CN111183149A - 用于治疗自身免疫疾病的细胞因子缀合物 - Google Patents

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杰罗德·普塔钦
卡罗利纳·E·卡法罗
马科斯·米拉
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Sissox
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Abstract

本文公开了白介素(IL)缀合物(例如，IL‑2缀合物)以及在治疗一种或多种适应症中的用途。本文还描述了包含一种或多种所述白介素缀合物(例如，IL‑2缀合物)的药物组合物和试剂盒。

Description

用于治疗自身免疫疾病的细胞因子缀合物
交叉引用
本申请要求2017年8月3日提交的第62/540,781号美国临时申请的权益，该美国临时申请通过引用整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。创建于2018年8月3日的所述ASCII副本被命名为46085-710_602_SL.txt，大小为3,703个字节。
背景技术
T细胞的不同群体调节免疫系统，以维持免疫稳态和耐受性。例如，调节性T(Treg)细胞通过防止病理性自身反应性而防止免疫系统的不适当应答，而细胞毒性T细胞则靶向并破坏感染的细胞和/或癌细胞。在一些情况下，对T细胞的不同群体的调节为疾病或适应症的治疗提供了选项。
发明内容
在某些实施方案中，本文公开了细胞因子缀合物以及在治疗一种或多种适应症中的用途。在一些实施方案中，本文描述的还包括白介素2(IL-2)缀合物以及在治疗一种或多种适应症中的用途。在一些情况下，所述一种或多种适应症包括自身免疫疾病。在一些情况下，本文描述了用于调节IL-2与IL-2受体之间的相互作用以特异性刺激或扩充调节性T细胞(Treg细胞)群体的IL-2缀合物。在一些情况下，本文描述了具有延长的体内半衰期、降低的毒性和/或扩大的治疗窗的IL-2缀合物。在另外的情况下，本文描述了包含一种或多种本文所述的白介素缀合物(例如，IL-2缀合物)的药物组合物和试剂盒。
在某些实施方案中，本文公开了在某位置处包含至少一个非天然氨基酸的分离并修饰的白介素2(IL-2)多肽，其降低对白介素2受体βγ(IL-2Rβγ)的受体信号传导效力或减少IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集，但保留白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)的显著激活，其中所述降低的受体信号传导效力是相比于野生型IL-2多肽与IL-2Rβγ之间的受体信号传导效力，并且其中所述募集是相比于野生型IL-2多肽对IL-2Rγ亚基的募集。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、R81、P82、R83、D84、S87、N88、N89、V91、I92、L94、E95、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112、T113、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、R81、D84、S87、N88、V91、I92、L94、E95、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、P82、R83、N89、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112和T113，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、D84、N88、E95和Q126，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9和H16，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自Q22、N26、N88和Q126，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自E15、D20、D84和E95，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自L12、L19和M23，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自Q22和N26，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸：是赖氨酸类似物；是半胱氨酸类似物或组氨酸类似物；包含芳族侧链；包含叠氮基；包含炔烃基团；或包含醛或酮基团。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸不包含芳族侧链。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸包括N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)、对碘-L-苯丙氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、膦酰基酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒基)丙酸或硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸通过正交tRNA合成酶/tRNA对掺入所述修饰的IL-2多肽中。在一些实施方案中，所述正交tRNA合成酶/tRNA对的正交tRNA包含至少一个非天然核碱基。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽通过所述至少一个非天然氨基酸共价连接至缀合部分。在一些实施方案中，所述缀合部分包含水溶性聚合物、脂质、蛋白质或肽。在一些实施方案中，该水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰基吗啉)或其组合。在一些实施方案中，该水溶性聚合物包括PEG分子。在一些实施方案中，该PEG分子是直链PEG。在一些实施方案中，该PEG分子是支链PEG。在一些实施方案中，该水溶性聚合物包括多糖。在一些实施方案中，该多糖包括葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。在一些实施方案中，所述脂质包括脂肪酸。在一些实施方案中，该脂肪酸包含约6至约26个碳原子、约6至约24个碳原子、约6至约22个碳原子、约6至约20个碳原子、约6至约18个碳原子、约20至约26个碳原子、约12至约26个碳原子、约12至约24个碳原子、约12至约22个碳原子、约12至约20个碳原子或约12至约18个碳原子。在一些实施方案中，该脂肪酸是饱和脂肪酸。在一些实施方案中，所述蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白或运甲状腺素蛋白。在一些实施方案中，该蛋白质包括抗体或其结合片段。在一些实施方案中，该抗体或其结合片段包括抗体的Fc部分。在一些实施方案中，所述肽包括XTEN肽、富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白(GLK)聚合物。在一些实施方案中，所述缀合部分通过连接体间接结合至所述修饰的IL-2的所述至少一个非天然氨基酸。在一些实施方案中，该连接体包括同双官能连接体、异双官能连接体、零长度连接体，可裂解或不可裂解的二肽连接体、马来酰亚胺基团、间隔基或其组合。在一些实施方案中，所述分离并修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低，并且受体信号传导效力的降低是相对于野生型IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍或更多。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽是：全长IL-2多肽的功能活性片段；重组IL-2多肽；或重组人IL-2多肽。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽包含N-末端缺失、C-末端缺失或其组合。在一些实施方案中，该N-末端缺失包括从N-末端缺失前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30个残基，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些实施方案中，该C-末端缺失包括从C-末端缺失最后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20个或更多个残基，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些实施方案中，所述功能活性片段包含IL-2区域10-133、20-133、30-133、10-130、20-130、30-130、10-125、20-125、30-125、1-130或1-125，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽与SEQ ID NO:1具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低的修饰的IL-2多肽能够扩充CD4+T调节性(Treg)细胞。在一些实施方案中，所述缀合部分损害或阻断IL-2与IL-2Rβγ的受体信号转导效力，或减少IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2/IL-2Rαβγ复合物引起的CD4+Treg细胞增殖等于或大于野生型IL-2多肽引起的增殖。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2/IL-2Rαβγ复合物诱导CD4+Treg细胞增殖为足以调节动物模型中的疾病过程的群体。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽表现出对IL-2Rβγ的第一受体信号传导效力和对IL-2Rαβγ的第二受体信号传导效力，其中第一受体信号传导效力比第二受体信号传导效力低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更多。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽的第一受体信号传导效力低于野生型IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽的第二受体信号传导效力低于野生型IL-2多肽对IL-2Rαβγ的受体信号传导效力。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽进一步提供IL-2Rα亚基向IL-2多肽的募集的增加，从而导致白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)的活化，其中该募集的增加是相比于野生型IL-2多肽对IL-2Rα亚基的募集。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽进一步提供IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集的减少，其中该募集的减少是相比于野生型IL-2多肽对IL-2Rβ亚基和/或IL-2Rγ亚基的募集。
在某些实施方案中，本文公开了在某位置处包含至少一个非天然氨基酸的分离并修饰的白介素2(IL-2)多肽，其增加IL-2Rα亚基向IL-2多肽的募集，从而导致白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)的活化，其中该募集的增加是相比于野生型IL-2多肽对IL-2Rα亚基的募集。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、R81、P82、R83、D84、S87、N88、N89、V91、I92、L94、E95、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112、T113、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、R81、D84、S87、N88、V91、I92、L94、E95、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、P82、R83、N89、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112和T113，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、D84、N88、E95和Q126，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9和H16，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自Q22、N26、N88和Q126，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自E15、D20、D84和E95，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自L12、L19和M23，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ IDNO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自Q22和N26，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸：是赖氨酸类似物；是半胱氨酸类似物或组氨酸类似物；包含芳族侧链；包含叠氮基；包含炔烃基团；或包含醛或酮基团。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸不包含芳族侧链。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸包括N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)、对碘-L-苯丙氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、膦酰基酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒基)丙酸或硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸通过正交tRNA合成酶/tRNA对掺入所述修饰的IL-2多肽中。在一些实施方案中，所述正交tRNA合成酶/tRNA对的正交tRNA包含至少一个非天然核碱基。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽通过所述至少一个非天然氨基酸共价连接至缀合部分。在一些实施方案中，所述缀合部分包含水溶性聚合物、脂质、蛋白质或肽。在一些实施方案中，该水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰基吗啉)或其组合。在一些实施方案中，该水溶性聚合物包括PEG分子。在一些实施方案中，该PEG分子是直链PEG。在一些实施方案中，该PEG分子是支链PEG。在一些实施方案中，该水溶性聚合物包括多糖。在一些实施方案中，该多糖包括葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。在一些实施方案中，所述脂质包括脂肪酸。在一些实施方案中，该脂肪酸包含约6至约26个碳原子、约6至约24个碳原子、约6至约22个碳原子、约6至约20个碳原子、约6至约18个碳原子、约20至约26个碳原子、约12至约26个碳原子、约12至约24个碳原子、约12至约22个碳原子、约12至约20个碳原子或约12至约18个碳原子。在一些实施方案中，该脂肪酸是饱和脂肪酸。在一些实施方案中，所述蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白或运甲状腺素蛋白。在一些实施方案中，该蛋白质包括抗体或其结合片段。在一些实施方案中，该抗体或其结合片段包括抗体的Fc部分。在一些实施方案中，所述肽包括XTEN肽、富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白(GLK)聚合物。在一些实施方案中，所述缀合部分通过连接体间接结合至所述修饰的IL-2的所述至少一个非天然氨基酸。在一些实施方案中，该连接体包括同双官能连接体、异双官能连接体、零长度连接体，可裂解或不可裂解的二肽连接体、马来酰亚胺基团、间隔基或其组合。在一些实施方案中，所述分离并修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低，并且受体信号传导效力的降低是相对于野生型IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍或更多。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽是：全长IL-2多肽的功能活性片段；重组IL-2多肽；或重组人IL-2多肽。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽包含N-末端缺失、C-末端缺失或其组合。在一些实施方案中，该N-末端缺失包括从N-末端缺失前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30个残基，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些实施方案中，该C-末端缺失包括从C-末端缺失最后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20个或更多个残基，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些实施方案中，所述功能活性片段包含IL-2区域10-133、20-133、30-133、10-130、20-130、30-130、10-125、20-125、30-125、1-130或1-125，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽与SEQ ID NO:1具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低的修饰的IL-2多肽能够扩充CD4+T调节性(Treg)细胞。在一些实施方案中，所述缀合部分损害或阻断IL-2与IL-2Rβγ的受体信号转导效力，或减少IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2/IL-2Rαβγ复合物引起的CD4+Treg细胞增殖等于或大于野生型IL-2多肽引起的增殖。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2/IL-2Rαβγ复合物诱导CD4+Treg细胞增殖为足以调节动物模型中的疾病过程的群体。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽表现出对IL-2Rβγ的第一受体信号传导效力和对IL-2Rαβγ的第二受体信号传导效力，其中第一受体信号传导效力比第二受体信号传导效力低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更多。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽的第一受体信号传导效力低于野生型IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽的第二受体信号传导效力低于野生型IL-2多肽对IL-2Rαβγ的受体信号传导效力。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽进一步提供IL-2Rα亚基向IL-2多肽的募集的增加，从而导致白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)的活化，其中该募集的增加是相比于野生型IL-2多肽对IL-2Rα亚基的募集。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽进一步提供IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集的减少，其中该募集的减少是相比于野生型IL-2多肽对IL-2Rβ亚基和/或IL-2Rγ亚基的募集。
在某些实施方案中，本文公开了在某位置处包含至少一个非天然氨基酸的分离并修饰的白介素2(IL-2)多肽，其降低该修饰的IL-2多肽与白介素2受体βγ(IL-2Rβγ)之间的结合，或减少IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集，但不损害白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)的活化，其中所述降低的结合是相比于野生型IL-2多肽与IL-2Rβγ之间的结合，并且其中募集的减少是相比于野生型IL-2多肽对IL-2Rγ亚基的募集。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、R81、P82、R83、D84、S87、N88、N89、V91、I92、L94、E95、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112、T113、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、R81、D84、S87、N88、V91、I92、L94、E95、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、P82、R83、N89、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112和T113，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、D84、N88、E95和Q126，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9和H16，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自Q22、N26、N88和Q126，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ IDNO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自E15、D20、D84和E95，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自L12、L19和M23，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自Q22和N26，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ IDNO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置在Q22，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置在N26，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸：是赖氨酸类似物；是半胱氨酸类似物或组氨酸类似物；包含芳族侧链；包含叠氮基；或包含醛或酮基团。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸不包含芳族侧链。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸包括N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)、对碘-L-苯丙氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、膦酰基酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒基)丙酸或硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸通过正交tRNA合成酶/tRNA对掺入所述修饰的IL-2多肽中。在一些实施方案中，所述正交tRNA合成酶/tRNA对的正交tRNA包含至少一个非天然核碱基。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽通过所述至少一个非天然氨基酸共价连接至缀合部分。在一些实施方案中，所述缀合部分包含水溶性聚合物、脂质、蛋白质或肽。在一些实施方案中，该水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰基吗啉)或其组合。在一些实施方案中，该水溶性聚合物包括PEG分子。在一些实施方案中，该PEG分子是直链PEG。在一些实施方案中，该PEG分子是支链PEG。在一些实施方案中，该水溶性聚合物包括多糖。在一些实施方案中，该多糖包括葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。在一些实施方案中，所述脂质包括脂肪酸。在一些实施方案中，该脂肪酸包含约6至约26个碳原子、约6至约24个碳原子、约6至约22个碳原子、约6至约20个碳原子、约6至约18个碳原子、约20至约26个碳原子、约12至约26个碳原子、约12至约24个碳原子、约12至约22个碳原子、约12至约20个碳原子或约12至约18个碳原子。在一些实施方案中，该脂肪酸是饱和脂肪酸。在一些实施方案中，所述蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白或运甲状腺素蛋白。在一些实施方案中，该蛋白质包括抗体或其结合片段。在一些实施方案中，该抗体或其结合片段包括抗体的Fc部分。在一些实施方案中，所述肽包括XTEN肽、富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白(GLK)聚合物。在一些实施方案中，所述缀合部分通过连接体间接结合至所述修饰的IL-2的所述至少一个非天然氨基酸。在一些实施方案中，该连接体包括同双官能连接体、异双官能连接体、零长度连接体，可裂解或不可裂解的二肽连接体、马来酰亚胺基团、间隔基或其组合。在一些实施方案中，结合的降低是相对于野生型IL-2多肽，对IL-2Rβγ的结合降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。在一些实施方案中，结合的降低是相对于野生型IL-2多肽，对IL-2Rβγ的结合降低约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1,000倍或更多。在一些实施方案中，IL-2Rγ亚基募集的减少是相对于野生型IL-2多肽减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。在一些实施方案中，IL-2Rγ亚基募集的减少是相对于野生型IL-2多肽减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1,000倍或更多。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽是：全长IL-2多肽的功能活性片段；重组IL-2多肽；或重组人IL-2多肽。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽包含N-末端缺失、C-末端缺失或其组合。在一些实施方案中，该N-末端缺失包括从N-末端缺失前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30个残基，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些实施方案中，该C-末端缺失包括从C-末端缺失最后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20个或更多个残基，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些实施方案中，所述功能活性片段包含IL-2区域10-133、20-133、30-133、10-130、20-130、30-130、10-125、20-125、30-125、1-130或1-125，其中残基位置参考SEQ IDNO:1中的位置。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽与SEQ ID NO:1具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，对IL-2Rβγ的结合亲和力降低的修饰的IL-2多肽能够扩充CD4+T调节性(Treg)细胞。在一些实施方案中，所述缀合部分损害或阻断IL-2与IL-2Rβγ的结合，或减少IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集。在一些实施方案中，所述修饰的IL-2/IL-2Rαβγ复合物引起的CD4+Treg细胞增殖等于或大于野生型IL-2多肽引起的增殖。
在某些实施方案中，本文公开了一种白介素2(IL-2)缀合物，其包含：分离并纯化的IL-2多肽；以及在选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、R81、P82、R83、D84、S87、N88、N89、V91、I92、L94、E95、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112、T113、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133的氨基酸残基处与所述分离并纯化的IL-2多肽结合的缀合部分，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、R81、D84、S87、N88、V91、I92、L94、E95、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、P82、R83、N89、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112和T113，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、D84、N88、E95和Q126，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述氨基酸位置选自K8、K9和H16。在一些实施方案中，所述氨基酸位置选自Q22、N26、N88和Q126。在一些实施方案中，所述氨基酸位置选自E15、D20、D84和E95。在一些实施方案中，所述氨基酸位置选自L12、L19、M23和F78。在一些实施方案中，所述氨基酸位置选自Q22和N26。在一些实施方案中，所述氨基酸位置在Q22。在一些实施方案中，所述氨基酸位置在N26。在一些实施方案中，选自K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、F78、D84、N88、E95和Q126的氨基酸残基进一步突变为赖氨酸、半胱氨酸或组氨酸。在一些实施方案中，所述氨基酸残基被突变为半胱氨酸。在一些实施方案中，所述氨基酸残基被突变为赖氨酸。在一些实施方案中，选自K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、F78、D84、N88、E95和Q126的氨基酸残基进一步突变为非天然氨基酸。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸包括对乙酰基-L-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)、对碘-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-多巴、氟代苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰丝氨酸、膦酰酪氨酸、对-溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸或异丙基-L-苯丙氨酸。在一些实施方案中，所述额外的突变的氨基酸残基与额外的缀合部分结合。在一些实施方案中，相对于野生型IL-2多肽，所述IL-2缀合物对IL-2受体β(IL-2Rβ)亚基、IL-2受体γ(IL-2Rγ)亚基或其组合的亲和力降低。在一些实施方案中，亲和力的降低是相对于野生型IL-2多肽，对IL-2Rβ、IL-2Rγ或其组合的结合亲和力降低约10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施方案中，亲和力的降低是相对于野生型IL-2多肽降低约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在一些实施方案中，所述缀合部分损害或阻断IL-2与IL-2Rβ、IL-2Rγ或其组合的结合。在一些实施方案中，所述缀合部分下调IL-Rγ链向形成的IL-2/IL-2Rβ链复合物的募集。在一些实施方案中，所述缀合部分延长多肽的全身半衰期，而不影响其对IL-2受体的α、β和γ链的亲和力。在一些实施方案中，所述缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施方案中，额外的缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施方案中，每种所述水溶性聚合物独立地包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰基吗啉)或其组合。在一些实施方案中，每种所述水溶性聚合物独立地包括PEG。在一些实施方案中，所述PEG是直链PEG或支链PEG。在一些实施方案中，每种所述水溶性聚合物独立地包括多糖。在一些实施方案中，该多糖包括葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。在一些实施方案中，每种所述水溶性聚合物独立地包括聚糖。在一些实施方案中，每种所述水溶性聚合物独立地包括多胺。在一些实施方案中，所述缀合部分包含蛋白质。在一些实施方案中，额外的缀合部分包含蛋白质。在一些实施方案中，每种所述蛋白质独立地包括白蛋白、转铁蛋白或运甲状腺素蛋白。在一些实施方案中，每种所述蛋白质独立地包括Fc部分。在一些实施方案中，每种所述蛋白质独立地包括IgG的Fc部分。在一些实施方案中，所述缀合部分包含多肽。在一些实施方案中，额外的缀合部分包含多肽。在一些实施方案中，每种所述多肽独立地包括XTEN肽、富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白(GLK)聚合物。在一些实施方案中，所述分离并纯化的IL-2多肽通过谷氨酰化进行修饰。在一些实施方案中，所述缀合部分直接结合至所述分离并纯化的IL-2多肽。在一些实施方案中，所述缀合部分通过连接体间接结合至所述分离并纯化的IL-2多肽。在一些实施方案中，所述连接体包括同双官能连接体。在一些实施方案中，所述同双官能连接体包括Lomant试剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3'3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基DST)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二亚胺代己二酸二甲酯(DMA)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、3,3'-二硫代二丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4-二-(3'-(2'-吡啶基二硫代)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)、含芳基卤的化合物(DFDNB)，例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3'-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α'-对二氨基二苯基、二碘-对二甲苯磺酸、N,N'-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N'-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。在一些实施方案中，所述连接体包括异双官能连接体。在一些实施方案中，所述异双官能连接体包括N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(sPDP)、长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(LC-sPDP)、水溶性长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代]-甲苯甲酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、琥珀酰亚胺基6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(sIAX)、琥珀酰亚胺基6-[6-(((碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸酯(sIAXX)、琥珀酰亚胺基4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(sIAC)、琥珀酰亚胺基6-(((((4-(碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸酯(sIACX)、对硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)、羰基反应性和巯基反应性交联剂，如4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼(PDPH)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基水杨酰胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰胺基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧基琥珀酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮基苯基)1,3'-二硫代丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀酰亚胺基(4-叠氮基苯基)-1,3'-二硫代丙酸酯(磺基-sADP)、磺基琥珀酰亚胺基4-(对叠氮基苯基)丁酸酯(磺基-sAPB)、磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAED)、磺基琥珀酰亚胺基7-叠氮基-4-甲基香豆素3-乙酸酯(磺基-sAMCA)、对硝基苯基重氮基丙酮酸(pNPDP)、对硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(对叠氮基水杨酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺(APDP)、苯甲酮-4-碘乙酰胺、对叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)、4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁胺(AsBA)或对叠氮基苯基乙二醛(APG)。在一些实施方案中，所述连接体包括可裂解的连接体，任选地包括二肽连接体。在一些实施方案中，所述二肽连接体包括Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些实施方案中，所述连接体包括不可裂解的连接体。在一些实施方案中，所述连接体包含马来酰亚胺基团，任选地包含马来酰亚胺基己酰基(mc)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些实施方案中，所述连接体进一步包含间隔基。在一些实施方案中，所述间隔基包含对氨基苄醇(PAB)、对氨基苄氧羰基(PABC)、其衍生物或类似物。在一些实施方案中，所述缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施方案中，额外的缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。
在某些实施方案中，本文公开了一种白介素2(IL-2)缀合物，其包含：分离并纯化的IL-2多肽；和缀合部分；其中相对于野生型IL-2多肽，该IL-2缀合物对IL-2受体β(IL-2Rβ)亚基、IL-2受体γ(IL-2Rγ)亚基或其组合的亲和力降低。在一些实施方案中，所述缀合部分结合至与IL-2Rβ或IL-2Rγ相互作用的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述缀合部分结合至选自K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、R81、D84、S87、N88、V91、I92、L94、E95、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133的氨基酸残基，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施方案中，额外的缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施方案中，每种所述水溶性聚合物独立地包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰基吗啉)或其组合。在一些实施方案中，每种所述水溶性聚合物独立地包括PEG。在一些实施方案中，所述PEG是直链PEG或支链PEG。在一些实施方案中，每种所述水溶性聚合物独立地包括多糖。在一些实施方案中，该多糖包括葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。在一些实施方案中，每种所述水溶性聚合物独立地包括聚糖。在一些实施方案中，每种所述水溶性聚合物独立地包括多胺。在一些实施方案中，所述缀合部分包含蛋白质。在一些实施方案中，额外的缀合部分包含蛋白质。在一些实施方案中，每种所述蛋白质独立地包括白蛋白、转铁蛋白或运甲状腺素蛋白。在一些实施方案中，每种所述蛋白质独立地包括Fc部分。在一些实施方案中，每种所述蛋白质独立地包括IgG的Fc部分。在一些实施方案中，所述缀合部分包含多肽。在一些实施方案中，额外的缀合部分包含多肽。在一些实施方案中，每种所述多肽独立地包括XTEN肽、富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白(GLK)聚合物。在一些实施方案中，所述分离并纯化的IL-2多肽通过谷氨酰化进行修饰。在一些实施方案中，所述缀合部分直接结合至所述分离并纯化的IL-2多肽。在一些实施方案中，所述缀合部分通过连接体间接结合至所述分离并纯化的IL-2多肽。在一些实施方案中，所述连接体包括同双官能连接体。在一些实施方案中，所述同双官能连接体包括Lomant试剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3'3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基DST)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二亚胺代己二酸二甲酯(DMA)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、3,3'-二硫代二丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4-二-(3'-(2'-吡啶基二硫代)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)、含芳基卤的化合物(DFDNB)，例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3'-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α'-对二氨基二苯基、二碘-对二甲苯磺酸、N,N'-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N'-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。在一些实施方案中，所述连接体包括异双官能连接体。在一些实施方案中，所述异双官能连接体包括N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(sPDP)、长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(LC-sPDP)、水溶性长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代]-甲苯甲酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、琥珀酰亚胺基6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(sIAX)、琥珀酰亚胺基6-[6-(((碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸酯(sIAXX)、琥珀酰亚胺基4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(sIAC)、琥珀酰亚胺基6-(((((4-(碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸酯(sIACX)、对硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)、羰基反应性和巯基反应性交联剂，如4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼(PDPH)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基水杨酰胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰胺基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧基琥珀酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮基苯基)1,3'-二硫代丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀酰亚胺基(4-叠氮基苯基)-1,3'-二硫代丙酸酯(磺基-sADP)、磺基琥珀酰亚胺基4-(对叠氮基苯基)丁酸酯(磺基-sAPB)、磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAED)、磺基琥珀酰亚胺基7-叠氮基-4-甲基香豆素3-乙酸酯(磺基-sAMCA)、对硝基苯基重氮基丙酮酸(pNPDP)、对硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(对叠氮基水杨酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺(APDP)、苯甲酮-4-碘乙酰胺、对叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)、4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁胺(AsBA)或对叠氮基苯基乙二醛(APG)。在一些实施方案中，所述连接体包括可裂解的连接体，任选地包括二肽连接体。在一些实施方案中，所述二肽连接体包括Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些实施方案中，所述连接体包括不可裂解的连接体。在一些实施方案中，所述连接体包含马来酰亚胺基团，任选地包含马来酰亚胺基己酰基(mc)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些实施方案中，所述连接体进一步包含间隔基。在一些实施方案中，所述间隔基包含对氨基苄醇(PAB)、对氨基苄氧羰基(PABC)、其衍生物或类似物。在一些实施方案中，所述缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施方案中，额外的缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。
在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含：上述IL-2缀合物；和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，该药物组合物被配制用于肠胃外给药。
在某些实施方案中，本文公开了一种治疗有需要的受试者的自身免疫疾病或病症的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的上述IL-2缀合物。在一些实施方案中，所述自身免疫疾病或病症包括斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、1型糖尿病、青少年特发性关节炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、多发性硬化、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮、甲状腺炎、葡萄膜炎、白癜风或韦格纳肉芽肿病。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用额外的治疗剂。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物和所述额外的治疗剂同时施用。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物和所述额外的治疗剂依次施用。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物在所述额外的治疗剂之前施用。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物在施用所述额外的治疗剂之后施用。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，本文公开了一种扩充调节性T(Treg)细胞群体的方法，其包括：(a)使细胞与上述IL-2缀合物接触；以及(b)使所述IL-2缀合物与IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ亚基相互作用以形成IL-2/IL-2Rαβγ复合物；其中所述IL-2缀合物对IL-2Rβ和/或IL-2Rγ亚基的亲和力降低，或下调IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集，或保持与IL-2对其α、β和γ受体亚基相似的效力，但延长其半衰期，并且其中所述IL-2/IL-2Rαβγ复合物与天然IL-2相似地或比其更有效地刺激Treg细胞的扩充。
在某些实施方案中，本文公开了包含上述IL-2缀合物的试剂盒；或包含上述IL-2缀合物的药物组合物。在一些实施方案中，本文还描述了一种试剂盒，其包含编码上述IL-2多肽的多核酸分子。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1显示了示例性的非天然氨基酸。该图改编自Young等人,“Beyond thecanonical 20amino acids:expanding the genetic lexicon,”J.of BiologicalChemistry285(15):11039-11044(2010)的图2。
图2A-图2B示出了示例性的非天然氨基酸。图2A示出了示例性的赖氨酸衍生物。图2B示出了示例性的苯丙氨酸衍生物。
图3A-图3D示出了示例性的非天然氨基酸。这些非天然氨基酸(UAA)已在蛋白质中遗传编码(图3A–UAA#1-42；图3B-UAA#43-89；图3C–UAA#90-128；图3D–UAA#129-167)。图3A-3D采自Dumas等人,Chemical Science 2015,6,50-69的表1。
图4A-图4B显示了示例性IL-2变体在人LRS原代细胞中的pSTAT5信号传导的剂量响应曲线(图4A)和在小鼠CTLL-2群体中的增殖响应(图4B)。
图5显示了示例性IL-2分子K35_30kD在两种不同浓度下的增强的PK曲线。
具体实施方式
细胞因子包括一类细胞信号传导蛋白质，如趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子和其他在先天性和适应性免疫细胞稳态中起作用的生长因子。细胞因子由诸如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞和不同基质细胞等免疫细胞产生。在一些情况下，细胞因子调节体液免疫应答与基于细胞的免疫应答之间的平衡。
白介素是调节T和B淋巴细胞、单核细胞谱系细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞和造血细胞的发育和分化的信号传导蛋白质。白介素由辅助CD4 T和B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和其他组织成员产生。在一些情况下，约有15种白介素，即白介素1-13、白介素15和白介素17。
白介素2(IL-2)是一种多效性1型细胞因子，其结构包含15.5kDa的四个α-螺旋束。IL-2的前体形式的长度为153个氨基酸残基，其中前20个氨基酸形成信号肽，而残基21-153形成成熟形式。IL-2主要在抗原刺激后由CD4+T细胞产生，并且较小程度地由CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞和NK T(NKT)细胞、活化的树突细胞(DC)和肥大细胞产生。IL-2信号传导通过与IL-2受体(IL-2R)亚基IL-2Rα(也称为CD25)、IL-2Rβ(也称为CD122)和IL-2Rγ(也称为CD132)的特定组合的相互作用而发生。IL-2与IL-2Rα的相互作用形成Kd约为10-8M的“低亲和力”IL-2受体复合物。IL-2与IL-2Rβ和IL-2Rγ的相互作用形成Kd约为10-9M的“中亲和力”IL-2受体复合物。IL-2与全部三个亚基IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ的相互作用形成Kd约>10-11M的“高亲和力”IL-2受体复合物。
在一些情况下，经由“高亲和力”IL-2Rαβγ复合物的IL-2信号传导调节调节性T细胞的活化和增殖。调节性T细胞或CD4+CD25+Foxp3+调节性T(Treg)细胞通过抑制效应细胞如CD8+T细胞、辅助细胞如CD4+Th1、Th2和Th17细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞而介导免疫稳态的维持。在一些情况下，Treg细胞由胸腺生成(tTreg细胞)，或者由外周的幼稚T细胞诱导(pTreg细胞)。在一些情况下，Treg细胞被认为是外周耐受的介质。实际上，在一项研究中，耗竭CD25的外周CD4+T细胞的转移在裸鼠中产生了多种自身免疫疾病，而CD4+CD25+T细胞的共转移抑制了自身免疫的发展(Sakaguchi等人,“Immunologic self-tolerancemaintained by activated T cells expressing IL-2receptor alpha-chains(CD25),”J.Immunol.155(3):1151-1164(1995))。Treg细胞群体的增加下调了效应T细胞的增殖，并抑制了自身免疫和T细胞抗肿瘤应答。
在某些实施方案中，本文公开了一种通过细胞因子/细胞因子受体信号传导选择性上调淋巴细胞的不同群体(例如，调节性T细胞)的方法。在一些情况下，该细胞因子包括白介素。在一些情况下，该细胞因子是细胞因子缀合物，例如白介素缀合物、干扰素缀合物或肿瘤坏死因子缀合物。在另外的情况下，本文描述了包含一种或多种本文所述的细胞因子缀合物的药物组合物和试剂盒。
在一些实施方案中，本文还描述了一种通过IL-2/IL-2R信号传导选择性上调Treg群体的方法。在一些情况下，IL-2是IL-2缀合物，相对于野生型IL-2，其在IL-2Rαβγ复合物内的IL-2Rβ和IL-2Rγ相互作用减弱，或下调IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集，或保持与IL-2对其α、β和γ受体亚基相似的效力，但延长其半衰期。在一些实施方案中，本文进一步描述了使用本文所述的IL-2缀合物治疗自身免疫疾病的方法。在另外的实施方案中，本文描述了包含一种或多种本文所述的IL-2缀合物的药物组合物和试剂盒。
细胞因子缀合物
在一些实施方案中，本文描述了细胞因子缀合物。在一些情况下，该细胞因子包括白介素、肿瘤坏死因子、干扰素、趋化因子或淋巴因子。在一些情况下，该细胞因子是白介素。在一些情况下，该细胞因子是干扰素。在另外的情况下，该细胞因子是肿瘤坏死因子。
在一些实施方案中，本文描述了一种白介素缀合物。示例性的白介素包括但不限于白介素1β(IL-1β)、白介素2(IL-2)、白介素7(IL-7)、白介素10(IL-10)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素18(IL-18)和白介素21(IL-21)。在一些情况下，本文描述了一种白介素缀合物，其中该白介素选自IL-1β、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。
IL-2缀合物
在一些实施方案中，本文描述了在氨基酸位置处被修饰的IL-2缀合物。在一些情况下，该IL-2多肽是分离并纯化的IL-2多肽。在一些情况下，该IL-2多肽是哺乳动物IL-2，例如啮齿动物IL-2蛋白质或人IL-2蛋白质。在一些情况下，该IL-2多肽是人IL-2蛋白质。在一些情况下，该IL-2多肽与SEQ ID NO:1具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，该IL-2多肽包含SEQ ID NO:1的序列。在一些情况下，该IL-2多肽由SEQ ID NO:1的序列组成。在另外的情况下，该IL-2多肽与SEQ ID NO:2具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在另外的情况下，该IL-2多肽包含SEQ ID NO:2的序列。在另外的情况下，该IL-2多肽由SEQ ID NO:2的序列组成。
在一些情况下，所述IL-2多肽是截短的变体。在一些情况下，该截短是N-末端缺失。在其他情况下，该截短是C-末端缺失。在另外的情况下，该截短包含N-末端和C-末端缺失。例如，该截短可以是从N-末端或C-末端或两个末端缺失至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20个或更多个残基。在一些情况下，该IL-2多肽包含至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20个或更多个残基的N-末端缺失。在一些情况下，该IL-2多肽包含至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基的N-末端缺失。在一些情况下，该IL-2多肽包含至少或大约2个残基的N-末端缺失。在一些情况下，该IL-2多肽包含至少或大约3个残基的N-末端缺失。在一些情况下，该IL-2多肽包含至少或大约4个残基的N-末端缺失。在一些情况下，该IL-2多肽包含至少或大约5个残基的N-末端缺失。在一些情况下，该IL-2多肽包含至少或大约6个残基的N-末端缺失。在一些情况下，该IL-2多肽包含至少或大约7个残基的N-末端缺失。在一些情况下，该IL-2多肽包含至少或大约8个残基的N-末端缺失。在一些情况下，该IL-2多肽包含至少或大约9个残基的N-末端缺失。在一些情况下，该IL-2多肽包含至少或大约10个残基的N-末端缺失。
在一些实施方案中，所述IL-2多肽是功能活性片段。在一些情况下，该功能活性片段包含IL-2区域10-133、20-133、30-133、10-130、20-130、30-130、10-125、20-125、30-125、1-130或1-125，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些情况下，该功能活性片段包含IL-2区域10-133，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些情况下，该功能活性片段包含IL-2区域20-133，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些情况下，该功能活性片段包含IL-2区域30-133，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些情况下，该功能活性片段包含IL-2区域10-125，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些情况下，该功能活性片段包含IL-2区域20-125，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些情况下，该功能活性片段包含IL-2区域1-130，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。在一些情况下，该功能活性片段包含IL-2区域1-125，其中残基位置参考SEQ IDNO:1中的位置。
在一些实施方案中，相对于野生型IL-2多肽，本文所述的包含分离并纯化的IL-2多肽和缀合部分的IL-2缀合物对IL-2受体β(IL-2Rβ)亚基、IL-2受体γ(IL-2Rγ)亚基或其组合的亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型IL-2多肽，所述IL-2缀合物向IL-2/IL-2Rβ复合物的IL-2Rγ亚基募集减少。在一些情况下，该缀合部分结合至与IL-2Rβ(例如，在IL-2/IL-2Rβ界面处)、与IL-2Rγ(例如，在IL-2/IL-2Rβ界面处)或其组合相互作用的氨基酸残基。在一些情况下，该缀合部分结合至邻近IL-2/IL-2Rβ界面、IL-2/IL-2Rβ界面或IL-2Rβγ界面的氨基酸残基。在一些情况下，该氨基酸残基距IL-2/IL-2Rβ界面、IL-2/IL-2Rβ界面或IL-2Rβγ界面约
Figure BDA0002437959900000281
约
Figure BDA0002437959900000282
约
Figure BDA0002437959900000283
或约
Figure BDA0002437959900000284
如本文所用的，参与IL-2/IL-2Rβ界面、IL-2/IL-2Rβ界面或IL-2Rβγ界面的残基包括与来自IL-2Rβ亚基、IL-2Rγ亚基的残基或IL-2Rβγ界面处的残基形成疏水相互作用、氢键或离子相互作用的IL-2残基。
在一些情况下，所述缀合部分结合至选自氨基酸位置P2、T3、S4、S5、S6、T7、K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、R81、P82、R83、D84、S87、N88、N89、V91、I92、L94、E95、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112、T113、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133的氨基酸残基，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些情况下，该氨基酸位置选自K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、R81、D84、S87、N88、V91、I92、L94、E95、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133。在一些情况下，该氨基酸位置选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、P82、R83、N89、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112和T113。在一些情况下，该氨基酸位置选自K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、D84、N88、E95和Q126。在一些情况下，该氨基酸位置选自K8、K9和H16。在一些情况下，该氨基酸位置选自Q22、N26、N88和Q126。在一些情况下，该氨基酸位置选自E15、D20、D84和E95。在一些情况下，该氨基酸位置选自L12、L19和M23。在一些情况下，该氨基酸位置选自Q22和N26。在一些情况下，该氨基酸位置在K8。在一些情况下，该氨基酸位置在K9。在一些情况下，该氨基酸位置在Q11。在一些情况下，该氨基酸位置在L12。在一些情况下，该氨基酸位置在E15。在一些情况下，该氨基酸位置在H16。在一些情况下，该氨基酸位置在L18。在一些情况下，该氨基酸位置在L19。在一些情况下，该氨基酸位置在D20。在一些情况下，该氨基酸位置在D22。在一些情况下，该氨基酸位置在M23。在一些情况下，该氨基酸位置在N26。在一些情况下，该氨基酸位置在R81。在一些情况下，该氨基酸位置在D84。在一些情况下，该氨基酸位置在S87。在一些情况下，该氨基酸位置在N88。在一些情况下，该氨基酸位置在V91。在一些情况下，该氨基酸位置在I92。在一些情况下，该氨基酸位置在L94。在一些情况下，该氨基酸位置在E95。在一些情况下，该氨基酸位置在E116。在一些情况下，该氨基酸位置在N119。在一些情况下，该氨基酸位置在R120。在一些情况下，该氨基酸位置在T123。在一些情况下，该氨基酸位置在A125。在一些情况下，该氨基酸位置在Q126。在一些情况下，该氨基酸位置在S127。在一些情况下，该氨基酸位置在S130。在一些情况下，该氨基酸位置在T131。在一些情况下，该氨基酸位置在L132。在一些情况下，该氨基酸位置在T133。
在一些情况下，所述IL-2缀合物进一步包含另外的突变。在这样的情况下，所述氨基酸与额外的缀合部分缀合，以增加血清半衰期、稳定性或其组合。或者，在与额外的缀合部分结合之前，首先将氨基酸突变为天然氨基酸，如赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸；或突变为非天然氨基酸。
在一些实施方案中，相对于野生型IL-2多肽，所述IL-2缀合物对IL-2Rαβγ复合物的IL-2受体β(IL-2Rβ)亚基、IL-2受体γ(IL-2Rγ)亚基或其组合的结合亲和力降低。在一些情况下，相对于野生型IL-2多肽，所述IL-2缀合物对IL-2受体β(IL-2Rβ)亚基、IL-2受体γ(IL-2Rγ)亚基或其组合的亲和力降低约为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％。在一些情况下，亲和力的降低约为10％。在一些情况下，亲和力的降低约为20％。在一些情况下，亲和力的降低约为40％。在一些情况下，亲和力的降低约为50％。在一些情况下，亲和力的降低约为60％。在一些情况下，亲和力的降低约为80％。在一些情况下，亲和力的降低约为90％。在一些情况下，亲和力的降低约为99％。在一些情况下，亲和力的降低大于99％。在一些情况下，亲和力的降低约为80％。在一些情况下，亲和力的降低约为100％。
在一些实施方案中，相对于野生型IL-2多肽，所述IL-2缀合物对IL-2受体β(IL-2Rβ)亚基、IL-2受体γ(IL-2Rγ)亚基或其组合的结合亲和力降低约为1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1,000倍或更多。在一些情况下，亲和力的降低约为1倍。在一些情况下，亲和力的降低约为2倍。在一些情况下，亲和力的降低约为4倍。在一些情况下，亲和力的降低约为5倍。在一些情况下，亲和力的降低约为6倍。在一些情况下，亲和力的降低约为8倍。在一些情况下，亲和力的降低约为10倍。在一些情况下，亲和力的降低约为30倍。在一些情况下，亲和力的降低约为50倍。在一些情况下，亲和力的降低约为100倍。在一些情况下，亲和力的降低约为300倍。在一些情况下，亲和力的降低约为500倍。在一些情况下，亲和力的降低约为1000倍。在一些情况下，亲和力的降低大于1,000倍。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物向IL-2/IL-2Rβ复合物的IL-2Rγ亚基募集减少。在一些情况下，募集的减少是相比于没有非天然氨基酸的相当的IL-2多肽(例如，野生型IL-2多肽)引起的IL-2Rγ亚基募集。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少是相对于没有非天然氨基酸修饰的相当的IL-2多肽减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为10％。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为20％。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为40％。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为50％。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为60％。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为70％。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为80％。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为90％。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为99％。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少大于99％。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为100％。在一些情况下，所述IL-2缀合物的IL-2Rα亚基募集进一步增加。
在一些实施方案中，IL-2Rγ亚基募集的减少是相对于没有非天然氨基酸修饰的相当的IL-2多肽(例如，野生型IL-2多肽)减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1,000倍或更多。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为1倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为2倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为4倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为5倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为6倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为8倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为10倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为30倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为50倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为100倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为300倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为500倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少约为1000倍。在一些情况下，IL-2Rγ亚基募集的减少超过1,000倍。在一些情况下，所述IL-2缀合物的IL-2Rα亚基募集进一步增加。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物向IL-2多肽的IL-2Rα亚基募集增加。在一些情况下，募集的减少是相比于没有非天然氨基酸的相当的IL-2多肽(例如，野生型IL-2多肽)引起的IL-2Rα亚基募集。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加是相对于没有非天然氨基酸修饰的相当的IL-2多肽增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为10％。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为20％。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为40％。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为50％。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为60％。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为70％。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为80％。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为90％。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为99％。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加大于99％。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为100％。在一些情况下，所述IL-2缀合物的IL-2Rβ亚基和/或IL-2Rγ亚基募集进一步减少。
在一些实施方案中，IL-2Rα亚基募集的增加是相对于没有非天然氨基酸修饰的相当的IL-2多肽(例如，野生型IL-2多肽)增加约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1,000倍或更多。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为1倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为2倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为4倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为5倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为6倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为8倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为10倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为30倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为50倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为100倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为300倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为500倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加约为1000倍。在一些情况下，IL-2Rα亚基募集的增加超过1,000倍。在一些情况下，所述IL-2缀合物的IL-2Rβ亚基和/或IL-2Rγ亚基募集进一步减少。
在一些实施方案中，本文所述的IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低。在一些情况下，受体信号传导效力的降低是相对于野生型IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍或更多。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为2倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为5倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为10倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为20倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为30倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为40倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为50倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为100倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为200倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为300倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为400倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为500倍。在一些情况下，受体信号传导效力的降低约为1000倍。
在一些情况下，所述受体信号传导效力通过EC50值来测量。在一些情况下，受体信号传导效力的降低是EC50的增加。在一些情况下，EC50的增加是相对于野生型IL-2多肽增加约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍或更多。
在一些情况下，所述受体信号传导效力通过ED50值来测量。在一些情况下，受体信号传导效力的降低是ED50的增加。在一些情况下，ED50的增加是相对于野生型IL-2多肽增加约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍或更多。
在一些实施方案中，与野生型IL-2多肽的治疗窗相比，本文所述的IL-2多肽具有扩大的治疗窗。在一些情况下，扩大的治疗窗是由于IL-2多肽与白介素2受体βγ(IL-2Rβγ)之间的结合降低，对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低，IL-2Rγ向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集减少，或IL-2Rα亚基向IL-2多肽的募集增加。在一些情况下，该IL-2多肽不具有受损的白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)的活化。
在一些实施方案中，所述修饰的IL-2多肽表现出对IL-2βγ信号传导复合物的第一受体信号传导效力和对IL-2αβγ信号传导复合物的第二受体信号传导效力，并且其中第一受体信号传导效力与第二受体信号传导效力之差至少为1倍。在一些情况下，该差异是至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍或更大。在一些情况下，第一受体信号传导效力低于第二受体信号传导效力。在一些情况下，第一受体信号传导效力比第二受体信号传导效力低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更多。在一些情况下，所述修饰的IL-2多肽对IL-2βγ信号传导复合物的受体信号传导效力低于对IL-2αβγ信号传导复合物的第二受体信号传导效力。在一些情况下，所述修饰的IL-2多肽的第一受体信号传导效力比野生型IL-2多肽的受体信号传导效力低至少1倍。在一些情况下，所述修饰的IL-2多肽的第一受体信号传导效力比野生型IL-2多肽的受体信号传导效力低至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍或500倍。在一些情况下，第一受体信号传导效力和第二受体信号传导效力均低于野生型IL-2多肽的相应效力，但是第一受体信号传导效力低于第二受体信号传导效力。在一些情况下，第一受体信号传导效力与第二受体信号传导效力之差增大了修饰的IL-2多肽的治疗窗。
在一些实施方案中，所述缀合部分直接地或通过连接体肽间接地连接至IL-2多肽的N-末端或C-末端。在一些情况下，该缀合部分(例如，聚合物、蛋白质或肽)直接地或通过连接体肽间接地与IL-2在IL-2的N-末端或C-末端遗传融合。在一些情况下，该缀合部分连接至N-末端或C-末端氨基酸残基。在一些情况下，该缀合部分连接至与N-末端或C-末端氨基酸残基结合的反应性基团。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时或更长的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过1小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过2小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过3小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过4小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过5小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过6小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过7小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过8小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过9小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过10小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过12小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过18小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有超过24小时的血浆半衰期。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、18小时、24小时或更长的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少1小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少2小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少3小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少4小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少5小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少6小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少7小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少8小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少9小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少10小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少12小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少18小时的血浆半衰期。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有至少24小时的血浆半衰期。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有约1小时至约7天、约12小时至约7天、约18小时至约7天、约24小时至约7天、约1小时至约5天、约12小时至约5天、约24小时至约5天、约2天至约5天或约2天至约3天的血浆半衰期。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有约1小时至约18小时、约1小时至约12小时、约2小时至约10小时、约2小时至约8小时、约4小时至约18小时、约4小时至约12小时、约4小时至约10小时、约4小时至约8小时、约6小时至约18小时、约6小时至约12小时、约6小时至约10小时、约6小时至约8小时、约8小时至约18小时、约8小时至约12小时或约8小时至约10小时的血浆半衰期。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有能够增殖和/或扩充Treg细胞，但是不会产生诸如凋亡等有害作用的血浆半衰期。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有相对于野生型IL-2延长的血浆半衰期，例如延长至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有相对于野生型IL-2延长的血浆半衰期，例如约1小时至约18小时、约1小时至约12小时、约2小时至约10小时、约2小时至约8小时、约4小时至约18小时、约4小时至约12小时、约4小时至约10小时、约4小时至约8小时、约6小时至约18小时、约6小时至约12小时、约6小时至约10小时、约6小时至约8小时、约8小时至约18小时、约8小时至约12小时或约8小时至约10小时。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物具有延长的血浆半衰期以及降低的毒性。在一些情况下，所述IL-2缀合物具有至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长的延长的血浆半衰期，以及降低的毒性。在一些情况下，所述IL-2缀合物具有至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、18小时、24小时或更长的延长的血浆半衰期，以及降低的毒性。在一些情况下，所述IL-2缀合物具有约1小时至约18小时、约1小时至约12小时、约2小时至约10小时、约2小时至约8小时、约4小时至约18小时、约4小时至约12小时、约4小时至约10小时、约4小时至约8小时、约6小时至约18小时、约6小时至约12小时、约6小时至约10小时、约6小时至约8小时、约8小时至约18小时、约8小时至约12小时或约8小时至约10小时的延长的血浆半衰期，以及降低的毒性。在一些情况下，所述毒性的降低是相对于野生型IL-2降低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或更多。在一些情况下，所述毒性的降低是相对于野生型IL-2降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含缀合部分，其中该缀合部分的大小(例如，体积或长度)增强血浆稳定性但不降低效力。在一些情况下，该缀合部分的大小使血浆半衰期延长至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长。在一些情况下，该缀合部分的大小使血浆半衰期延长至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、18小时、24小时或更长。在一些情况下，该缀合部分的大小使血浆半衰期延长约1小时至约18小时、约1小时至约12小时、约2小时至约10小时、约2小时至约8小时、约4小时至约18小时、约4小时至约12小时、约4小时至约10小时、约4小时至约8小时、约6小时至约18小时、约6小时至约12小时、约6小时至约10小时、约6小时至约8小时、约8小时至约18小时、约8小时至约12小时或约8小时至约10小时。在一些情况下，该缀合部分的大小使效力相对于野生型IL-2降低少于5％、4％、3％、2％、1％或更少。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物包含缀合部分，其中该缀合部分的大小(例如，体积或长度)增强血浆稳定性和效力。在一些情况下，该缀合部分的大小使血浆半衰期延长至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长。在一些情况下，该缀合部分的大小使血浆半衰期延长至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、18小时、24小时或更长。在一些情况下，该缀合部分的大小使血浆半衰期延长约1小时至约18小时、约1小时至约12小时、约2小时至约10小时、约2小时至约8小时、约4小时至约18小时、约4小时至约12小时、约4小时至约10小时、约4小时至约8小时、约6小时至约18小时、约6小时至约12小时、约6小时至约10小时、约6小时至约8小时、约8小时至约18小时、约8小时至约12小时或约8小时至约10小时。在一些情况下，该缀合部分的大小进一步使效力相对于野生型IL-2增强超过5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多。
在一些情况下，所述缀合部分损害或阻断IL-2与IL-2Rβγ的受体信号转导效力，或减少IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集。
在一些情况下，对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低的修饰的IL-2多肽能够扩充CD4+T调节性(Treg)细胞。
在一些实施方案中，所述修饰的IL-2/IL-2Rαβγ复合物引起的CD4+Treg细胞增殖等于或大于野生型IL-2多肽引起的增殖。
在一些实施方案中，所述IL-2/IL-2Rαβγ复合物诱导CD4+Treg细胞增殖为足以调节动物模型中的疾病过程的群体。
在一些实施方案中，本文描述了一种白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)结合蛋白，其中所述结合蛋白对白介素2βγ受体(IL-2Rβγ)的受体信号传导效力低于野生型人IL-2(hIL-2)对该受体的受体信号传导效力，并且其中所述结合蛋白包含至少一个非天然氨基酸。在一些情况下，所述结合蛋白是修饰的IL-2多肽或其功能活性片段，其中该修饰的IL-2多肽包含至少一个非天然氨基酸。
在一些实施方案中，本文描述了一种白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)结合蛋白，其中所述结合蛋白引起的IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集少于野生型人IL-2(hIL-2)引起的募集，并且其中所述结合蛋白包含至少一个非天然氨基酸。在一些情况下，所述结合蛋白是修饰的IL-2多肽或其功能活性片段，其中该修饰的IL-2多肽包含至少一个非天然氨基酸。
在一些实施方案中，本文描述了一种白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)结合蛋白，其中所述结合蛋白对白介素2βγ受体(IL-2Rβγ)的结合亲和力低于野生型人IL-2(hIL-2)对该受体的结合亲和力，并且其中所述结合蛋白包含至少一个非天然氨基酸。在这样的情况下，所述结合蛋白是修饰的IL-2多肽或其功能活性片段，其中该修饰的IL-2多肽包含至少一个非天然氨基酸。
在一些实施方案中，本文描述了一种IL-2/IL-2Rαβγ复合物，其包含含有非天然氨基酸的修饰的IL-2多肽和IL-2Rαβγ，其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低，并且其中受体信号传导效力的降低是相比于野生型IL-2多肽与IL-2Rβγ之间的结合亲和力。在一些情况下，所述修饰的IL-2多肽进一步包含共价连接至该非天然氨基酸的缀合部分。
在一些实施方案中，本文描述了一种IL-2/IL-2Rαβγ复合物，其包含含有非天然氨基酸的修饰的IL-2多肽和IL-2Rαβγ，其中所述修饰的IL-2多肽引起的IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集少于野生型IL-2多肽引起的募集。在一些情况下，所述修饰的IL-2多肽进一步包含共价连接至该非天然氨基酸的缀合部分。
在一些实施方案中，本文描述了一种IL-2/IL-2Rαβγ复合物，其包含含有非天然氨基酸的修饰的IL-2多肽和IL-2Rαβγ，其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ的结合亲和力降低，并且其中结合亲和力的降低是相比于野生型IL-2多肽与IL-2Rβγ之间的结合亲和力。在一些实施方案中，本文描述了一种IL-2/IL-2Rαβγ复合物，其包含含有非天然氨基酸的修饰的IL-2多肽和IL-2Rαβγ，其中所述修饰的IL-2多肽引起的IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集少于野生型IL-2多肽引起的募集。在一些情况下，所述修饰的IL-2多肽进一步包含共价连接至该非天然氨基酸的缀合部分。
在一些实施方案中，本文描述了选择性扩充细胞群体中的CD4+Treg细胞的CD4+Treg细胞激活剂，其中所述激活剂包含含有至少一个非天然氨基酸的修饰的IL-2多肽。在一些情况下，相对于被野生型IL-2多肽接触的CD3+细胞群体中CD8+效应T细胞和/或自然杀伤细胞的扩充，当所述激活剂与所述CD3+细胞群体接触时，所述激活剂使CD3+细胞群体中CD8+效应T细胞和/或自然杀伤细胞扩充少于20％、15％、10％、5％、1％或0.1％。在一些情况下，所述细胞群体是体内细胞群体。在一些情况下，所述细胞群体是体外细胞群体。在一些情况下，所述细胞群体是离体细胞群体。
IL-10缀合物
在一些实施方案中，本文描述了在氨基酸位置处被修饰的IL-10缀合物。IL-10，也被称为人细胞因子合成抑制因子或CSIF，是一种限制针对病原体的炎症反应的免疫调节性细胞因子，但由于其对CD8 T细胞的免疫刺激活性，也被确定为抗肿瘤细胞因子。IL-10下调Th1细胞因子、MHC II类抗原和巨噬细胞上的共刺激分子的表达，并进一步增强B细胞存活、增殖和抗体产生。另外，IL-10可以刺激胸腺细胞的增殖和CD8T细胞的细胞毒性。在一些情况下，该IL-10缀合物包含分离并纯化的IL-10多肽和缀合部分。在一些情况下，相对于野生型IL-10多肽，该IL-10缀合物对IL-10受体的亲和力降低。在一些情况下，该缀合部分结合至与IL-10受体(例如，在IL-10/IL-10R界面处)相互作用的氨基酸残基。在一些情况下，该缀合部分结合至邻近IL-10/IL-10R界面(例如，距IL-10/IL-10R界面约
Figure BDA0002437959900000401
约
Figure BDA0002437959900000402
约
Figure BDA0002437959900000403
或约
Figure BDA0002437959900000404
)的氨基酸残基。如本文所用的，参与IL-10/IL-10R界面的残基包括与来自IL-10R的残基形成疏水相互作用、氢键或离子相互作用的IL-10残基。在一些情况下，该缀合部分直接地或通过连接体肽间接地连接至IL-10多肽的N-末端或C-末端。在另外的情况下，该缀合部分调节IL-10与IL-10R之间的相互作用，以增强其免疫抑制活性并降低其免疫刺激活性。在一些情况下，该IL-10缀合物通过IL-10/IL-10R信号传导上调淋巴细胞的不同群体。在一些情况下，该IL-10缀合物调节免疫活性。
额外的细胞因子缀合物
在一些实施方案中，本文描述的包括在氨基酸位置处被修饰的一种或多种额外的细胞因子缀合物。示例性的细胞因子包括但不限于IL-1β、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在一些情况下，该细胞因子缀合物包含分离并纯化的细胞因子多肽和缀合部分。在一些情况下，相对于野生型细胞因子，该细胞因子缀合物对其相应受体的亲和力降低。在一些情况下，该缀合部分结合至邻近受体界面(例如，距受体界面约
Figure BDA0002437959900000411
约
Figure BDA0002437959900000412
约
Figure BDA0002437959900000413
或约
Figure BDA0002437959900000414
)的氨基酸残基。在一些情况下，该缀合部分直接地或通过连接体肽间接地连接至细胞因子多肽的N-末端或C-末端。在另外的情况下，该缀合部分调节细胞因子与其受体之间的相互作用，以增强其免疫抑制活性并降低其免疫刺激活性。在一些情况下，该细胞因子缀合物通过其受体信号传导上调淋巴细胞的不同群体。在一些情况下，该细胞因子缀合物调节免疫活性。
细胞因子缀合物前体
本文描述了包含突变细胞因子(如IL-2)的细胞因子缀合物前体，其中一个或多个氨基酸已从野生型氨基酸突变。这类前体通常与本文所述的方法一起用于疾病或病况的治疗。在一些实施方案中，细胞因子前体不缀合。这类突变不同地包括添加、缺失或置换。在一些实施方案中，该突变包括向不同天然氨基酸的置换。在一些情况下，突变细胞因子在氨基酸位置P2、T3、S4、S5、S6、T7、K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、R81、P82、R83、D84、S87、N88、N89、V91、I92、L94、E95、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112、T113、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133处包含突变，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些情况下，该氨基酸位置选自K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、R81、D84、S87、N88、V91、I92、L94、E95、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133。在一些情况下，该氨基酸位置选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、P82、R83、N89、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112和T113。在一些情况下，该氨基酸位置选自K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、D84、N88、E95和Q126。在一些情况下，该氨基酸位置选自K8、K9和H16。在一些情况下，该氨基酸位置选自Q22、N26、N88和Q126。在一些情况下，该氨基酸位置选自E15、D20、D84和E95。在一些情况下，该氨基酸位置选自L12、L19和M23。在一些情况下，该氨基酸位置选自Q22和N26。在一些实施方案中，细胞因子突变体包含缀合部分，其中该缀合部分连接至突变细胞因子中的突变位点。
蛋白质或肽融合体
在一些实施方案中，本文所述的细胞因子缀合物包含与肽或蛋白质融合的细胞因子(例如，IL-2或其他细胞因子)(融合体)。在一些实施方案中，所述肽或蛋白质是抗体或抗体片段。在一些实施方案中，本文所述的细胞因子缀合物包含与抗体或其结合片段融合的细胞因子(例如，IL-2或其他细胞因子)。在一些实施方案中，本文所述的细胞因子与多个蛋白质或肽融合。在一些实施方案中，细胞因子缀合物包含与蛋白质或肽融合的细胞因子融合体，以及至少一个缀合部分。在一些情况下，抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、鼠抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab'、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、双-scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体(minibody)、纳米抗体、三抗体、四抗体、人抗体(humabody)、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科动物抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段、或其化学修饰的衍生物。在一些情况下，这类融合蛋白是直接通过翻译生成的。在一些实施方案中，使用化学或其他酶促连接方法生成融合体。在一些实施方案中，细胞因子缀合物包含通过连接体连接的融合的肽或蛋白质。在一些实施方案中，该连接体是肽。在一些实施方案中，细胞因子缀合物包含N-末端肽或蛋白质融合体。在一些实施方案中，细胞因子缀合物包含C-末端肽或蛋白质融合体。在一些情况下，与肽或蛋白质融合的细胞因子进一步与一个或多个以下所述的缀合部分缀合。
在一些情况下，所述细胞因子缀合物包含与scFv、双-scFv、(scFv)2、dsFv或sdAb融合的融合体。在一些情况下，该融合体包含scFv。在一些情况下，该细胞因子缀合物包含与双-scFv的融合体。在一些情况下，该细胞因子缀合物包含与(scFv)2的融合体。在一些情况下，该细胞因子缀合物包含与dsFv的融合体。在一些情况下，该细胞因子缀合物包含与sdAb的融合体。在一些情况下，与scFv、双-scFv、(scFv)2、dsFv或sdAb融合的细胞因子进一步与一个或多个以下所述的缀合部分缀合。
在一些情况下，所述细胞因子缀合物包含与抗体的Fc部分，例如与IgG、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc部分的融合体。在一些情况下，所述细胞因子缀合物包含与IgG(例如，IgG1、IgG3或IgG4)的Fc部分的融合体。在一些情况下，与Fc部分融合的细胞因子进一步与一个或多个以下所述的缀合部分缀合。
在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与抗体或其结合片段融合。在一些情况下，该细胞因子多肽与人源化抗体或其结合片段、鼠抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab'、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、双-scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体(minibody)、纳米抗体、三抗体、四抗体、人抗体(humabody)、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科动物抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段、或其化学修饰的衍生物融合。在另外的情况下，该细胞因子多肽与抗体的Fc部分融合。在另外的情况下，该细胞因子多肽与IgG(例如，IgG1、IgG3或IgG4)的Fc部分融合。在一些情况下，与抗体或其结合片段融合的细胞因子进一步与一个或多个以下所述的缀合部分缀合。
在一些情况下，IL-2多肽与抗体或其结合片段融合。在一些情况下，该IL-2多肽与人源化抗体或其结合片段、鼠抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab'、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、双-scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体(minibody)、纳米抗体、三抗体、四抗体、人抗体(humabody)、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科动物抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段、或其化学修饰的衍生物融合。在另外的情况下，该IL-2多肽与抗体的Fc部分融合。在另外的情况下，该IL-2多肽与IgG(例如，IgG1、IgG3或IgG4)的Fc部分融合。在一些情况下，与IL-2多肽融合的抗体或其结合片段不阻碍IL-2多肽与IL-2Rβγ的结合。在一些情况下，与IL-2多肽融合的抗体或其结合片段部分阻断IL-2多肽与IL-2Rβγ的结合。在一些情况下，与抗体或其结合片段融合的IL-2多肽进一步与一个或多个以下所述的缀合部分缀合。
天然和非天然氨基酸
在一些实施方案中，在与缀合部分结合(或反应)之前，将本文所述的氨基酸残基(例如，在细胞因子如IL-2内)突变为赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸。例如，赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的侧链可与本文所述的缀合部分结合。在一些情况下，该氨基酸残基被突变为半胱氨酸、赖氨酸或组氨酸。在一些情况下，该氨基酸残基被突变为半胱氨酸。在一些情况下，该氨基酸残基被突变为赖氨酸。在一些情况下，该氨基酸残基被突变为组氨酸。在一些情况下，该氨基酸残基被突变为酪氨酸。在一些情况下，该氨基酸残基被突变为色氨酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸不与缀合部分缀合。在一些实施方案中，本文所述的细胞因子包含非天然氨基酸，其中该细胞因子与蛋白质缀合，其中连接点不是所述非天然氨基酸。
在一些实施方案中，在与缀合部分结合之前，将本文所述的氨基酸残基(例如，在细胞因子如IL-2内)突变为非天然氨基酸。在一些情况下，向非天然氨基酸的突变防止或最小化免疫系统的自身抗原应答。如本文所用的，术语“非天然氨基酸”是指除蛋白质中天然存在的20种氨基酸以外的氨基酸。非天然氨基酸的非限制性实例包括：对乙酰基-L-苯丙氨酸、对碘-L-苯丙氨酸、对甲氧基苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对硼酸基苯丙氨酸、O-炔丙基酪氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰丝氨酸、膦酰酪氨酸、对溴苯丙氨酸、硒代半胱氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、叠氮基-赖氨酸(AzK)、酪氨酸氨基酸的非天然类似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然类似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然类似物；丝氨酸氨基酸的非天然类似物；苏氨酸氨基酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤代、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒代、酯、硫代酸、硼酸盐、硼酸酯、磷酸基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸，或其组合；具有可光活化的交联体的氨基酸；旋转标记的氨基酸；荧光氨基酸；金属结合氨基酸；含金属的氨基酸；放射性氨基酸；光笼化和/或可光异构化的氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；含酮的氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学裂解或可光裂解的氨基酸；具有延长的侧链的氨基酸；含有毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸；碳连接的含糖氨基酸；氧化还原活性氨基酸；含α-羟基的酸；氨基硫代酸；α,α二取代的氨基酸；β-氨基酸；除脯氨酸或组氨酸以外的环状氨基酸，以及除苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸以外的芳族氨基酸。
在一些实施方案中，所述非天然氨基酸包含选择性反应性基团，或用于目标多肽的位点选择性标记的反应性基团。在一些情况下，所述化学法是双正交反应(例如，生物相容性和选择性反应)。在一些情况下，该化学法是Cu(I)催化的或“无铜的”炔烃-叠氮化物三唑形成反应、Staudinger连接、反电子需求Diels-Alder(IEDDA)反应、“光点击”化学法或金属介导的过程，如烯烃复分解和Suzuki-Miyaura或Sonogashira交叉偶合。
在一些实施方案中，所述非天然氨基酸包含光反应性基团，该基团在用例如UV照射时交联。
在一些实施方案中，所述非天然氨基酸包括光笼化的氨基酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是对位取代的、间位取代的或邻位取代的氨基酸衍生物。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包括对乙酰基-L-苯丙氨酸、对碘-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、对甲氧基苯丙氨酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-多巴、氟代苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰丝氨酸、膦酰酪氨酸、对-溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸或异丙基-L-苯丙氨酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是3-氨基酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3,4-二羟基-苯丙氨酸或3-碘酪氨酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是苯基硒代半胱氨酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是含有苯甲酮、酮、碘化物、甲氧基、乙酰基、苯甲酰基或叠氮化物的苯丙氨酸衍生物。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是含有苯甲酮、酮、碘化物、甲氧基、乙酰基、苯甲酰基或叠氮化物的赖氨酸衍生物。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包含芳族侧链。
在一些情况下，所述非天然氨基酸不包含芳族侧链。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包含叠氮基。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包含Michael受体基团。在一些情况下，Michael受体基团包含能够通过1,2-加成反应形成共价键的不饱和部分。在一些情况下，Michael受体基团包括缺电子的烯烃或炔烃。在一些情况下，Michael受体基团包括但不限于α,β不饱和的：酮、醛、亚砜、砜、腈、亚胺或芳族化合物。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是脱氢丙氨酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包含醛或酮基团。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是包含醛或酮基团的赖氨酸衍生物。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是在β、γ或δ位置包含一个或多个O、N、Se或S原子的赖氨酸衍生物。在一些情况下，所述非天然氨基酸是在γ位置包含O、N、Se或S原子的赖氨酸衍生物。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是赖氨酸衍生物，其中εN原子被氧原子替代。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是赖氨酸衍生物，其不是天然存在的翻译后修饰的赖氨酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是包含侧链的氨基酸，其中从α位置起的第六个原子包含羰基。在一些情况下，所述非天然氨基酸是包含侧链的氨基酸，其中从α位置起的第六个原子包含羰基，并且从α位置起的第五个原子是氮。在一些情况下，所述非天然氨基酸是包含侧链的氨基酸，其中从α位置起的第七个原子是氧原子。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是包含硒的丝氨酸衍生物。在一些情况下，所述非天然氨基酸是硒代丝氨酸(2-氨基-3-羟基硒代丙酸)。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒基)丙酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-3-(苯基硒基)丙酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸包含硒，其中该硒的氧化导致形成包含烯烃的非天然氨基酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包含环辛炔基。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包含反式环辛烯基。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包含降冰片烯基。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包含环丙烯基。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包含双吖丙啶基团。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包含四嗪基团。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是赖氨酸衍生物，其中侧链氮被氨基甲酰化。在一些情况下，所述非天然氨基酸是赖氨酸衍生物，其中侧链氮被酰化。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-6-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}己酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-6-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}己酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-Boc-N6-甲基赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-乙酰基赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是吡咯赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-三氟乙酰基赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-6-{[(苄氧基)羰基]氨基]己酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-6-{[(对碘苄氧基)羰基]氨基}己酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-6-{[(对硝基苄氧基)羰基]氨基}己酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-脯氨酰赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-6-{[(环戊基氧基)羰基]氨基]己酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-(环戊烷羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-(四氢呋喃-2-羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-(3-乙炔基四氢呋喃-2-羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-6-{[((2-叠氮基环戊基氧基)羰基]氨基]己酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((2-叠氮基乙氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-6-{[(2-硝基苄氧基)羰基]氨基}己酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-6-{[(2-环辛炔基氧基)羰基]氨基}己酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-(2-氨基丁-3-炔酰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-6-((2-氨基丁-3-炔酰基)氧基)己酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-(烯丙基氧基羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-(丁烯基-4-氧基羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-(戊烯基-5-氧基羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((丁-3-炔-1-基氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((戊-4-炔-1-基氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-(噻唑烷-4-羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-8-氧代壬酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-8-氧代辛酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-(2-氧代乙酰基)赖氨酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-丙酰基赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-丁酰基赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-(丁-2-烯酰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((螺[2.3]己-1-烯-5-基甲氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-(((4-(1-(三氟甲基)环丙-2-烯-1-基)苄基)氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基甲氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是半胱氨酰赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)乙氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((2-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)乙氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((间硝基苄氧基)N6-甲基羰基)赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基)羰基)-赖氨酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸是N6-((环庚-3-烯-1-基氧基)羰基)-L-赖氨酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸是2-氨基-3-(((((苄氧基)羰基)氨基)甲基)硒基)丙酸。
在一些实施方案中，所述非天然氨基酸通过改变目的的琥珀、卵白石或赭石终止密码子掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。
在一些实施方案中，所述非天然氨基酸通过4-碱基密码子掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。
在一些实施方案中，所述非天然氨基酸通过改变目的的稀有有义密码子掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。
在一些实施方案中，所述非天然氨基酸通过包含非天然核酸的合成密码子掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。在一些情况下，所述非天然氨基酸通过正交的、修饰的合成酶/tRNA对掺入细胞因子中。这类正交对包含这样的非天然合成酶：其能够使非天然tRNA加载非天然氨基酸，同时使a)其他内源氨基酸向非天然tRNA上的加载和b)非天然氨基酸向其他内源tRNA上的加载最小化。这类正交对包含这样的tRNA：其能够被非天然合成酶加载，同时避免被内源合成酶加载a)其他内源氨基酸。在一些实施方案中，从各种生物体，如细菌、酵母、古菌或人类来源中鉴定出这样的对。在一些实施方案中，正交合成酶/tRNA对包含来自单一生物体的组分。在一些实施方案中，正交合成酶/tRNA对包含来自两种不同生物体的组分。在一些实施方案中，正交合成酶/tRNA对包含在修饰之前促进两个不同氨基酸的翻译的组分。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的丙氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的精氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的天冬酰胺合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的天冬氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的半胱氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的谷氨酰胺合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的谷氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的丙氨酸甘氨酸。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的组氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的亮氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的异亮氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的赖氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的甲硫氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的苯丙氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的脯氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的丝氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的苏氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的色氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的酪氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的缬氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是修饰的磷酸丝氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的丙氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的精氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的天冬酰胺tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的天冬氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的半胱氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的谷氨酰胺tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的谷氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的丙氨酸甘氨酸。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的组氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的亮氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的异亮氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的赖氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的甲硫氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的苯丙氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的脯氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的丝氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的苏氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的色氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的酪氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的缬氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的磷酸丝氨酸tRNA。
在一些实施方案中，所述非天然氨基酸通过氨基酰基(aaRS或RS)-tRNA合成酶-tRNA对掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。示例性的aaRS-tRNA对包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(Mj-Tyr)aaRS/tRNA对、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)tRNACUA对、大肠杆菌LeuRS(Ec-Leu)/嗜热脂肪芽孢杆菌tRNACUA对和吡咯赖氨酰-tRNA对。在一些情况下，所述非天然氨基酸通过Mj-TyrRS/tRNA对掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。可以被Mj-TyrRS/tRNA对掺入的示例性UAA包括但不限于对位取代的苯丙氨酸衍生物，如对氨基苯丙氨酸和对甲氧基苯丙氨酸；间位取代的酪氨酸衍生物，如3-氨基酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸和3-碘酪氨酸；苯基硒代半胱氨酸；对硼酸基苯丙氨酸；和邻硝基苄基酪氨酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸通过Ec-Tyr/tRNACUA或Ec-Leu/tRNACUA对掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。可以通过Ec-Tyr/tRNACUA或Ec-Leu/tRNACUA对掺入的示例性UAA包括但不限于含有苯甲酮、酮、碘化物或叠氮化物取代基的苯丙氨酸衍生物；O-炔丙基酪氨酸；α-氨基辛酸、O-甲基酪氨酸、O-硝基苄基半胱氨酸；和3-(萘-2-基氨基)-2-氨基-丙酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸通过吡咯赖氨酰-tRNA对掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。在一些情况下，PylRS获自古菌，例如获自产甲烷的古菌。在一些情况下，PylRS获自巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)或乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)。可以通过吡咯赖氨酰-tRNA对掺入的示例性UAA包括但不限于酰胺和氨基甲酸酯取代的赖氨酸，如2-氨基-6-((R)-四氢呋喃-2-甲酰胺基)己酸、N-ε-D-脯氨酰基-L-赖氨酸和N-ε-环戊氧羰基-L-赖氨酸；N-ε-丙烯酰基-L-赖氨酸；N-ε-[(1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)乙氧基)羰基]-L-赖氨酸；和N-ε-(1-甲基环丙-2-烯甲酰胺基)赖氨酸。
在一些情况下，通过US 9,988,619和US 9,938,516中公开的合成酶将非天然氨基酸掺入本文所述的细胞因子(例如，IL多肽)中。可被此类合成酶掺入的示例性UAA包括对甲基叠氮基-L-苯丙氨酸，芳烷基、杂环基、杂芳烷基非天然氨基酸，等等。在一些实施方案中，此类UAA包含吡啶基、吡嗪基、吡唑基、三唑基、噁唑基、噻唑基、噻吩基或其他杂环。在一些实施方案中，此类氨基酸包含叠氮化物、四嗪或其他能够与偶联配偶体如水溶性部分缀合的化学基团。在一些实施方案中，此类合成酶被表达并用来在体内将UAA掺入细胞因子中。在一些实施方案中，使用无细胞翻译系统，利用此类合成酶将UAA掺入细胞因子中。
在一些情况下，通过天然存在的合成酶将非天然氨基酸掺入本文所述的细胞因子(例如，IL多肽)中。在一些实施方案中，通过对一种或多种氨基酸为营养缺陷型的生物体将非天然氨基酸掺入细胞因子中。在一些实施方案中，对应于营养缺陷型氨基酸的合成酶能够使相应的tRNA加载非天然氨基酸。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸是硒代半胱氨酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸是硒代甲硫氨酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸是芳族氨基酸，其中该芳族氨基酸包含芳基卤化物，如碘化物。在实施方案中，所述非天然氨基酸在结构上类似于营养缺陷型氨基酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包括图1所示的非天然氨基酸。
在一些情况下，所述非天然氨基酸包括赖氨酸或苯丙氨酸衍生物或类似物。在一些情况下，所述非天然氨基酸包括赖氨酸衍生物或赖氨酸类似物。在一些情况下，所述非天然氨基酸包括吡咯赖氨酸(Pyl)。在一些情况下，所述非天然氨基酸包括苯丙氨酸衍生物或苯丙氨酸类似物。在一些情况下，所述非天然氨基酸是Wan等人,“Pyrrolysyl-tRNAsynthetase:an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansiontool,”Biocheim Biophys Aceta 1844(6):1059-4070(2014)描述的非天然氨基酸。在一些情况下，所述非天然氨基酸包括图2(例如，图2A和图2B)所示的非天然氨基酸。
在一些实施方案中，所述非天然氨基酸包括图3A-图3D(采自Dumas等人,ChemicalScience 2015,6,50-69的表1)所示的非天然氨基酸。
在一些实施方案中，掺入本文所述的细胞因子(例如，IL多肽)中的非天然氨基酸公开于US 9,840,493；US 9,682,934；US 2017/0260137；US 9,938,516；或US 2018/0086734。可被此类合成酶掺入的示例性UAA包括对甲基叠氮基-L-苯丙氨酸，芳烷基、杂环基和杂芳烷基，以及赖氨酸衍生物非天然氨基酸。在一些实施方案中，此类UAA包含吡啶基、吡嗪基、吡唑基、三唑基、噁唑基、噻唑基、噻吩基或其他杂环。在一些实施方案中，此类氨基酸包含叠氮化物、四嗪或其他能够与偶联配偶体如水溶性部分缀合的化学基团。在一些实施方案中，UAA包含经由烷基连接体连接至芳族部分的叠氮化物。在一些实施方案中，烷基连接体是C1-C10连接体。在一些实施方案中，UAA包含经由烷基连接体连接至芳族部分的四嗪。在一些实施方案中，UAA包含经由氨基连接至芳族部分的四嗪。在一些实施方案中，UAA包含经由烷基氨基连接至芳族部分的四嗪。在一些实施方案中，UAA包含经由烷基链连接至氨基酸侧链的末端氮(例如，赖氨酸衍生物的N6，或包含较短烷基侧链的衍生物的N5、N4或N3)的叠氮化物。在一些实施方案中，UAA包含经由烷基链连接至氨基酸侧链的末端氮的四嗪。在一些实施方案中，UAA包含经由烷基连接体连接至酰胺的叠氮化物或四嗪。在一些实施方案中，该UAA是3-氨基丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸或其衍生物的含叠氮化物或四嗪的氨基甲酸酯或酰胺。在一些实施方案中，在体内将此类UAA掺入细胞因子中。在一些实施方案中，在无细胞系统中将此类UAA掺入细胞因子中。
缀合部分
在某些实施方案中，本文公开了与上文描述的一种或多种细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)结合的缀合部分。在一些情况下，该缀合部分是干扰细胞因子与其受体相互作用的分子。在一些情况下，该缀合部分是当与细胞因子键合时能够使细胞因子缀合物调节免疫应答的任何分子。在一些情况下，该缀合部分包含水溶性聚合物。在其他情况下，该缀合部分包含蛋白质或其结合片段。在另外的情况下，该缀合部分包含肽。在另外的情况下，该缀合部分包含核酸。在另外的情况下，该缀合部分包含小分子。在一些情况下，该缀合部分延长血清半衰期，并且/或者改善稳定性。在一些情况下，该缀合部分降低细胞因子与一个或多个细胞因子受体结构域或亚基的相互作用。在另外的情况下，该缀合部分阻断一个或多个细胞因子结构域或亚基与其同源受体的细胞因子相互作用。在一些实施方案中，本文所述的细胞因子缀合物包含多个缀合部分。在一些实施方案中，缀合部分连接至细胞因子肽中的非天然或天然氨基酸。在一些实施方案中，细胞因子缀合物包含连接至天然氨基酸的缀合部分。在一些实施方案中，细胞因子缀合物连接至细胞因子肽中的非天然氨基酸。在一些实施方案中，缀合部分连接至细胞因子肽的N或C末端氨基酸。本文公开了各种组合位点，例如，第一缀合部分连接至细胞因子肽中的非天然或天然氨基酸，而第二缀合部分连接至细胞因子肽的N或C末端氨基酸。在一些实施方案中，单个缀合部分连接至细胞因子肽的多个残基(例如钉(staple))。在一些实施方案中，缀合部分与细胞因子肽的N和C末端氨基酸均连接。
水溶性聚合物
在一些实施方案中，本文描述的缀合部分是水溶性聚合物。在一些情况下，该水溶性聚合物是非肽的、无毒的且生物相容的。如本文所用的，如果根据临床医生，例如医师、毒理学家或临床开发专家的评价，针对活组织(例如，施用于患者)与单独使用某物质或与另一种物质(例如活性剂，如细胞因子部分)组合使用该物质相关的有益效果超过了任何有害作用，则该物质被认为是生物相容的。在一些情况下，水溶性聚合物进一步是非免疫原性的。在一些情况下，如果某物质在体内的预期使用不产生不希望的免疫应答(例如，抗体的形成)，或者如果产生免疫应答，但根据临床医生，例如医师、毒理学家或临床开发专家的评价，认为这样的应答不具有临床意义或重要性，则该物质被认为是非免疫原性的。
在一些情况下，所述水溶性聚合物的特征在于具有约2个至约300个末端。示例性的水溶性聚合物包括但不限于聚(亚烷基二醇)，如聚乙二醇(“PEG”)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇与丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(PHPMA)、聚二甲基丙烯酰胺(PDAAm)、聚磷腈、聚噁唑啉(“POZ”)(在WO2008/106186中描述)、聚(N-丙烯酰基吗啉)，以及任何上述聚合物的组合。
在一些情况下，所述水溶性聚合物不限于特定的结构。在一些情况下，所述水溶性聚合物是直链的(例如封端的，例如烷氧基PEG或双官能PEG)、支链的或多臂的(例如，叉型PEG或与多元醇核心连接的PEG)、树枝状(或星型)架构，每种都带有或不带有一个或多个可降解的连接。此外，所述水溶性聚合物的内部结构可以以任何数目的不同重复模式来组织化，并且可以选自均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三元共聚物、无规三元共聚物和嵌段三元共聚物。
在一些实施方案中，所述IL-2缀合物中的水溶性聚合物的重均分子量为约100道尔顿至约150,000道尔顿。示例性的范围包括，例如，在大于5,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围内、在约6,000道尔顿至约90,000道尔顿的范围内、在约10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内、在大于10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内、在约20,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内、在约53,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内、在约25,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内、在约29,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内、在约35,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内以及在约40,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内的重均分子量。
所述水溶性聚合物的示例性重均分子量包括约100道尔顿、约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约1,500道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约4,500道尔顿、约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿和约75,000道尔顿。也可以使用总分子量为前述任何分子量的水溶性聚合物的支链形式(例如，由两个20,000道尔顿的聚合物组成的支链40,000道尔顿水溶性聚合物)。在一个或多个实施方案中，所述缀合物不具有直接或间接与重均分子量小于约6,000道尔顿的PEG连接的任何PEG部分。
PEG一般包含许多(OCH2CH2)单体[或(CH2CH2O)单体，取决于该PEG如何定义]。如本文所用的，重复单元的数目由“(OCH2CH2)n”中的下标“n”来标识。因此，(n)的值一般落在以下一个或多个范围内：2至约3400，约100至约2300，约100至约2270，约136至约2050，约225至约1930，约450至约1930，约1200至约1930，约568至约2727，约660至约2730，约795至约2730，约795至约2730，约909至约2730，以及约1,200至约1,900。对于任何已知分子量的给定聚合物，可以通过将该聚合物的总重均分子量除以重复单体的分子量来确定重复单元的数目(即“n”)。
在一些情况下，所述水溶性聚合物是封端的聚合物，即，至少一个末端被相对惰性的基团如低级C1-6烷氧基或羟基封端的聚合物。当聚合物是PEG时，例如，可以使用甲氧基-PEG(通常称为mPEG)，其为PEG的直链形式，其中该聚合物的一个末端是甲氧基(—OCH3)基团，而另一个末端是可以任选地化学修饰的羟基或其他官能团。
在一些实施方案中，示例性的水溶性聚合物包括但不限于来自QuantaBiodesign,Ltd的直链或支链离散PEG(dPEG)；来自Nektar Therapeutics的直链、支链或叉型PEG；以及来自JenKem Technology的Y形PEG衍生物。
在一些实施方案中，本文所述的细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与选自以下的水溶性聚合物缀合：聚(亚烷基二醇)，如聚乙二醇(“PEG”)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇与丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚二甲基丙烯酰胺(PDAAm)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(PHPMA)、聚磷腈、聚噁唑啉(“POZ”)、聚(N-丙烯酰基吗啉)及其组合。在一些情况下，该细胞因子多肽与PEG缀合(例如，PEG化)。在一些情况下，该细胞因子多肽与PPG缀合。在一些情况下，该细胞因子多肽与POZ缀合。在一些情况下，该细胞因子多肽与PVP缀合。
在一些实施方案中，本文所述的IL-2多肽与选自以下的水溶性聚合物缀合：聚(亚烷基二醇)，如聚乙二醇(“PEG”)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇与丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚二甲基丙烯酰胺(PDAAm)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(PHPMA)、聚磷腈、聚噁唑啉(“POZ”)、聚(N-丙烯酰基吗啉)及其组合。在一些情况下，该IL-2多肽与PEG缀合(例如，PEG化)。在一些情况下，该IL-2多肽与PPG缀合。在一些情况下，该IL-2多肽与POZ缀合。在一些情况下，该IL-2多肽与PVP缀合。
在一些情况下，水溶性聚合物包括聚甘油(PG)。在一些情况下，该聚甘油是超支化PG(HPG)(例如，如Imran等人.“Influence of architecture of high molecular weightlinear and branched polyglycerols on their biocompatibility andbiodistribution,”Biomaterials33:9135–9147(2012)所述)。在其他情况下，该聚甘油是直链PG(LPG)。在另外的情况下，该聚甘油是中官能性PG、直链嵌段超支化PG(例如，如Wurm等人,“Squaric acid mediated synthesis and biological activity of a library oflinear and hyperbranched poly(glycerol)-protein conjugates,”Biomacromolecules13:1161–1171(2012)所述)，或侧链官能性PG(例如，如Li等人,“Synthesis of linear polyether polyol derivatives as new materials forbioconjugation,”Bioconjugate Chem.20:780–789(2009)所述)。
在一些情况下，本文所述的细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽缀合至PG，例如，HPG、LPG、中官能性PG、直链-嵌段-超支化PG或侧链官能性PG。在一些情况下，该细胞因子是IL-2多肽。在一些情况下，该IL-2多肽与PG、中官能性PG、直链嵌段超支化PG缀合。
在一些实施方案中，水溶性聚合物是可降解的合成PEG替代物。示例性的可降解的合成PEG替代物包括但不限于聚[寡聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯](POEGMA)；通过远螯(telechelic)或基于二末端官能化PEG的大分子单体聚合而生成的骨架修饰的PEG衍生物；包含含有可降解键的共聚单体的PEG衍生物，如聚[(环氧乙烷)-共-(亚甲基环氧乙烷)][P(EO-共-MEO)]，环状烯酮缩醛，如与OEGMA共聚的5,6-苯并-2-亚甲基-1,3-二氧杂环庚烷(BMDO)、2-亚甲基-1,3-二氧杂环庚烷(MDO)和2-亚甲基-4-苯基-1,3-二氧戊环(MPDL)；或聚(ε-己内酯)-接枝-聚(环氧乙烷)(PCL-g-PEO)。
在一些情况下，本文所述的细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽缀合至可降解的合成PEG替代物，例如POEGM；通过远螯或基于二末端官能化PEG的大分子单体聚合而生成的骨架修饰的PEG衍生物；P(EO-共-MEO)；环状烯酮缩醛，如与OEGMA共聚的BMDO、MDO和MPDL；或PCL-g-PEO。在一些情况下，该细胞因子是IL-2多肽。在一些情况下，该IL-2多肽缀合至可降解的合成PEG替代物，例如POEGM；通过远螯或基于二末端官能化PEG的大分子单体聚合而生成的骨架修饰的PEG衍生物；P(EO-共-MEO)；环状烯酮缩醛，如与OEGMA共聚的BMDO、MDO和MPDL；或PCL-g-PEO。
在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(两性离子)。示例性的聚(两性离子)包括但不限于聚(硫代甜菜碱甲基丙烯酸酯)(PSBMA)、聚(羧基甜莱碱甲基丙烯酸酯)(PCBMA)和聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)(PMPC)。在一些情况下，本文所述的细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与聚(两性离子)如PSBMA、PCBMA或PMPC缀合。在一些情况下，该细胞因子是IL-2多肽。在一些情况下，该IL-2多肽与聚(两性离子)如PSBMA、PCBMA或PMPC缀合。
在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚碳酸酯。示例性的聚碳酸酯包括但不限于5-甲基-2-氧代-1,3-二氧六环-5-甲酸五氟苯酯(MTC-OC6F5)。在一些情况下，本文所述的细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与聚碳酸酯如MTC-OC6F5缀合。在一些情况下，该细胞因子是IL-2多肽。在一些情况下，该IL-2多肽与聚碳酸酯如MTC-OC6F5缀合。
在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚合物杂合体，例如聚碳酸酯/PEG聚合物杂合体、肽/蛋白质-聚合物缀合物或含羟基的和/或两性离子衍生的聚合物(例如，含羟基的和/或两性离子衍生的PEG聚合物)。在一些情况下，本文所述的细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽缀合至聚合物杂合体，如聚碳酸酯/PEG聚合物杂合体、肽/蛋白质-聚合物缀合物或含羟基的和/或两性离子衍生的聚合物(例如，含羟基的和/或两性离子衍生的PEG聚合物)。在一些情况下，该细胞因子是IL-2多肽。在一些情况下，该IL-2多肽缀合至聚合物杂合体，如聚碳酸酯/PEG聚合物杂合体、肽/蛋白质-聚合物缀合物或含羟基的和/或两性离子衍生的聚合物(例如，含羟基的和/或两性离子衍生的PEG聚合物)。
在一些情况下，水溶性聚合物包括多糖。示例性的多糖包括但不限于葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与多糖缀合。在一些情况下，IL-2多肽与葡聚糖缀合。在一些情况下，IL-2多肽与PSA缀合。在一些情况下，IL-2多肽与HA缀合。在一些情况下，IL-2多肽与直链淀粉缀合。在一些情况下，IL-2多肽与肝素缀合。在一些情况下，IL-2多肽与HS缀合。在一些情况下，IL-2多肽与糊精缀合。在一些情况下，IL-2多肽与HES缀合。
在一些情况下，水溶性聚合物包括聚糖。聚糖的示例性类别包括N-连接的聚糖、O-连接的聚糖、糖脂、O-GlcNAc和糖胺聚糖。在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与聚糖缀合。在一些情况下，IL-2多肽与N-连接的聚糖缀合。在一些情况下，IL-2多肽与O-连接的聚糖缀合。在一些情况下，IL-2多肽与糖脂缀合。在一些情况下，IL-2多肽与O-GlcNAc缀合。在一些情况下，IL-2多肽与糖胺聚糖缀合。
在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚噁唑啉聚合物。聚噁唑啉聚合物是直链合成聚合物，并且类似于PEG，具有低多分散性。在一些情况下，聚噁唑啉聚合物是以平均分子量表征的多分散的聚噁唑啉聚合物。在一些情况下，聚噁唑啉聚合物的平均分子量包括，例如，1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000、100,000、200,000、300,000、400,000或500,000Da。在一些情况下，聚噁唑啉聚合物包括聚(2-甲基2-噁唑啉)(PMOZ)、聚(2-乙基2-噁唑啉)(PEOZ)或聚(2-丙基2-噁唑啉)(PPOZ)。在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与聚噁唑啉聚合物缀合。在一些情况下，IL-2多肽与聚噁唑啉聚合物缀合。在一些情况下，IL-2多肽与PMOZ缀合。在一些情况下，IL-2多肽与PEOZ缀合。在一些情况下，IL-2多肽与PPOZ缀合。
在一些情况下，水溶性聚合物包括聚丙烯酸聚合物。在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与聚丙烯酸聚合物聚合物缀合。在一些情况下，IL-2多肽与聚丙烯酸聚合物缀合。
在一些情况下，水溶性聚合物包括多胺。多胺是包含两个或更多个伯氨基的有机聚合物。在一些实施方案中，多胺包括支链多胺、直链多胺或环状多胺。在一些情况下，多胺是低分子量的直链多胺。示例性的多胺包括腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、乙二胺、1,3-二氨基丙烷、六亚甲基二胺、四乙基亚甲基二胺和哌嗪。在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与多胺缀合。在一些情况下，IL-2多肽与多胺缀合。在一些情况下，IL-2多肽与腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、乙二胺、1,3-二氨基丙烷、六亚甲基二胺、四乙基亚甲基二胺或哌嗪缀合。
在一些情况下，水溶性聚合物描述于美国专利7,744,861、8,273,833和7,803,777。在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与美国专利7,744,861、8,273,833或7,803,777中描述的连接体缀合。在一些情况下，IL-2多肽与美国专利7,744,861、8,273,833或7,803,777中描述的连接体缀合。
蛋白质
在一些实施方案中，本文描述的缀合部分是蛋白质或其结合片段。示例性的蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白或运甲状腺素蛋白。在一些情况下，该蛋白质或其结合片段包括抗体或其结合片段。在一些情况下，细胞因子缀合物包含蛋白质或其结合片段。在一些情况下，包含蛋白质或其结合片段的IL-2缀合物具有增加的血清半衰期和/或稳定性。在一些情况下，包含蛋白质或其结合片段的IL-2缀合物具有降低的IL-2与一个或多个IL-2R亚基的相互作用。在另外的情况下，该蛋白质或其结合片段阻断IL-2与一个或多个IL-2R亚基的相互作用，或影响IL-2Rβγ信号传导复合物的装配。
在一些实施方案中，所述缀合部分是白蛋白。白蛋白是一系列水溶性球状蛋白质。它通常在血浆中发现，占全部血浆蛋白质的约55-60％。人血清白蛋白(HSA)是585个氨基酸的多肽，其中三级结构分为三个结构域：结构域I(氨基酸残基1-195)、结构域II(氨基酸残基196-383)和结构域III(氨基酸残基384-585)。每个结构域进一步包含结合位点，该结合位点可以与内源性配体如长链和中链脂肪酸、胆红素或血红素或者外源性化合物如杂环或芳族化合物可逆或不可逆地相互作用。
在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与白蛋白缀合。在一些情况下，该细胞因子多肽与人血清白蛋白(HSA)缀合。在另外的情况下，该细胞因子多肽与白蛋白的功能片段缀合。
在一些情况下，IL-2多肽与白蛋白缀合。在一些情况下，该IL-2多肽与人血清白蛋白(HSA)缀合。在另外的情况下，该IL-2多肽与白蛋白的功能片段缀合。
在一些实施方案中，所述缀合部分是转铁蛋白。转铁蛋白是大小约为80kDa的679个氨基酸的多肽，并且包含两个Fe3+结合位点，其中一个在N-末端结构域处，而另一个在C-末端结构域处。在一些情况下，人转铁蛋白的半衰期约为7-12天。
在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与转铁蛋白缀合。在一些情况下，该细胞因子多肽与人转铁蛋白缀合。在另外的情况下，该细胞因子多肽与转铁蛋白的功能片段缀合。
在一些情况下，IL-2多肽与转铁蛋白缀合。在一些情况下，该IL-2多肽与人转铁蛋白缀合。在另外的情况下，该IL-2多肽与转铁蛋白的功能片段缀合。
在一些实施方案中，所述缀合部分是运甲状腺素蛋白(TTR)。运甲状腺素蛋白是位于血清和脑脊液中的转运蛋白，其转运甲状腺激素甲状腺素(T4)和与视黄醇结合的视黄醇结合蛋白。
在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与运甲状腺素蛋白缀合(通过其末端之一或通过内部铰链区)。在一些情况下，该细胞因子多肽与运甲状腺素蛋白的功能片段缀合。
在一些情况下，IL-2多肽与运甲状腺素蛋白缀合(通过其末端之一或通过内部铰链区)。在一些情况下，该IL-2多肽与运甲状腺素蛋白的功能片段缀合。
在一些实施方案中，所述缀合部分是抗体或其结合片段。在一些情况下，抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、鼠抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab'、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、双-scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体(minibody)、纳米抗体、三抗体、四抗体、人抗体(humabody)、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科动物抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段、或其化学修饰的衍生物。
在一些情况下，所述缀合部分包含scFv、双-scFv、(scFv)2、dsFv或sdAb。在一些情况下，该缀合部分包含scFv。在一些情况下，该缀合部分包含双-scFv。在一些情况下，该缀合部分包含(scFv)2。在一些情况下，该缀合部分包含dsFv。在一些情况下，该缀合部分包含sdAb。
在一些情况下，所述缀合部分包含抗体的Fc部分，例如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc部分。在一些情况下，该部分包含IgG(例如，IgG1、IgG3或IgG4)的Fc部分。
在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与抗体或其结合片段缀合。在一些情况下，该细胞因子多肽与人源化抗体或其结合片段、鼠抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab'、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、双-scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体(minibody)、纳米抗体、三抗体、四抗体、人抗体(humabody)、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科动物抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段、或其化学修饰的衍生物缀合。在另外的情况下，该细胞因子多肽与抗体的Fc部分缀合。在另外的情况下，该细胞因子多肽与IgG(例如，IgG1、IgG3或IgG4)的Fc部分缀合。
在一些情况下，IL-2多肽与抗体或其结合片段缀合。在一些情况下，该IL-2多肽与人源化抗体或其结合片段、鼠抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab'、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、双-scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体(minibody)、纳米抗体、三抗体、四抗体、人抗体(humabody)、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科动物抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段、或其化学修饰的衍生物缀合。在另外的情况下，该IL-2多肽与抗体的Fc部分缀合。在另外的情况下，该IL-2多肽与IgG(例如，IgG1、IgG3或IgG4)的Fc部分缀合。
在一些实施方案中，IL-2多肽与水溶性聚合物(例如，PEG)和抗体或其结合片段缀合。在一些情况下，该抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、鼠抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab'、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、双-scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体(minibody)、纳米抗体、三抗体、四抗体、人抗体(humabody)、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科动物抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段、或其化学修饰的衍生物。在一些情况下，该抗体或其结合片段包含scFv、双-scFv、(scFv)2、dsFv或sdAb。在一些情况下，该抗体或其结合片段包含scFv。在一些情况下，该抗体或其结合片段将IL-2缀合物引导至目的靶细胞，并且所述水溶性聚合物增强稳定性和/或血清半衰期。
在一些情况下，一个或多个IL-2多肽-水溶性聚合物(例如，PEG)缀合物进一步与抗体或其结合片段结合。在一些情况下，IL-2缀合物与抗体之比约为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1或12:1。在一些情况下，IL-2缀合物与抗体之比约为1:1。在其他情况下，IL-2缀合物与抗体之比约为2:1、3:1或4:1。在另外的情况下，IL-2缀合物与抗体之比约为6:1或更高。
在一些实施方案中，所述一个或多个IL-2多肽-水溶性聚合物(例如，PEG)缀合物直接结合至所述抗体或其结合片段。在其他情况下，IL-2缀合物通过连接体间接地结合至抗体或其结合片段。示例性的连接体包括同双官能连接体、异双官能连接体、基于马来酰亚胺的连接体、零迹(zero-trace)连接体、自牺牲性(self-immolative)连接体、间隔基等。
在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段直接或间接地结合至所述IL-2多肽-水溶性聚合物(例如，PEG)缀合物的IL-2多肽部分。在这样的情况下，所述抗体针对IL-2多肽的缀合位点在不会阻碍IL-2多肽与IL-2Rβγ的结合的位点处。在另外的情况下，所述抗体针对IL-2多肽的缀合位点在部分阻断IL-2多肽与IL-2Rβγ的结合的位点处。在其他实施方案中，所述抗体或其结合片段直接或间接地结合至所述IL-2多肽-水溶性聚合物(例如，PEG)缀合物的水溶性聚合物部分。
肽
在一些实施方案中，本文所述的缀合部分是肽。在一些情况下，该肽是非结构化的肽。在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与肽缀合。在一些情况下，包含肽的IL-2缀合物具有增加的血清半衰期和/或稳定性。在一些情况下，包含肽的IL-2缀合物具有降低的IL-2与一个或多个IL-2R亚基的相互作用。在另外的情况下，该肽阻断IL-2与一个或多个IL-2R亚基的相互作用。
在一些情况下，所述缀合部分是XTENTM肽(Amunix Operating Inc.)，并且所述修饰被称为XTEN化。XTEN化是编码目的多肽的核酸与编码XTENTM肽(Amunix Operating Inc.)的核酸的遗传融合，XTENTM肽是一种长的非结构化亲水性肽，其包含不同百分比的六种氨基酸：Ala、Glu、Gly、Ser和Thr。在一些情况下，基于与目的多肽组合的性质如表达、遗传稳定性、溶解性、聚集抗性、增强的半衰期、增强的效力和/或增强的体外活性来选择XTENTM肽。在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与XTEN肽缀合。在一些情况下，IL-2多肽与XTEN肽缀合。
在一些情况下，所述缀合部分是富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)，并且所述修饰被称为HAP化。HAP化是编码目的多肽的核酸与编码富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)的核酸的遗传融合。在一些情况下，该HAP聚合物包含(Gly4Ser)n重复基序(SEQ ID NO:3)，并且有时长度为约50、100、150、200、250、300个或更多个残基。在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与HAP缀合。在一些情况下，IL-2多肽与HAP缀合。
在一些实施方案中，所述缀合部分是PAS多肽，并且所述修饰被称为PAS化。PAS化是编码目的多肽的核酸与编码PAS多肽的核酸的遗传融合。PAS多肽是由Pro、Ala和Ser残基组成的不带电荷的亲水性多肽。在一些情况下，PAS多肽的长度至少约为100、200、300、400、500或600个氨基酸。在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与PAS多肽缀合。在一些情况下，IL-2多肽与PAS多肽缀合。
在一些实施方案中，所述缀合部分是弹性蛋白样多肽(ELP)，并且所述修饰被称为ELP化。ELP化是编码目的多肽的核酸与编码弹性蛋白样多肽(ELP)的核酸的遗传融合。ELP包含VPGxG重复基序(SEQ ID NO:4)，其中x是除脯氨酸外的任何氨基酸。在一些情况下，细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽与ELP缀合。在一些情况下，IL-2多肽与ELP缀合。
在一些实施方案中，所述缀合部分是CTP肽。CTP肽包含31个氨基酸残基的肽FQSSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ(SEQ ID NO:5)，其中S*表示O-糖基化位点(OPKO)。在一些情况下，CTP肽与细胞因子多肽(例如，IL-2多肽)遗传融合。在一些情况下，细胞因子多肽(例如，IL-2多肽)与CTP肽缀合。
在一些实施方案中，细胞因子(例如，IL-2多肽)通过谷氨酰化进行修饰。谷氨酰化(或聚谷氨酰化)是谷氨酸的可逆翻译后修饰，其中谷氨酸的γ-羧基与游离谷氨酸的氨基形成肽样键，其中α-羧基延伸到聚谷氨酸链中。
在一些实施方案中，细胞因子(例如，IL-2多肽)被明胶样蛋白质(GLK)聚合物修饰。在一些情况下，该GLK聚合物包含Gly-Xaa-Yaa的多个重复，其中Xaa和Yaa分别主要包含脯氨酸和4-羟基脯氨酸。在一些情况下，该GLK聚合物进一步包含氨基酸残基Pro、Gly、Glu、Qln、Asn、Ser和Lys。在一些情况下，该GLK聚合物的长度为约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150个残基或更长。
额外的缀合部分
在一些情况下，所述缀合部分包含细胞外生物标志物。在一些情况下，该细胞外生物标志物是肿瘤抗原。在一些情况下，示例性的细胞外生物标志物物包括CD19、PSMA、B7-H3、B7-H6、CD70、CEA、CSPG4、EGFRvIII、EphA3、EpCAM、EGFR、ErbB2(HER2)、FAP、FRα、GD2、GD3、Lewis-Y、间皮素、Muc1、Muc 16、ROR1、TAG72、VEGFR2、CD11、Gr-1、CD204、CD16、CD49b、CD3、CD4、CD8和B220。在一些情况下，该缀合部分与细胞因子(例如，IL-2)键合或缀合。在一些情况下，该缀合部分例如在细胞因子(例如，IL-2)的N-末端或C-末端处遗传融合。
在一些情况下，所述缀合部分包含来自翻译后修饰的分子。在一些情况下，翻译后修饰的实例包括肉豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化(或异戊烯化)(例如，法呢基化或香叶酰香叶酰化)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、酰化(例如，O-酰化、N-酰化、S-酰化)、烷基化(例如，添加烷基，如甲基或乙基)、酰胺化、糖基化、羟基化、碘化、核苷酸添加、氧化、磷酸化、琥珀酰化、硫酸化、糖化、氨基甲酰化、谷氨酰化或脱酰胺。在一些情况下，所述细胞因子(例如，IL-2)通过翻译后修饰如肉豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化(或异戊烯化)(例如，法呢基化或香叶酰香叶酰化)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、酰化(例如，O-酰化、N-酰化、S-酰化)、烷基化(例如，添加烷基，如甲基或乙基)、酰胺化、糖基化、羟基化、碘化、核苷酸添加、氧化、磷酸化、琥珀酰化、硫酸化、糖化、氨基甲酰化、谷氨酰化或脱酰胺进行修饰。
缀合
连接体
在一些实施方案中，用于将缀合部分与本文所述的细胞因子多肽(例如，IL-2多肽)缀合或结合的有用的官能性反应性基团包括，例如，零阶或更高阶的连接体。在一些情况下，掺入本文所述的白介素中的非天然氨基酸包含官能性反应性基团。在一些情况下，连接体包含与掺入本文所述的白介素中的非天然氨基酸反应的官能性反应性基团。在一些情况下，缀合部分包含与掺入本文所述的白介素中的非天然氨基酸反应的官能性反应性基团。在一些情况下，缀合部分包含与本文所述的连接体(任选地预连接至细胞因子肽)反应的官能性反应性基团。在一些实施方案中，连接体包含与本文所述的细胞因子肽中的天然氨基酸反应的反应性基团。在一些情况下，高阶连接体包括双官能连接体，如同双官能连接体或异双官能连接体。示例性的同双官能连接体包括但不限于Lomant试剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3'3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基DST)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二亚胺代己二酸二甲酯(DMA)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、3,3'-二硫代二丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4-二-(3'-(2'-吡啶基二硫代)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)、含芳基卤的化合物(DFDNB)，例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3'-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α'-对二氨基二苯基、二碘-对二甲苯磺酸、N,N'-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N'-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。
在一些实施方案中，所述双官能连接体包括异双官能连接体。示例性的异双官能连接体包括但不限于胺反应性和巯基交联体，如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(sPDP)、长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(LC-sPDP)、水溶性长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代]-甲苯甲酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、琥珀酰亚胺基6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(sIAX)、琥珀酰亚胺基6-[6-(((碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸酯(sIAXX)、琥珀酰亚胺基4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(sIAC)、琥珀酰亚胺基6-((((4-(碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸酯(sIACX)、对硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)，羰基反应性和巯基反应性交联剂，如4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼(PDPH)，胺反应性和光反应性交联体，如N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基水杨酰胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰胺基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧基琥珀酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮基苯基)1,3'-二硫代丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀酰亚胺基(4-叠氮基苯基)-1,3'-二硫代丙酸酯(磺基-sADP)、磺基琥珀酰亚胺基4-(对叠氮基苯基)丁酸酯(磺基-sAPB)、磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAED)、磺基琥珀酰亚胺基7-叠氮基-4-甲基香豆素3-乙酸酯(磺基-sAMCA)、对硝基苯基重氮基丙酮酸(pNPDP)、对硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)，巯基反应性和光反应性交联体，如1-(对叠氮基水杨酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺(APDP)、苯甲酮-4-碘乙酰胺，苯甲酮-4-马来酰亚胺羰基反应性和光反应性交联体，如对叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)，羧酸反应性和光反应性交联体，如4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁胺(AsBA)，以及精氨酸反应性和光反应性交联体，如对叠氮基苯基乙二醛(APG)。
在一些情况下，所述反应性官能团包括对存在于结合部分上(例如，缀合部分上或IL-2上)的亲电子基团具有反应性的亲核基团。示例性的亲电子基团包括羰基——如醛、酮、羧酸、酯、酰胺、烯酮、酰基卤或酸酐。在一些实施方案中，所述反应性官能团是醛。示例性的亲核基团包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。
在一些实施方案中，所述连接体是可裂解的连接体。在一些实施方案中，该可裂解的连接体是二肽连接体。在一些实施方案中，该二肽连接体是缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)、苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)、缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)和缬氨酸-赖氨酸(Val-Lys)。在一些实施方案中，该二肽连接体是缬氨酸-瓜氨酸。
在一些实施方案中，所述连接体是包含例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个氨基酸的肽连接体。在一些情况下，该肽连接体包含至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45、50个或更少的氨基酸。在另外的情况下，该肽连接体包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。
在一些实施方案中，所述连接体包含自牺牲性连接体部分。在一些实施方案中，该自牺牲性连接体部分包含对氨基苄醇(PAB)、对氨基苄氧羰基(PABC)或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，该连接体包含二肽连接体部分和自牺牲性连接体部分。在一些实施方案中，该自牺牲性连接体部分例如在美国专利9089614和WIPO公开WO2015038426中描述。
在一些实施方案中，所述可裂解的连接体是葡糖苷酸。在一些实施方案中，该可裂解的连接体是酸可裂解的连接体。在一些实施方案中，该酸可裂解的连接体是肼。在一些实施方案中，该可裂解的连接体是可还原的连接体。
在一些实施方案中，所述连接体包含马来酰亚胺基团。在一些情况下，该马来酰亚胺基团也被称为马来酰亚胺间隔基。在一些情况下，该马来酰亚胺基团进一步包含己酸，从而形成马来酰亚胺基己酰基(mc)。在一些情况下，该连接体包含马来酰亚胺基己酰基(mc)。在一些情况下，连接体是马来酰亚胺基己酰基(mc)。在其他情况下，该马来酰亚胺基团包括以上描述的马来酰亚胺基甲基，如琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。
在一些情况下，所述马来酰亚胺基团是自稳定马来酰亚胺。在一些情况下，该自稳定马来酰亚胺利用二氨基丙酸(DPR)掺入与马来酰亚胺相邻的碱性氨基，以提供硫代琥珀酰亚胺环水解的分子内催化，从而避免马来酰亚胺通过逆Michael反应经历消除反应。在一些情况下，该自稳定马来酰亚胺是Lyon等人,“Self-hydrolyzing maleimides improvethe stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates,”Nat.Biotechnol.32(10):1059-1062(2014)描述的马来酰亚胺基团。在一些情况下，该连接体包含自稳定马来酰亚胺。在一些情况下，该连接体是自稳定马来酰亚胺。
缀合化学
各种缀合反应用来缀合连接体、缀合部分和掺入本文所述的细胞因子肽中的非天然氨基酸。此类缀合反应通常与水性条件如“生物正交”反应相容。在一些实施方案中，缀合反应由化学试剂如催化剂、光或在连接体、缀合部分或非天然氨基酸上发现的反应性化学基团介导。在一些实施方案中，缀合反应由酶介导。在一些实施方案中，本文使用的缀合反应在Gong,Y.,Pan,L.Tett.Lett.2015,56,2123中描述。在一些实施方案中，本文使用的缀合反应在Chen,X.；Wu.Y-W.Org.Biomol.Chem.2016,14,5417中描述。
在本文所述的一些实施方案中，缀合反应包括酮或醛与亲核试剂的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括酮与氨氧基反应形成肟的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括酮与芳基或杂芳基胺基团反应形成亚胺的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括醛与芳基或杂芳基胺基团反应形成亚胺的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应产生包含经由肟连接的连接体或缀合部分的细胞因子肽。在一些实施方案中，缀合反应包括醛或酮与色胺亲核试剂的Pictet-Spengler反应。在一些实施方案中，缀合反应包括肼基-Pictet-Spengler反应。在一些实施方案中，缀合反应包括Pictet-Spengler连接。
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括叠氮化物和膦的反应(Staudinger连接)。在一些实施方案中，该膦是芳基膦。在一些实施方案中，该芳基膦包含原酸酯基团。在一些实施方案中，该膦包含2-(二苯基膦基)苯甲酸甲酯结构。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应产生包含经由芳基酰胺连接的连接体或缀合部分的细胞因子肽。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应产生包含经由酰胺连接的连接体或缀合部分的细胞因子肽。
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括1,3-二极环加成反应。在一些实施方案中，该1,3-二极环加成反应包括叠氮化物和膦的反应(“点击”反应)。在一些实施方案中，所述缀合反应被铜催化。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应产生包含经由三唑连接的连接体或缀合部分的细胞因子肽。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括叠氮化物与张力(strained)烯烃的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括叠氮化物与张力炔烃的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括叠氮化物与环炔，例如OCT、DIFO、DIFBO、DIBO、BARAC、TMTH或其他张力环炔的反应，其结构在Gong,Y.,Pan,L.Tett.Lett.2015,56,2123中显示。在一些实施方案中，1,3-二极环加成反应被光催化(“光点击”)。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括末端烯丙基与四唑和光的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括末端炔基与四唑和光的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括O-烯丙基氨基酸与四嗪和光的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括O-烯丙基酪氨酸与四嗪和光的反应。
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括包含二烯和亲二烯体的反电子需求环加成反应。在一些实施方案中，该二烯包括四嗪。在一些实施方案中，该亲二烯体包括烯烃。在一些实施方案中，该亲二烯体包括炔烃。在一些实施方案中，该炔烃是张力炔烃。在一些实施方案中，该烯烃是张力二烯。在一些实施方案中，该炔烃是反式环辛炔。在一些实施方案中，该炔烃是环辛烯。在一些实施方案中，该烯烃是环丙烯。在一些实施方案中，该烯烃是氟环丙烯。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应导致形成经由在环中包含两个氮原子的6元环杂环连接至连接体或缀合部分的细胞因子肽。
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括烯烃复分解反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括烯烃和炔烃与钌催化剂的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括两个烯烃与钌催化剂的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括两个炔烃与钌催化剂的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括烯烃或炔烃与钌催化剂和包含烯丙基的氨基酸的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括烯烃或炔烃与钌催化剂和包含烯丙基硫醚或硒化物的氨基酸的反应。在一些实施方案中，钌催化剂是Hoveda-Grubbs第2代催化剂。在一些实施方案中，烯烃复分解反应包括一种或多种张力烯烃或炔烃的反应。
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括交叉偶合反应。在一些实施方案中，交叉偶合反应包含过渡金属催化剂，如铱、金、钌、铑、钯、镍、铂或其他过渡金属催化剂和一种或多种配体。在一些实施方案中，过渡金属催化剂是水溶性的。在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括Suzuki-Miyaura交叉偶合反应。在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括芳基卤(或三氟甲烷磺酸酯或甲苯磺酸酯)、芳基或烯基硼酸和钯催化剂的反应。在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括Sonogashira交叉偶合反应。在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括芳基卤(或三氟甲烷磺酸酯或甲苯磺酸酯)、炔烃和钯催化剂的反应。在一些实施方案中，交叉偶合反应导致连接体或缀合部分经由碳-碳键连接至细胞因子肽。
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括反应性基团在缀合之前的脱保护或“解笼”反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括用光使反应性基团解笼，随后进行缀合反应。在一些实施方案中，反应性基团用包含一个或多个硝基的芳烷基部分保护。在一些实施方案中，反应性基团的解笼产生游离胺、硫化物或其他反应性基团。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括用过渡金属催化剂使反应性基团解笼，随后进行缀合反应。在一些实施方案中，该过渡金属催化剂包含钯和一种或多种配体。在一些实施方案中，反应性基团用烯丙基部分保护。在一些实施方案中，反应性基团用氨基甲酸烯丙酯保护。在一些实施方案中，反应性基团用炔丙基部分保护。在一些实施方案中，反应性基团用氨基甲酸炔丙酯保护。在一些实施方案中，反应性基团用亲二烯体保护，其中暴露于二烯(如四嗪)导致该反应性基团的脱保护。
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括配体指导的反应，其中(任选地连接至反应性基团的)配体促进了反应性基团与细胞因子肽之间的缀合位点。在一些实施方案中，在细胞因子肽与反应性基团反应期间或之后裂解该配体。在一些实施方案中，该细胞因子肽的缀合位点是天然氨基酸。在一些实施方案中，该细胞因子肽的缀合位点是赖氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一些实施方案中，该细胞因子肽的缀合位点是本文所述的非天然氨基酸。在一些实施方案中，该反应性基团包含离去基团，如缺电子的芳基或杂芳基。在一些实施方案中，该反应性基团包含离去基团，如被细胞因子肽置换的缺电子的烷基。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括自由基捕获剂与自由基物质的反应。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括氧化自由基加成反应。在一些实施方案中，自由基捕获剂是芳基胺。在一些实施方案中，自由基物质是酪氨酰自由基。在一些实施方案中，自由基物质由钌催化剂(如[Ru(bpy)3])和光生成。
酶促反应任选地用于本文所述的缀合反应。示例性的酶促缀合包括SortA介导的缀合、TG介导的缀合或FGE介导的缀合。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括末端1-氨基-2-硫基与硫酯的天然蛋白质连接(NPL)以形成酰胺键。
本文描述了用于使连接体或缀合部分与细胞因子肽反应的各种缀合反应，其中该反应与细胞因子肽中的天然(“规范”)氨基酸发生。在一些实施方案中，该天然氨基酸在缀合位置处发现，该位置在野生型序列中发现，或者，该位置已被突变。在一些实施方案中，缀合反应包括在半胱氨酸残基处形成二硫键。在一些实施方案中，缀合反应包括半胱氨酸或赖氨酸的1,4-Michael加成反应。在一些实施方案中，缀合反应包括半胱氨酸的氰基苯并噻唑连接。在一些实施方案中，缀合反应包括与丙酮部分如1,3-二氯-2-丙酮的交联。在一些实施方案中，缀合反应包括通过半胱氨酸与O-均三甲苯磺酰基羟胺反应形成的脱氢丙氨酸的1,4-Michael加成。在一些实施方案中，缀合反应包括酪氨酸与三唑啉二酮(TAD)或TAD衍生物的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括色氨酸与铑卡宾体(carbenoid)的反应。
使用方法
自身免疫疾病或病症
在一些实施方案中，本文还描述了一种治疗有需要的受试者的自身免疫疾病或病症的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的本文所述的细胞因子缀合物(例如，IL-2缀合物)。在一些情况下，该IL-2缀合物包含分离并纯化的IL-2多肽和缀合部分，其中相对于野生型IL-2多肽，该IL-2缀合物对IL-2受体β(IL-2Rβ)亚基、IL-2受体γ(IL-2Rγ)亚基或其组合的亲和力降低。在一些情况下，该IL-2缀合物包含分离并纯化的IL-2多肽；以及在选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、R81、P82、R83、D84、S87、N88、N89、V91、I92、L94、E95、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112、T113、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133的氨基酸残基处与所述分离并纯化的IL-2多肽结合的缀合部分，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些情况下，该氨基酸残基选自K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、R81、D84、S87、N88、V91、I92、L94、E95、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133。在一些情况下，该氨基酸残基选自K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、D84、N88、E95和Q126。在一些情况下，所述IL-2缀合物与IL-2Rαβγ复合物相互作用，但对IL-2Rβ和IL-2Rγ亚基的亲和力降低，或减少IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集。在一些情况下，相对于野生型IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽维持对IL-2Rα的结合亲和力。在这样的情况下，所述IL-2/IL-2Rαβγ复合物刺激或增强CD4+Treg细胞的扩充。在另外的情况下，所述修饰的IL-2多肽增加经由IL-2Rβγ复合物激活Teff和/或NK细胞所需的剂量，从而扩大经由IL-2Rαβγ复合物激活Treg细胞的剂量范围(或扩大IL-2经由IL-2Rαβγ复合物激活Treg细胞的治疗窗)。
在一些情况下，所述自身免疫疾病或病症包括斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、1型糖尿病、青少年特发性关节炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、多发性硬化、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮、甲状腺炎、葡萄膜炎、白癜风或韦格纳肉芽肿病。
在一些情况下，将细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)缀合物施用于患有斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、1型糖尿病、青少年特发性关节炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、多发性硬化、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮、甲状腺炎、葡萄膜炎、白癜风或韦格纳肉芽肿病的受试者。
在一些情况下，将IL-2缀合物施用于患有斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、1型糖尿病、青少年特发性关节炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、多发性硬化、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮、甲状腺炎、葡萄膜炎、白癜风或韦格纳肉芽肿病的受试者。在一些情况下，将该IL-2缀合物施用于患有1型糖尿病的受试者。在一些情况下，将该IL-2缀合物施用于患有格雷夫斯病的受试者。在一些情况下，将该IL-2缀合物施用于患有多发性硬化的受试者。在一些情况下，将该IL-2缀合物施用于患有银屑病的受试者。在一些情况下，将该IL-2缀合物施用于患有类风湿性关节炎的受试者。在一些情况下，将该IL-2缀合物施用于患有舍格伦综合征的受试者。在一些情况下，将该IL-2缀合物施用于患有系统性红斑狼疮的受试者。在一些情况下，将该IL-2缀合物施用于患有葡萄膜炎的受试者。在一些情况下，将该IL-2缀合物施用于患有韦格纳肉芽肿病的受试者。
在一些情况下，将细胞因子缀合物(例如，IL-2缀合物)施用于受试者以供治疗移植物抗宿主疾病(GVHD)。
在一些实施方案中，进一步向受试者施用额外的治疗剂。在一些情况下，所述额外的治疗剂与细胞因子缀合物(例如，IL-2缀合物)同时施用。在其他情况下，依次施用所述额外的治疗剂和细胞因子缀合物(例如，IL-2缀合物)，例如，在所述额外的治疗剂之前施用细胞因子缀合物(例如，IL-2缀合物)，或在施用所述额外的治疗剂之后施用细胞因子缀合物(例如，IL-2缀合物)。
用于治疗自身免疫疾病或病症的示例性的额外治疗剂包括但不限于皮质类固醇类，如泼尼松、布地奈德或泼尼松龙；钙依赖磷酸酶抑制剂，如环孢菌素或他克莫司；mTOR抑制剂，如西罗莫司或依维莫司；IMDH抑制剂，如硫唑嘌呤、来氟米特或霉酚酸酯；生物制剂，如阿巴西普、阿达木单抗、阿那白滞素、赛妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗、ixekizumab、那他珠单抗、利妥昔单抗、苏金单抗、托珠单抗、乌司奴单抗(ustekinumab)或维多珠单抗(vedolizumab)；以及单克隆抗体，如巴利昔单抗、达克珠单抗或莫罗单抗(muromonab)。
在一些情况下，细胞因子缀合物(例如，IL-2缀合物)与额外的治疗剂一起施用，该额外的治疗剂选自皮质类固醇，如泼尼松、布地奈德或泼尼松龙；钙依赖磷酸酶抑制剂，如环孢菌素或他克莫司；mTOR抑制剂，如西罗莫司或依维莫司；IMDH抑制剂，如硫唑嘌呤、来氟米特或霉酚酸酯；生物制剂，如阿巴西普、阿达木单抗、阿那白滞素、赛妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗、ixekizumab、那他珠单抗、利妥昔单抗、苏金单抗、托珠单抗、乌司奴单抗(ustekinumab)或维多珠单抗(vedolizumab)；以及单克隆抗体，如巴利昔单抗、达克珠单抗或莫罗单抗(muromonab)。
细胞群体扩充方法
在一些实施方案中，本文另外描述了扩充Treg细胞群体的方法。在一些情况下，该方法包括使细胞与本文所述的细胞因子缀合物接触，并使该细胞因子与细胞因子受体相互作用以形成复合物，其中该复合物刺激不同淋巴细胞群体的扩充。
在一些实施方案中，扩充CD4+调节性T(Treg)细胞群体的方法包括使细胞与以上描述的分离并修饰的IL-2多肽接触足以诱导与IL-2Rαβγ形成复合物的时间，从而刺激Treg细胞群体的扩充。在一些实施方案中，扩充CD4+Treg细胞群体的方法包括(a)使细胞与本文所述的IL-2缀合物接触；以及(b)使该IL-2缀合物与IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ亚基相互作用以形成IL-2/IL-2Rαβγ复合物；其中该IL-2缀合物对IL-2Rβ和IL-2Rγ亚基的亲和力降低，或减少IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集，并且其中该IL-2/IL-2Rαβγ复合物刺激Treg细胞的扩充。在一些情况下，该IL-2缀合物包含分离并纯化的IL-2多肽；以及在选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、R81、P82、R83、D84、S87、N88、N89、V91、I92、L94、E95、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112、T113、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133的氨基酸残基处与所述分离并纯化的IL-2多肽结合的缀合部分，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。在一些情况下，该氨基酸残基选自K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、R81、D84、S87、N88、V91、I92、L94、E95、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133。在一些情况下，该氨基酸残基选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、P82、R83、N89、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112和T113。在一些情况下，该氨基酸位置选自K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、D84、N88、E95和Q126。在一些情况下，该氨基酸位置选自K8、K9和H16。在一些情况下，该氨基酸位置选自Q22、N26、N88和Q126。在一些情况下，该氨基酸位置选自E15、D20、D84和E95。在一些情况下，该氨基酸位置选自L12、L19、M23和F78。在一些情况下，该氨基酸位置选自Q22和N26。
在一些情况下，所述IL-2缀合物使CD4+T调节性(Treg)细胞扩充至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。在一些情况下，所述IL-2缀合物使CD4+T调节性(Treg)细胞扩充约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在一些情况下，所述IL-2缀合物使CD4+T调节性(Treg)细胞扩充至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍或更多。在一些情况下，所述IL-2缀合物使CD4+T调节性(Treg)细胞扩充约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍或更多。
在一些情况下，所述足以诱导与IL-2Rαβγ形成复合物的时间至少为5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一些情况下，所述足以诱导与IL-2Rαβγ形成复合物的时间约为5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天或7天。
在一些实施方案中，所述方法是体内方法。
在其他实施方案中，所述方法是体外方法。
在另外的实施方案中，所述方法是离体方法。
细胞因子多肽的产生
在一些情况下，包含天然氨基酸突变或非天然氨基酸突变的本文所述的细胞因子(例如，白介素、IFN或TNF)多肽是重组产生或化学合成的。在一些情况下，例如通过宿主细胞系统或在无细胞系统中重组产生本文所述的细胞因子(例如，IL-2)多肽。
在一些情况下，所述细胞因子(例如，IL-2)多肽通过宿主细胞系统重组产生。在一些情况下，该宿主细胞是真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或植物细胞)或原核细胞(例如，革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌)。在一些情况下，真核宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是稳定的细胞系，或者是已将目的遗传物质并入其自身基因组中并具有在多代细胞分裂后表达该遗传物质产物的能力的细胞系。在其他情况下，哺乳动物宿主细胞是瞬时细胞系，或者是已将目的遗传物质并入其自身基因组中并且不具有在多代细胞分裂后表达该遗传物质产物的能力的细胞系。
示例性的哺乳动物宿主细胞包括293T细胞系、293A细胞系、293FT细胞系、293F细胞、293H细胞、A549细胞、MDCK细胞、CHO DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-K1细胞、Expi293FTM细胞、Flp-InTMT-RExTM293细胞系、Flp-InTM-293细胞系、Flp-InTM-3T3细胞系、Flp-InTM-BHK细胞系、Flp-InTM-CHO细胞系、Flp-InTM-CV-1细胞系、Flp-InTM-Jurkat细胞系、FreeStyleTM293-F细胞、FreeStyleTMCHO-S细胞、GripTiteTM293MSR细胞系、GS-CHO细胞系、HepaRGTM细胞、T-RExTMJurkat细胞系、Per.C6细胞、T-RExTM-293细胞系、T-RExTM-CHO细胞系和T-RExTM-HeLa细胞系。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是昆虫宿主细胞。示例性的昆虫宿主细胞包括果蝇S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、High FiveTM细胞和
Figure BDA0002437959900000821
细胞。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是酵母宿主细胞。示例性的酵母宿主细胞包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)酵母菌株，如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H和X-33，以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母菌株，如INVScl。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是植物宿主细胞。在一些情况下，该植物细胞包括来自藻类的细胞。示例性的植物细胞系包括来自莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)137c或细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PPC 7942的株。
在一些实施方案中，宿主细胞是原核宿主细胞。示例性的原核宿主细胞包括BL21、Mach1TM、DH10BTM、TOP10、DH5α、DH10BacTM、OmniMaxTM、MegaXTM、DH12STM、INV110、TOP10F’、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2TM、Stbl3TM或Stbl4TM。
在一些情况下，用于产生本文所述的IL-2多肽的合适的多核酸分子或载体包括来源于真核或原核来源的任何合适的载体。示例性的多核酸分子或载体包括来自细菌(例如大肠杆菌)、昆虫、酵母(例如巴斯德毕赤酵母)、藻类或哺乳动物来源的载体。细菌载体包括，例如，pACYC177、pASK75、pBAD载体系列、pBADM载体系列、pET载体系列、pETM载体系列、pGEX载体系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE载体系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
昆虫载体包括，例如，pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393 M10、pVL1393M11、pVL1393 M12、FLAG载体如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT2，或者MAT载体如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2。
酵母载体包括，例如，
Figure BDA0002437959900000831
pDESTTM14载体、
Figure BDA0002437959900000832
pDESTTM15载体、
Figure BDA0002437959900000833
pDESTTM17载体、
Figure BDA0002437959900000834
pDESTTM24载体、
Figure BDA0002437959900000835
pYES-DEST52载体、pBAD-DEST49
Figure BDA0002437959900000836
目的载体、pAO815毕赤酵母载体、pFLD1巴斯德毕赤酵母载体、pGAPZA,B,&C巴斯德毕赤酵母载体、pPIC3.5K毕赤酵母载体、pPIC6 A、B和C毕赤酵母载体、pPIC9K毕赤酵母载体、pTEF1/Zeo、pYES2酵母载体、pYES2/CT酵母载体、pYES2/NT A、B和C酵母体或pYES3/CT酵母载体。
藻类载体包括，例如，pChlamy-4载体或MCS载体。
哺乳动物载体包括，例如，瞬时表达载体或稳定表达载体。示例性的哺乳动物瞬时表达载体包括p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a,b,c、pFLAG-CMV5.1、pFLAG-CMV 5a,b,c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。示例性的哺乳动物稳定表达载体包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
在一些情况下，无细胞系统用于产生本文所述的细胞因子(例如，IL-2)多肽。在一些情况下，无细胞系统包含来自细胞的细胞质和/或细胞核组分的混合物，并且适用于体外核酸合成。在一些情况下，无细胞系统利用原核细胞组分。在其他情况下，无细胞系统利用真核细胞组分。核酸合成是在基于例如果蝇细胞、爪蟾卵、古菌或HeLa细胞的无细胞系统中获得的。示例性的无细胞系统包括大肠杆菌S30 Extract系统、大肠杆菌T7 S30系统或
Figure BDA0002437959900000837
XpressCF和XpressCF+。
无细胞翻译系统各不相同地包含组分，如质粒、mRNA、DNA、tRNA、合成酶、释放因子、核糖体、伴侣蛋白、翻译起始和延伸因子、天然和/或非天然氨基酸和/或用于蛋白质表达的其他组分。任选地修饰这类组分以提高产率、增加合成速率、增加蛋白质产物的保真度或掺入非天然氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的细胞因子是使用US8,778,631、US2017/0283469、US 2018/0051065、US 2014/0315245或US8,778,631中描述的无细胞翻译系统合成的。在一些实施方案中，无细胞翻译系统包含修饰的释放因子，乃至从系统中去除一种或多种释放因子。在一些实施方案中，无细胞翻译系统包含降低的蛋白酶浓度。在一些实施方案中，无细胞翻译系统包含修饰的tRNA，其具有重新分配的用来编码非天然氨基酸的密码子。在一些实施方案中，本文所述的用于掺入非天然氨基酸的合成酶在无细胞翻译系统中使用。在一些实施方案中，在将tRNA添加到无细胞翻译系统之前，使用酶促或化学方法向该tRNA预先加载非天然氨基酸。在一些实施方案中，用于无细胞翻译系统的组分获自修饰的生物体，如修饰的细菌、酵母或其他生物体。
在一些实施方案中，经由表达宿主系统或通过无细胞系统，以环状排列的形式生成细胞因子(例如，IL-2)多肽。
包含非天然氨基酸的细胞因子多肽的产生
可以在本公开中使用正交或扩展的遗传密码，其中将存在于细胞因子(例如，IL-2)多肽的核酸序列中的一个或多个特定密码子分配以编码非天然氨基酸，使得可以通过使用正交tRNA合成酶/tRNA对将其遗传掺入到细胞因子(例如，IL-2)中。该正交tRNA合成酶/tRNA对能够使tRNA加载非天然氨基酸，并且能够响应于密码子将该非天然氨基酸掺入多肽链中。
在一些情况下，所述密码子是琥珀、赭石、卵白石密码子或四联密码子。在一些情况下，该密码子对应于将用来携带非天然氨基酸的正交tRNA。在一些情况下，该密码子是琥珀密码子。在其他情况下，该密码子是正交密码子。
在一些情况下，所述密码子是四联密码子，其可以被正交核糖体ribo-Q1解码。在一些情况下，该四联密码子如Neumann等人,“Encoding multiple unnatural amino acidsvia evolution of a quadruplet-decoding ribosome,”Nature,464(7287):441-444(2010)中所述。
在一些情况下，本公开中使用的密码子是重新编码的密码子，例如，同义密码子或用替代密码子替换的稀有密码子。在一些情况下，重新编码的密码子如Napolitano等人,“Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare argine codons inEscherichia coli,”PNAS,113(38):E5588-5597(2016)所述。在一些情况下，重新编码的密码子如Ostrov等人,“Design,synthesis,and testing toward a 57-codon genome,”Science353(6301):819-822(2016)所述。
在一些情况下，使用非天然核酸，从而导致向细胞因子(例如IL-2)中掺入一个或多个非天然氨基酸。示例性的非天然核酸包括但不限于尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基(I)、2-氨基腺嘌呤-9-基、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(尤其是5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。某些非天然核酸，如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2取代的嘌呤、N-6取代的嘌呤、O-6取代的嘌呤、2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、提高双链体形成的稳定性的那些非天然核酸、通用核酸、疏水性核酸、混杂核酸、大小扩展的核酸、氟化核酸、5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基、其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶，5-卤代胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，嘧啶核酸的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶，6-偶氮胞嘧啶，6-偶氮胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(尤其是5-溴)、5-三氟甲基、其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤，8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，3-脱氮鸟嘌呤，3-脱氮腺嘌呤，三环嘧啶，吩噁嗪胞苷([5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹，吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)，吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3’,2’:4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)，其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环替代的那些，7-脱氮-腺嘌呤，7-脱氮鸟苷，2-氨基吡啶，2-吡啶酮，氮杂胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，溴尿嘧啶，5-氯胞嘧啶，氯化胞嘧啶，环胞嘧啶，阿糖胞苷，5-氟胞嘧啶，氟嘧啶，氟尿嘧啶，5,6-二氢胞嘧啶，5-碘胞嘧啶，羟基脲，碘尿嘧啶，5-硝基胞嘧啶，5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶和5-碘尿嘧啶，2-氨基-腺嘌呤，6-硫代-鸟嘌呤，2-硫代-胸腺嘧啶，4-硫代-胸腺嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，4-硫代-尿嘧啶，N4-乙基胞嘧啶，7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤，5-羟基胞嘧啶，2’-脱氧尿苷，2-氨基-2’-脱氧腺苷，以及在下列文件中描述的那些：美国专利3,687,808；4,845,205；4,910,300；4,948,882；5,093,232；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653和6,005,096；WO 99/62923；Kandimalla等人,(2001)Bioorg.Med.Chem.9:807-813；The Concise Encyclopedia ofPolymer Science and Engineering,Kroschwitz,J.I.编,John Wiley&Sons,1990,858-859；Englisch等人,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613；以及Sanghvi,第15章,Antisense Research and Applications,Crookeand Lebleu Eds.,CRCPress,1993,273-288。其他碱基修饰可见于，例如，美国专利3,687,808；Englisch等人,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613；和Sanghvi,第15章,Antisense Research and Applications,第289-302页,Crooke and Lebleu编,CRCPress,1993。
包含各种杂环碱基和各种糖部分(和糖类似物)的非天然核酸是本领域可得到的，并且在一些情况下，所述核酸包含一种或数种不同于天然存在的核酸的主要五碱基组分的杂环碱基。例如，在一些情况下，该杂环碱基包括尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鸟嘌呤-7-基、鸟嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基基团，其中嘌呤通过9-位，嘧啶通过1-位，吡咯并嘧啶通过7-位而吡唑并嘧啶通过1-位连接至核酸的糖部分。
在一些实施方案中，核苷酸类似物也在磷酸部分被修饰。修饰的磷酸部分包括但不限于那些在两个核苷酸之间的连接处具有修饰的磷酸部分，并且含有，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫逐氨基磷酸酯、硫逐烷基膦酸酯、硫逐烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。应当理解，两个核苷酸之间的这些磷酸酯或修饰的磷酸酯键是通过3’-5’键或2’-5’键，并且该键含有颠倒的极性，如3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。许多美国专利教导了如何制备和使用含有修饰的磷酸酯的核苷酸，包括但不限于3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。
在一些实施方案中，非天然核酸包括2’,3’-双脱氧-2’,3’-双脱氢-核苷(PCT/US2002/006460)、5’-取代的DNA和RNA衍生物(PCT/US2011/033961；Saha等人,J.OrgChem.,1995,60,788-789；Wang等人,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,1999,9,885-890；和Mikhailov等人,Nucleosides&Nucleotides,1991,10(1-3),339-343；Leonid等人,1995,14(3-5),901-905；和Eppacher等人,Helvetica Chimica Acta,2004,87,3004-3020；PCT/JP2000/004720；PCT/JP2003/002342；PCT/JP2004/013216；PCT/JP2005/020435；PCT/JP2006/315479；PCT/JP2006/324484；PCT/JP2009/056718；PCT/JP2010/067560)，或制备成具有修饰碱基的单磷酸的5’-取代的单体(Wang等人,Nucleosides Nucleotides&Nucleic Acids,2004,23(1&2),317-337)。
在一些实施方案中，非天然核酸在糖环的5’-位和2’-位包含修饰(PCT/US94/02993)，如5’-CH2-取代的2’-O保护的核苷(Wu等人,Helvetica Chimica Acta,2000,83,1127-1143和Wu等人,Bioconjugate Chem.1999,10,921-924)。在一些情况下，非天然核酸包括已准备好掺入到寡核苷酸中的酰胺连接的核苷二聚体，其中该二聚体中的3’连接的核苷(5’至3’)包含2’-OCH3和5’-(S)-CH3(Mesmaeker等人,Synlett,1997,1287-1290)。非天然核酸可以包括2’-取代的5’-CH2(或O)修饰的核苷(PCT/US92/01020)。非天然核酸可以包括5’-亚甲基膦酸DNA和RNA单体，以及二聚体(Bohringer等人,Tet.Lett.,1993,34,2723-2726；Collingwood等人,Synlett,1995,7,703-705；和Hutter等人,Helvetica ChimicaActa,2002,85,2777-2806)。非天然核酸可以包括具有2’-取代的5’-膦酸单体(US2006/0074035)和其他修饰的5’-膦酸单体(WO1997/35869)。非天然核酸可以包括5’-修饰的亚甲基膦酸单体(EP614907和EP629633)。非天然核酸可以包括在5’和6’位包含羟基的5’或6’-膦酸核糖核苷的类似物(Chen等人,Phosphorus,Sulfur and Silicon,2002,777,1783-1786；Jung等人,Bioorg.Med.Chem.,2000,8,2501-2509；Gallier等人,Eur.J.Org.Chem.,2007,925-933；和Hampton等人,J.Med.Chem.,1976,19(8),1029-1033)。非天然核酸可以包括5’-膦酸脱氧核糖核苷单体和具有5’-磷酸基团的二聚体(Nawrot等人,Oligonucleotides,2006,16(1),68-82)。非天然核酸可以包括具有6’-膦酸基团的核苷，其中5’或/和6’-位未被取代或被硫代叔丁基(SC(CH3)3)(及其类似物)、亚甲基氨基(CH2NH2)(及其类似物)或氰基(CN)(及其类似物)取代(Fairhurst等人,Synlett,2001,4,467-472；Kappler等人,J.Med.Chem.,1986,29,1030-1038；Kappler等人,J.Med.Chem.,1982,25,1179-1184；Vrudhula等人,J.Med.Chem.,1987,30,888-894；Hampton等人,J.Med.Chem.,1976,19,1371-1377；Geze等人,J.Am.Chem.Soc,1983,105(26),7638-7640；和Hampton等人,J.Am.Chem.Soc,1973,95(13),4404-4414)。
在一些实施方案中，非天然核酸还包括糖部分的修饰。在一些情况下，核酸含有一种或多种其中糖基团已被修饰的核苷。此类糖修饰的核苷可赋予增强的核酸酶稳定性、提高的结合亲和力或一些其他有益的生物学性质。在某些实施方案中，核酸包含化学修饰的呋喃核糖环部分。化学修饰的呋喃核糖环的实例包括但不限于添加取代基(包括5’和/或2’取代基)；桥接两个环原子以形成双环核酸(BNA)；用S、N(R)或C(R1)(R2)(R＝H、C1-C12烷基或保护基团)替代核糖基环的氧原子；及其组合。化学修饰的糖的实例可见于WO2008/101157、US2005/0130923和WO2007/134181。
在一些情况下，修饰的核酸包含修饰的糖或糖类似物。因此，除了核糖和脱氧核糖外，糖部分还可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖或糖“类似物”环戊基。该糖可以是吡喃糖基或呋喃糖基形式。糖部分可以是核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2’-O-烷基核糖的呋喃糖苷，并且该糖可以以[α]或[β]异头构型连接至相应的杂环碱基。糖修饰包括但不限于2’-烷氧基-RNA类似物、2’-氨基-RNA类似物、2’-氟-DNA和2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。例如，糖修饰可以包括2’-O-甲基-尿苷或2’-O-甲基-胞苷。糖修饰包括2’-O-烷基取代的脱氧核糖核苷和2’-O-乙二醇样核糖核苷。这些糖或糖类似物以及其中这些糖或类似物连接至杂环碱基(核酸碱基)的相应“核苷”的制备是已知的。也可以进行糖修饰并将其与其他修饰组合。
对糖部分的修饰包括核糖和脱氧核糖的天然修饰以及非天然修饰。糖修饰包括但不限于在2’位的以下修饰：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。2’糖修饰还包括但不限于-O[(CH2)nO]m CH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)nONH2和-O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2，其中n和m为1至约10。
在2’位的其他修饰包括但不限于：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2 CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团，或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。也可以在糖上的其他位置进行类似的修饰，特别是在3’末端核苷酸上或2’-5’连接的寡核苷酸中的糖的3’位置，以及5’末端核苷酸的5’位置。修饰的糖还包括在诸如CH2和S的桥接环氧处含有修饰那些糖。核苷酸糖类似物也可以具有代替呋喃戊糖基糖的糖模拟物，如环丁基部分。有许多美国专利教导了此类修饰的糖结构的制备，并且详述且描述了一系列碱基修饰，如美国专利4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；5,681,941；和5,700,920，其中每一个均通过引用整体并入本文。
具有修饰的糖部分的核酸的实例包括但不限于包含5’-乙烯基、5’-甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH3和2’-O(CH2)2OCH3取代基的核酸。在2’位的取代基也可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-(C1-C10烷基)、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施方案中，本文所述的核酸包括一种或多种双环核酸。在某些这样的实施方案中，该双环核酸在4’核糖基环原子与2’核糖基环原子之间包含桥。在某些实施方案中，本文提供的核酸包括一种或多种双环核酸，其中该桥包含4’至2’双环核酸。这类4’至2’双环核酸的实例包括但不限于下式之一：4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’和4’-CH(CH2OCH3)-O-2’及其类似物(参见美国专利7,399,845)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’及其类似物(参见WO2009/006478、WO2008/150729、US2004/0171570、美国专利7,427,672、Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.,209,74,118-134和WO2008/154401)。还参见，例如：Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Elayadi等人,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人,Chem.Biol,2001,8,1-7；Oram等人,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利4,849,513；5,015,733；5,118,800；5,118,802；7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；6,525,191；6,670,461；和7,399,845；国际公开WO2004/106356、WO1994/14226、WO2005/021570、WO2007/090071和WO2007/134181；美国专利公开US2004/0171570、US2007/0287831和US2008/0039618；美国临时申请60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；以及国际申请PCT/US2008/064591、PCT US2008/066154、PCT US2008/068922和PCT/DK98/00393。
在某些实施方案中，核酸包含连接的核酸。核酸可以使用任何核酸间键连接在一起。核酸间连接基团的两个主要类别由磷原子的存在或不存在来定义。代表性的含磷的核酸间键包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(P＝S)。代表性的不含磷的核酸间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-OC(O)-S-)、硫逐氨基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)、硅氧烷(-O-Si(H)2-O-)和N,N*-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3))。在某些实施方案中，具有手性原子的核酸间键可被制备为外消旋混合物、单独的对映异构体，例如烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。非天然核酸可以含有单个修饰。非天然核酸可在一个部分内或不同部分之间含有多个修饰。
对核酸的骨架磷酸修饰包括但不限于甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(桥连或非桥连)、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、phosphodithioate和硼烷磷酸酯，并且可以以任何组合使用。也可以使用其他非磷酸酯键。
在一些实施方案中，骨架修饰(例如，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键)可以赋予修饰的核酸以免疫调节活性并且/或者增强其在体内的稳定性。
在一些情况下，磷衍生物(或修饰的磷酸基团)连接至糖或糖类似物部分，并且可以是一磷酸、二磷酸、三磷酸、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。含有修饰的磷酸酯键或非磷酸酯键的示例性多核苷酸可见于Peyrottes等人,1996,NucleicAcids Res.24:1841-1848；Chaturvedi等人,1996,Nucleic Acids Res.24:2318-2323；和Schultz等人,(1996)Nucleic Acids Res.24:2966-2973；Matteucci,1997,“Oligonucleotide Analogs:an Overview”in Oligonucleotides as TherapeuticAgents,(Chadwick和Cardew编)John Wiley and Sons,New York,NY；Zon,1993,“Oligonucleoside Phosphorothioates”in Protocols for Oligonucleotides andAnalogs,Synthesis and Properties,Humana Press,pp.165-190；Miller等人,1971,JACS93:6657-6665；Jager等人,1988,Biochem.27:7247-7246；Nelson等人,1997,JOC 62:7278-7287；美国专利5,453,496；和Micklefield,2001,Curr.Med.Chem.8:1157-1179。
在一些情况下，骨架修饰包括用替代部分如阴离子、中性或阳离子基团代替磷酸二酯键。此类修饰的实例包括：阴离子核苷间键；N3’至P5’氨基磷酸酯修饰；硼酸磷酸酯DNA；原寡核苷酸(prooligonucleotide)；中性核苷间键，如甲基膦酸酯；酰胺连接的DNA；亚甲基(甲基亚氨基)键；甲乙缩醛(formacetal)和硫代甲乙缩醛(thioformacetal)键；含有磺酰基的骨架；吗啉代寡核苷酸；肽核酸(PNA)；和带正电荷的脱氧核糖核酸胍(DNG)寡核苷酸(Micklefield,2001,Current Medicinal Chemistry8:1157-1179)。修饰的核酸可以包含嵌合或混合的骨架，该骨架包含一种或多种修饰，例如磷酸酯键的组合，如磷酸二酯键和硫代磷酸酯键的组合。
针对磷酸的取代物包括例如短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些包括具有吗啉基键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基骨架；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其他具有混合N、O、S和CH2组成部分的取代物。许多美国专利公开了如何制备和使用这些类型的磷酸替代，并且包括但不限于美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439。还应理解，在核苷酸取代物中，核苷酸的糖和磷酸部分都可以被例如酰胺型键(氨基乙基甘氨酸)(PNA)替代。美国专利5,539,082、5,714,331和5,719,262教导了如何制备和使用PNA分子，其中每一个均通过引用并入本文。还参见Nielsen等人,Science,1991,254,1497-1500。还可能将其他类型的分子(缀合物)连接至核苷酸或核苷酸类似物，以增强例如细胞摄取。缀合物可以化学连接至核苷酸或核苷酸类似物。这类缀合物包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)，胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人,Ann.KY.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.AcidsRes.,1992,20,533-538)，脂族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,EM5OJ,1991,10,1111-1118；Kabanov等人,FEBS Lett.,1990,259,327-330；Svinarchuk等人,Biochimie,1993,75,49-54)，磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙铵1-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-S-H-膦酸酯(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654；Shea等人,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等人,Biochem.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)。许多美国专利教导了这类缀合物的制备，并且包括但不限于美国专利4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。
在一些情况下，所述非天然核酸进一步形成非天然碱基对。能够在体内条件下形成非天然DNA或RNA碱基对(UBP)的示例性非天然核苷酸包括但不限于5SICS、d5SICS、NAM、dNaM及其组合。在一些实施方案中，非天然核苷酸包括：
Figure BDA0002437959900000951
在一些实施方案中，非天然碱基对生成Dumas等人,“Designing logical codonreassignment–Expanding the chemistry in biology,”Chemical Science,6:50-69(2015)描述的非天然氨基酸。
将引入了本文公开的构建体或载体的宿主细胞在合适的培养基中培养或维持，从而产生tRNA、tRNA合成酶和目的蛋白质。该培养基还包含非天然氨基酸，使得目的蛋白质中掺入非天然氨基酸。
正交tRNA合成酶/tRNA对使tRNA加载非天然氨基酸，并且响应于密码子将该非天然氨基酸掺入多肽链中。示例性的aaRS-tRNA对包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(Mj-Tyr)aaRS/tRNA对、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)tRNACUA对、大肠杆菌LeuRS(Ec-Leu)/嗜热脂肪芽孢杆菌tRNACUA对和吡咯赖氨酰-tRNA对。
通过向宿主细胞中引入本文所述的包含tRNA和tRNA合成酶并包含具有一个或多个框内正交(终止)密码子的目的核酸序列的核酸构建体，来制备包含非天然氨基酸的细胞因子(例如，IL-2)多肽。将该宿主细胞暴露于包含非天然氨基酸的生理溶液，然后将该宿主细胞维持在允许表达目的蛋白质编码序列的条件下。响应于密码子，该非天然氨基酸掺入多肽链中。例如，一个或多个非天然氨基酸掺入细胞因子(例如，IL-2)多肽中。或者，两个或更多个非天然氨基酸可以在蛋白质的两个或更多个位点处掺入细胞因子(例如，IL-2)多肽中。
当将多个非天然氨基酸掺入细胞因子(例如，IL-2)多肽中时，应当理解，需要将多个密码子引入编码核酸序列的所需位置，以使tRNA合成酶/tRNA对可以指导非天然氨基酸响应于密码子的掺入。可以将至少1、2、3、4个或更多个密码子编码核酸掺入目的核酸序列中。
当期望将超过一种类型的非天然氨基酸掺入目的蛋白质的单个蛋白质中时，可以使用第二或另外的正交tRNA-tRNA合成酶对掺入第二或另外的非天然氨基酸；适当地，所述第二或另外的正交tRNA-tRNA合成酶对识别编码目的蛋白质的核酸中的不同密码子，使得可以在单个制备步骤中将所述两个或更多个非天然氨基酸特异性地掺入该蛋白质中的不同限定位点。在某些实施方案中，因此可以使用两个或更多个正交tRNA-tRNA合成酶对。
一旦在宿主细胞中产生了掺入非天然氨基酸的细胞因子(例如，IL-2)多肽，就可以通过本领域已知的多种技术，包括酶促、化学和/或渗透裂解和物理破坏，从其中进行提取。可以通过本领域已知的标准技术，如制备型色谱法、亲和纯化或其他任何合适的技术，来纯化所述细胞因子(例如，IL-2)多肽。
合适的宿主细胞可以包括细菌细胞(例如大肠杆菌)，但是最合适的宿主细胞是真核细胞，例如昆虫细胞(例如果蝇，如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、酵母细胞、线虫(例如秀丽隐杆线虫(C.elegans))、小鼠(例如小家鼠(Mus musculus))或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞、人293T细胞、HeLa细胞、NIH3T3细胞和小鼠红白血病(MEL)细胞)或人细胞或其他真核细胞。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。适当地，该宿主细胞是哺乳动物细胞——如人细胞或昆虫细胞。
通常可以在本发明的实施方案中使用的其他合适的宿主细胞是在实施例部分中提到的那些细胞。可以通过常规转化或转染技术将载体DNA引入宿主细胞中。如本文所用的，术语“转化”和“转染”旨在表示用于将外来核酸分子(例如，DNA)引入宿主细胞中的多种公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适的方法是本领域公知的。
当创建细胞系时，通常优选制备稳定的细胞系。例如，对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据所使用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码选择性标记(例如，对抗生素的抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。优选的选择性标记包括赋予对诸如G418、潮霉素或氨甲蝶呤等药物的抗性的选择性标记。可以将编码选择性标记的核酸分子在相同载体上引入宿主细胞中，或者可以在分开的载体上引入。可以通过药物选择来鉴定被引入的核酸分子稳定转染的细胞(例如，掺入了选择性标记基因的细胞将存活，而其他细胞则死亡)。
在一个实施方案中，本文所述的构建体被整合到宿主细胞的基因组中。稳定整合的一个优点是可以实现各个细胞或克隆之间的均匀性。另一个优点是可以进行最佳生产者的选择。因此，期望创建稳定的细胞系。在另一个实施方案中，本文所述的构建体被转染到宿主细胞中。将构建体转染到宿主细胞中的优点是蛋白质产率可以最大化。在一个方面，描述了包含本文所述的核酸构建体或载体的细胞。
药物组合物和制剂
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物和制剂通过多种给药途径施用于受试者，所述途径包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内)、脑内、口服、鼻内、颊部、直肠、舌下或透皮给药途径。
在一些实施方案中，所述药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气雾剂、固体剂型、粉末、立即释放制剂、控制释放制剂、速熔制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂(例如纳米颗粒制剂)以及立即释放和控制释放混合型制剂。
在一些实施方案中，所述药物制剂包含基于与本文公开的组合物的相容性和所需剂型的释放谱特性而选择的载体或载体材料。示例性的载体材料包括，例如粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、湿润剂、稀释剂等。药学上相容的载体材料包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶态二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖、硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)，Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975，Liberman,H.A.和Lachman,L.编,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980，以及Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
在一些情况下，所述药物组合物被配制成免疫脂质体，其包含直接或间接地与脂质体的脂双层结合的多个IL-2缀合物。示例性的脂质包括但不限于脂肪酸；磷脂；固醇，如胆固醇；鞘脂，如鞘磷脂；糖鞘脂，如神经节苷脂、红细胞糖苷脂(globocide)和脑苷脂；表面活性胺，如硬脂胺、油胺和亚油胺。在一些情况下，该脂质包括阳离子脂质。在一些情况下，该脂质包括磷脂。示例性的磷脂包括但不限于磷脂酸(“PA”)、磷脂酰胆碱(“PC”)、磷脂酰甘油(“PG”)、磷脂酰乙醇胺(“PE”)、磷脂酰肌醇(“PI”)和磷脂酰丝氨酸(“PS”)、鞘磷脂(包括脑鞘磷脂)、卵磷脂、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、脑苷脂、二花生四烯酰基磷脂酰胆碱(“DAPC”)、二癸酰基-L-α-磷脂酰胆碱(“DDPC”)、二反油酰基酰磷脂酰胆碱(“DEPC”)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(“DLPC”)、二亚油酰基磷脂、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)、二油酰基磷脂酰胆碱(“DOPC”)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(“DPPC”)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(“DSPC”)、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(“POPC”)、二花生酰基磷脂酰甘油(“DAPG”)、二癸酰基-L-α-磷脂酰甘油(“DDPG”)、二反油酰基磷脂酰甘油(“DEPG”)、二月桂酰基磷脂酰甘油(“DLPG”)、二亚油酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(“DMPG”)、二油酰基磷脂酰甘油(“DOPG”)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(“DPPG”)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(“DSPG”)、l-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油(“POPG”)、二花生酰基磷脂酰乙醇胺(“DAPE”)、二癸酰基-L-α-磷脂酰乙醇胺(“DDPE”)、二反油酰基磷脂酰乙醇胺(“DEPE”)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(“DLPE”)、二亚油酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(“DMPE”)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(“POPE”)、二花生酰基磷脂酰肌醇(“DAPI”)、二癸酰基-L-α-磷脂酰肌醇(“DDPI”)、二反油酰基磷脂酰肌醇(“DEPI”)、二月桂酰基磷脂酰肌醇(“DLPI”)、二亚油酰基磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰肌醇(“DMPI”)、二油酰基磷脂酰肌醇(“DOPI”)、二棕榈酰基磷脂酰肌醇(“DPPI”)、二硬脂酰基磷脂酰肌醇(“DSPI”)、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰肌醇(“POPI”)、二花生酰基磷脂酰丝氨酸(“DAPS”)、二癸酰基-L-α-磷脂酰丝氨酸(“DDPS”)、二反油酰基磷脂酰丝氨酸(“DEPS”)、二月桂酰基磷脂酰丝氨酸(“DLPS”)、二亚油酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(“DMPS”)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(“DOPS”)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(“DPPS”)、二硬脂酰基磷脂丝氨酸(“DSPS”)、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸(“POPS”)、二花生酰基鞘磷脂、二癸酰基鞘磷脂、二反油酰基鞘磷脂、二月桂酰基鞘磷脂、二亚油酰基鞘磷脂、二肉豆蔻酰基鞘磷脂、鞘磷脂、二油酰基鞘磷脂、二棕榈酰基鞘磷脂、二硬脂酰基鞘磷脂和1-棕榈酰基-2-油酰基-鞘磷脂。
在一些情况下，所述药物制剂进一步包含pH调节剂或缓冲剂，其包括酸，如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；和缓冲液，如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。这类酸、碱和缓冲剂以使组合物的pH保持在可接受范围内所需的量包含在内。
在一些情况下，所述药物制剂以使组合物的重量摩尔渗透压浓度处于可接受范围内所需的量包含一种或多种盐。这类盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的盐，合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
在一些实施方案中，所述药物制剂包含但不限于糖，如海藻糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、葡萄糖，或盐，如磷酸钾、柠檬酸钠、硫酸铵，和/或其他试剂，如肝素，以增加多肽的溶解度和体内稳定性。
在一些情况下，所述药物制剂进一步包含稀释剂，该稀释剂用来稳定化合物，因为他们可以提供更稳定的环境。本领域中利用溶解于经缓冲的溶液(其也可以提供pH控制或维持)中的盐作为稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲的盐水溶液。在某些情况下，稀释剂增加组合物的体积，以便于压制或产生对用于胶囊填充的均质掺合物而言足够的体积。这类化合物可包括，例如，乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、诸如
Figure BDA0002437959900001001
等微晶纤维素、磷酸氢钙、磷酸二钙二水合物、磷酸三钙、磷酸钙、无水乳糖、喷雾干燥的乳糖、预胶化淀粉、诸如
Figure BDA0002437959900001002
(Amstar)等可压缩糖、甘露醇、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素乙酸硬脂酸酯、基于蔗糖的稀释剂、糖粉(confectioner’s sugar)、单碱式硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物、乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂(dextrates)、经水解的谷类固体、直链淀粉、粉状纤维素、碳酸钙、甘氨酸、高岭土、甘露醇、氯化钠、肌醇、膨润土等。
在一些情况下，所述药物制剂包含崩解试剂或崩解剂，以促进物质的分解或崩解。术语“崩解”包括当剂型与胃肠液接触时的溶解和分散。崩解剂的实例包括淀粉，例如天然淀粉，如玉米淀粉或马铃薯淀粉，预胶化淀粉如National 1551或
Figure BDA0002437959900001003
或羟基乙酸淀粉钠如
Figure BDA0002437959900001004
或
Figure BDA0002437959900001005
纤维素如木制品，甲基结晶纤维素，例如
Figure BDA0002437959900001006
PH101、
Figure BDA0002437959900001007
PH102、
Figure BDA0002437959900001008
PH105、
Figure BDA0002437959900001009
P100、
Figure BDA00024379599000010010
Ming
Figure BDA00024379599000010011
和
Figure BDA00024379599000010012
甲基纤维素，交联羧甲纤维素，或交联的纤维素，如交联的羧甲基纤维素钠
Figure BDA00024379599000010013
交联的羧甲基纤维素或交联的交联羧甲纤维素，交联的淀粉如羟基乙酸淀粉钠，交联的聚合物如交聚维酮，交联的聚乙烯吡咯烷酮，藻酸盐如藻酸或藻酸的盐如藻酸钠，粘土如
Figure BDA0002437959900001011
HV(硅酸铝镁)，胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶或黄蓍胶，羟基乙酸淀粉钠，膨润土，天然海绵，表面活性剂，树脂如阳离子交换树脂，柑橘渣，十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸钠与淀粉的组合，等等。
在一些情况下，所述药物制剂包含填充剂，如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等。
润滑剂和助流剂也任选地包含在本文所述的药物制剂中，以用于阻止、减少或抑制物质的粘附或摩擦。示例性的润滑剂包括，例如，硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，碳氢化合物如矿物油，或氢化植物油如氢化大豆油
Figure BDA0002437959900001012
高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐如铝盐、钙盐、镁盐、锌盐，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡、
Figure BDA0002437959900001013
硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM，油酸钠，苯甲酸钠，山萮酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠，胶态二氧化硅如yloidTM、
Figure BDA0002437959900001014
淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性剂，等等。
增塑剂包括用来软化微胶囊化材料或膜包衣以使它们较不易碎的化合物。合适的增塑剂包括，例如，诸如PEG300、PEG400、PEG600、PEG1450、PEG3350和PEG800等聚乙二醇、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三醋精。增塑剂还可以起到分散剂或湿润剂的作用。
增溶剂包括诸如三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆盐、聚乙二醇200-600、糖原质、还氧二元醇(transcutol)、丙二醇和异山梨醇二甲醚等化合物。
稳定剂包括诸如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等化合物。示例性的稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氨丁三醇、白蛋白(人)、柠檬酸、苯甲醇、苯酚、脱水磷酸氢二钠、丙二醇、间甲酚或间-甲酚、乙酸锌、聚山梨酯-20或吐温(Tween)或氨丁三醇。
悬浮剂包括诸如以下的化合物，如聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，聚乙二醇(例如聚乙二醇的分子量可以是约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400)，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟甲基纤维素乙酸硬脂酸酯，聚山梨酯-80，羟乙基纤维素，藻酸钠，树胶，例如黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶类(包括黄原胶)，糖，纤维素制品，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素，聚山梨酯-80，藻酸钠，聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯，聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯，聚维酮，等等。
表面活性剂包括诸如以下的化合物，如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或80、三醋精、维生素E TPGS、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨酯、泊洛沙姆(polaxomers)、胆盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚合物，例如
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(BASF)等。另外的表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇10(octoxynol 10)、辛苯昔醇40。有时，包括表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。
粘度增强剂包括，例如，甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素乙酸硬脂酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
湿润剂包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、吐温80、维生素E TPGS、铵盐等化合物。
治疗方案
在一些实施方案中，施用本文所述的药物组合物以用于治疗应用。在一些实施方案中，该药物组合物每天施用一次、每天施用两次、每天施用三次或更频繁。该药物组合物每天、每隔一天、隔日、每周五天、每周一次、每隔一周、每月两周、每月三周、每月一次、每月两次、每月三次或更频繁地施用。该药物组合物施用至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、2年、3年或更长时间。
在患者的状态确实得到改善的情况下，根据医生的裁量，继续进行组合物的施用；或者，所施用的组合物的剂量暂时减少或暂时停止某段时间长度(即“休药期”)。在一些情况下，休药期的长度为2天至1年不等，仅举例来说，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。在休药期期间的剂量减少是10％-100％，仅举例来说，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
一旦患者的状况已发生改善，如果必要的话，施用维持剂量。随后，根据症状，将给药剂量或频率或二者降低至疾病、病症或病况的改善得以保持的水平。
在一些实施方案中，对应于此量的给定药剂的量根据诸如具体化合物、疾病的严重程度、需要治疗的受试者或宿主的特性(例如体重)等因素而变化，不过仍根据该病例的具体情况以本领域已知的方式进行常规确定，所述情况包括例如所施用的具体药剂、给药途径和所治疗的受试者或宿主。在一些情况下，所需剂量方便地以单剂量或分剂量呈现，所述分剂量同时(或在短时间段内)或以适当的间隔施用，例如每天两次、三次、四次或更多次亚剂量。
前述范围仅是建议性的，因为关于个体治疗方案的变量数目很大，并且偏离这些推荐值的相当大的偏差也并不罕见。这样的剂量根据许多变量而改变，这些变量不限于所使用的化合物的活性、所治疗的疾病或病况、给药模式、受试个体的需求、所治疗的疾病或病况的严重程度，以及从业医生的判断。
在一些实施方案中，此类治疗方案的毒性和治疗效果通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中确定，包括但不限于LD50(群体中50％致死的剂量)和ED50(群体中50％治疗有效的剂量)的确定。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数，并且将其表示为LD50与ED50之间的比值。表现出高治疗指数的化合物是优选的。从细胞培养试验和动物研究获得的数据用于制定在人体中使用的剂量范围。此类化合物的剂量优选地处于包括ED50且具有最小毒性的循环浓度的范围内。该剂量在该范围内变化，这取决于所使用的剂型和所采用的给药途径。
试剂盒/制品
在某些实施方案中，本文公开了与本文所述的一种或多种方法和组合物一起使用的试剂盒和制品。这样的试剂盒包括载具、包装或容器，该容器被区室化为容纳一个或多个容器如小瓶、管等，每个容器包含在本文描述的方法中使用的一个单独元件。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，该容器由多种材料如玻璃或塑料形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、袋、容器、瓶子，和任何适于选定制剂和预期给药和治疗模式的包装材料。
例如，所述容器包含本文公开的一种或多种细胞因子(例如，IL-2)多肽或细胞因子(例如，IL-2)缀合物，以及可选的本文所述的一种或多种药物赋形剂，以促进细胞因子(例如，IL-2)多肽或细胞因子(例如，IL-2)缀合物的递送。此类试剂盒进一步任选地包括关于其在本文所述方法中的应用的标识性描述或标签或说明书。
试剂盒一般包括列出了内容物的标签和/或使用说明书，以及带有使用说明的包装插页。一般也包括一套说明书。
在一个实施方案中，标签位于容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当构成标签的字母、数字或其他字符附着、模塑或铭刻于容器自身时，标签位于容器上；当它存在于也支撑容器的托座或载具内时，例如作为包装插页时，标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用来指示内容物将用于特定的治疗性应用。标签还指示内容物的使用说明，例如在本文所述方法中的使用说明。
在某些实施方案中，所述药物组合物呈现于包装或分配器装置中，该包装或分配器装置包含一种或多种含有本文提供的化合物的单位剂型。例如，该包装包含金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施方案中，该包装或分配器装置附有给药说明书。在一个实施方案中，该包装或分配器还附有监管药物生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的、与容器相关联的告知书，该告知书反映出该机构批准该药物形式用于人类或兽医给药。例如，这样的告知书是由美国食品药品管理局对药物批准的标签，或批准的产品插页。在一个实施方案中，还制备含有在相容药物载体中配制的本文提供的化合物的组合物，将其置于适当的容器中，并且标示出用于治疗所示的病况。
某些术语
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均与所请求保护的主题所属领域的技术人员所一般了解的含义相同。应当理解，详细描述仅是示例性和说明性的，并非限制所请求保护的任何主题。在本申请中，除非另有特别说明，否则单数形式的使用包括复数形式。必须指出，除非上下文另有明确说明，否则如本说明书中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式如“包含”、“含有”和“具有”的使用不是限制性的。
尽管本发明的各个特征可以在单个实施方案的语境中描述，但是这些特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的语境中描述本发明，但是本发明也可以在单个实施方案中实现。
本说明书中提及“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”意指与该实施方案相关描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。
如本文所用的，范围和量可以被表示为“约”特定值或范围。“约”还包括确切的量。因此，“约5μL”表示“约5μL”，并且还表示“5μL”。通常，术语“约”包括预期在实验误差内的量，例如，在15％、10％或5％内。
本文所用的章节标题仅用于组织编排的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
如本文所用的，术语“个体”、“受试者”和“患者”是指任何哺乳动物。在一些实施方案中，该哺乳动物是人。在一些实施方案中，该哺乳动物是非人哺乳动物。这些术语都不需要或局限于以卫生保健工作者(例如，医生、注册护士、从业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作人员)的监护(例如，持续的或间歇的)为特征的情形。
如本文所用的，关于结合亲和力使用的术语“显著的”或“显著地”是指足以影响细胞因子(例如，IL-2多肽)与目标受体结合的细胞因子(例如，IL-2多肽)结合亲和力的变化。在一些情况下，该术语是指至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大的变化。在一些情况下，该术语是指至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更大的变化。
在一些情况下，关于一个或多个细胞群体通过细胞因子信号传导复合物的激活所使用的术语“显著的”或“显著地”是指足以激活该细胞群体的变化。在一些情况下，激活细胞群体的变化被测量为受体信号传导效力。在这样的情况下，可以提供EC50值。在其他情况下，可以提供ED50值。在另外的情况下，可以提供细胞因子的浓度或剂量。
如本文所用的，术语“效力”是指产生目标效应所需的细胞因子(例如，IL-2多肽)的量。在一些情况下，术语“效力”是指激活目标细胞因子受体(例如，IL-2受体)所需的细胞因子(例如，IL-2多肽)的量。在其他情况下，术语“效力”是指激活目标细胞群体所需的细胞因子(例如，IL-2多肽)的量。在一些情况下，效力被测量为ED50(有效剂量50)，或产生最大效应的50％所需的剂量。在其他情况下，效力被测量为EC50(有效浓度50)，或在群体的50％中产生目标效应所需的剂量。
实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明性目的，而并非限制本文提供的权利要求书的范围。
实施例1
激酶和细胞因子受体二聚化试验
细胞处理
按照标准程序，从冷冻储备液扩充PathHunter细胞系。将细胞以20μL的总体积接种到白壁384孔微孔板中，并在测试之前孵育适当的时间。
激动剂格式
为了确定激动剂，将细胞与样品一起孵育以诱导反应。对样品储备液进行中度稀释，以在测定缓冲液中生成5X样品。将约5μL的5X样品添加至细胞，并在37℃下孵育6至16小时(取决于该试验)。媒介物浓度为1％。
信号检测
对于激动剂和拮抗剂试验，分别通过单次加入12.5或15μL(50％v/v)PathHunter检测试剂混合物，随后在室温下孵育1小时，来生成测定信号。对于某些试验，使用高灵敏度检测试剂(PathHunter Flash Kit)检测活性以改善测定性能。在这些试验中，将等体积的检测试剂(25或30uL)加入孔中，然后在室温下孵育1小时。在用用于化学发光信号检测的PerkinElmer EnvisionTM仪器生成信号后，读取微孔板。
数据分析
使用CBIS数据分析套件(ChemInnovation,CA)分析化合物的活性。对于激动剂模式试验，利用下列公式计算活性百分比：
％活性＝100％x(测试样品的平均RLU-媒介物对照的平均RLU)/(对照配体的平均MAXRLU-媒介物对照的平均RLU)。
对于拮抗剂模式试验，利用下列公式计算抑制百分比：
％抑制＝100％x(1-测试样品的平均RLU-媒介物对照的平均RLU)/(EC80对照的平均RLU-媒介物对照的平均RLU))。
实施例2
示例性IL-2化合物在原发性人白细胞减少系统(LRS)衍生的PBMC样品中的离体免疫应答概况分析
为了确定示例性IL-2化合物的差异受体特异性如何影响原代免疫细胞亚群的活化，使用多色流式细胞术进行了人LRS衍生的外周血单核细胞(PBMC)样品中淋巴细胞活化的浓度-响应概况分析。这些研究是在PrimityBio LLC(Fremont,CA)进行的。用示例性IL-2化合物的稀释系列处理来源于人LRS样品的原代淋巴细胞，并使用表1所示的组根据每种淋巴细胞细胞类型中的pSTAT5信号传导进行定量。
标志物 细胞群体
CD3 T细胞
CD4 Th细胞
CD8 T效应细胞
CD45RA 幼稚T细胞
CD56 NK细胞
CD14/19 单核细胞/B细胞
CD25 Treg或有过经历的T细胞
CD127 不是Treg
CD62L 记忆T细胞与效应记忆T细胞
pSTAT5(Y694) 活化标志物
以浓度-响应模式分析了流式细胞术数据的不同T细胞和NK细胞亚组的活化，在用示例性IL-2变体K9_30kD处理后读取pSTAT5积累。
图4A-图4B显示了在人LRS原代细胞中的pSTAT5信号传导的剂量响应曲线(图4A)和在小鼠CTLL-2群体中的增殖响应(图4B)。
表2显示了用所示IL-2变体处理的人LRS样品或CTLL-2增殖中pSTAT5信号传导的剂量响应EC50(EC50)
Figure BDA0002437959900001091
从根据MFI图生成的剂量响应曲线计算EC50值(pg/ml)。
*在每个单独的实验中测得的与天然IL-2(野生型IL-2)相比的Treg效力变化。
实施例3
荷瘤C57BL/6小鼠中的PK研究
实验细节总结在表3中。
Figure BDA0002437959900001101
评价了示例性聚乙二醇化IL-2化合物K35_30kD在两个剂量水平下的药代动力学性质。将冻干的测试物在PBS中重建，并且对每个剂量组通过静脉内尾静脉注射以0.3和3mg/kg向9只雄性C57BL/6小鼠给药(参见下文的收集细节)。在给药后0.08、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时采集血样。不与天然小鼠IL-2交叉反应的来自Abcam的hIL-2ELISA试剂盒(ab100566)用于测试物的检测和定量。为了针对天然和聚乙二醇化化合物的试剂盒检测灵敏度的ELISA特异性差异进行调节，使用测试物稀释缓冲液生成了天然IL-2和K35_30kD测试物标准曲线，并针对各自的标准曲线分析了数据。绘制的数据代表如上所述的三个单独样品(生物学重复物)的平均值和SEM，并且提取K35_30kD测试物的PK参数并汇总在表4中。
Figure BDA0002437959900001102
图5显示了K35_30kD在两种不同浓度下的增强的PK曲线。将其PK曲线与野生型IL-2进行比较。
实施例4
表5示出了本文所述的IL-2序列。
Figure BDA0002437959900001111
虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，在实施本发明的过程中可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
序列表
<110> 辛索克斯公司
<120> 用于治疗自身免疫疾病的细胞因子缀合物
<130> 46085-710.602
<140>
<141>
<150> 62/540,781
<151> 2017-08-03
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 除脯氨酸外的任意氨基酸
<400> 4
Val Pro Gly Xaa Gly
1 5
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 5
Phe Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25 30

Claims (77)

1.在某位置处包含至少一个非天然氨基酸的分离并修饰的白介素2(IL-2)多肽，其降低对白介素2受体βγ(IL-2Rβγ)的受体信号传导效力或减少IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集，但保留白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)的显著激活，其中所述降低的受体信号传导效力是相比于野生型IL-2多肽与IL-2Rβγ之间的受体信号传导效力，并且其中所述募集是相比于野生型IL-2多肽对IL-2Rγ亚基的募集。
2.在某位置处包含至少一个非天然氨基酸的分离并修饰的白介素2(IL-2)多肽，其增加IL-2Rα亚基向IL-2多肽的募集，从而导致白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)的活化，其中该募集的增加是相比于野生型IL-2多肽对IL-2Rα亚基的募集。
3.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸的位置选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、R81、P82、R83、D84、S87、N88、N89、V91、I92、L94、E95、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112、T113、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。
4.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9、Q11、L12、E15、H16、L18、L19、D20、Q22、M23、N26、R81、D84、S87、N88、V91、I92、L94、E95、E116、N119、R120、T123、A125、Q126、S127、S130、T131、L132和T133，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。
5.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸的位置选自P2、T3、S4、S5、S6、T7、G27、N29、N30、Y31、K32、K35、T37、M46、K47、K48、A50、T51、E52、K53、H55、Q57、E60、E67、N71、Q74、S75、K76、N77、F78、H79、P82、R83、N89、K97、G98、S99、E100、T101、T102、F103、M104、C105、E106、Y107、A108、D109、E110、T111、A112和T113，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。
6.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、D84、N88、E95和Q126，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。
7.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸的位置选自K8、K9和H16，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。
8.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸的位置选自Q22、N26、N88和Q126，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。
9.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸的位置选自E15、D20、D84和E95，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。
10.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸的位置选自L12、L19和M23，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。
11.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸的位置选自Q22和N26，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1。
12.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸：
·是赖氨酸类似物；
·是半胱氨酸类似物或组氨酸类似物；
·包含芳族侧链；
·包含叠氮基；
·包含炔烃基团；或者
·包含醛或酮基团。
13.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸不包含芳族侧链。
14.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸包括N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)、对碘-L-苯丙氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、膦酰基酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒基)丙酸或硒代半胱氨酸。
15.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸通过正交tRNA合成酶/tRNA对掺入所述修饰的IL-2多肽中。
16.根据权利要求15所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述正交合成酶/tRNA对的正交tRNA包含至少一个非天然核碱基。
17.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽通过所述至少一个非天然氨基酸共价连接至缀合部分。
18.根据权利要求17所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述缀合部分包含水溶性聚合物、脂质、蛋白质或肽。
19.根据权利要求18所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰基吗啉)或其组合。
20.根据权利要求18所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述水溶性聚合物包括PEG分子。
21.根据权利要求20所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述PEG分子是直链PEG。
22.根据权利要求20所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述PEG分子是支链PEG。
23.根据权利要求18所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述水溶性聚合物包括多糖。
24.根据权利要求23所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述多糖包括葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。
25.根据权利要求18所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述脂质包括脂肪酸。
26.根据权利要求25所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述脂肪酸包含约6至约26个碳原子、约6至约24个碳原子、约6至约22个碳原子、约6至约20个碳原子、约6至约18个碳原子、约20至约26个碳原子、约12至约26个碳原子、约12至约24个碳原子、约12至约22个碳原子、约12至约20个碳原子或约12至约18个碳原子。
27.根据权利要求25所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述脂肪酸是饱和脂肪酸。
28.根据权利要求18所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白或运甲状腺素蛋白。
29.根据权利要求18所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述蛋白质包括抗体或其结合片段。
30.根据权利要求29所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述抗体或其结合片段包括抗体的Fc部分。
31.根据权利要求18所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述肽包括XTEN肽、富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白(GLK)聚合物。
32.根据权利要求17所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述缀合部分通过连接体间接结合至所述修饰的IL-2的所述至少一个非天然氨基酸。
33.根据权利要求32所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述连接体包括同双官能连接体、异双官能连接体、零长度连接体，可裂解或不可裂解的二肽连接体、马来酰亚胺基团、间隔基或其组合。
34.根据权利要求1所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述分离并修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低，并且受体信号传导效力的降低是相对于野生型IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍或更多。
35.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽是：
全长IL-2多肽的功能活性片段；
重组IL-2多肽；或
重组人IL-2多肽。
36.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含N-末端缺失、C-末端缺失或其组合。
37.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述N-末端缺失包括从N-末端缺失前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30个残基，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。
38.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述C-末端缺失包括从C-末端缺失最后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20个或更多个残基，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。
39.根据权利要求35所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述功能活性片段包含IL-2区域10-133、20-133、30-133、10-130、20-130、30-130、10-125、20-125、30-125、1-130或1-125，其中残基位置参考SEQ ID NO:1中的位置。
40.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽与SEQID NO:1具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
41.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低的修饰的IL-2多肽能够扩充CD4+ T调节性(Treg)细胞。
42.根据权利要求17所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述缀合部分损害或阻断IL-2与IL-2Rβγ的受体信号转导效力，或减少IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集。
43.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2/IL-2Rαβγ复合物引起的CD4+ Treg细胞增殖等于或大于野生型IL-2多肽引起的增殖。
44.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2/IL-2Rαβγ复合物诱导CD4+ Treg细胞增殖为足以调节动物模型中的疾病过程的群体。
45.根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽表现出对IL-2Rβγ的第一受体信号传导效力和对IL-2Rαβγ的第二受体信号传导效力，其中第一受体信号传导效力比第二受体信号传导效力低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更多。
46.根据权利要求45所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽的第一受体信号传导效力低于野生型IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力。
47.根据权利要求45所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽的第二受体信号传导效力低于野生型IL-2多肽对IL-2Rαβγ的受体信号传导效力。
48.根据权利要求1所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽进一步提供IL-2Rα亚基向IL-2多肽的募集的增加，从而导致白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)的活化，其中该募集的增加是相比于野生型IL-2多肽对IL-2Rα亚基的募集。
49.根据权利要求2所述的分离并修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽进一步提供IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集的减少，其中该募集的减少是相比于野生型IL-2多肽对IL-2Rβ亚基和/或IL-2Rγ亚基的募集。
50.一种白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)结合蛋白，其中所述结合蛋白对白介素2βγ受体(IL-2Rβγ)的受体信号传导效力低于野生型人IL-2(hIL-2)对该受体的受体信号传导效力，并且其中所述结合蛋白包含至少一个非天然氨基酸。
51.一种白介素2αβγ受体(IL-2Rαβγ)结合蛋白，其中所述结合蛋白引起的IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集少于野生型人IL-2(hIL-2)引起的募集，并且其中所述结合蛋白包含至少一个非天然氨基酸。
52.根据权利要求50或51所述的IL-2Rαβγ结合蛋白，其中所述结合蛋白是修饰的IL-2多肽或其功能活性片段，其中该修饰的IL-2多肽包含至少一个非天然氨基酸。
53.一种IL-2/IL-2Rαβγ复合物，其包含含有非天然氨基酸的修饰的IL-2多肽和IL-2Rαβγ，其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ的受体信号传导效力降低，并且其中受体信号传导效力的降低是相比于野生型IL-2多肽与IL-2Rβγ之间的结合亲和力。
54.一种IL-2/IL-2Rαβγ复合物，其包含含有非天然氨基酸的修饰的IL-2多肽和IL-2Rαβγ，其中所述修饰的IL-2多肽引起的IL-2Rγ亚基向IL-2/IL-2Rβ复合物的募集少于野生型IL-2多肽引起的募集。
55.根据权利要求53或54所述的IL-2/IL-2Rαβγ复合物，其中所述修饰的IL-2多肽进一步包含共价连接至所述非天然氨基酸的缀合部分。
56.一种选择性扩充细胞群体中的CD4+ Treg细胞的CD4+ Treg细胞激活剂，其中所述激活剂包含含有至少一个非天然氨基酸的修饰的IL-2多肽。
57.根据权利要求56所述的CD4+ Treg细胞激活剂，其中相对于被野生型IL-2多肽接触的CD3+细胞群体中CD8+效应T细胞和/或自然杀伤细胞的扩充，当所述激活剂与所述CD3+细胞群体接触时，所述激活剂使CD3+细胞群体中CD8+效应T细胞和/或自然杀伤细胞扩充少于20％、15％、10％、5％、1％或0.1％。
58.根据权利要求56所述的CD4+ Treg细胞激活剂，其中所述激活剂不扩充CD8+效应T细胞和/或自然杀伤细胞。
59.根据权利要求56所述的CD4+ Treg细胞激活剂，其中所述细胞群体是体内细胞群体。
60.根据权利要求56所述的CD4+ Treg细胞激活剂，其中所述细胞群体是体外细胞群体。
61.根据权利要求56所述的CD4+ Treg细胞激活剂，其中所述细胞群体是离体细胞群体。
62.一种药物组合物，其包含：
根据权利要求1-49所述的分离并修饰的IL-2多肽，根据权利要求50-52所述的IL-2Rαβγ结合蛋白，或根据权利要求56-61所述的CD4+Treg细胞；以及
药学上可接受的赋形剂。
63.根据权利要求62所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于全身递送。
64.根据权利要求62所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于肠胃外给药。
65.一种治疗有需要的受试者的自身免疫疾病或病症的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，根据权利要求50或51所述的IL-2Rαβγ结合蛋白，根据权利要求56所述的CD4+ Treg细胞，或根据权利要求62所述的药物组合物。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述自身免疫疾病或病症包括斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、1型糖尿病、青少年特发性关节炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、多发性硬化、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮、甲状腺炎、葡萄膜炎、白癜风或韦格纳肉芽肿病。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其进一步包括施用额外的治疗剂。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述IL-2缀合物和所述额外的治疗剂同时施用。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述IL-2缀合物和所述额外的治疗剂依次施用。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述IL-2缀合物在所述额外的治疗剂之前施用。
71.根据权利要求69所述的方法，其中所述IL-2缀合物在施用所述额外的治疗剂之后施用。
72.根据权利要求65-71中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
73.一种扩充CD4+调节性T(Treg)细胞群体的方法，其包括：
使细胞接触根据权利要求1或2所述的分离并修饰的IL-2多肽，根据权利要求50或51所述的IL-2Rαβγ结合蛋白，根据权利要求56所述的CD4+ Treg细胞，或根据权利要求62所述的药物组合物，持续足以诱导与IL-2Rαβγ形成复合物的时间，从而刺激Treg细胞群体的扩充。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述方法是体内方法。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述方法是体外方法。
76.根据权利要求73所述的方法，其中所述方法是离体方法。
77.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-49所述的分离并修饰的IL-2多肽，根据权利要求50-52所述的IL-2Rαβγ结合蛋白，根据权利要求56-61所述的CD4+Treg细胞，或根据权利要求62-64所述的药物组合物。
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