JP5424414B2 - 高選択・高効率でpcr増幅が可能な新規dna - Google Patents
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Description
nは、1ないし12から選択される整数であり;
mは、1ないし12から選択される整数であり;
lは、1ないし12から選択される整数であり;
Xは、−C≡C−CH2−、−C≡C−、−C=C−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され;
Yは、−CH3、−C2H5、−NH2、−OH、−COOH、−CHO、−SH、置換もしくは非置換アリール、−NHCO−Z、−CONH−Z、−NHCONH−Z、−O−Z、−COO−Z、−O−C(=O)−Z、−CO−Z、および、−S−Z、からなる群より選択され、ここでZは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸である鋳型鎖に対し、複製基質として塩基Ds、前記式IIで表される塩基、および/または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行うことにより、塩基Dsと前記式IIで表される塩基の人工塩基対を含む核酸を複製する、前記方法。
以下の式I:
nは、1ないし12から選択される整数であり;
mは、1ないし12から選択される整数であり;
lは、1ないし12から選択される整数であり;
Xは、−C≡C−CH2−、−C≡C−、−C=C−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され;
Yは、−CH3、−C2H5、−NH2、−OH、−COOH、−CHO、−SH、置換もしくは非置換アリール、−NHCO−Z、−CONH−Z、−NHCONH−Z、−O−Z、−COO−Z、−O−C(=O)−Z、−CO−Z、および、−S−Z、からなる群より選択され、ここでZは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される]
で表される塩基、塩基Ds、および/または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行い;
それにより、塩基Dsと前記式IIで表される塩基の人工塩基対を含む核酸が生成することにより、機能性置換基を結合した人工塩基がDNA中に導入される;
前記方法。
(a)N1がチミン(T)もしくはシトシン(C);
(b)N3がシトシン(C);
(c)N4がチミン(T);
(d)N5がチミン(T)もしくはシトシン(C);および
(e)N6がグアニン(G);
からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす、態様5〜7のいずれか1項に記載の方法。
(1)以下の式I:
nは、1ないし12から選択される整数であり;
mは、1ないし12から選択される整数であり;
lは、1ないし12から選択される整数であり;
Xは、−C≡C−CH2−、−C≡C−、−C=C−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され;
Yは、Zで置換されたアリール、−NHCO−Z、−CONH−Z、−NHCONH−Z、−O−Z、−COO−Z、−O−C(=O)−Z、−CO−Z、および、−S−Z、からなる群より選択され、ここでZは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される機能性置換基である]
で表される塩基、塩基Ds、および/または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行い;
(2)生成した核酸の中から、塩基Dsと前記式IIで表される塩基の人工塩基対を含む核酸を、前記式IIで表される塩基が有する機能性置換基の性質に基づいて選択的に回収する;
ことを含む、前記方法。
(a)N1がチミン(T)もしくはシトシン(C);
(b)N3がシトシン(C);
(c)N4がチミン(T);
(d)N5がチミン(T)もしくはシトシン(C);および
(e)N6がグアニン(G);
からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす、態様10〜12のいずれか1項に記載の方法。
(1)5’−(N)n(Nu1)(N)m−3’(配列番号2)、で示されるランダム領域を含むDNAライブラリーを調製し、ここでnおよびmはそれぞれ独立して1ないし10から選択される整数であり、Nu1は第一の人工塩基である;
(2)Nu1と人工塩基対を形成する第二の人工塩基Nu2を有するヌクレオシドを含む、複製基質を用いて前記DNAライブラリーに対して核酸の複製反応を行い、ここで、Nu2は機能性官能基を含んでいる;
(3)Nu1とNu2の人工塩基対の形成により機能性置換基が導入された核酸を、当該機能性置換基の性質に基づいて回収し;
(4)(3)で回収した核酸に対して、(2)および(3)の工程を繰り返し;そして、
(5)得られた核酸の配列を決定する;
ことを含む、前記方法。
(1)以下の式I:
(2)複製基質として、以下の式II:
nは、1ないし12から選択される整数であり;
mは、1ないし12から選択される整数であり;
lは、1ないし12から選択される整数であり;
Xは、−C≡C−CH2−、−C≡C−、−C=C−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され;
Yは、Zで置換されたアリール、−NHCO−Z、−CONH−Z、−NHCONH−Z、−O−Z、−COO−Z、−O−C(=O)−Z、−CO−Z、および、−S−Z、からなる群より選択され、ここでZは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される機能性置換基である]
で表される塩基、塩基Ds、および/または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸、を用いて前記DNAライブラリーに対して核酸の複製反応を行い;
(3)塩基Dsと前記式IIで表される塩基の人工塩基対の形成により機能性置換基が導入された核酸を、当該機能性置換基の性質に基づいて回収し;
(4)(3)で回収した核酸に対して、(2)および(3)の工程を繰り返し;そして
(5)得られた核酸の配列を決定する;
ことを含む、前記方法。
本発明の人工塩基対は、人工塩基Dsと人工塩基Pnの誘導体とで形成される塩基対である。
nは、1ないし12、好ましくは1ないし10、より好ましくは1ないし8、さらに好ましくは1ないし5、から選択される整数であり;
mは、1ないし12、好ましくは1ないし10、より好ましくは1ないし8、さらに好ましくは1ないし5、から選択される整数であり;
lは、1ないし12、好ましくは1ないし10、より好ましくは1ないし8、さらに好ましくは1ないし5、から選択される整数であり;
Xは、−C≡C−CH2−、−C≡C−、−C=C−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され、好ましくは−C≡C−CH2−もしくは−C≡C−、より好ましくは−C≡C−CH2−であり;
Yは、−CH3、−C2H5、−NH2、−OH、−COOH、−CHO、−SH、置換もしくは非置換アリール、−NHCO−Z、−CONH−Z、−NHCONH−Z、−O−Z、−COO−Z、−O−C(=O)−Z、−CO−Z、および、−S−Z、からなる群より選択され、ここでZは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される]
で表される。
特に好ましい態様において、本発明の人工塩基Pn誘導体は、
NH2−hx−Pn: 4−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−ニトロピロール−1−イル基;または
FAM−hx−Pn: 4−[3−[6−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−ニトロピロール−1−イル基;
である。
一態様において本発明は、人工塩基対を含む核酸を複製する方法であって、Dsおよび/またはPn誘導体を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸である鋳型鎖に対し、複製基質として塩基Ds、塩基Pn誘導体、および/または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行うことにより、塩基Dsと前記式IIで表される塩基の人工塩基対を含む核酸を複製する、前記方法、を提供する。
本発明の人工塩基Pn誘導体は、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される機能性置換基を有していてもよい。これらの機能性置換基をPn誘導体が有する場合、これら機能性置換基の性質に基づいて、本発明の核酸の複製方法により生成したDs−Pn誘導体の人工塩基対を含む核酸を選択的に検出および/または回収することができる。本発明において、人工塩基対を含む核酸の検出および/または回収が可能な機能性置換基を有する人工塩基の例には、式IIで表されるPn誘導体において、置換基Zとして蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、またはペプチド等を有する場合が挙げられる。
本発明者らは、複製における鋳型塩基と複製基質環での人工塩基対の形成の効率と選択性は、DNA中の人工塩基対近傍の天然型塩基の配列にも依存するとの仮説を立てた。そして、実施例2で後述するように、核酸複製反応において効率よく核酸が増幅する人工塩基対とその近傍の天然型塩基の配列についてin vitroセレクション法の手法を用いて調べた。その結果、核酸複製反応において効率よく核酸が増幅する人工塩基対とその近傍の天然型塩基の配列を見出した。
(a)N1がチミン(T)もしくはシトシン(C);
(b)N3がシトシン(C);
(c)N4がチミン(T);
(d)N5がチミン(T)もしくはシトシン(C);および
(e)N6がグアニン(G);
からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす、鋳型鎖を用いることをさらなる特徴とする方法をも提供する。好ましくは、上記(a)−(e)の条件を少なくとも3つ以上、より好ましくは4つ以上、さらに好ましくは5つすべて、の条件を満たす鋳型鎖を用いてもよい。あるいは、上記(b)、(c)および(e)からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす鋳型鎖を用いてもよい。
(a)N1'がシトシン(C);
(b)N2'がアデニン(A)もしくはグアニン(G);
(c)N3'がアデニン(A);
(d)N4'がグアニン(G);および
(e)N6'がアデニン(A)もしくはグアニン(G);
からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす、鋳型鎖を用いることをさらなる特徴とする方法をも提供する。好ましくは、上記(a)−(e)の条件を少なくとも3つ以上、より好ましくは4つ以上、さらに好ましくは5つすべて、の条件を満たす鋳型鎖を用いてもよい。あるいは、上記(a)、(c)および(d)からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす鋳型鎖を用いてもよい。
(a)N1がチミン(T)もしくはシトシン(C);
(b)N3がシトシン(C);
(c)N4がチミン(T);
(d)N5がチミン(T)もしくはシトシン(C);および
(e)N6がグアニン(G);
からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす前記核酸、を提供する。好ましくは、上記(a)−(e)の条件を少なくとも3つ以上、より好ましくは4つ以上、さらに好ましくは5つすべて、の条件を満たす核酸であってもよい。あるいは、上記(b)、(c)および(e)からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす核酸であってもよい。
(a)N1'がシトシン(C);
(b)N2'がアデニン(A)もしくはグアニン(G);
(c)N3'がアデニン(A);
(d)N4'がグアニン(G);および
(e)N6'がアデニン(A)もしくはグアニン(G);
からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす前記核酸を提供する。好ましくは、上記(a)−(e)の条件を少なくとも3つ以上、より好ましくは4つ以上、さらに好ましくは5つすべて、の条件を満たす核酸であってもよい。あるいは、上記(a)、(c)および(d)からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす核酸であってもよい。
人工塩基Dsを含むDNA断片の塩基配列決定は、Ds−Pa塩基対を用いておこなうことができる。
一態様において、本発明は、人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのDNA中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法を提供する。すなわち、本発明は、人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのDNA中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法であって、
(1)5’−(N)n(Nu1)(N)m−3’(配列番号2)、で示されるランダム領域を含むDNAライブラリーを調製し、ここでnおよびmはそれぞれ独立して1ないし10から選択される整数であり、Nu1は第一の人工塩基である;
(2)Nu1と人工塩基対を形成する第二の人工塩基Nu2を有するヌクレオシドを含む、複製基質を用いて前記DNAライブラリーに対して核酸の複製反応を行い、ここで、Nu2は機能性官能基を含んでいる;
(3)Nu1とNu2の人工塩基対の形成により機能性置換基が導入された核酸を、当該機能性置換基の性質に基づいて回収し;
(4)(3)で回収した核酸に対して、(2)および(3)の工程を繰り返し;そして、
(5)得られた核酸の配列を決定する;
ことを含む、前記方法、を提供する。
isoG−isoC(特許文献3、および非特許文献9);
P−Z(P:2−アミノ−イミダゾ[1,2−a]−1,3,5−トリアジン−4(8H)−オン、Z:6−アミノ−5−ニトロ−2(1H)−ピリドン)(非特許文献22);
s−y(s:2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン、y:2−オキソピリジン)(非特許文献16−17);
v−y(v:2−アミノ−6−(2−チアゾリル)プリン、y:2−オキソピリジン)(非特許文献18);
Ds−Pa;
Ds−Pn;および
Ds−Pn誘導体;
の組み合わせが挙げられる。なお、上記組み合わせのうちの前者がNu1である場合は後者がNu2となり、一方で後者がNu1である場合は前者がNu2となることは当業者に容易に理解されるであろう。
Pn: 2−ニトロ−1H−ピロール−1−イル基
Pa: 2−ホルミル−1H−ピロール−1−イル基
NH2−hx−Pn: 4−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−ニトロピロール−1−イル基
FAM−hx−Pn: 4−[3−[6−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−ニトロピロール−1−イル基
NH2−hx−dPnTP: 1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−ニトロピロール 5’−三リン酸
FAM−hx−dPnTP: 1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−[3−[6−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−ニトロピロール 5’−三リン酸
dPa’TP: 1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(1−プロピニル)ピロール−2−カルボアルデヒド 5’−三リン酸
ddPa’TP: 1−(2,3−ジデオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(1−プロピニル)ピロール−2−カルボアルデヒド 5’−三リン酸
また、Ds、Pn、NH2−hx−Pn、FAM−hx−Pnについての構造を図1に示す。
複製における人工塩基Pnの1−プロピニル誘導体とDsによる塩基対形成の効率と選択性を調べるために、大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのクレノウ断片によるヌクレオチド挿入実験を行い、反応速度定数を解析した。
複製における鋳型塩基と基質間での人工塩基対の形成の効率と選択性は、DNA中の人工塩基対近傍の天然型の塩基の配列にも依存するのではないかとの仮説を立て、PCRで効率よく増幅する人工塩基対とその近傍の天然型塩基の配列を試験管内進化工学(in vitroセレクション法)の手法を用いて調べた。
具体的には、ランダム配列のDNAライブラリーを用いる進化工学の手法を用いて、以下の手順で高効率かつ高選択でPCR増幅可能な人工塩基近傍の天然型塩基配列を決定するin vitroセレクションを行った。まず、Dsを含むDNA断片を、人工塩基Dsの両側の天然型塩基のそれぞれ3塩基をランダムにした一本鎖DNA(55−mer; 5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGG-NNN-Ds-NNN-CCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’(配列番号9))をDNA合成機により化学合成し、これをゲル電気泳動で精製して作成した。このDNA断片(2pmol)を鋳型にして、天然型塩基の基質(dNTPs、N=A、G、C、T)と人工塩基の基質(dDsTP、FAM−hx−dPnTP)、そしてDeepVent DNAポリメラーゼ(0.04ユニット/μl)を用いてPCRを行った。PCRの反応スケールは200 μlであり、反応緩衝液の組成は20mM Tris−HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% TritonX-100である。5’側プライマー(5’-GATAATACGACTCACTATAG-3’(配列番号10))および3’側プライマー(5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’(配列番号11))は各々1μMの濃度で、また各天然型塩基の基質dNTP(0.3mM)、人工塩基の基質としてFAM−hx−dPnTP(2.5 μM)とdDsTP(50 μM)を使用した。PCR条件は、94℃で30秒、45℃で30秒、65℃で4分を1サイクルとした。10サイクルのPCR増幅後、全長のPCR産物を10%PAGE−7M尿素ゲルによる電気泳動により精製し、260nmの吸光度から回収されたDNAの濃度を算出した。
方法1のシーケンシングパターンから、5’−CNA(Pa)GNG−3’(配列番号14)、すなわち5’−CNC(Ds)TNG−3’配列(配列番号15)(NはA、G、C、Tのどれかを示す)に収束していることがわかった(図3:方法1として示されるシーケンシングピークのパターン)。 また、方法2でクローニングして得られた配列中の各部位でのそれぞれの塩基の出現頻度を調べると、図3中の方法2の表に示したように、方法1と同様に、5’−CNC(Ds)TNG−3’配列(NはA、G、C、Tのどれかを示す)(配列番号15)が得られた。このように、人工塩基対に隣接する塩基のみならず、人工塩基から5’側と3’側の両側の3番目の塩基もPCRの効率と選択性に依存していることがわかった。
実施例2のセレクションにおいて、方法2の塩基配列解析法によりクローニングして得られた配列のDNA断片(S1−S8、(それぞれ、配列番号16−23))、および得られた配列を人為的に変えたDNA断片(N9−N12(それぞれ、配列番号24−27))をDNA合成機で作成し、それぞれのDNA断片のPCRにおける増幅効率と人工塩基の選択性を調べた。
)は、高い頻度で、5’−YNC(Ds)TYG−3’配列(Y=CまたはT、N=A、G、C、またはT)(配列番号29)を含み、ランダム配列のDNAと比較してこれらのDNAのPCR増幅効率は1.6倍から2.0倍向上した。また、FAM−hx−Pnの取り込み効率も、ランダム配列のDNAと比較して1.9倍から2.9倍向上した。さらに、人工塩基対の忠実度(選択性)も、これらの値と相関関係にあり、人工塩基対のPCRにおける選択性とその効率が人工塩基対の近傍の天然型塩基の配列に依存していることがわかった。
人工塩基Dsを含むDNA断片の塩基配列決定法は本発明者らがすでに報告している(I. Hirao, et al., Nature Methods, 3: 729-735 (2006).)。このDs−Pa塩基対を用いた従来法では、Dsの相補塩基であるPaのプロピニル誘導体の基質(dPa’TP)の有無によるシーケンシングパターンの違いを利用していた。たとえば、dPa’TPを加えずにDsを含むDNA断片のジデオキシダイミネーター法によるシーケンシングを行うと、鋳型鎖DNA中のDsに相補する塩基の部分でシーケンス反応が止まったピークパターンを与える。一方、dPa’TPを加えてシーケンシングをおこなうと、反応は進行するが、蛍光標識化したPa’のジデオキシダイターミネーターは加えていないため、鋳型鎖DNA中のDsに相補する塩基の位置のみ、シーケンシングのピークが消えたピークパターンを与える(図3b)。従来法は、これらの2つのシーケンシングパターンを比較することにより、人工塩基を含むDNAの配列を決定する方法である。
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(1−プロピニル)ピロール−2−カルボアルデヒド(249mg,1.00mmol)(I. Hirao, et al., Nature Methods, 3: 729-735 (2006))を無水ピリジン (10ml) に溶解させ、塩化トリチル (1.18g,4.21mmol) およびN,N−ジイソプロピルアミン (1.11ml,6.40mmol) を加え、室温で29時間、その後50℃で1.5時間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:酢酸エチル=100:0→100:3、その後ジクロロメタン:メタノール=100:2)で精製し、目的物(395mg,80%)を得た。
HRMS (FAB, 3-NBA マトリクス) C32H29N1Na1O4 [M + Na]+ について: 計算値, 514.1994;実測値, 514.1992.
工程(b)および(c):1−(2,3−ジデオキシ−5−O−トリチル−β−D−リボフラノシル)−4−(1−プロピニル)ピロール−2−カルボアルデヒドの合成
1−(2−デオキシ−5−O−トリチル−β−D−リボフラノシル)−4−(1−プロピニル)ピロール−2−カルボアルデヒド(392mg,797μmol)のアセトニトリル溶液に、アルゴン雰囲気下、4−ジメチルアミノピリジン(975mg,7.98mmol)およびクロロチオギ酸フェニル(470μl,3.40mmol)を加え、室温で攪拌した。23時間後、反応溶液を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(ヘキサン中、50−67% CH2Cl2)、中間体を得た(193mg,若干の不純物を含む)。この中間体のトルエン溶液(10ml)に水素化トリ−n−ブチルスズ(165μl,612μmol)およびα,α’−アゾビスイソブチロニトリル(15mg,92μmol)を加え、アルゴン雰囲気下5時間還流させた。反応溶液を減圧濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ヘキサン中、50−80% CH2Cl2)で精製し、目的物(84mg,58%)を得た。
HRMS (FAB, 3-NBA マトリクス) C32H29N1Na1O3 [M + Na]+ について:計算値, 498.2045; 実測値, 498.2072.
工程(d):1−(2,3−ジデオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(1−プロピニル)ピロール−2−カルボアルデヒドの合成
1−(2,3−ジデオキシ−5−O−トリチル−β−D−リボフラノシル)−4−(1−プロピニル)ピロール−2−カルボアルデヒド(82mg,171μmol)を80%酢酸(10ml)に溶解させ、室温で3時間、その後50℃でさらに2時間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、水で共沸を行った。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中、0−1% CH3OH)およびRP−HPLC(水中、35−80% CH3CN,12分)で精製し、目的物(31mg,78%)を得た。
13C NMR (DMSO-d6) δ 179.94, 130.80, 130.56, 127.11, 105.87, 87.74, 85.38, 82.80, 73.91, 62.32, 34.73, 24.58, 4.30.
HRMS (FAB, 3-NBA マトリクス) C13H16NO3(M + 1)について: 計算値, 234.1130; 実測値, 234.1137.
工程(e):1−(2,3−ジデオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(1−プロピニル)ピロール−2−カルボアルデヒド 5’−三リン酸(ddPa’TP)の合成
1−(2,3−ジデオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(1−プロピニル)ピロール−2−カルボアルデヒド(20.8mg,89μmol)に無水ピリジン(90μl)および無水ジオキサン(270μl)を加えて溶解し、2−クロロ−4H−1,2,3−ベンゾジオキサホスホリン−4−オンの1M ジオキサン溶液(100μl,100μmol) を加えて室温で10分間攪拌した後に、トリ−n−ブチルアミン(90μl)およびビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェートの0.5M DMF溶液(270μl)を加えて10分間攪拌した。1%ヨウ素/水/ピリジン溶液(1.8ml)を加え、室温で15分間攪拌し、5%亜硫酸水素ナトリウム水溶液(135μl)を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水(5ml)を加え、室温で1時間攪拌した。これをDEAE Sephadex A-25カラムクロマトグラフィー(1.5×30cm,濃度直線勾配;TEABの50mM−1M溶液)およびC18−HPLC(濃度勾配;0%−15%アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)で精製し、目的物を得た。
31P NMR (D2O) δ -23.28, -10.98, -10.98.
MS (ESI) C13H17N1O12P3 [M-H]- について:計算値, 472.00; 実測値, 471.94.
実施例4:機能性置換基を結合した人工塩基をPCR増幅でDNA中に導入する方法とその検出・単離方法
(4−1:人工塩基を含むDNAのPCR増幅)
Dsを含む断片(55−mer)にプライマーと人工塩基の基質(dDsTPとFAM−hx−dPnTPあるいはNH2−hx−dPnTP)を加えて、15から40サイクルのPCRを行った。
複数の人工塩基を含むDNA断片がPCRで増幅可能かどうかを調べるために、Dsを2つ含む断片(60−mer、62−mer、65−mer、68−mer)を鋳型にして、プライマーと人工塩基の基質(dDsTPとFAM−hx−dPnTPあるいはNH2−hx−dPnTP)を加えて、15サイクルのPCRを行った。
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTAC(Ds)GTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
Dsを2つ含むDNA断片 (62-mer)の配列(配列番号34):
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTGTAC(Ds)GTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
Dsを2つ含むDNA断片 (65-mer)の配列(配列番号35):
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTGTAATAC(Ds)GTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
Dsを2つ含むDNA断片 (68-mer)の配列(配列番号36):
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTGTAACGATAC(Ds)GTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は20mM Tris−HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% TritonX-100である。5’側プライマー(5’-CGTTGTAAAACGACGGCCAGGATAATACGACTCACTATAG-3’(配列番号12))および3’側プライマー(5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’(配列番号11))(各々1μM)、各天然型塩基の基質dNTP(0.3mM)、dDsTP(50μM)、FAM−hx−dPnTP(2.5μM)あるいはNH2−hx−dPnTP(50μM)、DeepVent DNAポリメラーゼ(0.02ユニット/μl)を用いてPCRを行った。PCRの1サイクルは、94℃30秒、45℃30秒、65℃4分で行った。鋳型に用いたDNA断片の濃度は0.6nMとした。PCR産物を15%ポリアクリルアミド−7M 尿素ゲルによる電気泳動で分離し、その産物のバンドをバイオイメージャーFLA−7000(富士フィルム)で検出・定量した。PCR増幅によりDNA中に取り込まれたFAM−hx−Pn由来の蛍光は、ゲルを直接ステージ上に載せ、蛍光解析(レーザー:473nm、フィルター青色励起用Y520)モードで検出した。また、塩基配列の解析では、PCRによる増幅産物をゲル電気泳動で精製した後に、最終濃度50μM dPa’TPを用いてシーケンシング反応を行い、その配列をDNAシーケンサーにより確認した。シーケンシングの方法は実施例2−1の(方法1)および実施例3を参照。
人工塩基Dsを含むDNA断片のPCR増幅では、その相補鎖DNA中にFAM−hx−Pnを取り込ませることができるので、抗FAM抗体で人工塩基対を含むDNA断片のみを単離することができる。このことを確認するために、本実施例では、プライマー領域は同じ配列であるが、それ以外の配列が異なる3種類のDNA断片と人工塩基Dsを含むDNA断片が等量ずつ存在する場合について、以下の実験を行った。
DNA1(55-mer)(配列番号45):
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
DNA2 (55-mer) (配列番号46):
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACACATGGAACTGCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
DNA3 (55-mer) (配列番号47):
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATGCAGACTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
DNA4 (55-mer) (配列番号48):
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACTTGATCCGTATCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
これらのDNA断片(各断片の最終濃度0.15nM)の混合物を鋳型にして、FAM−hx−dPnTP(2.5μM)およびdDsTP(50μM)、各天然型塩基の基質:dNTP(300μM)を用いて、DeepVent DNAポリメラーゼで15サイクル(94℃30秒、45℃30秒、65℃4分)のPCR(50μlスケール)を行った。増幅後のPCR溶液からその20μlをマイクロコンYM−30(ミリポア)を通し、さらに緩衝液(20mM Tris−HCl pH7.6、0.5M NaCl、10mM MgCl2)で洗浄し、溶液中に含まれる未反応の基質を除いた。この溶液(30μl)を予めストレプトアビジン磁気ビーズ(4mg/ml溶液を10μl、New England Biolabs)に固定したビオチン修飾された抗FAM抗体(1mg/ml溶液を10μl、インビトロジェン)と混ぜ、氷上にて1時間インキュベートした。溶液を除いた磁気ビーズを緩衝液(100μl)で2回洗浄し、次いで1mM EDTA溶液(pH8.0)を20μl加えて75℃で30秒間加温し、ビーズに結合したDNAを溶出した。シークエンス反応は、溶出されたDNA溶液を10μl用いて、dPa’TP存在下(最終濃度2μM)で行った。また、コントロールとして、抗FAM抗体による精製前、即ちPCR直後のサンプルの一部をゲル電気泳動により精製し、その産物を用いてシークエンス反応を行った。
本実施例では、Dsを含むDNA断片(55−mer、0.3amol)に天然型塩基のランダム配列からなる100−merの断片を107倍量加えてPCR増幅(30サイクル)を行い、人工塩基を含むDNA断片のみを抗FAM抗体で単離することにより、Dsを含むDNA断片の塩基配列を解析することができる例を示す。
5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCC(Ds)TTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’
このDNA断片(最終濃度6fM)に天然型塩基のランダム配列からなる100−merのDNA(最終濃度60nM)を混在させ、人工塩基の基質にFAM−hx−dPnTP(2.5μM)およびdDsTP(50μM)、各天然型塩基の基質にdNTP(300μM)を用いて、DeepVent DNAポリメラーゼで30サイクル(94℃30秒、45℃30秒、65℃4分)のPCR(50μlスケール)を行った。この溶液から20 μl分をCentri-SepTMスピンカラムで処理して、過剰の基質を除いた。得られた溶液を最終濃度で20mM Tris−HCl pH7.6、0.5M NaCl、1mM EDTAを含む溶液(40−50μl)に調製し、この溶液を、予めストレプトアビジン磁気ビーズ(4mg/ml溶液を20μl、New England Biolabs)に固定したビオチン修飾された抗FAM抗体(1mg/ml溶液を5μl、インビトロジェン)と混ぜ、氷上にて30分インキュベートした。溶液を除いた磁気ビーズを緩衝液(100μl)で1回洗浄し、次いで1mM EDTA溶液(pH8.0)を20μl加えて75℃で30秒間加温し、ビーズに結合したDNAを溶出した。溶出されたDNA溶液10μlを用いて、dPa’TP存在下(最終濃度2μM)でシーケンシングを行った。図8に示したとおり、大過剰のランダムなDNA断片が混在する場合でも、PCR産物から人工塩基を含む断片を抗FAM抗体で単離することができ、そして、その後シーケンスを行うことにより、Dsを含むDNA断片の塩基配列を解析することができた。
Claims (17)
- 人工塩基対を含む核酸を複製する方法であって、以下の式I:
Rは、−X−Y、
nは、1ないし12から選択される整数であり;
mは、1ないし12から選択される整数であり;
lは、1ないし12から選択される整数であり;
Xは、−C≡C−CH2−、−C≡C−、−C=C−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され;
Yは、−CH3、−C2H5、−NH2、−OH、−COOH、−CHO、−SH、置換もしくは非置換アリール、−NHCO−Z、−CONH−Z、−NHCONH−Z、−O−Z、−COO−Z、−O−C(=O)−Z、−CO−Z、および、−S−Z、からなる群より選択され、ここでZは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される]
で表される塩基を有するヌクレオチドを含む核酸である鋳型鎖に対し、複製基質として塩基Ds、前記式IIで表される塩基、および/または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行うことにより、塩基Dsと前記式IIで表される塩基の人工塩基対を含む核酸を複製する、前記方法。 - 鋳型鎖が、塩基Dsおよび/または式IIで表される塩基を有するヌクレオチドを少なくとも2つ含むDNAである、請求項1に記載の方法。
- 複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸ではない、請求項1または2に記載の方法。
- 蛍光色素がカルボキシフルオレセイン(FAM)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 機能性置換基を結合した人工塩基を、核酸の複製反応によりDNA中に導入する方法であって、
以下の式I:
複製基質として、以下の式II:
Rは、−X−Y、
nは、1ないし12から選択される整数であり;
mは、1ないし12から選択される整数であり;
lは、1ないし12から選択される整数であり;
Xは、−C≡C−CH2−、−C≡C−、−C=C−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され;
Yは、−CH3、−C2H5、−NH2、−OH、−COOH、−CHO、−SH、置換もしくは非置換アリール、−NHCO−Z、−CONH−Z、−NHCONH−Z、−O−Z、−COO−Z、−O−C(=O)−Z、−CO−Z、および、−S−Z、からなる群より選択され、ここでZは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される]
で表される塩基、塩基Ds、および/または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行い;
それにより、塩基Dsと前記式IIで表される塩基の人工塩基対を含む核酸が生成することにより、機能性置換基を結合した人工塩基がDNA中に導入される;
前記方法。 - 鋳型鎖が、塩基Dsを有するヌクレオチドを少なくとも2つ含む核酸である、請求項5に記載の方法。
- 複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸ではない、請求項5または6に記載の方法。
- 鋳型鎖において、塩基Dsの近傍の配列として、5’−N1N2N3(Ds)N4N5N6−3’(配列番号1)の配列を含み、ここで、N1、N2、N3、N4、N5、N6は天然型の塩基を有するヌクレオチドであって、以下の条件:
(a)N1がチミン(T)もしくはシトシン(C);
(b)N3がシトシン(C);
(c)N4がチミン(T);
(d)N5がチミン(T)もしくはシトシン(C);および
(e)N6がグアニン(G);
からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 蛍光色素がカルボキシフルオレセイン(FAM)である、請求項8に記載の方法。
- 核酸プールの中から人工塩基対を含む核酸を複製し、選択的に回収する方法であって、
(1)以下の式I:
Rは、−X−Y、
nは、1ないし12から選択される整数であり;
mは、1ないし12から選択される整数であり;
lは、1ないし12から選択される整数であり;
Xは、−C≡C−CH2−、−C≡C−、−C=C−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され;
Yは、Zで置換されたアリール、−NHCO−Z、−CONH−Z、−NHCONH−Z、−O−Z、−COO−Z、−O−C(=O)−Z、−CO−Z、および、−S−Z、からなる群より選択され、ここでZは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される機能性置換基である]
で表される塩基、塩基Ds、および/または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸、を用いて核酸の複製反応を行い;
(2)生成した核酸の中から、塩基Dsと前記式IIで表される塩基の人工塩基対を含む核酸を、前記式IIで表される塩基が有する機能性置換基の性質に基づいて選択的に回収する;
ことを含む、前記方法。 - 塩基Dsを有するヌクレオチドを含む核酸が、塩基Dsを有するヌクレオチドを少なくとも2つ含む、請求項10に記載の方法。
- 複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸ではない、請求項10または11に記載の方法。
- 塩基Dsを有するヌクレオチドを含む核酸において、塩基Dsの近傍の配列として、5’−N1N2N3(Ds)N4N5N6−3’(配列番号1)の配列を含み、ここで、N1、N2、N3、N4、N5、N6は天然型の塩基を有するヌクレオチドであって、以下の条件:
(a)N1がチミン(T)もしくはシトシン(C);
(b)N3がシトシン(C);
(c)N4がチミン(T);
(d)N5がチミン(T)もしくはシトシン(C);および
(e)N6がグアニン(G);
からなる群より選択される少なくとも2つ以上の条件を満たす、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 蛍光色素がカルボキシフルオレセイン(FAM)である、請求項13に記載の方法。
- 人工塩基を含む核酸の高効率かつ高選択的な複製を実現するためのDNA中の人工塩基近傍の天然型塩基の配列を決定する方法であって、
(1)以下の式I:
(2)複製基質として、以下の式II:
Rは、−X−Y、
nは、1ないし12から選択される整数であり;
mは、1ないし12から選択される整数であり;
lは、1ないし12から選択される整数であり;
Xは、−C≡C−CH2−、−C≡C−、−C=C−、アリール、チエニル、イミダゾリル、およびチアゾリルからなる群より選択され;
Yは、Zで置換されたアリール、−NHCO−Z、−CONH−Z、−NHCONH−Z、−O−Z、−COO−Z、−O−C(=O)−Z、−CO−Z、および、−S−Z、からなる群より選択され、ここでZは、蛍光色素、ビオチン、抗体に結合する化合物、光架橋剤、キレート剤、アミノ酸、およびペプチドからなる群より選択される機能性置換基である]
で表される塩基、塩基Ds、および/または天然型の塩基、を有する置換または非置換デオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸、を用いて前記DNAライブラリーに対して核酸の複製反応を行い;
(3)塩基Dsと前記式IIで表される塩基の人工塩基対の形成により機能性置換基が導入された核酸を、当該機能性置換基の性質に基づいて回収し;
(4)(3)で回収した核酸に対して、(2)および(3)の工程を繰り返し;そして
(5)得られた核酸の配列を決定する;
ことを含む、前記方法。 - 複製基質が、γ位のリン酸の水酸基が置換されているデオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸ではない、請求項15に記載の方法。
- 請求項15または16に記載の方法により得られる核酸。
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