PT1483297E - Anticorpos derivados de anti-ed-b l19 e direccionamento para a vasculatura tumoral - Google Patents

Description

ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Anticorpos derivados de anti-ED-B L19 e direccionamento para a vasculatura tumoral" 0 presente invento refere-se ao direccionamento para a vasculatura tumoral utilizando moléculas de anticorpo. Em particular, o invento refere-se à utilização de moléculas de anticorpo que se ligam a ED-B de fibronectina, e que são de utilidade demonstrada no direccionamento para tumores. Em diferentes concretizações do presente invento, utilizam-se moléculas de anticorpo em diferentes formatos moleculares. Em certas concretizações, as moléculas de anticorpo compreendem igGl humana. Noutras concretizações, as moléculas de anticorpo são mini-imunoglobulinas, tais como as geradas por fusão de uma molécula de anticorpo scFv com o domínio CH4 constante de uma isoforma de igE secretora que contém naturalmente uma cisteína no seu terminal COOH que forma um dímero ligado covalentemente. Taxa de depuração sanguínea, estabilidade in vivo e outras propriedades vantajosas são utilizadas em diferentes aspectos e concretizações do invento, e.g. direccionamento para tumores. O diferente comportamento in vivo de diferentes formatos de moléculas de anticorpo pode ser explorado para diferentes fins de diagnóstico e/ou terapêuticos, dependendo das necessidades clínicas e da doença.

Apesar do seu enorme potencial como agentes terapêuticos, os anticorpos monoclonais (mAb) de origem não humana têm tido um desempenho pobre em ensaios clínicos como resultado da sua imunogenicidade (1 Shawlert et al., 1985; 2 Miller et al., 1983), propriedades farmacocinéticas pobres (3 Hakimi et al., 1991; 4 Stephens et al., 1995) e ineficiência no recrutamento de funções efectoras (5 Riechmann et al., 1988; 6 Junghens et al., 1990). A perspectiva recente de isolamento de fragmentos de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de exibição em fagos (7 McCafferty et al., 1990; 8 Lowman et al., 1991; para revisões, ver 9 Nilsonn et al., 2000 e 10 Winter et al., 1994) transcende estes problemas, revitalizando estudos e renovando esperanças de utilização destes reagentes para tratar doenças importantes. De facto, estas moléculas deverão servir como blocos de construção ideais para novas ferramentas de diagnóstico e terapêuticas (11 Reichert, 2001; 12 Huls et al., 1999). Além disso, estes anticorpos podem ser "amadurecidos" para atingir afinidades na gama picomolar (13 Pini et al., 2 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ 1998), pelo menos desejáveis, se não necessárias, para a sua utilização clinica.

Aplicações clinicas de fragmentos de anticorpo humano para a entrega selectiva de agentes de diagnóstico ou terapêuticos requerem todavia alvos altamente específicos. No caso de tumores, os alvos mais populares são antigénios de superfície celular, que usualmente não são nem abundantes nem estáveis. Apesar disso, durante a progressão do tumor, o microambiente circundando as células tumorais é sujeito a extensa modificação, que gera um "ambiente tumoral", o que representa um alvo para terapia de tumores baseada em anticorpos (14 Neri e Zardi, 1998) . De facto, o conceito de que o microambiente tumoral alterado é ele próprio um carcinogénio que pode ser visado está cada vez mais a obter consenso. Moléculas que são capazes de entregar eficazmente agentes terapêuticos ao microambiente tumoral representam assim novas ferramentas promissoras e importantes para terapia do cancro (15 Bissel, 2001; 14 Neri e Zardi, 1998) . A fibronectina é um componente da matriz extracelular (ECM) que é amplamente expresso numa variedade de fluidos corporais e tecidos normais. Diferentes isoformas de FN podem ser geradas pelo splicing alternativo do pré-ARNm de FN, um processo que é modulado por citoquinas e pelo pH extracelular (16 Balza et ai., 1988; 17 Carnemolla et ai., 1989; 18 Borsi et al., 1990; 19 Borsi et al., 1995). A repetição ED-B do tipo III completa, também conhecida como repetição B de extratipo III (EIIIB), pode ser totalmente incluída ou omitida na molécula de FN (20 Zardi et al., 1987). O ED-B é altamente conservado em diferentes espécies, possuindo 100% de homologia em todos os mamíferos até agora estudados (humano, rato, ratinho, cão) e 96% de homologia com um domínio similar em galinha. A isoforma de FN contendo ED-B (B-FN) não é detectável imuno-histoquimicamente em tecidos de adulto normal, com a excepção de tecidos que estão a sofrer remodelação fisiológica (e.g., endométrio e ovário) e durante a cicatrização de feridas (17 Carnemolla et al., 1989; 21 ffrench-Constant, et al., 1989). Por contraste, a sua expressão em tumores e tecidos fetais é elevada (17 Carnemolla et al., 1989). Além disso, foi demonstrado que a B-FN é um marcador de angiogénese (22 Castellani et al., 1994) e que células endoteliais invadindo tecidos tumorais migram ao longo de fibras de ECM contendo B-FN (23 Tarli et al. 1999). 3 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Tem sido descrito o direccionamento selectivo para a vasculatura tumoral utilizando um anticorpo recombinante humano, scFv(L19) (13 Pini et al., 98), especifico para a isoforma B-FN (24 Carnemolla et al., 1996; 23 Tarli et al., 99; 25 Viti et al., 99; 26 Neri et al., 97; 27 Demartis et al., 2001). O anticorpo pode ser utilizado não só em diagnóstico In vivo (imunocintigrafia) mas também em abordagens terapêuticas implicando a entrega selectiva de radionuclidos terapêuticos ou de agentes tóxicos à vasculatura tumoral. Adicionalmente, Birchler et al. (28 1999) mostraram que o scFv(Ll9), acoplado quimicamente a um fotossensibilizador, se acumula selectivamente nos vasos sanguíneos recentemente formados do modelo angiogénico da córnea de coelho e, após irradiação com luz de infravermelho próximo, medeia a oclusão completa e selectiva da neovasculatura ocular.

Mais recentemente, Nilsson et al. (29 2001) noticiaram que o imunoconjugado de scFv(Ll9) com o domínio extracelular de factor tecidular medeia o enfarte selectivo em diferentes tipos de modelos de tumor murino. Para além disso, proteínas de fusão de scFv(Ll9) e IL-2 ou IL-12 têm mostrado eficácia terapêutica melhorada destas duas citoquinas (30 Halin et al., submetido; 31 Carnemolla et al., 2002). Ver também WO 01/62298 para utilização de fusões no tratamento de lesões de angiogénese patológica, incluindo tumores. Finalmente, uma vez que o L19 reage igualmente bem com ED-B de ratinho e humano, pode ser utilizado para estudos tanto pré-clínicos como clínicos.

Ver também WO 97/45544, WO 99/58570, WO 01/62800 e WO 01/62298.

Diferentes formatos de anticorpo têm mostrado comportamento diverso em termos de estabilidade in vivo, depuração e desempenho no direccionamento para tumores (32 Wu et al., 2000). Uma mini-imunoglobulina ou imunoproteína pequena (SIP) é descrita em (33 Li et al., 1997). O presente invento é baseado na preparação, caracterização e investigação da biodistribuição in vivo de moléculas de anticorpo humano L19 em diferentes formatos, nomeadamente, scFv, mini-imunoglobulina e igGl completa. 4 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Breve descrição das figuras A Figura 1 mostra modelos ilustrando as estruturas de diferentes proteínas. A: Modelo da estrutura de domínio de uma subunidade de FN. As sequências de proteína que sofrem splicing alternativo estão assinaladas a cinzento. Como indicado, o epítopo do anticorpo recombinante L19 está localizado dentro da repetição ED-B. B - D: Esquemas das construções utilizadas para expressar, respectivamente, L19 (scFv) (B); L19-SIP (C); e Ll9-IgGl/K. A Figura 2 mostra curvas de crescimento de tumor SK-MEL-28 em ratinhos nus (triângulos) e de tumor F9 na estirpe de ratinho 129 (círculos). 0 volume (mm3) está representado graficamente em função do tempo (dias). Cada ponto dos dados é a média de seis ratinhos ± DP. A Figura 3 mostra os resultados da cromatografia de exclusão por tamanhos nos diferentes formatos de L19. Nos painéis A, B e C mostram-se perfis de cromatografia de exclusão de tamanhos (Superdex 200) dos formatos de L19 scFv, mini-imunoglobulina e IgGl, respectivamente, após radioiodação. Os painéis D, E e F mostram perfis de cromatografia de exclusão de tamanhos (Superdex 200) de plasma para os tempos indicados após injecção i.v. dos formatos de L19 radioiodados, scFv, mini-imunoglobulina e IgGl, respectivamente. Não foram detectadas quaisquer alterações nos perfis das curvas de L19-SIP ou L19-IgGl quando se carregou plasma para diferentes tempos após injecção, enquanto 3 h após injecção de Ll9(scFv)2 se observou um segundo pico de massa molecular mais elevada. A Figura 4 mostra resultados de experiências de biodistribuição em ratinhos portadores de tumor SK-MEL-28 utilizando diferentes formatos de moléculas de anticorpo L19 radioiodados. São reportadas as variações da %ID/g no tumor (Figura 4A) e no sangue (Figura 4B) nos tempos indicados após injecção i.v.. Na Figura 4C representam-se graficamente as razões tumor-sangue da %ID/g. As curvas de L19(scFv) estão assinaladas por losangos, de mini-imunoglobulina de L19 por quadrados e de IgGl de L19 por triângulos. A Figura 5 mostra resultados de experiências de biodistribuição em ratinhos portadores de tumor F9 utilizando L19(scFv) (quadrados) e mini-imunoglobulina de L19 (losangos) 5 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ radioiodados. São reportadas as variações da %ID/g no tumor (A) e no sangue (B), nos diferentes tempos indicados após injecção i.v..

Num aspecto, o presente invento proporciona uma molécula de anticorpo anti-ED-B humano que se liga a ED-B humano de fibronectina e que compreende o domínio VH de L19 e o domínio VL de L19, e onde o membro de ligação específica compreende uma mini-imunoglobulina compreendendo o referido domínio VH de anticorpo e o referido domínio VL de anticorpo fundidos a £S2~ CH4 e dimerizados.

As sequências do domínio VH de L19 e do domínio VL de L19 são apresentadas em Pini et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776. A sequência do domínio VH de L19 é:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSS e a sequência do domínio VL de LI9 é:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDR

F5GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK

Geralmente, um domínio VH está emparelhado com um domínio VL para proporcionar um local de ligação ao antigénio do anticorpo. Na molécula de anticorpo do invento, o domínio VH de Ll9 está emparelhado com o domínio VL de L19, de modo a formar um local de ligação ao antigénio do anticorpo compreendendo ambos os domínios VH e VL de L19. 0 VH de L19 pode ser emparelhado com um outro domínio VL que não o VL de Ll9. A promiscuidade de cadeias leves está bem estabelecida na especialidade.

Uma ou mais CDR podem ser retiradas dos domínios VH ou VL de L19 e incorporadas numa estrutura (framework) adequada. Isto é discutido adicionalmente a seguir. As CDR 1, 2 e 3 de VH de L19 são mostradas nas SEQ ID N0:1, 2 e 3, respectivamente. As CDR 1, 2 e 3 de VL de L19 são mostradas nas SEQ ID NO:4, 5 e 6, respectivamente.

Variantes dos domínios VH e VL e CDR, cujas sequências são aqui apresentadas e que podem ser utilizadas em membros de 6 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ ligação específica para ED-B, podem ser obtidas através de métodos de alteração ou mutação de sequências e rastreio.

Variantes da sequência de aminoácidos de domínio variável de qualquer dos domínios VH e VL, cujas sequências são aqui especificamente reveladas, podem ser utilizadas de acordo com o presente invento, como discutido. Variantes particulares podem incluir uma ou mais alterações (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo aminoácido) da sequência de aminoácidos, podem ser menos de cerca de 20 alterações, menos de cerca de 15 alterações, menos de cerca de 10 alterações ou menos de cerca de 5 alterações, 4, 3, 2 ou 1. As alterações podem ser efectuadas em uma ou mais regiões estruturais.

Um membro de ligação específica pode ser um que compete pela ligação ao antigénio com um membro de ligação específica que não só se liga a ED-B mas também compreende um local de ligação ao antigénio formado pelo domínio VH de L19 e pelo domínio VL de L19. A competição entre membros de ligação pode ser facilmente ensaiada in vitro, por exemplo, por utilização de ELISA e/ou por marcação de um membro de ligação com uma molécula repórter específica que pode ser detectada na presença de outro(s) membro(s) de ligação não marcado(s), para possibilitar a identificação de membros de ligação específica que se ligam ao mesmo epítopo ou a um epítopo sobreposto.

Assim, é ainda descrito um membro de ligação específica compreendendo um local de ligação ao antigénio do anticorpo humano que compete com L19 pela ligação a ED-B.

Um membro de ligação específica pode ligar-se a ED-B com pelo menos a afinidade de L19, sendo a afinidade de ligação de diferentes membros de ligação específica comparada sob condições apropriadas.

Para além de sequências de anticorpo, um membro de ligação específica pode compreender outros aminoácidos, e.g. formando um péptido ou polipéptido, tal como um domínio dobrado, ou para conferir à molécula outra característica funcional para além da capacidade para se ligar ao antigénio. Os membros de ligação específica podem ser portadores de um marcador detectável, ou podem ser conjugados com uma toxina ou uma enzima (e.g. através de uma ligação ou um sistema de ligação peptidilo). 7 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

No tratamento de perturbações ou lesões de angiogénese patológica, um membro de ligação específica pode ser conjugado com uma molécula tóxica, por exemplo uma molécula biocida ou citotóxica que pode ser seleccionada entre interleucina-2 (IL-2), doxorrubicina, interleucina-12 (IL-12), interferão-γ (IFN-γ), factor α de necrose tumoral (TNFa) e factor tecidular (preferivelmente factor tecidular truncado, e.g. para resíduos 1-219). Ver e.g. WO 01/62298.

Noutros aspectos, o invento proporciona um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência codificando uma molécula de anticorpo de acordo com o presente invento, e são aqui revelados métodos de preparação de um membro de ligação específica que compreende a expressão do referido ácido nucleico sob condições que provocam a produção do referido membro de ligação específica e a sua recuperação.

Os membros de ligação específica podem ser utilizados num método de tratamento ou diagnóstico do corpo humano ou animal, tal como um método de tratamento (que pode incluir tratamento profiláctico) de uma doença ou perturbação num paciente humano que compreende a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um membro de ligação específica do invento. Condições tratáveis incluem tumores, especialmente tumores sólidos, e outras lesões de angiogénese patológica, incluindo, artrite reumatóide, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada com a idade e angiomas.

Ainda um aspecto adicional proporciona um método de produção de uma molécula de anticorpo do invento, o método compreendendo causar a expressão a partir de ácido nucleico codificante. Um tal método compreende a cultura de células hospedeiras sob condições para produção do referido membro de ligação específica.

Um método de produção pode compreender um passo de isolamento e/ou purificação do produto.

Um método de produção pode compreender a formulação do produto numa composição incluindo pelo menos um componente adicional, tal como um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Estes e outros aspectos do invento são descritos a seguir com mais detalhe. 8 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

TERMINOLOGIA

Membro de ligação específica

Descreve um membro de um par de moléculas que tem especificidade de ligação pelo outro membro. Os membros de um par de ligação especifica podem ser obtidos naturalmente ou produzidos total ou parcialmente de modo sintético. Um membro do par de moléculas tem uma área na sua superfície, ou uma cavidade, que especif icamente se liga a e é por isso complementar de uma organização espacial e polar particular do outro membro do par de moléculas. Assim, os membros do par têm a propriedade de se ligarem especificamente um ao outro. Exemplos de tipos de pares de ligação específica são antigénio-anticorpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando, enzima-substrato. Este pedido de patente refere-se a reacções do tipo antigénio-anticorpo.

Molécula de anticorpo

Descreve uma imunoglobulina seja esta natural ou produzida total ou parcialmente de modo sintético. 0 termo abrange também qualquer polipéptido ou proteína compreendendo um domínio de ligação de anticorpo. Fragmentos de anticorpo que compreendem um domínio de ligação ao antigénio são tais como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; e diacorpos. 0 presente invento refere-se a mini-imunoglobulinas compreendendo sS2-CH4 como revelado.

Podem-se utilizar técnicas de tecnologia de ADN recombinante para produzir, a partir de uma molécula de anticorpo inicial, outras moléculas de anticorpo que retêm a especificidade da molécula de anticorpo original. Estas técnicas podem envolver a introdução de ADN codificando a região variável de imunoglobulina, ou as regiões determinantes de complementaridade (CDR), de um anticorpo até às regiões constantes, ou regiões constantes mais regiões estruturais, de uma imunoglobulina diferente. Ver, por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400.

Como os anticorpos podem ser modificados de vários modos, o termo "molécula de anticorpo" deverá ser entendido como abrangendo qualquer membro de ligação específica ou substância possuindo um domínio de ligação ao antigénio do anticorpo com a especificidade requerida. Assim, este termo abrange 9 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ fragmentos e derivados de anticorpo, incluindo qualquer polipéptido compreendendo um domínio de imunoglobulina de ligação ao antigénio, seja este natural ou total ou parcialmente sintético. São deste modo incluídas moléculas quiméricas compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, ou equivalente, fundido a outro polipéptido. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritas em EP-A-0120694 e EP-A-0125023.

Domínio de ligação ao antigénio

Descreve a parte de uma molécula de anticorpo que compreende a área que se liga especificamente e é complementar a parte ou à totalidade de um antigénio. Quando um antigénio é grande, um anticorpo pode ligar-se apenas a uma parte particular do antigénio, parte esta que é denominada epítopo. Um domínio de ligação ao antigénio pode ser proporcionado por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (e.g. um denominado fragmento de anticorpo Fd consistindo num domínio VH).

Preferivelmente, um domínio de ligação ao antigénio compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).

Específico

Pode ser utilizado para referir a situação em que um membro de um par de ligação específica não exibirá qualquer ligação significativa a outras moléculas que não o(s) seu(s) parceiro(s) de ligação específica. 0 termo é também aplicável quando e.g. um domínio de ligação ao antigénio é específico para um epítopo particular que é transportado por vários antigénios, caso em que o membro de ligação específica transportando o domínio de ligação ao antigénio será capaz de se ligar aos vários antigénios transportando o epítopo.

Compreende É geralmente utilizado no sentido de incluir, isto é, permitir a presença de uma ou mais particularidades ou componentes.

Isolado

Refere-se ao estado em que moléculas de anticorpo do invento, ou ácido nucleico codificando estes membros de ligação, estarão geralmente de acordo com o presente invento. 10 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Membros e ácido nucleico estarão isentos ou substancialmente isentos de material com o qual estão naturalmente associados, tais como outros polipéptidos ou ácidos nucleicos com os quais são encontrados no seu ambiente natural, ou o ambiente nos quais são preparados (e.g. cultura de células) quando esta preparação é por tecnologia de ADN recombinante praticada in vitro ou in vivo. Membros e ácido nucleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda assim, para efeitos práticos, estarem isolados - por exemplo os membros estarão normalmente misturados com gelatina ou outros transportadores, se utilizados para revestir placas de microtitulação para utilização em imunoensaios, ou estarão misturados com transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, quando utilizados em diagnóstico ou terapia. Os membros de ligação especifica podem estar glicosilados, quer naturalmente quer por sistemas de células eucariotas heterólogas (e.g. células CHO ou NSO (ECACC 85110503)), ou podem estar não glicosilados (por exemplo, se produzidos por expressão numa célula procariota) .

Por "substancialmente como apresentado" significa que as CDR ou domínios VH ou VL relevantes serão idênticos ou altamente similares às regiões especificadas cuja sequência é aqui apresentada. Por "altamente similar" é contemplado que podem ser efectuadas de 1 a 5, preferivelmente de 1 a 4 tal como 1 a 3 ou 1 ou 2, ou 3 ou 4, substituições na CDR e/ou domínio VH ou VL. A estrutura para transportar uma CDR será geralmente uma sequência de cadeia pesada ou leve de anticorpo, ou uma sua porção substancial, na qual a CDR está localizada numa localização correspondente à CDR de domínios variáveis VH e VL de anticorpos de ocorrência natural codificada por genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e localizações de domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinadas por referência a (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition. US Department of Health and Human Services. 1991, e suas actualizações, agora disponível na Internet (http://immuno.bme.nwu.edu ou pesquisar "Kabat" utilizando qualquer motor de busca).

Preferivelmente, uma sequência de aminoácidos de CDR substancialmente como aqui apresentada é transportada como uma CDR num domínio variável humano ou numa sua porção substancial. Podem ser utilizadas as sequências de CDR3 de VH 11 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ de L19 e/ou CDR3 de VL de Ll9 substancialmente como aqui apresentadas e cada uma destas pode ser transportada na forma de uma CDR3 num dominio variável de cadeia pesada ou leve humano, conforme o caso, ou uma sua porção substancial.

Uma porção substancial de um dominio variável de imunoglobulina compreenderá pelo menos três regiões CDR, em conjunto com as suas regiões estruturais intervenientes. Preferivelmente, a porção incluirá também pelo menos cerca de 50% de qualquer uma ou de ambas as primeira e quarta regiões estruturais, os 50% sendo os 50% C-terminais da primeira região estrutural e os 50% N-terminais da quarta região estrutural. Resíduos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles que normalmente não estão associados a regiões de domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, a construção de membros de ligação específica do presente invento, realizada por técnicas de ADN recombinante, pode resultar na introdução de resíduos N-terminais ou C-terminais codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação. Outros passos de manipulação incluem a introdução de ligantes para unir domínios variáveis a sequências de proteína adicionais incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis ou marcadores de proteína como depois discutido com mais detalhe.

Numa molécula de anticorpo de igGl aqui revelada, podem ser ligados domínios VL, na extremidade C-terminal, a domínios constantes de cadeia leve de anticorpo incluindo cadeias Ck ou CX humanas, preferivelmente cadeias Ck.

As moléculas de anticorpo do invento podem ser marcadas com um marcador detectável ou funcional. Descrevem-se a seguir marcadores detectáveis e incluem radiomarcadores tais como radioisótopos de Tecnécio, índio, ítrio, Cobre, Lutécio ou Rénio, em particular 94mTc, 99mTc, 196Re, 188Re, luIn, 86Y, 88Y, 1 nn r A /-η

Lu, Cu e Cu, que podem ser ligados a anticorpos do invento utilizando química convencional conhecida na especialidade da imagiologia de anticorpos como aqui descrito.

Os marcadores incluem também marcadores enzimáticos tais como peroxidase de rábano. Os marcadores incluem ainda porções químicas, tais como biotina, que podem ser detectadas através 12 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ de ligação a uma porção detectável cognata específica, e.g. avidina marcada.

Os membros de ligação específica (L19-SIP) aqui revelados estão particularmente bem adaptados para radiomarcação com isótopos tais como 94mTc, 99mTc, 186Re, 43Sc, 47Sc, 110mln, inm, 97Ru, 62Cu, 64 90Y, 121Sn, lêlTb, 153Sm, lêêH0, 105Rh, 8Re, 203Pb, 67Ga, 69Ga, "Cu, 67Cu, 68Cu, 86Y, 88Y, ,77Lu, 72Lu e 18F, e utilização subsequente em radiodiagnóstico e radioterapia. 0 99mTc é um radioisótopo particularmente preferido para marcação, e um protocolo adequado é descrito na secção experimental a seguir.

Para radiomarcar os membros de ligação específica directamente, as moléculas ligadas por cisteína são primeiro reduzidas por um agente redutor apropriado e.g. cloreto estanoso(II), Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), gerando grupos SH livres de cisteína que podem reagir com isótopos e.g. Tc ou Re. Neste procedimento particular, os permetalatos obtidos a partir de um sistema gerador instantâneo são reduzidos por um agente redutor e.g. cloreto estanoso(II) na presença de um ligando auxiliar e.g. tartarato de sódio e o API (detalhes são fornecidos a seguir na secção experimental). A marcação indirecta com e.g. índio, ítrio, lantanídeos ou tecnécio e rénio pode ser realizada por pré-conjugação de um ligando quelante, preferivelmente derivado de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA), ácido ciclo-hexil-1,2-diaminotetra-acético (CDTA), ácido etilenoglicol-O,0'-bis(2-aminoetil) -N, N, N', N' -diacético (HBED), ácido trietilenotetra-amino-hexa-acético (TTHA), ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,N',N'''-tetra-acético (DOTA), ácido 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N' '-triacético (NOTA), ácido 1, 4, 8,11-tetra-azaciclotetradecano-N,Ν',Ν''Ν'''-tetra-acético (TETA), mercaptoacetildiglicina (MAG2), mercaptoacetiltriglicina (MAG3), mercaptoacetilglicil-cisteína (MAGO), cisteinilglicilcisteína (CGC), a grupos quer amina quer tiol do membro de ligação específica. Os ligandos quelantes possuem um grupo de acoplamento adequado e.g. ésteres activos, maleimidas, tiocarbamatos ou porções acetamida α-halogenadas. Para conjugação de ligandos quelantes a grupos amina, e.g. grupos ε-ΝΗ2 de resíduos lisina, não é requerida a redução prévia do composto L19-SIP. 13 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

As moléculas de anticorpo do presente invento são desenhadas para serem utilizadas em métodos de diagnóstico ou tratamento em indivíduos humanos ou animais, preferivelmente humanos. Estes métodos não são aqui reivindicados como tal.

As indicações clínicas nas quais uma molécula de anticorpo do invento pode ser utilizada para proporcionar benefício terapêutico incluem tumores tais como qualquer tumor sólido, também outras lesões de angiogénese patológica, incluindo artrite reumatóide, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada com a idade e angiomas.

Moléculas de anticorpo de acordo com o invento podem ser utilizadas num método de tratamento do corpo humano ou animal, tal como um método de tratamento (que pode incluir tratamento profiláctico) de uma doença ou perturbação num paciente humano que compreende a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um membro de ligação específica do invento. Condições tratáveis são aqui descritas noutro local. Estes métodos não são aqui reivindicados como tal.

Por conseguinte, aspectos adicionais do invento proporcionam composições farmacêuticas compreendendo uma tal molécula de anticorpo, e a utilização de uma tal molécula de anticorpo na fabricação de um medicamento para administração, por exemplo num método de produção de um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo a formulação da molécula de anticorpo com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

As composições fornecidas podem ser administradas a indivíduos. A administração é preferivelmente numa "quantidade terapeuticamente eficaz", sendo esta suficiente para exibir benefício para um paciente. Este benefício pode ser pelo menos melhoria de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada, e a taxa e o escalonamento no tempo da administração, dependerão da natureza e da gravidade do que está a ser tratado. A prescrição do tratamento, e.g. decisões sobre dosagem etc., está dentro da responsabilidade de médicos de clínica geral e de outras especialidades médicas. Doses apropriadas de anticorpo são bem conhecidas na especialidade; ver Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Câncer 47: 659 — 664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922. 14 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, quer simultaneamente quer sequencialmente dependendo da condição a ser tratada.

As moléculas de anticorpo do presente invento, incluindo aquelas compreendendo um domínio de ligação ao antigénio do anticorpo, podem ser administradas a um paciente necessitado de tratamento através de qualquer via adequada, usualmente por injecção na corrente sanguínea e/ou directamente no local a ser tratado, e.g. tumor. A dose exacta dependerá de vários factores, da via de tratamento, do tamanho e localização da área a ser tratada (e.g. tumor), da natureza exacta do anticorpo (e.g. molécula de anticorpo igGl inteira, molécula de mini-imunoglobulina), e da natureza de qualquer marcador detectável ou outra molécula ligada à molécula de anticorpo. Uma dose de anticorpo típica estará na gama de 10-50 mg.

Esta é uma dose para um único tratamento de um paciente adulto, que pode ser proporcionalmente ajustada para crianças e bebés, e também ajustada para outros formatos de anticorpo proporcionalmente ao peso molecular. Os tratamentos podem ser repetidos a intervalos diariamente, duas vezes por semana, semanalmente ou mensalmente, à discrição do médico.

As moléculas de anticorpo do presente invento serão usualmente administradas na forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente para além do membro de ligação específica.

Assim, composições farmacêuticas de acordo com o presente invento, e para utilização de acordo com o presente invento, podem compreender, para além do ingrediente activo, um excipiente, transportador, tampão, estabilizador ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos dos peritos na especialidade. Estes materiais deverão ser não tóxicos e não deverão interferir com a eficácia do ingrediente activo. A natureza exacta do transportador ou de outros materiais dependerá da via de administração, que pode ser oral, ou por injecção, e.g. intravenosa.

Para injecção intravenosa, ou injecção no local afectado, o ingrediente activo estará na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que está isenta de pirogénios e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Aqueles com competências relevantes na especialidade são bem capazes de 15 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotónicos tais como solução para injecção de cloreto de sódio, solução para injecção de Ringer, solução para injecção de lactato de Ringer. Podem ser incluídos conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos, como requerido.

Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, quer simultaneamente quer sequencialmente, dependendo da condição a ser tratada. Outros tratamentos podem incluir a administração de doses adequadas de fármacos para alívio da dor, tais como fármacos anti-inflamatórios não esteróides (e.g. aspirina, paracetamol, ibuprofeno ou cetoprofeno) ou opiáceos tais como morfina, ou antieméticos. 0 presente invento proporciona um método compreendendo causar ou permitir a ligação de um membro de ligação específica, como aqui proporcionado, a ED-B in vitro, por exemplo em ELISA, Western blotting, imunocitoquímica, imunoprecipitação ou cromatografia de afinidade.

Pode-se determinar a quantidade de ligação de membro de ligação específica a ED-B. A quantificação pode ser relacionada com a quantidade do antigénio numa amostra de teste, que pode ser de interesse para diagnóstico.

As reactividades de anticorpos numa amostra podem ser determinadas por quaisquer meios apropriados. Radioimunoensaio (RIA) é uma possibilidade. Mistura-se antigénio marcado radioactivo com antigénio não marcado (a amostra de teste) e deixa-se ligar ao anticorpo. Separa-se fisicamente o antigénio ligado do antigénio não ligado e determina-se a quantidade de antigénio radioactivo ligado ao anticorpo. Quanto mais antigénio existir na amostra de teste menos antigénio radioactivo se ligará ao anticorpo. Pode-se também utilizar um ensaio de ligação competitiva com antigénio não radioactivo, utilizando antigénio ou um análogo ligado a uma molécula repórter. A molécula repórter pode ser um fluorócromo, um pigmento fosforescente ou laser com características de absorção ou emissão isoladas espectralmente. Os fluorócromos adequados incluem fluoresceína, rodamina, ficoeritrina e Vermelho Texas. Os pigmentos cromogénicos adequados incluem diaminobenzidina. 16 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Outros repórteres incluem partículas coloidais macromoleculares ou material particulado tal como pérolas de látex que são coloridas, magnéticas ou paramagnéticas, e agentes biologicamente ou quimicamente activos que podem originar directamente ou indirectamente sinais detectáveis para serem observados visualmente, detectados electronicamente ou de outro modo registados. Estas moléculas podem ser enzimas que catalisam reacções que desenvolvem ou alteram cores ou causam alterações em propriedades eléctricas, por exemplo. Estas podem ser excitáveis molecularmente, tal que transições electrónicas entre estados de energia resultam em absorções ou emissões espectrais características. Estas podem incluir entidades químicas utilizadas em conjunção com biossensores. Podem-se utilizar sistemas de detecção de biotina/avidina ou biotina/estreptavidina e fosfatase alcalina.

Os sinais gerados por conjugados de anticorpo-repórter individuais podem ser utilizados para obter dados absolutos ou relativos quantificáveis da ligação de anticorpo relevante em amostras (normal e teste). É aqui revelado um membro de ligação específica que compete pela ligação a ED-B com qualquer membro de ligação específica que não só se liga ao antigénio mas também compreende um domínio V incluindo uma CDR com aminoácidos substancialmente como aqui apresentado, preferivelmente um domínio VH compreendendo CDR3 VH de SEQ ID NO:3. A competição entre membros de ligação pode ser ensaiada facilmente in vítro, por exemplo por marcação de um membro de ligação com uma molécula repórter específica que pode ser detectada na presença de outro(s) membro(s) de ligação não marcado(s), para permitir a identificação de membros de ligação específica que se ligam ao mesmo epítopo ou a um epítopo sobreposto. A competição pode ser determinada por exemplo utilizando o ELISA como descrito em Carnemolla et al. (24 1996). 0 presente invento proporciona ainda um ácido nucleico isolado codificando uma molécula de anticorpo do presente invento. 0 ácido nucleico pode ser ADN ou ARN. São aqui reveladas construções na forma de plasmídeos, vectores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleótido como anteriormente. 17 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ Ο presente invento proporciona também uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções como acima. Um ácido nucleico codificando uma molécula de anticorpo como proporcionado constitui ele próprio um aspecto do presente invento, bem como um método de produção do produto codificado, método que compreende a expressão a partir de ácido nucleico que o codifica. A expressão pode ser convenientemente conseguida por cultura das células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucleico, sob condições apropriadas. Após produção por expressão, um membro de ligação especifica pode ser isolado e/ou purificado, utilizando qualquer técnica adequada, e depois utilizado como apropriado.

As moléculas de anticorpo e moléculas e vectores de ácido nucleico codificante de acordo com o presente invento podem ser fornecidos isolados e/ou purificados, e.g. a partir do seu ambiente natural, em forma substancialmente pura ou homogénea, ou, no caso de ácido nucleico, livre ou substancialmente livre de ácido nucleico ou genes de outra origem que não a da sequência codificando um polipéptido com a função requerida. Ácido nucleico de acordo com o presente invento pode compreender ADN ou ARN e pode ser totalmente ou parcialmente sintético. A referência a uma sequência de nucleótidos como aqui apresentada abrange uma molécula de ADN com a sequência especificada, e abrange uma molécula de ARN com a sequência especificada na qual U é utilizado em substituição de T, a não ser que o contexto requeira outra substituição. São bem conhecidos sistemas para clonagem e expressão de um polipéptido numa variedade de células hospedeiras diferentes. Células hospedeiras adequadas incluem de bactérias, células de mamífero, sistemas levedura e baculovírus. Linhas de células de mamifero disponíveis na especialidade para expressão de um polipéptido heterólogo incluem células de ovário de hamster chinês, células HeLa, células de rim de hamster bebé, células de melanoma de ratinho NSO e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano preferido, comum, é E. coli. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos em células procariotas tais como E. coli está bem estabelecida na especialidade. Para uma revisão, ver por exemplo Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucariotas em cultura está também disponível para os peritos 18 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ na especialidade como uma opção para produção de um membro de ligação especifica, para revisões recentes ver, por exemplo, Ref, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.

Podem ser escolhidos ou construídos vectores adequados, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências de promotor, sequências de terminador, sequências de poliadenilação, sequências de intensificador, genes marcadores e outras sequências como apropriado. Os vectores podem ser plasmideos, virais e.g. fago ou fagemideo, conforme apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3.a edição, Sambrook et al., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo na preparação de construções de ácido nucleico, mutagénese, sequenciação, introdução de ADN no interior de células e expressão génica, e análise de proteínas, são descritos em detalhe em Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

Assim, um aspecto adicional do presente invento proporciona uma célula hospedeira contendo ácido nucleico como aqui revelado. Ainda um aspecto adicional proporciona um método compreendendo a introdução deste ácido nucleico numa célula hospedeira. A introdução pode utilizar qualquer técnica disponível. Para células eucariotas, técnicas adequadas podem incluir transfecção com fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, electroporação, transfecção mediada por lipossoma e transdução utilizando retrovirus ou outro vírus, e.g. vacínia ou, para células de insecto, baculovírus. Para células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir transformação de cloreto de cálcio, electroporação e transfecção utilizando bacteriófago. A introdução pode ser seguida provocando ou permitindo a expressão a partir do ácido nucleico, e.g. por cultura de células hospedeiras sob condições para expressão do gene. O ácido nucleico do invento pode ser integrado no genoma (e.g. cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão. 19 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ É aqui revelado um método que compreende a utilização de uma construção como acima exposto num sistema de expressão de modo a expressar um membro de ligação especifica ou polipéptido como acima.

Outros aspectos e concretizações do presente invento serão evidentes para os peritos na especialidade à luz da presente revelação incluindo a exemplificação experimental seguinte.

EXEMPLIFICAÇÃO EXPERIMENTAL DE ASPECTOS E CONCRETIZAÇÕES DO PRESENTE INVENTO

MATERIAIS E MÉTODOS

Preparação e expressão de scFv, imunoproteína pequena (SIP) e construções scFv de IgGl 0 scFv(Ll9) (Figura IA) é um fragmento de anticorpo (Kd = 5,4xl0-11 M) amadurecido por afinidade dirigido contra o domínio ED-B de fibronectina (13 Pini et al., 1998). Utilizou-se scFv(Dl.3) (7 McCafferty et al.; 26 Neri et al., 1997), um scFv de ratinho anti-lisozima de clara de ovo de galinha, como controlo. Estes scFv foram expressos em E. colí estirpe HB2151 (Maxim Biotech, San Francisco CA) de acordo com Pini et al. (34 1997).

Mini-imunoglobulina

Para construir o gene de imunoproteína pequena de L19 (L19-SIP) (Figura 1C), a sequência de ADN codificando o scFv(Ll9) foi amplificada por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando Pwo DNA Polymerase (Roche), de acordo com as recomendações do fabricante, com iniciadores BC-618 (gtgtgcactcggaggtgcagctgttggagtctggg - SEQ ID NO:8) e BC-619 (gcctccggatttgatttccaccttggtcccttggcc - SEQ ID NO:9), contendo locais de restrição ApaLl e BspEl, respectivamente. 0 produto de amplificação foi inserido ApaLl/BspEl no vector pUT-sSIP, que proporciona o gene scFv com um sinal de secreção, requerido para secreção de proteínas no meio extracelular. 0 vector pUT-sSlP foi obtido a partir do pUT-SIP-long (33 Li et al., 1997) anteriormente descrito após substituição do domínio yl-CH3 constante humano pelo domínio CH4 da isoforma secretora de IgE humana lgE-S2 (£S2_CH4; 35 Batista et al., 1996). CH4 é o domínio que permite dimerização na molécula de IgE e a 20 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ isoforma ε52 contém uma cisteína na extremidade carboxi-terminal, que estabiliza o dimero de igE através de uma ligação dissulfureto inter-cadeias. Na molécula SIP final, o ScFv(Ll9) estava ligado ao domínio sS2~CH4 por um ligante GGSG curto. O gene SIP foi depois excisado a partir do plasmideo pUT-£SIP-Ll9 com enzimas de restrição Hindlll e EcoRl e clonado no vector de expressão de mamifero pcDNA3 (Invitrogen, Groningen, Holanda), que contém o promotor de citomegalovirus (CMV), de modo a obter a construção pcDNA3-Ll9-SiP. A sequência de ADN codificando scFv(Dl.3) foi amplificada utilizando os iniciadores BC-721 (ctcgtgcactcgcaggtgcagctgcagg agtca - SEQ ID NO:10) e BC-732 (ctctccggaccgtttgatctcgcgcttggt - SEQ ID NO:ll) e inserida ApaLI/BspEI no vector pUT-sSIP vector. O gene D1.3-SIP foi depois excisado a partir do pUT-eSlP-Dl.3 com enzimas de restrição Hindlll e EcoRl e clonado em pcDNA3, de modo a obter a construção pcDNA3-Dl.3-SIP.

Utilizaram-se estas construções para transfectar células de mieloma murino SP2/0 (ATCC, American Type Culture Collection, Rockville, MD, E.U.A.) utilizando reagente de transfecção FuGENE 6 (Roche), seguindo o protocolo para células aderentes, optimizado pelo fabricante. Os transfectomas foram cultivados em DMEM suplementado com 10% de FCS e seleccionados utilizando 750 pg/ml de geneticina (G418, Calbiochem, San Diego, CA).

IgGl

Para preparar IgGl completa, a região variável da cadeia pesada de L19 (L19-VH), em conjunto com a sua sequência peptídica de secreção, foi excisada com Hindlll e Xhol a partir do Ll9-pUTsSIP anteriormente descrito e inserida no vector pUC-igGl, contendo o gene de cadeia pesada constante γΐ humano completo. O gene de IgGl recombinante foi depois excisado a partir do pUC-IgGl-L19-VH com Hindlll e EcoRl e clonado no pcDNA3, para obter a construção pcDNA3-Ll9-IgGl.

Para a preparação da cadeia leve de L19 completa, L19-VL foi amplificado a partir do L19-pUT-sSIP (acima descrito) por PCR utilizando os iniciadores BC-696 (tggtgtgcactcggaaattgtgtt gacgcagtc - SEQ ID NO:12) e BC-697 (ctctcgtacgtttgatttccaccttg gtcc - SEQ ID NO:13), contendo locais de restrição ApaLI e BsiWI, respectivamente. Após digestão com ApaLI e BsiWl, o produto de amplificação foi inserido no vector pUT-SEC-hCK 21 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ contendo a sequência de sinal de secreção e a sequência da cadeia leve κ constante humana. 0 gene da cadeia leve recombinante foi depois excisado a partir de pUT-SEC-hCK-Ll9-VL com HindIII e Xhol e inserido no vector de expressão de mamífero pCMV2h, derivado de um vector pcDNA3 por remoção do gene de resistência a G418, para obter a construção pCMV2A-L19-K.

Utilizaram-se quantidades equimolares destas construções para co-transfectar células de mieloma murino SP2/0 como acima descrito. Clones seleccionadas com geneticina foram rastreados em ELISA quando à capacidade para segregar imunoglobulina quimérica, completa de cadeias pesada e leve.

Todas as construções de ADN foram purificadas utilizando o sistema Maxiprep da Qiagen (Hilden, Alemanha), e as sequências de ADN de ambas as cadeias das construções foram confirmadas utilizando o ABI PRISM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA). Todas as enzimas de restrição (RE) foram da Roche Diagnostics (Milão, Itália), com a excepção de BsiWI (New England Biolabs, Beverly, MA) . Após digestão com enzimas de restrição, inserções e vectores foram recuperados a partir de géis de agarose utilizando o método Qiaquick (Qiagen).

Purificação e controlo de qualidade de anticorpos

Realizou-se cromatografia de afinidade para purificar os diferentes anticorpos de acordo com o procedimento descrito por Carnemolla et al. (24 1996).

Utilizou-se ED-B conjugado com Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech., Uppsala, Suécia) seguindo as instruções do fabricante (24 Carnemolla et ai., 96) para imunopurificar todos os diferentes formatos de anticorpo L19, enquanto para os anticorpos Dl.3 se utilizou uma coluna de lisozima de clara de ovo de galinha (Sigma, St. Louis, E.u.A.) conjugada com Sepharose 4B (Amersham Pharmacia) .

Os formatos de anticorpo imunopurifiçados L19-SIP e L19-igGl não requereram qualquer purificação adicional e forma dialisados contra PBS, pH 7,4, a +4°C. Uma vez que os scFv obtidos a partir da cromatografia de afinidade são constituídos de duas formas, monomérica e dimérica, um segundo passo de purificação, como descrito por Demartis et ai. (27 22 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ 2001), foi requerido para isolar a última forma. Prepararam-se lotes dos diferentes formatos de anticorpo e analisaram-se por SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras, imuno-histoquímica, cromatografia de exclusão de tamanhos (Superdex 200, Amersham Pharmacia Biotech) e experiências de elisa.

Electroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), Ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA), cromatografia de exclusão de tamanhos e imuno-histoquímica

Realizaram-se experiências de ELISA de rastreio nos meios de cultura condicionados de acordo com Carnemolla et al. (24 1996). Para revelar a expressão dos diferentes formatos de anticorpo L19, o fragmento recombinante 7B89 (24 Carnemolla et al., 1996), contendo o dominio ED-B de FN, que inclui o epitopo reconhecido pelo L19, foi imobilizado sobre imunoplacas Maxisorp (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Para detectar anticorpos Dl.3 em experiências de ELISA, imobilizou-se lisozima de clara de ovo de galinha (Sigma) foi sobre placas EIA de NH2 à superfície (Costar, Cambridge, MA) . Utilizou-se uma IgE de coelho anti-humano conjugada com peroxidase (Pierce, Rockford, IL), diluída de acordo com recomendações do fabricante, como anticorpo secundário para detectar SIP. Utilizou-se uma IgG de coelho anti-humano conjugada com peroxidase (Pierce) no caso de IgGl. Para os scFv contendo a sequência marcadora FLAG, utilizaram-se um anticorpo monoclonal de ratinho anti-FLAG humana (M2, Kodak) e um anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase (Pierce) como anticorpos secundários e terciários, respectivamente. Em todos os casos, a imunorreactividade com o antigénio imobilizado foi detectada utilizando o substrato ABTS para peroxidase (Roche) e mediu-se a absorvância fotométrica a 405 nm.

Utilizou-se uma coluna de cromatografia Superdex 200 (Amersham Pharmacia) para analisar perfis de filtração em gel dos anticorpos purificados sob condições nativas utilizando cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC; Amersham Pharmacia). A imuno-histoquímica de diferentes secções de tecido criopreservadas foi realizada como descrito por Castellani et al.(22 1994) e foi realizado um gradiente de 4-18% de SDS-PAGE de acordo com Carnemolla et al. (17 1989) sob condições redutoras e não redutoras. 23 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Animais e linhas de células

Ratinhos nus atímicos (fêmeas CDl nu/nu de 8 semanas de idade) foram obtidos na Harlan italy (Correzzana, Milão, Itália), ratinhos da estirpe 129 (clone SvHsd) (fêmeas, 8-10 semanas de idade) foram obtidos na Harlan UK (Oxon, Inglaterra). Células de teratocarcinoma de embrião de ratinho (F9), células derivadas de melanoma humano (SK-MEL-28) e células de mieloma de ratinho (SP2/0) foram compradas na American Type Culture Collection (Rockville, MD) . Para induzir tumores, os ratinhos nus foram injectados subcutaneamente com ΙβχΙΟ6 células SK-MEL-28 e os ratinhos da estirpe 129 com 3χ106 células F9. O volume de tumor foi determinado com a fórmula seguinte: (d)2xDxO,52, onde d e D são, respectivamente, as dimensões curtas e longas (cm) do tumor, medidas com um calibrador. O alojamento, os tratamentos e o sacrifício de animais foram realizados de acordo com a legislação nacional (Lei Italiana n.° 116 de 27 de Janeiro de 1992) referente à protecção de animais utilizados para fins científicos.

Radioiodação de anticorpos recombinantes A radioiodação de proteínas foi conseguida seguindo o método indirecto de Chizzonite (36 Riske et al., 1991) utilizando tubos de iodação pré-revestidas IODO-GEN (Pierce) para activar Na125I (NEN Life Science Products, Boston, MA) de acordo com recomendações do fabricante. Nas experiências noticiadas, utilizou-se 1,0 mCi de Na125l para 0,5 mg de proteina. As moléculas radiomarcadas foram separadas do 125I livre utilizando colunas PD10 (Amersham Pharmacia) pré-tratadas como BSA a 0,25% e equilibradas em PBS. A radioactividade das amostras foi estabelecida utilizando um contador γ Crystal (Packard Instruments, Milão, Itália). O ensaio de imunorreactividade da proteina radiomarcada foi realizado numa coluna de ED-B Sepharose de 200 μΐ saturada com BSA a 0,25% em PBS. Uma quantidade conhecida de anticorpo radioiodado, em 200 μΐ de BSA a 0,25% em PBS, foi aplicada por cima e deixada entrar na coluna. Lavou-se depois a coluna com I, 5 ml de BSA a 0,25% em PBS para remover anticorpos não ligados especificamente. Finalmente, o material ligado

imunorreactivo foi eluido utilizando 1,5 ml de TEA 0,1 M, pH II. Contou-se a radioactividade de material não ligado e ligado e calculou-se a percentagem de anticorpos 24 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ imunorreactivos. A imunorreactividade foi sempre superior a 90%.

Para analisar adicionalmente os anticorpos radioiodados carregou-se uma quantidade conhecida de proteina radiomarcada em 200 pl numa coluna Superdex 200. O volume de retenção das diferentes proteínas não variou após radioiodação. Para os três formatos de anticorpo L19 radioiodados e seus controlos negativos, a recuperação de radioactividade a partir da coluna Superdex 200 foi 100% (Figure 3A, 3B e 3C).

Experiência de biodistribuição

Para bloquear a acumulaçao nao especifica de iodo no estômago e a concentração na tiróide, 30 minutos antes da injecção dos anticorpos radiomarcados os ratinhos receberam oralmente 20 mg de perclorato de sódio (Cario Erba, Itália) em água. Repetiu-se este procedimento com intervalos de 24 h durante a duração das experiências de biodistribuição. Injectaram-se os ratinhos portadores de tumor na veia caudal com 0,1 nmol dos diferentes anticorpos radiomarcados (correspondendo a 6 pg para scFv, 8 pg para SIP e 18 pg para IgG) em 100 pl de solução salina. Sacrificaram-se três animais por ponto temporal, os diferentes órgãos, incluindo o tumor, foram excisados, pesados, contados num contador γ e depois fixados com formaldeído a 5% em PBS, pH 7,4, para serem processados para micro-autorradiografias, realizadas de acordo com Tarli et al. (23 1999).

Colheram-se também amostras de sangue para preparação de plasma para determinar a estabilidade das moléculas radiomarcadas na corrente sanguínea utilizando o teste de imunorreactividade já descrito e a análise de filtração em gel. Em ambos os casos utilizaram-se 200 pl de plasma. O conteúdo radioactivo dos diferentes órgãos foi expresso como percentagem da dose injectada por grama (%iD/g). Os parâmetros de depuração sanguínea dos anticorpos radioiodados foram ajustados com um procedimento de minimização dos mínimos quadrados, utilizando o programa em Macintosh Kaleidagraph (Synergy Software, Reading PA, E.U.A.) e a equação: X(t) = A exp (-(alfa t)) + B exp (-(beta t)) onde X(t) é a %ID/g de anticorpo radiomarcado no instante t. Esta equação descreve um perfil de depuração sanguínea bi- 25 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ exponencial, no qual a amplitude da fase alfa é definida como A x 100 / (A + B) e a amplitude da fase de eliminação beta é definida como B χ 100 / (A + B). Alfa e beta são parâmetros de velocidade relacionados com as meias-vidas das fases de depuração sanguínea correspondentes. Tl/2 (fase alfa) = ln2/alfa = 0, 692.../alfa Tl/2 (fase beta) = ln2/alfa = 0, 692... /alfa. X(0) foi assumido ser igual a 40%, correspondendo a um volume de sangue de 2,5 ml em cada ratinho.

RESULTADOS

Preparação de anticorpos

Utilização das regiões variáveis de diferentes formatos (scFv, mini-imunoglobulina e IgGl humana completa) de anticorpo L19 (13 Pini et al., 1998) e seu desempenho in vivo no direccionamento para a vasculatura tumoral. A Figura 1 mostra as construções utilizadas para expressar os diferentes formatos de anticorpo L19. Prepararam-se construções similares utilizando as regiões variáveis do scFv específico para um antigénio não relevante (Dl.3; 7 McCafferty; 26 Neri et al., 1997).

Para obter SIP e IgGl, transfectaram-se células de mieloma murino SP2/0 com as construções apresentadas na Figura 1 e seleccionaram-se transfectomas estáveis utilizando G418. Determinaram-se os melhores produtores por ELISA e expandiram-se estes clones para purificação de anticorpo. A purificação de todos os três formatos de anticorpo L19 foi baseada em cromatografia de afinidade utilizando ED-B recombinante conjugado a Sepharose. Os rendimentos foram de cerca de 8 mg/1 para scFv(Ll9), 10 mg/1 para L19-SIP, 3 mg/1 para Ll9-IgGl. Para as proteínas de controlo utilizou-se scFv(Dl.3) específico para lisozima de ovo de galinha, e, utilizando as regiões variáveis de scFv Dl.3, construiu-se D1.3-SIP. Estes dois anticorpos foram purificados em lisozima de ovo de galinha conjugada a Sepharose. Os rendimentos foram de 8 e 5 mg/1, respectivamente. Como controlo para Ll9-igGl utilizámos IgGl/κ humana disponível comercialmente (Sigma).

Realizou-se a análise SDS-PAGE dos três formatos de L19 purificados, sob ambas as condições redutoras e não redutoras. Para scFv(Ll9), a massa aparente foi, como esperado, cerca de 26 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ 28 kDa sob ambas as condições redutoras e não redutoras (não mostrados). A L19-SIP mostrou uma massa molecular de quase 80 kDa sob condições não redutoras, e tinha uma massa de cerca de 40 kDa sob condições redutoras. Os resultados demonstraram que mais de 95% da molécula nativa existem como um dímero ligado covalentemente. O Ll9-IgGl mostrou, como esperado, uma banda principal de cerca de 180 kDa sob condições não redutoras, enquanto, sob condições redutoras, mostrou duas bandas correspondendo à cadeia pesada de cerca de 55 kDa e à cadeia leve de cerca de 28 kDa. Obtiveram-se perfis de eluição dos três formatos de anticorpo L19 analisados por cromatografia de exclusão de tamanhos (Superdex 200) . Em todos os três casos, foi detectado um único pico com uma distribuição normal, e representando mais de 98%. Utilizando uma curva de calibração padrão, as massas moleculares aparentes foram 60 kDa para scFv(L19)2, 80 kDa para L19-SIP e 180 kDa para Ll9-IgGl. Além disso, demonstrou-se que estavam ausentes agregados moleculares, que estão muitas vezes presentes em preparações de proteína recombinante e que podem invalidar os resultados obtidos em estudos in vivo. SDS-PAGE e cromatografia de exclusão de tamanhos (Superdex 200) realizados nas proteínas de controlo purificadas deram resultados similares.

Utilizando estes três diferentes formatos de anticorpo L19, realizaram-se análises imuno-histoquímicas em secções criopreservadas de melanoma humano SK-MEL-28 induzido em ratinhos nus e de teratocarcinoma murino F9 induzido em ratinhos da estirpe 129. Obtiveram-se resultados óptimos para concentrações tão baixas quanto 0,25-0,5 nM. Todos os três anticorpos L19 purificados reconheceram estruturas idênticas.

Estabilidade in vivo dos formatos de anticorpo LI 9 radi omarcados

Para estudos de biodistribuição in vivo, utilizaram-se melanoma humano SK-MEL-28 e teratocarcinoma murino F9. O tumor SK-MEL-28 tem uma velocidade de crescimento relativamente lenta enquanto o tumor F9 cresce rapidamente (Figura 2) . Por conseguinte, a utilização de tumor SK-MEL-28 permitiu experiências de longa duração (até 144 h), enquanto o tumor F9 foi induzido para estudos de biodistribuição curtos (até 48 h) . Todas as experiências de biodistribuição foram realizadas quando os tumores tinham aproximadamente 0,ΙΟ, 3 cm3. Para comparação dos vários formatos de anticorpo, 27 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ injectaram-se quantidades equimolares (0,1 nmol) em 100 μΐ de solução salina estéril. Antes da injecção, filtraram-se os compostos radioiodados a 0,22 pm e verificaram-se a imunorreactividade e o perfil de filtração em qel (ver Materiais e Métodos). A imunorreactividade das proteínas radiomarcadas foi sempre superior a 90%. A Figura 3 A-C apresenta os perfis da análise de filtração em gel (Superdex 200) dos formatos de anticorpo L19 radioiodados.

Colheram-se amostras de sangue de animais tratados a diferentes intervalos de tempo desde a injecção e analisou-se a radioactividade presente no plasma para a imunorreactividade e por cromatografia de filtração em gel. Os perfis de filtração em gel mostraram um único pico principal, possuindo a massa molecular da proteína injectada, para todos os três formatos de anticorpo L19. Apenas o perfil do scFv revelou um segundo pico possuindo uma massa molecular superior, sugerindo a formação de agregados (Figura 3 D-F). Além disso, para scFv(L19)2, observou-se a formação de agregados de grande massa molecular que não foram eluídos da coluna Superdex 200. De facto, enquanto a recuperação a partir da coluna Superdex 200 foi de 90-100% da radioactividade aplicada tanto para L19-SIP como para Ll9-IgG, o rendimento da radioactividade carregada de scFv(Ll9)2 foi cerca de 55%. A radioactividade retida apenas foi recuperada após lavagem da coluna de cromatografia com NaOH 0,5 M, demonstrando que grandes agregados foram bloqueados no filtro da coluna (Tabela 1). A Tabela 1 relata também os resultados do teste de imunorreactividade realizado no plasma (ver Materiais e Métodos). Durante o período das experiências, L19-SIP e L19-igGl mantiveram a mesma imunorreactividade no plasma como os reagentes de partida. Pelo contrário, já 3 horas após injecção, a imunorreactividade de scFv(L19)2 no plasma foi reduzida para menos de 40%.

Experiências de biodistribuição comparativa

As Tabelas 2 a, b, c e a Figura 4 relatam os resultados obtidos nas experiências de biodistribuição com os anticorpos L19 radiomarcados em ratinhos portadores de tumor SK-MEL-28. 28 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

As Tabelas 2 a, b, c mostram, para diferentes tempos desde a injecção i.v. dos anticorpos radiomarcados, a média (±DP) da %ID/g de tecidos e órgãos, incluindo tumores.

Na Figura 4 são ilustradas as variações da %iD/g dos diferentes formatos de anticorpo em tumor (A) e sangue (B) para os diferentes tempos das experiências, bem como as razões (C) entre a %lD/g em tumor e sangue. Todos os três formatos de anticorpo L19 acumularam-se selectivamente no tumor e a razão da %ID/g de tumor e outros órgãos são reportados na Tabela 3.

Como demonstrado por micro-autorradiografia, os anticorpos acumulam-se apenas na vasculatura tumoral, enquanto não se observou qualquer acumulação especifica na vasculatura de órgãos normais. Por contraste, não se observou qualquer acumulação especifica das moléculas de controlo radioiodadas quer em tumores quer em tecidos normais (Tabelas 2 a, b, c).

Todos os três formatos de anticorpo L19 mostraram uma depuração que era mediada principalmente pelo rim, como determinado por contagem das amostras de urina. Como esperado, a taxa de depuração foi mais rápida para scFv(L19)2 e mais lenta para a Ll9-IgGl completa. 0 ajustamento da curva com uma função bi-exponencial produziu os valores de meia-vida reportados na Tabela 4. A Figura 5 ilustra as variações na %lD/g (±DP) de tumor e sangue obtidas com os scFv(L19)2 e L19-SIP radioiodados utilizando o modelo de tumor de teratocarcinoma F9. Devido à elevada actividade angiogénica do teratocarcinoma F9, a acumulação de moléculas radioactivas neste tumor foi 3 a 4 vezes mais elevada, 3 e 6 h após injecção i.v., do que no tumor SK-MEL-28 e foi persistentemente mais elevada durante as 48 h de duração da experiência. Tal como para o tumor SK-MEL-28, a acumulação especifica na vasculatura tumoral foi confirmada por micro-autorradiografia, enquanto não se observou qualquer acumulação especifica no tumor após injecção das moléculas de controlo. Na Tabela 5 são reportadas as %lD/g de Ll9(scFv) e L19-SIP, para diferentes tempos após injecção i.v., em tumores F9 e outros órgãos. Síntese de L19-SIP reduzido A uma solução de 375 pg (5 nmol) de L19-SIP em 422 μΐ de PBS adicionaram-se 50 μΐ de solução TCEP (14,34 mg de 29 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ TCEP.HC1/5 ml de Na2HP04 aquoso, 0,1 M, pH = 7,4). Agitou-se suavemente a mistura reaccional durante lha 37°C. Purificou-se o L19-SIP reduzido por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). A análise SDS-PAGE do produto isolado provou a transformação quantitativa de L19-SIP em L19-SIP reduzido.

Rendimento: 100,3 pg/200 μΐ de PBS (26,7%).

Síntese de Tc-99m-Ll9-SIP

Colocaram-se 3,0 mg de L-tartarato dissódico num frasco seguindo-se a adição de 100,3 pg de L19-SIP reduzido em 200 μΐ de PBS e diluiu-se a solução com 100 μΐ de tampão de Na2HPC>4 aquoso (1 M, pH = 10,5). Adicionaram-se 85 μΐ de eluído de gerador Tc-99m (24 h) e 10 μΐ de solução de SnCl2 (5 mg de SnCl2/l ml de HC1 0,1 M) . Agitou-se a mistura reaccional durante 0,5 ha 37°C. Purificou-se o L19-SIP marcado com Tc-99m por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). 35, 6% 90,2% (SDS-PAGE) 26,4 MBq/nmol 91,4%

Rendimento radioquimico: Pureza radioquimica: Actividade especifica: Imunorreactividade:

Síntese de carboximetil-t-butildissulfureto de Tc-99m-MAG2~ L19-SIP

Aqueceu-se uma solução de 21,75 ml (0,312 mol) de ácido 1-mercapto-acético, 43,5 ml (0,312 mol) de trietilamina e 100 g (0,312 mol) de N-(terc-butiltio)-N,N'-di-BOC-hidrazina em 1 litro de EtOH (abs.) sob refluxo (atmosfera de N2) durante 60 h. Evaporou-se o EtOH sob pressão reduzida até um volume final de cerca de 200 ml. Verteu-se o residuo em 1,8 litros de H20 e ajustou-se o pH da suspensão resultante a 7,14 utilizando NaOH 5 molar. Removeu-se por filtração a di-BOC-hidrazina e ajustou-se o pH da solução resultante a 2,2 utilizando HC1 meio concentrado. Extraiu-se o material em bruto a partir da fase aquosa 3x com 600 ml de CH2C12. Secaram-se os extractos orgânicos combinados sobre MgS04 e evaporou-se o solvente sob pressão reduzida produzindo 41,1 g 30 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ (80%) como um óleo amarelo. O material era puro o suficiente para a sintese posterior. Éster de t-butilo de N- (benziloxicarbonil-Gly) Gly (Éster de t-butilo de Z-(N-Gly)Gly)

Agitou-se uma solução de 35,02 g (114 mmol) de Z-Gly-O-succinimida e 15 g (114 mmol) de Gly-0-tBu em 1,4 litros de CH2C12 sob uma atmosfera de N2 à temperatura ambiente durante 20 h. Lavou-se a fase orgânica 3x com 250 ml de ácido cítrico aquoso a 1%, 2x com 200 ml de NaHCCb aquoso semi-saturado e lx com 200 ml de água. Secou-se a fase orgânica sobre MgS04 anidro. A evaporação de CH2C12 sob pressão reduzida produziu 36,5 g (99%) de Z-Gly-Gly-0-tBu como um óleo amarelo. O material em bruto era puro o suficiente para a síntese posterior. Éster de t-butilo de Gly-Gly

Dissolveram-se 36,5 g (113 mmol) de Z-Gly-Gly-OtBu em 1 litro de THF seguindo-se a adição de 3,65 g de paládio sobre carbono (10%). Agitou-se a mistura sob atmosfera de H2 (1 atm) durante 3 h à temperatura ambiente. Purgou-se a suspensão com N2, filtrou-se (filtro de PTFE: 0,45 pm) e concentrou-se o filtrado sob pressão reduzida produzindo 20,3 g (95%) de Gly-Gly-0-tBu como um óleo amarelo. O material em bruto era puro o suficiente para a síntese posterior. Éster de t-butilo de carboximetil-t-butildissulfureto de glicilglicina

Adicionou-se uma solução de 23,85 g (115,6 mmol) de DCC em 430 ml de CH2C12 gota a gota a uma solução de 21,76 g (115,6 mmol) de Gly-Gly-0-tBu, 20,84 g (115,6 mmol) de carboximetil-t-butildissulfureto e 13,3 g (115,6 mmol) de NHS em 1 litro de CH2C12. Agitou-se a suspensão resultante de um dia para o outro sob atmosfera de N2 à temperatura ambiente. Após filtração, lavou-se a solução resultante 3χ com 400 ml de NaHC03 aquoso semi-saturado e lx com 400 ml de água. Evaporou-se a fase orgânica seca (MgS04) sob pressão reduzida. Purificou-se o produto em bruto por cromatografia em sílica gel utilizando um gradiente de solvente variando de CH2Cl2/MeOH 99:1 a CH2Cl2/MeOH 98,5:1,5. Isolaram-se 26,1 g (64%) como um óleo amarelo. 31 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Mercaptoacetilglicilglicina

Dissolveram-se 26,32 g (75,09 mmol) de éster de t-butilo de carboximetil-t-butildissulfureto de glicilglicina em 233 ml de TFA sob atmosfera de N2. Agitou-se a solução resultante durante 20 min à temperatura ambiente. Evaporou-se o TFA sob pressão reduzida (5-10xl0~2 mbar) e secou-se o óleo resultante sob agitação durante 2 h adicionais (5-1χ10~2 mbar). Após adição de 250 ml de Et20 precipitou um pó branco e agitou-se a suspensão durante 3 h. Removeu-se o material por filtração e ressuspendeu-se em 100 ml de Et20. Agitou-se a suspensão resultante de um dia para o outro, removeu-se o produto por filtração e secou-se o material à temperatura ambiente sob pressão reduzida produzindo 20,46 g (92,5%) como um pó branco. Éster de NHS de mercaptoacetilglicilglicina

Combinaram-se mercaptoacetilglicilglicina (1 g, 3,4 mmol) e N-hidroxissuccinimida (391 mg, 3,4 mmol) num balão de fundo redondo seco e dissolveram-se em DMF anidra (4 ml). Adicionou-se DCC (700 mg, 3,4 mmol) em dioxano anidro (2 ml) enquanto se agitava a mistura reaccional. Em 15 min começou a formar-se um precipitado (DCU). Após 1 h removeu-se o precipitado por filtração de vácuo. Lavou-se o precipitado com dioxano frio. Removeu-se o dioxano do filtrado. O produto foi precipitado a partir da solução de DMF restante por adição de dietiléter. Isolou-se o produto por filtração, lavou-se com dietiléter frio e secou-se num exsicador de vácuo de um dia para o outro. Rendimento: 1,33 (99%).

Síntese de Tc-99m-MAG2-e -HN (Lys) -Ll 9-SIP

Diluiram-se 200 pg (2,66 nmol) de L19-SIP não reduzido em 111 μΐ de PBS com 300 μΐ de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) e dialisaram-se 2 χ 1 h com 200 ml de tampão de fosfato (0,1 M, pH 8,5) utilizando uma Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, E.U.A.). Adicionaram-se 50 μΐ de solução de éster de NHS de mercaptoacetilglicilglicina (0,50 mg dissolvidos em 500 μΐ de tampão de fosfato, 0,1 M, pH 8,5) e aqueceu-se a mistura reaccional durante 3 h a 37°C. Dialisou-se a mistura reaccional 2xlhelxl7h (de um dia para o outro) com 200 ml de tampão de fosfato (0,1 M, pH 8,5) de cada vez, utilizando uma Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, E.U.A.). Adicionaram-se ao frasco 3,0 mg de L-tartarato dissódico seguidos da adição de 90 μΐ de eluído de 32 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ gerador Tc-99m (eluído diariamente) e 25 μΐ de solução de SnCl2 (5 mg de SnCl2/l ml HC1 0,1 M) . Agitou-se a mistura reaccional durante 0,5 h a 37°C. Purificou-se o L19-SIP marcado com Tc-99m por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). 55,1% 94,5 % (SDS-PAGE) 15,2 MBq/nmol 81,1%

Rendimento radioquimico: Pureza radioquimica: Actividade especifica: Imunorreactividade:

Síntese de Re-188-L19-SIP

Colocaram-se 3,0 mg de L-tartarato dissódico num frasco seguindo-se a adição de 150 pg de L19-SIP-SH reduzido em 310 μΐ de PBS e diluiu-se a solução com 100 μΐ de tampão de Na2HP04 aquoso (1 M, pH = 10,5). Adicionaram-se 100 μΐ de eluído de gerador Re-188 e 50 μΐ de solução de SnCl2 (5 mg SnCl2/l ml HC1 0,1 M) . Agitou-se a mistura reaccional durante 1,5 h a 37°C. Purificou-se o L19-SIP marcado com Re-188 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). 34,8% 97,2% (SDS-PAGE) 13,5 MBq/nmol 91, 7%

Rendimento radioquimico: Pureza radioquimica: Actividade específica: Imunorreactividade: Síntese de L19-SIP reduzido para conjugação específica de EDTA, CDTA, TETA, DTPA, TTHA, HBED, DOTA, NOTA, D03A e de quelantes de tipo similar ao grupo SH de cisteína

Adicionaram-se 50 μΐ de solução de TCEP (14,34 mg de TCEP.HC1/5 ml de Na2HP04 aquoso, 0,1 M, pH = 7,4) a uma solução de 375 pg (5 nmol) de L19-SIP em 422 μΐ de PBS. Agitou-se suavemente a mistura reaccional durante lha 37°C. Purificou-se o L19-SIP reduzido por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: tampão de acetato de sódio, 0,1 M, pH 5,0). A análise SDS-PAGE do produto isolado provou a transformação quantitativa de L19-SIP em L19-SIP reduzido. Rendimento: 105,7 pg/200 μΐ (28,2%). 33 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ Síntese de ln-lll-MX-DTPA-Maleimida-S(Cys)-Ll9-SlP-R (R = reduzido)

Fizeram-se reagir 105 pg (2,8 nmol) de L19-SIP reduzido em 200 μΐ de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 5) com 50 μΐ 1,4,7-triaza-2-(N-maleimido-etileno-p-amino)benzil-1,7-bis(carboximetil)-4-carboximetil-6-metil-heptano dissolvido (0,25 mg de DTPA-maleimida em 500 μΐ de tampão de acetato de sódio 0,1 M, pH 5) durante 3 h a 37°C. Dialisou-se a mistura reaccional 2 χ 1 h com 200 ml de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 6) utilizando uma Slide-A-Lyzer MWCO 10000 (Pierce Inc., Rockford, IL, E.U.A.). Adicionaram-se 80 μΐ de solução de [In-111]lnCl3 (HC1, 1 N, 40 MBq, Amersham Inc.) e aqueceu-se a mistura reaccional a 37°C durante 30 min.

Purificou-se o DTPA-Maleimida-S(Cys)-L19-SIP marcado com in-111 por cromatografia em gel utilizando uma coluna nap-5 (Amersham, Eluente: PBS). 51, 6% 97,2% (SDS-PAGE) 7,9 MBq/nmol 88, 5%

Rendimento radioquimico: Pureza radioquimica: Actividade especifica: Imunorreactividade: Síntese de MX-DTPA-Maleimida (1,4,7-triaza-2- (N-maleimido-etileno-p-amino) benzil-1, 7-bis(carboximetil)-4-carboximetil-6-metil-heptano)

Dissolveram-se 512 mg (1 mmol) de ácido {[3—(4— aminofenil)-2- (bis-carboximetilamino)propil]-[2-(bis-carboxi-metilamino)propil]aminojacético (Macrocyclics Inc. Dallas, TX, E.U.A.) e 707 mg (7 mmol) de trietilamina em 3 ml de DMF seca. Adicionaram-se gota a gota 400 mg (1,5 mmol) de éster de 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo de ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidropirrol-l-il)propiónico (Aldrich) em 1 ml de DMF seca. Agitou-se a solução durante 5 h a 50°C. Adicionaram-se lentamente 30 ml de dietiléter. Agitou-se a mistura reaccional durante mais 30 min. Recolheu-se o precipitado por filtração. Purificou-se o produto em bruto por RP-HPLC (acetonitrilo: águarácido trif luoroacético/3 : 96,9 : 0,1 -> 99,9:0:0,1).

Rendimento: 61% (405 mg, 0,61 mmol). MS-ESI: 664 = M++l. 34 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Síntese de Ιη-111-MX-DTPA-ε-ΗΝ(Lys)-Ll9-SIP

Diluíram-se 200 pg (2,66 nmol) de L19-SIP não reduzido em 111 μΐ de PBS com 300 μΐ de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) e dialisou-se 2 χ 1 h com 200 ml de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8.5) utilizando uma Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, E.U.A.). Adicionaram-se 50 μΐ de solução de 1,4,7-triaza-2-(p-isotiocianato)benzil-1,7-bis(carboximetil)-4-carboximetil-6-metil-heptano (MX-DTPA) (0,33 mg de MX-DTPA dissolvidos em 500 μΐ de tampão de borato de sódio, 0,1 M, pH 8,5) e aqueceu-se a mistura reaccional durante 3 h a 37°C. Dialisou-se a mistura reaccional 2 χ 1 h e 1 χ 17 h (de um dia para o outro) com 200 ml de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 6,0) de cada vez, utilizando a Slide-A-Lyzer MWCO 10000 (Pierce Inc., Rockford, IL, E.U.A.).

Adicionaram-se 80 μΐ de solução de [In-111]InCl3 (HC1, 1 N, 40 MBq, Amersham Inc.) e aqueceu-se a mistura reaccional a 37°C durante 30 min. Purificou-se o MX-DTPA-ε-ΗΝ(Lys)-L19-SIP marcado com In-111 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). 72, 4% 80,3% (SDS-PAGE) 8,8 MBq/nmol 77, 5%

Rendimento radioquímico: Pureza radioquímica: Actividade específica: Imunorreactividade:

Síntese de In-lll-DOTA-C-benzíl-p-NCS-s-HN(Lys)-L19-SIP

Diluíram-se 200 pg (2,66 nmol) de L19-SIP não reduzido em 108 μΐ de PBS com 300 μΐ de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) e dialisou-se 2 χ 1 h com 200 ml de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) utilizando uma Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, E.U.A.). Adicionaram-se 50 μΐ de solução de ácido 1, 4, 7,10-tetra-aza-2-(p-isotiocianato)benzilciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (benzil-p-SCN-DOTA, Macrocyclics Inc., Dallas TX, E.U.A.) (1,5 mg de benzil-p-SCN-DOTA dissolvidos em 5 ml de tampão de borato de sódio, 0,1 M, pH 8,5) à solução e aqueceu-se a mistura reaccional durante 3 h a 37°C. Dialisou-se a mistura reaccional 2xlhelxl7h (de um dia para o outro) com 200 ml de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 6,0) de cada vez, utilizando a Slide-A-Lyzer MWCO 10000 (Pierce Inc., Rockford, IL, E.U.A.). 35 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Adicionaram-se 80 μΐ de solução de [ln-111]InCl3 (HC1, 1 N, 40 MBq, Amersham Inc.) e aqueceu-se a mistura reaccional a 37°C durante 30 min. Purificou-se o DOTA-C-benzil-p-NCS-ε-hn(Lys)-L19-SIP marcado com ln-111 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). 70,8% 92,1% (SDS-PAGE) 10,1 MBq/nmol 75, 1%

Rendimento radioquímico Pureza radioquimica: Actividade específica: imunorreactividade:

Síntese de Υ-88-MX-DTPA-s-HN(Lys)-L19-SIP

Diluíram-se 200 pg (2,66 nmol) de L19-SIP não reduzido em 110 μΐ de PBS com 300 μΐ de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) e dialisou-se 2 χ 1 h com 200 ml de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) utilizando uma Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, E.U.A.). Adicionaram-se 50 μΐ de solução de MX-DTPA (0,33 mg de MX-DTPA dissolvidos em 500 μΐ de tampão de borato de sódio, 0,1 M, pH 8,5) e aqueceu-se a mistura reaccional durante 3 h a 37°C. Dialisou-se a mistura reaccional 2xlhelxl7h (de um dia para o outro) com 200 ml de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 6,0) de cada vez, utilizando a Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, E.U.A.).

Adicionaram-se 100 μΐ de solução de [Y-88]YC13 (HC1, 1 N, 75 MBq, Oak Ridge National Lab.) e aqueceu-se a mistura reaccional a 37°C durante 30 min. Purificou-se o MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP marcado com Y-88 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). 68,1% 91,5% (SDS-PAGE) 11,4 MBq/nmol 70, 5%

Rendimento radioquímico: Pureza radioquimica: Actividade específica: Imunorreactividade:

Síntese de Lu-177-DOTA-C-benzil-p-NCS-z-HN(Lys)-Ll 9-SIP

Dissolveram-se 200 pg (2,66 nmol) de L19-SIP não reduzido em 120 μΐ de PBS com 300 μΐ de tampão de borato de sódio (0,1 M, pH 8,5) e dialisou-se 2 χ 1 h com 200 ml de tampão de 36 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ borato de sódio (0,1 Μ, pH 8,5) utilizando uma Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, E.U.A.). Adicionaram-se 50 μΐ de solução de benzil-p-SCN-DOTA (1,5 mg dissolvidos em 5 ml de tampão de borato de sódio, 0,1 M, pH 8,5) e aqueceu-se a mistura reaccional durante 3 h a 37°C. Dialisou-se a mistura reaccional 2xlhelxl7h (de um dia para o outro) com 200 ml de tampão de acetato de sódio (0,1 M, pH 6,0) de cada vez, utilizando a Slide-A-Lyzer MWCO 10 000 (Pierce Inc., Rockford, IL, E.U.A.).

Adicionaram-se 200 μΐ de solução de [Lu-177]LuC13 (HC1, 1 N, 80 MBq, NRH-Petten, Holanda) e aqueceu-se a mistura reaccional a 37°C durante 30 min. Purificou-se o DOTA-C-benzil-p-NCS-ε-ΗΝ(Lys)-L19-SIP marcado com Lu-177 por cromatografia em gel utilizando uma coluna NAP-5 (Amersham, Eluente: PBS). 72,2% 94,9% (SDS-PAGE) 18,3 MBq/nmol 73, 4%

Rendimento radioquimico: Pureza radioquimica: Actividade especifica: Imunorreactividade:

Distribuição em órgãos e excreção de In-lll-MX-DTPA-Ll9-SIP após uma única injecção i.v. em ratinhos nus portadores de tumor

Injectaram-se os péptidos marcados do invento intravenosamente numa dose de cerca de 3 7 kBq em animais portadores de F9 (teratocarcinoma) (peso corporal cerca de 25 g) . Mediu-se a concentração de radioactividade em vários órgãos, e a radioactividade nas excreções, utilizando um contador γ para vários tempos após administração da substância. A biodistribuição de In-lll-MX-DTPA-Ll9-SIP em ratinhos nus portadores de F9 (teratocarcinoma) (média ± DP, n=3) é apresentada na Tabela 6.

Distribuição em órgãos e excreção de Tc-99m-Ll9-SlP após uma única injecção i.v. em ratinhos nus portadores de tumor

Injectaram-se os péptidos marcados do invento intravenosamente numa dose de cerca de 56 kBq em animais 37 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ portadores de F9 (teratocarcinoma) (peso corporal cerca de 25 g) . Mediu-se a concentração de radioactividade em vários órgãos, e a radioactividade nas excreções, utilizando um contador γ para vários tempos após administração da substância. Para além disso, determinou-se a razão tumor para sangue para vários tempos com base na concentração do péptido no tumor e no sangue. A biodistribuição de Tc-99m-Ll9-SIP em ratinhos nus portadores de F9 (teratocarcinoma) (média ± DP, n=3) é apresentada na Tabela 7. A razão tumor para sangue de Tc-99m-Ll9-SlP em ratinhos nus portadores de F9 (teratocarcinoma) (média ± DP, n=3) é apresentada na Tabela 8.

Os péptidos radiomarcados provaram possuir propriedades favoráveis em experiências com animais. Por exemplo, Tc-99m-L19-SIP e In-lll-MX-DTPA-ε-ΗΝ(Lys)-L19-SIP exibiram elevada acumulação no tumor de 17,2% (Tc-99m) ou 12,9% (ln-111) da dose injectada por grama (ID/g) 1 hora pós-injecção (p.i.). Observou-se uma retenção significativa no tumor de 9,4% (Tc-99m) ou 13,0% (ln-111) da ID/g às 24 horas p.i.. Assim, a absorção pelo tumor é significativamente mais elevada em comparação com outros fragmentos de anticorpo marcados com ln-111 ou Tc-99m (e.g. Kobayashi et al., J. Nuc. Med., Vol. 41(4), págs. 755-762, 2000; Verhaar et al., J. Nuc. Med., vol. 37(5), págs. 868-872, 1996). A depuração sanguínea dos compostos conduziu a razões tumor/sangue de 13:1 e 6:1, respectivamente, às 24 h p.i.

Muito notavelmente, In-lll-MX-DTPA-ε-ΗΝ(Lys)-L19-SIP exibiu absorção e retenção pelo rim (22,5% ID/g) significativamente inferior a outros fragmentos de anticorpo recombinante marcados com ln-111 altamente retidos (120% ID/g) descritos por e.g. Kobayashi et al. às 24 h p.i.. A retenção pelo rim é um problema muito comum e usualmente impede a utilização de compostos marcados com lantanídeos em radioterapia.

Os resultados experimentais demonstram o excelente potencial dos radioimunoconjugados aqui descritos para aplicações de diagnóstico e terapêuticas, preferivelmente aplicados ao paciente por administração parentérica. 38 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

DISCUSSÃO A observação de que fármacos anticancerosos citotóxicos se localizam mais eficientemente em tecidos normais do que em tumores (37 Bosslet et al., 1998) desencadeou uma onda de estudos investiqando a possibilidade de entreqa selectiva de fármacos a tumores. 0 direccionamento eficaz para tumores, porém, tem dois requisitos principais: 1) um alvo no tumor que seja especifico, abundante, estável e prontamente disponível para as moléculas de ligando provenientes da corrente sanguínea, e 2) uma molécula de ligando com propriedades farmacocinéticas adequadas que seja facilmente difundível a partir da corrente sanguínea para o tumor e com uma elevada afinidade pelo alvo para assegurar a sua acumulação eficiente e selectiva no tumor.

Devido às suas particularidades distintivas, o microambiente tumoral é um alvo pan-tumoral possível. De facto, a progressão do tumor induz (e subsequentemente necessita) de modificações significativas em componentes do microambiente do tumor, particularmente os componentes da matriz extracelular (ECM). As moléculas que constituem a ECM de tumores sólidos diferem tanto quantitativamente como qualitativamente das da ECM normal. Para além disso, muitos destes componentes de ECM de tumor são partilhados por todos os tumores sólidos, contribuindo para propriedades gerais e funções tais como invasão celular (tanto de células normais em tecidos de tumor como de células de cancro em tecidos normais) e angiogénese. Das moléculas que constituem a ECM de tumor modificada, os presentes inventores concentraram a atenção numa isoforma de FN contendo o domínio ED-B (B-FN). A b-fn é amplamente expressa na ECM de todos os tumores sólidos até agora testados e está constantemente associada a processos angiogénicos (22 Castellani et al., 1994) mas, pelo contrário, não é detectável em tecidos adultos normais (17 Carnemolla et al., 1989). A entrega direccionada de agentes terapêuticos na ECM subendotelial permite ultrapassar problemas associados à hipertensão intersticial de tumores sólidos (38 Jain et al. 1988; 39 Jain, 1997; 40 Jain RK, 1999) . O L19 (13 Pini et al. 1998; 25 Viti, Canc. Res., 23 Tarli, et al., 1999), um scFv com uma elevada afinidade (Kd = 5,4χ10~η M) pelo domínio ED-B de FN, acumula-se selectivamente 39 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ e eficientemente ίη vivo à volta da neovasculatura do tumor e é capaz de transportar selectivamente e de concentrar na massa de tumor qualquer uma de várias moléculas terapêuticas com as quais está conjugado (28 Birchler et al.r 1999; 29 Nilsson, et al., 2001; 30 Halin et al. 2002; 31 Carnemolla et ai., 2002). A capacidade de L19 para visar selectivamente tumores foi também demonstrada em pacientes utilizando técnicas cintigráficas. O presente fascículo refere-se ao desempenho no direccionamento para a vasculatura tumoral e à farmacocinética de três diferentes formatos de anticorpo L19 humano: o scFv, a mini-imunoglobulina/imunoproteina pequena (SIP) e IgGl humana completa. A molécula SIP foi obtida por fusão do scFv(Ll9) com o dominio tCH4 da isoforma secretora S2 de IgE humana. O sCH4 é o dominio que permite a dimerização de moléculas de IgE e a isoforma S2 contém uma cisteina no terminal COOH que estabiliza covalentemente o dimero através de uma ligação dissulfureto intercadeia (35 Batista et al., 1996). Os locais de ligação de IgE para FcsRl residem no dominio CH3 (41 Turner e Kinet, 1999; 42 Vangelista et al., 1999; 43 Garman et al., 2000), pelo que scFv fundido com o dominio sCH4 de acordo com concretizações do presente invento não activa qualquer sinalização conducente a reacções de hipersensibilidade.

Estudou-se o desempenho destes três formatos em dois modelos de tumor diferentes em ratinho: em teratocarcinoma F9 murino e em melanoma SK-MEL-28 humano. O primeiro é um tumor de crescimento rápido que, uma vez implantado, mata os animais em cerca de duas semanas. O tumor SK-MEL-28, por outro lado, apresenta uma curva de crescimento bifásica, com uma fase de crescimento inicial, rápida, seguida por uma segunda fase, mais lenta. Foi anteriormente mostrado que a quantidade de ED-B no teratocarcinoma F9 permanece estável durante o crescimento do tumor (23 Tarli, et al., 1999); por contraste, o ED-B acumula-se no melanoma SK-MEL-28 proporcionalmente à capacidade do tumor para crescer (23 Tarli et al., 1999), encontrando-se ED-B abundante na primeira fase e uma menor quantidade na segunda. A utilização de tumor de melanoma SK-MEL-28 permitiu estudos de biodistribuição de longo prazo sem variações dramáticas de massa tumoral (Figura 2) que podiam dar origem a interpretação errada de resultados. 40 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Estudos comparativos dos três formatos de anticorpo L19 em termos de estabilidade in vivo mostraram que L19-SIP e L19-IgGl mantiveram, durante a duração das experiências (144 h), a mesma imunorreactividade e massa molecular no plasma como antes da injecção. Por contraste, o scFv(L19) perdeu rapidamente a sua imunorreactividade no plasma e gerou agregados que eram demasiado grandes para entrar na coluna de cromatografia de filtração em gel. Esta agregação do scFv é muito provavelmente responsável pela razão entre as %lD/g de tumor e pulmão, uma vez que os agregados se podiam acumular na microvasculatura do pulmão (Tabela 3) . Para todos os três formatos, a depuração sanguínea é mediada principalmente através do rim, mostrando uma curva bifásica com uma fase α e uma fase β, reportadas na Tabela 4, que é inversamente proporcional ao tamanho molecular. A acumulação dos diferentes formatos de anticorpo nos tumores estudados era uma consequência da taxa de depuração e da estabilidade in vivo das moléculas. Utilizando o scFv, observou-se a percentagem máxima da dose injectada por grama (%ID/g) 3 h após injecção do anticorpo radiomarcado e depois diminuiu rapidamente. Utilizando o SIP, a %ID/g nos tumores foi 2-5 vezes mais elevada do que a do scFv, atingindo um máximo 4-6 horas após injecção. Este padrão foi observado em ambos os tumores F9 e SK-MEL-28. Por contraste, a acumulação de IgGl em tumores aumentou constantemente durante as experiências. Contudo, devido à sua depuração lenta, a razão tumor-sangue da %ID/g após 144 horas era apenas cerca de 3, em comparação com uma razão de 10 para o scFv e 70 para o SIP após o mesmo período de tempo (Figura 4).

As mesmas propriedades distintivas de estabilidade in vivo, depuração e desempenho no direccionamento para o tumor exibidas pelos três formatos de anticorpo aqui estudados podem ser exploradas para diferentes fins de diagnóstico e/ou terapêuticos, dependendo das necessidades clínicas e da doença. Por exemplo, anticorpos radiomarcados exibindo boas razões tumor-órgão e tumor-sangue logo após a injecção são necessários para imunocintigrafia de diagnóstico in vivo, principalmente porque se utilizam nesta análise isótopos de meia-vida curta. São possíveis diferentes abordagens utilizando um anticorpo como veículo para agentes terapêuticos: entrega de substâncias que exibem os seus efeitos terapêuticos após 41 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ atingirem os seus alvos (e.g., fotossensibilizadores apenas activados sobre os alvos), para as quais a quantidade absoluta entregue ao tumor é relevante; entrega de substâncias que exercem os seus efeitos terapêuticos e tóxicos ainda antes de atingirem o alvo (e.g., o emissor β ítrio-90), para as quais tem de ser dada atenção à razão das áreas sob as curvas de acumulação no tumor e no sangue em função do tempo, de modo a minimizar a toxicidade sistémica e para maximizar o efeito terapêutico antitumoral. 0 L19-SIP, por exemplo, parece oferecer o melhor compromisso de estabilidade molecular, taxa de depuração e acumulação no tumor. Já foram anteriormente descritas proteínas de fusão similares compostas de fragmentos de anticorpo scFv ligados a um domínio de dimerização (44 Hu et al., 1996; 33 Li et al., 1997), mas em ambos os casos utilizou-se ο γ10Η3 humano como domínio de dimerização. A utilização do domínio sS2CH4 humano proporciona um modo fácil de se obter uma estabilização covalente do dímero. Adicionalmente, a ponte dissulfureto formada pelos resíduos cisteína C-terminais pode ser facilmente reduzida em condições moderadas o suficiente para preservar a estrutura global da molécula, proporcionando assim um grupo reactivo facilmente acessível para radiomarcação ou conjugação química. Esta particularidade parece particularmente promissora em termos de potencial clínico. A Ll9-IgGl acumula-se abundantemente em tumores e, ainda que esta acumulação seja compensada por uma taxa de depuração sanguínea lenta, pode-se utilizar o procedimento em três passos para remover anticorpos em circulação para permitir a sua utilização não apenas para fins terapêuticos mas também para imunocintigrafia de diagnóstico (45 Magnani et al. 2000).

REFERÊNCIAS 1. Shawler et al. J. Immunol., 135: 1530-1535, 1985 2. Miller et al. Blood, 62: 988-995 , 1983. 3. Hakimi et al. J. Immunol., 147: 1352-1359,1991. 4 . Stephens et al . Immunology, 85: 668-674, 1995. 5. Riechmann et al. Nature, 332: 323-327, 1988. 42 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ 6. Junghans et al. Câncer Res., 50: 1495-1502, 1990. 7. McCafferty et al. Nature, 348: 552-554, 1990. 8. Lowman et al. Biochemistry, 30: 10832-10838, 1991 9. Nilsonn et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 43: 165-196 2000. 10. Winter et al. Annu.Rev.Immunol., 12: 433-455, 1994. 11. Reichert, Nature Biotech., 19: 819-822, 2001. 12. Huls et al. Nature Biotech., 17: 276-281, 1999, 13. Pini et al. J Biol Chem, 273: 21769-21776, 1998. 14. Neri and Zardi. Advanced Drug Delivery Reviews, 31: 43-52 1998. 15. Bissel and Radisky. Nature Reviews - Câncer., 1: 46-54 2001 16. Balza et al. FEBS Lett., 228: 42-44, 1988 17. Carnemolla et al. J. Cell. Biol., 108: 1139-1148, 1989 18. Borsi et al. FEBS Lett., 261: 175-178, 1990 19. Borsi et al. J. Biol.Chem., 270: 6243-6245, 1995. 20. Zardi et al. EMBO J., 6: 2337-2342, 1987. 21. ffrench-Constant et al. J.Cell Biol., 109: 903-914, 1989. 22. Castellani et al. Int J Câncer, 59: 612-618, 1994 23. Tarli et al. Blood, 94:192-198, 1999. 24. Carnemolla et al. Int J Câncer, 68: 397-405, 1996 25. Viti et al. Câncer Res, 59: 347-353, 1999. 26. Neri et al. Nature Biotechnol, 15: 1271-1275, 1997. 27. Demartis et al. Eur J Nucl Med, 28: 4534-4539, 2001. 28. Birchler et al. Nat Biotechnol, 17: 984-988, 1999 29. Nilsson et al. Câncer Res., 61: 711-716, 2001. 43 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ 30. Halin et al. Nature Biotechnol. In the press, 2002. 31. Carnemolla et al. Blood , 99 :, 2002 32. Wu et al. Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 97: 8495-8500, 2000. 33. Li et al. Protein Engineering, 10: 731-736, 1997 34. Pini et al. J. Immunol. Methods, 206: 171-183, 1997. 35. Batista et al. J. Exp. Med., 184: 2197-205, 1996. 36. Riske et al. J.Biol. Chem., 266: 11245-11251, 1991. 37. Bosslet et al. Câncer Res., 58:1195-1201, 1998. 38. Jain and Baxter. Câncer Res., 48: 7022-7032, 1988. 39. Jain. Vascular and interstitial physiology of tumors. Role in câncer detection and treatment. In: R.Bicknell, C.E. Lewis and N. Ferrara (eds). Tumour Angiogenesis, pp. 45-59. New York: Oxford University Press, 1997. 40. Jain. Annu. Rev. Biomed. Eng., 1: 241-263, 1999. 41. Turner e Kinet, Nature, 402 Suppl., B24-B30, 1999. 42. Vangelista et al. Jour. Clin. Invest., 103:1571-1578, 1999 . 43. Garman et al. Nature, 406: 259-266, 2000. 44. Hu et al. Câncer Res., 56: 3055-3061, 1996. 45. Magnani et al. Br. J. Câncer, 82: 616-620, 2000. 44 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Tabela 1. Imunorreactividade (I*) e recuperação de radioactividade (R) a partir de Superdex 200 dos anticorpos radiomarcados para diferentes tempos após injecção i.v.

Tempo (h) 3 6 24 48 72 144 I R I R I R I R I R I R L19(scFv)2 36 54 32 58 27 nd 14 nd 9 nd 4 nd L19SIP 100 100 100 96 100 94 95 96 100 nd 95 nd L191gGl 100 100 100 100 95 100 100 100 100 100 95 100

Imunorreactividade (%) e recuperação de radioactividade (%) a partir de Superdex200 foram determinadas no plasma como descrito em Materiais e Métodos. -*Para normalizar, os resultados do teste de imunorreactividade são referidos como valores em percentagem da imunorreactividade antes da injecção i.v. - nd : não determinado

Tabela 2 a. Experiências de biodistribuição de fragmentos de anticorpo L19 e Dl.3 radiomarcados em ratinhos portadores de tumor SK-MEL-28 L19 (scFv) 2 3h 6h 24h 48h 72h 144h

TUMOR 2, 47 ±0, 65 2, 01 ±0, 72 1, 62 ±0, 43 0, 95 ±0, 14 0, σ'. 00 1+ o ,04 0, ,32 ±0, 14 Sangue 1, 45 ±0, 58 0, 54 ±0, 12 0, 10 ±0, 03 0, 04 ±0, 01 0, ,03 ±0, ,02 0, ,03 ±0, 01 Fígado 0, 48 ±0, 20 0, 18 ±0, 05 0, 04 ±0, 01 0, 02 ±0, 00 0, ,02 ±0, ,01 0, , 02 ±0, 00 Baço 0, 67 ±0, 28 o, 27 ±0, 04 0, 07 ±0, 02 0, 03 ±0, 00 0, ,02 ±0, ,01 0, , 02 ±0, 00 Rim 4, 36 ±0, 32 1, 67 ±0, 08 0, 16 ±0, 01 0, 06 ±0, 01 0, ,04 ±0, , 02 0, , 03 ±0, 00 Intestino o, 77 ±0, 21 o, 57 ±0, 05 0, 24 ±0, 06 0, 17 ±0, 04 0, ,12 ±0, , 05 0, , 09 ±0, 01 Coração o, 77 ±0, 20 o, 31 ±0, 07 0, 07 ±0, 02 0, 02 ±0, 00 0, ,02 ±0, ,01 0, , 02 ±0, 00 Pulmão 2, 86 ±0, 34 1, 50 ±0, 67 1, 07 ±0, 42 0, 73 ±0, 39 0, ,55 ±0, ,11 0, , 51 ±0, 22 Dl. 3 (scFv) 3h 6h 24h 48h 72h 144h TUMOR 1, 03 ±0, 74 o, 87 ±0, 42 0, 15 ±0, 10 0, 07 ±0, 02 nd nd Sangue 1, 52 ±0, 86 0, 81 ±0, 13 0, 02 ±0, 00 0, 01 ±0, 00 nd nd Fígado 1, 19 ±0, 65 0, 66 ±0, 26 0, 14 ±0, 04 0, 03 ±0, 08 nd nd Baço 1, 05 ±0, 88 0, 42 ±0, 33 0, 07 ±0, 02 0, 05 ±0, 01 nd nd Rim 3, 01 ±2, 48 1, 83 ±0, 76 0, 48 ±0, 01 0, 18 ±0, 05 nd nd Intestino o, 56 ±0, 54 0, 56 ±0, 13 0, 17 ±0, 03 0, 02 ±0, 01 nd nd Coração o, 86 ±0, 54 0, 55 ±0, 84 0, 02 ±0, 01 0, 01 ±0, 00 nd nd Pulmão 1, 28 ±0, 65 1, 06 ±0, 88 0, 04 ±0, 01 0, 03 ±0, 01 nd nd Os resultados estão injectada por grama nd: não determinado expressos de tecido como percentagem da dose de anticorpo (% ID/g)±DP 45 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Tabela 2 b. Experiências de biodistribuição de L19-SIP e Dl. 3-SIP radiomarcados em ratinhos portadores de tumor SK-MEL-28

LI 9 SIP 3h 6h 24h 48h 72h 144h TUMOR 5, 23 ±0, 65 6, 14 ±2, 23 4, 20 ±2, 47 2, 57 ±0, 31 2, 33 ±0, 90 1, 49 ±0, 65 Sangue 9, 82 ±0, 68 5, 03 ±0, 52 1, 39 ±0, 06 0, 29 ±0 . 04 0, 08 ±0, 02 0, 02 ±0, 01 Fígado 2 . 65 ±0, 14 1, 74 ±0, 31 0, 50 ±0, 04 0, 19 ±0, 01 0, 10 ±0, 02 0, 05 ±0, 01 Baço 3, 76 ±0, 36 2, 43 ±0, 24 0, 71 ±0, 05 0, 26 ±0, 04 0, 13 ±0, 01 0, 17 ±0, 18 Rim 7, 33 ±0, 91 3, 87 ±0, 21 1, 09 ±0, 05 0, 30 ±0, 04 0, 14 ±0, 02 0, 05 ±0, 01 Intestino 1, 45 ±0, 24 1, 44 ±0, 29 1, 06 ±0, 43 0, 56 ±0, 08 0, 40 ±0, 08 0, 18 ±0, 00 Coração 4, 16 ±0, 30 2, 15 ±0, 08 0, 52 ±0, 05 0, 13 ±0, 03 0, 06 ±0, 01 0, 02 ±0, 01 Pulmão 7, 72 ±0, 60 5, 41 ±0, 55 1, 81 ±0, 40 0, 59 ±0, 29 0, 19 ±0, 03 0, 05 ±0, 01 Dl.3SIP 3h 6h 24h 48h 72h 144h TUMOR 3, 80 ±0, 30 1, 65 ±0, 12 0, 70 ±0, 00 0, 26 ±0, 01 0, 07 ±0, 01 0, 04 ±0, 03 Sangue 10 r 40 ±0, ,81 4, 45 ±0, 14 1, 21 ±0, 01 0, 32 ±0, 00 0, 08 ±0, 01 0, 06 ±0, 02 Fígado 4, 05 ±0, 98 2, 73 ±0, 33 1, 43 ±0, 07 0, 51 ±0, 21 0, 15 ±0, 08 0, 02 ±0. 01 Baço 3, 31 ±0, 6 6 1, 76 ±0, 50 0, 82 ±0, 12 0, 46 ±0, 20 0, 15 ±0, 05 0, 04 ±0, 02 Rim 8, 41 ±0, 49 4, 64 ±0, 06 1, 47 ±0, 05 0, 36 ±0, 03 0, 16 ±0, 03 0, 06 ±0, 01 Intestino 2, 03 ±0, 55 1, 06 ±0, 20 1, 02 ±0, 06 0, 14 ±0, 03 0, 08 ±0, 02 0, 12 ±0, 04 Coração 3, 28 ±0, 20 1, 81 ±0, 02 0, 29 ±0, 01 0, 06 ±0, 00 0, 05 ±0, 01 0, 04 ±0, 01 Pulmão 6, 16 ±0, 28 4, 52 ±0, 07 1, 16 ±0, 05 0, 09 ±0, 00 0, 06 ±0 . 01 0, 05 ±0, 01 Os resultados estão injectada por grama nd: não determinado • expressos . de tecido como percentagem (% ID/g)±DP . da . dose de : anticorpo

Tabela 2 c. Experiências de biodistribuição de Ll9lgGl e hlgGlk radiomarcados em ratinhos portadores de tumor SK- -MEL- -28 LI 9 IgGl 3h 6h 24h 48h 72h 144h TUMOR 4, 46 ±0,08 5, 39 ±1, 01 6, 70 ±2,10 7, 80 ±2,51 8,90 ±2,52 11 , 22 Sangue 16,04 ±0,81 12,02 ±1,65 8,31 ±1,77 5,12 ±1,42 5, 02 ±3, 81 4, 87 ±0,26 Fígado 6,03 ±0,37 6,77 ±0,53 2, 41 ±0,35 1,45 ±0,41 1,26 ±0,71 1, 09 ±0, 16 Baço 6,63 ±1,34 6,37 ±1, 37 2, 51 ±0,47 2,01 ±0,32 1,80 ±1,02 1, 51 ±0, 29 Rim 6,47 ±0,39 5,12 ±0, 47 3,07 ±0,35 1,73 ±0,63 1,54 ±1,14 1, 12 ±0, 44 Intestino 1,60 ±0,39 1,35 ±0,65 1, 43 ±0,19 1,13 ±0,32 1,13 ±0,98 0, 97 ±0, 47 Coração 5, 63 ±0,67 4, 77 ±0,52 2, 87 ±0,45 1,48 ±0,51 1,32 ±1,09 0, 92 ±0, 37 Pulmão 6,55 ±0,65 5, 15 ±0,62 4, 16 ±0 f 6 6 2,28 ±0,80 1,98 ±1,60 1, 42 ±0, 45 46 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ hlgGlk 3h 6h 24h 48h 72h 144h TUMOR nd 3, 28 ±0, 38 4, 00 ±0,22 2, 78 ±0,20 nd 2, 32 ±0, 26 Sangue nd 10,12 ±0,35 7, 87 ±0,25 6,24 ±0,34 nd 5, 41 ±0,51 Fígado nd 4, 02 ±0, 09 2, 06 ±0,10 1,90 ±0,24 nd 1, 28 ±0, 03 Baço nd 4, 47 ±0, 28 1, 82 ±0,01 1, 42 ±0,19 nd 1, 24 ±0, 03 Rim nd 5, 40 ±0, 19 2, 56 ±0,06 2,08 ±0,22 nd 1, 30 ±0, 15 Intestino nd 0, 72 ±0, 07 o, 46 ±0,05 0.36 ±0,03 nd 0, 31 ±0, 01 Coração nd 3, 80 ±0, 15 2, 52 ±0,21 0,99 ±0,18 nd 1, 48 ±0,13 Pulmão nd 4, 82 ±0, 92 3, 64 ±0,08 1,75 ±0,32 nd 1, 09 ±0,13

Os resultados estão expressos como percentagem da dose de anticorpo injectada por grama de tecido (%ID/g)±DP nd: não determinado

Tabela 3. Razões tumor-órgão da % iD/g dos formatos de anticorpo LI 9 radiomarcados em ratinhos portadores de tumor SK-MEL-28. L19(ScFv)2 L19SIP L19IgGl Tempo(h) 3 6 24 48 72 144 3 6 24 48 72 144 3 6 24 48 72 144 TUMOR 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Sangue 1,7 3,7 16,2 23,7 22,7 10,7 0,5 1,2 3,0 8,9 29,1 74,5 0,3 0,4 0,8 1,5 1,8 2,3 Fígado 5,1 11,1 40,5 47,5 34,0 16,0 2,0 3,5 8,4 13,5 23,3 29,8 0,7 0,8 2,8 5,4 7,1 6,3 Baço 3,7 7,4 23,1 31,6 34,0 16,0 1,4 2,5 5,9 10,0 17, 9 8,8 0,7 0,6 2,7 3,9 4,9 7,4 Rim 0,6 1,2 10,1 15,8 17,0 10,7 0,7 1,6 3,8 8,6 16,6 29,8 0,7 1,0 2,2 4,5 5,8 5,3 Intestino 3,2 3,5 6,7 5,6 5,7 3,6 3,6 4,3 4,0 4, 6 5,8 8,3 2,8 4,0 4,7 6,9 7,9 7,1 Coração 3,2 6,5 23,1 47,5 34,0 16,0 1,3 2,9 8,1 20,0 38,8 74,5 0,8 1,1 2,3 5,3 6,7 5,8 Pulmão 0,9 1,3 1,5 1,3 1,2 0,6 0,7 1,1 2,3 4,3 12,3 29,8 0,7 1,0 1,6 3,4 4,5 3,7

Tabela 4.

Parâmetros cinéticos para depuração sanguínea dos três formatos de anticorpo L19 α β (%)a) ti/2(h) (%)2) ti/2 (h) LI9(scFv)2 96,7 0,53 3,3 8, 00 L19-SIP 83, 7 1, 06 16,3 10, 66 Ll9-IgGl 76,9 1, 48 23,1 106,7 a) Grandeza relativa dos dois componentes de meia vida 47 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Tabela 5. Experiências de biodistribuição de Ll9(scFv) e L19SIP radiomarcados em ratinhos portadores de tumor F9

Ll 9 (SCFv) 2 3h 6h 24h 48h TUMOR 10, 46 ±1, 75 8, 15 ±2,63 3, 18 ±0, 83 2,83 ±0, 71 Sangue 2, 05 ±0,38 1, 88 ±1, 14 0, 17 ±0, 01 0,06 ±0, 02 Fígado 1,62 ±1,67 0, 73 ±0,51 0, 07 ±0, 01 0,04 ±0, 02 Baço 1,53 ±0,36 0, 90 ±0,54 0.11 ±0, 01 0,06 ±0, 01 Rim 12, 70 ±0, 73 4,37 ±0, 98 0,24 ±0, 03 0,18 ±0, 08 Intestino 0,68 ±0, 15 0, 95 ±0,23 0,24 ±0, 01 0,17 ±0, 06 Coração 1,35 ±0,21 0, 81 ±0,38 0, 08 ±0, 02 0,04 ±0, 01 Pulmão 2, 88 ±0,29 2, 06 ±0,69 0,38 ±0,60 0,33 ±0, 05 L99SIP 3h 6h 24h 48h TUMOR 17, 46 ±1, 93 16,65 ±2,59 15,32 ±2, 17 12, 00 ±1, 91 Sangue 13,51 ±0,57 9,62 ±1, 18 1, 73 ±0, 02 1,14 ±0,20 Fígado 2, 81 ±0,37 2,39 ±0, 13 0,54 ±0, 14 0,32 ±0, 00 Baço 3, 42 ±0,26 2,66 ±0,27 0,61 ±0, 09 0,37 ±0, 01 Rim 9, 18 ±0, 76 5, 85 ±0,50 1, 16 ±0, 05 0,76 ±0, 06 Intestino 0, 95 ±0, 03 1,36 ±0,21 0, 83 ±0, 11 1,04 ±0, 14 Coração 4,64 ±0, 74 3,67 ±0,46 0,67 ±0, 06 0,46 ±0, 07 Pulmão 5,61 ±0, 01 5, 93 ±0,57 1,66 ±0, 19 0,91 ±0, 08

Os resultados estão expressos como percentagem da dose de anticorpo injectada por grama de tecido (%ID/g)±DP nd: não determinado

Tabela 6 % de dose / g de tecido lh p. i. 3h p. i. 24h P . i Baço 5, 05 + 1, 04 4,27 + 0,27 4, 86 + 1, 77 Fígado 10 80 ± 1,52 10,57 ± 1, 44 10,68 ± 1 ,51 Rim 14 30 + 1, 45 16,71 + 2, 42 22, 48 + 6 ,79 Pulmão 9, 94 ± 1, 72 6,15 ± 0, 80 3, 03 ± 0, 95 Estômago sem conteúdo 1, 10 + 0, 13 1,62 + 0, 19 1,66 + 0, 24 Intestino com conteúdo 1, 67 + 0, 14 2,65 + 0,30 2,64 + 1, 40 Tumor 12 ,93 ± 2, 76 10, 18 ± 2,28 12, 96 ± 3 ,13 Sangue 17 ,10 + 1, 49 9, 08 + 0, 96 1, 98 + 0, 47 48 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

Tabela 7 % de dose / ç de tecido lh p. i. 3h p. i. 24h P . i • Baço 6 ,92 ± 1,3 5,37 ± 0,23 2, 06 ± 0, 48 Figado 14 ,65 + 0,81 12, 43 + 0,37 4,62 + 0, 52 Rim 22 ,07 ± 1,87 15, 99 ± 1, 10 5, 92 ± 1, 18 Pulmão 10 , 06 + 1,67 5,33 + 0, 49 1,32 + 0, 25 Estômago sem conteúdo 2, 18 + 0,39 2, 12 + 0, 09 1, 15 + 0, 08 Intestino com conteúdo 3, 03 ± 0,25 3,62 ± 0,58 1,20 ± 0, 12 Tumor 17 ,20 + 7, 49 18, 79 + 5,35 9, 42 + 3, 84 Sangue 16 , 53 ± 2,04 7, 42 ± 0,21 0, 73 ± 0, 14

Tabela 8 lh p.i. 3h p.i. 24h p.i. Razão tumor:sangue 1,01 ± 0,33 2,54 ± 0,74 12,81 ± 4,03

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Philogen SRL Schering AG Laura Borsi,

Barbara Carnemolla,

Enrica Balza,

Patrizia Castellani,

Luciano Zardi,

Matthias Friebe,

Christoph-Stephan Hilger, <120> Direccionamento selectivo para vasculatura tumoral utilizando moléculas de anticorpo <130> SMWFP6134076 <140> PCT/IB03/01458 <141> 2003-03-11 <150> US 60/363,045 <151> 2002-03-11 <16 0> 13 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 5

<212> PRT <213> Homo sapiens 49 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ < 4 Ο Ο > 1

Ser Phe Ser Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 2 1 5 Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 3

Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr 1 5

Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys

<210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 4

Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser Phe Leu Ala 15 10

<210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 5

Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5

<210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 6

Gin Gin Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr 1 5 10 50 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

<210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Péptido ligante < 4 0 0 > 7

Gly Gly Ser Gly 1

<210> 8 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador < 4 0 0 > 8 gtgtgcactc ggaggtgcag ctgttggagt ctggg 35

<210> 9 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 9 gcctccggat ttgatttcca ccttggtccc ttggcc 36

<210> 10 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador < 4 0 0 > 10 ctcgtgcact cgcaggtgca gctgcaggag tca 33

<210> 11 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador < 4 0 0 > 11 ctctccggac cgtttgatct cgcgcttggt 30 51 ΕΡ 1 483 297/ΡΤ

<210> 12 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Iniciador < 4 0 0 > 12 33 tggtgtgcac tcggaaattg tgttgacgca gtc

<210> 13 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador < 4 0 0 > 13 ctctcgtacg tttgatttcc accttggtcc

Lisboa,2010-03-23 30

Claims (25)

1. ΕΡ 1 483 297/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de anticorpo anti-ED-B humano que compreende um domínio VH de anticorpo e um domínio VL de anticorpo, onde o domínio VH de anticorpo tem a sequência de aminoácidos: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSS; e onde o domínio VL de anticorpo tem a sequência de aminoácidos: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK; onde a molécula de anticorpo compreende uma mini-imunoglobulina compreendendo o referido domínio VH de anticorpo e o referido domínio VL de anticorpo fundidos com eS2-CH4 e dimerizados.
2. 2. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 onde o domínio VH de anticorpo e o domínio VL de anticorpo estão dentro de uma molécula de anticorpo scFv fundida com es2-CH4.
3. 3. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 2 onde a molécula de anticorpo scFv está fundida com £S2_CH4 através de um péptido ligante.
4. 4. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 3 onde o péptido ligante tem a sequência de aminoácidos GGSG (SEQ ID NO:7).
5. 5. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 que está conjugada com um radioisótopo.
6. 6. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 5 onde o radioisótopo é um radioisótopo de Tc, Re, In, Y ou Lu.
7. 7. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 5 onde o radioisótopo é seleccionado entre o grupo consistindo em 94m Tc, 99mTc, 186 Re, : 203Pb, 67Ga, 68Ga, 43Sc, 47Sc, 110mIn, inln, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 68Cu, 86γ, 88γ^ 90γ^ 121Sn^ 161^ 153Sm, 166Ho, 10SRh, 177Lu, 172Lu e 18F . ΕΡ 1 483 297/ΡΤ 2/3
8. 8. Ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleótidos ou sequências de nucleótidos codificando uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
9. 9. Célula hospedeira transformada com ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8.
10. 10. Método de produção de uma molécula de anticorpo, o método compreendendo a cultura de células hospedeiras de acordo com a reivindicação 9 sob condições para produção da referida molécula de anticorpo.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10 compreendendo ainda o isolamento e/ou a purificação da referida molécula de anticorpo.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou a reivindicação 11 compreendendo ainda a formulação da molécula de anticorpo numa composição incluindo pelo menos um componente adicional.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12 compreendendo ainda a ligação da molécula de anticorpo a ED-B ou a um fragmento de ED-B in vitro.
14. 14. Método compreendendo a ligação de uma molécula de anticorpo que se liga a ED-B de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, a ED-B ou a um fragmento de ED-B, in vitro.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou a reivindicação 14 compreendendo a determinação da quantidade de ligação da molécula de anticorpo a ED-B ou a um fragmento de ED-B .
16. 16. Composição compreendendo uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia. ΕΡ 1 483 297/ΡΤ 3/3
17. 17. Composição de acordo com a reivindicação 16 para utilização num método de tratamento de uma lesão de angiogénese patológica.
18. 18. Composição de acordo com a reivindicação 16 para utilização num método de tratamento de um tumor.
19. 19. Utilização de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 na fabricação de um medicamento para tratamento de uma lesão de angiogénese patológica.
20. 20. Utilização de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 na fabricação de um medicamento para tratamento de um tumor.
21. 21. Composição compreendendo uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.
22. 22. Composição de acordo com a reivindicação 21 para utilização num método de tratamento de uma lesão de angiogénese patológica.
23. 23. Composição de acordo com a reivindicação 22 para utilização num método de tratamento de um tumor.
24. 24. Utilização de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7 na fabricação de um medicamento para tratamento de uma lesão de angiogénese patológica.
25. 25. Utilização de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7 na fabricação de um medicamento para tratamento de um tumor. Lisboa, 2010-03-23