CN114349843A - 白细胞介素-2衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，提供一种IL‑2衍生物，包含IL‑2突变体和脂肪酸衍生物，其中，相对于SEQ ID NO:1所示的IL‑2野生型，所述IL‑2突变体包含一个或多个半胱氨酸突变，所述突变至少包含SEQ ID NO:1所示的第35位的赖氨酸突变为半胱氨酸；所述脂肪酸衍生物包含脂肪酸和水溶性连接子。本发明还提供所述IL‑2衍生物的制备和应用。本发明的IL‑2衍生物相对于天然IL‑2具有显著延长的半衰期以及更好的安全性，具有更优良的成药前景。

Description

白细胞介素-2衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及白细胞介素-2衍生物。

背景技术

白细胞介素-2(IL-2)是一种白细胞介素，是免疫系统中的一种细胞因子信号分子。分子量约为15.5KD，主要由活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞等分泌，负责调节淋巴细胞的活性。

IL-2通过与不同受体亚基的结合对免疫系统起多重调控作用。由IL-2Rα(CD25)、IL-2Rβ(CD122)、IL-2Rγ(CD132)形成的三聚体受体是IL-2最高亲和力(KD约为10pM)受体形式，主要表达于激活的淋巴细胞和CD4阳性(CD4+)、CD25阳性(CD25+)、FoxP3阳性(Foxp3+)的抑制型调节T细胞(Treg)上；由IL-2Rβγ亚基组成的二聚体受体为中间亲和力受体(KD约为1nM)，主要表达于细胞毒性T细胞(CD8+)和天然杀伤细胞(NK)上。CD8+T细胞、NK细胞的激活是IL-2发挥抗肿瘤作用的主要机制，而抑制性Treg细胞的激活可以降低肿瘤的杀伤效果，并且可引发毒性问题。另外，由于内皮细胞上IL-2Rα的表达，高剂量的IL-2可引发血管或者肺部内皮损伤，从而引发血管渗漏综合征或者肺水肿等严重副作用。

不管通过与三聚体受体结合还是二聚体受体结合，IL-2介导的信号通路均是由受体βγ胞内区传导的。其中最为主要的一条信号通路为JAK-STAT信号通路。具体为：IL-2与其受体结合后，βγ的胞内结构域异源二聚化，可募集JAK1和JAK3的激活，从而进一步引起STAT的磷酸化，主要为STAT5，从而引发最终生物学效应。

虽然目前市场上有多种IL-2制剂，但都存在一定问题，例如，高频率给药造成患者依从性差、经济负担重，临床治疗要求剂量很高，高剂量给药容易引发严重副作用等。以PEG修饰的IL-2分子可以降低IL-2引发的毒性问题，且可以有效延长IL-2分子的半衰期，但复杂的生产工艺导致产品质量性质不够稳定的问题。此外，由于某些改良型药物需要PEG分子在人体内逐渐脱落才可以转化为有活性的形式，脱落后的PEG分子可能会在体内累积存在潜在的健康风险。

基于上述现有问题，亟需开发出新型的、更为安全的、具有差异化的IL-2长效药物。

发明内容

本发明提供一种靶向激活效应CD8+T细胞、NK细胞的IL-2衍生物，以解决现有技术中存在的问题。

在第一个方面，本发明提供一种IL-2衍生物，包含IL-2突变体和脂肪酸衍生物，其中，相对于SEQ ID NO:1所示的IL-2野生型，所述IL-2突变体包含一个或多个半胱氨酸突变，其中，所述突变至少包含SEQ ID NO:1所示的第35位的赖氨酸突变为半胱氨酸；所述脂肪酸衍生物包含脂肪酸和水溶性连接子，所述脂肪酸优选为饱和脂肪酸；优选地，所述脂肪酸衍生物与所述IL-2突变体上半胱氨酸上的巯基相连接。

在一种优选的实施方式中，所述IL-2突变体具有SEQ ID NO:2所示序列，其相对于野生型IL-2序列(SEQ ID NO:1)具有K35C突变，该突变体命名为IL-2K35C。

在一些实施方式中，所述水溶性连接子含有与蛋白偶联的基团，所述与蛋白偶联的基团优选为马来酰亚胺基；优选地，所述水溶性连接子具有式I所示结构：

其中，n＝1～6，m＝2～6，n和m均为整数；优选地，n为2，m为2。

在一些实施方式中，所述脂肪酸衍生物中脂肪酸通过其羧基和水溶性连接子的氨基形成酰胺键进行连接；优选地，所述脂肪酸衍生物具有式II所示结构：

其中，R为C₁₂～C₁₆的烃基，n和m的定义如前面所述。

在一种优选的实施方式中，所述脂肪酸衍生物具有式III所示的结构：

优选地，所述脂肪酸衍生物的马来酰亚胺基的双键碳原子与IL-2突变体的第35位半胱氨酸上的巯基连接。

在一种优选的实施方式中，所述IL-2衍生物命名为IL-2K35C-FA。

第二个方面，提供制备本发明的IL-2衍生物的方法，包括以下步骤：

(1)通式化合物A与通式化合物B进行缩合反应得到通式化合物C，优选地，所述缩合反应的缩合剂为2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐；反应溶剂为DMF、THF、CH₂Cl₂中的一种或几种，优选为CH₂Cl₂；

(2)对步骤(1)的产物通式化合物C进行脱保护处理脱去Boc保护，得到通式化合物D，即脂肪酸衍生物；优选地，脱保护使用的试剂为酸性试剂，优选为三氟乙酸；

(3)IL-2突变体经还原后，与步骤(2)得到的脂肪酸衍生物通式化合物D进行偶联反应，即得IL-2衍生物通式化合物E。

在一种优选的实施方式中，提供制备IL-2K35C-FA的方法，所述方法包括步骤：

(1)22-(叔丁氧羰基)-43，43-二甲基-10，19，24，41-四羰基-3，6，12，15，42-五氧-9，18，23三氮-四十四酸与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺缩合反应得到叔丁基25-(叔丁氧羰基)-1-(2,5-羰基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，13，22，27-四羰基-6，9，15，18-四氧-3，12，21，26-四氮四十四酸酯，优选地，所述缩合反应的缩合剂为2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐(BEP)；

(2)对步骤(1)的产物脱去Boc保护，得到25-羧基-1-(2，5-二羰基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，13，22，27-四羰基-6，9，15，18-四氧-3，12，21，26-四氮四十四酸，即脂肪酸衍生物；优选地，脱保护使用的试剂为三氟乙酸；

(3)IL-2突变体IL-2K35C经还原后，与步骤(2)得到的脂肪酸衍生物进行偶联反应，即得IL-2衍生物；

优选地，所述IL-2突变体IL-2K35C的还原过程为：使用TCEP还原两个小时使突变后的表面半胱氨酸的巯基呈游离状态；还原缓冲液为35mM柠檬酸钠、2mM EDTA、154mMNaCl，pH＝5；

优选地，所述偶联反应中，脂肪酸衍生物与还原后的IL-2突变体IL-2K35C的摩尔比为2：1，偶联温度为18℃，反应时间为2小时。

第三个方面，提供一种组合物，其包含本发明的IL-2衍生物；优选地，所述组合物为药物组合物，进一步包含制药学可接受的辅料；进一步优选地，所述制药学可接受的辅料为载体、赋形剂或粘合剂。

第四个方面，提供本发明的IL-2衍生物或组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用；优选地，所述肿瘤为黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、胃癌、胰腺癌、肠癌、鳞状肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、尿路上皮癌、肾细胞癌、膀胱癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌或肉瘤。

第五个方面，提供本发明的IL-2衍生物或组合物在制备抑制Treg细胞激活而不明显降低CD8+T细胞或者NK细胞激活的制剂中的应用。

本发明的IL-2衍生物与野生型IL-2相比，具有显著降低的与α受体亚基的结合能力，同时保留其对β受体亚基的亲和力，能够显著抑制CTLL-2增殖，抑制Treg细胞激活，但不明显降低CD8+T细胞或NK细胞的激活。本发明的IL-2衍生物相对于天然IL-2具有显著延长的半衰期以及更好的安全性，具有更优良的成药前景。

附图说明

图1显示了纯化后的IL-2K35C蛋白的SDS-PAGE图；M表示标志物，1表示还原条件，2表示非还原条件；

图2显示了IL-2K35C蛋白的分子排阻色谱分析结果；

图3显示了一种具体实施方式中的脂肪酸衍生物的合成路线；

图4显示了脂肪酸衍生物和IL-2突变体偶联反应后的产物的反相高效液相色谱结果；

图5显示了偶联后产物用质谱法鉴定总分子量结果；

图6显示了偶联后产物用质谱法鉴定脂肪酸修饰位点的结果；

图7显示了ELISA法检测改造后IL-2分子与IL-2Rα/IL-2Rβ的结合；

图8显示了改造后分子刺激CTLL-2细胞增殖的情况；

图9显示了改造后分子刺激Treg细胞中IL-2介导的STAT5磷酸化水平；

图10显示了改造后分子刺激CD8+细胞中IL-2特异性STAT5磷酸化水平；

图11显示了小鼠B16F10黑色素瘤模型的给药方案；三角表示PBS给药频率，箭头表示IL-2K35C-FA给药频率；

图12显示了B16F10黑色素瘤模型一周内小鼠的体重情况；

图13显示了B16F10黑色素瘤模型一周内小鼠的肿瘤体积情况；

具体实施方式

下面将结合具体实施例来说明本发明内容。如无明确说明，以下方法中使用的试剂和仪器都是本领域常用试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的方法都是本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例所描述的内容可以毫无疑义地实施所述方法并获得相应的结果。

实施例1：IL-2K35C蛋白的制备

根据IL-2野生型序列(SEQ ID NO:1)，将第35位赖氨酸突变为半胱氨酸，将突变后的蛋白命名为IL-2K35C(SEQ ID NO:2)；另外，将第43位赖氨酸、第64位赖氨酸分别突变为半胱氨酸，命名为IL-2K43C、IL-2K64C，以作对照。为了便于后续纯化，在蛋白N端引入人IgG1的Fc区，并在Fc与目的蛋白引入凝血酶酶切位点LVPRGS。带有Fc标签的IL-2K35全长序列(Fc-IL-2K35C)如SEQ ID NO：3所示。

将以上克隆设计委托泰州市百英生物科技有限公司构建并进行CHO细胞表达纯化。使用125ml一次性无菌摇瓶，将冻存的CHO细胞37度水浴解冻，细胞稀释至0.3×10⁶个/ml，体积30ml。125rpm(19mm轨道)，8％CO₂，37℃培养至4-6×10⁶个/ml时进行传代，传代密度为0.2-0.3×10⁶个/ml，培养3天后进行转染。培养18-22个小时后加辅料和增强剂，32℃培养7天后进行细胞收集与蛋白纯化。结果显示在三个突变克隆中只有IL-2K35C获得了表达量相对较高的目的蛋白，IL-2K43C、IL-2K64C表达量很低，无法进行后续实验。

将Fc-IL-2K35C经过凝血酶酶切后获得不带Fc标签的目的蛋白IL-2K35C，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，条带较酶切前较杂，还原后可看到在15.5KD处存在主要目的条带(图1)，经分子排阻色谱(SEC)鉴定后目的条带纯度约为85％(图2)，产量约为25mg/L。IL-2蛋白作为细胞因子，由于作用时间迅速，负反馈调节机制多样以及其本身的氨基酸序列等天然性质，获得高纯度、高表达量外源重组蛋白一直以来都是一件非常具有挑战的事情，因此采用本文中的方法表达的IL-2突变体蛋白具备相对优异的应用基础。

实施例2：脂肪酸衍生物的合成

如图3所示，以22-(叔丁氧羰基)-43，43-二甲基-10，19，24，41-四羰基-3，6，12，15，42-五氧-9，18，23三氮-四十四酸(1)为原料(以下简称索马鲁肽侧链中间体，参照专利文件WO2011117415A的实施例1合成)与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺在缩合剂2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐(毕德医药，BKZ779)作用下反应得到叔丁基25-(叔丁氧羰基)-1-(2,5-羰基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，13，22，27-四羰基-6，9，15，18-四氧-3，12，21，26-四氮四十四酸酯(2)，然后用三氟乙酸(TEDIA，TS4295-013)脱去Boc保护，得到脂肪酸衍生物25-羧基-1-(2，5-二羰基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，13，22，27-四羰基-6，9，15，18-四氧-3，12，21，26-四氮四十四酸(3)。具体操作为：5.0g(0.0059mol)索马鲁肽侧链中间体溶于80ml二氯甲烷中，冰浴下，依次加入2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐2.45g(0.0089mol)、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐1.54g(0.0061mol)、二异丙基乙胺4.01ml(0.023mol)，保温搅拌1小时，然后恢复至室温过夜搅拌12小时，反应完全后，加入饱和食盐水100ml，洗涤3次，水相用二氯甲烷100ml提取2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到黄色油状液体5.5g。上步产物3.3g加入42ml二氯甲烷溶解，加入三氟乙酸42ml室温搅拌1小时，反应完全，浓缩后，加入乙醚，析出白色固体。最后过滤真空干燥得到2.48g白色固体产物。MS：m/e856.5(MH)⁺，878.5(M+Na)⁺。

实施例3：脂肪酸衍生物和IL-2K35C的偶联

将TCEP(苏州昊帆生物股份有限公司，20190501，以还原缓冲液配制成水溶液)与IL-2K35C蛋白以摩尔比6：1混合，在18℃下还原两个小时，以使突变后的表面半胱氨酸的巯基呈游离状态。还原缓冲液为35mM柠檬酸钠(生工生物、A610035)、2mM EDTA(生工生物、A610185-0500)、154mM NaCl(生工生物、A501218-0001)，pH＝5。还原完成后，将产物以7000rpm/min的速度，超速离心10次，置换10倍缓冲液体积，去除TCEP。将实施例2得到的脂肪酸衍生物(FA)溶解于含有5％的N,N-二甲基甲酰胺(DMA)(TEDIA、DS1441-001)的还原缓冲液中，与还原后的IL-2K35C以2：1摩尔比例进行混合，18℃下进行偶联反应，反应时间为2小时。

偶联完成后，将偶联产物在Aglient 1200高压液相色谱仪(美国Aglient公司)上对偶联后产物进行反相高效液相色谱鉴定，反相色谱柱为

C8,3.5μm。流动相A为含有0.1％三氟乙酸(TEDIA、TS4295-013)的水，流动相B为含有0.1％三氟乙酸的乙腈(Merk、81007918)。35％流动相B为起始梯度，并在30分钟内增加到85％B。进样量为20μl，流速1.0mL·min^-1,检测波长214nm。结果显示，IL-2K35C蛋白的出峰位置约为23.5分钟，脂肪酸衍生物(FA)的出峰位置约为13.6分钟，偶联产物(IL-2K35C-FA)的出峰位置为24.9分钟(图4)。

实施例4：色谱-二级串联质谱(LC-MS/MS)分析偶联后产物分子量

在ACQUITY UPLC-Xevo-G2S Q-TOF超高效液相色谱-二级串联质谱联用仪(美国Waters公司)上装配Waters MassPREP微量脱盐柱，对偶联产物(IL-2K35C-FA)进行分子量鉴定。流动相A为含有体积含量为0.1％甲酸的水，流动相B为含有体积含量为0.1％甲酸的乙腈。10％流动相B为起拉浓度，持续1分钟后在5分钟内升至90％流动相B。进样量为10μl，流速0.2mL·min^-1，检测波长为214nm。质谱操作条件为：毛细管电压2.5KV，样品锥孔电压100V，离子源温度120℃，雾化温度500℃，雾化流速800L·h^-1，质量分析范围250～4000m/z。利用Biopharmalynx 1.3.3软件(Waters)对液质联用获得数据进行分析。结果显示，IL-2突变体IL-2K35C分子量为16104.94道尔顿，偶联后主产物分子量为16960.48道尔顿，分子量增加了855.54道尔顿，为一分子脂肪酸衍生物FA的分子量(图5)。

实施例5：色谱-二级串联质谱(LC-MS/MS)分析偶联位点和二硫键情况

为进一步确定偶联后的蛋白是否保持了正确内部空间结构，本研究在酶切肽段水平上用质谱对氨基酸序列二硫键及偶联位点进行结构确证。

在ACQUITY UPLC-Xevo-G2S Q-TOF超高效液相色谱-二级串联质谱联用仪(美国Waters公司)上装配Waters BEH300C18柱子(2.1×150mm，1.7μm)，对偶联产物进行鉴定，以分析二硫键位置、偶联位点以及偶联的脂肪酸数量信息。首先将偶联产物与等体积0.25MTris-HCL缓冲液(pH＝7.5)混合，然后加入10％体积的胰酶，在37℃的温度下消化3个小时。流动相A为含有体积含量0.1％甲酸的水，流动相B为含有体积含量0.1％甲酸的乙腈。洗脱梯度为47分钟从2％B增加到50％B，流速0.2mL·min^-1，进样量10μl。质谱操作条件为：毛细管电压2.5KV，样品锥孔电压60V，离子源温度95℃，雾化温度400℃，雾化流速600L·h-1，质量分析范围50～2000m/z。利用Biopharmalynx 1.3.3软件(Waters)对液质联用获得数据进行分析。

结果如图6所示，肽段HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSK和GSETTFMCEYADETATIVEFLNR之间形成了二硫键。该二硫键为天然IL-2内部存在的正确二硫键形式，说明在还原的过程中并没有破坏IL-2天然结构。肽段NPCLT中的半胱氨酸呈现被修饰的状态，该氨基酸为第35位突变后的氨基酸位点，为目的修饰氨基酸位点。以上结果表明一个脂肪酸衍生物被偶联到了正确的位置。

实施例6：体外受体结合能力的检测

通过ELISA的方法检测IL-2K35C-FA与IL-2Rα受体的结合能力。将IL-2Rα-Fc(ACROBiosystems，ILA-H5251)用PBS稀释至2μg·mL^-1，以每孔100μL加入酶标板中，4℃孵育过夜。将酶标板用洗涤液(1×PBST)清洗3次后，以每孔100μL加入封闭液(1％BSA-1×PBST)，37℃封闭1h。将IL-2K35C-FA、IL-2K35C和对照IL-2WT(SEQ ID NO:1)用封闭液稀释至20ng·mL^-1，然后按1:2进行梯度稀释，共设10个稀释梯度。将封闭后的酶标板清洗3次后，以每孔100μL加入各浓度梯度的样本，每个梯度设3个复孔，室温500转速振荡孵育1.5h。将酶标板清洗3次后，以每孔100μL加入1:10000封闭液稀释后的羊抗人IgG Fc抗体-HRP(Abcam，ab7403)，室温500转速振荡孵育1h。将酶标板清洗3次后，以每孔100μL加入TMB显色液，室温避光反应15分钟后每孔加入100μL 1.0M硫酸终止反应。用酶标仪(Spectra MaxM5，美国Molecular Device公司)在450nm波长下测定各孔吸光度值。

采用同样的方法检测上述样本与IL-2Rβ的结合能力。将IL-2Rβ-Fc(SinoBiological，10696-H05H)用PBS稀释至2μg·mL^-1，以每孔100μL加入酶标板中，4℃孵育过夜。将酶标板用洗涤液(1×PBST)清洗3次后，以每孔100μL加入封闭液(1％BSA-1×PBST)，37℃封闭1h。将IL-2K35C-FA、IL-2K35C和对照用IL-2WT用封闭液稀释至20μg·mL-1，然后按1:5进行梯度稀释，共设10个稀释梯度。其他步骤请参考IL-2Rα的检测。

结果如图7所示，突变后的分子IL-2K35C相对于野生型IL-2，其对IL-2Rα的结合能力发生了显著降低，IL-2K35C-FA相对于IL-2K35C的结合能力发生了进一步降低，推测可能是FA偶联后的空间位阻效应进一步降低了该分子对受体α亚基的结合能力(图7)。

与中亲和力受体IL-2βγ的结合是其发挥肿瘤杀伤作用的主要机制。采用ELISA方法检测改造后分子与IL-2Rβ的结合能力，结果显示IL-2K35C-FA与IL-2Rβ的结合能力与IL-2WT相当(图7)，表明改造后分子与受体IL-2Rβ的结合能力没有受到影响。

实施例7：CTLL-2增殖检测

CTLL-2是小鼠T细胞，可高表达IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2γ三种受体。IL-2通过三聚体受体介导的信号通路激活，可刺激CTLL-2细胞的增殖。

收集对数期的CTLL-2细胞(ATCC)，用细胞完全培养液(RPMI1640+10％FBS)调整细胞密度为2×10⁵个/ml，以每孔50μL接种于96孔细胞培养板，放入37℃、5％二氧化碳培养箱培养18～24h。将样本(IL-2WT、IL-2K35C、IL-2K35C-FA)用细胞培养基稀释至50ng/ml，以此为首孔浓度进行2倍梯度稀释，共设置10个浓度点。将IL-2WT、IL-2K35C、IL-2K35C-FA溶液分别以每孔50μL加入接种有CTLL-2细胞的培养板中，5％二氧化碳培养箱培养48h。检测时每孔加入100μL

(Promega，G7570)显色，用酶标仪(Spectra Max M5，美国Molecular Device公司)在化学发光模式下检测各孔数值。

以样品作用量(ng)为横坐标，以测得的各孔发光度平均值为纵坐标，用酶标仪自带分析软件进行拟合，选择四参数方程回归模型，计算各样本对CTLL-2细胞的增殖活性。

结果显示：在IL-2WT、IL-2K35C、IL-2K35C-FA三个分子中，IL-2WT对CTLL-2细胞的增殖效果最为明显，IL-2K35C-FA效果最弱，IL-2K35C效果居中(图8)。该结果与Elisa检测结果吻合，说明改造后分子通过降低与IL-2Rα的结合能力产生了相应的细胞学效应。

实施例8：Treg/CD8+T细胞磷酸化STAT5检测

在本研究中，通过检测IL-2刺激Treg(ORiCELLS，PB009-4F-2)细胞中的p-STAT5水平来检测其对Treg细胞的激活作用。

将Treg细胞密度调整为每毫升1×10⁶个并以20μl/孔铺于InstantOne phospho-STAT5A/B Tyr694/699Elisa试剂盒(Invitrogen，85-86112-11)专用96孔板上，并将板子放入37℃、5％二氧化碳培养箱培养2小时。将IL-2K35C-FA、IL-2K35C、IL-2WT各稀释为0.1μg/ml、0.01μg/ml两个浓度，分别加入96孔板，然后按照说明书加入10μl/孔裂解液。将96孔板以每分钟300转的速度室温震荡10分钟后，加入试剂盒中的抗体和检测试剂，并按照说明书终止反应。用酶标仪(Spectra Max M5，美国Molecular Device公司)检测各孔OD450的吸收值。

在0.01μg/ml和0.1μg/ml的条件下，检测IL-2K35C-FA、IL-2K35C、IL-2WT的刺激效果。结果显示在两种浓度下，IL-2WT样本的OD450值分别为0.8641和1.4641，突变后的IL-2K35C对p-STAT5的刺激效果显著降低，OD450值分别为0.3020和0.5674，IL-2K35C-FA相对于IL-2K35C，刺激效果进一步降低，在三个样本中拥有最弱的激活效果，OD450值分别为0.1565和0.2883(图9)。

CD8+T细胞表面高表达IL-2Rβ和IL-2Rγ而不表达IL-2Rα，是发挥IL-2介导的肿瘤杀伤作用的主要细胞之一。改造后的分子理想的性质是不影响其激活CD8+T细胞的能力。将CD8+T(ORiCELLS，FPB009-3F-C-2.5M)细胞密度调整为每毫升1×10⁶个并以20μl/孔铺于InstantOne phospho-STAT5A/B Tyr694/699Elisa试剂盒专用96孔板上，并将板子放入37℃、5％二氧化碳培养箱培养2小时。将IL-2K35C-FA、IL-2K35C、IL-2WT各稀释为2μg/ml，分别加入96孔板，以无细胞溶液作为空白对照。其他步骤参考Treg细胞的检测。结果图10所示，相对于空白对照，IL-2K35C-FA、IL-2K35C均具有良好的激活CD8+T细胞的能力(OD450值分别为0.3519和0.3613)，且与IL-2WT(OD值分别为0.3332)激活能力相当。

实施例9：B16F10黑色素瘤模型体内试验

B16F10黑色素瘤模型是评价IL-2及其衍生物常用的动物药效模型之一。C57BL/6J(维通利华)小鼠皮下接种B16F10(ATCC)细胞，建立小鼠黑色素瘤皮下移植肿瘤模型。试验分为IL2K35C-FA(3mg/kg)组及PBS对照组，每组8只小鼠。PBS(10mL/kg)腹腔注射给药，每天给药2次，连续给药5天；IL-2K35C-FA(3mg/kg)组腹腔注射给药，每周给药1次。根据相对肿瘤抑制率(TGI)和实验动物生存情况进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。

TGI算法如下所示：

TV：肿瘤体积；RTV：相对肿瘤体积，公式：RTV＝Vt/V0，V0为分组时测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时肿瘤体积。

T/C：相对肿瘤增殖率T/C％是肿瘤对治疗的反应的指标，是最常用的评价指标，公式：T/C％＝TRTV/CRTV×100％；TRTV：治疗组RTV；CRTV：对照组RTV；

TGI：相对肿瘤抑制率，是肿瘤对于治疗的反应的指标之一：公式：TGI％＝1-T/C(％)。其中，T和C分别为治疗组和对照组某一特定时间点的相对肿瘤体积。

给药方案如图11所示。

在第0天、第3天和第7天对小鼠的体重(g)进行测定，结果显示，IL-2K35C-FA实验组小鼠体重与PBS组接近，安全性良好(图12)。

另外分别在第3天和第7天测量肿瘤的体积(mm³)，并绘制肿瘤生长曲线，结果显示在第7天时IL-2K35C-FA的TGI为37％(图13)。IL-2K35C-FA仅仅给药一次，在一周内表现出持续的肿瘤的抑制效果，表现出长效作用。

SEQ ID NO:1(IL-2WT)

SEQ ID NO:2(IL-2K35C)

SEQ ID NO:3(Fc-IL-2K35C)

EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLVPRGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPCLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

序列表

<110> 浙江博锐生物制药有限公司

海正生物制药有限公司

<120> 白细胞介素-2衍生物及其制备方法和应用

<130> DSP1F214232ZX

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Cys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 3

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Val Pro Arg Gly Ser Ala Pro

225 230 235 240

Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu

245 250 255

Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro

260 265 270

Cys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala

275 280 285

Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu

290 295 300

Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro

305 310 315 320

Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly

325 330 335

Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile

340 345 350

Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser

355 360 365

Thr Leu Thr

370

Claims (10)

1.一种IL-2衍生物，其特征在于，包含IL-2突变体和脂肪酸衍生物，其中，相对于SEQID NO:1所示的IL-2野生型，所述IL-2突变体包含一个或多个半胱氨酸突变，其中，所述突变至少包含SEQ ID NO:1所示的第35位的赖氨酸突变为半胱氨酸；优选地，所述IL-2突变体具有SEQ ID NO:2所示序列；所述脂肪酸衍生物包含脂肪酸和水溶性连接子，所述脂肪酸优选为饱和脂肪酸；优选地，所述脂肪酸衍生物与所述IL-2突变体上半胱氨酸上的巯基相连接。

2.根据权利要求1所述的IL-2衍生物，其特征在于，所述水溶性连接子含有与蛋白偶联的基团，所述与蛋白偶联的基团优选为马来酰亚胺基，进一步优选地，所述水溶性连接子具有式I所示结构：

其中，n＝1～6，m＝2～6，n和m均为整数；优选地，n为2，m为2。

3.根据权利要求1或2所述的IL-2衍生物，其特征在于，所述脂肪酸衍生物中脂肪酸通过其羧基和水溶性连接子的氨基形成酰胺键进行连接，优选地，所述脂肪酸衍生物具有式II所示结构：

其中，R为C₁₂～C₁₆的烃基，n和m的定义如权利要求2中所述。

4.根据权利要求1-3任一项所述的IL-2衍生物，其中，所述脂肪酸衍生物具有式III所示的结构：

优选地，所述脂肪酸衍生物的马来酰亚胺基的双键碳原子与IL-2突变体的第35位半胱氨酸上的巯基连接。

5.制备权利要求1～4任一项所述的IL-2衍生物的方法，包括以下步骤：

(1)通式化合物A与通式化合物B进行缩合反应得到通式化合物C，优选地，所述缩合反应的缩合剂为2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐；反应溶剂为DMF、THF、CH₂Cl₂中的一种或几种，优选为CH₂Cl₂；

(2)对步骤(1)的产物通式化合物C进行脱保护处理脱去Boc保护，得到通式化合物D；优选地，脱保护使用的试剂为酸性试剂，优选为三氟乙酸；

(3)IL-2突变体经还原后，与步骤(2)得到的通式化合物D进行偶联反应，即得IL-2衍生物通式化合物E。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述方法包括步骤：

(1)22-(叔丁氧羰基)-43，43-二甲基-10，19，24，41-四羰基-3，6，12，15，42-五氧-9，18，23三氮-四十四酸与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺缩合反应得到叔丁基25-(叔丁氧羰基)-1-(2,5-羰基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，13，22，27-四羰基-6，9，15，18-四氧-3，12，21，26-四氮四十四酸酯，优选地，所述缩合反应的缩合剂为2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐；

(2)对步骤(1)的产物脱去Boc保护，得到25-羧基-1-(2，5-二羰基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，13，22，27-四羰基-6，9，15，18-四氧-3，12，21，26-四氮四十四酸，即脂肪酸衍生物；优选地，脱保护使用的试剂为三氟乙酸；

(3)IL-2突变体经还原后，与步骤(2)得到的脂肪酸衍生物进行偶联反应，即得IL-2衍生物；

优选地，所述IL-2突变体的还原过程为：使用TCEP还原两个小时使突变后的表面半胱氨酸的巯基呈游离状态；还原缓冲液为35mM柠檬酸钠、2mM EDTA、154mM NaCl，pH＝5；

优选地，所述偶联反应中，脂肪酸衍生物与还原后的IL-2突变体的摩尔比为2：1，偶联温度为18℃，反应时间为2小时。

7.一种组合物，其包含权利要求1-4任一项所述的IL-2衍生物。

8.根据权利要求7所述的组合物，其为药物组合物，进一步包含制药学可接受的辅料；优选地，所述制药学可接受的辅料为载体、赋形剂或粘合剂。

9.权利要求1-4任一项所述的IL-2衍生物或权利要求7或8所述的组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用；优选地，所述肿瘤为黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、胃癌、胰腺癌、肠癌、鳞状肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、尿路上皮癌、肾细胞癌、膀胱癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌或肉瘤。

10.权利要求1-4任一项所述的IL-2衍生物或权利要求7或8所述的组合物在制备抑制Treg细胞激活而不明显降低CD8+T细胞或者NK细胞激活的制剂中的应用。

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