WO2022131350A1 - Ｄｎａアプタマーのスクリーニングに使用可能な新規人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、およびこれを含有する核酸 - Google Patents

Ｄｎａアプタマーのスクリーニングに使用可能な新規人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、およびこれを含有する核酸 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a deoxyribonucleoside or a deoxyribonucleotide having a novel artificial base that can be used for screening a DNA aptamer, and a nucleic acid containing the deoxyribonucleoside.
  • a DNA aptamer is a single-stranded DNA having a chain length of 30 to 70 bases, which forms a specific thermodynamically stable three-dimensional structure by self-annealing to form a target molecule such as a low molecular weight compound or a protein. It is a general term for DNA molecular species that have become able to interact specifically. Since DNA aptamers have excellent affinity for target molecules and selectivity for interaction with target molecules, they are also called synthetic antibodies and are expected as a modality for next-generation drug discovery.
  • Patent Document 1 the Systematic Evolution of Ligands by EXPONENTIAL ENRICHMENT (SELEX) method expired in 2011, research on aptamers has become active year by year, but the aptamer has been launched as a drug. So far, there is only one McGen® product. The reason for this is thought to be largely due to the pharmacokinetic properties of the DNA aptamer, but in addition to that, it is difficult to obtain an aptamer that binds to the target molecule due to the physical characteristics of the DNA aptamer, in other words. It is also considered that the physical characteristics of the DNA aptamer limit the variety of target molecules from which the aptamer can be obtained.
  • the following factors can be considered as factors that limit the diversity of target molecules from which DNA aptamers can be obtained.
  • the nucleobase which is a constituent unit, is widely used only in the four natural types (A, T, G, C). Therefore, compared to the existence of 20 kinds of natural amino acids, the natural nucleobase has a small number of structural units for forming an interaction, and accordingly, the types of combinations in which an interaction is formed are also scarce.
  • the base portions of the four natural nucleobases are used to directly interact with target molecules such as proteins, but the structure of the natural base portions is poorly flexible and fat.
  • oligonucleic acid containing DNA has a negative charge at the phosphate-binding moiety. For this reason, oligonucleic acid is difficult to interact with a negatively charged target molecule because it causes electrostatic repulsion, and there is a limit to the types of molecules that can be targeted by aptamers.
  • Somalogic, Inc. of the United States uses a method (Post modification method) in which an artificial base having a flexible lipophilic substituent introduced is chemically synthesized after obtaining a seed aptamer by the SELEX method. I tried to solve it.
  • Somalogic has succeeded in obtaining aptamers targeting more than 1000 proteins (Larry Gold, et al., PLos ONE, 2010, 5 (Larry Gold, et al., PLos ONE, 2010, 5). 11): e15004; Gupta S, et al., J. Biol. Chem. (2014) p8706-19).
  • DNA aptamers obtained by the SELEX method often have a phosphate-binding moiety that interacts with a positively charged partial structure of the target molecule, and thus have a positively charged substituent.
  • Introducing a base into an aptamer by Post modification causes electrostatic repulsion and may have an adverse effect. Therefore, in order for the DNA aptamer to acquire sufficient interaction with the negatively charged target molecule, a positively charged substituent is not introduced after the selection by modifying the base moiety.
  • DNA aptamers can be obtained inexpensively in a short period of time because there is no need for post modification.
  • the variety of target proteins for which DNA aptamers can be obtained has not been expanded. The reason is that although Ds is more lipophilic than natural bases, it is structurally less flexible and has sufficient interaction with target molecules to overcome the effects of charge and bind. It is possible that it has not been completed.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and the problems of DNA aptamer acquisition in the above-mentioned conventional method, that is, lack of diversification of interaction with the target molecule, and aptamer acquisition cost by Post modification. It is an object of the present invention to overcome problems such as increase in aptamer and limitation of target molecular species due to electric charge, and to provide a technique for obtaining a highly active aptamer at the lowest possible cost.
  • a novel artificial base that can be used for screening the DNA aptamer of the present invention and a nucleic acid containing the novel have the following constitutions.
  • the first aspect of the present invention is a deoxyribonucleoside or deoxyribonucleotide having the structure of the following formula I as a base.
  • R 1 is a substituted C 1 -C 3 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 4 -C 9 alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, a substituted or no substituted group.
  • Substituted araalkyl group, substituted or unsubstituted heteroaryl group is a substituted C 1 -C 3 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 4 -C 9 alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, a substituted or no substituted group.
  • R 1 may be a phenyl group, a 4-pyridyl group, a naphthyl group, an isopropyl group, or a cyclopentyl group.
  • it may be a deoxyribonucleotide having triphosphate at the 5'-hydroxyl group.
  • it may be a deoxyribonucleoside having a protecting group at the 5'-hydroxyl group and a phosphoramidite group or an H-phosphonate group at the 3'-hydroxyl group.
  • the second aspect of the present invention is a reagent for oligonucleic acid synthesis containing the deoxyribonucleoside or deoxyribonucleotide of the first aspect.
  • a third aspect of the present invention is a pharmaceutical product containing the nucleoside or nucleotide of the first aspect.
  • a fourth aspect of the present invention is a coupling reaction between a 2-bromothiophene derivative and a 2-amino-3-nitro-4-chloropyridine or 7-chloro-3H-imidazole [4,5-b] pyridine derivative.
  • the method for synthesizing deoxyribonucleoside according to the first aspect which comprises the step of performing the above-mentioned step.
  • the coupling reaction is carried out under Suzuki coupling reaction conditions.
  • a fifth aspect of the present invention is an oligodeoxyribonucleic acid incorporating a deoxyribonucleoside having the base of the first aspect.
  • the oligodeoxyribonucleic acid may be a DNA aptamer.
  • a sixth aspect of the present invention is an oligonucleic acid or a derivative thereof, which comprises the oligodeoxyribonucleic acid of the fifth aspect as a partial structure.
  • the seventh aspect of the present invention is a modified product in which an independent arbitrary molecular species is bound to the oligodeoxyribonucleic acid of the fifth aspect, or the oligonucleic acid of the sixth aspect or a derivative thereof.
  • An eighth aspect of the present invention is a human or veterinary drug containing the oligodeoxyribonucleic acid of the fifth aspect, the oligonucleic acid of the sixth aspect or a derivative thereof, or the modified product of the seventh aspect. It is a raw material of the pharmaceutical product, an additive of a health food, or a diagnostic reagent.
  • a ninth aspect of the present invention comprises disease treatment, lifesaving, and symptoms comprising the oligodeoxyribonucleic acid of the fifth aspect, the oligonucleic acid of the sixth aspect or a derivative thereof, or the modified product of the seventh aspect. It is a pharmaceutical product for the purpose of maintenance or maintenance of general condition.
  • the pharmaceutical product may be a medical material, a medical material, a medical device or a medical product.
  • a tenth aspect of the present invention is used for affinity column chromatography containing the oligodeoxyribonucleic acid of the fifth aspect, the oligonucleic acid of the sixth aspect or a derivative thereof, or the modified product of the seventh aspect.
  • the nucleoside having an artificial base according to the present invention can be used for general purposes by synthesizing it by a synthetic method including a step of performing a coupling reaction between a 2-bromothiophene derivative and 2-amino-3-nitro-4-chloropyridine.
  • the coupling reaction can be carried out without using the tin-containing intermediate.
  • waste containing tin is not discharged, so that a synthetic method with a reduced environmental load can be obtained.
  • deoxyribonucleoside having an artificial base according to the present invention By introducing deoxyribonucleoside having an artificial base according to the present invention into a DNA aptamer in advance, the ability of the interaction between the DNA aptamer and the target molecule can be improved by the functional group of the artificial base portion.
  • the DNA in which deoxyribonucleoside having an artificial base of the present invention is incorporated can be PCRed with high fidelity, the functional group having an artificial base can be introduced from the selection stage, and post-modification is necessary. There is no. This reduces the number of steps for acquiring DNA aptamers and enables acquisition at a lower cost.
  • nucleoside having an artificial base containing a heterocycle having a functional group having a positive charge under physiological conditions into a single-stranded DNA library for SELEX, a portion having a negative charge, which has been considered difficult in the past, is obtained. It also allows interaction with the structure.
  • the oligodeoxyribonucleoside incorporating a deoxyribonucleoside having a base according to the present invention can be more flexible and enable appropriate interaction with a wider range of target proteins.
  • the present inventors provide an artificial base that can be used by the SELEX method, that is, PCR can be performed with a high fidelity of the incorporated DNA, and can interact more flexibly with the target molecule.
  • PCR can be performed with a high fidelity of the incorporated DNA, and can interact more flexibly with the target molecule.
  • Ds (7- (2-thienyl) -3H-imidazole [4,5-b] -pyridine-3. -Il) was modified by introducing a lipophilic substituent or a substituent having a cationic partial structure, thereby completing the invention according to the present embodiment.
  • the following effects are expected by introducing a fat-soluble substituent. -Improved affinity by forming a more effective hydrophobic interaction with the target molecule. -Promotion of complex formation with target molecules in water by improving the lipophilicity of the entire molecule and reducing its water solubility.
  • the artificial bases according to this embodiment can be synthesized by a method including a step of performing a coupling reaction with 2-amino-3-nitro-4-chloropyridine.
  • the coupling reaction can be carried out without using a commonly used tin-containing intermediate.
  • waste containing tin is not discharged, so that the synthetic method can be made with a smaller environmental load than the conventional method using a tin-containing intermediate.
  • scaled-up synthesis can be enabled.
  • artificial base refers to an artificially formed nucleobase analog having properties similar to the base portion of a naturally occurring nucleoside.
  • the artificial base according to the present embodiment has a complementary artificial base that selectively and specifically forms a base pair.
  • Artificial base pairs are not limited to hydrogen bonds used for base pair formation between natural bases, but also physical bonds based on the structure or shape of artificial bases and stacking interactions such as ⁇ - ⁇ interactions. , Electrostatic bonds can be formed by sites with positive and negative charges.
  • Ds refers to 7- (2-thienyl) -3H-imidazole [4,5-b] -pyridin-3-yl, which is one of the artificial bases.
  • nucleoside refers to a compound in which a base moiety and a sugar are bound by a glycosidic bond.
  • nucleotide refers to a compound in which a 5'-or 3'-hydroxyl group of a nucleoside is bonded to phosphoric acid to form a phosphoric acid ester.
  • the "fat-soluble substituent” represents a substituent composed of only carbon, hydrogen, and halogen atoms.
  • the "cationic substituent” is a substituent composed of a nitrogen atom, and a substitution in which a nitrogen atom is protonated to form a positive charge in the pH range of 4 to 8 to form a cation. Represents a group.
  • the "derivative of an artificial base” means a base analog in which a part of the artificial base is substituted with the above-mentioned lipophilic substituent, cationic substituent, or other functional group.
  • the nucleoside having an artificial base of this embodiment can also be used as a pharmaceutical product.
  • the modulator of the adenosine receptor (Dilip K Tosh, et al., J. Med. Chem., 2012 (55), 4847-4860). ) Can be used.
  • nucleoside phosphoromidite having an artificial base and nucleoside triphosphate The 3'-phosphoroamideite in which the 5'-hydroxyl acid of the nucleoside having an artificial base of the present embodiment is protected with an appropriate protecting group is under the same conditions as the natural base. It can be used for chemical synthesis of DNA as a component of DNA or oligonucleic acid by the solid phase synthesis method. Specifically, a general-purpose DNA chemical synthesizer in which a 5'-hydroxyl protection-3'-phosphoroamidite of a nucleoside having an artificial base according to the present embodiment is combined with a natural or modified nucleoside phosphoramidite. Can synthesize DNA having a desired chain length.
  • the phosphoramidite moiety may be a commonly used 2-cyanoethyl-N, N'-diisopropylphosphoroamidite, where the 2-cyanoethyl group is another phosphate protecting group, N, N'-diisopropylphosphoroamidite. It may be another suitable amino group. Further, it may be a cyclic amidite in which NO is bonded.
  • the 5'-triphosphate of the nucleoside having the artificial base of this embodiment can be synthesized by a general-purpose chemical synthesis method.
  • nucleic acid containing a nucleoside having an artificial base The nucleotide having an artificial base of this embodiment functions in PCR because it can form a base pair with the complementary artificial base Px. That is, by adding the 5'-triphosphoric acid of the nucleoside having the artificial base of the present embodiment and the 5'-triphosphate of the nucleoside having Px to the PCR solution, the artificial base and Px of the present embodiment can be obtained. Double-stranded DNA with base pairs is amplified by PCR. Therefore, it can be used for screening aptamers by the SELEX method, which requires PCR.
  • the number of artificial bases introduced during DNA synthesis by amplification by PCR is appropriately 1 to 5 in one DNA, preferably 3 or less.
  • the artificial bases contained in one DNA may be the same, and the artificial bases forming different base pairs may be included. good. Further, a base pair may be formed in the same single chain to form a secondary structure or a tertiary structure.
  • “Aptamer” generally refers to a medium-sized (10 to 100 bases) oligonucleic acid or peptide that binds to a specific molecule, or a derivative or modified product thereof. Oligonucleic acids or DNAs that include the artificial base of this embodiment and bind to a particular molecule fall into the category of DNA aptamers.
  • the DNA aptamer can also be used as the aptamer itself, but if necessary, at the 5'end or 3'end, it has its own primary structure and its own primary structure against degradation by enzymatic degradation or physical stimuli such as light and heat.
  • Aptamers with oligonucleic acids added that have other functions such as protecting and stabilizing secondary and three-dimensional structures, PEG (polyethylene glycol)-and glycosylated modifiers, drug complexes, antibodies -It can also be used as a modified product such as an aptamer complex, a homopolyvalent aptamer such as antibody, and a hetero-polyvalent aptamer such as polyethylene.
  • the DNA aptamer produced by introducing the artificial base of the present embodiment is a specific human or animal drug or raw material thereof, medical material, a tool for drug delivery, a specific example as exemplified by affinity column chromatography. It can be used as a tool or module for substance or cell separation / purification, a sensor for detecting a specific substance, an additive for health foods, or a diagnostic reagent.
  • affinity column chromatography a substance selectively bound to a DNA aptamer can be separated by binding a DNA aptamer to a carrier and providing a sample to the column chromatography provided with the carrier.
  • Apheresis is a specific example of the application of affinity column chromatography to medical materials or medical devices.
  • nucleic acid refers to a biopolymer in which a plurality of nucleotides are linked via a phosphodiester bond.
  • DNA refers to a biopolymer in which deoxyribonucleotides are linked via a phosphodiester bond.
  • a part of the phosphate diester bond between nucleotides may be a modified phosphate such as phosphorothioate.
  • nucleic acid includes single-stranded or double-stranded DNA.
  • the "nucleic acid”, “oligonucleic acid” or “nucleic acid molecule” herein may form a triple or quadruplex, and in some cases, a chimeric molecule of DNA and RNA. There may be.
  • the 2'-position of deoxyribose or ribose forming a nucleoside may be modified with fluorine, a methoxy group or the like.
  • 2-Bromothiophene (50.0 g, 307 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (700 ml) under an argon atmosphere and cooled in a dry ice / acetone bath (internal temperature ⁇ 60 ° C.). Tetramethylethylenediamine (55.5 ml, 368 mmol) was added, a 1.1 M n-hexane / tetrahydrofuran solution (355 ml, 368 mmol) of lithium diisopropylamide was added dropwise while keeping the internal temperature below ⁇ 55 ° C., and the mixture was stirred as it was for 1 hour. ..
  • Example 1 a deoxynucleoside (compound 1) containing a base having a benzyl group at the 5-position of thiophene of Ds was synthesized, but another 5-position of thiophene of Ds was synthesized by the same method as the synthesis of compound 1.
  • Deoxynucleosides with functional groups can be synthesized.
  • Example 2 a 3'-phosphoromidite of a deoxynucleoside containing a base having a benzyl group at the 5-position of thiophene of Ds was synthesized, but another functional group was synthesized at the 5-position of thiophene of Ds by the same method. 3'-Phosphoramidite of the deoxynucleoside having the above can be synthesized.
  • Example 3 5'-triphosphate of a deoxynucleoside containing a base having a benzyl group at the 5-position of thiophene of Ds was synthesized.
  • 5'-triphosphate of deoxynucleoside having another functional group at the 5-position of thiophene of Ds can be synthesized.
  • Triphenylphosphine (123.57 g, 471 mmol) was added to bromocyclopentane (78.0 g, 523 mmol) under an argon atmosphere, the mixture was heated to 135 to 140 ° C., and the mixture was stirred as it was for 4.5 hours. After cooling to 40 ° C., toluene (100 mL) was added, the solid was filtered, the filtered solid was washed with toluene, dried under reduced pressure, and cyclopentyltriphenylphosphonium bromide (135.9 g, 82 wt%, yield: 57.5%).
  • reaction suspension After stirring for 15 minutes after all NaH has been added, the reaction suspension is cooled to 30 ° C., poured into ice water (4 L), extracted twice with ethyl acetate (2 L) and the organic layer is 20%-. After washing with a saline solution, the mixture was concentrated under reduced pressure. Heptane (500 mL) was added to the concentrated residue and suspended (ultrasound), and the suspension was filtered. The filtrate was washed with heptane and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The concentrated residue was purified by column chromatography (silica gel, 1 kg, heptane) to obtain 2-bromo-5- (cyclopentylidenemethyl) thiophene (34.2 g, 67.3%).
  • the reaction mixture was then cooled and poured into a mixed solvent of water (500 mL) -heptane (300 mL) -ethyl acetate (300 mL) and the insoluble material filtered.
  • the organic layer was separated and the aqueous layer was extracted again with heptane (200 mL) -ethyl acetate (200 mL).
  • the organic layer was washed with saturated brine (400 mL), dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to give a crude product (82.9 g).
  • Heptane (300 mL) was added, and concentration under reduced pressure was performed again.
  • the reaction mixture was returned to room temperature, poured into water (500 mL) -ethyl acetate (500 mL), and the insoluble material was filtered through cerite. The organic layer was separated and the aqueous layer was extracted again with ethyl acetate (500 mL). The organic layer was washed with saturated brine (300 mL) (again, insoluble material was filtered), dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to obtain a crude product (44.3 g).
  • the obtained 4- [5- (cyclopentylidenemethyl) -2-thienyl] -3-nitro-pyridine-2-amine (impure) was divided into two, and each was again subjected to column chromatography (silica 200 g, chloroform: acetate).
  • lithium diisopropylamide (1.08 M n-hexane / tetrahydrofuran solution, 50.0 mL, 54.1 mmol, 1.2 eq.
  • lithium diisopropylamide 50.0 mL, 54.1 mmol, 1.2 eq.
  • a solution of 2-Bromomethyl naphthalene (12.0 g, 54.1 mmol, 1.2 eq.) In tetrahydrofuran (20 mL) was added dropwise, the mixture was pulled up from a dry ice / acetone bath, heated to room temperature, and then stirred for 19 hours.
  • Example 1 [(2R) -3- (4-methylbenzoyl) oxy-5- [7- [5- (2-naphthylmethyl) -2-thienyl] produced in step 4 in the same manner as in step 7. ]
  • nucleoside 3'-amidite containing an artificial base of the present embodiment is used in a commonly used solid phase synthesis method. It can be used for the synthesis of oligonucleic acid under the same conditions as the natural base nucleoside 3'-amidite.
  • Compound 2 was applied to a solid phase synthesis method, and the obtained DNA strand was purified by polyacrylamide gel electrophoresis. As a result of analyzing the mass of the purified DNA chain by the MS spectrum, it was confirmed that the molecular weight was 31850.2 (theoretical value: 3185.29) and that the DNA containing the target Dsbn was obtained.
  • nucleoside 5'-triphosphate having an artificial base Application of nucleoside 5'-triphosphate having an artificial base to PCR
  • the artificial base 7- (5-benzyl-2-thienyl) -3H-imidazole [4,5-b] -pyridine-3-yl is used as a base.
  • the DNA fragment obtained by PCR was analyzed by LC / MS in order to confirm that the nucleotide (hereinafter referred to as dDsbn) contained in the portion was incorporated into the DNA strand by DNA polymerase and amplified.
  • the single-stranded DNA containing dDsbn prepared in Example 8 was used as a template for the following PCR.
  • PCR was performed with AkcuPrime Pfx DNA polymerase (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the composition of the solution for PCR is 1xAccuPrime Pfx Reaction Mix (including dNTP 0.3 mM, 1.0 mM ⁇ 4 ), 0.5 mM ⁇ 4 , 0.1 mM dNTP, 0.5 ⁇ M Forward Primer (see below for sequence), 0.5 ⁇ M Reverse Primer (see sequence below), 0.05 mM dDsbnTP, 0.05 mM diol1-dPxTP (1- (2-deoxy- ⁇ -D-ribofuranosyl) -4-[(4-pentin-1,2-diol) ) -1-Propinyl] -2-nitropyrrole-5'triphosphate), 0.05 unit / ⁇ L AccuPrime Pfx DNA polymerase.
  • the retention time of the main component of the 60 cycle PCR product was 4.44 seconds, and the measured molecular weight was 31836.2.
  • the data are shown in Table 1.
  • the retention time of the main component contained in each DNA product obtained from 20, 40, and 60 cycles is almost the same as the control, and the molecular weight of the measured value is 0.05% different from the theoretical value.
  • dDsbn of the present embodiment was recognized by DNA polymerase and incorporated into the replicated DNA fragment by PCR.
  • Example 10 Screening using a single-stranded DNA library containing a nucleoside with an artificial base ⁇ Acquisition of DNA aptamer for VEGF165>
  • the single-stranded DNA library containing dDsbn used in the screening was synthesized by a chemical synthesis method, and the obtained DNA was purified by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a single-stranded DNA library containing dDsbn in a random region was dissolved in PBS solution and a folding operation (95 ° C., 5 minutes ⁇ room temperature, 20 minutes ⁇ on ice, 5 minutes) was performed to form tertiary structure. did. Then, a PBS solution containing NP-40 was added, and the solution composition was prepared to a PBS solution (binding solution) containing 0.005% NP-40. Then, the target protein VEGF 165 was added, and the mixture was inverted and mixed at room temperature for 30 minutes.
  • Ez-Link Sulfo-NHS-Lc-biotin manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • glycine was added to terminate the reaction.
  • Amicon UltraFilter-0.5 50k manufactured by MERCK
  • PCR was performed using the AcuPrime Pfx DNA polymerase to amplify the recovered single-stranded DNA pool.
  • the composition of the PCR reaction solution is 1x AccuPrime Pfx Reaction Mix (including dNTP 0.3 mM, 1.0 mM ⁇ 4 ), 0.5 mM ⁇ 4 , 0.1 mM dNTP, 0.5 ⁇ M Forward Primer for selection (sequence is as follows). See), Reverse Primer for 0.5 ⁇ M selection (see below for sequence), 0.05 mM dDsbnTP, 0.05 mM diol1-dPxTP, 0.05 unit / ⁇ L AccuPrime Pfx DNA polymerase.
  • the PCR cycle conditions are 94 ° C., 2 minutes- (94 ° C., 15 seconds-65 ° C., 210 seconds) x n cycles.
  • the number of cycles n was different for each round, but the number of cycles required to amplify to an amount that could be purified by polyacrylamide gel electrophoresis was performed.
  • Purification of the single-stranded DNA pool from the amplified DNA fragment is performed by 10% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7M urea, and the DNA fragment is extracted from the gel piece containing the DNA fragment and desalted. Ethanol precipitation was performed on the subject to purify the single-stranded DNA pool that binds to the target protein. By repeating this operation under the conditions of changing the concentration of the single-stranded DNA pool and the target protein and the washing step, the concentration of the sequence bound to the target protein was promoted.
  • the magnetic beads are added to the pool after the folding operation and mixed by inversion for 30 minutes at room temperature.
  • the target protein was added to the pool solution from which the magnetic beads had been removed and reacted.
  • EMSA electrospray assay
  • a single-stranded DNA pool was prepared in a binding solution to 0.2 ⁇ M and folded (95 ° C., 5 minutes ⁇ (-0.1 ° C./sec) ⁇ 25 ° C.) to form tertiary structure. rice field.
  • the target protein was diluted with a binding solution to a predetermined concentration, mixed with the folded DNA solution, and kept warm at 37 ° C. for 30 minutes. The sample after heat insulation was run on a 10% undenatured polyacrylamide gel.
  • a next-generation sequencer (Ion PGM system, manufactured by Thremo fisher) was used to analyze the sequences contained in the DNA pool obtained by screening. As a result of clustering the sequence group in which the inserted base length between the Forward primer for selection and the Reverse Primer for selection did not change and the artificial base dDsbn remained, a single sequence occupied about 80%.
  • the oligomer corresponding to the candidate sequence was synthesized by a chemical synthesis method and purified by OPC (cartridge).
  • the purified candidate sequence oligomer (T-00199, sequence see below) was prepared in the binding solution to 0.2 ⁇ M and folded (95 ° C., 5 minutes ⁇ (-0.1 ° C./sec) ⁇ 25. °C) was carried out to form a tertiary structure.
  • VEGF165 was diluted with a binding solution to 0.2 ⁇ M, mixed with the folded DNA solution, and kept warm at 37 ° C.
  • a next-generation sequencer (Ion PGM system) was used to analyze the sequences contained in the DNA pool obtained by screening. As a result of clustering the sequence group in which the inserted base length between the Forward primer for selection and the Reverse Primer for selection did not change and the artificial base dDsbn remained, the most abundant single sequence was about 8%. there were.
  • EMSA ⁇ Evaluation of binding affinity of candidate sequence to target protein by EMSA> Whether or not the most concentrated candidate sequence binds to the target protein was analyzed by EMSA.
  • an oligomer corresponding to the candidate sequence (T-00202, sequence see below) was synthesized by a chemical synthesis method, and purified by OPC (cartridge).
  • the purified candidate sequence oligos are prepared in the binding solution to 0.2 ⁇ M, and the folding operation (95 ° C., 5 minutes ⁇ (-0.1 ° C./sec) ⁇ 25 ° C.) is performed to carry out the tertiary structure.
  • the folding operation 95 ° C., 5 minutes ⁇ (-0.1 ° C./sec) ⁇ 25 ° C.
  • the sIL-6R was then diluted to 0.2 ⁇ M with the binding solution, mixed with the folded DNA solution and kept warm at room temperature for 30 minutes.
  • the sample after heat insulation was run on an 8% undenatured polyacrylamide gel, and it was analyzed whether the band of the DNA-protein complex could be detected.
  • DNA was stained with SYBR Gold and detected by blue light at 470 nm (2 lanes on the left side of FIG. 4). As a result, a new band was detected in the presence of sIL-6R, and it was clarified that the sequence identified in this screening is an aptamer that binds to sIL-6R.
  • nucleoside 3'-amidite containing an artificial base of the present embodiment is used in a commonly used solid phase synthesis method. It can be used for the synthesis of oligonucleic acid under the same conditions as the natural base nucleoside 3'-amidite.
  • Compound 3 was applied to the solid phase synthesis method, and the obtained DNA strand (T-00243, see below for the sequence) was purified by polyacrylamide gel electrophoresis. The inclusion of dDscp in the synthesized DNA strand was analyzed using a next-generation sequencer (Ion PGM system).
  • Example 12 Application of nucleoside 5'-triphosphate with artificial base to PCR Artificial base 7- (5-cyclopentylmethylthiophene-2-yl) -3H-imidazole [4,5-b] pyridine-3-yl (
  • dDscp nucleotide having Dsc () as a base portion
  • the DNA fragment obtained by PCR was analyzed by a next-generation sequencer.
  • the single-stranded DNA (T-00243) containing dDscp prepared in Example 11 was used as a template DNA for the following PCR reaction.
  • PCR was performed with AccuPrime Pfx DNA polymerase.
  • the composition of the solution for PCR is 1xAccuPrime Pfx Reaction Mix (including dNTP 0.3 mM, 1.0 mM ⁇ 4 ), 0.5 mM ⁇ 4 , 0.1 mM dNTP, 0.5 ⁇ M Forward Primer, 0.5 ⁇ M Reverse Primer, 0. .05 mM dDscpTP, 0.05 mM diol1-dPxTP, 0.05 unit / ⁇ L AccuPrime Pfx DNA polymerase.
  • 4.8x10 9 molecules of single-stranded DNA T-00243 were added to the reaction solution having this composition, and PCR was carried out at 94 ° C.
  • the product was prepared.
  • the obtained PCR product was purified by polyacrylamide gel electrophoresis, and a single-stranded DNA fragment corresponding to the template DNA was isolated. Using the isolated and purified single-stranded DNA, amplification and purification of the DNA fragment were repeated under the above-mentioned PCR conditions to prepare a single-stranded DNA that had been subjected to a total of 60 cycles.
  • Example 13 Screening using a single-stranded DNA library containing a nucleoside with the artificial base dDscp ⁇ Acquisition of DNA aptamers for VEGF165>
  • the single-stranded DNA library containing dDscp used in the screening was synthesized by a chemical synthesis method, and the obtained DNA was purified by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • This single-stranded DNA library was different from the Primer combination used in Example 10, and used Forward Primer 2 and Reverse Primer 2 for selection (see below for the sequence).
  • the step of concentrating the binding sequence to VEGF165 using a single-stranded DNA library containing dDscp in a random region was carried out in the same procedure as the screening method shown in Example 6.
  • the DNA pool obtained in the screening step was evaluated by EMSA to see if it contained a DNA sequence that binds to VEGF165.
  • a folding operation was performed to form a three-dimensional structure, and VEGF165 was diluted with a binding solution to a predetermined concentration. Each was mixed, kept warm at 37 ° C. for 30 minutes and analyzed on an 8% undenatured polyacrylamide gel (FIG. 5). As a result, a clear shift band bound to VEGF165 was detected in the DNA pool of the final round, and it was clear that the DNA pool obtained by screening was enriched with the DNA sequence binding to VEGF165. became.
  • a next-generation sequencer (Ion PGM system) was used to analyze the sequences contained in the DNA pool obtained by screening. As a result of clustering the sequence group in which the inserted base length between Forward primer2 for selection and Reverse Primer2 for selection did not change and the artificial base dDscp remained, the most abundant single sequence was about 30%. there were.
  • EMSA ⁇ Evaluation of binding affinity of candidate sequence to target protein by EMSA> Whether or not the most concentrated candidate sequence binds to the target protein was analyzed by EMSA.
  • an oligomer (T-00244, sequence see below) corresponding to the candidate sequence was synthesized by a chemical synthesis method, and purified by OPC (cartridge).
  • the purified candidate sequence oligos are prepared in the binding solution to 0.2 ⁇ M, and the folding operation (95 ° C., 5 minutes ⁇ (-0.1 ° C./sec) ⁇ 25 ° C.) is performed to carry out the tertiary structure.
  • the folding operation 95 ° C., 5 minutes ⁇ (-0.1 ° C./sec) ⁇ 25 ° C.
  • VEGF165 was then diluted to 0.2 ⁇ M with the binding solution, mixed with the folded DNA solution and kept warm at 37 ° C. for 30 minutes. The sample after heat insulation was run on an 8% undenatured polyacrylamide gel, and it was analyzed whether the band of the DNA-protein complex could be detected. DNA was stained with SYBR Gold and detected with 470 nm blue light. As a result, a new band was detected in the presence of VEGF165 (two lanes on the left side of FIG. 6), indicating that the sequence identified in this screening is an aptamer that binds to VEGF165.
  • the DNA pool obtained in the screening step was evaluated by EMSA to see if it contained a DNA sequence that binds to sIL-6R.
  • a folding operation was performed to form a three-dimensional structure, and sIL-6R was diluted with a binding solution to a predetermined concentration. Each was mixed, kept warm at room temperature for 30 minutes and analyzed on an 8% undenatured polyacrylamide gel (FIG. 7). As a result, a clear shift band bound to the increased concentration of sIL-6R was detected in the DNA pool of the final round, and the DNA sequence obtained by screening had a DNA sequence that binds to sIL-6R. Was found to be concentrated.
  • a next-generation sequencer (Ion PGM system) was used to analyze the sequences contained in the DNA pool obtained by screening. As a result of clustering a group of sequences in which the inserted base length between Forward primer2 for selection and Reverse Primer2 for selection did not change and the artificial base dDscp remained, a single sequence having a high abundance ratio of about 22% was identified.
  • EMSA ⁇ Evaluation of binding affinity of candidate sequence to target protein by EMSA> Whether or not the most concentrated candidate sequence binds to the target protein was analyzed by EMSA.
  • an oligomer (T-00247, sequence see below) corresponding to the candidate sequence was synthesized by a chemical synthesis method, and purified by OPC (cartridge).
  • the purified candidate sequence oligos are prepared in the binding solution to 0.2 ⁇ M, and the folding operation (95 ° C., 5 minutes ⁇ (-0.1 ° C./sec) ⁇ 25 ° C.) is performed to carry out the tertiary structure.
  • the folding operation 95 ° C., 5 minutes ⁇ (-0.1 ° C./sec) ⁇ 25 ° C.
  • the sIL-6R was then diluted to 0.6 ⁇ M with the binding solution, mixed with the folded DNA solution and kept warm at room temperature for 30 minutes.
  • the sample after heat insulation was run on an 8% undenatured polyacrylamide gel, and it was analyzed whether the band of the DNA-protein complex could be detected.
  • DNA was stained with SYBR Gold and detected with 470 nm blue light. As a result, a new band was detected in the presence of sIL-6R (2 lanes on the left side of FIG. 8), demonstrating that the sequence identified in this screening is an aptamer that binds to sIL-6R. rice field.

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Abstract

ターゲット分子との相互作用の多様化の欠如、Ｐｏｓｔ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎによるアプタマー取得コストの増大、電荷に起因するターゲット分子種の制限といった，従来法におけるＤＮＡアプタマー取得の問題点を克服し、できるだけ安価に高活性なアプタマーを取得する技術を提供することを目的とする。下記式Ｉの構造を塩基として有するヌクレオシドまたはヌクレオチドを提供する。下記式Ｉ中、Ｒ１は、置換Ｃ１－Ｃ３アルキル基、置換または無置換Ｃ4－Ｃ９アルキル基、置換または無置換のアリール基、置換または無置換のシクロアルキル基、置換または無置換のアラアルキル基、置換または無置換のヘテロアリール基である。

Description

ＤＮＡアプタマーのスクリーニングに使用可能な新規人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、およびこれを含有する核酸
　本発明は、ＤＮＡアプタマーのスクリーニングに使用可能な新規人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオチド、およびこれを含有する核酸に関するものである。
　ＤＮＡアプタマーは、３０塩基から７０塩基の鎖長を有する１本鎖ＤＮＡが、自己アニーリングにより熱力学的に安定な特定の３次元構造を形成することで、低分子化合物やタンパク質等のターゲット分子と特異的に相互作用できるようになったＤＮＡ分子種の総称である。ＤＮＡアプタマーはそのターゲット分子への親和性やターゲット分子との相互作用の選択性が抗体並みに優れていることから、合成抗体ともよばれ、次世代の創薬のためのモダリティとして期待されている。
　一方で、２０１１年にＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法の特許（特許文献１）の存続期間が満了して以降、アプタマーの研究は年々活発化しているものの、薬として上市できたアプタマーはこれまでにマクジェン（登録商標）１製品のみである。その理由としては、ＤＮＡアプタマーの薬物動態的な性質が大きな原因であると考えられるが、それ以外に、ＤＮＡアプタマーが有する物性に起因する、ターゲット分子に結合するアプタマーの取得しにくさ、換言すると、ＤＮＡアプタマーが有する物性により、アプタマーを取得可能なターゲット分子の多様性が制限されていることも一因であると考えられる。
米国特許第５４７５０９６号明細書
　ＤＮＡアプタマーを取得可能なターゲット分子の多様性に制限が生じるのには、以下のような要因が考えられる。
（１）ＤＮＡの場合、構成単位である核酸塩基が、汎用されるのは天然型の４種（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）に限られている。このため、天然型アミノ酸が２０種存在することと比較すると、天然型核酸塩基は相互作用を形成するための構成単位が少ないため、それに伴い、相互作用が形成される組み合わせの種類も乏しい。
（２）ＤＮＡの場合、天然型の４種の核酸塩基の塩基部分が、タンパク質等のターゲット分子と直接相互作用するのに用いられるが、天然型の塩基部分の構造は柔軟性に乏しく、脂溶性もそれほど大きくないことから、脂溶性相互作用を期待する部分構造としては適切とはいえない。
（３）ＤＮＡを含むオリゴ核酸は、リン酸結合部分に負電荷を持つ。このためオリゴ核酸は、負電荷を持ったターゲット分子とは静電反発が生じることから相互作用しにくく、アプタマーのターゲットにできる分子の種類に制限がある。
　ＤＮＡアプタマー創生における上記の制限については、米国のソマロジック社が、ＳＥＬＥＸ法によるシードアプタマー取得後に、フレキシブルな脂溶性置換基を導入した人工塩基を化学合成的に導入する手法（Ｐｏｓｔ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ法）により解決を試みた。試行錯誤を経てＤＮＡアプタマーの活性を最適化することで、ソマロジック社は１０００を超えるタンパク質をターゲット分子とするアプタマーの取得に成功している（Ｌａｒｒｙ　Ｇｏｌｄ，ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，２０１０，５（１１）：ｅ１５００４；Ｇｕｐｔａ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１４）ｐ８７０６－１９）。
　しかしながら、現段階ではオリゴ核酸の高次構造を推定する手段が無いため、脂溶性置換基を導入した人工塩基の導入が活性の向上につながるとは限らない。このＰｏｓｔ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ法は、多くの誘導化アプタマー合成による試行錯誤が必要であることから非常に効率が悪く高コストで、活性もＫｄ値で数十ｎＭが限度となっており、安価なアプタマー取得法としては改善の余地がある。加えて、上記したように、ＤＮＡアプタマーはリン酸結合部分に負電荷を有するため、負電荷をもったターゲット分子とは相互作用をしにくい。負電荷をもったターゲット分子に対して結合するＤＮＡアプタマーを獲得する、または改善する手段としては、正電荷をもった置換基を導入した人工塩基をＤＮＡアプタマーに導入することが方策として考えられる。しかしながら、ＳＥＬＥＸ法で取得したＤＮＡアプタマーは、自身が有するリン酸結合部分がターゲット分子の正電荷をもつ部分構造と相互作用をしている場合が多いため、正電荷をもった置換基を有する人工塩基をＰｏｓｔ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎでアプタマーへ導入することは、静電的な反発を招き、逆効果となるおそれがある。このため、負電荷をもったターゲット分子への十分な相互作用をＤＮＡアプタマーが獲得するためには、正電荷をもった置換基をセレクションの後で塩基部分を修飾して導入するのではなく、ＳＥＬＥＸ法に用いるＤＮＡライブラリーに前もって正電荷をもった置換基を有する人工塩基を導入しておくことが重要であり好ましいと考えられる。換言すると、Ｐｏｓｔ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ法に基づくと、負電荷をもったターゲット分子に対して効率的にＤＮＡアプタマーを得ることは困難であると考えられる。
　一方で、平尾らは、理化学研究所在籍中に、高いフィデリティでＰＣＲが可能な、高脂溶性の人工塩基対（Ｄｓ－Ｐｘ）を開発し（特許第５４２４４１４号；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９（３７），ｅ１４）、数個のＤｓ（７－（２－チエニル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジン－３－イル）のみをＳｅｌｅｘで使用するライブラリーに導入してアプタマーのセレクションを行い、いくつかのタンパク質についてＫｄ値で数ｐＭという極めて高親和性を有するアプタマーの取得に成功している（特許第６３０７６７５号；Ｍｉｃｈｉｋｏ　Ｋｉｍｏｔｏ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３（３１），４５３－４５７）。この方法は、ｐｏｓｔ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎの必要がないため、短期間に安価でＤＮＡアプタマーの取得ができることを特徴の一つとする。その一方で、ＤＮＡアプタマーを取得可能なターゲットタンパク質の多様性を拡大するには至っていない。その理由としては、Ｄｓは、天然塩基と比較すると脂溶性は高くなっているものの、構造上柔軟性に乏しく、電荷の影響を克服して結合するに足りる、十分なターゲット分子との相互作用ができていないことが考えられる。
　本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、上述した従来法におけるＤＮＡアプタマー取得の問題点、すなわち、ターゲット分子との相互作用の多様化の欠如、Ｐｏｓｔ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎによるアプタマー取得コストの増大、電荷に起因するターゲット分子種の制限といった問題を克服し、できるだけ安価に高活性なアプタマーを取得する技術を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明のＤＮＡアプタマーのスクリーニングに使用可能な新規人工塩基およびこれを含有する核酸は、以下の構成を有する。
　本発明の第１の態様は、下記式Ｉの構造を塩基として有するデオキシリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
（式Ｉ中、Ｒ１は、置換Ｃ１－Ｃ３アルキル基、置換または無置換Ｃ4－Ｃ９アルキル基、置換または無置換のアリール基、置換または無置換のシクロアルキル基、置換または無置換のアラアルキル基、置換または無置換のヘテロアリール基である）
　前記第１の態様においては、前記式Ｉ中、Ｒ１がフェニル基、４－ピリジル基、ナフチル基、イソプロピル基、シクロペンチル基であってもよい。
　本発明の前記第１の態様においては、５´－水酸基に三リン酸を有するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
　本発明の前記第１の態様においては、５´－水酸基に保護基を有し、３´－水酸基にホスホロアミダイト基またはＨ－ホスホネート基を有するデオキシリボヌクレオシドであってもよい。
　本発明の第２の態様は、前記第１の態様のデオキシリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、オリゴ核酸合成用試薬である。
　本発明の第３の態様は、前記第１の態様のヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、医薬品である。
　本発明の第４の態様は、２－ブロモチオフェン誘導体と、２－アミノ－３－ニトロ－４－クロロピリジンまたは７－クロロ－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン誘導体とのカップリング反応を行う工程を含む、前記第１の態様のデオキシリボヌクレオシドの合成法である。
　前記第４の態様においては、前記カップリング反応を、鈴木カップリング反応条件下で行う。
　本発明の第５の態様は、前記第１の態様の塩基を有するデオキシリボヌクレオシドが組み込まれたオリゴデオキシリボ核酸である。前記オリゴデオキシリボ核酸が、ＤＮＡアプタマーであってもよい。
　本発明の第６の態様は、前記第５の態様のオリゴデオキシリボ核酸を部分構造として含む、オリゴ核酸またはその誘導体である。
　本発明の第７の態様は、前記第５の態様のオリゴデオキシリボ核酸、または前記第６の態様のオリゴ核酸もしくはその誘導体に、独立した任意の分子種を結合させた修飾体である。
　本発明の第８の態様は、前記第５の態様のオリゴデオキシリボ核酸、前記第６の態様のオリゴ核酸もしくはその誘導体、または前記第７の態様の修飾体を含有する、ヒトもしくは動物用医薬品、該医薬品の原料、健康食品の添加物、または診断試薬である。
　本発明の第９の態様は、前記第５の態様のオリゴデオキシリボ核酸、前記第６の態様のオリゴ核酸もしくはその誘導体、または前記第７の態様の修飾体を含有する、疾患治療、救命、症状の維持管理または全身状態の維持管理を目的とした医薬用品である。該医薬用品は、医療用材料、医療用資材、医療機器または医療用製品であってもよい。
　本発明の第１０の態様は、前記第５の態様のオリゴデオキシリボ核酸、前記第６の態様のオリゴ核酸もしくはその誘導体、または前記第７の態様の修飾体を含有する、アフィニティーカラムクロマトグラフィーに用いる担体、該担体を備えたカラム、または該担体を備えた物質分離用機器もしくは医療機器である。
　本発明に係る人工塩基を有するヌクレオシドは、２－ブロモチオフェン誘導体と、２－アミノ－３－ニトロ－４－クロロピリジンとのカップリング反応を行う工程を含んだ合成法により合成することで、汎用されているスズ含有中間体を用いることなくカップリング反応を行うことができる。これにより、スズを含む廃棄物を排出させることがないため、環境負荷を小さくした合成法とすることができる。また、ヌクレオシドの合成にあたり、よりスケールアップした合成を可能とすることができる。
　本発明に係る人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシドをＤＮＡアプタマーに予め導入しておくことで、人工塩基部分が有する官能基によって、ＤＮＡアプタマーとターゲット分子との相互作用の能力を向上させることができる。また、本発明の人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシドが組み込まれたＤＮＡは、高いフィデリティでのＰＣＲが可能であることから、人工塩基が有する官能基をセレクションの段階から導入可能であり、ｐｏｓｔ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎの必要がない。これにより、ＤＮＡアプタマー取得の工程が減り、より安価での取得が可能となる。また、生理的条件で正電荷をもつ官能基を有するヘテロ環を含む人工塩基を有するヌクレオシドをＳＥＬＥＸ用一本鎖ＤＮＡライブラリーに導入することで、従来難しいとされていた負電荷をもった部分構造との相互作用も可能となる。
　本発明に係る塩基を有するデオキシリボヌクレオシドが組み込まれたオリゴデオキシリボ核酸は、よりフレキシブルに、より広範なターゲットタンパク質と適切な相互作用を可能とすることができる。
ｄＤｓｂｎ体プールを用いてＶＥＧＦ１６５に対してスクリーニングを実施して得られたＤＮＡプールの、標的タンパク質に対する親和性を示すＥＭＳＡの結果を示す図である。 ｄＤｓｂｎ体候補配列のＶＥＧＦ１６５への結合親和性を示すＥＭＳＡの結果を示す図である。 ｄＤｓｂｎ体プールを用いてｓＩＬ－６Ｒに対してスクリーニングを実施して得られたＤＮＡプールの、標的タンパク質に対する親和性を示すＥＭＳＡの結果を示す図である。 ｄＤｓｂｎ体候補配列のｓＩＬ－６Ｒへの結合親和性を示すＥＭＳＡの結果を示す図である。 ｄＤｓｃｐ体プールを用いてＶＥＧＦ１６５に対してスクリーニングを実施して得られたＤＮＡプールの、標的タンパク質に対する親和性を示すＥＭＳＡの結果を示す図である。 ｄＤｓｃｐ体候補配列のＶＥＧＦ１６５への結合親和性を示すＥＭＳＡの結果を示す図である。 ｄＤｓｃｐ体プールを用いてｓＩＬ－６Ｒに対してスクリーニングを実施して得られたＤＮＡプールの、標的タンパク質に対する親和性を示すＥＭＳＡの結果を示す図である。 ｄＤｓｃｐ体候補配列のｓＩＬ－６Ｒへの結合親和性を示すＥＭＳＡの結果を示す図である。
　本発明者らは、上述した従来技術の問題点に鑑みて、ＳＥＬＥＸ法で使用可能、すなわち組み込んだＤＮＡが高いフィデリティでＰＣＲが可能であり、ターゲット分子とよりフレキシブルに相互作用できる人工塩基を提供することが課題を解決するための手段となり得ると考え、具体的には、以下の条件を満たす人工塩基の開発を目的に鋭意研究を行った。
（１）ＤＮＡまたはオリゴ核酸のユニットとして化学合成で使用可能である。
（２）ＰＣＲで増幅可能である。
（３）ターゲット分子とフレキシブルに適切な相互作用できる部分構造を有する。
（４）ターゲット分子と相互作用する条件下で正電荷をもつ部分構造を有する。
　本発明者らは、ＰＣＲで増幅可能でありＳＥＬＥＸ法にも使用可能である知見が得られているＤｓ（７－（２－チエニル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジン－３－イル）に、脂溶性置換基またはカチオン性の部分構造をもつ置換基を導入して改変することで、本実施形態に係る発明を完成するに至った。
　脂溶性置換基の導入により、以下のような効果が期待される。
・ターゲット分子とのより効果的な疎水性相互作用を形成することによる親和性の向上。
・分子全体の脂溶性の向上で水溶性が低下することによる、水中でのターゲット分子との複合体の形成促進。
　また、カチオン性の部分構造を持つ置換基の導入については以下のような効果が期待される。
・従来、ＤＮＡアプタマーが結合しにくいとされてきた負電荷を持つターゲット分子についても、適切な相互作用が期待でき、アプタマーの取得の可能性が向上する。
・従来、アプタマーを取得しにくいとされてきた糖鎖についても、アプタマー取得の可能性が向上する。
　以下に、本実施形態に係る人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオチド、およびこれを含有するオリゴデオキシリボ核酸の実施形態について説明する。
１．人工塩基を有するヌクレオシドおよびヌクレオチド
　本実施形態に係る人工塩基は、２－アミノ－３－ニトロ－４－クロロピリジンとのカップリング反応を行う工程を含む方法により合成することができる。当該カップリング反応を、鈴木カップリング反応条件で行うことにより、汎用されているスズ含有中間体を用いることなくカップリング反応を行うことができる。これにより、スズを含む廃棄物を排出させることがないため、スズ含有中間体を用いる従来法と比較して環境負荷を小さくした合成法とすることができる。また、スケールアップした合成を可能とすることができる。
　本明細書において、「人工塩基」とは、自然界に存在する天然型ヌクレオシドの塩基部分に類似した性質を有する、人工的に形成された核酸塩基類縁体をいう。本実施形態に係る人工塩基は、選択的かつ特異的に塩基対を形成する、相補的人工塩基を有する。人工塩基対間においては、天然型塩基間での塩基対形成に用いられる水素結合に限らず、人工塩基の構造または形状に基づく物理的な結合や、π－π相互作用のようなスタッキング相互作用、正電荷・負電荷を有する部位による静電的な結合が形成され得る。本明細書で「Ｄｓ」とは、人工塩基の一つである、７－（２－チエニル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジン－３－イルをいう。
　本明細書において、「ヌクレオシド」とは、塩基部分と糖とがグリコシド結合によって結合された化合物をいう。また本明細書において「ヌクレオチド」との用語は、ヌクレオシドの５´－または３´－水酸基がリン酸と結合してリン酸エステルを形成している化合物をいう。
　本明細書において、「脂溶性置換基」とは、炭素、水素、ハロゲン原子のみで構成された置換基を表す。また本明細書において、「カチオン性置換基」とは、窒素原子を含んで構成される置換基で、ｐＨ４～８の範囲において、窒素原子がプロトン化され正電荷を帯びてカチオンを形成する置換基を表す。また本明細書において、「人工塩基の誘導体」とは、人工塩基の一部が上述した脂溶性置換基やカチオン性置換基、またはその他の官能基に置換された塩基類似体をいう。
　本実施形態の人工塩基を有するヌクレオシドについては、医薬品としても使用することができる。例えば、本実施形態の人工塩基の構造がアデノシン誘導体と類似していることから、アデノシン受容体のモジュレーター（Ｄｉｌｉｐ　Ｋ　Ｔｏｓｈ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１２（５５），４８４７－４８６０）として使用することが考えられる。
２．人工塩基を有するヌクレオシドホスホロアミダイトおよびヌクレオシド三リン酸
　本実施形態の人工塩基を有するヌクレオシドの５´－水酸基を適切な保護基で保護した３´－ホスホロアミダイトは、天然塩基と同様の条件下で固相合成法により、ＤＮＡまたはオリゴ核酸の構成要素としてＤＮＡの化学合成に使用することができる。具体的には、本実施形態に係る人工塩基を有するヌクレオシドの５´－水酸基保護－３´－ホスホロアミダイトを、天然型または修飾ヌクレオシドホスホロアミダイトと組み合わせて、汎用されるＤＮＡの化学合成装置によって所望の鎖長を有するＤＮＡを合成することができる。
　ホスホロアミダイト部分は、汎用されている２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ´－ジイソプロピルホスホロアミダイトであってよく、２－シアノエチル基が他のリン酸保護基、Ｎ，Ｎ´－ジイソプロピルホスホロアミダイトが他の適当なアミノ基であってもよい。また、Ｎ－Ｏ間が結合された環状アミダイトであってもよい。
　本実施形態の人工塩基を有するヌクレオシドの５´－三リン酸は、汎用される化学合成法によって合成が可能である。
３．人工塩基を有するヌクレオシドを含有する核酸
　本実施形態の人工塩基を有するヌクレオチドは、相補的人工塩基Ｐｘと塩基対を形成することが可能であるため、ＰＣＲで機能する。すなわち、ＰＣＲ溶液に本実施形態の人工塩基を有するヌクレオシドの５´－三リン酸とともにＰｘを有するヌクレオシドの５´－三リン酸を添加しておくことで、本実施形態の人工塩基とＰｘとが塩基対を形成した二本鎖ＤＮＡがＰＣＲによって増幅される。よって、ＰＣＲが必要なＳＥＬＥＸ法でのアプタマーのスクリーニングに使用することができる。ＰＣＲでの増幅によるＤＮＡ合成時の人工塩基の導入の数は、１つのＤＮＡ中に１～５個が適当であり、好ましくは３個以下である。また、１つのＤＮＡ中に複数個の人工塩基を含む場合には、１つのＤＮＡ中に含まれる人工塩基が同じものであってもよく、別の塩基対を形成する人工塩基を含めることとしてもよい。また、同じ一本鎖の中で塩基対を形成し、二次構造や三次構造を形成してもよい。
　「アプタマー」とは、一般的には、特定の分子に結合する中分子サイズ（１０～１００塩基）のオリゴ核酸やペプチド、またはその誘導体もしくは修飾体のことを示す。本実施形態の人工塩基を含み、ある特定の分子と結合するオリゴ核酸またはＤＮＡは、ＤＮＡアプタマーのカテゴリーに分類される。
　ＤＮＡアプタマーは、アプタマーそのものとしても使用可能であるが、必要に応じて、５´末端または３´末端に、酵素分解や光、熱等の物理的刺激による分解に対して自身の１次構造および２次、３次元構造を保護、安定化させる等の別の機能を持ったオリゴ核酸を付加した付加体、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）化やグリコシル化を施した修飾体、薬物との複合体、抗体－アプタマー複合体のような修飾体、ｂｉｖａｌｅｎｔのようなホモ多価アプタマー、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃのようなヘテロ多価アプタマーとしても使用することができる。
　本実施形態の人工塩基を導入して作製したＤＮＡアプタマーは、ヒトもしくは動物用の医薬品やその原料、医療用材料、ドラッグデリバリーのためのツール、アフィニティーカラムクロマトグラフィーで例示されるような、特定の物質または細胞分離・精製のためのツールやモジュール、特定の物質の検出のためのセンサー、健康食品の添加物、診断試薬として使用可能である。アフィニティーカラムクロマトグラフィーに用いる場合には、担体にＤＮＡアプタマーを結合させ、その担体を備えたカラムクロマトグラフィーにサンプルを供することで、ＤＮＡアプタマーに選択的に結合した物質を分離することができる。アフィニティーカラムクロマトグラフィーを医療材料または医療機器に応用した具体例としては、アフェレーシスがある。
　本明細書において、「核酸」、「オリゴ核酸」または「核酸分子」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を介して連結された生体高分子をいう。また本明細書において「ＤＮＡ」とは、デオキシリボヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を介して連結された生体高分子をいう。場合によっては、ヌクレオチド間を結合するリン酸ジエステル部分の一部が、ホスホロチオエートのように修飾されたリン酸エステルであってもよい。本明細書における「核酸」、「オリゴ核酸」または「核酸分子」には、一本鎖または二本鎖のＤＮＡが含まれる。場合によっては、本明細書における「核酸」、「オリゴ核酸」または「核酸分子」は、三本鎖、四本鎖を形成してもよく、さらに場合によっては、ＤＮＡとＲＮＡとのキメラ分子であってもよい。場合によっては、本明細書における「核酸」、「オリゴ核酸」または「核酸分子」において、ヌクレオシドを形成するデオキシリボースまたはリボースの２´－位がフッ素、メトキシ基などで修飾されていてもよい。
〔実施例１〕
７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－（２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（化合物１）の合成
＜工程１：２－ブロモ－５－ベンジルチオフェンの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　アルゴン雰囲気下、２－ブロモチオフェン（５０．０ｇ、３０７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（７００ｍｌ）に溶解し、ドライアイス／アセトンバスにて冷却（内温－６０℃）した。テトラメチルエチレンジアミン（５５．５ｍｌ、３６８ｍｍｏｌ）を加え、内温を－５５℃以下に保ちながらリチウムジイソプロピルアミドの１．１Ｍ　ｎ－ヘキサン／テトラヒドロフラン溶液（３５５ｍｌ、３６８ｍｍｏｌ）を滴下し、そのまま１時間撹拌した。反応液にベンジルブロミド（４３．６ｍＬ，３６８ｍｏｌ）を加え、室温まで昇温し、２０時間撹拌した。原料消失を確認後、反応液に飽和塩化アンモニウム（１Ｌ）を添加し、ヘプタン／酢酸エチル＝１／１溶液で２回抽出した。有機層を併せて飽和食塩水洗浄後分液し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ去し、ろ液を減圧下濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘプタン）で精製し、２－ブロモ－５－ベンジルチオフェン（２９．１ｇ）を白色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：４．０６（ｓ，２Ｈ），６．５４－６．５５（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），７．２１－７．２５（ｍ，３Ｈ），７．２８－７．３３（ｍ，２Ｈ）．
＜工程２：５－ベンジルチオフェン－２－イルボロン酸ピナコールの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　２－ブロモ－５－ベンジルチオフェン（２０．２ｇ，８０ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（２００ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、ビス（ピナコラート）ジボロン（４０．５ｇ，１６０ｍｍｏｌ）、［１，１´－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド　ジクロロメタン付加物（４．８９ｇ，５．９８ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（２３．５ｇ，２３９ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で２時間撹拌した。原料の消失を確認後、反応液に水およびヘプタン／酢酸エチル＝１／１溶液の混合溶液に加えて撹拌後分液した。水層を更にヘプタン／酢酸エチル＝１／１溶液で１回抽出した。有機層を合一後、飽和食塩水で洗浄し無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（中性シリカゲル、展開溶媒：ヘプタン／酢酸エチル＝１／０→９／１）で精製することにより、５－ベンジルチオフェン－２－イルボロン酸ピナコール（１２．３ｇ）を黄色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｓ，１２Ｈ），４．１８（ｓ，２Ｈ），６．８７－６．８９（ｍ，１Ｈ），７．１９－７．３１（ｍ，５Ｈ），７．４７（２．３Ｈｚ，１Ｈ）．
＜工程３：２－アミノ－３－ニトロ－４－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）ピリジンの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　５－ベンジルチオフェン－２－イルボロン酸ピナコール（１２．３ｇ）、２－アミノ－３－ニトロ－４－クロロピリジン（５．６９ｇ，３２．８ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン／水＝１０／１（２４２ｍＬ）に溶解後脱気し、アルゴン雰囲気下、炭酸セシウム（２１．４ｇ，６５．６ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１．８９ｇ，１．６４ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で２時間３０分撹拌した。原料の消失を確認し、反応液に水および酢酸エチルの混合溶液を加えて撹拌、分液した。水層を酢酸エチルで１回抽出し有機層を合一後、無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過、減圧下濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（中性シリカゲル、展開溶媒：ヘプタン／酢酸エチル＝１／０→７／３）により精製し、２－アミノ－３－ニトロ－４－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）ピリジン（９．２０ｇ）を橙色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：４．１６（ｓ，２Ｈ），５．６３（ｂｓ，２Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７６－６．７８（ｍ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ）７．２６－７．３５（ｍ，５Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）．
＜工程４：２，３－ジアミノ－４－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）ピリジンの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　２－アミノ－３－ニトロ－４－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）ピリジン（９．８０ｇ）をテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶解した。パラジウム炭素（ＮＥ－ｃｈｅｍｃａｔ　Ｋ　ｔｙｐｅ，５０％ｗｅｔ，１．３ｇ）を加え、水素置換を３回行った後、水素バルーンを付し、室温で２４時間撹拌した。
　原料の消失を確認し、Ａｒ置換を行った後にセライト濾過を行い、残渣をメタノールで洗い込んだ。ろ液を減圧下濃縮することにより２，３－ジアミノ－４－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）ピリジン（１０．１ｇ）を黒褐色油状物質として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：３．７９（ｂｓ，２Ｈ），４．１６（ｓ，２Ｈ），４．４２（ｂｓ，２Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８１－６．８３（ｍ，１Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），７．２３－７．３５（ｍ，５Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ）．
＜工程５：７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　２，３－ジアミノ－４－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）ピリジン（１０．１ｇ）をオルトギ酸トリエチル（１５７ｍＬ，９４５ｍｍｏｌ）に溶解し、３５％塩酸（６．０１ｍＬ，６９．３ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、室温で４時間撹拌した。原料の消失を確認後、反応液をろ過し、濾物を酢酸エチルで洗浄した。濾物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液およびクロロホルム／メタノール＝９／１溶液の混合溶液へ加えて溶解させ、分液した。水層を更にクロロホルム／メタノール＝９／１溶液で１回抽出した。有機層を合一後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮残渣をアセトニトリルで懸濁洗浄を２回することにより７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（６．１２ｇ）を淡褐色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：４．２３（ｓ，２Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２３－７．２６（ｍ，１Ｈ），７．３２－７．３７（ｍ，４Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），８．２７（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），８．４３（ｓ，１Ｈ）．
＜工程６：７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－［３，５－ジ－Ｏ－（ｐ－トルオイル）－２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　アルゴン雰囲気下、７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（５．５０ｇ，１８．９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８８ｍＬ）に溶解し、氷浴下、水素化ナトリウム（６０ｗｔ％，０．７５ｇ，１８．９ｍｍｏｌ）を加え、その後室温まで昇温し１時間３０分撹拌した。撹拌後、反応液に氷浴下２－デオキシ－３，５－ジ－Ｏ－（ｐ－トルオイル）－α－Ｄ－エルスロヘントフラノシルクロリド（６．１２ｇ，１５．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間３０分撹拌した。原料の消失を確認し、反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液および酢酸エチルの混合溶液を加えて撹拌後分液した。水層は、更に酢酸エチルで１回抽出し、有機層を合一後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（中性シリカゲル、展開溶媒：ヘプタン／酢酸エチル＝１／０→１／１）により精製し、７－（５－ベンジルチオフェン２－イル）－３－［３，５－ジ－Ｏ－（ｐ－トルオイル）－２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（４．６１ｇ）を黄色アモルファス状固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：２．３８（ｓ，３Ｈ），２．４４（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，５．５Ｈｚ，１．８Ｈｚ，１Ｈ），３．１６－３．１９（ｍ，１Ｈ），４．２１（ｓ，１Ｈ），４．６４－４．７７（ｍ，３Ｈ），５．８３（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），６．６８（ｄｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，５．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１９－７．３４（ｍ，９Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．９８－７．９９（ｍ，３Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ），８．２９（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）．
＜工程７：７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－（２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（化合物１）の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－［３，５－ジ－Ｏ－（ｐ－トルオイル）－２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（４．６１ｇ，７．１６ｍｍｏｌ）をアンモニア（７Ｍメタノール溶液，４１０ｍＬ，２．８６ｍｏｌ）に添加し、室温で４８時間撹拌した。原料の消失を確認し、反応液を減圧下濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘプタン／酢酸エチル＝１／１→０／１→クロロホルム／メタノール＝１／０→９／１）により精製し、化合物１（２．７４ｇ）を白色アモルファス状固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：２．３４（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，６．０Ｈｚ，３．０Ｈｚ，１Ｈ），２．７５－２．８２（ｍ，１Ｈ），３．５２－３．５７（ｍ，１Ｈ），３．６３－３．６６（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｄｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｓ，２Ｈ），４．４４－４．４６（ｍ，１Ｈ），５．１２（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），５．３４（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），６．５２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），７．２４－７．２６（ｍ，１Ｈ），７．３２－７．３７（ｍ，４Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．１２（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），８．３０（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），８．７０（ｓ，１Ｈ）．
　上記実施例１では、Ｄｓのチオフェンの５位にベンジル基を有する塩基を含むデオキシヌクレオシド（化合物１）を合成したが、化合物１の合成と同様の方法によって、Ｄｓのチオフェンの５位に他の官能基を有するデオキシヌクレオシドを合成することができる。
〔実施例２〕
７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－［２－デオキシ－５－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ´－ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物２）の合成
＜工程１：７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－［２－デオキシ－５－O－（４，４´－ジメトキシトリチル）－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　実施例１で製造した化合物１（０．５ｇ，１．２３ｍｍｏｌ）をピリジン共沸（３回）した後、ピリジン（５ｍＬ）に溶解した。氷冷下、ＤＭＴｒＣｌ（０．４６ｇ，１．３５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。氷冷下、メタノール（１ｍＬ）を加えて反応を停止させ、減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミンを含むジクロロメタンおよびメタノール混合液、メタノール濃度０→３％）で精製し、７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－［２－デオキシ－５－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（０．６４ｇ）を得た。
Ｍａｓｓ：　ＥＳＩ（－）　７０８．２８
＜工程２：７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－［２－デオキシ－５－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ´－ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物２）の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－［２－デオキシ－５－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（０．６０ｇ，０．８５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル共沸（３回）した後、アセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解した。氷冷下、１Ｈ－テトラゾール（８２ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）および２－シアノエチル－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．３２ｍＬ，１．０２ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌後、酢酸エチル３０ｍＬで希釈し、ＮａＨＣＯ３水、食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後ろ過し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミンを含むヘキサンおよび酢酸エチル混合液、酢酸エチル濃度５％→３０％→５０％）で精製し、７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－［２－デオキシ－５－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ´－ジイソプロピルホスホロアミダイト（０．６６ｇ）を得た。
　上記実施例２では、Ｄｓのチオフェンの５位にベンジル基を有する塩基を含むデオキシヌクレオシドの３´－ホスホロアミダイトを合成したが、同様の方法により、Ｄｓのチオフェンの５位に他の官能基を有するデオキシヌクレオシドの３´－ホスホロアミダイトを合成することができる。
〔実施例３〕
７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－（２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン　５´－トリフォスフェートの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　実施例２の工程１で得られた７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－［２－デオキシ－５－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（０．６３ｇ，０．８９ｍｍｏｌ）をピリジン（９ｍＬ）に溶解した。無水酢酸（０．１７ｍＬ，１．７８ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。減圧下で溶媒を留去後、酢酸エチルで希釈し、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下で溶媒を留去した。残渣にトルエンを加えて共沸（３回）した後、ジクロロメタン（９０ｍＬ）に溶解した。氷冷下、ジクロロ酢酸（０．９ｍＬ）を加え、２５分攪拌した。減圧下で溶媒を留去後、ジクロロメタンで希釈し、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後減圧下で溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン－メタノール、酢酸エチルメタノール濃度０％→３％）で精製し、７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－［２－デオキシ－５－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンの３´－Ｏ－アセチル体を中間体として得た。この化合物（９０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）にピリジンを加え共沸し（３回）、ピリジン（０．２ｍＬ）および１，４－ジオキサン（０．８ｍＬ）に溶解した。１Ｍ　２－クロロ－４－Ｈ－１，３，２－ベンゾジオキサホスホリン－４－オンの１，４－ジオキサン溶液（０．３ｍＬ）を加え、室温で１５分攪拌した。ｎ－ブチルアミン（０．２ｍＬ）および０．５ＭトリブチルアンモニウムピロホスフェートのＤＭＦ溶液（０．８ｍＬ）を加え、室温で１５分攪拌後、１％ヨウ素／ピリジン－水（４９：１）を４ｍＬ加え、室温で１５分攪拌した。５％　亜硫酸水素ナトリウム（０．３ｍＬ）を加え、室温で２分攪拌後、減圧下で約１ｍＬまで濃縮した。残渣に水（１０ｍＬ）を加え、室温で３０分攪拌後、２８％アンモニア水（４０ｍＬ）を加え、室温で３．５時間攪拌し、減圧下で約５ｍＬに濃縮した。残渣をＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー（バッファーＡ：５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム溶液、バッファーＢ：２Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム溶液、直線勾配）で粗精製した。さらに逆相ＨＰＬＣ（バッファーＡ：５％アセトニトリル、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム溶液、バッファーＢ：アセトニトリル、バッファーＢ／２０％→８５％，１３分）で精製した。得られたフラクションを濃縮し、複数回、水と共沸後、凍結乾燥した。残渣を水に再溶解し３３．７ｍＭ水溶液（０．５ｍＬ）として目的物７－（５－ベンジルチオフェン－２－イル）－３－（２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン　５´－トリフォスフェートを得た。
Ｍａｓｓ：　ＥＳＩ（－）　６４６．２１
　上記実施例３では、Ｄｓのチオフェンの５位にベンジル基を有する塩基を含むデオキシヌクレオシドの５´－三リン酸を合成した。同様の方法により、Ｄｓのチオフェンの５位に他の官能基を有するデオキシヌクレオシドの５´－三リン酸を合成することができる。
〔実施例４〕
７－（５－シクロペンチルメチルチオフェン－２－イル）－３－（２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（化合物３）の合成
＜工程１：２－ブロモ－５－（シクロペンチリデンメチル）チオフェンの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　アルゴン雰囲気下、ブロモシクロペンタン（７８．０ｇ，５２３ｍｍｏｌ）にトリフェニルホスフィン（１２３．５７ｇ，４７１ｍｍｏｌ）を加え、１３５～１４０℃に加熱し、そのまま４．５時間撹拌した。４０℃に冷却後、トルエン（１００ｍＬ）を加え固体を濾過、濾過固体をトルエンで洗浄、減圧乾燥し、シクロペンチルトリフェニルフォスフォニウムブロミド（１３５．９ｇ，８２ｗｔ％，収率：５７．５％）を得た。
　アルゴン雰囲気下、２－ブロモー４－ホルミルチオフェン（４０．０ｇ，２０９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１Ｌ）に溶解し、シクロペンチルトリフェニルフォスフォニウムブロミド（１２６ｇ，２５１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１Ｌ）溶液を加えた。反応懸濁液を６０℃に加熱し、ＮａＨ（１．２６ｇ，２６．２ｍｍｏｌ，６０ｗｔ％品）を１５分間隔で２５回添加した（合計添加量３１．５ｇ、６５５ｍｍｏｌ）。すべてのＮａＨを添加し終えてから１５分攪拌した後に、反応懸濁液を３０℃まで冷却し、氷水（４Ｌ）に注ぎ、酢酸エチル（２Ｌ）で２回抽出し、有機層を２０％－食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。濃縮残渣にヘプタン（５００ｍＬ）を加え懸濁させ（超音波）、懸濁物を濾過した。濾過物をヘプタンで洗浄し、濾液を減圧濃縮した。濃縮残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１ｋｇ、ヘプタン）で精製し、２－ブロモー５―（シクロペンチリデンメチル）チオフェン（３４．２ｇ，６７．３％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ（ｐｐｍ）：１．６５－１．７２（ｍ，２Ｈ），１．８０－１．８７（ｍ，２Ｈ），２．４０－２．４６（ｍ，４Ｈ），６．４７－６．４８（ｍ，１Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ）
＜工程２：２－［５－（シクロペンチリデンメチル）－２－チエニル］－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロランの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　２－ブロモー５―（シクロペンチリデンメチル）チオフェン（２９．０ｇ，１１９ｍｍｏｌ）をジオキサン（２８７ｍＬ）に溶解した。Ｂｉｓ（ｐｉｎａｃｏｌａｔｏ）ｄｉｂｏｒｏｎ（６０．６ｇ，２３９ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（３５．１ｇ，３５８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下さらにＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２・ＤＣＭ（０．９７０ｇ，１．１９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を９０℃に加熱し、そのまま２時間４０分間撹拌した。Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２・ＤＣＭ（０．１ｇ，０．１２２ｍｍｏｌ）を追加し、さらに加熱攪拌を１時間１０分行った。その後反応混合物を冷却し、水（５００ｍＬ）－ヘプタン（３００ｍＬ）－酢酸エチル（３００ｍＬ）の混合溶媒に注ぎ、不溶物を濾過した。有機層を分液し、水層をヘプタン（２００ｍＬ）－酢酸エチル（２００ｍＬ）で再度抽出した。有機層を飽和食塩水（４００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮を行い粗生成物（８２．９ｇ）を得た。ヘプタン（３００ｍＬ）を加え、再度減圧濃縮を行った。濃縮残渣にヘプタン（８０ｍｌ）を加えて懸濁させ、懸濁物を濾過し、濾過物をヘプタンで洗浄した。濾液をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３００ｇ，ヘプタン溶出）で精製し、、２－［５－（シクロペンチリデンメチル）－２－チエニル］－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロランを得た（６０．５ｇ、１００％、ｂｉｓ（ｐｉｎａｃｏｌａｔｏ）ｄｉｂｏｒｏｎを残渣として含有）。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ（ｐｐｍ）：１．３４（ｓ，１２Ｈ），１．６５－１．７２（ｍ，２Ｈ），１．８０－１．８６（ｍ，２Ｈ），２．４６－２．５５（ｍ，４Ｈ），６．６４（ｍ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ）
＜工程３：４－［５－（シクロペンチリデンメチル）－２－チエニル］－３－ニトロ－ピリジン－２－アミンの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　２－アミノー４－クロロ－３―ニトロピリジン（９．６０ｇ，５５．３ｍｍｏｌ）、２－［５－（シクロペンチリデンメチル）－２－チエニル］－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン（５５．７ｇ，１９２ｍｍｏｌ）をジオキサン（１７３ｍＬ）に溶解した。水（１７．３ｍＬ）、炭酸セシウム（３６．０ｇ，１１１ｍｍｏｌ）を加え、系内のアルゴン置換を行った。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（３．２０ｇ，２．７７ｍｍｏｌ）を加え、系内を再度アルゴンで置換した。反応混合物を約９０℃に加熱し、そのまま１時間撹拌した。反応混合物を室温に戻し、水（５００ｍＬ）－酢酸エチル（５００ｍＬ）に注ぎ、不溶物をセライト濾過した。有機層を分液し、水層を酢酸エチル（５００ｍＬ）で再度抽出した。有機層を飽和食塩水（３００ｍＬ）で洗浄し（ここでも不溶物濾過を行った）、硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮を行い、粗生成物（４４．３ｇ）を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５００ｇ，酢酸エチル：ヘプタン＝１０：９０→１５：８５→２５：７５→３０：７０）で精製し、４－［５－（シクロペンチリデンメチル）－２－チエニル］－３－ニトロ－ピリジン－２－アミン（１１．５ｇ，ｉｍｐｕｒｅ）を得た。得られた４－［５－（シクロペンチリデンメチル）－２－チエニル］－３－ニトロ－ピリジン－２－アミン（ｉｍｐｕｒｅ）を２分割し、それぞれを再度カラムクロマトグラフィー（シリカゲル２００ｇ，クロロホルム：酢酸エチル＝１００：０→９０：１０）により精製を行い、４－［５－（シクロペンチリデンメチル）－２－チエニル］－３－ニトロ－ピリジン－２－アミン（５．０７ｇ、３０．４％、２－アミノ－４－クロロ－３－ニトロピリジンとの混合物）を得た。
＜工程４：４－［５－（シクロペンチリデンメチル）－チエニル］ピリジン－２，３－ジアミンの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　４－［５－（シクロペンチリデンメチル）－２－チエニル］－３－ニトローピリジン－２－アミン（４．３ｇ，１４．２７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４３ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下１０％－Ｐｄ／Ｃ（５０％ｗｅｔ，０．５６ｇ，２．６３ｍｍｏｌ）を加え、さらに系内を水素で置換し（２４→２２℃）、水素雰囲気下室温で２０時間撹拌した（ｂａｌｌｏｏｎ、内温２５～２６℃）。系内をアルゴンで置換後、反応混合物をセライト濾過し、ＴＨＦで洗浄した。濾液を減圧濃縮し、粗生成物（４．８３ｇ）を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＮＨシリカゲル１００ｇ，ＣＨＣｌ３：ヘプタン＝５０：５０→８５：１５）で精製し、不純物を含む部分を再度カラムクロマトグラフィー（ＮＨシリカゲル６０ｇ、ＣＨＣｌ３：ヘプタン＝３０：７０→６５：３５）により精製することにより４－［５－（シクロペンチリデンメチル）－チエニル］ピリジン－２，３－ジアミン（１．８１ｇ，４６．８％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ（ｐｐｍ）：１．６８－１．７５（ｍ，２Ｈ），１．８２－１．８９（ｍ，２Ｈ），２．４８－２．５５（ｍ，４Ｈ），３．７７（ｂｓ，２Ｈ），４．２５（ｂｓ，２Ｈ），６．５９（ｔ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）
＜工程５：４－［５－（シクロペンチルメチル）－チエニル］ピリジン－２，３－ジアミンの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　オートクレーブ反応装置で４－［５－（シクロペンチリデンメチル）－チエニル］ピリジン－２，３－ジアミン（１．８１ｇ，６．６７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０．１ｍＬ）に溶解し、系内のアルゴン置換を行った。１０％－Ｐｄ／Ｃ（５０％ｗｅｔ，０．２６ｇ，１．２２８ｍｍｏｌ）を加え、系内を０．６ＭＰａの水素で加圧し、室温で６．５時間撹拌した（０．３８ＭＰａに低下）。再度０．６　ＭＰａの水素加圧を行い、室温で６４時間撹拌した（０．２３ＭＰａに低下）。系内を常圧に戻しアルゴン置換を行い、反応混合物のセライト濾過を行った。セライトをＴＨＦで洗浄し、濾液を減圧濃縮した。メタノール、トルエンを加え、再度減圧濃縮して４－［５－（シクロペンチルメチル）－チエニル］ピリジン－２，３－ジアミン（１．８２ｇ，１００％）を得た。
＜工程６：７－（５－シクロペンチルメチルチオフェン－２－イル）－３－（２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（化合物３）の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　４－［５－（シクロペンチルメチル）－チエニル］ピリジン－２，３－ジアミン（１．８ｇ）を原料として、実施例１の工程４～７と同様な方法で７－（５－シクロペンチルメチルチオフェン－２－イル）－３－（２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（化合物３）５５５ｍｇを得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ（ｐｐｍ）：１．２２－１．３１（ｍ，２Ｈ），１．５２－１．６０（ｍ，２Ｈ），１．６２－１．７０（ｍ，２Ｈ），１．７７－１．８７（ｍ，２Ｈ），２．１５－２．２６（ｍ，２Ｈ），２．３１（ｄｄ，Ｊ＝５．７，１３．５Ｈｚ，１Ｈ），２．８８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．２０－３．２７（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｔ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ），４．００（ｄ，Ｊ＝１２．８，１Ｈ），４．２６（ｓ，１Ｈ），４．８３（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄｄ，Ｊ＝５．５，９．６Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ）
〔実施例５〕
化合物３のホスホロアミダイト体の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　実施例４で得られた７－（５－シクロペンチルメチルチオフェン－２－イル）－３－（２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（化合物３）を原料とし、実施例２と同様の方法で製造し、７－（５－シクロペンチルメチルチオフェン－２－イル）－３－［２－デオキシ－５－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ´－ジイソプロピルホスホロアミダイト（０．６６ｇ）を得た。
〔実施例６〕
化合物３のトリホスフェート体の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　実施例５で得られる中間体である７－（５－シクロペンチルメチルチオフェン－２－イル）－３－［２－デオキシ－５－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンを原料として用い、実施例３と同様の方法で製造し、７－（５－シクロペンチルメチルチオフェン－２－イル）－３－［２－デオキシ－５－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－１－β－Ｄ－リボフラノシル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン　５´－トリホスフェートを得た。
Ｍａｓｓ：　ＥＳＩ（－）　６３８．１０
〔実施例７〕
７－（２－ナフチルメチルチオフェン－２－イル）－３－（２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（化合物４）の合成
＜工程１：２－ブロモー５－（２－ナフチルメチル）チオフェンの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　アルゴン雰囲気下、１Ｌ－４つ口フラスコに２－ブロモチオフェン（７．３５ｇ，４５．１ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１０３ｍＬ）に溶解し、テトラメチルエチレンジアミン（８．１６ｍＬ，５４．１ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）を加えた後、ドライアイス／アセトンバスにて冷却した（内温－６０℃以下）。続いてリチウムジイソプロピルアミド（１．０８Ｍ　ｎ－ヘキサン／テトラヒドロフラン溶液、５０．０ｍＬ、５４．１ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）を２０分間かけて滴下し、そのままの温度で３０分間撹拌した。２－Ｂｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌ　ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ（１２．０ｇ，５４．１ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）溶液を滴下した後、ドライアイス／アセトンバスから引き上げ、室温まで昇温させた後に１９時間撹拌した。
　原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）及び酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えて分液し、水層を酢酸エチル（１００ｍＬ）で再抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮することで、褐色固体（２１．０ｇ）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（富士シリシア　ＳＩ５０　ＳＩＺＥ２００×４；ｎ－ヘプタン）により精製し、目的物のフラクションを減圧下濃縮することで、２－ブロモ－５－（２－ナフチルメチル）チオフェン（４．２７ｇ，収率３１％）を白色固体として取得した。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ（ｐｐｍ）：４．２３（ｓ，２Ｈ），６．５９－６．６１（ｍ，１Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４３－７．４９（ｍ，２Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），７．７８－７．８３（ｍ，３Ｈ）
＜工程２：４，４，５，５－テトラメチル－２－［５－（２－ナフチルメチル）－２－チエニル］－１，３，２－ジオキサボロランの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　アルゴン雰囲気下、１００ｍＬ－４つ口フラスコに２－ブロモ－５－（２－ナフチルメチル）チオフェン（４．２７ｇ，１４．１ｍｍｏｌ）、ビスピナコラートジボロン（３．７５ｇ，１４．８ｍｍｏｌ，１．０５ｅｑ．）をジオキサン（３５．３ｍＬ）に溶解した。酢酸カリウム（４．１５ｇ，４２．２ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）を加えた後、フラスコ内をアルゴン雰囲気下としてＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（８６０ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ，０．０７５ｅｑ．）を加えた後、内温９０℃で２４時間撹拌した。原料の消失を確認後、反応液を室温まで冷却し、セライト濾過した。濾液に、水（５０ｍＬ）及び酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え分液した。有機層を飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ｎ－ヘプタン：酢酸エチル＝１００：０→９０：１０）により精製し、目的物のフラクションを減圧下濃縮することで、４，４，５，５－テトラメチル－２－［５－（２－ナフチルメチル）－２－チエニル］－１，３，２－ジオキサボロラン（２．６１ｇ，収率５３％）を取得した。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｓ，１２Ｈ），４．３４（ｓ，２Ｈ），６．９２－６．９３（ｍ，１Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４２－７．４９（ｍ，３Ｈ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．７６－７．８１（ｍ，３Ｈ）
＜工程３：［（２Ｒ）－５－（７－クロロイミダゾ［４、５－ｂ］ピリジン－３－イル）－３－（４－メチルベンゾイル）オキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］メチル　４－メチルベンゾエートの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　アルゴン雰囲気下、１Ｌ－４つ口フラスコに７－クロロ－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（２．００ｇ，１３．２ｍｍｏｌ）、ＮａＨ（６０％，６３０ｍｇ，１５．６ｍｍｏｌ，１．２０ｅｑ．）、アセトニトリル（４２９ｍＬ）を氷冷下で仕込み、撹拌した。［（２Ｒ，５Ｒ）－５－クロロ－３－（４－メチルベンゾイル）オキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］メチル　４－メチルベンゾエート（６．８５ｇ，１７．６ｍｍｏｌ，１．３５ｅｑ．）を加えた後、室温で１時間撹拌した（無色透明溶液）。原料の消失を確認後、反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）及び酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えて分液した。その後、酢酸エチル（１００ｍＬ）で２回抽出した。有機層を飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮することで、黄色固体（１０．０ｇ）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ｎ－ヘプタン：酢酸エチル＝１００：０→５０：５０）により精製、目的物のフラクションを減圧下濃縮し、得られた残渣を再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒クロロホルム：メタノール＝１００：０→２０：１）により精製し、目的物のフラクションを減圧下濃縮することで［（２R）－５－（７－クロロイミダゾ［４、５－ｂ］ピリジン－３－イル）－３－（４－メチルベンゾイル）オキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］メチル　４－メチルベンゾエート（３．３１ｇ，収率５０％）を白色固体として取得した。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ（ｐｐｍ）：２．４１（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｄｄｄ，Ｊ＝２．２，５．６，１４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．０８－３．１９（ｍ，１Ｈ），４．６３－４．９２（ｍ，３Ｈ），５．８３（ｄｔ，Ｊ＝１．８，６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄｄ，Ｊ＝５．８，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１８－７．３０（ｍ，５Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），８．２６－８．２７（ｍ，２Ｈ）
＜工程４：［（２Ｒ）－３－（４－メチルベンゾイル）オキシ－５－［７－［５－（２－ナフチルメチル）－２－チエニル］イミダゾロ［４、５ｂ］ピリジン－３－イル］テトラヒドロフラン－２－イル］メチル４－メチルベンゾエートの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　アルゴン雰囲気下、２００ｍＬ－４つ口フラスコに４，４，５，５－テトラメチル－２－［５－（２－ナフチルメチル）－２－チエニル］－１，３，２－ジオキサボロラン（８３０ｍｇ，１．５８ｍｍｏｌ）、［（２Ｒ）－５－（７－クロロイミダゾ［４、５－ｂ］ピリジン－３－イル）－３－（４－メチルベンゾイル）オキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］メチル　４－メチルベンゾエート（８３１ｍｇ，２．３７ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ．）をジオキサン（８．００ｍＬ）に溶解し、撹拌した。炭酸セシウム（２．５０ｇ，３．１６ｍｍｏｌ，３ｅｑ．）／水（４．００ｍＬ）の水溶液を加えた後、反応容器内をアルゴン置換しＸｐｈｏｓ　Ｐｄ　Ｇ２（０．０５ｇ，０．０３２０ｍｍｏｌ，０．０５ｅｑ．）を加えた後、９０℃で１時間撹拌した。原料の消失を確認後、反応液に水（４０ｍＬ）及び酢酸エチル（４０ｍＬ）を加えて分液した。その後、酢酸エチル（４０ｍＬ）で２回抽出した。有機層を飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮することで、黄色固体（２．０１ｇ）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ｎ－ヘプタン：酢酸エチル＝８５：１５→７０：３０）により精製し、目的物のフラクションを減圧下濃縮することで、［（２Ｒ）－３－（４－メチルベンゾイル）オキシ－５－［７－［５－（２－ナフチルメチル）－２－チエニル］イミダゾロ［４、５ｂ］ピリジン－３－イル］テトラヒドロフラン－２－イル］メチル４－メチルベンゾエート（７８９ｍｇ，収率７６％）を白色固体として取得した。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ（ｐｐｍ）：２．３８（ｓ，３Ｈ），２．４４（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｄｄｄ，Ｊ＝２．２，５．６，１４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．１４－３．２１（ｍ，１Ｈ），４．３８（ｓ，２Ｈ），４．６６－４．７６（ｍ，３Ｈ），５．８３（ｄｔ，Ｊ＝１．８，６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６８（ｄｄ，Ｊ＝５．８，８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３８－７．４９（ｍ，４Ｈ），７．７４－７．８３（ｍ，４Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ），８．２９（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）
＜工程５：７－（２－ナフチルメチルチオフェン－２－イル）－３－（２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（化合物４）の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　実施例１工程７と同様な方法で、工程4で製造された［（２R）－３－（4－メチルベンゾイル）オキシ－５－［７－［５－（２－ナフチルメチル）－２－チエニル］イミダゾロ［４、５ｂ］ピリジン－３－イル］テトラヒドロフラン－２－イル］メチル４－メチルベンゾエート（０．９５９ｇ）から７－（２－ナフチルメチルチオフェン－２－イル）－３－（２－デオキシ－１－β－Ｄ－リボフラノシル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（化合物４）６２０ｍｇ、９９％を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ（ｐｐｍ）：１．８９（ｓ，１Ｈ），２．３１（ｄｄ，Ｊ＝５．２，１４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．２０－３．２７（ｍ，１Ｈ），３．７８－３．８４（ｍ，１Ｈ），３．９８－４．０１（ｍ，１Ｈ），４．２５（ｓ，１Ｈ），４．３８（ｓ，２Ｈ），４．８３（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），６．４２（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１０．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６９－６．７２（ｍ，１Ｈ），６．９４－６．９６（ｍ，１Ｈ），７．４０－７．４９（ｍ，４Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．７９－７．８３（ｍ，３Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）
〔実施例８〕
人工塩基を有するヌクレオシドの３´－アミダイトを用いたＤＮＡの合成
　化合物２を一例とする、本実施形態の人工塩基を含んだヌクレオシド３´－アミダイトは、一般的に用いられる固相合成法において、天然塩基のヌクレオシド３´－アミダイトと同等な条件でオリゴ核酸の合成に使用可能である。化合物２を固相合成法に適用し、得られたＤＮＡ鎖をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。精製したＤＮＡ鎖の質量をＭＳスペクトルにて解析した結果、分子量が３１８５０．２（理論値：３１８５２．９）であり、目的とするＤｓｂｎを含むＤＮＡが得られたことを確認できた。
〔実施例９〕
人工塩基を有するヌクレオシド５´－三リン酸のＰＣＲへの適用
　人工塩基である７－（５－ベンジル－２－チエニル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジン－３－イルを塩基部分にもつヌクレオチド（以下、ｄＤｓｂｎと称する）がＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ鎖に取り込まれ、かつ増幅することを確認するため、ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片をＬＣ／ＭＳで解析した。
　実施例８で調製したｄＤｓｂｎを含む一本鎖ＤＮＡを以下のＰＣＲの鋳型として用いた。
　ＰＣＲは、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ　Ｐｆｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で行った。ＰＣＲ用溶液の組成は、１ｘＡｃｃｕＰｒｉｍｅ　Ｐｆｘ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（ｄＮＴＰ　０．３ｍＭ，１．０ｍＭ　ＭｇＳＯ４を含む），０．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４，０．１ｍＭ　ｄＮＴＰ，０．５μＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（配列は下記を参照），０．５μＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ（配列下記参照），０．０５ｍＭ　ｄＤｓｂｎＴＰ，０．０５ｍＭ　ｄｉｏｌ１－ｄＰｘＴＰ（１－（２－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノシル）－４－［（４－ペンチン－１，２－ジオール）－１－プロピニル］－２－ニトロピロール－５´　トリホスフェート），０．０５ｕｎｉｔ／μＬ　ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ　Ｐｆｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。この組成の反応液中に一本鎖ＤＮＡ（Ｔ－００１９８、配列下記参照）を４．８ｘ１０９分子添加して、９４℃、２分－（９４℃、１５秒－６５℃、２１０秒）×２０サイクルでＰＣＲ産物を調製した。得られたＰＣＲ産物はポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、鋳型ＤＮＡに相当する一本鎖ＤＮＡ断片を単離した。単離精製した一本鎖ＤＮＡを用いて、上述のＰＣＲ条件でＤＮＡ断片の増幅および精製を繰り返し、トータル１００サイクルさせた一本鎖ＤＮＡを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　上記工程に従ってトータル２０、４０、６０サイクルで調製した一本鎖ＤＮＡにｄＤｓｂｎが取り込まれていることを、ＬＣ／ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ社製、Ａｃｑｕｉｔｙ　ＳＱＤ）を用いて評価した。解析にはＣ１８逆相カラム（Ａｃｑｕｉｔｙ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｃ１８　１．７μｍ，　２．１ｘ５０ｍｍ）を用いて、溶液は移動相
Ａ（１００ｍＭ　１，１，１，３，３，３－Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏ－２－ｐｒｏｐａｎｏｌ，　８ｍＭ　ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）移動相Ｂ（アセトニトリル）を使用した。移動相を０．２ｍＬ／ｍｉｎで流し、移動相Ｂを１０分間で１０％から５０％になるようなグラジェントをかけて分析した。その時のカラム温度は６０℃であり、２６０ｎｍの波長（Ａｃｑｕｉｔｙ　ＵＰＬＣ　ＰＤＡ）で検出した。ＤｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎはＰｒｏＭａｓｓを使用して解析を行った。
　まず、ＬＣ／ＭＳ解析のコントロールとして、化学合成で合成しＰＣＲで鋳型ＤＮＡとして用いた一本鎖ＤＮＡの解析を実施した。その結果、一本鎖ＤＮＡのｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅは４．４２秒、実測値の分子量は３１８５０．２であり、理論値（３１８５２．９）からのＭａｓｓ　ｅｒｒｏｒは－２．７　Ｄａ（－０．００８％）であった（表２）。次に、ＰＣＲ産物について同条件でＬＣ／ＭＳで解析を行った。２０ｃｙｃｌｅ　ＰＣＲ産物の主成分のｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅは４．４５秒、実測値の分子量は３１８６１．８であった。４０ｃｙｃｌｅ　ＰＣＲ産物の主成分のｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅは４．４６秒、実測値の分子量は３１８５９．７であった。６０ｃｙｃｌｅ　ＰＣＲ産物の主成分のｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅは４．４４秒、実測値の分子量は３１８３６．２であった。データは、表１に示した。２０，４０，６０ｃｙｃｌｅから得られたそれぞれのＤＮＡ産物に含まれている主成分のｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅは、コントロールとほぼ一致しており、実測値の分子量も理論値の分量との誤差は０．０５％以内であった。このことから、本実施形態のｄＤｓｂｎはＤＮＡポリメラーゼによって認識され、ＰＣＲによって、複製されたＤＮＡ断片に取り込まれることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
〔実施例１０〕
人工塩基を有するヌクレオシドを含む一本鎖ＤＮＡライブラリーを用いたスクリーニング
＜ＶＥＧＦ１６５に対するＤＮＡアプタマーの取得＞
　スクリーニングで使用する、ｄＤｓｂｎが含まれる一本鎖ＤＮＡライブラリーは、化学合成法により合成し、得られたＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
　ｄＤｓｂｎがランダム領域に含まれている一本鎖ＤＮＡライブラリーをＰＢＳ溶液に溶解し、三次構造を形成させるためにフォールディング操作（９５℃、５分間→室温、２０分間→氷上、５分間）を実施した。その後、ＮＰ－４０を含むＰＢＳ溶液を加え、溶液組成を０．００５％　ＮＰ－４０を含むＰＢＳ溶液（結合溶液）に調製した。その後、標的タンパク質ＶＥＧＦ１６５を加えて、室温で３０分間転倒混和した。標的タンパク質にビオチン－タグを付加させるために、Ｅｚ－Ｌｉｎｋ　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｌｃ－ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加えて室温、１５分間反応させ、反応を終了させるためにグリシンを添加した。その後、未反応の試薬を除去するためにＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　Ｆｉｌｔｅｒ　ｃｕｐ－０．５　５０ｋ（ＭＥＲＣＫ社製）で溶液交換を実施した。
　溶液交換した試料から、ストレプタアビジン磁気ビーズ（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用いてビオチン化した標的タンパク質を回収することで、結合している一本鎖ＤＮＡプールを釣り上げた。そのまま、結合溶液で磁気ビーズを洗浄することで、結合親和性が低い一本鎖ＤＮＡを除去した。洗浄しても標的タンパク質に結合している一本鎖ＤＮＡプールを磁気ビーズから回収した。
　回収した一本鎖ＤＮＡプールを増幅させるために、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ　Ｐｆｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応液の組成は、１ｘ　ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ　Ｐｆｘ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ　（ｄＮＴＰ　０．３ｍＭ，１．０ｍＭ　ＭｇＳＯ４を含む），０．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４，０．１ｍＭ　ｄＮＴＰ，０．５μＭ　セレクション用Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（配列は下記を参照），０．５μＭ　セレクション用Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ（配列は下記を参照），０．０５ｍＭ　ｄＤｓｂｎＴＰ，０．０５ｍＭ　ｄｉｏｌ１－ｄＰｘＴＰ，０．０５ｕｎｉｔ／μＬ　ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ　Ｐｆｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。ＰＣＲサイクル条件は、９４℃、２分－（９４℃、１５秒－６５℃、２１０秒）ｘ　ｎサイクルである。サイクル数のｎは、各ラウンドで異なるが、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製ができる量まで増幅するのに必要な回数を実施した。
　増幅したＤＮＡ断片から一本鎖ＤＮＡプールの精製は、７Ｍ尿素が含まれている１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で実施し、ＤＮＡ断片が含まれるゲル片からＤＮＡ断片を抽出し、脱塩するためにエタノール沈殿を行い、標的タンパク質に結合する一本鎖ＤＮＡプールを精製した。
　この操作を、一本鎖ＤＮＡプールと標的タンパク質の濃度や、洗浄工程を変えた条件を繰り返し行うことで、標的タンパク質に結合する配列の濃縮を進めた。２回目のラウンド以降では、ストレプタアビジン磁気ビーズに非特異的に結合してしまう一本鎖ＤＮＡプールの排除のために、フォールディング操作後のプールに磁気ビーズを加えて、室温で３０分間転倒混和をし、磁気ビーズを除去したプール溶液に標的タンパク質を加えて反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
＜スクリーニングで得られたＤＮＡプールの標的タンパク質に対する親和性評価＞
　標的タンパク質に結合する一本鎖ＤＮＡの濃縮させたプールを用いて、標的タンパク質とのＥＭＳＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｓｈｉｆｔ　ａｓｓａｙ）を実施することで、結合する配列が含まれているかを確認した。
　一本鎖ＤＮＡプールを結合溶液中に０．２μＭになるように調製し、フォールディング操作（９５℃、５分間→（－０．１℃／秒）→２５℃）を行い、三次構造を形成させた。標的タンパク質を結合溶液で所定の濃度に希釈し、フォールディング済みＤＮＡ溶液と混ぜて、３７℃で３０分間保温させた。保温後の試料を１０％未変性ポリアクリルアミドゲルで泳動した。泳動後のゲルはＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄで染色することでＤＮＡを検出した（図１）。その結果、最終ラウンドのプールにて、ＶＥＧＦ１６５の濃度が高くなるにつれて明確なシフトバンド強度が濃くなり、ＦｒｅｅのＤＮＡバンドが薄くなっていることから、標的タンパク質に結合する配列が存在していることを確認した。
＜候補配列の同定＞
　次世代シーケンサー（Ｉｏｎ　ＰＧＭシステム、Ｔｈｒｅｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、スクリーニングで得られたＤＮＡプールに含まれている配列を解析した。セレクション用Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒとセレクション用Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ間の挿入塩基長に変化がなく、さらに人工塩基ｄＤｓｂｎが残存している配列群をクラスタリングした結果、単一配列が約８０％程度を占めていた。
＜候補配列の標的タンパク質への結合親和性をＥＭＳＡで評価＞
　同定した候補配列が標的タンパク質に結合するかをＥＭＳＡによって解析した。
　まず候補配列に相当するオリゴマーを化学合成法で合成し、ＯＰＣ（カートリッジ）で精製を行った。
　精製した候補配列のオリゴマー(Ｔ－００１９９、配列下記参照)を結合溶液中に０．２μＭになるように調製し、フォールディング操作（９５℃、５分間→（－０．１℃／秒）→２５℃）を行うことで、三次構造を形成させた。その後、ＶＥＧＦ１６５を結合溶液で０．２μＭに希釈し、フォールディング済みＤＮＡ溶液と混合させ、３７℃で３０分間保温させた。保温後の試料を未変性１０％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、ＤＮＡ－タンパク質複合体のバンドを検出できるかどうかについて分析した。ＤＮＡはＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄで染色させ、４７０ｎｍのｂｌｕｅ　ｌｉｇｈｔで検出させた。その結果、ＶＥＧＦ１６５存在下で、新たなバンドが検出された（図２の左側の２レーン）ことから、本スクリーニングで同定した配列はＶＥＧＦ１６５に結合するアプタマーであることを明らかとなった。
　　次に、新規人工塩基ｄＤｓｂｎがＶＥＧＦ１６５との結合に関与しているかどうかを確認するために、ｄＤｓｂｎをｄＤｓおよびｄＡに置換したオリゴマー（ｄＤｓ置換体：Ｔ－００２００、ｄＡ置換体：Ｔ－００２０１、配列は下記を参照）を用いて評価した。オリゴマーは化学合成法で合成し、ＯＰＣ（カートリッジ）で精製を実施した。ＥＭＳＡは上記に示している通りにフォールディング操作および反応を行い、未変性ポリアクリルアミドでの分析を行った（図２のｄＤｓ：中央の２レーンおよびｄＡ：右側の２のレーン）。その結果、ｄＤｓｂｎをｄＤｓおよびｄＡに置換したことにより、タンパク質との複合体に由来するシフトバンドが消失した。このことより、本実験で同定したｄＤｓｂｎを含むＤＮＡアプタマーは、標的タンパク質との結合する際に、ＶＥＧＦ１６５と結合するのにｄＤｓｂｎが重要な働きをしていることを証明できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
＜ｓＩＬ－６Ｒに対するＤＮＡアプタマーの取得＞
　上述したＶＥＧＦ１６５と同じＤｓｂｎを含むＤＮＡライブラリーを用いて、スクリーニング方法も同様な手順で行い、ｓＩＬ－６Ｒに結合するＤＮＡ配列の濃縮を行った。
＜スクリーニングで得られたＤＮＡプールの標的タンパク質に対する親和性評価＞
　スクリーニングを進めて得られたＤＮＡプールにｓＩＬ－６Ｒに結合するＤＮＡ配列が含まれているのかどうかを、ＥＭＳＡで評価した。
　立体構造を形成させるためのフォールディング操作を実施し、標的タンパク質ｓＩＬ－６Ｒを結合溶液で所定の濃度に希釈した。結合反応は室温で３０分間保温し、８％未変性ポリアクリルアミドゲルで解析した（図３）。その結果、最終ラウンドのＤＮＡプールでは、ｓＩＬ－６Ｒ濃度が高くになるについてシフトバンドが濃くなっていることから、このＤＮＡプールにはｓＩＬ－６Ｒに結合するＤＮＡ配列が濃縮していることが明らかとなった。
＜候補配列の同定＞
　次世代シーケンサー（Ｉｏｎ　ＰＧＭシステム）を用いて、スクリーニングで得られたＤＮＡプールに含まれている配列を解析した。セレクション用Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒとセレクション用Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ間の挿入塩基長に変化がなく、さらに人工塩基ｄＤｓｂｎが残存している配列群をクラスタリングした結果、最も多く存在していた単一配列は約８％程度であった。
＜候補配列の標的タンパク質への結合親和性をＥＭＳＡで評価＞
　最も多く濃縮していた候補配列が標的タンパク質に結合するかどうかをＥＭＳＡによって解析した。
　まず候補配列に相当するオリゴマー（Ｔ－００２０２、配列下記参照）を化学合成法で合成し、ＯＰＣ（カートリッジ）で精製を行った。
　精製した候補配列のオリゴを結合溶液中に０．２μＭになるように調製し、フォールディング操作（９５℃、５分間→（－０．１℃／秒）→２５℃）を行うことで、三次構造を形成させた。その後ｓＩＬ－６Ｒを結合溶液で０．２μＭに希釈し、フォールディング済みＤＮＡ溶液と混合させ、室温で３０分間保温させた。保温後の試料を８％未変性ポリアクリルアミドゲルで泳動し、ＤＮＡ－タンパク質複合体のバンドを検出できるかどうかを分析した。ＤＮＡはＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄで染色させ、４７０ｎｍのｂｌｕｅ　ｌｉｇｈｔで検出させた（図４の左側の２レーン）。その結果、ｓＩＬ－６Ｒ存在下で、新たなバンドが検出されたことから、本スクリーニングで同定した配列はｓＩＬ－６Ｒに結合するアプタマーであることを明らかとなった。
　次に、新規人工塩基ｄＤｓｂｎがｓＩＬ－６Ｒとの結合に関与しているかを確認するために、ｄＤｓｂｎをｄＤｓおよびｄＡに置換したオリゴ（ｄＤｓ置換体：Ｔ－００２０３、ｄＡ置換体：Ｔ－００２０４、配列下記参照）を用いて評価した。オリゴは化学合成で合成し、ＯＰＣ（カートリッジ）で精製を実施した。ＥＭＳＡは上記に示している通りにフォールディング操作、反応、未変性ポリアクリルアミドでの分析を行った（図４）。その結果、ｄＤｓｂｎをｄＤｓおよびｄＡに置換したことにより、タンパク質との複合体に由来するシフトバンドが消失した。このことより、本実験で同定したｄＤｓｂｎを含むＤＮＡアプタマーは、標的タンパク質との結合する際に、ｓＩＬ－６Ｒと結合するにはｄＤｓｂｎが重要な働きをしていることを証明できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
〔実施例１１〕
人工塩基を有するヌクレオシドの３´－アミダイトを用いたＤＮＡの合成
　化合物３を一例とする、本実施形態の人工塩基を含んだヌクレオシド３´－アミダイトは、一般的に用いられる固相合成法において、天然塩基のヌクレオシド３´－アミダイトと同等な条件でオリゴ核酸の合成に使用可能である。化合物３を固相合成法に適用し、得られたＤＮＡ鎖（Ｔ－００２４３、配列は下記を参照）をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。合成したＤＮＡ鎖にｄＤｓｃｐが含まれていることは、次世代シーケンサー（Ｉｏｎ　ＰＧＭシステム）を用いて解析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
〔実施例１２〕
人工塩基を有するヌクレオシド５´－三リン酸のＰＣＲへの適用
　人工塩基である７－（５－シクロペンチルメチルチオフェン－２－イル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル（Ｄｓｃｐ）を塩基部分にもつヌクレオチド（以下、ｄＤｓｃｐと称する）がＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ鎖に取り込まれ、かつ増幅することを確認するため、ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を次世代シーケンサーで解析した。
　実施例１１で調製したｄＤｓｃｐを含む一本鎖ＤＮＡ（Ｔ－００２４３）を以下のＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして用いた。
　ＰＣＲは、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ　Ｐｆｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで行った。ＰＣＲ用溶液の組成は、１ｘＡｃｃｕＰｒｉｍｅ　Ｐｆｘ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（ｄＮＴＰ　０．３ｍＭ，１．０ｍＭ　ＭｇＳＯ４を含む），０．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４，０．１ｍＭ　ｄＮＴＰ，０．５μＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ，０．５μＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ，０．０５ｍＭ　ｄＤｓｃｐＴＰ，０．０５ｍＭ　ｄｉｏｌ１－ｄＰｘＴＰ，０．０５ｕｎｉｔ／μＬ　ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ　Ｐｆｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。この組成の反応液中に一本鎖ＤＮＡ（Ｔ－００２４３）を４．８ｘ１０９分子添加して、９４℃、２分－（９４℃、１５秒－６５℃、２１０秒）×２０サイクルでＰＣＲ産物を調製した。得られたＰＣＲ産物はポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、鋳型ＤＮＡに相当する一本鎖ＤＮＡ断片を単離した。単離精製した一本鎖ＤＮＡを用いて、上述のＰＣＲ条件でＤＮＡ断片の増幅および精製を繰り返し、トータル６０サイクルさせた一本鎖ＤＮＡを調製した。
　上記工程に従ってトータル６０サイクルで調製した一本鎖ＤＮＡにｄＤｓｃｐが取り込まれていることを、次世代シーケンサー（Ｉｏｎ　ＰＧＭシステム）を用いて評価した。その結果、トータル６０サイクルしたＰＣＲ産物には、所定の位置にｄＤｓｃｐが存在していることが確認できた。そのことから、ｄＤｓｃｐがＤＮＡポリメラーゼによって認識され、複製されたＤＮＡ断片に取り込まれていることが明らかとなった。
〔実施例１３〕
人工塩基ｄＤｓｃｐを有するヌクレオシドを含む一本鎖ＤＮＡライブラリーを用いたスクリーニング
＜ＶＥＧＦ１６５に対するＤＮＡアプタマーの取得＞
　スクリーニングで使用する、ｄＤｓｃｐが含まれる一本鎖ＤＮＡライブラリーは、化学合成法により合成し、得られたＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。この一本鎖ＤＮＡライブラリーは、実施例１０で使用しているＰｒｉｍｅｒの組み合わせとは異なり、セレクション用Ｆｏｒｗａｒａｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　２，　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　２（配列は下記を参照）を用いた。
　ｄＤｓｃｐがランダム領域に含まれる一本鎖ＤＮＡライブラリーを用いてＶＥＧＦ１６５に対する結合配列の濃縮工程は実施例６に示したスクリーニング方法と同様な手順で実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
＜スクリーニングで得られたＤＮＡプールの標的タンパク質に対する親和性評価＞
　スクリーニング工程で得られたＤＮＡプールにＶＥＧＦ１６５に結合するＤＮＡ配列が含まれているかをＥＭＳＡで評価した。立体構造を形成させるためのフォールディング操作を実施し、ＶＥＧＦ１６５は結合溶液で所定の濃度に希釈した。それぞれを混合し、３７℃で３０分間保温し、８％未変性ポリアクリルアミドゲルで解析した（図５）。その結果、最終ラウンドのＤＮＡプールには、ＶＥＧＦ１６５と結合した明確なシフトバンドが検出されたことより、スクリーニングで得られたＤＮＡプールにはＶＥＧＦ１６５に結合するＤＮＡ配列が濃縮していることが明らかとなった。
＜候補配列の同定＞
　次世代シーケンサー（Ｉｏｎ　ＰＧＭシステム）を用いて、スクリーニングで得られたＤＮＡプールに含まれている配列を解析した。セレクション用Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ２とセレクション用Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ２間の挿入塩基長に変化がなく、さらに人工塩基ｄＤｓｃｐが残存している配列群をクラスタリングした結果、最も多く存在していた単一配列は約３０％程度であった。
＜候補配列の標的タンパク質への結合親和性をＥＭＳＡで評価＞
　最も多く濃縮していた候補配列が標的タンパク質に結合するかどうかをＥＭＳＡによって解析した。まず候補配列に相当するオリゴマー（Ｔ－００２４４、配列下記参照）を化学合成法で合成し、ＯＰＣ（カートリッジ）で精製を行った。精製した候補配列のオリゴを結合溶液中に０．２μＭになるように調製し、フォールディング操作（９５℃、５分間→（－０．１℃／秒）→２５℃）を行うことで、三次構造を形成させた。その後ＶＥＧＦ１６５を結合溶液で０．２μＭに希釈し、フォールディング済みＤＮＡ溶液と混合させ、３７℃で３０分間保温させた。保温後の試料を８％未変性ポリアクリルアミドゲルで泳動し、ＤＮＡ－タンパク質複合体のバンドを検出できるかどうかを分析した。ＤＮＡはＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄで染色させ、４７０ｎｍのｂｌｕｅ　ｌｉｇｈｔで検出させた。その結果、ＶＥＧＦ１６５存在下で、新たなバンドが検出された（図６の左側の２レーン）ことから、本スクリーニングで同定した配列はＶＥＧＦ１６５に結合するアプタマーであることを明らかとなった。
　次に、新規人工塩基ｄＤｓｃｐがＶＥＧＦ１６５との結合に関与しているかを確認するために、ｄＤｓｃｐをｄＤｓおよびｄＡに置換したオリゴ（ｄＤｓ置換体：Ｔ－００２４５、ｄＡ置換体：Ｔ－００２４６、配列は下記を参照）を用いて評価した。オリゴは化学合成で合成し、ＯＰＣ（カートリッジ）で精製を実施した。ＥＭＳＡは上記に示している通りにフォールディング操作、反応、未変性ポリアクリルアミドでの分析を行った（図６）。その結果、ｄＤｓｃｐをｄＤｓおよびｄＡに置換したことにより、タンパク質との複合体に由来するシフトバンドが消失した。このことより、本実験で同定したＤＮＡアプタマーは、ＶＥＧＦ１６５と結合する際にはｄＤｓｃｐが重要な働きをしていることを証明できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
＜ｓＩＬ－６Ｒに対するＤＮＡアプタマーの取得＞
　ｄＤｓｃｐがランダム領域に含まれる一本鎖ＤＮＡライブラリーを用いてｓＩＬ―６Ｒに対する結合配列の濃縮工程は実施例１０に示したスクリーニング方法と同様な手順で実施した。
＜スクリーニングで得られたＤＮＡプールの標的タンパク質に対する親和性評価＞
　スクリーニング工程で得られたＤＮＡプールにｓＩＬ－６Ｒに結合するＤＮＡ配列が含まれているかをＥＭＳＡで評価した。立体構造を形成させるためのフォールディング操作を実施し、ｓＩＬ－６Ｒは結合溶液で所定の濃度に希釈した。それぞれを混合し、室温で３０分間保温し、８％未変性ポリアクリルアミドゲルで解析した（図７）。その結果、最終ラウンドのＤＮＡプールには、ｓＩＬ－６Ｒの濃度が濃くなるについて結合した明確なシフトバンドが検出されたことより、スクリーニングで得られたＤＮＡプールにはｓＩＬ－６Ｒに結合するＤＮＡ配列が濃縮していることが明らかとなった。
＜候補配列の同定＞
　次世代シーケンサー（Ｉｏｎ　ＰＧＭシステム）を用いて、スクリーニングで得られたＤＮＡプールに含まれている配列を解析した。セレクション用Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ２とセレクション用Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ２間の挿入塩基長に変化がなく、さらに人工塩基ｄＤｓｃｐが残存している配列群をクラスタリングした結果、存在割合が約２２％と高い単一配列を同定した。
＜候補配列の標的タンパク質への結合親和性をＥＭＳＡで評価＞
　最も多く濃縮していた候補配列が標的タンパク質に結合するかどうかをＥＭＳＡによって解析した。まず候補配列に相当するオリゴマー（Ｔ－００２４７、配列下記参照）を化学合成法で合成し、ＯＰＣ（カートリッジ）で精製を行った。精製した候補配列のオリゴを結合溶液中に０．２μＭになるように調製し、フォールディング操作（９５℃、５分間→（－０．１℃／秒）→２５℃）を行うことで、三次構造を形成させた。その後ｓＩＬ－６Ｒを結合溶液で０．６μＭに希釈し、フォールディング済みＤＮＡ溶液と混合させ、室温で３０分間保温させた。保温後の試料を８％未変性ポリアクリルアミドゲルで泳動し、ＤＮＡ－タンパク質複合体のバンドを検出できるかどうかを分析した。ＤＮＡはＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄで染色させ、４７０ｎｍのｂｌｕｅ　ｌｉｇｈｔで検出させた。その結果、ｓＩＬ－６Ｒ存在下で、新たなバンドが検出された（図８の左側の２レーン）ことから、本スクリーニングで同定した配列はｓＩＬ－６Ｒに結合するアプタマーであることを明らかとなった。
　次に、新規人工塩基ｄＤｓｃｐがｓＩＬ－６Ｒとの結合に関与しているかを確認するために、ｄＤｓｃｐをｄＤｓおよびｄＡに置換したオリゴ（ｄＤｓ置換体：Ｔ－００２４８、ｄＡ置換体：Ｔ－００２４９、配列は下記を参照）を用いて評価した。オリゴは化学合成で合成し、ＯＰＣ（カートリッジ）で精製を実施した。ＥＭＳＡは上記に示している通りにフォールディング操作、反応、未変性ポリアクリルアミドでの分析を行った（図８）。その結果、ｄＤｓｃｐをｄＤｓおよびｄＡに置換したことにより、タンパク質との複合体に由来するシフトバンドが消失した。このことより、本実験で同定したｄＤｓｃｐを含むＤＮＡアプタマーは、ｓＩＬ－６Ｒと結合する際にｄＤｓｃｐが重要な働きをしていることを証明できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　本発明は、上述した態様や実施例に限定されず、本願の請求項に規定される本発明の範囲内に含まれ得る代替態様、変更態様が含まれる。

Claims (16)

  1. 　下記式Ｉの構造を塩基として有するデオキシリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオチド。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式Ｉ中、Ｒ１は、置換Ｃ１－Ｃ３アルキル基、置換または無置換Ｃ4－Ｃ９アルキル基、置換または無置換のアリール基、置換または無置換のシクロアルキル基、置換または無置換のアラアルキル基、置換または無置換のヘテロアリール基である）
  2. 　Ｒ１がフェニル基、４－ピリジル基、ナフチル基、イソプロピル基、シクロペンチル基である請求項１に記載のデオキシリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオチド。
  3. 　５´－水酸基に三リン酸を有する、請求項１または２に記載のデオキシリボヌクレオチド。
  4. 　５´－水酸基に保護基を有し、３´－水酸基にホスホロアミダイト基またはＨ－ホスホネート基を有する、請求項１または２に記載のデオキシリボヌクレオシド。
  5. 　請求項１から４のいずれか１項に記載のデオキシリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、オリゴ核酸合成用試薬。
  6. 　請求項１から４のいずれか１項に記載のデオキシリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、医薬品。
  7. 　２－ブロモチオフェン誘導体と、２－アミノ－３－ニトロ－４－クロロピリジンまたは７－クロロ－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン誘導体とのカップリング反応を行う工程を含む、請求項１または２に記載のデオキシリボヌクレオシドの合成法。
  8. 　前記カップリング反応を、鈴木カップリング反応条件下で行う、請求項７に記載の合成法。
  9. 　請求項１または２に記載の塩基を有するデオキシリボヌクレオシドが組み込まれたオリゴデオキシリボ核酸。
  10. 　請求項９に記載のオリゴデオキシリボ核酸を部分構造として含む、オリゴ核酸またはその誘導体。
  11. 　請求項９のオリゴデオキシリボ核酸、または、請求項１０に記載のオリゴ核酸またはその誘導体に、独立した任意の分子種を結合させた修飾体。
  12. 　請求項９に記載のオリゴデオキシリボ核酸、請求項１０に記載のオリゴ核酸もしくはその誘導体、または請求項１１に記載の修飾体を含有する、ヒトもしくは動物用医薬品、該医薬品の原料、健康食品の添加物、または診断試薬。
  13. 　請求項９に記載のオリゴデオキシリボ核酸、請求項１０に記載のオリゴ核酸もしくはその誘導体、または請求項１１に記載の修飾体を含有する、医療用品。
  14. 　医療用材料、医療用資材、医療機器、または医療用製品である、請求項１３に記載の医療用品。
  15. 　請求項９に記載のオリゴデオキシリボ核酸、請求項１０に記載のオリゴ核酸もしくはその誘導体、または請求項１１に記載の修飾体を含有する、アフィニティーカラムクロマトグラフィーに用いる担体。
  16. 　請求項１５に記載の担体を備えたカラム、物質分離用機器または医療機器。
     
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006199617A (ja) * 2005-01-20 2006-08-03 Institute Of Physical & Chemical Research イミダゾピリジン誘導体
WO2007066737A1 (ja) * 2005-12-09 2007-06-14 Riken 核酸の複製の方法及び新規人工塩基対
US20120219963A1 (en) * 2009-10-30 2012-08-30 Gerd Wagner Derivatives of uridine phosphate and their uses in protein binding assays
JP5424414B2 (ja) 2008-03-31 2014-02-26 独立行政法人理化学研究所 高選択・高効率でｐｃｒ増幅が可能な新規ｄｎａ
JP6307675B2 (ja) 2011-11-18 2018-04-11 タグシクス・バイオ株式会社 標的タンパク質に結合する核酸断片

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2763958B2 (ja) 1990-06-11 1998-06-11 ネクスター ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド 核酸リガンド

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006199617A (ja) * 2005-01-20 2006-08-03 Institute Of Physical & Chemical Research イミダゾピリジン誘導体
WO2007066737A1 (ja) * 2005-12-09 2007-06-14 Riken 核酸の複製の方法及び新規人工塩基対
JP5424414B2 (ja) 2008-03-31 2014-02-26 独立行政法人理化学研究所 高選択・高効率でｐｃｒ増幅が可能な新規ｄｎａ
US20120219963A1 (en) * 2009-10-30 2012-08-30 Gerd Wagner Derivatives of uridine phosphate and their uses in protein binding assays
JP6307675B2 (ja) 2011-11-18 2018-04-11 タグシクス・バイオ株式会社 標的タンパク質に結合する核酸断片

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DILIP K TOSH ET AL., J. MED. CHEM., no. 55, 2012, pages 4847 - 4860
GUPTA S ET AL., J. BIOL. CHEM., 2014, pages 8706 - 19
LARRY GOLD ET AL., PLOS ONE, vol. 5, no. 11, 2010, pages e15004
MICHIKO KIMOTO ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, no. 31, 2013, pages 453 - 457
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, no. 37, 2009, pages e14

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