KR20050042146A - 결합 분자 - Google Patents

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KR20050042146A
KR20050042146A KR1020057002117A KR20057002117A KR20050042146A KR 20050042146 A KR20050042146 A KR 20050042146A KR 1020057002117 A KR1020057002117 A KR 1020057002117A KR 20057002117 A KR20057002117 A KR 20057002117A KR 20050042146 A KR20050042146 A KR 20050042146A
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amino acids
binding
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우도 하베를
크리스티안 프로쉬
한스-게오르그 프랑크
안드레아스 리브카
라이문트 비저
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아플라겐 게엠베하
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Abstract

본 발명은 사이드 체인 서브 유닛은 천연 및/또는 비천연의 D- 및/또는 L-아미노산으로 구성된 폴리펩티 체인이고, 사이드 체인 서브유닛은 지지 구조에 공유결합되는, 하나 이상의 환형 분자 서브유닛의 지지 구조 및 두 개 이상의 사이드 체인 서브유닛으로 구성되는 결합 분자에 관한 것이다.

Description

결합 분자{Binding molecules}
수많은 질병에서, 항체, 효소, 및 내분비물질(endocrin), 측분비물질(paracrine), 또는 자가분비물질(autocrine) 메신저의 활성 농도의 변화가 발병 과정에서 일어난다.
그러한 생물학적으로 활성이 있는 결합 분자는 단백질군(예: 인슐린, 성장인자, 사이토카인, 분비 호르몬, 항체, 효소 등), 지질류(예: 프로스타글란딘 및 유사 지방산 유도체), 스테로이드 류(글루코코르티코이드, 미네랄 코르티코이드) 중에 해당할 수 있다. 이하에서, 용어 사이토카인은 결합 과정 또는 신호 변환 과정에 연루되는 생물학적으로 활성이 있는 결합 분자에 대한 원형(prototypical manner)으로서 해석된다. 사이토카인은 높은 특이성과 한정된 활성을 갖는 생물학적 메신저이다. 사이토카인은 바람직하게는 표적 세포의 표면에 제공되는 사이토카인-특이적 수용체에 결합함으로써 그들의 생물학적 활성을 나타낸다. 메신저가 수용체에 접촉할 때, 전형적인 경우에 후자가 세포 또는 조직 내에서의 생물학적 활성을 생물학적 효과를 유발하는 세포내 신호 변환 캐스케이드를 촉발할 것이다. 그러한 수용체에 의해 촉발될 수 있는 전형적인 효과는 예를 들어, 세포의 세포주기 개시와 그와 함께 증식속도의 증가, 또는 세포 사망 형태인 아폽토시스의 촉발이다. 또한, 포유류 체내에서의 염증 과정, 면역학적 시스템, 및 많은 국소 조절 과정에서, 사이토카인은 각각의 생명체에서의 항상성에 있어서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 인터루킨 사이토카인 패밀리의 대부분의 멤버와 같이 많은 사이토카인에 있어서, 세포 표면의 수용체는 사이토카인 결합으로 인해 집중하는 서로 다른 단백질로 구성된다. 따라서, 많은 사이토카인은 동시에 두 개 이상의 수용체 단백질에 결합하여 매우 효율적으로 그들의 효과를 발휘해야 하는 특이적인 결합부위를 갖는다. 이는 사이토카인 수용체 상호작용에서, 사이토카인 분자에서의 다양한 결합 부위의 서로 간의 매우 한정된 거리 및 공간 배치가 완전한 효과의 발현을 위해 중요하고 필수적이라는 것을 나타낸다. 더욱이, 어떤 사이토카인의 경우에는, 사이토카인이 그 자체가 수용체 상호작용의 과정에서 결합을 필요로 하는 서로 다른 단백질로 구성된다(C. Aul, W. Schneider (Eds.), Biological Activities and Clinical Efficacies, 1997, Springer Verlag Berlin). 최근, 수많은 사이토카인이 약물로서 사용하기 위해 재조합 방식으로 제조되었다. 그러한 약물이 이미 사용된 적응증은 예를 들어, 치명적인 종양 질환 및 면역결핍질환이다.
그러나, 재조합 제제는 다음과 같은 여러 단점이 있다:
1. 예를 들어 사이토카인과 같은 재조합 단백질 제제는 "셋업(set-up)" 동안 고비용이 소용된다. 발현에 사용되는 세포가 단백질을 정확하게 "원래의" 구조로 생성하는지를 복잡한 방법으로 확인해야 한다. 세포 및 벡터, 그리고 높은 발현 및 용액에서의 안정성을 갖는 조건을 갖는 적절한 발현 시스템을 찾기 위해서는 여러 시험이 필요하다. 종종 "셋업" 조건은 대량 발효과정에 전용되지 못하기도 한다. 최적의 조건을 찾아낸다고 하더라도, 발현 조건이 종종 불안정하며 고장이 잘 일어난는 경향이 있기도 하다.
2. 사이토카인은 규칙적으로 투여되어야 하기 때문에, 발현 후에 세균에 대해 규칙적으로 정제를 하여야 하며, 정제한 다음 전신적인 알레르기를 피하기 위해 세균 오염물이 절대적으로 없다는 것을 확인해야 한다. 이것은 복잡한 방법의 사용을 필요로 하여, 가격에 지대한 영향을 미친다.
3. 예를 들어, 사이토카인과 같은 많은 메신저는 수용체에 대한 결합 부위뿐만 아니라 대부분의 경우 완전히 알려져 있지 않지만 아마도 의도하는 것 이외의 다른 신호 경로를 유도할 수 있는 다른 도메인을 더 갖는다. 이것은 또한, 부분적으로 이러한 물질로 치료하는 것을 불가능하게 하는 자주 나타나는 부작용을 또한 설명해 준다.
4. 재조합에 의해 제조되는 단백질은 종종 원래의 단백질의 구조에서 벗어나는 3 차 구조를 가져, 체내에서 "이물질(alien)"로서 인지된다. 그럼으로써 유도되는 항체는 사이토카인을 중화시키고 그 결과 사이토카인 활성의 손실을 유발시킨다.
5. 재조합 단백질은 종종 현저한 단백질 분해- 즉, 단백질을 분해하는-효소에 대해 현저한 불안정성을 나타낸다. 이로 인해 상대적으로 높은 농도로 자주 투여하는 것이 필요하며, 이로 인해 한편으로는 환자에게 스트레스를 주며, 다른 한편으로는 치료비용이 올라가게 된다.
사이토카인의 재조합 제제에 대한 경제적인 대이 유기화학적으로 접근 가능한, 예를 들어 사이토카인과 같은 생물학적으로 활성이 있는 단백질의 전합성 유사물질이다.
여기에서의 접근법은 비록 연구가 여전히 걸음마 단계에 있고, 현재까지 펩티드 구조(β-쉬트, 헬릭스, 턴스(turns))의 안정화와 어떤 경우는 더 작은 분자의 복합체 형성만이 실현될 수 있다고 할지라도, 예를 들어, 공지의 단백질의 촉매적으로 활성이 있는 센터의 인위적 디자인이다.
또 다른 접근법은 작고, 예를 들어 펩티드 천연물질과 같은 특이적인 결합 분자의 컴퓨터에 의한 디자인이다. 그러한 작은 특이적인 결합 분자는 대개 100 개의 아미노산보다 적은 서열을 갖는다. 그 크기로 인해, 그러한 분자는 완전한 사이토카인 활성을 위해 필요한 수용체 서브유닛의 결합에 기여할 수 없다. 대개는, 그것들은 또한 거대한 수용체 분자 상의 두 개 이상의 결합부위와 동시에 매우 밀접한 관계가 있도록 디자인되지도 않는다.
각각의 합성 전략이 각각의 펩티드에 대해 더욱 발전되어야 할 점이 있을지라도, 펩티드는 현재 수많은 표준화된 방법에 의해 매우 용이하게 화학적으로 합성될 수 있다. 대개, 펩티드는 N-말단이 보호된 아미노산을 원하는 펩티드가 완성될 때까지 활성화시키고, 결합시키고, 세척시키고, 탈차단시키고, 활성화시키는 작업을 반복하면서 고체상에서 합성된다. 상기 생성물을 고체상으로부터 분리하고, HPLC에 의해 정제한 다음, 예를 들어 서열 확인 및 생물학적 시험과 같은 조사과정을 실시한다. 일반적으로 합성은 펩티드가 더 짧을수록 보다 간단하고 보다 믿을 만하다.
펩티드 올리고머에 대한 몇 가지 검사는 화학적으로 합성되고 올리고머화된 펩티드가 생물학적 활성을 나타내며, 예를 들어 에리쓰로포이에틴의 경우(WO 96/40772)의 경우와 같이 그 활성이 천연의 단백질의 활성보다 통상적으로 낮다는 것이 입증되었으나, 종종 모노머의 효과보다 더 높기도 하다.
현재까지, 올리고머의 제조는 문헌에 개시되어 있는 표준화된 방법에 따라 대부분 상업적으로 입수 가능한 "크로스-링커"를 이용하여 수행되어 왔다. 자주, 체내에서 발견되지 않는 이러한 물질의 분자 구조는 생물학적으로 불활성이며, 특별한 화학적 조성물이 면역학적 반응을 일으키지 않을 의도를 가지고 "눈에 띄지 않는다".
펩티드는 매우 짧은 in vivo 반감기를 갖는다, 즉 그것은 내인성 효소에 의해 매우 빨리 분해되어 배설된다. 펩티드 및 단백질을 대사적으로 안정화하기 위해 다양한 접근법이 적용되었다. 한편으로는, 절단되지 않는 비천연의 아미노산이 합성에 사용되기도 하고, 또 다른 한편으로는 단백질을 불활성 화학 그룹에 의해 변형시켜 분해되는 것을 차단시키기도 한다. 이러한 것의 공지된 예가 PEG 인트론(Shering-Plaugh), 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 인터페론이다.
특이적 결합 분자로서의 펩티드의 의도한 기하학적 배열에 따라, 가능한 지지 구조의 제조를 위해 완전히 다른 전략을 사용하고, 각각의 특정 문제에 대하여 개개의 지지 구조를 개발해야 한다. 지금까지, 특정 결합 분자의 수와 종류 그리고 상호간의 방향 모두가 유연한, 보편적으로 적용 가능한 전략을 개발함으로써, 합성 방법에서 이러한 문제를 해결하기 위한 적절한 접근법은 존재하지 않는다. 적절한 지지 구조를 제조하기 위해 이미 사용된 접근법은 디설파이드 연결의 형성( (a) Nomiz, M., Utani, A., Shiraishi, N., Yamada, Y., Roller, P.;"Synthesis and conformation of the trimeric coiled-coil segment of laminin"; Int J Pept Protein Res (40(1); 1992; 72-79) 또는 라이신에 기초한 덴드리머-유사 구조의 사용((a) Carrithers, M. D., Lerner, M. R.; Synthesis and characterization of bivalent peptide ligands targeted to G-protein-coupled receptors"; Chem Biol 3(7); 1996; 537-542; (b) Wada, T., Okada, K., Nakamori, M., Mochizuki, E., Inaki, Y.; "Syntheis and properties of oligolysine and oligoflutamic acid derivatives containing nucleosides"; Nucleic Acids Symp Ser 29; 1993; 79-80; (c) Henkel, W., Vogl, T., Echner, H., Voelter, W., Urbanke, C., Schleuder, D., Rauterberg, J.; "Synthesis and folding of native collagen Ⅲ model peptides"; Biochemistry 38(41); 1999; 13610-22) 중 어느 하나에 기초하며, 따라서 그 접근법은 그 자체가 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 목적은, 상기 당해 기술 상태의 결합 분자의 단점을 갖지 않는 생물학적 활성이 높은 결합 분자를 제공하는 것이다.
놀랍게도, 본 발명의 기초를 형성하는 목적은, 사이드 체인 서브 유닛은 천연 및/또는 비천연의 D- 및/또는 L-아미노산으로부터 합성된 폴리펩티드 체인이고, 사이드 체인 서브유닛은 지지 구조에 공유결합되는, 하나 이상의 환형 분자 서브유닛의 지지 구조 및 두 개 이상의 사이드 체인 서브유닛으로 구성되는 결합 분자에 의해 획득된다.
환형 분자 서브유닛은 바람직하게는 천연 또는 비천연 D- 및/또는 L- 아미노산으로부터 합성된 환형 폴리펩티드, 방향족 고리, 방향조 고리 시스템, 폴리락톤, 폴리락탐, 벤젠트리아미드, 트리히드록시벤조산, 트리락톤, 또는 트리락탐이다. 정확히 두 개의 사이드 체인이 환형 지지 구조에 연결되는 몇몇 바람직한 구현예에서, 환형 지지 구조는 또한 구조적으로 최소화되어 선형 대칭구조로 치환될 수 있다.
시클릭 폴리펩티드를 형성하는 아미노산은 바람직하게는 펩티드 결합에 의해 연결된다. 본 발명에 있어서 시클릭 분자 서브유닛은, 환형 구조가 디설피드 결합의 형성에 의해 형성된다면 존재하지 않는다. 이러한 형태의 시클릭 폴리펩티드 구조는 많은 천연 단백질의 구성 부분이다. 불안정성 때문에, 그것은 본 발명에 있어서 지지 구조의 중앙의 시클릭 분자 서브유닛으로서 사용되기에 적절하지 않다. 물론, 이것은 본 발명의 결합 분자는 또한, 지지 구조의 보다 안정한 시클릭 분자 서브유닛 이외에 디설피드 결합을 함유한다는 것을 배제하지 않는다. 그러한 부가적인 디설피드 결합은 바람직하게는 지지구조로부터 상대적으로 먼 지점에 위치할 것이고, 두 개 이상의 사이드 체인 내에서 및/또는 사이에서 특정 공간 배열을 안정화하기 위해 도입될 것이다.
환형 분자 서브유닛이 시클릭 폴리펩티드일 경우, 바람직한 구현예에서는, 상기 결합 분자의 두 개 이상의 사이드 체인 서브유닛은, 환형 분자 서브유닛의 아미노산 라이신, 세린, 쓰레오닌, 글루타민, 아스파라긴, 및/또는 아스파테이트의 아미노산 사이드 체인 모이어티에 의해 환형 분자 서브유닛에 결합된다.
시클릭 폴리펩티드는 바람직하게는 2 내지 10 개, 특히 2, 3, 4, 또는 6 개의 아미노산으로 구성된다.
바람직한 구현예에서, 시클릭 분자 서브유닛은 다음 구조중 하나를 갖다:
a) 벤젠트리아미드:
b) 시클로헥사펩티드:
또는 1 내지 3 개의 사이드 체인 펩티드 Seq를 갖는 서열 DKDKDK의 시클로헥사펩티드,
c) 트리락톤:
d) 트리락탐:
e) 트리히드록시벤조산 지지 구조:
f) 시클릭 디펩티드: Seq로 유도된 시클로-L-Ala-L-Lys,
상기에서, Seq 또는 Pep는 사이드 체인 서브유닛 또는 -OH를 나타낸다. 본 발명에 따르면, 결합 분자는 동일하거나 서로 다를 수 있는 두 개 이상의 사이드 체인 서브유닛을 포함한다.
본 발명의 결합 분자의 상기 적어도 두 개 이상의 사이드 체인 서브유닛이 폴리펩티드 체인일 경우, 그것들은 동일한 아미노산 서열 또는 서로 다른 서열을 가질 수 있다.
사이드 체인 서브유닛의 폴리펩티드 체인은 바람직하게는 5 내지 60 개, 바람직하게는 10 내지 50 개, 특히 12 내지 40 개의 아미노산으로 구성된다. 그러한 폴리펩티드 체인의 분자량은 바람직하게는 10 kDa보다 크지 않고, 특히 8 kDa 미만 또는 5 kDa 미만이다.
두 개 이상의 사이드 체인의 환형 구조 상의 입체적 위치 또는 선형 연결 분자의 말단에서의 입체적 위치가, 각각의 사이드 체인의 두 개의 입체적으로 적절히 이웃하는 잔기(예: 시스테인 또는 호모 시스테인) 간의 디설피드 결합의 도입에 의해, 전체 분자의 합성동안 고정될 수 있다는 것은 본 발명의 일부이다. 이러한 목적으로, 사이드 체인의 아미노산 서열은 적절한 위치에 하나 이상의 적절한 SH-함유 잔기를 함유하도록 변형되거나 최적화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사이드 체인 서브유닛이 천연 또는 비천연 핵산 유닛으로 구성되는 올리고 또는 폴리 핵산인 결합분자이다. 이러한 경우, 뉴클레오티드는 자연적인 방법으로 연결되거나 펩티드 핵산(PNA)으로서 존재할 수 있다. 그러한 사이드 체인 서브유닛의 분자량은 바람직하게는 10 kDa 이하이고, 특히 8 kDa 미만, 또는 5 kDa 미만이다. 예를 들어,본 발명의 그러한 결합 분자는 DNA-결합 단백질 또는 여러 DNA 결합 부위를 갖는 단백질 복합체에 결합하는데 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 사이드체인 서브유닛은 천연 또는 비천연의 탄수화물 또는 핵산으로 구성되는 스페이서 분자 서브유닛(스페이서)에 의해 지지 구조에 연결된다.
바람직하게는, 사이드 체인 서브유닛의 유리 말단은 엑소펩티다아제 분해를 막기 위해 적절한 보호기에 공유결합된다. 사이드 체인 서브유닛 및 지지 구조 간의 결합의 종류에 따라, N- 또는 C- 말단이 유리 말단일 수 있다. 바람직한 보호기는 D-아미노산이며, 바람직하게는 디- 또는 트리-펩티드이다. 또한, 고체상 합성 분야에서 통상적으로 적용되는 보호기 및 모노머 및 폴리머 탄수화물이 사용될 수 있다.
엔도펩티다아제가 사이드 체인 서브유닛을 절단시키는 것을 막기 위해, 내부 아미노산이 또한 보호기에 공유결합될 수 있다. 바람직한 보호기는 글루코오스, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민 또는 살리실산으로부터 선택된 탄수화물이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자의 구성요소일 수 있는 비천연 아미노산은 화학식 NH2(CH2)nCOOH(n= 2 내지 8)이며, 특히 NH2 (CH2)2COOH, NH2(CH2)3COOH, 또는 NH2(CH2)4COOH를 갖는다.
본 발명은 현 기술 상태의 상기 단점을 극복하는 생리학적 결합 분자의 전합성 유사체의 개발 및 제조를 가능하게 한다. 본 발명은 결합 분자가 생물학적으로 활성이 있는 결합 분자의 결합 특성을 흉내내도록 배향되는 골격의 지지 구조를 디자인한다. 본 발명의 큰 장점은 본 발명의 결합 분자의 간단한 합성 제법이다. 유기 화학 합성은 유사한 단백질 분자의 재조합 제조방법보다 더 싸게 수행할 수 있으며 더 잘 제어할 수 있다. 더욱이, 또한 비천연 아미노산, 예를 들어 D-아미노산 또는 다른 적절한 모노머 유닛을 사용하여 더 우수한 적합성 또는 면역학적 내성이 기대될 수 있다.
그 중에서도 특히, 본 발명은 다음과 같은 점에 있어서 현 기술상태의 단점을 극복한다:
a) 대개 용이하게 제조할 수 있고 입수 가능하며, 특정 결합 분자의 배치를 위해 사용될 수 있는, 용이하게 제조 가능한 환형 지지 구조를 이용한다.
b) 지지 구조의 환형 구조는, 고리 크기 및 사이드 체인 서브유닛이 결합되는 부위들 간의 거리를 변화시킴으로써, 그리고 선택적으로 적절한 스페이서 분자를 도입함으로써, 실질적으로 임의의 바람직한 공간 배향으로 특정 결합 분자의 배치를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 결합분자는 오직 펩타이드의 합성 분자와의 무작위적인 교차결합이 수행되고 분자의 한정된 공간 배향은 불가능한 종래 기술 상태에 따른 것과는 명확히 다르다.
c) 적절한 모노머 유닛을 선택함으로써, 환형 지지 구조는 고체상에서 정해진 서열로 합성될 수 있으며, 특정 결합분자는 사이드 체인 서브유닛으로서 부착되거나 합성될 수 있다. 모노머 유닛이 아미노산일 경우, 이것은 지지 구조 상에 같은 방향이거나 다른 방향으로 배향되는 펩티드의 완전한 고체상 합성을 가능하게 한다.
d) 지지 구조는 사이드 체인 서브 유닛에 부착되는 특정 결합 분자의 수, 종류, 및 길이에 있어서 유연하다.
e) 본 발명에 따르면, 평행 또는 역평행으로 배향되는 아미노산 서열은 고체상의 한 합성 단계에서 지지 구조와 결합할 수 있으며, 선택적으로는 한 작업에서 합성될 수 있다. 후자는 생성물의 수율 및 순도, 그리고 생산 단가의 측면에서 유리하다. 여기에서, 평행 방향이란 모든 사이드 체인 서브유닛이 지지 구조에 동일한 방향으로 N-말단 또는 C-말단에 의해 결합되는 것을 말한다. 역평행 방향이란 적어도 하나 이상의 사이드 체인 서브유닛이 지지 구조에 N-말단으로 결합되고, 적어도 하나 이상의 사이드 체인 서브유닛이 지지 구조에 C-말단에 의해 결합되는 것을 말한다.
특정 결합 분자의 계획된 배치의 유연성은 비천연 아미노산 및 D-아미노산을 이용함으로써 증가시킬 수 있다. 비천연 아미노산 및 D-아미노산 또는 락톤 및 락탐의 사용은 단백질 분해에 대한 안정성을 증가시킨다. 안정성 및 반감기를 증가시키는 추가적인 작용기를 지지 구조의 다양성으로 인해 도입할 수 있다. 이를 위해 예를 들어, 보호기 화학에 대한 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있는 글리코실화, 아세틸화, 디설피드-결합 또는 다른 화학적 유도를 적용한다.
본 발명의 지지 구조에 배치되는 특정 결합 분자가 펩티드일 경우, 그것들은 지지 골격과 동일한 방향 또는 반대 방향으로 배향 가능하고 합성 가능하다.
본 발명의 지지 구조의 바람직한 구현예는 시클릭 펩티드이다. 적절한 종래 기술의 보호기 전략을 시클릭 펩티드에 사용할 수 있다. 시클릭 펩티드는 오직 엔도펩티다아제에 의해 절단되기 때문에 in vivo에서 더 느리게 분해한다. 더욱이, 본 발명의 방법에 따르면 시클릭 펩티드는 예를 들어 D-아미노산과 같이 비천연 아미노산을 이용함으로써 증가된 단백질 분해 저항을 갖도록 합성할 수 있다. 정확히 두 개의 작용기 사이드 체인이 연결되는 경우에, 지지 구조는 선형 구조로 최소화될 수 있다.
인터루킨-2 수용체-특이적 결합 분자
본 발명의 구현예에서, 인터루킨-2(IL-2)와 유사하고 IL2 특이적 수용체에 높은 친화도로 결합하는 능력을 갖는 합성 결합 분자를 제공한다. IL-2는 종양 치료에 사용되는 사이토카인이다. 그것은 133 개의 아미노산으로 구성되고 분자량이 15.4 kDa인 단백질이다. IL2는 특이적 수용체(ILR)에 결합함으로써, IL2-특이적 세포 내 신호가 촉발된다. 매우 관련이 높은 수용체(highly affine receptor)는 서브유닛 a, b, 및 g(또한, p55, p75, 및 p64로 각각 지정)로 구성되는 수용체 복합체이다. p75 및 p64로 구성되는 수용체 복합체를 자극시키는 것은 IL2의 완전한 활성을 유도하는데 충분하다.
IL2는 T 및 B 림프구의 증식을 촉진시켜, 세포독성 및 세포용해 NK세포를 활성화시킨다. 따라서, 면역반응의 조절에서 중추적인 영향을 미친다. 따라서, IL2는 종양에 대한 면역반응 및 염증반응에서 근본적으로 중요하다. IL2를 이용하는 종양 방어의 중요한 기전 중 하나가 LAKs("lymphokine activated killer cells") 의 유도인 것 같다. 이러한 세포들은 또한 종양 세포를 파괴할 수 있다.
최근에, IL2를 이용한 종양 치료에 관한 다양한 시도가 있었다. 지금까지, 전이한 신장세포 암종 및 전이 골수종의 치료를 위한 재조합 방식으로 제조된 생성물(Chiron의 Aldesleukin, Proleukin)이 시판되었다. 재조합 제제는 높은 개발비, 승인비, 생산비를 필요로 함에 따라 시장가격이 높다. 더욱이, 재조합 생산방법은 매우 고장이 자주 일어나는 경향이 있다. 치료되는 환자의 약 30% 만이 IL2 치료에 대한 반응을 나타낸다. IL2의 광범위한 임상 적용은 인간 생체 내에서의 극히 짧은 반감기(10 분 이하)와 광범위한 독성(연구 시 치료관련 치사율이 4%인 것으로 관찰됨)에 의해 제한된다.
오심, 구토, 및 설사 이외에, 상기 모든 IL2 치료는 장기 기능장애 및 신경정신병적 효과가 동반된다. 이러한 독성은 매우 높아, 동물연구에서 최적이라고 결정된 투여량의 10%만을 인간에게 사용한다. 따라서, 이 사이토카인의 치료 잠재력은 완전히 고갈되지는 않았다.
때때로, 수용체와 상호작용하는 짧은 IL2 도메인의 투여는 이미 세포 효과(예를 들어, 면역 흥분효과)의 적어도 일부를 획득하는데 충분하다. 그러나, 연구 결과, 아미노산 서열 1-30 IL2를 갖는 IL2 펩티드는 현저히 높은 농도에서만이 유사한 효과를 갖는 것으로 나타났다(Eckenberg, R., Xu, D., Moreau, J., Bossus, M., Mazie, J., Tartar, A., Liu, X., Alzari, P., Bertoglio, J., Theze, J. (1997) Analysis of human IL-2/IL-" Receptor beta chain interactions: Monoclonal antibody H2-8 and new IL-2 Mutants define the critical role of alpha Helix-A of IL-z. Cytokine 9: 488-498). 이것은 오직 이 펩티드만이 수용체 복합체의 β-체인에 결합하고 오직 그로 인해 매체-관련(medium-affine) 수용체 복합체를 활성화시킨다는 사실 때문인 것으로 보인다. 유사물질을 또 다른 IL2 부위로부터의 다른 서열에 적용한다(Eckenberg, R., Rose, T., Moreau, J.-L., Weil, R., Gesbert, F., Dubois, S., Tello, D., Bossus, M., Gras, H., Tartar, A., Bertoglio, J., Chouaib, S., Goldberg, M., Jacques, Y., Alzari, PM., Theze, J. (2000) The first"-Helix of Interleukin (IL)-2 Folds as a Homotetramer, Acts as an Agonist of the IL-2 Receptor B Chain, and Induces Lymphokine-activated Killer Cells. J. Exp. Med. 3: 529-39; Berndt, W., Chang, D., Smith, K., Ciardelli, T. (1994) Mutagenic analysis of a receptor contact site aninterleukin 2: Preparation of an Interleukin-2 analog with increased potency. Biochemistry 33: 6571-6577). 그러나, 이러한 모든 펩티드들은 본 발명의 특징인 지지 구조 상에 목적이 있는 부착 없이 합성되었다. 따라서, 이러한 펩티드들은 생리학적 수용체의 다이머화에 기여하지 못하고, 중간 내지 낮은 관련성의 수용체 서브유닛에 의해서만 배타적으로 작용한다. 따라서, 그 활성이 약하다. 더욱이, 이러한 펩티드들은 보호기를 도입함으로써 단백질 분해에 대한 차단도 이루어지지 않았다. 따라서, 이러한 펩티드들은 가속화된 in vivo 분해를 겪게 된다.
본 발명은 IL-2 또는 IL-2의 펩티드 프래그먼트의 제조 및 사용과 관련된 단점이 없으면서 활성이 높은 합성 IL2R 수용체 결합 분자의 제공을 가능하게 한다.
여기에서, 사이드 체인 서브유닛은 바람직하게는 다음 서열 중 하나 이상의 서열을 갖는다:
● APTSSSTKKT1 QLQLEHX1X2X3X4X5QMILNGINN 또는
● TIVX6FLNRWIT FX7QSX8ISTLT1,
상기에서,
X1은 I 또는 L로부터 선택되고,
X2는 I 또는 L로부터 선택되고,
X3는 V, L, 또는 M으로부터 선택되고,
X4는 E, D, 또는 K로부터 선택되고,
X5는 L 또는 F로부터 선택되고,
X6는 E 또는 D로부터 선택되고,
X7은 A, G, 또는 C로부터 선택되고,
X8은 A 또는 I로부터 선택되고;
T1 위치에서, 당해 기술분야에 따른 보호기, 바람직하게는 탄수화물 모이어티(바람직하게는 글루코오스, 만노오스, N-아세틸 글루코사민, 또는 N-아세틸갈락토사민으로부터 선택된다)가 단백질 분해에 대한 보호로서 적절한 방법으로 쓰레오닌에 선택적으로 공유결합된다.
본 발명에 따르면, 상기 서열을 갖는, 결합 분자의 사이드 체인 서브유닛이 80% 이상, 바람직하게는 90 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 결합 분자가 이용될 수 있다. 이러한 경우, 서열의 이탈은 특히 보존적인 아미노산의 교환이다.
바람직한 결합분자는 다음 구조를 갖는다:
● APTSSSTKKT1QLQLEHX1X2X3X4X5QMILNGINN-지지 구조-TIVX6FLNRWIT FX7QSX8ISTLT1;
● TIVX6FLNRWITFX7QSX8ISTLT1-지지 구조-APTSSSTKKT 1QLQLEHX1X2X3X4X5QMILNGINN;
● APTSSSTKKT1QLQLEHX1X2x3x4x5QMILNGINN-지지 구조-APTSSSTKKT1QLQLEHX 01X02X03X04X05QMILNGINN 또는
● TIVX6FLNRWIT FX7QSX8ISTLT1-지지 구조-TIVX06 FLNRWITFX07QSX08ISTLT1
상기에서, 아미노산 X01, X02, X03, X04 , 및 X05는 X1, X2, X3, X4, 및 X5에 대해서 나타낸 것과 같이 선택된다. 본 발명 따르면, 결합 분자의 사이드 체인 서브유닛은 80%, 바람직하게는 90 또는 95% 이상의 상기 서열에 대한 서열 상동성을 갖는 결합 분자를 사용할 수 있다. 이러한 경우에, 서열의 이탈은 특히 보존적 아미노산 교환이다.
본 발명의 IL2R 특이적 결합 분자는 종래 기술상태의 본질적인 단점을 극복할 수 있다. 그 결합 분자는 용이하게 그리고 경제적으로 생산될 수 있다. 본 발명의 결합분자는 재조합 분자의 높은 생산 단가 및 높은 생리학적 불안정성이 존재하지 않고, 또한 지지 구조가 수용체에 대해 친화도를 갖지 않고 정해진 공간 배치에서 기능적 상호협동적 방법으로 수용체 복합체에 결합되기 때문에, 펩티드에서 관찰되는 불충분한 수용체 흥분은 일어나지 않는다. 본 발명의 수용체 분자는 또한 의도적인 서열 최적화에 의해 활성을 증가시키고 부작용을 최소화하는 가능성을 제공한다.
상기 합성 IL2R 특이적 결합 분자는 면역 시스템의 질환, 예를 들어 염증 및 관절염 진행, 또는 모든 종류 및 기원의 면역결핍 증후군; 및 세포 증식의 증가와 관련된 질병, 예를 들어 암종, 고형암, 림프종, 및 백혈병; 또는 감염질환의 치료에 적합하다. 재조합 인터루킨 2가 인터루킨 12와 합께 종양 치료에 긍정적인 효과가 있다는 것이 이미 공지되어 있다. 또한, 그러한 약물은 타겟 세포, 특히 종양세포에 아폽토시스를 촉발하는 바람직한 복합 제제로서 본 발명의 약물과 조합될 수 있다. 이러한 경우에 치료 성공에 대해 기대되는 긍정적인 효과는 본 발명의 약물에 의한 종양 내에서의 국소적인 아폽토시스 및 국소적인 효과 증가를 유발하는 전신적인 면역흥분에 의해 이루어진다. 여기에서, TRAIL(TNF 관련 아폽토시스 유도 리간드) 수용체 특이적 분자 및 효과기 분자를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
상기 서열 및 결합 분자가 인간 IL-2 수용체에 최적으로 작용하도록 디자인되었지만, 전반적 개념을 상동 서열이 알려져 있는 임의의 종의 IL2-수용체에 적용시키는 것이 쉽게 가능하다.
각각의 인간 서열을 동물의 대응 부분으로 치환시키고, 동물에서의 효과를 최적화하여 최적의 수의학적 사용이 가능하도록 하기 위해 본 발명의 전형적인 방법으로 조합할 수 있다.
하기 나타낸 나열은 인간의 서열과 상동인 고양이의 및 개의 관련 서열을 나타낸다. 이러한 서열은 개 또는 고양이의 각각의 수용체 서브유닛에 결합하는 능력에 특징이 있다. 본 발명은 인간 서열과 관련하여 앞서 설명한 바와 같이 이러한 사이드 체인의 모든 통상적인 변형 및 조합을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 서열들은 서열에서의 아미노산의 보존적 교환의 도입, SH-함유 잔기 및 디설피드 결합의 도입, 뿐만 아니라 다른 화학적 변형에 의해 변형되어, 그 결과 생성된 분자의 공간적 디자인 및 안정성을 최적화 할 수 있다. 사이드 체인으로서, 그것들은 본 발명에 따른 지지 구조 상에 결합되어 수용체 다이머에 결합할 수 있다.
TRAIL 수용체-특이적 결합 분자
TRAIL(TNF 관련 아폽토시스 유도 리간드)는 종양세포에서 프로그래밍된 세포 사망(아폽토시스)를 촉발하는, TNF 패밀리에 속하는 단백질이다. 바람직하게는 적절한 환형 지지 구조에 기초하여 여기에서 합성된 TRAIL 특이적 결합 및 효과기 분자는 종양세포에 의해 발현되는 TRAIL 수용체에 특이적으로 결합하여 아폽토시스를 유발한다. TNF(종양괴사인자) 또는 Fas 및 AOP1과 같은 단백질 촉발 아폽토시스는 오랫동안 알려져 왔다. 초기에는, 사이토카인 TNF가 마우스에서 강력한 살종양 효과를 갖는 단백질로 규명되었다. 그러나, 그것은 강력한 전신 독성으로 인해 치료학적으로 인간에게 사용될 수 없었다. Fas 및 APO1도 마찬가지이다. TRAIL은 최초로 1999 년에 보고되었다(Walczak, H. et al. Nature Medicine 5 (1999) 157-163). 이 단백질은 281 개의 아미노산으로 구성되며, 절단에 의해 114-281개의 아미노산으로 구성되는 가용성 분자로 전환되는 타입 Ⅱ 멤브레인 단백질이다. 동시에 트리머화된 다음에, 그것은 특이적 수용체에 결합함으로써 수용체의 트리머화를 유도한다. 따라서, 그것은 카스파제에 의해 유도되는 세포내 세포 사망 프로그램을 촉발한다. 지금까지 4 개의 서로 다른 TRAIL 수용체가 보고되었다: TRAIL-R1 및 2는 모두 신호 전달에 연루되지만, 수용체 TRAIL-R3 및 4는 소위 "사망 도메인"을 갖고 있지 않으며, 따라서 TRAIL의 결합 후에 신호를 촉발할 수 없다. TRAIL 그 자체 및 상기 수용체 모두는 인간 조직 및 장기 대부분에 발현되고; 선택적인 살종양 효과는 아마도 정상 세포가 활성 수용체의 트리머화를 억제함으로써 효과적인 신호 촉발을 억제하는 "데코이 수용체(decoy receptor)" 3, 4를 더 많이 가지고 있다는 사실에 기초한다.
천연적으로 제조되는 또는 재조합 방식으로 제조되는 TRAIL의 아미노산 서열에서, 수용체에 결합하여 생물학적 활성에 책임이 있는 다양한 도메인, 즉 도메인 AA131-163, AA201-205, AA214-220, AA237-240, AA258-283이 있다. 입체적으로 이웃하여 위치하는 이러한 짧은 도메인은 상호협동적으로 TRAIL 수용체와의 상호작용을 담당한다.
본 발명은 높은 친화도로 TRAIL 수용에에 특이적으로 결합하는 결합분자를 제공하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 결합 분자에서, 상기 섹션에서 언급한 유사한 도메인은 생물학적 효과를 이루기 위해 환형 지지 구조에 적절한 상호협동적 배열로 결합한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 TRAILR 결합 분자는 트리머화 형태로 존재한다. 환형 분자 서브유닛과의 공유결합에 의해, 그것들은 높은 생물학적 반감기를 가지며, 트리머화로 인해 생물학적으로 가능한 최대한의 활성 및 그와 동시에 최소한의 부작용을 갖는다. 이러한 펩티드들은 그것의 생물학적 활성을 위해 필요한 최소한의 구조를 갖는 TRAIL 이다. 이로 인해 가장 적은 부작용 갖는 최대한의 특이성이 얻어진다. 바람직한 구현예에서, 트리머는 호모트리벌런트 또는 환형 지지 구조 또는 벤젠트리아미드 링커에 의해 제조된다.
바람직하게는, TRAIL 펩티드는 높은 생물학적 반감기를 갖도록 사카라이드-변형 형태로 제조된다. 이것은 투여 빈도 및 투여량, 그리고 환자의 스트레스를 감소시킨다. 의도하는 아미노산 교환에 의해, 펩티드는 한편으로는 보다 더욱 생물학적으로 활성이 있는 형태 또는 반감기가 증가된 형태로, 다른 한편으로는 길항제, 즉 억제형태로 전환될 수 있다.
일 구현예에서, TRAILER-특이적 결합 분자의 하나 이상의 사이드 체인 서브유닛은 다음과 같은 서열을 갖는다:
SKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLS
특별한 구현예에서, TRAIL 수용체에 대해 친화도를 갖는 결합 분자는 하기 서열을 갖는 하나 이상의 사이드 체인 서브유닛을 갖는다:
SKNEKALGRKIX1X2X3X4SSRX5GHSFLS
상기에서,
X1= N 또는 L,
X2= S 또는 Q 또는 L 또는 E,
X3= W 또는 L 또는 R 또는 A 또는 Y,
X4= E 또는 N 또는 A 또는 D 또는 H,
X5= S 또는 A.
본 발명의 또 다른 측면은 사이드 체인 서브유닛이 상기 서열과 80 % 이상, 바람직하게는 90 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 결합 분자이다. 여기에서, 서열 이탈은 특히 아미노산 교환이다.
특별한 구현예는 다음 구조를 갖는 화합물이다:
본 발명에 따르면, 사이드 체인 서브유닛이 상기 서열과 80 % 이상, 바람직하게는 90 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 결합 분자 또한 사용 가능하다. 여기에서, 서열 이탈은 특히 보존적 아미노산 교환이다.
항체 및 그것의 항이디오타입 항체
본 발명에 있어서, 또 다른 중요한 생물학적으로 활성이 있는 물질 부류는 항체이다. 항체는 통상적으로 신체에 대한 이물질인 항원이라고 칭하는 물질에 특이적인 결합을 나타내는 신체 내에서 생산되는 물질이다. 항체는 병원에 대한 방어에 있어서 그리고 생명체를 감염으로부터 보호하는데 있어서 중요하다. 다양한 치료학적 적용 및 진단적 적용에, 의도하는 적응증에 대한 관련 결합능을 갖는 항체가 사용되거나 개발되었다. 따라서, 항체는 정세포 작용제 또는 다른 종양에서의 종양-파괴 약물을 특이적으로 풍부하게 하는데 사용되거나, 조영제와 함께 그것을 로딩하는 것에 의한 조영 과정에서 신체의 소정 부위 또는 질병 부위를 표현하는데 사용된다. 항체는 인간 신체로부터 천연 항체로서 분리될 수 있다. 통상적으로, 소위 모노클로날 항체는 접종에 의해 실험실 설치류 동물에서 증식되고 이후에 항체 생산 세포의 골수종 세포와의 융합에 의해 무한증식되고, 분리에 의해 모노클론화된 항체이다. 더욱이, 항체는 또한 적절한 암호화 유전 정보를 종종 세균 또는 효모-기초 발현 시스템에 전이시키는 재조합 기술에 의해 모노클론화될 수 있다. 재조합 방식으로 제조되는 항체는 충분히 시퀀싱되고 알려진 면역 글로불린 유전자 레파토리를 갖는 모든 종으로부터 획득될 수 있다. 이하에서는, 상기 설명에 따른, 천연적으로 생성되는 모노클로날 항체 또는 재조합 방식으로 제조되는 항체를 말한다.
항체는 상대적으로 큰 분자이며, 그것의 특이적인 결합 부위는 (아미노산 서열에 기초하여) 6 개의 매우 다양한 부위를 함유한다. 항체의 결합 특성은 소위 CDR("Complementary Determining Region")로 정해진다. 그러나, 많은 경우에 6 개의 부위 모두가 협조적으로 결합에 참여하는 것이 아니며, 개개의 또는 여러 개의 부위가 중요한 방식으로 특이적 결합에 필요하지 않다. 모노클로날 항체 및 재조합으로 제조된 항체 모두는 치료학적으로 또는 진단학적으로 다양한 적응증에 사용된다. 그러나, 여러 단점이 항체에 치료학적 적용에 있어 문제가 된다. 한편으로는, 상기 두 가지 방법(모노클로날에 의한 제조 및 재조합 방식의 제조) 모두에 의한 항체의 제조가 복잡하고 비용이 매우 많이 든다. 다른 한편으로는, 항체 그 자체가 환자의 면역 시스템을 작동하게끔 하는 천연 물질이다. 치료는 실질적으로 환자 자신의 (치료에 사용되는 항체에 대한) 항체의 생산에 의해 또는 아나필락틱 반응에 의해 저지된다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 치료학적 항체를 제조하는 방법의 변화가 이루어져야 하며, 예를 들어 설치류 모노클로날 항체를 분자생물학적인, 시간이 소용되는, 복잡한 방법의 재조합 방법에 의한 생산으로 도입하는 것과 동시에 인간화, 즉 인간의 서열을 도입시킴으로써 치료학적 사용을 최적화 해야한다.
종래 기술의 상태에 따르면, 이미 벌써 항이도오타입 물질을 라이브러리(예: 재조합 펩티드 라이브러리)로부터 유리시키는 것이 가능하다. 통상적으로, 이러한 방식으로 유리된 펩티드는 단지 낮은 친화도로 항체에 결합하고, 병원성 항체의 형성을 완전히 차단할 수 없거나 단지 제한적으로 차단할 수 있다.
본 발명은 치료학적으로 관련이 있는 항체의 결합 특성을 닮은 합성 결합 분자를 제공함으로써 상기 문제를 해결한다. 본 발명의 지지 구조는 상기 종래 기술의 문제를 극복할 수 있도록 하며, 각각의 항체에 대한 전합성 유사체를 개발하고 디자인하는 것을 가능하게 한다. 유기화학적 합성은 유사체 분자의 제조에 대한 재조합 방법에 비해 보다 더 경제적이고 더 나은 제어를 수행할 수 있다. 또한, 보다 나은 적합성, 수명, 또는 면역내성이 기대되는, 기본적으로 비천연인 아미노산 또는 다른 적절한 모노머 유닛이 이용될 수 있다.
그러나, 항체는 치료에 중요할 뿐만 아니라 병인론적 약물일 수 있다. 따라서, 항체는 그것이 자가 조직을 공격함으로써 소위 자가면역 질환을 촉발한다면, 또는 그것이 적어도 이러한 것과 연관이 되어 있다면 병을 유발할 수 있다. 항체 또는 면역글로불린 수퍼패밀리의 다른 물질의 병리학적 역할의 다른 변형은 각각의 물질에 대해 알레르기가 있는 환자에서 알레르기 원인 물질로서 존재할 수 있다. 또한, 이러한 질병은 면역학적 장치의 허위 반응(false reaction)이며, 그것의 촉발은 각각의 알러젠(allergen)의 결합에 의해 개시된다. 이러한 모든 경우에, 병인적으로 관련이 있는 항체를 소위 항-이디오타입 물질과 반응시킴으로써 그것을 중화시키는 것이 바람직할 것이다. 항-이디오타입은 표면적으로 실제 항원과 같이 항체 결합능을 갖는 물질로 이해하면 된다. 이것은 자가 항원에 대한 병리학적 결합을 차단한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 고체상에 결합되는 사이드 체인 서브유닛의 펩티드가 연속적으로 각각의 아미노산에 의해 연장되고 선택적으로는 지지 구조와의 결합이 마지막 단계에서 뒤따르는 고체상 합성 과정으로서 수행되는 결합 분자를 제조하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 서열의 펩티드이다:
● APTSSSTKKT1 QLQLEHX1X2X3X4X5QMILNGINN 또는
● TIVX6FLNRWIT FX7QSX8ISTLT1이고,
상기에서,
X1은 I 또는 L로부터 선택되고,
X2는 I 또는 L로부터 선택되고,
X3는 V, L, 또는 M으로부터 선택되고,
X4는 E, D, 또는 K로부터 선택되고,
X5는 L 또는 F로부터 선택되고,
X6는 E 또는 D로부터 선택되고,
X7은 A, G, 또는 C로부터 선택되고,
X8은 A 또는 I로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 목적은 사이드 체인 서브유닛이 TRAIL 서열의 단편과 완전히 상동이 아닌, 상기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 결합 분자 또는 펩티드를 함유하는 의약 또는 진단용 의약이다.
본 발명의 결합분자는 바람직하게는 면역 시스템, 특히 염증, 관절염 진행, 면역결핍 증후군, 및 자가면역 증후군, 임신 장애, 피임, 또는 항바이러스 예방, 증가된 세포 증식과 관련된 질병, 특히 종양, 암종증, 고형암, 림프종, 및 백혈병; 및/또는 인간 또는 동물의 감염 진행의 치료 또는 규명을 위한 의약 또는 진단용 의약의 제조에 사용된다.
본 발명의 의약은 특히 적절한 첨가제, 담체, 아주반트, 및/또는 하나 이상의 활성물질을 함유하는 마이크로캡슐, 리포좀 제제, 또는 데포 제제의 형태로 제공된다. 선택적으로는, 본 발명의 의약은 통상의 적절한 약물 담체와 함께 제공된다. 예를 들어, 적절한 단체로는 완충 염화나트륨 용액, 물, 유제(예: o/w 유제), 습윤제, 무균 용액 등이 있다. 본 발명의 의약은 주사액, 정제, 연고, 좌제, 유제, 좌제, 에어로졸 등의 형태로 제공될 수 있으며, 데포 형태(마이크로캅셀, 아연 염, 리포좀 등)로 투여될 수 있다. 펩티드는 작은 크기로 인해 마이크로캅셀로 제조될 수 있으며, 그리하여 캅셀의 각각의 공극 크기에 따라 효과의 지속시간이 다른 데포 형태를 생성시킬 수 있다. 데포 형태는 높은 농도가 원하는 부위(예: 초기 암종) 에서 오랜 시간동안 확보될 수 있도록 국소로 투여될 수도 있다. 그중에서도 특히, 의약의 투여방법은 활성성분이 존재하는 형태에 의존하며; 경구로 또는 비경구로 투여될 수 있다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 여러 가지 방법을 알 것이다. 적절한 투여량은 예를 들어, 환자의 나이, 성별, 체중, 질병의 특성 및 단계, 투여방법 등과 같은 여러 인자에 의존한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합분자의 사용은 ex vivo에서 인간 LAK(Lyphokine Activated Killer Cells)의 제조를 위해 상기 분자를 사용함으로써 IL2-특이적으로 일어난다. 그러한 ex vivo 치료에서, 세포는 환자로부터 취하고, 활성물질로 치료하고, 배양 접시에서 활성화한 다음 다시 환자에게 주입한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 인터루킨 12 및 인터루킨 12 수용체-특이적 결합 및 효과기 분자, 또는 재조합 IL12는 부가적인 활성물질로서 사용한다.
또 다른 구현예에서, TRAIL(TNF 관련 아폽토시스 유도 리간드), TRAIL 수용체 특이적 결합 및 효과기 분자, 또는 재조합 TRAIL이 부가적인 활성물질로서 사용된다.
특별한 구현예에서, 정바이러스제(virostatic), 특히 바이러스의 유입, 특히 HIV 입자의 타겟 세포, 특히 T-림프구로의 유입을 지연시키거나 차단시킬 수 있는 정바이러스제가 부가적인 활성물질로서 본 발명의 의약에 부가된다.
본 발명의 또 다른 측면은 지지 구조가 G, 베타-D,L-알라닌, 또는 NH2(CH2)xCOOH (X= 3-8)로부터 선택된 1 내지 10 개의 아미노산의 선형 펩티드로 구성되는 결합 분자이다.
실시예 1
시클로펩티드에 기초한 펩티드의 중합체 형성의 원리
A: 역평행 다이머
시클릭 펩티드를 생성시키고 고체상 합성의 개시 지점으로서 사용하였다. 처음에는, 제 1 펩티드 가닥을 고체상에서 합성하고, 시클로펩티드를 거기에 결합킨 다음, 제 2 펩티드 가닥을 하나씩 이러한 로딩된 레진 상에서 합성하거나, 미리 정제된 펩티드 B를 거기에 결합시킨다.
용액 중에서의 라이신 시클로펩티드 및 아스파라긴산의 결합
NMM 0.2 ml 및 CDMT 1 mmol을 아르곤 대기 하에서 0℃로 냉각된 메틸렌 클로라이드 10 mL 중의 아스파라긴산 유도체 용액 1 mL에 부가하고, 이 혼합물을 2 시간동안 0℃에서 교반한다. 그런 다음, 절대 DMF 10 mL 중의 NMM 0.2 mL 및 시클로펩티드 1 몰당량을 부가한다. 이 혼합물을 0℃에서 2 시간동안, 실온에서 밤새도록 교반하고, 얼음물 50 mL를 부가하고, 그것을 각각 에틸 아세테이트 10 mL로 2 회 추출한다. 합한 유기층을 탄산수소나트륨 포화 용액 및 황산수소나트륨 5% 용액과 함께 교반함으로써 추출한다. 황산나트륨으로 건조한 후에, 남아 있는 용액을 Rotavapor 중에서 농축하고 잔사를 메틸렌 클로라이드 중에서 현탁하여, 생성물을 백색 고체의 형태로서 획득한다.
배치 크기:
Boc-L-Asp (OBz) 162 mg 0.5 mmol
시클로-L-Ala-L-Lys 100 mg 0.5 mmol
CDMT 89 mg
NMM 0.2 mL
메틸렌 클로라이드 5 ml
DMF 5 ml
수율:
이론치: 0.25g l00%
실측치: 0.18g 72%
B: 평행 다이머
서열 D-K-D-K-D-K의 시클로헥사펩티드를 하기 반응식에 나타낸 바에 따라 생성시킨다. 보호기를 적절하게 선택함으로써, 시클로펩티드를 아스파라긴산의 사이드 체인에 의해, 선택적으로는 스페이서 분자에 의해 폴리머 지지체에 결합시키고, 그런 다음 세 개의 펩티드 가닥을 평행하게 레진 상에서 합성하거나 정제된 펩티드를 고체상에 결합시킬 수 있다.
A = DB = KX, Y = 스페이서 분자
PG1 / PG2 = 직교 보호기(orthogonal protective group)
PG3 / PG4 = 직교 보호기
실시예 2
IL2R-특이적 결합 분자 형태의 실시예 1B에 따른 펩티드 A의 구현예:
펩티드를 다음과 같이 합성한다:
합성: 고체상 합성(어세이 당 100 mg Wang 레진 (0.4 mmol/g))을 이용하여, 다양한 서열을 갖는 펩티드를 합성 로봇(Sophas-3, Zinsser Analytik)에서 자동적으로 제조한다. 모노머로서, 당해 기술분야의 기술상태에 따라 적절한 부가적인 보호기를 갖는 유닛 Fmoc-유도 아미노산 (c = 0.5 mol/L)을 사용하였다. 아미노산 유닛 및 결합제(HOBt, C = 0.766 g/ml; PyBOP, c = 0.2602 g/ml)를 DMF에 녹여 제공하였다. 각각의 결합 단계를 각각 2 x 45 분간 수행하고, 레진을 단계 사이에서 DMF로 세척하였다. Fmoc 절단을 DMF 중의 피페리딘 50% (v/v) 용액으로 20 분 처리함으로써 수행하였다. 그런 다음, 레진의 절단을 트리플루오로아세트산 95%, 물 2.5%, 디이소프로필실란 2.5%로 20 분간 수행하였다. 절단된 펩티드를 t-부틸 메틸에테르를 부가함으로써 침전시키고, 원심분리하여 제거하고, 다시 t-부틸 메틸 에테르와 혼합하고 원심분리 하였다. 그런 다음, 펩티드를 동결건조하고 역상 HPLC를 이용하여 정제하고, LC/MS(Thermoquest LCQDuo)에 의해 규명하였다. 정제된 펩티드를 세포 배양에서 세포독성의 증가 작용으로서 확인하였다.
다음 구조를 갖는 펩티드를 제조하고 시험하였다:
서열 1: APTSSSTKKT QLQLEHLLLK LQMILNGINN
서열 2: APTSSSTKKT QLQLEHFLLD FQMILNGINN
서열 3: APTSSSTKKT QLQLEHFLMK FQMILNGINN
세포독성 시험:
세포독성 측정을 위해, 특이적으로 종양세포를 죽이는 NK 세포를 효과기 세포로서 시험 펩티드의 존재 하에서 표적 세포로서 종양 세포와 함께 배양하였다. 세포독성 측정은 세포독성 시험 키트(Promega, Germany)에 의해 그리고 마이크로웰 플레이트 리더 중에서 표준 프로토콜에 따라 락테이트 디하이드로게나제(LDH)의 분비를 측정함으로써 수행하였다. NK 세포(E)로서, YT 세포(DSMZ, Germany)를 사용하였다. 표적세포(T)로서, Daudi 세포(DSMZ, Germany)를 사용하였다. YT 및 Daudi 세포를 1:10이 비율로 마이크로웰 플레이트에 접종하고, 0.3, 3, 30 :M 시험 펩티드의 존재 하에서 16 시간동안 배양하였다. 5 nM 농도의 인간 IL-2 (Sigma)를 양의 대조군으로서 사용하였다.
다음 날, 각각 10 :l 용해 버퍼(lysis buffer)를 세포에 부가하고 세포를 2 시간 더 배양하였다. 그런 다음, 시약 5 :l을 제 2 마이크로웰로 옮기고 기질 버퍼 50 :l과 혼합하였다. 30 분동안 배양한 다음에, 정지 용액 50 :l로 반응을 종결시키고, 형성된 MTT 컬러 복합체의 흡수를 마이크로웰 플레이트 중에서 측정하였다.
표 1은 0.3 :M 농도에서의 상기 시험 펩티드의 세포독성 유도효과가 인간 IL-2와 동등하게 높다는 것을 나타낸다.
[표 1]
세포독성 시험의 결과 개요
서열(서열 #) 세포독성
대조군 10 %
IL-2 60 %
서열 1 30 :M 30 %
서열 1 3 :M 30 %
서열 1 0.3 :M 30 %
서열 2 30 :M 10 %
서열 2 3 :M 80 %
서열 2 0.3 :M 30 %
서열 3 30 :M 0 %
서열 3 3 :M 20 %
서열 3 0.3 :M 0 %
실시예 3:
트리히드록시 벤조산 지지 구조의 합성
어세이:
트리히드록시벤조산 4 mmol을 거의 비수성의 탄산나트륨 용액(pH = 9)에 가능한 용해하고, 아세톤 130 mL중의 펜타플루오로페놀 에스테르 16 mmol의 현탁액에 부가한다. 그 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고 5% HCl을 이용하여 0℃에서 pH = 1로 산성화한다. 용액을 Rotavapor 중에서 처음 부피의 절반으로 농축하고 에틸 아세테이트 2 x 150 ml와 함께 교반함으로써 추출한다. 합한 유기층을 물 100 mL 및 5 x 진한 황산수소나트륨 용액과 함께 교반함으로써 추출하고, 황산나트륨으로 건조한다. Rotavapor 중에서 휘발성 성분을 제거한 후에, 잔사를 메탄올 중에 현탁시키고, 흡입여과한 다음, 차가운 메탄올로 다시 세척하였다. 생성물이 침전하지 않으면, 완전히 회전증발된 것이다.
실시예 3:
인터루킨-2 이뮤노머(immunomer)의 합성
합성될 물질의 화학식
약어 물질
DMF N,N-디메틸포름아미드(펩티드 합성 그레이드)
DCM 디클로로메탄(펩티드 합성 그레이드)
HOBT 1-히드록시벤조트리아졸(무수)
DBU 1,8-디아자바이시클로[5,4,0]운데크-7-엔 98%
PyBOP 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄-헥사플루오로포스페이트
DIPEA N-에틸디이소프로필아민 98+%
TIS 트리이소프로필실란 99%
MeOH 메탄올 HPLC (경사 그레이드)
TFE 2,2,2-트리플루오로에탄올 99.8%
EDT 에탄디티올
전체적인 전략:
합성을 2-클로로트리틸 클로라이드 레진(200-400 메쉬) 상에서 0.2 mmol/g의 치환속도로 수행한다. 제 1의 7 개의 아미노산을 프래그먼트로서 결합한다. 그 다음 아미노산의 부착을 10 배 과량의 아미노산 및 결합 첨가제로서 PyBOP/HOBT/DIPEA로 단일, 이중, 또는 삼중 결합에 의해 수행한다. 자라나는 펩티드 체인의 N-말단 탈보호를 피페리딘/DMF (1/3)로 이중처리함으로써 수행한다. 어려운 경우에는, DBU/피페리딘/DMF(2/2/96)으로 제 3 의 처리를 수행한다. 사용된 결합 및 탈보호 사이클의 수를 아래에 나타내었다(HPLC-MS에 의한 각각의 연장의 모니터링에 의해 얻어지는 어려운 결합/탈보호의 정보).
RES-XXNNIGN-LCMQLDLLLHELQLQTKKTBGGB-TLTSIISQAFTIWRNCSEVITXXHHHH
결합: 22221211111111122222222-223333333333333333333333333
탈보호: 22222222222222322222222-223333333333333333333333333
1,2, 3 = 결합 또는 탈보호 사이클의 수
X = D-알라닌
B = β-알라닌
프로토콜 1: 제 1 펩티드 프래그먼트의 합성
제 1 아미노산 2 mmol 및 DIPEA 4 mmol을 건조 DCM 10 mL에 용해한다. 이 용액을 건조 2-클로로트리틸 클로라이드 레진 (200-400 메쉬) 1.0 g에 부가하고, 혼합물을 볼텍스 믹서 상에서 60 분간 반응시킨다. 반응이 끝날 때, 레진을 DCM/MeOH/DIPEA 20 mL로 3 분간 2 회 반응시키고, DCM 20 mL로 2 회, DMF로 2 회 세척한다. 그런 다음, 레진을 피페리딘/DMF (1:3) 20 mL로 각각 3/20 분 동안 2 회 처리하고, DMF 20 mL로 6 회 세척한다. 아미노산 2-7의 부착을 다음 방법에 따라 수행한다: 아미노산 5 mmol, HOBT 7.5 mmol, 및 DIPEA 10 mmol을 DMF 15 mL에 용해한다. 5 분 후에, PyBOP 5 mmol 및 DIPEA 10 mmol을 부가하고, 이 용액을 레진 상에 부가한다. 볼텍스 믹서 상에서 60 분 후에, 레진을 DMF 20 mL로 6 회 세척하고, 피페리딘/DMF(1:3) 20 mL로 각각 20/20 분간 2 회 세척하고, DMF 20 mL로 6 회 세척한다. N-말단 아미노산의 경우, 레진을 피페리딘/DMF로 처리하지 않는다.
프로토콜 2: 펩티드 프래그먼트의 절단
마지막 아미노산의 부착 후에, 레진을 DMF 20 mL로 6 회, DCM 20 mL로 2 회 세척한 다음, TFE/DCM (2/8) 50 mL로 반응시킨다. 레진을 여과하여 버리고, 용매를 감압 하에서 제거하고, 조 펩티드 프래그먼트를 더 이상의 정제 없이 사용한다.
프로토콜 3: 펩티드 프래그먼트의 재부착
상기 프래그먼트 1 mmol 및 DIPEA 2 mmol을 건조 DCM 50 mL 중에 용해한다. 이 용액을 건조 2-클로로트리틸 클로라이드 레진(200-400 메쉬) 5.0 g에 부가하고, 그 혼합물을 볼텍스 믹서 상에서 12 시간동안 반응시킨다. 반응이 완료된 후, 레진을 DCM/MeOH/DIPEA 50 mL로 3 분간 2 회 세척하고, DCM 50 mL로 2 회, 그리고 DMF 50 mL로 2 회 세척한다.
프로토콜 4: 아미노산 8-57의 결합
건조 레진을 피페리딘/DMF (1/3) 50 mL 중에서 30 분간 팽윤시키고, 피페리딘/DMF (1/3) 30 mL로 20 분간 처리하고, DBU/피페리딘/DMF (2/2/96) 30 mL로 20 분간 처리하고, DMF 30 mL로 6 회 세척한다. 아미노산 10 mmol, HOBT 15 mmol, 및 DIPEA 20 mmol을 DMF 30 mL 중에 용해한다. 5 분 후에, PyBOP 10 mmol 및 DIPEA 20 mmol을 부가하고, 이 용액을 레진 상에 붓는다. 60 분 후에, 볼텍스 믹서 상에서, 레진을 DMF 30 mL로 2 회 세척하고, 결합을 60 분간 1 회 또는 2 회(어려운 경우) 반복한다. 그런 다음, 레진을 DMF 30 mL로 6 회 세척한다. 그 레진을 다음 아미노산을 결합시키는데 직접적으로 사용하거나, DCM 30 mL로 2 회 세척한 후에 진공 하에서 건조하고 80℃에서 보관한다.
프로토콜 5: 절단 및 보호
마지막 아미노산을 결합한 후에, N-말단 보호기를 피페리딘/DMF (1/3) 30 mL로 20 분간 이중처리하고, DBU/피페리딘/DMF (2/2/96)으로 20 분간 처리함으로써 제거한다. 레진을 DMF 30 mL로 6 회, DCM 30 mL로 2 회 세척하고, TFE/DCM (2/8) 50 mL로 180 분간 처리한다. 여과한 후에, 용매를 진공 하에서 제거하고, 보호기를 180 분간 불활성 기체 하에서 TFA/TIS/EDT/물 (94/1/2.5/2.5) 30 mL로 처리함으로써 제거한다. 이 용액을 차가운 에테르 300 mL에 붓고, 침전물을 메탄올 중에 용해시키고, 펩티드를 RP-HPLC(Kromasil 100 C4 10㎛, 250x4.6 mm)로 정제하여, 수집된 분획을 리폴딩(refolding) 공정에서 직접 사용한다.
프로토콜 6: 리폴딩 공정
각각의 용리 분획을 용리 분획에 존재하는 용매와 동일한 용매를 이용하여 최종 부피 20 mL로 희석시켰다. 이 정제된 생성물의 용액을 비이커 중에서 약간의 진탕을 가하면서 Ni-NTA Superflow (Qiagen)과 함께 30 분간 실온에서 배양하였다. Superflow 이자를 빈 FPLC 컬럼으로 팩킹하고, FPLC-기계에 부착시켰다. 이러한 기계의 크로마토그래피 프로그램을 이용하여, 용매를 물에 의한 경사에서 10 분에 교환한 다음, 또 다른 10 분간 경사을 이용하여 용매를 물/트리플루오로에탄올(1/1)의 혼합물로 교환하였다. 24 시간동안, 디설피드 결합을 이루기 위해, 이 용매를 저장 보틀을 통해 산소를 버블링함으로써 그리고 보틀 중의 공기로서 산소를 이용함으로써 산화시킨다. 산화하는 동안, 저장 보틀로 용리액을 일정하게 재순환시키면서, 1 mL/분의 일정한 흐름을 컬럼을 통해 24 시간동안 통과시켰다.
24 시간이 끝날 때, 리폴딩되고 디설피드 결합에 의해 봉인된 최종 생성물을 150 mM 이미다졸을 함유하는 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.2)를 이용함으로써 또는 0.1 M 아세테이트 완충액(pH 4.5)를 이용함으로써 용리하였다.
그 결합분자는 베타/감마 인터루킨 2 수용체 헤테로다이머에 결합하여 그것을 활성화시키고 신호 전달을 유도할 수 있다.

Claims (25)

  1. 사이드 체인 서브 유닛은 천연 및/또는 비천연의 D- 및/또는 L-아미노산으로 구성된 폴리펩티 체인 및/또는 폴리뉴클레오티드 체인이고, 사이드 체인 서브유닛은 지지 구조에 공유결합되는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 환형 분자 서브유닛의 지지 구조 및 두 개 이상의 사이드 체인 서브유닛으로 구성되는 결합 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 환형 분자 서브유닛은 천연 또는 비천연 D- 및/또는 L- 아미노산으로부터 합성된 시클릭 폴리펩티드, 방향족 고리, 방향족 고리 시스템, 폴리락톤, 폴리락탐, 벤젠트리아미드, 트리락톤, 또는 트리락탐인 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 시클릭 폴리펩티드를 형성하는 아미노산은 폴리펩티드 결합으로 연결되는 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 환형 분자 서브유닛은 시클릭 폴리펩티드이고, 상기 두 개 이상의 사이드 체인 서브유닛은 환형 분자 서브유닛의 아미노산 라이신, 세린, 쓰레오닌, 글루타메이트, 아스파라긴, 및/또는 아스파테이트의 아미노산 사이드 체인 모이어티에 의해 환형 분자 서브유닛에 연결되는 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 시클릭 폴리펩티드는 2 내지 10 개, 바람직하게는 2, 3, 4, 또는 6 개의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  6. 제 1 항에 있어서, 다음 구조중 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 결합 분자:
    a) 벤젠트리아미드:
    b) 시클로헥사펩티드:
    또는 1 내지 3 개의 사이드 체인 펩티드 Seq를 갖는 서열 DKDKDK의 시클로헥사펩티드,
    c) 트리락톤:
    d) 트리락탐:
    e) 트리히드록시벤조산 지지 구조:
    f) 시클릭 디펩티드: Seq로 유도된 시클로-L-Ala-L-Lys,
    상기에서, Seq 또는 Pep는 사이드 체인 서브유닛 또는 -OH를 나타낸다.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 체인은 동일한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 체인은 5 내지 60 개, 바람직하게는 10 내지 50 개, 특히 12 내지 40 개의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 사이드 체인 서브유닛은 특히 탄수화물 또는 핵산으로 구성되는 스페이서 분자 서브유닛(스페이서)에 의해 지지 구조에 결합되는 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 아미노산은 화학식 NH2(CH2)nCOOH(n= 2 내지 8)이며, 특히 NH2(CH2 )2COOH, NH2(CH2)3COOH, 또는 NH2(CH2)4COOH를 갖는 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 지지 구조에 부착된 사이드 체인 서브유닛은 다음 서열 중 하나 이상의 서열을 갖고,
    ● APTSSSTKKT1 QLQLEHX1X2X3X4X5QFMILNGINN (SCI) 또는
    ● TIVX6FLNWIT RX7QSX8ISTLT1, (SC2) 또는
    ● TKETQQQLEQLLLDLRLLLNGVNNPE (SC3) 또는
    ● TKETEQQMEQLLLDLQLLLNGVNNYE (SC4) 또는
    ● NYDDETATIVEFLNKWITFAQSIFSTLT (SC5) 또는
    ● EYDDETATITEFLNKWITFAQSIFSTLT (SC6),
    상기에서,
    X1은 I 또는 L로부터 선택되고,
    X2는 I 또는 L로부터 선택되고,
    X3는 V, L, 또는 M으로부터 선택되고,
    X4는 E, D, 또는 K로부터 선택되고,
    X5는 L 또는 F로부터 선택되고,
    X6는 E 또는 D로부터 선택되고,
    X7은 A, G, 또는 C로부터 선택되고,
    X8은 A 또는 I로부터 선택된다;
    T1 쓰레오닌에서, 당해 기술분야에 따른 보호기, 바람직하게는 탄수화물 모이어티(바람직하게는 글루코오스, 만노오스, N-아세틸 글루코사민, 또는 N-아세틸갈락토사민으로부터 선택된다)가 단백질 분해에 대한 보호로서 적절한 방법으로 선택적으로 공유결합되고;
    엑소펩티다아제에 대한 보호는 유리 C- 및/또는 N-말단에서의 두 개의 D-아미노산 잔기의 부착에 의해 선택적으로 이루어지고;
    상기 서열은 지지 구조에 부착된 후에 폴리펩티드 사이드 체인 간의 디설피드 결합을 준비하기 위해 SH-그룹(들)을 갖는 잔기에 의한 단일 잔기의 치환에 의해 선택적으로 변형되고,
    결합 분자의 사이드 체인 서브유닛은 하기 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 가지며;
    상기 서열의 프래그먼트는 N- 또는 C-말단으로부터 최대 6 개의 아미노산이 짧아진 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  12. 제 11 항에 있어서, 다음 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 결합 분자:
    SCX-지지 구조-SCY
    상기에서, SCX(사이드 체인 X)는 제 11 항의 6 개의 사이드 체인(SC1-6)중에서 선택되고, SCY(사이드체인 Y)는 제 11 항의 6 개의 사이드 체인(SC1-6)중에서 선택된다.
  13. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 사이드 체인 서브유닛은 하기 서열을 가지며, 결합 분자의 사이드 체인 서브유닛은 하기 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 결합 분자:
    SKNEKALGRKIX1X2X3X4SSRX5GHSFLS
    상기에서,
    X1= N 또는 L,
    X2= S 또는 Q 또는 L 또는 E,
    X3= W 또는 L 또는 R 또는 A 또는 Y,
    X5= S 또는 A.
  14. 제 1 항에 있어서, 결합 분자는 다음 구조식 중 하나를 갖고, 결합분자의 사이드 체인 서브유닛은 하기 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 결합 분자:
    또는
    또는
    또는
    또는
    .
  15. 사이드 체인 서브유닛의 펩티드를 고체상에 결합시키고, 연속적으로 각각의 아미노산에 의해 연장시키고, 선택적으로 지지 구조와의 결합을 마지막 단계에서 수행하는 고체상 합성방법에 의한, 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자를 제조하는 방법.
  16. 하기 구조를 갖는 펩티드로서, 결합 분자의 사이드 체인 서브유닛은 하기 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드:
    ● APTSSSTKKTl QLQLEHX1X2X3X4X5QMILNGINN 또는
    ● TIVX6FLNRWIT FX7QSX8ISTLT1,
    상기에서,
    X1은 I 또는 L로부터 선택되고,
    X2는 I 또는 L로부터 선택되고,
    X3는 V, L, 또는 M으로부터 선택되고,
    X4는 E, D, 또는 K로부터 선택되고,
    X5는 L 또는 F로부터 선택되고,
    X6는 E 또는 D로부터 선택되고,
    X7은 A, G, 또는 C로부터 선택되고,
    X8은 A 또는 I로부터 선택된다.
  17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자 및/또는 제 16 항에 따른 펩티드를 함유하는 의약.
  18. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자 및/또는 제 16 항에 따른 펩티드를 함유하는 진단용 의약.
  19. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자 및/또는 제 16 항에 따른 펩티드를, 면역 시스템, 특히 염증, 관절염 진행, 면역결핍 증후군, 및 자가면역 증후군, 임신 장애, 피임, 또는 항바이러스 예방, 증가된 세포 증식과 관련된 질병, 특히 종양, 암종증, 고형암, 림프종, 및 백혈병; 및/또는 인간 또는 동물의 감염 진행의 치료 또는 검출을 위한 약물 또는 진단용 약물에 사용하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서, 적절한 첨가제, 담체, 아주반트, 및/또는 하나 이상의 활성물질을 함유하는 마이크로캡슐, 리포좀 제제, 또는 데포(depot) 제제의 형태인 것을 특징으로 하는 의약.
  21. 제 17 항에 있어서, 인터루킨 12, 인터루킨 12 수용체-특이적 결합 및 효과기 분자, 또는 재조합 IL12가 부가적인 활성물질로서 사용되는 것을 특징으로 하는 의약.
  22. 제 17 항에 있어서, TRAIL(리간드를 유도하는 TNF 관련 아폽토시스), TRAIL 수용체 특이적 결합 및 효과기 분자, 또는 재조합 TRAIL이 부가적인 활성물질로서 사용되는 것을 특징으로 하는 의약.
  23. 제 17 항에 있어서, 정바이러스제(virostatic), 특히 바이러스의 유입, 특히 HIV 입자의 타겟 세포, 특히 T-림프구로의 유입을 지연시키거나 차단시킬 수 있는 정바이러스제가 부가적인 활성물질로서 사용되는 것을 특징으로 하는 의약.
  24. 제 1 항 또는 제 12 항에 있어서, 정확히 2 개의 사이드 체인이 지지 구조에 결합되고, 그 지지 구조는 G, P, 베타-알라닌, 또는 NH2(CH2)xCOOH (X= 3-8)로부터 선택된 2 개 이상의 서로 다른 아미노산을 포함하는 2-10 개의 아미노산의 선형 펩티드로 최소화된 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  25. 제 24 항에 있어서, 하기 구조식으로 정의되는 것을 특징으로 하는 결합 분자:
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101632669B (zh) 2000-08-04 2011-05-18 Dmi生物科学公司 二酮基哌嗪和包含它们的组合物的使用方法
KR20120091266A (ko) 2003-05-15 2012-08-17 디엠아이 바이오사이언시스, 인크 Ｔ-세포 매개성 질환의 치료 방법
JP5856843B2 (ja) * 2008-05-27 2016-02-10 アンピオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド ジケトピペラジンを用いた医薬組成物
CA2810844C (en) 2010-09-07 2017-03-21 Dmi Acquisition Corp. Diketopiperazine compositions for the treatment of metabolic syndrome and related conditions
ES2795803T3 (es) 2011-10-10 2020-11-24 Ampio Pharmaceuticals Inc Tratamiento de artropatía degenerativa
SG10201608087WA (en) 2011-10-10 2016-11-29 Ampio Pharmaceuticals Inc Implantable medical devices with increased immune tolerance, and methods for making and implanting
AU2012328605B9 (en) 2011-10-28 2017-08-03 Ampio Pharmaceuticals, Inc. Treatment of rhinitis
EA201500943A1 (ru) 2013-03-15 2016-08-31 Ампио Фармасьютикалс, Инк. Составы для мобилизации, хоуминга, размножения и дифференцировки стволовых клеток и способы применения составов
US9956217B2 (en) 2014-08-18 2018-05-01 Ampio Pharmaceuticals, Inc. Treatment of joint conditions
EP3310375A4 (en) 2015-06-22 2019-02-20 Ampio Pharmaceuticals, Inc. USE OF LOW MOLECULAR WEIGHT HUMAN SERUM ALBUMIN FRACTIONS FOR TREATING DISEASES

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5449761A (en) * 1993-09-28 1995-09-12 Cytogen Corporation Metal-binding targeted polypeptide constructs
US6096710A (en) * 1995-11-17 2000-08-01 The Regents Of The University Of California Collagen-like peptoid residue-containing structures
US5856308A (en) * 1996-09-27 1999-01-05 Haemacure Corporation Artificial collagen

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