RU2819689C2

RU2819689C2 - Нуклеиновая кислота, фармацевтическая композиция, конъюгат, способ получения и применение

Info

Publication number: RU2819689C2
Application number: RU2021130599A
Authority: RU
Inventors: Хунъянь ЧЖАН; Шань ГАО; Дайву КАН; Баолэй ТЯНЬ
Original assignee: Сучжоу Рибо Лайф Сайенс Ко., Лтд.
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2024-05-22

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым конъюгатам ингибирующих нуклеиновых кислот. Изобретение раскрывает химическое соединение, способное ингибировать экспрессию гена субтилизина/кексина пропротеинконвертазы типа 9 (PCSK9). Конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению может быть применим в медицине для эффективного снижения содержания холестерина в плазме крови, в том числе и при лечении гиперхолестеринемии. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 6 пр., 8 табл., 4 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, способной ингибировать экспрессию гена пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 (PCSK9), фармацевтической композиции и конъюгату миРНК, содержащих ее. Настоящее изобретение также относится к способу получения и применению таких нуклеиновых кислот, фармацевтических композиций и конъюгатов миРНК.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Дислипидемия, особенно устойчиво высокий уровень холестерина липопротеинов низкой плотности (Х-ЛПНП), является важным фактором риска, который вызывает и способствует возникновению и развитию атеросклероза, и тесно связан с ишемическими сердечно-сосудистыми и цереброваскулярными заболеваниями, представляющими серьезную угрозу для здоровья человека. Доступные в настоящее время лекарственные средства для лечения дислипидемии в основном включают статины, ингибиторы абсорбции холестерина, смолы, пробукол, фибраты, ниацины и их производные. Применение гиполипидемических препаратов для снижения уровня холестерина в плазме крови может уменьшить риск сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний. Тем не менее, все еще существует значительная доля пациентов, у которых не получается понизить содержание липидов до желаемого уровня.

Согласно исследованиям, ген пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 (PCSK9) играет важную роль в метаболизме липидов, особенно в метаболизме холестерина. С помощью ингибирования экспрессии гена PCSK9 можно эффективно понизить уровень холестерина в плазме. Малая интерферирующая РНК (миРНК) может ингибировать или блокировать экспрессию целевого гена, представляющего интерес, специфичным для последовательности образом, основанным на механизме РНК-интерференции (РНКи), что позволит достичь цели лечения заболеваний. Ингибирование экспрессии гена PCSK9 на уровне матричной РНК (мРНК), несомненно, будет самым идеальным средством лечения.

Ключом к разработке лекарственных средств на основе миРНК, которые ингибируют экспрессию гена PCSK9 и лечат гиперхолестеринемию, является поиск подходящей миРНК, ее модификации и эффективной системы доставки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению, раскрытому ниже, способен специфически ингибировать экспрессию гена PCSK9 и специфически нацеливаться на печень и ингибировать экспрессию гена PCSK9 в печени, тем самым обеспечивая лечение или профилактику гиперхолестеринемии. Кроме того, авторы изобретения создали миРНК с более высокой активностью и ее фармацевтические композиции.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен конъюгат миРНК, имеющий структуру, представленную Формулой (308):

где

n1 представляет собой целое число от 1 до 3, и n3 представляет собой целое число от 0 до 4;

m1, m2 или m3 независимо представляют собой целые числа от 2 до 10;

R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ или R₁₅ независимо представляют собой Н или выбраны из группы, состоящей из C₁-С₁₀ алкила, С₁-С₁₀ галогеналкила и C₁-С₁₀ алкокси;

R₃ представляет собой группу, имеющую структуру, представленную Формулой (А59):

где

E₁ представляет собой ОН, SH или ВН₂;

Nu представляет собой миРНК;

миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь; каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид; причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двух цеп очечную область; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II представляют собой последовательности, выбранные из одной из следующих групп i)-vi):

i) нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 1, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 2, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₁ представляет собой С, и Z₂ представляет собой G, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₃ в положении, соответствующем Z₁; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₄ в положении, соответствующем Z₂, где нуклеотид Z₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи;

ii) нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 61, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 62, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₅ представляет собой А, и Z₆ представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₇ в положении, соответствующем Z₅; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₈ в положении, соответствующем Z₆, где нуклеотид Z₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи;

iii) нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 121, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 122, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₉ представляет собой А, и Z₁₀ представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₁ в положении, соответствующем Z₉; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₁₂ в положении, соответствующем Z₁₀, где нуклеотид Z₁₂ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи;

iv) нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 181, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 182, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

в которой Z₁₃ представляет собой U, и Z₁₄ представляет собой А, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₅ в положении, соответствующем Z₁₃; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₁₆ в положении, соответствующем Z₁₄, где нуклеотид Z₁₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи;

v) нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 241, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нукпеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 242, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₁₇ представляет собой U, и Z₁₈ представляет собой А, и

нукпеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₉ в положении, соответствующем Z₁₇; нукпеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₂₀ в положении, соответствующем Z₁₈, где нуклеотид Z₂₀ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи;

vi) нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нукпеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 301, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нукпеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 302, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₂₁ представляет собой А, и Z₂₂ представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₂₃ в положении, соответствующем Z₂₁; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₂₄ в положении, соответствующем Z₂₂, где нуклеотид Z₂₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи;

R₂ представляет собой линейный алкилен от 1 до 20 атомов углерода в длину, причем один или более атомов углерода необязательно замещен любой одной или более группой, выбранной из группы, состоящей из: С(О), NH, О, S, CH=N, S(O)₂, С₂-С₁₀ алкенилен, С₂-С₁₀ алкинилен, С₆-С₁₀ арилен, С₃-C₁₈ гетероциклилен и С₅-С₁₀ гетероарилен; и при этом R₂ необязательно содержит любой один или более заместитель, выбранный из группы, состоящей из: С₁-С₁₀ алкил, С₆-С₁₀ арил, С₅-С₁₀ гетероарил, C₁-С₁₀ галогеналкил, -OC₁-С₁₀ алкил, -OC₁-С₁₀ алкилфенил, -C₁-С₁₀ алкил-ОН, -OC₁-С₁₀ галогеналкил, -SC₁-С₁₀ алкил, -SC₁-С₁₀ алкилфенил, -C₁-С₁₀ алкил-SH, -SC₁-С₁₀ галогеналкил, галоген, -ОН, -SH, -NH₂, -C₁-С₁₀ алкил-NH₂, N(C₁-C₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкил), -NH(C₁-C₁₀ алкил), -N(C₁-C₁₀ алкил) (C₁-С₁₀ алкилфенил), NH(C₁-C₁₀ алкилфенил), циано, нитро, -CO₂H, -C(O)O(C₁-C₁₀ алкил), -CON(C₁-С₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкил), -CONH(C₁-C₁₀ алкил), -CONH₂, -NHC(O)(C₁-C₁₀ алкил), -NHC(O)(фенил), -N(C₁-С₁₀ алкил)С(О)(С₁-С₁₀ алкил), -N(C₁-C₁₀ алкил)С(О)(фенил), -C(O)C₁-C₁₀ алкил, -C(O)C₁-C₁₀ алкилфенил, -C(O)C₁-C₁₀ галогеналкил, -OC(O)C₁-C₁₀ алкил, -SO₂(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂(фенил), -SO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил), -SO₂NH₂, -SO₂NH(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂NH(фенил), -NHSO₂(C₁-C₁₀ алкил), -NHSO₂(фенил) и -NHSO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил);

каждый L₁ независимо представляет собой линейный алкилен от 1 до 70 атомов углерода в длину, причем один или более атом углерода необязательно замещен любой одной или более группой, выбранной из группы, состоящей из: С(О), NH, О, S, CH=N, S(O)₂, С₂-С₁₀ алкенилен, С₂-С₁₀ алкинилен, C₆-С₁₀ арилен, C₃-C₁₈ гетероциклилен и С₅-С₁₀ гетероарилен; и при этом L₁ необязательно содержит любой один или более заместитель, выбранный из группы, состоящей из: C₁-C₁₀ алкил, С₆-С₁₀ арил, С₅-С₁₀ гетероарил, C₁-С₁₀ галогеналкил, -OC₁-С₁₀ алкил, -ОС₁-С₁₀ алкилфенил, -C₁-С₁₀ алкил-ОН, -OC₁-С₁₀ галогеналкил, -SC₁-С₁₀ алкил, -SC₁-С₁₀ алкилфенил, -C₁-С₁₀ алкил-SH, -SC₁-С₁₀ галогеналкил, галоген, -ОН, -SH, -NH₂, -C₁-С₁₀ алкил-NH₂, -N(C₁-C₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкил), -NH(C₁-C₁₀ алкил), N(C₁-C₁₀ алкил) (C₁-С₁₀ алкилфенил), NH(C₁-C₁₀ алкилфенил), циано, нитро, -CO₂H, -С(O)O(С₁-С₁₀ алкил), -CON(C₁-C₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкил), -CONH(C₁-C₁₀ алкил), -CONH₂, -NHC(O)(C₁-C₁₀ алкил), -NHC(O)(фенил), -N(C₁-C₁₀ алкил)С(O)(С₁-С₁₀ алкил), -N(C₁-C₁₀ алкил)С(О)(фенил), -С(O)С₁-С₁₀ алкил, -С(O)С₁-С₁₀ алкилфенил, -С(O)С₁-С₁₀ галогеналкил, -OC(O)C₁-C₁₀ алкил, -SO₂(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂(фенил), -SO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил), -SO₂NH₂, -SO₂NH(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂NH(фенил), -NHSO₂(C₁-C₁₀ алкил), -NHSO₂(фенил) и -NHSO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил);

представляет положение, в котором группа ковалентно присоединена к остальной части молекулы; и M₁ представляет нацеливающую группу.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена миРНК, способная ингибировать экспрессию гена PCSK9, причем миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь; каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо представляет собой модифицированный фтором нуклеотид и нуклеотид снефторной модификацией; причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; модифицированные фтором нуклеотиды расположены внутри нуклеотидных последовательностей I и II; и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, и нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой нуклеотиды с нефторной модификацией; в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотид ной последовательности II в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, и нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой нуклеотиды с нефторной модификацией; и нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II представляют собой последовательности, выбранные из одной из вышеупомянутых групп i)-vi).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая миРНК, раскрытую в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен конъюгат миРНК, который содержит миРНК, раскрытую в настоящем документе, и конъюгирующую группу, соединенную с помощью конъюгации с миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено применение миРНК и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предотвращения заболеваний или патологических состояний, вызванных аномальной экспрессией гена PCSK9.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения и/или предотвращения заболеваний или паталогических состояний, вызванных аномальной экспрессией гена PCSK9, включающий введение эффективного количества миРНК и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ ингибирования экспрессии гена PCSK9 в гепатоцитах, включающий приведение эффективного количества миРНК и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в контакт с гепатоцитами.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен набор, содержащий миРНК и/или фармацевтическую композицию, и/или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению.

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЙ ЭФФЕКТЫ

МиРНК, фармацевтическая композиция и конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют высокую стабильность, имеют повышенную ингибирующую активность в отношении мРНК гена PCSK9 и пониженные нецелевой эффект и токсичность, и/или в значительной степени лечат и/или предотвращают заболевания или паталогические состояния, вызванные аномальной экспрессией гена PCSK9, такие как гиперхолестеринемия.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют превосходную ингибирующую активность в отношении экспрессии целевой мРНК в экспериментах с клетками в условиях in vitro. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспресии целевой мРНК в гепатоцитах по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению имеют повышенную стабильность и/или повышенную активность в условиях in vivo. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспресии целевого гена в условиях in vivo по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспрессии гена PCSK9 в условиях in vivo по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспрессии гена PCSK9 в печени в условиях in vivo по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспрессии гена PCSK9 в печени в условиях in vivo в моделях на животных по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспрессии гена PCSK9 в печени в условиях in vivo у человека по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению не проявляют очевидного нецелевого эффекта. Нецелевые эффекты могут представлять собой, например, ингибирование нормальной экспрессии нецелевых генов. Считается, что если связывание/ингибирование экспрессии нецелевых генов составляет менее 50%, 40%, 30%, 20% или 10% по сравнению с эффектом в отношении целевого гена, нецелевой эффект является несущественным.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению проявляет более высокую ингибирующую активность в системе psiCHECK, причем значения IC₅₀ для целевой последовательности находятся в диапазоне от 0,0194 нМ до 0,0561 нМ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения после однократной подкожной инъекции 9 мг/кг яванским макакам конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению демонстрирует процент ингибирования в отношении экспрессии мРНК гена PCSK9 в ткани печени нечеловеческих приматов (NHP) равную до 56-81% на 15-й день после введения по сравнению с 7-м днем до введения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляет более значительное ингибирование экспрессии белка PCSK9 в сыворотке и демонстрирует процент ингибирования в отношении экспрессии белка PCSK9 в сыворотке на 14-й день после введения на уровне до более 90%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению может значительно ингибировать уровни X-ЛПНП и холестерина (СНО) в сыворотке и, в частности, демонстрирует процент ингибирования Х-ЛПНП в течение периода с 14 по 29 день после введения на уровне до 30% или даже до 64%; указанный конъюгат также демонстрирует более высокую степень ингибирования уровня СНО, вплоть до более 35%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения после однократного введения 9 мг/кг конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению может поддерживать процент ингибирования Х-ЛПНП в течение 11 недель на уровне более 50%, и конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению не проявляет очевидной токсичности у крыс или мышей. В заключение, конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению начинает действовать быстро и его действие длится долго, он может значительно ингибировать экспрессию целевой мРНК, может эффективно понижать содержание белка PCSK9 в сыворотке, оказывает сильное ингибирующее действие в отношении Х-ЛПНП и СНО в сыворотке и обладает высокой биологической безопасностью.

Следовательно, миРНК, фармацевтическая композиция миРНК и конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению могут ингибировать экспрессию гена PCSK9, эффективно лечить и/или предотвращать заболевания или паталогические состояния, вызванные аномальной экспрессией гена PCSK9, и, таким образом, их применение является очень перспективным.

Дополнительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут подробно проиллюстрированы в следующей части «ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ».

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фигурах 1A-1F приведены кривые доза-эффект, аппроксимированные в соответствии с относительной остаточной активностью репортерного гена Renilla в системе psiCHECK после трансфекции различными миРНК (миРНК 1-6).

Фигура 2 иллюстрирует нормализованные уровни белка PCSK9 в сыворотке при различных временных точках после однократной подкожной инъекции 9 мг/кг конъюгата 1, 4 или 7 яванским макакам.

Фигура 3 иллюстрирует нормализованные уровни Х-ЛПНП в сыворотке при различных временных точках после однократной подкожной инъекции 9 мг/кг конъюгата 4 или 7 яванским макакам.

Фигура 4 иллюстрирует нормализованные уровни СНО в сыворотке при различных временных точках после однократной подкожной инъекции 9 мг/кг конъюгата 4 или 7 яванским макакам.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Конкретные варианты реализации настоящего изобретения подробно описаны ниже. Следует понимать, что конкретные варианты реализации, описанные в настоящем документе, предназначены только для иллюстрации и пояснения настоящего изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения в каком-либо отношении.

Применительно к настоящему изобретению PCSK9 мРНК относится к МРНК с нуклеотидной последовательностью, представленную под номером доступа в Genbank NM_174936.3. Кроме того, если не указано иное, термин «целевой ген», используемый в настоящем изобретении, относится к гену, который может транскрибировать вышеуказанную мРНК PCSK9; и термин «целевая мРНК» относится к вышеуказанной мРНК PCSK9.

Определения

Применительно к настоящему изобретению, если не указано иное, С, G, U, А и Т обозначают состав оснований нуклеотидов; буква m обозначает, что нуклеотид, стоящий слева от буквы m, представляет собой метокси-модифицированный нуклеотид; f обозначает, что нуклеотид, стоящий слева от буквы f, представляет собой модифицированный фтором нуклеотид; s обозначает, что два нуклеотида по обеим сторонам от буквы s соединены тиофосфотиоатной связью; Р1 обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне Р1, представляет собой 5'-фосфатный нуклеотид или нуклеотид, модифицированный аналогом 5'-фосфата, VP обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне VP, представляет собой нуклеотид, модифицированный винилфосфатом, Ps обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне Ps, представляет собой тиофосфат-модифицированный нуклеотид, и Р обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне Р, представляет собой 5'-фосфатный нуклеотид.

Применительно к настоящему изобретению термин «модифицированный фтором нуклеотид» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы нуклеотида фтором. Термин «нуклеотид с нефторной модификацией» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы нуклеотида группой, отличной от фторгруппы, или к аналогу нуклеотида. «Аналог нуклеотида» относится к группе, которая может заместить нуклеотид в нуклеиновой кислоте, при этом она структурно отличается от аденинового рибонуклеотида, гуанинового рибонуклеотида, цитозинового рибонуклеотида, урацилового рибонуклеотида или тиминового дезоксирибонуклеотида, такого как изонуклеотид, нуклеотид мостиковой нуклеиновой кислоты (BNA) или ациклический нуклеотид. «Метокси-модифицированный нуклеотид» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы метоксигруппой.

Применительно к настоящему изобретению выражения «комплементарный» и «обратнокомплементарный» могут использоваться взаимозаменяемо и имеют общеизвестное значение в данной области техники, а именно, основания в одной цепи комплементарно спарены с основаниями в другой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В ДНК пуриновое основание аденин (А) всегда спарено с пиримидиновым основанием тимином (Т) (или урацилом (U) в РНК); и пуриновое основание гуанин (G) всегда спарено с пиримидиновым основанием цитозином (С). Каждая пара оснований содержит пурин и пиримидин. Если аденины в одной цепи всегда спарены стиминами (или урацилами) в другой цепи, а гуанины всегда спарены с цитозинами, эти две цепи считаются комплементарными друг другу; и последовательность цепи может быть выведена из последовательности ее комплементарной цепи. Соответственно, «неправильное спаривание» означает, что в двухцепочечной нуклеиновой кислоте основания в соответствующих сайтах (положениях) не представлены в виде комплементарно спаренных.

Применительно к настоящему изобретению, если не указано иное, «преимущественно обратнокомплементарный» означает, что между двумя нуклеотидными последовательностями присутствует не более 3 неправильно спаренных оснований. «По существу обратнокомплементарный» означает, что между двумя нуклеотидными последовательностями присутствует не более 1 неправильно спаренного основания. «Полностью обратнокомплементарный» означает, что между двумя нуклеотидными последовательностями отсутствуют неправильно спаренные основания.

Применительно к настоящему изобретению, если нуклеотидная последовательность имеет «различие по нуклеотидам» от другой нуклеотидной последовательности, основания нуклеотидов в одном и том же положении между ними изменены. Например, если нуклеотидное основание во второй последовательности представляет собой А, а нуклеотидное основание в том же положении в первой последовательности представляет собой U, С, G или Т, эти две нуклеотидные последовательности считаются имеющими различие по нуклеотиду в этом положении. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если нуклеотид в некотором положении замещен лишенным азотистого основания нуклеотидом или аналогом нуклеотида, также считается, что в этом положении существует различие по нуклеотиду.

Применительно к настоящему изобретению, в частности, в описании миРНК, фармацевтической композиции миРНК или способа получения конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению, если не указано иное, термин «нуклеозидный мономер» относится, в соответствии с видом и последовательностью нуклеотидов в миРНК или конъюгате миРНК, которые должны быть получены, к немодифицированным или модифицированным фосфоамидитами нуклеозидов (немодифицированным или модифицированным РНК-фосфоамидитам; иногда РНК-фосфоамидиты называют фосфоамидитами нуклеозидов) применяемым в твердофазном фосфоамидитном синтезе. Твердофазный фосфоамидитный синтез представляет собой способ синтеза РНК, хорошо известный специалистам в данной области техники. Нуклеозидные мономеры, применяемые в настоящем изобретении, могут быть доступны коммерчески.

Применительно к настоящему изобретению, если не указано иное, «конъюгирование» относится к двум или более химическим группам, каждая из которых имеет специфическую функцию, соединенным друг с другом за счет ковалентной связи. Соответственно, «конъюгат» относится к соединению, образованному с помощью ковалентной связи отдельных химических групп. Кроме того, «конъюгат миРНК» представляет собой соединение, образованное с помощью ковалентного присоединения миРНК и одной или более химических групп, каждая из которых имеет специфические функции. В этом случае конъюгат миРНК, раскрытый в настоящем документе, иногда сокращенно обозначается как «конъюгат». Конъюгат миРНК следует понимать в соответствии с контекстом как общий термин для множества конъюгатов миРНК или конъюгата миРНК, представленного химической формулой. Применительно к настоящему изобретению термин «конъюгирующая молекула» следует понимать как конкретное соединение, которое может быть конъюгировано с миРНК за счет реакций с получением в конечном итоге конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению.

В настоящем документе термин «необязательный» или «необязательно» означает, что описанное впоследствии событие или условие может происходить или может не происходить, и что описание включает случаи, когда событие или условие происходит или не происходит. Например, «необязательно замещенный алкил» включает оба «алкил» и «замещенный алкил», как определено ниже. Специалисты в данной области техники поймут, в отношении любой группы, содержащей один или более заместителей, что такие группы не предназначены для введения какого-либо замещения или профилей замещения, которые являются стерически непрактичными, синтетически неосуществимыми и/или нестабильными по своей природе.

В настоящем документе термин «алкил» относится к линейной цепи и разветвленной цепи, содержащей указанное количество атомов углерода, обычно от 1 до 20 атомов углерода, например, от 1 до 10 атомов углерода, например, от 1 до 8 или от 1 до 6 атомов углерода. Например, C₁-C₆ алкил включает оба линейный и разветвленный алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода. При обозначении алкильного остатка, содержащего определенное количество атомов углерода, подразумевается включение всех форм с разветвленной цепью и линейной цепью, содержащих такое количество атомов углерода; таким образом, например, «бутил» означает н-бутил, втор-бутил, изобутил и трет-бутил; «пропил» включает н-пропил и изопропил. Алкилен представляет собой подгруппу ал кила, относящуюся к тем же остаткам, как и алкил, но имеющую два положения присоединения.

В настоящем документе термин «алкенил» относится к ненасыщенной разветвленной или линейной алкильной группе, имеющей по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод, которая получается путем соответствующего удаления одной молекулы водорода от двух соседних атомов углерода исходного алкила. Группа может быть в цис- или транс-конфигурации двойной связи. Типичные алкенильные группы включают, но не ограничиваются ими, этенил; пропенилы, такие как проп-1-ен-1-ил, проп-1-ен-2-ил, проп-2-ен-1-ил (аллил), проп-2-ен-2-ил; бутенилы, такие как бут-1-ен-1-ил, бут-1-ен-2-ил, 2-метилпроп-1-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, бут-2-ен-2-ил, бута-1,3-диен-1-ил, бута-1,3-диен-2-ил; и тому подобное. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения алкенильная группа содержит от 2 до 20 атомов углерода, а в других вариантах реализации от 2 до 10, от 2 до 8 или от 2 до 6 атомов углерода. Алкенилен представляет собой подгруппу алкенила, относящуюся к тем же остаткам, как и алкенил, но имеющую два положения присоединения.

В настоящем документе термин «алкинил» относится к ненасыщенной разветвленной или линейной алкильной группе, имеющей по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод, которая получается путем соответствующего удаления двух молекул водорода от двух смежных атомов углерода исходного алкила. Типичные алкинильные группы включают, но не ограничиваются ими, этинил; пропинилы, такие как проп-1-ин-1-ил, проп-2-ин-1-ил; бутинилы, такие как бут-1-ин-1-ил, бут-1-ин-3-ил, бут-3-ин-1-ил; и тому подобное. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения алкинильная группа содержит от 2 до 20 атомов углерода, а в других вариантах реализации от 2 до 10, от 2 до 8 или от 2 до 6 атомов углерода. Алкинилен представляет собой подгруппу алкинила, относящуюся к тем же остаткам, как и алкинил, но имеющую два положения присоединения.

В настоящем документе термин «алкокси» относится к алкильной группе с указанным количеством атомов углерода, присоединенной за счет кислородного мостика, например, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, н-бутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, пентилокси, 2-пентилокси, изопентилокси, неопентилокси, гексилокси, 2-гексилокси, 3-гексилокси, 3-метилпентилокси и тому подобное. Алкоксигруппы обычно содержат от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6 или от 1 до 4 атомов углерода, присоединенных за счет кислородного мостика.

в настоящем документе термин «арил» относится к заместителю, происходящему из ароматической моноциклической или полициклической углеводородной кольцевой системы путем удаления атома водорода от кольцевого атома углерода. Ароматическая моноциклическая или полициклическая углеводородная кольцевая система содержит только водород и углерод, включая от шести до восемнадцати атомов углерода, причем по меньшей мере одно кольцо в кольцевой системе является полностью ненасыщенным, т.е. оно содержит циклическую делокализованную (4n+2)π-электронную систему в соответствии с теорией Хюккеля. Арильные группы включают, но не ограничиваются ими, фенил, флуоренил, нафтил и тому подобное. Арилен представляет собой подгруппу арила, относящуюся к тем же остаткам, как и арил, но имеющую два положения присоединения.

В настоящем документе термин «гало-заместитель» или «галоген» относится к фторо, хлоро, бромо и йодо, а термин «галоген» включает фтор, хлор, бром и йод.

В настоящем документе термин «галогеналкил» относится к алкилу, определенному выше, с указанным количеством атомов углерода, замещенному одним или более атомами галогена, до максимально допустимого числа атомов галогена. Примеры галогеналкила включают, но не ограничиваются ими, трифторметил, дифторметил, 2-фторэтил и пентафторэтил.

«Гетероциклил» относится к стабильному 3-18-членному неароматическому кольцевому заместителю, который содержит от 2 до 12 атомов углерода и от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы. Если в описании не указано иное, гетероциклил представляет собой моноциклическую, бициклическую, трициклическую или тетрациклическую кольцевую систему, которая может содержать конденсированные или мостиковые кольцевые системы. Гетероатомы в гетероциклильном заместителе необязательно могут быть окислены. Один или более атомов азота, если они присутствуют, необязательно являются кватернизованными. Гетероциклил является частично или полностью насыщенным. Гетероциклил может быть соединен с остальной частью молекулы за счет любого атома кольца. Примеры такого гетероциклила включают, но не ограничиваются ими, диоксоланил, тиенил[1,3]дитианил, декагидроизохинолил, имидазолинил, имидазолидинил, изотиазолидинил, изоксазолидинил, морфолинил, октагидроиндолил, октагидроизоиндолил, 2-оксапиперазинил, 2-оксапиперидинил, 2-оксапиримидинил, оксазолидинил, пиперидинил, пиперазинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, пиразолидинил, хинуклидинил, тиазолидинил, тетрагидрофурил, тритианил, тетрагидропиранил, тиоморфолинил, тиаморфолинил, 1-о ксатио морфолинил и 1,1-диоксатиоморфолинил.

«Гетероарил» относится к заместителю, происходящему из 3-18-членного ароматического кольцевого заместителя, который содержит от 2 до 17 атомов углерода и от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы. В настоящем документе гетероарил может представлять собой моноциклическую, бициклическую, трициклическую или тетрациклическую кольцевую систему, причем по меньшей мере одно кольцо в кольцевой системе является полностью ненасыщенным, т.е. содержит циклическую делокализованную (4n+2)π-электронную систему в соответствии с теорией Хюккеля. Гетероарил включает конденсированные или мостиковые кольцевые системы. Гетероатом в гетероарильном заместителе необязательно окислен. Один или более атомов азота, если они присутствуют, необязательно являются кватернизованными. Гетероарил соединен с остальной частью молекулы за счет любого атома кольца. Примеры таких гетероарилов включают, но не ограничиваются ими, азепинил, акридинил, бензимидазолил, бензиндолил, 1,3-бензодиоксазолил, бензофуранил, бензоксазолил, бензо[d]тиазолил, бензотиадиазолил, бензо[b][1,4]диоксепинил, бензо[b][1,4]оксазинил, 1,4-бензодиоксанил, бензонафтофуранил, бензооксазолил, бензодиоксолил, бензодиоксинил, бензопиранил, бензопиранонил, бензофуранил, бензофуранонил, бензотиенил, бензотиено[3,2-d]пиримидинил, бензотриазолил, бензо[4,6]имидазо[1,2-а]пиридинил, карбазолил, циннолинил, циклопента[d]пиримидинил, 6,7-дигидро-5Н-циклопента[4,5]-тиено[2,3-d]-пиримидинил, 5,6-дигидробензо[h]хиназолинил, 5,6-дигидробензо[h]циннолинил, 6,7-дигидро-5Н-бензо[6,7]циклогепта[1,2-с]пиридазинил, дибензофуранил, дибензотиенил, фуранил, фуранонил, фуро[3,2-с]пиридинил, 5,6,7,8,9,10-гексагидроциклоокта[d]пиримидинил, 5,6,7,8,9,10-гексагидроциклогепта[d]пиридазинил, 5,6,7,8,9,10-гексагидроциклоокта[d]пиридинил, изотиазолил, имидазолил, индазолил, индолил, изоиндолил, индолинил, изоиндолинил, изохинолил, индолизинил, изоксазолил, 5,8-метано-5,6,7,8-тетрагидрохиназолинил, нафтиридинонил, 1,6-нафтиридинонил, оксадиазолил, 2-оксоазепинил, оксазолил, оксиранил, 5,6,6а,7,8,9,10,10а-октагидробензо[h]хиназолинил, 1-фенил-1Н-пирролил, феназинил, фенотиазинил, феноксазинил, фталазинил, птеридинил, пуринил, пирролил, пиразолил, пиразоло[3,4-d]пиримидинил, пиридинил, пиридо[3,2-d]пиримидинил, пиридо[3,4-d]пиримидинил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, хиназолинил, хиноксалинил, хинолинил, тетрагидрохинолинил, 5,6,7,8-тетрагидрохиназолинил, 5,6,7,8-тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидинил, 6,7,8,9-тетрагидро-5Н-циклогепта[4,5]тиено[2,3-d]пиримидинил, 5,6,7,8-тетрагидропиридо[4,5-с]пиридазинил, тиазолил, тиадиазолил, триазолил, тетразолил, триазинил, тиено[2,3-c]пиримидинил, тиено[3,2-d]пиримидинил, тиено[2,3-с]придинил и тиофенил/тиенил.

В настоящем изобретении можно применять различные защищающие гидроксил группы. Как правило, защитные группы делают химические функциональные группы инертными к конкретным условиям реакции и могут быть присоединены к таким функциональным группам в молекуле и удалены от них без существенного повреждения остальной части молекулы. Типичные защищающие гидроксил группы раскрыты в Beaucage, et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311, а также в Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2 изд., John Wiley & Sons, New York, 1991, каждый из которых тем самым полностью включен посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения защитная группа стабильна в основных условиях, но может быть удалена в кислых условиях. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения неисключающие примеры защищающих гидроксил групп, применяемых в настоящем документе, включают диметокситритил (DMT), монометокситритил, 9-фенилксантен-9-ил (Pixyl) и 9-(п-метоксифенил)ксантен-9-ил (Мох). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения неисключающие примеры защищающих гидроксил групп, применяемых в настоящем документе, включают Tr (тритил), MMTr (4-метокситритил), DMTr (4,4'-диметокситритил) и TMTr (4,4',4''-триметокситритил).

в настоящем документе термин «субъект» относится к любому животному, например, млекопитающему или сумчатому. Субъект согласно настоящему изобретению включает, но не ограничивается указанными, человека, примата, не относящегося к человеку (например, макаку резуса или другие виды макак), мышь, свинью, лошадь, осла, корову, овцу, крысу и любой вид домашней птицы.

В настоящем документе термин «лечение» относится к способу получения предпочтительного или целевого результата, включая, но не ограничиваясь этим, терапевтическую пользу. «Терапевтическая польза» означает устранение или улучшение потенциального нарушения, подлежащего лечению. Также терапевтическая польза достигается путем устранения или уменьшения одного или более физиологических симптомов, ассоциированных с потенциальным расстройством, так, что у субъекта наблюдается улучшение, несмотря на то, что субъект все еще может быть поражен потенциальным нарушением.

В настоящем документе термин «профилактика» относится к способу получения предпочтительного или целевого результата, включая, но не ограничиваясь этим, профилактическую пользу. Для получения «профилактической пользы» конъюгат миРНК или композицию миРНК можно вводить субъекту, подверженному риску развития конкретного заболевания, или субъекту, сообщающему об одном или более физиологических симптомах заболевания, даже если диагноз этого заболевания не был установлен.

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложено шесть миРНК, способные ингибировать экспрессию гена PCSK9.

МиРНК согласно настоящему изобретению содержит нуклеотиды в качестве основных структурных блоков. Специалистам в данной области техники хорошо известно, что нуклеотид содержит фосфатную группу, рибозную группу и основание. Подробные иллюстрации, относящиеся к таким группам, в настоящем документе не представлены.

МиРНК согласно настоящему изобретению содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь. Смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, причем смысловая цепь содержит 19-23 нуклеотида в длину, а антисмысловая цепь содержит 19-26 нуклеотидов в длину. Таким образом, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи в миРНК согласно настоящему изобретению может составлять 19/19, 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/23, 23/24, 23/25 или 23/26. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи в миРНК составляет 19/21, 21/23 или 23/25.

Первая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой первую миРНК.

Первая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, и каждый из нуклеотидов в первой миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двух цеп очечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 1, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами; и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 2, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

Применительно к настоящему изобретению термин «соответствующее положение» означает нахождение в одном и том же положении в нуклеотидной последовательности при отсчете с одного и того же конца нуклеотидной последовательности. Например, первый нуклеотид на 3'-конце нуклеотидной последовательности I представляет собой нуклеотид в положении, соответствующем первому нуклеотиду на 3'-конце SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смысловая цепь состоит исключительно из нуклеотидной последовательности I, а антисмысловая цепь состоит исключительно из нуклеотидной последовательности II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1; и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, включает различие в положении Z₄, причем Z₄ выбран из A, U или С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₄, причем Z₄ выбран из A, U или С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₃ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₄. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам имеют более высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I является преимущественно обратнокомплементарной, по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности II; «преимущественно обратнокомплементарный» относится к не более чем 3 неправильно спаренным основаниям в двух нуклеотидных последовательностях; «по существу обратнокомплементарный» относится к не более чем 1 неправильно спаренному основанию в двух нуклеотидных последовательностях; «полностью обратнокомплементарный» относится к отсутствию неправильно спаренных оснований в двух нуклеотидных последовательностях.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4:

в которых Z₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи; Z₃ выбран из A, U, G или С; в некоторых вариантах реализации Z3 представляет собой С и Z₄ представляет собой G.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и каждая из нуклеотидной последовательности III и нуклеотидной последовательности IV независимо имеет длину 1-4 нуклеотида; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I; нуклеотидная последовательность IV соединена с 3'-концом нуклеотидной последовательности II. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности; вторая нуклеотидная последовательность относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID NO: 1 и имеет ту же длину, что и нукпеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, основание нуклеотидной последовательности III представляет собой С, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой G; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой СС, и состав оснований нуклеотидной последовательности IM представляет собой GG; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой ССС, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой GGG; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой АССС, состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой GGGU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой СС, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой GG; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III полностью обратнокомплементарна нуклеотидной последовательности IV. Таким образом, если предложено основание нуклеотидной последовательности III, основание нуклеотидной последовательности IV также определено.

Вторая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой вторую миРНК.

Вторая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, и каждый из нуклеотидов во второй миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратномплементарны, что позволяет образовывать двух цеп очечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 61, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами; и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 62, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 61; и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 62, включает различие в положении Z₈, причем Z₈ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₈, причем Z₈ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₇ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₈. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам имеют более высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I является преимущественно обратнокомплементарной, по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63; и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64:

в которых Z₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи; Z₇ выбран из A, U, G или С и Z₈ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₇; в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения Z₇ представляет собой А и Z₈ представляет собой U.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и каждая из нуклеотидной последовательности III и нуклеотидной последовательности IV независимо имеет длину 1-4 нуклеотида; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I; нуклеотидная последовательность IV соединена с 3'-концом нуклеотидной последовательности II; нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности; вторая нуклеотидная последовательность относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID NO: 61 и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, основание нуклеотидной последовательности III представляет собой U, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой А; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой АС; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GGU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой АСС; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GGGU, состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой АССС; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой АС; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Третья миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой третью миРНК.

Третья миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, и каждый из нуклеотидов в первой миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двух цеп очечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 121, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами; и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 122, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 121; и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 122.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 122, включает различие в положении Z₁₂, причем Z₁₂ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₁₂, причем Z₁₂ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₁₁ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₂. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам имеют более высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 123; и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 124:

в которых Z₁₂ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₁₁ выбран из A, U, G или С, и Z₁₂ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₁; в некоторых вариантах реализации Z₁₁ представляет собой А, и Z₁₂ представляет собой U.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и каждая из нуклеотидной последовательности III и нуклеотидной последовательности IV независимо имеет длину 1-4 нуклеотида; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I; нуклеотидная последовательность IV соединена с 3'-концом нуклеотидной последовательности II; нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности; вторая нуклеотидная последовательность относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID NO: 121 и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, основание нуклеотидной последовательности III представляет собой G, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой С; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или нукпеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UAG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CUA; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AUAG, состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CUAU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Четвертая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой четвертую миРНК.

Четвертая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, и каждый из нуклеотидов в первой миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двух цеп очечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 181, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами; и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 182, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₅ в положении, соответствующем Z₁₃; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₁₆ в положении, соответствующем Z₁₄, где нуклеотид Z₁₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 181; и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 182.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 182, включает различие в положении Z₁₆, причем Z₁₆ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₁₆, причем Z₁₆ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₁₅ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₆. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам имеют более высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 183; и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 184:

в которых Z₁₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₁₅ выбран из A, U, G или С, и Z₁₆ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₅; в некоторых вариантах реализации Z₁₅ представляет собой U, и Z₁₆ представляет собой А.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и каждая из нуклеотидной последовательности III и нуклеотидной последовательности IV независимо имеет длину 1-4 нуклеотида; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I; нуклеотидная последовательность IV соединена с 3'-концом нуклеотидной последовательности II; нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности; вторая нуклеотидная последовательность относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID NO: 181 и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, основание нуклеотидной последовательности III представляет собой С, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой G; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой АС, и состав оснований нуклеотидной последовательности IM представляет собой GU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GAC, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой GUC; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AGAC, состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой GUCU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой АС, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой GU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Пятая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой пятую миРНК.

Пятая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, и каждый из нуклеотидов в первой миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двух цеп очечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 241, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами; и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 242, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₉ в положении, соответствующем Z₁₇; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₂₀ в положении, соответствующем Z₁₈, где нуклеотид Z₂₀ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 241; и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 242.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 242, включает различие в положении Z₂₀, причем Z₂₀ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₂₀, причем Z₂₀ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₁₉ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₀. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам имеют более высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 243; и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 244:

в которых Z₂₀ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₁₉ выбран из A, U, G или С, и Z₂₀ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₉; в некоторых вариантах реализации Z₁₉ представляет собой U, и Z₂₀ представляет собой А.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и каждая из нуклеотидной последовательности III и нуклеотидной последовательности IV независимо имеет длину 1-4 нуклеотида; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I; нуклеотидная последовательность IV соединена с 3'-концом нуклеотидной последовательности II; нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности; вторая нуклеотидная последовательность относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID NO: 241 и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, основание нуклеотидной последовательности III представляет собой G, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой С; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой СА; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CUG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CAG; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UCUG, состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CAGA; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой СА; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Шестая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой шестую миРНК.

Шестая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, и каждый из нуклеотидов в первой миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двух цеп очечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 301, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами; и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 302, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 301; и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 302.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 302, включает различие в положении Z₂₄, причем Z₂₄ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₂₄, причем Z₂₄ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₂₃ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₄. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам имеют более высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 303; и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 304:

в которых Z₂₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₂₃ выбран из A, U, G или С, и Z₂₄ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₃; в некоторых вариантах реализации Z₂₃ представляет собой А, и Z₂₄ представляет собой U.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и каждая из нуклеотидной последовательности III и нуклеотидной последовательности IV независимо имеет длину 1-4 нуклеотида; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I; нуклеотидная последовательность IV соединена с 3'-концом нуклеотидной последовательности II; нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности; вторая нуклеотидная последовательность относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID NO: 301 и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, основание нуклеотидной последовательности III представляет собой G, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой С; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой СА; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AUG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CAU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UAUG, состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CAUA; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой СА; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Липкий конец и модификация миРНК

Следующее описание, касающееся нуклеотидной последовательности V, последовательности нуклеиновой кислоты или нуклеотидной модификации и модифицированной последовательности миРНК применимо к любой миРНК, от первой до шестой. А именно, если не указано иное, следующее описание миРНК следует рассматривать как описание каждой из первой, второй, третьей, четвертой, пятой и шестой миРНК. Например, если не указана конкретная миРНК, выражение "миРНК дополнительно содержит нуклеотидную последовательность V" означает, что "первая миРНК, вторая миРНК, третья миРНК, четвертая миРНК, пятая миРНК и шестая миРНК дополнительно содержат нуклеотидную последовательность V".

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, и антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность V. Нуклеотидная последовательность V имеет длину 1-3 нуклеотида и соединена с 3'-концом антисмысловой цепи с образованием 3' -липкого конца антисмысловой цепи. В этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи в миРНК согласно настоящему изобретению может составлять 19/20, 19/21, 19/22, 20/21, 20/22, 20/23, 21/22, 21/23, 21/24, 22/23, 22/24, 22/25, 23/24, 23/25 или 23/26. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность V содержит 2 нуклеотида в длину. Таким образом, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи в миРНК согласно настоящему изобретению может составлять 19/21, 21/23 или 23/25.

Каждый нуклеотид в нуклеотидной последовательности V может представлять собой любой нуклеотид. Для облегчения и удешевления синтеза нуклеотидная последовательность V представляет собой 2 непрерывных тиминовых дезоксирибонуклеотида (dTdT) или 2 непрерывных урациловых рибонуклеотида (UU); для повышения аффинности между антисмысловой цепи миРНК и целевой мРНК, нуклеотидная последовательность V является комплементарной нуклеотидам в соответствующих положениях целевой мРНК. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи миРНК согласно настоящему изобретению составляет 19/21 или 21/23. В этом случае миРНК согласно настоящему изобретению проявляет лучшую подавляющую активность в отношении мРНК.

Нуклеотиды в соответствующих положениях целевой мРНК относятся к нуклеотидам или нуклеотидной последовательности, которые соединены с 5'-концом третьей нуклеотидной последовательности целевой мРНК. Эта третья нуклеотидная последовательность относится к сегменту нуклеотидной последовательности, который является по существу обратнокомплементарный или полностью обратнокомплементарным нуклеотидной последовательности II или по существу обратнокомплементарным или полностью обратнокомплементарным нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидной последовательности II и нуклеотидной последовательности IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к первой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6:

В качестве альтернативы, смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8:

в которых Z₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи; Z₃ выбран из A, U, G или С, и Z₄ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₃.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно ко второй миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66:

Согласно другому варианту смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 67, а антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68:

в которых Z₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи; Z₇ выбран из A, U, G или С, и Z₈ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₇.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к третьей миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 125, а антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 126:

Согласно другому варианту смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 127, а антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 128:

в которых Z₁₂ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи; Z₁₁ выбран из A, U, G или С, и Z₁₂ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₁.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к четвертой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 185, а антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 186:

Согласно другому варианту смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 187, а антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 188:

в которых Z₁₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи; Z₁₅ выбран из A, U, G или С, и Z₁₆ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₅.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к пятой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 245, а антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 246:

Согласно другому варианту смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 247, а антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 248:

в которых Z₂₀ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи; Z₁₉ выбран из A, U, G или С, и Z₂₀ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₉.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к шестой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 305, а антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 306:

Согласно другому варианту смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 307, а антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 308:

,

в которых Z₂₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи; Z₂₃ выбран из A, U, G или С, и Z₂₄ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₃.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой любую одну, выбранную из группы, состоящей из siPCSKa1, siPCSKa2, siPCSKb1, siPCSKb2, siPCSKc1, siPCSKc2, siPCSKd1, siPCSKd2, siPCSKe1, siPCSKe2, siPCSKf1 или siPCSKf2, перечисленные в Таблицах 1a-1f.

Как упоминалось выше, в миРНК согласно настоящему изобретению каждый нуклеотид независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотиды в миРНК согласно настоящему изобретению представляют собой немодифицированные нуклеотиды; согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в миРНК согласно настоящему изобретению некоторые или все нуклеотиды представляют собой модифицированные нуклеотиды. Такие модификации на нуклеотидах не будут вызывать значительного уменьшения или потери функции конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению для ингибирования экспрессии гена PCSK9.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере 1 модифицированный нуклеотид. Применительно к настоящему изобретению термин «модифицированный нуклеотид» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы нуклеотида другими группами, аналогу нуклеотида или нуклеотиду с модифицированным основанием Модифицированные нуклеотиды не будут вызывать значительного уменьшения или потери функции конъюгата миРНК в отношении ингибирования экспрессии генов. Например, могут быть выбраны модифицированные нуклеотиды, раскрытые J.K. Watts, G, F, Deleavey and М.J. Damha, Chemically Modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008.13(19-20): p. 842-55.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один нуклеотид в смысловой или антисмысловой цепи миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой модифицированный нуклеотид, и/или по меньшей мере один фосфат представляет собой фосфатную группу с модифицированными группами. Другими словами, по меньшей мере часть фосфатных и/или рибозных групп в фосфатно-рибозном остове по меньшей мере одной одиночной цепи в смысловой цепи и антисмысловой цепи представляют собой фосфатные и/или рибозные группы с модифицированными группами.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения все нуклеотиды в смысловой цепи и/или антисмысловой цепи представляют собой модифицированные нуклеотиды. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК согласно настоящему изобретению независимо представляет собой модифицированный фтором нуклеотид или нуклеотид с нефторной модификацией.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что миРНК согласно настоящему изобретению достигает высокой степени равновесия между стабильностью в сыворотке и эффективностью подавления генов в экспериментах на животных.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные фтором нуклеотиды расположены внутри нуклеотидных последовательностей I и II; и, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды; и, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные фтором нуклеотиды расположены внутри нуклеотидных последовательностей I и II; и в нуклеотидной последовательности I присутствует не более 5 модифицированных фтором нуклеотидов; и, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды; и в нуклеотидной последовательности II присутствует не более 7 модифицированных фтором нуклеотидов; и нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 или 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи представляют собой нуклеотиды с нефторной модификацией; в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 или 2, 6, 8, 9, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи представляют собой нуклеотиды с нефторной модификацией.

Применительно к настоящему изобретению термин «модифицированный фтором нуклеотид» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы нукпеотида фтором, имеющему структуру, представленную Формулой (7). Термин «нуклеотид с нефторной модификацией» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы нукпеотида группой, отличной от фторгруппы, или к аналогу нуклеотида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый нуклеотид с нефторной модификацией независимо выбран из группы, состоящей из нуклеотида, образованного путем замещения 2'-гидроксила его рибозной группы группой, отличной от фтора, и аналога нуклеотида.

Нуклеотид, образованный путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы группой, отличной от фтора, хорошо известен специалистам в данной области техники и может быть выбран из группы, состоящей из 2'-алкокси-модифицированного нуклеотида, 2'-замещенного алкокси-модифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, 2'-замещенного алкил-модифицированного нуклеотида, 2'-аминомодифицированного нуклеотида, 2'-замещенного амино-модифицированного нуклеотида и 2'-дезоксинуклеотида.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 2'-алкоксимодифицированный нуклеотид представляет собой метокси-модифицированный нуклеотид (2'-ОМе), представленный Формулой (8). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 2'-замещенный алкокси-модифицированный нуклеотид представляет собой, например, 2'-O-метоксиэтокси-модифицированный нуклеотид (2'-МОЕ), представленный Формулой (9). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 2'-амино-модифицированный нуклеотид (2'-NH₂) представляет собой тот, который представлен Формулой (10). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 2'-дезоксинуклеотид (ДНК) представляет собой тот, который представлен Формулой (11).

«Аналог нуклеотида» относится к группе, которая может замещать нуклеотид в нуклеиновой кислоте, при этом она структурно отличается от аденинового рибонуклеотида, гуанинового рибонуклеотида, цитозинового рибонуклеотида, урацилового рибонуклеотида или тиминового дезоксирибонуклеотида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог нуклеотида может представлять собой изонуклеотид, нуклеотид мостиковой нуклеиновой кислоты (BNA) или ациклический нуклеотид.

BNA представляет собой нуклеотид, который ограничен или недоступен. BNA может содержать 5-, 6-членную или даже 7-членную кольцевую мостиковую структуру со сморщиванием «фиксированного» С3'-эндо-сахара. Мостик, как правило, встроен в 2'- и 4'-положение рибозы, чтобы получить 2',4'-BNA нуклеотид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения BNA может представлять собой LNA, ENA, сЕТ BNAn т.п., которые представлены Формулами (12), (13) и (14), соответственно.

Ациклический нуклеотид представляет собой нуклеотид, в котором рибозное кольцо незамкнуто. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ациклический нуклеотид может представлять собой нуклеотид незапертой нуклеиновой кислоты (UNA) или нуклеотид нуклеиновой кислоты на основе глицерина (GNA), которые представлены Формулами (15) и (16), соответственно.

В приведенных выше Формулах (15) и (16) R выбран из Н, ОН или алкокси (О-алкила).

Изонуклеотид представляет собой соединение, образованное путем изменения положения основания на рибозном кольце в нуклеотиде. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения изонуклеотид может представлять собой соединение, в котором основание перемещено из положения -1' в положение -2' или -3' на рибозном кольце, представленное Формулами (17) или (18), соответственно.

В вышеуказанных соединениях формул (17)-(18) «основание» представляет собой основание, такое как A, U, G, С или Т; R представляет собой Н, ОН, F или группу, отличную от фтора, описанную выше.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог нуклеотида выбран из группы, состоящей из изонуклеотида, LNA, ENA, сЕТ, UNA и GNA. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый нуклеотид с нефторной модификацией представляет собой метокси-модифицированный нуклеотид. Применительно к настоящему изобретению метокси-модифицированный нуклеотид относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы метоксигруппой.

Применительно к настоящему изобретению термин «модифицированный фтором нуклеотид», «2'-фтор-модифицированный нуклеотид», «нуклеотид, в котором 2'-гидроксил рибозной группы замещен фтором», и «2'-фторрибозил» имеют одинаковое значение, относясь к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы фтором, имеющему структуру, представленную Формулой (7). «Метокси-модифицированный нуклеотид», «2'-метокси-модифицированный нуклеотид», «нуклеотид, в котором 2'-гидроксил рибозной группы замещен метокси» и «нуклеотид с 2'-метоксирибозилом» имеют одинаковое значение, относясь к нуклеотиду, в котором 2'-гидроксил рибозной группы в нуклеотиде замещен метокси, имеющему структуру, представленную Формулой (8).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой ми РНК со следующими модификациями: в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 или 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 или 2, 6, 8, 9, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой ми РНК со следующими модификациями: в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и, в направлении от 5'-конца к З'-концу, нуклеотиды в положениях 2, 6, 8, 9, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды;

согласно другому варианту, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды;

согласно другому варианту, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой любую одну, выбранную из группы, состоящей из siPCSKa1-M1, siPCSKa1-M2, siPCSKa1-M3, siPCSKa2-M1, siPCSKa2-M2, siPCSKa2-M3, siPCSKb1-M1, siPCSKb1-M2, siPCSKb1-M3, siPCSKb2-M1, siPCSKb2-M2, siPCSKb2-M3, siPCSKc1-M1, siPCSKc1-M2, siPCSKc1-M3, siPCSKc2-M1, siPCSKc2-M2, siPCSKc2-M3, siPCSKd1-M1, siPCSKd1-M2, siPCSKd1-M3, siPCSKd2-M1, siPCSKd2-M2, siPCSKd2-M3, siPCSKe1-M1, siPCSKe1-M2, siPCSKe1-M3, siPCSKe2-M1, siPCSKe2-M2, siPCSKe2-M3, siPCSKf1-M1, siPCSKf1-M2, siPCSKf1-M3, siPCSKf2-M1, siPCSKf2-M2 или siPCSKf2-M, перечисленных в Таблицах 1a-1f.

МиРНК с указанными модификациями могут быть обеспечены не только с более низкими затратами, но также снижают склонность рибонуклеаз расщеплять нуклеиновую кислоту в крови так, чтобы повысить стабильность нуклеиновой кислоты и обеспечить более высокую устойчивость нуклеиновой кислоты к гидролизу нуклеазами. Между тем, миРНК с вышеуказанными модификациями также проявляют более высокую ингибирующую активность в отношении целевой мРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере часть фосфатных групп в фосфатно-рибозном остове по меньшей мере одной одиночной цепи в смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК согласно настоящему изобретению представляют собой фосфатные группы с модифицированными группами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фосфатные группы с модифицированными группами представляют собой фосфотиоатные группы, образованные путем замещения по меньшей мере одного атома кислорода в сложной фосфодиэфирной связи в фосфатных группах атомом серы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фосфатные группы с модифицированными группами представляют собой фосфотиоатные группы, имеющие структуру, представленную Формулой (1):

Эта модификация стабилизирует двух цеп очечную структуру миРНК, что поддерживает высокую специфичность и высокую аффинность спаривания оснований.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в миРНК согласно настоящему изобретению фосфотиоатная связь присутствует в по меньшей мере одном из следующих положений: положение между первым и вторым нуклеотидами на любом конце смысловой или антисмысловой цепи, положение между вторым и третьим нуклеотидами на любом конце смысловой или антисмысловой цепи или в любой их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фосфотиоатная связь присутствует во всех вышеуказанных положениях, за исключением 5'-конца смысловой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фосфотиоатная связь присутствует во всех вышеуказанных положениях, за исключением 3'-конца смысловой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фосфотиоатная связь присутствует в по меньшей мере одном из следующих положений:

положение между первым и вторым нуклеотидами на 5'-конце смысловой цепи;

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 5'-конце смысловой цепи;

положение между первым и вторым нуклеотидами на 3'-конце смысловой цепи;

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 3'-конце смысловой цепи;

положение между первым и вторым нуклеотидами на 5'-конце антисмысловой цепи;

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 5'-конце антисмысловой цепи;

положение между первым и вторым нуклеотидами на 3'-конце антисмысловой цепи; и

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 3'-конце антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой любую одну, выбранную из группы, состоящей из siPCSKa1-M1S, siPCSKa1-M2S, siPCSKa1-M3S, siPCSKa2-M1S, siPCSKa2-M2S, siPCSKa2-M3S, siPCSKb1-M1S, siPCSKb1-M2S, siPCSKb1-M3S, siPCSKb2-M1S, siPCSKb2-M2S, siPCSKb2-M3S, siPCSKc1-M1S, siPCSKc1-M2S, siPCSKc1-M3S, siPCSKc2-M1S, siPCSKc2-M2S, siPCSKc2-M3S, siPCSKd1-M1S, siPCSKd1-M2S, siPCSKd1-M3S, siPCSKd2-M1S, siPCSKd2-M2S, siPCSKd2-M3S, siPCSKe1-M1S, siPCSKe1-M2S, siPCSKe1-M3S, siPCSKe2-M1S, siPCSKe2-M2S, siPCSKe2-M3S, siPCSKf1-M1S, siPCSKf1-M2S, siPCSKf1-M3S, siPCSKf2-M1S, siPCSKf2-M2S или siPCSKf2-M3S, перечисленных в Таблицах 1a-1f.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 5'-концевой нуклеотид в антисмысловой цепи миРНК представляет собой 5'-фосфатный нуклеотид или нуклеотид, модифицированный аналогом 5'-фосфата.

Обычные типы 5'-фосфатных нуклеотидов или нуклеотидов, модифицированных аналогом 5'-фосфата, хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, 5'-фосфатные нуклеотиды могут иметь следующую структуру:

в качестве другого примера, раскрытого в Anastasia Khvorova and Jonathan K. Watts, The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017, 35(3): 238-48, приведены следующие четыре нуклеотида, которые модифицированы аналогом 5'-фосфата:

где R выбран из Н, ОН, метокси и F;

«Основание» представляет собой основание, выбранное из A, U, С, G или Т.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 5'-фосфатный нуклеотид представляет собой нуклеотид с 5'-фосфатной модификацией, представленный Формулой (2); нуклеотид, модифицированный аналогом 5'-фосфата, представляет собой нуклеотид с 5'-(Е)-винилфосфонатной (E-VP) модификацией, представленный Формулой (3), или модифицированный фосфотиоатом нуклеотид, представленный Формулой (5).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой любую одну, выбранную из группы, состоящей из siPCSKa1-M1P1, siPCSKa1-M2P1, siPCSKa1-M3P1, siPCSKa2-M1P1, siPCSKa2-M2P1, siPCSKa2-M3P1, siPCSKb1-M1P1, siPCSKb1-M2P1, siPCSKb1-M3P1, siPCSKb2-M1P1, siPCSKb2-M2P1, siPCSKb2-M3P1, siPCSKc1-M1P1, siPCSKc1-M2P1, siPCSKc1-M3P1, siPCSKc2-M1P1, siPCSKc2-M2P1, siPCSKc2-M3P1, siPCSKd1-M1P1, siPCSKd1-M2P1, siPCSKd1-M3P1, siPCSKd2-M1P1, siPCSKd2-M2P1, siPCSKd2-M3P1, siPCSKe1-M1P1, siPCSKe1-M2P1, siPCSKe1-M3P1, siPCSKe2-M1P1, siPCSKe2-M2P1, siPCSKe2-M3P1, siPCSKf1-M1P1, siPCSKf1-M2P1, siPCSKf1-M3P1, siPCSKf2-M1P1, siPCSKf2-M2P1, siPCSKf2-M3P1, siPCSKa1-M1SP1, siPCSKa1-M2SP1, siPCSKa1-M3SP1, siPCSKa2-M1SP1, siPCSKa2-M2SP1, siPCSKa2-M3SP1, siPCSKb1-M1SP1, siPCSKb1-M2SP1, siPCSKb1-M3SP1, siPCSKb2-M1SP1, siPCSKb2-M2SP1, siPCSKb2-M3SP1, siPCSKc1-M1SP1, siPCSKc1-M2SP1, siPCSKc1-M3SP1, siPCSKc2-M1SP1, siPCSKc2-M2SP1, siPCSKc2-M3SP1, siPCSKd1-M1SP1, siPCSKd1-M2SP1, siPCSKd1-M3SP1, siPCSKd2-M1SP1, siPCSKd2-M2SP1, siPCSKd2-M3SP1, siPCSKe1-M1SP1, siPCSKe1-M2SP1, siPCSKe1-M3SP1, siPCSKe2-M1SP1, siPCSKe2-M2SP1, siPCSKe2-M3SP1, siPCSKf1-M1SP1, siPCSKf1-M2SP1, siPCSKf1-M3SP1, siPCSKf2-M1SP1, siPCSKf2-M2SP1 и siPCSKf2-M3SP1, перечисленных в Таблицах 1a-1f.

Седьмая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой седьмую миРНК.

Седьмая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, и каждый нуклеотид в седьмой миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид; причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двух цеп очечную область; нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 399, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами; и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 400, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

в которой Z₂₅ представляет собой U, и Z₂₆ представляет собой А, и нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₂₇ в положении, соответствующем Z₂₅; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₂₈ в положении, соответствующем Z₂₆, где нуклеотид Z₂₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи;

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 399; и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 400.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 400, включает различие в положении Z₂₈, причем Z₂₈ выбран из G, U или С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₂₈, причем Z₂₈ выбран из G, U или С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₂₇ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₈.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нукпеотидам между нуклеотидной последовательностью I и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 399, включает различие по 9-му нуклеотиду Z, отсчитываемому от 5'-конца нуклеотидной последовательности I, причем Z представляет собой dT.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нукпеотидам между нуклеотидной последовательностью I и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 399, включает различие в положении Z₂₇, причем Z₂₇ выбран из A, G или С.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нукпеотидам между нуклеотидной последовательностью I и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 399, представляет собой 2 нуклеотидных различия, и нуклеотидная последовательность I полностью обратнокомплементарна нуклеотидной последовательности II, причем 2 нуклеотидных различия представляют собой различия в положениях Z и Z₂₇, и Z представляет собой dT, и Z₂₇ выбран из A, G или С.

МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам имеют более высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 401, и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 402:

Где dT представляет собой дезоксинуклеотид тимина, Z₂₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₂₇ выбран из A, U, G или С, и Z₂₈ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₇; в некоторых вариантах реализации изобретения Z₂₇ представляет собой U, и Z₂₈ представляет собой А.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к седьмой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 403, а антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 404:

Согласно другому варианту смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 405, а антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 406:

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой siPCSKg3 или siPCSKg4, перечисленные в Таблице 1g.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в вышеупомянутых миРНК с нуклеотидными различиями в положениях Z и/или Z₂₇, по меньшей мере некоторые из нуклеотидов представляют собой модифицированные нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды или нуклеотиды с нефторной модификацией, модифицированные фтором нуклеотиды расположены в нуклеотидной последовательности I и нуклеотидной последовательности II, и, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды, по меньшей мере, в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой любую из siPCSKg3-M4, siPCSKg4-M5, siPCSKg3-M4S, siPCSKg4-M5S, siPCSKg3-M4P1, siPCSKg4-M5P1, siPCSKg3-M4SP1 или siPCSKg4-M5SP1, перечисленных в Таблице 1g.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что миРНК согласно настоящему изобретению обладают значительно повышенной стабильностью в плазме и лизосомах, проявляя при этом более высокую ингибирующую активность по отношению к целевой мРНК.

МиРНК согласно настоящему изобретению могут быть получены с помощью обычных способов получения миРНК в данной области техники, например, с помощью способов твердофазного синтеза и жидкофазного синтеза. При этом для твердофазного синтеза уже доступны коммерческие услуги по требованиям заказчика. Модифицированные нуклеотиды могут быть введены в миРНК согласно настоящему изобретению с применением нуклеотидного мономера, имеющего соответствующую модификацию. Способы получения нуклеотидного мономера, имеющего соответствующую модификацию и способы введения модифицированного нуклеотида в миРНК также хорошо известны специалистам в данной области техники.

Фармацевтическая композиция

Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая миРНК, описанную выше, в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой носитель, обычно применяемый в области введения миРНК, например, но не ограничиваясь этим, один или более из магнитных наночастиц (таких как наночастицы на основе Fe₃O₄ и Fe₂O₃), углеродных нанотрубок, мезопористого кремния, наночастиц фосфата кальция, полиэтиленимина (PEI), дендримера полиамидоамина (РАМАМ), поли-L-лизина (PLL), хитозана, 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропана (DOTAP), сополимера D- и L-молочной кислоты и гликолевой кислоты (PLGA), поли-2-аминоэтилэтиленфосфата (РРЕЕА), поли-2-диметиламиноэтилметакрилата (PDMAEMA) и их производных.

Особые требования к содержанию миРНК и фармацевтически приемлемому носителю в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению отсутствуют. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения массовое отношение миРНК к фармацевтически приемлемому носителю составляет 1:(1-500) и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 1:(1-50).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению также может содержать другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые могут представлять собой один или более из различных обычных составов или соединений в данной области техники. Например, указанные другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества могут содержать по меньшей мере один из буфера рН, защитного агента и регулятора осмотического давления.

Буфер рН может представлять собой буферный раствор гидрохлорида трис-гидроксиметиламинометана с рН=7,5-8,5 и/или фосфатный буферный раствор с рН=5,5-8,5, предпочтительно фосфатный буферный раствор с рН=5,5-8,5.

Защитный агент может представлять собой по меньшей мере один из инозита, сорбита, сахарозы, трегалозы, маннозы, мальтозы, лактозы и глюкозы. Содержание защитного агента может составлять от 0,01 масс. % до 30 масс. % на основании общей массы фармацевтической композиции.

Регулятор осмотического давления может представлять собой хлорид натрия и/или хлорид калия. Содержание регулятора осмотического давления обеспечивает осмотическое давление фармацевтической композиции 200-700 милиосмоль/кг. В зависимости от целевого осмотического давления специалисты в данной области техники могут легко определить содержание регулятора осмотического давления.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция может представлять собой жидкий состав, например, раствор для инъекций; или лиофилизированный порошок для инъекций, который смешивают с жидким вспомогательным веществом для получения жидкого состава при введении. Жидкий состав можно вводить, но не ограничиваясь этим, путем подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции, а также можно вводить, но не ограничиваясь этим, в легкие путем распыления или другие органы (такие как печень) через легкие путем распыления. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическую композицию вводят с помощью внутривенной инъекции.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть в форме липосомного состава. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель, применяемый в липосомном составе, содержит аминосодержащее соединение для трансфекции (далее по тексту также упоминаемое как органический амин), вспомогательный липид и/или пегилированный липид. При этом органический амин, вспомогательный липид и пегилированный липид могут быть выбраны, соответственно, из одного или более из аминосодержащих соединений для трансфекции или их фармацевтически приемлемых солей или производных, вспомогательных липидов и пегилированных липидов, описанных в CN103380113A, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический амин может представлять собой соединение, представленное Формулой (201), описанное в CN103380113A, или его фармацевтически приемлемую соль:

где

каждый Х₁₀₁ или Х₁₀₂ независимо друг от друга выбран из О, S, N-A и С-А, где А представляет собой водород или С₁-С₂₀ углеводородную цепь; каждый Y₁₀₁ или Z₁₀₁ независимо друг от друга выбран из С=O, C=S, S=O, СН-ОН или SO₂;

каждый R₁₀₁, R₁₀₂, R₁₀₃, R₁₀₄, R₁₀₅, R₁₀₆ или R₁₀₇ независимо друг от друга выбран из водорода; циклической или ациклической, замещенной или незамещенной, разветвленной или линейной алифатической группы; циклической или ациклической, замещенной или незамещенной, разветвленной или линейной гетероалифатической группы; замещенной или незамещенной, разветвленной или линейной ацильной группы; замещенной или незамещенной, разветвленной или линейной арильной группы; и замещенной или незамещенной, разветвленной или линейной гетероарильной группы;

х представляет собой целое число от 1 до 10;

n представляет собой целое число от 1 до 3, m представляет собой целое число от 0 до 20, р равно 0 или 1, при этом, если m=p=0, то R₁₀₂ представляет собой водород; и

если по меньшей мере один из n и m равен 2, то R₁₀₃ и азот в Формуле (201) образуют структуру, представленную Формулой (202) или (203):

в которых g, е или f независимо друг от друга представляют собой целое число от 1 до 6; «НСС» представляет собой углеводородную цепь и каждый *N представляет собой атом азота, показанный в Формуле (201).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₁₀₃ представляет собой полиамин. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения R₁₀₃ представляет собой кеталь. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₁₀₁ и R₁₀₂ в Формуле (201) независимо друг от друга представляют собой любую из замещенных или незамещенных, разветвленных или линейных алкильных или алкенильных групп, которые содержат 3-20 атомов углерода (например, 8-18 атомов углерода) и 0-4 двойные связи (например, 0-2 двойные связи).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если n и m независимо друг от друга представляют собой 1-3, R₁₀₃ представляет собой любую из следующих формул (204)-(213)

где в Формулах (204)-(213) g, е и f независимо друг от друга представляют собой целое число от 1 до 6, каждый «НСС» представляет собой углеводородную цепь и каждый символ * представляет собой потенциальную точку присоединения R₁₀₃ к атому азота в Формуле (201), где каждый Н в любом * положении может быть замещен, чтобы осуществить присоединение к атому азота в Формуле (201).

Соединение, представленное в Формуле (201), может быть получено, как описано в CN103380113A.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический амин может представлять собой органический амин, представленный Формулой (214), и/или органический амин, представленный Формулой (215):

Вспомогательный липид представляет собой холестерин, аналог холестерина и/или производные холестерина.

Пегилированный липид представляет собой 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин-N-[метоксиполиэтиленгликоль]-2000.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молярное отношение между органическим амином, вспомогательным липидом и пегилированным липидом в фармацевтической композиции составляет (19,7-80):(19,7-80):(0,3-50); например, молярное отношение может составлять (50-70):(20-40):(3-20).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции, образованные миРНК согласно настоящему изобретению и вышеуказанными аминосодержащими агентами для трансфекции, имеют средний диаметр от приблизительно 30 нм до приблизительно 200 нм, как правило, от приблизительно 40 нм до приблизительно 135 нм, и более типично средний диаметр липосомных частиц составляет от приблизительно 50 нм до приблизительно 120 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 100 нм, от приблизительно 60 нм до приблизительно 90 нм или от приблизительно 70 нм до приблизительно 90 нм, например, средний диаметр липосомных частиц составляет приблизительно 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 или 160 нм.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в фармацевтической композиции, образованной миРНК согласно настоящему изобретению и вышеуказанными аминосодержащими агентами для трансфекции, отношение (отношение масса/масса) миРНК к общим липидам, например, органическим аминам, вспомогательным липидам и/или пегилированный липидам, варьируется от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:50, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:30, от приблизительно 1:3 до приблизительно 1:20, от приблизительно 1:4 до приблизительно 1:18, от приблизительно 1:5 до приблизительно 1:17, от приблизительно 1:5 до приблизительно 1:15, от приблизительно 1:5 до приблизительно 1:12, от приблизительно 1:6 до приблизительно 1:12 или от приблизительно 1:6 до приблизительно 1:10. Например, отношение миРНК согласно настоящему изобретению к общим липидам составляет приблизительно 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17 или 1:18 по массе.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция может продаваться с каждым компонентом, предоставленным по отдельности, и может применяться в форме жидкого состава. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, образованная миРНК согласно настоящему изобретению и вышеуказанным фармацевтически приемлемым носителем, может быть получена с помощью различных известных способов, за исключением замены существующего двухцепочечного олигонуклеотида миРНК согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть получена в соответствии со следующим способом:

Органические амины, вспомогательные липиды и пегилированные липиды суспендируют в спирте в молярном отношении, описанном выше, и смешивают до однородности с получением раствора липидов; спирт применяют в таком количестве, чтобы полученный раствор липидов присутствовал в общей массовой концентрации от 2 до 25 мг/мл (например, от 8 до 18 мг/мл). Спирт представляет собой фармацевтически приемлемый спирт, такой как спирт, который находится в жидкой форме при приблизительно комнатной температуре, например, один или более из этанола, про пилен гликоля, бензилового спирта, глицерина, ПЭГ 200, ПЭГ 300, ПЭГ 400, предпочтительно этанол.

МиРНК согласно настоящему изобретению растворяют в забуференном солевом растворе для получения водного раствора миРНК. Забуференный солевой раствор имеет концентрацию от 0,05 до 0,5 М, такую как от 0,1 до 0,2 М. рН забуференного солевого раствора доводят до 4,0-5,5, например, от 5,0 до 5,2. Забуференный солевой раствор применяют в таком количестве, чтобы миРНК присутствовала в концентрации менее 0,6 мг/мл, например, от 0,2 до 0,4 мг/мл. Буферная соль может представлять собой одну или более, выбранных из группы, состоящей из растворимого ацетата и растворимого цитрата, такого как ацетат натрия и/или ацетат калия.

Раствор липидов и водный раствор миРНК смешивают. Продукт, полученный после смешивания, инкубируют при температуре от 40 до 60°С в течение по меньшей мере 2 минут (например, от 5 до 30 минут) для получения инкубированного липидного состава. Отношение объемов раствора липидов к водному раствору миРНК составляет 1:(2-5).

Инкубированный липидный состав концентрируют или разбавляют, очищают, чтобы удалить примеси, и затем стерилизуют с получением фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, которая имеет следующие физико-химические параметры: рН от 6,5 до 8, процент инкапсуляции более 80%, размер частиц от 40 до 200 нм, индекс полидисперсности менее 0,30 и осмотическое давление от 250 до 400 мОсм/кг. Например, физико-химические параметры могут быть следующими: рН от 7,2 до 7,6, процент инкапсуляции более 90%, размер частиц от 60 до 100 нм, индекс полидисперсности менее 0,20 и осмотическое давление от 300 до 400 мОсм/кг.

При этом стадия концентрирования или разбавления может быть выполнена до, после или одновременно со стадией удаления примесей. Способ удаления примесей может представлять собой любой из различных существующих способов, таких как ультрафильтрация с применением колонки с полыми волокнами 100 кДа, фосфатно-солевой буфер (ФСБ) при рН=7,4 в качестве раствора для обмена при ультрафильтрации и система тангенциального потока. Способ стерилизации может представлять собой любой из различных существующих способов, таких как стерилизация с помощью фильтрации на фильтре с размером пор 0,22 мкм.

Конъюгат миРНК

Согласно настоящему изобретению предложен конъюгат миРНК, который содержит описанную выше миРНК и присоединенную к ней конъюгирующую группу.

Конъюгирующая группа, как правило, содержит по меньшей мере одну фармацевтически приемлемую нацеливающую группу и необязательный линкер. Кроме того, миРНК, линкер и нацеливающая группа соединены последовательно. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения присутствует от 1 до 6 нацеливающих групп. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения присутствует от 2 до 4 нацеливающих групп. Молекула миРНК может быть нековалентно или ковалентно конъюгирована с конъюгирующей группой, например, молекула миРНК ковалентно конъюгирована с конъюгирующей группой. Положение конъюгации между миРНК и конъюгирующей группой может быть на 3'-конце или 5'-конце смысловой цепи миРНК, или на 5'-конце антисмысловой цепи миРНК, или во внутренней последовательности миРНК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения положение конъюгации между миРНКи конъюгирующей группой находится на 3'-конце смысловой цепи ми РНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгирующая группа соединена с фосфатной группой, 2'-гидроксигруппой или основанием нуклеотида. Конъюгирующая группа может быть соединена с 3'-гидроксигруппой, если нуклеотиды соединены за счет 2'-5'-фосфодиэфирной связи. Если конъюгирующая группа соединена с концом миРНК, конъюгирующая группа, как правило, соединена с фосфатной группой нуклеотида; если конъюгирующая группа соединена с внутренней последовательностью миРНК, конъюгирующая группа, как правило, соединена с рибозным кольцом или основанием. Для конкретных типов соединения можно сослаться на: Muthiah Manoharan et. al. siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes, ACS Chemical biology 2015, 10(5): 1181-7.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК и конъюгирующая группа могут быть соединены с помощью кислото-лабильной или восстанавливаемой химической связи, и эти химические связи могут быть разрушены в кислой среде эндосом клетки, что приводит миРНК в свободное состояние. Для неразрушаемых видов конъюгации конъюгирующая группа может быть соединена со смысловой цепью миРНК, что сводит к минимуму влияние конъюгации на активность миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемая нацеливающая группа может представлять собой обычный лиганд в области введения миРНК, например, различные лиганды, описанные в WO 2009082607 А2, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемая нацеливающая группа может быть выбрана из одного или более из лигандов, образованных следующими нацеливающими молекулами или их производными: липофильных молекул, таких как холестерин, желчных кислот, витаминов (таких как витамин Е), молекул липидов с разной длиной цепи; полимеров, таких как полиэтиленгликоль; полипептидов, таких как пептид для проникновения в клетки; аптамеров; антител; квантовых точек; сахаридов, таких как лактоза, полилактоза, манноза, галактоза, N-ацетилгалактозамин (GalNAc); соли фолиевой кислоты; или рецепторных лигандов, экспресс и руемых в паренхимных клетках печени, таких как асиалогликопротеин, асиало-сахарный остаток, липопротеины (такие как липопротеин высокой плотности, липопротеин низкой плотности), глюкагон, нейротрансмиттеры (такие как адреналин), факторы роста, трансферрин и тому подобное.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд независимо представляет собой лиганд, способный связываться с поверхностным рецептором клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой лиганд, способный связываться с поверхностным рецептором гепатоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой лиганд, способный связываться с поверхностным рецептором гепатоцитов млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой лиганд, способный связываться с поверхностным рецептором гепатоцитов человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой лиганд, способный связываться с печеночным поверхностным рецептором асиалогликопротеина (ASGP-R) на поверхности гепатоцитов. Типы этих лигандов хорошо известны специалистам в данной области техники, и они, как правило, выполняют функцию связывания со специфическими рецепторами на поверхности целевой клетки, что опосредует доставку миРНК, связанной с лигандом, в целевую клетку.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемая нацеливающая группа может представлять собой любой лиганд, который связывается с рецепторами асиалогликопротеина (ASGP-R) на поверхности гепатоцитов млекопитающего. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения каждый лиганд независимо выбран из асиалогликопротеина, такого как асиалооросомукоид (ASOR) или асиалофетуин (ASF). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лиганд представляет собой сахарид или его производные.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой сахарид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд представляет собой сахарид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой моносахарид, полисахарид, модифицированный моносахарид, модифицированный полисахарид или производное сахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд может представлять собой моносахарид, дисахарид или трисахарид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой модифицированный сахарид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд представляет собой модифицированный сахарид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд независимо выбран из группы, состоящей из полисахаридов, модифицированных полисахаридов, моносахаридов, модифицированных моносахаридов, производных полисахаридов и производных моносахаридов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд или по меньшей мере один лиганд может быть независимо выбран из группы, состоящей из глюкозы и ее производных, маннозы и ее производных, галактозы и ее производных, ксилозы и ее производных, рибозы и ее производных, фукозы и ее производных, лактозы и ее производных, мальтозы и ее производных, арабинозы и ее производных, фруктозы и ее производных, а также сиаловой кислоты.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд может быть независимо выбран из группы, состоящей из D-маннопиранозы, L-маннопиранозы, D-арабинозы, D-ксилофуранозы, L-ксилофуранозы, D-глюкозы, L-глюкозы, D-галактозы, L-галактозы, α-D-маннофуранозы, β-D-маннофуранозы, α-D-маннопиранозы, β-D-маннопиранозы, α-D-глюкопиранозы, β-D-глюкопиранозы, α-D-глюкофуранозы, β-D-глюкофуранозы, α-D-фруктофуранозы, α-D-фруктопиранозы, α-D-галактопиранозы, β-D-галактопиранозы, α-D-галактофуранозы, β-D-галактофуранозы, глюкозамина, сиаловой кислоты, галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-трифторацетилгалактозамина, N-пропионилгалактозамина, N-n-бутирилгалактозамина, N-изобутирилгалактозамина, 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы, 2-дезокси-2-метиламино-L-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино-D-глюкопиранозы, N-гликолил-α-нейраминовой кислоты, 5-тио-β-D-глюкопиранозы, метил-2,3,4-трис-O-ацетил-1-тио-6-O-тритил-α-D-глюкопиранозида, 4-tho-β-D-галактопиранозы, этил-3,4,6,7-тетра-O-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-α-D-глюкогептопиранозида, 2,5-ангидро-D-аллононитрила, рибозы, D-рибозы, D-4-тиорибозы, L-рибозы, L-4-тиорибозы. Другие наборы лигандов могут быть найдены, например, в раскрытии CN105378082A, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемая нацеливающая группа в первом конъюгате миРНК может представлять собой галактозу или N-ацетилгалактозамин, причем молекулы галактозы или N-ацетилгалактозамина могут быть моно-, би-, три- или тетравалентными. Следует понимать, что термины моно-, би-, три- или тетравалентный, описанные в настоящем документе, соответственно, означают, что молярное отношение молекулы двухцепочечного олигонуклеотида к молекуле галактозы или N-ацетилгалактозамина в конъюгате олигонуклеотида составляет 1:1, 1:2, 1:3 или 1:4, причем конъюгат олигонуклеотида образован из молекулы миРНК и конъюгирующей группы, содержащей молекулу галактозы или N-ацетилгалактозамина в качестве нацеливающей группы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемая нацеливающая группа представляет собой N-ацетилгалактозамин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если двухцепочечный олигонуклеотид согласно настоящему изобретению конъюгирован с конъюгирующей группой, содержащей N-ацетилгалактозамин, молекула N-ацетилгалактозамина является трехвалентной или четырехвалентной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если миРНК согласно настоящему изобретению конъюгирована с конъюгирующей группой, содержащей N-ацетилгалактозамин, молекула N-ацетилгалактозамина является трехвалентной.

Нацеливающая группа может быть соединена с молекулой миРНК за счет соответствующего линкера, и соответствующий линкер может быть выбран специалистом в данной области техники в соответствии с конкретным типом нацеливающей группы. Типы этих линкеров и нацеливающих групп, а также виды соединения с миРНК можно найти в раскрытии WO 2015006740 А2, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если нацеливающая группа представляет собой N-ацетилгалактозамин, подходящий линкер может иметь следующую структуру, представленную Формулой (301):

где

k представляет собой целое число от 1 до 3;

L^A представляет собой цепную группу, содержащую амидную связь, которая имеет структуру, представленную Формулой (302), причем каждый L^A соответствующим образом соединен с нацеливающей группой и группой L^C за счет простой эфирной связи на двух своих концах:

L^B представляет собой цепную группу, содержащую N-ацилпирролидин, которая имеет структуру, представленную Формулой (303), причем цепная группа содержит карбонильную группу на одном конце и соединена с группой L^C за счет амидной связи, а также содержит оксигруппу на другом конце и соединена с ми РНК за счет сложной фосфоэфирной связи:

L^C представляет собой двухвалентную или четырехвалентную соединяющую группу на основе гидроксиметиламинометана, дигидроксиметиламинометана или тригидроксиметиламинометана, причем группа L^C соединена с каждой из групп L^A посредством простой эфирной связи за счет атома кислорода и соединена с группой L^B посредством амидной связи за счет атома азота.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если n=3 и L^C представляет собой четырехвалентную соединяющую группу на основе тригидроксиметиламинометана, конъюгат миРНК, образованный путем соединения молекул N-ацетилгалактозамина с молекулой миРНК за счет -(L^A)₃-тригидрокси метилам инометан-L^B- в качестве линкера, имеет структуру, представленную Формулой (304):

в которой структура двойной спирали представляет собой миРНК.

Аналогичным образом, положение конъюгации между миРНК и конъюгирующей группой может находиться на 3'-конце или 5'-конце смысловой цепи миРНК, или на 5'-конце антисмысловой цепи, или во внутренней последовательности миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 3'-конец смысловой цепи миРНК согласно настоящему изобретению ковалентно конъюгирован с тремя молекулами N-ацетилгалактозамина (GalNAc) за счет линкера -(L^A)₃-тригидроксиметиламинометан-L^B- с получением первого конъюгата миРНК, в котором молярное отношение молекулы миРНК к молекуле GalNAc составляет 1:3 (далее по тексту упоминается как (GalNAc)3-миРНК), и этот конъюгат имеет структуру, представленную Формулой (305):

в которой структура двойной спирали представляет миРНК; и линкер соединен с 3'-концом смысловой цепи миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если нацеливающая группа представляет собой N-ацетилгалактозамин, подходящий линкер может иметь структуру, представленную Формулой (306):

где

I представляет собой целое число от 0 до 3;

* представляет собой положение на указанном линкере, соединенное с указанной нацеливающей группой за счет простой эфирной связи; и

# представляет собой положение на указанном линкере, соединенное с указанной миРНК за счет сложной фосфоэфирной связи.

Согласно некоторым конкретным вариантам реализации настоящего изобретения, если I=2, конъюгат ми РНК имеет структуру, представленную Формулой (307):

в которой структура двойной спирали обозначает миРНК; и линкер соединен с 3'-концом смысловой цепи миРНК.

Указанные выше конъюгаты могут быть синтезированы в соответствии со способом, подробно описанным в предшествующем уровне техники. Например, в WO 2015006740 А2 подробно описано получение различных конъюгатов. Конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению может быть получен с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Например, в WO 2014025805 A1 описан способ получения конъюгата, имеющего структуру, представленную Формулой (305). Rajeev et al., ChemBioChem 2015, 16, 903-908, описали способ получения конъюгата, имеющего структуру, представленную Формулой (307).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК имеет структуру, представленную Формулой (308):

где

каждый m1, m2 или m3 независимо друг от друга представляет собой целое число от 2 до 10;

R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ или R₁₅ независимо друг от друга представляет собой Н, или выбран из группы, состоящей из C₁-С₁₀ алкила, C₁-С₁₀ галогеналкила и C₁-С₁₀ алкокси,

в которой E₁ представляет собой ОН, SH или ВН₂; и Nu представляет собой миРНК согласно настоящему изобретению;

R₂ представляет собой линейный алкилен от 1 до 20 атомов углерода в длину, причем один или более атомов углерода необязательно замещен любой одной или более группой, выбранной из группы, состоящей из: С(О), NH, О, S, CH=N, S(O)₂, С₂-С₁₀ алкенилена, С₂-С₁₀ алкинилена, С₆-С₁₀ арилена, С₃-C₁₈ гетероциклилена и С₅-С₁₀ гетероарилена, и при этом R₂ необязательно содержит любой один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из: C₁-С₁₀ алкила, С₆-С₁₀ арила, С₅-С₁₀ гетероарила, C₁-С₁₀ галогеналкила, -ОС₁-С₁₀ алкила, -OC₁-С₁₀ алкилфенила, -C₁-С₁₀ алкил-ОН, -OC₁-С₁₀ галогеналкила, -SC₁-С₁₀ алкила, -SC₁-С₁₀ алкилфенила, -С₁-С₁₀ алкил-SH, -SC₁-C₁₀ галогеналкила, галогена, -ОН, -SH, -NH₂, -C₁-С₁₀ алкил-NH₂, -N(C₁-С₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкил), -NH(C₁-C₁₀ алкил), N(C₁-C₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкилфенил), NH(C₁-C₁₀ алкилфенил), циано, нитро, -СО₂Н, -C(O)OC₁-C₁₀ алкила, -CON(C₁-С₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкил), -CONH(C₁-C₁₀ алкил), -CONH₂, -NHC(O)(C₁-C₁₀ алкил), -NHC(O)(фенил), -N(C₁-C₁₀ алкил)С(O)(С₁-С₁₀ алкил), -N(C₁-С₁₀ ал кил) С(О) (фенил), -C(O)C₁-C₁₀ алкила, -С(O)С1-С₁₀ алкилфенила, -C(O)C₁-С₁₀ галогеналкила, -OC(O)C₁-C₁₀ алкила, -SO₂(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂(фенил), -SO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил), -SO₂NH₂, -SO₂NH(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂NH(фенил), -NHSO₂(C₁-C₁₀ алкил), -NHSO₂(фенил) и -NHSO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил);

каждый L₁ независимо представляет собой линейный алкилен от 1 до 70 атомов углерода в длину, причем один или более атомов углерода необязательно замещены любым одним или более из группы, состоящей из: С(О), NH, О, S, CH=N, S(O)₂, С₂-С₁₀ алкенилена, С₂-С₁₀ алкинилена, С₆-С₁₀ арилена, С₃-C₁₈ гетероциклилена и С₅-С₁₀ гетероарилена, и при этом L₁ необязательно содержит любой один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из: С₁-С₁₀ алкила, С₆-С₁₀ арила, С₅-С₁₀ гетероарила, C₁-С₁₀ галогеналкила, -ОС₁-С₁₀ алкила, -OC₁-С₁₀ алкилфенила, -C₁-С₁₀ алкил-ОН, -OC₁-С₁₀ галогеналкила, -SC₁-C₁₀ алкила, -SC₁-С₁₀ алкилфенила, -C₁-С₁₀ алкил-SH, -SC₁-С₁₀ галогеналкила, галогена, -ОН, -SH, -NH₂, -C₁-С₁₀ алкил-NH₂, -N(C₁-С₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкил), -NH(C₁-C₁₀ алкил), N(C₁-C₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкилфенил), NH(C₁-C₁₀ алкилфенил), циано, нитро, -СО₂Н, -C(O)OC₁-C₁₀ алкила, -CON(C₁-С₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкил), -CONH(C₁-C₁₀ алкил), -CONH₂, -NHC(O)(C₁-C₁₀ алкил), -NHC(O)(фенил), -N(C₁-C₁₀ алкил)С(O)(С₁-С₁₀ алкил), -N(C₁-С₁₀ алкил)С(О)(фенил), -C(O)C₁-₁₀ алкила, -C(O)C₁-C₁₀ алкилфенила, -C(O)C₁-С₁₀ галогеналкил, -OC(O)C₁-C₁₀ алкил, -SO₂(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂(фенил), -SO₂(C₁-С₁₀ галогеналкил), -SO₂NH₂, -SO₂NH(C₁-С₁₀ алкил), -SO₂NH(фенил), -NHSO₂(C₁-С₁₀ алкил), -NHSO₂(фенил) и -NHSO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ может быть выбран из группы, состоящей из групп (А1)-(А26) и любой их комбинации, причем структуры и определения (А1)-(А26) приведены далее:

где каждый j1 независимо представляет собой целое число от 1 до 20; каждый j2 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;

каждый R' независимо представляет собой C₁-С₁₀ алкил;

каждый Ra независимо выбран из группы, состоящей из групп Формул (А27)-(А45) или любой их комбинации:

каждый Rb независимо представляет собой C₁-С₁₀ алкил; и

представляет собой положение, в котором группа ковалентно соединена с остальной частью молекулы.

Специалисты в данной области техники поймут, что, несмотря на то, что для удобства L₁ определен как линейный алкил, он не может представлять собой линейную группу или не может называться по-другому, например, амином или алкенилом, полученным с помощью указанной выше замены и/или замещения. Для целей настоящего изобретения длина L₁ представляет собой количество атомов в цепи, соединяющей две точки присоединения. Для этой цели кольцо, полученное путем замещения атома углерода линейного алкилена, такого как гетероциклилен или гетероарилен, считается как один атом.

M₁ представляет собой нацеливающую группу, определения и варианты которой аналогичны тем, которые описаны выше. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый M₁ независимо выбран из одного из лигандов, которые обладают аффинностью в отношении рецептора асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов млекопитающего.

Если M₁ представляет собой лиганд, который обладает аффинностью в отношении рецептора асиалогликопротеина (ASGP-R) на поверхности гепатоцита млекопитающего, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения n1 может представлять собой целое число от 1 до 3, а n3 может представлять собой целое число от 0 до 4, чтобы гарантировать, что количество лиганда M₁ в конъюгате может составлять по меньшей мере 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения n1+n3≥2, поэтому количество лиганда M₁ в конъюгате может составлять по меньшей мере 3, это обеспечивает более легкое связывание лиганда M₁ с рецептором асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов, что может облегчать эндоцитоз конъюгата в клетки. Эксперименты показали, что, если количество лиганда M₁ превышает 3, легкость связывания лиганда M₁ с рецептором асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов существенно не увеличивается. Таким образом, с учетом различных аспектов, таких как удобство синтеза, стоимость структуры/способа и эффективность доставки, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, n1 представляет собой целое число от 1 до 2, n3 представляет собой целое число от 0 до 1 и n1+n3=от 2 до 3.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если каждый из m1, m2 и m3 независимо друг от друга выбран из целого числа от 2 до 10, стерические взаимные положения среди многих лигандов M₁ могут быть соответствующими для связывания лигандов M₁ с рецептором асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов. Для того чтобы конъюгат согласно настоящему изобретению имел более простую структуру, более легкий синтез и/или уменьшенную стоимость, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, каждый из m1, m2 и m3 независимо друг от друга представляет собой целое число от 2 до 5, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения m1=m2=m3.

Специалисты в данной области техники поймут, что, если R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ или R₁₅ независимо друг от друга выбраны из Н, C₁-С₁₀ алкила, C₁-С₁₀ галогеналкила и C₁-С₁₀ алкокси, они не изменят свойства конъюгата согласно настоящему изобретению и все смогут достичь цели настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ или R₁₅ независимо друг от друга выбраны из Н, метила или этила. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ и R₁₅ представляют собой Н.

R₃ представляет собой группу, имеющую структуру, представленную Формулой (А59), где E₁ представляет собой ОН, SH или ВН₂, и с учетом доступности исходных материалов, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, E₁ представляет собой ОН или SH.

R₂ выбран для того чтобы обеспечить соединение между группой, представленной Формулой (А59), и атомом N на азотистом остове. Применительно к настоящему изобретению «азотистый остов» относится к цепной структуре, в которой атом углерода, присоединенный к R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ и R₁₅, и атомы N соединены друг с другом. Таким образом, R₂ может представлять собой любую соединяющую группу, способную присоединять группу, представленную Формулой (А59), к атому N на азотистом остове с помощью подходящих средств. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в случае если конъюгат миРНК Формулы (308) получен с помощью способа твердофазного синтеза, группа R₂ должна иметь и положение, соединяющееся с атомом N на азотистом остове, и положение, соединяющееся с атомом Р в R₃. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в R₂ положение, соединяющееся с атомом N на азотистом остове, образует амидную связь с атомом N, а положение, соединяющееся с атомом Р в R₃, образует сложную фосфоэфирную связь с атомом Р. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₂ может представлять собой В5, В6, В5' или В6':

в которых представляет собой положение, в котором группа присоединена ковалентно;

q2 представляет собой целое число от 1 до 10; согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения q2 представляет собой целое число от 1 до 5.

L₁ применяется для соединения лиганда M₁ с атомом N на азотистом остове, что обеспечивает функцию нацеливания на печень для конъюгата миРНК Формулы (308). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ выбран из соединенных комбинаций одной или более из Формул (А1)-(А26). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения U выбран из соединенных комбинаций одной или более из Формул (А1), (А4), (А5), (А6), (А8), (А10), (А11) и (А13). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ выбран из соединенных комбинаций по меньшей мере двух из Формул (А1), (А4), (А8), (А10) и (А11). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L1 выбран из соединенных комбинаций по меньшей мере двух из Формулы (А1), (А8) и (А10).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения длина L₁ может составлять от 3 до 25, от 3 до 20, от 4 до 15 или от 5 до 12 атомов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ содержит 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 атомов в длину.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения j1 представляет собой целое число от 2 до 10 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения j1 представляет собой целое число от 3 до 5. Согласно некоторым вариантам реализации j2 представляет собой целое число от 2 до 10 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения j2 представляет собой целое число от 3 до 5. R' представляет собой С₁-С₄ алкил и согласно некоторым вариантам реализации R' представляет собой метил, этил или изопропил. Ra представляет собой один из (А27), (А28), (А29), (А30) и (А31) и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Ra представляет собой (А27) или (А28). Rb представляет собой C₁-С₅ алкил и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой метил, этил, изопропил или бутил. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения j1, j2, R', Ra и Rb Формул (A1)-(A26), соответственно, выбраны, чтобы обеспечить соединение между лигандами M₁ и атомом N на азотистом остове, а также чтобы создать стерическое взаимное расположение среди лигандов M₁, более подходящее для связывания лигандов M₁ с рецептором асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК имеет структуру, представленную Формулой (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421) или (422):

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) может быть соединен с любым возможным положением в последовательности миРНК. Например, атом Р в Формуле (А59) может быть соединен с любым нуклеотидом в смысловой или антисмысловой цепи миРНК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) соединен с любым нуклеотидом в смысловой цепи миРНК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) может быть соединен с концом смысловой или антисмысловой цепи миРНК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) соединен с концом смысловой цепи ми РНК. Указанный конец относится к первым 4 нуклеотидам, отсчитанным от одного конца смысловой или антисмысловой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) соединен с любым концом смысловой цепи или антисмысловой цепи миРНК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) соединен с 3'-концом смысловой цепи миРНК. В случае если атом Р в Формуле (А59) соединен с вышеуказанным положением в смысловой цепи миРНК, после проникновения в клетки, конъюгат Формулы (308) может высвобождать отдельную антисмысловую цепь миРНК во время раскручивания, что блокирует трансляцию мРНК PCSK9 в белок и ингибирует экспрессию гена PCSK9.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) может быть соединен с любым возможным положением нуклеотида в миРНК, представленной Nu, например, с положением 5', 2' или 3' или с основанием нуклеотида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) может быть соединен с положением 2', 3' или 5' нуклеотида в миРНК путем образования сложной фосфодиэфирной связи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) соединен с атомом кислорода, образованным в результате депротонирования 3'-гидроксила нуклеотида на 3'-конце смысловой цепи в миРНК (в таком случае атом Р в Формуле (А59) также называют атомом Р в фосфатной группе миРНК), или атом Р в Формуле (А59) соединен с нуклеотидом путем замещения атома водорода в 2'-гидроксиле нуклеотида смысловой цепи в миРНК, или атом Р в Формуле (А59) соединен с нуклеотидом путем замещения атома водорода в 5'-гидроксиле нуклеотида на 5'-конце смысловой цепи в миРНК.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляет значительно улучшенную стабильность в сыворотке и более низкий нецелевой эффект без существенного снижения активности подавления в отношении мРНК PCSK9 и, кроме того, проявляет более высокое ингибирующее действие на липиды крови. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению могут представлять собой любые ми РНК, представленные в Таблице 1: Конъюгаты, содержащие эти миРНК, проявляют более высокую активность подавления в отношении мРНК PCSK9.

В миРНК или конъюгате миРНК согласно настоящему изобретению каждая пара смежных нуклеотидов соединена за счет сложной фосфодиэфирной связи или сложной фосфотиодиэфирной связи. Немостиковый атом кислорода или серы в сложной фосфодиэфирной связи или сложной фосфотиодиэфирной связи заряжен отрицательно и может присутствовать в форме гидроксила или сульфгидрила. Кроме того, ион водорода в гидроксиле или сульфгидриле может быть частично или полностью замещен катионом. Катион может представлять собой любой катион, такой как катион металла, катион аммония NH4⁺ или органической катион аммония. Для того чтобы повысить растворимость, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, катион выбран из одного или более из катиона щелочного металла, катиона аммония, образованного третичным амином, и катиона четвертичного аммония. Ион щелочного металла может представлять собой K⁺ и/или Na⁺, а катион, образованный третичным амином, может представлять собой катион аммония, образованный триэтиламином, и/или катион аммония, образованный N,N-диизопропилэтиламином. Таким образом, миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению может по меньшей мере частично присутствовать в форме соли. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения немостиковый атом кислорода или атом серы в сложной фосфодиэфирной связи или сложной фосфотиодиэфирной связи по меньшей мере частично связывается с ионом натрия, и, таким образом, миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению присутствует или частично присутствует в форме натриевой соли.

Специалистам в данной области техники хорошо известно, что модифицированный нуклеотид может быть введен в миРНК согласно настоящему изобретению с помощью нуклеозидного мономера с соответствующей модификацией. Способы получения нуклеозидного мономера, имеющего соответствующую модификацию, и способы введения модифицированного нуклеотида в миРНК также хорошо известны специалистам в данной области техники. Все модифицированные нуклеозидные мономеры могут быть доступны коммерчески или получены с помощью известных способов.

Получение конъюгата миРНК, представленного Формулой (308)

Конъюгат миРНК, представленный Формулой (308), может быть получен с помощью любых соответствующих путей синтеза.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК, представленный Формулой (308) может быть получен с помощью следующего способа, включающего: последовательное соединение нуклеозидных мономеров в направлении от 3' к 5' в соответствии с типом и последовательностью нуклеотидов в смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК, соответственно, в условии твердофазного фосфоамидитного синтеза, причем стадия соединения каждого нуклеозидного мономера включает четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления или сульфуризации; выделение смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК; и ренатурацию; причем миРНК представляет собой описанную выше миРНК согласно настоящему изобретению.

Кроме того, способ дополнительно включает: приведение соединения, представленного Формулой (321), в контакт с нуклеозидным мономером или нуклеотидной последовательностью, соединенной с твердофазной подложкой, в условии реакции связывания и в присутствии связывающего агента, что приводит к связыванию соединения, представленного Формулой (321), с нуклеотидной последовательностью за счет реакции связывания. Далее по тексту соединение, представленное Формулой (321), также упоминается как конъюгирующая молекула.

где

R₄ представляет собой группу, способную связываться с миРНК, представленной Nu, в соединении Формулы (308). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ представляет собой группу, способную связываться с миРНК, представленной Nu, за счет ковалентной связи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ представляет собой группу, содержащую любую функциональную группу, которая может быть конъюгирована с миРНК, представленной Nu, за счет сложной фосфодиэфирной связи с помощью реакции;

каждый S₁ независимо представляет собой группу, образованную замещением всего активного гидроксила в M₁ группой YCOO^-, где каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из метила, трифторметила, дифторметила, монофторметила, трихлорметила, дихлорметила, монохлорметила, этила, н-пропила, изопропила, фенила, галогенфенила и алкилфенила.

определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, R₁₅, L₁ и M₁, соответственно, описаны выше.

R₄ выбран, чтобы обеспечить соединение с атомом N на азотистом остове и обеспечить подходящий реакционный сайт для синтеза конъюгата миРНК, представленного Формулой (308). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ содержит соединяющую группу R₂ или защищенную соединяющую группу R₂ и может образовывать функциональную группу представленную Формулой (А59), с миРНК за счет реакции.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ содержит первую функциональную группу, которая может реагировать с группой на миРНК, представленной Nu, или нуклеозидном мономере с образованием сложного фосфитного эфира, и вторую функциональную группу, которая может образовывать ковалентную связь с гидроксигруппой или аминогруппой, или содержит твердофазную подложку, присоединенную за счет ковалентной связи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая функциональная группа представляет собой фосфоамидит, гидроксил или защищенный гидроксил. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая функциональная группа представляет собой фосфоамидит, карбоксил или карбоксилатную соль. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая функциональная группа представляет собой твердофазную подложку, соединенную с остальной частью молекулы за счет ковалентной связи, которая образована гидроксигруппой или аминогруппой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения твердофазная подложка соединена за счет сложной фосфоэфирной связи, сложной карбоксиэфирной связи или амидной связи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения твердофазная подложка представляет собой смолу.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая функциональная группа содержит гидрокси, -OR_k или группу, представленную Формулой (С3); вторая функциональная группа содержит группу представленную Формулой (С1), (С2), (С3), (С1') или (С3'):

в которых q₁ представляет собой целое число от 1 до 4, X представляет собой О или NH, М⁺ представляет собой катион, R_k представляет собой защищающую гидроксил группу, SPS представляет собой твердофазную подложку и представляет собой положение, в котором группа ковалентно присоединена.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая функциональная группа содержит фосфоамидитную функциональную группу, такую как группа, представленная Формулой (С3). Фосфоамидитная группа может образовывать сложный фосфитный эфир с гидроксилом в любом положении на нуклеотиде (таком как 2'- или 3'-гидрокси) с помощью реакции связывания, а сложный фосфитный эфир может образовывать сложную фосфодиэфирную связь или сложную фосфотиоэфирную связь, представленную Формулой (А59), за счет окисления или сульфуризации, так, чтобы конъюгировать конъюгирующую молекулу с миРНК. В настоящем документе, даже если вторая функциональная группа не существует, соединение, представленное Формулой (321), все же может быть конъюгировано с нуклеотидом, без отрицательного влияния на получение конъюгата миРНК, представленного Формулой (308). При таких обстоятельствах, после получения смысловой или антисмысловой цепи миРНК с помощью такого способа как твердофазный фосфоамидитный синтез, соединение, представленное Формулой (321), подвергают взаимодействию с гидроксилом на концевом нуклеотиде нуклеотидной последовательности и полученный сложный фосфитный эфир образует сложную фосфодиэфирную связь или фосфотиоатную связь в результате последующего окисления или сульфуризации, что приводит к конъюгации соединения, представленного Формулой (321), с миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая функциональная группа содержит защищенную гидроксигруппу. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая функциональная группа содержит группу, которая может реагировать с твердофазной подложкой, чтобы обеспечить конъюгирующую молекулу, содержащую твердофазную подложку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая функциональная группа содержит карбоксил, карбоксилат или фосфоамидит, например, функциональная группа, представленная Формулой (С1), (С2) или (С3). Если вторая функциональная группа содержит карбоксил или карбоксилат, соединение, представленное Формулой (321), может реагировать за счет реакции этерификации или амидирования с гидрокси- или аминогруппой на твердофазной подложке (такой как смола) с образованием конъюгирующей молекулы, содержащей твердофазную подложку, присоединенную за счет карбоксилатной сложноэфирной связи или амидной связи. Если вторая функциональная группа содержит фосфоамидитную функциональную группу, соединение, представленное Формулой (321), может быть связано с гидрокси группой на универсальной твердофазной подложке (такой как смола), и путем окисления образует конъюгирующую молекулу, содержащую твердофазную подложку, присоединенную за счет сложной фосфодиэфирной связи. Затем, начиная с указанного выше продукта, соединенного с твердофазной подложкой, нуклеозидные мономеры последовательно соединяют с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза с получением тем самым смысловой или антисмысловой цепи миРНК, соединенной с конъюгирующей группой. Во время твердофазного фосфоамидитного синтеза снимают защиту с первой функциональной группы, а затем связывают ее с фосфоамидитной группой на нуклеозидном мономере в условии реакции связывания.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая функциональная группа содержит гид рокси группу или защищенную гидроксигруппу, а вторая функциональная группа содержит твердофазную подложку, присоединенную за счет сложной карбоксиэфирной связи, амидной связи или сложной фосфоэфирной связи, как представлено Формулой (С1'), или (С3'). При таких обстоятельствах, начиная с соединения, представленного Формулой (321), вместо твердофазной подложки, нуклеозидные мономеры последовательно соединяют с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза с получением тем самым смысловой или антисмысловой цепи миРНК, соединенной с конъюгирующей группой.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения карбоксилат может быть представлен как -СОО^-М⁺, где М⁺ представляет собой катион, такой как один из катиона металла, катиона аммония NH₄ ⁺ и органического катиона аммония. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения катион металла может представлять собой катион щелочного металла, такой как K⁺ или Na⁺. Чтобы повысить растворимость и облегчить реакцию, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, органический катион аммония представляет собой катион аммония, образованный третичным амином, или катион четвертичного аммония, такой как катион аммония, образованный триэтиламином или N,N-диизопропилэтиламином. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения карбоксилат представляет собой карбоксилат триэтиламина или карбоксилат N,N-диизопропилэтиламина.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ содержит структуру, представленную Формулой (В9), (В10), (В9'), (В10'), (В11), (В12), (В11') или (В12'):

в которых q₁ представляет собой целое число от 1 до 4, q₂ представляет собой целое число от 1 до 10, X представляет собой О или NH, М⁺ представляет собой катион, R_k представляет собой защищающую гидроксил группу, SPS представляет собой твердофазную подложку и представляет собой положение, в котором группа ковалентно соединена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения q₁ равно 1 или 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения q₂ представляет собой целое число от 1 до 5. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ содержит структуру, представленную Формулой (В9) или (В10). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ содержит структуру, представленную Формулой (В11) или (В12).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R_k представляет собой один или более из Tr (тритил), MMTr (4-метокситритил), DMTr (4,4'-диметокситритил) и TMTr (4,4',4''-триметокситритил). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R_k может представлять собой DMTr, т.е. 4,4'-диметокситритил.

Определение L₁ описано выше.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ применяют для соединения лиганда M₁ с атомом N на азотистом остове, что обеспечивает функцию нацеливания на печень для конъюгата миРНК Формулы (308). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ содержит любую из Формул (А1)-(А26) или их комбинацию.

В соответствии с вариантами реализации, описанными выше, специалисты в данной области техники легко поймут, что по сравнению со способами твердофазного фосфоамидитного синтеза, хорошо известными в данной области техники, конъюгат миРНК Формулы (308), в котором конъюгирующая молекула соединена с любым возможным положением нуклеотидной последовательности, может быть получен с помощью вышеуказанной первой функциональной группы и необязательной второй функциональной группы. Например, конъюгирующая молекула соединена с концом нуклеотидной последовательности или с каждым концом нуклеотидной последовательности. Соответственно, если не указано иное, в следующем описании, касающемся получения конъюгата, при ссылке на такие реакции как «снятие защиты», «связывание», «кэпирование», «окисление», «сульфуризация» следует понимать, что к этим реакциям также будут применимы условия реакции и агенты, участвующие в способах твердофазного фосфоамидитного синтеза, хорошо известные в данной области техники. Примерные условия реакции и агенты будут подробно описаны ниже.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый S₁ независимо представляет собой M₁. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый S₁ независимо представляет собой группу, образованную в результате защиты по меньшей мере одного активного гидроксила в M₁ с применением защищающей гидроксил группы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый S₁ независимо представляет собой группу, образованную в результате защиты всех активных гидроксилов в M₁ с применением защищающих гидроксил групп. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая защищающая гидроксил группа, известная специалистам в данной области техники, может применяться для защиты активного гидроксила на M₁. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения защищенный гидроксил выражается Формулой YCOO^-, где каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из С₁-С₁₀ алкила и С₆-С₁₀ арила, которая необязательно замещена одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена и C₁-C₆ алкила. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из метила, трифторметила, дифторметила, монофторметила, трихлорметила, дихлорметила, монохлорметила, этила, н-пропила, изопропила, фенила, галогенфенила и C₁-C₆ алкилфенила.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый S₁ независимо выбран из группы, состоящей из Формул (А46) - (А54):

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения S₁ представляет собой (А49) или (А50).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый Y независимо выбран из одного из метила, трифторметила, дифторметила, монофторметила, трихлорметила, дихлорметила, монохлорметила, этила, н-пропила, изопропила, фенила, галогенфенила и алкилфенила. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Y представляет собой метил.

Как упоминалось ранее, способ получения конъюгата миРНК Формулы (308) дополнительно включает следующие стадии: синтез другой цепи миРНК (например, если смысловая цепь миРНК, соединенная с конъюгирующей молекулой, синтезируется на вышеуказанной стадии, способ дополнительно включает синтез антисмысловой цепи миРНК методом твердофазного синтеза и наоборот); выделение смысловой цепи и антисмысловой цепи; и ренатурацию. В частности, на стадии выделения твердофазную подложку, соединенную с нуклеотидной последовательностью и/или конъюгирующей молекулой, отщепляют и в это же время удаляют необходимую защитную группу (в этом случае каждая группа S₁ в соединении, представленном Формулой (321), превращается в соответствующий лиганд M₁), что обеспечивает смысловую цепь (или антисмысловую цепь) миРНК, соединенную с конъюгирующей молекулой и соответствующей антисмысловой цепью (или смысловой цепью). Смысловую цепь и антисмысловую цепь ренатурируют с образованием двухцепочечной РНК-структуры, что обеспечивает конъюгат миРНК, представленный Формулой (308).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ получения конъюгата миРНК Формулы (308) включает следующие стадии: приведение соединения, представленного Формулой (321), в контакт с первым нуклеозидным мономером на 3'-конце смысловой или антисмысловой цепи в условии реакции связывания в присутствии связывающего агента, что обеспечивает связывание соединения, представленного Формулой (321), с первым нуклеотидом в последовательности; последовательное соединение нуклеозидных мономеров в направлении от 3' к 5' для синтеза смысловой или антисмысловой цепи миРНК в соответствии с требуемым типом и последовательностью нуклеотидов смысловой или антисмысловой цепи в условии твердофазного фосфоамидитного синтеза; причем соединение Формулы (321) представляет собой соединение, в котором R₄ содержит первую функциональную группу, содержащую защищенную гидрокси группу, и вторую функциональную группу, содержащую группу, представленную Формулой (С1') или (С3'), при этом перед связыванием с первым нуклеозидным мономером с соединения Формулы (321) снимают защиту; и соединение каждого нуклеозидного мономера включает четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, копирования и окисления или сульфуризации; с получением таким образом смысловой или антисмысловой цепи нуклеиновой кислоты, соединенной с конъюгирующей молекулой; последовательное соединение нуклеозидных мономеров в направлении от 3' к 5' для синтеза смысловой или антисмысловой цепи нуклеиновой кислоты в соответствии с типом и последовательностью нуклеотидов смысловой или антисмысловой цепи в условии твердофазного фосфоамидитного синтеза; причем соединение каждого нуклеозидного мономера включает четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, копирования и окисления или сульфуризации; удаление защитных групп и отщепление твердофазной подложки; выделение и очистку смысловой цепи и антисмысловой цепи нуклеиновой кислоты; и ренатурацию.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ получения конъюгата миРНК Формулы (308) включает следующие стадии: последовательное соединение нуклеозидных мономеров в направлении от 3' к 5' для синтеза смысловой цепи или антисмысловой цепи в соответствии с типом и последовательностью нуклеотидов смысловой или антисмысловой цепи в двухцепочечном олигонуклеотиде; причем соединение каждого нуклеозидного мономера включает четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, копирования и окисления или сульфуризации с получением таким образом смысловой цепи, соединенной с твердофазной подложкой, и антисмысловой цепи, соединенной с твердофазной подложкой; приведение соединения, представленного Формулой (321), в контакт со смысловой цепью, соединенной с твердофазной подложкой, или антисмысловой цепью, соединенной с твердофазной подложкой, в условии реакции связывания в присутствии связывающего агента, что приводит к связыванию соединения, представленного Формулой (321), со смысловой цепью или антисмысловой цепью; причем соединение Формулы (321) представляет собой соединение, в котором R₄ содержит фосфоамидитную группу в качестве первой функциональной группы; удаление защитных групп и отщепление твердофазной подложки; соответственно, выделение и очистку смысловой или антисмысловой цепи миРНК; и ренатурацию; при этом смысловая или антисмысловая цепь миРНК соединена с конъюгирующей молекулой.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) соединен с 3'-концом смысловой цепи миРНК, и способ получения конъюгата миРНК Формулы (308) включает:

(1) удаление защищающей гидроксил группы R_k в соединении Формулы (321) при этом соединение Формулы (321) представляет собой соединение, в котором R₄ содержит первую функциональную группу, которая содержит защищенную гидроксигруппу OR_k, и вторую функциональную группу, которая содержит структуру, представленную Формулой (С1') или (С3'); приведение продукта со снятой защитой в контакт с нуклеозидным мономером с получением нуклеозидного мономера, соединенного с твердофазной подложкой за счет конъюгирующей молекулы, в условии реакции связывания в присутствии связывающего агента;

(2) начиная с нуклеозидного мономера, соединенного с твердофазной подложкой за счет конъюгирующей молекулы, синтез смысловой цепи миРНК в направлении от 3' к 5' с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза;

(3) синтез антисмысловой цепи миРНК с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза; и

(4) выделение смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК и их ренатурацию с получением конъюгата миРНК Формулы (308).

При этом на стадии (1) способ удаления защитной группы R_k в соединении Формулы (321) включает приведение соединения Формулы (321) в контакт с агентом для снятия защиты в условии снятия защиты. Условие снятия защиты включает температуру 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 30-300 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 50-150 секунд. Агент для снятия защиты может быть выбран из одной или более из трифторуксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты, дихлоруксусной кислоты и монохлоруксусной кислоты, и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения агент для снятия защиты представляет собой дихлоруксусную кислоту. Молярное отношение агента для снятия защиты к соединению, представленному Формулой (321), составляет от 10:1 до 1000:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 50:1 до 500:1.

Условие реакции связывания и связывающий агент могут представлять собой любые условия и агенты, подходящие для вышеуказанной реакции связывания. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять те же условия и агент, как и в реакции связывания в способе твердофазного синтеза.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакции связывания включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С. Молярное отношение соединения Формулы (321) к нуклеозидному мономеру составляет от 1:1 до 1:50 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:2 до 1:5. Молярное отношение соединения Формулы (321) к связывающему агенту может составлять от 1:1 до 1:50 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:3 до 1:10. Время реакции составляет 200-3000 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 500-1500 секунд. Связывающий агент выбран из одного или более из 1Н-тетразола, 5-этилтио-1Н-тетразола и 5-бензилтио-1Н-тетразола и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой 5-этилтио-1Н-тетразол. Реакцию связывания можно выполнять в органическом растворителе. Органический растворитель выбран из одного или более из безводного ацетонитрила, безводного ДМФА и безводного дихлорметана и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой безводный ацетонитрил. Количество органического растворителя составляет 3-50 л/моль и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 5-20 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (321).

На стадии (2) смысловую цепь SS конъюгата миРНК синтезируют в направлении от 3' к 5' с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза, начиная с нуклеозидного мономера, соединенного с твердофазной подложкой за счет конъюгирующей молекулы, полученной на предшествующей стадии. В этом случае конъюгирующая молекула соединена с 3'-концом полученной смысловой цепи.

В качестве других условий твердофазного синтеза на стадиях (2) и (3), включая условие снятия защиты с нуклеозидного мономера, тип и количество агента для снятия защиты, условие реакции связывания, тип и количество связывающего агента, условие реакции копирования, тип и количество копирующего агента, условие реакции окисления, тип и количество окисляющего агента, условие реакции сульфуризации, а также тип и количество агента для сульфуризации, можно применять различные агенты, количества и условия, общепринятые в данной области техники.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, например, твердофазный синтез на стадиях (2) и (3), можно применять следующие условия:

Условие снятия защиты для нуклеозидного мономера включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 30-300 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 50-150 секунд. Агент для снятия защиты может быть выбран из одной или более из трифторуксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты, дихлоруксусной кислоты и монохлоруксусной кислоты и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой дихлоруксусную кислоту. Молярное отношение агента для снятия защиты к защитной группе 4,4'-диметокситритил на твердофазной подложке составляет от 2:1 до 100:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 3:1 до 50:1.

Условие реакции связывания включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С. Молярное отношение последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, к нуклеозидному мономеру составляет от 1:1 до 1:50 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:5 до 1:15. Молярное отношение последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, к связывающему агенту составляет от 1:1 до 1:100 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составляет от 1:50 до 1:80. Выбор времени реакции и связывающего агента может быть таким же, как указано выше.

Условие реакции копирования включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 5-500 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 10-100 секунд. Выбор копирующего агента может быть таким же, как указано выше. Молярное отношение общего количества копирующего агента к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, может составлять от 1:100 до 100:1 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составляет от 1:10 до 10:1. В случае если в качестве копирующего агента применяют эквимолярное количество уксусного ангидрида и N-метилимидазола, молярное отношение уксусного ангидрида, N-метилимидазола и последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, может составлять 1:1:10-10:10:1 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составляет 1:1:2-2:2:1.

Условие реакции окисления включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 1-100 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 5-50 секунд. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения окисляющий агент представляет собой йод (согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обеспечен в виде раствора йода в воде). Молярное отношение окисляющего агента к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой на стадии связывания, может составлять от 1:1 до 100:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 5:1 до 50:1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения реакцию окисления выполняют в смешанном растворителе, в котором соотношение тетрагидрофуран : вода : пиридин составляет 3:1:1-1:1:3. Условие реакции сульфуризации включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 50-2000 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 100-1000 секунд. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения агент для сульфуризации представляет собой ксантановый гидрид. Молярное отношение агента для сульфуризации к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой на стадии связывания, составляет от 10:1 до 1000:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 10:1 до 500:1 Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения реакцию сульфуризации выполняют в смешанном растворителе, в котором соотношение ацетонитрил : пиридин составляет 1:3-3:1.

Способ дополнительно включает выделение смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК после соединения всех нуклеозидных мономеров и перед ренатурацией. Способы выделения хорошо известны специалистам в данной области техники и обычно включают отщепление синтезированной нуклеотидной последовательности от твердофазной подложки, удаление защитных групп на основаниях, фосфатных группах и лигандах, очистку и обессоливание.

Общепринятые способы отщепления и снятия защиты при синтезе миРНК можно применять для отщепления синтезированной нуклеотидной последовательности от твердофазной подложки и удаления защитных групп на основаниях, фосфатных группах и лигандах. Например, приведение полученной нуклеотидной последовательности, соединенной с твердофазной подложкой, в контакт с концентрированным водным раствором аммиака; во время снятия защиты защитная группа YCOO^- в группах (А46)-(А54) превращается в гидроксильную группу, и, таким образом, группы S₁ превращаются в соответствующие группы M₁, что обеспечивает конъюгат, представленный Формулой (308); причем концентрированный водный раствор аммиака может представлять собой водный раствор аммиака с концентрацией 25-30% по массе. Количество концентрированного водного раствора аммиака может составлять от 0,2 мл/мкмоль до 0,8 мл/мкмоль по отношению к целевой миРНК.

Если на синтезированной нуклеотидной последовательности имеется по меньшей мере несколько защит 2'-TBDMS, способ дополнительно включает приведение нуклеотидной последовательности, удаленной от твердофазной подложки, в контакт с тригидрофторидом триэтиламина для снятия защиты 2'-TBDMS. В настоящем документе полученная целевая последовательность миРНК содержит соответствующий нуклеозид, имеющий свободный 2'-гидроксил. Количество чистого тригидрофторида триэтиламина составляет 0,4 мл/мкмоль -1,0 мл/мкмоль по отношению к целевой последовательности миРНК. Таким образом, может быть получен конъюгат миРНК, представленный Формулой (1).

Способы очистки и обессоливания хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, очистку нуклеиновой кислоты можно выполнять с применением колонки для очистки методом препаративной ионной хроматографии с градиентным элюированием NaBr или NaCl; после сбора и объединения продукта обессоливание можно выполнять с применением колонки для очистки методом хроматографии с обращенной фазой.

Немостиковый атом кислорода или серы в сложной фосфодиэфирной связи или сложной фосфотиодиэфирной связи между нуклеотидами в полученном конъюгате миРНК Формулы (308) по существу связывается с ионом натрия, и конъюгат миРНК Формулы (308) по существу присутствует в форме натриевой соли. Можно применять хорошо известные ионообменные способы, в которых ион натрия может быть заменен ионом водорода и/или другими катионами, что обеспечивает другие формы конъюгатов миРНК Формулы (308). Катионы представляют собой те, которые описаны выше.

Во время синтеза чистоту и молекулярную массу последовательности нуклеиновой кислоты можно определить в любое время, чтобы лучше контролировать качество синтеза. Такие способы определения хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, чистоту нуклеиновой кислоты можно определить с помощью ионообменной хроматографии, а молекулярную массу можно определить с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС).

Способы ренатурации также хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, синтезированная смысловая цепь (SS-цепь) и антисмысловая цепь (AS-цепь) могут быть просто смешаны в воде для инъекции в эквимолярном отношении, нагреты до 70-95°С, а затем охлаждены при комнатной температуре с образованием двухцепочечной структуры за счет водородной связи. Следовательно, может быть получен второй конъюгат ми РНК Формулы (308).

После получения конъюгат, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК Формулы (308), синтезированный таким способом, также можно охарактеризовать с помощью средств, таких как определение молекулярной массы с применением таких способов как ЖХ-МС, чтобы подтвердить, что синтезированный конъюгат миРНК представляет собой разработанный конъюгат миРНК Формулы (308), представляющий интерес, и последовательность синтезированной миРНК представляет собой последовательность миРНК, которую необходимо синтезировать, например, представляет собой одну из последовательностей, перечисленных в Таблицах 1а-1g выше.

Соединение, представленное Формулой (321), может быть получено с помощью следующего способа, включающего: приведение соединения, представленного Формулой (313), в контакт с циклическим ангидридом в органическом растворителе в условии реакции этерификации в присутствии основания и катализатора этерификации; выделение соединения, представленного Формулой (321), с помощью ионного обмена:

при этом определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, R₁₅, L₁ и S₁, соответственно, описаны выше.

R₆ представляет собой группу для обеспечения R₄ Формулы (321); Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₆ имеет структуру, представленную Формулой (А61):

где R_i представляет собой любую группу, способную соединяться с атомом N на азотистом остове, соединяться с R_kO и соединяться со свободной гидроксигруппой; R_k представляет собой защищающую гидроксил группу. В этом случае получают соединение, представленное Формулой (321), где R₄ содержит первую функциональную группу в качестве защищающей гидроксил группы и вторую функциональную группу, содержащую группу, представленную Формулой (С1) или (С2).

Условие реакции этерификации включает температуру реакции 0-100°С и время реакции 8-48 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакции этерификации включает температуру реакции 10-40°С и время реакции 20-30 часов.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель содержит один или более из эпоксидного растворителя, простого эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран, простой эфирный растворитель представляет собой простой диэтиловый эфир и/или простой трет-бутилметиловый эфир, галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой дихлорметан. Количество органического растворителя составляет 3-50 л/моль и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 5-20 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (313).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения циклический ангидрид представляет собой один из янтарного ангидрида, глутарового ангидрида, адипинового ангидрида или пимелинового ангидрида, и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения циклический ангидрид представляет собой янтарный ангидрид. Молярное отношение циклического ангидрида к соединению, представленному Формулой (313), составляет от 1:1 до 10:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 2:1 до 5:1.

Катализатор этерификации может представлять собой любой катализатор, способный катализировать этерификацию, такой как 4-диметиламинопиридин. Молярное отношение катализатора к соединению, представленному Формулой (313), составляет от 1:1 до 10:1 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составляет от 2:1 до 5:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения основание может представлять собой любое неорганическое основание, органическое основание или их комбинацию. Учитывая растворимость и стабильность продукта, основание представляет собой органическое основание третичного амина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органическое основание третичного амина представляет собой триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин. Молярное отношение органического основания третичного амина к соединению, представленному Формулой (313), составляет от 1:1 до 20:1 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составляет от 3:1 до 10:1.

Ионный обмен выполняет функцию превращения соединения, представленного Формулой (321), в целевую форму карбоновой кислоты или соли карбоновой кислоты, и способы ионного обмена хорошо известны специалистам в данной области техники. Указанная выше конъюгирующая молекула, в которой катион представляет собой М⁺, может быть получена с применением подходящего ионообменного раствора и условия ионного обмена, которые не описаны подробно в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в реакции ионного обмена применяют раствор фосфата триэтиламина, и концентрация раствора фосфата триэтиламина составляет 0,2-0,8 М. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения концентрация раствора фосфата триэтиламина составляет 0,4-0,6 М, и количество раствора фосфата триэтиламина составляет 3-6 л/моль, а в дополнительном варианте реализации 4-5 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (313).

Соединение, представленное Формулой (321), может быть выделено из реакционной смеси с применением любых подходящих способов выделения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, представленное Формулой (321), может быть выделено с помощью удаления растворителя за счет выпаривания с последующей хроматографией. Например, следующие хроматографические условия могут применяться для выделения: (1) очистка с обычной фазой: силикагелевый наполнитель с 200-300 меш, градиентное элюирование триэтиламином в дихлорметан : метанол = 100:18-100:20; или (2) очистка с обращенной фазой: наполнитель с обращенной фазой С18 и С8, градиентное элюирование метанол : ацетонитрил = 0,1:1-1:0,1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения растворитель может быть непосредственно удален с получением неочищенного продукта соединения, представленного Формулой (321), который может быть непосредственно использован в последующих реакциях.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ получения соединения, представленного Формулой (321), дополнительно включает: приведение продукта, полученного в результате вышеуказанной реакции ионного обмена, в контакт с твердофазной подложкой с амино- или гидроксигруппами в органическом растворителе в условии реакции конденсации в присутствии конденсирующего агента и органического основания третичного амина. В этом случае получают соединение, представленное Формулой (321), где R₄ содержит первую функциональную группу, содержащую защищающую гидроксил группу, и вторую функциональную группу, имеющую структуру, представленную Формулой (С1').

Твердофазная подложка представляет собой одну из подложек, применяемых в твердофазном синтезе миРНК, некоторые из которых хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, твердофазная подложка может быть выбрана из твердофазных подложек, содержащих активную функциональную гидрокси- или аминогруппу, и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения твердофазная подложка представляет собой амино или гидрокси-смолу. Амино- или гидрокси-смола, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, имеет следующие параметры: размер частиц 100-400 меш и поверхностное содержание аминогрупп или гидроксигрупп 0,2-0,5 ммоль/г. Отношение соединения, представленного Формулой (321), к твердофазной подложке составляет от 10 мкмоль соединения на грамм твердофазной подложки (мкмоль/г) до 400 мкмоль/г. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отношение соединения Формулы (321) к твердофазной подложке составляет от 50 мкмоль/г до 200 мкмоль/г.

Органический растворитель может представлять собой любой подходящий растворитель или смешанные растворители, известные специалистам в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой один или более из ацетонитрила, эпоксидного растворителя, простого эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран; простой эфирный растворитель представляет собой простой диэтиловый эфир и/или простой трет-бутилметило вый эфир; галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой ацетонитрил. Количество органического растворителя составляет 20-200 л/моль, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 50-100 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (321).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конденсирующий агент может представлять собой гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония (РуВор), 3-диэтоксифосфорил-1,2,3-бензотризин-4(3Н)-он (DEPBT) и/или гексафторфосфат О-бензотриазолтетраметилурония. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конденсирующий агент представляет собой гексафторфосфат О-бензотриазолтетраметилурония. Молярное отношение конденсирующего агента к соединению, представленному Формулой (321), составляет от 1:1 до 20:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:1 до 5:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органическое основание третичного амина представляет собой триэтиламин и/или N,N-диизопропилэтиламин и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, N,N-диизопропилэтиламин. Молярное отношение органического основания третичного амина к соединению, представленному Формулой (321), составляет от 1:1 до 20:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:1 до 5:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ получения соединения, представленного Формулой (321), дополнительно включает: приведение полученного продукта конденсации в контакт с копирующим агентом и катализатором ацилирования в органическом растворителе в условии реакции кэпирования и выделение соединения, представленного Формулой (321). Реакция кэпирования используется для удаления любой активной функциональной группы, которая не вступает в реакцию полностью, чтобы избежать образования ненужных побочных продуктов в последующих реакциях. Условие реакции кэпирования включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 1-10 часов и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 3-6 часов. Кэпирующий агент может представлять собой кэпирующий агент, применяемый в твердофазном синтезе миРНК, который хорошо известен специалистам в данной области техники.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кэпирующий агент состоит из кэпирующего агента 1 (сар1) и кэпирующего агента 2 (сар2). Сар1 представляет собой N-метилимидазол и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обеспечен в виде смешанного раствора N-метилимидазола в пиридине/ацетонитриле, причем объемное отношение пиридина к ацетонитрилу составляет от 1:10 до 1:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:3 до 1:1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отношение общего объема пиридина и ацетонитрила к объему N-метилимидазола составляет от 1:1 до 10:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 3:1 до 7:1. Сар2 представляет собой уксусный ангидрид и в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения сар2 обеспечен в виде раствора уксусного ангидрида в ацетонитриле, причем объемное отношение уксусного ангидрида к ацетонитрилу составляет от 1:1 до 1:10 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:2 до 1:6.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отношение объема смешанного раствора N-метилимидазола в пиридине/ацетонитриле к массе соединения Формулы (321) составляет 5 мл/г-50 мл/г и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15 мл/г-30 мл/г. Отношение объема раствора уксусного ангидрида в ацетонитриле к массе соединения Формулы (321) составляет 0,5 мл/г-10 мл/г и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 1 мл/г-5 мл/г.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кэпирующий агент содержит эквимолярное количество уксусного ангидрида и N-метилимидазола. Органический растворитель представляет собой один или более из ацетонитрила, эпоксидного растворителя, простого эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой ацетонитрил. Количество органического растворителя составляет 10-50 л/моль и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 5-30 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (321).

В некоторых вариантах реализации изобретения катализатор ацилирования может быть выбран из любого катализатора, который можно применять для конденсации путем этерификации или амидной конденсации, такого как щелочные гетероциклические соединения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения катализатор ацилирования представляет собой 4-диметиламинопиридин. Массовое отношение катализатора к соединению, представленному Формулой (321), может составлять от 0,001:1 до 1:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 0,01:1 до 0,1:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, представленное Формулой (321), может быть выделено из реакционной смеси с помощью любых подходящих способов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение Формулы (321) может быть получено путем тщательной промывки органическим растворителем и фильтрации для удаления не вступивших в реакцию реагентов, избыточного кэпирующего агента и других примесей, при этом органический растворитель выбран из ацетонитрила, дихлорметана или метанола. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой ацетонитрил.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения получение конъюгирующей молекулы, представленной Формулой (321), включает приведение соединения, представленного Формулой (313), в контакт с фосфодиамидитом в органическом растворителе в условии реакции связывания в присутствии связывающего агента, и выделение соединения, представленного Формулой (321). В этом случае получают соединение, представленное Формулой (321), в котором R4 содержит первую функциональную группу, содержащую защищающую гидроксил группу, и вторую функциональную группу, содержащую структуру, представленную Формулой (С3).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакция связывания включает температуру реакции 0-50°С, например, 15-35°С; молярное отношение соединения Формулы (313) к фосфодиамидиту может составлять от 1:1 до 1:50, например, от 1:5 до 1:15; молярное отношение соединения Формулы (313) к связывающему агенту может составлять от 1:1 до 1:100, например, от 1:50 до 1:80; и время реакции может составлять 200-3000 секунд, например, 500-1500 секунд. Фосфодиамидит может представлять собой, например, бис(диизопропиламино)(2-цианоэтокси)фосфин, который может быть доступен коммерчески или синтезирован в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Связывающий агент выбран из одного или более из 1Н-тетразола, 5-этилтио-1Н-тетразола и 5-бензилтио-1Н-тетразола, например, 5-этилтио-1Н-тетразол. Реакцию связывания можно выполнять в органическом растворителе. Органический растворитель выбран из одного или более из безводного ацетонитрила, безводного ДМФА и безводного дихлорметана, например, представляет собой безводный ацетонитрил. Количество органического растворителя может составлять 3-50 л/моль, например, 5-20 л/моль, по отношению к соединению, представленному Формулой (313). При выполнении реакции связывания гидроксигруппа в соединении Формулы (313) реагирует с фосфодиамидитом с образованием фосфоамидитной группы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения растворитель может быть непосредственно удален с получением неочищенного продукта соединения, представленного Формулой (321), который может быть непосредственно использован в последующих реакциях.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ получения соединения, представленного Формулой (321), дополнительно включает: приведение выделенного продукта в контакт с твердофазной подложкой с гидроксильными группами в органическом растворителе в условии реакции связывания в присутствии связывающего агента с последующим копированием, окислением и выделением, чтобы получить соединение, представленное Формулой (321), где R₄ представляет собой первую функциональную группу, содержащую защищающую гидроксил группу, и вторую функциональную группу, имеющую структуру, представленную Формулой (С3').

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения твердофазная подложка представляет собой подложку, хорошо известную в области твердофазного синтеза нуклеиновой кислоты, такую как коммерчески доступная универсальная твердофазная подложка со снятой защитой, например, подложка для синтеза олигонуклеотидов (NittoPhase®HL UnyLinker™ 300, Kinovate Life Sciences, представленная Формулой (B80)):

Реакция снятия защиты хорошо известна в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие снятия защиты включает температуру 0-50°С, например, 15-35°С, и время реакции 30-300 секунд, например, 50-150 секунд. Агент для снятия защиты может быть выбран из одной или более из трифторуксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты, дихлоруксусной кислоты и монохлоруксусной кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения агент для снятия защиты представляет собой дихлоруксусную кислоту. Молярное отношение агента для снятия защиты к защитной группе -DMTr (4,4'-диметокситритил) на твердофазной подложке может составлять от 2:1 до 100:1, например, от 3:1 до 50:1. С помощью такого удаления защиты на поверхности твердофазной подложки получают реакционноспособные свободные гидроксигруппы, чтобы облегчить последующую реакцию связывания.

Условие реакции связывания и связывающий агент могут быть выбраны, как указано выше. При такой реакции связывания свободные гидроксигруппы, образованные в реакции снятия защиты, реагируют с фосфоамидитными группами с образованием сложноэфирной фосфитной связи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакции кэпирования включает температуру 0-50°С, например, 15-35°С, и время реакции 5-500 секунд, например, 10-100 секунд. Реакцию кэпирования выполняют в присутствии кэпирующего агента. Выбор и количество кэпирующего агента описаны выше.

Условие реакции окисления включает температуру 0-50°С, например, 15-35°С, и время реакции 1-100 секунд, например, 5-50 секунд. Окисляющий агент может представлять собой, например, йод (согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обеспечен в виде раствора йода в воде). Молярное отношение последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, к нуклеозидному мономеру составляет от 1:1 до 100:1, предпочтительно от 5:1 до 50:1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения реакцию окисления выполняют в смешанном растворителе, в котором отношение тетрагидрофуран:вода:пиридин составляет 3:1:1-1:1:3.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₆ представляет собой группу, представленную Формулой (В7) или (В8):

при этом определения q₂ и R_k представляют собой те, которые описаны выше.

В этом случае соединение, представленное Формулой (313), может быть получено с помощью следующего способа получения, включающего: приведение соединения, представленного Формулой (314), в контакт с соединением, представленным Формулой (А-1) или (А-2), в органическом растворителе в условии реакции амидирования в присутствии агента для амидной конденсации и органического основания третичного амина, а также выделение:

Формула (314)

при этом определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, R₁₅, L₁, S₁, q₂ и R_k, соответственно, описаны выше.

Условие реакции амидирования включает температуру реакции 0-100°С и время реакции 1-48 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакции амидирования включает температуру реакции 10-40°С и время реакции 2-16 часов.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой один или более из спиртового растворителя, эпоксидного растворителя, простого эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спиртовой растворитель представляет собой один или более из метанола, этанола и пропанола и, в дополнительных вариантах, представляет собой этанол. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения простой эфирный растворитель представляет собой простой диэтиловый эфир и/или простой трет-бутилметило вый эфир. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой дихлорметан. Количество органического растворителя составляет 3-50 л/моль и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 3-20 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (314).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения агент для амидной конденсации представляет собой гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония, 3-диэтоксифосфорилокси-1,2,3-бензотризин-4(3Н)-он, гидрохлорид 4-(4,6-диметокситриазин-2)-ил)-4-метилморфолина, 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ) или гексафторфосфат О-бензотриазолтетраметилурония и в других вариантах представляет собой 3-диэтоксифосфорилокси-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он. Молярное отношение агента для амидной конденсации к соединению, представленному Формулой (314), может составлять от 1:1 до 10:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 2,5:1 до 5:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органическое основание третичного амина представляет собой триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой N,N-диизопропилэтиламин. Молярное отношение третичного амина к соединению, представленному Формулой (314), может составлять от 3:1 до 20:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 5:1 до 10:1.

Соединения Формулы (А-1) и (А-2) могут быть получены с помощью любых подходящих способов. Например, если R_k представляет собой группу DMTr, соединение Формулы (А-1) может быть получено путем взаимодействия глицерата кальция с DMTrCl. Аналогичным образом, соединение Формулы (А-2) может быть получено путем приведения 3-амино-1,2-пропандиола в контакт с циклическим ангидридом и последующей реакции с DMTrCl, причем циклический ангидрид может содержать 4-13 атомов углерода и, в некоторых вариантах реализации, 4-8 атомов углерода. Специалисты в данной области техники легко поймут, что наборы различных циклических ангидридов соответствуют различным значениям q2 в соединении Формулы (А-2). Например, если циклический ангидрид представляет собой янтарный ангидрид, q₂=1; если циклический ангидрид представляет собой глутаровый ангидрид, q₂=2 и так далее.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение Формулы (313) также можно получить путем последовательного взаимодействия соединения, представленного Формулой (314), с циклическим ангидридом, 3-амино-1,2-пропандиолом и DMTrCl. Специалисты в данной области техники легко поймут, что эти варианты не будут влиять на структуру и функцию соединения Формулы (313), и эти варианты могут быть легко осуществлены специалистами в данной области техники на основе вышеуказанных способов.

Аналогичным образом, соединение Формулы (313) может быть выделено из реакционной смеси с помощью любых подходящих способов выделения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, представленное Формулой (313), может быть выделено с помощью удаления растворителя путем выпаривания с последующей хроматографией. Например, для выделения можно использовать следующие хроматографические условия: (1) очистка с обычной фазой: силикагелевый наполнитель с 200-300 меш, градиентное элюирование простой петролейный эфир:этилацетат:дихлорметан:N,N-диметилформамид = 1:1:1:0,5-1:1:1:0,6; и (2) очистка с обращенной фазой: наполнители с обращенной фазой С18 и С8, градиентное элюирование метанол:ацетонитрил = 0,1:1-1:0,1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения растворитель может быть непосредственно удален с получением неочищенного продукта соединения, представленного Формулой (313), который может быть непосредственно использован в последующих реакциях.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, представленное Формулой (314), может быть получено с помощью следующего способа получения, включающего: приведение соединения, представленного Формулой (320), в контакт с соединением, представленным Формулой (316) в органическом растворителе в условии реакции конденсации в присутствии агента для амидной конденсации и органического основания третичного амина, а также выделение:

Формула (316),

Формула (320)

при этом определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ и R₁₅, соответственно, описаны выше.

Соединение Формулы (316) может представлять собой то, которое описано в J, Am. Chem, Soc. 2014, 136, 16958-16961, Согласно другому варианту соединения Формулы (316) могут быть получены специалистами в данной области техники с помощью различных способов. Например, некоторые соединения Формулы (316) могут быть получены в соответствии со способом, описанным в Примере 1 патента US8106022B2, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакции конденсации включает температуру реакции 0-100°С и время реакции 0,1-24 часа, а согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения температуру реакции 10-40°С и время реакции 0,5-16 часов.

Учитывая структуру целевого соединения Формулы (314), молярное отношение соединения, представленного Формулой (316), к соединению, представленному Формулой (320), следует определять на основе суммы n1 и n3 в Формуле (320). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, например, когда n1+n3=3 для того, чтобы реакция прошла полностью и при этом не осталось избытка какого-либо реагента, молярное отношение соединения, представленного Формулой (316), к соединению, представленному Формулой (320), может составлять от 3:1 до 3,5:1 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения от 3,01:1 до 3,15:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой один или более из ацетонитрила, эпоксидного растворителя, простого эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения простой эфирный растворитель представляет собой простой диэтиловый эфир и/или простой трет-бутилметиловый эфир. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой дихлорметан. Количество органического растворителя составляет 3-50 л/моль и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 5-20 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (320).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конденсирующий агент для реакции амидирования представляет собой гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония, 3-диэтоксифосфорилокси-1,2,3-бензотризин-4(3H)-он (DEPBT), гексафторфосфат О-бензотриазолтетраметилурония или гидрохлорид 4-(4,6-диметокситриазин-2-ил)-4-метилморфолина или 1-гидроксибензотриазол и согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой смесь гексафторфосфата бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония с 1-гидроксибензотриазолом, где гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония и 1-гидроксибензотриазол применяют в эквимолярных количествах. Молярное отношение агента для амидной конденсации к соединению, представленному Формулой (316), составляет от 1:1 до 3:1 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составляет от 1,05:1 до 1,5:1.

Третичный амин может представлять собой N-метилморфолин, триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, N-метилморфолин. Молярное отношение третичного амина к соединению, представленному Формулой (316), может составлять от 2:1 до 10:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 2:1 до 5:1.

Аналогичным образом, соединение, представленное Формулой (314), может быть выделено из реакционной смеси с помощью любого подходящего способа выделения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, представленное Формулой (314), выделяют с помощью удаления растворителя путем выпаривания с последующей хроматографией, например, с применением следующих двух наборов хроматографических условий для выделения: (1) очистка с обычной фазой: силикагелевый наполнитель с 200-300 меш, градиентное элюирование дихлорметан:метанол = 100:5-100:7; (2) очистка с обращенной фазой: наполнители с обращенной фазой С18 и С8, градиентное элюирование метанол:ацетонитрил = 0,1:1-1:0,1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения растворитель непосредственно удаляют с получением неочищенного продукта соединения, представленного Формулой (314), который можно непосредственно использовать в последующих реакциях.

Соединение, представленное Формулой (320), может быть доступно коммерчески или получено специалистами в данной области техники с помощью известных способов. Например, в случае если m1=m2=m3=3, n1=1, n3=2 и R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, и R₁₅ все представляют собой Н, соединение, представленное Формулой (320), доступно коммерчески от Alfa Aesar Inc.

Конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению также можно применять в комбинации с другими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, которые могут представлять собой один или более из различных составов или соединений, общепринятых в данной области техники. Подробная информация представлена в приведенном выше описании фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению.

Применение миРНК, фармацевтической композиции и конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено применение миРНК, и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предотвращения заболеваний или патологических состояний, вызванных повышенной экспрессией гена PCSK9.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения заболеваний или патологических состояний, вызванных повышенной экспрессией гена PCSK9, включающий введение эффективного количества миРНК, и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.

Цель предотвращения и/или лечения заболеваний или физиологических состояний, вызванных повышенной экспрессией гена PCSK9, может быть достигнута на основе механизма РНК-интерференции (РНКи) путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, миРНК согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Таким образом, миРНК, и/или фармацевтическая композиция, и/или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению можно применять для предотвращения и/или лечения заболеваний или патологических состояний, вызванных повышенной экспрессией гена PCSK9, или для получения лекарственного средства для предотвращения и/или лечения заболеваний или патологических состояний, вызванных повышенной экспрессией гена PCSK9.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заболевания или паталогические состояния, вызванные повышенной экспрессией гена PCSK9, относятся к гиперхолестеринемии и возникающим в результате сердечно-сосудистым заболеваниям, включая атеросклероз, ишемическую болезнь сердца и гипертензию.

В настоящем документе термин «введение/вводить» относится к доставке миРНК, и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в организм субъекта с помощью способа или пути, который по меньшей мере частично локализует миРНК, и/или фармацевтическую композицию, и/или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению в целевом сайте для получения целевого эффекта. Подходящие пути введения для способов согласно настоящему изобретению включают местное введение и системное введение. Обычно местное введение приводит к доставке большего количества конъюгатов миРНК в конкретный сайт по сравнению с системным кровообращением субъекта; тогда как системное введение приводит к доставке миРНК, и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в основной системный кровоток субъекта. Принимая во внимание, что настоящее изобретение предназначено для обеспечения средств для предотвращения и/или лечения гиперхолестеринемии, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применяется способ введения, способный доставлять лекарственное средство в печень.

Введение субъекту можно осуществлять с помощью любых подходящих путей, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, пероральный или парентеральный путь, такой как внутривенное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, трансдермальное введение, внутритрахеальное введение (аэрозоль), легочное введение, назальное введение, ректальное введение и местное введение (включая буккальное введение и подъязычное введение). Частота введения может составлять один или более раз в сутки, еженедельно, один раз в две недели, один раз в три недели, ежемесячно, один раз в два месяца, один раз в квартал, один раз в полгода или ежегодно.

Доза миРНК, или фармацевтической композиции, или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению может представлять собой обычную дозу в данной области техники, которая может быть определена в соответствии с различными параметрами, в частности, возрастом, массой и полом субъекта. Токсичность и эффективность могут быть измерены в клеточных культурах или на экспериментальных животных с помощью стандартных фармацевтических процедур, например, путем определения LD₅₀ (летальная доза, вызывающая гибель 50% популяции), ED₅₀ (доза, которая может вызывать 50% от максимальной интенсивности ответа при количественном ответе и которая приводит к тому, что 50% экспериментальных субъектов имеют положительный ответ при качественном ответе) или IC₅₀ (концентрация ингибитора/лекарственного средства, при которой количественный ответ ингибируется наполовину). Диапазон доз для человека может быть получен на основании данных, полученных из анализа клеточных культур и исследований на животных.

При введении миРНК, фармацевтической композиции и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению например, самцам или самкам яванских макак в возрасте 3-5 лет и с массой тела от 2 до 6 кг, (i) для конъюгата миРНК дозировка его миРНК может составлять от 0,001 до 100 мг/кг массы тела, в некоторых вариантах реализации от 0,01 до 50 мг/кг массы тела, в некоторых вариантах реализации от 0,05 до 20 мг/кг массы тела, в других вариантах реализации от 0,1 до 15 мг/кг массы тела и в других вариантах реализации от 0,1 до 10 мг/кг массы тела; (ii) для фармацевтической композиции, образованной миРНК и фармацевтически приемлемым носителем, дозировка ее миРНК может составлять от 0,001 до 50 мг/кг массы тела, в некоторых вариантах реализации от 0,01 до 10 мг/кг массы тела, в некоторых вариантах реализации от 0,05 до 5 мг/кг массы тела, и в некоторых вариантах реализации от 0,1 до 3 мг/кг массы тела, в зависимости от количества миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ ингибирования экспрессии гена PCSK9 в гепатоцитах, включающий приведение эффективного количества миРНК и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в контакт с гепатоцитами, и введение миРНК и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в гепатоциты с целью ингибирования экспрессии гена PCSK9 в гепатоцитах с помощью механизма РНК-интерференции. Гепатоциты могут быть выбраны из линий клеток гепатомы (таких как SMMC-7721, HepG2 и Huh7) и выделенных первичных гепатоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гепатоциты представляют собой клетки гепатомы HepG2.

В случае если экспрессию гена PCSK9 в клетке ингибируют способом согласно настоящему изобретению, количество миРНК в модифицированной миРНК, и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгате миРНК согласно настоящему изобретению, как правило, представляет собой количество, достаточное для снижения экспрессии целевого гена и получения внеклеточной концентрации от 1 пМ до 1 мкМ или от 0,01 нМ до 100 нМ, или от 0,05 нМ до 50 нМ, или от 0,05 нМ до приблизительно 5 нМ на поверхности целевых клеток. Количество, требуемое для достижения этой локальной концентрации, будет варьироваться в зависимости от различных факторов, включая способ доставки, место доставки, количество клеточных слоев между местом доставки и целевыми клетками или тканями, путь доставки (местный или системный) и т.д. Концентрация в месте доставки может быть значительно выше, чем концентрация на поверхности целевых клеток или тканей.

Набор

Согласно настоящему изобретению предложен набор, содержащий эффективное количество по меньшей мере одного из модифицированной миРНК, фармацевтической композиции и конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор согласно настоящему изобретению может обеспечивать модифицированную миРНК в контейнере. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор согласно настоящему изобретению может содержать контейнер, содержащий фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор может дополнительно содержать другие ингредиенты, такие как стабилизаторы или консерванты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор согласно настоящему изобретению может содержать по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент в другом контейнере, отличном от контейнера, содержащего модифицированную миРНК согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор может содержать инструкцию по смешиванию модифицированной миРНК с фармацевтически приемлемыми носителями и/или вспомогательными веществами или другими ингредиентами (если таковые имеются).

В наборе согласно настоящему изобретению модифицированная миРНК и фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество, а также модифицированная миРНК, фармацевтическая композиция, и/или конъюгат миРНК, и/или конъюгат, и/или фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество могут быть обеспечены в любой форме, например, в жидкой форме, сухой форме или лиофилизированной форме. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированная миРНК и фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество, а также фармацевтическая композиция и/или конъюгат и необязательное фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество (вещества) являются по существу чистыми и/или стерильными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в наборе согласно настоящему изобретению может содержаться стерильная вода.

Настоящее изобретение будет дополнительно описано далее с использованием примеров получения и экспериментальных примеров, но не ограничивается ими ни в каком отношении.

Примеры

Если не указано иное, агенты и культуральные среды, применяемые в следующих примерах, являются коммерчески доступными, и все применяемые процедуры, такие как электрофорез нуклеиновых кислотах и ПЦР в режиме реального времени, выполняют в соответствии со способами, описанными в Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

Когда миРНК или конъюгат миРНК против гена PCSK9, синтезированный в настоящем изобретении, или миРНК или конъюгат миРНК в качестве отрицательного контроля использовали для трансфецирования клеток, в качестве трансфекционного реагента использовали Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen). Конкретные процедуры могут относиться к инструкции, предоставленной изготовителем.

Если не указано иное, все отношения реагентов, представленные ниже, рассчитаны как отношения по объему (об./об.).

Все экспериментальные данные выражены в виде X±SEM (среднее ± стандартная погрешность), для анализа данных использовали программное обеспечение для статистического анализа Graphpad Prism 6.0. Для анализа данных выбран однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), и в качестве аналитического метода для сравнения групп с целью определения значимости различия между ними использовали метод Тьюки. Если с помощью метода однофакторного дисперсионного анализа не обнаруживали существенной разницы, где общее значение р<0,05, для двухсторонней проверки использовали Т-критерий; где р<0,05 означает, что существует существенная разница между двумя группами.

Пример получения 1: Получение конъюгата 1

В этом примере получения синтезировали Конъюгат 1 с номером L10-siPCSKa 1M1S, представленный в Таблице 3. Конъюгированная миРНК в этом конъюгате содержит смысловую и антисмысловую цепи Конъюгата 1, представленные в Таблице 3.

(1-1) Синтез соединения L-10:

Соединение L-10 синтезировали в соответствии со следующим способом:

(1-1-1) Синтез GAL-5 (концевой сегмент конъюгирующей молекулы)

100,0 г GAL-1 (гидрохлорида N-ацетил-D-галактозамина, №CAS 1772-03-8, приобретен у Ningbo Hongxiang Bio-Chem Co., Ltd., 463,8 ммоль) растворяли в 1000 мл безводного пиридина, к которому добавляли 540 мл уксусного ангидрида (приобретен у Enox Inc., 5565,6 ммоль) на бане с ледяной водой для взаимодействия при перемешивании при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Полученный реакционный раствор выливали в 10 л ледяной воды и подвергали вакуумной фильтрации при пониженном давлении. Остаток промывали 2 л ледяной воды и затем добавляли смешанный растворитель ацетонитрил/толуол (отношение об./об. ацетонитрил: толуол = 1:1) до полного растворения. Растворитель удаляли с помощью выпаривания с получением 130,0 г продукта GAL-2 в виде белого твердого вещества.

(1-1-1b) Синтез GAL-3

GAL-2 (35,1 г, 90,0 ммоль), полученный на стадии (1 -1 -1 а), растворяли в 213 мл безводного 1,2-дихлорэтана, к которому добавляли 24,0 г триметилсилилтрифторметансульфоната (TMSOTf, №CAS 27607-77-8, приобретен у Macklin Inc., 108,0 ммоль) на бане с ледяной водой в атмосфере азота для взаимодействия при комнатной температуре в течение ночи.

400 мл дихлорметана добавляли к реакционному раствору для разбавления, фильтровали через диатомит, а затем добавляли 1 л насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и перемешивали до однородности. Выделяли органическую фазу. Оставшуюся водную фазу экстрагировали дважды, каждый раз с применением 300 мл дихлорэтана. Органические фазы объединяли и промывали с применением 300 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и 300 мл насыщенного рассола, соответственно. Органическую фазу выделяли и высушивали с применением безводного сульфата натрия. Растворитель удаляли с помощью выпаривания при пониженном давлении с получением 26,9 г продукта GAL-3 в виде светло-желтого вязкого сиропа.

(1-1-1с) Синтез GAL-4

GAL-3 (26,9 г, 81,7 ммоль), полученный на стадии (1-1-1b), растворяли в 136 мл безводного 1,2-дихлорэтана, добавляли 30 г порошка сухого молекулярного сита 4А, а затем 9,0 г 5-гексен-1-ола (№CAS 821-41-0, приобретен у Adamas-beta Inc., 89,9 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут.9,08 г TMSOTf (40,9 ммоль) добавляли на ледяной бане в атмосфере азота для взаимодействия при перемешивании при комнатной температуре в течение ночи. Порошок молекулярного сита 4А удаляли с помощью фильтрации. К фильтрату добавляли 300 мл дихлорэтана для разбавления, фильтровали через диатомит, а затем добавляли 500 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и перемешивали в течение 10 минут для промывки. Выделяли органическую фазу. Водную фазу экстрагировали один раз с применением 300 мл дихлорэтана. Органические фазы объединяли и промывали с применением 300 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и 300 мл насыщенного рассола, соответственно. Органическую фазу выделяли и высушивали с применением безводного сульфата натрия. Растворитель удаляли с помощью выпаривания при пониженном давлении с получением 41,3 г продукта GAL-4 в виде желтого сиропа, который непосредственно использовали в следующей реакции окисления без очистки.

(1-1-1d) Синтез GAL-5

GAL-4 (14,9 г, 34,7 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на стадии (1-1-1 с), растворяли в смешанном растворителе из 77 мл дихлорметана и 77 мл ацетонитрила, добавляли 103 мл деионизированной воды и 29,7 г периодата натрия (№CAS 7790-28-5, приобретен у Aladdin Inc., 138,8 ммоль), соответственно, и перемешивали на ледяной бане в течение 10 минут. Трихлорид рутения (№CAS 14898-67-0, доступен у Energy Chemical, 238 мг, 1,145 ммоль) добавляли для взаимодействия при комнатной температуре в течение ночи. Полученный реакционный раствор разбавляли путем добавления 300 мл воды при перемешивании и доводили до рН приблизительно 7,5, добавляя насыщенный бикарбонат натрия. Органическую фазу выделяли и удаляли. Водную фазу трижды экстрагировали, каждый раз с применением 200 мл дихлорметана, а органическую фазу удаляли. Водную фазу доводили до рН приблизительно 3 с применением сухого вещества лимонной кислоты, трижды экстрагировали, каждый раз с применением 200 мл дихлорметана, и полученные органические фазы объединяли и высушивали с применением безводного сульфата натрия. Растворитель удаляли с помощью выпаривания при пониженном давлении с получением 6,85 г продукта GAL-5 в виде белого пенистого твердого вещества. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 12,01 (br, 1Н), 7,83 (d, J=9,2 Гц, 1Н), 5,21 (d, J=3,2 Гц, 1Н), 4,96 (dd, J=11,2, 3,2 Гц, 1Н), 4,49 (d, J=8,4 Гц, 1Н), 4,07 - 3,95 (m, 3H), 3,92 - 3,85 (m, 1Н), 3,74 - 3,67 (m, 1Н), 3,48 - 3,39 (m, 1Н), 2,20 (t, J=6,8 Гц, 2Н), 2,11 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,90 (s, 3H), 1,77 (s, 3H), 1,55-1,45 (m, 4Н).

(1-1-2) Синтез L-8:

J-0 (9,886 г, 52,5 ммоль, приобретен у Alfa Aesar Inc.) и GAL-5 (72,819 г, 162,75 ммоль, полученный путем объединения нескольких партий продуктов), полученный на стадии (1-1-1), растворяли в 525 мл дихлорметана и добавляли диизопропилэтиламин (DIEA, 44,782 г, 346,50 ммоль), бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфонийгексафторфосфат (РуВОР, 90, 158 г, 173,25 ммоль) и гидроксибензотриазол (HOBt, 23,410 г, 173,25 ммоль) для взаимодействия при комнатной температуре в течение 4 часов. Полученный реакционный раствор промывали путем добавления 20 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 200 мл насыщенного рассола. Водную фазу экстрагировали дважды, каждый раз с применением 100 мл дихлорметана.

Органические фазы объединяли, высушивали с применением безводного сульфата натрия и фильтровали. Затем растворитель удаляли с помощью выпаривания при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали с помощью колонки с силикагелем с обычной фазой (200-300 меш). В колонку вносили 10 масс. % триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля, уравновешивали 1 масс. %о триэтиламином и элюировали с помощью градиентного элюирования дихлорметан: метанол = 100:25-100:40. Элюат собирали, и растворитель удаляли с помощью выпаривания при пониженном давлении с получением 38,8 г чистого продукта L-8. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 7,84 (d, J=9,0 Гц, 3H), 7,27 -7,23 (m, 1Н), 7,13 - 7,18 (m, 1Н), 5,22 (d, J=3,1 Гц, 3H), 4,97 (dd, J=11,3, 3,1 Гц, 3H), 4,48 (d, J=8,4 Гц, 3H), 4,09 - 3,98 (m, 9Н), 3,88 (dd, J=19,3, 9,3 Гц, 3H), 3,75 - 3,66 (m, 3H), 3,44-3,38 (m, 3H), 3,17 - 3,30 (m, 4Н), 3,10 - 2,97 (m, 4Н), 2,35 - 2,20 (m, 6Н), 2,15-2,08 (m, 9Н), 2,07- 1,98 (m, 13Н), 1,84- 1,87 (m, 9Н), 1,81 -1,74 (m, 9Н), 1,65 - 1,62 (m, 18Н). MS m/z: C₈₅H₁₁₉N₇O₃₀, [М+Н]⁺, вычислено: 1477,59, измерено: 1477,23.

(1-1-3а) Синтез А-1

DMTrCl (хлорид 4,4'-диметокситритила, 101,65 г, 300 ммоль) растворяли в 1000 мл безводного пиридина и добавляли гидрат DL-глицерата кальция (28,63 г, 100 ммоль) для взаимодействия при 45°С в течение 20 часов. Полученный реакционный раствор фильтровали. Остаток промывали с применением 200 мл ДХМ, и фильтрат концентрировали до сухого состояния при пониженном давлении. Остаток повторно растворяли в 500 мл дихлорметана и дважды промывали, каждый раз с применением 200 мл 0,5 М фосфата триэтиламина (рН=7-8). Водную фазу экстрагировали дважды, каждый раз с применением 200 мл дихлорметана. Органические фазы объединяли, высушивали с применением безводного сульфата натрия и фильтровали. Растворитель удаляли с помощью выпаривания при пониженном давлении, и остаток очищали с применением колонки с силикагелем с обычной фазой (200-300 меш). Колонку элюировали с помощью градиентного элюирования простой петролейный эфир: этилацетат:дихлорметан: метанол = 1:1:1: 0,35-1:1:1:0,55. Элюат собирали, и растворитель удаляли с помощью выпаривания при пониженном давлении. Остаток повторно растворяли в 600 мл дихлорметана и промывали один раз с применением 200 мл 0,5 М фосфата триэтиламина. Водную фазу экстрагировали один раз с применением 200 мл дихлорметана. Органические фазы объединяли, высушивали с применением безводного сульфата натрия и фильтровали. Растворитель удаляли с помощью выпаривания до сухого состояния при пониженном давлении, и остаток высушивали при пониженном давлении в вакуумном масляном насосе в течение ночи с получением 50,7 г продукта А-1 в виде белого твердого вещества. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,46 (ddd, J=6,5, 2,3, 1,1 Гц, 1Н), 7,40 - 7,28 (m, 7Н), 6,89 - 6,81 (m, 4Н), 4,84 (d, J=5,0 Гц, 1Н), 4,36-4,24 (m, 1Н), 4,29 (s, 6Н), 3,92 (dd, J=12,4, 7,0 Гц, 1Н), 3,67 (dd, J=12,3, 7,0 Гц, 1 Н), 2,52 (q, J=6,3 Гц, 6Н), 1,03 (t, J=6,3 Гц, 9Н). MS m/z: C₂₄H₂₃O₆, [М-Н]^-, вычислено: 407,15, измерено: 406,92.

(1-1-3b) Синтез L-7

L-8 (40 г, 27,09 ммоль, полученный путем объединения нескольких партий продуктов), полученный на стадии (1-1-2), и А-1 (41,418 г, 81,27 ммоль), полученный на стадии (1-1-3а), смешивали и растворяли в 271 мл дихлорметана, добавляли 3-диэтоксифосфорил-1,2,3-бензотризин-4 (3H)-он (DEPBT) (24,318 г, 81,37 ммоль), а затем добавляли диизопропилэтиламин (21,007 г, 162,54 ммоль) для взаимодействия при перемешивании при 25°С в течение 1,5 часов. Органическую фазу промывали с применением 800 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия. Водную фазу экстрагировали трижды, каждый раз с применением 50 мл дихлорметана. Органическую фазу промывали с применением 150 мл насыщенного рассола, водную фазу однократно экстрагировали с применением 50 мл дихлорметана, органические фазы объединяли, высушивали с применением безводного сульфата натрия и фильтровали. Растворитель удаляли с помощью выпаривания при пониженном давлении, и остаток высушивали во вспененном состоянии в вакуумном масляном насосе в течение ночи с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке. Колонку заполняли 2 кг силикагеля с обычной фазой (200-300 меш), добавляли 200 мл триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля, уравновешивали простым петролейным эфиром, содержащим 1 масс. % триэтиламина, и элюировали с помощью градиентного элюирования простой петролейный эфир: этилацетат: дихлорметан: N,N-диметилформамид = 1:1:0,5-1:1:0,6. Элюат собирали, и растворитель удаляли с помощью выпаривания при пониженном давлении с получением 40,4 г чистого продукта L-7. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 7,90 - 7,78 (m, 4Н), 7,75 - 7,64 (m, 1Н), 7,38 - 7,18 (m, 9Н), 6,91 - 6,83 (m, 4Н), 5,25 - 5,10 (m, 4Н), 4,97 (dd, J=11,2, 3,2 Гц, 3H), 4,48 - 4,30 (m, 4Н), 4,02 (s, 9Н), 3,93 - 3,84 (m, 3H), 3,76 - 3,66 (m, 9Н), 3,45 - 3,35 (m, 3H), 3,24 - 2,98 (m, 10Н), 2,30 - 2,20 (m, 2Н), 2,11 - 1,88 (m, 31Н), 1,80 - 1,40 (m, 28Н). MS m/z: C₉₀H₁₂₈N₇O₃₅, [M-DMTr]⁺, вычислено: 1564,65, измерено: 1564,88.

(1-1-4) Синтез L-9

L-7 (40 г, 21,4247 ммоль), полученный на стадии (1-1-3b), янтарный ангидрид (4,288 г, 42,8494 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (DMAP, 5,235 г, 42,8494 ммоль) смешивали и растворяли в 215 мл дихлорметана, затем добавляли диизопропилэтиламин (DIEA, 13,845 г, 107,1235 ммоль) и перемешивали при 25°С в течение 24 часов. Полученный реакционный раствор промывали с применением 800 мл 0,5 М фосфата триэтиламина. Водную фазу трижды экстрагировали, каждый раз с применением 5 мл дихлорметана. Органические фазы объединяли и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке. Колонку заполняли 1 кг силикагеля с обычной фазой (200-300 меш), добавляли 1 масс. % триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля, уравновешивали дихлорметаном и элюировали с помощью градиентного элюирования 1 масс. % триэтиламина в дихлорметане: метанол = 100:18-100:20. Элюат собирали, и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 31,0 г чистого продукта конъюгирующей молекулы L-9. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 8,58 (d, J=4,2 Hz, 1Н), 7,94 - 7,82 (m, 3H), 7,41 - 7,29 (m, 5Н), 7,22 (d, J=8,1 Hz, 5H), 6,89 (d, J=8,3 Hz, 4H), 5,49 - 5,37 (m, 1H), 5,21 (d, J=3,0 Hz, 3H), 4,97 (d, J=11,1 Hz, 3H), 4,49 (d, J=8,2 Hz, 3H), 4,02 (s, 9H), 3,88 (dd, J=19,4, 9,4 Hz, 3H), 3,77 - 3,65 (m, 9H), 3,50 - 3,39 (m, 6H), 3,11 - 2,90 (m, 5H), 2,61 - 2,54 (m, 4H), 2,47 - 2,41 (m, 2H), 2,26-2,17 (m, 2H), 2,15-1,95 (m, 22H), 1,92 - 1,84 (m, 9H), 1,80 - 1,70 (m, 10H), 1,65 -1,35 (m, 17H), 1,31-1,19 (m, 4H), 0,96 (t, J=7,1 Hz, 9H). MS m/z: C₉₄H₁₃₂N₇O₃₈, [M-DMTr]⁺, вычислено: 1664,72, измерено: 1665,03.

(1-1-5) Синтез соединения L-10:

На этой стадии соединение L-10 получали путем соединения конъюгирующей молекулы L-9 с твердофазной подложкой.

Конъюгирующую молекулу L-9 (22,751 г, 11 ммоль), полученную на стадии (1-1-4), гексафторфосфат О-бензотриазолтетраметилурония (HBTU, 6,257 г, 16,5 ммоль) и диизопропилэтиламин (DIEA, 2,843 г, 22 ммоль) смешивали и растворяли в 900 мл ацетонитрила и перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут. К полученному реакционному раствору добавляли аминометиловую смолу (H₂NResin, 88 г, 100-200 меш, нагрузка аминогруппами: 400 мкмоль/г, приобретена у Tianjin Nankai HECHENG S&T Co., Ltd.). Реакцию выполняли на шейкере при 25°С и скорости вращения 150 об./мин в течение 18 часов с последующей фильтрацией. Остаток дважды промывали (каждый раз с применением 300 мл ДХМ), затем три раза (каждый раз с применением 300 мл ацетонитрила) и высушивали в течение 18 часов с помощью вакуумного масляного насоса. Затем выполняли реакцию копирования путем добавления исходных материалов (СарА, СарВ, 4-диметиламинопиридина (DMAP) и ацетонитрила) в соответствии с отношением зарядов, представленным в Таблице 2. Реакцию выполняли на шейкере при 25°С и скорости вращения 150 об./мин в течение 5 часов. Реакционную жидкость фильтровали. Остаток промывали трижды, каждый раз с применением 300 мл ацетонитрила. Растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении, и смесь высушивали в течение ночи при пониженном давлении с помощью вакуумного масляного насоса с получением 102 г соединения L-10 (т.е. конъюгирующая молекула L-9 соединена с твердофазной подложкой) с нагрузкой 90,8 мкмоль/г.

В приведенной выше таблице СарА и СарВ представляют собой растворы копирующих агентов. СарА представляет собой 20% раствор по объему N-метилимидазола в смеси пиридин/ацетонитрил, причем объемное отношение пиридина к ацетонитрилу составляет 3:5. СарВ представляет собой 20% раствор по объему уксусного ангидрида в ацетонитриле.

(1-2) Синтез смысловой цепи Конъюгата 1

Смысловую цепь Конъюгата миРНК 1 в Таблице 3 синтезировали путем соединения нуклеозидных мономеров одного за другим в направлении от 3' к 5' в соответствии с последовательностью расположения нуклеотидов в смысловой цепи с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза, циклы начинали с соединения L-10, полученного на вышеуказанной стадии.

Соединение каждого нуклеозидного мономера включало четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления или сульфуризации. При этом, если два нуклеотида соединены за счет фосфоэфирной связи, четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления включали во время присоединения последующего нуклеозидного мономера; и если два нуклеотида соединены за счет фосфотиоатной связи, четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, кэпирования и сульфуризации включали во время присоединения последующего нуклеозидного мономера. Условие синтеза было задано следующим образом.

Нуклеозидные мономеры обеспечены в 0,1 М растворе ацетонитрила. Условие реакции снятия защиты является идентичным на каждой стадии, т.е. температура 25°С, время реакции 70 секунд, в качестве агента для снятия защиты применяют раствор дихлоруксусной кислоты в дихлорметане (3% об./об.) и молярное отношение дихлоруксусной кислоты к защитной группе 4,4'-диметокситритил на твердофазной подложке 5:1.

Условие реакции связывания является идентичным на каждой стадии, включая температуру 25°С, молярное отношение последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, к нуклеозидным мономерам 1:10, молярное отношение последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, к связывающему агенту 1:65, время реакции 600 секунд и 0,5 М раствор 5-этилтио-1Н-тетразола (ЕТТ) в ацетонитриле в качестве связывающего агента.

Условие для реакции кэпирования является идентичным на каждой стадии, включая температуру 25°С, время реакции 15 секунд, в качестве раствора кэпирующего агента применяют смешанный раствор СарА и СарВ в молярном отношении 1:1 и молярное отношение кэпирующего агента к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, составляет 1:1:1 (уксусный ангидрид:N-метилимидазол последовательность нуклеиновой кислоты, соединенная с твердофазной подложкой).

Условие реакции окисления является идентичным на каждой стадии, включая температуру 25°С, время реакции 15 секунд и 0,05 М раствор йода в воде в качестве окисляющего агента; и молярное отношение йода к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой на стадии связывания, 30:1. Реакцию проводят в смешанном растворителе, в котором отношение тетрагидрофуран:вода:пиридин составляет 3:1:1

Условие для реакции сульфуризации является идентичным на каждой стадии, включая температуру 25°С, время реакции 300 секунд и ксантановый гидрид в качестве агента сульфуризации; молярное отношение агента сульфуризации к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой на стадии связывания, 120:1. Реакцию проводят в смешанном растворителе, в котором отношение ацетонитрил:пиридин составляет 1:1.

После завершения связывания последнего нуклеозидного мономера последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с твердофазной подложкой, отщепляли, снимали защиту, очищали, обессоливали и затем лиофилизировали с получением смысловой цепи, где

Условия отщепления и удаления защитной группы являются следующими: добавление синтезированной нуклеотидной последовательности, соединенной с подложкой, в 25 масс. % водный раствор аммиака для взаимодействия при 55°С в течение 16 часов, при этом количество водного раствора аммиака составляет 0,5 мл/мкмоль. Оставшуюся подложку удаляли с помощью фильтрации, и супернатант концентрировали до сухого состояния в вакууме.

Условия очистки и обессоливания следующие: очистку нуклеиновой кислоты осуществляют с помощью колонки для препаративной ионной хроматографии (Source 15Q) с градиентным элюированием NaCl. В частности, элюент А представляет собой 20 мМ фосфат натрия (рН=8,1), растворитель представляет собой воду/ацетонитрил в соотношении 9:1 (об./об.); элюент В представляет собой 1,5 М хлорид натрия, 20 мМ фосфат натрия (рН=8,1), растворитель представляет собой воду/ацетонитрил в соотношении 9:1 (об./об.); градиент элюирования: соотношение элюент А: элюент В=100:0-50:50. Элюат собирают, объединяют и обессоливают, используя колонку для хроматографии с обращенной фазой. Конкретные условия включают: применение колонки с сефадексом для обессоливания (наполнитель: сефадекс G25) и деионизированной воды для элюирования.

Способ определения заключается в следующем: чистоту вышеупомянутой смысловой цепи определяли с помощью ионообменной хроматографии (ИХ-ВЭЖХ); и молекулярную массу анализировали методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Тот факт, что измеренные значения соответствовали вычисленным значениям, свидетельствует о том, что была синтезирована смысловая цепь SS, 3'-концевая часть которой конъюгирована с конъюгирующей молекулой L-9.

(1-3) Синтез антисмысловой цепи Конъюгата 1

Антисмысловую цепь Конъюгата 1 в Таблице 3 синтезировали путем запуска циклов с применением универсальной твердофазной подложки (загруженных UnyLinker™ твердых подложек NittoPhase®HL, Kinovate Life Sciences Inc.) в соответствии с твердофазным фосфоамидитным синтезом. Условия реакции снятия защиты, связывания, копирования, окисления или сульфуризации, отщепления и снятия защиты, очистки и обессоливания в способе твердофазного синтеза проводили в тех же условиях, как и при синтезе смысловой цепи. Затем проводили лиофилизацию с получением антисмысловой цепи. Чистоту антисмысловой цепи определяли с помощью ионообменной хроматографии (ИХ-ВЭЖХ); и молекулярную массу анализировали методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Тот факт, что измеренные значения соответствовали вычисленным значениям, свидетельствует о том, что была синтезирована антисмысловая цепь AS, содержащая целевую последовательность.

(1-4) Синтез Конъюгата 1

Для Конъюгата 1 смысловую цепь и антисмысловую цепь, соответственно, растворяли в воде для инъекций с получением раствора 40 мг/мл. Их смешивали в эквимолярном отношении, нагревали при 50°С в течение 15 минут, охлаждали при комнатной температуре с образованием двухцепочечной структуры, а затем лиофилизировали с получением лиофилизированного порошка. После того, как конъюгат разбавляли до концентрации 0,2 мг/мл ультрачистой водой (приготовленной с помощью прибора для чистой воды Milli-Q, с удельным сопротивлением 18,2 МОм*см (25°С)), молекулярную массу измеряли с помощью прибора для жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС) (приобретен у Waters Corp., модель: LCT Premier). Поскольку измеренные значения соответствовали вычисленным значениям, было подтверждено, что синтезированный Конъюгат 1 представлял собой разработанную последовательность двухцепочечной нуклеиновой кислоты, представляющую интерес, с конъюгирующей молекулой L-9. Конъюгат 1 имеет структуру, представленную Формулой (403). Конъюгированная миРНК в этом конъюгате содержит последовательности Конъюгата 1 (также называемого L10-siPCSKa1M1S), как показано в Таблице 3.

Пример получения 2: Получение Конъюгатов 2-7

Конъюгаты 2-7, как показано в Таблице 3, получали тем же способом, как и в Примере получения 1, за исключением того, что смысловая цепь и последовательности антисмысловой цепи, участвующие в синтезе, представляли собой последовательности смысловой цепи и антисмысловой цепи конъюгированной миРНК в Конъюгате 2, Конъюгате 3, Конъюгате 4, Конъюгате 5, Конъюгате 6 или Конъюгате 7, как показано в Таблице 3. Таким образом, Конъюгаты 2-7 были получены соответственно. Определяли молекулярные массы Конъюгатов 2-7.

Последовательности конъюгатов и их номера представлены в Таблице 3.

Пример получения 3: Синтез последовательностей миРНК

МиРНК 1, как показано в Таблице 3, синтезировали тем же способом, как и в Примере получения 1, за исключением того, что

1) в случае смысловой цепи циклы запускали с применением универсальной твердофазной подложки (загруженные UnyLinker™ твердые подложки NittoPhase®HL, Kinovate Life Sciences Inc.);

2) в случае антисмысловой цепи, последовательность миРНК 1 отличалась от последовательности антисмысловой цепи конъюгированной миРНК в Конъюгате 1 тем, что антисмысловая цепь миРНК 1 содержала 5'-фосфат на первом нуклеотиде на 5'-конце Таким образом, во время получения антисмысловых цепей в соответствии со способом твердофазного фосфоамидитного синтеза, после присоединения последнего нуклеозидного мономера антисмысловой цепи, мономер Формулы (CPR-I) (приобретен у Suzhou GenePharma Inc. номер по каталогу 13-2601-XX) соединяли с 5'-концом антисмысловой цепи с помощью четырехступенчатой реакции снятия защиты, связывания, копирования и окисления с образованием 5' -фосфомодификации.

Во время связывания применяли условия снятия защиты, связывания, копирования, окисления, отщепления и снятия защиты, очистки и обессоливания, аналогичные тем, которые применяли при синтезе смысловой цепи.

МиРНК 2 получали, применяя тот же способ, как и для получения миРНК 1, за исключением того, что последовательности нуклеиновой кислоты смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК, участвующих в синтезе миРНК 2, представляли собой смысловую цепь и антисмысловую цепь последовательности миРНК 2, как показано в Таблице 4.

МиРНК 3-6 получали, применяя тот же способ, как и для получения миРНК 1, за исключением того, что последовательности нуклеиновой кислоты смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК, участвующих в синтезе, представляли собой смысловую цепь и антисмысловую цепь последовательностей миРНК 3, миРНК 4, миРНК 5 или миРНК 6, как показано в Таблице 4, где антисмысловые цепи этих миРНК имели 5'-фосфатную модификацию на первом нуклеотиде на 5'-конце. Таким образом, антисмысловая цепь с 5'-фосфотиоатной модификацией может быть получена путем замены условия реакции окисления условием реакции сульфуризации при присоединении мономера CPR-I. Таким образом, миРНК 3, миРНК 4, миРНК 5 или миРНК 6 были получены соответственно.

В Таблице 4 перечислены номера и последовательности миРНК.

Экспериментальный пример 1. Ингибирующая активность и нецелевой эффект миРНК в системе psiCHECK в условиях in vitro

В этом экспериментальном примере целевую активность и нецелевой эффект миРНК согласно настоящему изобретению оценивали путем измерения ингибирования каждой антисмысловой цепи миРНК 1-6 в отношении экспрессии целевой плазмиды и ингибирования каждой смысловой цепи, затравочной области антисмысловой цепи или затравочной области смысловой цепи миРНК в отношении экспрессии нецелевой плазмиды в системе psiCHECK в условиях in vitro.

В соответствии со способом, описанным в Kumico Ui-Tei et. ai, Functional dissection ofsiRNA sequence by systematic DNA substitution: modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect. Nucleic Acids Research, 2008.36(7), 2136-2151, плазмиды для определения конструировали и совместно трансфецировали с миРНК, подлежащей определению, в клетки НЕК293А; и уровни экспрессии двойного репортерного гена люциферазы отражают активность миРНК в отношении мишени и нецелевой эффект миРНК. Конкретные стадии описаны далее:

[1] Конструирование плазмиды для определения

Четыре типа плазмид для определения конструировали с применением плазмиды psiCHECK™-2 (Promega™), в которой GSCM представляет собой целевую плазмиду; и PSCM, GSSM и PSSM представляют собой нецелевые плазмиды:

(1) GSCM, применяемый для определения целевой активности антисмысловой цепи миРНК, содержит целевую последовательность, которая содержит область, которая полностью комплементарна последовательности антисмысловой цепи миРНК, подлежащей определению, причем целевая последовательность в GSCM, соответствующая миРНК 1, 2, 4, 5 и 6, представлена в SEQ ID NO: 373:

и целевая последовательность в GSCM, соответствующая миРНК 3, представлена в SEQ ID NO: 374:

(2) PSCM, применяемый для определения нецелевого эффекта смысловой цепи, содержит целевую последовательность, которая полностью совпадает с последовательностью антисмысловой цепи миРНК, подлежащей обнаружению, причем целевая последовательность в PSCM, соответствующая каждой миРНК, показана в Таблице 5а:

(3) GSSM применяют для определения нецелевого эффекта затравочной области антисмысловой цепи, причем целевая последовательность в GSSM, соответствующая каждой миРНК, показана в Таблице 5b:

(4) PSSM применяют для определения нецелевого эффекта затравочной области смысловой цепи, причем целевая последовательность в PSSM, соответствующая каждой миРНК, показана в Таблице 5с:

Одиночную копию вышеупомянутых целевых последовательностей встраивали в сайт Xho I/Not I плазмиды psiCHECK™-2, соответственно.

[2] Культура клеток и трансфекция

(1) Совместная трансфекция GSCM и миРНК 1

Клетки НЕК293А (приобретенные у Nanjing Cobioer Biosciences Co., LTD) культивировали в полной среде H-DMEM (компания Hyclone), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС, компания Hyclone), и 0,2% (об.%) пенициллина-стрептомицина (компания Hyclone), при 37°С в инкубаторе, содержащем 5% СО₂/95% воздуха.

Клетки НЕК293А инокулировали в 96-луночный планшет в количестве 8×10³ клеток/лунку. Через 16 часов плотность роста клеток достигла 70-80%. При этом полные среды H-DMEM в культуральных лунках аспирировали. В каждую лунку добавляли 80 мкл среды Opti-MEM (компания GIBCO) и обработку культур продолжали в течение 1,5 ч.

Плазмиды детектирования GSCM разбавляли водой DEPC с получением рабочего раствора плазмиды детектирования 200 нг/мкл; миРНК 1 получали с помощью воды DEPC в рабочие растворы миРНК в 11 различных концентрациях 1000 нМ, 333 нМ, 111 нМ, 37,0 нМ, 12,3 нМ, 4,12 нМ, 1,37 нМ, 0,46 нМ, 0,15 нМ, 0,05 нМ и 0,017 нМ, соответственно.

Растворы А1-А11 были приготовлены соответствующим образом. Каждая порция растворов А1-А11 содержит, в свою очередь, 1 мкл рабочего раствора ми РНК в одной из вышеуказанных 11 концентраций, 0,05 мкл рабочего раствора детектирующей плазмиды (содержащего 10 нг детектирующей плазмиды) и 10 мкл среды Opti-MEM.

Готовили растворы В. Каждая порция раствора В содержит 0,2 мкл Lipofectamine™ 2000 и 10 мкл среды Opti-MEM.

Готовили растворы С.Каждая порция раствора С содержит 0,05 мкл рабочего раствора детектирующей плазмиды (содержащего 10 нг детектирующей плазмиды) и 10 мкл среды Opti-MEM

Одну порцию раствора В последовательно смешивали с одной порцией каждого из растворов А1-А11 и одной порцией раствора С, соответственно. Смеси инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре для получения 12 трансфекционных комплексов Х1-Х12. Каждый трансфекционный комплекс готовили в трех повторностях.

Трансфекционные комплексы Х1-Х11 добавляли, соответственно, к культуральным лункам в количестве 20 мкл/лунку и равномерно перемешивали, и три аликвоты трансфекционного комплекса при одинаковой концентрации миРНК добавляли, соответственно, к трем различным культуральным лункам с получением смесей для котрансфекции при конечных концентрациях ми РНК 10 нМ, 3,33 нМ, 1,11 нМ, 0,37 нМ, 0,123 нМ, 0,0412 нМ, 0,0137 нМ, 0,0046 нМ, 0,0015 нМ, 0,0005 нМ и 0,00017 нМ (записанных как тестовые группы 1-11).

Трансфекционные комплексы Х12 добавляли соответственно к трем другим культуральным лункам в количестве 20 мкл/лунку для получения трансфекционных смесей без миРНК (записанных как контрольные группы).

После того, как смеси для котрансфекции, содержащие миРНК, и смеси для трансфекции без миРНК трансфицировали в культуральных лунках в течение 4 часов, каждую лунку дополняли 100 мкл полной среды H-DMEM, содержащей 20% FBS. 96-луночный планшет помещали в СО₂ инкубатор и продолжали инкубацию в течение 24 часов.

(2) Совместная трансфекция других миРНК и плазмид.

GSCM и миРНК 2-6 совместно трансфицировали так же, как GSCM и миРНК 1, за исключением того, что миРНК1 была последовательно заменена миРНК2-6.

PSCM и миРНК 1-6 совместно трансфицировали также, как GSCM и миРНК 1-6, за исключением того, что GSCM последовательно заменяли на PSCM.

GSSM и миРНК 1-6 совместно трансфицировали также, как GSCM и миРНК 1-6, за исключением того, что GSCM последовательно заменяли GSSM.

PSSM и миРНК 1-6 совместно трансфицировали также, как GSCM и миРНК 1-6, за исключением того, что GSCM последовательно заменяли на PSSM.

[3] Определение

Среды в культуральных лунках аспирировали. В каждую лунку добавляли 150 мкл смешанного раствора реагента Dual-Glo® Luciferase и H-DMEM (в объемном отношении 1:1) и тщательно перемешивали. После инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре 120 мкл смешанного раствора переносили в 96-луночный планшет для твердофазного иммуноферментного анализа (твердофазный ИФА, ELISA). Значение хемилюминесценции Firefly (Fir) в каждой лунке планшета для ИФА считывали с помощью многомодового планшет-ридера Synergy II (компания BioTek). Затем в каждую лунку планшета для ИФА добавляли 60 мкл реагента Dual-Glo® Stop & Glo® и тщательно перемешивали. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут значение хемилюминесценции Renilla (REN) в каждой лунке планшета для ИФА считывали с помощью считывающего устройства для микропланшетов в соответствии с процедурой считывания FIR.

Вычисляли коэффициент люминесценции (Ratio = REN/FIR) каждой лунки планшета для ИФА, а коэффициент люминесценции (Ratio (test) или Ratio (control)) каждой испытуемой группы или контрольной группы представляли собой среднее значение коэффициентов трех лунок для культивирования. Используя коэффициент люминесценции контрольной группы в качестве эталона, коэффициент люминесценции каждой тестируемой группы нормализовали для получения соотношения R соотношения (тест)/соотношения (контроль), которое представляет собой уровень экспрессии, т.е. относительную остаточную активность, репортерного гена Renilla. Скорость ингибирования миРНК составляла (1-R) × 100%.

Кривые зависимости ответа от дозы строили по результатам измерения активности при различных концентрациях миРНК, и кривые аппроксимировали, используя функцию log (ингибитор) в зависимости от ответа - переменный наклон программного обеспечения Graphpad 5.0, в соответствии с относительной остаточной активностью репортерного гена Renilla в системе psiCHECK после трансфекции различными миРНК (миРНК 1, миРНК 2, миРНК 3, миРНК 4, миРНК 5 или миРНК 6). Фигуры 1А-1F представляют собой кривые доза-эффект миРНК 1-6, соответственно, где абсцисса представляет собой логарифм концентрации ми РНК (lg nM), ордината представляет собой относительную остаточную активность (%) гена Renilla, и каждая точка представляет собой среднее значение относительной остаточной активности гена Renilla в 3 культуральных лунках тестируемой группы по сравнению с контрольной группой.

Значение IC₅₀ тестируемой миРНК, нацеленной на GSCM, вычисляли на основании функции, соответствующей установленной кривой зависимости эффекта от дозы. Функция выглядит следующим образом:

в которой:

Y представляет собой отношение R, т.е. относительную остаточную активность (%) Renilla,

X представляет собой логарифм концентрации трансфецированных миРНК, Bot представляет собой значение Y в нижней части стационарной стадии, Тор представляет собой значение Y в верхней части стационарной стадии, X' представляет собой значение X, при котором Y представляет собой медианное значение между низом и верхом ассимптоты, a HillSlope (угловой коэффициент Хилла) представляет собой наклон кривой при X.

При Y=50%, соответствующее значение Х₅₀ определяли на основании кривой зависимости эффекта от дозы и соответствующей функции. Рассчитывали значение IC₅₀ каждой миРНК (значение IC₅₀=10^∧Х₅₀ (нМ)). Значения IC₅₀ и R² приведены в Таблице 6.

Таблица 6 и Фигуры 1A-1F показывают, что миРНК согласно настоящему изобретению проявляют относительно высокую ингибирующую активность в клетках НЕК293А в условиях in vitro, причем значения IC₅₀ находятся в диапазоне от 0,0194 нМ до 0,0561 нМ.

Последовательно получали кривые доза-эффект миРНК 1-6 в зависимости от соответствующих PSCM, GSSM и PSSM, применяя тот же способ, как и выше, за исключением того, что GSCM заменяли PSCM, GSSM и PSSM, соответственно. Результаты показывают, что каждая миРНК при каждой концентрации не оказывает ингибирующего действия на соответствующие нецелевые плазмиды PSCM, GSSM и PSSM.

Вышеуказанные результаты свидетельствуют о том, что миРНК согласно настоящему изобретению обладают хорошей нацеливающей специфичностью, и ни одна из смысловых цепей, затравочной области антисмысловой цепи и затравочной области смысловой цепи не имеет очевидного нецелевого эффекта.

Экспериментальный пример 2. Оценка эффективности конъюгатов миРНК у приматов, не являющихся человеком (NHP)

Обычные яванские макаки (массой тела 2,4-3,1 кг) в возрасте от 3 до 4 лет были разделены на 2 группы по массе тела. Каждой группе из 4 яванских макак, половину из которых составляли самцы, однократно делали подкожную инъекцию Конъюгата 4 или 5 соответственно.

Обычные яванские макаки (массой тела 4,0-5,5 кг) в возрасте от 4 до 5 лет были разделены на 3 группы по массе тела. Каждой группе из 3 яванских макак, все из которых были самцами, делали однократную подкожную инъекцию Конъюгата 1, 2 или 7, соответственно.

Каждый конъюгат готовили с помощью стерильной инъекции хлорида натрия в раствор 9 мг/мл (на основе миРНК; то же самое применимо далее). Объем, вводимый каждому животному, составлял 1 мл/кг, а вводимая доза составляла 9 мг/кг. День за n дней до введения называют D-n, день введения называют D1, а n-й день после введения называют Dn.

(2-1) Обнаружение мРНК PCSK9 в тканях печени

На день D-7 и день D15 пункцию печени выполняли, соответственно, на яванских макаках, которым в каждой группе вводили Конъюгат 1, Конъюгат 2, Конъюгат 4, Конъюгат 5 или Конъюгат 7. Во всех случаях отбирали ткань печени размером около 2×2×8 мм³ и хранили в 1,5 мл стерильной пробирке ЕР, содержащей 1 мл консервирующего раствора RNAIater (компания Sigma Aldrich). Образец помещали в холодильник при 4°С на 24 часа, затем его переносили для хранения при -80°С.

После этого образец тканей печени гомогенизировали с помощью гомогенизатора ткани. Затем общую РНК тканей печени экстрагировали и получали с применением тризола (компания Thermo Fisher) в соответствии со стандартными процедурами экстракции общей РНК.

Для общей РНК, экстрагированной из ткани печени каждого животного, 1 мкг общей РНК брали в качестве матрицы для обратной транскрипции, а реагент представленный в наборе для синтеза кДНК Goldenstar™ RT6 (приобретен у Beijing Tsingke Biotechnology Co., Ltd., номер по каталогу TSK301M), в котором в качестве праймера выбрали Goldenstar™ Oligo (dT)₁₇, использовали для получения 20 мкл реакционной системы обратной транскрипции в соответствии с приоритетами обратной транскрипции в инструкции к набору. Общая РНК каждой из вышеупомянутых тканей печени была обратно транскрибирована. Условия обратной транскрипции были следующими: каждую реакционную систему обратной транскрипции инкубировали при 50°С в течение 50 минут, затем инкубировали при 85°С в течение 5 минут и, наконец, инкубировали при 4°С в течение 30 секунд; после завершения реакции 80 мкл воды DEPC добавляли к каждой реакционной системе обратной транскрипции с получением кДНК-содержащего раствора.

Для каждой системы реакции обратной транскрипции в качестве матрицы для кПЦР брали 5 мкл вышеупомянутого раствора, содержащего кДНК, и реагент, представленный в наборе NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus (приобретен у Novoprotein Scientific Co., Ltd., номер по каталогу E096-01B) использовали для получения 20 мкл реакционной системы кПЦР где последовательности праймеров ПЦР используемые для амплификации целевого гена PCSK9 и гена внутреннего контроля GAPDH, показаны в Таблице 7, а конечная концентрация каждого праймера составляет 0,25 мкМ. Каждую реакционную систему кПЦР помещали в прибор для ПЦР в реальном времени ABI StepOnePlus и амплифицировали с применением трехэтапного метода. Процедуры амплификации состояли из предварительной денатурации при 95°С в течение 10 минут, денатурации при 95°С в течение 30 с и отжига при 60°С в течение 30 с с последующим продлением при 72°С в течение 30 с. После повторения вышеупомянутого процесса денатурации, отжига и продления 40 раз был получен продукт W, содержащий амплифицированный целевой ген PCSK9 и амплифицированный ген внутреннего контроля GAPDH. Затем продукт W инкубировали при 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 1 мин и 95°С в течение 15 с. Кривые плавления целевого гена PCSK9 и гена внутреннего контроля GAPDH в продукте W соответственно собирали с использованием флуоресцентного количественного ПЦР-инструмента в реальном времени, и получали значения Ct целевого гена PCSK9 и гена внутреннего контроля GAPDH.

Относительный количественный расчет уровня экспрессии целевого гена в дни D15 и D-7 PCSK9 проводили методом сравнения Ct (AACt). Метод расчета выглядит следующим образом:

ΔCt (D15)=Ct (целевой ген в D15) - Ct (ген внутреннего контроля в D15)

ΔCt (D-7)=Ct (целевой ген в D-7) - Ct (ген внутреннего контроля в D-7)

ΔCt (D15)=ACt (D15) - ΔCt (среднее значение в D-7)

ΔCt (D-7)=ACt (D-7) - ΔCt (среднее значение в D-7)

где ΔCt (среднее значение в D-7) представляет собой среднее арифметическое ΔCt (D-7) каждого животного перед введением. Таким образом, каждому животному соответствует значение ΔΔCt (D15) и ΔΔCt (D-7).

Уровень экспрессии мРНК PCSK9 в D15 у животного нормализовали на основе показателя в D-7 этого животного, при этом уровень экспрессии мРНК PCSK9 в D-7 определяли как 100%;

относительный уровень экспрессии мРНК PCSK9=2^(-ΔΔCt(D15)) × 100%;

скорость ингибирования конъюгата в отношении мРНК PCSK9=(1-2^(-ΔΔCt(D15)) × 100%.

Для группы животных, которым вводили один и тот же конъюгат, степень ингибирования конъюгата в отношении мРНК PCSK9 представляла собой среднее арифметическое показателей ингибирования у всех животных этой группы.

В Таблице 8 показана скорость ингибирования каждого конъюгата в отношении мРНК PCSK9 печени.

Как следует из Таблицы 8, после однократного введения 9 мг/кг для всех конъюгатов миРНК наблюдался уровень ингибирования более 56% в отношении мРНК PCSK9 на 15-й день после введения по сравнению с 7-м днем перед введением, при этом для Конъюгата 1 и Конъюгата 4 наблюдали уровни ингибирования до 79% и 81% в отношении мРНК PCSK9 в ткани печени NHP, соответственно.

(2-2) Определение содержания белка PCSK9 в сыворотке

У NHP, которому вводили Конъюгат 4, брали венозную кровь на D-15 и D-9 и D1, соответственно, перед введением, и на D3, D8, D14, D22 и D29, соответственно, после введения. После этого еженедельно выполняли забор крови в течение 18 недель до D127.

У NHP, которому вводили Конъюгат 1 или 7, брали венозную кровь на D-14 и D-7 и D1 соответственно перед введением, а также на D4, D8, D15, D22 и D29 соответственно после введения. После этого еженедельно выполняли забор крови в течение 12 недель до D85.

Сыворотку отделяли от каждого из собранных образцов крови при комнатной температуре.

(2-2-1) Определение содержания белка PCSK9 в сыворотке яванских макак, которым вводили Конъюгат 4

Выбирали сыворотку, отобранную на день D9, D8, D14, D85, D92, D99, D106 и D120 после введения Конъюгата 4, вышеупомянутую сыворотку, полученную в каждой временной точке, разбавляли 25 раз с помощью реагента для разведения калибратора RD5P (разведение 1:5) в наборе для ELISA человеческой пропротеинконвертазы 9/PCSK9 Quantikine (R&D Systems company, U.S., кат. №DPC900), и оптическую плотность каждой разведенной сыворотки при 450 нм определяли с помощью полноавтоматического считывателя микропланшетов (SYNERGY™ MX, компания Biotek) в соответствии с процедурами, описанными в инструкции к набору. В соответствии с каждой концентрацией разведения стандарта в наборе и соответствующим значением оптической плотности строили стандартную кривую, используя функцию линейной регрессии программного обеспечения Graphpad 5.0, и получали соответствующее линейное уравнение: Y=аХ+b, где а представляет собой наклон аппроксимирующей прямой линии, и b представляет собой соответствующее значение Y (точка пересечения) при X=0. Содержание белка PCSK9 в разведенной сыворотке может быть рассчитано путем подстановки измеренного значения оптической плотности каждой разведенной сыворотки в приведенное выше уравнение. Содержание белка PCSK9 в сыворотке, полученное в каждой временной точке, может быть получено в соответствии с временем разведения.

Нормированный уровень белка PCSK9 = (содержание белка PCSK9 после введения/содержание белка PCSK9 перед введением)

Степень ингибирования в отношении экспрессии белка PCSK9 = (содержание белка 1-PCSK9 после введения/содержание белка PCSK9 перед введением) × 100%;

причем содержание белка PCSK9 перед введением представляет собой содержание белка PCSK9 на D9.

Содержание белка PCSK9 в каждой временной точке после введения было нормализовано на основании содержания белка PCSK9 до введения; уровень белка PCSK9 до введения приняли как 100% и он представлен в виде D0 на Фигуре 2; на Фигуре 2 представлен нормализованный уровень белка PCSK9 в сыворотке, полученный в различных временных точках, после введения яванским макакам однократной подкожной инъекции Конъюгата 4 в дозировке 9 мг/кг.

(2-2-2) Определение содержания белка PCSK9 в сыворотке яванских макак, которым вводили Конъюгат 1 или 7

Содержание белка PCSK9 в сыворотке яванских макак, которым давали Конъюгат 1 или 7, определяли с помощью того же способа, как и в (2-2-1), за исключением того, что (1) отбирали сыворотку на D14, D7, D8, D15, D22, D29, D36, D43, D50, D57, D64 и D85; и (2) содержание белка PCSK9 перед введением представляло собой среднее арифметическое содержания двух белков PCSK9 на D14 и D7. На Фигуре 2 представлен нормализованный уровень белка PCSK9 в сыворотке, полученный в различных временных точках, после введения яванским макакам однократной подкожной инъекции Конъюгатов 1 или 7 в дозировке 9 мг/кг.

Как следует из Фигуры 2, на 14-й день после однократного введения для Конъюгата 4 наблюдали уровень ингибирования более 90% в отношении экспрессии белка PCSK9 в сыворотке NHP и уровень ингибирования более 50% в отношении экспрессии белка PCSK9 сохранялся до 12 недели после введения.

Для Конъюгата 7 на 22 день после однократного введения наблюдали уровень ингибирования 82% в отношении экспрессии белка PCSK9 в сыворотке NHP и уровень ингибирования более 66% в отношении экспрессии белка PCSK9 сохранялся до 9 недели после введения.

Для конъюгата 1 на 15-й день после однократного введения наблюдали уровень ингибирования 83% в отношении экспрессии белка PCSK9 в сыворотке NHP и уровень ингибирования более 65% в отношении экспрессии белка PCSK9 сохранялся до 7 недели после введения.

(2-3) Определение содержания липидов в сыворотке крови (Х-ЛПНП и СНО)

(2-3-1) Определение содержания липидов в сыворотке крови (Х-ЛПНП и СНО) яванских макак, которым вводили Конъюгат 4

Выбирали сыворотку, отобранную в каждой временной точке после введения Конъюгата 4 в пункте (2-2), и содержание липидов в сыворотке крови (LDL-C или СНО), полученной в каждой временной точке, измеряли с помощью полностью автоматического биохимического анализатора (Hitachi 7060) с использованием набора для анализа LDL-C (DENUO СН7538, Shanghai Zhicheng Biotechnology Co., Ltd.) или набора для анализа CHOL (DENUO СН7532, Shanghai Zhicheng Biotechnology Co., Ltd.) в соответствии с процедурами, описанными в инструкции.

Нормированный уровень липидов в крови = (содержание липидов в крови после введения/содержание липидов в крови до введения) × 100%.

Показатель ингибирования в отношении липида крови = (1 - содержание липида крови после введения/содержание липида крови перед введением) × 100%.

При этом содержание липидов в крови перед введением представляет собой среднее арифметическое содержания трех липидов в крови на D15, D9 и D1 перед введением; и липид в крови относится кХ-ЛПНП или СНО.

Содержание липидов в крови в каждой временной точке после введения нормализовали на основании содержания липидов в крови перед введением; уровень липидов в крови перед введением принимали за 100%, и он представлен в виде D0 на Фигуре 3 и Фигуре 4.

На Фигуре 3 и Фигуре 4, соответственно, представлены нормализованные уровни Х-ЛПНП и СНО в сыворотке, полученные в различных временных точках, после введения яванским макакам однократной подкожной инъекции Конъюгата 4 в дозировке 9 мг/кг.

(2-3-2) Определение содержания липидов в крови (Х-ЛПНП и СНО) в сыворотке яванских макак, которым вводили Конъюгат 7

Содержание липида в сыворотке крови (Х-ЛПНП и СНО) яванских макак, которым вводили Конъюгат 7, определяли тем же способом, как и в (2-3-1), за исключением того, что (1) сыворотку, полученную в каждый момент времени после введения Конъюгата 7 в (2-2), выбирали для обнаружения липида крови; и (2) содержание липида крови перед введением представляло собой среднее арифметическое содержания трех липидов крови на D14, D7 и D1 перед введением. На Фигуре 3 и Фигуре 4, соответственно, представлены нормализованные уровни Х-ЛПНП и СНО в сыворотке, полученные в различных временных точках, после введения яванским макакам однократной подкожной инъекции Конъюгата 2 в дозировке 9 мг/кг.

Как показано на Фигуре 3, Конъюгат 4 проявлял значительный ингибирующий эффект в отношении Х-ЛПНП с 14-го дня после однократного введения. На 22-й день после введения уровень ингибирования в отношении Х-ЛПНП для Конъюгата 4 составил 64%. В случае Конъюгата 4 уровень ингибирования в отношении Х-ЛПНП сохранялся более 50% со 2-й недели до 11-й недели после введения. В течение 127-дневного периода наблюдения уровень Х-ЛПНП в сыворотке NHR которым вводили Конъюгат 4, был всегда ниже, чем до введения.

Что касается Конъюгата 7, для него на 22-й день после однократного введения наблюдали уровень ингибирования 36% в отношении Х-ЛПНП. Для Конъюгата 7 уровень ингибирования в отношении Х-ЛПНП сохранялся около 30% со 2-й недели по 4-ую неделю после введения. В течение 11-недельного периода наблюдения уровень Х-ЛПНП в сыворотке NHP, которым вводили Конъюгат 7, был всегда ниже, чем до введения.

Как показано на Фигуре 4, начиная с 14-го дня после однократного введения, Конъюгат 4 также проявлял значительный ингибирующий эффект в отношении СНО. На 22-й день после введения для Конъюгата 4 наблюдали уровень ингибирования в отношении СНО до 38%. Для Конъюгата 4 уровень ингибирования в отношении СНО сохранялся более 30% со 2-й по 8-ую неделю после введения. В течение 127-дневного периода наблюдения уровень СНО в сыворотке NHP, которым вводили Конъюгат 4, был всегда ниже, чем до введения.

Что касается Конъюгата 7, на 22-й день после его однократного введения наблюдали уровень ингибирования в отношении СНО 38%. Для Конъюгата 7 скорость ингибирования в отношении СНО сохранялась в основном более 30% со 2-й по 8-ую неделю после введения. В течение 11-недельного периода наблюдения уровень СНО в сыворотке NHP, которым вводили Конъюгат 7, был всегда ниже, чем до введения.

(2-4) Регулярные анализы крови и функции свертывания до и после пункции печени

До и после пункции печени у животных, которым вводили Конъюгаты 4 или 5, проводили забор венозной крови. Проводили рутинный анализ крови и определяли функцию свертывания крови с помощью полноавтоматического гематологического анализатора пяти классификаций (ADVIA 2120/ADVIA 2120i, компания Siemens, Германия) и полноавтоматического анализатора свертывания крови (CA-7000/CS-2000i, компания Sysmex, Япония) соответственно. Результаты свидетельствуют о том, что введение каждого конъюгата не оказывает существенного влияния на рутинный анализ крови и функцию свертывания, что свидетельствует о том, что конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению обладают хорошей биологической безопасностью.

Экспериментальный пример 3. Оценка токсичности конъюгатов миРНК у крыс и мышей

В этом экспериментальном примере токсические реакции на конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению у мелких животных оценивали путем наблюдения за клиническими токсическими реакциями у крыс или мышей, которым вводили Конъюгат 1, 4 или 7, определения массы печени, рутинных анализов крови, биохимии крови, липидов крови и других показателей и проведения макроскопических анатомических и гистопатологических исследований.

(3-1) Оценка токсичности у крыс

(3-1-1) Испытание на токсичность у крыс линии SD, которым вводили Конъюгаты 1 или 4

Самцов крыс класса SPF SD в возрасте 6-9 недель и массой 210-250 г (приобретенные у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., номер лицензии на производство: SCXK (Beijing) 2016-0011 или SCXK (Beijing) 2016-0006) разделили на 3 группы в соответствии с их массой тела, по 5 крыс в каждой группе. Крысам подкожно вводили Конъюгат 1, Конъюгат 4 или 1 × PBS (рН=7,4) в качестве контроля. Дозу конъюгата вычисляли на основании массы тела. Каждый конъюгат готовили с 1 × PBS (рН=7,4) в 60 мг/мл раствора, объем введения составлял 5 мл/кг, а доза введения составляла 300 мг/кг.

После однократного подкожного введения определяли следующие показатели:

1) наблюдение за общим состоянием: наблюдение за общим состоянием осуществляли два раза в день;

(2) Масса тела: массу тела измеряли на D1 перед введением, D3, D6, D10 и D14 после введения и D15 (при проведении диссекции);

3) потребление пищи: потребление пищи измеряли соответственно на D2-3, D6-7 и D12-13;

(4) Гематология: На D15 перед диссекцией отбирали 1,9 мл крови из брюшной аорты крыс, где 1,0 мл образца крови антикоагулировали с помощью EDTA-K2, и цельную кровь непосредственно вводили для обнаружения следующих цитологических показателей крови: количества эритроцитов (RBC), количества лейкоцитов (WBC), количества тромбоцитов (PLT), гемоглобина (HGB), гематокрита (НСТ), среднего объема эритроцитов (MCV), среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (МСН), средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (МСНС), количества ретикулоцитов (RET), процента ретикулоцитов (RET%), количества и процента нейтрофилов (NEU), количества и процента лимфоцитов (LYM), количества и процента моноцитов (MONO), количества и процента эозинофилов (EOS) и количества и процента базофилов (BASO); а оставшийся 0,9 мл образца крови антикоагулировали натрий-цитратом и центрифугировали при 1800°С в течение от 25 минут до 10 минут для раздельного времени коагуляции плазмы (РТТ) и времени активации (тромбина);

(5) Биохимия крови: после введения 0,6 мл крови отбирали из яремной вены крысы на D2, и 3 мл крови собирали из брюшной аорты крысы на D15 перед диссекцией; образцы крови, ни один из которых не был антикоагулирован, центрифугировали при 1800×g при 15°С - 25°С в течение 10 минут и сыворотку отделяли для измерения биохимических показателей крови щелочной фосфатазы (ЩФ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), креатинкиназы (КК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), γ-глутамилтранспептидазы (ГГТ), мочевины (мочевины), креатинина (Креа), концентрации ионов натрия (Na⁺), концентрации ионов калия (К⁺), хлорида иона (Cl), глюкозы крови (ГЛЮКОЗЫ), общего билирубина (ТБИЛ), общего белка (TP), альбумина (ALB) и альбулина/глобулина (G/).

(6) Общая анатомия и гистопатологическое исследование: животных рассекали на D15, взвешивали каждый орган и проводили гистопатологическое исследование.

(3-1-2) Испытание на токсичность у крыс линии SD, которым вводили Конъюгат 7

Токсичность у крыс линии SD, которым вводили Конъюгат 7, определяли, применяя тот же способ, как и в (3-1-1), за исключением того, что Конъюгат 4 заменяли Конъюгатом 7; Конъюгат 7 получали с 1 × PBS (рН 7,4) в 20 мг/мл раствора и 6 мг/мл раствора, соответственно; объем введения составлял 5 мл/кг, а доза введения составляла 100 мг/кг и 30 мг/кг, соответственно. Для показателя (5) биохимии крови, кровь собирали на D8 и D15 после введения, соответственно, перед диссекцией.

Результаты показывают, что ни один из конъюгатов не показал очевидной токсичности у крыс.

(3-2) Оценка токсичности у мышей

Каждой группе из 10 мышей ICR класса SPF в возрасте 5-6 недель (приобретенных у SPF (Beijing) Biotechnology Co., LTD.), половину из которых составляли самцы, подкожно вводили Конъюгат 1, Конъюгат 4 или Конъюгат 7. Введение проводили один раз в неделю в течение 2 недель непрерывно, в общей сложности 3 раза (на D1, D8 и D15 соответственно). Дозу конъюгата вычисляли на основании массы тела. Каждый конъюгат готовили с 1 × PBS (рН=7,4) в 30 мг/мл раствора, объем введения составлял 10 мл/кг, а доза введения составляла 300 мг/кг.

После введения 3 раза определяли следующие показатели:

1) наблюдение за общим состоянием: наблюдение за общим состоянием осуществляли один раз в день;

(2) Масса тела: массу тела измеряли на D1, D8 и D15, а также перед введением и D16 (когда проводилась диссекция) соответственно;

3) потребление пищи: потребление пищи измеряли каждую неделю;

(4) Биохимический анализ крови: На D16, когда проводили диссекцию, 1 мл крови отбирали путем удаления глазного яблока и не антикоагулировали; кровь сначала инкубировали при 37°С в течение 60 минут, а затем центрифугировали при 4°С при 3000 об/мин в течение 15 минут для получения сыворотки для биохимического измерения крови; показатели теста были такими же, как и биохимические показатели крови в тесте токсичности на крысах.

(6) Общая анатомия и гистопатологическое исследование: животных рассекали на D16, взвешивали каждый орган и проводили гистопатологическое исследование.

Результаты показывают, что ни один из конъюгатов не продемонстрировал очевидной токсичности у мышей.

Вышеприведенные результаты показывают, что конъюгаты согласно настоящему изобретению обладают хорошей биологической безопасностью.

Некоторые варианты реализации настоящего изобретения подробно описаны выше, но настоящее изобретение не ограничено конкретными подробностями вышеприведенных вариантов реализации. Различные простые изменения технического решения настоящего изобретения могут быть выполнены в пределах объема технической концепции настоящего изобретения, и эти простые изменения находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Следует отметить, что каждый из конкретных технических признаков, описанных в вышеупомянутых вариантах реализации, может быть объединен любым подходящим способом, при условии, что не возникает противоречие. Чтобы избежать ненужного повторения, различные возможные способы комбинирования далее не будут описаны в настоящем изобретении.

Кроме того, различные варианты реализации настоящего изобретения также могут быть выполнены в любой комбинации, при условии, что не возникает противоречие идее настоящего изобретения, это также следует рассматривать как раскрытие настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>SuzhouRiboLifeScienceCo.,Ltd

<120> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, КОНЪЮГАТ,

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ

<130>FP1200369P

<150> 201910431319.2

<151> 2019-05-22

<150> 201910433243.7

<151> 2019-05-23

<160> 426

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 1

aagcaagcagacauuuaun

19

<210> 2

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 2

gauaaaugucugcuugcuu

19

<210> 3

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 3

aagcaagcagacauuuaun

19

<210> 4

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 4

nauaaaugucugcuugcuu

19

<210> 5

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 5

aagcaagcagacauuuaun

19

<210> 6

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 6

nauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 7

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 7

ccaagcaagcagacauuuaun

21

<210> 8

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 8

nauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 9

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 9

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 10

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 10

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 11

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 11

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 12

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 12

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 13

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 13

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 14

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 14

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 15

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 15

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 16

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 16

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 17

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 17

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 18

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 18

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 19

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 19

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 20

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 20

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 21

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 21

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 22

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 22

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 23

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 23

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 24

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 24

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 25

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 25

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 26

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 26

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 27

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 27

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 28

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 28

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 29

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 29

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 30

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 30

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 31

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 31

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 32

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 32

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 33

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 33

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 34

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 34

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 35

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 35

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 36

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 36

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 37

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 37

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 38

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 38

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 39

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 39

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 40

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 40

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 41

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 41

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 42

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 42

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 43

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 43

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 44

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 44

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 45

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 45

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 46

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 46

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 47

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 47

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 48

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 48

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 49

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 49

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 50

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 50

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 51

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 51

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 52

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 52

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 53

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 53

aagcaagcagacauuuauc

19

<210> 54

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 54

gauaaaugucugcuugcuugg

21

<210> 55

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 55

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 56

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 56

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 57

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 57

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 58

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 58

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 59

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 59

ccaagcaagcagacauuuauc

21

<210> 60

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 60

gauaaaugucugcuugcuugggu

23

<210> 61

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 61

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 62

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 62

uuaauaaaaaugcuacaaa

19

<210> 63

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 63

uuuguagcauuuuuauuan

19

<210> 64

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 64

nuaauaaaaaugcuacaaa

19

<210> 65

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 65

uuuguagcauuuuuauuan

19

<210> 66

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 66

nuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 67

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 67

guuuuguagcauuuuuauuan

21

<210> 68

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 68

nuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 69

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 69

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 70

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 70

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 71

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 71

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 72

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 72

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 73

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 73

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 74

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 74

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 75

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 75

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 76

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 76

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 77

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 77

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 78

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 78

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 79

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 79

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 80

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 80

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 81

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 81

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 82

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 82

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 83

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 83

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 84

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 84

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 85

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 85

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 86

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 86

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 87

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 87

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 88

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 88

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 89

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 89

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 90

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 90

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 91

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 91

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 92

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 92

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 93

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 93

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 94

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 94

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 95

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 95

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 96

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 96

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 97

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 97

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 98

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 98

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 99

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 99

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 100

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 100

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 101

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 101

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 102

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 102

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 103

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 103

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 104

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 104

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 105

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 105

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 106

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 106

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 107

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 107

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 108

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 108

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 109

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 109

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 110

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 110

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 111

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 111

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 112

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 112

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 113

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 113

uuuguagcauuuuuauuaa

19

<210> 114

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 114

uuaauaaaaaugcuacaaaac

21

<210> 115

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 115

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 116

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 116

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 117

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 117

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 118

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 118

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 119

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 119

guuuuguagcauuuuuauuaa

21

<210> 120

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 120

uuaauaaaaaugcuacaaaaccc

23

<210> 121

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 121

gccuggaguuuauucggaa

19

<210> 122

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 122

uuccgaauaaacuccaggc

19

<210> 123

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 123

gccuggaguuuauucggan

19

<210> 124

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 124

nuccgaauaaacuccaggc

19

<210> 125

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 125

gccuggaguuuauucggan

19

<210> 126

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 126

nuccgaauaaacuccaggccu

21

<210> 127

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 127

aggccuggaguuuauucggan

21

<210> 128

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 128

nuccgaauaaacuccaggccuau

23

<210> 129

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 129

gccuggaguuuauucggaa

19

<210> 130

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 130

uuccgaauaaacuccaggccu

21

<210> 131

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 131

aggccuggaguuuauucggaa

21

<210> 132

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 132

uuccgaauaaacuccaggccuau

23

<210> 133

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 133

gccuggaguuuauucggaa

19

<210> 134

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 134

uuccgaauaaacuccaggccu

21

<210> 135

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 135

gccuggaguuuauucggaa

19

<210> 136

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 136

uuccgaauaaacuccaggccu

21

<210> 137

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 137

gccuggaguuuauucggaa

19

<210> 138

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 138

uuccgaauaaacuccaggccu

21

<210> 139

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 139

aggccuggaguuuauucggaa

21

<210> 140

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 140

uuccgaauaaacuccaggccuau

23

<210> 141

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 141

aggccuggaguuuauucggaa

21

<210> 142

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 142

uuccgaauaaacuccaggccuau

23

<210> 143

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 143

aggccuggaguuuauucggaa

21

<210> 144

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 144

uuccgaauaaacuccaggccuau

23

<210> 145

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 145

gccuggaguuuauucggaa

19

<210> 146

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 146

uuccgaauaaacuccaggccu

21

<210> 147

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 147

gccuggaguuuauucggaa

19

<210> 148

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 148

uuccgaauaaacuccaggccu

21

<210> 149

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 149

gccuggaguuuauucggaa

19

<210> 150

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 150

uuccgaauaaacuccaggccu

21

<210> 151

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 151

aggccuggaguuuauucggaa

21

<210> 152

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 152

uuccgaauaaacuccaggccuau

23

<210> 153

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 153

aggccuggag uuuauucgga a

21

<210> 154

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 154

uuccgaauaa acuccaggcc uau

23

<210> 155

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 155

aggccuggag uuuauucgga a

21

<210> 156

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 156

uuccgaauaa acuccaggcc uau

23

<210> 157

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 157

gccuggaguu uauucggaa

19

<210> 158

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 158

uuccgaauaa acuccaggcc u

21

<210> 159

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 159

gccuggaguu uauucggaa

19

<210> 160

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 160

uuccgaauaa acuccaggcc u

21

<210> 161

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 161

gccuggaguu uauucggaa

19

<210> 162

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 162

uuccgaauaa acuccaggcc u

21

<210> 163

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 163

aggccuggag uuuauucgga a

21

<210> 164

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 164

uuccgaauaa acuccaggcc uau

23

<210> 165

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 165

aggccuggag uuuauucgga a

21

<210> 166

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 166

uuccgaauaa acuccaggcc uau

23

<210> 167

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 167

aggccuggag uuuauucgga a

21

<210> 168

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 168

uuccgaauaa acuccaggcc uau

23

<210> 169

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 169

gccuggaguu uauucggaa

19

<210> 170

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 170

uuccgaauaa acuccaggcc u

21

<210> 171

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 171

gccuggaguu uauucggaa

19

<210> 172

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 172

uuccgaauaa acuccaggcc u

21

<210> 173

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 173

gccuggaguu uauucggaa

19

<210> 174

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 174

uuccgaauaa acuccaggcc u

21

<210> 175

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 175

aggccuggag uuuauucgga a

21

<210> 176

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 176

uuccgaauaa acuccaggcc uau

23

<210> 177

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 177

aggccuggag uuuauucgga a

21

<210> 178

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 178

uuccgaauaa acuccaggcc uau

23

<210> 179

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 179

aggccuggag uuuauucgga a

21

<210> 180

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 180

uuccgaauaa acuccaggcc uau

23

<210> 181

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 181

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 182

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 182

aguuacaaaa gcaaaacag

19

<210> 183

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 183

cuguuuugcu uuuguaacn

19

<210> 184

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 184

nguuacaaaa gcaaaacag

19

<210> 185

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 185

cuguuuugcu uuuguaacn

19

<210> 186

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 186

nguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 187

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 187

accuguuuug cuuuuguaac n

21

<210> 188

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 188

nguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 189

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 189

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 190

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 190

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 191

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 191

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 192

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 192

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 193

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 193

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 194

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 194

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 195

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 195

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 196

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 196

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 197

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 197

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 198

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 198

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 199

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 199

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 200

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 200

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 201

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 201

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 202

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 202

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 203

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 203

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 204

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 204

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 205

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 205

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 206

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 206

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 207

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 207

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 208

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 208

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 209

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 209

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 210

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 210

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 211

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 211

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 212

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 212

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 213

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 213

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 214

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 214

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 215

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 215

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 216

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 216

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 217

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 217

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 218

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 218

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 219

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 219

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 220

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 220

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 221

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 221

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 222

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 222

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 223

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 223

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 224

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 224

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 225

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 225

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 226

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 226

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 227

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 227

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 228

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 228

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 229

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 229

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 230

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 230

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 231

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 231

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 232

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 232

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 233

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 233

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 234

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 234

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 235

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 235

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 236

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 236

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 237

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 237

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 238

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 238

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 239

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 239

accuguuuug cuuuuguaac u

21

<210> 240

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 240

aguuacaaaa gcaaaacagg ucu

23

<210> 241

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 241

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 242

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 242

auaaaaaugc uacaaaacc

19

<210> 243

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 243

gguuuuguag cauuuuuan

19

<210> 244

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 244

nuaaaaaugc uacaaaacc

19

<210> 245

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 245

gguuuuguag cauuuuuan

19

<210> 246

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 246

nuaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 247

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 247

uggguuuugu agcauuuuua n

21

<210> 248

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 248

nuaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 249

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 249

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 250

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 250

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 251

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 251

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 252

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 252

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 253

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 253

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 254

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 254

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 255

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 255

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 256

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 256

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 257

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 257

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 258

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 258

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 259

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 259

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 260

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 260

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 261

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 261

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 262

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 262

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 263

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 263

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 264

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 264

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 265

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 265

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 266

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 266

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 267

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 267

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 268

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 268

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 269

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 269

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 270

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 270

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 271

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 271

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 272

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 272

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 273

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 273

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 274

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 274

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 275

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 275

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 276

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 276

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 277

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 277

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 278

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 278

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 279

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 279

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 280

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 280

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 281

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 281

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 282

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 282

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 283

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 283

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 284

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 284

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 285

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 285

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 286

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 286

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 287

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 287

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 288

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 288

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 289

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 289

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 290

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 290

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 291

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 291

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 292

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 292

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 293

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 293

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 294

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 294

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 295

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 295

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 296

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 296

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 297

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 297

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 298

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 298

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 299

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 299

uggguuuugu agcauuuuua u

21

<210> 300

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 300

auaaaaaugc uacaaaaccc aga

23

<210> 301

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 301

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 302

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 302

uuuuauuuua aaaagucac

19

<210> 303

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 303

gugacuuuuu aaaauaaan

19

<210> 304

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 304

nuuuauuuua aaaagucac

19

<210> 305

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 305

gugacuuuuu aaaauaaan

19

<210> 306

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 306

nuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 307

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 307

uggugacuuu uuaaaauaaa n

21

<210> 308

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 308

nuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 309

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 309

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 310

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 310

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 311

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 311

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 312

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 312

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 313

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 313

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 314

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 314

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 315

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 315

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 316

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 316

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 317

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 317

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 318

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 318

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 319

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 319

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 320

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 320

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 321

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 321

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 322

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 322

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 323

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 323

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 324

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 324

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 325

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 325

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 326

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 326

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 327

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 327

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 328

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 328

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 329

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 329

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 330

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 330

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 331

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 331

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 332

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 332

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 333

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 333

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 334

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 334

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 335

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 335

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 336

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 336

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 337

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 337

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 338

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 338

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 339

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 339

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 340

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 340

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 341

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 341

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 342

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 342

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 343

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 343

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 344

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 344

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 345

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 345

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 346

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 346

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 347

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 347

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 348

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 348

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 349

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 349

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 350

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 350

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 351

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 351

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 352

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 352

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 353

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 353

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 354

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 354

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 355

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 355

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 356

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 356

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 357

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 357

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 358

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 358

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 359

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 359

uggugacuuu uuaaaauaaa a

21

<210> 360

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 360

uuuuauuuua aaaagucacc aua

23

<210> 361

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 361

aagcaagcag acauuuauc

19

<210> 362

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 362

gauaaauguc ugcuugcuug g

21

<210> 363

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 363

uuuguagcau uuuuauuaa

19

<210> 364

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 364

uuaauaaaaa ugcuacaaaa c

21

<210> 365

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 365

gccuggaguu uauucggaa

19

<210> 366

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 366

uuccgaauaa acuccaggcc u

21

<210> 367

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 367

cuguuuugcu uuuguaacu

19

<210> 368

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 368

aguuacaaaa gcaaaacagg u

21

<210> 369

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 369

gguuuuguag cauuuuuau

19

<210> 370

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 370

auaaaaaugc uacaaaaccc a

21

<210> 371

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 371

gugacuuuuu aaaauaaaa

19

<210> 372

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 372

uuuuauuuua aaaagucacc a

21

<210> 373

<211> 491

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 373

ggcgtgcctg ccaagctcac acagcaggaa ctgagccaga aacgcagatt gggctggctc

60

tgaagccaag cctcttctta cttcacccgg ctgggctcct catttttacg ggtaacagtg

120

aggctgggaa ggggaacaca gaccaggaag ctcggtgagt gatggcagaa cgatgcctgc

180

aggcatggaa ctttttccgt tatcacccag gcctgattca ctggcctggc ggagatgctt

240

ctaaggcatg gtcgggggag agggccaaca actgtccctc cttgagcacc agccccaccc

300

aagcaagcag acatttatct tttgggtctg tcctctctgt tgccttttta cagccaactt

360

ttctagacct gttttgcttt tgtaacttga agatatttat tctgggtttt gtagcatttt

420

tattaatatg gtgacttttt aaaataaaaa caaacaaacg ttgtcctaac aaaaaaaaaa

480

aaaaaaaaaa a

491

<210> 374

<211> 590

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 374

gcgtggccaa gggtgccagc atgcgcagcc tgcgcgtgct caactgccaa gggaagggca

60

cggttagcgg caccctcata ggcctggagt ttattcggaa aagccagctg gtccagcctg

120

tggggccact ggtggtgctg ctgcccctgg cgggtgggta cagccgcgtc ctcaacgccg

180

cctgccagcg cctggcgagg gctggggtcg tgctggtcac cgctgccggc aacttccggg

240

acgatgcctg cctctactcc ccagcctcag ctcccgaggt catcacagtt ggggccacca

300

atgcccaaga ccagccggtg accctgggga ctttggggac caactttggc cgctgtgtgg

360

acctctttgc cccaggggag gacatcattg gtgcctccag cgactgcagc acctgctttg

420

tgtcacagag tgggacatca caggctgctg cccacgtggc tggcattgca gccatgatgc

480

tgtctgccga gccggagctc accctggccg agttgaggca gagactgatc cacttctctg

540

ccaaagatgt catcaatgag gcctggttcc ctgaggacca gcgggtactg

590

<210> 375

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 375

gataaatgtc tgcttgcttg g

21

<210> 376

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 376

ttaataaaaa tgctacaaaa c

21

<210> 377

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 377

ttccgaataa actccaggcc t

21

<210> 378

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 378

agttacaaaa gcaaaacagg t

21

<210> 379

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 379

ataaaaatgc tacaaaaccc a

21

<210> 380

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 380

ttttatttta aaaagtcacc a

21

<210> 381

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 381

aacctaccta ctccatttat c

21

<210> 382

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 382

tggggtgcta cggtttatta a

21

<210> 383

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 383

cttaagttct gggattcgga a

21

<210> 384

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 384

caagtggggt aggttgtaac t

21

<210> 385

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 385

gtttggggtg ctaattttta t

21

<210> 386

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 386

gttgtcaggg ggcaaataaa a

21

<210> 387

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 387

tcgcccgtga ggcttgcttt t

21

<210> 388

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 388

ggccgccccc ggctacaaac a

21

<210> 389

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 389

ggaatccgcc cctccaggca g

21

<210> 390

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 390

ctggcacccc tcaaaacagt g

21

<210> 391

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК

<400> 391

cgcccccgta gacaaaacca c

21

<210> 392

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 392

ggggcggggc caaagtcaca c

21

<210> 393

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 393

gaaggggaac acagaccagg

20

<210> 394

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 394

ctccatcagg ccacagtgaa

20

<210> 395

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 395

gggagccaaa agggtcatca

20

<210> 396

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 396

cgtggactgt ggtcatgagt

20

<210> 397

<211> 22

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 397

cuagaccugu dtuugcuuuu gu

22

<210> 398

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 398

acaaaagcaa aacaggucua gaa

23

<210> 399

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 399

agaccuguuu ugcuuuugu

19

<210> 400

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 400

acaaaagcaa aacaggucu

19

<210> 401

<211> 20

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 401

agaccugudt uugcuuuugn

20

<210> 402

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 402

ncaaaagcaa aacaggucu

19

<210> 403

<211> 20

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 403

agaccugudt uugcuuuugn

20

<210> 404

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 404

ncaaaagcaa aacaggucua g

21

<210> 405

<211> 22

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 405

cuagaccugu dtuugcuuuu gn

22

<210> 406

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 406

ncaaaagcaa aacaggucua gaa

23

<210> 407

<211> 20

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 407

agaccugudt uugcuuuugu

20

<210> 408

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 408

acaaaagcaa aacaggucua g

21

<210> 409

<211> 22

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 409

cuagaccugu dtuugcuuuu gu

22

<210> 410

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 410

acaaaagcaa aacaggucua gaa

23

<210> 411

<211> 20

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 411

agaccugudt uugcuuuugu

20

<210> 412

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 412

acaaaagcaa aacaggucua g

21

<210> 413

<211> 22

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 413

cuagaccugu dtuugcuuuu gu

22

<210> 414

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 414

acaaaagcaa aacaggucua gaa

23

<210> 415

<211> 20

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 415

agaccugudt uugcuuuugu

20

<210> 416

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 416

acaaaagcaa aacaggucua g

21

<210> 417

<211> 22

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 417

cuagaccugu dtuugcuuuu gu

22

<210> 418

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 418

acaaaagcaa aacaggucua gaa

23

<210> 419

<211> 20

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 419

agaccugudt uugcuuuugu

20

<210> 420

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 420

acaaaagcaa aacaggucua g

21

<210> 421

<211> 22

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 421

cuagaccugu dtuugcuuuu gu

22

<210> 422

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 422

acaaaagcaa aacaggucua gaa

23

<210> 423

<211> 20

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 423

agaccugudtuugcuuuugu

20

<210> 424

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 424

acaaaagcaaaacaggucuag

21

<210> 425

<211> 22

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 425

cuagaccugudtuugcuuuugu

22

<210> 426

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 426

acaaaagcaa aacaggucua gaa

23

<---

Claims

1. Конъюгат миРНК для ингибирования экспрессии гена PCSK9 в гепатоцитах, который имеет структуру, представленную Формулой (308)

Формула (308),

где n1 представляет собой целое число от 1 до 3 и n3 представляет собой целое число от 0 до 4;

R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ или R₁₅ независимо представляют собой H или выбраны из группы, состоящей из C₁-C₁₀ алкила, C₁-C₁₀ галогеналкила и C₁-C₁₀ алкокси;

R₃ представляет собой группу, имеющую структуру, представленную Формулой (A59)

(A59)

где E₁ представляет собой OH, SH или BH₂;

Nu представляет собой миРНК;

миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь; каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид; причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II представляют собой последовательности, выбранные из одной из следующих групп i)-vi):

5’ - AAGCAAGCAGACAUUUAUZ₁ - 3’ (SEQ ID NO: 1);

5’ - Z₂AUAAAUGUCUGCUUGCUU - 3’ (SEQ ID NO: 2),

где Z₁представляет собой C и Z₂ представляет собой G, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₃ в положении, соответствующем Z₁; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₄ в положении, соответствующем Z₂, где нуклеотид Z₄ представляет собой первый нуклеотид с 5’-конца антисмысловой цепи;

5’ - UUUGUAGCAUUUUUAUUAZ₅ - 3’ (SEQ ID NO: 61);

5’ - Z₆UAAUAAAAAUGCUACAAA - 3’ (SEQ ID NO: 62),

где Z₅представляет собой A и Z_b представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₇ в положении, соответствующем Z₅; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₈ в положении, соответствующем Z₆, где нуклеотид Z₈ представляет собой первый нуклеотид с 5’-конца антисмысловой цепи;

5’ - GCCUGGAGUUUAUUCGGAZ₉ - 3’ (SEQ ID NO: 121);

5’ - Z₁₀UCCGAAUAAACUCCAGGC - 3’ (SEQ ID NO: 122),

где Z₉представляет собой A и Z₁₀ представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₁ в положении, соответствующем Z₉; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₁₂ в положении, соответствующем Z₁₀, где нуклеотид Z₁₂ представляет собой первый нуклеотид с 5’-конца антисмысловой цепи;

5’ - CUGUUUUGCUUUUGUAACZ₁₃ - 3’ (SEQ ID NO: 181);

5’ - Z₁₄GUUACAAAAGCAAAACAG - 3’ (SEQ ID NO: 182),

в которой Z₁₃представляет собой U , и Z₁₄ представляет собой A, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₅ в положении, соответствующем Z₁₃; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₁₆ в положении, соответствующем Z₁₄, где нуклеотид Z₁₆ представляет собой первый нуклеотид с 5’-конца антисмысловой цепи;

v) нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 241, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 242, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

5’ - GGUUUUGUAGCAUUUUUAZ₁₇ - 3’ (SEQ ID NO: 241);

5’ - Z₁₈UAAAAAUGCUACAAAACC - 3’ (SEQ ID NO: 242),

где Z₁₇ представляет собой U и Z₁₈ представляет собой A, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₉ в положении, соответствующем Z₁₇; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₂₀ в положении, соответствующем Z₁₈, где нуклеотид Z₂₀ представляет собой первый нуклеотид с 5’-конца антисмысловой цепи;

vi) нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 301, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 302, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

5’ - GUGACUUUUUAAAAUAAAZ₂₁ - 3’ (SEQ ID NO: 301);

5’ - Z₂₂UUUAUUUUAAAAAGUCAC - 3’ (SEQ ID NO: 302),

где Z₂₁ представляет собой A, и Z₂₂ представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₂₃ в положении, соответствующем Z₂₁; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₂₄ в положении, соответствующем Z₂₂, где нуклеотид Z₂₄ представляет собой первый нуклеотид с 5’-конца антисмысловой цепи;

R₂ представляет собой линейный алкилен от 1 до 20 атомов углерода в длину, причем один или более атомов углерода необязательно замещен любой одной или более группой, выбранной из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)₂, C₂-C₁₀ алкенилен, C₂-C₁₀ алкинилен, C₆-C₁₀ арилен, C₃-C₁₈ гетероциклилен и C₅-C₁₀ гетероарилен; и при этом R₂ необязательно содержит любой один или более заместитель, выбранный из группы, состоящей из: C₁-C₁₀ алкил, C₆-C₁₀ арил, C₅-C₁₀ гетероарил, C₁-C₁₀ галогеналкил, OC₁-C₁₀ алкил, OC₁-C₁₀ алкилфенил, -C₁-C₁₀ алкилOH, OC₁-C₁₀ галогеналкил, SC₁-C₁₀ алкил, SC₁-C₁₀ алкилфенил, -C₁-C₁₀ алкилSH, SC₁-C₁₀ галогеналкил, галоген, OH, -SH, NH₂, C₁-C₁₀ алкилNH₂, N(C₁-C₁₀ алкил)(C₁-C₁₀алкил), NH(C₁-C₁₀ алкил), -N(C₁-C₁₀ алкил) (C₁-C₁₀ алкилфенил), -NH(C₁-C₁₀ алкилфенил), циано, нитро, CO₂H, C(O)O(C₁-C₁₀ алкил), CON(C₁-C₁₀ алкил)(C₁-C₁₀ алкил), CONH(C₁-C₁₀ алкил), CONH₂, NHC(O)(C₁-C₁₀ алкил), NHC(O)(фенил), N(C₁-C₁₀ алкил)C(O)(C₁-C₁₀ алкил), N(C₁-C₁₀ алкил)C(O)(фенил), C(O)C₁-C₁₀ алкил, C(O)C₁-C₁₀ алкилфенил, C(O)C₁-C₁₀ галогеналкил, OC(O)C₁-C₁₀ алкил, -SO₂(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂(фенил), -SO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил), -SO₂NH₂, SO₂NH(C₁-C₁₀ алкил), SO₂NH(фенил), -NHSO₂(C₁-C₁₀ алкил), -NHSO₂(фенил) и NHSO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил);

каждый L₁ независимо представляет собой линейный алкилен от 1 до 70 атомов углерода в длину, причем один или более атом углерода необязательно замещен любой одной или более группой, выбранной из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)₂, C₂-C₁₀ алкенилен, C₂-C₁₀ алкинилен, C₆-C₁₀ арилен, C₃-C₁₈ гетероциклилен и C₅-C₁₀ гетероарилен; и при этом L₁ необязательно содержит любой один или более заместитель, выбранный из группы, состоящей из: C₁-C₁₀ алкил, C₆-C₁₀ арил, C₅-C₁₀гетероарил, C₁-C₁₀ галогеналкил, OC₁-C₁₀ алкил, OC₁-C₁₀ алкилфенил, -C₁-C₁₀ алкилOH, OC₁-C₁₀ галогеналкил, SC₁-C₁₀ алкил, SC₁-C₁₀ алкилфенил, -C₁-C₁₀ алкилSH, SC₁-C₁₀ галогеналкил, галоген, OH, -SH, NH₂, C₁-C₁₀ алкилNH₂, N(C₁-C₁₀ алкил)(C₁-C₁₀ алкил), NH(C₁-C₁₀ алкил), -N(C₁-C₁₀ алкил)(C₁-C₁₀ алкилфенил), -NH(C₁-C₁₀ алкилфенил), циано, нитро, CO₂H, C(O)O(C₁-C₁₀ алкил), CON(C₁-C₁₀ алкил)(C₁-C₁₀ алкил), CONH(C₁-C₁₀ алкил), CONH₂, NHC(O)(C₁-C₁₀ алкил), NHC(O)(фенил), N(C₁-C₁₀ алкил)C(O)(C₁-C₁₀ алкил), N(C₁-C₁₀ алкил)C(O)(фенил), C(O)C₁-C₁₀ алкил, C(O)C₁-C₁₀ алкилфенил, C(O)C₁-C₁₀ галогеналкил, OC(O)C₁-C₁₀ алкил, -SO₂(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂(фенил), -SO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил), -SO₂NH₂, SO₂NH(C₁-C₁₀ алкил), SO₂NH(фенил), -NHSO₂(C₁-C₁₀ алкил), -NHSO₂(фенил) и NHSO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил);

представляет собой положение, в котором группа ковалентно присоединена; и M₁ представляет собой нацеливающую группу;

где каждая из нацеливающих групп независимо представляет собой лиганд, который связывается с рецепторами асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов млекопитающего; или

каждая из указанных нацеливающих групп независимо представляет собой асиалогликопротеин или сахарид; или

каждая из нацеливающих групп независимо выбрана из группы, состоящей из D-маннопиранозы, L-маннопиранозы, D-арабинозы, D-ксилофуранозы, L-ксилофуранозы, D-глюкозы, L-глюкозы, D-галактозы, L-галактозы, α-D-маннофуранозы, β-D-маннофуранозы, α-D-маннопиранозы, β-D-маннопиранозы, α-D-глюкопиранозы, β-D-глюкопиранозы, α-D-глюкофуранозы, β-D-глюкофуранозы, α-D-фруктофуранозы, α-D-фруктопиранозы, α-D-галактопиранозы, β-D-галактопиранозы, α-D-галактофуранозы, β-D-галактофуранозы, глюкозамина, сиаловой кислоты, галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-трифторацетилгалактозамина, N-пропионилгалактозамина, N-n-бутирилгалактозамина, N-изобутирилгалактозамина, 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы, 2-дезокси-2-метиламино-L-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино-D-глюкопиранозы, N-гликолил-α-нейраминовой кислоты, 5-тио-β-D-глюкопиранозы, метил-2,3,4-трис-O-ацетил-1-тио-6-O-тритил-α-D-глюкопиранозида, 4-тио-β-D-галактопиранозы, этил-3,4,6,7-тетра-O-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-α-D-глюкогептопиранозида, 2,5-ангидро-D-аллононитрила, рибозы, D-рибозы, D-4-тиорибозы, L-рибозы, L-4-тиорибозы; или

по меньшей мере одна или каждая из указанных нацеливающих групп представляет собой галактозу или N-ацетилгалактозамин.

2. Конъюгат миРНК по п. 1, где каждый L₁ независимо выбран из группы, состоящей из групп Формул (A1)-(A26) и любых их комбинаций:

где

каждый j1 независимо представляет собой целое число от 1 до 20; каждый j2 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;

каждый R’ независимо представляет собой C₁-C₁₀ алкил;

каждый Ra независимо выбран из группы, состоящей из групп Формул (A27)-(A45) или любых их комбинаций:

каждый Rb независимо представляет собой C₁-C₁₀ алкил;

или L₁ выбран из соединенных комбинаций одной или более из Формул (A1), (A4), (A5), (A6), (A8), (A10), (A11) и (A13);

или L₁ выбран из соединенных комбинаций по меньшей мере двух из Формул (A1), (A4), (A8), (A10) и (A11);

или L₁ выбран из соединенных комбинаций по меньшей мере двух из Формул (A1), (A8) и (A10);

или длина L₁ составляет от 3 до 25 атомов;

или длина L₁ составляет от 4 до 15 атомов;

представляет собой положение, в котором группа ковалентно присоединена.

3. Конъюгат миРНК по п. 1 или 2, где каждый m1, m2 или m3 независимо друг от друга представляет собой целое число от 2 до 5 и/или m1 = m2 = m3.

4. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-3, где R₂ содержит и положение, соединяющееся с атомом N на азотистом остове, и положение, соединяющееся с атомом P в R₃; или

в R₂ положение, соединяющееся с атомом N на азотистом остове, образует амидную связь с атомом N, а положение, соединяющееся с атомом P в R₃, образует сложную фосфоэфирную связь с атомом P;

или R₂ представляет собой группу со структурой, представленной любой из Формул (B5), (B6), (B5’) или (B6’),

в которых представляет собой положение, в котором группа ковалентно присоединена; и

q₂ представляет собой целое число от 1 до 10.

5. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-4, где указанный конъюгат имеет структуру, представленную Формулой (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421) или (422):

Формула (403)

Формула (404)

Формула (405)

Формула (406)

Формула (407)

Формула (408)

Формула (409)

Формула (410)

Формула (411)

Формула (412)

Формула (413)

Формула (414)

Формула (415)

Формула (416)

Формула (417)

Формула (418)

Формула (419)

Формула (420)

Формула (421)

Формула (422).

6. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-5, где атом P в Формуле (A59) соединен с концевой областью смысловой или антисмысловой цепи миРНК и концевая область относится к первым 4 нуклеотидам, отсчитанным от одного конца смысловой или антисмысловой цепи; или

атом P в Формуле (A59) соединен с одним концом смысловой или антисмысловой цепи миРНК; или

атом P в Формуле (A59) соединен с 3’-концом смысловой цепи миРНК; или

атом P в Формуле (A59) соединен с положением 2’, 3’ или 5’ нуклеотида в миРНК путем образования сложной фосфодиэфирной связи.

7. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-6, где i) нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1; и/или указанная нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; или

ii) нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 61; и/или указанная нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62; или

iii) нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 121; и/или указанная нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 122; или

iv) нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 181; и/или указанная нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 182;

v) нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 241; и/или указанная нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 242; или

vi) нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 301; и/или указанная нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 302.

8. Конъюгат миРНК по п. 7, где i) различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, включает различие в положении Z₄, где Z₄ выбран из A, U или C; или

ii) различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 62, включает различие в положении Z₈, где Z₈ выбран из A, C или G; или

iii) различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 122, включает различие в положении Z₁₂, где Z₁₂ выбран из A, C или G; или

iv) различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 182, включает различие в положении Z₁₆, где Z₁₆ выбран из U, C или G;

v) различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:242, включает различие в положении Z₂₀, где Z₂₀ выбран из U, C или G; или

vi) различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 302, включает различие в положении Z₂₄, где Z₂₄ выбран из A, C или G;

где Z₃ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₄; или

Z₇ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₈; или

Z₁₁ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₂; или

Z₁₅ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₆; или

Z₁₉ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₀; или

Z₂₃ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z_24.

9. Конъюгат миРНК по п. 7 или 8, где

смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III,

антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV; и

каждая из нуклеотидной последовательности III и нуклеотидной последовательности IV независимо имеет длину 1-4 нуклеотида; нуклеотидная последовательность III соединена с 5’-концом нуклеотидной последовательности I; нуклеотидная последовательность IV соединена с 3’-концом нуклеотидной последовательности II; нуклеотидная последовательность III имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV, и они по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны друг другу;

термин «по существу обратнокомплементарный» означает, что в двух нуклеотидных последовательностях содержится не более чем 1 неправильно спаренное основание;

термин «полностью обратнокомплементарный» означает отсутствие неправильно спаренных оснований в двух нуклеотидных последовательностях.

10. Конъюгат миРНК по п. 9, где i) нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4; и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют 1 нуклеотид в длину и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой C; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CC; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CCC; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой ACCC; или

ii) нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63; нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64; и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют 1 нуклеотид в длину и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой U; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GU; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GGU; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GGGU; или

iii) нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 123; нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 124; и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют 1 нуклеотид в длину и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой G; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AG; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UAG; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AUAG; или

iv) нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 183; нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 184; и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют 1 нуклеотид в длину и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой C; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AC; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GAC; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AGAC;

v) нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 243; нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 244; и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют 1 нуклеотид в длину и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой G; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UG; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CUG; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UCUG; или

vi) нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 303; нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 304; и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют 1 нуклеотид в длину и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой G; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AUG; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UAUG.

11. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-10, где антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность V, которая имеет длину 1-3 нуклеотида и соединена с 3’-концом антисмысловой цепи с образованием 3’- липкого конца антисмысловой цепи; или

нуклеотидная последовательность V имеет 2 нуклеотида в длину; или

нуклеотидная последовательность V представляет собой 2 непрерывных тиминовых дезоксирибонуклеотида или 2 непрерывных урациловых рибонуклеотида; или

нуклеотидная последовательность V является комплементарной нуклеотидам в соответствующих положениях целевой мРНК.

12. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-11, где смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6; или

смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8; или

смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66; или

смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 67, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68; или

смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 125, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 126; или

смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 127, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 128; или

смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 185, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 186; или

смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 187, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 188; или

смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 245, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 246; или

смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 247, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 248; или

смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 305, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 306; или

смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 307, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 308.

13. Конъюгат миРНК по любому из пп. 7-12, где миРНК имеет нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NOs: 9-12, SEQ ID NOs: 69-72, SEQ ID NOs: 129-132, SEQ ID NOs: 189-192, SEQ ID NOs: 249-252 или SEQ ID NOs: 309-312.

14. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-13, где каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо представляет собой модифицированный атомом фтора нуклеотид или нуклеотид с модификацией, не содержащей атом фтора; или

модифицированные атомом фтора нуклеотиды расположены внутри нуклеотидных последовательностей I и II; и в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды по меньшей мере в положениях 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I представляют собой модифицированные атомом фтора нуклеотиды; и в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды по меньшей мере в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II представляют собой модифицированные атомом фтора нуклеотиды; или

в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 или 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи представляют собой модифицированные атомом фтора нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи представляют собой нуклеотиды с модификацией, не содержащей атом фтора; в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 или 2, 6, 8, 9, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные атомом фтора нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи представляют собой нуклеотиды с модификацией, не содержащей атом фтора.

15. Конъюгат миРНК по п. 14, где каждый нуклеотид с модификацией, не содержащей атом фтора, независимо представляет собой нуклеотид, образованный путем замещения 2’-гидроксила рибозной группы нуклеотида группой, отличной от фтора, или аналог нуклеотида; или

нуклеотид, образованный путем замещения 2’-гидроксила рибозной группы нуклеотида группой, отличной от фтора, выбран из группы, состоящей из 2’-алкокси-модифицированного нуклеотида, 2’-замещенного алкокси-модифицированного нуклеотида, 2’-алкил-модифицированного нуклеотида, 2’-замещенного алкил-модифицированного нуклеотида, 2’-амино-модифицированного нуклеотида, 2’-замещенного амино-модифицированного нуклеотида и 2’-дезоксинуклеотида; и аналог нуклеотида, выбранный из группы, состоящей из изонуклеотида, LNA, ENA, cET, UNA и GNA; или

каждый нуклеотид с модификацией, не содержащей атом фтора, представляет собой метокси-модифицированный нуклеотид, где метокси-модифицированный нуклеотид относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы метоксигруппой.

16. Конъюгат миРНК по п. 14 или 15, где в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды в положениях 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные атомом фтора нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды в положениях 2, 6, 8, 9, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные атомом фтора нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; или

в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды в положениях 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные атомом фтора нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные атомом фтора нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; или

в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные атомом фтора нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и в направлении от 5’-конца к 3’-концу нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные атомом фтора нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды.

17. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-16, где миРНК имеет нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NOs: 13-24, SEQ ID NOs: 73-84, SEQ ID NOs: 133-144, SEQ ID NOs: 193-204, SEQ ID NOs: 253-264 или SEQ ID NOs: 313-324.

18. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-17, где в миРНК по меньшей мере одна фосфатная группа представляет собой фосфотиоатную группу и фосфотиоатная связь присутствует в по меньшей мере одном из группы, состоящей из следующих положений:

положение между первым и вторым нуклеотидами на 5’-конце смысловой цепи;

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 5’-конце смысловой цепи;

положение между первым и вторым нуклеотидами на 3’-конце смысловой цепи;

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 3’-конце смысловой цепи;

положение между первым и вторым нуклеотидами на 5’-конце антисмысловой цепи;

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 5’-конце антисмысловой цепи;

положение между первым и вторым нуклеотидами на 3’-конце антисмысловой цепи; и

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 3’-конце антисмысловой цепи.

19. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-18, где миРНК имеет нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NOs: 25-36, SEQ ID NOs: 85-96, SEQ ID NOs: 145-156, SEQ ID NOs: 205-216, SEQ ID NOs: 265-276 или SEQ ID NOs: 325-336.

20. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-19, где 5’-концевой нуклеотид в антисмысловой цепи миРНК представляет собой 5’-фосфатный нуклеотид или нуклеотид, модифицированный аналогом 5’-фосфата; или

5’-концевой нуклеотид представляет собой нуклеотид со структурой, представленной Формулой (2); и нуклеотид, модифицированный аналогом 5’-фосфата, представляет собой нуклеотид со структурой, представленной любой из Формул (3)-(6):

где R выбран из H, OH, метокси или F;

«Основание» представляет собой основание, выбранное из A, U, C, G или T.

21. Конъюгат миРНК по любому из пп. 1-20, где миРНК имеет нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NOs: 37-60, SEQ ID NOs: 97-120, SEQ ID NOs: 157-180, SEQ ID NOs: 217-240, SEQ ID NOs: 277-300 или SEQ ID NOs: 337-360.

22. Применение конъюгата миРНК по любому из пп. 1-21 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения заболеваний или патологических состояний, вызванных избыточной экспрессией гена PCSK9.

23. Способ лечения или предотвращения заболеваний и/или патологических состояний, вызванных избыточной экспрессией гена PCSK9, включающий введение эффективного количества конъюгата миРНК по любому из пп. 1-21 субъекту, страдающему от указанных заболеваний или патологических состояний.

24. Способ ингибирования экспрессии гена PCSK9 в гепатоцитах, включающий приведение эффективного количества конъюгата миРНК по любому из пп. 1-21 в контакт с гепатоцитами.