KR20200005526A

KR20200005526A - 신규한 스테이플화 펩티드 및 이의 용도

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Publication number: KR20200005526A
Application number: KR1020197020767A
Authority: KR
Inventors: 기욤 라콘데; 뮤리엘 암브라드-카우씰; 진 마르티네즈; 크리스티안 요르겐센; 플로렌스 압파레일리-세찬; 이자벨 뒤룩스-리차드
Original assignee: 유니베르시테 드 몽펠리에; 에꼴 나쇼날 쉬페리에르 드 시미에 드 몽펠리에; 인스티튜트 내셔널 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 (인 썸); 쌍트르 나시오날 드 라 르쉐르쉐 싸이엉띠피끄(쎄.엔.에르.에스.); 상트르 하스피탈리에 레지오날 유니베르시테르 드 몽쁠리에
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2020-01-15
Also published as: CA3047507A1; WO2018115400A1; EP3559020B1; AU2017382037B2; US20210130405A1; AU2017382037A1; KR102490489B1; EP3559020A1; US11339191B2; ES2932772T3; JP7213811B2; CN110248953A; JP2020503313A

Abstract

본 발명은 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커, 및 다음 (i) 인간 서열 IRAK2 54-71 (서열번호 1)에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 14-15의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 (ii) 인간 서열 IRAKM 66-83 (서열번호 2)에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 13-14의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드모방체 매크로사이클로서, 상기 펩티드모방체 매크로사이클이 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된 적어도 2개의 천연 또는 2개의 비천연 아미노산 및 α-나선을 포함하는, 펩티드모방체 매크로사이클에 관한 것이다. 또한, 상기 펩티드모방체 매크로사이클의 제조 방법 및 이의 용도, 약제학적 조성물 및, 특히 염증 경로의 억제제로서의 이의 용도에 관한 것이기도 하다.

Description

신규한 스테이플화 펩티드 및 이의 용도

본 발명은 IRAK2 및 IRAK4의 IRAKM(IRAK3으로도 칭명됨) 단백질 결합 영역으로부터 유래된 스테이플화 펩티드라고 명명되기도 하는 신규한 펩티드모방체 매크로사이클 및 이의 용도, 특히 염증 경로의 억제제로서의 이들의 용도를 제공한다.

본원에 사용된 용어 "IRAK"는 자극시 인터류킨 수용체(IL-R)와 관련되게 되는 인터류킨-수용체 관련 키나제를 지칭한다. IRAK 유전자는 부분적으로 전사 인자 NF-κB의 인터류킨-유도 상향조절을 담당한다.

톨형 수용체(TLR)에 의한 신호 전달은 많은 병원성 미생물에 대한 숙주 방어의 중심이며, 또한 만성 염증성 장애를 포함하는 인간 질환의 큰 부담을 강조한다.

염증성 장애 및 자가 면역 질환은 전세계적으로 수백만 명의 사람들의 삶에 영향을 미치고 특이적 치료 개입을 필요로 하는 중요한 공중 보건 문제이다. TLR 신호 전달 경로는 암뿐만 아니라 전염성 및 염증성 장애에서 연구되어 왔다. 이 신호 전달 경로의 표적화는 류마티스성 관절염, 다발성 경화증 및 크론병과 같은 자가 면역 질환뿐만 아니라 2형 당뇨병, 감염, 패혈증, 암 및 심혈관 질환과 같은 염증 신호의 규제 완화와 관련된 다른 일반적인 질환과 관련될 수 있다.

따라서, TLR에 의한 신호 전달의 메카니즘 및 조절은 새롭고 특이적인 항염증 요법의 개발에 상당한 관심의 대상이다(참조: 0'Neill et al. Nat. Rev. Immunol. 2007).

TLR 활성화는 다중 단백질 복합체, 즉 '미도솜(Myddosome)' 복합체의 조립을 촉진하고 핵 인자-κB(NF-κB)를 활성화시키고 전염증성 사이토카인(TNFα, IL-1β, IL-6...)의 생산을 유도하는 하류 신호 변환기 상호작용의 캐스케이드를 유도한다. 미도솜은 MYD88, IRAK4 및 IRAK2의 여러 분자를 함유하는 올리고머 구조이다(참조: Lin et al. Nature 2010).

현재 큰 약제학적 그룹은 IRAK4 키나제 활성의 억제에 대해 연구하고 있다. 일부 화합물은 전임상 단계에 있다(참조: Chaudhary et al, Journal of Medicinal Chemistry, 2015).

그러나, 전염증성 사이토카인의 생산을 차단하는 것이 치료 목표로 충분히 인정되고 있지만, 현재 그들의 분비 상류에서 전염증성 사이토카인(IL1β, TNF α 및 IL6)의 생산을 차단하는 전략에 의해 이 경로를 억제하는 시판 약물은 없다. 또한, IRAK2 및 IRAKM은 의사-키나제이며, 따라서 이들의 활성은 규칙적인 키나제억제제 전략을 통해 억제될 수 없다. 주(Zhou)와 동료들(참조: Hao Zhou et al., The EMBO Journal (2013) 32, 583-596)은 IRAKM이 IRAK2와 같은 Myd88-IRAK4와 상호작용함을 입증했다.

따라서, 사이토카인 TNFα, IL-6 및 IL1β 생산의 신호전달 TLR 경로를 억제할 수 있는 새로운 화합물이 필요하다.

본 발명자들은 IRAK2/IRAK4 상호작용을 억제하고, 따라서 '미도솜' 조립체 및 전염증성 매개체의 하류 생산을 간섭하는 스테이플화 펩티드라고 칭명되기도 하는 특이적 매크로사이클 펩티드를 고안했다.

본 발명의 독창성은 현재 제안되지 않은, 새로운 표적에서 작용하는, 염증성 및 감염성 질환이 신체에서 발생하자 마자 그들을 치료하는 것이다. 실제로, 오늘날 이용가능한 유일한 효과적인 항-TNFα 치료는 아달리무맙, 인플릭시맙 또는 에타네르셉트와 같은 모노클로날 항체이다. 그러나, 항체는 무거운 처리이고 상류 염증성 경로를 차단하는 것을 허용하지 않는다.

따라서, 스테이플화 펩티드를 통해 IRAK-2와 IRAK-4의 상호작용을 억제하는 것이 전략적인 대안적 선택이다.

본 발명은 TLR 및 IL1R을 통해 활성화된 염증 경로를 억제하는 IRAK2 및 IRAK4의 IRAKM 및 단백질 결합 영역으로부터 유래된 특정 펩티드모방체 매크로사이클에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그들의 제조 방법, 이들 펩티드모방체 매크로사이클을 함유하는 약제학적 조성물, 및 단독으로 또는 항염증성 또는 세포 표적화 화합물로부터 선택된 추가 화합물과 조합하여 염증, 특히 급성 또는 만성 염증성 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 그들의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따르는 정의

본 발명에 따르는 "펩티드모방체 매크로사이클" 또는 "가교결합된 폴리펩티드" 또는 "스테이플화 펩티드"라는 용어는 복수의 펩티드 결합에 의해 결합된 복수의 아미노산 잔기 및 동일한 분자 내에서 제1 천연 또는 비천연 아미노산 잔기 (또는 유사체)와 제2 천연 또는 비천연 아미노산 잔기 (또는 유사체) 사이에 매크로사이클을 형성하는 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커(macrocycle-forming linker)를 포함하는 화합물을 의미한다.

펩티드모방체 매크로사이클은 매크로사이클 형성 링커가 제1 아미노산 잔기 (또는 유사체)의 a-탄소를 제2 아미노산 잔기 (또는 유사체)의 a-탄소에 연결하는 구현예를 포함한다.

펩티드모방체 매크로사이클의 맥락에서 언급될 때 "상응하는 비가교결합된 폴리펩티드" 또는 "선형 펩티드"는 매크로사이클과 동일한 길이의 폴리펩티드에 관한 것이고, 매크로사이클에 상응하는 야생형 서열의 동등한 천연 아미노산을 포함하는 것으로 이해된다.

본 발명에 따르는 용어 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 공유 결합(예: 아미드 결합)에 의해 결합된 2개 이상의 천연 또는 비천연 아미노산을 포함한다. 본 발명에 따르는 펩티드는 일반적으로 8 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다.

본 발명에 따르는 용어 "아미노산"은 아미노 그룹 및 카복실 그룹을 모두 함유하는 분자를 의미한다. 적합한 아미노산은, 제한 없이, 유기 합성 또는 다른 대사 경로에 의해 제조된 비천연 아미노산뿐만 아니라 천연 아미노산의 D- 및 L-이성체를 모두 포함한다. 본원에 사용된 용어 아미노산은, 제한 없이, a-아미노산, 천연 아미노산, 비천연 아미노산 및 아미노산 유사체를 포함한다.

본 발명에 따르는 용어 "천연 아미노산"은 자연에서 합성된 펩티드에서 통상적으로 발견되는 20개의 L-아미노산 중 임의의 하나, 즉 알라닌(Ala 또는 A), 아르기닌(Arg 또는 R), 아스파라긴(Asn 또는 N), 아스파르트산(Asp 또는 D), 시스테인(Cys 또는 C), 글루탐산(Glu 또는 E), 글루타민(Glu 또는 Q), 글리신(Gly 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소류신(Ile 또는 I), 류신(Leu 또는 L), 리신(Lys 또는 K), 메티오닌(Met 또는 M), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 프롤린(Pro 또는 P), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 트립토판(Trp 또는 W), 티로신(Tyr 또는 Y) 및 발린(Val 또는 V)의 L-이성체이다. 산화에 민감한 천연 아미노산의 경우, 펩티드모방체의 아미노산은 보존적 아미노산 치환으로 대체된다; 예를 들어, 메티오닌(M)은 이의 생물학적 활성에 영향을 주지 않고 노르류신(Nle)으로 대체된다.

본 발명에 따르는 "아미노산 유사체" 또는 "비천연 아미노산"이란 용어는 아미노산과 구조적으로 유사하고 펩티드모방체 매크로사이클의 형성에서 아미노산을 치환할 수 있는 분자를 지칭한다. 예로서, 오르니틴은 리신의 유사체이다.

아미노산 유사체는, 제한 없이, 아미노 및 카복실 그룹(예: α-아미노 β- 카복시산) 사이에 하나 이상의 추가의 메틸렌 그룹의 포함, 또는 유사하게 반응성인 그룹에 의한 아미노 또는 카복시 그룹의 치환(예를 들어, 2급 또는 3급 아민에 의한 1급 아민의 치환, 또는 에스테르에 의한 카복실 그룹의 치환)을 제외하고 본원에 정의된 바와 같은 아미노산과 구조적으로 동일한 화합물을 포함한다.

본 발명에 따르는 용어 "비천연 아미노산"은 자연에서 합성된 펩티드에서 통상적으로 발견되는 20개 아미노산 중의 하나는 아니지만, 대신에 화학적 합성 또는 천연 아미노산의 화학적 변형을 통해 생성되는 아미노산을 의미한다.

본 발명에 따르는 용어 "비필수" 아미노산 잔기는 본질적인 생물학적 또는 생화학적 활성(예: 수용체 결합 또는 활성화)을 폐지하지 않거나 실질적으로 폐지하지 않고 폴리펩티드의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기이다. 본 발명에 따르는 용어 "필수" 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 야생형 서열로부터 변경될 때, 폴리펩티드의 본질적인 생물학적 또는 생화학적 활성을 폐지하거나 실질적으로 폐지하는 잔기이다.

"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업계에 정의되어 있다. 이러한 계열은 염기성 측쇄(예: K, R, H), 산성 측쇄(예: D, E), 비하전된 극성 측쇄(예: G, N, Q, S, T, Y, C), 비극성 측쇄(예: A, V, L, I, P, F, M, W), 베타-분지된 측쇄(예: T, V, I) 및 방향족 측쇄(예: Y, F, W, H)를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 폴리펩티드 내의 예측된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 계열로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 허용되는 치환의 다른 예는 등전자 고려 사항(예: 메티오닌의 경우 노르류신) 또는 다른 특성(예: 페닐알라닌의 경우 2-티에닐알라닌)에 기초하는 치환이다.

용어 "생물학적 활성"은 본 발명의 매크로사이클의 구조적 및 기능적 특성을 포함한다. 생물학적 활성은, 예를 들어, 구조적 안정성, α-헬리시티, 표적에 대한 친화성, 단백질 분해에 대한 내성, 세포 침투성, 세포내 안정성, 생체내 안정성 또는 이들의 임의의 조합이다.

본 발명에 따르는 용어 "i", "i+3", "i+4" 및 "i+7"은 스테이플의 형성시 서로 공유 결합되는 펩티드 내의 아미노산의 위치를 의미한다. "i" 위치는 펩티드의 아미노 말단에 가장 가까운 아미노산의 위치를 의미한다. "i+3" 위치는 "i" 위치의 하류 3개의 아미노산(카복시-말단을 향한 추가의 3개의 아미노산)이고, "i+4" 위치는 "i" 위치의 하류 4개의 아미노산(카복시-말단을 향한 추가의 4개의 아미노산)이고 "i+7" 위치는 "i" 위치의 하류 7개의 아미노산이다. 스테이플의 형성시, 공유 결합은 위치 i의 아미노산과 위치 i+3, i+4 및 i+7의 아미노산 사이에 형성된다.

본 발명에 따르는 용어 "나선형 안정성"은 원편광 이색성(circular dichroism)에 의해 측정된 바와 같이 본원에서 제공된 펩티드모방체 매크로사이클에 의한 나선형 구조의 유지를 지칭한다.

용어 "알킬렌"은 2가 알킬(즉, -R-)을 의미한다.

용어 "알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 측쇄인 탄화수소 쇄를 의미한다. 알케닐 잔기는 지시된 수의 탄소 원자를 함유한다. 예를 들어, C2-C10은 그룹이 2 내지 10개(포괄적)의 탄소 원자를 갖는다는 것을 나타낸다.

용어 "알키닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 측쇄인 탄화수소 쇄를 지칭한다.

본 발명의 상세한 설명

펩티드모방체 매크로사이클(스테이플화 펩티드)

본 발명에 따르는 스테이플화 펩티드는 펩티드 내의 2개의 아미노산의 측쇄 사이에 공유 결합을 포함한다. 펩티드 스테이플링은 펩티드를 특정 형태로 물리적으로 제한하는 데(예: 펩티드를 본래의 α-나선형 상태로 물리적으로 제한하는 데) 사용될 수 있다. 이것은 또한 표적 분자와 상호작용하여 세포 침투를 증가시키고/시키거나 펩티드를 단백질 분해 분해로부터 보호하는 데 필요한 천연 구조를 유지하도록 도와줌으로써 펩티드의 약리학적 특성을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 따르는 스테이플화 펩티드의 설계는 Myd88/IRAK4/IRAK2 복합체의 상호작용의 억제에 기초한다. 이 단백질 복합체는, 일단 형성되면, NF-kB 경로의 활성화를 통해 IL-1β, TNFα 및 IL-6을 포함하는 몇 가지 전염증성 사이토카인의 합성을 유도한다(도 1). Myd88/IRAK4/IRAK2 복합체의 결정학 연구 및 Ala-스캔 가상 스크리닝은 IRAK4 표면과 상호작용하는 본 발명자들이 IRAK2 54-71을 칭명하는 IRAK2에서 α-나선의 존재를 나타냈다. IRAK4와 IRAK2 사이의 상호작용은 Myd88/IRAK4/IRAK2 복합체의 활성에 필수적이다. 채택된 전략은 IRAK2 α-나선을 모방하고 이러한 펩티드가 복합체 내에서 IRAK2 단백질을 대체함으로써 이의 형성 및 전염증성 사이토카인의 하류 생산을 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 이 서열의 스테이플화 펩티드를 개발하는 것이었다.

문헌(참조: Du et al., Cell Commun Signal, 2014)의 더 면밀한 연구는 IRAKM (IRAK3) 단백질이 IRAK2를 대체하여 복합체 Myd88/IRAK4/IRAK2를 억제하는 천연 단백질임을 나타냈다. IRAKM에 대한 결정학적 데이터의 부족은 IRAK2와 IRAKM 사이의 서열 정렬을 수행하게 하여 이 단백질이 IRAK2 54-71의 α-나선과 동일한 아미노산을 갖는지의 여부를 확인했다. 이 연구는 아미노산의 50%가 이 α-나선 내에서 보존된다는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명자들은 또한 본 발명자들이 IRAKM 66-83이라고 칭명한 IRAKM의 스테이플화 펩티드를 합성했다.

서열은 하기와 같이 정의된다:

IRAK2 54-71 : VSITRELLWWWGMRQATV (서열번호 1)

IRAKM 66-83 : KSGTRELLWSWAQKNKTI (서열번호 2)

IRAK2 54-71 (서열번호 1)의 위치 5-6, 9-11, 13-15, 바람직하게는 14-15의 아미노산 및 IRAKM 66-83 (서열번호 2)의 위치 5-6, 9-11, 13-15, 바람직하게는 13-14의 아미노산 각각은 필수적이며, 이는 상기 아미노산의 변형이 α-나선의 기능성 또는 활성 및 구조에 영향을 미칠 것이라는 것을 의미한다. 결과적으로, 본 발명에 따르는 설계된 스테이플화 펩티드는 아미노산 위치의 중요성을 고려하여 제조되었다.

합성 전략 및 스테이플링 위치를 확립한 후, 몇 가지 펩티드가 합성되었다. 그 중에서, 본 발명자들은 활성을 기재하기 위해 6개의 펩티드를 선택했다: IRAK2와 IRAKM의 α-나선의 두 개의 유사한 선형 서열과 이러한 서열로부터 유래된 4개의 스테이플화 펩티드. 생물학적 시험에서 음성 대조군 스테이플화 펩티드를 갖도록 추가의 펩티드를 합성했다. 본 발명자들이 Mock S로 명명한 이 펩티드는 IRAK2 54-71 (서열번호 1) 및 IRAKM 66-83 (서열번호 2)의 서열에 상응하지 않는 무작위 스테이플화 펩티드이다.

서열은 하기 표 1에 열거되었다.

산화에 민감한 위치 13의 메티오닌 'M'은 보존적 아미노산 치환인 노르류신 'Β'로 대체되었다.

서열번호 12 내지 서열번호 15에 대한 대안적인 구현예에서, 리신(K)은 오르니틴으로 대체될 수 있고/있거나 아스파르트산(D)은 글루탐산(E)으로 대체될 수 있다.

IRAK2 S1은 또한 본 발명에서 IRAK2-JMV6645로 명명된다.

IRAK2 S2는 또한 본 발명에서 IRAK2-JMV6646으로 명명된다.

IRAKM S1은 또한 본 발명에서 IRAKM-JMV6647로 명명된다.

IRAKM S2는 또한 본 발명에서 IRAKM-JMV6648로 명명된다.

"S5"로 제시된 아미노산은 하나의 이중 결합을 포함하는 모든 탄소 i 내지 i+4 가교결합제로 연결된 α-Me S5-펜테닐-알라닌 올레핀 아미노산이다.

"Ac"는 아세틸을 나타낸다.

"B"는 아미노산 노르류신을 나타낸다.

이러한 스테이플 펩티드는 또한 하기 표 2a 및 표 2b에 제시된다:

[표 2a]

[표 2b]

단백질로부터 유래된 작은 a-나선형 세그먼트 내의 공유 측쇄 대 측쇄 결합("스테이플링")은 올리고펩티드가 본래의 맥락에서 절제될 때 이들 올리고펩티드에 의해 용액에 나타나는 나선형 특성을 거의 또는 전혀 극복하지 못한다. 따라서, 짧은 탄화수소 쇄를 ≪스테이플≫로서 혼입시키면 헬리시티, 단백질 분해에 대한 내성 및 세포 침투성을 향상시키는 것으로 나타났다(참조: Lau et al., Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 91-102; Walensky and Bird, J. Med. Chem., 2014, 57, 6275-6288, Guerlavais and Sawyer, Annual reports in Med. Chem., 2014, 49, 331-345). 이어서, 펩티드모방체 매크로사이클은 그들의 상응하는 비가교결합된(예: 선형) 펩티드모방체 매크로사이클 또는 스테이플화 펩티드에 비해 개선된 약제학적 특성을 갖는다. 이러한 개선된 특성은 개선된 생체이용성 및 생체내 안정성(내가수분해성)을 포함한다.

스테이플화 펩티드가 본 발명에 따르는 경우와 같이 펩티드를 원래의 α-나선형 상태로 물리적으로 제한하는데 사용되는 경우, 펩티드의 i 및 i+3 위치 사이 또는 펩티드의 i 및 i+4 위치 사이 또는 펩티드의 i 및 i+7 위치 사이에 스테이플을 형성하는 것이 바람직하다. 이는 α 나선의 형성시, i와 i+3, i, i+4 및 i+7 위치의 아미노산의 아미노산 측쇄가 나선의 동일한 면 상에 위치하기 때문이다.

i와 i+3, i와 i+4 및 i와 i+7 위치 사이에 스테이플러가 있는 스테이플화 펩티드의 예가 도 2a에 제시된다.

본 발명의 제1 목적은 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커 및 다음

(i) 인간 서열 IRAK2 54-71 (서열번호 1)에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성(sequence identity)을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 13-15, 바람직하게는 14-15의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는

(ii) 인간 서열 IRAKM 66-83 (서열번호 2)에 대해 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 13-15, 바람직하게는 13-14의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드모방체 매크로사이클로서,

상기 펩티드모방체 매크로사이클이 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된 적어도 2개의 천연 또는 비천연 아미노산 및 α-나선을 포함하는, 펩티드모방체 매크로사이클이다.

특정 구현예에서, 펩티드모방체 매크로사이클은 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커 및 다음

(i) 인간 서열 IRAK2 54-71 (서열번호 1)에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖고, 위치 5-7, 9-11, 14-15의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는

(ii) 인간 서열 IRAKM 66-83 (서열번호 2)에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖고, 위치 5-7, 9-11, 13-14 위치의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,

상기 펩티드모방체 매크로사이클은 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된 적어도 2개의 천연 또는 비천연 아미노산 및 α-나선을 포함한다.

서열 동일성은 당업계에 공지된 방법에 따라서 서열 정렬에 의해 계산된다.

두 아미노산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적 비교를 위해 정렬된다. 예를 들어, 갭이 제2 아미노산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 서열의 서열에 도입될 수 있다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치의 아미노산 잔기를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기로 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 따라서 % 동일성 = 동일한 위치의 수/중복되는 위치의 총 수 X 100이다.

이 비교에서 서열은 동일한 길이이거나 길이가 다를 수 있다. 비교 창을 결정하기 위한 서열의 최적 정렬은 스미스 및 워터맨(Smith and Waterman)의 국소 상동성 알고리즘(J. Theor. Biol., 1981)에 의해, 니들맨 및 분쉬(Needleman and Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘(J. Mol. Biol, 1972)에 의해, 피어슨 및 립맨(Pearson and Lipman)의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988)을 통해 유사성을 검색함으로써, 이들 알고리즘의 컴퓨터화 구현(위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 제네틱 컴퓨터 그룹의 Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해 또는, 예를 들어, BLAST[2]와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 소프트웨어를 사용할 때, 갭 패널티 또는 익스텐션 패널티와 같은 디폴트 파라미터가 바람직하게 사용된다. 다양한 방법에 의해 생성된 (즉, 비교창에 대한 최고 퍼센트 동일성을 유도하는) 최상의 정렬이 선택된다.

특정 구현예에서, 펩티드모방체 매크로사이클은 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커 및 인간 서열 IRAK2 54-71 (서열번호 1)에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 14-15의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 인간 서열 IRAKM 66-83 (서열번호 2)에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 13-15, 바람직하게는 13-14의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

아미노산의 위치는 언급된 서열 서열번호에 따라 결정된다.

또 다른 특정 구현예에서, 펩티드모방체 매크로사이클은 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커 및 인간 서열 IRAK2 54-71 (서열번호 1)에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 14-15의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 인간 서열 IRAKM 66-83 (서열번호 2)에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 13-15, 바람직하게는 13-14의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 특정 구현예에서, 펩티드모방체 매크로사이클은 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커 및 인간 서열 IRAK2 54-71 (서열번호 1) 또는 인간 서열 IRAKM 66-83 (서열번호 2)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 13-15의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특별하고 바람직한 구현예에서, 펩티드모방체 매크로사이클은 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커 및 인간 서열 IRAK2 54-71 (서열번호 1)에 대해 65% 내지 90% 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 14-15의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 인간 서열 IRAKM 66-83 (서열번호 2)에 대해 65% 내지 90% 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 13-14의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

특별하고 바람직한 구현예에서, 펩티드모방체 매크로사이클은 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커 및 인간 서열 IRAK2 54-71 (서열번호 1)에 대해 68% 내지 90%의 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 14-15의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

특별하고 바람직한 구현예에서, 펩티드모방체 매크로사이클은 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커 및 인간 서열 IRAKM 66-83 (서열번호 2)에 대해 70% 내지 90%의 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 13-14의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

IRAK2 54-71 (서열번호 1)의 위치 5-6, 9-11, 13-15, 바람직하게는 14-15의 아미노산 및 IRAKM 66-83 (서열번호 2)의 위치 5-6, 9-11, 13-14의 아미노산 각각은 상기 정의된 바와 같은 펩티드모방체 매크로사이클의 생물학적 활성을 위한 필수 아미노산이다.

IRAK2 54-71 (서열번호 1)의 위치 5-7, 9-11, 14-15의 아미노산 및 IRAKM 66-83 (서열번호 2)의 위치 5-7, 9-11, 13-14의 아미노산 각각은 또한 상기 정의된 펩티드모방체 매크로사이클의 생물학적 활성을 위한 필수 아미노산으로 간주될 수 있다.

몇 가지 유형의 펩티드 스테이플 또는 매크로사이클 링커가 언급될 수 있다: (a) 락탐 브리지, (b) 탄화수소 브리지, (c) 금속 이온 클립; (d) 수소 결합 대용 물; 및 (e) 헤테로사이클 브릿지. 임의의 이러한 유형의 스테이플 또는 당업계에 공지된 다른 펩티드 스테이플이 본원에 기재된 임의의 펩티드와 함께 사용될 수 있다.

락탐 브릿지는 펩티드의 글루탐산 또는 아스파르트산 및 리신 (또는 이의 유사체 오르니틴) 잔기를 형성할 수 있다. 글루탐산 또는 아스파르트산 및 리신 잔기는 펩티드의 천연 서열에 존재할 수 있다. 대안적으로, 펩티드의 목적하는 위치에서 글루탐산, 아스파르트산 및/또는 리신 (또는 이의 유사체 오르니틴)에 대한 아미노산 치환은 또는 펩티드 합성 동안 목적하는 위치에 도입될 수 있다.

특정 구현예에서, 락탐 브릿지는 리신 및 아스파르트산 잔기를 사용하여 형성된다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 치환은 위치 i에서 리신 유도체 잔기로의 치환 및 위치 i+3 또는 위치 i+4 또는 위치 i+7, 바람직하게는 위치 i+4에서의 아스파르트산 유도체로의 치환을 포함할 수 있다.

탄화수소 브릿지(예: 올레핀 브릿지)는 펩티드의 두 알릴글리신 잔기 사이에 형성될 수 있다. 2개의 알릴글리신 잔기는 목적하는 위치에서 펩티드로 도입될 수 있고, 이어서 탄화수소 브릿지가 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 형성될 수 있다. 알릴글리신 잔기가 탄화수소 브릿지의 형성에 사용되는 경우, 치환은 바람직하게는 펩티드의 i 및 i+4 위치에서 이루어진다.

또 다른 특정 구현예에서, 탄화수소 브릿지는 또한 알라닌 유도체 S5, R8 및/또는 R5를 사용하여 형성될 수 있고, 예를 들어, "S5-올레핀 아미노산"은 (S)-a-(2'-펜테닐) 알라닌이고, "R8 올레핀 아미노산"은 (R)-a-(2'-옥테닐) 알라닌이고, "R5-올레핀 아미노산"은 (R)-a-(2'-펜테닐) 알라닌이다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 치환은 위치 i에서 알라닌 유도체 R5 잔기로의 치환 및 위치 i+3에서 알라닌 유도체 S5로의 치환을 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 하나 이상의 치환은 위치 i에서 알라닌 유도체 R8로의 치환 및 위치 i+4 및 i+7 중 하나에서 알라닌 유도체 S5로의 치환을 포함할 수 있다.

금속 이온 클립에서, 브릿지는 금속 이온(예: 레늄, 루테늄 또는 팔라듐 이온)과의 배위 결합을 통해 형성된다.

수소 결합 대용물에서, 탄화수소 브릿지는 펩티드의 아미노 말단 질소 원자와 아미노산 측쇄 사이에 형성된다.

본 발명의 특정 구현예에서, 락탐 브릿지 또는 탄화수소 브릿지가 매크로사이클 링커로서 사용된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 매크로사이클 형성 링커는 포화된 또는 불포화된, 및 임의로 치환된 탄화수소 쇄를 포함한다.

탄화수소 쇄는 6 내지 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 6 내지 14개의 탄소 원자를 함유할 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 탄화수소 쇄의 -CH₂- 그룹은 아미드 작용기 -NH-CO-로 대체되었다.

바람직한 구현예에서, 탄화수소 쇄는 불포화되고, 이는 그것이 이중 결합을 함유함을 의미한다.

특정 구현예에서, 탄화수소 쇄는 치환될 수 있다. 특히, 디하이드록시 화합물은 이중 쇄로부터 제조될 수 있고, 이들 디하이드록시 화합물은 치환될 수 있다.

특정 구현예에서, 매크로사이클 형성 링커는 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌 및 이들의 유도체, 바람직하게는 알킬렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 탄화수소 쇄를 포함한다.

특정 구현예에서, 매크로사이클 형성 링커는 포화 또는 불포화, 특히 -CH₂- 그룹이 아미드 작용기 -NH-CO-로 대체된 포화 탄화수소 쇄를 포함한다.

특정 구현예에서, 매크로사이클 링커는 -CH₂- 그룹이 아미드 작용기 -NH-CO-로 대체된 상기 정의된 바와 같은 탄화수소 쇄로 이루어진 락탐 브릿지이다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커는 6 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 알케닐이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커는 8 내지 12개의 탄소 원자, 예를 들어 8, 9, 10, 11 또는 12개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 알케닐이다.

특정 구현예에서, 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된 2개의 천연 또는 비천연 아미노산은 적어도 3개의 아미노산(i 및 i+3), 4개의 아미노산(i 및 i+4), 또는 7개의 아미노산(i 및 i+7), 바람직하게는 4개의 아미노산(i 및 i+4)에 의해 이격된다. 바람직하게는 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된 2개의 천연 또는 비천연 아미노산은 i 및 i+3 위치, 또는 i 및 i+4 위치, 또는 i 및 i+7 위치, 바람직하게는 i 및 i+4 위치에 존재한다.

특정 구현예에서, 매크로사이클 형성 링커는 서열 IRAK2 54-71 (서열번호 1)의 위치 4 (i) 및 8 (i+4)의 아미노산을 연결한다.

또 다른 특정 구현예에서, 매크로사이클 형성 링커는 서열 IRAKM 66-83 (서열번호 2)의 위치 4 (i) 및 8 (i+4)의 아미노산을 연결한다.

또 다른 특정 구현예에서, 매크로사이클 형성 링커는 서열 IRAK2 54-71 (서열번호 1)의 위치 8 (i) 및 12 (i+4)의 아미노산을 연결한다.

또 다른 특정 구현예에서, 매크로사이클 형성 링커는 서열 IRAKM 66-83 (서열번호 2)의 위치 8 (i) 및 12 (i+4)의 아미노산을 연결한다.

스테이플화 펩티드 서열 및 아미노산 위치는 도 2b에 제시된다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따르는 펩티드모방체 매크로사이클은 각각 독립적으로 하나의 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된 적어도 2쌍의 천연 또는 비천연 아미노산을 포함한다.

예를 들어, 펩티드는 제1 위치 i, 제1 위치 i+3, 제1 위치 i+4 및/또는 제1 위치 i+7에 하나 이상의 제1 치환(여기서, 상기 하나 이상의 제1 치환은 제1 위치 i의 아미노산과 제1 위치 i+3, 제1 위치 i+4 또는 제1 위치 i+7의 아미노산 사이에 공유 결합이 형성되게 한다); 및 제2 위치 i, 제2 위치 i+3, 제2 위치 i+4 및/또는 제2 위치 i+7에서의 하나 이상의 제2 치환(여기서, 상기 하나 이상의 제2 치환은 제2 위치 i의 아미노산과 제2 위치 i+3, 제2 위치 i+4 또는 제2 위치 i+7의 아미노산 사이에 공유 결합이 형성되게 한다)을 포함할 수 있다.

이러한 구현예에서, 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커는 제1 및 제2 매크로사이클 형성 링커를 포함하고, 여기서 상기 제1 매크로사이클 형성 링커는 제1 및 제2 아미노산을 연결하고, 상기 제2 매크로사이클 형성 링커는 제3 및 제4 아미노산을 연결하고, 상기 제1 아미노산은 상기 제2 아미노산의 상류이고, 상기 제2 아미노산은 상기 제3 아미노산의 상류이고, 상기 제3 아미노산은 상기 제4 아미노산의 상류이다. 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산에 의해 분리된 제1 및 제2 매크로사이클 형성 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커는 4 또는 5개의 아미노산에 의해 분리된 제1 및 제2 매크로사이클 형성 링커를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따르는 펩티드모방체 매크로사이클은

서열번호 3　(IRAK2 S1-JMV6645): Ac-X-REL-X-WWWGBRQA-NH₂

서열번호 4　(IRAK2 S2-JMV6646): Ac-RREL-X-WWW-X-BRQA-NH₂

서열번호 5 (IRAKM S1-JMV6647): Ac-KSG-X-REL-X-WSWAQK-NH₂

서열번호 6 (IRAKM S2-JMV6648): Ac-RREL-X-WSW-X-QK-NH₂

서열번호 10 (IRAK2-JM6650): Ac-VSI-X-REL-X-WWWGBRQA-NH₂

서열번호 11 (IRAKM-JM6649): Ac-KSG-X-REL-X-WSWAQKNKTI-NH₂(여기서, 비천연 아미노산 X는 올레핀에 의해 종결되고, 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된다), 또는

서열번호 12 (IRAK2-JMV6651): Ac-K-REL-D-WWWGBRQA-NH₂

서열번호 13 (IRAK2-JMV6652): Ac-VSI-K-REL-D-WWWGBRQATV-NH₂

서열번호 14 (IRAKM-JMV6653): Ac-KSG-K-REL-D-WSWAQK-NH₂

서열번호 15 (IRAKM-JMV6654): Ac-KSG-K-REL-D-WSWAQKNKTI-NH₂(여기서, 천연 아미노산 리신(K) 및 아스파르트산(D)은 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

서열번호 12 내지 15에 대한 대안적인 구현예에서, 리신(K)은 오르니틴으로 대체될 수 있고/있거나 아스파르트산(D)은 글루탐산(E)으로 대체될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 비천연 아미노산 X는 (S)-2(4-펜테닐)알라닌(S5로 표시됨) 또는 이의 유도체이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된 천연 아미노산은 리신 및 아스파르트산 잔기이다.

다음 바람직한 배열은 알라닌 유도체 S5, R8 및/또는 R5를 사용하여 펩티드에서 탄화수소 브릿지를 생성하는 데 사용될 수 있다:

- 제1 구현예에서, 하나 이상의 치환은 위치 i 및 i+4에서 알라닌 유도체 S5 잔기로의 치환을 포함할 수 있고;

- 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 치환은 위치 i에서 알라닌 유도체 R8로의 치환 및 위치 i+7에서 알라닌 유도체 S5로의 치환을 포함할 수 있으며;

- 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 치환은 위치 i에서 알라닌 유도체 R5 잔기로의 치환 및 위치 i+3에서 알라닌 유도체 S5로의 치환을 포함할 수 있다.

이러한 구성은 도 2a에 제시된다.

위치 i의 아미노산은 바람직하게는 위치 i+3, i+4 또는 i+7의 아미노산에 공유 결합된다.

바람직한 구현예에서, 하나 이상의 치환은 위치 i 및 i+4에서 알라닌 유도체 S5 잔기로의 치환을 포함한다.

특정 구현예에서, 비천연 아미노산인 α-Me S5-펜테닐-알라닌 올레핀 아미노산(S5)은 하나의 이중 결합을 포함하는 모든-탄소 i 내지 i+4 가교결합제에 의해 연결된다.

본 발명에 따르는 펩티드모방체 매크로사이클은 일반적으로 8 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 20개의 아미노산을 포함한다.

본 발명에 따르는 스테이플화 펩티드는 또한 본 발명의 펩티드의 기능적으로 동등한 변이체 또는 유사체를 포함할 수 있다. 이는 본원에 기재된 펩티드의 서열과 비교하여 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환을 갖는 펩티드를 갖는 펩티드를 포함한다. 치환은 바람직하게는 보존적 치환이며, 펩티드의 생물학적 또는 구조적 특성에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초할 수 있다. 따라서, 보존적 아미노산 변화는 원래 존재하는 것과 동일한 유형일 수 있는 특정 위치에서의 아미노산 변화를 의미한다; 즉, 소수성 아미노산을 소수성 아미노산으로, 염기성 아미노산을 염기성 아미노산으로 교환하는 등이다. 보존적 치환의 예는, 제한 없이, 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 비극성 (소수성) 잔기의 다른 것으로의 치환, 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이와 같은 하나의 극성 (친수성) 잔기의 다른 것으로의 치환, 리신, 아르기닌 또는 히스티틴과 같은 하나의 염기성 잔기의 다른 것으로의 치환, 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 하나의 산성 잔기의 다른 것으로의 치환, 이소류신, 류신 또는 발린과 같은 측쇄 아미노산의 다른 것으로의 치환, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판과 같은 하나의 방향족 아미노산의 다른 것으로의 치환을 포함할 수 있다.

이러한 보존적 변화의 예는 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 본 발명의 범위 내에 있다. 보존적 치환은 또한 생성되는 펩티드가 본 발명의 펩티드와 생물학적으로 기능적 등가물이다는 조건하에 비유도체화된 잔기 대신에 화학적으로 유도체화된 잔기의 사용을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 임의의 스테이플화 펩티드는 또한 다양한 화학적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 임의의 펩티드는 그의 카복시 말단에서 아미드화될 수 있다. 대안적으로 또는 또한, 임의의 펩티드는 그의 아미노 말단에서 아세틸화될 수 있다. 이러한 변형은 말단 아세틸화/아미드화가 천연 단백질의 보다 근접한 모방체를 생성하기 때문에 안정성을 증가시킬 수 있는 펩티드의 전체 전하를 감소시킨다. 따라서, 이러한 변형은 펩티드의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다. 본원에 기재된 임의의 펩티드에 대해서 다른 변형이 또한 이루어질 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 인산화, 글리코실화, PEG화, 지질화, 셀룰로스 또는 변형된 셀룰로스로 작용화될 수 있거나, 이들의 조합물일 수 있다.

특별하고 바람직한 구현예에서, 본 발명의 스테이플화 펩티드는 표적을 더 잘 인식하고 억제 효율을 개선시키기 위해 천연 서열에 가까운 서열로부터 설계된다.

본원에 기재된 임의의 펩티드는 검출 가능한 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 검출 가능한 라벨은 비오틴, 자성 라벨, 상자성 라벨, 방사성 라벨, 형광 라벨, 방사선불투과성(radiodense) 라벨, 효소 및 이들의 조합물일 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따르는 펩티드모방체 매크로사이클은 추가로 적어도 하나의 스페이서를 포함한다.

스페이서는 그의 세포 표적화 또는 침투를 개선하기 위해 스테이플화 펩티드와 추가의 펩티드 사이에 존재할 수 있다.

'스테이플화 펩티드의 세포 표적화 또는 침투를 개선시키기 위한 추가의 펩티드'로서, Tat, 페네트라틴 또는 Pep1과 같은 세포-침투성 펩티드가 언급될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따르는 펩티드모방체 매크로사이클은 추가로 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드를 포함한다.

펩티드모방체 매크로사이클의 제조 방법

펩티드모방체 매크로사이클을 형성시키는 다양한 방법이 당업계에 공지되어있다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 펩티드모방체 매크로사이클의 제조는 문헌[참조: Yu et al. (Chem. Soc. Rev., 2015, 44, 91)]에 기재되어 있다.

펩티드 합성은 고상 조건, AmphiSpheres 링크 아미드(Agilent) 및 Fmoc 주쇄 보호 그룹 화학을 사용하여 수동으로 수행될 수 있다. 천연 Fmoc-보호 아미노산(Iris biotech), 비천연 아미노산 S5, R5 및 R8 또는 천연 아미노산 Lys (K) 및 Asp (D)의 커플링을 위해, 아미노산의 등가물 및 커플링 시약의 특정 몰 비가 사용되었다. 합성 펩티드의 N-말단은 아세틸화되었고, C- 말단은 아민화되었다.

본원에 기재된 펩티드모방체 전구체 및 펩티드모방체 매크로사이클을 제조하는 하나의 바람직한 방식은 고상 펩티드 합성(SPPS)을 사용한다. C-말단 아미노산은 링커 분자를 갖는 산 불안정한 결합을 통해 가교결합된 폴리스티렌 수지에 부착된다. 이 수지는 합성에 사용되는 용매에 불용성이어서 비교적 간단하고 신속하게 과량의 시약 및 부산물을 세척 제거하도록 한다. N 말단은 산에서 안정하지만 염기에 의해 제거 가능한 Fmoc 그룹으로 보호된다. 측쇄 작용성 그룹은 필요에 따라 염기 안정성, 산 불안정성 그룹으로 보호된다.

비천연 아미노산 S5, R5 및 R8을 전구체 폴리펩티드에 도입한 후, 말단 올레핀을 복분해 촉매와 반응시켜 펩티드모방체 매크로사이클을 형성시킨다.

이러한 구현예에서, 매크로사이클화 시약 또는 매크로사이클 형성 시약은 안정화된 후기 전이 금속 카르벤 복합체 촉매, 예를 들어, VIII족 전이 금속 카르벤 촉매를 포함하지만 이에 제한되지 않는 복분해 촉매이다. 예를 들어, 이러한 촉매는 +2 산화 상태, 전자 수 16 및 5배위된 Ru 및 Os 금속 중심이다. 다양한 촉매가 문헌[참조: Grubbs et al., Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446-452; Yu et al., Nature 2011, 479, 88; and Peryshkov et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 20754]에 개시되어 있다.

일부 구현예에서, 접촉 단계는 양성자성 용매, 수성 용매, 유기 용매, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용매에서 수행된다. 예를 들어, 용매는 H2O, THF, THF/H2O, tBuOH/H2O, DMF, DIEA, CH3CN 또는 CH2Cl2, ClCH2CH2Cl 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, DMF가 사용된다.

펩티드는 표준 방법으로 정제되고 특성화된다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따르는 펩티드모방체 매크로사이클을 제조하는 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:

(i) 각 펩티드가 고체 지지체 상에 고정된, 보호 그룹을 포함하는 다수의 펩티드를 제공하는 단계;

(ii) 고정된 펩티드에 탈보호 시약을 노출시켜 고정된 펩티드의 적어도 일부로부터 보호 그룹을 제거하는 단계;

(iii) 탈보호 시약의 적어도 일부를 제거하는 단계;

(iv) 보호된 아미노산 잔기를 용매, 바람직하게는 DMF에 가용화시키는 단계;

(v) 커플링 시약, 바람직하게는 HATU를 사용하는 단계,

(vi) 염기 시약, 바람직하게는 DIEA를 사용하는 단계,

(vii) 보호된 아미노산 잔기 및 커플링 시약을 고정된 펩티드에 노출시켜, 활성화된 아미노산 잔기의 적어도 일부가 고정된 펩티드에 결합되어 새로 결합된 아미노산 잔기를 형성되도록 하는 단계; 및

(viii) 고정된 펩티드에 결합하지 않은 활성화된 아미노산 잔기의 적어도 일부를 제거하는 단계,

(ix) 최종 선형 폴리펩티드를 복분해 반응을 위한 그럽스 촉매(Grubb's catalyst) 시약에 노출시켜 펩티드모방체 매크로사이클을 생성시키는 단계,

(x) 최종 펩티드모방체 매크로사이클을 최종 탈보호를 위한 절단제에 노출시키는 단계,

(xi) 바람직하게는 95% 이상의 순도를 수득하기 위한 최종 펩티드모방체 매크로사이클의 침전, 정제 및 동결 건조.

락탐 브릿지를 갖는 스테이플화-펩티드의 제조의 경우, 최종 선형 폴리펩티드를 펩티드모방체 매크로사이클을 생성하는 복분해 반응을 위한 그럽스 촉매 시약에 노출시키는 단계 (ix)는 탈보호 단계 (ix)a에 이어 사이클릭화 단계 (ix)b로 대체된다.

조성물 및 조합물

본 발명의 또 다른 목적은 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 펩티드모방체 매크로사이클 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 약제학적 조성물은 보조제 또는 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 보조제 또는 추가 성분은 하나 이상의 펩티드의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다.

특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 펩티드모방체 매크로사이클 및 항염증성 화합물, 항대사 화합물, 세포 표적화 화합물, 바람직하게는 대식세포 표적화 화합물 및/또는 리포솜의 구성 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 성분 및/또는 활성제를 포함한다.

'항염증성 화합물'로서, 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID) 및 글루코코르티코이드(스테로이드성 항염증성 약물)가 언급될 수 있다.

'항대사 화합물'로서, 류마티스성 다발성 관절염에 사용되는 메토트렉세이트가 언급될 수 있다.

특정 구현예에서, 적어도 펩티드모방체 매크로사이클은 리포좀 또는 지질 제형에 제공될 수 있다.

약제학적 조성물은 주사(예: 근육내, 피하, 정맥내 또는 복강내 주사), 경구 투여, 국소 투여, 경피 투여, 비내 투여 또는 흡입용으로 제형화될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사, 특히 정맥내 주사용으로 제형화될 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 멸균 식염수, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트린, 한천, 펙틴, 식물성 오일, 탈이온수 및 이들의 혼합물을 포함한다.

약제학적 조성물은 하나 이상의 안정화제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 탄수화물(예: 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트린, 글루코스, 또는 이들의 조합물), 단백질, 예를 들어, 알부민 또는 카제인, 및/또는 완충제(예: 알칼리성 인산염)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 정의된 바와 같은 펩티드모방체 매크로사이클 및 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 추가 성분 및/또는 활성제를 포함하는 조합물이다. 펩티드모방체 매크로사이클 및 추가 성분은 동시적, 순차적 또는 연속적 사용을 위해 제조될 수 있다.

추가 성분 및/또는 활성제는 상기 정의된 바와 같다.

본원에 제공된 펩티드모방체 매크로사이클은 또한 이의 약제학적으로 허용되는 유도체 또는 프로드럭을 포함한다.

"약제학적으로 허용되는 유도체"는 수혜자에게 투여시 (직접 또는 간접적으로) 본 발명의 화합물을 제공할 수 있는 본 발명의 화합물의 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르, 에스테르의 염, 프로드럭 또는 기타 유도체를 의미한다.

일부 약제학적으로 허용되는 유도체는 펩티드모방체 매크로사이클의 수용성 또는 활성 수송을 증가시키는 화학 그룹을 포함한다.

약제학적 제제는 바람직하게는 단위 투여 형태일 수 있다. 단위 투여 형태는 패키징된 제제일 수 있으며, 패키지는 패키징된 정제, 캡슐 및 바이알 또는 앰풀 중 분말과 같은 별개의 양의 제제를 함유한다.

본 발명의 조성물이 펩티드모방체 매크로사이클 및 하나 이상의 추가의 치료제 또는 예방제의 조합물을 포함하는 경우, 화합물 및 추가의 제제는 모두 일반적으로 단일요법 섭생으로 투여된 용량의 약 1 내지 100%, 보다 바람직하게는 약 5 내지 95%의 용량 수준으로 존재해야 한다. 일부 구현예에서, 추가의 제제는 다중 투여 섭생의 일부로서 본 발명의 화합물로부터 별도로 투여된다. 대안적으로, 이들 제제는 단일 조성물로 본 발명의 화합물과 함께 혼합된 단일 투여 형태의 일부이다.

적합한 투여 경로는 경구, 정맥내, 직장, 에어로졸, 비경구, 안과, 폐, 경점막, 경피, 질, 귀, 비강 및 국소 투여를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 단지 예로서, 비경구 전달은 근육내, 피하, 정맥내, 골수내 주사뿐만 아니라 척수강내, 직접 심실내, 복강내, 림프관내 및 비강내 주사를 포함한다. 예로서, 펩티드모방체 매크로사이클은 표적화된 약물 전달 시스템, 예를 들어, 리포좀, 바람직하게는 양이온성 리포좀에 전달된다. 바람직한 구현예에서, 펩티드모방체 매크로사이클은 단핵 식세포 시스템(MPS)에 흡수된 리포솜으로 전달되고 염증 조직 또는 기관에 표적화된다.

특정 구현예에서, 적합한 투여 경로는 정맥내 투여를 포함한다.

용도

본 발명은 또한 약물로서 사용하기 위한 상기한 바와 같은 펩티드모방체 매크로사이클, 또는 본 발명에 따르는 약제학적 조성물 또는 조합물에 관한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 염증, 특히 급성 또는 만성 염증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기한 바와 같은 펩티드모방체 매크로사이클 또는 본 발명에 따르는 약제학적 조성물 또는 조합물에 관한 것이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 감염성 또는 자가 면역 질환, 특히 결핵, 패혈증, 수막염, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 크론병, 2형 당뇨병, 암, 심혈관 질환, 또는 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균과 같은 병원성 미생물에 의해 유발되는 질환을 포함하는 급성 및 만성 염증성 장애를 예방 또는 치료하는 데 사용하기 위한 상기한 바와 같은 펩티드모방체 매크로사이클, 또는 본 발명에 따르는 약제학적 조성물 또는 조합물에 관한 것이다.

투여 경로

실시예에서 추가로 예시된 바와 같이, 본 발명의 펩티드모방체 매크로사이클은 효율적이며, '동시', '예방적' 또는 '치유적' 상태에서의 사용에 따라 특이적 효율을 갖는다.

'동시' 상태란, 본 발명의 펩티드모방체 매크로사이클이 효율적이고, 염증의 급성 단계 또는 만성 단계 동안 훨씬 더 효율적이라는 것을 의미한다. 염증의 급성 단계는 염증 마커의 검출에 의해 예상될 수 있으며, 본 발명의 펩티드모방체 매크로사이클은 염증의 급성 단계 동안 또는 만성 염증 동안 유리하게 사용된다.

'예방적' 상태란, 본 발명의 펩티드모방체 매크로사이클이 효율적이고, 염증 전에 훨씬 더 효율적이라는 것을 의미한다. 염증은 염증 마커의 검출에 의해 예상될 수 있으며, 본 발명의 펩티드모방체 매크로사이클은 상기 염증의 급성 단계 전에, 예를 들어, 염증 전 적어도 12시간 전에, 바람직하게는 8시간 전에, 특히 4시간 전에 유리하게 사용된다.

'치유적' 상태란, 본 발명의 펩티드모방체 매크로사이클이 효율적이고, 염증 진단 후에 훨씬 더 효율적이라는 것을 의미한다. 염증은 염증 마커의 검출에 의해 예상될 수 있으며, 본 발명의 펩티드모방체 매크로사이클은 염증이 시작된 후, 예를 들어, 염증 후 적어도 4시간 후, 특히 8시간 후, 심지어 12시간 후에 유리하게 사용된다.

따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 염증, 특히 급성 또는 만성 염증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 펩티드모방체 매크로사이클, 또는 이를 함유하는 약제학적 조성물, 또는 상기 펩티드모방체 매크로사이클 및 항염증제 화합물, 세포 표적화 화합물, 바람직하게는 대식세포 표적화 화합물 및/또는 리포솜의 구성 화합물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 성분 및/또는 활성제의 조합물이고, 이때 상기 펩티드모방체 매크로사이클은 염증성 장애의 진단 전, 진단 동안 및/또는 진단 후에 투여된다

특정 구현예에서, 본 발명의 'IRAK2' 유형의 펩티드모방체 매크로사이클, 즉 서열번호 3(IRAK2 S1 JMV6645), 서열번호 4(IRAK2 S2 JMV6646) 및 서열번호 10(IRAK2-JM6650)는 동시 및/또는 치유적 상태에 유리하게 사용될 수 있다.

또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 'IRAKM' 유형의 펩티드모방체 매크로사이클, 즉 서열번호 5(IRAKM S1 JMV6647), 서열번호 6(IRAKM S2 JMV6648) 및 서열번호 11(IRAKM-JM6649)은 동시 및/또는 예방적 상태에 유리하게 사용될 수 있다.

도 1은 TRL 경로 체계이다.
도 2a는 펩티드모방체 매크로사이클 또는 스테이플화 펩티드의 표현이다.
도 2b는 스테이플화 펩티드 서열 및 아미노산 위치의 표현이다.
도 3은 스테이플화 펩티드 IRAK2 S1에 의한 소포체 응력의 억제이다.
도 3a는 튜니카마이신으로 처리한 후 RNA IRAK2 및 IRAK1의 발현 동역학을 나타내고,
도 3b는 ER 응력의 주요 유전자의 발현을 나타내고,
도 3c는 ER 응력의 유전자 발현 억제에 대한 IRAK2-S1 펩티드의 투여량 반응 효과를 나타내고,
도 3d는 IRAK2-S1 펩티드의 특이성을 나타낸다.
도 4는 스테이플화 펩티드 IRAK2-S1에 의한 대식세포 분화 동안 단핵구에 의해 생성된 IL-1β의 유도의 억제이다.
도 4a는 단핵구에 의해 생성된 IL-1β RNA의 발현 수준을 나타내고,
도 4b는 상청액 중의 IL-1β의 단백질 수준을 나타낸다.
도 5는 스테이플화 펩티드 IRAK2-S1 및 IRAKM-S1에 의한 전염증성 사이토카인의 LPS 유도의 억제이다.
도 6은 LPS 자극의 세 가지 다른 상태를 나타낸다: 단핵구의 LPS 자극 및 스테이플화 펩티드의 첨가가 동시에 수행되는 상태(동시 상태: A), 스테이플화 펩티드가 LPS 자극 6시간 전에 첨가되는 상태(예방적 상태: B) 또는 6시간 후에 첨가되는 상태(치유적 상태: C).
도 7은 LPS 자극과 동시(동시 상태: 7a), 6시간 전(예방적 상태: 7b) 또는 후(치유적 상태: 7c)에 스테이플화 펩티드를 첨가한 단핵구의 LPS 자극 상태 후 IL-6 및 TNFα 발현의 억제를 나타낸다.
도 8은 ≪동시≫ 상태에 대한 스테이플화-펩티드 IRAK2-JMV6649 및 IRAKM-JMV6650 효능의 평가이다.
도 9는 ≪예방적≫ 상태(9a) 및 ≪치유적≫ 상태(9b)에 대한 새로운 스테이플화 펩티드 IRAK2-JMV6649 및 IRAKM-JMV6650 효능의 평가이다.

하기 비제한적인 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공된다.

실시예

실시예 1: 스테이플화 펩티드 IRAK2 및 IRAKM의 제조 및 특성화

1.1 탄화수소 브릿지를 갖는 스테이플화-펩티드의 합성

IRAK2 및 IRAKM 스테이플화 펩티드의 합성은 SPPS 방법에 의해 수동으로 수행된다. 합성 규모는 0.4mmol/g으로 적재된 40-RAM amphisphere Rink 아미드 수지와 함께 0.1mmol이고, 과량의 5당량이 보호된 아미노산을 위해 사용된다. 커플링제인 0-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU)뿐만 아니라 모든 보호된 아미노산을 미리 DMF에 가용화시켜 0.5M 농도의 스톡 용액을 제조한다. 수지는 초기에 와동 진탕하에 15분 동안 DMF 6ml에서 팽창시킨다. 여과에 의한 DMF의 제거 후, Fmoc 그룹의 탈보호는 20% 피페리딘/DMF 용액(6ml)을 1분 동안 와동시키면서 첨가함으로써 수행된다. 이를 두 번 수행한다. 수지를 DMF로 3회 세척한다. 목적하는 아미노산(1ml, 0.5mmol), N,N-디이소소프로필에틸아민(DIEA)(0.164ml, 1mmol) 및 HATU 커플링제(1ml, 0.5mmol)를 연속적으로 첨가하고, 와동 진탕하에 5분 동안 교반한다. 이 작업은 두 커플링 사이에서 DMF 세척으로 두 번 수행된다. 아미노산 S5((S)-a-(2'-펜테닐) 알라닌)와 관련하여, 간단한 커플링을 1시간의 교반 시간으로 수행한다. 이러한 Fmoc의 탈보호 및 아미노산의 커플링은 예상되는 선형 서열이 수득될 때까지 반복한다. 일단 선형 펩티드가 합성되면, 복분해 반응은 2시간 동안 와동시키면서 DCE(6ml) 중 1세대 그럽스 촉매(0.04mmol)를 사용하여 개시한다. 이 반응은 각각의 복분해 반응 사이에서 DCM 세척으로 2회 수행된다.

일단 펩티드가 스테이플화되면, 최종 Fmoc 그룹의 탈보호가 수행되고, 아세틸화 반응이 10분 동안 DMF(1/1/8) 중의 DIEA의 존재하에 아세트산 무수물의 용액으로 수행된다. 펩티드의 최종 절단은 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 물(95/2.5/2.5)의 용액(10ml)의 존재하에 수행한다. 여과 후, 용액을 농축시키고, 디에틸 에테르에 용해시킨다. 침전물을 원심 분리하고 모액을 따라 낸다. 이를 두 번 수행한다. 침전물을 물에 용해시키고, 동결 건조하여 완전히 탈보호된 펩티드를 수득한다. 일단 동결 건조되면, 펩티드를 0.1% TFA의 존재하에 아세토 니트릴/물 용출하에 예비 역상 HPLC로 정제한다. 따라서, 스테이플화 펩티드가 바람직하게는 95% 초과의 순도로 수득된다.

1.2 락탐-브릿지를 이용한 스테이플화-펩티드의 합성

IRAK2 및 IRAKM 락탐 펩티드의 합성은 SPPS 방법에 의해 수동으로 수행된다. 합성 규모는 0.4mmol/g으로 적재된 40-RAM amphisphere Rink 아미드 수지와 함께 0.1mmol이고, 과량의 5당량이 보호된 아미노산을 위해 사용된다. 커플링제인 0-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU)뿐만 아니라 모든 보호된 아미노산을 미리 DMF에 가용화시켜 0.5M 농도의 스톡 용액을 제조한다. 수지는 초기에 와동 진탕하에 15분 동안 DMF 6ml에서 팽창시킨다. 여과에 의한 DMF의 제거 후, Fmoc 그룹의 탈보호는 20% 피페리딘/DMF 용액(6ml)을 1분 동안 와동시키면서 첨가함으로써 수행한다. 이를 두 번 수행한다. 수지를 DMF로 3회 세척한다. 목적하는 아미노산(1ml, 0.5mmol), N,N-디이소소프로필에틸아민(DIEA)(0.164ml, 1mmol) 및 HATU 커플링제(1ml, 0.5mmol)를 연속적으로 첨가하고, 와동 진탕하에 5분 동안 교반한다. 이 작업은 두 커플링 사이에서 DMF 세척으로 두 번 수행한다. 아미노산 fmoc-L-Lys(alloc)-OH 및 Fmoc-L-Asp(Oall)-OH와 관련하여, 간단한 커플링은 1시간의 교반 시간으로 수행한다. 이러한 Fmoc의 탈보호 및 아미노산의 커플링은 예상되는 선형 서열이 수득될 때까지 반복한다. 일단 선형 펩티드가 합성되면, alloc 및 알릴의 탈보호는 30분 동안 와동시키면서 DCE(6ml) 중 페닐실란(2mmol)과 함께 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(0.04mmol)을 사용하여 2회 개시한다. 이 반응은 각각의 탈보호 반응 사이에서 DCM 세척으로 2회 수행된다. 탈보호 후, 락탐은 N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)(0.100ml, 0.6mmol) 및 HATU 커플링제(0.6ml, 0.3mmol)로 실현된다.

일단 펩티드가 락탐이면, 최종 Fmoc 그룹의 탈보호가 수행되고, 아세틸화 반응이 10분 동안 DMF(1/1/8) 중의 DIEA의 존재하에 아세트산 무수물의 용액으로 수행된다. 펩티드의 최종 절단은 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 물(95/2.5/2.5)의 용액(10ml)의 존재하에 수행된다. 여과 후, 용액을 농축시키고, 디에틸 에테르에 용해시킨다. 침전물을 원심 분리하고 모액을 따라 낸다. 이를 두 번 수행한다. 침전물을 물에 용해시키고, 동결 건조하여 완전히 탈보호된 펩티드를 수득한다. 일단 동결 건조되면, 펩티드를 0.1% TFA의 존재하에 아세토니트릴/물 용출하에 예비 역상 HPLC로 정제한다. 따라서, 스테이플화 펩티드가 바람직하게는 95% 초과의 순도로 수득된다.

1.3 특성화

가교결합된 화합물의 정제는 역상 C18 칼럼(Waters)에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(PLC2250, Gilson)에 의해 달성되어 순수한 화합물을 수득했다. 순수 생성물의 화학적 조성은 LC/MS 질량 분광법(Waters 2790 HPLC 시스템과 인터페이스된 Micromass ZQ) 및 아미노산 분석(Beckman System Gold 고성능 액체 크로마토그래프)에 의해 확인되었다. 결과는 하기 표 3에 제시된다:

실시예 2: IRAK2 표적에서 스테이플화 펩티드의 특이성 및 효율 평가

2.1. 소포체 응력(ER 응력)의 활성화

세포에서, 대부분의 분비된 단백질 및 막 단백질은 그들이 운송되기 전에 중첩되어 조립되는 소포체에서 합성된다. 특정 조건하에서, 비정상적인 형태의 단백질은 소포체(ER)에 축적되어 응력(ER 응력) 및 UPR(비중첩된 단백질 반응)을 유도한다. ER 응력은 또한 NF-κB 전사 인자와 염증 유전자(전염증성 사이토카인)의 전사를 상이한 방식으로 활성화시켜 염증 반응에 기여한다. UPR 반응은 표적 유전자의 전사 활성화 및 번역의 철저한 억제를 포함하고, 이것은 중첩 및 분해 능력을증가시키고 소포체에 새로운 단백질의 도달을 제한한다. 연구는, IRAK2 분자가 소포체 응력 유도(참조: Benosmab et al., PLoS One 2013), IRAK1을 대신하여 IRAK4와 직접 상호작용하여 TLR(톨형 수용체) 후기 단계에 의해 매개되는 항바이러스 반응(참조: Kawagoe et al., Nature Immunol 2008)에 모두 필수적이다는 것을 보여준다. 스테이플화 펩티드 IRAK2의 인식 특이성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 8시간 및 24시간 동안 튜니카마이신(0.1㎍/ml)으로 치료하여 인간 단핵구 세포주 THP-1에서 ER 응력을 유도했다.

THP-1 세포를 10% 태아 송아지 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 L-글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 배양했다(300,000 세포/웰). 세포를 30분, 8시간 또는 24시간 동안 0.1㎍/mL의 튜니카마이신으로 처리했다. 펩티드를 4% DMSO에 용해시키고, 1 내지 20μM 범위의 농도로 사용했다. 총 세포 RNA를 miRNeasy 키트(Qiagen)로 추출한 후, 유전자 발현 수준은 Taqman 검정(Lifetechnology) 기술을 사용하여 RT-qPCR로 측정했다.

본 발명자들은 IRAK2가 IRAK1과 비교하여 8시간에 발현된 주요 키나제라는 것을 보여 주었다(도 3a). CHOP, BIP 및 GRP94 유전자의 발현 측정은 문헌에 따라 예상된 바와 같이, 8시간에서 ER 응력의 활성화를 확인했다(도 3b). 이 연구에서, 펩티드 IRAK2 Li, IRAKM Li, IRAK2 S1, IRAK2 S2(선형 펩티드의 경우 Li, 스테이플화 펩티드의 경우 S1 및 S2)를 시험했다. 스테이플화 펩티드 IRAK2 S1 및 튜니카마이신으로 단핵구를 동시에 치료하면 CHOP, GRP94 및 BIP의 발현을 용량 의존적 방식으로 차단하여 ER 응력의 억제를 암시한다(도 3c). 이 억제는 스테이플화 펩티드 농도 20μM에서, 대조군 스테이플화 펩티드(Mock S)가 아무런 효과가 없기 때문에 특이적이었다(도 3d). 본 결과는, IRAK2-S1 스테이플화 펩티드가 IRAK4와 특이적으로 상호작용하고, ER 응력의 활성화 효과를 억제한다는 것을 시사한다.

2.2 대식세포 분화의 유도 .

PMA(포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트)에 의한 단핵구 THP-1의 자극은 대식세포에서 그들의 분화를 유도한다. 이것은 IRAK 계열 구성원인 특정 TLR(2 및 4)의 발현, NF-κB 경로의 활성화 및 전염증성 사이토카인 IL-1β의 분비의 유도와 관련된다. IRAKI, IRAK2 및 IRAK4의 간섭에 대해 RNA를 사용하여, 이전의 연구는 mRNA 및 단백질 수준 모두에서 IL-1β의 발현 감소를 나타냈다(참조: Tiwari et al., Journal of Immunology 2011).

본 발명자들은 0.1㎍/ml PMA로 THP-1 단핵구를 48시간 동안 자극하여 대식세포로의 분화를 유도하고. 20μM 스테이플화 펩티드(IRAK2-S1 또는 Mock-S)로 처리했다.

THP1 세포를 10% 태아 송아지 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 L-글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 배양했다(300,000 세포/웰). 세포를 PMA 0.1㎍/ml로 48시간 동안 처리했다. 펩티드를 4% DMSO에 용해시키고, 20μM으로 사용했다. 펩티드는 PMA와 함께 첨가한다. 세포의 총 RNA를 miRNeasy 키트(Qiagen)로 추출하고, IL-1β의 발현 수준은 Taqman 검정(lifetechnology)을 사용하여 RT-qPCR 기술로 측정했다.

RNA를 추출한 후, 본 발명자들은 RT-qPCR에 의해 IL-1β의 RNA 발현 수준을 정량화했다(도 4a). ELISA 방법을 사용하여, 처리된 THP-1의 상청액에서 사이토카인 분비를 측정했다(도 4b). IRAK2-S1 펩티드는 20μM에서 IL-1β의 발현 및 생산을 차단할 수 있었다. 이 농도에서, 펩티드는 세포의 생존력 및 형태에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.

2.3 내독소에 대한 반응의 유도 .

염증은 감염 및/또는 조직 손상에 대한 반응에서 선천적 면역 세포에 의해 주로 채택되는 복잡한 생리학적 상태이다. 적응은 과염증을 조절하고 내독소 충격에 대한 숙주의 보호로서 기능하기 위해 존재한다. 이러한 보호 메커니즘의 고전적인 예 중 하나는 내독소 내성이다. 세포 또는 유기체가 저농도의 내독소(LPS)에 노출되는 현상은 내독소에 의한 새로운 자극에 반응할 수 없는 일시적인 저반응 상태로 들어간다; 환언하면, 그들은 내독소에 대한 일종의 "내성"을 개발한다. 단핵구 및 대식세포에서 시험관내 및 인간뿐만 아니라 동물 모델에서 생체내에서 모두 관찰되었다(참조: Biswas SK et al., Trends in Immunology, 2009). 내성 조건 하에서, IRAK-M (또는 IRAK-3)은 단핵구에서 과발현되며(참조: Escoll et al., BBRC, 2003), 톨형 수용체 의존적 MyD88(TLR2, TLR4, TLR7/8 및 TLR9)의 활성화를 부정적으로 조절한다. LPS에 대한 내성의 시험관내 THP-1 모델의 저반응은 저농도에서 첫 번째 용량에 이어, 18시간 간격의 강한 용량이 이어지는 LPS의 2회 연속 자극 후 TNFα와 IL-6의 감소된 발현을 특징으로 한다. 스테이플화 펩티드는 천연 미도솜 억제제 IRAK-M의 작용을 모방하여 THP1 스테이플화 IRAK-2 펩티드에의 단핵구의 노출이 LPS 내성 조건을 재현할 것으로 기대된다.

THP1 세포를 10% 태아 송아지 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 L-글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 배양했다(300,000 세포/웰). 세포를 TNFα에 대해 6시간 동안, IL-6 및 IL-1β에 대해 24시간 동안 0.1㎍/ml LPS로 처리했다. 펩티드를 4% DMSO에 가용화시키고, 5 및 20μM으로 사용했다. 펩티드는 LPS와 동시에 추가했다. 배양 상청액 중 사이토카인의 측정은 특정 ELISA 키트(eBioscience)를 사용하여 수행했다.

도 5는 LPS 자극(0.1㎍/ml) 후 THP1 세포에 의해 분비된 IL-1β, TNFa 및 IL-6 전염증성 사이토카인의 ELISA 검정을 도시한다. 스테이플화 펩티드 IRAK2-S1에 의한 세포의 치료는 용량 의존 방식으로 3개의 사이토카인의 발현을 감소시켰다(도 5a). IRAK2-S1과 50% 서열 상동성을 갖는 스테이플화 펩티드 IRAKM-S1로 THP-1을 치료함으로써 3개의 사이토카인의 발현을 억제하는 유사한 작용을 생성했다(도 5b).

이들 상이한 기능적 연구는, 본 발명에 따르는 스테이플화 펩티드가 MyD88/IRAK4/IRAK2 복합체를 억제함으로써 TNFα, IL-6 및 IL-1β 전염증성 사이토카인의 생산을 감소시키는 TLR 경로의 조절제임을 보여준다.

실시예 3: 3가지 상이한 상태: 동시, 치료적 또는 예방적 치료 후 스테이플화-펩티드 IRAK2-S1 및 IRAK-M-S1 효능의 평가

이전 실시예는 스테이플화-펩티드가 천연 미도솜 억제제 IRAK-M의 작용을 모방함을 보여준다. 실제로, LPS 자극 6시간 후에 스테이플화-펩티드 IRAK2-S1 및 IRAKM-S1에 THP1 단핵구를 노출시키면 LPS 내성 상태, 즉 IL-6 및 TNFα 사이토카인 생산의 억제를 재현한다는 것이 입증되었다. 본 실시예는 다른 실험 환경이 더 나은 효능을 나타낼 수 있는지 여부를 연구한다. LPS 자극의 3가지 다른 상태를 비교했다: 단핵구의 LPS 자극 및 스테이플화 펩티드의 첨가가 동시에 수행되는 상태(동시 상태: A), 스테이플화 펩티드가 LPS 자극 6시간 전에 첨가되는 상태(예방적 상태: B) 또는 LPS 자극 6시간 후에 첨가되는 상태(치유적 상태: C)(도 6).

시험된 모든 조건에 대해, THP-1 단핵구를 10% 태아 송아지 혈청; 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 L-글루타민을 함유하는 RPMI에서 배양했다(300,000 세포/웰). THP-1을 0.1㎍/mL의 LPS로 24시간 동안 처리하고, 스테이플화-펩티드 IRAK2-S1 및 IRAKM-S1을 1 내지 20μM으로 사용하고, 상태 A를 위해 동시에, 상태 B를 위해 LPS 6시간 전 및 상태 C를 위해 LPS 6시간 후에 첨가했다. 배양 상청액 중의 사이토카인의 정량화는 특정 IL-6 및 TNFα ELISA(eBioscience)로 수행했다.

결과는 도 7에 제시되어 있고, 이하에 개시된다:

· ≪동시≫ 상태(7a): TNFα 및 IL-6 발현의 용량-반응 억제가 시험된 2개의 펩티드에 대해 관찰되었다. 펩티드 IRAK2-S1 및 IRAKM-S1은 10μM 및 20μM에서 TNFα와 IL-6 사이토카인의 분비를 현저히 억제하며, IRAKM-S1은 20μM에서 더 큰 효과를 갖고, 이는 TNFα 및 IL-6 발현을 각각 최대 95% 및 90% 억제한다. 그러나, 이 농도에서, 펩티드 Mock-S 대조군은 15 내지 20%의 범위에서 TNFα 및 IL-6의 비특이적 억제를 유도한다(도 7a). IRAKM-S1은 단핵구에 의한 전염증성 사이토카인 생산을 감소시키기는 데 IRAK2-S1보다 더 효율적인 것으로 보인다.

· ≪예방적≫ 상태(7b): TNFα 및 IL-6 발현 수준의 용량 반응 억제가 IRAKM-S1에 대해 관찰되었고, 이는 20μM에서 TNFα(95%) 및 IL-6(90%)의 분비를 유의하게 억제한다. 이 농도에서 IRAK2-S1은 TNFα 및 II-6 발현을 15-20%만 억제한다. IRAK2-S1의 경우 10μM에서 사이토카인 발현의 억제는 관찰되지 않았다(도 7b). IRAK2-S1과 달리, 스테이플화 펩티드 IRAKM-S1은 TLR4 결합 후 THP-1 단핵구에서 전염증성 사이토카인의 발현에 대한 예방 효과를 나타냈다.

· ≪치유적≫ 조건(7c): TNFα의 발현 수준에 대한 용량-반응 억제가 IRAK2-S1에 대해 관찰되었고, 이는 TNFα 분비를 각각 10 및 20μM에서 30% 및 70%로 유의하게 억제한다. 20μM에서, IRAKM-S1은 TNFα 발현을 15-20%만 억제한다. IRAKM-S1의 경우 10μM에서 사이토카인 발현의 억제는 관찰되지 않았다(도 7c). 마지막으로, 모든 스테이플화 펩티드에 대한 이 상태에 대해 IL-6의 발현 수준에 대한 어떠한 영향도 관찰되지 않았다(도 7c). IRAKM-S1과 달리, 스테이플화 펩티드 IRAK2-S1은 TLR4 결합 후 THP-1 단핵구에서 TNFα의 발현에 대한 치유적 효과를 나타냈다.

이러한 결과는, IRAKM-S1이 치유적 상태보다 동시 및 예방적 상태에서 더 효율적이라는 것을 입증했다. IRAK2-S1은 예방적 상태보다 동시 및 치유적 상태에서 더 효율적이다. 당업자는 치료될 상태 및/또는 장애를 고려하고, 각 스테이플화-펩티드의 효율 및 거동에 기초하여 상기 스테이플화 펩티드의 투여 경로를 적응시킬 수 있을 것이다.

실시예 4: 새로운 스테이플화 펩티드 IRAK2-JMV6649 및 IRAKM-JMV6650의 평가

IRAK2 54-71 및 IRAKM 66-83의 천연 서열에 일치시키기 위한 새로운 스테이플화-펩티드 IRAK2-JMV6649 및 IRAKM-JMV6650의 시험관내 효능을 평가하고, 3가지 상이한 상태: 동시, 치유적 및 예방적 치료하에 IRAK2-S1 및 IRAK-M-S1을 비교했다.

시험된 모든 조건에 대해, THP-1 단핵구를 10% 태아 송아지 혈청; 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 L-글루타민을 함유하는 RPMI에서 배양했다(300,000 세포/웰). THP-1을 0.1㎍/mL의 LPS로 24시간 동안 처리한 후, 스테이플화-펩티드 IRAK2-S1, IRAK2-JMV6649, IRAKM-S1 및 IRAKM-JMV6650을 10 내지 20μM으로 사용하였고, ≪동시≫ 상태를 위해 동시에, ≪예방적≫ 상태를 위해 LPS 6시간 전에, ≪치유적≫ 상태를 위해 LPS 6시간 후에 첨가했다. ELISA(eBioscience)를 사용하여, IL-6 및 TNFa 정량화를 단핵구 배양 상청액에서 수행했다.

"동시" 상태에 대한 결과는 도 8에 제시되어 있고, 이하 개시된다:

≪동시≫ 상태: 20μM에서 IRAKM-JMV6649는 IRAKM-S1 펩티드와 비교하여 IL-6의 분비를 70% 이상 감소시키지만, TNFα 발현에 대한 부가적 억제 효과는 나타내지 않았다(도 8a). IRAK2 펩티드의 효능은 JMV6650 변형으로 더 이상 관찰되지 않았다(도 8b).

"예방적" 및 "치유적" 상태에 대한 결과는 도 9에 제시되어 있고, 이하 개시된다:

≪예방적≫ 상태: IRAKM-JMV6649 펩티드는 10μM에서 60%, 20μM에서 80%의 부가적 억제와 함께 IRAKM-S1 펩티드보다 IL-6 발현의 양호한 억제를 유도한다. TNFα 발현의 억제는 10μM에서 20%에 도달하는 변형된 펩티드 IRAKM-JMV6649보다 더 크다(도 9a). IRAK2 펩티드의 효능은 JMV6650 변형으로 더 이상 관찰되지 않았다(데이터는 제시되지 않음).

≪치유적≫ 상태: 새로운 펩티드는 사이토카인 발현에 대한 부가적인 억제를 나타내지 않았다. IRAK2-JMV6650은 TNFα 생산을 IRAK2-S1보다 더 효율적으로 감소시키는 경향이 있지만, 그것은 유의하지 않았고, 그것은 IL-6 발현에 대해 20μM에서 IRAK2-S1로서 작용한다. IRAKM-JMV6649는 IRAKM-S1과 비교하여 20μM에서 TNFα 및 IL6 발현의 억제를 증가시키는 경향이 있으나, 또한 그것은 유의하지 않았다(도 9b).

이러한 결과는 IRAKM 펩티드 서열에 대한 화학적 변형이 ≪동시≫ 및 ≪예방적≫ 상태 치료 하에서 단핵구에 의한 IL-6 발현의 억제에 이점을 제공한다는 것을 입증했다. IRAK2 펩티드의 서열에 도입된 것들은 시험된 모든 치료 상태에서 임의의 유의한 이점을 일으키지 않았다.

이러한 모든 결과는, 본 발명에 따르는 스테이플화 펩티드가 효율적이지만 거동의 특이성을 갖는다, 즉 이들 중 일부는 예방적 상태(염증 진단 전)에서 더 효율적이고/이거나 동시 상태(염증 동안)에서 더 효율적이고/이거나 치유적 상태(염증 진단 후)에서 더 효율적임을 입증하였다. 스테이플화 펩티드 IRAK2-JMV6650 및 IRAKM-JMV6649는 IRAK2-S1 또는 IRAKM-S1만큼 효율적이어서 IRAK2 54-71 및 IRAKM 66-83의 천연 서열에 일치시키기 위한 Ac 및 NH₂ 말단의 변형이 그들의 효율에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITE DE MONTPELLIER CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE(C.N.R.S.) CENTRE HOSPITALIER REGIONAL UNIVERSITAIRE DE MONTPELLIER INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) ECOLE NATIONALE SUPERIEURE DE CHIMIE DE MONTPELLIER <120> NEW STAPLED-PEPTIDES AND USES THEREOF <130> IPA190820-FR <150> EP 16306788.7 <151> 2016-12-22 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linear peptide IRAK2 54-71 <400> 1 Val Ser Ile Thr Arg Glu Leu Leu Trp Trp Trp Gly Met Arg Gln Ala 1 5 10 15 Thr Val <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linear peptide IRAKM 66-83 <400> 2 Lys Ser Gly Thr Arg Glu Leu Leu Trp Ser Trp Ala Gln Lys Asn Lys 1 5 10 15 Thr Ile <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> artificial <220> <223> stapled peptide IRAK2 S1 (JMV6645) <220> <221> BINDING <222> (1)..(5) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is a (S)-2-(4'-pentenyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is a (S)-2-(4'-pentenyl)alanine <220> 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(S)-2-(4'-pentenyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> AMIDATION <400> 5 Lys Ser Gly Xaa Arg Glu Leu Xaa Trp Ser Trp Ala Gln Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> stapled peptide IRAKM S2 (JMV6648) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> BINDING <222> (5)..(9) <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa is a (S)-2-(4'-pentenyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Xaa is a (S)-2-(4'-pentenyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> AMIDATION <400> 6 Arg Arg Glu Leu Xaa Trp Ser Trp Xaa Gln Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linear peptide IRAK2 Li <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa is Nle <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> AMIDATION <400> 7 Arg Arg Glu Leu Leu Trp Trp Trp Gly Xaa Arg Gln Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linear peptide IRAKM Li <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> AMIDATION <400> 8 Arg Arg Glu Leu Leu Trp Ser Trp Ala Gln Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> artificial <220> <223> stapled peptide Mock-S <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> BINDING <222> (4)..(8) <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is a (S)-2-(4'-pentenyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is a (S)-2-(4'-pentenyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> AMIDATION <400> 9 Ile Thr Phe Xaa Asn Leu Leu Xaa Tyr Tyr Gly Pro 1 5 10 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> artificial <220> <223> stapled peptide IRAK2 (JMV6650) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> BINDING <222> (4)..(8) <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is a (S)-2-(4'-pentenyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is a (S)-2-(4'-pentenyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa is Nle <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> AMIDATION <400> 10 Val Ser Ile Xaa Arg Glu Leu Xaa Trp Trp Trp Gly Xaa Arg Gln Ala 1 5 10 15 Thr Val <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> artificial <220> <223> stapled peptide IRAKM (JMV6649) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> BINDING <222> (4)..(8) <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Xaa is a (S)-2-(4'-pentenyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa is a (S)-2-(4'-pentenyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> AMIDATION <400> 11 Lys Ser Gly Xaa Arg Glu Leu Xaa Trp Ser Trp Ala Gln Lys Asn Lys 1 5 10 15 Thr Ile <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> artificial <220> <223> stapled peptide IRAK2 (JMV6651) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> BINDING <222> (1)..(5) <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa is Nle <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> AMIDATION <400> 12 Lys Arg Glu Leu Asp Trp Trp Trp Gly Xaa Arg Gln Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> artificial <220> <223> stapled peptide IRAK2 (JMV6652) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> BINDING <222> (4)..(8) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Xaa is Nle <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> AMIDATION <400> 13 Val Ser Ile Lys Arg Glu Leu Asp Trp Trp Trp Gly Xaa Arg Gln Ala 1 5 10 15 Thr Val <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> stapled peptide IRAKM (JMV6653) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> BINDING <222> (4)..(8) <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> AMIDATION <400> 14 Lys Ser Gly Lys Arg Glu Leu Asp Trp Ser Trp Ala Gln Lys 1 5 10 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> artificial <220> <223> stapled peptide IRAKM (JMV6654) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> BINDING <222> (4)..(8) <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> AMIDATION <400> 15 Lys Ser Gly Lys Arg Glu Leu Asp Trp Ser Trp Ala Gln Lys Asn Lys 1 5 10 15 Thr Ile

Claims

적어도 하나의 매크로사이클 형성 링커(macrocycle-forming linker) 및 다음
(i) 인간 서열 IRAK2 54-71 (서열번호 1)에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성(sequence identity)을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 14-15의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는
(ii) 인간 서열 IRAKM 66-83 (서열번호 2)에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖고, 위치 5-6, 9-11, 13-14의 아미노산과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 8 내지 30개 아미노산의 펩티드모방체 매크로사이클(peptidomimetic macrocycle)로서, 상기 펩티드모방체 매크로사이클이 i 및 i+3 위치, 또는 i 및 i+4 위치, 또는 i 및 i+7 위치에서 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된 적어도 2개의 천연 또는 비천연 아미노산 및 α-나선을 포함하는, 펩티드모방체 매크로사이클.
제1항에 있어서, 상기 매크로사이클 형성 링커가 포화된 또는 불포화된, 및 임의로 치환된 탄화수소 쇄를 포함하는, 펩티드모방체 매크로사이클.
제2항에 있어서, 상기 매크로사이클 형성 링커가 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌 및 이들의 유도체, 바람직하게는 알킬렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 탄화수소 쇄를 포함하는, 펩티드모방체 매크로사이클.
제2항에 있어서, 상기 탄화수소 쇄의 -CH₂- 그룹이 아미드 작용기 -NH-CO-로 대체되는, 펩티드모방체 매크로사이클.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된 상기 2개의 천연 또는 비천연 아미노산이 i 및 i+4 위치에 있는, 펩티드모방체 매크로사이클.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 3 (IRAK2 S1): Ac-X-REL-X-WWWGBRQA-NH₂
서열번호 4 (IRAK2 S2): Ac-RREL-X-WWW-X-BRQA-NH₂
서열번호 5 (IRAKM S1): Ac-KSG-X-REL-X-WSWAQK-NH₂
서열번호 6 (IRAKM S2): Ac-RREL-X-WSW-X-QK-NH₂
서열번호 10 (IRAK2-JMV6650) Ac-VSI-X-REL-X-WWWGBRQA-NH₂
서열번호 11 (IRAKM-JMV6649) Ac-KSG-X-REL-X-WSWAQKNKTI-NH₂(여기서, 비천연 아미노산 X는 올레핀에 의해 종결되고, 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된다), 또는
서열번호 12 (IRAK2-JMV6651): Ac-K-REL-D-WWWGBRQA-NH₂
서열번호 13 (IRAK2-JMV6652): Ac-VSI-K-REL-D-WWWGBRQATV-NH₂
서열번호 14 (IRAKM-JMV6653): Ac-KSG-K-REL-D-WSWAQK-NH₂
서열번호 15 (IRAKM-JMV6654): Ac-KSG-K-REL-D-WSWAQKNKTI-NH₂(여기서, 천연 아미노산 리신(K) 및 아스파르트산(D)은 매크로사이클 형성 링커에 의해 가교결합된다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 펩티드모방체 매크로사이클.
제6항에 있어서, 비천연 아미노산 X가 (S)-2-(4'-펜테닐)알라닌 또는 이의 유도체인, 펩티드모방체 매크로사이클.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 스페이서를 추가로 포함하는, 펩티드모방체 매크로사이클.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포 침투성 펩티드를 추가로 포함하는, 펩티드모방체 매크로사이클.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 펩티드모방체 매크로사이클 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 항염증성 화합물, 세포 표적화 화합물, 바람직하게는 대식세포 표적화 화합물 및/또는 리포솜의 구성 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 성분 및/또는 활성제를 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드모방체 매크로사이클 및 제11항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 추가 성분 및/또는 활성제를 포함하는 조합물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항, 또는 제10항 또는 제11항, 또는 제12항에 있어서, 약물로서 사용하기 위한, 펩티드모방체 매크로사이클, 또는 약제학적 조성물, 또는 조합물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항, 또는 제10항 또는 제11항, 또는 제12항에 있어서, 염증, 특히 급성 또는 만성 염증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 펩티드모방체 매크로사이클, 또는 약제학적 조성물, 또는 조합물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항, 또는 제10항 또는 제11항, 또는 제12항에 있어서, 감염성 또는 자가 면역 질환, 특히 결핵, 패혈증, 수막염, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 크론병, 2형 당뇨병, 암, 심혈관 질환, 또는 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균과 같은 병원성 미생물에 의해 유발되는 질환을 포함하는 급성 및 만성 염증성 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 펩티드모방체 매크로사이클, 또는 약제학적 조성물, 또는 조합물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항, 또는 제10항 또는 제11항, 또는 제12항에 있어서, 상기 펩티드모방체 매크로사이클이 염증성 장애의 진단 전, 진단 동안 및/또는 진단 후에 투여되는, 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따라서 사용하기 위한, 펩티드모방체 매크로사이클, 또는 약제학적 조성물, 또는 조합물.