KR20220004134A - 서방형 사이토카인 컨쥬게이트 - Google Patents

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사무엘 제이. 파프
다니엘 브이. 산티
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프로린크스 엘엘시
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Abstract

본 발명은 일반적으로 방출형 사이토카인 컨쥬게이트(releasable cytokine conjugate) 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

서방형 사이토카인 컨쥬게이트
관련 출원의 상호 참조
[0001] 본 출원은 2019년 4월 26일자, 미국 가출원번호 제62/839,112호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
[0002] 본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2020년 4월 24일 작성된, 26,622 byte 크기의 파일명 670572002240SeqList.TXT으로 제공된다. 전자 형식의 서열 목록에 있는 정보는 본 출원에 그 전체가 참조로 포함된다.
[0003] 본 발명은 일반적으로 방출형 사이토카인 컨쥬게이트(releasable cytokine conjugate) 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
[0004] 사이토카인(cytokine)은 세포 신호 전달에 관여하는 작은 (최대 ~ 20 kDa) 단백질이며, 광범위한 범주의 인터루킨 (interleukin, IL), 인터페론 (interferon, IF), 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor, TNF), 케모카인(chemokine), 및 림포카인(lymphokine)을 포함한다. 이들은 범위한 범위의 세포에서 생성되며, 체액 기반 및 세포 기반 면역 반응 사이의 균형을 조절하는 면역 시스템에서 특히 중요하다. 인터루킨은 면역에서 특히 중요한 역할을 하는 하나의 사이토카인 그룹을 포함한다. 대부분의 인터루킨은 헬퍼 CD4 T 림프구에서 발현되며, T 및 B 림프구 및 조혈 세포의 발달 및 분화를 촉진한다.
[0005] 인터루킨-2 (IL-2) (서열 번호 1)은 ~16 kDa 사이토카인이며 미생물 감염에 대한 자연적인 반응 및 고유 세포와 외래 세포 사이의 구별에 중요하다. IL-2는 주로 T 세포에 대한 직접적인 영향을 통해 면역계의 핵심 기능, 내성 및 면역에 필수적인 역할을 한다. T 세포가 성숙하는 흉선에서, 특정 미성숙 T 세포를 조절 T 세포 (Treg)로 분화하는 것을 촉진하여 자가면역 질환을 예방하는데, 신체의 정상적인 건강한 세포를 공격하도록 준비된 다른 T 세포를 억제한다. IL-2는 활성화 유도 세포 사멸 (AICD)을 향상시킨다.IL-2는 초기 T 세포가 또한 항원에 의해 자극될 때 T 세포가 이펙터 T 세포(Teff) 및 기억 T 세포 (Tmem)로 분화하도록 또한 촉진하여, 신체가 감염과 싸울 수 있도록 돕는다.다른 극성화 사이토카인과 함께, IL-2는 나이브 CD4+ T 세포가 Th1 및 Th2 림프구로 분화하도록 자극하는 반면, Th17 및 여포 Th 림프구(follicular Th lymphocyte)로의 분화는 방해한다.
[0006] IL-2 수용체 (IL-2R) α 서브유닛 (CD25)은 낮은 친화력으로 (Kd~ 10-8 M) IL-2에 결합한다. IL-2와 CD25 단독의 상호작용은 짧은 세포 내 사슬로 인해 신호 전달을 유도하지 않지만 (β 및 γ 서브유닛에 결합될 때) IL-2R 친화력 1000 배 증가시키는 능력이 있다. IL-2R의 β 및 γ 서브유닛의 이종이량체화는 T 세포에서의 신호 전달에 필수적이다. IL-2는 중간-친화성 이량체 CD122/CD132 IL-2Rβγ 수용체 (Kd~ 10-9 M) 또는 고친화성 삼량체 CD25/CD122/CD132 IL-2Rαβγ 수용체 (Kd~ 10-11 M)를 통해 신호를 전달할 수 있다. 이량체 IL-2Rβγ는 CD8+ Tmem 세포 및 NK 세포에 의해 발현되는 반면, Treg 및 활성화된 T 세포는 높은 수준의 삼량체 IL-2Rαβγ를 발현한다. γ 서브유닛 (CD132)은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15, 및 IL-21에 대한 수용체 사이에 공유된다.
[0007] 조절 T 세포 (Treg)는 자가 내성을 유지하는데 중요한 T 림프구의 하위 집합이다. IL-2는 조절 및 이펙터 (Teff) 세포 둘 모두의 활성화에 관여하지만, Teff 세포에 비해 Treg에서 고친화성 수용체가 더 많이 발현하는 것은 저용량의 IL-2가 Treg 세포의 유지를 우선적으로 뒷받침한다는 것을 의미한다. 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 크론병, 및 전신 홍반 루푸스와 같은 질병에서 자가 면역 반응은 Treg 결핍과 관련이 있다. 고친화성 수용체를 통한 선택적이며, 오래 지속되는 Treg 세포의 자극은 따라서 자가면역 질병의 치료에 대한 장래성을 가진다.
[0008] 알데류스킨 (Aldesleukin, 재조합 IL-2)을 사용한 고용량 IL-2 요법은 전이성 흑색종 및 신세포 암종의 치료에 대해 승인되었다. 그러나, 고용량 요법의 경우 객관적 반응률이 낮고 말단 장기 독성 발생률이 높다. IL-2의 대부분의 항종양 활성은 고친화성 IL-2Rαβγ 수용체를 통한 T 세포의 자극에 기인하며, 대부분의 독성은 저친화성 IL-2Rβγ 수용체를 통한 자연 살해 세포에 의해 염증성 단백질의 방출에 기인한 것으로 여겨진다. 위치 88에 아르기닌이 아스파라긴을 대체하는 IL-2 뮤테인 (서열 번호 2; IL2-N88R, BAY 50-4798)은 고친화성 IL-2Rαβγ 수용체에 선택적으로 결합하여, Teff 및 NK 세포에 비해 Treg 세포의 활성화에 대한 선택성이 3,000 배 증가한다. 이러한 견해와 일치하여, 설치류 모델은 BAY 50-4798 및 알데류스킨과 동등한 효능을 나타내었지만, 뮤테인에서는 독성이 더 낮았다. BAY 50-4798의 인간 1상 시험으로 Teff 및 NK 세포에 비해 Treg 세포의 예상되는 차등 활성화를 확인하였지만, 항종양 반응은 제한적이었고, 뮤테인의 발달은 중단되었다.
[0009] IL-2 및 유사체의 생체 내 반감기를 연장하여, 이의 효능을 개선하려는 시도가 보고되어 있다. IL-2와 항체 및 항체 단편의 다양한 융합이 개시되어 있다 (WO2014/023752 A1). 여러 연구자들은 IL-2 {Bell, 2015 #2} 또는 Tregs-특이적 뮤테인과의 Fc 또는 IgG 융합, 예컨대 Fc-IL-2N88R (Greve, J. US 2017/0204154 A1) 또는 IgG-IL-2N88D {Peterson, 2018 #1}을 개시하였다. 시노몰로구스 원숭이에서 IgG-IL-2N88D는 반감기가 IV 주입 시 단지 ~8 시간, 또는 SC 주입 시 14 시간으로, IgG에 대해 예상되는 14일 보다 훨씬 짧으며, 짧은 t1/2는 수용체-매개 엔도사이토시스 (RME)에 기인한다. 그럼에도 불구하고, IgG-IL-2N88ND의 1회 SC 주입으로 저용량 IL-2를 매일 주입하는 것과 유사한 조절 T 세포의 연장된 증가를 제공하였다. 즉, 1회 주사 후, Tregs는 ~ 4 일에 최대로 확장하여 ~ 14 일간 지속되었다. CD4+ 및 CD8+ CD25+FOXP3+ Tregs는 10 배 내지 14 배 증가하였지만, CD4+ 또는 CD8+ 기억 이펙터 T 세포에는 영향을 미치지 않았다. 그러나, 이러한 융합 단백질은 천연 단백질에 비해 효능이 손실되거나 면역원성이 증가하는 것과 같이 여러 결핍을 겪는다. IL-2와 수용성 중합체의 특정 영구적인 방출형 컨쥬게이트가 개시되어 있다 (미국 특허 9,861,705). 수용체와 및 이의 수용성 컨쥬게이트 사이의 선택성을 변경하기 위한 비천연 아미노산을 함유하는 IL-2 뮤테인이 개시되어 있다 (WO2019/028425; WO2019/028419).
[0010] 인터루킨-15은 독특한 수용체 α-사슬을 통해 작용하지만 IL-2와 동일한 β 및 γ 수용체 사슬을 통해 작용하는 관련 사이토카인이다. IL-15는 적응 및 내재 면역 모두에 중요한 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인 이다. IL-15는 자연 살해 (NK) 및 CD8+ 이펙터 Tmem 세포의 활성화 및 유지를 촉진하고, 암 및 면역결핍증의 치료에 대해 면역치료제로서 관심이 있다. 외인성 IL-15는 생체 내 및 시험관 내 모두에서 CD8+ Tmem 세포의 증식을 자극하는 것으로 나타났다. IL-15을 사용한 저용량 요법은 종양-특이적 CD8+ Tmem 세포의 유지 및 기능을 촉진하여 실패한 입양 면역요법에서 종양 재발을 지연시키거나 또는 방지하도록 가정한다 (Roychowdhury et al., Cancer Research 64: 8062-7 (2004)). 원숭이에게 10 일에 걸쳐 지속적으로 주입하는 저용량 요법은 말초 혈액에서 CD8+ 이펙터 Tmem 세포를 100 배 확장하였으며, 이것은 일일 볼루스 투여 요법보다 더 효과적이었다 (Sneller et al., Blood 118: 6845-8 (2011)). IL-15의 안정화된 뮤테인이 보고되어 있다 (Nellis et al., Pharm. Res. 29: 722-38 (2012)). IL-15와 수용성 중합체의 특정 영구적인 방출형 컨쥬게이트가 개시되어 있다 (PCT 공개 공보 WO2015/153753A2). 개선된 수용체 작용성(agonism)을 나타내는 IL-15의 뮤테인이 개시되어 있다 (Zhu et al., J. Immunology 2009, 183(6): 3598). IL-15[N72D]는 세포 증식 분석에서 천연 IL-15에 비해 4-5 배 증가한 생물학적 활성을 나타냈다. IL-15 및 IL-15R α의 스시 도메인 (IL-15RαSu)을 포함하는 IL-15 수용체 작용제가 또한, 둘 모두 복합체로서 및 융합 단백질로서 보고되어 있다 (Han et al., Cytokine 2011, 56(3):804-10; Mortier et al., J. Biological Chem. 2006, 281: 1612-9; 미국 특허 10,358,477). IL-15[N72D] 및 IgG1의 Fc 도메인에 접합된 IL-15RαSuFc (ALT-803)의 다량체 복합체는 현재 임상 시험중이다.
[0011] 삼량체 수용체에 대해 친화도가 감소한 IL-2의 뮤테인이 개시되어 있다 (미국 특허 9,206,243). 이러한 뮤테인은 Treg 세포를 자극하는 능력이 감소되지만, CD4+ T 헬퍼 세포, CD8+ T 세포, 및 자연 살해 (NK) 세포를 자극하는 능력을 유지하는 것을 나타낸다. 이러한 IL-2 뮤테인은 Treg 세포에 의한 면역 억제의 부족으로 인해 항종양 활성이 향상된 것을 나타낼 수 있는 것으로 제안된다.
[0012] IL-7은 T 세포 발달 및 생존 및 성숙한 T 세포의 항상성에 필요한 사이토카인이다. 흉선에서 이중 음성 (DN) CD4- CD8- 흉선 전구 세포의 전환이 IL-7 신호 전달을 필요로 하지만, 고용량에서는 IL-7이 DN 진행을 차단한다. 말초에 있으면, 나이브 T 세포의 생존은 IL-7에 의존한다. IL-7 수용체는 림프계 세포에서만 거의 독점적으로 발현되는 특이적 α-사슬 (CD127)과 함께 IL-2, IL-15, IL-9, 및 IL-21에 사용되는 공통 γ-사슬 (CD132)을 포함한다. IL-7는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수준을 증가시키려는 시도로 T 세포-고갈 요법을 받은 암 환자에 대한 면역 치료제로서 임상 시험중이다. IL-7를 투여하면 나이브 T 세포가 우선적으로 확장하여, 환자의 연령에 관계없이 더 넓은 T 세포 레퍼토리를 제공하며, 낮은 나이브 T 세포 집단을 가지는 환자에서 면역 반응을 향상시키기 위한 IL-7을 사용한 잠재적 치료를 제안한다 (ElKassar & Gress, J. Immunotoxicol. (2010) 7: 1-7.)
[0013] IL-9은 비만 세포, NK 세포, TH2, TH17, Treg, ILC2, 및 Th9 세포에 의해 생성되는 IL-2 및 IL-15와구조적으로 연관된 또 다른 다면발현성 사이토카인이며, Th9 세포가 주요 CD4+ T 세포 생산자로 간주된다. IL-9 수용체는 특이적 알파 -사슬 (CD129)과 함께 공통 γ-사슬 (CD132)를 포함한다. IL-9를 사용한 저용량 요법은 화학요법으로 인한 혈소판 감소증(thrombocytopenia)을 예방하고 혈소판 회복을 가속화하기 위해 제안되었다 (Xiao et al., Blood 129: 3196-3209 (2017)).
[0014] IL-10 (인간 사이토카인 합성 억제 인자)는 Th2 세포, B 세포, 및 대식세포에 의해 생성되는 항염증성, 면역억제 사이토카인이다. 이는 감마-인터페론, IL-2, 및 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α)를 비롯한 Th1 세포에 의해 생성되는 열 사이토카인의 합성을 억제하며, 단핵구 및 대식세포에 의한 IL-1, IL-6, IL-8, 과립구 집락 촉진 인자 (G-CSF), 및 TNF-α의 생성을 억제한다. IL-10는 용량 의존적 방식으로 NK-세포 활성화 및 표적-세포 파괴를 유도하는 것으로 보인다 (Zheng et al. J. Exp.Med. 184:579-84 (1996)). 이는 자가면역 질병, 패혈성 쇼크, 및 세균성 패혈증의 치료제로 연구중이다. IL-10의 PEG화 유도체가 개시되어 있다 (PCT 공개 공보 WO2010/077853). PEG화-IL10은 인터페론 감마 및 CD8+ T-세포 의존적 항종양 면역을 유도하는 것으로 나타났다 (Emmerich et al., Cancer Res. 72: 3570-81 (2012); Mumm et al., Cancer Cell 20:781-96 (2011); Chan et al., J Interferon Cytokine Res. 35: 948-55 (2015)). PEG화-IL10에 대한 조사에 따르면 인간 요법에서 IL-10은 주로 CD8+ T 세포의 활성화를 통한 면역자극성이 있으며, 전이성 4기 췌장암 치료에 대한 3상 시험이 1차 평가 변수를 만족하지 못했지만, 비소세포 폐암에 대한 2상 시험이 진행중이다.
[0015] IL-21은 활성화된 CD4+ T 세포에서 발현되며, Th2 및 Th17 T 헬퍼 세포 및 T 여포 세포에서 상향 조절된다. 이는 NK 세포에서 발현되며 이의 기능을 조절한다. IL-21 수용체 (IL21R)는 T, B, 및 NK 세포의 표면에서 발현되며, 공통γ-사슬 (CD132)과 조합하여 기능한다. 알러지, 바이러스 감염, 및 암의 치료에서 IL-21의 역할이 제안되어 있으며, 전이성 흑색종 및 신세포 암종의 치료를 위한 임상 시험이 진행되었다. IL-21는 HIV에 감염된 대상체에서 HIV-특이적 세포독성 T 세포 반응 및 NK 세포 기능을 개선하는 것으로 보고되어, HIV의 치료에 사용할 가능성이 있음을 시사한다.
[0016] 지속적인 주입은 사이토카인을 사용한 저용량의, 연속 용량 요법의 가능성을 보여주지만, 인간 요법에서 실질적으로 구현하기는 어렵다. 이에 따라, 암 및 자가면역 장애를 비롯한 다양한 질병에 대해 사이토카인을 사용하여 저용량의, 지속 기간이 연장된 요법을 가능하게 하는 개선된 제제에 대한 필요성이 존재한다.
[0017] 하나의 양태에서, 화학식(I)의 링커-약물:
Z-L-D (I),
이 제공되며, 여기서 Z, L, D는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
[0018] 일부 구현예에서, 링커-약물 Z-L-D는 화학식(Ia)의 화합물:
Figure pct00001
(Ia),
이며, 여기서 Z, S, n, R1, R2, R4, Y, 및 D는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
[0019] 또 다른 양태에서, 화학식(IIa)의 링커:
Figure pct00002
(IIa),
가 제공되며, 여기서 n, Z, S, R1, R2, R4 및 X는 기재된 바와 같다.
[0020] 또 다른 양태에서, 화학식(III)의 컨쥬게이트:
M-[Z*-L-D]q (III),
가 제공되며 M, Z*, L, D, 및 q는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
[0021] 또 다른 양태에서, 화학식(IV)의 분해성 가교 하이드로겔:
Figure pct00003
(IV),
이 제공되며, 여기서 P1, P2, r, A*, B, C*, n, R11, R12, R14, x, y, 및 z는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
[0022] 또 다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 화합물의 제조 방법, 및 이의 사용 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 화학식(III)의 컨쥬게이트 또는 화학식(IV)의 하이드로겔을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
[0023] 도 1은 링커-약물이 하이드로겔에 부착된 컨쥬게이트의 일반적인 구조를 도시한다.
[0024] 도 2는 αβγ 및 βγ 수용체를 함유하는 세포에 대한 IL-2[N88R,C125S]의 결합을 도시한다.
[0025] 도 3은 IL-2[N88R,C125S]의 환원성 알킬화로부터 링커-단백질 생성물에 해당하는 밴드를 가지는 SDS-PAGE 겔을 도시한다.
[0026] 도 4는 미소구체-IL2-N88R로 처리한 후 래트에서 혈장 IL2[N88R]의 C 대 t 플롯을 도시한다. 도 4A는 0.25 μmol/kg으로 투여된 무작위 아실화 컨쥬게이트로부터 IL-2[N88R,C125]의 방출을 도시하고, 도 4B는 0.12 μmol/kg으로 투여된 환원성 알킬화 컨쥬게이트로부터 AP-IL-2 [N88R,C125S]의 방출을 도시한다.
[0027] 도 5는 비장에서 IL-2[N88R,C125S]의 약력학을 도시한다. 왼쪽: CD4+ 이펙터/기억 T-세포의 백분율; 오른쪽: CD8+ 이펙터/기억 T-세포의 백분율.
[0028] 도 6은 췌도에서 IL-2[N88R,C125S]의 약력학을 도시한다. 왼쪽 상단 Foxp3+CD4+ T-세포의 백분율; 오른쪽 상단: CD4+의 백분율; 왼쪽 하단: CD8+의 백분율; 오른쪽 하단: 선천성 림프구 세포. NOD 마우스에 PBS 비히클, 프롤류킨(Proleukin) (25000 유닛) 또는 IL-2[N88R,C125S] (25000 유닛)을 매일 주사하였고, 제5일째에 마지막 주사 2 시간 후 희생시켰다.
[0029] 도 7은 마우스에서 미소구체-IL-2[N88R,C125S] (“뮤테인(mutein)”)으로부터 방출된 [아미노프로필]-IL-2[N88R,C125S]의 약동학을 도시한다. 도 7A: BALB/c 마우스 (n = 6)는 28 nmol (19 mg/kg) 또는 9.9 nmol (6.5 mg/kg) 미소구체-IL-2[N88R,C125S]를 함유하는 단일 피하 주사를 옆구리에 제공하였다. t1/2가 31 시간으로 결정되었다. 도 7B: 패널 B: NOD 마우스 (n = 6)의 옆구리에 미소구체-IL-2[N88R,C125S] (0.5, 1, 5, 10 또는 19 mg/kg)를 투여하였다. t1/2가 18 시간으로 결정되었다. 도 7C: NSG 마우스 (n = 6) 또는 NOD 마우스 (n = 6)의 옆구리에 미소구체-IL-2[N88R,C125S] (5 mg/kg)를 투여하였다. NSG 마우스에서 152 시간의 t1/2은 [아미노프로필]-IL2[N88R,C125S]으로 결정되었다. 모든 경우에, IL-2[N88R,C125S] 농도를 정량화하기 위해 Thermofisher ELISA를 사용하여 혈장을 분석하였다.
[0030] 도 8은 IL-2[N88R,C125S] (“뮤테인”)이 Foxp3+CD4+ 및 CD8+ 세포 집단의 확장에 미치는 영향을 도시한다. 도 8A는 비장 및 말초혈액 단핵구 (PBMC)에서 Foxp3+CD4+ T-세포의 확장을 도시한다. 도 8B는 비장 및 PBMC에서CD8+ T-세포의 확장을 도시한다. 비장 및 PBMC에서 발견된 CD8+ 세포의 백분율은 각각 대략 11% 및 19 %이었다. 이러한 백분율은 미소구체-IL-2[N88R,C125S]으로 처리했을 때 각각 대략 25% 및 60% 으로 증가하였다. NOD 마우스에는 IL2-뮤테인 (QDx5, 25,000 유닛), 빈 미소구체 또는 미소구체-IL-2[N88R,C125S] (18 mg/kg)의 단일 주사를 투여하였다. 제5일 마지막 투여 2시간 후 마우스를 희생시켰다.
[0031] 도 9는 PBMC에서 용량 의존적 Foxp3+CD4+ T 세포 확장을 도시한다. 도 9A는 미소구체-IL-2[N88R,C125S]가 Foxp3+CD4+ T-세포의 확장에 미치는 영향을 도시하며, 도 9B는 NOD 마우스 (n=3/투여 그룹)에서 CD8+ 세포의 활성화에 미치는 영향을 도시한다 (오른쪽). 미소구체-IL-2[N88R,C125S]는 Foxp3+CD4+ T-세포를 우선적으로 확장하며, NOD 마우스 (n=3/투여 그룹)에서 CD8+ 세포의 활성화를 방지한다. Foxp3+CD4+ T-세포 확장은 모든 용량에 대해 제4일에 최고조에 달하고, 제14일에 기준선 수준으로 돌아온다.
[0032] 도 10은 IL-15의 환원성 알킬화로부터 링커-단백질 생성물에 해당하는 밴드를 가지는 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 왼쪽에서 오른쪽으로:분자량 마커;IL-15;IL-15+PEG5kDa-DBCO;IL-15+1Eq (IIb) +PEG5kDa-DBCO;IL-15+3Eq (IIb) +PEG5kDa-DBCO; 및 IL-15+5Eq (IIb) +PEG5kDa-DBCO.
[0033] 도 11은 C57BL/6J 마우스에서 MS-IL-15로부터 방출된 [아미노프로필]-IL-15의 약동학을 도시한다. 정상적인 수컷 C57BL/6J 마우스에 MS~IL-15 (50 μg)를 t=0 시간 및 t=240 시간에 투여하였다. 혈장 샘플을 제조하고 인간 IL-15 Quantikine ELISA (R&D systems)을 사용하여 분석하였다. 240 시간에 걸쳐 두 가지 구별되는 t1/2가 관찰되었다. 120 시간에 걸쳐 > 200 시간의 t1/2가 관찰된 다음 120 시간에서 240 시간 사이에 27 시간의 두 번째 t1/2가 관찰된다. 두 번째 MS~IL15 (50 μg) 주사를 240 시간 채혈 후 즉시 투여하였다 (청색 데이터). 23 시간의 t1/2가 264 시간에서 360 시간 사이에 관찰되었다.
[0034] 도 13은 C57BL/6J 마우스에서 미소구체-IL-15로부터 방출된 [아미노프로필]-IL-15의 용량-의존적 약동학을 도시한다. 정상적인 수컷 C57BL/6J 마우스에 MS-IL-15 (12.5, 25 또는 50 μg)를 투여하였다. 혈장 샘플을 제조하고 인간 IL-15 Quantikine ELISA (R&D systems)을 사용하여 분석하였다. 120 시간 동안 데이터 적합도에 대해 115 207 시간의 t1/2가 관찰되었다.
[0035] 도 13은 피하 투여 대 복강 내 투여된 C57BL/6J 마우스에서 미소구체-IL-15로부터 방출된 [아미노프로필]-IL-15의 약력학을 도시한다. 정상, 수컷 C57BL/6J 마우스에 피하 주사 (흑색,
Figure pct00004
) 또는 복강 내 주사 (청색,
Figure pct00005
)으로 MS-IL-15 (50 μg)를 투여하였다. 혈장 샘플을 제조하고 인간 IL-15 Quantikine ELISA (R&D systems)을 사용하여 분석하였다. 120 시간 동안 피하 (115 h) 및 복강 내 (129 시간) 투여에 대해 유사한 t1/2가 관찰되었다.
[0036] 도 14는 미소구체-IL15 컨쥬게이트가 NK 세포 및 CD44hiCD8+ T 세포에 미치는 영향을 도시한다. 미소구체-IL15 컨쥬게이트는 CD44hiCD8+ T 세포 및 NK 세포를 확장한다. 도 14A: CD44hiCD8+ T 세포의 확장. 도 14B: NK 세포의 확장. 정상적인 수컷 C57BL/6J 마우스에 단일 피하 주사 미소구체~IL-15 (2.5, 12.5, 25 또는 50 μg의 IL-15), 빈 미소구체 (흑색) 또는 rhIL15 (2.5 μg)의 단일 피하 주사를 투여햐였다. 유세포 분석을 사용하여 PBMC에서 NK 세포 및 CD44hiCD8+ T 세포의 확장을 모니터링하였다. CD44hiCD8+ T 세포의 확장이 미소구체-IL15의 단일 50 ug 주사 후 28 일 동안 지속되었다.
[0037] 도 15는 PEG5kDa-DBCO으로 겔 이동 반응 후 가시화된, 링커 (IIb)를 가지는 수용체-연결된 인터루킨 (RLI)의 환원성 알킬화로부터 링커-단백질 생성물에 해당하는 밴드를 가지는 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 왼쪽에서 오른쪽으로: 분자량 마커; RLI; RLI + PEG5kDa-DBCO; RLI + 1.5 Eq (IIb) + PEG5kDa-DBCO; RLI + 2 Eq (IIb) + PEG5kDa-DBCO; RLI + 3 Eq (IIb) + PEG5kDa-DBCO; 및 RLI + 5 Eq (IIb) + PEG5kDa-DBCO.
[0038] 도 16은 RLI에 대한 IL-2Rβγ 수용체-결합 세포-기반 분석의 결과를 도시한다. U2OS 세포-기반 분석을 사용하여 pH 7.4에서 컨쥬게이트로부터 방출된 [아미노프로필]-RLI의 결합 활성을 (EC50 = 180 pM) 천연 RLI의 결합 활성 (EC50 = 160 pM)과 비교하여 결정하였다.
[0039] 도 17은 미소구체 컨쥬게이트로부터 방출된 [아미노프로필]-RLI의 약동학을 도시한다. 정상적인 수컷 C57BL/6J 마우스에 미소구체-RLI 컨쥬게이트 (1.5 nmol)를 투여하였다. 혈장 샘플을 준비하고 R&D systems DuoSet hIL15/IL15Rα 복합 ELISA (DY6924)를 사용하여 분석하였다.
[0040] 도 18은 PBMC에서 CD8+ 기억 T 세포의 확장을 측정하여, 미소구체 컨쥬게이트로부터 방출된 [아미노프로필]-RLI의 약력학을 도시한다. 도 8A: PBMC에서 CD8+ 기억 T 세포의 세포 백분율 및 도 18B: CD8+ T 세포의 증식. 정상적인 수컷 C57BL/6J 마우스에 빈 MS, MS~RLI (34 μg, 1.5 nmol), 또는 천연 RLI (2.5 μg, 0.11 nmol QDx4)를 옆구리에 피하 주사를 통해 투여하였다. 채혈 후 PBMC을 준비하고 유세포 분석을 위해 염색하였다.
[0041] 도 19는 미소구체-RLI로 처리했을 때 PBMC에서 NK 세포의 확장을 도시한다. 도 19A: PBMC에서 NK 세포의 세포 백분율 및 도 19B: NK 세포의 증식. 정상적인 수컷 C57BL/6J 마우스에 빈 MS, MS~RLI (34 μg, 1.5 nmol), 또는 천연 RLI (2.5 μg, 0.11 nmol QDx4)를 옆구리에 피하 주사를 통해 투여하였다. 채혈 후 PBMC을 준비하고 유세포 분석을 통한 분석을 위해 염색하였다.
[0042] 본 발명은 사이토카인 단백질 및 이의 변이체의 방출형 컨쥬게이트를 제공한다. 컨쥬게이트는 이러한 단백질 치료제를 장기간에 걸쳐 낮은, 지속 용량으로 전달하여, 다양한 질병의 치료에 유용하다.
[0043] 하나의 양태에서, 본 발명은 거대분자 담체에 대한 단백질의 컨쥬게이션에 적합한 방출형 링커가 부착된 사이토카인 및 이의 변이체를 제공한다. 이러한 링커는 담체로부터 단백질의 방출 속도를 제어하여, 체내 사이토카인 또는 변이체의 농도 및 지속 기간을 결정한다.
[0044] 또 다른 양태에서, 본 발명은 거대분자 담체로부터 사이토카인 및 이의 변이체를 방출하는 컨쥬게이트를 제공한다. 담체는 체내 단백질의 지속기간을 연장하는 가용성 또는 불용성 저장소이다.
[0045] 또 다른 양태에서, 본 발명의 링커-사이토카인 및 컨쥬게이트의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
정의
[0046] 본 명세서에서 사용 시, 달리 명확하게 지시되지 않는 한 단수형 용어 (“a”“an”등)의 사용은 하나 이상을 지칭한다.
[0047] 본 명세서에서 사용 시, 달리 명시되지 않는 한, 용어 “약” 또는 “대략”은 값과 관련되어 사용될 때, 15% 이내, 10% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내, 또는 0.5% 이내의 값을 고려한다.
[0048] 용어 “알킬”은 1-20, 1-12, 1-8, 1-6, 또는 1-4개 탄소 원자의 선형, 분지형, 또는 사이클릭 포화 탄화수소 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 알킬은 선형 또는 분지형이다. 선형 또는 분지형 알킬 기의 예로는, 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, t-뷰틸, 아이소뷰틸, sec-뷰틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 알킬은 사이클릭이다. 사이클릭 알킬 기의 예로는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜타다이에닐, 사이클로헥실, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
[0049] 용어 “알콕시”는 산소에 결합된 알킬 기를 포함하며, 메톡시, 에톡시, 아이소프로폭시, 사이클로프로폭시, 사이클로뷰톡시, 등을 포함한다.
[0050] 용어 “알케닐”은 2-20, 2-12, 2-8, 2-6, 또는　2-4개 탄소 원자의, 탄소-탄소 이중 결합을 가지는 비-방향족 불포화 탄화수소를 포함한다.
[0051] 용어 “알키닐”은 2-20, 2-12, 2-8, 2-6, 또는　2-4개 탄소 원자의, 탄소-탄소 삼중 결합을 가지는 비-방향족 불포화 탄화수소를 포함한다.
[0052] 용어 “아릴”은 6-18개 탄소, 바람직하게 6-10개 탄소의 방향족 탄화수소 기를 포함하며, 페닐, 나프틸, 및 안트라세닐과 같은 기를 포함한다. 용어 “헤테로아릴”은 N, O 또는 S 원자 중 적어도 하나를 함유하는 3-15개 탄소, 바람직하게 N, O 또는 S 원자 중 적어도 하나를 포함하는　3-7개 탄소를 포함하는 방향족 고리를 포함하며, 피롤릴, 피리딜, 피리미디닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 아이속사졸릴, 싸이아졸릴, 아이소싸이아졸릴, 퀴놀릴, 인돌릴, 인데닐, 등과 같은 기를 포함한다.
[0053] 일부 경우에, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티는 알킬 연결부를 통해 분자의 나머지 부분에 커플링될 수 있다. 이러한 경우, 치환체는 알케닐알킬, 알키닐알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬로서 지칭될 것이며, 이는 알킬렌 모이어티가 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티와, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴이 커플링되는 분자 사이에 있음을 나타낸다.
[0054] 용어 “할로겐” 또는 “할로”는 브로모, 플루오로, 클로로 및 아이오도를 포함한다.
[0055] 용어 “헤테로사이클릭 고리” 또는 “헤테로사이클릴”은 N, O, 또는 S 원자 중 적어도 하나를 포함하는 3-15 원 방향족 또는 비방향족 고리를 지칭한다. 예시로는 피페리디닐, 피페라지닐, 테트라하이드로피라닐, 피롤리딘, 및 테트라하이드로퓨라닐, 뿐만 아니라 상기 용어 “헤테로아릴”에 대해 제공된 예시적인 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릭 고리 또는 헤테로사이클릴은 비방향족이다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릭 고리 또는 헤테로사이클릴은 방향족이다.
[0056] 용어 “거대분자”는 분자량이 5,000 내지 1,000,000 달톤, 바람직하게 10,000 내지 500,000 달톤, 및 더욱 바람직하게 10,000 내지 250,000 달톤인 분자 또는 분자의 잔기를 지칭한다. 거대분자의 예로는 항체, 항체 단편, 및 효소를 비롯한 단백질; 폴리(아미노산) 예컨대 폴리(라이신) 및 폴리(발린) 및 혼합-서열 폴리펩타이드를 비롯한 폴리펩타이드; 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드) (PEO), 폴리(에틸렌 이민) (PEI), 및 이의 공중합체를 비롯한 합성 중합체; 및 덱스트란과 같은 다당류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 거대분자는 천연적으로 또는 화학적 변형 후, 컨쥬게이션에 적합한 적어도 하나의 작용기, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 아민, 카복실 산, 알코올, 싸이올, 알킨, 아자이드, 또는 말레이미드 기를 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 거대분자는 폴리에틸렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 분지형일 수 있으며, 한쪽 말단은 컨쥬게이션에 적합한 작용기로 종결되고 다른 말단 또는 말단들은 캡핑 기 (예를 들어, 메틸)로 종결되거나, 또는 다중 아암(arm)을 포함하여, 각각의 아암이 컨쥬게이션에 적합한 작용기로 종결되는 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 평균 분자량이 20,000 내지 200,000 달톤, 바람직하게 20,000 내지 100,000 달톤, 및 가장 바람직하게 대략 40,000 달톤인 선형, 분지형, 또는 다중-아암 중합체이다. 이러한 폴리에틸렌 글리콜은 기술 분야 내 공지되어 있으며, 예를 들어 NOF Corporation (일본, 도쿄)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
[0057] “임의 치환된”은, 달리 명시되지 않는 한, 기(group)가 동일하거나 또는 상이한 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의) 치환기로 치환되거나 또는 비치환될 수 있음을 의미한다. 치환기의 예로는, 비제한적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, -CN, -ORaa, -SRaa, -NRaaRbb, -NO2, -C=NH(ORaa), -C(O)Raa, -OC(O)Raa, -C(O)ORaa, -C(O)NRaaRbb, -OC(O)NRaaRbb, -NRaaC(O)Rbb, -NRaaC(O)ORbb, -S(O)Raa, -S(O)2Raa, -NRaaS(O)Rbb, -C(O)NRaaS(O)Rbb, -NRaaS(O)2Rbb, -C(O)NRaaS(O)2Rbb, -S(O)NRaaRbb, -S(O)2NRaaRbb, -P(O)(ORaa) (ORbb), 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 아릴을 포함하되, 여기서 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 및 아릴은 각각 독립적으로 Rcc으로 임의 치환되고, 여기서
Raa 및 Rbb는 각각 독립적으로 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 아릴이거나, 또는
Raa 및 Rbb는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릴을 형성하는데, 이는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 하이드록실, 알콕시, 또는 -CN으로 임의 치환되고, 여기서:
각각의 Rcc는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 아릴, -CN, 또는 -NO2이다.
[0058] 일반적으로, 약물의 활성 형태는 본 발명의 컨쥬게이트로부터 직접적으로 방출되지만, 일부 경우에, 이의 전구약물 형태로 활성 약물을 방출하는 것이 가능하다.
링커-약물
[0059] 하나의 양태에서, 화학식(I)의 링커-약물:
Z-L-D (I),
이 제공되며, 여기서 Z는 링커-약물을 거대분자 담체에 연결시키는 작용기이며, L는 절단가능한 링커이고, D는 사이토카인 또는 사이토카인 변이체이다. 일부 구현예에서, 방출형 링커는 단백질을 거대분자 담체에 대한 단백질의 컨쥬게이션에 적합하다. 일부 구현예에서, 링커는 담체로부터 사이토카인 및 변이체의 방출 속도를 제어하여, 체내 활성 단백질의 농도 및 지속 기간을 결정한다. 하나의 양태에서, 화학식(I)의 링커-약물:
Z-L-D (I),
이 제공되며, 여기서 Z는 링커-약물을 거대분자 담체에 연결시키는 작용기이며, L는 절단가능한 링커이고, D는 사이토카인 또는 사이토카인 변이체이다.
[0060] 화학식(I)의 링커-약물의 일부 구현예에서, 사이토카인 D은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-10, IL-15, IL-21, 또는 이의 사이토카인 변이체이다. D는 또한 사이토카인에 대해 특정 화학적 변형을 가지는 사이토카인, 예컨대 NH(CH2CH2O)p(CH2)m을 포함하며, 여기서 m은 2 내지 6의 정수이고 p은 0 내지 1000의 정수이고, 링커 L을 부착하기 위한 환원 아민화로 인한 아민 기에 부착된다. 특정 구체예에서, 이러한 변형체는 단백질 서열의 N-말단 알파-아미노 기에 부착된다.
[0061] “사이토카인 변이체”는 천연 사이토카인에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 서열 상동성을 가지는 변경된 서열을 가지는 단백질 (“뮤테인”)을 의미한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 변이체는 천연 사이토카인에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 가진다. 일부 구현예에서, 사이토카인 변이체는 천연 서열으로부터 1 내지 10 개의 변경된 아미노산을 포함하며, 단백질 안정성 및/또는 수용체 결합 친화력 또는 선택성의 개선에 치고하여 선택된다. 재조합 사이토카인을 생성하기 위해 사용되는 발현 시스템에 따라, 서열은 개시 메티오닌 잔기를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 IL-2 변이체는 이량체 βγ 수용체에 비해 삼량체 αβγ-수용체에 대한 결합 친화도가 증가한 변이체로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2 변이체는 추가된 안정성 또는 선택성을 부여하기 위해 아스파라긴-88에 돌연변이, 예를 들어 N88R 또는 N88D를 가지며, 이는 C125S와 같은 다른 돌연변이와 조합될 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 다른 IL-2 뮤테인, 예를 들어 아스파테이트-20에 변경을 가지는 뮤테인 예컨대 IL-2 D20T, 또는 미국 특허 9,206,243에 개시된 삼량체 수용체에 대해 친화력이 감소된 뮤테인이 개시되어 있다. IL-2 및 변이체에 대한 구체적인 구현예가 서열 번호 1-11으로 주어진다.
[0062] 서열 번호 1 천연 인간 IL-2
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS LT
[0063] 서열 번호 2 IL-2-N88R (BAY 50-4798)
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
[0064] 서열 번호 3 IL-2-N88R,C125S
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
[0065] 서열 번호 4 IL-2-D20T
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
[0066] 서열 번호 5 IL-2-D20T,C125S
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
[0067] 서열 번호 6 IL-2-R38K,F42I,Y45N,E62L,E68V
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTKML TIKFNMPKKA TELKHLQCLE ELLKPLEVVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
[0068] 서열 번호 7 IL-2-R38K,F42Q,Y45E,E68V
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTKML TQKFEMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEVVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
[0069] 서열 번호 8 IL-2-R38A,F42I,Y45N,E62L,E68V
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TIKFNMPKKA TELKHLQCLE ELLKPLEVVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
[0070] 서열 번호 9 IL-2-R38K,F42K,Y45R,E62L,E68V
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTKML TKKFRMPKKA TELKHLQCLE ELLKPLEVVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
[0071] 서열 번호 10 IL-2 R38K,F42I,Y45E,E68V
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTKML TIKFEMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEVVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
[0072] 서열 번호 11 IL-2 R38A,F42A,Y45A,E62A
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TAKFAMPKKA TELKHLQCLE EALKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
[0073] 이와 유사하게, 천연 IL-15은 개선된 활성, 수용체 결합 선택성, 또는 안정성을 부여하는 뮤테인으로 대체될 수 있다. 예를 들어, 천연 IL-15 (서열 번호 12)는 아스파라긴 탈아마이드화에 의해 분해 저항성이 개선된 뮤테인으로 치환될 수 있으며, 예로는 생물학적 활성을 유지하는 것으로 나타난 IL-15-[N77A] (서열 번호 13) 또는 IL-15-[N71S,N72A,N77A] (서열 번호 14) (Nellis et al., Pharm. Res. 29:722-38 (2012)), 또는 수용체 작용성이 향상된 IL-15[N72D] (서열 번호 15) (Zhu et al., J. Immunology 2009, 183(6): 3598)이 있다.
[74] 서열 번호 12 IL-15
NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS
[75] 서열 번호 13 IL-15 [N77A]
NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NNSLSSAGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS
[76] 서열 번호 14 IL-15 [N71S,N72A,N77A]
NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA SASLSSAGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS
[77] 서열 번호 15 IL-15 [N72D]
NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS
[0078] IL-15와 IL-15RαSu의 복합체 및 융합 단백질, 예를 들어 수용체-연결된 인터루킨 RLI (서열 번호 16) 및 이의 변이체가 또한 사용될 수 있다 (Mortier et al., J. Biological Chem. 2006, 281: 1612-9; 미국 특허 10,358,477). 이러한 융합 단백질은 IL-15RαSu 신호 서열 및 단백질의 단리 및 정제를 용이하게 하는 것으로 기술 분야 내 공지된 서열, 예를 들어 His-태그 및 Flag-태그를 선택적으로 포함할 수도 있거나, 또는 이러한 요소가 없을 수도 있다 (서열 번호 17).
[0079] 서열 번호 16 RLI
MAPRRARGC RTLGLPALLL LLLLRPPATR GDYKDDDDKI EGRITCRRRM SVEHADIWVK SYSLYSRERY ICNSGFKRKA GTSSLTECVL NKATNVAHWT TPSLKCIRDP ALVHQRPAPP SGGSGGGGSG GGSGGGGSLQ NWVNVISDLK KIQDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS
[0080] 서열 번호 17 RLI [N77A]
ITCPPPMSVE HADIWVKSY SLYSRERYIC NSGFKRKAGT SSLTECVLNK ATNVAHWTTP SLKCIRDPAL VHQRPAPPSS GGSGGGGSGG GSGGGGSLQN WVNVISDLKK IEDLIQSMHI DATLYTESDV HPSCKVTAMK CFLLELQVIS LESGDASIHD TVENLIILAN NSLSSAGNVT ESGCKECEEL EEKNIKEFLQ SFVHIVQMFI NTS
[0081] 다른 사이토카인으로는 IL-7, IL-9, IL-10, 및 IL-21 (서열 번호 18-21)를 포함한다.
[0082] 서열 번호 18 IL-7
DCDIEGKDGK QYESVLMVSI DQLLDSMKEI GSNCLNNEFNFFKRHICDAN KEGMFLFRAA RKLRQFLKMN STGDFDLHLL KVSEGTTILL NCTGQVKGRK PAALGEAQPT KSLEENKSLK EQKKLNDLCF LKRLLQEIKT CWNKILMGTK EH
[0083] 서열 번호 19 IL-9
QGCPTLAGIL DINFLINKMQ EDPASKCHCS ANVTSCLCLG IPSDNCTRPC FSERLSQMTN TTMQTRYPLI FSRVKKSVEV LKNNKCPYFS CEQPCNQTTA GNALTFLKSL LEIFQKEKMR GMRGKI
[0084] 서열 번호 20 IL-21
QGQDRHMIRM RQLIDIVDQL KNYVNDLVPE FLPAPEDVET NCEWSAFSCF QKAQLKSANT GNNERIINVS IKKLKRKPPS TNAGRRQKHR LTCPSCDSYE KKPPKEFLER FKSLLQKMIH QHLSSRTHGS EDS
[0085] 서열 번호 21 IL-10
MSPGQGTQSE NSCTHFPGNL PNMLRDLRDA FSRVKTFFQM KDQLDNLLLK ESLLEDFKGY LGCQALSEMI QFYLEEVMPQ AENQDPDIKA HVNSLGENLK TLRLRLRRCH RFLPCENKSK AVEQVKNAFN KLQEKGIYKA MSEFDIFINY IEAYMTMKIR N
[0086] 특정 구체예에서, 사이토카인은 예를 들어 하나 이상의 위치에 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체의 부착에 의해 화학적으로 변형되어, 컨쥬게이트로부터 방출되면 체내 단백질 지속 기간을 연장하고 및/또는 수용체 선택성을 변형할 수 있다.
[0087] 이러한 단백질은 기술 분야 내 공지된 방법을 사용하여 제조될수 있다. 재조합으로 제조된 경우, 원핵 생물 또는 진핵 생물 시스템에서 발현될 수 있다.
[0088] 다양한 절단가능한 링커 L이 사용될 수 있으며, 미국 특허 8,680,315; PCT 공개 공보 WO2013/036857; PCT 공개 공보 WO2006/138572; PCT 공개 공보 WO2005/099768; PCT 공개 공보 WO2006/136586; PCT 공개 공보 WO2011/012722; PCT 공개 공보 WO2011/089214; PCT 공개 공보 WO2011/089215; PCT 공개 공보 WO2011/089216; 및 PCT 공개 공보 WO2016/020373에 개시된 링커를 포함한다. 링커 L은 적절한 조건 하에서 특정 속도로 절단되는 공유 결합을 포함한다. 이러한 절단은 촉매화 또는 비촉매화 가수분해, 단백질 분해, 또는 제거 반응을 통해 이루어질 수 있다. 절단에 적절한 조건으로는 생리학적 환경에서 발견되는 조건, 일반적으로 대략 pH 6.5-7.5 및 30-45 ℃의 온도 및 바람직하게 대략 pH 7.4 및 대략 37 ℃의 온도이다.
[0089] 일부 구현예에서, 화학식(I)의 링커-약물은 화학식(Ia)의 화합물이고:
Figure pct00006
(Ia),
여기서:
n은 0 내지 6의 정수이고;
R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 두 개의 R4는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 3-6 원 고리를 형성하고;
Z는 링커를 거대분자 담체에 연결하기 위한 기이며;
S는 부재하거나 또는 (CH2CH2O)h(CH2)gCONH이되, 여기서 g는 1 내지 6의 정수이고 h는 0 내지 1000의 정수이고;
Y는 부재하거나 또는 NH(CH2CH2O)p(CH2)m이되, 여기서 m은 2 내지 6의 정수이고 p는 0 내지 1000의 정수이고;
D는 본 명세서에 개시된 사이토카인 또는 사이토카인 변이체의 아민 잔기이다.
[0090] 화학식(Ia)의 링커-약물의 일부 구현예에서, n = 1-6이고, R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고; 각각의 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 결합되어 3-6 원 고리를 형성할 수 있고; Z는 링커를 거대분자 담체에 연결하기 위한 기이고; S는 부재하거나 또는 (CH2CH2O)h(CH2)gCONH이되, 여기서 g = 1-6 및 h = 0-1000이고; Y는 부재하거나 또는 NH(CH2CH2O)p(CH2)m이되, 여기서 m = 2-6 및 p = 0-1000이고; D는 IL-2, IL-2 변이체, IL-15, 또는 IL-15 변이체 사이토카인의 아민 잔기이다.
[0091] R1 및 R2의 전자 끄는 기에 대한 설명은 미국 특허 8,680,315에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다. 전자 끄는 기는 Hammett 시그마(sigma) 값이 0 초과인 기로 정의된다 (예를 들어, Hansch et al. 1991 Chemical Reviews 91: 165-195 참조). 전자 끄는 기의 전형적인 예로는 나이트릴, 나이트로, 설폰, 설포옥사이드, 카보닐, 임의 치환된 아릴 및 임의 치환된 헤테로아릴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
[0092] 화학식(Ia)의 링커-약물의 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는
-CN;
-NO2;
임의 치환된 아릴;
임의 치환된 헤테로아릴;
임의 치환된 알케닐;
임의 치환된 알키닐;
-COR5, -SOR5, 또는 -SO2R5이되,
여기서 R5는 H, 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 임의 치환된 헤테로아릴알킬, -OR6 또는 -NR6 2이되, 여기서 각각의 R6는 독립적으로 H, 임의 치환된　알킬, 임의 치환된　 아릴, 또는 임의 치환된　 헤테로아릴이거나, 또는 두 R6 기 모두는 이들이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하고; 또는
SR7이되, 여기서 R7은 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴알킬인 것인 하이드로겔.
[0093] 화학식(Ia)의 링커-약물의 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 -CN이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 -NO2이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 6-10개의 탄소를 함유하는 임의 치환된 아릴이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자 끄는 기는 임의 치환된 페닐, 나프틸, 또는 안트라세닐. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 3-7개의 탄소를 포함하고 N, O, 또는 S 원자 중 적어도 하나를 포함하는 임의 치환된 헤테로아릴이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 피롤릴, 피리딜, 피리미디닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 아이속사졸릴, 싸이아졸릴, 아이소싸이아졸릴, 퀴놀릴, 인돌릴, 또는 인데닐이며, 각각은 임의 치환된다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 2-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알케닐이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 2-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알키닐이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 -COR5, -SOR5, 또는 -SO2R5이되, 여기서 R5는 H, 1-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 임의 치환된 헤테로아릴알킬, -OR6 또는 -NR6 2이되 각각의 R6은 독립적으로 H 또는 1-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R6 기 모두 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 -SR7이되 여기서 R7은 1-20 개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴알킬이다.
[0094] 화학식(Ia)의 링커-약물의 일부 구현예에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN, -SOR5 또는 -SO2R5이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN 또는 -SO2R5이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN 또는 -SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 또는 이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN, -SO2N(CH3)2, -SO2CH3, -SO2Ph, -SO2PhCl, -SO2N(CH2CH2)2O, -SO2CH(CH3)2, -SO2N(CH3)(CH2CH3), 또는 -SO2N(CH2CH2OCH3)2이다.
[0095] 화학식(Ia)의 링커-약물의 일부 구현예에서, 각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 R4는 메틸이다. 일부 구현예에서, 두 개의 R4 모두는 메틸이다.
[0096] 화학식(Ia)의 링커-약물의 일부 구현예에서, n은 1 내지 6의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 1 내지 3의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 0 내지 3의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 0이다. 일부 구현예에서, n은 1이다. 일부 구현예에서, n은 2이다. 일부 구현예에서, n은 3이다. 일부 구현예에서, n은 4이다. 일부 구현예에서, n은 5이다. 일부 구현예에서, n은 6이다.
[0097] 화학식(Ia)의 링커-약물의 일부 구현예에서, R1은 CN 또는 -SO2R5이되, 여기서 R5는 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 -NR6 2이고, R6는 독립적으로 C1-C6 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고, R2 = H이고, 여기서 R5 및 R6 각각은 독립적으로 임의 치환된다.
[0098] 화학식(Ia)의 링커-약물의 일부 구현예에서, Z는 컨쥬게이션에 대해 기술 분야 내 공지된 임의의 작용기를 포함할 수 있다. 이러한 작용기의 예로는 아민, 아미노옥시, 케톤, 알데하이드, 말레이미딜, 싸이올, 알코올, 아자이드, 1,2,4,5-테트라아지닐, 트랜스-사이클로옥테닐, 바이사이클로노니닐, 사이클로옥티닐, 및 이의 보호된 변이체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Z는 보호된 아민, 보호된 아미노옥시, 케톤 또는 보호된 케톤, 알데하이드 또는 보호된 알데하이드, 말레이미딜, 보호된 싸이올, 보호된 알코올, 아자이드, 1,2,4,5-테트라아지닐, 트랜스-사이클로옥테닐, 바이사이클로노니닐, 또는 사이클로옥티닐을 포함한다. 일부 구현예에서, Z는 아자이드, 케톤, 또는 보호된 케톤을 포함한다. 일부 구현예에서, Z는 거대분자 담체 상의 동족 작용기 Z'와 선택적으로 반응하여 연결 작용기 Z*를 형성할 수 있는 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 작용기 Z*는 Z/Z'가 아민/카복실레이트 또는 활성 에스터인 경우, 카복사마이드이고; Z/Z'가 NH2O/케톤 또는 알데하이드인 경우, 옥심이고; Z/Z'가 싸이올/말레이미드 또는 할로카보닐인 경우, 싸이오에터이고; 또는 Z/Z'가 아자이드/사이클로옥틴인 경우, 트라이아졸이다.
[0099] 화학식(Ia)의 링커-약물의 일부 구현예에서, S는 부재한다. 일부 구현예에서, S는 (CH2CH2O)h(CH2)gCONH이다.
[0100] 화학식(Ia)의 링커-약물의 일부 구현예에서, Y는 부재한다. 일부 구현예에서, Y는 NH(CH2CH2O)p(CH2)m이다.
[0101] 본 명세서의 설명에서, 하나의 모이어티의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는 다른 모이어티의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태와 조합될 수 있으며, 각각의 모든 설명 조합이 구체적으로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하게 이해해야 한다. 예를 들어, 화학식(I)의 R1에 대해 본 명세서에 제공된 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는 Z, S, n, R2, R4, Y, 및/또는 D의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태와 조합될 수 있으며, 각각의 모든 조합이 구체적으로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하다. 또한, 화학식(I), (Ia), (IIa), (IIIa), (IV), (V), 또는 (VI)와 같은 임의의 화학식의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는, 적용 가능한 경우, 본 명세서에 설명된 다른 화학식에 동일하게 적용되고, 동일하게 기재되며, 각각의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태가 모든 화학식에 대해 별도로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하게 이해된다. 예를 들어, 화학식(I)의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는, 적용 가능한 경우, 본 명세서에 설명된 임의의 화학식, 예컨대 화학식(Ia), (IIa), (IIIa), (IV), (V), 또는 (VI)에 동일하게 적용되고, 동일하게 기재되며, 각각의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태가 모든 화학식에 대해 별도로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하다.
링커
[0102] 또 다른 양태에서, 화학식(IIa)의 링커:
Figure pct00007
(IIa)
가 제공되며, 여기서 n, Z, S, R1, R2, 및 R4는 화학식(Ia)에 대해 본 명세서에 개시된 바와 같고; X는 할로겐, 활성 에스터 (예를 들어, N-석신이미딜옥시, 나이트로페녹시, 또는 펜타할로페녹시), 또는 NH(CH2CH2O)p(CH2)(m-1)CHO이되, 여기서 m은 2 내지 6의 정수이고 p는 0 내지 1000의 정수이다. 일부 구현예에서, X는 할로겐이다. 일부 구현예에서, X는 석신이미딜옥시와 같은 활성 에스터이다. 일부 구현예에서, X는 할라이드, 석신이미딜옥시, 또는 나이트로페녹시. 일부 구현예에서, X는 NH(CH2CH2O)p(CH2)(m-1)CHO이다. X가 NH(CH2CH2O)p(CH2)(m-1)CHO인 링커는 환원성 알킬화에 의해 사이토카인에 부착될 수 있는데, 상기 알킬화에서 링커의 알데하이드 기는 이민과 함께 사이토카인의 아민 기를 형성하고, 이러한 이민은 소듐 사이아노보로하이드라이드와 같은 환원제의 존재하에 아민으로 환원된다. 상기 방법은 일반적으로 사이토카인의 N-말단 알파-아민 기에 연결에 대해 선택적이다. 이러한 구현예에서, 링커의 절단 시 컨쥬게이트로부터 방출된 사이토카인은 NH2(CH2CH2O)p(CH2)m의 첨가에 의해 N-말단 알파-아민에서 변형된다. 이러한 링커는 문헌 [Schneider et al. (2016) BioBioconjugate Chem 27: 2534-9 (본 명세서에 참조 문헌으로 포함)]에 기재된 바와 같이 제조된다. 일부 구현예에서, p는 0이며 링커의 절단 시 컨쥬게이트로부터 방출된 사이토카인은 NH2(CH2)m의 첨가에 의해 N-말단 알파-아민에서 변형된다.
[0103] 화학식(IIa)의 링커의 일부 구현예에서, n = 1-6이고, R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고; 각각의 R4는 H 또는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 결합되어 3-6 원 고리를 형성할 수 있고; Z는 링커를 거대분자 담체에 연결하기 위한 기이고; S는 부재하거나 또는 (CH2CH2O)h(CH2)gCONH이되, 여기서 g = 1-6 및 h = 0-1000이고; X는 할라이드, 석신이미딜옥시, 또는 나이트로페녹시이다.
[0104] 이러한 링커 시약의 제조는 미국 특허 8,680,315 및 PCT 특허 출원 PCT/US2020/026726 (2020년 4월 3일자)에 개시되어 있으며, 상기 문헌 둘 모두는 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
[0105] 이러한 링커는 기술 분야 내 공지된 방법에 의해, 예를 들어, pH 6 내지 9 에서, 바람직하게 pH 7 내지 8에서, 단백질의 완충액과 반응함하여 단백질의 아민 기가 아실화되어 화학식(I)의 링커-단백질을 형성함으로써, 사이토카인 또는 사이토카인 변이체에 부착된다. 단백질 상의 하나 이상의 아민 기가 반응에 사용할 수 있는 경우, 여러 링커가 각 단백질에 부착될 수 있다. 단백질에 부착되는 링커의 수에 대한 선택성은 단백질에 대한 링커 시약의 화학량론을 사용하여 제어될 수 있다. 오직 하나의 링커가 부착되는 경우, 링커의 절단 시 컨쥬게이트로부터 방출되는 단백질은 추가적으로 변형되지 않는다.
컨쥬게이트
[0106] 또 다른 양태에서, 화학식(III)의 컨쥬게이트:
M-[Z*-L-D]q (III)
가 제공되며, 여기서 M은 거대분자 담체이고, Z*는 연결 작용기이고, L은 절단가능한 링커이고, D는 사이토카인 또는 사이토카인 변이체 단백질이며, M이 가용성 거대분자 담체인 경우 q는 1 내지 10의 정수이거나, 또는 M이 불용성 거대분자 담체인 경우 q는 다중도이다. M이 불용성 거대분자 담체 예컨대 불용성 매트릭스 또는 지지체인 경우, 다수의 링커-약물이 M에 부착될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, M이 화학식(IV)의 하이드로겔이되 P1 및 P2 모두 4-아암 중합체인 경우, 1, 2, 3, 또는 4 개의 링커-약물이 각 P1-P2 유닛에 부착될 수 있다. 이에 따라, 바람직한 다중도는 링커-약물을 M과 적합한 비율로 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 이와 같이, 매트릭스의 부피에서 적합한 약물 농도가 달성될 수 있다.
[0107] 일부 구현예에서, 화학식(III)의 컨쥬게이트는 화학식(IIIa)이고:
Figure pct00008
(IIIa).
여기서 M, Z*, S, n, R1, R2 및 R4, Y 및 D는 화학식(I), (Ia), 또는 (IIa)에 대해 본 명세서에 설명된 바와 같이 정의된다.
[0108] 일부 구현예에서, M은 가용성 거대분자 담체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 단백질, 또는 항체이고; Z*는 연결기이고; q = 1 내지 10이다. 각각의 경우에 , M은 반응성 Z' 기를 포함하며, 이는 화학식(I)의 화합물의 Z 기와 반응하여 연결기 Z*를 형성한다. 연결기 Z*는 Z/Z'가 아민/카복실레이트 또는 활성 에스터인 경우, 카복사마이드이고; Z/Z'가 아미노옥시/케톤 또는 알데하이드인 경우, 옥심이고; Z/Z'가 싸이올/말레이미드 또는 할로카보닐인 경우, 싸이오에터이고; 또는 Z/Z'가 아자이드/사이클로옥틴인 경우, 트라이아졸이다. 일부 구현예에서, Z*는 아마이드, 카복사마이드, 옥심, 트라이아졸, 싸이오에터, 싸이오석신이미드, 또는 에터를 포함한다. 일부 구현예에서,
[0109] 일부 구현예에서, M은 평균 분자량이 1,000 내지 100,000 달톤, 바람직하게 10,000 내지 60,000 달톤, 및 가장 바람직하게 20,000 내지 40,000 달톤인 폴리에틸렌 글리콜이다. M은 단일 사슬, 분지형 사슬, 또는 다중 아암일 수도 있다. M은 링커 약물에 부착하기 위한 하나 이상의 작용기 Z'를 포함한다. Z'는 기술 분야 내 공지된 방법을 사용하여 상업적으로-수득가능한 중합체 M에 부착될 수 있고; 예를 들어, M이 아민 기를 포함하는 경우, 이는 (Boc-아미노옥시)아세트산과의 반응 후 보호해제를 통해 Z' = 아미노옥시를 도입하는 아실화에 의해; 사이클로옥틴의 활성 에스터 또는 카보네이트 (예를 들어, 4-사이클로옥티닐 석신이미딜 카보네이트 또는 (1R,8S,9s)-바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시 석신이미딜 카보네이트 (BCN-OSu) 또는 이의 (1R,8S,9r) 부분입체 이성질체)와의 반응을 통해 Z' = 사이클로옥틴을 도입하기 위한 아실화에 의해; 또는 3-말레이미도프로피온산과의 반응을 통해 말레이미드 기를 도입하기 위한 아실화에 의해, 추가적으로 유도체화될 수 있다.
[0110] 일부 구현예에서, M은 하이드로겔 또는 수술 장치와 같은 불용성 거대분자 담체이다. 이러한 구현예에서, q는 불용성 지지체에 부착되는 반응성 Z'기의 수에 의해 결정되는 다중도이다. 일부 구현예에서, M은 화학식(IV)의 분해성 가교 하이드로겔이며:
Figure pct00009
(IV),
여기서 P1 및 P2는 독립적으로 r-아암 중합체 (여기서 r이 2 내지 8의 정수)이고;
n은 0 내지 6의 정수이고;
x, y, 및 z는 각각 독립적으로 0-6의 정수이고;
B는 Z'를 포함하는 기이고;
A* 및 C*는 각각 독립적으로 연결기 예컨대 카복사마이드, 옥심, 에터, 싸이오에터, 또는 트라이아졸이고;
R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, C1-C4 알킬, 또는 전자 끄는 기이되, 여기서 R11 또는 R12 중 적어도 하나는 전자 끄는 기이고;
각각의 R14는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 두 개의 R14는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 3-6 원 고리를 형성한다;
[0111] R11 및 R12의 전자 끄는 기에 대한 설명은 미국 특허 8,680,315에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다. 화학식(IV)의 하이드로겔의 일부 구현예에서, R11 및 R12의 전자 끄는 기는
-CN;
-NO2;
임의 치환된 아릴;
임의 치환된 헤테로아릴;
임의 치환된 알케닐;
임의 치환된 알키닐;
-COR15, -SOR15, 또는 -SO2R15이되,
여기서 R15는 H, 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 임의 치환된 헤테로아릴알킬, -OR16 또는 -NR16 2이되, 여기서 각각의 R16은 독립적으로 H, 임의 치환된　알킬, 임의 치환된　 아릴, 또는 임의 치환된　 헤테로아릴이거나, 또는 두 R16 기 모두 이들이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하거나; 또는
SR17이되, 여기서 R17은 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴알킬이다.
[0112] 화학식(IV)의 하이드로겔의 일부 구현예에서, R11 및 R12의 전자 끄는 기는 -CN이다. 일부 구현예에서, R11 및 R12의 전자-끄는 기는 -NO2이다. 일부 구현예에서, R11 및 R12의 전자-끄는 기는 6-10개의 탄소를 함유하는 임의 치환된 아릴이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R11 및 R12의 전자 끄는 기는 임의 치환된 페닐, 나프틸, 또는 안트라세닐. 일부 구현예에서, R11 및 R12의 전자-끄는 기는 3-7개의 탄소를 포함하고 N, O, 또는 S 원자 중 적어도 하나를 포함하는 임의 치환된 헤테로아릴이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R11 및 R12의 전자-끄는 기는 피롤릴, 피리딜, 피리미디닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 아이속사졸릴, 싸이아졸릴, 아이소싸이아졸릴, 퀴놀릴, 인돌릴, 또는 인데닐이며, 각각은 임의 치환된다. 일부 구현예에서, R11 및 R12의 전자-끄는 기는 2-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알케닐이다. 일부 구현예에서, R11 및 R12의 전자-끄는 기는 2-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알키닐이다. 일부 구현예에서, R11 및 R12의 전자-끄는 기는 -COR15, -SOR15, 또는 -SO2R 15, 이되 여기서 R3는 H, 1-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 임의 치환된 헤테로아릴알킬, -OR16 또는 -NR16 2이되 각각의 R16은 독립적으로 H 또는 1-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R16 기 모두 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, R11 및 R12의 전자-끄는 기는 -SR17이되 여기서 R17은 1-20 개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴알킬이다.
[0113] 화학식(IV)의 하이드로겔의 일부 구현예에서, R11 및 R12 중 적어도 하나는 -CN, -SOR15 또는 -SO2R15이다. 일부 구현예에서, R11 및 R12 중 적어도 하나는 -CN 또는 -SO2R15이다. 일부 구현예에서, R11 및 R12 중 적어도 하나는 -CN 또는 -SO2R15이되, 여기서 R15는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 또는 이다. 일부 구현예에서, R11 및 R12 중 적어도 하나는 -CN, -SO2N(CH3)2, -SO2CH3, -SO2Ph, -SO2PhCl, -SO2N(CH2CH2)2O, -SO2CH(CH3)2, -SO2N(CH3)(CH2CH3), 또는 -SO2N(CH2CH2OCH3)2이다.
[0114] 화학식(IV)의 하이드로겔의 일부 구현예에서, 각각의 R14는 독립적으로 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, R14 중 적어도 하나는 메틸이다. 일부 구현예에서, 두 개의 R14 모두는 메틸이다.
[0115] 화학식(IV)의 하이드로겔의 일부 구현예에서, R11은 CN 또는 -SO2R15이되, 여기서 R15은 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 -NR16 2이고, 각각의 R16은 독립적으로 C1-C6 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고, R12 = H이며, 여기서 R15 및 R16 각각은 독립적으로 임의 치환된다.
[0116] 이러한 하이드로겔에 부착된 링커-단백질에 대한 일반 화학식이 도 1에 도시되어 있다.
[0117] 구체적인 구현예에서, M은 화학식(V) 또는 화학식(VI)의 하이드로겔이며
Figure pct00010
(V)
Figure pct00011
(VI).
여기서 P1, P2, r, R11, R12, 및 R14는 화학식(IV)에 대해 본 명세서에 설명된 바와 같고;
Z'는 사이클로옥틴 기를 포함한다. 구체적인 구현예에서, Z'는 4-사이클로옥티닐옥시카보닐 또는 (1R,8S,9s)-바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시카보닐이다.
[0118] 상기 화학식의 하이드로겔 지지체의 제조는 미국 특허 9,649,385 및 PCT/US2020/026726 (2020년 4월 3일자)에 개시되어 있으며, 상기 문헌 각각은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
[0119] 상기 기재된 컨쥬게이트는 사이토카인의 저용량, 연속 용량을, 이러한 요법으로 치료될 수 있는 질병 또는 병태를 가지는 대상체에게 공급하기 위해 사용될 수 있다. 사이토카인의 저용량, 연속 용량 요법으로 치료될 수 있는 구체적인 질병 및 병태로는 관용원성 CD4+ CD25+ FOXP3+ 조절 T 세포의 부적절한 재구성과 관련된 만성 이식편대숙주병 (chronic graft-vs-host disease, cGVHD) (Koreth et al., Blood128: 130-7 (2016)); 전신성 홍반성 루푸스; 유육종증; C형 간염 유발 혈관염; 원형 탈모증; 류마티스 관절염; 염증성 장 질병; 다발성 경화증; 및 제1형 당뇨병 (Koreth et al., Oncology & Hematology Review 10: 157-63 (2014))을 포함한다. 외인성 사이토카인을 통한 면역 증강은 암 및 면역결핍의 치료에 유용할 수 있다.
[0120] 본 발명의 컨쥬게이트는 기술 분야 내 공지된 표준 완충액 및 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다. 사용되는 완충액은 바람직하게 pH 3 내지 pH 7, 더욱 바람직하게 pH 4 내지 pH 6이다. 투여는 가용성 컨쥬게이트의 경우 정맥내, 피하, 또는 유리체내, 근육내일 수 있고, 불용성 컨쥬게이트의 경우 피하, 유리체내, 또는 근육내일 수 있다. 종양내 주사가 또한 사용될 수 있다.
약제학적 조성물
[0121] 또 다른 양태에서, 본 명세서에는 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 함께 약제학적으로 허용되는 완충제 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 완충제는 링커의 안정성이 저장하는 동안 및 필요한 경우 재구성할 시에 유지되도록 선택되며, 일반적으로 pH가 2 내지 7, 바람직하게 2 내지 6, 및 더욱 바람직하게 2 내지 5이다. 허용되는 완충제로는 아세트산, 시트르산, 인산, 히스티딘, 글루콘산, 아스파르트산, 글루탐산, 락트산, 타르타르산, 숙신산, 말산, 푸마르산, 알파-케토글루타르산 등을 포함한다. 부형제에는 소듐 클로라이드과 같은 장성 및 삼투압 제제; 구연산 또는 구연산염, 및 파라벤과 같은 방부제; 페놀 및 크레졸과 같은 항균제; 뷰틸화 하이드록시톨루엔, 비타민 A, C, E, 시스테인, 메티오닌 등의 항산화제; 자당, 폴리올, 히알루론산 및 카복시메틸셀룰로스와 같은 밀도 조절제. 이러한 제형은 당업자에게 공지된 종래의 방법, 예를 들어 [“Remington's Pharmaceutical Science,”A.R. Gennaro, ed., 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA]에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 공급될 수 있거나, 또는 예를 들어 액체 조성물의 동결 건조에 의해, 고체로서 제공될 수 있다. 이러한 동결건조물은 사용 전에 신속하고 효율적인 재구성을 보장하기 위해 증량제를 추가로 포함할 수 있다.
사용 방법
[0122] 또 다른 양태에서, 상기 기재된 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 개체에서 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 개체에게 본 명세서에 기재된 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트 또는 본 명세서에 기재된 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. “개체”는 인간, 또는 고양이, 개, 소, 쥐, 마우스, 말, 토끼 또는 기타 가축과 같은 동물일 수 있다.
[0123] 또한 질병 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 본 명세서에는 질병 또는 병태의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 명세서에 기재된 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트의 용도가 제공된다.
[0124] 치료를 필요로 하는 적용 가능한 질병 또는 병태는 컨쥬게이트 약물의 성질로부터 당업자에 의해 공지될 것이다.
[0125] 다음의 특정 예시적인 구현예가 하기에 제공된다:
구현예 1. 다음의 화학식을 가지는 컨쥬게이트로서
M-[Z*-L-D]q
여기서 M은 거대분자 담체이고;
Z*는 연결 작용기이고;
L은 절단가능한 링커이고;
D는 사이토카인 또는 이의 변이체의 아민 잔기이고;
여기서 M이 가용성 담체인 경우, q = 1-10이고, M이 불용성 담체인 경우, q는 다중도인 컨쥬게이트.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, Z*는 카복사마이드, 옥심, 싸이오에터, 또는 트라이아졸이고; L은 화학식이되
Figure pct00012
여기서
n = 0-6 또는 1-6이고;
R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나, 또는 두 R4 모두는 함께 3-6 원 고리를 형성하고;
S는 부재하거나 또는 (CH2CH2O)h(CH2)gCONH이되, 여기서 g = 1-6 및 h = 0-1000이고;
Y는 부재하거나 또는 NH(CH2CH2O)p(CH2)m이되, 여기서 m = 2-6 및 p = 0-1000인 것인 컨쥬게이트.
구현예 3. 구현예 2에 있어서, R1은 CN 또는 R5SO2이되 여기서 R5는 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로아릴이거나, 또는 (R6)2N이고, R6는 C1-C6 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고, R2 = H이며, 여기서 R4 - R6 각각은 임의 치환될 수 있는 것인 컨쥬게이트.
구현예 4. 구현예 1-3 중 어느 하나에 있어서, M은 평균 분자량이 1,000 내지 100,000 달톤인 가용성 폴리에틸렌 글리콜이고, q = 1-10인 것인 컨쥬게이트.
구현예 5. 구현예 1-3 중 어느 하나에 있어서, M은 불용성 하이드로겔 또는 수술 장치이고, q는 다중도인 것인 컨쥬게이트.
구현예 6. 구현예 1-3 중 어느 하나에 있어서, D는 IL-2, IL-7, IL-9, IL-10, IL-15, IL-21 또는 이의 변이체인 것인 컨쥬게이트.
구현예 7. 구현예 6에 있어서, D는 이량체 βγ 수용체에 비해 삼량체 αβγ-수용체에 대한 선택적 결합을 가지는 IL-2 변이체이거나 또는 삼량체 αβγ-수용체에 비해 이량체 βγ-수용체에 대한 선택적 결합을 가지는 IL-2 변이체인 것인 컨쥬게이트.
구현예 8. 구현예 1-3 중 어느 하나에 있어서, D는 탈아마이드화에 대해 안정화된 IL-15 변이체인 것인 컨쥬게이트.
구현예 9. 다음 화학식의 링커-단백질로서,
Figure pct00013
여기서 n = 1-6이고, R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고; 각각의 R4는 H 또는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 결합되어 3-6 원 고리를 형성할 수 있고; Z는 링커를 거대분자 담체에 연결하기 위한 작용기이고; S는 부재하거나 또는 (CH2CH2O)h(CH2)gCONH이되, 여기서 g = 1-6 및 h = 0-1000이고; Y는 부재하거나 또는 NH(CH2CH2O)p(CH2)m이되, 여기서 m = 2-6 및 p = 0-1000이고; D는 사이토카인 또는 이의 변이체의 아민 잔기인 것인 링커-단백질.
구현예 10. 구현예 9에 있어서, R1은 CN 또는 R5SO2이되, 여기서 R5는 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로아릴이거나, 또는 (R6)2N이고, R6는 C1-C6 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고, R2 = H이며, 여기서 R4 - R6 각각은 임의 치환될 수 있는 것인 링커-단백질.
구현예 11. 구현예 9 또는 10에 있어서, D는 IL-2, IL-7, IL-9, IL-10, IL-15, IL-21 또는 이의 변이체인 것인 링커-단백질.
구현예 12. 구현예 11에 있어서, D는 이량체 βγ 수용체에 비해 삼량체 αβγ-수용체에 대한 선택적 결합을 가지는 IL-2 변이체이거나 또는 삼량체 αβγ-수용체에 비해 이량체 βγ-수용체에 대한 선택적 결합을 가지는 IL-2 변이체인 것인 링커-단백질.
구현예 13. 구현예 12에 있어서, D는 IL-2, IL-2 N88R, IL-2 N88D, IL-2 N88R,C125S, 및 IL-2 N88D,C125S으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 링커-단백질.
구현예 14. 구현예 9 또는 10에 있어서, D는 IL-15, IL-15 N77A, 및 IL-15-[N71S,N72A,N77A]으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 링커-단백질.
구현예 15. 구현예 9 또는 10에 있어서, D는 IL-2, IL-7, IL-9, IL-10, IL-15, IL-21, 또는 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 N-알파 아민 기는 NH2(CH2CH2O)p(CH2)m (여기서 m = 2-6 및 p = 0-1000)를 첨가하여 변형되는 것인 링커 단백질.
구현예 16. 대상체에서 Treg 세포를 선택적으로 확장시키는 방법으로서, D가 IL-2 또는 IL-2 변이체인 구현예 1-3 중 어느 하나의 컨쥬게이트로 치료하는 것으로 구성되는 방법.
구현예 17. 대상체에서 CD8+ 이펙터 T 세포를 선택적으로 확장시키는 방법으로서, D가 IL-15 또는 IL-15 변이체인 구현예 1-3 중 어느 하나의 컨쥬게이트로 치료하는 것으로 구성되는 방법.
구현예 18. 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 구현예 1-8 중 어느 하나의 컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 19. 구현예 18에 있어서, 질병 및 병태는 관용원성 CD4+ CD25+ FOXP3+ 조절 T 세포의 부적절한 재구성과 관련된 만성 이식편대숙주병 (cGVHD); 전신성 홍반성 루푸스; 유육종증; C형 간염 유발 혈관염; 원형 탈모증; 류마티스 관절염; 염증성 장 질병; 다발성 경화증; 및 제1형 당뇨병인 것인 방법.
구현예 20. 요법을 받는 대상체에서 면역요법을 증대시키는 방법으로서, 구현예 1-8 중 어느 하나의 컨쥬게이트를 투여하는 것으로 구성되는 방법.
[0126] 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기보다는 설명하는 역할을 할 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 본 명세서의 개시내용의 특정 양태, 특히 이러한 양태, 뿐만 아니라 일반적으로 인용된 것을 포함하여 참고 문헌으로 포함된다.
제조 A
화학식(IIa)의 링커이되 S가 부재하는 링커
Figure pct00014
[0127] 화학식(IIa)의 링커이되 S가 부재하는 링커를 다음의 일반적인 절차에 따라 제조하였다. 하나의 방법에서, Z 및 R4 기를 포함하는 에스터를 염기, 일반적으로 포타슘 tert-뷰톡사이드 또는 포타슘 tert-펜톡사이드의 존재하에 R1R2CH2와 축합하여 중간체 케톤을 형성하고, 이를 소듐 보로하이드라이드를 사용하여 알코올로 환원시켰다. 이를 트라이포스진 및 피리딘과의 반응으로 활성화시켜 X = Cl인 화학식(IIa)의 링커를 제공하였다. 이것은 클로로포메이트와 N-하이드록시석신이미드의 반응에 의해 X = 석신이미딜옥시로 추가적으로 전환될 수 있다. 또 다른 방법에서, 초기 축합은 먼저 R1R2CH2 를 강염기, 예컨대 뷰틸리튬, 리튬 다이아이소프로필아마이드, 또는 메틸화 헥사메틸다이실라잔과 반응시킨 다음, 생성된 R1R2CH- 카바니온을 에스터로 처리하여 동일한 케톤 중간체를 제공하였다. 일부 구체적인 실시예는 다음과 같다:
(1) 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식(I)이되 여기서 n = 1, R 1 = CN, R 2 = H, R 4 = CH 3 , Z = N 3 , 및 X = 석신이미딜옥시).
[0128] -30 ℃에서 THF 중의 1 M 포타슘 tert-뷰톡사이드 용액 (3.5 mL, 3.5 mmol)을 7 mL의 THF 중의 메틸 3-아지도-2,2-다이메틸프로피오네이트 ([Kim, Synthetic Communications]에 따라 제조; 300 mg, 1.9 mmol) 및 아세토나이트릴 (0.365 mL, 7.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 -30 ℃에서 30 분간 교반한 다음 1 시간에 걸쳐 주위 온도로 가온시키고 추가적인 30 분 동안 교반하였다. 혼합물을 얼음 위에서 냉각시키고 6 N HCl (0.62 mL, 3.7 mmol)을 첨가하여 켄칭한 다음, EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 수상을 2x EtOAc으로 추출하고, 조합된 유기물 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 케톤을 제공하였다.
[0129] 소듐 보로하이드라이드 (33 mg, 0.88 mmol)를 7 mL의 메탄올 중의 미정제 케톤 (300 mg, ca. 1.75 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 15 분간 교반한 다음 켄칭 6 N HCl (0.7 mL)을 첨가하여 켄칭하고, EtOAc와 물 사이에 사이에 분배하였다. 수상을 2x EtOAc으로 추출하고, 및 조합된 유기물 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 알코올을 제공하였다. SiO2 (20-40% EtOAc/헥산)에서 정제하여 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰탄올 (142 mg, 0.85 mmol)을 제공하였다. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) d 3.83-3.92 (m,1H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), 및 0.96 (s,3H).
[0130] 피리딘 (136 uL, 1.7 mmol)을 얼음 위에서 냉각된 8 mL의 THF 중의 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰탄올 (142 mg, 0.85 mmol) 및 트라이포스진 (425 mg, 1.44 mmol)의 용액에 적가하였다. 생성된 현탁액을 주위 온도로 가온시키고 15 분간 교반한 다음, 여과하고 농축하여 미정제 클로로포메이트를 제공하였다. 이것을 8 mL의 THF에 용해시키고, 얼음 위에서 냉각시키고, N-하이드록시석신이미드 (291 mg, 2.5 mmol) 및 피리딘 (204 uL, 2.53 mmol)으로 처리하였다. 생성된 현탁액을 주위 온도로 가온시키고 15 분간 교반한 다음, EtOAc와 5% KHSO4 사이에 분배하였다. 수상을 2x EtOAc으로 추출하고, 및 조합된 유기물 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 석신이미딜 카보네이트를 제공하였다. SiO2 (20-40% EtOAc/헥산)에서 정제하여 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (174 mg, 0.56 mmol)를 제공하였다. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) d 5.03 (dd,J=7.0,5.1,1H), 3.27-3.41 (m,6H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), 및 0.96 (s,3H).
(2) 4-아지도-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식(I)이되 여기서 n = 1, R 1 = SO 2 N(CH 3 ) 2 , R 2 = H, R 4 = CH 3 , Z = N 3 , 및 X = 석신이미딜옥시).
[0131] 불활성 분위기 하에서 헥산 중의 1.43 M의 n-뷰틸리튬 용액 (70 mL, 100 mmol)을 -50 ℃로 유지되어 200 mL의 무수 THF 중의 N,N-다이메틸 메탄설폰아마이드 (12.33 g, 100 mmol)의 교반되는 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1 시간에 걸쳐 -20 ℃로 가온시킨 다음, -50 ℃로 재냉각시키고, 메틸 3-아지도-2,2,-다이메틸프로피오네이트 ([Kim, Snythetic Communications]에 따라 제조; 7.70 g, 50 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 2 시간에에 걸쳐 +10 ℃로 가온시킨 다음, 20 mL의 6 N HCl을 첨가하여 켄칭하였다. 혼합물을 메틸 t-뷰틸 에터 (MTBE, 200 mL)으로 희석하고, 2x 100 mL의 물 및 1x 100 mL의 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 14.05 g의 미정제 케톤 생성물을 산출하였다. SiO2 (220 g) 상에서 0, 20, 30, 40, 및 50% EtOAc/헥산의 단계적 구배를 사용하는 크로마토그래피는, 결정질 고체로서 정제된 4-아지도-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰타논 (10.65 g, 86%)을 산출하였다.
[0132] 상기 케톤을 200 mL의 메탄올에 용해시키고, 얼음 위에서 냉각하고, 소듐 보로하이드라이드 (0.96 g, 25 mmol)로 15 분간 처리한 후 4 mL의 6 N HCl로 ??칭하고 농축하였다. 생성된 슬러리를 메틸 t-뷰틸 에터 (MTBE, 200 mL)으로 희석하고, 1x 100 mL의 물 및 1x 100 mL의 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 10.0 g의 결정질 4-아지도-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰탄올을 산출하였다.
[0133] 피리딘 (10.6 mL, 132 mmol)을 10 분에 걸쳐 얼음 위에서 냉각된 250 mL의 다이클로로메탄 중의 N-하이드록시석신이미드 (6.90 g, 60 mmol) 및 트라이포스진 (5.93 g, 20 mmol)의 교반 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 얼음 위에서 15 분간 교반한 다음, 30 분에 걸쳐 주위 온도로 가온시켰다. 20 mL의 다이클로로메탄 중의 4-아지도-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰탄올 (10.0 g, 40 mmol) 용액을 첨가하고 혼합물을 주위 온도에서에서 추가적인 1 시간 동안 교반하였다. 얼음 위에서 냉각한 후, 혼합물을 100 mL의 물로 처리하고 상을 분리하였다. 유기 상을 2x 물, 1x 5% KHSO4, 및 1x 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 미정제 생성물을 100 mL의 30% EtOAc/헥산으로부터 결정화하고, 백색 결정질 고체로서 4-아지도-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (11.1 g, 71%)를 수득하였다.
(3) 이러한 절차에 따라 제조된 화학식(I)의 추가적인 화합물은 다음을 포함한다:
4-아지도-1-(메틸설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2CH3, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-((4-메틸피페리디닐)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2N(CH2CH2)2CHCH3, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시). LC/MS는 [M+H]+ = 446.15를 나타낸다.
4-아지도-1-(페닐설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2Ph, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-(4-클로로페닐설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2PhCl, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-(4-모폴리노설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2N(CH2CH2)2O, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-(아이소프로필설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2CH(CH3)2, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-((N-에틸-N-메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2N(CH3)(CH2CH3), R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-((N,N-비스(2-메톡시에틸)아미노설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2N(CH2CH2OCH3)2, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-(4-메틸페닐설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2PhCH3, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-(tert-뷰톡시카보닐)아미노-1-(메틸설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2CH3, R2 = H, R4 = CH3, Z = NH-Boc, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-(tert-뷰톡시카보닐)아미노-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2CH3, R2 = H, R4 = CH3, Z = NH-Boc, 및 X = 석신이미딜옥시).
화학식(I)의 화합물이되 S가 부재하고 각각의 R4가 H인 화합물을 또한 [Santi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109(16): 6211-6]에 따라 제조하였다.
제조 B
화학식(IIa)의 링커
여기서 S = (CH 2 CH 2 O) h (CH2) g C(O)NH 및 X = NH(CH 2 CH 2 O) p (CH 2 ) (m-1) CHO
Figure pct00015
[0134] 화학식(IIa)의 링커이되 여기서 S = (CH2CH2O)h(CH2)gC(O)NH 및 X = NH(CH2CH2O)p(CH2)(m-1)CHO인 링커를 다음과 같이 제조하였다. 하나의 방법에서, 화학식(IIa)의 링커이되 Z가 아자이드이고, S가 부재하고, X = 석신이미딜옥시인 링커를 아민-아세탈 H2N-(CH2)m-1CH(OR)2 (R은 알킬)과 반응시켜 아지도 카바메이트 아세탈을 제공하였다. 팔라듐 촉매를 통한 촉매적 수소 첨가 분해에 의해 또는 물의 존재하에 트라이메틸포스핀을 사용한 Staudinger 환원에 의해, 아자이드 기를 아민으로 환원시킨 다음, 스페이서-석신이미딜 에스터 Z-(CH2CH2O)h(CH2)gC(O)OSu를 첨가하여 링커를 아세탈-보호 형태로 제공하였다. 그런 다음, 산성 조건 하에서 아세탈의 가수분해로 S = (CH2CH2O)h(CH2)gC(O)NH, 및 X = NH(CH2CH2O)p(CH2)(m-1)CHO인 화학식(IIa)의 링커를 제공하였다. 구체적인 실시예는 다음과 같다:
7-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸아마이도)-1-(4-페닐설포닐)-2-헵틸 N-(3-옥시프로필) 카바메이트 (화학식 IIa이되, 여기서 Z = N 3 , S = (CH 2 CH 2 O) 4 (CH2) 2 C(O)NH, n = 5, R 1 = (4-메틸페닐)SO 2 , R 2 = H, 각각의 R 4 = H, 및 X = NH(CH 2 ) 2 CHO)):
Figure pct00016
[0135] (1) 7-아지도-1-(4-메틸페닐설포닐)-2-헵틸 N-(3,3-다이에톡시프로필) 카바메이트. 7-아지도-1-(4-메틸페닐설포닐)-2-헵틸 석신이미딜 카보네이트 (125 mg, 277 μmol, 50 mM 최종 농도) (Santi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109(16): 6211-6)를 5.5 mL의 MeCN에 용해시키고, 1-아미노-3,3-다이에톡시프로판 (54 μL, 0.33 mmol, 60 mM 최종 농도)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 15 분 이내에, TLC으로 판단한 바와 같이 출발 카보네이트는 완전히 소모되었다. 반응 혼합물을 100 mL의 1:1 EtOAc:NaHCO3 (포화 수용액) 사이에 분배하였다. 수성 층을 40 mL의 EtOAc으로 추출하였다. 조합된 유기층을 물, KHSO4 (5% 수용액), 물 및 염수 (각각 1 x 30 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 분리하고, MgSO4으로 건조시키고, 여과하고 농축시켜 무색 오일로서 109 mg (81% 미정제)의 표제 화합물을 제공하였으며, 그 전체를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.76 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.33 (d, J=8.1 Hz, 2H), 5.04 (quin, J=6.8 Hz, 1H), 4.91 (t, J=5.4 Hz, 1H), 4.49 (t, J=5.2 Hz, 1H), 3.62 (m, 2H), 3.37-3.53 (m, 3H), 3.10-3.25 (m, 5H), 2.42 (s, 3H), 1.74 (q, J=5.8 Hz, 2H), 1.63 (br q, J=5.7 Hz, 2H), 1.52 (m, 2H), 1.30 (br m, 4H), 1.17 (td, J=7.0, 2.1 Hz, 6H).
LC-MS (m/z): 계산치, 529.2; 관찰치, 529.6 [M+HCO2]-.
Figure pct00017
[0136] (2) 7-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸아마이도)-1-(4-메틸페닐설포닐)-2-헵틸 N-(3,3-다이에톡시프로필) 카바메이트. 7-아지도-1-(4-메틸페닐설포닐)-2-헵틸 N-(3,3-다이에톡시프로필) 카바메이트 (109 mg, 225 μmol, 0.1 M 최종 농도)를 2.3 mL의 무수 EtOH에 용해시켰다. 탄소 상의 팔라듐 (10%, 활성화, 109 mg)을 첨가하였다. 반응 플라스크를 고무 격막으로 밀봉한 다음 비우고 수소 가스로 (3x) 다시 채웠다. 반응 혼합물을 H2 (풍선)의 분위기 하의 주위 온도에서 격렬하게 교반하였다. 90 분 이내에, TLC으로 판단한 바와 같이 출발 물질은 완전히 소모되었다. 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)의 짧은 피펫 플러그를 통해 여과하고, 패드를 10 mL의 EtOH으로 세척하였다. 여액을 농축 건조시켜 90 mg의 오일로서 중간체 아민을 제공하였으며, 그 전체를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
미정제 7-아미노-1-(4-메틸페닐설포닐)-2-헵틸 N-(3,3-다이에톡시프로필) 카바메이트 (90 mg, 0.20 mmol max, 0.1 M 최종 농도)를 2.0 mL의 MeCN에 용해시켰다. 석신이미딜 15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데카노에이트 (93 mg, 0.24 mmol, 0.12 M 최종 농도) 및 DIPEA (42 μL, 0.22 mmol)를 첨가하고, 반응을 주위 온도에서 교반하고 TLC으로 모니터링하였다. 1 시간 후, 반응 혼합물을 60 mL의 1:1 EtOAc:NaHCO3 (포화 수용액) 사이에 분배하였다. 유기층을 물, 시트르산 (10% 수용액), 물 및 염수 (각각 1 x 30 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 분리하고, MgSO4으로 건조시키고, 여과하고 농축 건조시켰다. 미정제 생성물을 4 g SiliaSep 컬럼에서 정제하여, CH2Cl2 중의 0%, 10%, 20%, 30%, 40% 및 50% (각각 30 mL)의 아세톤의 단계적 구배로 용리하였다. 깨끗한 생성물-함유 분획을 조합하고 농축하여 무색 오일로서 표제 화합물 (68 mg, 93 μmol, 2 단계로 41%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.76 (d, J=8.3 Hz, 2H), 7.32 (d, J=8.1 Hz, 2H), 6.60 (br t, J=5.8 Hz, 1H), 4.95-5.08 (m, 2H), 4.50 (br t, J=4.9 Hz, 1H), 3.56-3.74 (m, 18H), 3.40-3.52 (m, 3H), 3.36 (t, J=5.1 Hz, 2H), 3.10-3.26 (m, 5H), 2.44 (t, J=5.8 Hz, 2H, 가려짐), 2.42 (s, 3H), 1.74 (q, J=6.0 Hz, 2H), 1.62 (br s, 2H), 1.43 (br m, 2H), 1.26 (br s, 4H), 1.17 (td, J=7.0, 2.3 Hz, 6H).
LC-MS (m/z): 계산치, 776.4; 관찰치, 776.7 [M+HCO2]-.
Figure pct00018
[0137] (3) 7-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸아마이도)-1-(4-메틸페닐설포닐)-2-헵틸 N-(3-옥시프로필) 카바메이트. 7-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸아마이도)-1-(4-메틸페닐설포닐)-2-헵틸 N-(3,3-다이에톡시프로필) 카바메이트 (68 mg, 93 μmol, 0.1 M 최종 농도)를 0.62 mL의 CHCl3에 용해하였다. 물 및 TFA (각각 0.16 mL)를 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 격렬하게 교반하였다. 2 시간 후, TLC으로 판단한 바와 같이 출발 아세탈은 완전히 소모되었다. 반응 혼합물을 농축 건조한 다음 4 g SiliaSep 컬럼에서 정제하여, CH2Cl2 중의 0%, 15%, 30%, 45%, 60% and 75% (각각 30 mL)의 아세톤의 단계적 구배로 용리하였다. 깨끗한 생성물-함유 분획을 조합하고 농축하여 무색 오일로서 표제 화합물 (26 mg g, 40 mmol, 43%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ9.78 (s, 1H), 7.78 (d, J=8.3 Hz, 2H), 7.36 (d, J=8.0 Hz, 2H), 6.60 (br s, 1H), 5.09 (m, 1H), 4.98 (t, J=6.0 Hz, 1H), 3.62-3.75 (m, 16H), 3.36-3.44 (m, 5H), 3.13-3.26 (m, 3H), 2.70 (t, J=5.7 Hz, 2H), 2.47 (t, J=5.7 Hz, 2H, 가려짐), 2.45 (s, 3H), 1.63 (br s, 2H), 1.46 (br t, J=6.6 Hz, 2H), 1.29 (m, 4H). LC-MS (m/z): 계산치, 656.3; 관찰치, 656.6 [M-H]-; 계산치, 702.3; 관찰치, 702.6 [M+HCO2]-; 계산치, 734.3; 관찰치, 734.7 [M+CH3OH+HCO2]-.
[0138] 두 번째 방법으로, 화학식(IIa)의 링커이되 Z = Boc-아미노, S = 부재, 및 X = OH인 링커는 유사한 일련의 단계를 통해 수행하였지만, 산성 처리 하에서 Boc 기를 먼저 제거하고 스페이서-석신이미딜 에스터 Z-(CH2CH2O)h(CH2)gC(O)OSu를 부착하였다. 그런 다음 트라이포스진 및 피리딘을 사용한 반응으로 알코올을 활성화하고, 생성된 클로로포메이트를 아민-아세탈 H2N-(CH2)m-1CH(OR)2 (여기서 R은 알킬)과 반응시켜 아세탈-보호된 링커를 제공하였다. 그런 다음, 산성 조건 하에서 아세탈의 가수분해로 S = (CH2CH2O)h(CH2)gC(O)NH, 및 X = NH(CH2CH2O)p(CH2)(m-1)CHO인 화학식(IIa)의 링커를 제공하였다. 구체적인 실시예는 다음과 같다:
Figure pct00019
1-아지도-18,18-다이메틸-20-페닐설포닐-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자이코산-19-일 (3-옥소프로필)카바메이트 (화학식 IIa이되, 여기서 Z = N 3 , S = (CH 2 CH 2 O) 4 (CH2) 2 C(O)NH, n = 1, R 1 = 페닐SO 2 , R 2 = H, 각각의 R 4 = 메틸, 및 X = NH(CH 2 ) 2 CHO.
[0139] 단계 1 및 2. 1-아지도-18,18-다이메틸-20-페닐설포닐-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자-19-이코사놀. 트라이플루오로아세트산 (1 mL)를 1 mL의 CH2Cl2 중의 4-[(tert-뷰톡시카보닐)아미노]-1-페닐설포닐-3,3-다이메틸-2-뷰탄올 (58% w/w 혼합물 124 mg; 72 mg, 0.20 mmol, 0.1 M 최종 농도) 용액에 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 유지하고 TLC으로 모니터링하였다 (헥산 중의 40% EtOAc, 세륨 몰리브데이트 염색). 10 분 후, 출발 물질은 TLC에 의해 보다 극성인 단일 스팟으로 전환되었다. 반응을 농축 건조시키고, 잔류 휘발성 물질을 고진공 하에서 제거하여 백색 필름으로서 중간체 아민을 제공하였다. 중간체를 1.8 mL의 MeCN에 용해시키고, DIPEA (0.17 mL, 1.0 mmol)를 첨가하였다. 순수한 아지도-PEG4-OSu (78 mg, 0.2 mmol)를 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 모니터링하였다. 아지도-PEG4-OSu는 5 분 이내에 빠르게 이동하는 단일 HPLC 피크 단일 완전히 변환되었다. 반응을 농축 건조시킨 후 4 g SiliaSep 실리카 겔 컬럼에 로딩하였다. 생성물을 CH2Cl2 중의 아세톤의 단계적 구배 (0%, 10%, 20%, 30%, 아세톤; 각 단계에 30 mL)로 용리하였다. C18 HPLC으로 판단한 깨끗한 생성물-함유 분획을 조합하고 농축 건조하였다. 잔류 휘발성 물질을 고진공하에 제거하여 무색 오일로서 표제 화합물 (85 mg, 0.16 mmol, 80% 2 단계 수율)을 제공하였다. C18 HPLC, ELSD에 의해 계산된 순도: 98.2% (RV = 9.12 mL).
[0140] 단계 3. 1-아지도-18,18-다이메틸-20-페닐설포닐-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자이코산-19-일 (3,3-다이에톡시프로필)카바메이트. N-하이드록시석신이미드 (92 mg, 0.80 mmol)를 N2 하에서 8.0 mL의 무수 THF 중의 트라이포스진 (0.24 g, 0.80 mmol)의 용액에 첨가하였다. 피리딘 (77 μL, 0.96 mmol)을 적가하고, 백색 침전물이 즉시 형성되었다. 현탁액을 주위 온도에서 15분 동안 교반한 다음, 면 플러그를 통해 여과하였다. 여액을 농축 건조시키고, 1.6 mL의 무수 THF에 재용해시켰다. 1 mL의 무수 THF 중의 1-아지도-18,18-다이메틸-20-페닐설포닐-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자-19-이코사놀 (86 mg, 0.16 mmol, 0.1 M)의 용액을 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 모니터링하였다. 1 시간 후, 출발 알코올은 소모되었다. 반응 혼합물을 50 mL의 1:1 EtOAc:KHSO4 (5% 수용액) 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, 유기 상을 KHSO4 (5% 수용액), 물, NaHCO3 (포화 수용액) 및 염수 (각각 25 mL)로 연속적으로 세척하였다. 세척된 유기 상을 MgSO4으로 건조시키고, 여과하고, 회전 증발로 농축시켰다. 미정제 석신이미딜 카보네이트를 1.6 mL의 무수 THF에 용해시키고, 1-아미노-3,3-다이에톡시프로판 (86 μL, 0.53 mmol)을 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 모니터링하였다. 25 분 후, 석신이미딜 카보네이트는 두 개의, 느리게 용리하는 생성물 피크로 전환되었다. 반응 혼합물을 30 mL의 1:1 EtOAc:소듐 아세테이트 (0.2M, pH 5.0) 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, 유기 상을 물, 및 염수 (각각 15 mL)로 연속적으로 세척하였다. 세척된 유기 상을 MgSO4으로 건조시키고, 여과하고, 회전 증발로 농축시켰다. 잔류 휘발성 물질을 고진공하에 제거하여 황색 오일로서 미정제 표제 화합물 (105 mg, 0.15 mmol, 94% 미정제 2 단계 수율)을 제공하였다.
[0141] 단계 4. 1-아지도-18,18-다이메틸-20-페닐설포닐-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자이코산-19-일 (3-옥소프로필)카바메이트. 물 (0.21 mL) 및 TFA (0.21 mL)를 1.1 mL의 CH2Cl2 중의 1-아지도-18,18-다이메틸-20-페닐설포닐-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자이코산-19-일 (3,3-다이에톡시프로필)카바메이트 (105 mg, 0.15 mmol, 0.1 M 최종 농도)의 용액에 연속적으로 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 모니터링하였다. 10 분 후, 반응이 종료된 것으로 판단하였다. 혼합물을 농축 건조시켰다. 농축물을 SiliaSep 4 g 실리카 겔 컬럼에 로딩하고, 생성물을 CH2Cl2 중의 아세톤의 단계적 구배 (0%, 20%, 40%, 60% 아세톤; 각 단계에 30 mL)로 용리시켰다. 분획을 TLC (세륨 몰리브데이트 염색)으로 분석하였다. 깨끗한 생성물-함유 분획을 조합하고 농축 건조하였다. 잔류 휘발성 물질을 고진공하에 제거하여 무색 오일로서 표제 화합물 (34 mg, 54 μmol, 36% 수율)을 제공하였다. 생성물을 5.0 mL의 Gibco H2O (질량으로 0.01 M)에 용해시켰다. C18 HPLC, ELSD에 의해 계산된 순도: 99.0% (RV = 8.76 mL)
1-아지도-18,18-다이메틸-20-메틸설포닐-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자이코산-19-일 (3-옥소프로필)카바메이트 (화학식 IIa이되, 여기서 Z = N 3 , S = (CH 2 CH 2 O) 4 (CH2) 2 C(O)NH, n = 1, R 1 = MeSO 2 , R 2 = H, 각각의 R 4 = 메틸, 및 X = NH(CH 2 ) 2 CHO.
[0142] 단계 3. 1-아지도-18,18-다이메틸-20-메틸설포닐-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자이코산-19-일 (3,3-다이에톡시프로필)카바메이트. N-하이드록시석신이미드 (98 mg, 0.85 mmol)를 N2 하에서 8.5 mL의 무수 THF 중의 트라이포스진 (0.25 g, 0.85 mmol)의 용액에 첨가하였다. 피리딘 (82 μL, 1.0 mmol)을 적가하고, 백색 침전물이 즉시 형성되었다. 현탁액을 주위 온도에서 15분 동안 교반한 다음, 면 플러그를 통해 여과하였다. 여액을 농축 건조시키고, 2 mL의 무수 THF에 재용해시켰다. 1 mL의 무수 THF 중의 1-아지도-18,18-다이메틸-20-메틸설포닐-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자-19-이코사놀 (80 mg, 0.17 mmol, 0.06 M)의 용액을 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 모니터링하였다. 2 시간 후, 출발 알코올은 소모되었다. 반응 혼합물을 50 mL의 1:1 EtOAc:KHSO4 (5% 수용액) 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, 세척된 유기 상을 KHSO4 (5% 수용액), 물, NaHCO3 (포화 수용액) 및 염수 (각각 25 mL)으로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4으로 건조시키고, 여과하고, 회전 증발로 농축시켰다. 미정제 석신이미딜 카보네이트 (91 mg)를 2 mL의 무수 THF에 용해시키고, 1-아미노-3,3-다이에톡시프로판 (61 μL, 0.37 mmol)을 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 모니터링하였다. 5 분 후, 석신이미딜 카보네이트는 단일의, 느리게 용리하는 생성물 피크로 전환되었다. 반응 혼합물을 30 mL의 1:1 EtOAc:소듐 아세테이트 (0.2M, pH 5.0) 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, 유기 상을 물, 및 염수 (각각 15 mL)로 연속적으로 세척하였다. 세척된 유기 상을 MgSO4으로 건조시키고, 여과하고, 회전 증발로 농축시켰다. 잔류 휘발성 물질을 고진공하에 제거하여 황색 오일로서 미정제 표제 화합물 (61 mg, 95 μmol, 56% 미정제 2 단계 수율)을 제공하였다.
[0143] 단계 4. 1-아지도-18,18-다이메틸-20-메틸설포닐-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자이코산-19-일 (3-옥소프로필)카바메이트. 물 (135 μL) 및 TFA (135 μL)을 0.68 mL의 CH2Cl2 중의 1-아지도-18,18-다이메틸-20-메틸설포닐-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자이코산-19-일 (3,3-다이에톡시프로필)카바메이트 (61 mg, 95 μmol, 0.1 M 최종 농도)의 용액에 연속적으로 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 모니터링하였다. 25 분 후, 반응이 종료된 것으로 판단하였다. 혼합물을 농축 건조시켰다. 농축물을 SiliaSep 4 g 실리카 겔 컬럼에 로딩하고, 생성물을 CH2Cl2 중의 아세톤의 단계적 구배 (0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 아세톤; 각 단계에 30 mL)로 용리시켰다. 분획을 TLC (세륨 몰리브데이트 염색) 및 C18 HPLC으로 분석하였다. 깨끗한 생성물-함유 분획을 조합하고 농축 건조하였다. 잔류 휘발성 물질을 고진공하에 제거하여 무색 오일로서 표제 화합물 (12 mg, 21 μmol, 22% 수율)을 제공하였다. 특징 분석 후, 생성물을 2.0 mL의 Gibco H2O (질량으로 0.01 M)에 용해시켰다. C18 HPLC, ELSD에 의해 계산된 순도: 91.3% (RV = 5.60 mL)
(3) 이러한 절차에 따라 제조된 화학식(I)의 추가적인 화합물은 다음을 포함한다:
7-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸아마이도)-1-(4-페닐설포닐)-2-헵틸 N-(3-옥시프로필) 카바메이트 (화학식 IIa이되, 여기서 Z = N3, S = (CH2CH2O)4(CH2)2C(O)NH, n = 5, R1 = PhSO2, R2 = H, 각각의 R4 = H, 및 X = NH(CH2)2CHO)).
7-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸아마이도)-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 N-(3-옥시프로필) 카바메이트 (화학식 IIa이되, 여기서 Z = N3, S = (CH2CH2O)4(CH2)2C(O)NH, n = 5, R1 = MeSO2, R2 = H, 각각의 R4 = H, 및 X = NH(CH2)2CHO)).
7-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸아마이도)-1-(모폴리노설포닐)-2-헵틸 N-(3-옥시프로필) 카바메이트 (화학식 IIa이되, 여기서 Z = N3, S = (CH2CH2O)4(CH2)2C(O)NH, n = 5, R1 = O(CH2CH2)2N-SO2, R2 = H, 각각의 R4 = H, 및 X = NH(CH2)2CHO)).
5-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸아마이도)-3,3-다이메틸-1-(싸이오모폴리노설포닐)-2-펜틸 N-(3-옥시프로필) 카바메이트 (화학식 IIa이되, 여기서 Z = N3, S = (CH2CH2O)4(CH2)2C(O)NH, n = 1, R1 = S(CH2CH2)2NSO2, R2 = H, 각각의 R4 = 메틸, 및 X = NH(CH2)2CHO).
실시예 1
IL-2[N88R,C125S]의 제조 및 활성
[0144] IL-2[N88R,C125S]를 HEK 세포에서의 발현에 의해 제조하였다. 세포-기반의 수용체 결합 분석을 수행하여 IL-2 수용체의 고친화성 αβγ 삼량체 (Treg) 및 중간 친화성 βγ 이량체 (Teff) 형태에 대한 뮤테인의 활성을 평가하였다 (표 1). 뮤테인은 IL-2Rαβγ에 대해 IL-2보다 단지 6배 열악하게 결합하지만, IL-2Rβγ에 대해 약 900 배 열악하게 결합한다. 중요한 것은, 뮤테인은 IL-2Rαβγ 대 IL-2Rβγ에 대해 3,000 배 더 선택적이다.
[0145] IL-2Rαβγ 결합에 대한 U2OS 세포-기반 분석 키트를 제조업체의 지침 (DiscoverX, Part #93-1003E3CP0)에 따라 수행하였다. 96 웰 분석 플레이트에 세포를 100 μL (~10,000 세포/웰)으로 플레이팅하고 37 ℃, 5% CO2에서 24 시간 동안 성장시켰다. 세포를 pH 9.4에서 미소구체로부터 방출된 WT IL-2, IL-2 N88R, C125S, 또는 IL-2 N88R, C125S의 희석 시리즈로 37 ℃, 5% CO2에서 6 시간 동안 처리하였다. 11가지의 WT IL-2 농도를 2 pg/mL - 100 ng/mL (0.1 pM - 6 nM) 사이에서 분석하였다. 11가지의 IL-2 N88R, C125S 및 방출된 IL-2 N88R, C125S 농도를 200 pg/mL - 10 μg/mL (10 pM - 600 nM) 사이에서 분석하였다. 처리된 세포를 암실에서 주위 온도에서 1시간 동안 화학발광 기질과 함께 인큐베이션한 다음, 250 ms 통합 시간으로 Spectramax i3 플레이트 판독기로 발광을 판독하였다.
[0146] IL-2Rβγ 결합에 대한 U2OS 세포-기반 분석 키트를 제조업체의 지침 (DiscoverX, Part #93-0998E3CP5)에 따라 수행하였다. 96 웰 분석 플레이트에 세포를 50 μL (~5,000 세포/웰)으로 플레이팅하고 37 ℃, 5% CO2에서 48 시간 동안 성장시켰다. 세포를 pH 9.4에서 미소구체로부터 방출된 WT IL-2, IL-2 N88R, C125S, 또는 IL-2 N88R, C125S의 희석 시리즈로 37 ℃, 5% CO2에서 6 시간 동안 처리하였다. 11가지의 WT IL-2 농도를 17 pg/mL - 1 μg/mL (1 pM - 61 nM) 사이에서 분석하였다. 11가지의 IL-2 N88R, C125S 농도를 1.7 ng/mL - 100 μg/mL (100 pM - 6 μM) 사이에서 분석하였다. 11가지의 방출된 나머지 IL-2 N88R, C125S 농도를 170 pg/mL - 10 μg/mL (10 pM - 600 nM) 사이에서 분석하였다. 처리된 세포를 암실에서 주위 온도에서 1시간 동안 화학발광 기질과 함께 인큐베이션한 다음, 250 ms 통합 시간으로 Spectramax i3 플레이트 판독기로 발광을 판독하였다.
[0147] 이러한 측정의 결과가 도 2 및 표 1에 나와있다.
표 1. αβγ 및 βγ 수용체를 포함하는 세포에 대한 IL-2 및 IL-2N88R,C125S의 결합.
Figure pct00020
실시예 2
사이토카인 환원성 알킬화의 최적화
Figure pct00021
[0148] 링커 부착은 IL-2 N-말단 아미노 기의 환원성 알킬화에 의해 이루어졌다. 200 μM의 IL-2 N88R, C125S를 10 mM NaCNBH3의 존재하에 화학식(IIb)의 링커 시약 (즉, 화학식(IIa)의 링커이되 여기서 R1 = MeSO2, R2 및 R4 = H, S = (CH2CH2O)h(CH2)gC(O)NH, 및 X = NH(CH2CH2O)p(CH2)(m-1)CHO (여기서 h = 4, g = 2, p = 0, 및 m = 3))의 농도 시리즈로 처리하였다. N3 기를 PEG-사이클로옥틴 DBCO-PEG5kDa와 반응시켜 PEG 부착으로 인한 겔 이동을 유도한 후, 반응을 SDS-PAGE 으로 분석하였다. 1.5:1의 링커:단백질 비율이 최적인 것을 발견하여, 58:34:5:3의 비변형 단백질:단일-링커-단백질:이중-링커 단백질:삼중-링커 단백질의 혼합물을 제공하였다(표 2). 도 3은 ImageJ으로 정량화된 생성된 겔 밴드를 도시한다. C125S (200 μM)를 주위 온도에서 20 시간 동안 1, 1.5, 2 또는 3 당량의 링커-CHO (Mod = MeSO2) 및 50 mM MES 중의 10 mM NaCNBH3, 150 mM NaCl (pH 6.0)로 처리하였다.
표 2. IL-2 N88R,C125S의 환원성 알킬화로부터의 링커-단백질 생성물이 분포
Figure pct00022
실시예 3
링커-사이토카인의 제조
[0149] IL-2[N88R,C125S]를 두 방법 중 하나에 의해 방출형 링커에 부착하였다.
[0150] (1) 무작위 아실화. 사이토카인 (4.81 mg/mL의 3.4 mL, 1.00 umol) 및 1.44 mL의 100 mM HEPES의 혼합물 (pH 7.0)을 4-아지도-3,3-다이메틸-1-(아이소프로필설포닐)-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 [화학식(II)이되 여기서 R1 = iPrSO2, R2 = H, R4 = Me, Z = N3, n = 1; S = 부재; 및 X = 석신이미딜옥시] (아세토나이트릴 중의 10 mg/mL의 156 uL, 4 umol)와 혼합하고 4 oC에서 20 시간 동안 유지하였다. 하이드록실아민 (0.55 mL의 1 M, pH 7.0)를 첨가하고 4 oC에서 추가의 23 시간 동안 유지하였다. 혼합물을 50 mM MES (pH 6.0), 0.05% Tween-20을 사용하는 PD-10 컬럼에 적용하여 OD280에 의해 1 umol의 회수된 단백질을 제공하였다. SDS-PAGE에 의한 분석은 비변형:1 링커: 2 링커: 3+ 링커의 57:31:6:6 혼합물이 형성된 것을 나타냈다.
[0151] (2) 환원성 알킬화. 환원성 알킬화는 문헌 [Schneider et al., Bioconjugate Chem (2016) 27: 2534-9 (본 명세서에 참조 문헌으로 포함)]에 기재된 방법을 사용하여 수행하였다. 0 ℃에서 4.25 mL의 50 mM MES, 150 mM NaCl pH 6.0 (반응 완충액) 중의 IL-2 N88R,C125S (250 μM 최종 농도, 1.25 μmol, 20.5 mg)의 용액에, 20 mM NaOAC pH 5.0 중의 O-7-[(15-아지도-13,10,7,4-테트라옥사펜타데카노일)아미노]-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 N-3-옥사프로필카바메이트 [화학식(II)이되 여기서 R1 = MeSO2, R2 = H, R4 = H, Z = N3, S = (CH2CH2O)4CH2CH2CONH); n = 4; 및 X = (CH2)2CHO] (375 μM 최종 농도, 1.9 μmol, 0.9 mg, 0.27 mL)의 용액, 및 반응 완충액 중의 NaCNBH3 (10 mM 최종 농도, 1 μmol, 0.5 μL)을 첨가하였다. 반응을 암실에서 주위 온도에서 22시간 동안 진행하였다. 20 mM MES, 150 mM NaCl, 0.05% tween-20 (pH 6.0)으로 평형화된 PD-10 컬럼을 사용하여 과량의 시약을 제거하였다. Amicon Ultra 10,000 MW 컷오프 농축기로 농축한 후, 600 μM의 1.85 mL (A280 기준) (1.1 μmol, 89%)의 전체 펩타이드를 링커-N-말단 아미노프로필-IL-2 [N88R,C125S]로부터 회수하였다.
실시예 4
IL2- 및 [아미노프로필]-IL2-방출 하이드로겔 미소구체의 제조
[0152] 미소구체 활성화: 화학식(IV)의 PEG 하이드로겔 미소구체 ([Henise et al., Engineering Reports (2020) https://doi.org/10.1002/eng2.12091]에 따라 제조)를 사용하였으며, 여기서 P1 및 P2는 20-kDa 4-아암 PEG이었고; Z = N3 및 Z' = 5-하이드록시사이클로옥틴으로부터 Z*는 트라이아졸이었고; n = 4; R11 = CN; R12 = H; 각각의 R14 = H; B = NH2; x = 4; y = 0; z = 0; 및 r = 4이었다. 이를 다음과 같이 B = NH-CO-O-(4-사이클로옥티닐)인 화학식(IV)으로 활성화하였다. 15 mL 원뿔형 튜브에서 MeCN 중의 B = NH2 (4.2 μmol NH2)인 미소구체 슬러리의 1.3 g 현탁액에 1 mL MeCN 중의 4-사이클로옥티닐 석신이미딜 카보네이트 (5 μmol, 1.2 당량) 및 1 mL MeCN 중의 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (17 μmol, 4 당량)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 6시간 동안 종단 간에 회전시켰다. 슬러리를 4 x 12 mL MeCN으로 세척한 다음, 4 x 12 mL 20 mM MES, 150 mM NaCl, 0.05% tween-20 (pH 6.0)으로 세척하였다.
[0153] 동일한 방법을 사용하여, B = NH2인 화학식(IV)의 미소구체를 4-사이클로옥티닐 석신이미딜 카보네이트 대신 BCN-OSu ((1R,8S,9s)-바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 석신이미딜 카보네이트)와 반응시켜 B = (1R,8S,9s)-바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시-CO-NH인 화학식(IV)으로 활성화하였다.
[0154] 링커-사이토카인을 부착하기 위해, 15 mL 원뿔형 튜브에서 20 mM MES 중의 활성화된 미소구체 (4.2 μmol 5HCO), 150 mM NaCl, 0.05% tween-20 (pH 6.0)의 슬러리의 2 g 현탁액을 1.9 mL의 동일한 완충액 중의 18.3 mg (1.1 nmol)의 링커-AP-IL-2 N88R, C125S (겔 이동 분석에 의한 37% 링커-IL-2, 실시예 3)의 용액과 함께 혼합하였다. 혼합물을 250 rpm에서 궤도 진탕하면서 37 ℃에서 23 시간 동안 인큐베이션하였다. 슬러리를 8 x 12 mL의 상기 완충액으로 으로 세척한 다음, 4 x 6 mL의 20 mM MES, 250 mM NaCl, 0.05% tween-20 (pH 6.0)으로 세척하였다. 미소구체의 전체 로딩은 50 mM NaOH의 9 부피에 용해된 29-32 mg 분취량의 슬러리로부터 방출된 AP-IL-2의 A280 (ε280 = 10,095 M-1cm-1)에 의해 결정된 바와 같이, 슬러리 중 102 nmol IL-2 N88R, C125S gm-1 이었다.
[0155] PEG 하이드로겔 미소구체를 무작위 아실화 (실시예 3)에 의해 제조된 링커-IL-2와 함께 동일한 방식으로 로딩하여, 서열 번호 3을 가지는 단백질과 함께 0.11 mM으로 로딩된 불용성 컨쥬게이트를 제조하였다.
실시예 5
시험관 내 방출 역학
[0156] β-제거 역학은 37 ℃의 에펜도르프 튜브에서 257 μL의 250 mM Na 보레이트, 0.05% (v/v) tween-20 (pH 9.4) 중의 257 mg의 실시예 4의 미소구체-IL-2 뮤테인 슬러리를 사용하여 가속화된 방출 조건하에서 결정하였다. 시간 간격으로, 샘플을 37 ℃ 수조로부터 제거하고, 1 분간 21,000 x g으로 원심분리하고, 큐벳 기반 UV/Vis 분광광도계에서 100 μL의 상등액의 A280를 측정하였다. 측정 후 분석된 상등액을 미소구체-함유 튜브에 다시 넣고, 37 ℃에서 인큐베이션을 계속하였다. 방출 속도를 Graphpad Prism에서 1차 속도 방정식에 대해 방출된 A280 대 시간을 피팅하여 계산하였다. β-제거가 하이드록사이드 이온에서 1차인 것을 감안하여, pH 7.4에서 kpH 7.4= kpH x 10(pH-7.4)로서 속도를 계산하였다. 실시예 2의 무작위 아실화 컨쥬게이트로부터의 IL-2 [N88R,C125S]에 대한 방출 프로파일은 2상(biphasic)이었으며, 반감기가 pH 9.4에서 0.4 및 41 시간이었고, 이는 pH 7.4에서 40 및 4100 시간에 상응한다. 실시예 2의 환원성 알킬화 컨쥬게이트로부터의 AP-IL-2 [N88R,C125S]에 대한 방출 프로파일은 단상이며, 반감기가 pH 9.0에서 11시간이었고, 이는 pH 7.4에서 440 시간에 상응한다.
실시예 6
래트에서 하이드로겔 미소구체로부터 방출된 IL-2[N88R,C125S]의 약동학
[0157] 멸균 조건 하에서 실린지 (0.5 mL 29 게이지, 고정 바늘, BD)을 20 mM MES, 250 mM NaCl, 0.05% (w/v) tween-20 (pH 6.0)으로 구성된 투여 완충액 중 실시예 4의 미소구체-IL-2 슬러리의 평균 50 mg 또는 300 mg (5 nmol 또는 30 nmol IL-2 [N88R,C125S])으로 채웠다. 평균 중량 250 g의 4 마리의 캐뉼러가 삽입된 수컷 Sprague Dawley 래트의 옆구리에 각 실린지의 내용물을 피하 투여하였다. 혈액 샘플을 (200 μL)을 0, 4, 8, 24, 48, 96, 168, 240, 336, 408, 504, 576 및 672 시간에 채혈하고; 혈장을 수집하고, 프로테아제 억제제를 첨가하고, 분석할 때까지 샘플을 -80 ℃에서 동결시켰다. 도 4에 도시된 바와 같이, 실시예 2의 미소구체 컨쥬게이트를 사용하여, IL-2 (또는 NH2(CH2)3-IL-2, “AP-IL2”가 투여 후 96 시간 동안 혈장에서 관찰되었다.
실시예 7
마우스에서 IL2 및 IL2[N88R,C125S]의 약력학
[0158] 유리 IL-2[N88R,C125S]의 약력학을 NOD (비 비만형 당뇨병) 마우스에서 천연 IL-2의 약력학과 비교하였다. 3 마리 NOD 마우스의 3 개의 그룹 각각에 PBS 비히클, 프롤류킨 (25,000 유닛, 63 μg) 또는 IL-2[N88R,C125S] (25,000 유닛, 63 μg)을 연속 5일 동안 매일 주사하였다. 마지막 주사 2 시간 후 마우스를 희생시키고 유세포 분석을 위해 비장 및 췌장을 수집하여 비장 및 췌도에서 T-세포 및 이의 분화의 전체 수를 측정하였다.
[0159] IL-2[N88R,C125S]는 비장에서 CD4+ 및 CD8+ 이펙터/기억 T-세포에 거의 내지는 전혀 영향을 미치지 않았지만, 천연 IL-2는 T-세포 집단 모두에서 증가하였다 (도 5).
[0160] NOD 마우스에 PBS 비히클, 프롤류킨(Proleukin) (25,000 유닛) 또는 IL-2[N88R,C125S] (25,000 유닛)을 매일 주사하였고, 제5일째에 마지막 주사 2 시간 후 희생시켰다. 비장에서 IL-2[N88R,C125S]의 약력학이 도 5에 도시된다.
[0161] 천연 IL-2 및 IL-2[N88R,C125S] 모두 PBS 비히클과 비교하여 췌도에서 T-세포에 거의 내지는 전혀 영향을 미치지 않았다 (도 6). 마우스가 IL-2[N88R,C125S]으로 처리되었을 때 췌도의 전체적인 수가 감소했음을 주목해야 한다.
[0162] NOD 마우스에 PBS 비히클, 프롤류킨(Proleukin) (25000 유닛) 또는 IL-2[N88R,C125S] (25000 유닛)을 매일 주사하였고, 제5일째에 마지막 주사 2 시간 후 희생시켰다. 췌도에서 IL-2[N88R,C125S]의 약력학이 도 6에 도시한다.
실시예 8
마우스에서 미소구체-IL-2[N88R,C125S]로부터 방출된 [아미노프로필]-IL2[N88R,C125S]의 약동학/약력학
[0163] 6 마리 NOD 마우스의 3 개의 그룹을 사용하여 미소구체-IL-2[N88R,C125S] 컨쥬게이트로부터 방출된 [아미노프로필]-IL-2[N88R,C125S]의 PK/PD를 결정하였다. 제1 그룹에는 유리 IL-2[N88R,C125S] (25,000 유닛, 63 μg)을 매일 5회 주사하였다. 제2 그룹에는 사이클로옥틴이 N3(CH2CH2O)7H으로 캡핑된 빈 미소구체를 피하 주사로 투여하였다. 제3 그룹에는 실시예 4의 미소구체-IL-2[N88R,C125S] (0.5, 1, 5, 10 또는 19 mg의 단백질/kg)를 단일 피하 주사로 투여하였다. 도면 범례의 설명에 따라 혈장, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 장기 조직을 준비하고 분석하였다. T 세포 집단의 변화를 모니터링하기 위해 림프구의 유세포 분석을 수행하였다. 비장과 림프절 및 췌도를 분리하고 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 유세포 분석을 위한 표준 세포 표면 면역형광 염색 후 표면 염색을 수행하였다. 고정 및 세포 내 염색은 eBioscience Foxp3/전사 인자 염색 버퍼 세트(ThermoFisher Scientific)의 프로토콜을 따랐다. 사용된 항체는 CD3, CD4, CD8, CD25, CD44 CD45, 및 FoxP3에 대한 것이었으며; 모두 상업적 공급 업체로부터 입수하였다. 염색된 단일 세포 현탁액을 LSRII 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
[0164] 도 7은 마우스에서 미소구체-IL-2[N88R,C125S] (“뮤테인”)로부터 방출된 [아미노프로필]-IL-2[N88R,C125S]의 약동학을 도시한다. 패널 A: BALB/c 마우스 (n = 6)의 옆구리에 28 nmol (19 mg/kg) 또는 9.9 nmol (6.5 mg/kg) 미소구체-IL-2[N88R,C125S]를 함유하는 단일 피하 주사를 제공하였다. t1/2가 31 시간으로 결정되었다. 패널 B: NOD 마우스 (n = 6)의 옆구리에 미소구체-IL-2[N88R,C125S]를 투여하였다. 두 경우 모두, IL-2[N88R,C125S] 농도를 정량화하기 위해 Thermofisher ELISA를 사용하여 혈장을 분석하였다.
[0165] 미소구체-IL-2[N88R,C125S]로 처리한 결과 비장 및 PBMC 모두에서 Foxp3+CD4+ T-세포가 대규모로 확장되었다. 비장 및 PBMC에서, 각각 거의 70 및 55%의 T-세포가 Foxp3+CD4+ T-세포이었다 (도 8). CD8+ T-세포의 백분율이 또한 대조군에 비해 증가하였다. CD8+ 세포는 비장에서 11%에서 25%으로, PBMC에서 15%에서 60%으로 증가하였다.
[0166] 도 8A는 비장 및 PBMC에서 Foxp3+CD4+ T-세포의 확장을 도시한다. 도 8B는 비장 및 PBMC에서CD8+ T-세포의 확장을 도시한다. 비장 및 PBMC에서 발견된 CD8+ 세포의 백분율은 각각 대략 11% 및 19 %이었다. 이러한 백분율은 미소구체-IL-2[N88R,C125S]으로 처리했을 때 각각 대략 25% 및 60% 으로 증가하였다. NOD 마우스에는 IL2-뮤테인 (QDx5, 25,000 유닛), 빈 미소구체 또는 미소구체-IL-2[N88R,C125S] (18 mg/kg)의 단일 주사를 투여하였다. 제5일 마지막 투여 2시간 후 마우스를 희생시켰다.
[0167] CD8+ 세포를 활성화하지 않고 Foxp3+CD4+ T 세포 집단을 확장하는 효과적인 용량을 결정하기 위해, 미소구체-IL-2[N88R,C125S]의 용량 적정 연구를 수행하였다. 미소구체-IL-2[N88R,C125S]의 4가지 농도 (0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg 및 10 mg/kg)를 테스트하고, 2 주에 걸쳐 PBMC을 통해 약력학을 모니터링하였다. PBMC에서 미소구체-IL-2[N88R,C125S]의 단일 주사 후 Foxp3+CD4+ T-세포의 용량 의존적 확장이 관찰되었다. 모든 용량에 대해 Foxp3+CD4+ T-세포 확장은 제4일에 최고조에 달하고 제14일에 기준선 수준으로 돌아왔다 (도 9 A). 중요한 것은, CD8+ 세포의 백분율은 투여된 어느 용량에서도 증가하지 않았다 (도 9 B).
[0168] 도 9A는 미소구체-IL-2[N88R,C125S]가 Foxp3+CD4+ T-세포를 우선적으로 확장하는 것을 도시하며, 도 9B는 NOD 마우스 (n=3/투여 그룹)에서 CD8+ 세포의 활성화를 방지하는 것을 도시한다 (오른쪽). 도시된 바와 같이, Foxp3+CD4+ T-세포 확장은 모든 용량에 대해 제4일에 최고조에 달하고, 제14일에 기준선 수준으로 돌아왔다.
실시예 9
링커-IL-15의 제조
[0169] 상기 IL-2에 대해 기재된 바와 같이 NaCNBH3 를 사용하는 환원성 알킬화를 통해 IL-15의 N-말단에 실시예 2의 링커를 컨쥬게이션하였다. 반응 혼합물은 IL-15 (30 μM), N3-PEG4-링커(MeSO2)-CHO (90 μM) 및 25 mM Na 포스페이트 중의 NaCNBH3 (10 mM), 250 mM NaCl (pH 7.4)를 포함하였다. 반응을 암실에서 주위 온도에서 24 시간 동안 진행하였다. 20 mM Na 시트레이트, 500 mM NaCl, 0.05% tween-20 (pH 5.86)으로 평형화된 PD-10 컬럼을 사용하여 과량의 시약을 제거하였다. 탈염된 반응 혼합물을 Amicon Ultra 3,500 MW 컷오프 농축기를 사용하여 농축하였다.
[0170] 최적의 반응 조건을 결정하기 위해, 링커 당량을 변화시키는 소규모 (2.25 nmol, 75 μL) 환원성 알킬화 반응을 IL-15으로 수행하였다. 초기 반응은 1, 1.5 및 2 당량의 N3-PEG4-L(MeSO2)-CHO 링커를 사용하여 수행하였으며, 1:1의 비율로 단백질에 1개의 링커가 첨가되는 것으로 나타났다(데이터는 나타나지 않음). 비변형 단백질의 전환을 증가시키기 위해 후속 반응을 1.5, 3 및 5 당량의 링커로 수행하였다 (도 10 A). 3 당량의 링커로, 반응 결과는 IL-15 중 대략 52%는 단백질에 오직 1개의 링커가 부착되었으며, IL-15 중 대략 5%는 2 개의 링커가 부착되었다 (도 10 B). 링커의 농도를 5 당량으로 증가시킨 결과 단일 링커 단백질이 소량 증가하였지만, 전체 단백질 중 대략 27%는 2개 이상의 링커가 부착되었다.
[0171] 반응의 진행은 도 10에 도시된 바와 같이 SDS-PAGE DBCO-PEG5k 겔 이동 분석에 의해 결정하였다. 표 3은 변형된 IL-15의 백분율을 보여준다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밴드를 정량화하였다. 주위 온도의 암실에서 IL-15 (30 μM)를 1.5, 3 또는 5 당량의 링커-CHO (Mod = MeSO2) 및 25 mM 소듐 포스페이트 중의 NaCNBH3 (10 mM), 500 mM NaCl로 20 시간 동안 처리하였다.
표 3.
Figure pct00023
[0172] 3 당량의 링커를 사용하는 최적화된 반응 조건을 대규모 (0.93 μmol - 1.08 μmol) 반응에 사용하였다. 대규모 반응을 2회 수행하였다.
실시예 10
미소구체-IL-15의 제조
[0173] BCN-활성화된 미소구체 (2.6 μmol BCN, 실시예 4)의 슬러리를 멸균 실린지 중의 20 mM Na 시트레이트, 500 mM NaCl, 0.05% tween-20 (pH 5.86)으로 5회 세척하였다 (~35 mL). 링커-IL-15 (실시예 9) (1 μmol 전체 단백질, 대략 50% 알킬화 IL-15 함유)를 멸균 필터를 통해 실린지에 첨가하였다 (0.22 μM). 혼합물을 18 시간 동안 주위 온도에서 종단간 회전시켰다. 슬러리 혼합물을 20 mM Na 시트레이트, 500 mM NaCl, 0.05% tween-20 (pH 5.86)으로 5회 세척하였다. 반응하지 않은 BCN 활성화된 미소구체를 N3(CH2CH2O)7H으로 캡핑한 다음 6회 세척하였다. 미소구체 (216 - 336 μM)에 로딩된 IL-15 농도는 50 mM NaOH 4 부피에 용해된 5 mg 분취량의 슬러리로부터 방출된 IL-15으로부터 A280 (e280= 7240 M-1 cm-1)에 의해 결정하였다. 3 개의 개별 로딩으로부터 MS-IL-15 농도는 336 nmol/mL, 216 nmol/mL 및 232 nmol/mL인 것으로 결정하였다.
실시예 11
미소구체-IL-15로부터 방출된 IL-15의 약동학
[0174] 실시예 10의 미소구체-IL-15 슬러리 (275 nmol 단백질/mL)를 500 mM NaCl, 0.05% tween-20 및 1.25% (w/v) 히알루론산을 함유하는 25 mM Na 시트레이트 완충액 (pH 5.9)에 희석하였다. 다양한 용량의 미소구체-IL15가 필요한 연구를 위해, 원하는 미소구체-IL-15 농도를 얻기 위해 연속 희석을 사용하였다. 모든 경우에, 미소구체 컨쥬게이트를 처리 및 제조하기 위해 무균 조건을 사용하였다. 고정 바늘을 가지는 실린지 (27G)를 컨쥬게이트 (100 μL)로 다시 채웠다. 실린지의 내용물을 피하로 또는 복강 내로 정상적인 수컷 C57BL/6J 마우스에게 투여하였다. 혈액 샘플은 각각 3마리의 마우스로 구성된 교대 그룹으로부터 -24, 4, 8, 24, 48, 96, 168 및 240 시간에 채혈하였다. HALT 프로테아제 억제제 칵테일 (ThermoFisher Scientific)을 모든 혈장 샘플에 첨가한 후 분석할 때까지 -80℃에서 동결하였다.
[0175] hIL-15에 대한 ELISA를 제조업체의 지침 (R&D 시스템, hIL-15 Quantikine, Catalog #D1500)에 따라 수행하여 rhIL-15 혈장울 결정하였다. 제조업체가 제공한 표준 희석제에 희석하기 전에 혈장 샘플을 얼음 위에서 해동하였다. 4, 8, 시간 샘플을 50 배 희석하였고, 24시간 샘플을 25 배 희석하였으며, 사전 채혈, 48, 96, 168 및 240시간 샘플은 10 배 희석하였다. hIL-15 농도를 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 시간 및 적합도의 함수로서 플롯팅하였다.
[0176] 유세포 분석을 위헤, PMBC를 준비하고 표면 염색을 수행하여 NK1.1, CD3, CD8, 및 CD44 발현 세포을 정량화하였다. 상용의 FITC-, PE- 또는 알로피코시아닌(allophycocyanin)-컨쥬게이션된 항체를 사용하였다. FACScan 유세포 분석기 (BD Biosciences) 에서 샘플 데이터를 수집하고 FlowJo 유세포 분석 소프트웨어 (TreeStar, Ashland, OR)를 사용하여 분석하였다.
[0177] 미소구체 컨쥬게이트로부터 방출된 [아미노프로필]-IL-15의 약동학을 정상적인 C57BL/6J 마우스에서 측정하였다. 마우스에 2.4 nmol 컨쥬게이션된 단백질 (200 μL 주사)를 투여하였다. 초기 평균 마우스 체중 (25.1 ± 1.3 g) 및 최종 평균 마우스 체중 (25.1 ± 1.4 g)에 유의한 변화는 없었다. 대략 120 시간 후, 관찰된 농도가 빠르게 감소한다 (도 11). 120을 통한 데이터의 단상 붕괴 모델 적합도는 적어도 200 시간의 반감기를 초래하였다. 120 시간에서 240 시간 사이의 데이터 포인터는 단상 붕괴 모델에 적합하여 27 시간의 t1/2를 생성하였다. 두 번째 MS~IL-15 (50 μg)주사는 248 시간에 측정된 혈장 IL-15을 초기 용량의 유사한 농도로 증가시킨다. 23 시간의 t1/2가 264 시간에서 360 시간 사이에 관찰된다.
[0178] 도 11은 C57BL/6J 마우스에서 MS-IL-15로부터 방출된 [아미노프로필]-IL-15의 약동학을 도시한다. 정상적인 수컷 C57BL/6J 마우스에 MS-IL-15 (50 μg)를 t=0 시간 및 t=240 시간에 투여하였다. 혈장 샘플을 제조하고 인간 IL-15 Quantikine ELISA (R&D systems)을 사용하여 분석하였다. 240 시간에 걸쳐 두 가지 구별되는 t1/2가 관찰된다. 120 시간에 걸쳐 적어도 115 시간의 t1/2가 관찰된 다음 120 시간에서 240 시간 사이에 43 시간의 두 번째 t1/2가 관찰된다. 두 번째 MS-IL15 (50 μg) 주사를 240 시간 채혈 후 즉시 투여하였다 (청색 데이터).
[0179] 도 12는 C57BL/6J 마우스에서 미소구체-IL-15로부터 방출된 [아미노-프로필]-IL-15의 용량-의존적 약동학을 도시한다. 정상적인 수컷 C57BL/6J 마우스에 MS-IL-15 (12.5, 25 또는 50 μg)를 투여하였다. 혈장 샘플을 제조하고 인간 IL-15 Quantikine ELISA (R&D systems)을 사용하여 분석하였다.
[0180] 투여 경로 (즉, 피하 및 복강 내)는 방출된 [아미노프로필]-IL15의 t1/2를 변경하지 않았다 (도 13). 그러나, AUCip (25.2 nM*h)는 AUCsc (14.9 nM*h)와 비교하여 거의 2배 높았다. 이것은 생체 이용률이 증가하거나 복강 내 공간에서 IL-15의 흡수 속도가 증가했음을 나타낼 수 있다.
[0181] 도 13은 피하 투여 대 복강 내 투여된 C57BL/6J 마우스에서 미소구체-IL-15로부터 방출된 [아미노프로필]-IL-15의 약동학을 도시한다. 정상, 수컷 C57BL/6J 마우스에 피하 주사 (흑색,
Figure pct00024
) 또는 복강 내 주사 (청색,
Figure pct00025
)으로 MS-IL-15 (50 μg)를 투여하였다. 혈장 샘플을 제조하고 인간 IL-15 Quantikine ELISA (R&D systems)을 사용하여 분석하였다. 120 시간 동안 피하 (115 h) 및 복강 내 (129 h) 투여에 대해 유사한 t1/2가 관찰되었다.
실시예 12
미소구체-IL-15로부터 방출된 [아미노프로필]-IL-15의 약력학
[0182] 실시예 10의 미소구체-IL-15로부터 방출된 [아미노프로필]-IL-15의 약력학을 정상적인, 수컷 C57BL/6J 마우스 (n=3/그룹)에서 측정하였다 (도 14). 마우스에 실시예 10에서 제조된 미소구체~IL-15 (2.5, 12.5, 25 또는 50 μg 컨쥬게이션된 단백질)를 투여하였다. NK1.1, CD3, CD8, 및 CD44 발현 세포의 유세포 분석을 위해 PMBC를 준비하고 표면을 염색하였다. 상용의 FITC-, PE- 또는 알로피코시아닌(allophycocyanin)-컨쥬게이션된 항체를 사용하였다. FACScan 유세포 분석기 (BD Biosciences) 에서 샘플 데이터를 수집하고 FlowJo 유세포 분석 소프트웨어 (TreeStar, Ashland, OR)를 사용하여 분석하였다. 임상 관찰에서는 주사 부위 반응이 없었으며, 초기 평균 체중 (25.1 ± 1.3 g) 및 최종 평균 체중 (25.1 ± 1.4 g)에서도 유의한 변화는 없었다.
[0183] MS~IL-15 컨쥬게이트 (12.5 μg, 25 μg 또는 50 μg)의 단일 피하 주사는 PBMC에서 CD44hiCD8+ T 세포를 용량 의존적을 확장하였다. CD44hiCD8+ T 세포의 2배 내지 4배 확장은 처리 후 제5일에 최고조에 달했다. 이러한 세포는 21 일 동안 대조군보다 높게 유지되었다 (도 14A). 제28일에, 최고 용량의 MS~IL-15 (50 μg)이 투여된 마우스는 CD44hiCD8+ T 세포 수준이 대조군보다 2배 높았다. 실험 기간 동안 단일 용량의 천연 rhIL-15 (2.5 μg)으로부터 또는 등가 용량의 MS~IL-15 (2.5 μg)으로부터 CD44hiCD8+ T 세포의 확장은 관찰되지 않았다.
[0184] NK 세포의 용량 의존적 확장이 또한 PBMC에서 MS~IL-15 컨쥬게이트룰 단일 피하 주사한 후 관찰되었다 (도 14B). NK 세포의 대략 2-3 배 확장은 MS~IL-15 (12.5 μg, 25 μg 또는 50 μg)이 투여되었을 때 처리 후 6일 내지 7일에 최고조에 달했다. NK 세포는 14 일 내지 21 일에 높게 유지된다. 단일 용량의 천연 rhIL-15 (2.5 μg)으로부터 또는 등가 용량의 MS~IL-15 (2.5 μg)으로부터 NK 세포의 확장은 관찰되지 않았다.
실시예 13
링커-RLI 및 미소구체-RLI 컨쥬게이트의 제조
[0185] 수용체RLI (수용체-연결된 인터루킨(receptor-linked interleukin))은 IL-15 및 수용체 α-서브유닛의 스시-도메인을 포함하는 융합 단백질이며 IL-15 수용체 복합체의 초작용제(super-agonist)로서 작용한다 (Mortier et al., J. Biological Chem. 2006, 281: 1612-9; 미국 특허 10,358,488).
[0186] 화학량론적 링커 첨가를 위한 최적의 반응 조건을 결정하기 위해, 링커 농도를 변화시키는 RLI (10 nmol, 50 μL)의 소규모 환원성 알킬화 반응을 수행하였다. 초기 반응은 1.5, 2, 3 및 5 당량의 실시예 2의 링커 (IIb)를 사용하여 수행하였다. 테스트된 조건하에서, 1.5 당량의 링커를 사용했을 때 RLI의 44%는 하나의 링커로 변형되었고, 46%는 수정되지 않은 채로 남아 있었다. 2 당량의 링커는 RLI 중 대략 53% 링커가 링커의 화학양론적 첨가를 초래하는 것으로 결정되었고; RLI의 33%는 변형되지 않았고 14%는 공유 결합된 하나 이상의 링커를 가졌다. 링커 등가량을 3 당량으로 증가시킨 결과 2 개 링커의 첨가 백분율이 증가하였으며 (27%) 뿐만 아니라 3 개의 링거를 포함하는 RLI의 형성 백분율도 증가하였다 (6%). 이러한 백분율은 5 당량의 링커의 존재하에는 훨씬 더 증가하였다 (도 15).
표 4.
Figure pct00026
[0187] RLI의 환원성 알킬화는 SDS-PAGE DBCO-PEG5K 겔 이동 분석에 의해 결정하였다. 도 15는 겔 이동 분석으로부터 결정된 바와 같은 변형된 RLI의 백분율을 도시한다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밴드를 정량화하였다. 주위 온도의 암실에서 RLI (10 nmol)를 1.5, 2, 3 또는 5 당량의 링커-CHO (Mod = MeSO2) 및 25 mM MES 중의 NaCNBH3 (10 mM), 500 mM NaCl 및 0.05% tween-20으로 20 시간 동안 처리하였다.
[0188] 2 당량의 링커를 사용하여, 대규모 환원성 알킬화 반응 (800 nmol, 4 mL)을 수행하였다. 환원성 알킬화된 RLI를 BCN-활성화된 미소구체에 컨쥬게이션하였다 (실시예 4). 산화 공정을 최소화하기 위해 EDTA (1 mM) 및 메티오닌 (30 mM)을 반응에 첨가하였다. 컨쥬게이션 반응 이후, 미소구체를 완충액 (25 mM Na 시트레이트, 500 mM NaCl, 0.05% tween-20, 30 mM 메티오닌, pH 5.9)으로 광범위하게 세척하여 비공유적으로 부착된 RLI를 제거하였다. 작은 분취량 (~25 mg)의 세척된 미소구체를 NaOH (50 mM)에서 분해하여 미소구체에 공유 결합된 RLI의 농도를 결정하였다. 미소구체 상의 RLI 농도는 175 nmol/mL인 것으로 결정하였다.
실시예 14
미소구체 컨쥬게이트로부터 방출된 RLI의 생체활성
[0189] RLI가 미소구체 컨쥬게이트로부터 방출된 후, 컨쥬게이션의 위치에 아미노프로필 잔여물이 남는다. 방출된 [아미노프로필]-RLI의 생체활성을 테스트하기 위해, 세포 기반 분석을 사용하여 수용체 이량체화를 유도하는 [아미노프로필]-RLI의 능력을 천연 RLI와 비교하여 결정하였다. 천연 RLI 및 [아미노프로필]-RLI의 EC50 곡선이 서로 중첩되어, 상기 생체활성 분석에서 평가된 바와 같이, 아미노프로필 잔여물이 IL-15 활성에 영향을 미치지 않음을 나타낸다 (도 16).
[0190] 도 16은 RLI에 대한 IL-2Rβγ 수용체-결합 세포-기반 분석의 결과를 도시한다. U2OS 세포-기반 분석을 사용하여 pH 7.4에서 컨쥬게이트로부터 방출된 아미노프로필-RLI의 결합 활성을 (EC50 = 180 pM) 천연 RLI의 결합 활성 (EC50 = 160 pM)과 비교하여 결정하였다.
실시예 15
미소구체 컨쥬게이트로부터 방출된 [아미노프로필]-RLI의 약동학
[0191] 미소구체 컨쥬게이트로부터 방출된 [아미노프로필]-RLI의 약동학을 정상적인 C57BL/6J 마우스에서 측정하였다. 마우스에게 쥬게이트의 피하 주사 (1.5 nmol 단백질, 100 μL 주사)를 제공하였다. 10일의 기간에 걸쳐 미리 결정된 시점에서 채혈하고 혈장을 준비하였다. 혈장 내 [아미노프로필]-RLI의 농도를 RLI에 대해 특이적인 ELISA를 사용하여 측정하였다 (도 17). 데이터의 수동 검사는 48시간의 Tmax를 제안하고 단상 붕괴 모델에 대한 데이터의 적합은 135시간의 반감기를 초래하였다. 마우스의 체중은 변하지 않았다 (초기 체중: 21.5 ± 1.1 g; 최종 체중: 21.5 ± 1.1 g).
[0192] 도 17은 미소구체 컨쥬게이트로부터 방출된 [아미노프로필]-RLI의 약동학을 도시한다. 정상적인 수컷 C57BL/6J 마우스에 미소구체-RLI 컨쥬게이트 (1.5 nmol)를 투여하였다. 혈장 샘플을 준비하고 R&D systems DuoSet hIL15/IL15Rα 복합 ELISA (DY6924)를 사용하여 분석하였다. 데이터는 단상 붕괴 모델에 적합하여 반감기가 135 시간이다.
실시예 16
미소구체 컨쥬게이트로부터 방출된 [아미노프로필]-RLI의 약력학
[0193] C57Black 마우스 (n = 5/그룹)에서 MS~RLI 컨쥬게이트 (34 μg, 1.5 nmol)의 약력학을 빈 MS, 및 유리 RLI (2.5 μg, QDx4)의 약력학과 비교하였다. 13일에 걸쳐 채혈하였으며, 일반 실험실 절차를 사용하여 PBMC 표면을 염색하였다. 고정 및 세포 내 염색은 eBioscience Foxp3/전사 인자 염색 버퍼 세트 (ThermoFisher Scientific)의 프로토콜을 따랐다. NK1.1, CD3, CD8, CD19, CD44 및 Ki-67 발현 세포에 대한 상용의 항체를 사용하였다. LSRII 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 염색된 단일 세포 현탁액을 분석하고 FlowJo 유세포 분석 소프트웨어 (TreeStar, Ashland, OR)를 사용하여 분석하였다. 세포 집단 중 CD8+ 기억 T 세포 (CD44hiCD8+), 자연 살해 (CD3-NK1.1+) 세포, 증식 CD8+ 기억 T 세포 (CD44hiCD8+Ki-67+), 및 증식 자연 살해 (CD3-NK1.1+Ki-67+) 세포가 특히 관심을 끌었다.
[0194] CD44hiCD8+ T 세포의 증가는 MS~RLI 및 천연 RLI 그룹에서 처리 후 제 5일에 눈에 띄게 나타났다 (도 18A). 상기 세포 집단은 천연 RLI에 의해 유지되지 않았고 집단은 제7일에 기준선 수준으로 돌아왔다. 이것은 짧은 반감기 (t1/2 = 3 시간) 및 유리 RLI의 빠른 제거로 인한 것으로 예상되었다. MS~RLI 컨쥬게이트는 처리 후 제13일 동안 CD44hiCD8+ T 세포 수준을 유지하였다. MS~RLI 컨쥬게이트가 투여된 모든 5마리 마우스에서 주사 부위 병변이 발생하였고 안락사가 요구되었다.
[0195] CD8+ T 세포의 증식은 증식 마커 Ki-67에 의해 결정하였다. 주사 후 3일에, 대조군과 비교하여 CD8+ T 세포 증가가 관찰되었다 (도 18B). 증식하는 CD8+ T 세포의 백분율은 모든 그룹에서 5일째에 최고조에 달한 후 기준선으로 빠르게 복귀했다.
[0196] 대조군 및 천연 RLI와 비교하여 NK 세포 백분율의 증가가 MS~RLI 컨쥬게이트가 투여된 마우스에서 또한 관찰되었다 (도 19A). 유리 RLI 주사 및 MS~RLI 컨쥬게이트로 PBMC에서 NK 세포의 백분율이 각각 ~4 배 및 ~15 배 증가하였다. NK 세포 수준은 모든 그룹에 대해 처리 후 제10일에 기준선으로 돌아왔다. NK 세포의 증식은 처리 후 3일 동안 유의하게 증가하였고, 각 그룹에 대해 5일 동안 유지되었다 (도 19B). NK 세포의 증식은 처리 후 제7일에 기준선으로 돌아왔다.
실시예 17
분해성 PEG-하이드로겔의 제조
Figure pct00027
[0197] 본 발명의 하이드로겔은 반응하여 연결 작용기, C*를 형성할 수 있는 C 및 C'기를 포함하는 두 가지 예비중합체의 중합에 의해 제조한다. C 또는 C' 중 하나에 대한 예비중합체 연결은 화학식(I)의 분자와의 반응에 의해 유도된 절단가능한 링커, 예컨대 본 명세서에 개시된 바와 같은 화학식(IIa)의 링커를 추가로 포함하여, 하이드로겔의 각 가교에 절단 가능한 링커를 도입할 수 있다.
[0198] 하나의 구체예에서, 제1 예비중합체는 4-아암 PEG를 포함하며, 여기서 각각의 아암은 두 개의 상호-비반응성 (“직교”) 작용기 B 및 C를 가지는 어댑터 유닛으로 종결된다. B 및 C는 초기에 보호된 형태로 존재하여, 후속 단계에서 선택적인 화학 작용을 할 수 있다. 특정 구체예에서, 어댑터 유닛은 아미노산 유도체, 구체적으로 라이신, 시스테인, 아스파르테이트, 또는 글루타메이트의 유도체를 비롯하여 알파-아민 기가 아자이드로 전환된 유도체, 예를 들어 2-아자이도글루타르산의 모노에스터이다. 어댑터 유닛은 연결 작용기 A*를 통해 각각의 제1 예비중합체 아암에 연결되고, 이는 각각의 예비중합체 아암 상의 작용기 A와 어댑터 유닛 상의 동족 작용기 A'의 축합에 의해 형성된다. 제2 예비중합체는 4-아암 PEG을 포함하며, 여기서 각각의 아암은 제1 예비중합체의 C 기와 상보적인 반응성을 가지는 작용기 C'로 종결되어, C 및 C'가 반응하여 C*를 형성할 때 두 예비중합체 사이에서 가교가 일어난다.
[0199] 예시적인 실시예로서, 제1 예비중합체는 다음과 같이 제조하였다. H-Lys(Boc)-OH를 Z = 아자이드인 화학식(IIa)의 링커로 아실화하여, A = COOH, B = Boc-보호된 NH2, 및 C = 아자이드인 어댑터 유닛을 제공하였다. 이는 20-kDa 4-아암 PEG-테트라아민에 커플링되며, Boc 기는 제거되어 A* = 아마이드, B = NH2, 및 C = 아자이드인 제1 예비중합체를 제공하고, 여기서 절단 가능한 화학식(IIa)의 링커는 각각의 아암과 제1 예비중합체의 C 기 사이에 연결부로 혼입된다. 상응하는 제2 예비중합체는 20-kDa 4-아암 PEG-테트라아민을 5-사이클로옥티닐 석신이미딜 카보네이트로 아실화하여 제조하였고, C' = 사이클로옥틴인 제2 예비중합체를 제공한다. 제1 및 제2 예비중합체를 혼합할 때, C = 아자이드 및 C' = 사이클로옥틴 기의 반응은 상응하는 트라이아졸 기를 형성하며 이에 따라 두 예비중합체를 3차원 네트워크로 가교 결합시키고, 각각의 가교 결합은 화학식(IIa)의 화합물의 혼입으로부터 생성된 절단 가능한 링커를 포함하며, 여기서 제1 예비중합체의 혼입으로부터 생성된 각각의 노드(node)는 나머지 작용기 B = NH2를 포함하는데 이는 추가적인 링커, 약물, 형광단, 금속 킬레이터, 등의 부착을 위해 유도체화될 수 있다.
[0200] 본 명세서에 언급된 특허, 특허 출원 및 과학 논문을 비롯한 모든 간행물은 특허, 특허 출원 및 과학 논문을 비롯한 각각의 개별 간행물이 구체적으로 및 개별적으로 참조 문헌으로 포함되도록 지시된 것처럼 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 인용된다.
[0201] 전술한 발명이 이해의 명료함을 위해 예시 및 실시예를 통해 일부 상세하게 설명되었지만, 특정 사소한 변경 및 수정이 상기 교시에 비추어 실시될 것이라는 것이 당업자에게 명백하다. 따라서, 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
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Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 19 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Gly Cys Pro Thr Leu Ala Gly Ile Leu Asp Ile Asn Phe Leu Ile 1 5 10 15 Asn Lys Met Gln Glu Asp Pro Ala Ser Lys Cys His Cys Ser Ala Asn 20 25 30 Val Thr Ser Cys Leu Cys Leu Gly Ile Pro Ser Asp Asn Cys Thr Arg 35 40 45 Pro Cys Phe Ser Glu Arg Leu Ser Gln Met Thr Asn Thr Thr Met Gln 50 55 60 Thr Arg Tyr Pro Leu Ile Phe Ser Arg Val Lys Lys Ser Val Glu Val 65 70 75 80 Leu Lys Asn Asn Lys Cys Pro Tyr Phe Ser Cys Glu Gln Pro Cys Asn 85 90 95 Gln Thr Thr Ala Gly Asn Ala Leu Thr Phe Leu Lys Ser Leu Leu Glu 100 105 110 Ile Phe Gln Lys Glu Lys Met Arg Gly Met Arg Gly Lys Ile 115 120 125 <210> 20 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile 1 5 10 15 Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu 20 25 30 Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser 35 40 45 Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu 50 55 60 Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser 65 70 75 80 Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys 85 90 95 Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys 100 105 110 Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His 115 120 125 Gly Ser Glu Asp Ser 130 <210> 21 <211> 161 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe 1 5 10 15 Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser 20 25 30 Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu 35 40 45 Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln 50 55 60 Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly 85 90 95 Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe 100 105 110 Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala 115 120 125 Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe 130 135 140 Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg 145 150 155 160 Asn

Claims (24)

  1. 화학식(I)의 컨쥬게이트로서,
    M-[Z*-L-D]q (I)
    여기서 M은 거대분자 담체이고;
    Z*는 연결 작용기이고;
    L은 절단가능한 링커이고;
    D는 사이토카인 또는 이의 변이체의 아민 잔기이고;
    M이 가용성 거대분자 담체인 경우 q는 1 내지 10의 정수이거나, 또는 M이 불용성 거대분자 담체인 경우 q는 다중도인 것인, 컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, Z*는 카복사마이드, 아마이드, 옥심, 트라이아졸, 싸이오에터, 싸이오석신이미드, 또는 에터를 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  3. 제2항에 있어서, Z*는 카복사마이드, 옥심, 싸이오에터, 또는 트라이아졸을 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L은 하기 화학식을 가지며,
    Figure pct00028

    여기서
    n은 0 내지 6의 정수이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고;
    각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 두 개의 R4는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 3-6 원 고리를 형성하고;
    S는 부재하거나 또는 (CH2CH2O)h(CH2)gCONH이되, 여기서 g = 1-6 및 h = 0-1000이고;
    Y는 부재하거나 또는 NH(CH2CH2O)p(CH2)m이되, 여기서 m = 2-6 및 p = 0-1000인 것인 컨쥬게이트.
  5. 제4항에 있어서, R1은 CN 또는 -SO2R5이되, 여기서 R5는 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 -NR6 2이고, 각각의 R6는 독립적으로 C1-C6 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고, R2는 H이고, R5 및 R6 각각은 독립적으로 임의 치환된 것인 컨쥬게이트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, M은 평균 분자량이 1,000 내지 100,000 달톤인 가용성 폴리에틸렌 글리콜이고, q는 1 내지 10의 정수인 것인 컨쥬게이트.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, M은 불용성 하이드로겔 또는 수술 장치이고, q는 다중도인 것인 컨쥬게이트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, D는 IL-2, IL-7, IL-9, IL-10, IL-15, IL-15ㆍL-15RαSu 융합 단백질, IL-21 또는 이의 변이체인 것인 컨쥬게이트.
  9. 제8항에 있어서, D는 이량체 βγ 수용체에 비해 삼량체 αβγ-수용체에 대한 선택적 결합을 가지는 IL-2 변이체이거나 또는 삼량체 αβγ-수용체에 비해 이량체 βγ-수용체에 대한 선택적 결합을 가지는 IL-2 변이체인 것인 컨쥬게이트.
  10. 제8항에 있어서, D는 IL-15, IL-15ㆍL-15RαSu 융합 단백질, 또는 이의 변이체인 것인 컨쥬게이트.
  11. 제8항에 있어서, D는 IL-15 또는 탈아마이드화에 대해 안정화된 IL-15ㆍL-15RαSu 융합 단백질 변이체인 것인 컨쥬게이트.
  12. 화학식(Ia)의 링커-약물로서,
    Figure pct00029
    (Ia),
    여기서:
    n은 0 내지 6의 정수이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고;
    각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 두 개의 R4는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 3-6 원 고리를 형성하고;
    Z는 링커를 거대분자 담체에 연결하기 위한 기이며;
    S는 부재하거나 또는 (CH2CH2O)h(CH2)gCONH이되, 여기서 g는 1 내지 6의 정수이고 h는 0 내지 1000의 정수이고;
    Y는 부재하거나 또는 NH(CH2CH2O)p(CH2)m이되, 여기서 m은 2 내지 6의 정수이고 p는 0 내지 1000의 정수이고;
    D는 본 명세서에 개시된 사이토카인 또는 사이토카인 변이체의 아민 잔기인 것인 링커-약물.
  13. 제12항에 있어서, R1은 CN 또는 -SO2R5이되, 여기서 R5는 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 -NR6 2이고, 각각의 R6는 독립적으로 C1-C6 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고, R2는 H이고, R5 및 R6 각각은 독립적으로 임의 치환된 것인 링커-약물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, D는 IL-2, IL-7, IL-9, IL-10, IL-15, IL-15ㆍL-15RαSu 융합 단백질, IL-21 또는 이의 변이체인 것인 링커-약물.
  15. 제14항에 있어서, D는 이량체 βγ 수용체에 비해 삼량체 αβγ-수용체에 대한 선택적 결합을 가지는 IL-2 변이체이거나 또는 삼량체 αβγ-수용체에 비해 이량체 βγ-수용체에 대한 선택적 결합을 가지는 IL-2 변이체인 것인 링커-약물.
  16. 제15항에 있어서, D는 IL-2, IL-2 [N88R], IL-2 [N88D], IL-2 [N88R,C125S], 및 IL-2 [N88D,C125S]으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 링커-약물.
  17. 제12항 또는 제13항에 있어서, D는 IL-15, IL-15 N77A, IL-15-[N71S,N72A,N77A], IL-15ㆍL-15RαSu 융합 단백질, 또는 이의 변이체인 것인 링커-약물.
  18. 제12항 또는 제13항에 있어서, D는 IL-2, IL-7, IL-9, IL-10, IL-15, IL-15ㆍL-15RαSu 융합 단백질, IL-21, 또는 이의 사이토카인 변이체로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 N-알파 아민 기는 NH2(CH2CH2O)p(CH2)m (여기서 m은 2 내지 6의 정수이고 p는 0 내지 1000의 정수)의 첨가로 변형되는 것인 링커-약물.
  19. 대상체에서 Treg 세포를 선택적으로 확장시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트로 대상체를 치료하는 것을 포함하며, 여기서 D는 IL-2 또는 IL-2 변이체인 것인 방법.
  20. 대상체에서 CD8+ 이펙터 T 세포를 선택적으로 확장시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트로 대상체를 치료하는 것을 포함하며, 여기서 D는 IL-15, IL-15ㆍL-15RαSu 융합 단백질, 또는 이의 변이체인 것인 방법.
  21. 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 질병 및 병태는 자가면역 질환; 관용원성 CD4+ CD25+ FOXP3+ 조절 T 세포의 부적절한 재구성과 관련된 만성 이식편대숙주병 (cGVHD); 전신성 홍반성 루푸스; 유육종증; C형 간염 유발 혈관염; 원형 탈모증; 류마티스 관절염; 염증성 장 질병; 다발성 경화증; 및 제1형 당뇨병인 것인 방법.
  23. 요법을 받는 대상체에서 면역요법을 증대시키는 방법으로서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  24. NH2(CH2CH2O)p(CH2)m을 첨가하여 N-말단 알파 아민이 변형된 사이토카인 또는 사이토카인 변이체로서, 여기서 m은 2 내지 6의 정수이고 p는 0 내지 1000의 정수인 것인 사이토카인 또는 사이토카인 변형체.
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