CN116655715A - 一种GalNAc衍生物、缀合物、组合物以及它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及核酸基因药物的递送载体领域，具体公开了一种如式(I)所示的GalNAc衍生物、缀合物、组合物以及它们的用途。本公开提供的GalNAc衍生物作为核酸基因药物的递送载体，能够将本公开提供的缀合物高度有效地靶向到肝脏，并对肝脏靶基因的表达产生有效抑制，可用于治疗和/或预防肝源性疾病，并且本公开提供的缀合物具有体内活性高、药效作用持久、动物水平毒性低的优点。

Description

一种GalNAc衍生物、缀合物、组合物以及它们的用途
技术领域
本公开涉及核酸基因药物的递送载体领域，具体涉及一种GalNAc衍生物、缀合物、组合物以及它们的用途。
背景技术
以小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）、反义寡核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotide，ASODN)和核酸刺激基序（CpG）为代表的小分子核酸类药物在基因治疗中占据着越来越重要的地位，部分药物已经通过FDA批准上市，目前更有多种核酸类药物处于临床前和临床试验。核酸类药物是指通过结合或裂解作用特异地针对致病基因或蛋白，从而抑制/促进某些的基因/蛋白表达的核酸序列，其包括一切可替换缺陷基因的人体正常基因，阻断基因表达的反义核酸或促进三链形成的单链核酸等，如siRNA、DNA、MicroRNA或CpG等。
递送系统是小核酸药物开发中的核心关键技术之一，目前全球范围内对小核酸递送系统研究最广泛的一类递送系统是靶向缀合递送技术。开发一种新的具有较高活性药物体内递送效率、较低的毒性、较高活性的药物缀合物，在本领域中仍存在迫切需求。
发明内容
本公开旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
为此，本公开提供了GalNAc衍生物、缀合物、组合物以及它们的用途。本公开提供的GalNAc衍生物作为递送载体，能够将本公开提供的缀合物高度有效地靶向到肝脏，并对肝脏靶基因的表达产生有效抑制，可用于治疗和/或预防肝源性疾病，并且本公开提供的缀合物具有体内活性高、药效作用持久、动物水平毒性低的优点。
在本公开的第一个方面，本公开提供了一种如式(I)所示的GalNAc衍生物：
其中，每个L1各自独立地选自取代或未取代的C3-C8直链亚烷基、或者；其中，L1a、L1b各自独立地选自取代或未取代的C1-C5直链亚烷基；
L2选自取代或未取代的C1-C5直链亚烷基；
p和q各自独立地选自0、1或2；
R1选自H、羟基保护基团或；/>代表用于连接药物活性分子的连接位点，R1a选自OH、O-、SH或S-；
R2选自H或；R2b选自含有氨基官能团的固相载体，R2a选自与所述氨基官能团连接的共价连接基团；
每个R3各自独立地选自H、取代或未取代的C1-C4烷基酰基或取代或未取代的C5-C7芳基酰基。
在本公开的一些可选实施方案中，每个L1各自独立地选自取代或未取代的C3-C8直链亚烷基。
在本公开的一些可选实施方案中，每个L1各自独立地选自、、/>、/>、/>、。
在本公开的一些具体实施方案中，每个L1都选自。
在本公开的一些可选实施方案中，每个L1各自独立地选自；其中，L1a、L1b各自独立地选自取代或未取代的C1-C5直链亚烷基。
在本公开的一些可选实施方案中，每个L1各自独立地选自；其中，L1a、L1b各自独立地选自C1-C5直链亚烷基。例如：每个L1a各自独立地选自C1-C5直链亚烷基、C1-C4直链亚烷基、C1-C3直链亚烷基、C1-C2直链亚烷基、C2-C5直链亚烷基、C2-C4直链亚烷基、C2-C3直链亚烷基、或C2直链亚烷基。每个L1b各自独立地选自C1-C5直链亚烷基、C1-C4直链亚烷基、C2-C5直链亚烷基、C2-C4直链亚烷基、C3-C5直链亚烷基、C3-C4直链亚烷基、或C4直链亚烷基。
在本公开的一些可选实施方案中，每个L1各自独立地选自；其中，L1a、L1b各自独立地选自/>、/>、/>、/>或。
在本公开的一些具体实施方案中，L1a选自。
在本公开的一些具体实施方案中，L1b选自。
在本公开的一些可选实施方案中，每个L1各自独立地选自、、/>、/>或。
在本公开的一些具体实施方案中，每个L1都选自。
在本公开的一些可选实施方案中，L2选自C1-C5直链亚烷基。例如：C1-C4直链亚烷基、C1-C3直链亚烷基、C1-C2直链亚烷基、C2-C5直链亚烷基、C2-C4直链亚烷基、C2-C3直链亚烷基、C2直链亚烷基。
在本公开的一些可选实施方案中，L2选自、/>、/>、或/>。
在本公开的一些具体实施方案中，L2选自。
在本公开的一些具体实施方案中，p选自1且q选自1。
在本公开的一些具体实施方案中，R1选自羟基保护基团。
在本公开的一些可选实施方案中，所述羟基保护基团选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基或4,4',4''-三甲氧基三苯基。
在本公开的一些具体实施方案中，所述羟基保护基团选自4,4'-二甲氧基三苯甲基。
在本公开的一些具体实施方案中，R1选自；/>代表用于连接药物活性分子的连接位点。
在本公开的一些可选实施方案中，所述药物活性分子选自小分子药物、抗体或寡核苷酸。
在本公开的一些可选实施方案中，所述寡核苷酸选自单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。
在本公开的一些可选实施方案中，所述单链寡核苷酸选自ASO。
在本公开的一些可选实施方案中，所述双链寡核苷酸选自siRNA。
在本公开的一些具体实施方案中，所述药物活性分子选自siRNA。
在本公开的一些具体实施方案中，R2a选自。
在本公开的一些可选实施方案中，所述固相载体选自包含羟基和/或氨基官能团的树脂或含可控孔径的玻璃球。
在本公开的一些可选实施方案中，R2b选自，/>选自树脂或可控孔径玻璃球。
在本公开的一些具体实施方案中，选自/>。
在本公开的一些可选实施方案中，每个R3各自独立地选自H、、、/>、/>、/>、/>、、/>、/>或/>。
在本公开的一些可选实施方案中，每个R3各自独立地选自H或。
在本公开的一些具体实施方案中，每个R3都选自。
在本公开的一些具体实施方案中，每个R3都选自H。
在本公开的一些可选实施方案中，所述GalNAc衍生物如式(II)所示：
。
在本公开的一些具体实施方案中，所述GalNAc衍生物选自以下任一化合物：
。
在本公开的第二个方面，本公开提供了一种如式(III)所示的缀合物：
其中，Nu代表寡核苷酸；
k选自1、2、3或4；
Q的结构式选自
，
L1、L2、p、q、R1a、如前述所定义。
在本公开的一些可选实施方案中，所述寡核苷酸选自单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。
在本公开的一些可选实施方案中，所述单链寡核苷酸选自ASO。
在本公开的一些具体实施方案中，所述寡核苷酸选自双链寡核苷酸。
在本公开的一些具体实施方案中，所述双链寡核苷酸选自siRNA。
在本公开的一些具体实施方案中，k选自1。
在本公开的一些具体实施方案中，k选自1，所述寡核苷酸选自双链寡核苷酸，一个所述Q缀合到所述双链寡核苷酸的正义链3'末端。
在本公开的一些可选实施方案中，k选自2。
本公开的一些可选实施方案中，k选自2，所述寡核苷酸选自双链寡核苷酸，两个所述Q分别缀合到所述双链寡核苷酸的正义链3'末端和正义链5'末端。
在本公开的一些可选实施方案中，k选自3。
本公开的一些可选实施方案中，k选自3，所述寡核苷酸选自双链寡核苷酸；三个所述Q分别缀合到所述双链寡核苷酸的正义链3'末端、正义链5'末端、反义链3'末端，或者三个所述Q缀合分别到所述双链寡核苷酸的正义链3'末端、正义链5'末端和反义链5'末端。
在本公开的一些可选实施方案中，k选自4。
在本公开的一些可选实施方案中，k选自4，所述寡核苷酸选自双链寡核苷酸；四个所述Q分别缀合到所述双链寡核苷酸的正义链3'末端、正义链5'末端、反义链3'末端和反义链5'末端。
在本公开的一些具体实施方案中，所述缀合物选自以下任一化合物：
。
在本公开的第三个方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含第二方面所述的缀合物。
本公开的一些可选实施方案中，所述组合物进一步包含任选地一种或多种药学上可接受的载体。
在本公开的第四个方面，本公开提供了如下任意项在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途：
（I）第一方面所述的NalNAc衍生物；和/或
（II）第二方面所述的缀合物；和/或
（III）第三方面所述的组合物。
本公开的一些可选实施方案中，所述疾病选自由肝脏细胞中靶基因的非正常表达而引起的病理状况或疾病。
在本公开的一些具体实施方案中，所述靶基因选自超氧化物歧化酶1（SuperoxideDismutase 1，SOD1）或血管生成素样蛋白3（angiopoietin-like 3，ANGPTL3）。
在本公开的第五个方面，本公开提供了一种降低靶基因的表达或活性的方法，所述方法包含如下任意项与肝脏细胞进行接触：
（I）第二方面所述的缀合物；和/或
（II）第三方面所述的组合物。
在本公开的一些具体实施方案中，所述靶基因选自SOD1或ANGPTL3。
本公开具有以下有益效果：
本公开提供的GalNAc衍生物作为递送载体，能够将本公开提供的缀合物高度有效地靶向到肝脏，并对肝脏靶基因的表达产生有效抑制，可用于治疗和/或预防肝源性疾病，并且本公开提供的缀合物具有体内活性高、药效作用持久、动物水平毒性低的优点。
附图说明
图1给予实施例1所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的相对表达水平；
图2 给予实施例2所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的相对表达水平。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
术语解释
在本公开的上下文中，术语“N-乙酰半乳糖胺（N-Acetylgalactosamine，GalNAc）”对去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）具有很高的亲和力，而ASGPR主要表达在肝实质细胞表面。例如：将siRNA缀合至GalNAc，形成GalNAc-siRNA缀合物，其中GalNAc配体可以结合肝脏表达的ASGPR并将siRNA靶向递送至肝细胞。
在本公开的上下文中，术语“直链亚烷基”是指通式为的直链亚烃基。其中，术语“C1-C5直链亚烷基”是指具有1至5个碳原子的直链亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚正丁基、亚正戊基。术语“C3-C8直链亚烷基”是指具有3至8个碳原子的直链亚烷基，例如亚正丙基、亚正丁基、亚正戊基、亚正己基、亚正庚基、亚正辛基。
在本公开的上下文中，术语“烷基”是指通式为的链烷基，链烷基可以是直链烷基或支链烷基。其中，术语“C1-C4烷基”是指具有1至4个碳原子的链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。
在本公开的上下文中，术语“烷酰基”的结构式为；其中，R代表烷基。
在本公开的上下文中，术语“芳酰基”的结构式为，其中，Ar是指芳基（aryl group），Ar在有机化学中是指任何从简单芳香环衍生出的官能团或取代基。最简单的芳基是苯基（Phenyl），由苯衍生而来。
在本公开的上下文中，“”表示基团通过共价键连接的位点。
本公开所述GalNAc衍生物和所述缀合物的结构式中，键“”表示未指定构型。如果化学结构中存在手性异构，键“/>”可以为“/>”、“/>”、或者同时包含“/>”和“/>”两种构型。虽然为简便起见将全部上述结构式画成某些异构体形式，但是本公开可以包括所有的异构体，例如：互变异构体、旋转异构体、几何异构体、非对映异构体、外消旋体和对映异构体。
本公开所述化合物结构式中，键“”表示未指定构型。如果化学结构中存在顺反异构，键“/>”的构型可以为E型、Z型、或者同时包含E和Z两种构型。
除非另外说明，应当应用本文所使用的下列定义。出于本公开的目的，化学元素与元素周期表CAS版，和《化学和物理手册》，第75版，1994一致。此外，有机化学一般原理可参考"Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito:1999, 和 "March's Advanced Organic Chemistry” by Michael B. Smith and JerryMarch, John Wiley&Sons, New York: 2007中的描述，其全部内容通过引用并入本文。除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个（种）”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个（即至少一个）宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。
本公开所述化合物结构式中，术语“包含”为开放式表达，即包括本公开所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
本公开所述化合物结构式中，术语“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体（旋转异构体）、几何异构体（顺/反）异构体、阻转异构体，等等。
本公开所述化合物结构式中，术语“手性”是具有与其镜像不能重叠性质的分子；而“非手性”是指与其镜像可以重叠的分子。
本公开所述化合物结构式中，术语“对映异构体”是指一个化合物的两个不能重叠但互成镜像关系的异构体。
本公开所述化合物结构式中，术语“非对映异构体”是指有两个或多个手性中心并且其分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体混合物可通过高分辨分析操作如电泳和色谱，例如HPLC来分离。
本公开所使用的立体化学定义和规则一般遵循S.P.Parker，Ed.，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York ；andEliel，E.and Wilen，S.，“Stereochemistry of Organic Compounds”，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1994。
一般而言，术语“取代的”表示所给结构中的一个或多个氢原子被具体取代基所取代。除非其他方面表明，一个被取代的基团可以有一个取代基在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式中不止一个位置能被选自具体基团的一个或多个取代基所取代时，那么取代基可以相同或不同地在各个可取代的位置取代。
术语“未取代的”，表示指定基团不带有取代基。
术语“任选地被……所取代”，可以与术语“未取代或被……所取代”交换使用，即所述结构是未取代的或者被一个或多个本公开所述的取代基取代。本公开所述的取代基包括但不限于：D、F、Cl、Br、I、N3、CN、NO2、OH、SH、NH2、烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、卤代烷基氨基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基等等。
另外，需要说明的是，除非以其他方式明确指出，在本公开中所采用的描述方式“各…独立地为”与“…各自独立地为”和“…独立地为”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
需要说明的是，除非以其他方式明确指出，在本公开中所采用的描述方式术语“缀合物”、“siRNA缀合物”和“siRNA序列”可以互换。
在本公开的上下文中，术语“寡核苷酸”是脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)或核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，一般是由10-50个核苷酸组成。寡核苷酸可通过核糖核酸干扰、核糖核酸酶介导的靶标降解、剪接调控、非编码RNA抑制、基因激活和程序化基因编辑等一系列过程来调控基因表达。
在本公开的上下文中，“反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）”是一种单链寡核苷酸分子，一般是由10～50个核苷酸组成。ASO进入细胞后在核糖核酸酶H1的作用下通过碱基互补配对原则与其互补的靶mRNA结合，抑制靶基因的表达。
在本公开的上下文中，术语“小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）”是一类的双链RNA，包含正义链和反义链，每条链的长度为17到30个核苷酸。siRNA通过形成沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），介导RISC途径的RNA转录物靶向切割。具体地，siRNA通过已知的RNA干扰（RNAi）过程指导mRNA序列的特异性降解，抑制mRNA翻译成氨基酸和转化为蛋白质。
在本公开的上下文中，术语“反义链（或称引导链）”包括与一个靶序列基本上互补的区域。“正义链（或称随从链）”是指含有与在反义链基本上互补的iRNA链。
在本公开的上下文中，术语“药学上可接受的载体”包括任何溶剂，分散介质，包衣衣料，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)，等渗剂，盐，药物稳定剂，粘合剂，赋形剂，分散剂，润滑剂，甜味剂，调味剂，着色剂，或其组合物，这些载体都是所属技术领域技术人员的已知的(如Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. MackPrinting Company, 1990, pp. 1289-1329所述)。除了任意常规载体与活性成分不相容的情况外，涵盖其在治疗或药物组合物中的用途。
在本公开的上下文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本公开的siRNA不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本公开所考虑的范围。
在本公开的上下文中，“治疗”、“减轻”或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此处，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
在本公开的上下文中，“预防”和“防止”可互换使用。这些术语指获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将缀合物、RNAi试剂或组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使可能该疾病的诊断尚未作出。在本公开的上下文中，除非另有说明，本公开各实施例中所述试剂比例均按体积比（v/v）计算。
除非另有说明，本公开提供的NalNAc衍生物的制备过程中所用原料及试剂均购自于北京偶合科技有限公司。其中，本公开用到的部分试剂详情如表1所示。
表1 部分试剂详情
除非另有说明，本公开使用的试剂耗材（表2）及仪器设备（表3）均来源于下述厂家的市售产品。
表2 主要试剂耗材
表3主要仪器设备
制备例1：化合物CR01009的合成
本制备例中，化合物CR01009的合成路线如下所示：
（1-1）化合物CR01009-1的合成
将化合物Gal-5（4.29g，9.59mmol，3.3eq）、1-羟基苯并三唑（1.76g，13.04mmol，4.5eq）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（2.51g，13.07mmol，4.5eq）、N,N-二甲基甲酰胺（20ml）和N,N-二异丙基乙胺（3.75g，29mmol，10.0eq）混合，搅拌0.5小时，加入轮环藤宁（0.5g，2.9mmol，1.0eq），氮气置换3次，25℃下搅拌20小时。反应结束后，反应液直接进行柱层析反相纯化（C18色谱柱，洗脱液：乙腈/水=72/28，v/v），得到化合物CR01009-1（3.23g，收率67.7%）。MS ESI (m/z) = 1641 [M + H]+。
（1-2）化合物CR01009-2的合成
将化合物CR01009-2（2.0g，1.37mmol，1.2eq）、丁二酸单苄酯（0.34g，1.63mmol，1.0eq）、N,N-二异丙基乙胺（0.35g，2.7mmol，2.0eq）、N,N-二甲基甲酰胺（20ml）和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（0.78g，2.05mmol，1.5eq）混合，氮气置换3次，25℃下搅拌16小时。反应结束后，反应液直接进行柱层析反相纯化（C18色谱柱，洗脱液：乙腈/水=72/28，v/v），得到化合物CR01009-2（1.64g，收率81.6%）。MS ESI (m/z) =1651[M + H]+。
（1-3）化合物CR01009-3的合成
将化合物CR01009-2（1.64g，0.993mmol）溶于甲醇（16ml）中，加入湿钯碳（10%w/w），氢气置换3次，25℃下搅拌16小时。反应结束后，过滤反应液，浓缩滤液，得到化合物CR01009-3（1.2g，收率77.4%）。MS ESI (m/z) = 1561 [M + H]+。
（1-4）化合物CR01009-4的合成
将化合物CR01009-3（0.4g，0.256mmol，1.0eq）、2-氨基-1-(4-(双(4-甲氧基苯基苯基)甲氧基)甲基)哌啶-1-基)-3-羟基-1-丙酮（155mg，0.307mmol，1.2eq）、N,N-二异丙基乙胺（66mg，0.51mmol，2.0eq）和N,N-二甲基甲酰胺（8ml）混合，加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（146mg，0.384mmol，1.5eq），氮气置换3次，25℃下搅拌3小时。反应结束后，反应液直接进行柱层析反相纯化（C18色谱柱，洗脱液：乙腈/水=72/28，v/v），得到化合物CR01009-4（280mg，收率53.8%）。MS ESI (m/z) = 2048 [M + H]+。
（1-5）化合物CR01009-5的合成
将化合物CR01009-4（280mg，0.137mmol，1.0eq）、丁二酸酐（17.8mg，0.178mmol，1.3eq）、4-二甲氨基吡啶（1.7mg，0.014mmol，0.1eq）、三乙胺（27.6mg，0.27mmol，2.0eq）、二氯甲烷（3ml）混合，氮气置换3次，25℃下搅拌16小时，反应液直接进行柱层析反相纯化（C18色谱柱，洗脱液：乙腈/水=72/28，v/v），得到化合物CR01009-5（140mg）。MS ESI (m/z) =2147 [M + H]+。
（1-6）化合物CR01009的合成
将化合物CR01009-5（140mg，0.066mmol）、氨基CPG（1.63g，0.13mmol）、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（37mg，0.097mmol）、N,N-二异丙基乙胺(17mg，0.132mmol）、乙腈（10ml）混合，氮气置换3次，25℃下摇床16小时，过滤反应液，滤饼依次用乙腈（20ml）洗涤一次和二氯甲烷（20ml）洗涤一次后减压干燥，将干燥好的滤饼与cap1（20ml）、cap2（2ml）、4-二甲氨基吡啶（4mg，0.033mmol）混合，25℃下摇床6小时，过滤反应液，滤饼用10ml乙腈洗涤一次后减压干燥，得到化合物CR01009（1.54g）。
其中，Cap1和Cap2为盖帽试剂溶液，Cap1为20体积%N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5；Cap2为20体积%乙酸酐的乙腈溶液。
制备例2：化合物CR01016的合成
本制备例中，化合物CR01016的合成路线如下所示：
（2-1）化合物CR01016-1的合成
将化合物Gal-5（1157mg，2.587mmol）、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（1475mg，3.88mmol），N,N-二甲基甲酰胺（12mL）、N,N-二异丙基乙胺（668mg，5.174mmol）和3-氨基丙酸苄酯（556mg，3.1mmol）混合，氮气置换3次，25℃下搅拌20小时。反应结束后，反应液直接进行柱层析反相纯化（C18色谱柱，洗脱液：乙腈/水=72/28，v/v），得到化合物CR01016-1（1243mg，收率79%）。MS ESI (m/z) = 608 [M + H]+。
（2-2）化合物CR01016-2的合成
将化合物CR01016-1（1243mg，2.045mmol）溶于甲醇（2.5ml）中，加入湿钯碳（125mg，10%w/w），氢气置换3次，25℃下搅拌20小时。反应结束后，反应液直接过滤并浓缩，得到化合物CR01016-2（964mg，收率91.0%）。MS ESI (m/z) = 518 [M + H]+。
（2-3）化合物CR01016-3的合成
将化合物CR01009-2（964mg，1.86mmol，3.2eq）、1-羟基苯并三唑（353mg，2.6mmol，4.5eq）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（502mg，2.6mmol，4.5eq）、N,N-二甲基甲酰胺（2ml）和N,N-二异丙基乙胺（750mg，5.8mmol，10.0eq）混合，25℃下搅拌0.5小时，加入轮环藤宁（100mg，0.58mmol，1.0eq），氮气置换3次，25℃下搅拌20小时。反应结束后，反应液直接进行柱层析反相纯化（C18色谱柱，洗脱液：乙腈/水=72/28，v/v），得到化合物CR01016-3（780mg，收率80.4%）。MS ESI (m/z) = 1674 [M + H]+。
（2-4）化合物CR01016-4的合成
将化合物CR01016-3（780mg，0.466mmol，1.0eq）、丁二酸单苄酯（116mg，0.557mmol，1.2eq）、N,N-二异丙基乙胺（120mg，0.93mmol，2.0eq）、N,N-二甲基甲酰胺（8ml）和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（266g，0.7mmol，1.5eq）混合，氮气置换3次，25℃下搅拌16小时。反应结束后，反应液直接进行柱层析反相纯化（C18色谱柱，洗脱液：乙腈/水=72/28，v/v），得到化合物CR01016-4（750mg，收率86.4%）。MS ESI (m/z) = 1864[M + H]+。
（2-5）化合物CR01016-5的合成
将化合物CR01016-4（750mg，0.402mmol，1.0eq）溶于甲醇（7.5ml）中，加入湿钯碳（10%w/w），氢气置换3次，搅拌16小时。反应结束后，过滤反应液，浓缩滤液，得到化合物CR01016-5（680mg，收率91.6%）。MS ESI (m/z) = 1774 [M + H]+。
（2-6）化合物CR01016-6的合成
将化合物CR01016-5（680mg，0.383mmol，1.0eq）、2-氨基-1-(4-(双(4-甲氧基苯基苯基)甲氧基)甲基)哌啶-1-基)-3-羟基-1-丙酮（232mg，0.46mmol，1.2eq）、N,N-二异丙基乙胺（100mg，0.775mmol，2.0eq）溶于N,N-二甲基甲酰胺（7ml）中，加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（218mg，0.574mmol，1.5eq），氮气置换3次，25℃下搅拌3小时。反应结束后，反应液直接进行柱层析反相纯化（C18色谱柱，洗脱液：乙腈/水=72/28，v/v），得到化合物CR01016-6（700mg，收率80.8%）。MS ESI (m/z) = 2260 [M + H]+。
（2-7）化合物CR01016-7的合成
将化合物CR01016-5（350mg，0.155mmol）、丁二酸酐（28mg，0.28mmol）、4-二甲氨基吡啶（2mg,0.016mmol）、三乙胺（31mg,0.307mmol）溶于二氯甲烷（3.5ml）中，氮气置换3次，25℃下搅拌16小时。反应液直接进行柱层析反相纯化（C18色谱柱，洗脱液：乙腈/水=72/28，v/v），得到化合物CR01016-7（170mg）。MS ESI (m/z) = 2360 [M + H]+。
（2-8）化合物CR01016的合成
将化合物CR01016-7（100mg，0.042mmol）、氨基CPG（1.06g，0.084mmol）、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（24mg，0.064mmol）、N,N-二异丙基乙胺（11mg，0.086mmol）加入到乙腈（20ml）中，氮气置换3次，25℃下摇床16小时，过滤反应液，滤饼依次用乙腈（20ml）洗涤一次和二氯甲烷（20ml）洗涤一次后减压干燥。将干燥好的滤饼和cap1（20ml）、cap2（2ml）、4-二甲氨基吡啶（4mg，0.033mmol）混合，25℃下摇床6小时，过滤反应液，滤饼用10ml乙腈洗涤一次后减压干燥，得到化合物CR01016（0.987g）。
其中，Cap1和Cap2为盖帽试剂溶液，Cap1为20体积%N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5；Cap2为20体积%乙酸酐的乙腈溶液。
制备例3：siRNA缀合物的制备
（3-1）正义链（SS）的合成
通过亚磷酰胺核酸固相合成法的方法，利用上述连接至固相载体的化合物（即：CR01009、CR01016）起始循环，按照核苷酸序列按照3'-5'的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。合成条件给定如下：
将核苷单体配制成浓度为0.1M的核苷单体的乙腈溶液。
每一步的脱保护反应的条件相同。脱保护反应的条件：温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液（3体积%），二氯乙酸与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应的条件相同。偶联反应的条件为：温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为浓度为0.5M的5-乙硫基-1H-四氮唑的乙腈溶液，硫代试剂为浓度为0.2mol/L的氢化黄原素的乙腈/吡啶混合溶液（乙腈和吡啶体积比为1:1）。
每一步盖帽反应的条件均相同。盖帽反应的条件为：温度为25℃；反应时间为2分钟；盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的Cap1和Cap2的混合溶液，Cap1为浓度为20体积%的N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5，Cap2为年攻读为20体积%的乙酸酐的乙腈溶液；Cap1盖帽试剂中的N-甲基咪唑、Cap2盖帽试剂中的乙酸酐与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1:1。
每一步氧化反应的条件相同。氧化反应的条件为：温度为25℃；反应时间为3秒；氧化试剂浓度为0.05M的碘水，碘与偶联反应中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1；氧化反应在水/吡啶混和溶剂（水和吡啶的体积比为1:9）中进行。硫化反应的条件为：温度为25℃；反应时间为360秒；硫代试剂浓度为0.2M氢化黄原素的吡啶溶液，硫代试剂与偶联反应中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为4:1；硫代反应在在水/吡啶混和溶剂（水和吡啶的体积比为1:9）中进行。
待最后一个核苷单体连接完成后，依次对固相载体上连接的核酸序列进行切割、脱保护、纯化、脱盐，随后冻干获得正义链，其中：
切割和脱保护条件如下：将合成的连接有固相载体的核苷酸序列加入到浓度为25质量%的氨水中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃下反应16小时，除去溶剂，真空浓缩至干。在氨水处理后，相对于单链核酸的量，用0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解产品，随后加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氢氟酸盐，脱除核糖上的2'-O-TBDMS保护。
纯化和脱盐的条件：利用制备型离子色谱纯化柱（Source 15Q）通过NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂1为20mM磷酸钠（pH=8.1），溶剂为水/乙腈混合溶液（水和乙腈的体积比为9:1）；洗脱剂2为1.5M氯化钠，20mM磷酸钠（pH=8.1），溶剂为水/乙腈混合溶液（水和乙腈的体积比为9:1）；洗脱梯度为洗脱剂1:洗脱剂2=(100:0)-(50:50)。收集产品洗脱液后合并，采用反向色谱纯化柱进行脱盐，脱盐条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25，以去离子水洗脱。
检测：使用离子交换色谱（IEX-HPLC）进行纯度检测；使用液质联用（LC-MS）进行分子量检测，比较分子量的实测值与理论值，若实测值和理论值一致，表明得到化合物缀合在siRNA正义链的3'端。
（3-2）反义链（AS）的合成
利用通用固相载体合成了反义链。反义链的固相合成方法中的脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化反应条件、切割和脱保护条件、纯化和脱盐的条件与步骤（3-1）合成正义链相同。
检测：使用离子交换色谱（IEX-HPLC）进行纯度检测；使用液质联用（LC-MS）进行分子量检测，比较分子量的实测值与理论值，若实测值和理论值一致，表明得到siRNA反义链。
（3-3）siRNA缀合物的合成
将步骤（3-1）中合成的正义链和步骤（3-2）中合成的反义链以等摩尔比混合，溶于注射用水中并加热至95℃，缓慢冷却至室温并在室温下保持10分钟，使正义链和反义链通过氢键形成双链结构，从而得到具有表4所示正义链和反义链的siRNA缀合物。
UmsUmsUmUmAmAmUfCfCfUmCmAmCmUmCmUmAmAmAm，如SEQ ID NO: 1所示；
UmsUfsUmAmGmAfGmUmGmAmGmGmAmUfUmAfAmAmAmsUmsGm，如SEQ ID NO: 2所示；
CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm，如SEQ ID NO: 3所示；
UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsUmsUm，如SEQ ID NO: 4所示。
表4 siRNA缀合物的序列信息
如无特别说明，本公开各实施例中所述的碱基组成及修饰含义如下：大写字母A、U、G、C、T表示核苷酸的碱基组成，小写字母m表示其之前一位字母表示的核苷酸为甲氧基修饰核苷酸；小写字母f表示其之前一位字母表示的核苷酸为氟代修饰核苷酸；小写字母s表示其前后两位字母表示的核苷酸之间为硫代磷酸酯键连接。
除非另有说明，本公开使用的siRNA序列均委托苏州贝信生物技术有限公司合成；本公开使用的PCR引物合成均委托北京擎科生物科技有限公司完成；本公开使用的实验动物C57BL/6J小鼠均购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。
表5 siRNA缀合物的检测结果
由5数据可以看出，正义链（SS）和反义链（AS）能够较好且保持较高纯度的连接在配体上。
小鼠体内靶基因抑制活性评估方法
将6-8周龄C57BL/6J小鼠按体重随机分组（均为雌性）。每组中的小鼠根据体重计算药剂量，采用腹部皮下注射方式单次给药，各siRNA缀合物分别用PBS溶液配置成相应浓度（以siRNA计算）溶液用于给药，给药体积为5ml（以siRNA计）/kg（以小鼠体重计）。PBS对照组给予5ml/kg（以小鼠体重计）的PBS溶液（不含药物缀合物）。给药当天记为第1天（记为D1），在给药后的预设时间，每组分别处死5只小鼠。分别对处死的小鼠进行大体解剖并收集每只处死小鼠的肝脏组织，将肝脏组织切割成约2mm3小块，用RNA Later保存。
从上述RNA later中取不同实验组中不同时间点的肝脏组织样本，将肝脏组织样本在Tissuelyser II型全自动组织匀浆仪中破碎60s，再用全自动核酸提取仪（购自浙江瀚维科技有限责任公司）及核酸提取试剂盒（购自浙江瀚维科技有限责任公司）按照总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
取上述1μg总RNA，使用反转录试剂盒（Promega公司，Reverse TranscriptionSystem，A3500）并选取Oligo (dT)15逆转录引物，按照反转录试剂盒说明书记载的方法配置20μL逆转录体系并完成逆转录反应。反应结束后，向逆转录体系中加入80μL RNase-Free水，得到cDNA溶液。接着使用实时荧光定量PCR试剂盒（ABI公司，SYBR™ Select MasterMix，Catalog number：4472908）检测肝脏组织中目标基因mRNA的表达量。在该实时荧光定量PCR法中，使用针对目标基因的引物和针对内参基因的引物分别对目标基因和内参基因进行检测。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书记载的方法配置每个PCR检测孔20μL Real-time PCR反应体系，每个反应体系中含有5μL上述逆转录反应得到的cDNA溶液、10μL SYBR™ Select Master Mix、0.5μL 10μM上游引物、0.5μL 10μM下游引物、4μL RNase-FreeH2O。将配置好的反应体系置于实时荧光定量PCR仪（ABI公司，StepOnePlus™）上，使用三步法进行Real-time PCR扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复变性、退火、延伸的过程40个循环。在该实时荧光定量PCR法中，采用ΔΔCt法对各测试组中目标基因mRNA的表达水平和抑制率进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组) = Ct(测试组目标基因) – Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组) = Ct(对照组目标基因) – Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组) = ΔCt(测试组) – ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组) = ΔCt(对照组) – ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组在相同时间点所处死5只小鼠各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。因此，测试组和对照组的每只小鼠均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组目标基因mRNA表达水平进行归一化，定义对照组目标基因mRNA表达水平为100%。
测试组目标基因mRNA相对表达水平 = 2-ΔΔCt(测试组) × 100%
测试组目标基因mRNA表达抑制率 = (1 – 测试组目标基因mRNA相对表达水平)× 100%
除非另有说明，体内活性实验数据均以X±SD表示，实验数据均采用GraphPadprism 8.0软件进行制图和分析。
实施例1CR01009、CR01016载体缀合超氧化物歧化酶1（Superoxide Dismutase 1,SOD1）siRNA的体内活性评估
本实施例采用小鼠体内靶基因抑制活性评估方法评价了siRNA正义链3'末端缀合CR01009载体的siRNA序列RZ899029、以及siRNA正义链3'末端缀合CR01016载体的siRNA序列RZ899037在小鼠体内对目标靶基因SOD1的抑制活性。RZ899029与RZ899037具有相同的核酸序列和化学修饰，差别仅在于CR01009和CR01016载体的连接子长度不同。
将6-8周龄C57BL/6j小鼠按体重随机分组，每组15只，共3组。每组小鼠分别采用腹部皮下给药方式给予本实施例所述的siRNA缀合物和不含siRNA缀合物的PBS溶液，其中siRNA缀合物实验组中的每只小鼠给药剂量3mg（以siRNA计）/kg（以小鼠体重计），给药体积5mL/kg（以小鼠体重计）；PBS对照组中的每只小鼠给药体积5mL/kg（以小鼠体重计）。给药当天记为第一天（D1），给药后分别于第15天（D15）、第29天（D29）和第43天（D43），每组处死5只小鼠。收集肝组织进行RNA提取、逆转录反应和Real-time PCR检测，并根据前述ΔΔCt法对各测试组中目标基因mRNA进行相对定量计算。
表6 实施例1的引物序列表
本实施例的结果表明，缀合CR01009载体的siRNA缀合物RZ899029与缀合CR01016载体的siRNA缀合物RZ899037均能够对目标靶基因产生持续有效的抑制活性，D15时两者抑制活性最高，分别达94.47%（RZ899029）和97.84%（RZ899037），持续至D43时仍分别有23.75%（RZ899029）和45.51%（RZ899037）的抑制活性。从整体上看，RZ899037（CR01016缀合物）的体内活性高于RZ899029（CR01009缀合物）（图1，表7）。
表7 给予实施例1所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的抑制活性
实施例2CR01009、CR01016载体缀合血管生成素样蛋白3（angiopoietin-like 3,ANGPTL3）siRNA的体内活性评估
本实施例采用小鼠体内靶基因抑制活性评估方法评价了siRNA正义链3'末端缀合CR01009载体的siRNA序列RZ897004、以及siRNA正义链3'末端缀合CR01016载体的siRNA序列RZ897008在小鼠体内对目标靶基因ANGPTL3的抑制活性。RZ897004与RZ897008具有相同的核酸序列和化学修饰，差别仅在于CR01009和CR01016载体的连接子长度不同。
将6-8周龄C57BL/6j小鼠按体重随机分组，每组15只，共3组。每组小鼠分别采用腹部皮下给药方式给予本实施例所述siRNA缀合物和不含siRNA缀合物的PBS溶液，其中，siRNA缀合物实验组中的每只小鼠给药剂量3mg（以siRNA计）/kg（以小鼠计），给药体积5mL/kg（以小鼠计）；PBS对照组中的每只小鼠给药体积5mL/kg（以小鼠计）。给药当天记为第一天（D1），给药后分别于第15天（D15）和第29天（D29），每组处死5只小鼠。收集肝组织进行RNA提取、逆转录反应和Real-time PCR检测，并根据前述ΔΔCt法对各测试组中目标基因mRNA进行相对定量计算。
表8 实施例2的引物序列表
本实施例的结果表明，缀合CR01009载体的siRNA缀合物RZ897004与缀合CR01016载体的siRNA缀合物RZ897008均能够对目标靶基因产生持续有效的抑制活性，D15时两者抑制活性最高，分别达91.09%（RZ897004）和91.86%（RZ897008）。在D29时，RZ897008（C01016缀合物）的抑制活性高于RZ897004（CR01009缀合物）的抑制活性，其中，RZ897004（CR01009缀合物）的抑制活性为39.38%，RZ897008（C01016缀合物）的抑制活性为47.42%，（图2，表9）。
表9 给予实施例2所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的抑制活性
siRNA缀合物体内毒性实验
将C57BL/6J小鼠随机分为4组（即：RZ899029实验组、RZ897004实验组、RZ899037实验组、RZ897008实验组），每组2只小鼠，雌雄各半，并采用皮下注射方式分别向各实验组的小鼠单次给药300mg/kg小鼠体重（以siRNA计）的siRNA缀合物，连续观察14天，未出现动物死亡，也未观察到药物不良反应相关的临床症状，在观察结束后，对各小鼠进行大体解剖，也均未发现异常。因此，上述结果表明本公开的siRNA缀合物安全性良好，具有较低的动物水平毒性。
可以理解的是，以上实施方案仅仅是为了说明本公开的原理而采用的示例性实施方案，然而本公开并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本公开的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本公开的保护范围。

Claims (21)

1.一种如式(I)所示的GalNAc衍生物：
其中，每个L1各自独立地选自取代或未取代的C3-C8直链亚烷基、或者；其中，L1a、L1b各自独立地选自取代或未取代的C1-C5直链亚烷基；
L2选自取代或未取代的C1-C5直链亚烷基；
p和q各自独立地选自0、1或2；
R1选自H、羟基保护基团或；/>代表用于连接药物活性分子的连接位点，R1a选自OH、O-、SH或S-；
R2选自H或；R2b选自含有氨基官能团的固相载体，R2a选自与所述氨基官能团连接的共价连接基团；
每个R3各自独立地选自H、取代或未取代的C1-C4烷基酰基或取代或未取代的C5-C7芳基酰基。
2.根据权利要求1所述的GalNAc衍生物，其特征在于，每个L1各自独立地选自取代或未取代的C3-C8直链亚烷基。
3.根据权利要求2所述的GalNAc衍生物，其特征在于，每个L1各自独立地选自、/>、/>、/>、、/>。
4.根据权利要求3所述的GalNAc衍生物，其特征在于，每个L1都选自。
5.根据权利要求1所述的GalNAc衍生物，其特征在于，每个L1各自独立地选自；其中，L1a、L1b各自独立地选自取代或未取代的C1-C5直链亚烷基。
6.根据权利要求5所述的GalNAc衍生物，其特征在于，每个L1各自独立地选自；其中，L1a、L1b各自独立地选自/>、/>、/>、或/>。
7.根据权利要求6所述的GalNAc衍生物，其特征在于，每个L1都选自。
8.根据权利要求1所述的GalNAc衍生物，其特征在于，L2选自、/>、、/>或/>。
9.根据权利要求1所述的GalNAc衍生物，其特征在于，p选自1且q选自1。
10.根据权利要求1所述的GalNAc衍生物，其特征在于，所述羟基保护基团选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基或4,4',4''-三甲氧基三苯基。
11.根据权利要求1所述的GalNAc衍生物，其特征在于，R2a选自。
12.根据权利要求1所述的GalNAc衍生物，其特征在于，R2b选自，/>选自树脂或可控孔径玻璃球。
13.根据权利要求1-12任一项所述的GalNAc衍生物，其特征在于，所述GalNAc衍生物如式(II)所示：
。
14.根据权利要求1所述的GalNAc衍生物，其特征在于，所述GalNAc衍生物选自以下任一化合物：
。
15.一种如式(III)所示的缀合物：
其中，Nu代表寡核苷酸；
k选自1、2、3或4；
Q的结构式选自
，
L1、L2、p、q、R1a、如权利要求1-14任一项所定义。
16.根据权利要求15所述的缀合物，其特征在于，所述寡核苷酸选自双链寡核苷酸。
17.根据权利要求16所述的缀合物，其特征在于，所述双链寡核苷酸选自siRNA。
18.根据权利要求15所述的缀合物，其特征在于，k选自1。
19.根据权利要求15所述的缀合物，其特征在于，所述缀合物选自以下任一化合物：
。
20.组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求15-19任一项所述的缀合物。
21.如下任意项在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途：
（I）权利要求1-14任一项所述的NalNAc衍生物；和/或
（II）权利要求15-19任一项所述的缀合物；和/或
（III）权利要求20所述的组合物。
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