFLAG-CMV 8, pFLAG-Myc-CMV 19, pFLAG-Myc-CMV 23, pFLAG-CMV 2, pFLAG-CMV 6a,b,c, pFLAG-CMV
5.1, pFLAG-CMV 5a,b,c, p3xFLAG-CMV 7.1, pFLAG-CMV 20, p3xFLAG-Myc-CMV 24, pCMV-FLAG-MAT1, pCMV-FLAG-MAT2, pBICEP- CMV 3, ou pBICEP-CMV 4. Vetores de expressão estáveis exemplificativos de mamíferos incluem pFLAG-CMV 3, p3xFLAG- CMV 9, p3xFLAG-CMV 13, pFLAG-Myc-CMV 21, p3xFLAG-Myc-CMV 25, pFLAG-CMV 4, p3xFLAG-CMV 10, p3xFLAG-CMV 14, pFLAG-Myc- CMV 22, p3xFLAG-Myc-CMV 26, pBICEP-CMV 1, ou pBICEP-CMV 2.
[0221] Em alguns exemplos, um sistema de livre de células é usado para a produção de um polipeptídeo de citocina (por exemplo, IL-2) descrito no presente documento. Em alguns casos, um sistema isento de células compreende uma mistura de componentes citoplasmáticos e/ou nucleares de uma célula e é adequado para a síntese de ácido nucleico in vitro. Em alguns casos, um sistema isento de células usa componentes de células procarióticas. Em outros casos, um sistema isento de células usa componentes de células eucarióticas. A síntese de ácido nucleico é obtida em um sistema isento de células com base em, por exemplo, células de Drosophila, ovo de Xenopus, Archaea ou células HeLa. Sistemas isentos de células exemplares incluem sistema de extrato de E. coli S30, sistema de E. coli T7 S30, ou sistema PURExpress®, XpressCF e XpressCF+.
[0222] Sistemas de tradução de livre de células compreendem variadamente componentes como plasmídeos, mRNA, DNA, tRNAs, sintetases, fatores de liberação, ribossomos, proteínas de chaperona, fatores de iniciação e alongamento de tradução, aminoácidos naturais e/ou não naturais, e/ou outros componentes usados para expressão de proteína. Tais componentes são opcionalmente modificados para aprimorar rendimentos, aumentar taxa de síntese, aumentar fidelidade de produto de proteína ou incorporar aminoácidos não naturais. Em algumas modalidades, citocinas são descritas no presente documento sintetizadas com o uso de sistemas de tradução livre de células descritos nos documentos US
8.778.631; US 2017/0283469; US 2018/0051065; US 2014/0315245; ou US 8.778.631. Em algumas modalidades, sistemas de tradução livre de células compreendem fatores de liberação modificados, ou até mesmo a remoção de um ou mais fatores de liberação do sistema. Em algumas modalidades, sistemas de tradução livre de células compreendem uma concentração de protease reduzida. Em algumas modalidades, sistemas de tradução livre de células compreendem tRNAs modificados com códons reatribuídos usados para codificar aminoácidos não naturais. Em algumas modalidades, as sintetases descritas no presente documento para a incorporação de aminoácidos não naturais são usadas em sistemas de tradução livre de células. Em algumas modalidades, tRNAs são pré-carregados com aminoácidos não naturais com o uso de métodos enzimáticos ou químicos antes de serem adicionados a um sistema de tradução livre de célula. Em algumas modalidades, componentes para um sistema de tradução livre de célula são obtidos a partir de organismos modificados, como bactéria, levedura ou outro organismo modificado.
[0223] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de citocina (por exemplo, IL-2) é gerado como uma forma circularmente permutada, por meio de um sistema hospedeiro de expressão ou através de um sistema de célula livre. Produção de Polipeptídeo de Citocina que Compreende um Aminoácido Não Natural
[0224] Um código genético ortogonal ou expandido pode ser usado na presente revelação, em que um ou mais códons específicos presentes na sequência de ácido nucleico de um polipeptídeo de citocina (por exemplo, IL-2) são alocados para codificar o aminoácido não natural de modo que o mesmo possa ser geneticamente incorporado na citocina (por exemplo, IL-2) com o uso de um par de tRNA sintetase/tRNA ortogonal. O par de tRNA sintetase/tRNA ortogonal tem a capacidade para carregar um tRNA com um aminoácido não natural e tem a capacidade para incorporar tal aminoácido não natural na cadeia polipeptídica em resposta ao códon.
[0225] Em alguns exemplos, o códon é o códon âmbar, ocre, opal ou um códon quadrupleto. Em alguns casos, o códon corresponde ao tRNA ortogonal que será usado para carrear o aminoácido não natural. Em alguns casos, o códon é âmbar. Em outros casos, o códon é um códon ortogonal.
[0226] Em alguns exemplos, o códon é um códon quadrupleto, que pode ser decodificado por um ribossomo ortogonal ribo-Q1. Em alguns casos, o códon quadrupleto é como ilustrado em Neumann, et al., “Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet- decoding ribosome”, Nature, 464(7287): 441-444 (2010).
[0227] Em alguns exemplos, um códon usado na presente revelação é um códon recodificado, por exemplo, um códon de sinônimo ou um códon raro que é substituído por códon alternativo. Em alguns casos, o códon recodificado é como descrito em Napolitano, et al., “Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare argine codons in Escherichia coli”, PNAS, 113(38): E5588-5597 (2016). Em alguns casos, o códon recodificado é como descrito em Ostrov et al., “Design, synthesis, and testing toward a 57- codon genome”, Science 353(6301): 819-822 (2016).
[0228] Em alguns exemplos, ácidos nucleicos não naturais são utilizados resultando na incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais na citocina (por exemplo, IL-2). Ácidos nucleicos não naturais exemplificativos incluem, porém sem limitação, uracil-5-ila, hipoxantin-9-ila (I), 2- aminoadenin-9-ila, 5-metilcitosina (5-me-C), citosina de 5-
hidroximetila, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6- metila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-propila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5- halouracila e citosina, uracila de 5-propinila e citosina, uracila de 6-azo, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracil), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8- tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8- substituídas, 5-halo, particularmente, 5-bromo, 5- trifiuorometila e outras uracilas e citosinas 5- substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-aza-adenina, 7-deazaguanina e 7-deaza-adenina e 3- deazaguanina e 3-deaza-adenina.
Determinados ácidos nucleicos não naturais, como pirimidinas 5-substituídas, 6- azapirimidinas e purinas N-2 substituídas, purinas N-6 substituídas, purinas O-6 substituídas, 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracila, 5-propinilcitosina, 5-metilcitosina, aquelas que aumenta a estabilidade de formação duplex, ácidos nucleicos universais, ácidos nucleicos hidrofóbicos, ácidos nucleicos promíscuos, ácidos nucleicos de tamanho expandido, ácidos nucleicos fluorados, pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e N-2, N-6 e purinas 0-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina. 5-Metilcitosina (5- me-C), citosina de 5- hidroximetila, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metila, outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-propila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2- tiocitosina, 5-halouracila, 5-halocitosina, uracila de 5- propinila (-C≡C-CH3), citosina de 5-propinila, outros derivados de alquinila de ácidos nucleicos de pirimidina, uracila de 6-azo, citosina de 6-azo, timina de 6-azo, 5- uracila (pseudouracil), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8- tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo, particularmente, 5-bromo, 5-trifluorometila, outras uracilas e citosinas 5- substituídas, 7-metilguanina, 7- metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina, 8-azaadenina, 7- deazaguanina, 7- deaza-adenina, 3-deazaguanina, 3-deaza- adenina, pirimidinas tricíclicas, citidina fenoxazina ([5,4-b][l,4]benzoxazin-2(3H)-ona), citidina de fenotiazina (1H-pirimido[5,4-b][l,4]benzotiazin-2(3H)-ona), grampos G, citidina de fenoxazina (por exemplo, 9- (2-aminoetoxi)-H- pirimido[5,4-b][l,4]benzoxazin-2(3H)-ona), citidina de carbazol (2H-pirimido[4,5- b]indol-2-ona), citidina de piridoindol (H-pirido[3’,2’:4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2- ona), aqueles em que a base de purina ou pirimidina base é substituída por outros heterociclos, 7-deaza-adenina, 7- deazaguanosina, 2-aminopiridina, 2-piridona, azacitosina, 5-bromocitosina, bromouracila, 5-clorocitosina, citosina clorinatada, ciclocitosina, citosina arabinosida, 5- fluorocitosina, fluoropirimidina, fluorouracila, 5,6-di- hidrocitosina, 5-iodocitosina, hidroxiureia, iodouracila, 5-nitrocitosina, 5-bromouracila, 5-clorouracila, 5- fluorouracila e 5-iodouracila, 2-amino-adenina, 6-tio- guanina, 2-tio-timina, 4-tio-timina, 5-propinil-uracila, 4- tio-uracila, N4-etilcitosina, 7-deazaguanina, 7-deaza-8- azaguanina, 5-hidroxicitosina, 2’-desoxiuridina, 2-amino- 2’-desoxiadenosina, e aqueles descritos nas Patentes US nº
3.687.808; 4.845.205; 4.910.300; 4.948.882; 5.093.232;
5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272;
5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711;
5.552.540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617;
5.645.985; 5.681.941; 5.750.692; 5.763.588; 5.830.653 e
6.005.096; documento WO 99/62923; Kandimalla et al., (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; The Concise Enciclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858- 859; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; e Sanghvi, Capítulo 15, Antisense Research and Applications, Crookeand Lebleu Eds., CRC Press, 1993, 273-288. Modificações de base adicionais podem ser encontradas, por exemplo, na Patente nº US 3.687.808; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; e Sanghvi, Capítulo 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke e Lebleu ed., CRC Press, 1993.
[0229] Ácidos nucleicos não naturais que compreendem diversas bases heterocíclicas e diversas frações de açúcar (e análogos de açúcar) estão disponíveis na técnica, e os ácidos nucleicos em alguns cases incluem um ou diversas bases heterocíclicas diferentes dos cinco componentes de base principais de ácidos nucleicos de ocorrência natural. Por exemplo, a base heterocíclica inclui, em alguns casos, grupos uracil-5-ila, citosin-5-ila, adenin-7-ila, adenin-8- ila, guanin-7-ila, guanin-8-ila, 4- aminopirrolo [2.3-d] pirimidin-5-ila, 2-amino-4-oxopirolo [2, 3-d] pirimidin-5- ila, 2-amino-4-oxopirrolo [2.3-d] pirimidin-3-ila, em que as purinas são fixadas à fração de açúcar do ácido nucleico por meio da posição 9, as pirimidinas por meio da posição 1, as pirrolopirimidinas por meio da posição 7 e as pirazolopirimidinas por meio da posição 1.
[0230] Em algumas modalidades, análogos de nucleotídeo também são modificados na fração de fosfato. As frações de fosfato modificados incluem, porém sem limitação, aquelas sem modificação na ligação entre dois nucleotídeos e contêm, por exemplo, um fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, metila e outros fosfonatos de alquila que incluem fosfonato de 3’-alquileno e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos que incluem fosforamidato de 3’-amino e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres e boranofosfatos. Entende-se que essas ligações de fosfato ou fosfato modificado entre dois nucleotídeos se dão através de uma ligação de 3’-5’ ou uma ligação de 2’-5’, e a ligação contém polaridade invertida como 3’-5’ a 5’-3’ ou 2’-5’ a 5’-2’. Vários sais, sais misturados e formas de ácido livre também são incluídas. Diversas patentes dos Estados Unidos professam como compor e usar nucleotídeos que contêm fosfatos modificados e incluem, porém sem limitação, 3.687.808; 4.469.863;
4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423;
5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676;
5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925;
5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253;
5.571.799; 5.587.361; e 5.625.050.
[0231] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos não naturais incluem 2’,3’-dideoxi-2’,3’-dide-hidro- nucleosídeos (documento PCT/US2002/006460), derivados de DNA e RNA 5’-substituídos (documento PCT/US2011/033961;
Saha et al., J. Org Chem., 1995, 60, 788-789; Wang et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890; e Mikhailov et al., Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1- 3), 339-343; Leonid et al., 1995, 14(3-5), 901-905; e Eppacher et al., Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004- 3020; documentos PCT/JP2000/004720; PCT/JP2003/002342; PCT/JP2004/013216; PCT/JP2005/020435; PCT/JP2006/315479; PCT/JP2006/324484; PCT/JP2009/056718; PCT/JP2010/067560), ou monômeros 5’-substituídos feitos como o monofosfato com bases modificadas (Wang et al., Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004,] 23 (1 & 2), 317-337).
[0232] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos não naturais incluem modificações na posição 5’ e na posição 2’ do anel de açúcar (documento PCT/US94/02993), como nucleosídeos 2’-O-protegido 5’-CH2-substituídos (Wu et al., Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143 e Wu et al., Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924). Em alguns casos, ácidos nucleicos não naturais incluem dímeros de nucleosídeo ligados a amida que foram preparados para incorporação em oligonucleotídeos em que o nucleosídeo ligado a 3’ no dímero (5’ a 3’) compreende um 2’-OCH3 e a 5’-(S)-CH3 (Mesmaeker et al., Synlett, 1997, 1287-1290). Ácidos nucleicos não naturais podem incluir nucleosídeos modificados 5’-CH2 2’-substituídos (ou O) (PCT/US92/01020). Ácidos nucleicos não naturais podem incluir monômeros de DNA e RNA de 5’-metilenofosfonato, e dímeros (Bohringer et al., Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726; Collingwood et al., Synlett, 1995, 7, 703-705; e Hutter et al., Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806). Ácidos nucleicos não naturais podem incluir monômeros de 5’-fosfonato que têm uma 2’-substituição (documento US2006/0074035) e outros monômeros de 5’-fosfonato modificados (documento WO1997/35869). Ácidos nucleicos não naturais podem incluir monômeros de metilenofosfonato de 5’-modificado (documentos EP614907 e EP629633). Ácidos nucleicos não naturais podem incluir análogos de ribonucleosídeos de 5’ ou 6’-fosfonato que compreendem um grupo hidroxila na posição 5’ e/ou 6’ (Chen et al., Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786; Jung et al., Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501- 2509; Gallier et al., Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933; e Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033). Ácidos nucleicos não naturais podem incluir monômeros e dímeros e desoxirribonucleosídeo de 5’-fosfonato que tem um grupo 5’-fosfato (Nawrot et al., Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82). Ácidos nucleicos não naturais podem incluir nucleosídeos que tem um grupo 6’-fosfonato em que a posição 5’ ou/e 6’ é não substituída ou substituída com um grupo tio-terc-butila (SC(CH3)3) (e análogos do mesmo); um grupo metilenoamino (CH2NH2) (e análogos do mesmo) ou um grupo ciano (CN) (e análogos do mesmo) (Fairhurst et al., Synlett, 2001, 4, 467-472; Kappler et al., J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038; Kappler et al., J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184; Vrudhula et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894; Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19, 1371- 1377; Geze et al., J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638- 7640; e Hampton et al., J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414).
[0233] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos não naturais também incluem modificações da fração de açúcar. Em alguns casos, ácidos nucleicos contêm um ou mais nucleosídeos em que o grupo açúcar foi modificado. Tais nucleosídeos modificados por açúcar podem prejudicar estabilidade de nuclease melhorada, afinidade de ligação aumentada ou alguma outra propriedade biológica benéfica. Em determinadas modalidades, ácidos nucleicos compreendem uma fração de anel de ribofuranose quimicamente modificada. Exemplos de anéis de ribofuranose quimicamente modificados incluem, sem limitação, adição de grupos substituintes (incluindo grupos substituintes de 5’ e/ou 2’; ligação de dois átomos de anel para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA); substituição do átomo de oxigênio de anel de ribosila com S, N(R), ou C(R1)(R2) (R = H, C1-C12 alquila ou um grupo de proteção); e combinações dos mesmos. Exemplos de açúcares quimicamente modificados podem ser encontrados nos documentos WO2008/101157, US2005/0130923 e WO2007/134181.
[0234] Em alguns exemplos, um ácido nucleico modificado compreende açúcares modificados ou análogos de açúcar. Desse modo, além de ribose e desoxirribose, a fração de açúcar pode ser pentose, desoxipentose, hexose, desoxi- hexose, glucose, arabinose, xilose, lixose, ou um grupo ciclopentila “análogo” de açúcar. O açúcar pode estar em uma forma de piranosila ou furanosila. A fração de açúcar pode ser o furanosídeo de ribose, desoxirribose, arabinose ou 2’-O-alquilribose, e o açúcar pode ser fixada às respectivas bases heterocíclicas em configuração anomérica [alfa] ou [beta]. Modificações de açúcar incluem, porém sem limitação, análogos de 2’-alcoxi-RNA, análogos de 2’-amino- RNA, 2’-fluoro-DNA, e quimeras de 2’-alcoxi- ou amino- RNA/DNA. Por exemplo, uma modificação de açúcar pode incluir 2’-O-metil-uridina ou 2’-O-metil-citidina. Modificações de açúcar incluem desoxirribonucleosídeos 2’- O-alquil-substituídos e ribonucleosídoes similares a 2’-O- etilenoglicol. A preparação desses açúcares ou análogos de açúcar e dos respectivos “nucleosídeos” em que tais açúcares ou análogos são fixados a uma base heterocíclica (base de ácido nucleico) é conhecida. As modificações de açúcar também podem ser feitas e combinadas com outras modificações.
[0235] As modificações para a fração de açúcar incluem modificações naturais da ribose e da desoxirribose, bem como modificações não naturais. Modificações de açúcar incluem, porém sem limitação, as seguintes modificações na posição 2’: OH; F; O-, S-, ou N-alquila; O-, S-, ou N- alquenila; O-, S- ou N-alquinila; ou O-alquil-O-alquila, em que a alquila, alquenila e alquinila podem ser C1 a C10, alquila ou C2 a C10 alquenila e alquinila substituídas ou não substituídas. Modificações de 2’-açúcar também incluem, porém sem limitação, -O[(CH2)nO]m CH3, -O(CH2)nOCH3, - O(CH2)nNH2, -O(CH2)nCH3, -O(CH2)nONH2, e -O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2, em que n e m são de 1 a cerca de 10.
[0236] Outras modificações na posição 2’ incluem, porém sem limitação: C1 a C10 alquila inferior, alquila inferior substituída, alcarila, aralquila, O-alcarila, O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituída, um grupo de clivagem de RNA, um grupo reportador, um intercalador, um grupo para aprimorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucleotideo, ou um grupo para aprimorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleotideo, e outros substituintes que têm propriedades similares. Modificações similares também podem ser feitas em outras posições no açúcar, particularmente, a posição 3’ do açúcar no nucleotídeo de terminal 3’ ou em oligonucleotídeos ligados a 2’-5’ e a posição 5’ do nucleotídeo terminal 5’. Açúcares modificados também incluem aqueles que contêm modificações no oxigênio em anel de ligação, como CH2 e S. Análogos de açúcar de nucleotídeo também podem ter imitações de açúcar como frações de ciclobutila em vez do açúcar de pentofuranosila. Há diversas patentes dos Estados Unidos que professam a preparação de tais estruturas de açúcar modificadas e que detalham e descrevem uma faixa de modificações de base, como as Patentes nº US 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080;
5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785;
5.519.134; 5.567,811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909;
5.610,300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658,873;
5.670.633; 4.845.205; 5.130.302; 5.134,066; 5.175.273;
5.367.066; 5.432.272; 5.457,187; 5.459.255; 5.484.908;
5.502.177; 5.525,711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121,
5.596,091; 5.614.617; 5.681.941; e 5.700.920, em que cada uma é incorporada no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0237] Exemplos de ácidos nucleicos que têm frações de açúcar modificadas incluem, sem limitação, ácidos nucleicos que compreende 5’-vinila, 5’-metila (R ou S), 4’-S, 2’-F, 2’-OCH3 e grupos substituintes 2’-O(CH2)2OCH3. O substituinte na posição 2’ também pode ser selecionado a partir de alila, amino, azido, tio, O-alila, O-(C1-C1O alquila), OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), e O-CH2- C(=O)-N(Rm)(Rn), em que cada Rm e Rn é, independentemente, H ou C1-C10 alquila substituída ou não substituída.
[0238] Em determinadas modalidades, ácidos nucleicos descritos no presente documento incluem um ou mais ácidos nucleicos bicíclicos. Em determinadas tais modalidades, o ácido nucleico bicíclico compreende uma ponte entre os átomos de anel de ribosila de 4’ e 2’. Em determinadas modalidades, ácidos nucleicos fornecidos no presente documento incluem um ou mais ácidos nucleicos bicíclicos, em que a ponte compreende um ácido nucleico bicíclico de 4’ a 2’. Exemplos de tais ácidos nucleicos bicíclicos de 4’ a 2’ incluem, porém sem limitação, uma dentre as fórmulas: 4’-(CH2)-O-2’ (LNA); 4’-(CH2)-S-2’; 4’-(CH2)2-O-2’ (ENA); 4’-CH(CH3)-O-2’ e 4’-CH(CH2OCH3)-O-2’, e análogos dos mesmos (consultar, a Patente nº US 7.399.845); 4’-C(CH3)(CH3)-O-2’ e análogos dos mesmos, (consultar documentos WO2009/006478, WO2008/150729, US2004/0171570, Patente nº US 7.427.672, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 209, 74, 118-134 e documento WO2008/154401). Consultar também, por exemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patentes nº US
4.849.513; 5.015.733; 5.118.800; 5.118.802; 7.053.207;
6.268.490; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 6.525.191;
6.670.461; e 7.399.845; Pedidos Internacionais nº WO2004/106356, WO1994/14226, WO2005/021570, WO2007/090071, e WO2007/134181; Publicações de Patente nº US US2004/0171570, US2007/0287831 e US2008/0039618; Pedidos Provisórios nº US 60/989.574, 61/026.995, 61/026.998, 61/056.564, 61/086.231, 61/097.787, e 61/099.844; e Pedidos Internacionais nº PCT/US2008/064591, PCT US2008/066154, PCT US2008/068922, e PCT/DK98/00393.
[0239] Em determinadas modalidades, ácidos nucleicos compreendem ácidos nucleicos ligados. Ácidos nucleicos podem ser ligados com o uso de qualquer ligação entre ácidos nucleicos. As duas classes principais de grupos de ligação entre ácidos nucleicos são definidas pela presença ou ausência de um átomo de fósforo. Ligações entre ácidos nucleicos que contêm fósforo representativas incluem, porém sem limitação, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato e fosforotioatos (P=S). Grupos de ligação entre ácidos nucleicos que contêm não fósforos representativos incluem, porém sem limitação, metilenometilimino (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), tiodiéster (-O- C(O)-S-), tionocarbamato (-O-C(O)(NH)-S-); siloxano (-O- Si(H)2-O-); e N,N*-dimetil-hidrazina (-CH2-N(CH3)-N(CH3)). Em determinadas modalidades, ligações entre ácidos nucleicos que têm um átomo quiral podem ser preparadas como uma mistura racêmica, como enantiômeros separados, por exemplo, alquilfosfonatos e fosforotioatos. Ácidos nucleicos não naturais podem contar uma única modificação. Ácidos nucleicos não naturais podem conter múltiplas modificações em uma dentre as frações ou entre as frações diferentes.
[0240] Modificações de fosfato de estrutura principal para ácido nucleico incluem, porém sem limitação, fosfonato de metila, fosforotioato, fosforamidato (ligação ou não ligação), fosfotriéster, fosforoditioato, fosfoditioato, e boranofosfato, e podem ser usados em qualquer combinação. Outras ligações de não fosfato também podem ser usadas.
[0241] Em algumas modalidades, modificações de estrutura principal (por exemplo, ligações entre nucleotídeos de metilfosfonato, fosforotioato, fosforoamidato e fosforoditioato) podem conferir atividade imunomodulatória no ácido nucleico modificado e/ou suas estabilidades melhoradas in vivo.
[0242] Em alguns exemplos, um derivado de fósforo (ou grupo fosfato modificado) é fixado à fração de açúcar ou análogo de açúcar em e pode ser um monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato ou similares. Polinucleotídeos exemplificativos que contêm ligações de fosfato modificado ou ligações de não fosfato podem ser constatadas em Peyrottes et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; e Schultz et al., (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973; Matteucci, 1997, “Oligonucleotide Analogs: an Overview” em Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (Chadwick e Cardew, ed.) John Wiley and Sons, Nova York, NY; Zon, 1993, “Oligonucleoside Phosphorotioatos” em Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, pp. 165-190; Miller et al., 1971, JACS 93:6657-6665; Jager et al., 1988, Biochem. 27:7247-
7246; Nelson et al., 1997, JOC 62:7278-7287; Patente nº US
5.453.496; e Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-
1179.
[0243] Em alguns casos, a modificação de estrutura principal compreende substituir a ligação de fosfodiéster com uma fração alternativa como um grupo aniônico, neutro ou catiônico. Exemplos de tais modificações incluem: ligação internucleosídeo aniônico; modificação de fosforamidato de N3’ a P5’; DNA de boranofosfato; pro- oligonucleotídeos; ligações entre nucleosídeos neutros como metilfosfonatos; DNA ligado a amida; ligações de metileno(metilimino); ligações de formacetal e tioformacetal; estruturas principais que contêm grupos sulfonila; oligos morfolino; ácidos nucleicos peptídicos (PNA); e oligos de guanidina desoxirribonucleico positivamente carregados (DNG) (Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179). Um ácido nucleico modificado pode compreender uma estrutura principal quimérica ou misturada que compreende uma ou mais modificações, por exemplo, uma combinação de ligações de fosfato como uma combinação de ligações de fosfodiéster e fosforotioato.
[0244] Substituintes para o fosfato incluem, por exemplo, ligações entre nucleosídeos de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, heteroátomo misturado e ligações entre nucleosídeos de alquila ou cicloalquila, ou uma ou mais ligações entre nucleosídeos heteroatômicos ou heterocíclicos de cadeia curta. Esses incluem aqueles que têm ligações de morfolino (formados em parte a partir da porção de açúcar de um nucleosídeo); estruturas principais de siloxano; estruturas principais de sulfeto, sulfóxido e sulfona; estruturas principais de formacetila e tioformacetila; estruturas principais de formacetila e tioformacetila de metileno; alceno que contém estruturas principais; estruturas principais de sulfamato; estruturas principais de metilenoimino e metileno-hidrazina; estruturas principais de sulfonato e sulfonamida; estruturas principais de amida; e outros que têm partes de componente N, O, S e CH2 misturados. Diversas patentes dos Estados Unidos revelam como compor e usar esses tipos de substituições de fosfato e incluem, porém sem limitação, Patentes nº US 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134;
5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938;
5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307;
5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240;
5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312;
5.633.360; 5.677.437; e 5.677.439. Entende-se também em um substituto de nucleotídeo que tanto frações de açúcar quanto de fosfato do nucleotídeo podem ser substituídos, por exemplo, por uma ligação do tipo amida (aminoetilglicina) (PNA). Patentes dos Estados Unidos nº
5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262 professam como compor e usar moléculas de PNA, em que cada uma está incorporada ao presente documento a título de referência. Consultar também Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500. Também é possível ligar outros tipos de moléculas (conjugados) a nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo para melhorar, por exemplo, coleta celular. Os conjugados podem ser quimicamente ligados ao nucleotídeo ou análogos de nucleotídeo. Tais conjugados incluem, porém sem limitação,
frações de lipídeo como uma fração de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), um tioéter, por exemplo, hexil-S- tritiltiol (Manoharan et al., Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou undecila (Saison- Behmoaras et al., EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou l-di-O-hexadecil-rac-glicero- S-H-fosfonato de trietilamônio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), ou ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), uma fração de palmitila (Mishra et al., Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), ou uma fração de octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923- 937). Diversas patentes dos Estados Unidos professam a preparação de tais conjugados e incluem, porém sem limitação, Patentes nº US 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105;
5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717.
5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802;
5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718;
5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779;
4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582;
4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830;
5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506;
5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241,
5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667;
5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481;
5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 e
5.688.941.
[0245] Em alguns casos, os ácidos nucleicos não naturais formam adicionalmente pares de bases não naturais. Nucleotídeos não naturais exemplificativos com a capacidade para formar um par de bases de DNA ou RNA não naturais (UBP) sob condições in vivo incluem, porém sem limitação, 5SICS, d5SICS, NAM, dNaM, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, nucleotídeos não naturais incluem: .
[0246] Em algumas modalidades, um par de bases não naturais geram um aminoácido não natural descrito em Dumas et al., “Designing logical codon reassignment – Expanding the chemistry in biology”, Chemical Science, 6: 50-69 (2015).
[0247] A célula hospedeira na qual os construtos ou vetores revelados no presente documento são introduzidos em cultura ou mantidos em um meio adequado, de modo que o tRNA, o tRNA sintetase e a proteína de interesse sejam produzidos. O meio também compreende o(s) aminoácido(s) não natural(is) de modo que a proteína de interesse incorpore o(s) aminoácido(s) não natural(is).
[0248] O par de tRNA sintetase/tRNA ortogonal carrega um tRNA com um aminoácido não natural e incorpora o aminoácido não natural na cadeia polipeptídica em resposta ao códon. Pares de aaRS-tRNA incluem, porém sem limitação, pares de Metanococcus jannaschii (Mj-Tyr) aaRS/tRNA, pares de E. coli TyrRS (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus tRNACUA, pares de E. coli LeuRS (Ec-Leu)/B. stearothermophilus tRNACUA, e pares de pirrolisil-tRNA.
[0249] Um polipeptídeo de citocina (por exemplo, IL-2) que compreende um aminoácido(s) não natural(is) é preparado introduzindo-se os construtos de ácido nucleico descritos no presente documento que compreende o tRNA e tRNA sintetase e que compreende uma sequência de ácido nucleico de interesse com um ou mais e códons (de parada) ortogonais de quadro em uma célula hospedeira. A célula hospedeira é exposta a uma solução fisiológica que compreende o(s) aminoácido(s) não natural(is), e as células hospedeiras são, então, mantidas sob condições que permitem a expressão da sequência de codificação de proteína de interesse. O(s) aminoácido(s) não natural(is) é(são) incorporado(s) na cadeia polipeptídica em resposta ao códon. Por exemplo, um ou mais aminoácidos não naturais são incorporados no polipeptídeo de citocina (por exemplo, IL-2). Alternativamente, dois ou mais aminoácidos não naturais podem ser incorporados no polipeptídeo de citocina (por exemplo, IL-2) em dois ou mais sítios na proteína.
[0250] Quando múltiplos aminoácidos não naturais forem incorporados em um polipeptídeo de citocina (por exemplo, IL-2), será entendido que múltiplos códons deverão ser incorporados na sequência de codificação de ácido nucleico nas posições desejadas, de modo que os pares de tRNA sintetase/tRNA possam direcionar a incorporação dos aminoácidos não naturais em resposta ao(s) códon(s). Pelo menos 1, 2, 3, 4 ou mais ácidos nucleicos que codificam códon podem ser incorporados na sequência de ácido nucleico de interesse.
[0251] Quando for desejado incorporar mais que um tipo de aminoácido não natural na proteína de interesse em uma única proteína, um segundo par de tRNA ortogonal-tRNA sintetase ou par adicional pode ser usado para incorporar o segundo ou aminoácido não natural ou aminoácido adicional; o dito segundo par de tRNA ortogonal-tRNA sintetase ou par adicional reconhece um códon diferente no ácido nucleico que codifica a proteína de interesse, de modo que os dois ou mais aminoácidos não naturais possa ser especificamente incorporados em sítios definidos diferentes na proteína em uma única etapa de fabricação. Em determinadas modalidades, dois ou mais pares de tRNA ortogonal-tRNA sintetase podem,
portanto, ser usados.
[0252] Uma vez que o polipeptídeo de citocina (por exemplo, IL-2) que incorpora o(s) aminoácido(s) não natural(is) tenha sido produzido na célula hospedeira pode ser extraído do mesmo por uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo lise enzimática, química e/ou osmótica e interrupção física. O polipeptídeo de citocina (por exemplo, IL-2) pode ser purificado por técnicas padrão conhecidas na técnica, como cromatografia preparativa, purificação por afinidade ou qualquer outra técnica adequada.
[0253] Células hospedeiras adequadas podem incluir células bacterianas (por exemplo, E. coli), mas células hospedeiras mais adequadas são células eucarióticas, por exemplo, células de inseto (por exemplo, Drosophila como Drosophila melanogaster), células de levedura, nematodos (por exemplo, Celegans), camundongos (por exemplo, Mus musculus), ou células de mamífero (como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células COS, células 293T humanas, células HeLa, células NIH 3T3, e células eritroleucêmicas de camundongo (MEL)) ou células humanas ou outras células eucarióticas. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas por aqueles versados na técnica. Adequadamente, a célula hospedeira é uma célula de mamífero - como uma célula humana ou uma célula de inseto.
[0254] Outras células hospedeiras adequadas que podem ser usadas de modo geral nas modalidades da invenção são aquelas mencionadas na seção exemplos. O DNA de vetor pode ser introduzida nas células hospedeiras por meio de técnicas de transformação ou transfecção convencionais.
Como usado no presente documento, os termos "transformação" e "transfecção" se destinam a se referir a uma variedade de técnicas bem reconhecidas para introduzir uma molécula de ácido nucleico estranha (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo coprecipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE- dextrano, lipofecção ou eletroporação. Métodos adequados para transformar ou transfectar células hospedeiras são bem conhecidos na técnica.
[0255] Ao criar linhagens celulares, prefere-se de modo geral que as linhagens celulares estáveis sejam preparadas. Para transfecção estável de células de mamífero, por exemplo, é conhecido que, dependendo da técnica de vetor e transfecção de expressão usada, apenas uma fração pequena de células pode integrar o DNA estranho em seu genoma. A fim de identificar e selecionar esses integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, para resistência a antibióticos) é, de modo geral, introduzido nas células hospedeiras juntamente do gene de interesse. Marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência a fármacos, como G418, higromicina ou metotrexato. Moléculas de ácido nucleico que codificam um marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor ou podem ser introduzidas em um vetor separado. Células estavelmente transfectadas com a molécula de ácido nucleico introduzida pode ser identificada por seleção de fármaco (por exemplo, células que incorporaram o gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto outras células morrerão).
[0256] Em uma modalidade, os construtos são descritos no presente documento integrados no genoma da célula hospedeira. Uma vantagem de integração estável é que a uniformidade entre células individuais ou clones é obtida. Outra vantagem é que a seleção dos melhores produtores pode ser realizada. Consequentemente, é desejável criar linhagens celulares estáveis. Em outra modalidade, os construtos são descritos no presente documento transfectados em uma célula hospedeira. Uma vantagem de transfectar os construtos na célula hospedeira é que os rendimentos de proteína podem ser maximizados. Em um aspecto, é descrita uma célula que compreende o construto de ácido nucleico ou o vetor descrito no presente documento. Composições Farmacêuticas e Formulações
[0257] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica e formulações são descritos no presente documento administradas a um indivíduo por múltiplas vias de administração, incluindo, porém sem limitação, vias de administração parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular), intracerebral, oral, intranasal, bucal, retal, sublingual ou transdérmica.
[0258] Em algumas modalidades, as formulações farmacêuticas incluem, porém sem limitação, dispersões líquidas aquosas, dispersões autoemulsificantes, soluções sólidas, dispersões lipossômicas, aerossóis, formas de dosagem sólidas, pós, formulações de liberação imediata, formulações de liberação controlada, formulações de fusão rápida, comprimidos, cápsulas, pílulas, formulações de liberação atrasada, formulações de liberação estendida, formulações de liberação pulsátil, formulações de multiparticulados (por exemplo, formulações de nanopartículas), e formulações de liberação imediata e controlada misturada.
[0259] Em algumas modalidades, as formulações farmacêuticas incluem um carreador ou materiais carreadores selecionados com base na compatibilidade com a composição revelada no presente documento, e as propriedades de perfil de liberação da forma de dosagem desejada. Materiais carreadores exemplificativos incluem, por exemplo, ligantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração, agentes de carga, tensoativos, solubilizantes, estabilizantes, lubrificantes, agentes umectantes, diluentes, e similares. Materiais carreadores farmaceuticamente compatíveis incluem, porém sem limitação, acácia, gelatina, dióxido de silício coloidal, glicerofosfato de cálcio, lactato de cálcio, maltodextrina, glicerina, silicato de magnésio, polivinilpirrolidona (PVP), colesterol, ésteres de colesterol, caseinato de sódio, lecitina de soja, ácido taurocólico, fosfotidilcolina, cloreto de sódio, fosfato tricálcico, fosfato dipotássico, celulose e conjugados de celulose, açúcares, estearoil lactilato de sódio, carragena, monoglicerídeo, diglicerídeo, amido pré-gelatinizado e semelhantes. Consultar, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Décima nona Edição (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995), Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975, Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Nova York, N.Y., 1980, e Pharmaceutical Dosage Forms and Drug
Delivery Systems, Sétima Edição. (Lippincott Williams & Wilkins1999).
[0260] Em alguns casos, a composição farmacêutica é formulada como um imunolipossomo, que compreende uma pluralidade de conjugados de IL-2 ligados direta ou indiretamente a bicamada de lipídeo de lipossomos. lipídeos exemplificativos incluem, porém sem limitação, ácidos graxos; fosfolipídeos; esteróis como colesteróis; esfingolipídeos como esfingomielina; glicoesfingolipídeos como gangliosídeos, globocídeos, e cerebrosídeos; aminas de tensoativo como estearila, oleila e aminas de linoleila. Em alguns exemplos, o lipídeo compreende um lipídeo catiônico. Em alguns exemplos, o lipídeo compreende um fosfolipídeo. Fosfolipídeos exemplificativos incluem, porém sem limitação, ácido fosfatídico (“PA”), fosfatidilcolina (“PC”), fosfatidilglicerol (“PG”), fosfatidiletanolamina (“PE”), fosatidilinositol (“PI”), e fosfatidilserina (“PS”), esfingomielina (incluindo esfingomielina cerebral), lecitina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, cerebrosídeos, diaraquidoilfosfatidilcolina (“DAPC”), didecanoil-L-alfa-fosfatidilcolina (“DDPC”), dielaidoilfosfatidilcolina (“DEPC”), dilauroilfosfatidilcolina (“DLPC”), dilinoleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina (“DMPC”), dioleoilfosfatidilcolina (“DOPC”), dipalmitoilfosfatidilcolina (“DPPC”), distearoilfosfatidilcolina (“DSPC”), 1-palmitoil-2-oleoil- fosfatidilcolina (“POPC”), diaraquidoilfosfatidilglicerol (“DAPG”), didecanoil-L-alfa-fosfatidilglicerol (“DDPG”), dielaidoilfosfatidilglicerol (“DEPG”),
dilauroilfosfatidilglicerol (“DLPG”), dilinoleoilfosfatidilglicerol, dimiristoilfosfatidilglicerol (“DMPG”), dioleoilfosfatidilglicerol (“DOPG”), dipalmitoilfosfatidilglicerol (“DPPG”), distearoilfosfatidilglicerol (“DSPG”), 1-palmitoil-2- oleoil-fosfatidilglicerol (“POPG”), diaraquidoilfosfatidiletanolamina (“DAPE”), didecanoil-L- alfa-fosfatidiletanolamina (“DDPE”), dielaidoilfosfatidiletanolamina (“DEPE”), dilauroilfosfatidiletanolamina (“DLPE”), dilinoleoilfosfatidiletanolamina, dimiristoilfosfatidiletanolamina (“DMPE”), dioleoilfosfatidiletanolamina (“DOPE”), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (“DPPE”), distearoilfosfatidiletanolamina (“DSPE”), 1-palmitoil-2- oleoil-fosfatidiletanolamina (“POPE”), diarachidoilfosfatidilinositol (“DAPI”), didecanoil-L-alfa- fosfatidilinositol (“DDPI”), dielaidoilfosfatidilinositol (“DEPI”), dilauroilfosfatidilinositol (“DLPI”), dilinoleoilfosfatidilinositol, dimiristoilfosfatidilinositol (“DMPI”), dioleoilfosfatidilinositol (“DOPI”), dipalmitoilfosfatidilinositol (“DPPI”), distearoilfosfatidilinositol (“DSPI”), 1-palmitoil-2- oleoil-fosfatidilinositol (“POPI”), diaraquidoilfosfatidilserina (“DAPS”), didecanoil-L-alfa- fosfatidilserina (“DDPS”), dielaidoilfosfatidilserina (“DEPS”), dilauroilfosfatidilserina (“DLPS”), dilinoleoilfosfatidilserina, dimiristoilfosfatidilserina
(“DMPS”), dioleoilfosfatidilserina (“DOPS”), dipalmitoilfosfatidilserina (“DPPS”), distearoilfosfatidilserina (“DSPS”), 1-palmitoil-2-oleoil- fosfatidilserina (“POPS”), esfingomielina de diaraquidoíla, esfingomielina de didecanoíla, esfingomielina de dielaidoíla, esfingomielina de dilauroíla, esfingomielina de dilinoleoíla, esfingomielina de dimiristoíla, esfingomielina, esfingomielina de dioleoíla, esfingomielina de dipalmitoíla, esfingomielina de distearoíla e 1- palmitoil-2-oleoil-esfingomielina.
[0261] Em alguns exemplos, as formulações farmacêuticas incluem adicionalmente agentes de ajuste de pH ou agentes de tamponamento que incluem ácidos como ácidos acético, bórico, cítrico, láctico, fosfórico e clorídrico, bases como hidróxido de sódio, fosfato de sódio, borato de sódio, citrato de sódio, acetato de sódio, lactato de sódio e tris-hidroximetilaminometano, e tampões como citrato/dextrose, bicarbonato de sódio e cloreto de amônio. Tais ácidos, bases e tampões são incluídos em uma quantidade exigida para manter pH da composição em uma faixa aceitável.
[0262] Em alguns exemplos, a formulação farmacêutica inclui um ou mais sais em uma quantidade exigida para levar osmolalidade da composição a uma faixa aceitável. Tais sais incluem aqueles que têm cátions e cloreto de sódio, potássio ou amônio, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, ânions de tiossulfato ou bissulfito, em que sais adequados incluem cloreto de sódio, cloreto de potássio, tiossulfato de sódio, bissulfito de sódio e sulfato de amônio.
[0263] Em algumas modalidades, as formulações farmacêuticas incluem, porém sem limitação, açúcares como trealose, sacarose, manitol, maltose, glucose, ou sais como potássio fosfato, citrato de sódio, sulfato de amônio e/ou outros agentes como heparina para aumentar a solubilidade e estabilidade in vivo de polipeptídeos.
[0264] Em alguns exemplos, as formulações farmacêuticas incluem adicionalmente diluentes que são usados para estabilizar compostos devido ao fato de os mesmos poderem fornecer um ambiente mais estável. Sais dissolvidos em soluções tampão (que também podem proporcionar controle ou manutenção do pH) são usados como diluentes no estado da técnica, incluindo, sem limitação, uma solução salina tamponada com fosfato. Em determinados exemplos, os diluentes aumentam o volume da composição para facilitar a compressão ou criar volume suficiente para mescla homogênea para carga de cápsula. Tais compostos podem incluir, por exemplo, lactose, amido, manitol, sorbitol, dextrose, celulose microcristalina como Avicel®, fosfato de cálcio dibásico, di-hidrato de fosfato de dicálcio, fosfato de tricálcio, fosfato de cálcio, lactose anidrosa, lactose seca por spray, amido pré-gelatinizado, açúcar compremível, como Di-Pac® (Amstar), manitol, hidroxipropilmetilcelulose, estearato de acetato de hidroxipropilmetilcelulose, diluentes à base de sacarose, açúcar de confeiteiro, mono- hidrato de sulfato de cálcio monobásico, di-hidrato de sulfato de cálcio, tri-hidrato de lactato de cálcio, dextratos, sólidos de cereal hidrolisado, amilose, celulose em pó, carbonato de cálcio, glicina, caulino, manitol, cloreto de sódio, inositol, bentonita e similares.
[0265] Em alguns casos, as formulações farmacêuticas incluem agentes de desintegração ou desintegrantes para facilitar a quebra ou desintegração de uma substância. O termo “desintegrar” inclui tanto a dissolução quanto a dispersão da forma de dosagem quando estiver em contato com fluido gastrointestinal. Exemplos de agentes de desintegração incluem um amido, por exemplo, um amido natural como amido de milho ou amido de batata, um amido pré-gelatinizado como National 1551 ou Amijel®, ou glicolato de amido de sódio como Promogel® ou Explotab®, uma celulose como um produto de madeira, celulose metilcristalina, por exemplo, Avicel®, Avicel® PH101, Avicel® PH102, Avicel® PH105, Elcema® P100, Emcocel®, Vivacel®, Ming Tia®, e Solka-Floc®, metilcelulose, croscarmelose, ou uma celulose reticulada, como carboximetilcelulose de sódio reticulada (Ac-Di-Sol®), carboximetilcelulose reticulada, ou croscarmelose reticulada, um amido reticulado como glicolato de amido de sódio, um polímero reticulado como crospovidona, uma polivinilpirrolidona reticulada, alginato como ácido algínico ou um sal de ácido algínico como alginato de sódio, uma argila como Veegum® HV (silicato de alumínio de magnésio), uma goma como ágar, guar, alfarroba, Karaya, pectina ou adragante, glicolato de amido de sódio, bentonita, uma esponja natural, um tensoativo, uma resina como uma resina de troca de cátion, polpa cítrica, lauril sulfato de sódio, lauril sulfato de sódio em combinação com amido e similares.
[0266] Em alguns exemplos, as formulações farmacêuticas incluem agentes de carga como lactose, carbonato de cálcio,
fosfato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico, sulfato de cálcio, celulose microcristalina, pó de celulose, dextrose, dextratos, dextrano, amidos, amido pré-gelatinizado, sacarose, xilitol, lactitol, manitol, sorbitol, cloreto de sódio, polietileno glicol e similares.
[0267] Lubrificantes e deslizantes também são opcionalmente incluídos nas formulações farmacêuticas descritas no presente documento para impedir, reduzir ou inibir a adesão ou atrito de materiais. Lubrificantes exemplificativos incluem, por exemplo, ácido esteárico, hidróxido de cálcio, talco, sódio estearil fumerato, um hidrocarboneto como óleo mineral ou óleo vegetal hidrogenado como óleo de soja hidrogenado (Sterotex®), ácidos graxos superiores e seus sais metal alcalino e metal alcalino-terroso, como alumínio, cálcio, magnésio, zinco, ácido esteárico, estearatos de sódio, glicerol, talco, ceras, Stearowet®, ácido bórico, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, leucina, um polietileno glicol (por exemplo, PEG-4000) ou um metoxipolietileno glicol como Carbowax™, oleato de sódio, benzoato de sódio, beenato de glicerila, polietileno glicol, lauril sulfato de magnésio ou sódico, sílica coloidal como Syloid™, Cab-O-Sil®, um amido como amido de milho, óleo de silicone, um tensoativo e similares.
[0268] Plastificantes incluem compostos usados para amolecer o material de microencapsulamento ou revestimentos de película para tornar os mesmos menos frágeis. Plastificantes adequados incluem, por exemplo, polietileno glicóis como PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350, e PEG 800, ácido esteárico, propileno glicol, ácido oleico,
trietil celulose e triacetina. Plastificantes também podem funcionar como agentes dispersante ou agentes umectantes.
[0269] Solubilizantes incluem compostos como triacetina, trietilcitrato, etil oleato, etil caprilato, lauril sulfato de sódio, docusato de sódio, vitamina E TPGS, dimetilacetamida, N-metilpirrolidona, N- hidroxietilpirrolidona, polivinilpirrolidona, celulose, hidroxipropil ciclodextrinas, etanol, n-butanol, álcool isopropílico, colesterol, sais biliares, polietilenoglicol 200-600, glicofurol, transcutol, propilenoglicol e dimetil isossorbida e similares.
[0270] Estabilizantes incluem compostos como quaisquer agentes de antioxidação, tampões, ácidos, conservantes e similares. Estabilizantes exemplificativos incluem cloridrato de L-arginina, trometamina, albumina (humana), ácido cítrico, álcool benzílico, fenol, di-hidrato de bifosfato dissódico, propileno glicol, metacresol ou m- cresol, acetato de zinco, polissorbato-20 ou Tween® 20, ou trometamol.
[0271] Agentes de suspensão incluem compostos como polivinilpirrolidona, por exemplo, polivinilpirrolidona K12, polivinilpirrolidona K17, polivinilpirrolidona K25, ou polivinilpirrolidona K30, copolímero de pirrolidona de vinila/acetato de vinila (S630), polietileno glicol, por exemplo, o polietileno glicol pode ter um peso molecular de cerca de 300 a cerca de 6000, ou cerca de 3350 a cerca de 4000, ou cerca de 7000 a cerca de 5400, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, estearato de acetato de hidroximetilcelulose, polissorbato-80, hidroxietilcelulose,
alginato de sódio, gomas como, por exemplo, goma de tragacanto e goma acácia, goma guar, xantanas, incluindo goma xantana, açúcares, celulósicos como, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose, polissorbato-80, alginato de sódio, monolaurato de sorbitano polietoxilado, monolaurato de sorbitano polietoxilado, povidona e similares.
[0272] Tensoativos incluem compostos como lauril sulfato de sódio, docusato de sódio, Tween 60 ou 80, triacetina, vitamina E TPGS, mono-oleato de sorbitano, mono-oleato de polioxietileno sorbitano, polissorbatos, poloxâmeros, sais biliares, monoestearato de glicerila, copolímeros de óxido de etileno e óxido de propileno, por exemplo, Pluronic® (BASF) e similares. Tensoativos adicionais incluem glicerídeos de ácido graxo de polioxietileno e óleos vegetais, por exemplo, polioxietileno (60) óleo rícino hidrogenado, e alquiléteres de polioxietileno e éteres de alquilfenila, por exemplo, octoxinol 10, octoxinol 40. Algumas vezes, os tensoativos são incluídos para melhorar a estabilidade física, ou para outros fins.
[0273] Agentes de melhoria de viscosidade incluem, por exemplo, metil celulose, goma de xantana, carboximetil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropilmetil celulose, estearato de acetato de hidroxipropilmetil celulose, ftatalato de hidroxipropilmetil celulose, carbômero, álcool polivinílico, alginatos, acácia, quitosanos e combinações dos mesmos.
[0274] Agentes umectantes incluem compostos como ácido oleico, monostearato de glicerila, mono-oleato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, mono-oleato de sorbitano de polioxietileno, monolaurato de sorbitano de polioxietileno, docusato de sódio, oleato de sódio, lauril sulfato de sódio, docusato de sódio, triacetina, Tween 80, vitamina E TPGS, sais de amônio e similares. Regimes Terapêuticos
[0275] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são descritas no presente documento administrada para aplicações terapêuticas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada uma vez por dia, duas vezes por dia, três vezes por dia ou mais. A composição farmacêutica é administrada diariamente, todos os dias, em dias alternados, cinco dias por semana, uma vez por semana, quinzenalmente, duas semanas por mês, três semanas por mês, uma vez por mês, duas vezes por mês, três vezes por mês ou mais. A composição farmacêutica é administrada por pelo menos 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 18 meses, 2 anos, 3 anos ou mais.
[0276] No caso em que o estado do paciente não melhora, mediante a vontade do médico, a administração da composição é dada continuamente, de modo alternativo, a dose da composição que é administrada é temporariamente reduzida ou temporariamente suspensa por um determinado período de tempo (isto é, uma “interrupção do fármaco”). Em alguns exemplos, a duração da interrupção do tratamento varia entre 2 dias e 1 ano, incluindo apenas a título de exemplo, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 10 dias, 12 dias, 15 dias, 20 dias, 28 dias, 35 dias, 50 dias, 70 dias, 100 dias, 120 dias, 150 dias, 180 dias, 200 dias, 250 dias, 280 dias, 300 dias, 320 dias, 350 dias ou 365 dias. A redução da dose durante um período de descanso do tratamento é de 10 %-100 %, incluindo, por exemplo, apenas 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 %.
[0277] Após a melhora das afecções do paciente ter ocorrido, uma dose de manutenção é administrada se necessário. Posteriormente, a dosagem ou a frequência de administração, ou ambas, podem ser reduzidas, em função dos sintomas, a um nível em que a melhora da doença, transtorno ou afecção seja mantida.
[0278] Em algumas modalidades, a quantidade de um determinado agente que corresponde a tal quantidade varia dependendo de fatores como o composto particular, a gravidade da doença, a identidade (por exemplo, peso) do indivíduo ou hospedeiro que necessita de tratamento, mas, não obstante, é rotineiramente determinado de maneira conhecida técnica, de acordo com circunstâncias particulares que envolvem o caso, incluindo, por exemplo, o agente específico que é administrado, da via de administração e do indivíduo ou hospedeiro que é tratado. Em alguns exemplos, a dose desejada é convenientemente apresentada em uma dose única ou como doses divididas administradas simultaneamente (ou durante um curto período de tempo) ou em intervalos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais subdoses por dia.
[0279] As faixas supracitadas são meras sugestões, visto que o número de variáveis com relação a um regime de tratamento individual é grande, e excursões consideráveis desses valores recomendados não são incomuns. Tais dosagens são alteradas dependendo de inúmeras variáveis, não limitadas à atividade do composto usado, à doença ou afecção a ser tratada, ao modo de administração, aos requisitos do indivíduo, à gravidade da doença ou afecção a ser tratada e ao julgamento do médico.
[0280] Em algumas modalidades, toxicidade e a eficácia terapêutica de tais regimes terapêuticos são determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, incluindo, porém, sem limitação, a determinação do LD50 (a dose letal para 50 % da população) e de ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50 % da população). A razão de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e é expressa como a razão entre LD50 e ED50. Os compostos que exibem índices terapêuticos altos são preferenciais. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura celular e estudos animais são usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em seres humanos. A dosagem de tais compostos se situa, de preferência, em uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com toxicidade mínima. A dosagem varia dentro dessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração usada. Kits/Artigo de Fabricação
[0281] São revelados no presente documento, em determinadas modalidades, kits e artigos de fabricação para uso com um ou mais métodos e composições descritos no presente documento. Tais kits incluem um carreador, pacote, ou recipiente que é compartimentalizado para receber um ou mais recipientes como frascos, tubos e semelhantes, em que cada um dentre os recipientes compreende um dentre os elementos separados a serem usados em um método descrito no presente documento. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Em uma modalidade, os recipientes são formados a partir de uma variedade de materiais como vidro ou plástico.
[0282] Os artigos de manufatura proporcionados no presente documento contêm materiais de embalagem. Exemplos de materiais de embalagem farmacêutica incluem, sem limitação, embalagens em blister, garrafas, tubos, sacos, recipientes, garrafas e qualquer material de embalagem adequado para uma formulação selecionada e um modo de administração e tratamento pretendido.
[0283] Por exemplo, o(s) recipiente(s) incluem um ou mais dos polipeptídeos de citocina (por exemplo, IL-2) ou conjugados de citocina (por exemplo, IL-2) revelados no presente documento, e opcionalmente um ou mais excipientes farmacêuticos descritos no presente documento para facilitar a entrega de polipeptídeos de citocina (por exemplo, IL-2) ou conjugados de citocina (por exemplo, IL- 2). Tais kits incluem opcionalmente, ademais, uma descrição ou rótulo de identificação ou instruções relacionadas a seus usos nos métodos descritos no presente documento.
[0284] Um kit inclui tipicamente rótulos que listam conteúdos e/ou instruções para uso, e insertos de pacote com instruções para uso. Um conjunto de instruções também será tipicamente incluído.
[0285] Em uma modalidade, um rótulo está ligado ou associado ao recipiente. Em uma modalidade, um rótulo está em um recipiente quando letras, números ou outros caracteres que formam um rótulo estiverem fixados, moldados ou gravados no próprio recipiente, um rótulo é associado a um recipiente quando o mesmo for apresentado em um receptáculo ou transportador que retém o recipiente, por exemplo, como um inserto de pacote. Em uma modalidade, é usado um rótulo para indicar que os conteúdos devem ser usados para uma aplicação terapêutica específica. O rótulo também indica as instruções de uso dos conteúdos, tal como nos métodos descritos no presente documento.
[0286] Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas são apresentadas em um pacote ou um dispositivo dosador que contém uma ou mais formas de dosagem unitária contendo um composto proporcionado no presente documento. O pacote, por exemplo, contém folha metálica ou plástica, como um pacote em blister. Em uma modalidade, o pacote ou dispositivo dosador é acompanhado de instruções para administração. Em uma modalidade, o pacote ou dosador também é acompanhado de uma notificação associada ao recipiente na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, cuja notificação reflete a aprovação pela agência da forma do fármaco para administração humana ou veterinária. Tal notificação, por exemplo, é a rotulagem aprovada pela US Food and Drug Administration para medicamentos ou o folheto aprovado para o produto. Em uma modalidade, as composições que contêm um composto proporcionado no presente documento, formulado em um veículo farmacêutico compatível, colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de uma afecção indicada. Determinadas Terminologias
[0287] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos do presente documento têm o mesmo significado comumente entendido por um versado na técnica a que a matéria pertence. Deve ser entendido que a descrição detalhada é exemplificativa e explicativa apenas e não é restritiva de qualquer matéria reivindicada. Nesse pedido, o uso do singular inclui o plural, exceto se for especificamente declarado de outro modo. Deve ser observado que, como usado no relatório específico, as formas singulares “um”, “uma” e “o” incluem referentes no plural, exceto se o contexto claramente ditar de outro modo. Neste pedido, o uso de “ou” significa “e/ou” exceto quando especificado o contrário. Ademais, o uso do termo “que inclui”, bem como outras formas, como “incluir”, “inclui” e “incluído”, não é limitante.
[0288] Embora diversos recursos da invenção possam ser descritos no contexto de uma única modalidade, os recursos também podem ser fornecidos separadamente ou em qualquer combinação adequada. Por outro lado, embora a invenção possa ser descrita no presente documento no contexto de modalidades separadas para clareza, a invenção também pode ser implantada em uma única modalidade.
[0289] A referência no relatório descritivo a “algumas modalidades”, “uma (artigo indefinido) modalidade”, “uma (numeral) modalidade” ou “outras modalidades” significa que um recurso, estrutura ou característica particulares descritos em conexão às modalidades é incluída em pelo menos algumas modalidades, mas não necessariamente a todas as modalidades, das invenções.
[0290] Como usado no presente documento, faixas e quantidades podem ser expressas como “cerca de” um valor ou uma faixa particular. Cerca de também inclui a quantidade exata. Desse modo, “cerca de 5 µl” significa “cerca de 5 µl” e também “5 µl”. De modo geral, o termo “cerca de” inclui uma quantidade que seria esperada no erro experimental, por exemplo, em 15 %, 10 %, ou 5 %.
[0291] Os títulos de seção usados no presente documento são para propósitos organizacionais apenas e não devem ser interpretados como limitantes da matéria descrita.
[0292] Como usado no presente documento, os termos “individuo(s)”, “sujeito(s)” e “paciente(s)” significa qualquer mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um humano. Em algumas modalidades, o mamífero é um não humano. Nenhum dentre os termos exige ou são limitados a situações caracterizadas pela supervisão (por exemplo, constante ou intermitente) de um trabalhador de cuidados de saúde (por exemplo, um doutor, uma enfermeira registrada, uma enfermeira clínica, um assistente de médico, um trabalhador regular ou de um hospício).
[0293] Como usado no presente documento, o termo “significativo” ou “de modo significativo” em referência à afinidade de ligação significa uma alteração na afinidade de ligação da citocina (por exemplo, polipeptídeo de IL-2) suficiente para impactar a ligação da citocina (por exemplo, polipeptídeo de IL-2) a um receptor-alvo. Em alguns exemplos, o termo se refere a uma alteração de pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais. Em alguns exemplos, o termo significa uma alteração de pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes, 1000 vezes ou mais.
[0294] Em alguns exemplos, o termo “significativo” ou “de modo significativo” em referência a ativação de umas ou mais populações celulares por meio de um complexo de sinalização de citocina significa uma alteração suficiente para ativar a população celular. Em alguns casos, a alteração para ativar a população celular é medida como uma potência de sinalização de receptor. Em tais casos, um valor de EC50 pode ser fornecido. Em outros casos, um valor de ED50 pode ser fornecido. Em casos adicionais, uma concentração ou dosagem da citocina pode ser fornecida.
[0295] Como usado no presente documento, o termo “potência” se refere à quantidade de uma citocina (por exemplo, polipeptídeo de IL-2) exigida para produzir um efeito-alvo. Em alguns exemplos, o termo “potência” se refere à quantidade de citocina (por exemplo, polipeptídeo de IL-2) exigida para ativar um receptor-alvo de citocina (por exemplo, receptor de IL-2). Em outros exemplos, o termo “potência” se refere à quantidade de citocina (por exemplo, polipeptídeo de IL-2) exigida para ativar uma população celular alvo. Em alguns casos, a potência é medida como ED50 (Dose Eficaz 50), ou a dose exigida para produzir 50 % de um efeito máximo. Em outros casos, potência é medida como EC50 (Concentração Eficaz 50), ou a dose exigida para produzir o efeito-alvo em 50 % da população.
EXEMPLOS
[0296] Esses exemplos são fornecidos para fins ilustrativos apenas e não para limitar o escopo das reivindicações fornecidas no presente documento. EXEMPLO 1
[0297] Ensaios de Dimerização de Receptor Quinase e Citocina
[0298] Manuseio Celular
[0299] Linhagens celulares PathHunter foram expandidas a partir de estoques do congelador, de acordo com procedimentos padrão. As células foram semeadas em um volume total de 20 µl em microplacas de 384 poços com parede branca e incubadas pelo período de tempo adequado antes do teste.
[0300] Formato Agonista
[0301] Para determinação de agonista, as células foram incubadas com amostra para induzir resposta. A diluição intermediária de estoques de amostra foi realizada para gerar amostra 5X em tampão de ensaio. Cerca de 5 µl de amostra 5X foram adicionados às células e incubados a 37 °C por 6 a 16 horas dependendo do ensaio. A concentração de veículo foi de 1 %.
[0302] Detecção de Sinal
[0303] O sinal de ensaio foi gerado através de uma única adição de 12,5 ou 15 µl (50 % em v/v) de coquetel de reagente de Detecção PathHunter para ensaios de agonista e antagonista, respectivamente, seguido por uma incubação de uma hora em temperatura ambiente. Para alguns ensaios, a atividade foi detectada com o uso de um reagente de detecção de alta sensibilidade (Kit Flash PathHunter) para aprimorar o desempenho de ensaio. Nesses ensaios, um volume igual de reagente de detecção (25 ou 30 ul) foi adicionado aos poços, seguido por uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. Microplacas foram lidas seguindo a geração de sinal com um instrumento PerkinElmer EnvisionTM para a detecção de sinal quimioluminescente.
[0304] Análise de Dados
[0305] A atividade de composto foi analisada com o uso de pacote de análise dados de CBIS (ChemInnovation, CA). Para ensaios de modo agonista, a atividade de porcentagem foi calculada com o uso da seguinte fórmula: % de Atividade = 100 % x (RLU médio de amostra de teste - RLU médio de controle de veículo) / (ligante de controle de RLU MÁX médio - RLU médio de controle de veículo).
[0306] Para ensaios de modo antagonista, a inibição de porcentagem foi calculada com o uso da seguinte fórmula: % de Inibição =100 % x (1 - (RLU médio de amostra de teste - RLU médio de controle de veículo) / (RLU médio de controle de EC80 - RLU médio de controle de veículo)). EXEMPLO 2
[0307] Perfil de resposta imunológica ex-vivo de compostos de IL-2 exemplificativos em amostras de PBMC derivadas de (LRS) de sistema de redução de leucócito humano primário
[0308] Para determinar como a especificidade de receptor diferencial de compostos de IL-2 exemplificativos afeta a ativação de subpopulações celulares imunes primárias, o perfil de resposta à concentração de ativação de linfócito em amostras de célula mononuclear de sangue periférico (PBMC) derivadas de LRS humano foram realizadas com o uso de citometria de fluxo de múltiplas cores. Esses estudos foram realizados em PrimityBio LLC (Fremont, CA).
Linfócitos primários derivados de amostras de LRS humanas foram tratados com diluições em série de compostos de IL-2 exemplificativos e quantificados com base na sinalização de pSTAT5 em cada tipo de célula linfócito com o uso do painel mostrado na Tabela 1.
Marcador População celular CD3 Células T CD4 Células Th CD8 Células T efetoras CD45RA Células T naive CD56 Células NK CD14/19 Monócito/células B CD25 Célula Tregs ou T experimentada CD127 Não Treg CD62L Memória T vs célula T de memória efetora pSTAT5 (Y694) Marcador de ativação
[0309] Dados de citometria de fluxo foram analisados para ativação de subconjuntos de célula T e NK diferentes em modo de resposta à concentração, leitura de acúmulo de pSTAT5 após tratamento com uma variante de IL-2 K9_30kD exemplificativa.
[0310] As Fig. 4A-Fig. 4B mostram as curvas de resposta à dose para sinalização de pSTAT5 em célula primária de LRS humano (Fig. 4A) e resposta à proliferação em populações de CTLL-2 de camundongo (Fig. 4B).
[0311] A Tabela 2 mostra a resposta de dose EC50 para sinalização de pSTAT5 (EC50) em amostras de LRS humanas ou proliferação de CTLL-2 tratada com variante de IL-2 indicada. Aumento de vezes em Treg EC50 Células Células Células Razão de vs IL-2 Proliferação Composto NK CD8+ Treg CD8+/Treg nativa de CTLL-2 IL-2 nativa 4586 31024 75 414 1 455,8 K9_30kD 169578 1100679 2217 496 30 504 H16_30kD 2545257 12070108 34976 345 466 80755 L19_30kD 6756768 22436430 93205 241 1243 3510 D20_30kD 2643930 9505217 1129455 8 15059 689939 M23_30kD 143620 539824 1030 524 14 1102 N26_30kD 258531 1188859 2459 483 33 2594 N88_30kD 3298113 11111537 323201 34 4309 66606 E100_30kD 35088 195823 483 405 6 1676 N119_30kD 34010 143380 535 268 11 1215 T123_30kD 33396 152928 269 569 6 255 Q126_30kD 3676807 19722480 29454 670 393 3584 S127_30kD 20210 92190 150 615 3 123 T131_30kD 24207 132922 258 515 3 641 N88R/D109_30kD 2780819 12503386 175805 71 3663 59577 V91K 20537 102255 142 720 3 99,5 N88R 2312847 15025734 11082 1356 148 363
[0312] Os valores de EC50 (pg/ml) foram calculados a partir de curvas de resposta de dose geradas a partir das plotagens de MFI.
[0313] *Alteração de potência de Treg em comparação a IL-2 nativa (IL-2 do tipo selvagem) executada em cada experimento individual.
EXEMPLO 3
[0314] Estudo de PK em Camundongos C57BL/6 que Portam Tumor
[0315] Os detalhes experimentais são resumidos na Tabela
3. Grupo Número de Artigo de Via, Regime Ponto(s) Animais Teste/Controle de Dosagem Final(is) (dose) 1 9 IL-2 Nativa (do IV, dose Coleta tipo selvagem) única no Dia sanguínea a (3,0 mg/kg) 0 a T=0 a 0,08, 0,25, Concentração: 5 ml/kg 0,5, 1, 2, 4, 0,6 mg/ml 8,12 e 24 horas 2 9 K35_30kD IV, dose após dose (3,0 mg/kg) única no Dia Concentração: 0 a T=0 a 0,6 mg/ml 5 ml/kg 3 9 K35_30kD IV, dose (0,3 mg/kg) única no Dia Concentração: 0 a T=0 a 0,6 mg/ml 5 ml/kg Extra 6 N/A N/A Coleta de Matriz Bruta (sem duração específica) Total 33
[0316] As propriedades farmacocinéticas de um composto de IL-2 PEGilatado exemplificativo K35_30kD em dois níveis de dose foram avaliados. O artigo de teste liofilizado foi reconstituído em PBS, e nove camundongos C57BL/6 machos foram dosados com 0,3 e 3 mg/kg por meio de injeção intravenosa em veia de cauda para cada grupo de dose
(consultar detalhes de coleta abaixo). Amostras sanguíneas foram coletadas em 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas após a dose. O kit ELISA de hIL-2 da Abcam (ab100566), que não reticula com IL-2 de camundongo nativo, foi usado para detecção e quantificação de artigos de teste. Para ajustar para diferenças específicas de ELISA em sensibilidade de detecção de kit de compostos nativos e PEGilatados, curvas de artigo de teste de IL-2 nativa e K35_30kD foram geradas com o uso do tampão de diluente de artigo de teste, e os dados foram analisados com relação às respectivas curvas padrão. Os dados plotados representam a média e SEM de três amostras individuais (réplicas biológicas) como descrito acima, e parâmetros de PK para artigos de teste de K35_30kD foram extraídos e resumidos na Tabela 4.
Dose 0,3 mg/kg 3 mg/kg Analito Parâmetro Unidade Estimativa IL-2 K35-mPEG30kD Tmáx hr 0,250 0,250 Cmáx ng/ml 6080 57700 AUCo-t hr*/ng/ml 38500 425000 2 R 0,994 0,947 AUC½extrap % 35,3 37,4 AUC0-∞ h*ng/ml 59600 679000 t1/2 hr 18,2 19,5 Cmáx/D kg*ng/ml/mg 20300 19200 AUCo-t/D hr*ng/ml 128000 142000
[0317] A Fig. 5 mostra perfil de K35_30kD em duas concentrações diferentes. Seus perfis de PK são comparados a IL-2 do tipo selvagem. EXEMPLO 4
[0318] A Tabela 5 ilustra sequências de IL-2 descritas no presente documento. Nome Sequência SEQ ID NO: IL-2 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL 1 (homo sapiens) TRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNL (forma madura) AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYA
DETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT IL-2 MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEH 2 (homo sapiens) LLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATE (precursor) LKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISN nº de Acesso de INVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF NCBI: CQSIISTLT AAB46883.1
[0319] Embora as modalidades preferenciais da presente invenção tenham sido apresentadas e descritas no presente documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas apenas por meio de exemplo. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora para aqueles versados na técnica sem se distanciar da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas às modalidades da invenção descritas no presente documento podem ser empregues na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam cobertos por elas.

Claims (77)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo de interleucina 2 (IL-2) isolada e modificada caracterizado por compreender pelo menos um aminoácido não natural em uma posição que reduz a potência de sinalização de receptor para receptor βγ de interleucina 2 (IL-2Rβγ) ou reduz um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ, mas retém ativação significativa de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ), em que a potência de sinalização de receptor reduzida é comparada à potência de sinalização de receptor entre um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem e IL-2Rβγ, e em que o recrutamento é comparado a um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ por um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
2. Polipeptídeo de interleucina 2 (IL-2) isolada e modificada caracterizado por compreender pelo menos um aminoácido não natural em uma posição que aumenta um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rα para o polipeptídeo de IL-2 que resulta na ativação de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ), em que o aumento no recrutamento é comparado a um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rα por um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
3. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53,
H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, R81, P82, R83, D84, S87, N88, N89, V91, I92, L94, E95, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, T113, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132 e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1.
4. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, Q11, L12, E15, H16, L18, L19, D20, Q22, M23, N26, R81, D84, S87, N88, V91, I92, L94, E95, E116, N119, R120, T123, A125, Q126, S127, S130, T131, L132, e T133, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1.
5. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de P2, T3, S4, S5, S6, T7, G27, N29, N30, Y31, K32, K35, T37, M46, K47, K48, A50, T51, E52, K53, H55, Q57, E60, E67, N71, Q74, S75, K76, N77, F78, H79, P82, R83, N89, K97, G98, S99, E100, T101, T102, F103, M104, C105, E106, Y107, A108, D109, E110, T111, A112, e T113, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1.
6. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, D84, N88, E95, e Q126, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1.
7. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de K8, K9, e H16, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1.
8. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de Q22, N26, N88, e Q126, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1.
9. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de E15, D20, D84, e E95, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1.
10. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de L12, L19, e M23, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1.
11. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a posição do pelo menos um aminoácido não natural é selecionada a partir de Q22 e N26, em que a numeração dos resíduos de aminoácido se corresponde a SEQ ID NO: 1.
12. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um aminoácido não natural:
• é um análogo de lisina; • é um análogo de cisteína ou um análogo de histidina; • compreende uma cadeia lateral aromática; • compreende um grupo azido; • compreende um grupo alcino; ou • compreende um grupo aldeído ou cetona.
13. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um aminoácido não natural não compreende uma cadeia lateral aromática.
14. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um aminoácido não natural compreende N6-azidoetoxi-L-lisina(AzK), N6-propargiletoxi-L-lisina (PraK), BCN-L-lisina, lisina de norborneno, TCO-lisina, lisina de metiltetrazina, aliloxicarbonilisina, ácido 2- amino-8-oxononanoico, ácido 2-amino-8-oxo-octanoico, p- acetil-L-fenilalanina, p-azidometil-L-fenilalanina (pAMF), p-iodo-L-fenilalanina, m-acetilfenilalanina, ácido 2-amino- 8-oxononanoico, p-propargiloxifenilalanina, p-propargil- fenilalanina, 3-metil-fenilalanina, L-Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-acil-L-fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, p- bromofenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, isopropil-L- fenilalanina, O-aliltirosina, O-metil-L-tirosina, O-4-alil- L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, fosfonotirosina, tri-O- acetil-GlcNAcp-serina, L-fosfosserina, fosfonosserina, L-3- (2-naftil)alanina, ácido 2-amino-3-((2-((3-(benziloxi)-3- oxopropil)amino)etil)selanil)propanoico, ácido 2-amino-3- (fenilselanil)propanoico, ou selenocisteína.
15. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um aminoácido não natural é incorporado no polipeptídeo de IL-2 modificada por um par de tRNA sintetase/tRNA ortogonal.
16. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato que o tRNA ortogonal do par sintetase/tRNA ortogonal compreende pelo menos uma nucleobase não natural.
17. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, sendo o polipeptídeo de IL-2 modificada caracterizado por ser covalentemente fixado a uma fração de conjugação através do pelo menos um aminoácido não natural.
18. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a fração de conjugação compreende um polímero solúvel em água, um lipídeo, uma proteína ou um peptídeo.
19. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polímero solúvel em água compreende polietileno glicol (PEG), poli(propileno glicol) (PPG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, poliol poli(oxietilado), álcool poli(olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacarídeos), ácido poli(α-hidróxi), álcool poli(vinila), polifosfazeno, polioxazolinas (POZ), poli(N-acriloilmorfolina), ou uma combinação dos mesmos.
20. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polímero solúvel em água compreende uma molécula de PEG.
21. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a molécula de PEG é um PEG linear.
22. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a molécula de PEG é um PEG ramificado.
23. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polímero solúvel em água compreende um polissacarídeo.
24. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo compreende dextrano, ácido polissiálico (PSA), ácido hialurônico (HA), amilose, heparina, sulfato de heparano (HS), dextrina ou amido de hidroxietila (HES).
25. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o lipídeo compreende um ácido graxo.
26. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende de cerca de 6 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 24 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 22 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 20 átomos de carbono, de cerca de 6 a cerca de 18 átomos de carbono, de cerca de 20 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 26 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 24 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 22 átomos de carbono, de cerca de 12 a cerca de 20 átomos de carbono, ou de cerca de 12 a cerca de 18 átomos de carbono.
27. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é um ácido graxo saturado.
28. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a proteína compreende uma albumina, uma transferrina ou uma transtiretina.
29. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a proteína compreende um anticorpo ou seus fragmentos de ligação do mesmo.
30. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seus fragmentos de ligação do mesmo compreende uma porção de Fc de um anticorpo.
31. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 18, em que o peptídeo é caracterizado por compreender um peptídeo de XTEN, um polímero de homoaminoácido rico em glicina (HAP), um polipeptídeo de PAS, um polipeptídeo semelhante à elastina (ELP), um peptídeo de CTP, ou um polímero de proteína semelhante à gelatina.
32. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a fração de conjugação é indiretamente ligada ao pelo menos um aminoácido não natural da IL-2 modificada através de um ligante.
33. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende um ligante homobifuncional, um ligante heterobifuncional, um ligante de comprimento zero, um ligante dipeptídeo clivável ou um não clivável, um grupo maleimida, um espaçador, ou uma combinação dos mesmos.
34. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1, sendo o polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada caracterizado por ter uma diminuição em potência de sinalização de receptor para IL-2Rβγ, e a diminuição em potência de sinalização de receptor é de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou mais para IL-2Rβγ com relação a um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
35. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, sendo o polipeptídeo de IL-2 modificada caracterizado por ser: um fragmento funcionalmente ativo de um polipeptídeo de IL-2 de comprimento completo; um polipeptídeo de IL-2 recombinante; ou um polipeptídeo de IL-2 humana recombinante.
36. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, sendo o polipeptídeo de IL-2 modificada caracterizado por compreender uma deleção N-terminal, uma deleção C-terminal, ou uma combinação das mesmas.
37. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a deleção N-terminal compreende uma deleção dos primeiros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 ou 30 resíduos dos N-terminais, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1.
38. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a deleção C-terminal compreende uma deleção dos últimos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ou mais resíduos do C-terminal, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1.
39. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o fragmento funcionalmente ativo compreende região de IL-2 10-133, 20-133, 30-133, 10-130, 20-130, 30-130, 10- 125, 20-125, 30-125, 1-130 ou 1-125, em que as posições de resíduo são em referência às posições em SEQ ID NO: 1.
40. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, sendo o polipeptídeo de IL-2 modificada caracterizado por compreender cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1.
41. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de IL-2 modificada com a diminuição em potência de sinalização de receptor para IL-2Rβγ tem a capacidade para expandir células CD4+ T regulatórias (Treg).
42. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a fração de conjugação prejudica ou bloqueia a potência de sinalização de receptor de IL-2 com IL-2Rβγ, ou reduz o recrutamento da subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL- 2/IL-2Rβ.
43. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proliferação de célula Treg CD4+ pelo complexo de IL-2/IL-2Rαβγ modificada é equivalente ou maior que aquela de um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
44. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o complexo de IL-2/IL-2Rαβγ modificada induz a proliferação das células Treg CD4+ a uma população que é suficiente para modular um curso de doença em um modelo animal.
45. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, sendo o polipeptídeo de IL-2 modificada caracterizado por exibir uma primeira potência de sinalização de receptor para IL-2Rβγ e uma segunda potência de sinalização de receptor para IL-2Rαβγ, em que a primeira potência de sinalização de receptor é pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, ou inferior à segunda potência de sinalização de receptor.
46. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a primeira potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 modificada é inferior a uma potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem para IL-2Rβγ.
47. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a segunda potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 modificada é inferior a uma potência de sinalização de receptor do polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem para IL-2Rαβγ.
48. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 1, sendo o polipeptídeo de IL-2 modificada caracterizado por fornecer adicionalmente um aumento em um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rα para o polipeptídeo de IL-2 resultando na ativação de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ), em que o aumento em recrutamento é comparado a um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rα por um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
49. Polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada, de acordo com a reivindicação 2, sendo o polipeptídeo de IL-2 modificada caracterizado por fornecer adicionalmente uma diminuição em um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ para o complexo de IL-2/IL-2Rβ, em que o recrutamento reduzido é comparado a um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ e/ou subunidade de IL-2Rβ por um polipeptídeo de IL- 2 do tipo selvagem.
50. Proteína de ligação de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ) caracterizada pelo fato de que a potência de sinalização de receptor para um receptor βγ de interleucina 2 (IL-2Rβγ) da dita proteína de ligação é menor que aquela da IL-2 humana do tipo selvagem (hIL-2), e em que a dita proteína de ligação compreende pelo menos um aminoácido não natural.
51. Proteína de ligação de receptor αβγ de interleucina 2 (IL-2Rαβγ) caracterizada pelo fato de que um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ para um complexo de IL-2/IL-2Rβ pela dita proteína de ligação é menor que aquele da IL-2 humana do tipo selvagem (hIL-2), e em que a dita proteína de ligação compreende pelo menos um aminoácido não natural.
52. Proteína de ligação de IL-2Rαβγ conforme definida na reivindicação 50 ou 51, sendo a dita proteína de ligação caracterizada por ser um polipeptídeo de IL-2 modificada ou um fragmento funcionalmente ativo do mesmo, em que o polipeptídeo de IL-2 modificada compreende pelo menos um aminoácido não natural.
53. Complexo de IL-2/IL-2Rαβγ caracterizado por compreender um polipeptídeo de IL-2 modificada que compreende um aminoácido não natural e um IL-2Rαβγ, em que o polipeptídeo de IL-2 modificada tem uma potência de sinalização de receptor reduzida em direção a IL-2Rβγ, e em que a potência de sinalização de receptor reduzida é comparada a uma afinidade de ligação entre um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem e IL-2Rβγ.
54. Complexo de IL-2/IL-2Rαβγ caracterizado por compreender um polipeptídeo de IL-2 modificada que compreende um aminoácido não natural e um IL-2Rαβγ, em que um recrutamento de uma subunidade de IL-2Rβ para um complexo de IL-2/IL-2Rβ pelo dito polipeptídeo de IL-2 modificada é menor que aquele de um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
55. Complexo de IL-2/IL-2Rαβγ, de acordo com a reivindicação 53 ou 54, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de IL-2 modificada compreende adicionalmente uma fração de conjugação covalentemente fixada ao aminoácido não natural.
56. Ativador de célula Treg CD4+ caracterizado por expandir seletivamente células Treg CD4+ em uma população celular, em que o dito ativador compreende um polipeptídeo de IL-2 modificada que compreende pelo menos um aminoácido não natural.
57. Ativador de célula Treg CD4+, de acordo com a reivindicação 56, sendo o dito ativador caracterizado por expandir a célula T efetora CD8+ e/ou células Exterminadoras Naturais em menos que 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 % ou 0,1 % na população celular de CD3+ quando o dito ativador está em contato com a dita população celular de CD3+, com relação a uma expansão de célula T efetora CD8+ e/ou células Exterminadoras Naturais na população celular de CD3+ em contato com um polipeptídeo de IL-2 do tipo selvagem.
58. Ativador de célula Treg CD4+, de acordo com a reivindicação 56, sendo o dito ativador caracterizado por não expandir célula T efetora CD8+ e/ou células Exterminadoras Naturais.
59. Ativador de célula Treg CD4+, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a dita população celular é uma população celular in vivo.
60. Ativador de célula Treg CD4+, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a população celular é uma população celular in vitro.
61. Ativador de célula Treg CD4+, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a dita população celular é uma população celular ex vivo.
62. Composição farmacêutica caracterizada por compreender: um polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada conforme definido nas reivindicações 1-49, uma proteína de ligação de IL-2Rαβγ conforme definida nas reivindicações 50-52, ou uma célula Treg CD4+ conforme definida nas reivindicações 56-61; e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
63. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 62, sendo a composição farmacêutica caracterizada por ser formulada para entrega sistêmica.
64. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 62, sendo a composição farmacêutica caracterizada por ser formulada para administração parenteral.
65. Método para tratar uma doença ou um transtorno autoimune em um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado por compreender a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada conforme definido na reivindicação 1 ou 2, uma proteína de ligação de IL- 2Rαβγ conforme definida na reivindicação 50 ou 51, uma célula Treg CD4+ conforme definida na reivindicação 56, ou uma composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 62.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a doença ou o transtorno autoimune compreende alopecia areata, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, dermatomiosite, diabetes tipo 1, artrite idiopática juvenil, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, púrpura trombocitopênica idiopática, miastenia grave, esclerose múltipla, penfigo/penfigoide, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, polimiosite, cirrose biliar primária, psoríase, artrite reumatoide, escleroderma, síndrome de Sjögren, lúpus eritematoso sistêmico, tireoidite, uveíte, vitiligo ou granulomatose de Wegener.
67. Método, de acordo com a reivindicação 65 ou 66, caracterizado por compreender adicionalmente administrar um agente terapêutico adicional.
68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o conjugado de IL-2 e o agente terapêutico adicional são administrados simultaneamente.
69. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o conjugado de IL-2 e o agente terapêutico adicional são administrados sequencialmente.
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o conjugado de IL-2 é administrado antes do agente terapêutico adicional.
71. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o conjugado de IL-2 é administrado após a administração do agente terapêutico adicional.
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65-71, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
73. Método para expandir população celular de CD4+ regulatório T (Treg) caracterizado por compreender: colocar uma célula em contato com um polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada conforme definido na reivindicação 1 ou 2, uma proteína de ligação de IL- 2Rαβγ conforme definida na reivindicação 50 ou 51, uma célula Treg CD4+ conforme definida na reivindicação 56, ou uma composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 62, por um tempo suficiente para induzir a formação de um complexo com um IL-2Rαβγ estimulando, por meio disso, a expansão da população de célula Treg.
74. Método, de acordo com a reivindicação 73, sendo o método caracterizado por ser um método in vivo.
75. Método, de acordo com a reivindicação 73, sendo o método caracterizado por ser um método in vitro.
76. Método, de acordo com a reivindicação 73, sendo o método caracterizado por ser um método ex vivo.
77. Kit caracterizado por compreender um polipeptídeo de IL-2 isolada e modificada conforme definido nas reivindicações 1-49, uma proteína de ligação de IL-2Rαβγ conforme definida nas reivindicações 50-52, uma célula Treg CD4+ conforme definida nas reivindicações 56-61, ou uma composição farmacêutica conforme definida nas reivindicações 62-64.
BR112020002272-1A 2017-08-03 2018-08-03 conjugados de citocina para o tratamento de doenças autoimunes BR112020002272A2 (pt)

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