CN116949044B - 一种双链寡链核苷酸、包含该双链寡核苷酸的缀合物以及它们的用途 - Google Patents

一种双链寡链核苷酸、包含该双链寡核苷酸的缀合物以及它们的用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及小核酸药物技术领域，具体公开了一种双链寡核苷酸、包含该双链寡核苷酸的缀合物以及它们的用途。所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，每条链具有17‑35个核苷酸；按照5'端到3'端方向，所述反义链的第2‑8位中的至少一个核苷酸被核苷酸类似物所替代，每个核苷酸类似物独立地选自式(101)所示的结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐。本公开提高了该双链寡核苷酸与靶点基因的亲和作用，使得该双链寡核苷酸的防脱靶效果得到提高，并且在不降低双链寡核苷酸活性的同时具有明显的毒理改善作用。

Description

一种双链寡链核苷酸、包含该双链寡核苷酸的缀合物以及它 们的用途
技术领域
本公开涉及小核酸药物技术领域，具体涉及一种双链寡核苷酸、包含该双链寡核苷酸的缀合物以及它们的用途。
背景技术
双链寡核苷酸是由人工化学合成的一类药物，其通过碱基互补配对作用于mRNA，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，使编码异常的基因丧失功能，进而阻止“错误”蛋白质的表达，从而发挥基因水平上调控疾病基因转录翻译过程的独特机制。
由于寡核苷酸药物独特的化学结构，表现出较差的成药性：分子量较大、亲水性强、高度负电性、不遵循Lipinski's原则，并且药代特征也较差、无法通过生物膜，还会有脱靶效应。
未经修饰的双链寡核苷酸带负电、极性大、水溶性强（在中性和碱性环境下）、不易通过脂质双分子层和血脑屏障等生物膜，分布特性差；稳定性差，在细胞外液中易降解，易被肾脏和肝网状内皮系统（如单核吞噬细胞、肝窦状内皮细胞、库弗氏细胞）清除；对靶点的亲和力差，易脱靶等特点，所以，需要借助化学修饰或者递药系统改善成药性。
化学修饰对抵抗核酸酶的降解尤为重要,对于反义寡核苷酸的修饰主要基于三个方面：一是对磷酸骨架的修饰；二是对糖的修饰（尤其对核糖的2'位修饰）；三是对碱基的修饰。通过修饰，可提高药物对核酶的抗性，增加与mRNA的结合力，减少毒副作用。尽管化学修饰提升了药物的稳定性，但是同时降低了药物与靶点基因的亲和作用。
发明内容
本公开提供双链寡核苷酸、包含该双链寡核苷酸的缀合物以及它们的用途，提高了该双链寡核苷酸与靶点基因的亲和作用，使得该双链寡核苷酸的防脱靶效果得到提高，并且在不降低双链寡核苷酸活性的同时具有明显的毒理改善作用。
在本公开的第一方面，本公开提供了一种双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，每条链具有17-35个核苷酸；按照5'末端到3'末端方向，所述反义链的第2-8位中的至少一个核苷酸被核苷酸类似物所替代，每个核苷酸类似物独立地选自式(101)所示的结构或其药学上可接受的盐：
其中，代表所述核苷酸类似物与相邻核苷酸的共价连接位点；
Z选自羟基或巯基；
X选自O、S或NH；
n选自1、2或3；
Base选自碱基或修饰碱基。
在本公开的一些可选实施方案中，所述修饰碱基选自、/>、、/>和/>。
在本公开的一些可选实施方案中，按照5'末端到3'末端方向，所述反义链的第2-8位中的一个核苷酸被所述核苷酸类似物所替代。
在本公开的一些可选实施方案中，按照5'末端到3'末端方向，所述反义链的第5位、第6位、第7位或第8位核苷酸被所述核苷酸类似物所替代。
在本公开的一些具体实施方案中，按照5'末端到3'末端方向，所述反义链的第7位核苷酸被所述核苷酸类似物所替代。
在本公开的一些可选实施方案中，Base选自碱基尿嘧啶U、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C、腺嘌呤A或鸟嘌呤G。
在本公开的一些具体实施方案中，Base选自碱基尿嘧啶U。
在本公开的一些具体实施方案中，每个所述核苷酸类似物中的Base与其所替代核苷酸中的碱基相同。
在本公开的一些具体实施方案中，X选自O。
在本公开的一些具体实施方案中，Z选自羟基。
在本公开的一些具体实施方案中，n选自1。
在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(101A)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或者式(101B)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
、/>。
在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(101A)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
。
在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(101B)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(102)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
。
在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(102A)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或者式(102B)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
、/>。
在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自如式(102A)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
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在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(102B)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
。
在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(103)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
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在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(103A)所示的结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或者式(103B)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
、/>。
在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(103A)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
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在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(103B)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
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在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(104)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
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在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(104A)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或者式(104B)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
、/>。
在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(104A)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
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在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(104B)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
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在本公开的一些可选实施方案中，每个所述核苷酸类似物独立地选自如下任一结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
、/>、/>、、/>。
在本公开的一些具体实施方案中，所述正义链具有19个核苷酸。
在本公开的一些具体实施方案中，所述反义链具有21个核苷酸。
在本公开的一些具体实施方案中，所述双链寡核苷酸中除被所述核苷酸类似物所替代的核苷酸之外的其他核苷酸各自独立地选自如下经修饰的核苷酸：
2'-O-任选取代的C1-6烷基修饰的核苷酸、2'-卤代修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸或脱碱基核苷酸；
其中，若2'-O-任选取代的C1-6烷基修饰的核苷酸中含有取代基，该取代基选自卤素、C1-6烷氧基、羟基或氨基。
在本文中，“2'-O-任选取代的C1-6烷基修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基替换为-O-任选取代的C1-6烷基所形成的核苷酸。示例性地，2'-O-甲基（又称2'-甲氧基、2'-OME）修饰的核苷酸。
在本公开的一些可选实施方案中，所述2'-O-任选取代的C1-6烷基修饰的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸。
在本文中，“2'-卤代修饰的核苷酸”是指核苷酸中的核糖2'位羟基替换为卤原子所形成的核苷酸。示例性地，2'-氟代修饰的核苷酸。
在本公开的一些可选实施方案中，所述2'-卤代修饰的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸。
在本文中，“2'-脱氧修饰的核苷酸”是指核苷酸中的核糖2'位羟基替换为氢原子所形成的核苷酸。
在本文中，“脱碱基核苷酸”是指核苷酸中的碱基替换为氢原子所形成的核苷酸。
在本公开的一些具体实施方案中，所述双链寡核苷酸中除被所述核苷酸类似物所替代的核苷酸之外的其他核苷酸各自独立地选自如下经修饰的核苷酸：
2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸和2'-脱氧修饰的核苷酸。
在本公开的一些可选实施方案中，按照5'末端到3'末端方向，所述反义链的第2位、第6位、第14位、第16位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第7位的核苷酸被所述核苷酸类似物所替代，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸；和/或，
按照5'末端到3'末端方向，所述正义链的第7位、第9位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第8位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸。
在本公开的一些具体实施方案中，按照5'末端到3'末端方向，所述反义链的第2位、第6位、第14位、第16位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第7位的核苷酸被所述核苷酸类似物所替代，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸；和/或，
按照5'末端到3'末端方向，所述正义链的第7-9位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸。
在本公开的一些具体实施方案中，按照5'末端到3'末端方向，所述反义链的第2位、第6位、第14位、第16位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第7位的核苷酸被所述核苷酸类似物所替代，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸；和/或，
按照5'末端到3'末端方向，所述正义链的第7位、第9位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第8位的核苷酸选自2'-脱氧修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸。
在本公开的一些具体实施方案中，所述正义链和/或所述反义链独立地包含一个或多个硫代磷酸二酯键。
在本公开的一些具体实施方案中，所述反义链包括位于5'端的两个连续硫代磷酸二酯键和位于3'端的两个连续硫代磷酸二酯键。
在本公开的一些具体实施方案中，所述正义链包括位于5'末端的两个连续硫代磷酸二酯键。
本公开的一些具体实施方案中，所述反义链包括位于5'末端的两个硫代磷酸二酯键和位于3'末端的两个硫代磷酸二酯核苷酸间键；所述正义链包括位于5'末端的两个硫代磷酸二酯键。
在本公开的一些可选实施方案中，所述正义链或所述反义链包含具有至少1个核苷酸的3'突出端。
在本公开的一些可选实施方案中，所述反义链包含具有至少1个核苷酸的3'突出端。
在本公开的一些可选实施方案中，所述反义链包含具有2个核苷酸的3'突出端。
在本公开的一些可选实施方案中，所述目标基因选自肝脏细胞中的目标基因。
在本公开的一些具体实施方案中，所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ANGPTL3、CC3。
在本公开的一些具体实施方案中，所述双链寡核苷酸选自siRNA。
在本公开的第二方面，本公开提供了一种缀合物，所述缀合物包含第一方面所述的双链寡核苷酸以及一个或多个能够与细胞表面受体结合的配体。
在本公开的一些具体实施方案中，所述细胞选自肝脏细胞。
在本公开的一些可选实施方案中，所述配体的数量选自1个、2个、3个或4个。所述配体独立地选自缀合连接到所述正义链的3'末端、所述正义链的5'末端、所述反义链的3'末端或所述反义链的5'末端，且所述配体在所述双链寡核苷酸上的缀合位点不同。
在本公开的一些具体实施方案中，所述配体的数量选自1个。
在本公开的一些可选实施方案中，所述配体的数量选自1个；其中，一个所述配体可以缀合到所述正义链的3'末端，或一个所述配体可以缀合到所述正义链的5'末端，或一个所述配体可以缀合到所述反义链的3'末端，或一个所述配体可以缀合到所述反义链的5'末端。
在本公开的一些具体实施方案中，所述配体的数量选自1个，且一个所述配体缀合到所述双链寡核苷酸的正义链的3'末端。
在本公开的一些可选实施方案中，所述配体的数量选自2个。其中，两个所述配体分别缀合到所述正义链的3'末端和所述正义链的5'末端；或两个所述配体分别缀合到所述正义链的3'末端和所述反义链的3'末端；或两个所述配体分别缀合到所述正义链的3'末端和所述反义链的5'末端；或两个所述配体分别缀合到所述正义链的5'末端和所述反义链的3'末端；或两个所述配体分别缀合到所述正义链的5'末端和所述反义链的5'末端。在本公开的一些可选实施方案中，所述配体的数量选自2个，且两个所述配体分别缀合到所述正义链的3'末端和所述正义链的5'末端。
在本公开的一些可选实施方案中，所述配体的数量选自3个。其中，三个所述配体分别缀合到所述正义链的3'末端、所述正义链的5'末端和所述反义链的3'末端；或三个所述配体分别缀合到所述正义链的3'末端、所述正义链的5'末端和所述反义链的5'末端；或三个所述配体分别缀合到所述正义链的3'末端、所述反义链的3'末端和所述反义链的5'末端；或三个所述配体分别缀合到所述正义链的5'末端、所述反义链的3'末端和所述反义链的5'末端。
在本公开的一些可选实施方案中，所述配体的数量选自4个。其中，四个所述配体分别缀合到所述正义链的3'末端、所述正义链的5'末端、所述反义链的3'末端和所述反义链的5'末端。
在本公开的一些具体实施方案中，所述配体选自去唾液酸糖蛋白受体配体（ASGPR配体）。
在本公开的一些具体实施方案中，所述去唾液酸糖蛋白受体配体包括半乳糖和/或其衍生物。
在本公开的一些具体实施方案中，所述半乳糖的衍生物选自对去唾液酸糖蛋白受体的亲和性等于或超过半乳糖的半乳糖衍生物，例如N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）。
在本公开的一些具体实施方案中，所述半乳糖衍生物选自N-乙酰半乳糖胺。
在本公开的一些具体实施方案中，所述去唾液酸糖蛋白受体配体包括N-乙酰半乳糖胺。其中，所述N-乙酰半乳糖胺具有如式(201)所示的结构：
。
在本公开的一些具体实施方案中，所述去唾液酸糖蛋白受体配体包括1个、2个或3个N-乙酰半乳糖胺。
在本公开的一些具体实施方案中，所述去唾液酸糖蛋白受体配体包括3个N-乙酰半乳糖胺。
在本公开的一些可选实施方案中，所述去唾液酸糖蛋白受体配体包括N-乙酰半乳糖胺以及用于所述N-乙酰半乳糖胺和所述双链寡核苷酸连接的接头。
在本公开的一些可选实施方案中，所述接头具有如式(202)所示的结构或其药学上可接受的盐：
其中，Z'选自羟基或巯基；
k选自1、2或3；
j1选自8、9、10、11或12的整数；
j2、j3、j4、j5各自独立地选自1、2、3或4。
在本公开的一些具体实施方案中，Z选自羟基。
在本公开的一些具体实施方案中，k选自3。其中，N-乙酰半乳糖胺的个数选自三个。
在本公开的一些具体实施方案中，j1选自10。
在本公开的一些具体实施方案中，j2选自1。
在本公开的一些具体实施方案中，j3选自2。
在本公开的一些具体实施方案中，j4选自3。
在本公开的一些具体实施方案中，j5选自4。
在本公开的一些具体实施方案中，所述接头具有如式(203)所示的结构或其药学上可接受的盐：
。
在本公开的一些可选实施方案中，所述配体具有如式(204)所示的结构或其药学上可接受的盐：
。
在本公开的一些具体实施方案中，所述缀合物具有如式(205)所示的结构或其药学上可接受的盐：
其中，Nu代表本公开第一方面所述的双链寡核苷酸。进一步地，所述配体缀合连接到所述双链寡核苷酸的正义链3'末端。
在本公开的第三方面，本公开提供了如下任意项在制备用于治疗和/或预防与目标基因表达的mRNA失调相关的疾病或病症的药物中的用途：
（I）、第一方面所述的双链寡核苷酸；和/或
（II）、第二方面所述的双链寡核苷酸缀合物。
在本公开的一些可选实施方案中，所述目标基因选自肝脏细胞中的目标基因。
在本公开的一些具体实施方案中，所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ANGPTL3、CC3。
在本公开的第四方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如下任意项以及药学上可接受的辅料或助剂：
（I）、第一方面所述的双链寡核苷酸；和/或
（II）、第二方面所述的双链寡核苷酸缀合物。
在本公开的第五方面，本公开提供了一种调节细胞中目标基因表达mRNA失调的方法，所述方法包含将如下任意项与所述细胞接触：
（I）、第一方面所述的双链寡核苷酸；和/或
（II）、第二方面所述的双链寡核苷酸缀合物；和/或
（III）、第四方面所述的药物组合物。
在本公开的一些具体实施方案中，所述细胞选自肝脏细胞。
所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ANGPTL3、CC3。
本公开具有以下有益效果：本公开在双链寡核苷酸的反义链第2-8位中的至少一个核苷酸被式(101)所示的核苷酸类似物所替代，提高了本公开提供的双链寡核苷酸与靶点基因的亲和作用，使得该双链寡核苷酸的防脱靶效果得到提高，并且而且在不降低双链寡核苷酸活性的同时具有明显的毒理改善作用。
附图说明
图1是给予实施例1所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的相对表达水平；
图2是给予实施例2所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的相对表达水平；
图3是给予实施例3所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的相对表达水平；
图4是给予实施例4所述siRNA缀合物后，ICR雌性小鼠血清中ALT浓度；
图5是给予实施例4所述siRNA缀合物后，ICR雌性小鼠血清中AST浓度；
图6是给予实施例4所述siRNA缀合物后，ICR雌性小鼠肝组织病理评分；
图7是给予实施例4所述siRNA缀合物后，ICR雌性小鼠肝组织病理切片；
图8是给予实施例5所述siRNA缀合物后，ICR雄性小鼠血清ALT浓度；
图9是给予实施例5所述siRNA缀合物后，ICR雄性小鼠血清AST浓度；
图10是给予实施例5所述siRNA缀合物后，小鼠肝组织病理评分；
图11是给予实施例5所述siRNA缀合物后，小鼠肝组织病理切片。
图7和图11中，箭头代表细胞点状坏死；*代表结缔组织增生；#代表炎性细胞浸润；▲代表胞质疏松。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
除非另外说明，应当应用本文所使用的下列定义。出于本公开的目的，化学元素与元素周期表CAS版，和《化学和物理手册》，第75版，1994一致。此外，有机化学一般原理可参考"Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito:1999, 和 "March's Advanced Organic Chemistry" by Michael B. Smith and JerryMarch, John Wiley & Sons, New York: 2007中的描述，其全部内容通过引用并入本文。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本公开所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“任选取代的”用于定义变量，该变量可以是未取代的，也可以是经取代的。
在本文中，术语“未取代的”表示指定基团不带有取代基。
在本文中，术语“经取代的”、“被取代的”和“取代的”交换使用，表示所给结构中的任何一个或多个氢原子被具体取代基（例如：C1-3烷基，C1-3烷氧基或卤素）所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物。除非其他方面表明，一个被取代的基团可以有一个取代基在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式中不止一个位置能被选自具体基团的一个或多个取代基所取代时，那么取代基可以相同或不同地在各个可取代的位置取代。
在本文中，术语“每个…独立地选自”与“…各自独立地选自”和“…独立地选自”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
在本文中，术语“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体（旋转异构体）、几何异构体（顺/反）异构体、阻转异构体，等等。
在本文中，术语“手性”是具有与其镜像不能重叠性质的分子；而“非手性”是指与其镜像可以重叠的分子。
在本文中，术语“对映异构体”是指一个化合物的两个不能重叠但互成镜像关系的异构体。
在本文中，术语“非对映异构体”是指有两个或多个手性中心并且其分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体混合物可通过高分辨分析操作如电泳和色谱，例如HPLC来分离。
在本文中，所用立体化学定义和规则一般遵循S.P.Parker，Ed.，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York ；andEliel，E.and Wilen，S.，“Stereochemistry of Organic Compounds”，John Wiley &Sons，Inc.，New York，1994。
在本文中，术语“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指两个或多个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“药物缀合物”表示一个或多个具体特定功能的化学部分共价连接至活性药物上而形成的化合物。在本文中，有时，特别是在实施例中，也将本公开的“药物缀合物”称为“缀合物”、“双链寡核苷酸缀合物”或“siRNA缀合物”。药物缀合物应根据上下文，理解为药物缀合物的总称或由特定结构式表示的具体药物缀合物。
在本文中，术语“小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）”是一个长17到25个核苷酸的双链RNA，包含正义链和反义链。siRNA通过形成沉默复合体（RNA-inducedsilencing complex，RISC），介导RISC途径的RNA转录物靶向切割。具体地，siRNA通过已知的RNA干扰（RNAi）过程指导mRNA序列的特异性降解，抑制mRNA翻译成氨基酸和转化为蛋白质。
在本文中，术语“反义链（或称引导链）”包括与一个靶序列基本上互补的区域。术语“正义链（或称随从链）”是指含有与在反义链基本上互补的iRNA链。术语“基本上互补”是指完全互补或至少部分互补，例如该反义链与靶序列完全互补或至少部分互补。部分互补的情况下，错配可以存在于分子的内部或末端区域内，其中，最耐受的错配存在于末端区域内，例如在iRNA的5’-和/或3'末端的5、4、3或2个核苷酸内部。需要说明的是，反义链与mRNA的“至少部分基本上互补”是指反义链具有与感兴趣的mRNA的一个连续部分基本互补的多核苷酸。
在本文中，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
本文中，术语“治疗”、“减轻”或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此处，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
本文中，术语“预防”和“防止”可互换使用，即指获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将缀合物、RNAi试剂或组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使可能该疾病的诊断尚未作出。
在本文中，术语“配体”通常是指能够共价地或以其它化学方式与生物活性物质(如寡核苷酸)结合的任何化合物或分子。在某些实施方案中，配体能够与另一种化合物例如受体直接或间接地相互作用，与配体相互作用的受体可以存在于细胞表面上，或可替代地可以是细胞内和/或细胞间受体，配体与受体的相互作用可以导致生化反应，或可以仅仅是物理相互作用或结合。
在本文中，术语“施用”通常是指通过任意引入或递送途径将本公开药物制剂引入受试者的身体中。可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与所述药物接触的任何方法。所述施用可以包括而不限于静脉内、动脉内、鼻内、腹内、肌内、皮下或口服。每日剂量可以划分成一个、两个或更多个合适形式的剂量以在某个时间段期间的一个、两个或更多个时间施用。
在本文中，“药物组合物”可指用于疾病的治疗，也可用于细胞的体外培养实验。用于疾病的治疗时，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的辅料相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性siRNA与液体辅料、细碎固体辅料或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本公开的siRNA不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本公开所考虑的范围。
除了任何常规的辅料外，与本公开的siRNA不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本公开所考虑的范围。
实施例
除非另有说明，本公开所用试剂、试剂耗材以及仪器设备均来源于市售。其中，主要试剂如表1所示，主要试剂耗材如表2所示，主要仪器设备如表3所示。
表1 主要试剂
表2 主要试剂耗材
表3主要仪器设备
制备例1：化合物NM028A和化合物NM028B的合成
本制备例中，化合物NM028A和化合物NM028B的合成路线如下所示：
（1-1）化合物NM028-3的合成
将化合物NM028-1（6.35g，56.62mmol，1.2eq，尿嘧啶）溶于60ml乙腈中，加入BSA（24g，117.98mmol，2.5eq），在80℃下搅拌反应2小时；加入化合物NM028-2（11.72g，47.19mmol，1.0eq），冰浴降温至0℃，滴加入TMSOTf（15.73g，70.79 mmol，1.5eq），25℃下搅拌反应12小时。反应结束后，向反应液中加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取三次（每次用100ml），合并有机相，有机相先用饱和氯化钠水溶液洗涤两次（每次用50ml），再用无水硫酸钠干燥，并过滤、浓缩，柱色谱纯化（洗脱液：二氯甲烷/甲醇=20/1，v/v），得到黄色固体状的化合物NM028-3（14g，收率98.89%）。MS-ESI (m/z) = 323 [M + Na]+。
（1-2）化合物NM028-4的合成
将化合物NM028-3（14g，46.67mmol，1.0eq）溶于140ml甲醇中，加入甲醇钠（6.12g，112mmol，2.4eq），25℃下搅拌反应1小时。反应结束后，向反应液中滴加浓度为4mol/L的氯化氢的1,4-二氧六环溶液调节反应液的pH值在7至8范围内，浓缩反应液，得到黄色固体状的化合物NM028-4（9.7g），不进行纯化直接进行下一步反应。MS-ESI (m/z) = 216 [M + H]+。
（1-3）化合物NM028-5的合成
将化合物NM028-4（9.23g，42.69mmol，1.0eq）溶于90ml吡啶中，冰浴降温至0℃，分批次加入DMTrCl（15.91g，46.96mmol，1.1eq），0℃下搅拌1小时。反应结束后，向反应液中加入甲醇淬灭，浓缩除去吡啶，加入200ml饱和氯化铵水溶液，并用乙酸乙酯萃取两次（每次用100ml），合并有机相，有机相先用饱和氯化钠水溶液洗涤两次（每次用50ml），再用无水硫酸钠干燥，并过滤、浓缩，柱色谱纯化（洗脱液：石油醚/乙酸乙酯=1/1，v/v），得到黄色固体状的化合物NM028-5（9.83g，收率44.45%）。MS-ESI (m/z) = 519 [M + H]+。
（1-4）化合物NM028-5A和化合物NM028-5B的合成
化合物NM028-5经过超临界液相色谱手性分离，得到化合物NM028-5A（4.42g）、化合物NM028-5B（3.96g）。旋光度：[α]NM028-5A = -7.843、[α]NM028-5B = 9.804。
其中，超临界液相色谱手性分离的方法如表4所示。
表4 手性分离方法
（1-5）化合物NM028A的合成
将化合物NM028-5A（1.6g，3.08mmol，1.0eq）溶于20ml无水二氯甲烷中，分别加入DCI（291.5mg，2.46 mmol，0.8eq）和双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦（1.39g，4.62mmol，1.5eq），氮气置换3次，25℃下搅拌反应1小时。反应结束后，反应液先用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤二次（每次用20ml）、再用饱和氯化钠水溶液洗涤一次（每次用20ml），用无水硫酸钠干燥，并过滤、浓缩，柱色谱纯化（洗脱液：水/乙腈=8/92，v/v），得到白色固体状的化合物NM028A（1g，1.39mmol，收率45.22%）。MS-ESI (m/z) = 719 [M + H] +.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.37 (s, 1H), 7.81 (d, J = 7.9 Hz, 1H),7.40 – 7.17 (m, 9H), 6.88 (d, J = 8.3 Hz, 4H), 5.78 (s, 1H), 5.41 – 5.18 (m,2H), 4.06 (dp, J = 17.1, 6.1, 5.6 Hz, 2H), 3.75 (s, 6H), 3.67 – 3.62 (m, 2H),3.53 – 3.46 (m, 3H), 3.02 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 2.91 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 2.71(dt, J = 11.4, 6.8 Hz, 2H), 1.22 (q, J = 10.0, 5.8 Hz, 9H), 1.10 (s, 2H),1.05 (s, 1H).
31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 147.28。
（1-6）化合物NM028B的合成
将化合物NM028-5B（3.7g，7.14mmol，1.0eq）溶于40ml无水二氯甲烷中，分别加入DCI（673.5mg，5.71mmol，0.8eq）和双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦（3.23g，10.7mmol，1.5eq），氮气置换3次，25℃下搅拌反应1小时。反应结束后，反应液先用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次（每次用20ml）、再用饱和氯化钠水溶液洗涤一次（每次用20ml），无水硫酸钠干燥，并过滤、浓缩，柱色谱纯化（洗脱液：水/乙腈=8/92，v/v），得到白色固体状的化合物NM028B（4.02g，5.60mmol，收率78.39%）。MS-ESI (m/z) = 719 [M + H]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.37 (s, 1H), 7.78 (dd, J = 7.9, 2.2 Hz,1H), 7.38 – 7.25 (m, 4H), 7.22 (ddd, J = 8.6, 3.4, 1.8 Hz, 5H), 6.86 (d, J =8.4 Hz, 4H), 5.62 (dd, J = 7.9, 1.3 Hz, 1H), 5.36 – 5.14 (m, 2H), 4.01 (q, J= 5.2 Hz, 1H), 3.73 (s, 6H), 3.68 – 3.56 (m, 3H), 3.56 – 3.38 (m, 3H), 3.01(t, J = 4.8 Hz, 2H), 2.69 (dt, J = 11.5, 5.9 Hz, 2H), 1.21 – 0.88 (m, 12H).
31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 147.34。
制备例2：化合物NM028的合成
本制备例中，化合物NM028的合成路线如下所示：
化合物NM028-5不经过手性分离，直接与亚磷酰化试剂双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦进行亚膦酰化反应，具体合成过程参照步骤（1-5）化合物NM028A的合成或步骤（1-6）化合物NM028B的合成。
制备例3：化合物NM050的合成
（3-1）化合物NM050-2的合成
将化合物NM050-1（更昔洛韦，5.31g，20.8mmol，1eq）溶于212ml吡啶中，滴加入TMSCl（32.5ml，12.3eq），在25℃下搅拌反应2小时；加入(i-BuCO)2O（34.5ml，10eq），在25℃下搅拌反应2小时；用冰浴将反应体系降温至0℃，加入水30ml，搅拌反应5分钟，加入氨水30ml，搅拌反应5分钟。反应结束后，旋干除去吡啶，加入饱和氯化铵的水溶液100ml，用乙酸乙酯萃取三次（每次用100ml），合并有机相，有机相先用饱和氯化钠水溶液洗涤两次（每次用50ml），再用无水硫酸钠干燥，并过滤、浓缩，柱色谱纯化（洗脱液：水/乙腈=78/22，v/v），得到白色固状的化合物NM050-2（4.8g，14.8 mmol，收率70.9%）。MS-ESI (m/z) = 326.2 [M+ 1]+。
（3-2）化合物NM050-3的合成
将化合物NM050-2（3.09g，9.50mmol，1.0eq）溶于30ml吡啶中，冰浴降温至0℃，并在0℃下分批次加入DMTrCl（4.83g，14.3mmol，1.5eq），在0℃下搅拌1小时。反应结束后，加入甲醇淬灭，浓缩除去吡啶，加入饱和氯化铵水溶液50ml，用乙酸乙酯萃取2次（每次用50ml），合并有机相，有机相先用饱和氯化钠水溶液洗涤一次（每次用50ml），再用无水硫酸钠干燥，并过滤、浓缩，柱色谱纯化（洗脱液：石油醚/乙酸乙酯=1/1，v/v），得到黄色固体状的化合物NM050-3（4.4g，7.01mmol，收率73.8%）。
（3-3）化合物NM050的合成
将化合物NM050-3（1.0g，1.59mmol，1.0 eq）溶于10ml无水二氯甲烷中，分别加入DCI（150mg，1.28mmol，0.8eq）和双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦（505mg，1.67mmol，1.05eq），氮气置换三次，在25℃下搅拌反应1小时。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次（每次用10ml），有机相先用饱和食盐水洗涤一次（每次用10ml），再用无水硫酸钠干燥，并过滤、浓缩，柱色谱纯化（洗脱液：水/乙腈=10/90，v/v），得到白色固体状的化合物NM-050（1.01g，1.22 mmol，收率76.7%）。MS-ESI (m/z) = 828 [M + H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.85 (s, 1H), 8.27 (d, J = 1.5 Hz, 1H),7.30 – 7.15 (m, 5H), 7.13 – 7.04 (m, 4H), 6.83 (dt, J = 9.0, 2.8 Hz, 4H),5.71 – 5.56 (m, 2H), 3.73 (s, 6H), 3.60 (ttd, J = 7.9, 6.4, 5.8, 4.1 Hz, 3H),3.53 – 3.38 (m, 4H), 2.98 (ddd, J = 14.7, 10.1, 6.9 Hz, 1H), 2.91 (t, J = 5.8Hz, 2H), 2.81 (p, J = 6.8 Hz, 1H), 2.70 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 1.15 – 1.04 (m,12H), 0.98 (dd, J = 6.8, 3.0 Hz, 6H)。
31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 147.28。
制备例4：正义链3'末端缀合L96载体的siRNA缀合物的合成
化合物L96-PS购自凯莱英医药基团（天津）股份有限公司，载量为120±12µmol/g（检测方法为：UV/HPLC）。化合物L96-PS的结构式如下所示：
其中，PS代表聚苯乙烯（Polystyrene）树脂固相载体。
（4-1）3'末端缀合L96载体的正义链（SS）的合成
通过亚磷酰胺核酸固相合成法的方法，利用上述连接至固相载体的化合物L96-PS起始循环，按照核苷酸序列按照3'-5'的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。合成条件给定如下：
将核苷单体配制成浓度为0.1M的核苷单体的乙腈溶液。
每一步的脱保护反应的条件相同。脱保护反应的条件：温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液（3体积%），二氯乙酸与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护基团的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应的条件相同。偶联反应的条件为：温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为浓度为0.5M的5-乙硫基-1H-四氮唑的乙腈溶液，硫代试剂为浓度为0.2mol/L的氢化黄原素的乙腈/吡啶混合溶液（乙腈和吡啶体积比为1:1）。
每一步盖帽反应的条件均相同。盖帽反应的条件为：温度为25℃；反应时间为2分钟；盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的Cap1和Cap2的混合溶液，Cap1为浓度为20体积%的N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5，Cap2为年攻读为20体积%的乙酸酐的乙腈溶液；Cap1盖帽试剂中的N-甲基咪唑、Cap2盖帽试剂中的乙酸酐与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1:1。
每一步氧化反应的条件相同。氧化反应的条件为：温度为25℃；反应时间为3秒；氧化试剂浓度为0.05M的碘水，碘与偶联反应中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1；氧化反应在水/吡啶混和溶剂（水和吡啶的体积比为1:9）中进行。硫化反应的条件为：温度为25℃；反应时间为360秒；硫代试剂浓度为0.2M氢化黄原素的吡啶溶液，硫代试剂与偶联反应中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为4:1；硫代反应在在水/吡啶混和溶剂（水和吡啶的体积比为1:9）中进行。
待最后一个核苷单体连接完成后，依次对固相载体上连接的核酸序列进行切割、脱保护、纯化、脱盐，随后冻干获得正义链，其中：
切割和脱保护条件如下：将合成的连接有固相载体的核苷酸序列加入到浓度为25质量%的氨水中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃下反应16小时，除去溶剂，真空浓缩至干。在氨水处理后，相对于单链核酸的量，用0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解产品，随后加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氢氟酸盐，脱除核糖上的2'-O-TBDMS保护。
纯化和脱盐的条件：利用制备型离子色谱纯化柱（Source 15Q）通过NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂1为20mM磷酸钠（pH=8.1），溶剂为水/乙腈混合溶液（水和乙腈的体积比为9:1）；洗脱剂2为1.5M氯化钠，20mM磷酸钠（pH=8.1），溶剂为水/乙腈混合溶液（水和乙腈的体积比为9:1）；洗脱梯度为洗脱剂1:洗脱剂2=(100:0)-(50:50)。收集产品洗脱液后合并，采用反向色谱纯化柱进行脱盐，脱盐条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25，以去离子水洗脱。
检测：使用离子交换色谱（IEX-HPLC）进行纯度检测；使用液质联用（LC-MS）进行分子量检测，比较分子量的实测值与理论值，若实测值和理论值一致，表明得到化合物缀合在siRNA正义链的3'端。
（4-2）反义链（AS）的合成
利用通用固相载体合成了反义链。反义链的固相合成方法中的脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化反应条件、切割和脱保护条件、纯化和脱盐的条件与步骤（4-1）合成正义链相同。
检测：使用离子交换色谱（IEX-HPLC）进行纯度检测；使用液质联用（LC-MS）进行分子量检测，比较分子量的实测值与理论值，若实测值和理论值一致，表明得到siRNA反义链。
（4-3）siRNA缀合物的合成
将步骤（4-1）中合成的正义链和步骤（4-2）中合成的反义链以等摩尔比混合，溶于注射用水中并加热至95℃，缓慢冷却至室温并在室温下保持10分钟，使正义链和反义链通过氢键形成双链结构，从而得到具有表4所示正义链和反义链的siRNA。
正义链3'末端缀合L96载体的siRNA缀合物的结构式如下所示：
其中，代表siRNA。其中，L96载体通过磷酸二酯键缀合连接到siRNA正义链的3'末端。
表5 形成siRNA缀合物的未修饰核苷酸序列信息
表6 siRNA缀合物的序列信息
示例性的解释：“CmsAmsGmAmCmAmGfAdCfAmAmGmAmCmCmAmUmCmUm_L96”代表L96载体通过磷酸二酯键缀合连接到核苷酸序列的3'末端，其中，所述核苷酸序列为CmsAmsGmAmCmAmGfAdCfAmAmGmAmCmCmAmUmCmUm。
除非另有说明，本公开所述的碱基组成及修饰含义如下：大写字母A、U、G、C、T表示核苷酸的碱基组成，m表示该小写字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-O-甲基修饰（2'-甲氧基修饰）的核苷酸；f表示该小写字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸；s表示该小写字母s前后两个核苷酸之间通过硫代磷酸二酯键连接。
其中，(Ugna)表示一个核苷酸类似物，其结构式为：。
除非另有说明，本公开所用的siRNA序列均委托苏州贝信生物技术有限公司合成；本公开所用的PCR引物合成均委托北京擎科生物科技有限公司完成；本公开所用的实验动物C57BL/6J小鼠均购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。
表7 siRNA缀合物的检测结果
由上述数据可以看出，正义链（SS）和反义链（AS）能够较好且保持较高纯度的连接在配体上。
生物学检测实验
siRNA缀合物在小鼠体内靶基因抑制活性评估方法
将6-8周龄C57BL/6J小鼠按体重随机分组（均为雌性）。每组中的小鼠根据体重计算药剂量，采用腹部皮下注射方式单次给药，各siRNA缀合物分别用PBS溶液配置成相应浓度（以siRNA计算）溶液用于给药，给药体积为5ml（以siRNA计）/kg（以小鼠计）。PBS对照组给予5ml/kg（以小鼠计）的PBS溶液（不含药物缀合物）。给药当天记为第1天（记为D1），在给药后的预设时间，每组分别处死5只小鼠。分别对处死的小鼠进行大体解剖并收集每只处死小鼠的肝脏组织，将肝脏组织切割成约2mm3小块，用RNA Later保存。
从上述RNA later中取不同实验组中不同时间点的肝脏组织样本，将肝脏组织样本在Tissuelyser II型全自动组织匀浆仪中破碎60s，再用全自动核酸提取仪（购自浙江瀚维科技有限责任公司）及核酸提取试剂盒（购自浙江瀚维科技有限责任公司）按照总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
取上述1μg总RNA，使用反转录试剂盒（Promega公司，Reverse TranscriptionSystem，A3500）并选取Oligo (dT)15逆转录引物，按照反转录试剂盒说明书记载的方法配置20μL逆转录体系并完成逆转录反应。反应结束后，向逆转录体系中加入80μL RNase-Free水，得到cDNA溶液。接着使用实时荧光定量PCR试剂盒（ABI公司，SYBR™ Select MasterMix，Catalog number：4472908）检测肝脏组织中目标基因mRNA的表达量。在该实时荧光定量PCR法中，使用针对目标基因的引物和针对内参基因的引物分别对目标基因和内参基因进行检测。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书记载的方法配置每个PCR检测孔20μL Real-time PCR反应体系，每个反应体系中含有5μL上述逆转录反应得到的cDNA溶液、10μL SYBR™ Select Master Mix、0.5μL 10μM上游引物、0.5μL 10μM下游引物、4μL RNase-FreeH2O。将配置好的反应体系置于实时荧光定量PCR仪（ABI公司，StepOnePlus™）上，使用三步法进行Real-time PCR扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复变性、退火、延伸的过程40个循环。在该实时荧光定量PCR法中，采用ΔΔCt法对各测试组中目标基因mRNA的表达水平和抑制率进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组) = Ct(测试组目标基因) – Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组) = Ct(对照组目标基因) – Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组) = ΔCt(测试组) – ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组) = ΔCt(对照组) – ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组在相同时间点所处死5只小鼠各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。因此，测试组和对照组的每只小鼠均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组目标基因mRNA表达水平进行归一化，定义对照组目标基因mRNA表达水平为100%。
测试组目标基因mRNA相对表达水平 = 2-ΔΔCt(测试组) × 100%
测试组目标基因mRNA表达抑制率 = (1 – 测试组目标基因mRNA相对表达水平)× 100%
除非另有说明，体内活性实验数据均以X±SD表示，实验数据均采用GraphPadprism 8.0软件进行制图和分析。
实施例1siRNA缀合物在小鼠体内对靶基因补体成分3（complement component 3, CC3）的抑制活性评估
本实施例采用小鼠体内靶基因抑制活性评估方法评价了反义链包含NM028替换基团的siRNA缀合物RZ502027、反义链不包含该NM028替换基团的参比siRNA缀合物RZ502017在小鼠体内对目标靶基因CC3的抑制活性。
将6-8周龄C57BL/6j小鼠按体重随机分组3组，每组10只，每组小鼠分别采用腹部皮下给药方式给予上述siRNA缀合物及PBS对照组。其中，PBS对照组中的每只小鼠给予剂量为给药体积5mL/kg（小鼠体重）；siRNA缀合物实验组每只给药剂量3mg（以siRNA计）/kg（小鼠体重），给药体积5mL/kg（小鼠体重）。给药当天记为第一天（D0），给药后分别于第7天（D7）各组处死5只小鼠、第28天（D28）各组处死5只小鼠。收集肝组织进行RNA提取、逆转录反应和Real-time PCR检测，并根据前述ΔΔCt法对各测试组中目标基因mRNA进行相对定量计算。
表8 实施例1中的引物序列信息
实施例1的实验结果表明，反义链包含NM028替换基团的siRNA缀合物RZ502027与反义链不包含该NM028替换基团的siRNA缀合物RZ502017在D7及D28活性基本相当（图1，表9）。
表9 给予实施例1所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的抑制活性
实施例2siRNA缀合物在小鼠体内对靶基因血管生成素样蛋白3(angiopoietin- like protein 3，ANGPTL3)的抑制活性评估
本实施例采用小鼠体内靶基因抑制活性评估方法评价了在反义链包含NM028替换基团的siRNA缀合物RZ597008、反义链包含NM028A替换基团的siRNA缀合物RZ597032、反义链包含NM028B替换基团的siRNA缀合物RZ597033、以及反义链不包含替换基团的参比siRNA缀合物RZ597002和反义链包含(Ugna)替换基团的参比siRNA缀合物RZ597009在小鼠体内对目标靶基因ANGPTL3的抑制活性。
表10 实施例2中的引物序列信息
实施例2的结果表明，siRNA缀合物RZ597008、siRNA缀合物RZ597032和siRNA缀合物RZ597033的活性基本相当，并且siRNA缀合物RZ597008、siRNA缀合物RZ597032和siRNA缀合物RZ597033的活性均优于siRAN缀合物RZ597002和siRNA缀合物RZ597009的活性（图2，表11）。
表11 给予实施例2所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的抑制活性
实施例3siRNA缀合物在小鼠体内对ANGPTL3的抑制活性长效性评估
本实施例采用小鼠体内靶基因抑制活性评估方法评价了在反义链包含NM028B替换基团的siRNA缀合物RZ597033、反义链不包含替换基团的参比siRNA缀合物RZ597002和反义链包含替换基团(Ugna)的参比siRNA缀合物RZ597009在小鼠体内对目标靶基因ANGPTL3的抑制活性长效性评估。
本实施例所用引物序列信息如实施例2中的表10所示。
实施例3的结果表明，siRNA缀合物RZ597033与参比siRNA缀合物RZ597002、siRNA缀合物RZ597009相比，在D7、D28及D56具有更高的靶基因抑制效果，并且表现出更长的药效作用时间。在D28 siRNA缀合物RZ597033的抑制效果比RZ597002及RZ597009分别高15.14%及13.02%，在D56 siRNA缀合物RZ597033仍保持27.28%的抑制活性，而RZ597002仅有10%左右，RZ597009基本无活性（图3，表12）。
表12 给予实施例3所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的抑制活性
实施例4siRNA缀合物在雌性小鼠体内毒理评估
本实施例采用皮下注射给药方式评估了包含NM028基团的siRNA缀合物RZ597008，NM028结构构象拆分基团NM028A的siRNA缀合物RZ597032、NM028结构构象拆分基团NM028B的siRNA缀合物RZ597033，以及不包含替代基团的参比缀合物RZ597002和包含替换基团(Ugna)的参比缀合物RZ597009在ICR雌性小鼠中的毒性反应的性质、程度。
将6-8周龄ICR雌性小鼠按体重随机分组，每组3只小鼠。每个测试组给予上述剂量的药物缀合物并增加PBS对照组。所有小鼠根据体重计算药剂量，采用腹部皮下注射方式单次给药，各药物缀合物以60 mg/mL（以siRNA计算）的PBS溶液形式给药，给药体积为给药体积10mL/kg小鼠体重，即，每一药物缀合物的给药剂量为600 mg/kg小鼠体重（以siRNA计算）。PBS对照组给予同样体积的PBS溶液（不含药物缀合物），观察7天。给药当天记为第1天（记为D1），于试验期间首次给药后每天至少进行一次临床观察；于试验第7天（记为D7）对所有动物进行取血（采样检测前小鼠禁食不少于12小时，不禁水），进行血液生化检测。采集血液样本（无抗凝），室温下放置约30 min，待血液凝固后4℃条件下2000 g离心10 min，使用全自动生化分析仪（迈瑞BS-430）进行血生化检测。血清生化各指标变化率计算公式：变化率=（试验组-空白对照组（PBS））/空白对照组。
图4和图5分别是给予600mg/kg的RZ597008、RZ597032、RZ597033及参比缀合物RZ597002、RZ597009与空白对照组PBS后，小鼠血清中ALT和AST浓度的散点图。由图4、图5和表13可见，与空白对照组相比，给予不包含替代基团的缀合物RZ597002后，小鼠血清ALT变化程度从空白对照组34.67 U/L增长至1969.53 U/L，变化率为56倍；AST浓度同样有明显升高，由195.73 U/L增长至1395.77 U/L，变化率为6倍；而给予本实施例的siRNA缀合物后，血清ALT和AST浓度均有不同程度的下降，表明本实施例的siRNA缀合物具有一定降低肝毒性的作用。其中，给予NM028B（RZ597033）缀合物之后，小鼠血清ALT浓度降低至447.93U/L，使得该缀合物的ALT变化率由56倍（RZ597002）减弱至12倍，AST浓度降低至498.03 U/L使得该缀合物的AST变化率由6倍（RZ597002）减弱至1.5倍；参比缀合物RZ597009小鼠血清ALT和AST的浓度同样升高，程度与缀合物RZ597002基本相近，表明该参比siRNA缀合物（RZ597009）可能在ICR雌性小鼠中难以降低肝毒性。
表13 给予本实施例所述siRNA缀合物后，雌性小鼠血液生化检测结果
于试验第7天（记为D7）对所有动物进行解剖，解剖前待解剖小鼠需禁食不禁水至少12 h，瑞沃德R540IE小动物麻醉机麻醉，采血后腹主动脉放血实施安乐死，对其进行大体解剖观察；将所有动物的肝脏用4％细胞组织固定液中保存并进行组织病理学检查（采用苏木精-伊红染色）。对病理切片中肝细胞变性的严重程度进行评价分级，采用四级定级系统（参考文件：[美] Peter. Mann 等.大鼠和小鼠病理变化术语及诊断标准的国际规范（INHAND）[M].杨利峰, 周向梅, 赵德明主译. 北京:中国农业出版社, 2019.），并作相对比较。
如图6及图7，病理切片结果显示，与空白对照相比，给予不包含任何替代基团的参比缀合物RZ597002的3只小鼠中，1只小鼠表现出中度至重度肝细胞变性，具体表现为中央静脉、汇管区周围及肝实质内均多见肝细胞轻度颗粒变性，胞质疏松淡染（▲）；多见肝细胞点状坏死，胞核固缩深染、碎裂或溶解消失，胞质嗜酸性增强（箭头），以及周围少见粒细胞、淋巴细胞浸润（#）；1只小鼠表现出中度肝细胞变性，中央静脉、汇管区周围及肝实质内广泛可见肝细胞轻度空泡变性，胞质内可见体积微小的圆形空泡（*），较多的肝细胞点状坏死，胞质嗜酸性增强，及周围少见粒细胞、淋巴细胞浸润；1只小鼠表现出轻微至轻度的肝细胞变性；综上显示出比空白对照组更为严重的肝细胞变性。包含GNA的参比缀合RZ597009的3只小鼠中，有2只表现出轻度至中度的肝细胞变性，具体表现为部分轻度的空泡变性，多见肝细胞点状坏死。
给予包含替代基团NM028（RZ597008）、NM028A（RZ597032）以及NM028B（RZ597033）的缀合物后，病理切片中肝细胞变性的各个指标均有减弱（图6），尤其是NM028B（RZ597033）的缀合物的3只雌性小鼠中，仅有2只表现出轻微至轻度的肝细胞变性，具体表现极少量的肝细胞点状坏死，由于空白对照组中1只小鼠同样表现出极少量的肝细胞点状坏死，评估原因为动物自身细胞代谢原因。其中1只轻度的空泡变性，未见中度及重度以上的肝细胞变性。
实施例5 siRNA缀合物在雄性小鼠体内毒理评估
本实施例采用皮下注射给药方式评估了包含NM028B的siRNA缀合物RZ597033，及不包含替代基团的参比缀合物RZ597002和包含GNA基团的参比缀合物RZ597009在ICR雄性小鼠中的毒性反应的性质、程度。
将6-8周龄ICR雄性小鼠按体重随机分组，每组3只小鼠。每个测试组给予上述剂量的药物缀合物并增加PBS对照组。采用腹部皮下注射方式单次给药，各药物缀合物给药剂量为600 mg（以siRNA计算）/kg小鼠体重，给药体积为给药体积10 mL/kg小鼠体重。PBS对照组给予同样体积的PBS溶液（不含药物缀合物），观察7天。给药当天记为第0天（记为D0），于试验期间首次给药后每天至少进行一次临床观察；于D7对所有动物取血，进行血液生化检测。
图8和图9分别是给予600mg/kg的RZ597033及参比缀合物RZ597002、RZ597009与空白对照组PBS后，小鼠血清中ALT和AST浓度的散点图。由图8、图9及表14可见，与空白对照组相比，给予不包含替代基团的缀合物RZ597002后，小鼠血清ALT变化程度从空白对照组18.10 U/L增长至450.10 U/L，变化率为24倍；AST浓度同样有明显升高，由62.60 U/L增长至478.90 U/L，变化率为7倍；而给予本实施例的siRNA 缀合物XJ-028B（RZ597033）后，小鼠血清ALT浓度降低至42.70 U/L，变化率为1倍，AST浓度降低至76.50U/L，基本与PBS组62.60U/L持平，表明本实施例的siRNA缀合物XJ-028B（RZ597033）在雄性ICR小鼠基本无肝脏毒性反应，很大程度上降低了原序列RZ597002的毒副作用；参比缀合物RZ597009小鼠血清ALT和AST的浓度分别降低至87.40U/L和96.40U/L，变化率分别为4倍及0.5倍，与XJ-028B（RZ597033）相比，该参比缀合物（RZ597009）具有一定的降低毒性反应的作用，但未减缓毒性至肝脏正常水平。
表14 给予本实施例所述siRNA缀合物后，ICR雄性小鼠血液生化检测结果
于D7对所有动物进行大体解剖，所有动物的肝脏进行组织病理学检查，并采用四级定级系统对肝细胞变性的严重程度进行评价分级及相对比较。
如图10及图11，病理切片结果显示，与空白对照相比，给予不包含任何替代基团的参比缀合物RZ597002的3只小鼠中，1只小鼠表现出中度至重度肝细胞变性，具体表现为大量肝细胞水样变性，细胞重度肿胀，胞质疏松淡染（▲），肝细胞排列不规则，多见肝细胞坏死，核溶解（箭头），大量静脉血管与肝窦周围可见结缔组织增生（*），肝小叶结构紊乱，伴有散在的淋巴细胞浸润（#）；1只小鼠表现出轻度至中度肝细胞变性，中央静脉、汇管区周围及肝实质内广泛可见较多的肝细胞点状坏死，胞质嗜酸性增强，大量肝细胞肿胀，胞质疏松淡染及周围少见粒细胞、淋巴细胞浸润；1只小鼠表现出轻微的肝细胞变性，部分肝细胞发生水样变性及少量的肝细胞坏死，综上显示出比空白对照组更为严重的肝细胞变性。包含(Ugna)的参比缀合RZ597009的3只小鼠中，均表现出轻微至轻度的肝细胞变性，具体表现为少见淋巴细胞浸润，少量肝细胞坏死及水样变性。而给予包含替代基团NM028B（RZ597033）的缀合物后，病理切片中仅表现极少量的肝细胞水样变性，有1只小鼠有极少量的炎性细胞浸润，此外未见其他肝细胞变性现象。综合评估，包含替代基团NM028B的siRNA缀合物具有显著的毒性反应改善作用。
综上所述，与未包含替代基团的缀合物（RZ597002）及参比缀合物（RZ597009）相比，本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应，其中NM028B（RZ597033）基团表现出更高的安全性。
可以理解的是，以上实施方案仅仅是为了说明本公开的原理而采用的示例性实施方案，然而本公开并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本公开的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本公开的保护范围。

Claims (20)

1.双链寡核苷酸，其特征在于，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，每条链具有17-35个核苷酸；按照5'端到3'端方向，所述反义链的第2-8位中的至少一个核苷酸被核苷酸类似物所替代，每个核苷酸类似物独立地选自式(101)所示的结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
其中，代表所述核苷酸类似物与相邻核苷酸的共价连接位点；
Z选自羟基或巯基；
X选自O；
n为1；
Base选自碱基或修饰碱基。
2.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其特征在于，按照5'端到3'端方向，所述反义链的第2-8位中的一个核苷酸被所述核苷酸类似物所替代。
3.根据权利要求2所述的双链寡核苷酸，其特征在于，按照5'端到3'端方向，所述反义链的第5位、第6位、第7位或第8位核苷酸被所述核苷酸类似物所替代。
4.根据权利要求3所述的双链寡核苷酸，其特征在于，按照5'端到3'端方向，所述反义链的第7位核苷酸被所述核苷酸类似物所替代。
5.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其特征在于，Base选自碱基尿嘧啶U、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C、腺嘌呤A或鸟嘌呤G。
6.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其特征在于，Base选自碱基尿嘧啶U。
7.根据权利要求5所述的双链寡核苷酸，其特征在于，每个所述核苷酸类似物中的Base与其所替代核苷酸中的碱基相同。
8.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其特征在于，Z选自羟基。
9.根据权利要求1至8任一项所述的双链寡核苷酸，其特征在于，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(101B)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
。
10.根据权利要求9所述的双链寡核苷酸，其特征在于，每个所述核苷酸类似物独立地选自式(103B)所示结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
。
11.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其特征在于，每个所述核苷酸类似物独立地选自以下任一结构、或其互变异构体、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：
、/>、/>、、/>。
12.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其特征在于，所述双链寡核苷酸中除被所述核苷酸类似物所替代的核苷酸之外的其他核苷酸各自独立地选自如下经修饰的核苷酸：
2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸和2'-脱氧修饰的核苷酸。
13.根据权利要求12所述的双链寡核苷酸，其特征在于，按照5'末端到3'末端方向，所述反义链的第2位、第6位、第14位、第16位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第7位的核苷酸被所述核苷酸类似物所替代，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸；和/或，
按照5'末端到3'末端方向，所述正义链的第7位、第9位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第8位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸。
14.根据权利要求13所述的双链寡核苷酸，其特征在于，所述反义链包括位于5'末端的两个硫代磷酸二酯核苷酸间键和位于3'末端的两个硫代磷酸二酯键；和/或，
所述正义链包括位于5'末端的两个硫代磷酸二酯键。
15.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其特征在于，所述反义链与靶基因表达的mRNA中的一段核苷酸序列基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补，其中，基本上反向互补是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；实质上反向互补是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指所涉及的两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
16.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其特征在于，所述双链寡核苷酸选自siRNA。
17.缀合物，其特征在于，所述缀合物包含权利要求1至16任一项所述的双链寡核苷酸以及一个或多个能够与细胞表面受体结合的配体。
18.根据权利要求17所述的缀合物，其特征在于，所述配体选自去唾液酸糖蛋白受体配体。
19.根据权利要求17所述的缀合物，其特征在于，所述配体的数量选自一个，一个所述配体缀合连接到所述双链寡核苷酸的正义链3'末端。
20.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如下任意项以及药学上可接受的辅料或助剂：
（I）、权利要求1至16任一项所述的双链寡核苷酸；和/或
（II）、权利要求17至19任一项所述的缀合物。
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