JP2022530462A

JP2022530462A - 徐放性サイトカインコンジュゲート

Info

Publication number: JP2022530462A
Application number: JP2021563306A
Authority: JP
Inventors: エイ，ザサードハンガスキー，ジョン; ジェイファフ，サミュエル; ブイサンティ，ダニエル
Original assignee: プロリンクスエルエルシー
Priority date: 2019-04-26
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2022-06-29
Also published as: WO2020219943A1; EP3958888A4; AU2020261076A1; KR20220004134A; EP3958888A1; US20220193253A1; MX2021012813A; CN114126638A; CA3136726A1; SG11202111175YA; BR112021021481A2

Abstract

本開示は、一般に、放出可能なサイトカインコンジュゲート、およびそれを使用する方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月２６日に出願された米国仮出願第６２／８３９，１１２号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表の参照による組み込み
本出願は、電子フォーマットの配列表を伴って提出されている。その配列表は、２０２０年４月２４日作成、サイズ２６，６２２バイトの、670572002240SeqList.txtという名称のファイルとして提供されている。配列表の電子フォーマットの情報は、参照によりその全体が組み込まれる。

技術分野
本開示は、一般に、放出可能なサイトカインコンジュゲート、およびそれを用いた方法に関する。

サイトカインは、細胞シグナル伝達に関与する小さな（最大～２０ｋＤａ）タンパク質であり、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ケモカイン、およびリンホカインの幅広いカテゴリーを含む。これらは、広範囲の細胞によって産生され、免疫系において特に重要であり、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の間のバランスを調節する。インターロイキンは、免疫において特に重要な役割を果たすサイトカインの１つのグループを構成する。インターロイキンの大部分は、ヘルパーＣＤ４Ｔリンパ球で発現し、Ｔリンパ球とＢリンパ球および造血細胞の、発達と分化を促進する。

インターロイキン－２（ＩＬ－２）（配列番号１）は、微生物感染に対する天然の応答、および天然細胞と外来細胞との間の識別、において重要な、～１６ｋＤａのサイトカインである。ＩＬ－２は、主にＴ細胞への直接的な影響を介して、免疫系、寛容性、免疫の、重要な機能に、不可欠な役割を果たしている。Ｔ細胞が成熟する胸腺では、特定の未成熟Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）への分化を促進することにより、自己免疫疾患を防いでおり、この制御性Ｔ細胞は、体内の正常で健康な細胞を攻撃するように準備されている、他のＴ細胞を抑制する。ＩＬ－２は、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を増強する。ＩＬ－２はまた、初期のＴ細胞がまた抗原によって刺激されると、Ｔ細胞から、エフェクターＴ細胞（Ｔ_ｅｆｆ）およびメモリーＴ細胞（Ｔ_ｍｅｍ）への分化を促進し、それにより、身体が感染症と戦うのを助ける。ＩＬ－２は、他の極性化サイトカインとともに、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞のＴｈ１およびＴｈ２リンパ球への分化を刺激し、一方、Ｔｈ１７および濾胞性Ｔｈリンパ球への分化を阻害する。

ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）のαサブユニット（ＣＤ２５）は、低い親和性（Ｋ_ｄ～１０^－８Ｍ）でＩＬ－２に結合する。ＩＬ－２とＣＤ２５の相互作用は、細胞内鎖が短いため、単独でシグナル伝達をもたらさないが、（βおよびγサブユニットに結合した場合）ＩＬ－２Ｒ親和性を１０００倍に増加させる能力がある。ＩＬ－２Ｒのβおよびγサブユニットのヘテロ二量体化は、Ｔ細胞のシグナル伝達に不可欠である。ＩＬ－２は、中程度の親和性の二量体ＣＤ１２２／ＣＤ１３２ＩＬ－２Ｒβγ受容体（Ｋ_ｄ～１０^－９Ｍ）、または高親和性の三量体ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２ＩＬ－２Ｒαβγ受容体（Ｋ_ｄ～１０^－１１Ｍ）のいずれかを介して、シグナル伝達をすることができる。二量体ＩＬ－２Ｒβγは、ＣＤ８^＋Ｔ_ｍｅｍ細胞およびＮＫ細胞によって発現されるが、Ｔ_ｒｅｇおよび活性化Ｔ細胞は、高レベルの三量体ＩＬ－２Ｒαβγを発現する。γサブユニット（ＣＤ１３２）は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１の受容体間で共有されている。

制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）は、自己寛容の維持に重要なＴリンパ球のサブセットである。ＩＬ－２は、制御性Ｔ細胞とエフェクター（Ｔ_ｅｆｆ）細胞の両方の活性化に関与しているが、Ｔ_ｅｆｆ細胞よりもＴ_ｒｅｇ細胞の高親和性受容体の発現が高いということは、低用量のＩＬ－２が、Ｔ_ｒｅｇ細胞の維持を優先的にサポートすることを意味する。１型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、および全身性エリテマトーデスなどの疾患における自己免疫反応は、Ｔ_ｒｅｇの欠損と相関している。したがって、高親和性受容体を介したＴ_ｒｅｇ細胞の選択的で長期的な刺激は、自己免疫疾患の治療に有望である。

アルデスロイキン（組換えＩＬ－２）を用いた高用量ＩＬ－２療法は、転移性黒色腫および腎細胞癌の治療に承認されている。しかしながら、客観的奏効率が低く、高用量療法では、末端臓器毒性の発生率が高くなる。ＩＬ－２のほとんどの抗腫瘍活性は、高親和性ＩＬ－２Ｒαβγ受容体を介したＴ細胞の刺激からもたらされ、毒性のほとんどは、低親和性ＩＬ－２Ｒβγ受容体を介したナチュラルキラー細胞による炎症性タンパク質の放出に起因すると考えられている。８８位にアスパラギンを置き換えてアルギニンを有するＩＬ－２変異体（ｍｕｔｅｉｎ）（配列番号２；ＩＬ２－Ｎ８８Ｒ、ＢＡＹ５０－４７９８）は、高親和性ＩＬ－２Ｒαβγ受容体に選択的に結合し、Ｔ_ｅｆｆ細胞およびＮＫ細胞よりも、Ｔ_ｒｅｇ細胞の活性化に対する選択性を３，０００倍、増加させる。この考えと一致して、げっ歯類モデルにより、ＢＡＹ５０－４７９８とアルデスロイキンの同等な有効性が示されたが、変異体では毒性が低かった。ＢＡＹ５０－４７９８のヒト第１相試験では、Ｔ_ｅｆｆ細胞およびＮＫ細胞よりも、Ｔ_ｒｅｇ細胞の、予想される異なる活性化が確認されたが、抗腫瘍反応は制限され、変異体（ｍｕｔｅｉｎ）の開発はストップした。

ＩＬ－２および類似体のインビボ半減期を延長し、それによってそれらの効力を向上する試みが、報告されている。ＩＬ－２と抗体および抗体フラグメントとのさまざまな融合（ＷＯ２０１４／０２３７５２Ａ１）が開示されている。何人かの研究者は、ＦｃまたはＩｇＧと、ＩＬ－２｛Ｂｅｌｌ、２０１５＃２｝またはＴ_ｒｅｇ特異的変異体との融合、例えば、Ｆｃ－ＩＬ－２Ｎ８８Ｒ（Ｇｒｅｖｅ，Ｊ．ＵＳ２０１７／０２０４１５４Ａ１）、またはＩｇＧ－ＩＬ－２Ｎ８８Ｄ｛Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，２０１８＃１｝など、を開示している。ＩｇＧ－ＩＬ－２Ｎ８８Ｄの半減期は、カニクイザルにおいて、ＩＶ注射した場合は～８時間で、ＳＣ注射した場合は１４時間でしかなく、ＩｇＧにおいて期待される１４日よりもはるかに短く、ｔ_１／２が短いことは、受容体媒介のエンドサイトーシス（ＲＭＥ）に起因していた。それにもかかわらず、ＩｇＧ－ＩＬ－２Ｎ８８ＮＤの１回のＳＣ注射は、低用量ＩＬ－２の毎日の注射に匹敵する、制御性Ｔ細胞の長期的な増加をもたらした。すなわち、１回の注射後、Ｔ_ｒｅｇは、最大で～４日まで増殖し、～１４日間続いた。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ_ｒｅｇは、１０～１４倍に増加したが、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋メモリーエフェクターＴ細胞には、影響しなかった。しかしながら、そのような融合タンパク質は、効力の喪失、および天然タンパク質に対する免疫原性の増加などの、いくつかの欠陥を被る。ＩＬ－２と水溶性ポリマーとの特定の永続的かつ放出可能なコンジュゲートが開示されている（米国特許第９，８６１，７０５号）。受容体とその水溶性コンジュゲートとの間の選択性を変化させるために、非天然アミノ酸を含むＩＬ－２異性体が開示されている（ＷＯ２０１９／０２８４２５；ＷＯ２０１９／０２８４１９）。

インターロイキン－１５は、独特の受容体α鎖を介して作用するが、ＩＬ－２と同様のβおよびγ受容体鎖を介して作用する、関連サイトカインである。ＩＬ－１５は、獲得免疫および自然免疫の両方にとって重要な多面発現性のサイトカインである。ＩＬ－１５は、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＣＤ８^＋エフェクターＴ_ｍｅｍ細胞の活性化と維持を促進し、癌および免疫不全の治療のための免疫療法剤として興味がもたれている。外因性ＩＬ－１５は、インビボおよびインビトロの両方で、ＣＤ８^＋Ｔ_ｍｅｍ細胞の増殖を刺激することが示されている。ＩＬ－１５による低用量療法は、腫瘍特異的ＣＤ８^＋Ｔ_ｍｅｍ細胞の維持と機能を促進し、養子免疫療法の失敗における腫瘍の再発を遅延または防止すると仮定されている（Roychowdhury et al., Cancer Research 64: 8062-7 (2004)）。１０日間にわたるサルへの継続注入による低用量療法は、末梢血中のＣＤ８^＋エフェクターＴ_ｍｅｍ細胞の１００倍の増大をもたらし、これは毎日のボーラス投与レジメンよりも効果的であった（Sneller et al., Blood 118: 6845-8 (2011)）。ＩＬ－１５の安定化変異体が報告されている（Nellis et al., Pharm. Res. 29: 722-38 (2012)）。ＩＬ－１５と水溶性ポリマーとの特定の永続的かつ放出可能なコンジュゲートが開示されている（ＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／１５３７５３Ａ２）。改良された受容体アゴニズムを示すＩＬ－１５の変異体が開示されている（Zhu et al., J. Immunology 2009, 183(6): 3598）。ＩＬ－１５［Ｎ７２Ｄ］は、細胞増殖アッセイにおいて、ネイティブのＩＬ－１５の４～５倍の生物活性の増加を示した。ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒαのスシ（ｓｕｓｈｉ）ドメイン（ＩＬ－１５ＲαＳｕ）を含む、ＩＬ－１５受容体アゴニストはまた、複合体としても、および融合タンパク質としても、報告されている（Han et al., Cytokine 2011, 56(3):804-10; Mortier et al., J. Biological Chem. 2006, 281: 1612-9; 米国特許１０，３５８，４７７号）。ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＩＬ－１５ＲαＳｕＦｃとＩＬ－１５［Ｎ７２Ｄ］との多量体複合体（ＡＬＴ－８０３）が、現在、臨床試験中である。

三量体受容体に対する親和性が低下したＩＬ－２の変異体が、開示されている（米国特許第９，２０６，２４３号）。これらの変異体は、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激する能力を維持しながら、Ｔ_ｒｅｇ細胞を刺激する能力の低下を示す。このようなＩＬ－２変異体は、Ｔ_ｒｅｇ細胞による免疫抑制が欠如しているため、抗腫瘍活性の増強を示し得ることが、提案されている。

ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発達、および成熟Ｔ細胞の生存および恒常性に必要なサイトカインである。胸腺におけるダブルネガティブ（ＤＮ）ＣＤ４^－ＣＤ８^－胸腺細胞前駆細胞の移行には、ＩＬ－７シグナル伝達が必要であるが、高用量のＩＬ－７は、ＤＮの進行をブロックする。末梢に入ると、ナイーブＴ細胞の生存は、ＩＬ－７に依存する。ＩＬ－７受容体には、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－９、およびＩＬ－２１に使用される、共通のγ鎖（ＣＤ１３２）とともに、リンパ球にほぼ独占的に発現する特定のα鎖（ＣＤ１２７）が含まれている。ＩＬ－７は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを上昇させるために、Ｔ細胞除去療法を受けた癌患者の免疫療法剤として、臨床試験が行われている。ＩＬ－７の投与により、ナイーブＴ細胞が優先的に増殖し、患者の年齢に関係なく、Ｔ細胞のレパートリーが広がり、ナイーブＴ細胞集団が少ない患者の免疫応答を増強するＩＬ－７による治療の可能性が示唆された（ElKassar & Gress, J. Immunotoxicol. (2010) 7: 1-7.）。

ＩＬ－９は、肥満細胞、ＮＫ細胞、ＴＨ２、ＴＨ１７、Ｔ_ｒｅｇ、ＩＬＣ２、およびＴｈ９細胞によって産生される、ＩＬ－２およびＩＬ－１５に構造的に関連する別の多面的なサイトカインであり、Ｔｈ９細胞は、主要なＣＤ４＋Ｔ細胞産生体とみなされる。ＩＬ－９受容体は、共通のγ鎖（ＣＤ１３２）とともに、特定のアルファ鎖（ＣＤ１２９）を含んでいる。化学療法誘発性の血小板減少症を防ぎ、血小板の回復を促進するために、ＩＬ－９を用いた低用量療法が、提案されている（Xiao et al., Blood 129: 3196-3209 (2017)）。

ＩＬ－１０（ヒトサイトカイン合成阻害因子）は、Ｔｈ２細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージによって産生される、抗炎症性の免疫抑制性サイトカインである。それは、ガンマインターフェロン、ＩＬ－２、および腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）が含まれる、Ｔｈ１細胞によって産生されるいくつかのサイトカインの合成を阻害し、そして、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、および、単球とマクロファージによるＴＮＦ－α、の産生を阻害する。ＩＬ－１０は、用量依存的にＮＫ細胞の活性化と標的細胞の破壊を誘導することが見られる（Zheng et al. J. Exp.Med. 184:579-84 (1996)）。それは、自己免疫疾患、敗血症性ショック、および細菌性敗血症の治療のために、調査中である。ＩＬ－１０のＰＥＧ化誘導体が、開示されている（ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０７７８５３）。ＰＥＧ化ＩＬ１０は、インターフェロンガンマおよびＣＤ８＋Ｔ細胞依存性抗腫瘍免疫を誘導することが示されている（Emmerich et al., Cancer Res. 72: 3570-81 (2012); Mumm et al., Cancer Cell 20:781-96 (2011); Chan et al., J Interferon Cytokine Res. 35: 948-55 (2015)）。ＰＥＧ化ＩＬ１０の調査は、ヒトの治療において、ＩＬ－１０が、主にＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を介した免疫刺激性であることを示唆し、転移ステージ４の膵臓癌の治療に関する第３相試験は主要評価項目を達成できなかったが、非小細胞肺癌の第２相試験が進行中である。

ＩＬ－２１は、活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞で発現され、Ｔｈ２およびＴｈ１７Ｔヘルパー細胞、ならびにＴ濾胞細胞において、アップレギュレートされる。それは、ＮＫ細胞で発現され、その機能を調節する。ＩＬ－２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞の表面に発現し、共通のγ鎖（ＣＤ１３２）と組み合わさって、機能する。アレルギー、ウイルス感染、および癌の治療におけるＩＬ－２１の利用が、提案されており、転移性黒色腫および腎細胞癌の治療のための臨床試験が行われている。ＩＬ－２１は、ＨＩＶに感染した被験者における、ＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答およびＮＫ細胞機能を改善することが報告されており、ＨＩＶの治療における使用の可能性が示唆されている。

持続注入は、サイトカインによる持続的低用量療法の期待を示すが、しかしながら、ヒト治療において実際に実施することは困難である。したがって、サイトカインを用いた、癌および自己免疫障害を含む様々な疾患に対する、低用量で長期間の治療を可能にする、改良された薬剤が必要である。

一態様において、式（Ｉ）：
Ｚ－Ｌ－Ｄ（Ｉ）
［式中、Ｚ、Ｌ、Ｄは、本明細書に記載された通りである。］
で示される、リンカー－薬物が提供される。

いくつかの実施形態において、リンカー－薬物Ｚ－Ｌ－Ｄは、式（Ｉａ）：

（Ｉａ）
［式中、Ｚ、Ｓ、ｎ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｙ、およびＤは、本明細書に記載された通りである。］
で示される化合物である。

別の態様において、式（ＩＩａ）：

（ＩＩａ）
［式中、ｎ、Ｚ、Ｓ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＸは、本明細書に記載された通りである。］
で示されるリンカー、が提供される。

別の態様において、式（ＩＩＩ）：
Ｍ－［Ｚ^＊－Ｌ－Ｄ］_ｑ（ＩＩＩ）
［式中、Ｍ、Ｚ^＊、Ｌ、Ｄ、およびｑは、本明細書に記載された通りである。］
で示されるコンジュゲート、が提供される。

別の態様において、式（ＩＶ）：

（ＩＶ）
［式中、Ｐ^１、Ｐ^２、ｒ、Ａ^＊、Ｂ、Ｃ^＊、ｎ、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１４、ｘ、ｙ、およびｚは、本明細書に記載された通りである。］
で示される分解性架橋ヒドロゲル、が提供される

別の態様において、本明細書に開示された化合物を製造する方法、およびそれらを使用する方法、が提供される。別の態様において、式（ＩＩＩ）のコンジュゲート、または式（ＩＶ）のヒドロゲルを含む、医薬組成物、が提供される。

図１は、リンカー－薬物がヒドロゲルに結合しているコンジュゲートの一般的な構造を示している。

図２は、αβγおよびβγ受容体を含む細胞に対する、ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の結合を示している。

図３は、ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の還元的アルキル化からのリンカー－タンパク質生成物に対応するバンドを有する、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示している。

図４は、マイクロスフェア－ＩＬ２－Ｎ８８Ｒで処置した後のラットにおける血漿ＩＬ２［Ｎ８８Ｒ］の、Ｃ対ｔプロットを示している。図４Ａは、０．２５μｍｏｌ／ｋｇで投与されたランダムアシル化コンジュゲートからのＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５］の放出を示し、図４Ｂは、０．１２μｍｏｌ／ｋｇで投与された還元アルキル化コンジュゲートからのＡＰ－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の放出を示している。

図５は、脾臓におけるＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の薬力学を示している。左：ＣＤ４^＋エフェクター／メモリーＴ細胞のパーセンテージ；右：ＣＤ８^＋エフェクター／メモリーＴ細胞のパーセンテージ。

図６は、膵島におけるＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の薬力学を示している。左上：Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞のパーセンテージ；右上：ＣＤ４^＋のパーセンテージ；左下：ＣＤ８^＋のパーセンテージ；右下：自然リンパ球。ＮＯＤマウスに、ＰＢＳビヒクル、プロロイキン（Proleukin）（２５０００ユニット）、またはＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（２５０００ユニット）を、毎日注射し、５日目の最後の注射の２時間後、屠殺した。

図７は、マウスにおける、マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（「ＭＳ－ＩＬ－２変異体」）から放出された、［アミノプロピル］－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の薬物動態を示している。図７Ａ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）の側腹部に、２８ｎｍｏｌ（１９ｍｇ／ｋｇ）または９．９ｎｍｏｌ（６．５ｍｇ／ｋｇ）のマイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］を含む、１回の皮下注射投与を行った。３１時間のｔ_１／２が測定された。図７Ｂ：ＮＯＤマウス（ｎ＝６）の側腹部に、マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（０．５、１、５、１０、または１９ｍｇ／ｋｇ）を投与した。１８時間のｔ_１／２が測定された。図７Ｃ：ＮＳＧマウス（ｎ＝６）またはＮＯＤマウス（ｎ＝６）の側腹部に、マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。ＮＳＧマウスにおいて、［アミノプロピル］－ＩＬ２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］で、１５２時間のｔ_１／２が測定された。すべての場合において、血漿は、ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＥＬＩＳＡを使用して分析し、ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］濃度を定量した。

図８は、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞の集団の増殖に対する、ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（「ＩＬ－２変異体」）の効果を示している。図８Ａは、脾臓および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を示している。図８Ｂは、脾臓およびＰＢＭＣにおける、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を示している。脾臓およびＰＢＭＣに見られるＣＤ８^＋細胞のパーセンテージは、それぞれ、約１１％および１９％であった。マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］で処理した場合、これらのパーセンテージは、それぞれ、約２５％および６０％に増加した。ＮＯＤマウスに、ＩＬ２－変異体（ＱＤ×５、２５，０００ユニット）、単回注射の空（エンプティ）のマイクロスフェア、またはマイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（１８ｍｇ／ｋｇ）を投与した。５日目の最後の投与の２時間後に、マウスを屠殺した。

図９は、ＰＢＭＣにおける用量依存的なＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を示している。図９Ａは、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖に対する、マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の効果を示し、図９Ｂは、ＣＤ８^＋細胞の活性化に対する、その効果を示しており（右）、これらはＮＯＤマウス（ｎ＝３／用量群）におけるものである。マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］は、ＮＯＤマウス（ｎ＝３／用量群）において、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞を優先的に増殖させ、ＣＤ８^＋細胞の活性化を避ける。Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖は、すべての用量で４日目にピークに達し、１４日目までにベースラインレベルに戻る。

図１０は、ＩＬ－１５の還元的アルキル化からのリンカー－タンパク質生成物に対応するバンドを有する、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示している。左から右に：分子量マーカー；ＩＬ－１５；ＩＬ－１５＋ＰＥＧ_５ｋＤａ－ＤＢＣＯ；ＩＬ－１５＋１Ｅｑ（ＩＩｂ）＋ＰＥＧ_５ｋＤａ－ＤＢＣＯ；ＩＬ－１５＋３Ｅｑ（ＩＩｂ）＋ＰＥＧ_５ｋＤａ－ＤＢＣＯ；および、ＩＬ－１５＋５Ｅｑ（ＩＩｂ）＋ＰＥＧ_５ｋＤａ－ＤＢＣＯ。

図１１は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける、ＭＳ－ＩＬ－１５から放出された［アミノプロピル］－ＩＬ－１５の薬物動態を示している。正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ｔ＝０時間およびｔ＝２４０時間に、ＭＳ～ＩＬ－１５（５０μｇ）を投与した。血漿サンプルを、ヒトＩＬ－１５ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、調製および分析した。２４０時間を通して２つの異なるｔ_１／２が観測された。ｔ_１／２＞２００時間が、１２０時間まで観測され、その後、１２０時間から２４０時間までで、２７時間の２回目のｔ_１／２が観測された。ＭＳ～ＩＬ－１５（５０μｇ）の２回目の注射は、２４０時間の採血直後に投与した（青色のデータ）。２３時間のｔ_１／２が、２６４時間から３６０時間までで、観測された。

図１２は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける、マイクロスフェア－ＩＬ－１５から放出された、［アミノプロピル］－ＩＬ－１５の薬物動態の用量依存性を示している。正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＭＳ－ＩＬ－１５（１２．５、２５、または５０μｇ）を投与した。血漿サンプルを、ヒトＩＬ－１５ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、調製および分析した。１２０時間までのデータフィットでは、１１５～２０７時間のｔ_１／２が観測された。

図１３は、皮下投与あるいは腹腔内投与したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける、マイクロスフェア－ＩＬ－１５から放出された、［アミノプロピル］－ＩＬ－１５の薬物動態学を示している。正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＭＳ－ＩＬ－１５（５０μｇ）を、皮下（s.c.）注射（黒色、●）または腹腔内（i.p.）注射（青色、■）で、投与した。血漿サンプルを、ヒトＩＬ－１５ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、調製および分析した。１２０時間までで、皮下投与（１１５時間）および腹腔内投与（１２９時間）において、同様のｔ_１／２が観測された。

図１４は、ＮＫ細胞およびＣＤ４４ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する、マイクロスフェア－ＩＬ１５コンジュゲートの効果を示している。マイクロスフェア－ＩＬ１５コンジュゲートは、ＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を増殖させる。図１４Ａ：ＣＤ４４ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖。図１４Ｂ：ＮＫ細胞の増殖。正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、単回の皮下注射のマイクロスフェア～ＩＬ－１５（２．５、１２．５、２５、または５０μｇのＩＬ－１５）、空（エンプティ）のマイクロスフェア（黒色）、または、単回の皮下注射のｒｈＩＬ１５（２．５μｇ）、を投与した。フローサイトメトリーを使用して、ＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞およびＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖をモニタリングした。ＣＤ４４ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖は、マイクロスフェア－ＩＬ１５の５０ｕｇ単回注射の後、２８日間続いた。

図１５は、ＰＥＧ_５ｋＤａ－ＤＢＣＯとのゲルシフト反応後に視覚化された、リンカー（ＩＩｂ）による受容体結合インターロイキン（ＲＬＩ）の還元的アルキル化からのリンカー－タンパク質生成物に対応するバンドを有する、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示している。左から右に：分子量マーカー；ＲＬＩ；ＲＬＩ＋ＰＥＧ_５ｋＤａ－ＤＢＣＯ；ＲＬＩ＋１．５Ｅｑ（ＩＩｂ）＋ＰＥＧ_５ｋＤａ－ＤＢＣＯ；ＲＬＩ＋２Ｅｑ（ＩＩｂ）＋ＰＥＧ_５ｋＤａ－ＤＢＣＯ；ＲＬＩ＋３Ｅｑ（ＩＩｂ）＋ＰＥＧ_５ｋＤａ－ＤＢＣＯ；および、ＲＬＩ＋５Ｅｑ（ＩＩｂ）＋ＰＥＧ_５ｋＤａ－ＤＢＣＯ。

図１６は、ＲＬＩのためのＩＬ－２Ｒβγ受容体結合細胞ベースのアッセイの結果を示している。Ｕ２ＯＳ細胞ベースのアッセイを使用して、ｐＨ７．４でコンジュゲートから放出した［アミノプロピル］－ＲＬＩの結合活性（ＥＣ_５０＝１８０ｐＭ）を測定し、天然のＲＬＩ（ＥＣ_５０＝１６０ｐＭ）と比較した。

図１７は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける、マイクロスフェアコンジュゲートから放出された、［アミノプロピル］－ＲＬＩの薬物動態を示している。正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、マイクロスフェア－ＲＬＩコンジュゲート（１．５ｎｍｏｌ）を投与した。血漿サンプルを、Ｒ＆ＤｓｙｓｔｅｍｓＤｕｏＳｅｔｈＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα ｃｏｍｐｌｅｘＥＬＩＳＡ（ＤＹ６９２４）を使用して、調製および分析した。

図１８は、マイクロスフェアコンジュゲートから放出された［アミノプロピル］－ＲＬＩの薬力学を示し、ＰＢＭＣにおけるＣＤ８^＋メモリーＴ細胞の増殖を測定している。図１８Ａ：ＰＢＭＣにおけるＣＤ８^＋メモリーＴ細胞の細胞の割合、および、図１８Ｂ：ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖。正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの側腹部に、空（エンプティ）のＭＳ、ＭＳ～ＲＬＩ（３４μｇ、１．５ｎｍｏｌ）、または、天然のＲＬＩ（２．５μｇ、０．１１ｎｍｏｌ、ＱＤ×４）を、皮下注射で投与した。採血後にＰＢＭＣを調製し、フローサイトメトリー分析のために染色した。

図１９は、マイクロスフェア－ＲＬＩにより処置した、ＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞の増殖を示している。図１９Ａ：ＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞の細胞割合、および、図１９Ｂ：ＮＫ細胞の増殖。正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの側腹部に、空（エンプティ）のＭＳ、ＭＳ～ＲＬＩ（３４μｇ、１．５ｎｍｏｌ）、または、天然のＲＬＩ（２．５μｇ、０．１１ｎｍｏｌ、ＱＤ×４）を、皮下注射で投与した。採血後にＰＢＭＣを調製し、フローサイトメトリーによる分析のために染色した。

本開示は、その変異体を含むサイトカインタンパク質の放出可能なコンジュゲートを提供する。コンジュゲートは、これらのタンパク質治療薬を、長期間にわたって低用量で用量持続的に送達するため、さまざまな疾患の治療に有用である。

一態様において、本開示は、タンパク質の高分子担体へのコンジュゲーションに適した、結合した放出可能なリンカーを有する、サイトカインおよびその変異体を提供する。これらのリンカーは、担体からのタンパク質の放出速度を制御し、したがって、体内のサイトカインまたは変異体の濃度および持続時間を決定する。

別の態様において、本開示は、高分子担体からサイトカインおよびその変異体を放出するコンジュゲートを提供する。担体は、体内のタンパク質の持続時間を延長させる、可溶性または不溶性のデポ剤（ｄｅｐｏｔｓ）である。

別の態様において、本開示は、本開示のリンカー－サイトカインおよびコンジュゲートのための、製造および使用の方法を提供する。

定義
本明細書において、特に断りのない限り、「ａ」、「ａｎ」などの用語の使用は、１つまたは複数を意味する。

本明細書において、特に断りのない限り、「約」または「おおよそ」との用語は、数値に関連して使用する場合、１５％以内、１０％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、または０．５％以内の数値を企図する。

「アルキル」との用語は、１～２０、１～１２、１～８、１～６、または１～４個の炭素原子の、直鎖、分岐、または環状の飽和炭化水素基を含む。いくつかの実施形態において、アルキルは、直鎖または分枝である。直鎖または分岐のアルキル基としては、これに限定されるものではないが、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシルなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、アルキルは環状である。環状アルキル基としては、これに限定されるものではないが、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシルなどが挙げられる。

「アルコキシ」との用語は、酸素に結合したアルキル基を含み、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、シクロプロポキシ、シクロブトキシなどが挙げられる。

「アルケニル」との用語は、炭素－炭素二重結合を有し、および２～２０、２～１２、２～８、２～６、または２～４個の炭素原子を有する、非芳香族の不飽和炭化水素を含む。

「アルキニル」との用語は、炭素－炭素三重結合を有し、および２～２０、２～１２、２～８、２～６、または２～４個の炭素原子を有する、非芳香族の不飽和炭化水素を含む。

「アリール」との用語は、６～１８個の炭素、好ましくは６～１０個の炭素の芳香族炭化水素基を含み、フェニル、ナフチル、およびアントラセニルなどの基が挙げられる。「ヘテロアリール」との用語は、少なくとも１つのＮ、ＯまたはＳ原子を含んで、３～１５個の炭素を含む、好ましくは、少なくとも１つのＮ、ＯまたはＳ原子を含んで、３～７個の炭素を含む、芳香族環を含み、ピロリル、ピリジル、ピリミジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、キノリル、インドリル、インデニルなどの基が挙げられる。

いくつかの例において、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリールの部分は、アルキル結合を介して分子の残りの部分に結合し得る。これらの状況下で、置換基は、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルと称され、アルキレン部分が、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリールの部分と、該アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリールが結合している分子との間にあることを示す。

「ハロゲン」または「ハロ」との用語は、ブロモ、フルオロ、クロロ、およびヨードを含む。

「ヘテロ環」または「ヘテロシクリル」との用語は、少なくとも１つのＮ、Ｏ、またはＳ原子を含む、３～１５員の芳香族または非芳香族の環を意味する。これに限定されるものではないが、例えば、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、ピロリジン、およびテトラヒドロフラニル、ならびに、上記の「ヘテロアリール」の用語のために提供された例示の基が含まれる。いくつかの実施形態において、ヘテロ環またはヘテロシクリルは、非芳香族である。いくつかの実施形態において、ヘテロ環またはヘテロシクリルは、芳香族である。

「高分子」との用語は、分子量が、５，０００～１，０００，０００ダルトン、好ましくは１０，０００～５００，０００ダルトン、より好ましくは１０，０００～２５０，０００ダルトンの、分子または分子の残基を意味する。高分子としては、これに限定されるものではないが、例えば、抗体、抗体フラグメント、および酵素を含む、タンパク質；ポリ（リジン）、およびポリ（バリン）などのポリ（アミノ酸）、および混合配列ポリペプチドを含む、ポリペプチド；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、およびそれらのコポリマーを含む、合成ポリマー；および、デキストランなどの多糖類、が挙げられる。いくつかの実施形態において、高分子は、上記のような、アミン、カルボン酸、アルコール、チオール、アルキン、アジド、またはマレイミド基などの、天然または化学的変換後のいずれかで、コンジュゲーションに適した少なくとも１つの官能基を含む。本開示の特定の実施形態において、高分子は、ポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールは、直鎖または分枝であって、一端がコンジュゲーションに適した官能基で終端となり、他端（または複数の他端）がキャッピング基（例えば、メチル）で終端となっていてもよく、あるいは、各アームが、コンジュゲーションに適した官能基で終端となった、複数のアームを含んでいてもよい。本開示の好ましい実施形態において、ポリエチレングリコールは、平均分子量が、２０，０００～２００，０００ダルトン、好ましくは２０，０００～１００，０００ダルトン、最も好ましくは約４０，０００ダルトン、である、直鎖、分岐、またはマルチアームのポリマーである。そのようなポリエチレングリコールの例は、当技術分野で知られており、例えば、日油株式会社（東京、日本）から市販されている。

特に断りのない限り、「任意に置換されていてもよい」とは、基が、非置換であるか、または、同じかまたは異なっていてもよい置換基の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４または５つ）によって、置換され得ることを意味する。置換基としては、これに限定されるものではないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、－ＣＮ、－ＯＲ^ａａ、－ＳＲ^ａａ、－ＮＲ^ａａＲ^ｂｂ、－ＮＯ_２、－Ｃ＝ＮＨ（ＯＲ^ａａ）、－Ｃ（Ｏ）Ｒ^ａａ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ^ａａ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ^ａａ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ａａＲ^ｂｂ、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^ａａＲ^ｂｂ、－ＮＲ^ａａＣ（Ｏ）Ｒ^ｂｂ、－ＮＲ^ａａＣ（Ｏ）ＯＲ^ｂｂ、－Ｓ（Ｏ）Ｒ^ａａ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^ａａ、－ＮＲ^ａａＳ（Ｏ）Ｒ^ｂｂ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ａａＳ（Ｏ）Ｒ^ｂｂ、－ＮＲ^ａａＳ（Ｏ）_２Ｒ^ｂｂ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ａａＳ（Ｏ）_２Ｒ^ｂｂ、－Ｓ（Ｏ）ＮＲ^ａａＲ^ｂｂ、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ^ａａＲ^ｂｂ、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ^ａａ）（ＯＲ^ｂｂ）、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、またはアリール、が挙げられ、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、およびアリールは、それぞれ独立して、任意に、Ｒ^ｃｃによって置換されていてもよく、ここで、
Ｒ^ａａおよびＲ^ｂｂは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、またはアリールであるか、または、
Ｒ^ａａおよびＲ^ｂｂは、それらが結合する窒素原子と一緒になってヘテロシクリルを形成し、これは、任意に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、または－ＣＮで置換されていてもよく、ここで、
各Ｒ^ｃｃは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アリール、－ＣＮ、または－ＮＯ_２である。

典型的には、薬物の活性形態が、本開示のコンジュゲートから直接放出されるが、いくつかの場合において、そのプロドラッグの形態で、活性な薬物を放出することが可能である。

リンカー－薬物
一態様において、式（Ｉ）：
Ｚ－Ｌ－Ｄ（Ｉ）
［式中、Ｚは、リンカー－薬物の高分子担体への接続を可能にする官能基であり、Ｌは、切断可能なリンカーであり、および、Ｄは、サイトカインまたはサイトカイン変異体である。］
で示される、リンカー－薬物が提供される。
いくつかの実施形態において、放出可能なリンカーは、タンパク質の高分子担体へのコンジュゲーションに適している。いくつかの実施形態において、リンカーは、担体からのサイトカインまたは変異体の放出速度を制御し、したがって、体内の活性タンパク質の濃度および持続時間を決定する。
一態様において、式（Ｉ）：
Ｚ－Ｌ－Ｄ（Ｉ）
［式中、Ｚは、リンカー－薬物の高分子担体への接続を可能にする官能基であり、Ｌは、切断可能なリンカーであり、および、Ｄは、サイトカインまたはサイトカイン変異体である。］
で示される、リンカー－薬物が提供される。

式（Ｉ）のリンカー－薬物のいくつかの実施形態において、サイトカインＤは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそのサイトカイン変異体、である。Ｄは、また、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍなどの、サイトカインに特定の化学修飾を有するサイトカインを包含し、ここで前記式において、ｍは、２～６の整数であり、ｐは、０～１０００の整数であり、リンカーＬを結合するための還元的アミノ化から生じるアミン基に結合される。特定の実施形態において、この修飾は、タンパク質配列のＮ末端アルファ－アミノ基に結合される。

「サイトカイン変異体」とは、天然（native）のサイトカインに対して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％の配列同一性を有する、変更された配列のタンパク質（「変異体」（ムテイン、mutein））を意味する。いくつかの実施形態において、サイトカイン変異体は、天然のサイトカインに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、サイトカイン変異体は、天然配列から１～１０個の変更されたアミノ酸を含み、タンパク質の安定性および／または受容体結合親和性または選択性の向上に基づいて、選択される。組換えサイトカインを産生するために使用される発現系に応じて、配列は、開始メチオニン残基を含んでもよいし、あるいは含まなくてもよい。例えば、本開示において有用なＩＬ－２変異体は、二量体βγ受容体よりも三量体αβγ受容体に対しての結合親和性が増加したものから選択され得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異体は、アスパラギン－８８に変異を有し、例えば、Ｎ８８ＲまたはＮ８８Ｄであり、これは、Ｃ１２５Ｓなどの他の変異と組み合わせて、さらなる安定性または選択性を与え得る。本開示における使用に適した他のＩＬ－２変異体を開示すると、例えば、ＩＬ－２Ｄ２０Ｔなどの、アスパラギン酸－２０において変更された変異体、または、米国特許第９，２０６，２４３号に開示される三量体受容体に対する親和性が低下した変異体、が挙げられる。ＩＬ－２および変異体の特定の実施形態は、配列番号１～１１に示されるものである。

配列番号１天然のヒトＩＬ－２
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS LT

配列番号２ＩＬ－２－Ｎ８８Ｒ（ＢＡＹ５０－４７９８）
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT

配列番号３ＩＬ－２－Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

配列番号４ＩＬ－２－Ｄ２０Ｔ
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT

配列番号５ＩＬ－２－Ｄ２０Ｔ，Ｃ１２５Ｓ
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

配列番号６ＩＬ－２－Ｒ３８Ｋ，Ｆ４２Ｉ，Ｙ４５Ｎ，Ｅ６２Ｌ，Ｅ６８Ｖ
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTKML TIKFNMPKKA TELKHLQCLE ELLKPLEVVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT

配列番号７ＩＬ－２－Ｒ３８Ｋ，Ｆ４２Ｑ，Ｙ４５Ｅ，Ｅ６８Ｖ
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTKML TQKFEMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEVVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT

配列番号８ＩＬ－２－Ｒ３８Ａ，Ｆ４２Ｉ，Ｙ４５Ｎ，Ｅ６２Ｌ，Ｅ６８Ｖ
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TIKFNMPKKA TELKHLQCLE ELLKPLEVVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT

配列番号９ＩＬ－２－Ｒ３８Ｋ，Ｆ４２Ｋ，Ｙ４５Ｒ，Ｅ６２Ｌ，Ｅ６８Ｖ
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTKML TKKFRMPKKA TELKHLQCLE ELLKPLEVVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT

配列番号１０ＩＬ－２Ｒ３８Ｋ，Ｆ４２Ｉ，Ｙ４５Ｅ，Ｅ６８Ｖ
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTKML TIKFEMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEVVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT

配列番号１１ＩＬ－２Ｒ３８Ａ，Ｆ４２Ａ，Ｙ４５Ａ，Ｅ６２Ａ
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TAKFAMPKKA TELKHLQCLE EALKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT

同様に、天然のＩＬ－１５は、活性、受容体結合選択性、または安定性を向上させる変異体で置き換えることができる。例えば、天然のＩＬ－１５（配列番号１２）は、アスパラギン脱アミド化による分解に対する耐性が向上した変異体によって置換され得、例えば、ＩＬ－１５－［Ｎ７７Ａ］（配列番号１３）、またはＩＬ－１５－［Ｎ７１Ｓ，Ｎ７２Ａ，Ｎ７７Ａ］（配列番号１４）が挙げられ、これらは生物学的活性を保持することが示され（Nellis et al., Pharm. Res. 29:722-38 (2012)）、あるいは、ＩＬ－１５［Ｎ７２Ｄ］（配列番号１５）が挙げられ、これは増強された受容体アゴニズムを示す（Zhu et al., J. Immunology 2009, 183(6): 3598）。

配列番号１２ＩＬ－１５
NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS

配列番号１３ＩＬ－１５［Ｎ７７Ａ］
NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NNSLSSAGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS

配列番号１４ＩＬ－１５［Ｎ７１Ｓ，Ｎ７２Ａ，Ｎ７７Ａ］
NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA SASLSSAGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS

配列番号１５ＩＬ－１５［Ｎ７２Ｄ］
NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NDSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS

ＩＬ－１５とＩＬ－１５ＲαＳｕとの、複合体および融合タンパク質もまた、使用することができ、例えば、受容体結合インターロイキンＲＬＩ（配列番号１６）およびその変異体（Mortier et al., J. Biological Chem. 2006, 281: 1612-9；米国特許１０，３５８，４７７号）が挙げられる。これらの融合タンパク質は、任意に、ＩＬ－１５ＲαＳｕシグナル配列、および、タンパク質の単離および精製を容易にするために当技術分野で知られた配列、例えば、ＨｉｓタグおよびＦｌａｇタグ、を含んでもよいし、あるいは、これらの構成要素が存在しなくてもよい（配列番号１７）。

配列番号１６ＲＬＩ
MAPRRARGC RTLGLPALLL LLLLRPPATR GDYKDDDDKI EGRITCRRRM SVEHADIWVK SYSLYSRERY ICNSGFKRKA GTSSLTECVL NKATNVAHWT TPSLKCIRDP ALVHQRPAPP SGGSGGGGSG GGSGGGGSLQ NWVNVISDLK KIQDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH DTVENLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS

配列番号１７ＲＬＩ［Ｎ７７Ａ］
ITCPPPMSVE HADIWVKSY SLYSRERYIC NSGFKRKAGT SSLTECVLNK ATNVAHWTTP SLKCIRDPAL VHQRPAPPSS GGSGGGGSGG GSGGGGSLQN WVNVISDLKK IEDLIQSMHI DATLYTESDV HPSCKVTAMK CFLLELQVIS LESGDASIHD TVENLIILAN NSLSSAGNVT ESGCKECEEL EEKNIKEFLQ SFVHIVQMFI NTS

他のサイトカインとしては、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、およびＩＬ－２１（配列番号１８～２１）が挙げられる。

配列番号１８ＩＬ－７
DCDIEGKDGK QYESVLMVSI DQLLDSMKEI GSNCLNNEFNFFKRHICDAN KEGMFLFRAA RKLRQFLKMN STGDFDLHLL KVSEGTTILL NCTGQVKGRK PAALGEAQPT KSLEENKSLK EQKKLNDLCF LKRLLQEIKT CWNKILMGTK EH

配列番号１９ＩＬ－９
QGCPTLAGIL DINFLINKMQ EDPASKCHCS ANVTSCLCLG IPSDNCTRPC FSERLSQMTN TTMQTRYPLI FSRVKKSVEV LKNNKCPYFS CEQPCNQTTA GNALTFLKSL LEIFQKEKMR GMRGKI

配列番号２０ＩＬ－２１
QGQDRHMIRM RQLIDIVDQL KNYVNDLVPE FLPAPEDVET NCEWSAFSCF QKAQLKSANT GNNERIINVS IKKLKRKPPS TNAGRRQKHR LTCPSCDSYE KKPPKEFLER FKSLLQKMIH QHLSSRTHGS EDS

配列番号２１ＩＬ－１０
MSPGQGTQSE NSCTHFPGNL PNMLRDLRDA FSRVKTFFQM KDQLDNLLLK ESLLEDFKGY LGCQALSEMI QFYLEEVMPQ AENQDPDIKA HVNSLGENLK TLRLRLRRCH RFLPCENKSK AVEQVKNAFN KLQEKGIYKA MSEFDIFINY IEAYMTMKIR N

特定の実施形態において、サイトカインは、化学的に修飾して、例えば、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーを１つまたは複数の位置に結合させることによって、コンジュゲートから放出された体内のタンパク質の持続時間を延長したり、および／または、受容体の選択性を変更したりすることができる。

これらのタンパク質は、当技術分野で知られている方法を用いて製造することができる。組換えにより製造する場合、それらは原核生物または真核生物のいずれかの系で発現させることができる。

様々な切断可能なリンカーＬを使用することができ、例えば、米国特許第８，６８０，３１５号；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３６８５７号；ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／１３８５７２号；ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０９９７６８号；ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／１３６５８６号；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０１２７２２号；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０８９２１４号；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０８９２１５号；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０８９２１６号；および、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０２０３７３号、に開示されているものが挙げられる。リンカーＬは、適切な条件下で特定の速度で切断する共有結合を含む。このような切断は、触媒作用または非触媒作用による加水分解、タンパク質分解、または脱離反応によるものであり得る。切断のための適切な条件は、生理学的環境で典型的に見られる条件であり、典型的には、ｐＨが約６．５～７．５で、温度が３０～４５℃であり、好ましくは、ｐＨが約７．４で、温度が約３７℃、である。

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のリンカー－薬物は、式（Ｉａ）：

（Ｉａ）
［式中、
ｎは、０～６の整数であり；
Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、電子求引基、アルキル、またはＨであり、ここで、Ｒ^１およびＲ^２のうちの少なくとも１つは、電子求引基であり；
各Ｒ^４は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであるか、または、２つのＲ^４は、それらが結合する炭素原子と一緒になって３～６員環を形成し；
Ｚは、リンカーを高分子担体に接続するための基であり；
Ｓは、存在しないか、または、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣＯＮＨであり、ここで、ｇは、１～６の整数であり、ｈは、０～１０００の整数であり；
Ｙは、存在しないか、または、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍであり、ここで、ｍは、２～６の整数であり、ｐは、０～１０００の整数であり；および、
Ｄは、本明細書に開示されたサイトカインまたはサイトカイン変異体のアミン残基である。］
で示される、化合物である。

式（Ｉａ）のリンカー－薬物のいくつかの実施形態において、ｎ＝１～６、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、電子求引基、アルキル、またはＨであり、ここで、Ｒ^１およびＲ^２のうちの少なくとも１つは、電子求引基であり；各Ｒ^４は、独立して、Ｈ、またはＣ_１－Ｃ_３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成してもよく；Ｚは、リンカーを高分子担体に接続するための基であり；Ｓは、存在しないか、または、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣＯＮＨであり、ここで、ｇ＝１～６、およびｈ＝０～１０００であり；Ｙは、存在しないか、または、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍであり、ここで、ｍ＝２～６、および、ｐ＝０～１０００であり；そして、Ｄは、ＩＬ－２、ＩＬ－２変異体、ＩＬ－１５、またはＩＬ－１５変異体のサイトカインのアミン残基である。

Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基の説明は、米国特許第８，６８０，３１５号に見られ得るものであり、これは、参照により本明細書に組み込まれる。電子求引基は、ハメットのシグマ値が０より大きい基として定義される（例えば、Hansch et al. 1991 Chemical Reviews 91: 165-195を参照）。電子求引基の典型的な例としては、これに限定されるものではないが、ニトリル、ニトロ、スルホン、スルホキシド、カルボニル、任意に置換されていてもよいアリール、および、任意に置換されていてもよいヘテロアリール、が挙げられる。

式（Ｉａ）のリンカー－薬物のいくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基は、
－ＣＮ；
－ＮＯ_２；
任意に置換されていてもよいアリール；
任意に置換されていてもよいヘテロアリール；
任意に置換されていてもよいアルケニル；
任意に置換されていてもよいアルキニル；
－ＣＯＲ^５、－ＳＯＲ^５、または、－ＳＯ_２Ｒ^５、
［ここで、Ｒ^５は、Ｈ、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいアリールアルキル、任意に置換されていてもよいヘテロアリール、任意に置換されていてもよいヘテロアリールアルキル、－ＯＲ^６、または－ＮＲ^６ _２であり、ここで、各Ｒ^６は、独立して、Ｈ、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、または任意に置換されていてもよいヘテロアリールであるか、または、２つのＲ^６基は、それらが結合している窒素と一緒になってヘテロ環を形成する。］；または、
ＳＲ^７
［ここで、Ｒ^７は、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいアリールアルキル、任意に置換されていてもよいヘテロアリール、または、任意に置換されていてもよいヘテロアリールアルキルである。］
である。

式（Ｉａ）のリンカー－薬物のいくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基は、－ＣＮである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基は、－ＮＯ_２である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基は、６～１０個の炭素を含む任意に置換されていてもよいアリールである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基は、任意に置換されていてもよい、フェニル、ナフチル、またはアントラセニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基は、３～７個の炭素を含み、Ｎ、Ｏ、またはＳ原子の少なくとも１つを含む、任意に置換されていてもよいヘテロアリールである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基は、ピロリル、ピリジル、ピリミジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、キノリル、インドリル、またはインデニルであり、これらのそれぞれは、任意に置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基は、２～２０個の炭素原子を含む任意に置換されていてもよいアルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基は、２～２０個の炭素原子を含む任意に置換されていてもよいアルキニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基は、－ＣＯＲ^５、－ＳＯＲ^５、または－ＳＯ_２Ｒ^５であり、ここで、Ｒ^５は、Ｈ、１～２０個の炭素原子を含む任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいアリールアルキル、任意に置換されていてもよいヘテロアリール、任意に置換されていてもよいヘテロアリールアルキル、－ＯＲ^６、または－ＮＲ^６ _２であり、ここで、各Ｒ^６は、独立して、Ｈ、または１～２０個の炭素原子を含む任意に置換されていてもよいアルキルであるか、または、２つのＲ^６基はそれらが結合している窒素と一緒になってヘテロ環を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の電子求引基は、－ＳＲ^７であり、ここで、Ｒ^７は、１～２０個の炭素原子を含む任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいアリールアルキル、任意に置換されていてもよいヘテロアリール、または、任意に置換されていてもよいヘテロアリールアルキルである。

式（Ｉａ）のリンカー－薬物のいくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２のうちの少なくとも１つは、－ＣＮ、－ＳＯＲ^５、または－ＳＯ_２Ｒ^５である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２のうちの少なくとも１つは、－ＣＮ、または－ＳＯ_２Ｒ^５である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２のうちの少なくとも１つは、－ＣＮ、または－ＳＯ_２Ｒ^５であり、ここで、Ｒ^５は、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリールである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２のうちの少なくとも１つは、－ＣＮ、－ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_３）_２、－ＳＯ_２ＣＨ_３、－ＳＯ_２Ｐｈ、－ＳＯ_２ＰｈＣｌ、－ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２Ｏ、－ＳＯ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）、または、－ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）_２、である。

式（Ｉａ）のリンカー－薬物のいくつかの実施形態において、各Ｒ^４は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^４の少なくとも１つは、メチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^４は両方、メチルである。

式（Ｉａ）のリンカー－薬物のいくつかの実施形態において、ｎは、１～６の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは、１～３の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは、０～３の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは０である。いくつかの実施形態において、ｎは１である。いくつかの実施形態において、ｎは２である。いくつかの実施形態において、ｎは３である。いくつかの実施形態において、ｎは４である。いくつかの実施形態において、ｎは５である。いくつかの実施形態において、ｎは６である。

式（Ｉａ）のリンカー－薬物のいくつかの実施形態において、Ｒ^１はＣＮ、または－ＳＯ_２Ｒ^５であり、ここで、Ｒ^５は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、ヘテロアリール、または－ＮＲ^６ _２であり、ここで、Ｒ^６は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、および、Ｒ^２＝Ｈであり、ここで、Ｒ^５およびＲ^６のそれぞれは、独立して、任意に置換されていてもよい。

式（Ｉａ）のリンカー－薬物のいくつかの実施形態において、Ｚは、コンジュゲートについて当技術分野で知られている任意の官能基を含むことができる。そのような官能基としては、これに限定されるものではないが、例えば、アミン、アミノオキシ、ケトン、アルデヒド、マレイミジル、チオール、アルコール、アジド、１，２，４，５－テトラジニル、トランス－シクロオクテニル、ビシクロノニニル（bicyclononynyl）、シクロオクチニル、およびそれらの保護された変異体、が挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｚは、保護されたアミン、保護されたアミノオキシ、ケトンまたは保護されたケトン、アルデヒドまたは保護されたアルデヒド、マレイミジル、保護されたチオール、保護されたアルコール、アジド、１，２，４，５－テトラジニル、トランス－シクロオクテニル、ビシクロノニニル、またはシクロオクチニルを含む。いくつかの実施形態において、Ｚは、アジド、ケトン、または保護されたケトンを含む。いくつかの実施形態において、Ｚは、高分子担体上の関連する官能基Ｚ’と選択的に反応して、接続官能基Ｚ^＊を形成することを可能にする官能基を含む。いくつかの実施形態において、接続官能基Ｚ^＊は、Ｚ／Ｚ’が、アミン／カルボキシレートまたは活性エステルである場合、カルボキサミドであり；Ｚ／Ｚ’が、ＮＨ_２Ｏ／ケトンまたはアルデヒドである場合、オキシムであり；Ｚ／Ｚ’が、チオール／マレイミドまたはハロカルボニルである場合、チオエーテルであり；あるいは、Ｚ／Ｚ’が、アジド／シクロオクチンである場合、トリアゾールである。

式（Ｉａ）のリンカー－薬物のいくつかの実施形態において、Ｓは存在しない。いくつかの実施形態において、Ｓは、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣＯＮＨである。

式（Ｉａ）のリンカー－薬物のいくつかの実施形態において、Ｙは存在しない。いくつかの実施形態において、Ｙは、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍである。

本明細書の記載において、部分についての、すべての記載、変形例、実施形態、または態様は、記載のそれぞれのおよびすべての組み合わせが具体的にかつ個別的に記載されているのと同じように、他の部分についての、すべての記載、変形例、実施形態、または態様と組み合わせることができることが理解される。例えば、式（Ｉ）のＲ^１に関して本明細書で提供される、すべての記載、変形例、実施形態、または態様は、それぞれのおよびすべての組み合わせが具体的にかつ個別的に記載されているのと同じように、Ｚ、Ｓ、ｎ、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｙ、および／またはＤの、すべての記載、変形例、実施形態、または態様と組み合わせることができる。また、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）などの式の、すべての記載、変形例、実施形態、または態様は、適用可能な場合、本明細書で述べられる他の式にも等しく適用され、そして、すべての記載、変形例、実施形態、または態様が、すべての式について別々に個別に記載されているのと同じように、等しく記載されるものと理解される。例えば、式（Ｉ）の、すべての記載、変形例、実施形態、または態様は、適用可能な場合、式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）などの、本明細書で述べられる式の、いずれにも等しく適用され、そして、すべての記載、変形例、実施形態、または態様が、すべての式について別々に個別に記載されているのと同じように、等しく記載される。

リンカー
別の態様において、式（ＩＩａ）：

（ＩＩａ）
［式中、ｎ、Ｚ、Ｓ、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^４は、式（Ｉａ）について本明細書に開示された通りであり；および、Ｘは、ハロゲン、活性エステル（例えば、Ｎ－スクシンイミジルオキシ、ニトロフェノキシ、またはペンタハロフェノキシ）、または、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_{（ｍ－１）}ＣＨＯであり、ここで、ｍは、２～６の整数であり、ｐは、０～１０００の整数である。］
で示される、リンカーが提供される。
いくつかの実施形態において、Ｘはハロゲンである。いくつかの実施形態において、Ｘは、スクシンイミジルオキシなどの、活性エステルである。いくつかの実施形態において、Ｘは、ハライド、スクシンイミジルオキシ、またはニトロフェノキシである。いくつかの実施形態において、Ｘは、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_{（ｍ－１）}ＣＨＯである。Ｘが、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_{（ｍ－１）}ＣＨＯであるリンカーは、還元的アルキル化によってサイトカインに結合することができ、この還元的アルキル化では、リンカーのアルデヒド基が、サイトカインのアミン基とイミンを形成し、そして、このイミンは、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤の存在下でアミンに還元される。この方法は、通常、リンカーを、サイトカインのＮ末端アルファ－アミン基に接続するのに、選択的である。この実施形態において、リンカーの切断時にコンジュゲートから放出されるサイトカインは、ＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍの付加によって、Ｎ末端アルファ－アミンにおいて修飾される。これらのリンカーは、Schneider et al. (2016) Bioconjugate Chem 27: 2534-9（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように製造される。いくつかの実施形態において、ｐは、０であり、リンカーの切断時にコンジュゲートから放出されるサイトカインは、ＮＨ_２（ＣＨ_２）_ｍの付加よって、Ｎ末端アルファ－アミンにおいて修飾される。

式（ＩＩａ）のリンカーのいくつかの実施形態において、ｎ＝１～６、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、電子求引基、アルキル、またはＨであり、ここで、Ｒ^１およびＲ^２のうちの少なくとも１つは、電子求引基であり；各Ｒ^４は、独立して、Ｈ、またはＣ_１－Ｃ_３アルキルであるか、または、一緒になって３～６員環を形成してもよく；Ｚは、リンカーを高分子担体に接続するための基であり；Ｓは、存在しないか、または、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣＯＮＨであり、ここで、ｇ＝１～６、およびｈ＝０～１０００であり；および、Ｘは、ハライド、スクシンイミジルオキシ、またはニトロフェノキシである。

これらのリンカー試薬の製造は、米国特許第８，６８０，３１５号、およびＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２６７２６（２０２０年４月３日出願）に開示されており、これらはともに、参照により本明細書に組み込まれる。

これらのリンカーは、当技術分野で知られている方法によって、サイトカインまたはサイトカイン変異体に結合でき、例えば、ｐＨ６～９、好ましくはｐＨ７～８で、タンパク質の緩衝液と反応させて、タンパク質上のアミン基をアシル化して、式（Ｉ）のリンカー－タンパク質を形成することによって行う。タンパク質上の複数のアミン基が反応に利用できる場合、複数のリンカーが各タンパク質に結合し得る。タンパク質に結合するリンカーの数の選択性は、タンパク質に対するリンカー試薬の化学量論を使用して、制御することができる。リンカーが１つだけ結合している場合、リンカーが切断してコンジュゲートから放出されるタンパク質は、追加の修飾を有さない。

コンジュゲート
別の態様において、式（ＩＩＩ）：
Ｍ－［Ｚ^＊－Ｌ－Ｄ］_ｑ（ＩＩＩ）
［式中、Ｍは、高分子担体であり、Ｚ^＊は、接続官能基であり、Ｌは、切断可能なリンカーであり、Ｄは、サイトカインまたはサイトカイン変異体タンパク質であり、ｑは、Ｍが可溶性高分子担体の場合、１～１０の整数であり、または、ｑは、Ｍが不溶性高分子担体の場合、多数である。］
で示される、コンジュゲートが提供される。
Ｍが、不溶性のマトリックスまたは支持体などの不溶性高分子担体である場合、多数のリンカー－薬物が、Ｍに結合し得ることが理解される。例えば、いくつかの実施形態において、Ｍが、式（ＩＶ）のヒドロゲルであって、Ｐ^１およびＰ^２が両方、４－アームのポリマーである場合、１、２、３、または４つのリンカー－薬物を、各Ｐ^１－Ｐ^２ユニットに結合させることができる。したがって、リンカー－薬物を適切な比率でＭと反応させることにより、所望の数の多数を得ることができる。このようにして、マトリックスの体積中の適切な薬物濃度を得ることができる。

いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩＩａ）：

（ＩＩＩａ）
［式中、Ｍ、Ｚ^＊、Ｓ、ｎ、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^４、ＹおよびＤは、式（Ｉ）、（Ｉａ）、または（ＩＩａ）について本明細書で説明された通りに定義される。］
で示されるものである。

いくつかの実施形態において、Ｍは、ポリエチレングリコール、デキストラン、タンパク質、または抗体などの、可溶性高分子担体であり；Ｚ^＊は、接続基であり；ｑ＝１～１０である。それぞれの場合において、Ｍは、式（Ｉ）の化合物上の基Ｚと反応して、接続基Ｚ^＊を形成する、反応性基Ｚ’を含む。接続基Ｚ^＊は、Ｚ／Ｚ’が、アミン／カルボキシレートまたは活性エステルの場合、カルボキサミドであり；Ｚ／Ｚ’が、アミノオキシ／ケトンまたはアルデヒドの場合、オキシムであり；Ｚ／Ｚ’が、チオール／マレイミドまたはハロカルボニルの場合、チオエーテルであり；または、Ｚ／Ｚ’が、アジド／シクロオクチンの場合、トリアゾールである。いくつかの実施形態において、Ｚ^＊は、アミド、カルボキサミド、オキシム、トリアゾール、チオエーテル、チオスクシンイミド、またはエーテルを含む。

いくつかの実施形態において、Ｍは、平均分子量が１，０００～１００，０００ダルトン、好ましくは１０，０００～６０，０００ダルトン、最も好ましくは２０，０００～４０，０００ダルトンの、ポリエチレングリコールである。Ｍは、単鎖、分岐鎖、または、マルチアームのものであり得る。Ｍは、リンカー－薬物に接続するための１つまたは複数の官能基Ｚ’を含む。Ｚ’は、当技術分野で知られている方法を用いて、商業的に入手可能なポリマーＭに結合させることができ；例えば、Ｍがアミン基を含む場合、これはさらに誘導化して、アシル化によって、（Ｂｏｃ－アミノオキシ）酢酸との反応とそれに続く脱保護により、Ｚ’＝アミノオキシを導入することができ；アシル化によって、シクロオクチンの活性エステルまたはカーボネート（例えば、４－シクロオクチニルスクシンイミジルカーボネート、または、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメトキシスクシンイミジルカーボネート（ＢＣＮ－ＯＳｕ）またはその（１Ｒ，８Ｓ，９ｒ）ジアステレオマー）との反応により、Ｚ’＝シクロオクチンを導入することができ；または、アシル化によって、３－マレイミドプロピオン酸との反応により、マレイミド基を導入することができる。

いくつかの実施形態において、Ｍは、ヒドロゲルまたは外科装置などの、不溶性高分子担体である。そのような実施形態において、ｑは、不溶性支持体に付いた反応性基Ｚ’の数によって決定される、多数である。いくつかの実施形態において、Ｍは、式（ＩＶ）：

（ＩＶ）
［式中、
Ｐ^１およびＰ^２は、独立して、ｒ－アームポリマーであり、ここで、ｒは、２～８の整数であり；
ｎは、０～６の整数であり；
ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ独立して、０～６の整数であり；
Ｂは、Ｚ’を含む基であり；
Ａ^＊およびＣ^＊は、それぞれ独立して、カルボキサミド、オキシム、エーテル、チオエーテル、またはトリアゾールなどの、接続基であり；
Ｒ^１１およびＲ^１２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、または電子求引基であり、ここで、Ｒ^１１またはＲ^１２のうちの少なくとも１つは、電子求引基であり；および、
各Ｒ^１４は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであるか、または、２つのＲ^１４は、それらが結合する炭素原子と一緒になって３～６員環を形成する。］
で示される、分解性架橋ヒドロゲルである。

電子求引基Ｒ^１１およびＲ^１２の説明は、米国特許第８，６８０，３１５号に見られ得るものであり、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
式（ＩＶ）のヒドロゲルのいくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２の電子求引基は、
－ＣＮ；
－ＮＯ_２；
任意に置換されていてもよいアリール；
任意に置換されていてもよいヘテロアリール；
任意に置換されていてもよいアルケニル；
任意に置換されていてもよいアルキニル；
－ＣＯＲ^１５、－ＳＯＲ^１５、または、－ＳＯ_２Ｒ^１５、
［ここで、Ｒ^１５は、Ｈ、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいアリールアルキル、任意に置換されていてもよいヘテロアリール、任意に置換されていてもよいヘテロアリールアルキル、－ＯＲ^１６、または－ＮＲ^１６ _２であり、ここで、各Ｒ^１６は、独立して、Ｈ、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、または任意に置換されていてもよいヘテロアリールであるか、または、２つのＲ^１６基は、それらが結合する窒素と一緒になってヘテロ環を形成する。］；または、
ＳＲ^１７
［ここで、Ｒ^１７は、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいアリールアルキル、任意に置換されていてもよいヘテロアリール、または任意に置換されていてもよいヘテロアリールアルキルである。］
である。

式（ＩＶ）のヒドロゲルのいくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２の電子求引基は、－ＣＮである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２の電子求引基は、－ＮＯ_２である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２の電子求引基は、６～１０個の炭素を含む任意に置換されていてもよいアリールである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２の電子求引基は、任意に置換されていてもよい、フェニル、ナフチル、またはアントラセニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２の電子求引基は、３～７個の炭素を含み、少なくとも１つのＮ、Ｏ、またはＳ原子を含む、任意に置換されていてもよいヘテロアリールである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２の電子求引基は、ピロリル、ピリジル、ピリミジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、キノリル、インドリル、またはインデニルであり、これらのそれぞれは、任意に置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２の電子求引基は、２～２０個の炭素原子を含む任意に置換されていてもよいアルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２の電子求引基は、２～２０個の炭素原子を含む任意に置換されていてもよいアルキニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２の電子求引基は、－ＣＯＲ^１５、－ＳＯＲ^１５、または－ＳＯ_２Ｒ^１５であり、ここで、Ｒ^１５は、Ｈ、１～２０個の炭素原子を含む任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいアリールアルキル、任意に置換されていてもよいヘテロアリール、任意に置換されていてもよいヘテロアリールアルキル、－ＯＲ^１６または－ＮＲ^１６ _２であり、ここで、各Ｒ^１６は、独立して、Ｈ、または１～２０個の炭素原子を含む任意に置換されていてもよいアルキルであるか、または、２つのＲ^１６基は、それらが結合している窒素と一緒になってヘテロ環を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２の電子求引基は、－ＳＲ^１７であり、ここで、Ｒ^１７は、１～２０個の炭素原子を含む任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいアリールアルキル、任意に置換されていてもよいヘテロアリール、または、任意に置換されていてもよいヘテロアリールアルキルである。

式（ＩＶ）のヒドロゲルのいくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２のうちの少なくとも１つは、－ＣＮ、－ＳＯＲ^１５、または－ＳＯ_２Ｒ^１５である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２のうちの少なくとも１つは、－ＣＮ、または－ＳＯ_２Ｒ^１５である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２のうちの少なくとも１つは、－ＣＮ、または－ＳＯ_２Ｒ^１５であり、ここで、Ｒ^１５は、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアリールである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２のうちの少なくとも１つは、－ＣＮ、－ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_３）_２、－ＳＯ_２ＣＨ_３、－ＳＯ_２Ｐｈ、－ＳＯ_２ＰｈＣｌ、－ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２Ｏ、－ＳＯ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）、または、－ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）_２、である。

式（ＩＶ）のヒドロゲルのいくつかの実施形態において、各Ｒ^１４は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１４の少なくとも１つは、メチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１４は両方、メチルである。

式（ＩＶ）のヒドロゲルのいくつかの実施形態において、Ｒ^１１は、ＣＮ、または－ＳＯ_２Ｒ^１５であり、ここで、Ｒ^１５は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、ヘテロアリール、または－ＮＲ^１６ _２であり、ここで、各Ｒ^１６は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、またはヘテロアリール、および、Ｒ^１２＝Ｈであり、ここで、Ｒ^１５およびＲ^１６のそれぞれは、独立して、任意に置換されていてもよい。

そのようなヒドロゲルに結合したリンカー－タンパク質の一般式を、図１に示す。

特定の実施形態において、Ｍは、式（Ｖ）または式（ＶＩ）

（Ｖ）

（ＶＩ）
［式中、Ｐ^１、Ｐ^２、ｒ、Ｒ^１１、Ｒ^１２、およびＲ^１４は、式（ＩＶ）について本明細書に記載した通りであり；および、
Ｚ’はシクロオクチン基を含む。］
で示される、ヒドロゲルである。
特定の実施形態において、Ｚ’は、４－シクロオクチニルオキシカルボニル、または（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメトキシカルボニル、である。

これらの式のヒドロゲル支持体の製造は、米国特許第９，６４９，３８５号、およびＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２６７２６（２０２０年４月３日出願）に開示されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。

上記のコンジュゲートは、そのレジメンで治療することができる疾患または病気を有する対象において、サイトカインの連続的低用量を供給するために、使用され得る。連続的低用量のサイトカイン療法で治療可能な特定の疾患および病気としては、寛容原性ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋制御性Ｔ細胞の不適切な再構成に関連する、慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）（Koreth et al., Blood 128: 130-7 (2016)）；全身性エリテマトーデス；サルコイドーシス；Ｃ型肝炎誘発性血管炎；円形脱毛症；関節リウマチ；炎症性腸疾患；多発性硬化症；および、１型糖尿病（Koreth et al., Oncology & Hematology Review 10: 157-63 (2014)）、が挙げられる。外因性サイトカインによる免疫増強は、癌や免疫不全の治療に有用であり得る。

本開示のコンジュゲートは、当技術分野で知られている標準的な緩衝液および賦形剤を使用して、製剤化することができる。使用される緩衝液は、好ましくはｐＨ３～ｐＨ７であり、より好ましくはｐＨ４～ｐＨ６である。投与は、可溶性コンジュゲートの場合、静脈内、皮下、硝子体内、または筋肉内であり得、そして、不溶性コンジュゲートの場合、皮下、硝子体内、または筋肉内であり得る。腫瘍内注射も使用され得る。

医薬組成物
別の態様において、薬学的に許容される緩衝液および／または賦形剤と一緒に、高分子担体－薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物、が本明細書で提供される。緩衝液は、リンカーの安定性が保存中および必要に応じた再調製時に維持されるように、選択され、典型的には、ｐＨが、２～７、好ましくは２～６、より好ましくは２～５である。許容される緩衝液としては、酢酸、クエン酸、リン酸、ヒスチジン、グルコン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、乳酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、α－ケトグルタル酸などが挙げられる。賦形剤としては、塩化ナトリウムなどの、張性剤および浸透圧剤；クエン酸またはクエン酸塩、およびパラベンなどの、保存剤；フェノールおよびクレゾールなどの、抗菌剤；ブチル化ヒドロキシトルエン、ビタミンＡ、Ｃ、またはＥ、システイン、メチオニンなどの、抗酸化剤；スクロース、ポリオール、ヒアルロン酸、およびカルボキシメチルセルロースなどの、密度調整剤、を挙げることができる。これらの製剤は、例えば、「Remington’s Pharmaceutical Science」 A.R. Gennaro, ed., 17^th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, PA, USAに記載されているように、当業者に知られている従来の方法によって、製造することができる。医薬組成物は、液体溶液または懸濁液で供給されてもよく、あるいは、例えば、液体組成物の凍結乾燥によって、固体として提供されてもよい。このような凍結乾燥物は、使用前に迅速かつ効率的な再調製を行うための増量剤をさらに含み得る。

使用方法
別の態様において、本明細書に記載の高分子担体－薬物コンジュゲートおよびそれを含む医薬組成物を用いて、個体の疾患または病気を治療または予防することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の高分子担体－薬物コンジュゲート、または本明細書に記載の高分子担体－薬物コンジュゲートを含む医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、疾患または病気を治療する方法、が提供される。「個体」は、ヒトであってよく、あるいは、ネコ、イヌ、ウシ、ラット、マウス、ウマ、ウサギ、または他の飼育動物などの、動物であってもよい。

また、疾患または病気の治療に使用するための、本明細書に記載の高分子担体－薬物コンジュゲートを含む組成物、が提供される。また、疾患または病気の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載の高分子担体－薬物コンジュゲートの使用、が本明細書で提供される。

治療を必要とする適用可能な疾患または病気は、コンジュゲート薬物の性質から、当業者によって認識されるものである。

特定の代表的な実施形態が以下に提供される。
実施形態１
下記の式
Ｍ－［Ｚ^＊－Ｌ－Ｄ］_ｑ
［式中、
Ｍは、高分子担体であり；
Ｚ^＊は、接続官能基であり；
Ｌは、切断可能なリンカーであり；および、
Ｄは、サイトカインまたはその変異体のアミン残基であり；および、
ここで、Ｍが可溶性担体である場合、ｑ＝１～１０であり、Ｍが不溶性担体である場合、ｑは多数である。］
で示される、コンジュゲート。
実施形態２
Ｚ^＊が、カルボキサミド、オキシム、チオエーテル、またはトリアゾールであり；
Ｌが、下記の式

［式中、
ｎ＝０～６、またはｎ＝１～６であり；
Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、電子求引基、アルキル、またはＨであり、ここで、Ｒ^１およびＲ^２のうちの少なくとも１つは、電子求引基であり；
各Ｒ^４は、独立して、Ｈ、またはＣ_１－Ｃ_３アルキルであるか、または、２つのＲ^４は、一緒になって３～６員環を形成し；
Ｓは、存在しないか、または、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣＯＮＨであり、ここで、ｇ＝１～６、および、ｈ＝０～１０００であり；
Ｙは、存在しないか、または、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍであり、ここで、ｍ＝２～６、および、ｐ＝０～１０００である。］
で示されるものである、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態３
Ｒ^１が、ＣＮ、またはＲ^５ＳＯ_２であり、ここで、Ｒ^５は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、ヘテロアリールであるか、または、（Ｒ^６）_２Ｎであり、ここで、Ｒ^６は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、および、Ｒ^２＝Ｈであり、ここで、Ｒ^４～Ｒ^６のそれぞれは、任意に置換されていてもよい、実施形態２に記載のコンジュゲート。
実施形態４
Ｍが、平均分子量１，０００～１００，０００ダルトンの可溶性ポリエチレングリコールであり、および、ｑ＝１～１０である、実施形態１～３のいずれかに記載のコンジュゲート。
実施形態５
Ｍが、不溶性ヒドロゲル、または外科装置であり、ｑが、多数である、実施形態１～３のいずれかに記載のコンジュゲート。
実施形態６
Ｄが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの変異体である、実施形態１～３のいずれかに記載のコンジュゲート。
実施形態７
Ｄが、二量体βγ受容体よりも三量体αβγ受容体に対して選択的結合性を有するＩＬ－２変異体であるか、または、三量体αβγ受容体よりも二量体βγ受容体に対して選択的結合性を有するＩＬ－２変異体である、実施形態６に記載のコンジュゲート。
実施形態８
Ｄが、脱アミド化に対して安定化されたＩＬ－１５変異体である、実施形態１～３のいずれかに記載のコンジュゲート。
実施形態９
下記の式

［式中、ｎ＝０～６、またはｎ＝１～６であり、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、電子求引基、アルキル、またはＨであり、ここで、Ｒ^１およびＲ^２のうちの少なくとも１つは、電子求引基であり；各Ｒ^４は、独立して、Ｈ、またはＣ_１－Ｃ_３アルキルであるか、または、一緒になって３～６員環を形成していてもよく；Ｚは、リンカーを高分子担体に接続するための官能基であり；Ｓは、存在しないか、または、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣＯＮＨであり、ここで、ｇ＝１～６、および、ｈ＝０～１０００であり；Ｙは、存在しないか、または、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍであり、ここで、ｍ＝２～６、および、ｐ＝０～１０００であり；そして、Ｄは、サイトカインまたはその変異体のアミン残基である。］
で示されるリンカー－タンパク質。
実施形態１０
Ｒ^１が、ＣＮ、またはＲ^５ＳＯ_２であり、ここで、Ｒ^５が、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、ヘテロアリールであるか、または、（Ｒ^６）_２Ｎであり、ここで、Ｒ^６は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、および、Ｒ^２＝Ｈであり、ここで、Ｒ^４～Ｒ^６のそれぞれは、任意に置換されていてもよい、実施形態９に記載のリンカー－タンパク質。
実施形態１１
Ｄが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの変異体である、実施形態９または１０に記載のリンカー－タンパク質。
実施形態１２
Ｄが、二量体βγ受容体よりも三量体αβγ受容体に対して選択的結合性を有するＩＬ－２変異体であるか、または、三量体αβγ受容体よりも二量体βγ受容体に対して選択的結合性を有するＩＬ－２変異体である、実施形態１１に記載のリンカー－タンパク質。
実施形態１３
Ｄが、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｎ８８Ｒ、ＩＬ－２Ｎ８８Ｄ、ＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ、および、ＩＬ－２Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ｓ、からなる群から選択される、実施形態１２に記載のリンカー－タンパク質。
実施形態１４
Ｄが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｎ７７Ａ、および、ＩＬ－１５－［Ｎ７１Ｓ，Ｎ７２Ａ，Ｎ７７Ａ］、からなる群から選択される、実施形態９または１０に記載のリンカー－タンパク質。
実施形態１５
Ｄが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの変異体からなる群から選択され、ここで、そのＮ－アルファアミン基は、ＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍの付加によって修飾され、ここで、ｍ＝２～６、および、ｐ＝０～１０００である、実施形態９または１０に記載のリンカー－タンパク質。
実施形態１６
Ｄが、ＩＬ－２、またはＩＬ－２変異体である、実施形態１～３のいずれかに記載のコンジュゲートにより対象を処置することからなる、対象において、Ｔ_ｒｅｇ細胞を選択的に増殖させる方法。
実施形態１７
Ｄが、ＩＬ－１５、またはＩＬ－１５変異体である、実施形態１～３のいずれかに記載のコンジュゲートにより対象を処置することからなる、対象において、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を選択的に増殖させる方法。
実施形態１８
実施形態１～８のいずれかに記載のコンジュゲートを投与することを含む、そのような治療を必要とする対象における、疾患または病気を治療する方法。
実施形態１９
疾患または病気が、自己免疫疾患、寛容原性ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋制御性Ｔ細胞の不適切な再構成に関連する慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）；全身性エリテマトーデス；サルコイドーシス；Ｃ型肝炎誘発性血管炎；脱毛症；関節リウマチ；炎症性腸疾患；多発性硬化症；または、１型糖尿病である、実施形態１８に記載の方法。
実施形態２０
実施形態１～８のいずれかに記載のコンジュゲートを投与することからなる、そのような治療を受けている対象における、免疫療法を増強するための方法。

以下の実施例は、説明に役立つためのものであり、本開示の範囲を限定するものではない。その中で引用されているすべての参考文献は、それらの開示の特定の態様として、特にそれらの態様および一般的なものとして、引用されているものを含め、参照により本明細書に組み込まれる。

製造Ａ
Ｓが存在しない、式（ＩＩａ）のリンカー

Ｓが存在しない式（ＩＩａ）のリンカーを、以下の一般的な手法に従って製造した。一方法において、基ＺおよびＲ^４を含むエステルを、塩基の、典型的にはカリウムｔｅｒｔ－ブトキシドまたはカリウムｔｅｒｔ－ペントキシドの存在下、Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ_２と縮合させて、中間体ケトンを形成し、これを、水素化ホウ素ナトリウムを用いて、アルコールに還元した。次いで、これを、トリホスゲンおよびピリジンとの反応によって活性化して、Ｘ＝Ｃｌである式（ＩＩａ）のリンカーを得た。これは、クロロホルメートとＮ－ヒドロキシスクシンイミドとの反応により、Ｘ＝スクシンイミジルオキシに、さらに変換することができた。別の方法において、最初の縮合は、まず、Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ_２を、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド、または金属化ヘキサメチルジシラザンなどの強塩基と反応させ、次に、得られたＲ^１Ｒ^２ＣＨ^－カルバニオンをエステルで処理して、同様のケトン中間体を生成することによって、実施した。いくつかの具体的な例を以下に示す。

（１）４－アジド－１－シアノ－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（式（Ｉ）において、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＣＮ、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝ＣＨ_３、Ｚ＝Ｎ_３、および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ）
１Ｍのカリウムｔｅｒｔ－ブトキシドのＴＨＦ溶液（３．５ｍＬ、３．５ｍｍｏｌ）を、－３０℃で、メチル３－アジド－２，２－ジメチルプロピオネート（Kim, Synthetic Communicationsに従って調製；３００ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（０．３６５ｍＬ、７．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ７ｍＬの溶液に加えた。混合物を－３０℃で３０分間撹拌し、次いで、１時間で周囲温度まで昇温し、さらに３０分間撹拌した。混合物を氷で冷却し、６ＮのＨＣｌ（０．６２ｍＬ、３．７ｍｍｏｌ）を加えてクエンチし、次に、ＥｔＯＡｃと水で分液した。水相をＥｔＯＡｃで２回抽出し、合わせた有機物を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして、濃縮して、粗製のケトンを得た。

水素化ホウ素ナトリウム（３３ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を、粗製のケトン（３００ｍｇ、約１．７５ｍｍｏｌ）のメタノール７ｍＬの溶液に加えた。次いで、混合物を１５分間撹拌し、６ＮのＨＣｌ（０．７ｍＬ）を加えることによりクエンチし、ＥｔＯＡｃと水で分液した。水相をＥｔＯＡｃで２回抽出し、合わせた有機物を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして、濃縮して、粗製のアルコールを得た。ＳｉＯ_２（２０～４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製することにより、４－アジド－１－シアノ－３，３－ジメチル－２－ブタノール（１４２ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を得た。
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz) d 3.83-3.92 (m,1H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), 0.96 (s,3H).

ピリジン（１３６μＬ、１．７ｍｍｏｌ）を、氷冷した、４－アジド－１－シアノ－３，３－ジメチル－２－ブタノール（１４２ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）、およびトリホスゲン（４２５ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ８ｍＬの溶液に、滴下して加えた。得られた懸濁液を周囲温度まで昇温し、１５分間撹拌し、次いで、濾過し、濃縮して、粗製のクロロホルメートを得た。これを８ｍＬのＴＨＦに溶解し、氷冷し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（２９１ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）、およびピリジン（２０４μＬ、２．５３ｍｍｏｌ）で処理した。得られた懸濁液を周囲温度まで昇温し、１５分間撹拌し、次いで、ＥｔＯＡｃと５％ＫＨＳＯ_４で分液した。水相をＥｔＯＡｃで２回抽出し、合わせた有機物を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして、濃縮して、粗製のスクシンイミジルカーボネートを得た。ＳｉＯ_２（２０～４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製することにより、４－アジド－１－シアノ－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（１７４ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を得た。
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz) d 5.03 (dd,J=7.0,5.1,1H), 3.27-3.41 (m,6H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), 0.96 (s,3H).

（２）４－アジド－１－（（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）スルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（式（Ｉ）において、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_３）_２、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝ＣＨ_３、Ｚ＝Ｎ_３、および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ）。
１．４３Ｍのｎ－ブチルリチウムのヘキサン溶液（７０ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下、－５０℃に保った、Ｎ，Ｎ－ジメチルメタンスルホンアミド（１２．３３ｇ、１００ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ２００ｍＬの撹拌溶液に加えた。混合物を１時間で－２０℃に昇温し、次いで、－５０℃に再冷却した後、メチル３－アジド－２，２－ジメチルプロピオネート（Kim, Synthetic Communicationsに従って調製；７．７０ｇ、５０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２時間で＋１０℃に昇温し、次いで、２０ｍＬの６ＮのＨＣｌでクエンチした。混合物を、メチルｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、２００ｍＬ）で希釈し、水１００ｍＬで２回、および食塩水１００ｍＬで１回、洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、濃縮して、粗製のケトン生成物１４．０５ｇを得た。０、２０、３０、４０、および５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンの段階グラジエントを用いたＳｉＯ_２（２２０ｇ）のクロマトグラフィーにより精製して、結晶固体として、４－アジド－１－（（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）スルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブタノン（１０．６５ｇ、８６％）を得た。

上記のケトンをメタノール２００ｍＬに溶解し、氷冷し、水素化ホウ素ナトリウム（０．９６ｇ、２５ｍｍｏｌ）で１５分間処理した後、４ｍＬの６ＮのＨＣｌでクエンチし、濃縮した。得られたスラリーをメチルｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、２００ｍＬ）で希釈し、水１００ｍＬで１回、食塩水１００ｍＬで１回、洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、濃縮して、１０．０ｇの結晶の４－アジド－１－（（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）スルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブタノールを得た。

ピリジン（１０．６ｍＬ、１３２ｍｍｏｌ）を、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（６．９０ｇ、６０ｍｍｏｌ）、およびトリホスゲン（５．９３ｇ、２０ｍｍｏｌ）の、氷冷したジクロロメタン２５０ｍＬの撹拌混合物に、１０分で加えた。混合物を氷冷で１５分間撹拌し、次いで、３０分で周囲温度まで昇温した。４－アジド－１－（（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）スルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブタノール（１０．０ｇ、４０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン２０ｍＬの溶液を加え、混合物を周囲温度で１時間さらに撹拌した。氷冷した後、混合物を、水１００ｍＬで処理し、相を分離した。有機相を、水で２回、５％ＫＨＳＯ_４で１回、および食塩水で１回、洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物を、１００ｍＬの３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから結晶化して、白色の結晶固体として、４－アジド－１－（（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）スルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（１１．１ｇ、７１％）を得た。
（３）これらの手法に従って製造した、さらなる式（Ｉ）の化合物は、以下のものが挙げられる。
４－アジド－１－（メチルスルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（式Ｉにおいて、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＳＯ_２ＣＨ_３、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝ＣＨ_３、Ｚ＝Ｎ_３、および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ）。
４－アジド－１－（（４－メチルピペリジニル）スルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（式Ｉにおいて、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＣＨＣＨ_３、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝ＣＨ_３、Ｚ＝Ｎ_３、および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ）。ＬＣ／ＭＳは［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４４６．１５を示す。
４－アジド－１－（フェニルスルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（式Ｉにおいて、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＳＯ_２Ｐｈ、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝ＣＨ_３、Ｚ＝Ｎ_３、および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ）。
４－アジド－１－（４－クロロフェニルスルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（式Ｉにおいて、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＳＯ_２ＰｈＣｌ、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝ＣＨ_３、Ｚ＝Ｎ_３、および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ）。
４－アジド－１－（４－モルホリノスルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（式Ｉにおいて、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２Ｏ、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝ＣＨ_３、Ｚ＝Ｎ_３、および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ）。
４－アジド－１－（イソプロピルスルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（式Ｉにおいて、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＳＯ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝ＣＨ_３、Ｚ＝Ｎ_３、および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ）。
４－アジド－１－（（Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ）スルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（式Ｉにおいて、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝ＣＨ_３、Ｚ＝Ｎ_３、および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ）。
４－アジド－１－（（Ｎ，Ｎ－ビス（２－メトキシエチル）アミノスルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（式Ｉにおいて、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＳＯ_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）_２、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝ＣＨ_３、Ｚ＝Ｎ_３、および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ）。
４－アジド－１－（４－メチルフェニルスルホニル）－３，３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート（式Ｉにおいて、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＳＯ_２ＰｈＣＨ_３、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝ＣＨ_３、Ｚ＝Ｎ_３、および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ）。
Ｓが存在せず、各Ｒ^４がＨである、式（Ｉ）の化合物を、Santi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109(16): 6211-6に従って、製造した。

製造Ｂ
Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣ（Ｏ）ＮＨ、および、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_{（ｍ－１）}ＣＨＯである、式（ＩＩａ）のリンカー

Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣ（Ｏ）ＮＨ、および、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_{（ｍ－１）}ＣＨＯである、式（ＩＩａ）のリンカーを、以下のように製造した。一方法において、Ｚがアジドであり、Ｓが存在せず、Ｘ＝スクシンイミジルオキシである式（ＩＩａ）のリンカーを、Ｒがアルキルであるアミン－アセタールＨ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_ｍ－１ＣＨ（ＯＲ）_２と反応させ、アジドカルバメートアセタールを得た。パラジウム触媒での触媒的水素化、または、水の存在下でのトリメチルホスフィンによるシュタウディンガー還元のいずれかにより、アジド基をアミンに還元し、続いて、スペーサー－スクシンイミジルエステルＺ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣ（Ｏ）ＯＳｕを加えて、アセタール保護の形態のリンカーを得た。次いで、酸性条件下でのアセタールの加水分解により、Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣ（Ｏ）ＮＨ、および、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_{（ｍ－１）}ＣＨＯである、式（ＩＩａ）のリンカーを得た。具体例は次のとおりである。

７－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカンアミド）－１－（４－フェニルスルホニル）－２－ヘプチルＮ－（３－オキシプロピル）カルバメート（式ＩＩａにおいて、Ｚ＝Ｎ_３、Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ｎ＝５、Ｒ^１＝（４－メチルフェニル）ＳＯ_２、Ｒ^２＝Ｈ、各Ｒ^４＝Ｈ、および、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＣＨＯ））

（１）７－アジド－１－（４－メチルフェニルスルホニル）－２－ヘプチルＮ－（３，３－ジエトキシプロピル）カルバメート
７－アジド－１－（４－メチルフェニルスルホニル）－２－ヘプチルスクシンイミジルカーボネート（１２５ｍｇ、２７７μｍｏｌ、最終濃度５０ｍＭ）（Santi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109(16): 6211-6）を、５．５ｍＬのＭｅＣＮに溶解し、１－アミノ－３，３－ジエトキシプロパン（５４μＬ、０．３３ｍｍｏｌ、最終濃度６０ｍＭ）を加えた。反応混合物を周囲温度で撹拌した。１５分以内に、ＴＬＣの判断により、出発のカーボネートが完全に消費された。反応混合物を、１００ｍＬの１：１のＥｔＯＡｃ：ＮａＨＣＯ_３（飽和水溶液）で分液した。水層を４０ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を、水、ＫＨＳＯ_４（５％水溶液）、水および食塩水（各１×３０ｍＬ）で、順次に洗浄した。有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、濃縮して、１０９ｍｇ（粗８１％）の表題の化合物を、無色の油として得て、これをさらに精製することなく次の工程ですべて使用した。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.76 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.33 (d, J=8.1 Hz, 2H), 5.04 (quin, J=6.8 Hz, 1H), 4.91 (t, J=5.4 Hz, 1H), 4.49 (t, J=5.2 Hz, 1H), 3.62 (m, 2H), 3.37-3.53 (m, 3H), 3.10-3.25 (m, 5H), 2.42 (s, 3H), 1.74 (q, J=5.8 Hz, 2H), 1.63 (br q, J=5.7 Hz, 2H), 1.52 (m, 2H), 1.30 (br m, 4H), 1.17 (td, J=7.0, 2.1 Hz, 6H).
LC-MS (m/z): calc, 529.2; obsd, 529.6 [M+HCO₂]^-.

（２）７－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカンアミド）－１－（４－メチルフェニルスルホニル）－２－ヘプチルＮ－（３，３－ジエトキシプロピル）カルバメート
７－アジド－１－（４－メチルフェニルスルホニル）－２－ヘプチルＮ－（３，３－ジエトキシプロピル）カルバメート（１０９ｍｇ、２２５μｍｏｌ、最終濃度０．１Ｍ）を、２．３ｍＬの無水ＥｔＯＨに溶解した。パラジウム炭素（１０％、活性化、１０９ｍｇ）を加えた。反応フラスコをゴム製セプタムで密閉し、次いで、排気し、水素ガスを充填した（３×）。反応混合物を、Ｈ_２（バルーン）の雰囲気下、周囲温度で、激しく撹拌した。９０分後、ＴＬＣの判断により、出発物質は完全に消費された。反応混合物を、セライトの短いピペットプラグを通して濾過し、パッドを１０ｍＬのＥｔＯＨで洗浄した。濾液を濃縮して乾燥して、９０ｍｇの中間体アミンを、無色の油として得て、これをさらに精製することなく次の工程ですべて使用した。
粗製の７－アミノ－１－（４－メチルフェニルスルホニル）－２－ヘプチルＮ－（３，３－ジエトキシプロピル）カルバメート（９０ｍｇ、最大０．２０ｍｍｏｌ、最終濃度０．１Ｍ）を、２．０ｍＬのＭｅＣＮに溶解した。スクシンイミジル１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカノエート（９３ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、最終濃度０．１２Ｍ）、およびＤＩＰＥＡ（４２μＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を加え、反応物を、周囲温度で撹拌し、ＴＬＣでモニタリングした。１時間後、反応混合物を、６０ｍＬの１：１のＥｔＯＡｃ：ＮａＨＣＯ_３（飽和水溶液）で分液した。有機層を、水、クエン酸（１０％水溶液）、水および食塩水（各１×３０ｍＬ）で、順次に洗浄した。有機相を、分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、濃縮して乾燥した。粗生成物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２中アセトンの段階的勾配：０％、１０％、２０％、３０％、４０％および５０％（各３０ｍＬ）で溶出する、４ｇのＳｉｌｉａＳｅｐカラムで精製した。精製された生成物を含む画分を合わせて濃縮し、表題の化合物（６８ｍｇ、９３μｍｏｌ、２工程で４１％）を、無色の油として得た。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.76 (d, J=8.3 Hz, 2H), 7.32 (d, J=8.1 Hz, 2H), 6.60 (br t, J=5.8 Hz, 1H), 4.95-5.08 (m, 2H), 4.50 (br t, J=4.9 Hz, 1H), 3.56-3.74 (m, 18H), 3.40-3.52 (m, 3H), 3.36 (t, J=5.1 Hz, 2H), 3.10-3.26 (m, 5H), 2.44 (t, J=5.8 Hz, 2H, obscured), 2.42 (s, 3H), 1.74 (q, J=6.0 Hz, 2H), 1.62 (br s, 2H), 1.43 (br m, 2H), 1.26 (br s, 4H), 1.17 (td, J=7.0, 2.3 Hz, 6H).
LC-MS (m/z): calc, 776.4; obsd, 776.7 [M+HCO₂]^-.

（３）７－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカンアミド）－１－（４－メチルフェニルスルホニル）－２－ヘプチルＮ－（３－オキシプロピル）カルバメート
７－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカンアミド）－１－（４－メチルフェニルスルホニル）－２－ヘプチルＮ－（３，３－ジエトキシプロピル）カルバメート（６８ｍｇ、９３μｍｏｌ、最終濃度０．１Ｍ）を、０．６２ｍＬのＣＨＣｌ_３に溶解した。水およびＴＦＡ（各０．１６ｍＬ）を、順次に加えた。反応混合物を周囲温度で激しく撹拌した。２時間後、ＴＬＣの判断により、出発物のアセタールは完全に消費された。反応混合物を濃縮して乾燥し、次いで、ＣＨ_２Ｃｌ_２中アセトンの段階的勾配：０％、１５％、３０％、４５％、６０％および７５％（各３０ｍＬ）で溶出する、４ｇのＳｉｌｉａＳｅｐカラムで精製した。精製された生成物を含む画分を合わせて濃縮し、表題の化合物（２６ｍｇ、４０μｍｏｌ、４３％）を、無色の油として得た。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.78 (s, 1H), 7.78 (d, J=8.3 Hz, 2H), 7.36 (d, J=8.0 Hz, 2H), 6.60 (br s, 1H), 5.09 (m, 1H), 4.98 (t, J=6.0 Hz, 1H), 3.62-3.75 (m, 16H), 3.36-3.44 (m, 5H), 3.13-3.26 (m, 3H), 2.70 (t, J=5.7 Hz, 2H), 2.47 (t, J=5.7 Hz, 2H, obscured), 2.45 (s, 3H), 1.63 (br s, 2H), 1.46 (br t, J=6.6 Hz, 2H), 1.29 (m, 4H). LC-MS (m/z): calc, 656.3; obsd, 656.6 [M-H]^-; calc, 702.3; obsd, 702.6 [M+HCO₂]^-; calc, 734.3; obsd, 734.7 [M+CH₃OH+HCO₂]^-.

第２の方法において、Ｚ＝Ｂｏｃ－アミノ、Ｓ＝不存在、および、Ｘ＝ＯＨである、式（ＩＩａ）のリンカーを、同様の一連の工程を経て実施したが、ただし、Ｂｏｃ基は最初に酸性処理下で除去し、スペーサー－スクシンイミジルエステルＺ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣ（Ｏ）ＯＳｕが付加された。次いで、アルコールを、トリホスゲンおよびピリジンとの反応により活性化し、得られたクロロホルメートを、Ｒがアルキルであるアミン－アセタールＨ_２Ｎ－（ＣＨ_２）_ｍ－１ＣＨ（ＯＲ）_２と反応させ、アセタール保護リンカーを得た。次に、酸性条件下でのアセタールの加水分解により、Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣ（Ｏ）ＮＨ、および、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_{（ｍ－１）}ＣＨＯである、式（ＩＩａ）のリンカーを得た。具体例は次のとおりである。

１－アジド－１８，１８－ジメチル－２０－フェニルスルホニル－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザイコサン－１９－イル（３－オキソプロピル）カルバメート（式ＩＩａにおいて、Ｚ＝Ｎ_３、Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ｎ＝１、Ｒ^１＝フェニルＳＯ_２、Ｒ^２＝Ｈ、各Ｒ^４＝メチル、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＣＨＯ）
工程１および２
１－アジド－１８，１８－ジメチル－２０－フェニルスルホニル－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザ－１９－イコサノール
トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を、４－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－１－フェニルスルホニル－３，３－ジメチル－２－ブタノール（５８％ｗ／ｗ混合物の１２４ｍｇ；７２ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、最終濃度０．１Ｍ）の１ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２溶液に加えた。反応物を周囲温度で撹拌し、ＴＬＣ（ヘキサン中４０％ＥｔＯＡｃ、モリブデン酸セリウム染色）によってモニタリングした。１０分後、ＴＬＣによって、出発物質が単一のより極性の高いスポットに変換された。反応物を濃縮して乾燥し、残留揮発性物質を高真空下で除去して、中間体アミンを、白色のフィルムとして得た。中間体を、１．８ｍＬのＭｅＣＮに溶解し、ＤＩＰＥＡ（０．１７ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を加えた。無溶媒のアジド－ＰＥＧ_４－ＯＳｕ（７８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を、周囲温度で撹拌し、Ｃ１８－ＨＰＬＣ（ＥＬＳＤ）によってモニタリングした。アジド－ＰＥＧ_４－ＯＳｕは、５分以内に、単一のより速く移動するＨＰＬＣピークに完全に変換された。次いで、反応物を濃縮して乾燥し、４ｇのＳｉｌｉａＳｅｐシリカゲルカラムに載せた。生成物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２中アセトンの段階的勾配（０％、１０％、２０％、３０％、アセトン；各段階３０ｍＬ）で溶出した。Ｃ１８－ＨＰＬＣにより判断して、精製された生成物を含む画分を合わせ、濃縮して乾燥した。残留揮発性物質を高真空下で除去して、表題の化合物（８５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、２工程の収率８０％）を、無色の油として得た。Ｃ１８－ＨＰＬＣ、純度はＥＬＳＤによって決定した：９８．２％（ＲＶ＝９．１２ｍＬ）。

工程３
１－アジド－１８，１８－ジメチル－２０－フェニルスルホニル－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザイコサン－１９－イル（３，３－ジエトキシプロピル）カルバメート
Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（９２ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２下、トリホスゲン（０．２４ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）の８．０ｍＬの無水ＴＨＦ溶液に加えた。ピリジン（７７μＬ、０．９６ｍｍｏｌ）を滴下して加えると、すぐに白い沈殿物が形成された。懸濁液を、周囲温度で１５分間撹拌し、次いで、綿栓を通して濾過した。濾液を濃縮して乾燥し、１．６ｍＬの無水ＴＨＦに再溶解した。１－アジド－１８，１８－ジメチル－２０－フェニルスルホニル－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザ－１９－イコサノール（８６ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、０．１Ｍ）の１ｍＬの無水ＴＨＦ溶液を加えた。反応物を周囲温度で撹拌し、Ｃ１８－ＨＰＬＣ（ＥＬＳＤ）によってモニタリングした。１時間後、出発物のアルコールが消費された。反応混合物を５０ｍＬの１：１のＥｔＯＡｃ：ＫＨＳＯ_４（５％水溶液）で分液した。層を分離し、有機相を、ＫＨＳＯ_４（５％水溶液）、水、ＮａＨＣＯ_３（飽和水溶液）および食塩水（各２５ｍＬ）で、順次に洗浄した。洗浄した有機相を、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗製のスクシンイミジルカーボネートを、１．６ｍＬの無水ＴＨＦに溶解し、１－アミノ－３，３－ジエトキシプロパン（８６μＬ、０．５３ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を、周囲温度で撹拌し、Ｃ１８－ＨＰＬＣ（ＥＬＳＤ）によってモニタリングした。２５分後、スクシンイミジルカーボネートは、２つのより遅く溶出する生成物のピークに変換された。反応混合物を、３０ｍＬの１：１のＥｔＯＡｃ：酢酸ナトリウム（０．２Ｍ、ｐＨ５．０）で分液した。層を分離し、有機相を、水および食塩水（各１５ｍＬ）で、順次に洗浄した。洗浄した有機相を、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。残留揮発性物質を高真空下で除去して、粗製の表題の化合物（１０５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、２工程の粗収率９４％）を、黄色の油として得た。

工程４
１－アジド－１８，１８－ジメチル－２０－フェニルスルホニル－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザイコサン－１９－イル（３－オキソプロピル）カルバメート
水（０．２１ｍＬ）およびＴＦＡ（０．２１ｍＬ）を、１－アジド－１８，１８－ジメチル－２０－フェニルスルホニル－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザイコサン－１９－イル（３，３－ジエトキシプロピル）カルバメート（１０５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、最終濃度０．１Ｍ）の、１．１ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２溶液に、順次に加えた。反応物を、周囲温度で撹拌し、Ｃ１８－ＨＰＬＣ（ＥＬＳＤ）によってモニタリングした。１０分後、反応が完了したと判断された。混合物を濃縮して乾燥させた。濃縮物を、ＳｉｌｉａＳｅｐ４ｇシリカゲルカラムに載せ、生成物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２中アセトンの段階的勾配（０％、２０％、４０％、６０％アセトン、各段階３０ｍＬ）で溶出した。画分はＴＬＣ（モリブデン酸セリウム染色）で分析した。精製された生成物を含む画分を合わせ、濃縮して乾燥した。残留揮発性物質を高真空下で除去して、表題の化合物（３４ｍｇ、５４μｍｏｌ、収率３６％）を、無色の油として得た。生成物を、５．０ｍＬのＧｉｂｃｏＨ_２Ｏ（０．０１Ｍ質量）に溶解した。Ｃ１８－ＨＰＬＣ、純度はＥＬＳＤによって決定した：９９．０％（ＲＶ＝８．７６ｍＬ）。

１－アジド－１８，１８－ジメチル－２０－メチルスルホニル－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザイコサン－１９－イル（３－オキソプロピル）カルバメート（式ＩＩａにおいて、Ｚ＝Ｎ_３、Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ｎ＝１、Ｒ^１＝ＭｅＳＯ_２、Ｒ^２＝Ｈ、各Ｒ^４＝メチル、および、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＣＨＯ）
工程３
１－アジド－１８，１８－ジメチル－２０－メチルスルホニル－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザイコサン－１９－イル（３，３－ジエトキシプロピル）カルバメート
Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（９８ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２下、トリホスゲン（０．２５ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）の８．５ｍＬの無水ＴＨＦ溶液に加えた。ピリジン（８２μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を滴下して加えると、すぐに白い沈殿物が形成された。懸濁液を、周囲温度で１５分間撹拌し、次いで、綿栓を通して濾過した。濾液を濃縮して乾燥し、２ｍＬの無水ＴＨＦに再溶解した。１－アジド－１８，１８－ジメチル－２０－メチルスルホニル－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザ－１９－イコサノール（８０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、０．０６Ｍ）の１ｍＬの無水ＴＨＦ溶液を加えた。反応物を周囲温度で撹拌し、Ｃ１８－ＨＰＬＣ（ＥＬＳＤ）によってモニタリングした。２時間後、出発物のアルコールが消費された。反応混合物を５０ｍＬの１：１のＥｔＯＡｃ：ＫＨＳＯ_４（５％水溶液）で分液した。層を分離し、洗浄した有機相を、ＫＨＳＯ_４（５％水溶液）、水、ＮａＨＣＯ_３（飽和水溶液）および食塩水（各２５ｍＬ）で、順次に洗浄した。有機相を、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗製のスクシンイミジルカーボネート（９１ｍｇ）を、２ｍＬの無水ＴＨＦに溶解し、１－アミノ－３，３－ジエトキシプロパン（６１μＬ、０．３７ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を、周囲温度で撹拌し、Ｃ１８－ＨＰＬＣ（ＥＬＳＤ）によってモニタリングした。５分後、スクシンイミジルカーボネートは、単一のより遅く溶出する生成物のピークに変換された。反応混合物を、３０ｍＬの１：１のＥｔＯＡｃ：酢酸ナトリウム（０．２Ｍ、ｐＨ５．０）で分液した。層を分離し、有機相を、水および食塩水（各１５ｍＬ）で、順次に洗浄した。洗浄した有機相を、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。残留揮発性物質を高真空下で除去して、粗製の表題の化合物（６１ｍｇ、９５μｍｏｌ、２工程の粗収率５６％）を、黄色の油として得た。

工程４
１－アジド－１８，１８－ジメチル－２０－メチルスルホニル－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザイコサン－１９－イル（３－オキソプロピル）カルバメート
水（１３５μＬ）およびＴＦＡ（１３５μＬ）を、１－アジド－１８，１８－ジメチル－２０－メチルスルホニル－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザイコサン－１９－イル（３，３－ジエトキシプロピル）カルバメート（６１ｍｇ、９５μｍｏｌ、最終濃度０．１Ｍ）の、０．６８ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２溶液に、順次に加えた。反応物を、周囲温度で撹拌し、Ｃ１８－ＨＰＬＣ（ＥＬＳＤ）によってモニタリングした。２５分後、反応が完了したと判断された。混合物を濃縮して乾燥させた。濃縮物をＳｉｌｉａＳｅｐ４ｇシリカゲルカラムに載せ、生成物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２中アセトンの段階的勾配（０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％アセトン、各段階３０ｍＬ）で溶出した。画分はＴＬＣ（モリブデン酸セリウム染色）およびＣ１８－ＨＰＬＣで分析した。精製された生成物を含む画分を合わせ、濃縮して乾燥した。残留揮発性物質を高真空下で除去して、表題の化合物（１２ｍｇ、２１μｍｏｌ、収率２２％）を、無色の油として得た。特性評価の後、生成物を、２．０ｍＬのＧｉｂｃｏＨ_２Ｏ（０．０１Ｍ質量）に溶解した。Ｃ１８－ＨＰＬＣ、純度はＥＬＳＤによって決定した：９１．３％（ＲＶ＝５．６０ｍＬ）
（４）これらの方法に従って製造した、さらなる式（Ｉ）の化合物を、以下に挙げる。
７－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカンアミド）－１－（４－フェニルスルホニル）－２－ヘプチルＮ－（３－オキシプロピル）カルバメート（式ＩＩａにおいて、Ｚ＝Ｎ_３、Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ｎ＝５、Ｒ^１＝ＰｈＳＯ_２、Ｒ^２＝Ｈ、各Ｒ^４＝Ｈ、および、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＣＨＯ））。
７－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカンアミド）－１－（メチルスルホニル）－２－ヘプチルＮ－（３－オキシプロピル）カルバメート（式ＩＩａにおいて、Ｚ＝Ｎ_３、Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ｎ＝５、Ｒ^１＝ＭｅＳＯ_２、Ｒ^２＝Ｈ、各Ｒ^４＝Ｈ、および、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＣＨＯ））。
７－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカンアミド）－１－（モルホリノスルホニル）－２－ヘプチルＮ－（３－オキシプロピル）カルバメート（式ＩＩａにおいて、Ｚ＝Ｎ_３、Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ｎ＝５、Ｒ^１＝Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２Ｎ－ＳＯ_２、Ｒ^２＝Ｈ、各Ｒ^４＝Ｈ、および、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＣＨＯ））。
５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカンアミド）－３，３－ジメチル－１－（チオモルホリノスルホニル）－２－ペンチルＮ－（３－オキシプロピル）カルバメート（式ＩＩａにおいて、Ｚ＝Ｎ_３、Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ｎ＝１、Ｒ^１＝Ｓ（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＳＯ_２、Ｒ^２＝Ｈ、各Ｒ^４＝メチル、および、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＣＨＯ）。

実施例１
ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の製造と活性
ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］は、ＨＥＫ細胞での発現によって製造した。細胞ベースの受容体結合アッセイを実施して、ＩＬ－２受容体の高親和性αβγ三量体（Ｔ_ｒｅｇ）および中親和性βγ二量体（Ｔ_ｅｆｆ）の形態に対する、変異体（mutein）の活性を評価した（表１）。変異体は、ＩＬ－２よりもＩＬ－２Ｒαβγに６倍弱く結合するだけであるが、ＩＬ－２Ｒβγには約９００倍弱く結合する。重要なことに、変異体は、ＩＬ－２Ｒαβγ対ＩＬ－２Ｒβγについて３，０００倍以上選択的である。

ＩＬ－２Ｒαβγ結合のためのＵ２ＯＳ細胞ベースのアッセイキットを、製造業者の指示に従って実施した（ＤｉｓｃｅｒＸ、Ｐａｒｔ＃９３－１００３Ｅ３ＣＰ０）。細胞を、９６ウェルアッセイプレートに１００μＬ（～１０，０００細胞／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で、２４時間増殖させた。次いで、細胞を、ＷＴＩＬ－２、ＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ、または、ｐＨ９．４でマイクロスフェアから放出されたＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ、のいずれかの希釈系により、３７℃、５％ＣＯ_２で、６時間処理した。１１個のＷＴＩＬ－２濃度が、２ｐｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ（０．１ｐＭ～６ｎＭ）でアッセイされた。１１個の、ＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ濃度、および、放出ＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ濃度が、２００ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ（１０ｐＭ～６００ｎＭ）でアッセイされた。処理した細胞を、化学発光基質とともに、暗所において周囲温度で、１時間インキュベートし、次いで、発光を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘｉ３プレートリーダーで、２５０ｍｓの積算時間で読み取った。

ＩＬ－２Ｒβγ結合のためのＵ２ＯＳ細胞ベースのアッセイキットを、製造業者の指示に従って実施した（ＤｉｓｃｅｒＸ、Ｐａｒｔ＃９３－０９９８Ｅ３ＣＰ５）。細胞を、９６ウェルアッセイプレートに５０μＬ（～５，０００細胞／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間増殖させた。次いで、細胞を、ＷＴＩＬ－２、ＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ、または、ｐＨ９．４でマイクロスフェアから放出されたＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ、のいずれかの希釈系により、３７℃、５％ＣＯ_２で、６時間処理した。１１個のＷＴＩＬ－２濃度が、１７ｐｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ（１ｐＭ～６１ｎＭ）でアッセイされた。１１個のＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ濃度が、１．７ｎｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ（１００ｐＭ～６μＭ）でアッセイされた。１１個の放出残留ＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ濃度が、１７０ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ（１０ｐＭ～６００ｎＭ）でアッセイされた。処理した細胞を、化学発光基質とともに、暗所において周囲温度で、１時間インキュベートし、次いで、発光を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘｉ３プレートリーダーで、２５０ｍｓの積算時間で読み取った。

これらの測定の結果を、図２および表１に示す。
表１．αβγ受容体およびβγ受容体を含む細胞への、ＩＬ－２およびＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓの結合

実施例２
サイトカイン還元的アルキル化の最適化

リンカーの結合は、ＩＬ－２のＮ末端アミノ基の還元的アルキル化によるものとした。２００μＭのＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓを、１０ｍＭのＮａＣＮＢＨ_３の存在下、式（ＩＩｂ）のリンカー試薬（すなわち、式（ＩＩａ）において、Ｒ^１＝ＭｅＳＯ_２、Ｒ^２およびＲ^４＝Ｈ、Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣ（Ｏ）ＮＨ、および、Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_{（ｍ－１）}ＣＨＯ、ここで、ｈ＝４、ｇ＝２、ｐ＝０、およびｍ＝３である、リンカー）の濃度系列で処理した。Ｎ_３基を、ＰＥＧ－シクロオクチンＤＢＣＯ－ＰＥＧ_５ｋＤａと反応させて、ＰＥＧ結合によるゲルシフトを誘導した後、反応物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。１．５：１のリンカー：タンパク質の比率が最適であることがわかり、５８：３４：５：３の未修飾タンパク質：シングルリンカー－タンパク質：ダブルリンカー－タンパク質：トリプルリンカー－タンパク質の混合物が得られた（表２）。図３は、ＩｍａｇｅＪで定量化したゲルバンドの結果を示している。Ｃ１２５Ｓ（２００μＭ）を、１、１．５、２、または３当量（Ｅｑ．）のリンカー－ＣＨＯ（Ｍｏｄ＝ＭｅＳＯ_２）、および１０ｍＭのＮａＣＮＢＨ_３で、５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ中、ｐＨ６．０、周囲温度で２０時間、処理した。
表２．ＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓの還元的アルキル化によるリンカー－タンパク質生成物の分布

実施例３
リンカー－サイトカインの製造
ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］を、２つの方法のうちの１つによって、放出可能なリンカーに結合させた。

（１）ランダムアシル化
サイトカイン（３．４ｍＬ、４．８１ｍｇ／ｍＬ、１．００ｕｍｏｌ）、および、１．４４ｍＬの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）の混合物を、４－アジド－３，３－ジメチル－１－（イソプロピルスルホニル）－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート［式（ＩＩ）において、Ｒ^１＝^ｉＰｒＳＯ_２、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝Ｍｅ、Ｚ＝Ｎ_３、ｎ＝１；Ｓ＝不存在；および、Ｘ＝スクシンイミジルオキシ］（１５６ｕＬ、アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕｍｏｌ）と混合し、４℃で２０時間保持した。ヒドロキシルアミン（０．５５ｍＬ、１Ｍ、ｐＨ７．０）を加え、４℃でさらに２３時間保持した。混合物を、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を使用して、ＰＤ－１０カラムにアプライし、ＯＤ_２８０によって１ｕｍｏｌの回収タンパク質を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析により、５７：３１：６：６の、未修飾：１リンカー：２リンカー：３＋リンカーの混合物の形成が示された。

（２）還元的アルキル化
還元的アルキル化は、Schneider et al., Bioconjugate Chem (2016) 27: 2534-9（参照により本明細書に組み込まれる）に記載された方法を用いて、実施した。ＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ（最終濃度２５０μＭ、１．２５μｍｏｌ、２０．５ｍｇ）の、４．２５ｍＬの５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）（反応バッファー）の０℃の溶液に、Ｏ－７－［（１５－アジド－１３，１０，７，４－テトラオキサペンタデカノイル）アミノ］－１－（メチルスルホニル）－２－ヘプチルＮ－３－オキサプロピルカルバメート［式（ＩＩ）において、Ｒ^１＝ＭｅＳＯ_２、Ｒ^２＝Ｈ、Ｒ^４＝Ｈ、Ｚ＝Ｎ_３、Ｓ＝（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨ）；ｎ＝４；および、Ｘ＝（ＣＨ_２）_２ＣＨＯ］（最終濃度３７５μＭ、１．９μｍｏｌ、０．９ｍｇ、０．２７ｍＬ）の、２０ｍＭのＮａＯＡＣ（ｐＨ５．０）、および、ＮａＣＮＢＨ_３（最終濃度１０ｍＭ、１μｍｏｌ、０．５μＬ）の、反応バッファーの溶液を、加えた。反応を、暗所において周囲温度で、２２時間行った。２０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０、で平衡化したＰＤ－１０カラムを使用して、過剰の試薬を除去した。ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１０，０００ＭＷカットオフコンセントレーターで濃縮した後、１．８５ｍＬ、６００μＭ（Ａ２８０による）－１．１μｍｏｌ、８９％－総ペプチドで、リンカー－Ｎ末端アミノプロピル－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］が、回収された。

実施例４
ＩＬ２－および［アミノプロピル］－ＩＬ２－放出ヒドロゲルマイクロスフェアの製造
マイクロスフェア活性化
式（ＩＶ）のＰＥＧヒドロゲルマイクロスフェア（Henise et al., Engineering Reports (2020) https://doi.org/10.1002/eng2.12091に従って調製）（ここで、Ｐ^１およびＰ^２が、２０ｋＤａの４－アームＰＥＧであり；Ｚ^＊が、Ｚ＝Ｎ_３およびＺ’＝５－ヒドロキシシクロオクチンからのトリアゾールであり；ｎ＝４；Ｒ^１１＝ＣＮ；Ｒ^１２＝Ｈ；各Ｒ^１４＝Ｈ；Ｂ＝ＮＨ_２；ｘ＝４；ｙ＝０；ｚ＝０；および、ｒ＝４である）を使用した。これらを、以下のようにして、Ｂ＝ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－（４－シクロオクチニル）である、式（ＩＶ）に活性化した。１５ｍＬコニカルチューブ内で、Ｂ＝ＮＨ_２（４．２μｍｏｌ、ＮＨ_２）であるマイクロスフェアのスラリー１．３ｇのＭｅＣＮ懸濁液に、４－シクロオクチニルスクシンイミジルカーボネート（５μｍｏｌ、１．２当量）の１ｍＬのＭｅＣＮ溶液、および、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７μｍｏｌ、４当量）の１ｍＬのＭｅＣＮ溶液、を加えた。反応物を、周囲温度で６時間、転倒回転して撹拌した。スラリーを、４×１２ｍＬのＭｅＣＮ、次いで、４×１２ｍＬの２０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０、で洗浄した。

同じ方法を用い、４－シクロオクチニルスクシンイミジルカーボネートの代わりに、ＢＣＮ－ＯＳｕ（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルスクシンイミジルカーボネート）との反応により、Ｂ＝ＮＨ_２である式（ＩＶ）のマイクロスフェアを、Ｂ＝（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメトキシ－ＣＯ－ＮＨである式（ＩＶ）のものに、活性化した。

リンカー－サイトカインを結合させるために、２ｇの活性化したマイクロスフェアのスラリーの、２０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０の懸濁液を、１５ｍＬコニカルチューブ内で、１８．３ｍｇ（１．１ｎｍｏｌ）のリンカー－ＡＰ－ＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ（ゲルシフトアッセイにより３７％のリンカー－ＩＬ－２、実施例３）の、１．９ｍＬの同じバッファーの溶液と、混合した。混合物を、２５０ｒｐｍのオービタルシェーカーによって、３７℃で２３時間、インキュベートした。スラリーを、上記のバッファー８×１２ｍＬで洗浄し、続いて、２０ｍＭのＭＥＳ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０の４×６ｍＬで、洗浄した。マイクロスフェアの総担持量は、９倍容量の５０ｍＭのＮａＯＨにおいて溶解したスラリーの２９～３２ｍｇアリコートから放出される、ＡＰ－ＩＬ－２のＡ２８０（ε_２８０＝１０，０９５Ｍ^－１ｃｍ^－１）により求められ、スラリーにおいて、１０２ｎｍｏｌＩＬ－２Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓｇｍ^－１であった。

ＰＥＧヒドロゲルマイクロスフェアを、同じ方法でランダムアシル化（実施例３）によって製造したリンカー－ＩＬ－２で担持させ、配列番号３を有するタンパク質で０．１１ｍＭに担持された不溶性コンジュゲートを得た。

実施例５
インビトロ放出速度論
β脱離の速度を、実施例４の２５７ｍｇのマイクロスフェア－ＩＬ－２変異体スラリーの、２５７μＬの２５０ｍＭのＮａＢｏｒａｔｅ、０．０５％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ９．４、の液を使用して、エッペンドルフチューブ内において３７℃で、加速放出条件下で、測定した。時間の間隔をおいて、サンプルを３７℃ウォーターバスから取り出し、２１，０００×ｇで１分間遠心分離し、１００μＬの上清のＡ_２８０を、キュベットベースのＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で測定した。測定後、アッセイした上清を、マイクロスフェアを含むチューブに戻し、３７℃でのインキュベーションを続けた。放出速度を、放出されたＡ_２８０対（ｖｓ）時間をＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍの１次反応速度式に適合させることによって、計算した。β脱離が水酸化物イオンで一次であるとの認識より、速度は、ｐＨ７．４で、ｋ_{ｐＨ７．４}＝ｋ_ｐＨ×１０^{（ｐＨ－７．４）}として計算した。実施例２のランダムアシル化コンジュゲートからのＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の放出プロファイルは、二相性であり、半減期は、ｐＨ９．４で、０．４および４１時間であり、これは、ｐＨ７．４で、４０および４１００時間に対応する。実施例２の還元的アルキル化コンジュゲートからのＡＰ－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の放出プロファイルは、単相性であり、半減期は、ｐＨ９．０で、１１時間であり、これは、ｐＨ７．４で、４４０時間に相当する。

実施例６
ラットにおける、ヒドロゲルマイクロスフェアから放出される、ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の薬物動態
シリンジ（０．５ｍＬ、２９ゲージ、固定針、ＢＤ）に、無菌条件下で、実施例４のマイクロスフェア－ＩＬ－２スラリーを、平均５０ｍｇまたは３００ｍｇ（５ｎｍｏｌまたは３０ｎｍｏｌＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］）で、２０ｍＭのＭＥＳ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０からなる投与バッファーにおいて、充填した。各シリンジの内容物を、カニューレを挿入した４匹のオスの平均体重２５０ｇのＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの側腹部に、皮下投与した。血液サンプル（２００μＬ）を、０、４、８、２４、４８、９６、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４、５７６、および６７２時間に、採取した。血漿を収集し、プロテアーゼ阻害剤を添加し、分析まで、サンプルを－８０℃で凍結した。図４に示すように、実施例２のマイクロスフェアコンジュゲートを使用して、投与後９６時間、血漿中に、ＩＬ－２（または、ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３－ＩＬ－２、「ＡＰ－ＩＬ２」）が観測された。

実施例７
マウスにおける、ＩＬ２およびＩＬ２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の薬力学
遊離ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の薬力学を、ＮＯＤ（非肥満糖尿病）マウスにおける天然ＩＬ－２の薬力学と、比較した。３匹のＮＯＤマウスからなる３つの群に、それぞれ、ＰＢＳビヒクル、プロロイキン（２５，０００ユニット、６３μｇ）、または、ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（２５，０００ユニット、６３μｇ）のいずれかを、５日間連続して、毎日注射した。最後の注射の２時間後にマウスを屠殺し、脾臓および膵臓をフローサイトメトリー分析のために採取して、Ｔ細胞の総数の変化、および脾臓および膵島におけるそれらの分化、を測定した。

ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］は、脾臓のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋エフェクター／メモリーＴ細胞にほとんどまたは全く影響を及ぼさなかったが、Ｔ細胞集団の増加は両方、天然ＩＬ－２において増加した（図５）。

ＮＯＤマウスは、ＰＢＳビヒクル、プロロイキン（２５，０００ユニット）、またはＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（２５，０００ユニット）の毎日の注射が与えられ、そして、５日目の最後の注射の２時間後に屠殺された。脾臓におけるＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の薬力学を、図５に示す。

天然ＩＬ－２およびＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］はどちらも、ＰＢＳビヒクルと比較して、膵島のＴ細胞にほとんどまたは全く影響を及ぼさなかった（図６）。マウスをＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］で処置すると、膵島の総数が減少したことに注意すべきである。

ＮＯＤマウスは、ＰＢＳビヒクル、プロロイキン（２５０００ユニット）、またはＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（２５０００ユニット）の毎日の注射が与えられ、そして、５日目の最後の注射の２時間後に屠殺された。膵島におけるＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の薬力学を、図６に示す。

実施例８
マウスにおける、マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］から放出される、［アミノプロピル］－ＩＬ２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の薬物動態／薬力学
６匹のＮＯＤマウスの３つの群を用いて、マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］コンジュゲートから放出された、［アミノプロピル］－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］のＰＫ／ＰＤを測定した。第１番目の群には、遊離ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（２５，０００ユニット、６３μｇ）を、１日５回注射した。第２番目の群には、シクロオクチンがＮ_３（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_７Ｈでキャップされた、空のマイクロスフェアを、皮下注射で投与した。第３番目の群には、実施例４のマイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（０．５、１、５、１０または１９ｍｇのタンパク質／ｋｇ）を、単回の皮下注射で投与した。血漿、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、および臓器組織を、図の説明の記載に従って、調製し、分析した。Ｔ細胞集団の変化をモニタリングするために、リンパ球のフローサイトメトリー分析を行った。脾臓およびリンパ節および膵島を単離し、単一細胞懸濁液を調製した。フローサイトメトリー用の標準的な細胞表面免疫蛍光染色によって、表面染色を実施した。固定および細胞内染色は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＦｏｘｐ３／ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒＳｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のプロトコルに従った。使用した抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、およびＦｏｘＰ３に対するものであり；すべて商用販売業者からのものであった。染色した単一細胞懸濁液を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、分析した。

図７は、マウスにおける、マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（「ＭＳ－ＩＬ－２変異体」）から放出された、［アミノプロピル］－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の薬物動態を示している。パネルＡ：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）の側腹部に、２８ｎｍｏｌ（１９ｍｇ／ｋｇ）または９．９ｎｍｏｌ（６．５ｍｇ／ｋｇ）のマイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］を含む、１回の皮下注射投与を行った。３１時間のｔ_１／２が測定された。パネルＢ：ＮＯＤマウス（ｎ＝６）の側腹部に、マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］を投与した。どちらの場合も、血漿は、ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＥＬＩＳＡを使用して分析し、ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の濃度を定量化した。

マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］での処置は、脾臓およびＰＢＭＣの両方において、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の大幅な増加をもたらした。脾臓およびＰＢＭＣにおいて、Ｔ細胞のそれぞれほぼ７０％および５５％が、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞であった（図８）。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合も、対照と比較して増加した。ＣＤ８^＋細胞は、脾臓では１１％から２５％に、ＰＢＭＣでは１５％から６０％に増加した。

図８Ａは、脾臓およびＰＢＭＣにおける、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を示している。図８Ｂは、脾臓およびＰＢＭＣにおける、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を示している。脾臓およびＰＢＭＣに見られるＣＤ８^＋細胞の割合は、それぞれ、約１１％および１９％であった。マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］で処置した場合、これらのパーセンテージは、それぞれ、約２５％および約６０％に増加した。ＮＯＤマウスに、ＩＬ２－変異体（ＱＤ×５、２５，０００ユニット）、単回注射の空のマイクロスフェア、またはマイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］（１８ｍｇ／ｋｇ）を投与した。５日目の最後の投与の２時間後にマウスを屠殺した。

ＣＤ８^＋細胞を活性化せずにＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団を増殖させる有効用量を決定するために、マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の用量滴定試験を実施した。マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の４つの濃度（０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）を試験し、薬力学を、ＰＢＭＣによって、２週間にわたってモニタリングした。Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の用量依存的な増殖が、マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］の単回注射後、ＰＢＭＣにおいて、観測された。Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖は、４日でピークに達し、すべての投与量で、１４日目にベースラインレベルに戻った（図９Ａ）。重要なことに、ＣＤ８^＋細胞の割合は、どの投与量でも増加しなかった（図９Ｂ）。

図９Ａは、ＮＯＤマウス（ｎ＝３／用量群）において、マイクロスフェア－ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］が、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞を優先的に増殖させることを示し、図９Ｂは、それらが、ＣＤ８^＋細胞（右）の活性化を避けることを示している。示されるように、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖は、すべての用量で４日目にピークに達し、１４日目までにベースラインレベルに戻った。

実施例９
リンカー－ＩＬ－１５の製造
実施例２のリンカーを、上記のＩＬ－２について記載されたように、ＮａＣＮＢＨ_３を用いた還元的アルキル化を介して、ＩＬ－１５のＮ末端にコンジュゲートさせた。反応混合物は、２５ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に、ＩＬ－１５（３０μＭ）、Ｎ_３－ＰＥＧ_４－リンカー（ＭｅＳＯ_２）－ＣＨＯ（９０μＭ）、およびＮａＣＮＢＨ_３（１０ｍＭ）を含んでいた。反応は、暗所において周囲温度で、２４時間行った。２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ５．８６、で平衡化したＰＤ－１０カラムを使用して、過剰の試薬を除去した。脱塩した反応混合物を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ３，５００ＭＷカットオフコンセントレーターを用いて濃縮した。

リンカー当量を変化させた小スケール（２．２５ｎｍｏｌ、７５μＬ）の還元的アルキル化反応を、ＩＬ－１５で実施し、最適な反応条件を決定した。最初の反応は、１、１．５、および２当量のＮ_３－ＰＥＧ_４－Ｌ（ＭｅＳＯ_２）－ＣＨＯリンカーを用いて実施し、１：１の比率でタンパク質に１つのリンカーが結合したことが示された（データは示さない）。その後の反応は、１．５、３、および５当量のリンカーを用いて実施し、未修飾タンパク質の変換を増加させた（図１０Ａ）。３当量のリンカーを使用した場合、反応の結果、ＩＬ－１５の約５２％がタンパク質に１つのリンカーのみが結合し、ＩＬ－１５の約５％が２つのリンカーと結合した（図１０Ｂ）。リンカー濃度を５当量に増やすと、シングルリンカー－タンパク質は少し増加したが、総タンパク質の約２７％が、２つ以上のリンカーと結合した。

反応の進行は、図１０に示すように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥＤＢＣＯ－ＰＥＧ_５ｋゲルシフトアッセイによって、測定した。表３は、修飾されたＩＬ－１５のパーセントを示す。バンドは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。ＩＬ－１５（３０μＭ）を、２５ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ中、１．５、３、または５当量のリンカー－ＣＨＯ（Ｍｏｄ＝ＭｅＳＯ_２）およびＮａＣＮＢＨ_３（１０ｍＭ）で、暗所において周囲温度で２０時間、処理した。

３当量のリンカーを用いた最適化された反応条件を、大スケール（０．９３μｍｏｌ～１．０８μｍｏｌ）の反応で使用した。大スケールの反応を２回行った。

実施例１０
マイクロスフェア－ＩＬ－１５の製造
ＢＣＮ活性化マイクロスフェアのスラリー（２．６μｍｏｌＢＣＮ、実施例４）を、滅菌シリンジ内で、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ５．８６、で５回（～３５ｍＬ）、洗浄した。リンカー－ＩＬ－１５（実施例９）（総タンパク質１μｍｏｌ、約５０％のアルキル化ＩＬ－１５を含む）を、滅菌フィルターを通してシリンジに加えた（０．２２μＭ）。混合物を、周囲温度で１８時間、転倒回転させて撹拌した。次いで、スラリー混合物を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ５．８６、で５回洗浄した。未反応のＢＣＮ活性化マイクロスフェアを、Ｎ_３（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_７Ｈでキャップし、その後、さらに６回洗浄した。マイクロスフェア（２１６～３３６μＭ）に担持されたＩＬ－１５濃度は、４倍容量の５０ｍＭのＮａＯＨに溶解したスラリーの５ｍｇアリコートから放出されたＩＬ－１５からのＡ２８０（ε_２８０＝７２４０Ｍ^－１ｃｍ^－１）によって、測定した。３つの別々の担持からのＭＳ－ＩＬ－１５濃度は、３３６ｎｍｏｌ／ｍＬ、２１６ｎｍｏｌ／ｍＬ、および２３２ｎｍｏｌ／ｍＬであると決定された。

実施例１１
マイクロスフェア－ＩＬ－１５から放出される、ＩＬ－１５の薬物動態
実施例１０のマイクロスフェア－ＩＬ－１５スラリー（２７５ｎｍｏｌ、タンパク質／ｍＬ）を、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０、および１．２５％（ｗ／ｖ）ヒアルロン酸を含む、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．９、で希釈した。さまざまな用量のマイクロスフェア－ＩＬ１５を要する試験のため、段階希釈を用いて、目的のマイクロスフェア－ＩＬ－１５濃度を得た。すべての場合において、無菌条件を用いて、マイクロスフェアコンジュゲートを、取り扱いおよび調製した。固定針（２７Ｇ）を有するシリンジに、コンジュゲート（１００μＬ）を後ろから充填した。シリンジの内容物を、正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、皮下投与または腹腔内投与した。血液サンプルを、各３匹のマウスからなるそれぞれの群から、－２４、４、８、２４、４８、９６、１６８、および２４０時間に、採取した。ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、すべての血漿サンプルに添加し、その後、分析まで、－８０℃で凍結した。

ｈＩＬ－１５のＥＬＩＳＡを、製造業者の指示（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ｈＩＬ－１５Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、カタログ＃Ｄ１５００）に従って実施し、ｒｈＩＬ－１５血漿を測定した。血漿サンプルは、氷上で解凍し、その後、製造業者が提供する標準希釈液で希釈した。４、８時間のサンプルは５０倍に希釈し、２４時間のサンプルは２５倍に希釈し、プレブリード、４８、９６、１６８、および２４０時間のサンプルは１０倍に希釈した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ｈＩＬ－１５濃度を、時間と適合度の関数としてプロットした。

フローサイトメトリー分析のために、ＰＭＢＣを調製し、表面染色を実施して、ＮＫ１．１、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４４の発現細胞を定量化した。市販のＦＩＴＣ－、ＰＥ－、またはアロフィコシアニン－コンジュゲート抗体を使用した。サンプルデータを、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏサイトメトリー分析ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して、分析した。

マイクロスフェアコンジュゲートから放出された［アミノプロピル］－ＩＬ－１５の薬物動態を、正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで測定した。マウスに、２．４ｎｍｏｌのコンジュゲートタンパク質を投与した（２００μＬの注射）。開始時の平均マウス体重（２５．１±１．３ｇ）と、終了時の平均マウス体重（２５．１±１．４ｇ）に、有意な変化はなかった。約１２０時間後、観測された濃度は急速に低下している（図１１）。１２０時間までのデータの１相減衰モデルの適合は、少なくとも２００時間の半減期をもたらしている。１２０時間から２４０時間までのデータポイントは、１相減衰モデルに適合し、２７時間のｔ_１／２であった。ＭＳ～ＩＬ－１５（５０μｇ）の２回目の注射により、２４８時間で測定された血漿ＩＬ－１５が、初期投与と同様の濃度に増加している。２３時間のｔ_１／２が、２６４時間から３６０時間までで、観測されている。

図１１は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける、ＭＳ－ＩＬ－１５から放出された［アミノプロピル］－ＩＬ－１５の薬物動態を示している。正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＭＳ－ＩＬ－１５（５０μｇ）を、ｔ＝０時間およびｔ＝２４０時間に、投与した。血漿サンプルを、ヒトＩＬ－１５ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、調製および分析した。２４０時間を通して２つの異なるｔ_１／２が観測されており、少なくとも１１５時間のｔ_１／２が、１２０時間までで観測され、続いて、１２０時間から２４０時間までで４３時間の２回目のｔ_１／２が、観測されている。ＭＳ－ＩＬ１５（５０μｇ）の２回目の注射は、２４０時間の採血直後に投与した（青色のデータ）。

図１２は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける、マイクロスフェア－ＩＬ－１５から放出された、［アミノ－プロピル］－ＩＬ－１５の薬物動態の用量依存性を示している。正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＭＳ－ＩＬ－１５（１２．５、２５、または５０μｇ）を投与した。血漿サンプルを、ヒトＩＬ－１５ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、調製および分析した。

投与経路（すなわち、皮下［s.c.］および腹腔内［i.p.］）は、放出された［アミノプロピル］－ＩＬ１５のｔ_１／２を変化させなかった（図１３）。しかしながら、ＡＵＣ_ｓｃ（１４．９ｎＭ^＊ｈ）と比較して、ＡＵＣ_ｉｐ（２５．２ｎＭ^＊ｈ）は、ほぼ２倍高くなった。これにより、腹腔内スペースからのＩＬ－１５の生物学的利用能の増加または吸収速度の増加が、示され得る。

図１３は、皮下投与あるいは腹腔内投与したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける、マイクロスフェア－ＩＬ－１５から放出された、［アミノプロピル］－ＩＬ－１５の薬物動態を示している。正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＭＳ－ＩＬ－１５（５０μｇ）を、皮下注射（黒色、●）または腹腔内注射（青色、■）で、投与した。血漿サンプルを、ヒトＩＬ－１５ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、調製および分析した。１２０時間までで、皮下投与（１１５時間）および腹腔内投与（１２９時間）において、同様のｔ_１／２が観測された。

実施例１２
マイクロスフェア－ＩＬ－１５から放出される、［アミノプロピル］－ＩＬ－１５の薬力学
実施例１０のマイクロスフェア－ＩＬ－１５から放出される、［アミノプロピル］－ＩＬ－１５の薬力学を、正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３／群）で測定した（図１４）。実施例１０で製造したマイクロスフェア～ＩＬ－１５（２．５、１２．５、２５、または５０μｇ、コンジュゲートしたタンパク質）を、マウスに投与した。ＰＭＢＣを調製し、ＮＫ１．１、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４４の発現細胞のフローサイトメトリー分析のために、表面染色した。市販のＦＩＴＣ－、ＰＥ－、またはアロフィコシアニン－コンジュゲート抗体を使用した。サンプルデータを、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏサイトメトリー分析ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して、分析した。臨床観察では、注射部位で反応がなく、また、開始時平均体重（２５．１±１．３ｇ）と、終了時平均体重（２５．１±１．４ｇ）に、有意な変化がなかった。

ＭＳ～ＩＬ－１５コンジュゲート（１２．５μｇ、２５μｇ、または５０μｇ）の単回皮下注射は、ＰＢＭＣにおいて、ＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞の用量依存的増加をもたらした。ＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞の２～４倍の増殖は、処置後５日でピークに達した。これらの細胞は、２１日間、対照群よりも上昇したままであった（図１４Ａ）。最高用量のＭＳ～ＩＬ－１５（５０μｇ）が投与されたマウスは、２８日目に、依然として、ＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞のレベルが、対照群の２倍であった。実験期間中、天然ｒｈＩＬ－１５（２．５μｇ）の単回投与、またはＭＳ～ＩＬ－１５（２．５μｇ）の同等の用量から、ＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加は観測されなかった。

ＮＫ細胞の用量依存的増殖はまた、ＭＳ～ＩＬ－１５コンジュゲートの単回皮下注射後、ＰＢＭＣにおいて観測された（図１４Ｂ）。ＭＳ～ＩＬ－１５（１２．５μｇ、２５μｇ、または５０μｇ）を投与した場合、ＮＫ細胞の約２～３倍の増殖が、処置後５～７日でピークに達した。ＮＫ細胞は、１４日から２１日の間上昇したままであった。ＮＫ細胞の増殖は、天然ｒｈＩＬ－１５の単回投与（２．５μｇ）、または同等の用量のＭＳ～ＩＬ－１５（２．５μｇ）では観測されなかった。

実施例１３
リンカー－ＲＬＩおよびマイクロスフェア－ＲＬＩコンジュゲートの製造
ＲＬＩ（受容体結合インターロイキン）は、ＩＬ－１５、および、ＩＬ－１５受容体β／γ複合体のスーパーアゴニストとして作用する受容体αサブユニットのスシ（ｓｕｓｈｉ）ドメインを含む、融合タンパク質である（Mortier et al., J. Biological Chem. 2006, 281: 1612-9；米国特許第１０，３５８，４８８号）。

リンカー濃度を変化させて、ＲＬＩ（１０ｎｍｏｌ、５０μＬ）の小スケールの還元的アルキル化反応を実施して、化学量論的リンカー付加のための最適な反応条件を決定した。１．５、２、３、および５当量の実施例２のリンカー（ＩＩｂ）を使用して、最初の反応を実施した。試験条件下で、１．５当量のリンカーを使用した場合、４４％のＲＬＩが１つのリンカーで修飾され、４６％が未修飾のままであった。２当量のリンカーにおいて、ＲＬＩの約５３％がリンカーの化学量論的付加をもたらし、３３％のＲＬＩが未修飾で、１４％が複数のリンカーと共有結合することが確認された。リンカー量を３当量に増加させると、２つのリンカーの結合の割合（２７％）が増加し、３つのリンカーを含むＲＬＩの形成も増加した（６％）。これらのパーセンテージは、５当量のリンカーの存在下で、さらに増加した（図１５）。

ＲＬＩの還元的アルキル化を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥＤＢＣＯ－ＰＥＧ_５Ｋゲルシフトアッセイによって、測定した。図１５は、ゲルシフトアッセイから測定された、修飾されたＲＬＩの割合を示している。バンドは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。ＲＬＩ（１０ｎｍｏｌ）を、１．５、２、３、または５当量のリンカー－ＣＨＯ（Ｍｏｄ＝ＭｅＳＯ_２）、およびＮａＣＮＢＨ_３（１０ｍＭ）の、２５ｍＭのＭＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０の液で、暗所において室温で２０時間、処理した。

２当量のリンカーを使用して、大スケールの還元的アルキル化反応（８００ｎｍｏｌ、４ｍＬ）を実施した。次いで、還元的にアルキル化したＲＬＩを、ＢＣＮ活性化マイクロスフェア（実施例４）にコンジュゲートさせた。酸化プロセスを最小限に抑えるために、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）およびメチオニン（３０ｍＭ）を、反応に加えた。コンジュゲーション反応後、マイクロスフェアを、バッファー（２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０、３０ｍＭのメチオニン、ｐＨ５．９）で、よく洗浄し、非共有結合で付いたＲＬＩを除去した。洗浄したマイクロスフェアの少量アリコート（～２５ｍｇ）を、ＮａＯＨ（５０ｍＭ）で処理し、マイクロスフェアに共有結合したＲＬＩの濃度を測定した。マイクロスフェア上のＲＬＩ濃度は、１７５ｎｍｏｌ／ｍＬであると決定した。

実施例１４
マイクロスフェアコンジュゲートから放出されたＲＬＩの生物活性
ＲＬＩがマイクロスフェアコンジュゲートから放出された後、アミノプロピル残基がコンジュゲーションの部位に残る。放出された［アミノプロピル］－ＲＬＩの生物活性を試験するために、細胞ベースのアッセイを使用して、［アミノプロピル］－ＲＬＩが、天然のＲＬＩと比較して、受容体の二量体化を誘導する能力を測定した。天然のＲＬＩと［アミノプロピル］－ＲＬＩのＥＣ_５０曲線は、互いに重なり合っており、この生物活性アッセイで評価されるように、アミノプロピル残基が、ＩＬ－１５活性に影響を与えないことを示している（図１６）。

図１６は、ＲＬＩのためのＩＬ－２Ｒβγ受容体結合細胞ベースのアッセイの結果を示している。Ｕ２ＯＳ細胞ベースのアッセイを使用して、ｐＨ７．４でコンジュゲートから放出したアミノプロピル－ＲＬＩの結合活性（ＥＣ_５０＝１８０ｐＭ）を測定し、天然のＲＬＩ（ＥＣ_５０＝１６０ｐＭ）と比較した。

実施例１５
マイクロスフェアコンジュゲートから放出される、［アミノプロピル］－ＲＬＩの薬物動態
マイクロスフェアコンジュゲートから放出される、［アミノプロピル］－ＲＬＩの薬物動態を、正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで測定した。マウスに、コンジュゲートを皮下注射した（１．５ｎｍｏｌタンパク質、１００μＬ注射）。採血を、１０日間にわたって所定の時点で行い、血漿を調製した。血漿中の［アミノプロピル］－ＲＬＩの濃度を、ＲＬＩに特異的なＥＬＩＳＡを使用して測定した（図１７）。データのマニュアルの検査により、Ｔｍａｘは４８時間であると示唆され、データを単相減衰モデルに適合させると、半減期は１３５時間になった。マウスの体重に変化はなかった（開始時体重：２１．５±１．１ｇ；終了時体重：２１．５±１．１ｇ）。

図１７は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける、マイクロスフェアコンジュゲートから放出された、［アミノプロピル］－ＲＬＩの薬物動態を示している。正常なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、マイクロスフェア－ＲＬＩコンジュゲート（１．５ｎｍｏｌ）を投与した。血漿サンプルを、Ｒ＆ＤｓｙｓｔｅｍｓＤｕｏＳｅｔｈＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα ｃｏｍｐｌｅｘＥＬＩＳＡ（ＤＹ６９２４）を使用して、調製および分析した。データは、単相減衰モデルに適合し、半減期は１３５時間になった。

実施例１６
マイクロスフェアコンジュゲートから放出される、［アミノプロピル］－ＲＬＩの薬力学
ＭＳ～ＲＬＩコンジュゲート（３４μｇ、１．５ｎｍｏｌ）の薬力学を、Ｃ５７Ｂｌａｃｋマウス（ｎ＝５／群）において、空のＭＳ、および遊離ＲＬＩ（２．５μｇ、ＱＤ×４）の薬力学と、比較した。採血を１３日間にわたって行い、ＰＢＭＣの表面を、一般的な実験手法を用いて染色した。固定および細胞内染色は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＦｏｘｐ３／ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒＳｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のプロトコルに従った。使用した市販の抗体は、ＮＫ１．１、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ４４、およびＫｉ－６７の発現細胞に対するものであった。染色した単一の細胞懸濁液を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析し、ＦｌｏｗＪｏサイトメトリー分析ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して、分析した。特に注目した細胞集団は、ＣＤ８^＋メモリーＴ細胞（ＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋）、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ３^－ＮＫ１．１^＋）、増殖するＣＤ８^＋メモリーＴ細胞（ＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｋｉ－６７^＋）、および、増殖するナチュラルキラー細胞（ＣＤ３^－ＮＫ１．１^＋Ｋｉ－６７^＋）、であった。

ＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加は、ＭＳ～ＲＬＩおよび天然ＲＬＩ群の処置の５日後に、顕著であった（図１８Ａ）。この細胞量は、天然ＲＬＩによって維持されず、その量は、７日目までにベースラインレベルに戻った。これは、半減期が短く（ｔ_１／２＝３時間）、遊離ＲＬＩが急速にクリアランスされるためと予想された。ＭＳ～ＲＬＩコンジュゲートは、処置後１３日間、ＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞レベルを維持した。ＭＳ～ＲＬＩコンジュゲートが投与された５匹のマウスはすべて、注射部位で病変を発症し、安楽死を要した。

ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を、増殖マーカーＫｉ－６７によって測定した。注射の３日後、対照と比較して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加が観測された（図１８Ｂ）。増殖しているＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合は、すべての群で、５日でピークに達し、その後、急速にベースラインに戻った。

ＮＫ細胞の割合の増加はまた、対照および天然ＲＬＩと比較して、ＭＳ～ＲＬＩコンジュゲートが投与されたマウスで、観測された（図１９Ａ）。遊離ＲＬＩ注射、およびＭＳ～ＲＬＩコンジュゲートは、ＰＢＭＣにおいて、ＮＫ細胞の割合を、それぞれ～４倍および～１５倍増加させた。ＮＫ細胞レベルは、すべての群で、処置後１０日までにベースラインに戻った。ＮＫ細胞の増殖は、処置後３日で有意に増加し、各群において、５日間維持された（図１９Ｂ）。ＮＫ細胞の増殖は、処置後７日までにベースラインに戻った。

実施例１７
分解性ＰＥＧヒドロゲルの製造

本発明のヒドロゲルは、反応して接続官能基Ｃ^＊を形成する基Ｃおよび基Ｃ’を含む、２つのプレポリマーの重合によって製造される。ＣまたはＣ’のうちの１つへのプレポリマー接続は、ヒドロゲルの各架橋に切断可能なリンカーを導入するために、本明細書に記載の式（ＩＩａ）のリンカーなどの切断可能なリンカーとの反応によって導入される、切断可能なリンカーをさらに含む。

一実施形態において、第１のプレポリマーは、４－アームのＰＥＧを含み、これは、各アームが、２つの相互に非反応性（「異種」）の官能基ＢおよびＣを有するアダプターユニットで終端となっている。ＢおよびＣは、最初、保護された形態で存在することができ、次の工程において選択的な化学反応を可能にする。特定の実施形態において、アダプターユニットは、アミノ酸、特に、リジン、システイン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸、の誘導体であり、これには、アルファアミン基がアジドに変換された誘導体、例えば、２－アジドグルタル酸のモノエステル、が含まれる。アダプターユニットは、各プレポリマーのアーム上の官能基Ａと、アダプターユニット上の関連する官能基Ａ’との縮合によって形成される接続官能基Ａ^＊を介して、各第１のプレポリマーアームに接続される。第２のプレポリマーは、各アームが、第１のプレポリマーの基Ｃと相補的な反応性を有する官能基Ｃ’が終端となった、４－アームのＰＥＧを含み、ＣとＣ’が反応してＣ^＊を形成したときに、２つのプレポリマー間の架橋が起こる。

例示的な例として、第１のプレポリマーを以下のように製造した。Ｈ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨを、Ｚ＝アジドである式（ＩＩａ）のリンカーでアシル化して、Ａ＝ＣＯＯＨ、Ｂ＝Ｂｏｃ保護ＮＨ_２、およびＣ＝アジドである、アダプターユニットを得た。これを２０ｋＤａの４－アームＰＥＧ－テトラアミンとカップリングさせ、Ｂｏｃ基を除去することで、Ａ^＊＝アミド、Ｂ＝ＮＨ_２、およびＣ＝アジドである、第１のプレポリマーであって、式（ＩＩａ）の切断可能なリンカーが、各アームと第１のプレポリマーの基Ｃの間の結合に組み込まれた、第１のプレポリマーを得た。対応する第２のプレポリマーは、２０ｋＤａの４－アームのＰＥＧ－テトラアミンを５－シクロオクチニルスクシンイミジルカーボネートでアシル化することによって製造し、Ｃ’＝シクロオクチンである第２のプレポリマーを得た。第１および第２のプレポリマーを混合すると、Ｃ＝アジド基とＣ’＝シクロオクチン基の反応により、対応するトリアゾール基が形成され、それにより、２つのプレポリマーが３次元ネットワークに架橋され、ここで、各架橋は、式（ＩＩａ）の化合物の組み込みにより得られる切断可能なリンカーを含み、ここで、第１のプレポリマーの組み込みにより得られる各節点（node）は、さらなるリンカー、薬物、フルオロフォア、金属キレート剤などの付加のために誘導化することが可能な、残留した官能基Ｂ＝ＮＨ_２を含んでいる。

本明細書で述べられた、特許、特許出願、および科学論文を含むすべての刊行物は、特許、特許出願、または科学論文を含む個々の刊行物が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたようなものと同程度に、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

前記の発明は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によって、いくらか詳細に説明されているが、特定の小さな変更および修正が、上記の教示に照らして実施されることは、当業者には明らかである。したがって、明細書および実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

Claims

式（Ｉ）
Ｍ－［Ｚ^＊－Ｌ－Ｄ］_ｑ（Ｉ）
［式中、
Ｍは、高分子担体であり；
Ｚ^＊は、接続官能基であり；
Ｌは、切断可能なリンカーであり；
Ｄは、サイトカインまたはその変異体のアミン残基であり；および、
ｑは、Ｍが可溶性高分子担体の場合、１～１０の整数であり、または、ｑは、Ｍが不溶性高分子担体の場合、多数である。］
で示される、コンジュゲート。
Ｚ^＊が、カルボキサミド、アミド、オキシム、トリアゾール、チオエーテル、チオスクシンイミド、またはエーテル、を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
Ｚ^＊が、カルボキサミド、オキシム、チオエーテル、またはトリアゾールを含む、請求項２に記載のコンジュゲート。
Ｌが、下記の式：

［式中、
ｎは、０～６の整数であり；
Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、電子求引基、アルキル、またはＨであり、ここで、Ｒ^１およびＲ^２のうちの少なくとも１つは、電子求引基であり；
各Ｒ^４は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであるか、または、２つのＲ^４は、それらが結合する炭素原子と一緒になって３～６員環を形成し；
Ｓは、存在しないか、または、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣＯＮＨであり、ここで、ｇ＝１～６、および、ｈ＝０～１０００であり；および、
Ｙは、存在しないか、または、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍであり、ここで、ｍ＝２～６、および、ｐ＝０～１０００である。］
で示されるものである、請求項１～３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
Ｒ^１が、－ＣＮ、または－ＳＯ_２Ｒ^５であり、ここで、Ｒ^５は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはＮＲ^６ _２であり、ここで、各Ｒ^６は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、および、Ｒ^２が、Ｈであり、ここで、Ｒ^５およびＲ^６のそれぞれは、独立して、任意に置換されていてもよい、請求項４に記載のコンジュゲート。
Ｍが、平均分子量１，０００～１００，０００ダルトンの可溶性ポリエチレングリコールであり、ｑが、１～１０の整数である、請求項１～５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
Ｍが、不溶性ヒドロゲル、または外科装置であり、ｑが、多数である、請求項１～５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
Ｄが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５・ＩＬ－１５ＲαＳｕ融合タンパク質、ＩＬ－２１、またはそれらの変異体である、請求項１～７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
Ｄが、二量体βγ受容体よりも三量体αβγ受容体に対して選択的結合性を有するＩＬ－２変異体であるか、または、三量体αβγ受容体よりも二量体βγ受容体に対して選択的結合性を有するＩＬ－２変異体である、請求項８に記載のコンジュゲート。
Ｄが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５・ＩＬ－１５ＲαＳｕ融合タンパク質、またはそれらの変異体である、請求項８に記載のコンジュゲート。
Ｄが、ＩＬ－１５、または、脱アミド化に対して安定化されたＩＬ－１５・ＩＬ－１５ＲαＳｕ融合タンパク質変異体である、請求項８に記載のコンジュゲート。
式（Ｉａ）

（Ｉａ）
［式中、
ｎは、０～６の整数であり；
Ｒ^１およびＲ^２は、独立して、電子求引基、アルキル、またはＨであり、ここで、Ｒ^１およびＲ^２のうちの少なくとも１つは、電子求引基であり；
各Ｒ^４は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであるか、または、２つのＲ^４は、それらが結合する炭素原子と一緒になって３～６員環を形成し；
Ｚは、リンカーを高分子担体に接続するための基であり；
Ｓは、存在しないか、または、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｈ（ＣＨ_２）_ｇＣＯＮＨであり、ここで、ｇは、１～６の整数であり、ｈは、０～１０００の整数であり；
Ｙは、存在しないか、または、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍであり、ここで、ｍは、２～６の整数であり、ｐは、０～１０００の整数であり；および、
Ｄは、本明細書に開示されるサイトカインまたはサイトカイン変異体のアミン残基である。］
で示される、リンカー－薬物。
Ｒ^１が、－ＣＮ、または－ＳＯ_２Ｒ^５であり、ここで、Ｒ^５は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはＮＲ^６ _２であり、ここで、各Ｒ^６は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、および、Ｒ^２が、Ｈであり、ここで、Ｒ^５およびＲ^６のそれぞれは、独立して、任意に置換されていてもよい、請求項１２に記載のリンカー－薬物。
Ｄが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５・ＩＬ－１５ＲαＳｕ融合タンパク質、ＩＬ－２１、またはそれらの変異体である、請求項１２または１３に記載のリンカー－薬物。
Ｄが、二量体βγ受容体よりも三量体αβγ受容体に対して選択的結合性を有するＩＬ－２変異体であるか、または、三量体αβγ受容体よりも二量体βγ受容体に対して選択的結合性を有するＩＬ－２変異体である、請求項１４に記載のリンカー－薬物。
Ｄが、ＩＬ－２、ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ］、ＩＬ－２［Ｎ８８Ｄ］、ＩＬ－２［Ｎ８８Ｒ，Ｃ１２５Ｓ］、および、ＩＬ－２［Ｎ８８Ｄ，Ｃ１２５Ｓ］からなる群から選択される、請求項１５に記載のリンカー－薬物。
Ｄが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｎ７７Ａ、ＩＬ－１５－［Ｎ７１Ｓ，Ｎ７２Ａ，Ｎ７７Ａ］、ＩＬ－１５・ＩＬ－１５ＲαＳｕ融合タンパク質、または、それらの変異体である、請求項１２または１３に記載のリンカー－薬物。
Ｄが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５・ＩＬ－１５ＲαＳｕ融合タンパク質、ＩＬ－２１、または、それらのサイトカイン変異体からなる群から選択され、ここで、Ｎ－アルファアミン基が、ＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍの付加によって修飾され、ここで、ｍは、２～６の整数であり、および、ｐは、０～１０００の整数である、請求項１２または１３に記載のリンカー－薬物。
Ｄが、ＩＬ－２またはＩＬ－２変異体である、請求項１～７のいずれか１項に記載のコンジュゲートにより、対象を処置することを含む、対象における、Ｔ_ｒｅｇ細胞を選択的に増殖させる方法。
Ｄが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５・ＩＬ－１５ＲαＳｕ融合タンパク質、またはそれらの変異体である、請求項１～７のいずれか１項に記載のコンジュゲートにより、対象を処置することを含む、対象における、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞を選択的に増殖させる方法。
請求項１～１１のいずれか１項に記載のコンジュゲートを対象に投与することを含む、それを必要とする対象における、疾患または病気を治療する方法。
疾患または病気が、自己免疫疾患；寛容原性ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋制御性Ｔ細胞の不適切な再構成に関連する慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）；全身性エリテマトーデス；サルコイドーシス；Ｃ型肝炎誘発性血管炎；脱毛症；関節リウマチ；炎症性腸疾患；多発性硬化症；または、１型糖尿病、である、請求項２１に記載の方法。
請求項１～１１のいずれか１項に記載のコンジュゲートを投与することを含む、その治療を受けている対象における、免疫療法の増強のための方法。
ＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ（ＣＨ_２）_ｍ［式中、ｍは、２～６の整数であり、および、ｐは、０～１０００の整数である。］の付加によって、Ｎ末端アルファアミンにおいて修飾された、サイトカインまたはサイトカイン変異体。