CN100535013C - 应用抗体分子对肿瘤血管进行选择性定向 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用针对纤连蛋白的血管生成标记物ED-B结构域的人重组scFv，L19，在体内对肿瘤血管进行选择性定向。在优选的实施方案中，使用具有L19可变区的完整人IgG1。在其他的实施方案中，采用了通过scFv L19和分泌型IgE异构体的恒定CH4结构域融合所生成的小免疫球蛋白，该恒定CH4结构域在其COOH末端天然地含有半胱氨酸并形成共价连接的二聚体。依赖于临床的需要和疾病，可开发出具有不同体内性能的抗体形式，用于不同的诊断性和治疗性目的。这些抗体可以如所述进行标记。

Description

应用抗体分子对肿瘤血管进行选择性定向
本发明涉及应用抗体分子对肿瘤血管系统进行定向(targeting)。特别的，本发明涉及与纤连蛋白的ED-B结合且被证实其能用于肿瘤定向的抗体分子的用途。在本发明的不同的实施方案中，采用了不同分子形式的抗体分子。在某些实施方案中，抗体分子包括人IgG1。在其他的实施方案中，抗体分析是小免疫球蛋白(mini-immunoglobulin)，例如通过将scFv抗体分子融合到在COOH末端天然地含有半胱氨酸的分泌型IgE异构体的恒定CH4结构域生成这种小免疫球蛋白，这形成一个共价连接的二聚体。在例如肿瘤定向的本发明的不同方面和实施方案中利用了血浆清除率、体内稳定性和其他有用的特性。根据临床的需要和疾病，可以将不同抗体分子形式的不同的体内特性用于不同的诊断和/或治疗目的。
由于非人源化的单克隆抗体具有免疫原性(1 Shawlert et al.，1985；2Miller et al.，1983)、差的药代动力学特性(3 Hakimi et al.，1991；4 Stephenset al.，1995)以及对所补充的效应物功能无效(5 Riechmann et al.，1988；6Junghens et al.，1990)，因此尽管它们具有用作治疗药物的巨大潜能，但是在临床试验中很少地采用非人源化的单克隆抗体(mAbs)。最近对来源于噬菌体展示库的分离的人抗体片段的研究解决了这些问题，再次激活了这些研究并再燃起利用这些药物治疗重大疾病的希望。事实上，这些分子可用作新的诊断和治疗工具的理想构架(11 Reichert，2001；12 Huls etal.，1999)。此外，这些抗体可以被“成熟”为达到(即使没有必要，但也至少是合意的)用于临床的微微摩尔范围内的亲和力(13 Pini et al.，1998)。
然而，用于选择性转送诊断剂或治疗剂的人抗体片段的临床应用需要高度特异的靶。对于肿瘤，最常用的靶是细胞表面抗原，但它常既不丰富也不稳定。而在肿瘤进展过程中，肿瘤周围的微环境发生了巨大的改变，它形成了具有用于基于抗体的肿瘤治疗的靶的“肿瘤环境”(14 Neriand Zardi，1998)。事实上，变化的肿瘤微环境本身是个可以被定向的致癌物的概念正逐渐成为一致的意见。因此，能有效地将治疗药物转送到肿瘤微环境的分子代表着肿瘤治疗的有希望的和重要的新工具(15 Bissel，2001；14 Neri and Zardi，1998)。
纤连蛋白(FN)是一种细胞外基质(ECM)成分，它广泛地表达于各种正常的组织和体液中。通过对FN前mRNA(pre-mRNA)的不同的剪切可以生成不同的FN异构体，这个过程是被细胞因子和细胞外pH值所调节的(16 Balza etal.，1988；17 Carnemolla et al.，1989；18 Borsi et al.，1990；19 Borsi et al.，1995)。FN分子可以完全地包含或不包含完整的III型重复ED-B，也称为外型III型重复B(EIIIB)(20 Zardi et al.，1987)。ED-B在不同的物种中是高度保守的，因此在广泛被研究的哺乳动物中有着100％同源性(人、兔、鼠、狗)以及与鸡的相似结构域有着96％同源性。在正常成人组织中免疫组化不能测定到含有ED-B的FN异构体(B-FN)，除非是遭受生理重建(例如，子宫内膜和卵巢)及伤口愈合期间的组织(17 Carnemolla et al.，1989；21 ffrench-Constant，et al.，1989)。相反的，它在肿瘤和胎儿组织中是高表达的(17 Carnemolla et al，1989)。此外，已经证实B-FN是血管生成的标记物(22 Castellani et al.，1994)以及内皮细胞沿着含有B-FN的ECM纤维游走并侵入肿瘤组织(23 Tarli et al.1999)。
已经描述了应用特异于BF-N异构体(24 Carnemolla et al.，1996；23Tarli et al.，99；25 Viti et al.，99；26 Neri et al.，97；27 Demartis et al.，2001)的人重组抗体，scFv(L19)(13 Pini et al.，98)对肿瘤血管进行选择性定向。抗体可应用于将治疗性放射性核素或毒性物质选择性转送到肿瘤血管的体内诊断性(免疫闪烁描绘术)和治疗性方法中。另外，Birchler et al.(28 1999)显示将化学结合于光敏剂的scFv(L19)选择性地聚集于血管生成的鼠角膜模型的新生的血管中，在用近红外线照射后，它导致了眼新生血管的完全和选择性阻塞。
更最近的，Nilsson et al.(29 2001)报道了scFv(L19)与组织因子的细胞外结构域的免疫缀合物介导了不同类型的鼠肿瘤模型的选择性梗死。此外，scFv(L19)和IL-2或IL-12的融合蛋白已经显示出增强了这两种细胞因子的治疗作用(30 Halin et al.，submitted；31 Carnemolla et al.，2002)。也可参见WO01/62298中融合蛋白在包括肿瘤的病理性血管发生病变治疗上的用途。最后，既然L19与鼠及人的ED-B有着同等好的反应，因此它可以被用于临床前和临床研究。
也见于PCT/GB97/01412、PCT/EP99/03210、PCT/EP01/02062和PCT/IB01/00382。
不同的抗体形式已经显示在体内稳定性、清除率和对肿瘤定向的作用上有着不同的特性(32 Wu et al.，2000)。Li(33 Li et al.，1997)描述了小免疫球蛋白或小免疫蛋白(SIP)。
本发明涉及scFv、小免疫球蛋白和完整IgG1等不同形式的L19人抗体分子的制备、特征以及体内生物分布的研究。
附图说明
图1显示了举例说明不同蛋白结构的模型。A：FN亚基的结构域结构的模型。用灰色显示了进行选择性剪切的蛋白序列。如所示的，重组抗体L19的抗原决定簇定位于重复ED-B内。B-D：相应地用于表示L19(scFv)(B)、L19-SIP(C)、和L19-IgG1/κ构建体的图解。
图2显示了SK-MEL-28瘤在裸鼠中的生长曲线(三角)以及F9瘤在129小鼠品系中(圆圈)的生长曲线。绘制了体积(mm3)对时间(天)的曲线。每个数据点为六只鼠的平均值±SD。
图3显示了不同的L19形式的体积排阻(size exclusionchromatography)色谱的结果。在图A、B和C中相应地显示了在放射性碘标记后L19形式的scFv、小免疫球蛋白及IgG1的体积排阻色谱值(Superdex 200)。图D、E和F相应地显示了静脉注射放射性碘标记的L19形式的scFv、小免疫球蛋白及IgG1后的所示时间内血浆的体积排阻色谱值(Superdex 200)。在注射后的不同时间点，被测血浆中L19-SIP或L19-IgG1的曲线值没有测定到变化，而在注射L19(scFv)2后3h观察到了更高分子量的第二个峰。
图4显示了用不同的放射性碘标记的L19抗体分子形式在SK-MEL-28肿瘤负荷鼠的生物分布试验的结果。报告了在i.v.注射后的所示时间内肿瘤内(图4A)和血液内(图4B)％ID/g的差异。在图4C中绘制了肿瘤-血％ID/g比例曲线。L19(scFv)曲线用棱形表示，而L19小免疫球蛋白曲线用正方形表示，以及L19IgG1用三角形表示。
图5显示了用放射性碘标记的L19(scFv)(正方形)与L19小免疫球蛋白(棱形)在F9肿瘤负荷鼠的生物分布试验结果。报告了在i.v.注射后的所示时间时肿瘤内(A)和血液内(B)％ID/g的差异。
在一个方面，本发明提供了一种与人纤连蛋白的ED-B结合的特异性结合构件(member)，它包括L19 VH结构域和一个VL结构域、任意的一个L19 VL结构域，并且其中特异性结合构件包含包括与εs2-CH4融合的所述抗体VH结构域和抗体VL结构域并二聚体化的小免疫球蛋白，或包含整个IgG1抗体分子。
在Pini et al.(1998)J.Biol.Chem.273：21769-21776中揭示了L19 VH结构域和L19 VL结构域的序列，Pini et al.的这些序列在此完全并入作为参考。
通常地，一个VH结构域与一个VL结构域的配对提供了一个抗体的抗原结合位点。在一个优选的实施方案中，L19 VH结构域与L19 VL结构域配对，因此形成了包括L19 VH与L19 VL结构域的抗体的抗原结合位点。在其他的实施方案中，L19 VH与除L19 VL以外的其他VL结构域配对。轻链的杂乱性(promiscuity)在本领域是熟知的。
可以从L19 VH或VL结构域得到一个或更多个CDR并将其结合到合适的框架中。下面将进一步地讨论这个问题。SEQ ID NO.1、2、和3相应地显示了L19 VH CDR 1、2、和3。SEQ ID NO.1、2、和3相应地显示了L19 VL CDR 1、2、和3。
在此展示了VH和VL结构域的变体以及它们的CDR的序列，它们可以应用于针对ED-B的特异性结合构件中，利用序列变更或突变以及筛选方法的方式可以生成这些变体。
如所讨论的，根据本发明可以采用任一VH和VL结构域的可变区结构域的氨基酸序列变体，在此特异性地阐述了它们的序列。特殊变体可以包括一个或多个氨基酸序列变更(一个氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，可以是小于20个变更、小于15个变更、小于10个变更或小于约5个变更、4、3、2或1个变更。变更可以发生于一个或多个框架区域和/或一个或多个CDR。
根据本发明的特异性结合构件可以是与能结合于ED-B并包含L19VH结构域和L19 VL结构域所形成的抗原结合位点的特异性结合构件竞争性结合抗体的构件。体外容易测定结合构件之间的竞争，例如利用ELISA和/或通过将特殊的报告分子标记于结合构件，并在存在有其他非标记的结合构件时测定该标记的构件，这样能鉴别与相同的抗原决定簇或重叠的抗原决定簇相结合的特异性结合构件。
因此，本明的进一步的方面采用了含有人抗体的抗原结合位点的特异性结合构件，它与L19竞争性结合到ED-B。
根据本发明的特异性结合构件至少可以以L19的亲和力与ED-B结合，在适当的条件下可以比较不同的结合构件的结合亲和力。
除了抗体序列，根据本发明的特异性结合构件可以包括其他的氨基酸，例如形成肽或多肽，例如折叠结构域、或是赋予分子除了与抗原结合的能力外的其他功能特征。本发明的特异性结合构件可以具有可测定的标记物，或可以缀合一种毒素或酶(例如通过肽键或连接体)。
对于病理性血管生成疾病或病变的治疗，本发明的特异性结合构件可以缀合一种毒素分子，例如一种杀生物剂分子或细胞毒性分子，它们可以选自白介素-2(IL-2)、阿霉素、白介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及组织因子(优选的为截断的组织因子(truncated tissue factor)，例如残基1-219)。见，例如WO01/62298。
在更多的方面，本方面提供了一种包含编码根据本发明的特异性结合构件的序列的分离的核酸，以及制备特异性结合构件的方法，它包括在能生成所述特异性结合构件并将其回收的条件下表达所述核酸。
根据本发明的特异性结合构件可以用于人体或动物体的治疗或诊断方法，例如治疗(可以包括预防性治疗)人患者的疾病或病变的方法，包括给所述患者施用有效量的本发明的特异性结合构件。根据本发明的治疗病变包括肿瘤，尤其是实体瘤，以及其他的病理性血管生成病变，包括类风湿关节炎、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、以及血管瘤。
在另一个方面，提供了一种生产本发明的特异性结合构件的方法，该方法包括引起编码核酸的表达。这样一种方法可以包括在生产所述特异性结合构件的条件下培养宿主细胞。
生产方法可以包括产物的分离和/或纯化步骤。
生产方法可以包括将产物加工成含有至少一种附加成分例如药用可接受赋形剂的组合物。
下面进一步地详细阐述了本发明的这些和其他的方面。
术语
特异性结合构件(Specific binding member)
它描述了一对彼此具有结合特异性的分子中的一个构件。特异性结合对的构件可以是天然起源的或是整个地或部分地合成生产的。分子对的一个构件在它的表面或穴内具有能特异性结合并互补于该分子对的另一个构件的特殊的空间或极性组合的区域。因此，分子对的构件具有能彼此特异性结合的特性。特异性结合对类型的实例为抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本应用是有关于抗原-抗体类型的反应。
抗体分子
它描述了一种无论是天然的或部分或整个合成生产的免疫球蛋白。该术语也覆盖了任何含有抗体结合结构域的多肽或蛋白。含有抗原结合结构域的抗体片段是那些Fab、scFv、Fv、dAb、Fd以及微型双功能抗体。本发明是有关于完整IgG1抗体分子及如所述的含有εs2-CH4的小免疫球蛋白。
可以用DNA重组技术的方法从原始的抗体分子生成保持有原始抗体分子的特异性的其他抗体分子。这些技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区、或互补决定区(CDR)的DNA引入到不同的免疫球蛋白的恒定区，或恒定区加上框架区域。见，例如，EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。
可以用多种方法改造抗体，术语“抗体分子”应当被理解为覆盖所有的具有所需特异性的抗体的抗原结合结构域的特异性结合构件或物质。因此，该术语覆盖了抗体片段和衍生物，包括任何含有免疫球蛋白的抗原结合结构域的多肽，无论它是天然的或整个或部分合成的。所以还包括含有与另一个多肽融合的免疫球蛋白的结合结构域或其等价物的嵌合分子。EP-A-0120694和EP-A-0125023描述了对嵌合抗体的克隆和表达。
抗原结合结构域
它描述了抗体分子的一部分，包括能特异性结合并互补于抗原的一部分或全部的区域。其中如果抗原是巨大的，那么抗体可以只结合于抗原的特殊部分，这部分被称为抗原决定簇。抗原结合结构域可以被一个或多个抗体的可变区所提供(例如称为含有VH结构域的Fd抗体片段)。优选地，抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
特异性
它所指的是特异性结合对中的一个构件没有显示出对除它的特异性结合配体外的其他分子任何显著结合的状态。术语可适用于例如抗原结合结构域是特异于多种抗原所携带的特殊的抗原决定簇，其中具有抗原结合结构域的特异性结合构件能结合携带有抗原决定簇的各种抗原。
包含
常用的意思是包括，也就是说容许存在一或多种特征或成分。
分离的
这指的是根据本发明发明的特异性结合构件或编码这些结合构件的核酸通常所处的状态。构件或核酸是游离的，或基本游离于它们所天然相关的物质，例如其他的多肽或游离于在它们的天然环境中所发现的核酸、或游离于当用DNA重组技术进行体外或体内制备时所制备它们的环境(例如细胞培养基)。可以用稀释物或佐剂加工构件和核酸分子以及因为实践目的仍保持其为分离的，例如如果将构件用于包被用于免疫检测的微量滴定板时，一般将构件和凝胶或其他载体混合；或者当构件用于诊断或治疗时，用药用可接受载体与其混合。特异性结合构件可以被天然地或通过异种真核细胞体系(例如CHO或NSO(ECACC 85110503)细胞)糖基化，或它们可以是非糖基化(例如如果通过原核细胞内表达生成)。
“基本如同展示的”指的是本发明的的CDR或VH或VL结构域与在此所展示的序列的特定区域完全一致或高度相似。“高度相似”意思是在CDR和/或VH或VL结构域可以发生从1个到5个，优选的从1个到4个例如1到3或1或2、或3或4个取代。
用于携带本发明的CDR的结构一般是抗体的重链或轻链序列或它们的主要部分，其中CDR定位于对应于重组免疫球蛋白基因所编码的天然发生的VH和VL抗体可变结构域的CDR位点。参照于Kabat，E.A等(Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th Edition.USDepartment of Health and Human Services.1991)及其更新(现可自互联网查到：http://immuno.bme.nwu.edu，或使用任何搜索工具查找″Kabat″)可以测定出免疫球蛋白可变结构域的结构和位点。
优选地，携带基本如同展示的CDR氨基酸序列作为人可变结构域或它们的主要部分的CDR。基本如同展示的L19 VH CDR3和/或L19 VLCDR3可以被用于本发明的优选的实施方案中，以及优选的它们中的每个CDR3都可被用作为人重链或轻链或它们的主要部分的可变结构域。
免疫球蛋白可变结构域的主要部分将包括至少三个CDR区域，以及它们之间的框架区域。优选地，该部分也将包括第一和第四框架区域的每个区域或两个区域的至少约50％、这50％将是第一框架区域的C末端50％以及第四框架区域的N末端50％。可变结构域的主要部分的N末端或C末端附加残基可以是那些一般与天然发生的可变结构域区域不相关的残基。例如，利用DNA重组技术制成的本发明特异性结合构件的构建体可以造成引入所导入的促进克隆或其他操作步骤的连接剂所编码的N或C末端残基。其他的操作步骤包括引入连接剂，将本发明的可变结构域进一步地连接到包括免疫球蛋白重链、其他可变结构域或如下所详细描述的蛋白标记物的蛋白序列。
在根据本发明的IgG1抗体中，VL结构域可以以C末端连接到包括人Cκ或Cλ链，优选的CK链的抗体轻链的恒定结构域。
可以用可测定的或功能性的标记物标记本发明的特异性结合构件。下面描述了可测定的标记物，它包括放射性标记物，例如锝、铟、钇、铜、镥或铼的放射性同位素，特别是94mTc、99mTc、186Re、188Re、111In、86Y、88Y、177Lu、64Cu和67Cu，利用在此所描述的抗体成像领域中已知的传统化学将它们连接到本发明的抗体上。
标记物也包括酶标记物，例如辣根过氧化物酶。标记物进一步地包括可以被与例如标记的抗生物素蛋白的特异可测定亚基结合测定的化学亚基例如生物素。
在此所阐述的特异性结合构件(L19-SIP)特别地适合于用例如94mTc、99mTc，186Re、188Re、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、111In、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F同位素进行放射性标记，以及随后用于放射性诊断和放射性治疗。99mTc是特别优选的用于标记的放射性同位素，下面的试验部分描述了一个合适方案。
为了直接地标记特异性结合构件，首先用例如氯化锡(II)、Tris(2-羧乙基)膦(TECP)的适当的还原试剂还原半胱氨酸桥接的分子并生成游离的半胱氨酸SH基团，它可以与例如Tc或Re同位素反应。在这个特殊的过程中，在存在有例如酒石酸钠和API的辅助配体时，用例如氯化锡(II)的还原试剂还原从即时反应体系中生成的permetalates(在下面的试验部分提供有细节)。
利用预先与螯合配体的结合可以进行用例如铟、钇、镧系元素或锝和铼直接标记特异性结合构件的氨基或巯基。螯合配体优选的来自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、环己基1，2-二氨五乙酸(CDTA)、乙烯甘油-O，O’-双(2-氨乙基)-N，N，N′，N′-乙酰乙酸(HBED)、三乙烯四氨基己乙酸(TTHA)、1，4，7，10--四氮杂环十二烷-N，N′，N′″-四乙酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-N，N′，N″-tetraacetic acid，DOTA)、1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(1，4，7-triazacyclononane-N，N′，N′-triaceticacid，NOTA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N′″-四乙酸(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane-N，N′，N″，N′″-tetraacetic acid，TETA)、巯基乙酰二甘氨酸(mercaptoacetyl diglycine，MAG2)、巯基乙酰三甘氨酸(mercaptoacetyl triglycine，MAG3)、巯基乙酰甘氨酰半胱氨酸(mercaptoacetyl glycyl cysteine，MAGC)、半胱氨酸甘氨酰半胱氨酸(cysteinyl glycyl cysteine，CGC)。螯合配体具有适宜的结合基团，例如活性酯基、马来酰亚胺、硫氨基甲醛或α-卤化乙酰胺基团。对于将螯合配体结合到例如赖氨酸残基的ε-NH2基团，不需要对L-19-SIP的预先还原。
将本发明的特异性结合构件设计用于针对人或动物对象的诊断或治疗方法，优选以人为对象。
因此，本发明的进一步的方面提供了治疗方法，包括施用所提供的特异性结合构件及包含该特异性结合构件的药用组合物，以及提供了该特异性结合构件在生产用于施用的药物中的用途，例如用于制备药物或含有用药用可接受赋形剂加工的特异性结合构件的药用组合物的方法。
本发明的特异性结合构件所能提供治疗价值的临床适应证包括肿瘤例如实体肿瘤、也包括其他的病理性血管生成病变，包括类风湿关节炎、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性以及血管瘤。
根据本发明的特异性结合构件可以用于治疗人或动物身体的方法，例如治疗(可以包括预防性治疗)人患者的疾病或病变的方法，它包括给所述患者施用有效量的本发明的特异性结合构件。在别处讨论了根据本发明所治疗的病变。
因此，本发明的进一步的方面提供了治疗方法包括施用所提供的特异性结合构件、含有这种特异性结合构件的药用组合物，以及这种特异性结合构件用于生产施用的药物的用途，例如用于制备药物或含有用药用可接受赋形剂加工的特异性结合构件的药用组合物的方法。
根据本发明，可以将所提供的组合物施用于个体。施用量优选的是“治疗有效量”，就是足以显示出对患者有益疗效的量。这些有益疗效可以是至少改善至少一个症状。确切的给药量以及给药速度和给药时间将依赖于所治疗疾病的性质和严重性。例如决定剂量的治疗处方是在全科医生和其他医生的职权范围内。抗体的合适剂量是本领域熟知的，见Ledermann J.A.et al.(1991)Int J.Cancer 47：659-664；Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4：915-922所述。
可以单独施用或和其他的治疗同步或序贯地联合施用组合物，这依赖于所治疗的病变。
本发明的特异性结合构件包括那些含有抗体的抗原结合结构域的构件，可以通过任何合适的途径，通常是通过注射到血液和/或直接注射到需治疗的部位例如肿瘤而施用于所需要治疗的患者。精确的剂量依赖于多种因素：治疗途径、治疗区域(例如肿瘤)的大小和定位、抗体确切的性质(例如，整个IgG1抗体分子、小免疫球蛋白分子)以及连接于抗体分子的任何可测定标记物或其他分子的性质。常用的抗体剂量是在10-50mg范围内。
这是单次治疗成人患者的剂量，它可按比例地调整以用于治疗儿童和婴儿，也可以根据分子量比例调整其他抗体形式的剂量。根据医生的判断，可以每天、每周两次、每周或每月间隔地重复治疗。
通常以药用组合物形式施用本发明的特异性结合构件，它包括至少一种除特异性结合构件以外的成分。
因此根据本发明的药用组合物以及根据本发明用法的组合物可以包括除了活性成分以外的药用可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其他本领域人员所熟知的其他材料。这些材料应当是无毒的且不干扰活性成分的疗效。载体或其他材料的准确性质依赖于给药的途径、它可以是口服的或例如经静脉内注射的。
对于静脉内注射或病变局部注射，活性成分应当是可肠外给药的水溶液形式，它应是无热原的并具有合适的pH值、渗透压和稳定性。本领域相关人员能制备所用的适宜的溶液，例如等渗介质，例如氯化钠注射液、Ringer注射液、加入乳酸盐的Ringer注射液。可以按需包含有防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
可以单独施用或和其他治疗同步或序贯地联合施用组合物，这依赖于所治疗的病变。其他治疗可以包括施用适宜剂量的疼痛缓解药物例如非甾体类抗炎药物(例如阿斯匹林、扑热息痛、布洛芬或酮洛芬)或阿片类例如吗啡、或止吐药。
本发明提供了一种包括引起或容许在此所提供的特异性结合构件与ED-B结合的方法。要注意的是，这样的结合可以发生在体内，例如在施用特异性结合构件之后、或施用编码特异性结合构件的核酸后，或结合可以发生在体外，例如ELISA、Western印迹、免疫细胞化学法、免疫沉淀或亲和色谱法中。
可以测定与ED-B结合的特异性结合构件的量。该量可能与测试标本中抗原的量相关，标本可以是诊断相关的标本，可以是治疗相关的标本。
通过适当的方法可以测定标本中的抗体反应性。放射免疫法(RIA)是一种可能的方法。将放射活性标记的抗原与未标记的抗原(测试标本)混合并容许其与抗体结合。将结合抗原和非结合抗原完全分开并测定与抗体结合的放射活性抗原的量。测试标本中抗原越多那么与抗体结合的放射活性抗原就越少。利用结合有报告分子的抗原或类似物，用非放射活性抗原也可以进行竞争性结合检测。报告分子可以是荧光染料、具有独立吸收或发射光谱特性的发光或激光染料。适宜的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和得克萨斯红。适宜的显色染料包括二氨基联苯胺。
其他报告物包括大分子胶状粒子或特殊材料例如被染色的乳胶珠、磁性或常磁性的、能直接或间接地形成可肉眼观察到的可测定信号的生物或化学活性物质、电可测定的或其他可记录的物质。例如这些分子可以是催化发生或改变颜色或引起电特性改变的反应的酶。它们可以是分子可激动的，使得能量状态之间的电转换可以造成特征性的吸收或发射光谱。它们可以包括用于和生物传感器相结合的化学实体。可以采用生物素/抗生物素蛋白或生物素/抗生物素链菌素蛋白以及碱性磷酸酶检测系统。
可以用单个抗体-报告物缀合物所生成的信号获得标本中(正常或测试标本)相关结合抗体的定量的绝对或相对数据。
本发明可以进一步扩展到与任何特异性结合构件竞争地与ED-B结合的特异性结合构件，该特异性结合构件与抗原结合并包括一个V结构域，该结构域包括基本如同在此所展示的氨基酸的CDR，优选包括含有SEQ ID NO.3的VH CDR3的VH结构域。体外容易测定结合构件之间的竞争，例如通过在存在其他未标记结合构件时，用特异的报告物分子标记一个能测定的结合构件，这能鉴别与相同抗原决定簇或重叠抗原决定簇结合的特异性结合构件。利用例如Carnemolla等(24 1996)所描述的ELISA可以测定竞争性。
本发明进一步提供了编码本发明的特异性结合构件的分离的核酸。核酸可以是DNA或RNA。
本发明也提供了包括至少一个同上的多核苷酸的质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体。
本发明也提供了一种含有一种或多种所述的构建体的重组宿主细胞。编码所提供的特异性结合构件的核酸本身形成了本发明的一个方面，生产该编码产物的方法也同样形成了本发明的一个方面，方法包括从编码核酸中表达。通过在适宜的条件下培养含有核酸的重组宿主细胞可以容易地获得表达。在表达生成之后，然后适当地使用任一合适的技术可以分离和/或纯化特异性结合构件。
根据本发明可以提供分离的和/或游离于它们的天然环境的基本纯化或同源形式的特异性结合构件和编码核酸分子及载体，或者对于核酸，它是游离于或基本游离于除外编码所需功能的多肽的核酸的原始核酸或基因。根据本发明核酸可以包括DNA或RNA以及可以是全部或部分合成的核酸。参照于在此所展示的核苷酸序列包括具有特异性序列的DNA分子，以及包括具有特异性序列的RNA分子，其中U取代了T，除非文中有其他的需要。
在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的体系是熟知的。适宜的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和昆虫杆状病毒体系。本领域可获得的用于异种多肽表达的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼年仓鼠肾脏细胞、NSO小鼠黑色素瘤细胞和许多其他的细胞。常用的并优选的细菌宿主是大肠杆菌。
本领域已经较好地建立了抗体和抗体片段在例如大肠杆菌的原核细胞中的表达。有关综述见例如Pluckthun，A.Bio/Technology 9：545-551(1991)。本领域人员也可进行在真核细胞培养中的表达，并作为一种生产特异性结合构件的选择，见最近的综述例如M.E.(1993)Curr.OpinionBiotech.4：573-576；Trill J.J.et al.(1995)Curr.Opinion Biotech 6：553-560。
可以选择或构建含有包括启动子序列、终止子序列、多腺苷序列、增强子序列、标记基因和其他适宜的序列的适当的调节序列的适宜载体。载体可以是适宜的质粒、病毒噬菌体或噬菌体质粒。进一步的详细说明见，例如，Molecular Cloning：a Laboratory Manual：3nd edition，Sambrook etal.，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
在Current Protocols in Molecular Biology，Second Edition，Ausubel etal.eds.，John Wiley & Sons，1992中详细地描述了许多已知的扩增核酸的技术和方法，例如制备核酸构建体、生成突变、测序、将DNA导入到细胞以及基因表达、和蛋白分析。在此一并参考Sambrook et al.和Ausubelet al.的阐述。
因此，本发明的进一步的方面提供了含有在此所阐述的核酸的宿主细胞。仍是进一步的方面提供了一种包括将这样的核酸导入到宿主细胞的方法。导入可以采用任何一种可获得的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染以及利用逆转录病毒或例如牛痘的其他病毒对昆虫细胞和昆虫杆状病毒的转化。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和利用细菌噬菌体的转染。
在导入后紧接着的是引起或容许核酸的表达，例如通过在容许基因表达的条件下培养宿主细胞。
在一个实施方案中，将本发明的核酸整合到宿主细胞的基因组中(例如染色体)。根据标准技术通过将促进重组的序列包含于基因组中可以促进整合。
本发明也提供了一种方法，包括在表达体系中用如上所述的构建体表达所述的特异性结合构件或多肽。
根据说明书包括以下实验性实施例所揭示的内容，本发明的进一步的方面和实施方案对于本领域人员是显而易见的。
本申请中任何地方所提及的所有文献均并入一并作为参考。
实施例
材料和方法
scFv、小免疫蛋白(SIP)和IgG1构建体scFv(L19)的制备和表达
scFv(L19)是一种特异性针对于纤连蛋白ED-B结构域的亲和力成熟(Kd＝5.4x 10-11M)的抗体片段(13 Pini et al.，1998)。将scFv(D1.3)(7McCafferty et al.；26 Neri et al.，1997)，即小鼠抗鸡卵清溶菌酶scFv，作为对照。根据Pini et al.(34 1997)在大肠杆菌株HB2151(Maxim Biotech，San Francisco CA)中表达这些scFv。
小免疫球蛋白(Mini-immunoglobulin)
为了构建L19小免疫蛋白(L19-SIP)基因(图1C)，利用相应地含有ApaLI和BspEI限制性位点的引物BC-618(gtgtgcactcggaggtgcagctgttggagtctggg-SEQ ID NO.8)及BC-619(gcctccggatttgatttccaccttggtcccttggcc-SEQ ID NO.9)，根据厂家的说明书用Pwo DNA聚合酶通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码scFv(L19)的DNA序列。将扩增产物插入到pUT-εSIP载体的ApaLI/BspEI位点，它提供了具有细胞外介质蛋白分泌所需的分泌信号的scFv基因。在用人IgE分泌型异构体IgE-S2(εs2-CH4；35 Batista et al.，1996)的CH4结构域取代人恒定γ1-CH3结构域后，从先前描述的pUT-SIP-long(33 Li et al.，1997)可生成pUT-εSIP载体。CH4是一种容许IgE分子二聚体化的结构域，这些εs2异构体在其末端含有半胱氨酸，它可以通过链间二硫键稳定IgE二聚体。在最终的SIP分子中，通过短GGSG连接体将ScFv(L19)连接到εs2-CH4结构域上。为了得到构建体pcDNA3-L19-SIP，用HindIII和EcoRI限制性酶从质粒pUT-εSIP-L19中分离出SIP基因，并将其克隆进哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)中，该载体含有巨细胞病毒(CMV)启动子，以便生成构建体pcDNA3-D1.3-SIP。
用引物BC-721(ctcgtgcactcgcaggtgcagctgcaggagtca-SEQ ID NO.10)和BC-732(ctctccggaccgtttgatctcgcgcttggt-SEQ ID NO.11)扩增编码scFv(D1.3)的DNA序列，并将其插入到PUT-SIP载体的ApaLI/BspH位点，然后用HindIII和EcoRI限制性酶从质粒pUT-εSIP-D1.3中分离出D1.3-SIP基因，并将其克隆进pcDNA3。
将这些构建体用于按生产商所优化的粘附细胞的方案用FuGENE 6转染试剂转染SP2/0鼠黑色素瘤细胞(ATCC，American Type CultureCollection，Rockville，MD，USA)。将转染瘤(transfectoma)生长于补充有10％FCS和选择性应用750μg/ml庆大霉素(G418，Calbiochem，San Diego，CA)的DMEM中。
IgG1
为了制备完整的IgG1，用HindIII和XhoI从先前描述的L19-pUTeSIP分离出L19重链(L19-VH)的可变区以及它的分泌肽序列，并将它们插入到含有完整人γ1恒定重链基因的pUC-IgG1载体中。然后用HindIII和EcoRI从pUC-IgG1-L19-VH中分离出重组IgG1基因并将其克隆到pcDNA3中，得到构建体pcDNA3-L19-IgG1。
为了制备完整的L19轻链，用相应地含有ApaLI和BsiWI限制性位点的引物BC-696(tggtgtgcactcggaaattgtgttgacgcagtc-SEQ ID NO.12)和BC-697(ctctcgtacgtttgatttccaccttggtcc-SEQ ID NO.13)通过PCR从L19-pUT-εSIP(上述的)扩增出L19-VL。在用ApaLI和BsiWI消化后，将扩增产物插入到含有分泌信号序列及人恒定κ轻链序列的载体pUT-SEC-hCκ中。然后用HindIII和XhoI从pUT-SEC-hCκ-L19-VL分离出重组轻链基因并将其插入到通过将维持基因转移到G418而来源于pcDNA3载体的哺乳动物表达载体pCMV2Δ中，以获得构建体CMV2Δ-L19-κ。
如上所述用这些等摩尔量(equimolar amount)的构建体共转染SP2/0鼠黑色素瘤细胞。在ELISA中筛选庆大霉素选择克隆的分泌嵌合免疫球蛋白、完整重链及轻链的能力。
利用Maxiprep体系从Qiagen(Hilden，Germany)纯化所有的DNA构建体，并用ABI PRISM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit(Perkin Elmer，Foster City，CA)确定构建体双链的DNA序列。除BsiWI(New England Biolabs，Beverly，MA)以外的所有限制性酶都来自Roche Diagnostics(Milan，Italy)，在RE消化后，利用Qiaquick方法(Qiagen)从琼糖胶中还原插入物和载体。
抗体的纯化和质控
根据Carnemolla et al.(24 1996)所描述的方法，用免疫亲和色谱法纯化不同的抗体。
按照生产商的说明书(24 Carnemolla et al.，96)用与琼脂糖4B(Amersham Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden)缀合的ED-B免疫纯化所有不同的L19抗体形式，而用与琼脂糖4B(Amersham Pharmacia)缀合的鸡卵清溶菌酶分离柱纯化D1.3抗体。
免疫纯化的抗体形式L19-SIP和L19-IgG1不需要进一步的纯化，用pH值为7.4的PBS在4℃将其透析。因为从免疫亲和色谱法获得的scFv包含有两种形式，单体的和二聚体的，因此需要如Demartis et al.(27 2001)所描述的第二个纯化步骤来分离后一种形式。制备成批的不同的抗体形式，并利用在还原和非还原条件下的SDS-PAGE、免疫组化、体积排阻色谱(Superdex 200，Amersham Pharmacia Biotech)以及ELISA试验对其进行分析。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、体积排阻色谱和免疫组化
依照Carnemolla et al.(24 1996)在给定条件的培养介质中进行筛选ELISA试验。为了揭示不同的L19抗体形式的表达，将含有包含有L19所识别的抗原决定簇的FN的ED-B结构域的重组片段7B89(24Carnemolla et al.，1996)固定于Maxisorp免疫板(Nunc，Roskilde，Denmark)。为了测定ELISA试验中的D1.3抗体，将鸡卵清鸡溶菌酶(Sigma)固定于EIA板的NH2表面(Costar，Cambridge，MA)。将按照生产商的说明书稀释的缀合了过氧化物酶的兔抗人IgE(Pierce，Rockford，IL)用作为检测SIP的第二抗体。对于IgG1，使用缀合过氧化物酶的兔抗人IgG(Pierce)。对于含有标记序列FLAG的scFv，相应地将鼠抗人FLAG单克隆抗体(M2，Kodak)和缀合过氧化物酶的山羊抗鼠抗体(Pierce)用作为第二和第三抗体。在所有的情况中，利用过氧化物酶的底物ABTS(Roche)测定固定抗原的免疫反应性，并测定了在405nm的分光光度吸光度。
利用快速蛋白液态色谱法(FPLC；Amersham Pharmacia)用Superdex200(Amersham Pharmacia)色谱柱分析纯化的抗体在天然条件下的凝胶滤过值。如Castellani et al.(22 1994)所描述的进行不同组织晶体切片上的免疫组化，在还原或非还原条件下依照Carnemolla et al.(17 1989)进行4-18％梯度的SDS-PAGE。
动物和细胞株
无胸腺裸鼠(8周大裸/裸CD1雌性)来自Harlan Italy(Correzzana，Milano，Italy)，129(克隆SvHsd)株鼠(8-10周大小，雌性)来自HarlanUK(Oxon，England)。鼠胚胎畸胎癌细胞(F9)、人黑色素瘤来源细胞(SK-MEL-28)及鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)购自American Type CultureCollection(Rockville，MD)。为了诱导肿瘤，用16x106 SK-MEL-28细胞皮下注射裸鼠，以及用3x106 F9细胞处理129株鼠。用下面的公式测定肿瘤体积：(d)2x D x 0.52，其中d和D分别是用测径器测量的肿瘤的短径和长径。依照国内立法(Italian law no.116 of 27 January，1992)并参照于用于科学目的的动物保护方法饲养、处理和处死动物。
重组抗体的放射性碘标记
依照生产商的说明书利用IODO-GEN预先包被的碘标记的管(Pierce)激活Na125I(NEN Life Science Products，Boston，MA)，按照Chizzonite间接方法(36 Riske et al.，1991)完成蛋白的放射性碘标记。在报道的实施方案中，用1.0mCi Na125I碘标记的0.5mg蛋白。利用0.25％BSA预先处理及PBS平衡的PD10柱(Amersham Pharmacia)从游离125I中分离出放射性标记的分子。用晶体γ计数器(Packard Instruments，Milano，Italy)测定标本的放射活性。对放射性标记蛋白的免疫反应性检测在用200μl含0.25％BSA的PBS溶液饱和的ED-B琼脂糖柱中进行。将200μl含0.25％BSA PBS溶液的已知量的放射性碘标记的抗体应用于柱的顶部并容许其进入柱。然后用1.5ml 0.25％BSA PBS溶液洗脱柱以去除非特异性结合的抗体。最后用1.5ml 0.1M pH 11的TEA洗脱免疫反应性的结合材料。计数未结合和结合材料的放射性活性并计算出免疫反应性抗体的百分比。免疫反应性一直高于90％。
为了进一步分析放射性碘标记的抗体，将200μl已知量的放射性标记的蛋白加入到Superdex 200柱中。放射性碘标记后不同蛋白的储存体积没有不同。对于三种碘标记的L19抗体形式以及它们的阴性对照，从Superdex 200柱的放射活性收复率是100％(图3A、3B和3C)。
生物分布试验
为了阻断125I在胃的非特异性聚集以及在甲状腺的浓聚，在注射放射性标记的抗体前30分钟让鼠口服溶于20mg水性高氯酸钠(Carlo Erba，Italy)。在生物分布试验期间每24h间隔重复该步骤。用100μl盐水中的0.1nmol不同的放射性标记的抗体(相应的为6μg scFv、8μg SIP和18μgIgG)注射到瘤负荷鼠的尾部静脉。在每个时间点处死三只动物，取出含有肿瘤的不同器官，称重并在γ计数器计数，然后用5％甲醛pH值7.4的PBS溶液固定，用于依照Tarli et al.(231999)进行的微量自动放射性显像。
取出的血液标本也将其用于血浆制备，利用已经描述的免疫反应性检测和凝胶滤过分析测定放射性标记的分子在血液中的稳定性。在两种测定中都使用200μl血浆。不同器官的放射活性成分表示为每克注射剂量的百分比(％ID/g)。使用MacIntosh Program Kaleidagraph(SynergySoftware，Reading PA，USA)，通过最小平方极小化处理(a least squaresminimization procedure)计算放射性碘标记的抗体的血液清除参数，公式为：
X(t)＝A exp(-(αt))+B exp(-(βt)
其中X(t)为放射性标记的抗体在时间t的％ID/g。该公式描述了双指数的血清除值，其中α期的幅度被定义为A x 100/(A+B)以及β清除期的幅度被定义为B x 100/(A+B)。α和β是与相应的血液清除相的半衰期相关的速度参数。T1/2(α期)＝ln2/α＝0.692.../α；T1/2(β期)＝ln2/β＝0.692.../β；对应于每只小鼠的2.5ml体积的血液，假定X(0)等于40％。
结果
抗体的制备
应用不同的L19(13 Pini et al.，1998)抗体形式(scFv、小免疫球蛋白和完整的人IgG1)以及它们在体内对肿瘤血管进行定向中的作用。
图1显示了用于表达不同的L19抗体形式的构建体。利用特异于非相关抗原的scFv的可变区(D1.3；7 McCafferty；26 Neri et al.，1997)制备相似的构建体。
为了生成SIP和IgG1，用图1所示的构建体转染SP2/0鼠骨髓瘤细胞并用G418选择稳定的转染瘤。通过ELISA确定出最佳生产者并将这些克隆扩增用于抗体纯化。所有的三种L19抗体形式的纯化是依据利用与琼脂糖缀合的重组ED-B的免疫亲和色谱。ScFv(L19)的产量为约8mg/l，L19-SIP为10mg/l，L19-IgG1为3mg/l。对于所用的特异于鸡蛋溶菌酶的scFv(D1.3)的阴性对照，利用scFv D1.3的可变区构建了D1.3-SIP。在与琼脂糖缀合的鸡蛋溶菌酶上纯化这两种抗体。相应的产量是8和5mg/l。我们将商品化可获得的人IgG1/κ(Sigma)用作为L19IgG1的对照。
在还原和非还原条件下都进行了对三种纯化L19形式的SDS-PAGE分析。对于scFv(L19)，如期望的一样在还原和非还原条件下(未显示)显示的分子量都为约28kDa。L19-SIP在非还原条件下表现为近80kDa的分子量，而在还原条件下分子量为约40kDa。这些结果表明超过95％的天然分子以共价连接的二聚体形式存在。如所期望的那样，L19-IgG1在非还原条件下显示出约180kDa的主带，而在还原条件下显示出两条对应于约55kDa重链和约28kDa轻链的条带。
通过体积排阻色谱分析获得了三种L19抗体形式的洗脱值。在所有的三种情况中都测定到代表着大于98％的正常分布的单一峰值。利用标准校对曲线，scFv(L19)2的外显分子量为60kDa，L19-SIP为80kDa，以及L19-IgG1为180kDa。此外，证实不存在经常出现于重组蛋白制备中并可能使得体内研究所获得的结果无效的分子聚集。对纯化的对照蛋白进行的SDS-PAGE和体积排阻色谱(Superdex 200)给出了相似的结果。
利用这三种不同的L19抗体形式，对裸鼠中所诱导的SK-MEL-28人黑色素瘤细胞以及129株鼠中所诱导的F9鼠畸胎癌细胞的晶体切片进行免疫组化分析。在0.25-0.5nM低的浓度得到了最佳结果。所有的三种纯化的L19抗体识别完全一致的结构。
放射性标记的L19抗体形式的体内稳定性
将SK-MEL-28人黑色素瘤和F9鼠畸胎瘤用于体内生物分布研究。SK-MEL-28瘤有着相对缓慢的生长速度，而F9瘤却生长迅速(图2)。因此，使用SK-MEL-28瘤能进行长时间的试验(最长到144h)，而F9瘤用于短时间的生物分布研究(最长到48h)。当肿瘤生长到近0.1-0.3cm3进行所有的生物分布试验。为了比较不同的抗体形式，注射了100μl无菌盐水的相同摩尔量的抗体形式。在注射前，将放射性碘标记的化合物用0.22μm滤过，并检测了免疫反应性以及凝胶滤过值(见材料和方法)。放射性标记蛋白的免疫反应性始终大于90％。
图3A-C报告了对放射性碘标记的L19抗体形式的凝胶滤过分析(Superdex 200)的数值。
在距离注射的不同时间间隔时从治疗动物中取出血液标本，并用凝胶滤过色谱分析血浆中所存在的放射活性的免疫反应性。所有的三种L19抗体形式的凝胶滤过值都显示为单一主峰，具有注射蛋白的分子量。仅仅scFv的数值显示出具有更高分子量的第二峰，提示有聚集的形成(图3D-F)。此外，在scFv(L19)2中观察到形成了不能从Superdex 200柱上洗提的大分子量的聚集物。事实上，当L19SIP和L19-IgG从Superdex 200柱的回收率为所应用的放射活性的90-100％时，scFv(L19)2的放射活性的产量为约55％。仅仅在用0.5M NaOH洗涤色谱柱后才回收到剩余的放射活性，这表明大的聚集物被阻滞于柱滤器中(表1)。
表1也报告了血浆中所进行的免疫反应性测定的结果(见材料和方法)。在试验结束后，血浆中的L19-SIP和L19-IgG1保持了与初始试剂一样的免疫反应性。相反的，在注射3h后，血浆中的scFv(L19)2的免疫反应性减少到小于40％。
比较生物分布试验
表2a、b、c和图4报告了放射性标记的L19抗体在SK-MEL-28瘤负荷鼠的生物分布试验中所得到的结果。
表2a、b、c显示了在距离静脉注射放射性标记的抗体的不同时间时，组织和器官包括肿瘤的％ID/g的平均值(SD)。
图4显示了在试验的不同时间时肿瘤和血中不同抗体形式的％ID/g的差异，以及肿瘤和血％ID/g之间的比值。所有的三种L19抗体形式都选择性地聚集于肿瘤内，表3中报告了肿瘤和其他器官的％ID/g的比值。
如微量自动放射显像所证实的那样，抗体只聚集在肿瘤血管上，其中可以见无在正常器官血管的特异性聚集。相反的，在肿瘤或在正常组织内都没有发现放射性碘标记的对照分子的特异性聚集(表2a、b、c)。
如同通过计数尿标本所证实的那样，所有三种抗体形式都显示出清除主要是由肾脏介导的。和所预期的一样，scFv(L19)2的清除是更快的，而完整L19-IgG1的清除是更慢的。通过双指数函数曲线计算生成了表4所报告的半衰期值。
图5描述了用放射性碘标记的scFv(L19)2和L19SIP在F9畸胎瘤肿瘤模型上所获得的肿瘤和血％ID/g(SD)的差异。因为F9畸胎瘤的高血管生成活性，在i.v.注射3和6个小时时，肿瘤中所聚集的放射活性分子是SK-MEL-28瘤内的3到4倍，并且持续更高达48h的试验持续时间。和SK-MEL-28瘤一样，用微量自动化放射显像证实了在肿瘤血管内的特异性聚集，而在注射对照分子后没有发现特异性的肿瘤聚集。在表5中报告了在i.v.注射后的不同时间时F9肿瘤和其他器官内的L19(scFv)和L19SIP的％ID/g。
还原型L19-SIP的合成
将422μl含有375μg(5nmol)L 19-SIP的PBS溶液加入到50μl TCEP溶液(14.34mg TCEP xHCl/5ml Na2HPO4水溶液，0.1M，pH＝7.4)中。在37℃轻轻地摇晃反应混合物1个小时。用NAP-5柱(Amersham，洗提液：PBS)通过凝胶色谱法纯化还原型L19-SIP。对分离产物的SDS-PAGE分子证实L19-SIP定量转换定为还原型L19-SIP。
产量：100.3μg/200μl PBS(26.7％)。
Tc-99m-L19-SIP的合成
将3.0mg L-酒石酸二钠放置于小瓶中，紧接着加入200μl含有100.3μg还原型L19-SIP的PBS溶液，并用100μl Na2HPO4缓冲水溶液(1M，pH＝10.5)稀释。加入85μl Tc-99m发生器洗脱液(24h)和10μlSnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HC1)。在37℃摇晃反应混合物半小时。用NAP-5柱(Amersham，洗脱液：PBS)通过凝胶色谱法纯化Tc-99m标记的L19-SIP。
放射化学产率：35.6％。
放射化学纯度：90.2％(SDS-PAGE)。
特异活性：26.4MBq/nmol。
免疫反应性：91.4％。
Tc-99m-MAG2-L19-SIP羧基甲基-t-丁基二硫化物的合成
将1L含有21.75ml(0.312mol)1-巯基乙酸、43.5ml(0.312mol)三乙胺和100g(0.312mol)N-(叔-丁基巯基)-N，N′-双-BOC-肼(N-(tert.-butylthio)-N，N′-di-BOC-hydrazine)的EtOH(abs.)溶液在逆流下加热60h。在加压下蒸发EtOH使得最终的体积为约200ml。将剩余物倒入到1.81H2O中并用5摩尔NaOH将所得到的悬浮液的pH值调整为7.14。滤除Di-BOC-肼并用半量浓度的HCl将所得溶液的pH值调整为2.2。用600ml CH2Cl2从水中提取粗材料3次。在MgSO4上干燥混合有机层，并在减压下蒸发溶剂得到41.1g黄色油。该材料对于进一步的分析是足够纯的。
N-(苄氧羰基-Gly)Gly叔-丁酯(Z-(N-Gly)Gly叔-丁酯(N-(benzyloxycarbonyl-Gly)Gly t-butyl ester(Z-(N-Gly)Gly t-butyl ester)
将1.4l含有35.02g(114mmol)Z-Gly-O琥珀酰亚胺及15g(114mmol)Gly-O-tBu的CH2Cl2溶液在室温N2气下搅拌20h。用250ml 1％水性柠檬酸洗涤有机层3次，用200ml半饱和水性NaHCO3洗涤2次以及用200ml水洗涤1次。在非水性的MgSO4上干燥有机层。在减压下蒸发CH2Cl2得到36.5g(99％)黄色油状的Z-Gly-Gly-O-tBu。粗材料对于进一步的分析是足够纯的。
Gly-Gly叔-丁酯
将36.5g(113mmol)Z-Gly-Gly-O-tBu溶解于1l THF中，紧接着加入3.65g活性碳钯(10％)。在室温H2气下搅拌混合物3h。用N2净化悬浮液、过滤(PTFE滤膜：0.45nm)并在减压下浓缩滤过液得到20.3g(95％)黄色油状的Gly-Gly-O-tBu。粗材料对于进一步的分析是足够纯的。
羧基甲基-t-丁基二硫化物甘氨酰甘氨酸t-丁酯(Carboxy methyl-t-butyldisulfide glycyl glycine t-butylester)
将430ml含有23.85g(115.6mmol)DDC的CH2Cl2溶液逐滴加入到1l含有21.76g(115.6mmol)Gly-Gly-O-tBu、20.84(115.6mmol)羧基甲基-t-丁基二硫化物及13.3g(115.6mmol)NHS的CH2Cl2溶液中。将所得到的悬浮液在室温N2气下搅拌过夜。将所得到的溶液过滤后，用400ml半饱和水性NaHCO3洗涤三次和用400ml水洗涤一次。在减压下将干有机层(MgSO4)蒸发。用梯度范围从CH2Cl2/MeOH 99∶1到CH2Cl2/MeOH98.5∶1.5的溶剂在硅胶上通过层析法纯化粗产物。分离到26.1g(64％)的黄色油状物。
巯基乙酰甘氨酰甘氨酸(Mercaptoacetyl glycyl glycine)
将26.32g(75.09nmol)羧基甲基-t-丁基二硫化物甘氨酰甘氨酸-丁酯在N2气下溶解于233ml TFA中。在室温下搅拌所得溶液20分钟。在减压(5-10x10～2mbar)下蒸发TFA，并另外搅拌干燥所得油2h(5-10x10～2mbar)。加入250ml Et20后，沉淀出白色粉末以及搅拌悬浮液3h。滤过沉淀物并重悬于100ml Et20中。搅拌所得悬浮液过夜，滤过产物并在减压下室温中干燥产物得到20.46g(92.5％)白色粉末。
巯基乙酰甘氨酰甘氨酸NHS酯
将巯基乙酰甘氨酰甘氨酸(1g，3.4mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(391mg，3.4mmol)混合于干燥的平底烧瓶中并溶解于无水的DMF(4ml)。在搅拌反应混合物的同时加入含有DDC(700mg，3.4mmol)的无水二恶烷。在15分钟内开始形成沉淀(DCU)。1h后通过真空过滤去除沉淀物。用冷二恶烷洗涤沉淀物。从滤过液中去除二恶烷。通过加入二乙醚从剩余的DMF溶液中沉淀出产物。过滤分离产物，用冷二乙醚洗涤，并在真空干燥器中干燥。产量为1.33(99％)。
Tc-99m-MAG2-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成
用300μl四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)稀释111μl含有200μg(2.66nmol)非还原型L19-SIP的PBS，并利用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml磷酸缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析两个1h。加入50μl巯基乙酰甘氨酰甘氨酸NHS酯溶液(0.5mg溶解于500μl磷酸缓冲液，0.1M，pH 8.5)并在37℃加热反应混合物3h。并利用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)，每次用200ml磷酸缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析两个1h及1个17h(过夜)。往小瓶中加入3.0mg L-酒石酸二钠后加入90μl Tc-99m发生器洗脱液(每天洗脱)以及加入25μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。在37℃摇晃反应混合物0.5h。用NAP-5柱(Amersham，洗脱液：PBS)通过凝胶色谱法纯化Tc-99m标记的L19-SIP。
放射化学产率：55.1％。
放射化学纯度：94.5％(SDS-PAGE)。
特异性活性：15.2MBq/nmol。
免疫反应性：81.1％。
Re-188-L19-SIP的合成
将3.0mg L-酒石酸二钠放置于小瓶中，紧接着加入310μl含有150μg还原型L19-SIP的PBS溶液，并用100μl Na2HPO4缓冲水溶液(1M，pH＝10.5)稀释。加入100μl Tc-99m发生器洗脱液(24h)和50μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。在37℃摇晃反应混合物1.5小时。用NAP-5柱(Amersham，洗脱液：PBS)通过凝胶色谱法纯化Tc-99m标记的L19-SIP。
放射化学产率：34.8％。
放射化学纯度：97.2％(SDS-PAGE)。
特异活性：13.5MBq/nmol.。
免疫反应性：91.7％。
合成用于将EDTA、CDTA、TETA、DTPA、TTHA、HBED、DOTA、NOTA、D03A、以及类似类型的螯合剂缀合于半胱氨酸SH基团的还原型L19-SIP
将50μl TECP溶液(14.34mg TCEP xHCl/5ml水性Na2HPO4，0.1M，pH＝7.4)加入到422μl含有375μg(5nmol)L19-SIP的PBS溶液中。在37℃轻轻地摇晃反应混合物1小时。用NAP-5柱(Amersham，洗脱液：乙酸钠缓冲液，0.1M，pH 5.0)通过凝胶色谱法纯化Tc-99m标记的还原型L19-SIP。对分离产物的SDS-PAGE分子证实L19-SIP定量转换定为还原型L19-SIP。产量：105.7μg/200μl(28.2％)。
In-111-MX-DTPA-马来酰亚胺-S(Cys)-L19-SIP-R(R＝还原型)的合成
将200μl含有105μg(2.8nmol)还原型L19-SIP的乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 5.0)与50μl溶解的1，4，7-三氮-2-(N-马来酰亚胺乙烯基p-氨基)苄基-1，7-双(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷(1，4，7-triaza-2-(N-maleimidoethylene p-amino)benzyl-1，7-bis(carboxymethyl)-4-carboxymethyl 6-methylheptane)(500μl 0.1M，pH 5.0乙酸钠缓冲液中含有0.25mg DTPA-马来酰亚胺)在37℃反应3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 6)透析两次各1h。加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40MBq，Amersham Inc.)并在37℃加热反应混合物30分钟。
用NAP-5柱(Amersham，洗脱液：PBS)通过凝胶色谱法纯化In-111标记的DTPA-马来酰亚胺-S(Cys)-L 19-SIP。
放射化学产率：51.6％。
放射化学纯度：97.2％(SDS-PAGE)。
特异性活性：7.9MBq/nmol。
免疫反应性：88.5％。
合成MX-DTPA-马来酰亚胺(1，4，7-三氮-2-(N-马来酰亚胺乙烯基p-氨基)苄基-1，7-双(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷)
将512mg(1mmol){[3-(4-氨基-苯基)-2-(双-羧甲基-氨基)-丙基]-[2-(双-羧甲基-氨基)-丙基]-氨基}乙酸(Macrocyclics Inc.Dallas，TX，U.S.A.)和707mg(7mmol)三乙胺溶解于3ml干DMF中。逐滴加入1ml含有400mg(1.5mmol)3-(2，5-Dioxo-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯(Aldrich)的干DMF。在50℃搅拌溶液5h。缓慢加入30ml二乙醚。将反应混合物进一步搅拌30min。过滤收集沉淀物。用RP-HPLC(乙氰-∶水-∶三氟乙酸/3∶96.9∶0.1→99.9∶0∶0.1)。产率：61％(405mg，0.61mmol)。MS-ESI：664＝M++1。
In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成
用300μl四硼酸钠(0.1M，pH 8.5)稀释111μl含有200μg(2.66mmol)非还原型L19-SIP的PBS溶液，并利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH8.5)透析两次各1h。加入50μl 1，4，7-三氮-2-(p-异硫氰酰)苄基-1，7-双(羧甲基)-4-羧甲基-6-甲基庚烷(MX-DTPA)(0.33mg MX-DTPA溶解于500μl四硼酸钠缓冲液0.1M，pH 8.5)并将反应混合物在37℃加热3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)透析1h两次以及17h一次(过夜)。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40MBq，Amersham Inc.)并在37℃加热反应混合物30分钟。用NAP-5柱(Amersham，洗脱液：PBS)通过凝胶色谱法纯化In-111标记的MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP。
放射化学产率：72.4％。
放射化学纯度：80.3％(SDS-PAGE)。
特异性活性：8.8MBq/nmol。
免疫反应性：77.5％。
In-111-DOTA-C-Benzyl-p-NCS-E-HN(Lys)-L19-SIP的合成
用300μl四硼酸钠(0.1M，pH 8.5)稀释108μl含有200μg(2.66mmol)非还原型L19-SIP的PBS溶液，并利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH8.5)透析1h两次。加入50μl 1，4，7，10-四氮-2-(p-异硫氰酰)苄基环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(苄基-p-SCN-DOTA)(Macrocyclics Inc.，Dallas TX，U.S.A.)(1.5mg苄基-p-SCN-DOTA溶解于5ml四硼酸钠缓冲液0.1M，pH 8.5)并将反应混合物在37℃加热3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)透析1h两次以及17h一次(过夜)。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40MBq，Amersham Inc.)并在37℃加热反应混合物30分钟。用NAP-5柱(Amersham，洗脱液：PBS)通过凝胶色谱法纯化In-111标记的DOTA-C-Benzyl-p-NCS--HN(Lys)-L19-SIP。
放射化学产率：70.8％。
放射化学纯度：92.1％(SDS-PAGE)。
特异性活性：10.1MBq/nmol。
免疫反应性：75.1％。
Y-88-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成
用300μl四硼酸钠(0.1M，pH 8.5)稀释110μl含有200μg(2.66mmol)非还原型L19-SIP的PBS溶液，并利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH8.5)透析1h两次。加入50μl MX-DTPA溶液(0.33mg MX-DTPA溶解于500μl四硼酸钠缓冲液0.1M，pH 8.5)并将反应混合物在37℃加热3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)透析1h两次以及17h一次(过夜)。
加入100μl[Y-88]YCl3溶液(HCl，1N，75MBq，Oak Ridge NationalLab.)并在37℃加热反应混合物30分钟。用NAP-5柱(Amersham，洗脱液：PBS)通过凝胶色谱法纯化Y-88标记的Y-88-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP。
放射化学产率：68.1％。
放射化学纯度：91.5％(SDS-PAGE)。
特异性活性：11.4MBq/nmol。
免疫反应性：70.5％。
Lu-177-DOTA-C-Benzyl-p-NCS-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成
用300μl四硼酸钠(0.1M，pH 8.5)稀释120μl含有200μg(2.66mmol)非还原型L19-SIP的PBS溶液，并利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH8.5)透析1h两次。加入50μl苄基-p-SCN-DOTA溶液(1.5mg溶解于5ml四硼酸钠缓冲液0.1M，pH 8.5)并将反应混合物在37℃加热3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)透析1h两次以及17h一次(过夜)。
加入200μl[Lu-177]LuCl3溶液(HCl，1N，80MBq，NRH-Petten，Netherlands)并在37℃加热反应混合物30分钟。用NAP-5柱(Amersham，洗脱液：PBS)通过凝胶色谱法纯化Lu-177标记的DOTA-C-Benzyl-p-NCS-E-HN(Lys)-L19-SIP。
放射化学产率：72.2％。
放射化学纯度：94.9％(SDS-PAGE)。
特异性活性：18.3MBq/nmol。
免疫反应性：73.4％。
给肿瘤负荷裸鼠单次静脉注射In-111-MX-DTPA-L19-SIP后的器官分布及排泄
给F9(畸胎瘤)负荷动物(体重约25g)静脉注射约37kBq剂量的本发明的标记肽。在施用该肽后的不同时间点，用γ计数器测定了不同器官内的放射活性以及排泄物的放射活性。
表6显示了In-111-MX-DTPA-L19-SIP在F9(畸胎瘤)负荷裸鼠的生物分布(平均值±SD，n＝3)。
给肿瘤负荷裸鼠单次静脉注射Tc-99m-L19-SIP后的器官分布及排泄
给F9(畸胎瘤)负荷动物(体重约25g)静脉注射约56kBq剂量的标记肽。在施用该肽后的不同时间点，用γ计数器测定了不同器官内的放射活性以及排泄物的放射活性。另外，依照肿瘤和血液的肽浓度测定了不同时间的肿瘤血液比。
表7显示了Tc-99m-L19-SIP在F9(畸胎瘤)负荷裸鼠的生物分布(平均值±SD，n＝3)。
表8显示了Tc-99m-L19-SIP在F9(畸胎瘤)负荷裸鼠的肿瘤血液比(平均值±SD，n＝3)。
在动物试验中证实放射性标记肽具有有利的特性。例如，Tc-99m-L19-SIP和In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP表现出高水平的肿瘤聚集，在注射后(p.i.)1小时为每克注射剂量的17.2(Tc-99m)或12.9(In-111)％(ID/g)。在p.i.24小时时观察到显著的肿瘤滞留为9.4(Tc-99m)或13.0(In-111)％ID/g。因此，肿瘤对其的摄取比其他已知的In-111或Tc-99m标记的抗体片段更高(e.g.Kobayashi et al.，J.Nuc.Med.，Vol.41(4)，pp.755-762，2000；Verhaar et al.，J.Nuc.Med.，Vol.37(5)，pp.868-872，1996)。在24h p.i.化合物的血液清除使得它们的肿瘤/血液比相应的为13∶1和6∶1。
最显著的，In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP(22.5％ID/g)比Kobayashi et al.描述的其他高滞留的In-111标记的重组抗体片段(120％ID/g)表现出明显更低的肾脏摄取和滞留。在24h p.i.肾脏的滞留是非常常见的问题并常阻碍了镧系元素标记的化合物在放疗中的应用。
试验结果表明在此所描述的放射性免疫缀合物具有对于诊断性和治疗性应用的杰出潜能，优选的通过肠外给药而施用于患者。
讨论
关于细胞毒性抗肿瘤药物在正常组织中的分布比在肿瘤中更为有效的观察(37 Bosslet et al.，1998)引起了探索将药物选择性转送到肿瘤的可能性的一系列研究。然而，对肿瘤进行有效的定向有着两个主要的要求：1)肿瘤内的靶是特异的、充足的、稳定的并容易被来自血液的配体分子利用，以及2)具有适当的药代动力学特性的配体分子，它容易从血液弥散到肿瘤并与靶具有高亲和力以保证它在肿瘤内有效且选择性聚集。
由于具有与众不同的特性，肿瘤微环境是一种可能的泛肿瘤靶(pan-tumoral target)。事实上，肿瘤进展诱导了(以及随后需要)肿瘤环境成分的显著变化，特别是那些细胞外基质(ECM)。构成实体瘤ECM的分子与正常ECM的分子有着数量和质量上的差异。另外，所有的实体瘤都具有了多种这类肿瘤的ECM成分，这些成分代表了例如细胞侵袭(正常细胞侵袭到肿瘤组织和肿瘤细胞侵袭到正常组织中)和血管生成的常见性能和功能。本发明者已经关注到组成变化的肿瘤ECM的多种分子的含有ED-B结构域(B-FN)的FN异构体。
BF-N广泛地表达于所有实体瘤的ECM中，因此它被广泛地研究以及始终与血管生成过程相关(22 Castellani et al.，1994)，而且不存在于正常的成人组织中(17 Carnemolla et al.，1989)。将治疗药物靶向转送到内皮下ECM克服了与实体瘤的间质高血压(interstitial hypertension)相关的问题(38 Jain et al.，1988；39 Jain，1997；40 Jain RK，1999)。
L19(13 Pini et al.1998；25 Viti，Canc.Res.，23 Tarli，et al.，1999)，一种与FN的ED-B结构域具有高亲和力的scFv，体内选择性地并优选地聚集于肿瘤新生血管周围，并且能将与它缀合的许多治疗分子的任何一种分子选择性地转送并聚集到肿瘤实体中(28 Birchler et al.，1999；29 Nilsson，etal.，2001；30 Halin et al.2002；31 Carnemolla et al.，2002)。利用闪烁描绘术已经证实L19具有选择性地定向肿瘤的能力。
本说明书报道了三种不同的L19抗体形式：scFv、小免疫球蛋白/小免疫蛋白(SIP)和完整IgG1对肿瘤血管定向的作用，以及其药代动力学。
通过将scFv(L19)与人IgE的分泌型异构体S2的εCH4结构域融合生成SIP分子。该εCH4是容许IgE分子二聚体化的结构域，以及S2异构体在其COOH末端含有半胱氨酸，它能通过链间二硫键稳定二聚体(35Batista et al.，1996)。IgE的FcεRI结合位点位于CH3结构域(41 Turner andKinet，1999；42 Vangelista et al.，1999；43 Garman et al.，2000)，所以根据本发明的实施方案，scFv与εCH4结构域的融合将不会激活任何导致高敏反应的信号。
已经研究了三种形式在两种不同肿瘤模型中的表现：鼠F9畸胎瘤和人SK-MEL-28黑色素瘤。第一种是快速生长的肿瘤，一旦种植在约2周时间内导致动物死亡。另一方面，SK-MEL-28表现为双期生长曲线，具有早期的快速生长期，随后为第二个慢生长期。先前已经显示F9畸胎瘤中的ED-B量在肿瘤生长期间保持恒定(23 Tarli，et al.，1999)；相反，聚集于SK-MEL-28黑色素瘤的ED-B与肿瘤生长的能力成正比(23 Tarli etal.，1999)，在第一期发现有丰富的ED-B，而在第二期的量较少。应用SK-MEL-28黑色素瘤可以进行长时间的生物分布研究，且没有能引起曲解结果的肿瘤实体的动态差异(图2)。
对三种L19抗体形式的体内稳定性的比较研究显示，血浆L19-SIP和L19-IgG1在这个试验期间保持有与注射前相同的免疫反应性和分子量。相反的，血浆scFv(L19)快速地散失了它的免疫反应性，并生成了太大而不能进入凝胶过滤层析柱的聚集物。这样的scFv聚集物非常可能造成了肿瘤和肺的％ID/g之间的比率，因为聚集物可以聚集于肺的微血管中(表3)。对于所有的三种形式，血浆清除主要是通过肾脏清除，表现为具有α和β期的双期曲线，如表4所报告的，它与分子大小成反比。
所研究的不同的抗体形式在肿瘤的聚集是分子的清除率和体内稳定性的结果。利用scFv，在注射放射性标记的抗体3h后观察到每克注射剂量的最大百分比(％ID/g)，然后迅速减少。利用SIP，肿瘤内的％ID/g比scFv的高2-5倍，并在注射后4-6小时达到最高值。在F9和SK-Mel-28瘤中都观察到了这种模式。相反的，在试验期间IgG1在肿瘤内的聚集持续增高。然而，因为它的缓慢清除，比较于相同时间后的scFv的10比率以及SIP的70，144小时后％ID/g的肿瘤-血液比仅仅是3(图4)。
在此所研究的三种抗体形式所表现出的体内稳定性、清除率和肿瘤定向能力的同样出色的特性已经被用于各种诊断和/或治疗目的，这依赖于临床的需要和疾病。例如，在注射后即刻显示出好的肿瘤-器官和肿瘤-血液比率的放射性标记的抗体对于体内诊断性闪烁描绘术是必需的，主要是因为在这些分析中使用短半衰期的同位素。
将抗体作为一种治疗药物的载体的不同尝试是有可能的：转送到达它们的靶后才表现出它们的治疗作用的物质(例如仅仅在靶才激活光敏物)，对此与转送到肿瘤的绝对量是相关的；转送甚至在到达靶之前就发挥出它们的治疗和毒性作用的物质(例如发射物钇-90)，对此必须特别地关注于作为时间函数的肿瘤和血液聚集曲线下面积的比例，使得全身毒性最小化和抗肿瘤治疗作用最大化。
例如，L19-SIP似乎是分子稳定性、清除率和肿瘤聚集的最佳的协调分子。已经描述(44 Hu.et al，1996；33 Li et al.，1997)了由scFv抗体片段与二聚体结构域结合构成的相似的融合蛋白，但是两者都将γ1CH3用作为二聚体结构域。人εs2CH4的应用提供了一种生成共价稳定的二聚体的简便方法。此外，在轻微充分的条件下可以容易地还原C末端半胱氨酸残基所形成的二硫键桥以保持分子的整体结构，因此提供了用于易获得的放射性标记或化学结合的反应基团。这个特性对于临床应用似乎是特别有作为的。
L19-IgG1大量地聚集于肿瘤内，尽管这种聚集可以被缓慢的血液清除所抵消，可以利用去除循环抗体的三步方法使得它不仅可以用于治疗目的也可以用于诊断性免疫闪烁描绘术(45 Magnani et al.2000)。
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表1.在i.v.注射后不同时间点放射性标记抗体的免疫反应性(I*)和从superdex200的放射活性回收率(R)
Figure C0380570500421
如材料和方法所述的测定了血浆的免疫反应性(％)和从superdex200的放射活性回收率(％)。
*：为达到标准化，免疫反应性测定结果指的是i.v.注射前的免疫反应性的百分比数值。
Nd：未测定
表2a.放射性标记的L19和D1.3抗体片段在SK-MEL-28瘤负荷鼠中的生物分布试验L19(scFv)
  3h   6h   24h   48h   72h   144h
  肿瘤   2.47±0.65   2.01±0.72   1.62±0.43   0.95±0.14   0.68±0.04   0.32±0.14
  血液   1.45±0.58   0.54±0.12   0.10±0.03   0.04±0.01   0.03±0.02   0.03±0.01
  肝脏   0.48±0.20   0.18±0.05   0.04±0.01   0.02±0.00   0.02±0.01   0.02±0.00
  脾脏   0.67±0.28   0.27±0.04   0.07±0.02   0.03±0.00   0.02±0.01   0.02±0.00
  肾脏   4.36±0.32   1.67±0.08   0.16±0.01   0.06±0.01   0.04±0.02   0.03±0.00
  小肠   0.77±0.21   0.57±0.05   0.24±0.06   0.17±0.04   0.12±0.05   0.09±0.01
  心脏   0.77±0.20   0.31±0.07   0.07±0.02   0.02±0.00   0.02±0.01   0.02±0.00
  肺   2.86±0.34   1.50±0.67   1.07±0.42   0.73±0.39   0.55±0.11   0.51±0.22
D1.3(scFv)
  3h   6h   24h   48h   72h   144h
  肿瘤   1.03±0.74   0.87±0.42   0.15±0.10   0.07±0.02   Nd   Nd
  血液   1.52±0.86   0.81±0.13   0.02±0.00   0.01±0.00   Nd   Nd
  肝脏   1.19±0.65   0.66±0.26   0.14±0.04   0.03±0.08   Nd   Nd
  脾脏   1.05±0.88   0.42±0.33   0.07±0.02   0.05±0.01   Nd   Nd
  肾脏   3.01±2.48   1.83±0.76   0.48±0.01   0.18±0.05   Nd   Nd
  小肠   0.56±0.54   0.56±0.13   0.17±0.03   0.02±0.01   Nd   Nd
  心脏   0.86±0.54   0.55±0.84   0.02±0.01   0.01±0.00   Nd   Nd
  肺   1.28±0.65   1.06±0.88   0.04±0.01   0.03±0.01   Nd   Nd
结果表示为每克注射剂量的组织抗体的百分比(％ID/g)±SD
nd：未测定
表2b.放射性标记的L1-SIP和D1.3-SIP在SK-MEL-28瘤负荷鼠中的生物分布试验L19 SIP
  3h   6h   24h   48h   72h   144h
  肿瘤   5.23±0.65   6.14±2.23   4.20±2.47   2.57±0.31   2.33±0.90   1.49±0.65
  血液   9.82±0.68   5.03±0.52   1.39±0.06   0.29±0.04   0.08±0.02   0.02±0.01
  肝脏   2.65±0.14   1.74±0.31   0.50±0.06   0.19±0.01   0.10±0.02   0.05±0.01
  脾脏   3.76±0.36   2.43±0.24   0.71±0.05   0.26±0.04   0.13±0.01   0.17±0.18
  肾脏   7.33±0.91   3.87±0.21   1.09±0.05   0.30±0.04   0.14±0.02   0.06±0.01
  小肠   1.45±0.24   1.44±0.29   1.06±0.43   0.56±0.08   0.40±0.08   0.18±0.00
  心脏   4.16±0.24   2.15±0.08   0.52±0.05   0.13±0.03   0.06±0.01   0.02±0.01
  肺   7.72±0.60   5.41±0.55   1.81±0.40   0.59±0.29   0.19±0.03   0.05±0.01
D1.3 SIP
  3h   6h   24h   48h   72h   144h
  肿瘤   3.80±0.30   1.65±0.12   0.70±0.00   0.26±0.01   0.07±0.01   0.04±0.03
  血液   10.40±0.81   4.45±0.14   1.21±0.01   0.32±0.00   0.08±0.01   0.06±0.02
  肝脏   4.05±0.98   2.73±0.33   1.43±0.07   0.51±0.21   0.15±0.08   0.02±0.01
  脾脏   3.31±0.66   1.76±0.50   0.82±0.12   0.46±0.20   0.15±0.05   0.04±0.02
  肾脏   8.41±0.49   4.64±0.06   1.47±0.05   0.36±0.20   0.16±0.03   0.06±0.01
  小肠   2.03±0.55   1.06±0.20   1.02±0.06   0.14±0.03   0.08±0.02   0.12±0.04
  心脏   3.28±0.20   1.81±0.02   0.29±0.01   0.06±0.00   0.05±0.01   0.04±0.01
  肺   6.16±0.28   4.52±0.07   1.16±0.05   0.09±0.00   0.06±0.01   0.05±0.01
结果表示为每克注射剂量的组织抗体的百分比(％ID/g)±SD
nd：未测定
表2c.放射性标记的L1-IgG1和hIgG1κ在SK-MEL-28瘤负荷鼠中的生物分布试验L19 IgG1
  3h   6h   24h   48h   72h   144h
  肿瘤   4.46±0.08   5.39±1.01   6.70±2.10   7.80±2.51   8.90±2.52   11.22±3.19
  血液   16.04±0.81   12.02±1.65   8.31±1.77   5.12±1.42   5.02±3.81   4.87±0.26
  肝脏   6.03±0.37   6.77±0.53   2.41±0.35   1.45±0.41   1.26±0.71   1.09±0.16
  脾脏   6.63±1.34   6.37±1.37   2.51±0.47   2.01±0.32   1.80±1.02   1.51±0.29
  肾脏   6.47±0.39   5.12±0.47   3.07±0.35   1.73±0.63   1.54±1.14   1.12±0.44
  小肠   1.60±0.39   1.35±0.65   1.43±0.19   1.13±0.32   1.13±0.98   0.97±0.47
  心脏   5.63±0.67   4.77±0.52   2.87±0.45   1.48±0.51   1.32±1.09   0.92±0.37
  肺   6.55±0.65   5.15±0.62   4.16±0.66   2.28±0.80   1.98±1.60   1.42±0.45
hIgG1κ
  3h   6h   24h   48h   72h   144h
  肿瘤   Nd   3.28±0.38   4.00±0.22   2.78±0.20   Nd   2.32±0.26
  血液   Nd   10.12±0.35   7.87±0.25   6.24±0.34   Nd   5.41±0.51
  肝脏   Nd   4.02±0.09   2.06±0.10   1.90±0.24   Nd   1.28±0.03
  脾脏   Nd   4.47±0.28   1.82±0.01   1.42±0.19   Nd   1.24±0.03
  肾脏   Nd   5.40±0.19   2.56±0.06   2.08±0.22   Nd   1.30±0.15
  小肠   Nd   0.72±0.07   0.46±0.05   0.36±0.03   Nd   0.31±0.01
  心脏   Nd   3.80±0.15   2.52±0.21   0.99±0.18   Nd   1.48±0.13
  肺   Nd   4.82±0.92   3.64±0.08   1.75±0.32   Nd   1.09±0.13
结果表示为每克注射剂量的组织抗体的百分比(％ID/g)±SD
nd：未测定
Figure C0380570500461
表4.三种L19抗体形式血液清除的动力学参数
Figure C0380570500471
a)：两个半衰期部分的相对数量
表5.放射性标记的L19(scFv)和L19 SIP在F9瘤负荷鼠中的生物分布试验L19(scFv)
  3h   6h   24h   48h
  肿瘤   10.46±1.75   8.15±2.63   3.18±0.83   2.83±0.71
  血液   2.05±0.38   1.88±1.14   0.17±0.01   0.06±0.02
  肝脏   1.62±1.67   0.73±0.51   0.07±0.01   0.04±0.02
  脾脏   1.53±0.36   0.90±0.54   0.11±.0.01   0.05±0.01
  肾脏   12.70±0.73   4.37±0.98   0.24±0.03   0.18±0.08
  小肠   0.68±0.15   0.95±0.23   0.24±0.01   0.17±0.06
  心脏   1.35±0.21   0.81±0.38   0.08±0.02   0.04±0.01
  肺   2.88±0.29   2.06±0.69   0.38±0.60   0.33±0.05
L19 SIP
  3h   6h   24h   48h
  肿瘤   17.46±1.93   16.65±2.59   15.32±2.17   12.00±1.91
  血液   13.51±0.57   9.62±1.18   1.73±0.02   1.14±0.20
  肝脏   2.81±0.37   2.39±0.13   0.54±0.14   0.32±0.00
  脾脏   3.42±0.26   2.66±0.27   0.61±0.09   0.37±0.01
  肾脏   9.18±0.76   5.85±0.50   1.16±0.05   0.76±0.06
  小肠   0.95±0.03   1.36±0.21   0.83±0.11   1.04±0.14
  心脏   4.64±0.24   3.67±0.46   0.67±0.06   0.46±0.14
  肺   5.61±0.01   5.93±0.57   1.66±0.19   0.91±0.08
结果表示为每克注射剂量的组织抗体的百分比(％ID/g)±SD
nd：未测定
表6
Figure C0380570500491
表7
Figure C0380570500492
表8
  1hp.i.   3hp.i.   24hp.i.
  肿瘤血液比   1.01±0.33   2.54±0.74   12.81±4.03
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舍林股份公司
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Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
<210>3
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
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Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala
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ctctcgtacg tttgatttcc accttggtcc            30
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
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Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105

Claims (20)

1.一种抗人ED-B抗体分子，包含一个抗体VH结构域和抗体VL结构域，其中抗体VH结构域是SEQ ID NO.14的L19 VH结构域；且其中抗体VL结构域是SEQ ID NO.15的L19 VL结构域；其中所述抗体分子包含一种小免疫球蛋白，所述小免疫球蛋白包含与εs2-CH4融合的并二聚体化的所述抗体VH结构域和抗体VL结构域。
2.权利要求1的抗体分子，其中抗体VH结构域和抗体VL结构域存在于与εs2-CH4融合的scFv抗体分子内。
3.权利要求2的抗体分子，其中所述scFv抗体分子通过连接肽与εs2-CH4融合。
4.权利要求3的抗体分子，其中所述连接肽是氨基酸序列GGSG(SEQ ID NO.7)。
5.权利要求1-4中任一项的抗体分子，其缀合了一种放射性同位素。
6.权利要求5的抗体分子，其中放射性同位素是Tc、Re、In、Y或Lu中的一种放射性同位素。
7.权利要求5的抗体分子，其中放射性同位素选自由94mTc、99mTc、186Re、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、111In、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F组成的组。
8.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1到4中任一项的抗体分子的一或多种核苷酸序列。
9.用权利要求8的核酸转化的宿主细胞。
10.一种生产抗体分子的方法，所述方法包括在用于生产所述抗体分子的条件下培养权利要求9的宿主细胞。
11.权利要求10的方法，进一步包括分离和/或纯化所述抗体分子。
12.权利要求10或11的方法，进一步包括在体外将所述抗体分子结合于ED-B。
13.一种方法，包括在体外将权利要求1到4中任一项的结合ED-B的抗体分子结合于ED-B。
14.权利要求12或13的方法，包括确定所述抗体分子与ED-B的结合的量。
15.一种用于治疗人体或动物体的病理性血管生成病变或肿瘤的方法中的组合物，其包含权利要求1到4中任一项的抗体分子。
16.权利要求1到4中任一项的抗体分子在生产用于治疗病理性血管生成病变的药物中的用途。
17.权利要求1到4中任一项的抗体分子在生产用于治疗肿瘤的药物中的用途。
18.一种用于治疗人体或动物体的病理性血管生成病变或肿瘤的方法中的组合物，其包含权利要求5到7中任一项的抗体分子。
19.权利要求5到7中任一项的抗体分子在生产用于治疗病理性血管生成病变的药物中的用途。
20.权利要求5到7中任一项的抗体分子在生产用于治疗肿瘤的药物中的用途。
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