TWI826405B - 化合物、綴合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

一種用於與活性劑例如寡核苷酸形成綴合物的化合物，該化合物具有如式(321)所示的結構。本公開還提供了相應的綴合物。本公開的綴合物能夠特異性地標靶肝細胞，從而有效解決寡核苷酸藥物的體內遞送的相關問題，毒性低，並在保持所遞送的寡核苷酸高度穩定的同時，還具有優異的遞送效率

Description

化合物、綴合物及其用途
本公開涉及藥物領域，具體而言涉及一種用於藉由與活性藥物形成綴合物來遞送活性藥物的化合物及其製備方法和用途。本公開還涉及由該化合物形成的綴合物。
遞送系統是小核酸藥物開發中的關鍵技術之一，一種小核酸遞送系統是針對肝細胞的標靶綴合遞送技術。
根據本發明的一方面，本公開提供了一種化合物，該化合物具有式(321)所示的結構：
Figure 107142925-A0305-02-0002-3
 其中， n1為1-3的整數，n3為0-4的整數；每個m1、m2和m3各自獨立地為2-10的整數；R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地選自H、C1-C10烷基、C1-C10鹵代烷基和C1-C10烷氧基；R4為能夠藉由共價鍵與活性藥物或活性劑結合的基團；每個L1是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的群組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C6-C10亞芳基、C3-C18亞雜環基和C5-C10亞雜芳基；並且其中，L1任選地具有由以下基團所組成的群組中的任何一個或多個的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10雜芳基、C1-C10鹵代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10鹵代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10鹵代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10鹵代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10鹵代烷基)；每個S1獨立地為M1，其中任何活性羥基，如果有的話，都被羥基保護基團保護； 每個M1獨立地選自能夠和細胞表面受體結合的配體。
在一些實施方式中，每個L1獨立地選自於由基團A1-A26及其任意組合所組成的群組：
Figure 107142925-A0305-02-0004-4
Figure 107142925-A0305-02-0005-5
 其中，每個j1獨立地為1-20的整數；每個j2獨立地為1-20的整數；每個R’獨立地為C1-C10烷基；每個Ra獨立地選自於由基團A27-A45及其任意組合所組成的群組：
Figure 107142925-A0305-02-0005-623
Figure 107142925-A0305-02-0006-7
 每個Rb獨立地為C1-C10烷基；
Figure 107142925-A0305-02-0006-624
表示基團連接至分子其餘部分的位點。
在本發明的一個方面，本公開提供了一種綴合物，該綴合物具有式(1)所示的結構：
Figure 107142925-A0305-02-0006-8
 其中： n1為1-3的整數，n3為0-4的整數；m1、m2和m3各自獨立地為2-10的整數；R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地選自H、C1-C10烷基、C1-C10鹵代烷基或C1-C10烷氧基；R3為活性藥物；R2是長度為1-20個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於由以下所組成的群組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C6-C10亞芳基、C3-C18亞雜環基和C5-C10亞雜芳基；並且其中，R2任選地具有由以下基團所組成的群組中的任何一個或多個的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10雜芳基、C1-C10鹵代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10鹵代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10鹵代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10鹵代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10鹵代烷基)；每個L1獨立地為長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的群組中的任何一個或多個所替 換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C6-C10亞芳基、C3-C18亞雜環基和C5-C10亞雜芳基；並且其中，L1任選地具有由以下基團所組成的群組中的任何一個或多個的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10雜芳基、C1-C10鹵代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10鹵代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10鹵代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10鹵代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10鹵代烷基)；每個M1選自能夠和細胞表面受體結合的配體之一。
在一些實施方式中，每個L1獨立地選自於由基團A1-A26及其任意組合所組成的群組：
Figure 107142925-A0305-02-0008-9
Figure 107142925-A0305-02-0009-11
Figure 107142925-A0305-02-0009-12
、以及
Figure 107142925-A0305-02-0009-14
；其中，每個j1獨立地為1-20的整數；每個j2獨立地為1-20的整數；每個R’獨立地為C1-C10烷基； 每個Ra獨立地選自式A27-A45基團及其任意組合：
Figure 107142925-A0305-02-0010-15
Figure 107142925-A0305-02-0011-16
 每個Rb獨立地為C1-C10烷基；
Figure 107142925-A0305-02-0011-625
表示基團連接至分子其餘部分的位點。
在本發明的一個方面，本文提供了一種本文公開的綴合物在用於製備治療和/或預防由肝細胞中特定基因的表達而引起的病理狀態或疾病的藥物中的應用。
在本發明的一個方面，本文提供了一種治療有需要的受試者中因肝細胞中特定基因的表達而引起的病理狀態或疾病的方法，該方法包括向受試者給予有效劑量的本文公開的綴合物。
在本發明的一個方面，本文提供了一種抑制在肝細胞中特定基因的表達的方法，該方法包括和本文公開的綴合物接觸。
在本發明的一個方面，本文提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含本文公開的綴合物。
本公開的其他特徵和優點將在後文予以詳細說明。
以引用的方式併入
本說明書中提及的所有出版物、專利以及專利申請均以引用的方式併入本文，其程度與每一單獨的出版物、專利或專利申請均明確地並且單獨地以引用的方式併入本文的程度相同。
所附的申請專利範圍中詳細的闡述了本發明的新穎特徵，本發明的特點和優點將藉由以下闡述了說明性實施方案的詳細描述以及圖式得到更好的理解，這些說明性實施方案利用本發明的原理，其中圖式為：第1A圖和第1B圖示出了siRNA綴合物在體外Tritosome中的穩定性試驗的半定量結果。
第2A圖和第2B圖示出了測試siRNA綴合物在體外人血漿中的穩定性試驗的半定量結果。
第3A圖和第3B圖示出了測試siRNA綴合物在體外猴血漿中的穩定性試驗的半定量結果。
第4圖至第11圖為示出以下PK/TK血漿濃度或組織濃度的經時代謝曲線：10mg/kg劑量下，綴合物24在大鼠血漿中(第4圖)；10mg/kg劑量下，綴合物24在大鼠肝和腎中(第5圖)；50mg/kg劑量下，綴合物24在大鼠血漿中(第6圖)；50mg/kg劑量下，綴合物24在大鼠肝和腎中(第7圖)；10mg/kg劑量下，綴合物25在大鼠血漿中(第8圖)；10mg/kg劑量下，綴合物25在大鼠肝和腎中(第9圖)；50mg/kg劑量下，綴合物25在大鼠血漿中(第10圖)；50mg/kg劑量下，綴合物25在大鼠肝和腎中(第11圖)。
第12A圖、第12B圖、第12C圖和第12D圖分別示出了綴合物24抑制GSCM表達的IC50值的測定，分別對照GSSM、PSCM和PSSM。
第13圖至第15圖示出了本公開的綴合物在體內對HBV mRNA的抑制作用。
第16圖示出了本公開的綴合物對HBV轉基因小鼠血清中HBsAg表達的隨時間變化的抑制作用。
第17圖示出了本公開的綴合物對HBV轉基因小鼠血清中HBV DNA表達的隨時間變化的抑制作用。
第18圖示出了本公開的綴合物25對HBV轉基因小鼠血清中HBsAg表達的隨時間變化的抑制作用。
第19圖示出了本公開的綴合物對M-Tg模型中HBsAg表達的隨時間變化的抑制作用。
第20圖示出了本公開的綴合物對M-Tg模型中HBsAg表達的隨時間變化的抑制作用。
第21圖示出了本公開的綴合物對1.28copy HBV-Tg模型中HBsAg表達的隨時間變化的抑制作用。
第22圖至第24圖示出了本公開的綴合物對靶mRNA相對於脫靶mRNA的抑制作用。
第25圖至第27圖示出了本公開的綴合物在體內對HBV mRNA的抑制作用。
第28圖示出了本公開的綴合物對HBV轉基因小鼠血清中HBsAg表達的隨時間變化的抑制作用。
第29圖示出了本公開的綴合物對HBV轉基因小鼠血清中HBsAg表達的隨時間變化的抑制作用。
第30圖示出了本公開的綴合物在第85天時對HBV mRNA的體內抑制作用。
第31圖示出了綴合物43對HBV轉基因小鼠血清中HBsAg表達的隨時間變化的抑制作用。
第32圖示出了綴合物43對HBV轉基因小鼠血清中HBV DNA表達的隨時間變化的抑制作用。
第33圖和第34圖示出了綴合物167在人源和鼠源溶酶體裂解液中的穩定性。
第35圖示出了綴合物168在1.28copy HBV-Tg模型中對HBsAg表達的隨時間變化的抑制作用。
第36圖示出了綴合物168在1.28copy HBV-Tg模型中對HBeAg表達的隨時間變化的抑制作用。
第37圖示出了綴合物168在1.28copy HBV-Tg模型中對HBV DNA表達的隨時間變化的抑制作用。
第38A圖和第38B圖示出了在第14天和第28天時的ANGPTL mRNA表達的抑制率。
第39A圖和第39B圖示出了本公開的綴合物對血脂的抑制率，以血清中的總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)表示。
第40A圖和第40B圖示出了綴合物115對血脂的隨時間變化的抑制率，以血清總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)表示。
第41A圖和第41B圖示出了綴合物115和111對血脂的隨時間變化的抑制率，以血清總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)表示。
第42A圖、第42B圖、第42C圖和第42D圖示出了綴合物111在不同劑量下對血脂的隨時間變化的抑制率，以血清總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)表示。
第43A圖和第43B圖示出了綴合物25和169對血脂的隨時間變化的抑制率，以血清總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)表示；第43C圖示出了ANGPTL mRNA表達的抑制率。
第44A圖示出了在第14天時，肝中APOC3表達的抑制率，第44B圖和第44C圖示出了不同劑量的綴合物144對血脂的抑制率，以血清總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)表示。
第45A圖和第45B圖示出了不同劑量的綴合物170對血脂的抑制率，以血清總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)表示。
第46A圖、第46B圖、第46C圖和第46D圖示出了本公開的綴合物對血脂的抑制率，以血清總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)表示。
以下對本公開的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用於說明和解釋本公開，而不旨在在任何方面限制本公開。
定義
在本公開的上下文中，如無特別說明，大寫字母C、G、U和A表示核苷酸的鹼基組成；小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為2’-甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為2’-氟修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接；P1表示該P1右側相鄰的一個核苷酸為5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸類似物修飾的核苷酸，尤指乙烯基磷酸酯修飾的核苷酸(以下實施例中以VP表 示)、5’-磷酸核苷酸(以下實施例中以P表示)或5’-硫代磷酸酯修飾的核苷酸(以下實施例中以Ps表示)。
在本公開的上下文中，表述“互補”或“反向互補”可互相替代使用，並具有本領域中眾所周知的含義，即，在雙鏈核酸分子中，一條鏈的鹼基各自與另一條鏈上的鹼基以互補的方式相配對。在DNA中，嘌呤鹼基腺嘌呤(A)始終與嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中為尿嘧啶(U))相配對；嘌呤鹼基鳥嘌呤(G)始終與嘧啶鹼基胞嘧啶(C)相配對。每個鹼基對都包括一個嘌呤和一個嘧啶。當鏈上的腺嘌呤始終與另一條鏈上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配對，以及鳥嘌呤始終與胞嘧啶配對時，兩條鏈被認為是互補的，鏈的鹼基序列可從其互補鏈的序列推斷出來。與此相應地，“錯配”指在雙鏈核酸中，對應位置上的鹼基並未以互補配對的形式存在。
在本公開的上下文中，如無特別說明，“基本上反向互補”是指兩段核苷酸序列中存在不多於3個的鹼基錯配；“基本上完全反向互補”是指兩段核苷酸序列中存在不多於1個的鹼基錯配；“完全反向互補”指兩段核苷酸序列中不存在鹼基錯配。
在本公開的上下文中，一條核苷酸序列與另外一條核苷酸序列之間的“核苷酸差異”指核苷酸序列間相同位置的核苷酸的鹼基發生了改變，例如，在第二序列中核苷酸鹼基為A，而在第一序列相同位置處的鹼基為U、C、G或者T的情況下，認為兩序列之間在該位置處存在核苷酸差異。在一些實施方式中，以無鹼基核苷酸或者核苷酸類似物代替某位置的核苷酸時，也認為在該位置處存在核苷酸差異。
在本公開文中，特別是在描述製備本公開所述的綴合分子或siRNA綴合物的方法時，除非另有說明，核苷單體(nucleoside monomer)指，根據欲製備的RNA序列，所述“未修飾或修飾RNA亞磷醯胺(unmodified or modified RNA phosphoramidite)”，分別用於所謂的固相亞磷醯胺合成，固相亞磷醯胺合成是本領域合成RNA眾所周知的方法。在文中其他地方RNA亞磷醯胺也被稱為核苷亞磷醯胺(nucleoside phosphoramidite)。本公開所使用的核苷單體均可商購得到。
如本文所使用的，不介於兩個字母之間或兩個符號之間的短橫(“-”)是用於指示取代基連接點。例如：-C1-C10烷基-NH2藉由C1-C10烷基而連接。
如本文所使用的，“任選的”或“任選地”是指其後描述的事件或狀況可以發生或不發生，並且該描述包括事件或狀況發生的情況和不發生的情況。例如，“任選地取代的烷基”包括下文定義的“烷基”和“取代烷基”。所屬技術領域具有通常知識者會理解，對於包含一個或多個取代基的任何基團，這些基團不旨在引入空間上不現實、合成上不可行和/或本身不穩定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定數量的碳原子的直鏈和支鏈，通常為1至20個碳原子，例如1至10個碳原子，如1至8個或1至6個碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6個碳原子的直鏈和支鏈烷基。當提及具有特定數量的碳的烷基殘基時，旨在涵蓋具有該數量的碳的所有支鏈和直鏈形式；因此，例如，“丁基”意味著包括正丁基、仲丁基、異丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和異丙基。亞烷基是烷基的子集，指與烷基相同、但具有兩個連接點的殘基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一個碳-碳雙鍵的不飽和支鏈或直鏈烷基，所述碳-碳雙鍵是藉由從母體烷基的相鄰碳原子中除去一分子氫而獲得的。該基團關於雙鍵可以為順式或反式構型。典型的烯基基團包括但不限於：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、 丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些實施方式中，烯基基團具有2到20個碳原子，而在其他實施方式中，具有2至10個、2至8個或2至6個碳原子。亞烯基是烯基的子集，指與烯基相同、但具有兩個連接點的殘基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一個碳-碳三鍵的不飽和支鏈或直鏈烷基，所述碳-碳三鍵是藉由從母體烷基的相鄰碳原子中除去兩分子氫而獲得的。典型的炔基基團包括但不限於：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些實施方式中，炔基具有2到20個碳原子，而在其他實施方式中，具有2至10、2至8或2至6個碳原子。亞炔基是炔基的子集，指的是與炔基相同、但有兩個連接點的殘基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指藉由氧橋連接的指定數量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、異戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10個、1至8個、1至6個，或1至4個藉由氧橋連接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指藉由從環碳原子上去除氫原子而衍生自芳香族單環或多環烴環系統的基團。所述芳香族單環或多環烴環系統僅含有氫和6至18個碳原子的碳，其中所述環系統中的至少一個環是完全不飽和的，即，其包含根據Hückel理論的環狀、非定域化的(4n+2)π-電子體系。芳基包括但不限於諸如苯基、芴基和萘基的基團。亞芳基是芳基的子集，指與芳基相同、但具有兩個連接點的殘基。
如本文所使用的，“環烷基”是指非芳香族碳環，其通常具有3至7個環碳原子。環可以是飽和的，或具有一個或多個碳-碳雙鍵。環烷基的實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基和環己烯基，以及橋聯和籠狀環基團，如降冰片烷(norbornane)。
如本文所使用的，“鹵素取代基”或“鹵素”指氟代、氯代、溴代和碘代，術語“鹵素”包括氟、氯、溴和碘。
如本文所使用的，“鹵代烷基”是指指定數量的碳原子被一個或多個、直至最大允許數量的鹵素原子取代的如上述所定義的烷基。鹵代烷基的實例包括但不限於三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。
“雜環基”是指穩定的3至18元非芳香族環基，其包含2-12個碳原子和選自氮、氧和硫的1-6個雜原子。除非說明書中另有說明，否則雜環基是單環、雙環、三環或四環系統，可包括稠環或橋環系統。雜環基中的雜原子可以任選地被氧化。一個或多個氮原子(如果存在的話)任選地被季銨化。雜環基是部分飽和或完全飽和的。雜環基可以藉由任何環原子連接至分子的其餘部分。此類雜環基的實例包括但不限於：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫醯基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氫異喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、異噻唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、2-氧雜呱嗪基、2-氧雜呱啶基、2-氧雜吡咯烷基、噁唑烷基、呱啶基、呱嗪基、4-呱啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎寧環基、噻唑烷基、四氫呋喃基、三硫醯基(trithianyl)、四氫吡喃基、硫代嗎啉基、硫雜嗎啉基、1-氧代硫嗎啉基和1,1-二氧代硫嗎啉基。
“雜芳基”指由3至18元芳香族環自由基衍生的基團，其包含2個至17個碳原子和選自氮、氧和硫的1至6個雜原子。如本文所使用的，雜芳基可以是單環、雙環、三環或四環系統，其中環系統中的至少一個環是完全不飽和的，即，其包含根據Hückel理論的環狀非定域化(4n+2)π-電子體系。雜芳基包 括稠環或橋環系統。雜芳基中的雜原子被任選地氧化。一個或多個氮原子(如果存在的話)任選地被季銨化。雜芳基藉由任何環原子連接至分子的其餘部分。雜芳基的實例包括但不限於：氮雜環庚三烯基、吖啶基、苯並咪唑基、苯並吲哚基、1,3-苯並二噁唑基、苯並呋喃基、苯並噁唑基、苯並[d]噻唑基、苯並噻二唑基、苯並[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯並[b][1,4]噁嗪基、1,4-苯並二噁烷基、苯並萘並呋喃基、苯並噁唑基、苯並間二氧雜環戊烯基(benzodioxolyl)、苯並二噁英基(benzodioxinyl)、苯並吡喃基、苯並吡喃酮基、苯並呋喃基、苯並呋喃酮基、苯並噻吩基、苯並噻吩並[3,2-d]嘧啶基、苯並三唑基、苯並[4,6]咪唑並[1,2-a]吡啶基、哢唑基、噌啉基、環戊烷並[d]嘧啶基、6,7-二氫-5H-環戊烷並[4,5]噻吩並[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氫苯並[h]喹唑啉基、5,6-二氫苯並[h]噌啉基、6,7-二氫-5H-苯並[6,7]環庚烷並[1,2-c]噠嗪基、二苯並呋喃基、二苯並噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃並[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷並[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷並[d]噠嗪基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷並[d]吡啶基、異噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、異吲哚基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、異喹啉基、吲哚嗪基、異噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氫喹唑啉基、萘啶基、1,6-萘啶酮基、噁二唑基、2-氧雜吖庚因基、噁唑基、氧雜環丙烷基、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氫苯並[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑並[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶並[3,2-d]嘧啶基、吡啶並[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、異喹啉基、四氫喹啉基、5,6,7,8-四氫喹唑啉基、5,6,7,8-四氫苯並[4,5]噻吩並[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氫-5H-環庚烷並[4,5]噻吩並[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氫吡啶並[4,5-c]噠嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩並[2,3-d]嘧啶基、噻吩並[3,2-d]嘧啶基、噻吩並[2,3-c]吡啶基和苯硫基(即噻吩基)。
在本公開中可以使用各種羥基保護基團。一般來說，保護基團使化學官能團對特定的反應條件不敏感，並且可以在分子中的該官能團上添加以及去除，而不實質上損害分子的其餘部分。代表性的羥基保護基團公開於Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版，第二章，John Wiley & Sons，New York，1991中，其各自以引用的方式整體併入本文。在一些實施方式中，保護基團在鹼性條件下穩定，但可以在酸性條件下脫除。在一些實施方式中，本文可使用的羥基保護基的非排他性實例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、單甲氧基三苯甲基、9-苯基氧雜蒽-9-基(Pixyl)和9-(對甲氧基苯基)氧雜蒽-9-基(Mox)。在一些實施方式中，本文可使用的羥基保護基的非排他性實例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受試者”一詞，如本文所使用的，指任何動物，例如哺乳動物或有袋動物。本發明的受試者包括但不限於人類、非人靈長類(例如，恆河猴或其他類型的獼猴)、小鼠、豬、馬、驢、牛、綿羊、大鼠和任何種類的家禽。
如本文所使用的，“治療”、“減輕”或“改善”可在此處互換使用。這些術語指的是獲得有益的或期望的結果的方法，包括但不限於治療益處。“治療益處”意味著根除或改善被治療的潛在障礙。此外，治療益處藉由根除或改善與潛在障礙相關的一個或多個生理症狀，從而在患者中觀察到改善而獲得，儘管患者可能仍然受到潛在障礙的折磨。
如本文所使用的，“防止”和“預防”可互換使用。這些術語指獲得有益或期望的結果的方法，包括但不限於預防性益處。為了獲得“預防性益處”， 可將綴合物或組合物給予有罹患特定疾病風險的患者，或給予報告疾病的一種或多種生理症狀的受試者，即便可能該疾病的診斷尚未作出。
綴合分子
在一個方面，本文公開了一種用於遞送活性劑或活性藥物的綴合分子。在一些實施方式中，本文公開的綴合分子用於組織特異性標靶。在一些實施方式中，本文公開的綴合分子與細胞表面受體結合。為此目的，任何細胞表面受體或生物標誌物或其一部分都被認為是合適的。在一些實施方式中，本文公開的綴合分子特異性地結合到特定組織的特有受體，從而實現組織特異性標靶。在一些實施方式中，本文公開的綴合分子特異性標靶肝細胞表面受體，從而特異性標靶肝組織。在一些實施方式中，本文公開的綴合分子特異性標靶肝細胞特有的細胞表面受體。在一些實施方式中，本文公開的綴合分子特異性標靶肝表面的去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)。
如本文所使用的，“活性劑”和“活性藥物”可互換使用，都是指能夠藉由本文公開的綴合分子遞送的分子。在一些實施方式中，活性劑為期望遞送到肝細胞的試劑。這些試劑為所屬技術領域具有通常知識者所熟知的，包括但不限於功能性核苷酸，如功能性寡核苷酸，特別是本文公開的那些。
在一些實施方式中，本公開提供了一種綴合分子，該綴合分子具有式(321)所示的結構：
Figure 107142925-A0305-02-0022-17
其中： n1為1-3的整數，n3為0-4的整數；m1、m2和m3各自獨立地為2-10的整數；R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地選自H、C1-C10烷基、C1-C10鹵代烷基和C1-C10烷氧基；R4為能夠藉由共價鍵與活性藥物或活性劑結合的基團；每個L1是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的群組中的一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C6-C10亞芳基、C3-C18亞雜環基和C5-C10亞雜芳基；並且其中，L1任選地具有由以下基團所組成的群組中的任何一個或多個的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10雜芳基、C1-C10鹵代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10鹵代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10鹵代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10鹵代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10鹵代烷基)；每個S1獨立地為M1，其中任何活性羥基，如果有的話，都被羥基保護基團保護；每個M1獨立地選自能夠和細胞表面受體結合的配體。
在一些實施方式中，n1可為1-3的整數，n3可為0-4的整數，從而保證所述綴合分子中至少存在2個S1基團；在一些實施方式中，n1+n3
Figure 107142925-A0305-02-0024-626
2，這樣可以使得由該綴合分子形成的綴合物中，M1配體的個數可以至少為3，從而使得M1配體與肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體更容易結合，這可以促進綴合物藉由內吞作用進入細胞。實驗表明，當M1配體的個數大於3個時，M1配體與肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體結合的容易程度增加並不明顯，因此，從合成容易程度、結構/製程成本和遞送效率等多方面綜合考慮，在一些實施方式中，n1為1-2的整數，n3為0-1的整數，且n1+n3=2-3。
在一些實施方式中，當m1、m2和m3各自獨立地選自2-10的整數時，認為可能使得由該綴合分子形成的綴合物中，多個M1配體之間的空間位置適合M1配體與肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體的結合，為了使本公開提供的綴合分子更為簡單，更容易合成和/或降低成本，根據本公開的一些實施方式，m1、m2和m3各自獨立地為2-5的整數，在一個實施方式中，m1=m2=m3。
所屬技術領域具有通常知識者可以理解，當R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地選自H、C1-C10烷基、C1-C10鹵代烷基和C1-C10烷氧基時，不改變本公開提供的綴合分子的性質，均可實現本公開的目的。在一些實施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立的選自H、甲基或乙基。在一些實施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15均為H。
R4為能夠結合到藉由本公開的綴合分子遞送的活性劑的基團。在一些實施方式中，R4為能夠結合到待藉由本公開的綴合分子遞送的寡核苷酸的基團。在一些實施方式中，R4為能夠藉由共價鍵與寡核苷酸結合的基團。在一些實施方式中，R4為能夠藉由磷酸二酯鍵與寡核苷酸結合的基團。在一些實施 方式中，R4選擇為實現與含氮骨架上的N原子的連接，並且為合成寡核苷酸綴合物提供合適的反應位點。在本公開的上下文中，“含氮骨架”是指鏈結構，其中連接有R10、R11、R12、R13、R14和R15的碳原子與N原子互相連接。在一些實施方式中，R4可為能夠以適當方式連接至含氮骨架上的N原子的基團。在一些實施方式中，R4包含連接於含氮骨架上的N原子的位點以及可經反應而藉由磷酸二酯鍵綴合至寡核苷酸的任意官能團。
在一些實施方式中，R4含有能夠與寡核苷酸或核苷酸上的基團反應形成磷酸酯鍵的第1官能團，和能夠與羥基或氨基形成共價鍵的第2官能團，或者含有由所述共價鍵連接的固相載體。在一些實施方式中，第1官能團為亞磷醯胺、羥基或被保護的羥基。在一些實施方式中，第2官能團為亞磷醯胺、羧基或羧酸鹽。在一些實施方式中，第2官能團為經與羥基或氨基形成的共價鍵連接至分子其它部分的固相載體。在一些實施方式中，所述固相載體經由磷酸酯鍵、羧酸酯鍵或醯胺鍵連接。在一些實施方式中，所述固相載體為樹脂。
在一些實施方式中，所述第1官能團含有羥基、-ORk或式(C3)所示的基團；和/或所述第2官能團含有式(C1)、(C2)、(C3)、(C1’)或(C3’)所示的基團：
Figure 107142925-A0305-02-0025-18
Figure 107142925-A0305-02-0026-19
 式中，q1為1-4的整數，X為O或NH，M+為陽離子，Rk為羥基保護基團，SPS表示固相載體，
Figure 107142925-A0305-02-0026-627
表示基團共價連接的位點。
在一些實施方式中，第1官能團含有亞磷醯胺官能團，如式(C3)所示的基團，該亞磷醯胺官能團可以與核苷酸上的任意位置的羥基，如2’位羥基或3’位羥基發生偶聯，並經氧化形成磷酸二酯鍵，從而將綴合分子綴合至寡核苷酸。因此，即使第2官能團不存在，本文公開的綴合分子也能夠綴合到核苷酸上。該情況下，綴合分子適合於與核苷酸序列中末端核苷酸上的羥基反應，並在後續的氧化過程中形成磷酸二酯鍵，從而將本公開的綴合分子綴合至寡核苷酸。
在一些實施方式中，所述第1官能團含有被保護的羥基。在一些實施方式中，所述第2官能團含有對固相載體有反應性的基團，以提供含有固相載體的綴合分子。在一些實施方式中，第2官能團含有羧基、羧酸鹽或亞磷醯胺，如式(C1)、(C2)或(C3)所示。羧基或羧酸鹽可以與固相載體，例如樹脂上的羥基或氨基進行酯化反應或醯胺化反應，形成含有經羧酸酯鍵連接的固相載體或經醯胺鍵連接的固相載體的綴合分子。亞磷醯胺可以與通用固相載體，例如樹脂上的羥基發生偶聯反應，並經後續的氧化形成經磷酸二酯鍵連接的固相載體。由此，根據本發明的一方面，提供了一種用這種綴合分子來製備本公開的綴合物的方法。在一些實施方式中，該方法包括首先將綴合分子與固相載體藉由縮合或偶聯反應進行連接，然後按照固相亞磷醯胺合成方法加入 核苷單體，從而得到包含綴合至寡核苷酸的本公開的綴合分子的本公開的綴合物。在一些實施方式中，在亞磷醯胺固相合成過程中，第1官能團發生脫保護，隨後在偶聯反應條件下與核苷上的亞磷醯胺基團發生偶聯，在一些實施方式中，R4含有第1官能團和第2官能團，所述第1官能團含有羥基或被保護的羥基；所述第2官能團含有羧酸酯鍵、醯胺鍵或磷酸二酯鍵，或者藉由羧酸酯鍵、醯胺鍵或磷酸二酯鍵連接的固相載體。在一些實施方式中，第2官能團為如式(C1’)或(C3’)所示的基團。在一些實施方式中，當第2官能團含有固相載體時，含有所述固相載體的綴合分子用於本公開綴合物的製備。因此，在本發明的一方面，提供了一種用所述綴合分子製備本公開的綴合物的方法。在一些實施方式中，該方法包括將含有固相載體的綴合分子與核苷單體按照亞磷醯胺固相合成方法進行反應，從而將本公開的綴合分子綴合到寡核苷酸上。在一些實施方式中，所述含有固相載體的綴合分子可藉由綴合分子與固相載體反應在內部得到，所述綴合分子具有羧基、羧酸鹽或亞磷醯胺。在一些實施方式中，綴合分子可以由供應商提供。
在一些實施方式中，羧酸鹽可以表示為─COO-M+，其中，M+是陽離子，例如選自金屬陽離子，銨陽離子NH4 +或有機銨陽離子。在一些實施方式中，所述金屬離子可為鹼金屬離子，如K+或Na+。出於提高溶解性、使反應順利進行的考慮，在一些實施方式中，有機銨陽離子為三級胺形成的銨陽離子或季銨陽離子，如，三乙胺形成的銨離子或N,N-二異丙基乙胺形成的銨陽離子。在一些實施方式中，羧酸鹽是三乙胺羧酸鹽或N,N-二異丙基乙胺羧酸鹽。
在本公開的一些實施方式中，R4為式(B9)、(B10)、(B9’)、(B10’)、(B11)、(B12)、(B11’)或(B12’)所示的基團：
Figure 107142925-A0305-02-0028-20
 其中，q1為1-4的整數，q2為1-10的整數，X為O或NH，M+為陽離子，Rk為羥基保護基團，SPS表示固相載體，
Figure 107142925-A0305-02-0028-628
表示基團共價連接的位點。在一些實施方式中，q1為1或2。在一些實施方式中，q2為1-5的整數。在一些實施方式中，R4含有式(B9)或(B10)所示的基團。在一些實施方式中，R4含有式(B11)或(B12)所示的基團。
在一些實施方式中，Rk為Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)、TMTr(4,4’,4’-三甲氧基三苯甲基)中的一種或多種。在一些實施方式中，Rk是DMTr。
L1是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的群組中的一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C6-C10亞芳基、C3-C18亞雜環基和C5-C10亞雜芳基；並且其中，L1任選地具有由以下基團所組成的群組中的任何一個或多個的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10雜芳基、C1-C10鹵代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10鹵代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10鹵代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10鹵代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10鹵代烷基)。所屬技術領域具有通常知識者會理解，儘管為了方便起見，L1被定義為線性亞烷基，但是它可能不是線性基團或者名稱不同，例如由於上述替換和/或取代而產生的胺或烯基。為了本公開的目的，L1的長度是連接兩個連接點的鏈中 的原子數。為此目的，將替換所述直鏈亞烷基的碳原子而得到的環(如亞雜環基或亞雜芳基)計為一個原子。
在一些實施方式中，L1的作用是將M1配體(或對應的S1基團)與含氮骨架上的N原子連接，從而為本公開的綴合物提供肝標靶功能。在一些實施方式中，L1選自式A1-A26基團中的任何一種或其任意組合。在一些實施方式中，L1為A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的任何一種或任意組合。在一些實施方式中，L1為A1、A4、A8、A10和A11中至少2個的組合。在一些實施方式中，L1為A1、A8、A10中至少2個的組合。
在一些實施方式中，L1的長度可為3-25、3-20、4-15或5-12個原子。在一些實施方式中，L1的長度為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55或60個原子。根據本公開的一些實施方式中，j1為2-10的整數，在一些實施方式中，j1為3-5的整數。在一些實施方式中，j2為2-10的整數，在一些實施方式中，j2為3-5的整數。R’為C1-C4烷基，在一些實施方式中，R’為甲基、乙基和異丙基中的一種。Ra為A27、A28、A29、A30和A31中的一種，在一些實施方式中，Ra為A27或A28。Rb為C1-C5烷基，在一些實施方式中，Rb為甲基、乙基、異丙基和丁基中的一種。在一些實施方式中，分別對式A1-A26中的j1、j2、R’、Ra、Rb進行選擇，以實現在由綴合分子形成的寡核苷酸綴合物中，M1配體與含氮骨架上的N原子連接，並使M1配體之間的空間位置更適合於使M1配體與肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體結合。
每個M1獨立地選自能夠和細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個M1為能夠和肝細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式 中，至少一個M1為能夠和哺乳動物細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個M1為能夠和人肝細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個M1為能夠和肝表面去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)結合的配體。
在一些實施方式中，M1可能是對哺乳動物肝細胞表面上的去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)具有親合力的任何一種配體，這些配體的種類為所屬技術領域具有通常知識者所公知。在一些實施方式中，至少一個M1為糖。在一些實施方式中，每個M1為糖。在一些實施方式中，至少一個M1為單糖、二糖、三糖或多糖。在一些實施方式中，每個M1為單糖、二糖、三糖或多糖。在一些實施方式中，至少一個M1是修飾的糖。在一些實施方式中，每個M1為修飾的糖。在一些實施方式中，每個M1獨立地選自多糖、修飾的多糖、單糖或單糖衍生物。在一些實施方式中，每個或至少一個M1可能獨立地選自於由以下糖所組成的群組：葡萄糖及其衍生物、甘露糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖及其衍生物、麥芽糖及其衍生物、阿拉伯糖及其衍生物、果糖及其衍生物以及唾液酸。
在一些實施方式中，每個或至少一個M1可能獨立地選自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺、N-異丁醯基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖、 2-脫氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脫氧-4-甲醯胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脫氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇醯基-α-神經氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙醯基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙醯基-2-脫氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脫水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。在一些實施方式中，至少一個M1為N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)。在一些實施方式中，每個M1均為N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)。配體選擇可參見例如CN105378082A的公開內容，以引用的方式將其全部公開內容併入本文。
CN105378082A公開了一種包含修飾寡核苷酸和綴合基團的化合物，所述綴合基團包含至少一個磷連接基團或中性連接基團及1個或多個配體。每個配體選自多糖、修飾多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脫氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脫氧-4-甲醯胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脫氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇醯基-α-神經氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙醯基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙醯基-2-脫氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脫水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。據稱，該化合物可以降低細胞中核酸轉錄物的量或活性。
WO2016077321A1公開了眾多特異性標靶HBV基因的siRNA以及對其進行遞送的方法，並藉由對siRNA的核苷酸進行修飾，從而增強了siRNA的血清穩定性。該文獻還公開了siRNA綴合物，並且進一步具體公開了數種siRNA綴合物。
WO2016168286A1公開了眾多特異性標靶ANGPTL3基因的siRNA以及對其進行遞送的方法，並藉由對siRNA的核苷酸進行修飾，從而增強了siRNA的血清穩定性。該文獻還公開了siRNA綴合物。
N-乙醯半乳糖胺(N-acetylgalgactosamine，GalNAc)是一種與肝表面去唾液酸糖蛋白受體結合的配體。去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是肝細胞特異性表達的一種內吞型受體。近年來，N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)作為標靶分子以將小RNA遞送至肝臟。例如，阿爾尼拉姆公司(Alnylam pharmaceuticals,Inc.)首次報道了基於GalNAc綴合技術的siRNA在小鼠體內發揮干擾活性(Nair等，J.Am.Chem.Soc.,2014，136，16958-16961)。文章報道了綴合至三簇GalNAc的siRNA，在體內和體外實驗中均展現了良好的遞送活性。藉由皮下給藥的小鼠體內實驗，單一劑量的ED50確定為1mg/kg，單次注射劑量小於1ml。在長期給藥實驗中，每週皮下注射一次，可獲得長達9個月的穩定干擾活性。
在一些實施方式中，S1獨立的為M1。在一些實施方式中，S1獨立地是M1中至少一個活性羥基被羥基保護基團保護的基團。在一些實施方式中，S1獨立地是M1中全部活性羥基(如果存在的話)被羥基保護基團保護的基團。在一些實施方式中，所屬技術領域具有通常知識者熟知的任何羥基保護基團可被用於保護M1上的活性羥基。在一些實施方式中，被保護的羥基由式 YCOO-表示，其中每個Y獨立地選自於由C1-C10烷基和C6-C10芳基所組成的群組，其可任選地由一個或多個選自鹵素取代基和C1-C6烷基的取代基取代。在一些實施方式中，每個Y獨立地選自於由以下基團所組成的群組：甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、異丙基、苯基、鹵代苯基和C1-C6烷基苯基。
在一些實施方式中，每個S1各自獨立地選自於由式A46-A54基團所組成的群組：
Figure 107142925-A0305-02-0034-21
在一些實施方式中，S1為式A49或A50。
在一些實施方式中，每個Y獨立地為甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、異丙基、苯基、鹵代苯基以及烷基苯基中的一種。出於簡化本公開的綴合分子的目的，在一些實施方式中，Y為甲基。
在一些實施方式中，本公開的綴合分子具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的結構：
Figure 107142925-A0305-02-0035-22
Figure 107142925-A0305-02-0035-23
Figure 107142925-A0305-02-0035-24
 (405)
Figure 107142925-A0305-02-0036-25
Figure 107142925-A0305-02-0036-26
Figure 107142925-A0305-02-0036-28
Figure 107142925-A0305-02-0036-29
Figure 107142925-A0305-02-0037-31
Figure 107142925-A0305-02-0037-32
Figure 107142925-A0305-02-0037-33
Figure 107142925-A0305-02-0037-34
Figure 107142925-A0305-02-0038-35
Figure 107142925-A0305-02-0038-36
Figure 107142925-A0305-02-0038-37
Figure 107142925-A0305-02-0039-38
Figure 107142925-A0305-02-0039-39
Figure 107142925-A0305-02-0039-40
Figure 107142925-A0305-02-0040-41
Figure 107142925-A0305-02-0040-42
Figure 107142925-A0305-02-0040-43
以上式(403)-(422)中，其中，X為O或NH，Rk為羥基保護基團，M+為金屬陽離子、銨陽離子、三級胺形成的陽離子或季銨陽離子中的一種。在一些實施方式中，M+為
Figure 107142925-A0305-02-0041-44
。
在一些實施方式中，本公開的綴合分子可具有式(423)、(424)、(425)、(426)、(427)、(428)、(429)、(430)、(431)、(432)、(433)、(434)、(435)、(436)、(437)、(438)、(439)、(440)、(441)或(442)所示的結構：
Figure 107142925-A0305-02-0041-45
Figure 107142925-A0305-02-0041-46
Figure 107142925-A0305-02-0041-47
 (425)
Figure 107142925-A0305-02-0042-49
Figure 107142925-A0305-02-0042-50
Figure 107142925-A0305-02-0042-51
Figure 107142925-A0305-02-0042-52
Figure 107142925-A0305-02-0043-54
Figure 107142925-A0305-02-0043-55
Figure 107142925-A0305-02-0043-56
Figure 107142925-A0305-02-0043-57
Figure 107142925-A0305-02-0044-58
Figure 107142925-A0305-02-0044-59
Figure 107142925-A0305-02-0044-60
Figure 107142925-A0305-02-0045-61
Figure 107142925-A0305-02-0045-62
Figure 107142925-A0305-02-0045-63
Figure 107142925-A0305-02-0046-64
Figure 107142925-A0305-02-0046-65
Figure 107142925-A0305-02-0046-66
以上式(423)-(442)中，其中，X為O或NH，Rk為羥基保護基團，SPS表示固相載體。
在一些實施方式中，本公開的綴合分子具有式(503)、(504)、(505)、(506)、(507)、(508)、(509)、(510)、(511)、(512)、(513)、(514)、(515)、(516)、(517)、(518)、(519)、(520)、(521)或(522)所示的結構：
Figure 107142925-A0305-02-0047-67
Figure 107142925-A0305-02-0047-68
Figure 107142925-A0305-02-0047-69
Figure 107142925-A0305-02-0048-70
Figure 107142925-A0305-02-0048-73
Figure 107142925-A0305-02-0048-72
Figure 107142925-A0305-02-0048-74
Figure 107142925-A0305-02-0049-75
Figure 107142925-A0305-02-0049-76
Figure 107142925-A0305-02-0049-77
Figure 107142925-A0305-02-0049-78
Figure 107142925-A0305-02-0050-79
Figure 107142925-A0305-02-0050-80
Figure 107142925-A0305-02-0050-81
Figure 107142925-A0305-02-0051-82
Figure 107142925-A0305-02-0051-83
Figure 107142925-A0305-02-0051-84
Figure 107142925-A0305-02-0052-85
Figure 107142925-A0305-02-0052-86
Figure 107142925-A0305-02-0052-87
以上式(503)-(522)中，DMTr表示4,4’-雙甲氧基三苯甲基，結構
Figure 107142925-A0305-02-0053-89
表示相應羧酸與三乙胺形成的鹽。
在一些實施方式中，本公開的綴合分子可具有式(523)、(524)、(525)、(526)、(527)、(528)、(529)、(530)、(531)、(532)、(533)、(534)、(535)、(536)、(537)、(538)、(539)、(540)、(541)或(542)所示的結構：
Figure 107142925-A0305-02-0053-90
Figure 107142925-A0305-02-0053-92
Figure 107142925-A0305-02-0053-93
Figure 107142925-A0305-02-0054-94
Figure 107142925-A0305-02-0054-95
Figure 107142925-A0305-02-0054-96
Figure 107142925-A0305-02-0054-97
Figure 107142925-A0305-02-0055-98
Figure 107142925-A0305-02-0055-99
Figure 107142925-A0305-02-0055-100
Figure 107142925-A0305-02-0055-101
Figure 107142925-A0305-02-0056-102
Figure 107142925-A0305-02-0056-103
Figure 107142925-A0305-02-0056-104
Figure 107142925-A0305-02-0056-105
Figure 107142925-A0305-02-0057-106
Figure 107142925-A0305-02-0057-107
Figure 107142925-A0305-02-0057-108
Figure 107142925-A0305-02-0057-109
 (541)
Figure 107142925-A0305-02-0058-110
以上式(523)-(542)中，SPS表示固相載體，DMTr表示4,4,-雙甲氧基三苯甲基。
本公開的綴合分子的製備
所屬技術領域具有通常知識者可採用任意合理的合成路徑製備本公開的綴合分子。
在本公開的一些實施方式中，製備式(321)所示綴合分子的方法包括在有機溶劑中，在酯化反應條件下，以及在鹼和酯化催化劑存在下，將式(313)所示化合物與環狀酸酐接觸，進行離子交換，分離得到式(321)所示化合物：
Figure 107142925-A0305-02-0058-111
 其中：R6為提供式(321)中R4的基團。在一些實施方式中，例如，R6具有式(A61)所示的結構：
Figure 107142925-A0305-02-0059-112
 n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15、L1、S1各自的定義和可選擇的範圍如前所述，Ri為能夠與含氮骨架上的N原子連接、與RkO連接並且連接有游離羥基的任意基團，Rk為羥基保護基團。此時，所獲得的是式(321)化合物，其中R4包含作為第1官能團的羥基保護基團，和作為第2官能團的如式(C1)或(C2)所示的基團。在一些實施方式中，R6為B7或B8：
Figure 107142925-A0305-02-0059-113
 其中，q2和Rk各自的定義如前所述。
所述酯化反應條件包括反應溫度為0-100℃，反應時間為8-48小時，在一個實施方式中，所述酯化反應條件包括反應溫度為10-40℃，反應時間為20-30小時。
在一些實施方式中，所述有機溶劑包括環氧溶劑、醚溶劑、鹵代烷溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。在一些實施方式中，所述環氧溶劑為二氧六環和/或四氫呋喃。在一些實施方式 中，所述醚溶劑為乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述鹵代烷溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種。在一些實施方式中，所述有機溶劑為二氯甲烷。相對於所述式(313)所示化合物，所述有機溶劑的用量為3-50L/mol，在一些實施方式中為5-20L/mol。
在一些實施方式中，所述環狀酸酐為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐或庚二酸酐中的一種，在一些實施方式中所述環狀酸酐為丁二酸酐。所述環狀酸酐與所述式(313)所示化合物的莫耳比為1：1-10：1，在一些實施方式中為2：1-5：1。
所述酯化催化劑可以是任何對該酯化反應起到催化作用的催化劑，例如該催化劑可以是4-二甲氨基吡啶。所述催化劑與式(313)所示化合物的莫耳比為1：1-10：1，在一些實施方式中為2：1-5：1。
在一些實施方式中，所述鹼可以是任意的無機鹼、有機鹼或者它們的結合。考慮溶解性和產物穩定性，鹼是三級胺。在一些實施方式中，所述三級胺為三乙胺或N,N-二異丙基乙胺。所述三級胺與式(313)所示化合物的莫耳比為1：1-20：1，在一些實施方式中為3：1-10：1。
所述離子交換作用用於將式(321)化合物轉化為期望的羧酸或羧酸鹽的形式，離子交換的方法為所屬技術領域具有通常知識者所公知，可以使用合適的離子交換溶液和交換條件，得到具有M+陽離子的綴合分子。在一些實施方式中，所述離子交換反應使用三乙胺磷酸鹽溶液進行。在一些實施方式中，所述三乙胺磷酸鹽溶液的濃度為0.2-0.8M，在一些實施方式中，所述三乙胺磷酸鹽溶液的濃度為0.4-0.6M。在一些實施方式中，相對於式(313)化合物，所述三乙胺磷酸鹽溶液的用量為3-6L/mol，在另一些實施方式中為4-5L/mol。
可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式(321)化合物。在一些實施方式中，可藉由蒸發除去溶劑、隨後藉由層析方法分離式(321) 化合物，例如，可使用如下層析條件進行分離：(1)正相純化：200-300目矽膠填料，使用含1wt‰三乙胺的二氯甲烷：甲醇=100：18-100：20梯度沖提；或者(2)反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇：乙腈=0.1：1-1：0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可直接除去溶劑得到式(321)化合物粗產品，該粗產品可直接用於後續反應。
在一些實施方式中，式(321)化合物的製備方法還進一步包括在縮合反應條件下，在有機溶劑中，在縮合劑、縮合催化劑和三級胺的存在下，將上述離子交換產物與含有氨基或羥基的固相載體進行接觸。此時，所獲得的為式(321)化合物，其中R4中含有作為第1官能團的羥基保護基團和作為第2官能團的式(C1’)所示的基團。
所述固相載體為固相合成siRNA中所用的載體中的一種，其中的一些為所屬技術領域具有通常知識者所公知。例如，所述固相載體可選自含有活性羥基或氨基官能團的固相載體，在一些實施方式中，所述固相載體為氨基樹脂或羥基樹脂。在一些實施方式中，所述氨基或羥基樹脂具有如下參數：粒徑100-400目(mesh)，表面氨基或羥基載量為0.2-0.5mmol/g。式(321)所示化合物與固相載體的比為10-400μmol化合物每克固相載體(μmol/g)。在一些實施方式中，所述式(321)所示化合物與固相載體的比為50-200μmol/g。
所述有機溶劑可以是所屬技術領域具有通常知識者已知的任何合適的溶劑或混合溶劑。在一些實施方式中，所述有機溶劑為乙腈、環氧溶劑、醚溶劑、鹵代烷溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。在一些實施方式中，所述環氧溶劑為二氧六環和/或四氫呋喃，所述醚溶劑為乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述鹵代烷溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種。在一些實施方式中，所述有機溶劑為乙腈。相 對於式(313)化合物，所述有機溶劑的用量為20-200L/mol，在一個實施方式中為50-100L/mol。
在一些實施方式中，所述縮合劑可以是苯並三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽、3-二乙氧基磷醯基-1,2,3-苯並三唑4(3H)-酮和/或O-苯並三唑-四甲基脲六氟磷酸鹽。在一些實施方式中，所述縮合劑為O-苯並三唑-四甲基脲六氟磷酸鹽。所述縮合劑與式(313)所示化合物的莫耳比為1：1-20：1，在其他實施方式中為1：1-5：1。
在一些實施方式中，所述三級胺為三乙胺和/或N,N-二異丙基乙胺，在一些實施方式中為N,N-二異丙基乙胺；所述三級胺與式(313)所示化合物的莫耳比為1：1-20：1，在一些實施方式中為1：1-5：1。
在一些實施方式中，製備式(321)化合物的方法還包括在蓋帽反應條件下，在有機溶劑中，將得到的縮合反應產物與蓋帽試劑和醯化催化劑接觸，分離得到式(321)所示化合物。所述蓋帽反應的作用在於除去任何尚未反應的活性官能團，以避免在後續反應中產生不必要的副產物。所述蓋帽反應的條件包括反應溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應的時間為1-10h，在一些實施方式中為3-6h。蓋帽試劑可為siRNA固相合成中所使用的蓋帽試劑，其為所屬技術領域具有通常知識者所公知。在一些實施方式中，所述蓋帽試劑由蓋帽試劑A(capA)和蓋帽試劑B(capB)組成。蓋帽試劑A為N-甲基咪唑，在一些實施方式中以N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液形式提供，其中，吡啶與乙腈的體積比為1：10-1：1。在一些實施方式中為1：3-1：1。在一些實施方式中，吡啶與乙腈的總體積與N-甲基咪唑的體積比為1：1-10：1，在一些實施方式中為3：1-7：1。在一些實施方式中，所述蓋帽試劑B為乙酸酐，在一些實施方式中，蓋帽試劑B以乙酸酐的乙腈溶液形式提供，其中，乙酸酐和乙腈的體積比為1：1-1：10，在另一些實施方式中為1：2-1：6。
在一些實施方式中，所述N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液的體積與式(313)化合物的質量之比為5ml/g-50ml/g，在一些實施方式中為15ml/g-30ml/g。所述乙酸酐的乙腈溶液的體積與式(313)化合物的質量之比為0.5ml/g-10ml/g，在一些實施方式中為1ml/g-5ml/g。
在一些實施方式中，蓋帽試劑為等莫耳量的乙酸酐與N-甲基咪唑。在一些實施方式中，所述有機溶劑為乙腈、環氧溶劑、醚溶劑、鹵代烷溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。在一些實施方式中，所述有機溶劑為乙腈。相對於式(313)化合物，所述有機溶劑的用量為10-50L/mol，在一些實施方式中為5-30L/mol。
在一些實施方式中，所述醯化催化劑可以選自任何可用於酯化或醯胺化反應的催化劑，例如鹼性雜環化合物。在一些實施方式中，所述醯化催化劑為4-二甲氨基吡啶。所述催化劑與式(313)所示化合物的質量之比為0.001：1-1：1，在一些實施方式中為0.01：1-0.1：1。
在一些實施方式中，可使用任何合適的方法從反應混合物中分離式(321)化合物。在一些實施方式中，可藉由以有機溶劑充分洗滌，並過濾去除未反應的反應物、過量的蓋帽試劑及其它雜質，得到式(321)化合物，所述有機溶劑選自乙腈、二氯甲烷或甲醇，在一些實施方式中有機溶劑為乙腈。
在一些實施方式中，式(321)所示綴合分子的製備方法包括在有機溶劑中，在偶聯反應條件下，以及在偶聯試劑存在下，將式(313)所示化合物與亞磷醯二胺接觸，分離得到式(321)所示化合物。此時，所獲得的為式(321)化合物，其中R4中含有作為第1官能團的羥基保護基團和作為第2官能團的式(C3)所示的基團。
在一些實施方式中，偶聯反應條件包括溫度為0-50℃，例如為15-35℃，式(313)化合物與亞磷醯二胺的莫耳比可以為1：1-1：50，例如為 1：5-1：15。式(313)化合物和偶聯試劑的莫耳比可以為1：1-1：100，例如為1：50-1：80。反應時間可以為200-3000秒，例如為500-1500秒。所述亞磷醯二胺例如可為雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦，其可商購獲得或按照本領域中公知的方法製備獲得。偶聯試劑選自1H-四唑、5-乙基硫-1H-四唑、5-苄基硫-1H-四唑中的一種或多種，例如為5-乙基硫-1H-四唑。所述偶聯反應可在有機溶劑中進行，所述有機溶劑選自無水乙腈、無水DMF、無水二氯甲烷中的一種或多種，較佳為無水乙腈。相對於式(313)化合物，所述有機溶劑的用量可為3-50L/mol，例如可以為5-20L/mol。藉由進行該偶聯反應，式(313)化合物中的羥基與亞磷醯二胺反應形成亞磷醯胺基團。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式(321)化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。
在一些實施方式中，式(321)化合物的製備方法還包括：在偶聯反應條件下，在有機溶劑中，以及在偶聯試劑存在下，將分離產物與含有羥基的固相載體進行接觸。隨後，經蓋帽反應、氧化反應，分離得到式(321)化合物。此時，所獲得的為式(321)化合物，其中R4含有作為第1官能團的羥基保護基團和作為第2官能團的式(C3’)所示的基團。
在一些實施方式中，所述固相載體為可用於核酸固相合成的固相載體，例如，可以是經脫保護反應後的市售的通用固相載體(例如NittoPhase®HL UnyLinkerTM 300 Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate Life Sciences，結構如式B80所示)：
Figure 107142925-A0305-02-0064-114
脫保護反應為本領域眾所周知的。在一些實施方式中，脫保護條件包括溫度為0-50℃，例如為15-35℃；反應時間為30-300秒，例如為50-150秒。脫保護試劑可以選自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一種或多種，在一些實施方式中，脫保護試劑為二氯乙酸。脫保護試劑與固相載體上的-DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)保護基的莫耳比可為2：1-100：1，例如為3：1-50：1。藉由進行所述脫保護，在所述固相載體表面上獲得具有反應活性的游離羥基，從而能夠進行後續的偶聯反應。
偶聯反應條件以及偶聯試劑可如上所述進行選擇。藉由進行該偶聯反應，脫保護反應中形成的游離羥基與亞磷醯胺基團反應形成亞磷酸酯連接。
在一些實施方式中，蓋帽反應條件包括溫度為0-50℃，例如為15-35℃，反應時間為5-500秒，例如為10-100秒。蓋帽試劑和用量可如上所述進行選擇。
氧化反應條件可包括溫度為0-50℃，例如可以為15-35℃，反應時間為1-100秒，例如5-50秒，氧化試劑例如可以為碘(在一些實施方式中，以碘水的形式提供)。在一些實施方式中，氧化試劑與連接至固相載體的核酸序列的莫耳比為1：1-100：1，較佳為5：1-50：1。在一些實施方式中，所述氧化反應在四氫呋喃：水：吡啶=3：1：1-1：1：3的混合溶劑中進行。
在一些實施方式中，R6為式B7或B8，此時，式(313)所示化合物可以藉由以下製備方法得到：在有機溶劑中，在醯胺化反應條件下，以及在醯胺化反應縮合劑和三級胺存在下，將式(314)所示化合物與式(A-1)所示化合物或式(A-2)所示化合物接觸，分離得到式(313)所示化合物：
Figure 107142925-A0305-02-0066-115
 其中，n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15、L1、S1、q2和Rk各自的定義和可選擇的範圍如前所述。
所述醯胺化反應條件可包括：反應溫度為0-100℃，反應時間為1-48小時。在一些實施方式中，所述醯胺化反應條件為反應溫度為10-40℃，反應時間為2-16小時。
在一些實施方式中，所述有機溶劑為醇溶劑、環氧溶劑、醚溶劑、鹵代烷溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。在一些實施方式中，所述醇溶劑為甲醇、乙醇、和丙醇中的一種或多種，在另一些實施方式中為乙醇。在一些實施方式中，所述環氧溶劑為二氧六環和/或四氫呋喃。在一些實施方式中，所述醚溶劑為乙醚和/或甲基叔丁基醚。在一些實施方式中，所述鹵代烷類溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種。在一些實施方式中，所述有機溶劑為二氯甲烷。相對於式(314)化合物，有機溶劑用量為3-50L/mol，在一個實施方式中為3-20L/mol。
在一些實施方式中，所述醯胺化反應縮合劑為苯並三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽、3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯並三嗪-4(3H)-酮、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽、2-乙氧基-1-乙氧碳醯基-1,2-二氫 喹啉(EEDQ)或O-苯並三唑-四甲基脲六氟磷酸鹽，在進一步的實施方式中為3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯並三嗪4(3H)-酮。所述醯胺化反應縮合劑與式(314)所示化合物的莫耳比可為1：110：1，在一些實施方式中為2.5：1-5：1。
在一些實施方式中，所述三級胺為三乙胺或N,N-二異丙基乙胺，在進一步的實施方式中為N,N-二異丙基乙胺。所述三級胺與式(314)所示化合物的莫耳比為3：1-20：1，在一個實施方式中為5：1-10：1。
在一些實施方式中，式(A-1)和式(A-2)化合物可藉由任何適當的方式製備。例如，當Rk為DMTr基團時，可藉由甘油酸鈣與DMTrCl反應製備式(A-1)化合物。類似地，可先將3-氨基-1,2-丙二醇與環狀酸酐接觸，隨後再與DMTrCl反應製備式(A-2)化合物，所述環狀酸酐可以是碳原子數為4-13、在一個實施方式中為4-8的環狀酸酐。所屬技術領域具有通常知識者容易理解的是，所述環狀酸酐的選擇對應於(A-2)化合物中q2的不同值，例如，當所述環狀酸酐為丁二酸酐時，q2=1，當所述環狀酸酐為戊二酸酐時，q2=2，以此類推。
在一些變型中，也可藉由使式(314)所示化合物依次與所述環狀酸酐、3-氨基-1,2-丙二醇和DMTrCl反應，製備式(313)化合物。所屬技術領域具有通常知識者容易理解的是，這些變型不會影響式(313)化合物的結構與功能，並且這些變型是所屬技術領域具有通常知識者在上述方法的基礎上容易實現的。
與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式(313)化合物。在一些實施方式中，可藉由蒸發除去溶劑、隨後藉由層析方法分離式(313)化合物，例如，可使用如下兩組層析條件進行分離：(1)正相純化：200-300目矽膠填料，使用石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷：N,N-二甲基甲醯胺=1：1：1：0.5-1：1：1：0.6梯度沖提；以及(2)反相純化：C18、C8反相填料，使用 甲醇：乙腈=0.1：1-1：0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式(313)化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。
在一些實施方式中，式(314)所示化合物可以藉由以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑中，在脫保護反應條件下，將式(315)所示化合物與鹵代乙酸接觸，分離得到所述式(314)所示化合物：
Figure 107142925-A0305-02-0068-116
其中，R7選自式(330)、(331)、(332)或(333)所示的基團，在一個實施方式中，R7的結構如式(330)所示：
Figure 107142925-A0305-02-0068-117
 其中n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15、L1、S1各自的定義和可選擇的範圍如前所述。
所述鹵代乙酸可選自二氯乙酸、三氯乙酸、一氯乙酸和三氟乙酸中的一種或多種，在一些實施方式中為二氯乙酸。
所述脫保護反應條件可包括反應溫度為0-100℃，反應時間為0.1-24小時，在一個實施方式中反應溫度為10-40℃，反應時間為0.5-16小時。
在一些實施方式中，所述有機溶劑為環氧溶劑、醚溶劑、鹵代烷溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。所述環氧溶劑在一個實施方式中為二氧六環和/或四氫呋喃，所述醚溶劑在一些實施方式中為乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述鹵代烷溶劑在一些實施方式中為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種，在一些實施方式中，所述有機溶劑為二氯甲烷。相對於式(315)化合物，有機溶劑用量為3-50L/mol，在進一步的實施方式中為5-20L/mol。
所述鹵代乙酸與所述式(315)所示化合物的莫耳比可為5：1-100：1，在一些實施方式中為10：1-50：1。
與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式(314)化合物。在一些實施方式中，可藉由蒸發除去溶劑、隨後藉由層析方法分離式(314)化合物，例如，可使用如下兩組層析條件進行分離：(1)正相純化：200-300目矽膠填料，使用二氯甲烷：甲醇=100：30-100：40梯度沖提；以及(2)反相純化：C18和C8反相填料，使用甲醇：乙腈=0.1：1-1：0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式(314)化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。
式(315)所示化合物可以藉由以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑中，在醯胺化反應縮合劑和三級胺存在下，在縮合反應條件下，將式(317)所示化合物與式(316)所示化合物接觸，隨後進行分離：S1─L1─COOH式(316)
Figure 107142925-A0305-02-0069-118
 式(317) 其中，n1、n3、m1、m2、m3、R7、R10、R11、R12、R13、R14、R15、L1、S1各自的定義和可選擇的範圍如前所述。
式(316)化合物可使用例如J.Am.Chem.Soc.2014,136,16958-16961中所公開的化合物，或者，式(316)化合物可由所屬技術領域具有通常知識者藉由各種方法製備，例如，可參照US 8,106,022 B2實施例1中所公開的方法製備某些式(316)化合物，以引用的方式將以上文獻的全部內容整體併入本文。
在一些實施方式中，所述縮合反應條件包括反應溫度為0-100℃，反應時間為0.1-24小時，在一些實施方式中為反應溫度為10-40℃，反應時間為0.5-16小時。
所述式(316)所示化合物與所述式(317)所示化合物的莫耳可比為2：1至10：1，在一些實施方式中為2.5：1-5：1。
在一些實施方式中，所述有機溶劑為乙腈、環氧溶劑、醚溶劑、鹵代烷溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。所述環氧溶劑在一些實施方式中為二氧六環和/或四氫呋喃，所述醚溶劑在一些實施方式中為乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述鹵代烷溶劑在一個實施方式中為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種，在一些實施方式中，所述有機溶劑為乙腈。相對於式(317)化合物，所述有機溶劑的用量可為3-50L/mol，在一個實施方式中為5-20L/mol。
在一些實施方式中，所述醯胺化反應縮合劑為苯並三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽、3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯並三嗪-4(3H)-酮 (DEPBT)、O-苯並三唑-四甲基脲六氟磷酸鹽或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽，在進一步的實施方式中可為4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽。所述醯胺化反應縮合劑與式(317)所示化合物的莫耳比為2：1-10：1，在一些實施方式中為2.5：1-5：1；所述三級胺可為N-甲基嗎啉、三乙胺或N,N-二異丙基乙胺，在一些實施方式中為N-甲基嗎啉；所述三級胺與式(317)所示化合物的莫耳比可為3：1-20：1，在一些實施方式中為5：1-10：1。
與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式(315)化合物。在一些實施方式中，可藉由蒸發除去溶劑、隨後藉由層析方法分離式(315)化合物例如，可使用如下兩組層析條件進行分離：(1)正相純化：200-300目矽膠填料，使用二氯甲烷：甲醇=100：5-100：7梯度沖提；以及(2)反相純化：C18和C8反相填料，使用甲醇：乙腈=0.1：1-1：0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式(315)化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。
在一些實施方式中，式(317)化合物與足量的一種式(316)化合物一次反應即生成期望的式(315)化合物，式(315)化合物各個S1-L1基團彼此相同。在一些實施方式中，可根據需要，藉由使式(317)化合物分批與不同的式(316)化合物，即L1和/或S1不同的式(316)化合物發生反應，使得生成的式(315)化合物中含有兩種或多於兩種的S1和/或L1。例如，可先使1eq的式(317)化合物與2eq的第一式(316)化合物接觸，在式(317)化合物中的兩個末端伯胺基團上連接第一S1-L1基團，隨後，使其與(n3+n1-1)eq的第二式(316)化合物接觸(n3和n1的定義和取值範圍如前所述)，從而在式(317)化合物中的(n3+n1-1)個仲胺基團上連接第二S1-L1基團。
在一些實施方式中，式(317)所示化合物可以藉由以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑存在下，在脫保護反應條件下，將式(318)所示化合物與甲胺水溶液接觸，分離得到式(317)所示化合物：
Figure 107142925-A0305-02-0072-119
 其中，n1、n3、m1、m2、m3、R7、R10、R11、R12、R13、R14和R15各自的定義和可選擇的範圍如前所述。
所述脫保護反應條件可包括反應溫度為0-150℃，反應時間為5-72小時，在一些實施方式中為反應溫度為20-80℃，反應時間為10-30小時。
所述有機溶劑可選自醇，在一些實施方式中為甲醇、乙醇和異丙醇中的一種，在一些實施方式中為甲醇；相對於式(318)化合物，所述有機溶劑的用量可為1-20L/mol，在一個實施方式中為1.5-10L/mol。
所述甲胺水溶液的濃度可為30-40質量%，甲胺與式(318)所示化合物的莫耳比可為10：1-500：1，在一些實施方式中為50：1-200：1。
與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式(317)化合物。在一些實施方式中，可藉由蒸發除去溶劑、隨後藉由層析方法分離式(317)化合物例如，可使用如下兩組層析條件進行分離：(1)正相純化：200-300目矽膠填料，使用二氯甲烷：甲醇：氨水(25wt%)=1：1：0.05-1：1：0.25梯度沖提；以及(2)反相純化：C18和C8反相填料，使用甲醇：乙腈=0.1：1-1：0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式(317)化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。
在一些實施方式中，式(318)所示化合物可以藉由以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑存在下，在取代反應條件下，將式(319)所示化合物與三苯基氯甲烷(TrCl)、二苯基乙苯基氯甲烷、苯基二乙苯基氯甲烷或三乙苯基氯甲烷接觸、在一些實施方式中為與三苯基氯甲烷(TrCl)接觸，隨後進行分離：
Figure 107142925-A0305-02-0073-120
 其中，n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14和R15各自的定義和可選擇的範圍如前所述。
所述取代反應條件可包括反應溫度為0-100℃，反應時間為5-72小時，在一個實施方式中反應溫度為10-40℃，反應時間為10-30小時。
三苯基氯甲烷(TrCl)、二苯基乙苯基氯甲烷、苯基二乙苯基氯甲烷或三乙苯基氯甲烷可商購得到，三苯基氯甲烷(TrCl)、二苯基乙苯基氯甲烷、苯基二乙苯基氯甲烷或三乙苯基氯甲烷與式(319)所示化合物的莫耳比可為1：1-10：1，在一些實施方式中為1：1-3：1。
所述有機溶劑可為環氧溶劑、醚溶劑、鹵代烷溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。所述環氧類溶劑在一些實施方式中為二氧六環和/或四氫呋喃，所述醚溶劑在一個實施方式中為乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述鹵代烷溶劑在一個實施方式中為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種；在一個實施方式中，所述有機溶劑為二氯甲 烷。相對於式(319)化合物，所述有機溶劑的用量為3-50L/mol，在一個實施方式中為5-20L/mol。
與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式(318)化合物。在一些實施方式中，可藉由蒸發除去溶劑、隨後藉由層析方法分離式(318)化合物例如，可使用如下兩組層析條件進行分離：(1)正相純化：200-300目矽膠填料，使用甲醇：二氯甲烷=0.01：1-0.5：1梯度沖提；或者使用甲醇：二氯甲烷：乙酸乙酯：石油醚=0.1：1：1：1-1：1：1：1梯度沖提；以及(2)反相純化：C18和C8反相填料，使用甲醇：乙腈=0.1：1-1：0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式(318)化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。
在一些實施方式中，式(319)所示化合物可以藉由以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑中，在取代反應條件下，將式(320)所示化合物與三氟乙酸乙酯接觸，分離得到式(319)所示化合物：
Figure 107142925-A0305-02-0074-121
 其中，n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14和R15各自的定義和可選擇的範圍如前所述。
在一些實施方式中，所述有機溶劑為乙腈、環氧溶劑、醚溶劑、鹵代烷溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。在一些實施方式中，所述環氧溶劑在一些實施方式中為二氧六環和/或四氫呋喃，在一些實施方式中，所述醚溶劑在一個實施方式中為乙醚和/或甲基叔 丁基醚，在一些實施方式中，所述鹵代烷溶劑在一個實施方式中為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種，在一些實施方式中，所述有機溶劑為乙腈。相對於式(320)化合物，所述有機溶劑的用量為1-50L/mol，在一些實施方式中為1-20L/mol。
所述取代反應條件可包括反應溫度為0-100℃，反應時間為5-72小時，在一些實施方式中反應溫度為10-40℃，反應時間為10-30小時。
式(320)化合物可商購獲得，或者由所屬技術領域具有通常知識者使用已知的方法獲得。例如，當m1=m2=m3=3，n1=1，n3=2，且R10、R11、R12、R13、R14、R15均為H時，式(320)化合物可自阿法埃莎公司(Alfa Aesar Inc.)商購獲得。
所述三氟乙酸乙酯與式(320)所示化合物的莫耳比可為2：1-10：1，在一個實施方式中為3：1-5：1。
與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式(319)化合物。在一些實施方式中，可藉由蒸發除去溶劑、隨後藉由層析方法分離式(319)化合物例如，可使用如下兩組層析條件進行分離：(1)正相純化：200-300目矽膠填料，使用甲醇：二氯甲烷=0.01：1-0.5：1梯度沖提；或者使用甲醇：二氯甲烷：乙酸乙酯：石油醚=0.1：1：1：1-1：1：1：1梯度沖提；以及(2)反相純化：C18和C8反相填料，使用甲醇：乙腈=0.1：1-1：0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式(319)化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。
綴合物
在另一方面，本公開提供了一種綴合物，該綴合物具有如式(1)所示的結構：
Figure 107142925-A0305-02-0076-122
 其中：n1為1-3的整數，n3為0-4的整數；每個m1、m2和m3獨立地為2-10的整數；每個R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地選自H、C1-C10烷基、C1-C10鹵代烷基或C1-C10烷氧基，在一些實施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地選自H、甲基或乙基；R3為活性藥物，在一些實施方式中，R3含有功能性寡核苷酸；R2是長度為1-20個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團中的一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C6-C10亞芳基、C3-C18亞雜環基和C5-C10亞雜芳基；並且其中，R2任選地被選自以下任何一個或多個基團所取代：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10雜芳基、C1-C10鹵代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10鹵代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2， -NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10鹵代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10鹵代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10鹵代烷基)；每個L1是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的群組中的一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C6-C10亞芳基、C3-C18亞雜環基和C5-C10亞雜芳基；並且其中，L1任選地具有由以下基團所組成的群組中的任何一個或多個的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10雜芳基、C1-C10鹵代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10鹵代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10鹵代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10鹵代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10鹵代烷基)；在一些實施方式中，L1可選自式A1-A26基團或其任意組合，A1-A26的結構和定義如前所述。
n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15和M1如前述所定義。
在一些實施方式中，R2是式(321)化合物中的R4基團經反應連接至活性藥物而形成的連接基團。在一些實施方式中，R2是式(321)化合物中的R4基團經反應連接至功能性寡核苷酸而形成的連接基團。在一些實施方式中，R2基團中同時含有與含氮骨架上的N原子連接的連接位點以及與R3中的P原子相連接的連接位點。在一些實施方式中，R2中與含氮骨架上的N原子連接的位點與N原子形成醯胺鍵，所述與R3中的P原子連接的位點與P原子形成磷酸酯鍵。在一些實施方式中，R2可以是B5、B6、B5’或B6’：
Figure 107142925-A0305-02-0078-123
 其中，
Figure 107142925-A0305-02-0078-629
表示基團共價鍵連接的位點，q2的選擇和取值範圍如前所述。
在一些實施方式中，R3為A59所示結構的基團：
Figure 107142925-A0305-02-0078-124
 (A59)
其中，E1為OH、SH或BH2，在一些實施方式中，E1為OH或SH；Nu為功能性寡核苷酸。
在本公開的上下文中，除非另有說明，“綴合”基團或分子是指能夠與相應的配位體形成共價鍵的基團或分子，且綴合基團或分子及其配位體都具有特定的功能。相應地，“綴合物”是指該化學基團與其配位體藉由共價連接而形成的化合物。進一步地，“寡核苷酸綴合物”表示一個或多個具有特定功能的綴合基團共價連接至寡核苷酸上而形成的化合物。在一些實施方式中，本文公開的綴合物是寡核苷酸綴合物。在本公開的上下文中，“綴合分子”可以是藉由反應綴合至寡核苷酸、最終形成本公開的寡核苷酸綴合物的特定化合物。在一些實施方式中，寡核苷酸是siRNA，此時，本公開的綴合物是siRNA綴合物。
在一些實施方式中，綴合物具有式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)或(22)所示的結構：
Figure 107142925-A0305-02-0079-125
Figure 107142925-A0305-02-0080-126
Figure 107142925-A0305-02-0080-127
Figure 107142925-A0305-02-0080-128
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在一些實施方式中，本公開的寡核苷酸綴合物中的寡核苷酸是功能性寡核苷酸。功能性寡核苷酸是指這樣的寡核苷酸：所述寡核苷酸能夠藉由 與靶序列之間產生穩定且特異性的雜交，利用RNA激活(RNA activation，RNAa)、RNA干擾(RNA interference，RNAi)、反義核酸技術、外顯子跳躍(exon skipping)技術等原理，上調或下調靶基因的表達，或導致mRNA可變剪接。在一些方面，功能性寡核苷酸還可以是與靶蛋白之間產生穩定且特異性地結合的核酸結構。此外，所屬技術領域具有通常知識者容易理解的是，多核苷酸(例如mRNA本身或其片段)也同樣適用於與本公開提供的綴合分子綴合形成綴合物以實現標靶遞送，比如肝標靶遞送，從而調節mRNA轉錄出的蛋白質的表達。因此，在上下文中，“功能性寡核苷酸”的概念也可涵蓋mRNA或其片段。
在一些實施方式中，所述功能性寡核苷酸能夠與靶序列發生相互作用，從而影響靶序列分子的正常功能，如導致發生mRNA斷裂或轉譯阻遏或外顯子跳躍引發mRNA可變剪接等。在一些實施方式中，所述功能性寡核苷酸與靶序列的鹼基互補。在一些實施方式中，所述功能性寡核苷酸可以與靶序列中超過80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的鹼基互補，或者與靶序列完全互補。在一些實施方式中，所述功能性寡核苷酸可以含有1個、2個或3個不與靶序列互補的鹼基。在一些實施方式中，所述功能性寡核苷酸包括脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、以及具有修飾的核苷酸。在一些實施方式中，所述功能性寡核苷酸是單鏈的DNA、RNA或DNA-RNA嵌合體(chimera)，或者是雙鏈的DNA、RNA或DNA-RNA雜交體(hybrid)。
由此，在一些實施方式中，適合於本公開的寡核苷酸綴合物的功能性寡核苷酸可以是小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗劑(antagomir)、微小RNA模擬物(microRNA mimics)、誘餌寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四 極子(G-quadruplex)、可變剪接體(splice altering)、單鏈RNA(ssRNA)、反義核酸(antisense)、核酸適配體(Nucleic Acid Aptamer)、小激活RNA(small activating RNA，saRNA)、莖環RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一種。WO2015/006740A2公開了一種不同配體綴合到寡核苷酸的綴合物，其中配體藉由連接子(linker)與寡核苷酸進行連接。所述寡核苷酸選自小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗劑(antagomir)、微小RNA模擬物(microRNA mimics)、誘餌寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四極子(G-quadruplex)、可變剪接體(splice altering)、單鏈RNA(ssRNA)、反義核酸(antisense)、適配體(aptamer)、莖環RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一種。這些綴合物在寡核苷酸的體內遞送上表現出好的穩定性。在進一步的實施方式中，適合於本公開的寡核苷酸綴合物的功能性寡核苷酸是WO2009082607A2、WO2009073809A2或WO2015006740A2中公開的寡核苷酸，以引用的方式將其整體內容併入本文。
本公開的寡核苷酸綴合物可藉由提高活性劑比如功能性寡核苷酸的肝標靶遞送效率，來調節特定細胞如肝細胞中特定基因的異常表達，從而增強功能性寡核苷酸和細胞中標靶序列之間的相互作用。在一些實施方式中，所述特定基因可以是肝臟中表達的內源性基因，也可以是在肝臟中繁殖的病原體基因。在肝細胞中異常表達的基因可以是例如ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等基因。在一些實施方式中，所述在肝細胞異常表達的基因是HBV基因、ANGPTL3基因或APOC3基因。在本公開的上下文中，HBV基因是指具有如Genbank註冊號NC_003977.1所示序列的基因；ANGPTL3基因是指具有如Genbank註冊號NM_014495.3所示mRNA序列的基因；APOC3基因是指具有如Genbank註冊號NM_000040.1所示mRNA序列的基因。
在一些實施方式中，“靶序列”是靶mRNA。在本公開的上下文中，“靶mRNA”是指在如肝細胞中異常表達的基因對應的mRNA，它既可以是過量表達的基因對應的mRNA，或者是表達不足的基因對應的mRNA。在一些實施方式中，由於大部分疾病源於mRNA的過量表達，因此靶mRNA較佳為過量表達的基因對應的mRNA。在本公開的一些實施方式中，對應於上述異常表達的基因的靶mRNA可以是ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等基因對應的mRNA。在一些實施方式中，所述靶mRNA可以是由對應HBV基因、ANGPTL3基因或者APOC3基因轉錄而得的mRNA。
式A59中的P原子可以連接到寡核苷酸序列中任何可能的位置，例如，可以連接到寡核苷酸的任意核苷酸上。在一些實施方式中，本公開的寡核苷酸綴合物中的功能性寡核苷酸是單鏈寡核苷酸(例如，單鏈RNA或者適配體)。此時，式A59中的P原子可以連接到所述單鏈寡核苷酸的末端區域，所述單鏈寡核苷酸的末端區域指所述單鏈寡核苷酸中從一端起算的前4個核苷酸。在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到所述單鏈寡核苷酸的任意末端。
在一些實施方式中，本公開的寡核苷酸綴合物中的功能性寡核苷酸是雙鏈寡核苷酸(例如，siRNA、microRNA或者DNA)，所述雙鏈寡核苷酸包含正義鏈和反義鏈。在一些實施方式中，所述式A59中的P原子連接到所述雙鏈寡核苷酸中正義鏈或反義鏈的末端區域，所述末端區域指所述正義鏈或所述反義鏈中從一端起算的前4個核苷酸，在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到所述正義鏈或所述反義鏈的任意末端；在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到所述正義鏈的3’末端。在式A59中的P原子連接至雙鏈寡核苷酸的正義鏈的上述位置的情況下，本公開提供的寡核苷酸綴合物進入細胞後， 在解旋時，可以釋放出單獨的雙鏈寡核苷酸反義鏈，以阻斷靶mRNA轉譯蛋白質的過程，抑制特定基因的表達。
式A59中的P原子可以連接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5’位、核苷酸的2’位、核苷酸的3’位或核苷酸的鹼基上。在一些實施方式中，式A59中的P原子可藉由形成磷酸二酯鍵而連接至所述寡核苷酸序列中的核苷酸的2’位、3’位或5’位。在一些具體實施方式中，式A59中的P原子連接在雙鏈寡核苷酸序列中正義鏈3’末端核苷酸的3’羥基脫氫後形成的氧原子上，或者式A59中的P原子藉由取代雙鏈寡核苷酸序列中正義鏈中的核苷酸的2’-羥基中的氫與核苷酸連接，或者式A59中的P原子藉由取代雙鏈寡核苷酸序列中正義鏈5’末端核苷酸的5’羥基中的氫原子與核苷酸連接。
在不願受到限制的情況下，在下面的實施方式和實施例中，詳細描述了本公開的寡核苷酸綴合物中的功能性寡核苷酸為小干擾RNA(siRNA)的情況。此時，本公開的寡核苷酸綴合物為siRNA綴合物。在本文的上下文中，為了描述方便，也將這些實施方式中的siRNA綴合物稱為本公開的siRNA綴合物。這並不代表本公開的寡核苷酸綴合物中的寡核苷酸僅可以是siRNA，相反，所述寡核苷酸甚至活性藥物可能是本公開的或者所屬技術領域具有通常知識者所熟知的其它替代物。根據siRNA綴合物的詳細說明，可以設想其它活性藥物或者功能性寡核苷酸與本公開提供的綴合分子綴合時也會有類似的作用。
所屬技術領域具有通常知識者公知，siRNA含有核苷酸基團作為結構單元，所述核苷酸基團含有磷酸基團、核糖基團和鹼基。通常活性的，即功能性的siRNA的長度約為12-40個核苷酸，在一些實施方式中約為15-30個核苷酸，所述siRNA中的每個核苷酸可以獨立地是修飾或未修飾的核苷酸，為了增加穩定性，所述siRNA中至少一個核苷酸是修飾的核苷酸。
本公開的發明人發現，下面的實施方式中所述的siRNA具有較高的活性和/或穩定性，因而可以作為本公開中發明目的的siRNA。
在一些實施方式中，本公開的siRNA綴合物中的siRNA(以下，也稱為本公開的siRNA)中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，該siRNA含有正義鏈和反義鏈，其中，所述正義鏈包含核苷酸序列1，所述反義鏈包含核苷酸序列2。所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的長度均為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸，並且至少部分地反向互補形成互補雙鏈區，所述核苷酸序列2的至少一部分與第一段核苷酸序列互補，所述第一段核苷酸序列為靶mRNA中的一段核苷酸序列。
在一些實施方式中，本公開的siRNA是指在3mg/kg的濃度下，能夠抑制至少50%HBV基因表達、至少50% ANGPTL3基因表達或者至少50% APOC3基因表達的siRNA。在一些實施方式中，本公開的siRNA指在濃度為3mg/kg時，能夠抑制至少55%、60%、65%、70%、75%或80%HBV基因、ANGPTL3基因或APOC3基因表達。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列1與所述第一段核苷酸序列長度相等，且不超過3個核苷酸差異；所述核苷酸序列2與核苷酸序列B長度相等，且不超過3個核苷酸差異；所述核苷酸序列B為與所述第一段核苷酸序列完全反向互補的核苷酸序列。在不願受到限制的情況下，這些特定的核苷酸差異並不會顯著降低siRNA綴合物的抑制能力，而這些包含特定核苷酸差異的siRNA綴合物也在本公開的保護範圍之內。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互補、基本上完全反向互補或完全反向互補。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列1與所述第一段核苷酸序列不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列2與所述核苷酸序列B不多於1個核苷酸差異。在一些實施方式中，所述核苷酸序列2與所述核苷酸序列B之間的核苷酸差異包括按照5’末端到3’末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一個核苷酸Z’位置上的差異。在一些實施方式中，按照5’末端到3’末端的方向，所述核苷酸序列1上的最後一個核苷酸Z是與Z’互補的核苷酸。
在一些實施方式中，所述正義鏈還含有核苷酸序列3，所述反義鏈還含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的長度相等且均為1-4個核苷酸，所述核苷酸序列3連接在所述核苷酸序列1的5’末端，並且所述核苷酸序列4連接在所述核苷酸序列2的3’末端，所述核苷酸序列4與第二段核苷酸序列互補，該第二段核苷酸序列是指靶mRNA中與所述第一段核苷酸序列相鄰、且長度與所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列。在一些實施方式中，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4基本上完全反向互補或完全反向互補。因此，所述正義鏈和反義鏈的長度可以是19-23個核苷酸。
在一些實施方式中，本公開的siRNA還含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的長度為1至3個核苷酸，連接在所述反義鏈的3’末端，從而構成所述反義鏈的3’突出端(overhang)；在一些實施方式中，所述核苷酸序列5的長度為1或2個核苷酸。這樣，在一些實施方式中，本公開的siRNA的正義鏈和反義鏈的長度之比可以是19/20、19/21、20/21、20/22、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24或23/25。
在一個實施方式中，所述核苷酸序列5的長度為2個核苷酸，並且按照5’末端到3’末端的方向，所述核苷酸序列5為連續的2個脫氧胸腺嘧啶核苷酸、或連續的2個尿嘧啶核苷酸、或者與第三段核苷酸序列互補，所述第三段序列是指靶mRNA中與所述第一段核苷酸序列相鄰、或者和所述第二段核 苷酸序列相鄰，並且長度與所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。在一些實施方式中，本公開的siRNA的正義鏈和反義鏈的長度之比為19/21或21/23，此時，本公開的siRNA具有顯著的肝細胞mRNA沉默活性。
在一些實施方式中，本公開的siRNA中的核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸。在一些實施方式中，本公開的siRNA不含修飾的核苷酸基團；在一些實施方式中，本公開的siRNA含有修飾的核苷酸基團。
目前，本領域存在多種可用於修飾siRNA的方式，包括骨架修飾(也稱為核苷酸間連接修飾，如磷酸基團修飾)、核糖基團修飾及鹼基修飾等(例如，請參見Watts，J.K.，G.F.Deleavey and M.J.Damha，Chemically modified siRNA：tools and applications.Drug Discov Today，2008.13(19-20)：p.842-55，以引用的方式將其整體內容併入本文)。
在本公開的上下文中，所使用的術語“修飾的核苷酸”包括以下核苷酸：其核糖基被修飾，比如2’位羥基被其他基團取代形成的核苷酸、核苷酸類似物，或者具有經修飾的鹼基的核苷酸。
在本公開的一些實施方式中，所述正義鏈或所述反義鏈中的至少一個核苷酸為修飾的核苷酸，和/或至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基。換句話說，所述正義鏈和所述反義鏈中至少一條單鏈的磷酸-核糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分為具有修飾基團的磷酸酯基和/或具有修飾基團的核糖基(或修飾的磷酸酯基和/或修飾的核糖基)。在本公開的一些實施方式中，所述正義鏈和/或所述反義鏈中的全部核苷酸均為修飾的核苷酸。
在一些實施方式中，正義鏈和反義鏈中的每一個核苷酸獨立地為氟代修飾的核苷酸或非氟代修飾的核苷酸。
“氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2’位的羥基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(207)所示的結構。
“非氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2’位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物。在一些實施方式中，每一個非氟代修飾的核苷酸獨立地為核苷酸的核糖基2’位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物。
核糖基2’位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸是所屬技術領域具有通常知識者所公知的，這些核苷酸例如為2’-烷氧基修飾的核苷酸、2’-經取代的烷氧基修飾的核苷酸、2’-烷基修飾的核苷酸、2’-經取代的烷基修飾的核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、2’-經取代的氨基修飾的核苷酸或2’-脫氧核苷酸。
在一些實施方式中，2’-烷氧基修飾的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸，如式(208)所示。在一些實施方式中，2’-經取代的烷氧基修飾的核苷酸是2’-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸，如式(209)所示。在一些實施方式中，2’-氨基修飾的核苷酸如式(210)所示。在一些實施方式中，2’-脫氧核苷酸(DNA)如式(211)所示。
Figure 107142925-A0305-02-0092-145
核苷酸類似物指能夠代替核酸中的核苷酸，但不同於腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶的基團。在一些實施方式中，所述核苷酸類似物可以為如異核苷酸、橋聯核酸(bridged nucleic acid，簡稱BNA)核苷酸或無環核苷酸。
BNA核苷酸是指受約束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元環、六元環、或七元環的具有“固定的”C3’-內切糖縮攏的橋聯結構。通常將該橋併入該核糖環的2’-、4’-位處以提供2’,4’-BNA核苷酸，如LNA、ENA和 cET BNA，其中，LNA如式(212)所示，ENA如式(213)所示，cET BNA如式(214)所示。
Figure 107142925-A0305-02-0093-146
無環核苷酸是核苷酸的糖環被打開形成的核苷酸，如解鎖核酸(UNA)核苷酸和甘油核酸(GNA)核苷酸，其中，UNA如式(215)所示，GNA如式(216)所示。
Figure 107142925-A0305-02-0093-147
其中，R為H、OH或烷氧基(O-烷基)。
異核苷酸是指鹼基在核糖環上的位置發生改變而形成的核苷酸，例如，鹼基從核糖環的1’-位移動至2’-位或3’-位而形成的化合物，如式(217)或(218)所示。
Figure 107142925-A0305-02-0093-148
其中，Base表示核酸鹼基，例如A、U、G、C或T；R為H、OH、F或者如上所述的非氟基團。
在一些實施方式中，核苷酸類似物為異核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA或GNA。在一些實施方式中，每一個非氟代修飾的核苷酸均為甲氧基修飾的核苷酸，所述甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2’-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修飾的核苷酸”、“2’-氟修飾的核苷酸”、“核糖基團的2’-羥基被氟取代的核苷酸”和“具有2’-氟代核糖基的核苷酸”意義相同，均指核苷酸的2’-羥基被氟取代而形成的具有如式(207)所示結構；“甲氧基修飾的核苷酸”、“2’-甲氧基修飾的核苷酸”、“核糖基團的2’-羥基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2’-甲氧基核糖基的核苷酸”意義相同，均指核苷酸核糖基團的2’-羥基被甲氧基取代，而形成如式(208)所示。
在一些實施方式中，本公開的siRNA是具有以下修飾的siRNA：按照5’末端到3’末端的方向，所述siRNA的正義鏈中所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述正義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸和/或在所述反義鏈中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述反義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；在一些實施方式中，本公開的siRNA是具有以下修飾的siRNA：按照5’末端到3’末端的方向，所述siRNA的正義鏈中所述核苷酸序列1的第5、7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述正義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；和/或在所述反義鏈中，所述核苷酸序列2的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述反義鏈中其餘位置的核苷酸為2’-甲氧基修飾的核苷酸。在一些實施方式中，本公開的siRNA是具有以下修飾的siRNA：按照5’末端到3’末端的方向，所述siRNA的正義鏈中所述核苷酸序列1的第7、8和9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述正義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸，和/或按照5’末端到3’末端的方向，所述siRNA的 反義鏈中所述核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述反義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸。
在本公開所述siRNA的一些具體實施方式中，所述核苷酸含有磷酸基團修飾。在本公開的上下文中，磷酸基團上的修飾在一個實施方式中為如下式(201)所示的硫代磷酸(phosphorthioate)修飾，即，用硫原子取代磷酸二酯鍵中的非橋氧原子，從而以硫代磷酸二酯鍵替換磷酸二酯鍵。在一些實施方式中，該修飾穩定siRNA的結構，保持鹼基配對的高特異性和高親和力。
Figure 107142925-A0305-02-0095-149
根據本公開一些實施方式，所述siRNA中，硫代磷酸酯基連接存在於以下位置中的至少一處：正義鏈或反義鏈任意一端的第一個和第二個核苷酸之間；正義鏈或反義鏈任意一端的第二個和第三個核苷酸之間；或上述的任意組合。在一些實施方式中，硫代磷酸酯基連接存在於除正義鏈5’末端以外的全部上述位置處。在一些實施方式中，硫代磷酸酯基連接存在於除正義鏈3’末端以外的全部上述位置處。在一些實施方式中，硫代磷酸酯基連接存在於以下位置中的至少一處：所述正義鏈的5’末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；所述正義鏈的5’末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；所述正義鏈的3’末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；所述正義鏈的3’末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；所述反義鏈的5’末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；所述反義鏈的5’末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間； 所述反義鏈的3’末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及所述反義鏈的3’末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。
按照本公開一些實施方式，所述siRNA分子的反義鏈序列5’末端核苷酸為5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸類似物修飾的核苷酸。
在一些實施方式中，5’-磷酸核苷酸可具有式(202)所示結構：
Figure 107142925-A0305-02-0096-150
 常用的所述5’-磷酸類似物修飾的核苷酸的種類是所屬技術領域具有通常知識者公知的，例如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3)：238-48中公開的如下如式(203)-(206)所示的4種核苷酸：
Figure 107142925-A0305-02-0096-151
 其中，R表示選自於由H、OH、F和甲氧基所組成的群組的基團；Base表示選自A、U、C、G或T的鹼基。
在一些實施方式中，5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸類似物修飾的核苷酸為式(203)所示的含有乙烯基磷酸酯(vinylphosphonate，VP)修飾的核苷酸、式(202)所示的5’-磷酸核苷酸或式(205)所示的5’-硫代磷酸修飾的核苷酸。
本公開的發明人出人意料地發現，本公開所述siRNA綴合物在具有顯著提高的血清穩定性的同時，還表現出並未明顯降低的靶mRNA沉默活性以及優異的體內基因表達抑制效果。從而顯示出，本公開的siRNA綴合物具有較高的體內遞送效率。按照本公開的一些實施方式，本公開的寡核苷酸綴合物為包含諸如表1A至1F所示的siRNA的siRNA綴合物：表1 siRNA序列
Figure 107142925-A0305-02-0097-152
表1B
Figure 107142925-A0305-02-0098-153
Figure 107142925-A0305-02-0098-154
Figure 107142925-A0305-02-0099-155
Figure 107142925-A0305-02-0099-156
Figure 107142925-A0305-02-0099-157
Figure 107142925-A0305-02-0100-158
Figure 107142925-A0305-02-0100-159
Figure 107142925-A0305-02-0101-160
上表中，大寫字母C、G、U、A表示核苷酸的鹼基組成；小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為2’-甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為2’-氟代修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間的連接為硫代磷酸酯基連接；P1表示該P1右側相鄰的一個核苷酸為5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸類似物修飾的核苷酸，在一些實施方式中為乙烯基磷酸酯修飾的核苷酸(以下實施例中以VP表示)、5’-磷酸核苷酸(以下實施例中以P表示)或硫代磷酸酯修飾的核苷酸(以下實施例中以Ps表示)。
所屬技術領域具有通常知識者清楚知曉的是，可以藉由使用具有相應修飾的核苷單體來將修飾的核苷酸基團引入本公開所述的siRNA中，製備 具有相應修飾的核苷單體的方法及將修飾的核苷酸基團引入siRNA的方法也是所屬技術領域具有通常知識者所熟知的。所有修飾的核苷單體可以商購得到或者採用已知方法製備得到。
寡核苷酸綴合物的製備
可以採用任意合理的合成路徑製備本公開的寡核苷酸綴合物。例如，本公開的寡核苷酸綴合物可以採用如下方法製備，該方法包括在亞磷醯胺固相合成的條件下，分別按照所述寡核苷酸的核苷酸種類和順序，按照3’到5’的方向將核苷單體依次連接，每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應；在一些實施方式中，所述方法還包含在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將式(321)所示的化合物與核苷單體或連接在固相載體上的核苷酸序列接觸，從而使式(321)所示的化合物經偶聯反應連接至核苷酸序列。
在一些實施方式中，該方法還包含脫除保護基並與固相載體切割、分離純化步驟。
在一些實施方式中，所述寡核苷酸為雙鏈寡核苷酸，所述製備方法包含以下步驟：在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將式(321)所示的化合物與正義鏈或反義鏈的3’末端的核苷單體接觸，使式(321)所示的化合物連接上序列中第一個核苷酸，按照3’到5’的方向將核苷單體依次連接，合成雙鏈寡核苷酸的正義鏈或反義鏈；其中，(321)化合物為R4中含有作為第1官能團被保護的羥基，和作為第2官能團的如式(C1’)或(C3’)所示基團的式(321)所示的化合物，與第一個核苷單體連接前，式(321)化合物經過脫保護；每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應；得到連接有綴合分子的核酸的正義鏈或反義鏈；按照3’到5’的方向將核苷單體依次連接來合成雙鏈寡核苷酸另一條鏈，每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、 氧化或硫化四步反應；脫除保護基並與固相載體切割，分離純化獲得正義鏈和反義鏈，退火。
在一些實施方式中，所述寡核苷酸為雙鏈寡核苷酸，所述製備方法包含以下步驟：按照3’到5’的方向將核苷單體依次連接，合成雙鏈寡核苷酸的正義鏈和反義鏈，每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應，得到連接在固相載體上的正義鏈和連接在固相載體上的反義鏈；在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將式(321)所示的化合物與連接在固相載體上的正義鏈或連接在固相載體上的反義鏈接觸，從而將式(321)化合物連接至正義鏈或反義鏈，其中，式(321)化合物是R4中含有亞磷醯胺作為第1官能團的式(321)化合物；脫除保護基並與固相載體切割，藉由分離純化獲得寡核苷酸的正義鏈或反義鏈，退火，其中，所述寡核苷酸的正義鏈或反義鏈上連接有綴合分子。
在一些實施方式中，式A59中的P原子連接至siRNA中的正義鏈的3’末端，本公開的siRNA綴合物的製備方法包括：(1)脫除上述連接有固相載體的式(321)化合物(以下，也稱為連接固相載體的L綴合分子)中的保護基團Rk；在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將該連接固相載體的L綴合分子與核苷單體接觸，得到藉由L綴合分子連接至固相載體的核苷單體；(2)以該藉由L綴合分子連接至固相載體的核苷單體起始，按照3’-5’的方向藉由亞磷醯胺固相合成方法合成siRNA的正義鏈；(3)藉由亞磷醯胺固相合成方法，合成siRNA的反義鏈；(4)分離出siRNA的正義鏈和反義鏈並退火，獲得本公開的siRNA綴合物。
其中，在步驟(1)中，脫除該連接固相載體的L綴合分子中的保護基團Rk的方法包括在脫保護條件下，將式(321)化合物與脫保護試劑接觸。脫保護條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應時間為30-300秒，在一些實施方式中為50-150秒，脫保護試劑可以選自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一種或多種，在一些實施方式中為二氯乙酸。脫保護試劑與式(321)化合物的莫耳比可為10：1至1000：1，在一些實施方式中為50：1至500：1。
所述偶聯反應條件和偶聯試劑可使用任何適於上述偶聯反應的條件和試劑。在一些實施方式中，使用與所採用的固相合成方法中的偶聯反應相同的條件與試劑。
在一些實施方式中，所述偶聯反應的條件包括反應溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃。式(321)化合物與核苷單體的莫耳比可為1：1-1：50，在一些實施方式中為1：2-1：5；式(321)化合物和偶聯試劑的莫耳可比為1：1至1：50，在一些實施方式中為1：3-1：10，反應時間可為200-3000秒，在一些實施方式中為500-1500秒。偶聯試劑可選自1H-四唑、5-乙硫基1H-四唑、5-苄硫基1H-四唑中的一種或多種，在一些實施方式中為5-乙硫基1H-四唑。所述偶聯反應可在有機溶劑中進行，所述有機溶劑可選自無水乙腈、無水DMF、無水二氯甲烷中的一種或多種，在一些實施方式中為無水乙腈。相對於式(321)化合物，所述有機溶劑的用量可為3-50L/mol，在一些實施方式中為5-20L/mol。
在步驟(2)中，藉由亞磷醯胺核酸固相合成的方法，從藉由上述步驟製備的L綴合分子連接至固相載體的核苷單體起始，按照3’-5’的方向合成siRNA綴合物的正義鏈S。此時，L綴合分子連接至所得到的正義鏈的3’末端。
步驟(2)和(3)中所述固相合成的其它條件，包括核苷單體脫保護條件，脫保護試劑種類和用量，偶聯反應條件，偶聯試劑的種類和用量，蓋帽反應的條件，蓋帽試劑的種類和用量，氧化反應條件，氧化試劑種類和用量，硫化反應條件，硫化試劑種類和用量，本文中採用本領域中常規使用的各種試劑、用量和條件。
例如，在一些實施方式中，步驟(2)和(3)中所述固相合成可使用如下條件：核苷單體脫保護條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應時間為30-300秒，在一些實施方式中為50-150秒，脫保護試劑可以選自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一種或多種，在一些實施方式中為二氯乙酸。脫保護試劑與固相載體上4,4’-二甲氧基三苯甲基保護基的的莫耳比可為2：1-100：1，在一些實施方式中為3：1-50：1。
偶聯反應條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，固相載體上連接的核酸序列與核苷單體的莫耳比可為1：1-1：50，在一些實施方式中為1：5-1：15；固相載體上連接的核酸序列和偶聯試劑的莫耳比可為1：1-1：100，在一些實施方式中為1：50-1：80，反應時間和偶聯試劑的選擇與前述相同。
蓋帽反應條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應時間為5-500秒，在一些實施方式中為10-100秒，蓋帽試劑的選擇與前述相同。蓋帽試劑的總量與固相載體上連接的核酸序列的莫耳比可為1：100-100：1，在一些實施方式中為1：10-10：1。在使用等莫耳量的乙酸酐與N-甲基咪唑作為蓋帽試劑的情況下，乙酸酐、N-甲基咪唑以及固相載體上連接的核酸序列的莫耳比可為1：1：10-10：10：1，在一些實施方式中為1：1：2-2：2：1。
氧化反應條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應時間為1-100秒，在一些實施方式中為5-50秒，氧化試劑在一些實施方式中為碘(在進一步實施方式中，以碘水的形式提供)。氧化試劑與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比可為1：1-100：1，在一些實施方式中為5：1-50：1。在一些實施方式中，所述氧化反應在四氫呋喃：水：吡啶=3：1：1-1：1：3的混合溶劑中進行。硫化反應條件包括溫度為0-50℃，在一些實施方式中為15-35℃，反應時間為50-2000秒，在一些實施方式中為100-1000秒，硫化試劑在一些實施方式中為氫化黃原素。硫化試劑與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比可為10：1-1000：1，在一些實施方式中為10：1-500：1。在一些實施方式中，所述硫化反應在乙腈：吡啶=1：3-3：1的混合溶劑中進行。
按照本公開提供的方法，在將所有核苷單體連接之後，退火之前，該方法還包括分離出siRNA的正義鏈和反義鏈。分離的方法為所屬技術領域具有通常知識者所公知，一般包括將合成得到的核苷酸序列從固相載體上切割下來，脫除鹼基上、磷酸基上和配體上的保護基團，純化和脫鹽。
將合成得到的核苷酸序列從固相載體上切割下來，並脫除鹼基上、磷酸基上和配體上的保護基團可按照siRNA合成中常規的切割和脫保護方法進行。例如，將得到的連接有固相載體的核苷酸序列與濃氨水接觸；在脫保護的過程中，A46-A54基團的保護基團YCOO-轉化為羥基，S1基團轉化為相應的M1基團，從而生成式(1)所示的綴合物。其中，所述濃氨水可以是指濃度為25-30重量%的氨水，濃氨水的用量與目標siRNA序列相比可為0.2ml/μmol-0.8ml/μmol。
在所合成的核苷酸序列上存在至少一個2’-TBDMS保護時，所述方法還包括將脫除了固相載體的核苷酸序列與三乙胺三氫氟酸鹽接觸，以脫除該2’-TBDMS保護。此時，所得到的目標siRNA序列中具有相應核苷的游離2’- 羥基。三乙胺三氫氟酸鹽純品的用量與目標siRNA序列相比可為0.4ml/μmol-1.0ml/μmol。這樣即可得到本公開的siRNA綴合物。
純化和脫鹽的方法是所屬技術領域具有通常知識者熟知的。例如，可利用製備型離子層析純化柱，藉由NaBr或NaCl的梯度沖提，來進行核酸的純化；產品收集合併後，可採用反相層析純化柱進行脫鹽。
在合成過程中，可隨時對核酸序列的純度和分子量進行檢測，從而更好地控制合成質量，檢測的方法為所屬技術領域具有通常知識者所公知。例如，可藉由離子交換層析檢測核酸純度，並藉由液質聯用層析(LC-MS)測定分子量。
退火的方法也是所屬技術領域具有通常知識者熟知的。例如，可簡單地將所合成的正義鏈(S鏈)與反義鏈(AS鏈)以等莫耳比混合在注射用水中加熱至70-95℃，隨後室溫冷卻，使其藉由氫鍵形成雙鏈結構。這樣即可得到本公開的siRNA綴合物。
在獲得本公開的綴合物後，在一些實施方式中，還可利用例如液質聯用層析等方法，藉由分子量檢測等方式對所合成的siRNA綴合物進行表徵，確定所合成的siRNA綴合物為目標設計的siRNA綴合物，且所合成的siRNA的序列與欲合成的siRNA的序列相符，例如與上述表1中所列的序列之一相符。
本公開的綴合物的應用
如本公開所示，所述綴合物可向細胞遞送某種活性劑，用於治療或預防可能需要這種遞送的疾病或狀況。在不願受任何理論束縛的情況下，我們認為綴合分子的空間排列在標靶細胞表面受體方面特別有效，從而使負載的活性劑與細胞接觸。在一些實施方式中，這種綴合物是標靶肝細胞的寡核苷酸綴合物。
在一些實施方式中，本公開的寡核苷酸綴合物具有優異的肝標靶特異性，因此能夠高效地將所綴合的功能性寡核苷酸遞送至肝部，從而有效地對肝細胞內特定基因表達進行調控。從而，本公開的寡核苷酸綴合物具有廣泛的應用前景。
按照本公開的一些實施方式，本公開提供了本公開的寡核苷酸綴合物在製備用於治療和/或預防由肝細胞中特定基因的表達引起的病理狀況或疾病的藥物中的用途。所述特定基因可以是肝臟中表達的內源性基因，也可以是在肝臟中繁殖的病原體基因。在一些實施方式中，所述特定基因例如為ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV或HCV。在一些實施方式中，所述特定基因為B型肝炎病毒基因、血管生成素樣蛋白3基因或者載脂蛋白C3基因。相應地，所述疾病選自慢性肝病、肝炎、肝纖維化疾病、肝增生性疾病和血脂異常。在一些實施方式中，所述血脂異常為高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症或動脈粥樣硬化。
在一些實施方式中，本文提供用於治療由肝細胞中特定基因的表達引起的病理狀況或疾病的方法，其包括向有需要的患者給予本公開的寡核苷酸綴合物。在一些實施方式中，所述特定基因例如為ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV或HCV。在一些實施方式中，所述特定基因選自B型肝炎病毒基因、血管生成素樣蛋白3基因和載脂蛋白C3基因。相應地，所述疾病選自慢性肝病、肝炎、肝纖維化疾病、肝增生性疾病和血脂異常。在一些實施方式中，所述血脂異常為高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症或動脈粥樣硬化。在一些實施方式中，本公開提供的綴合物也可用於治療其它肝臟疾病，包括以不期望的細胞增殖為特徵的疾病、血液疾病、代謝疾病和以炎症為特徵的疾病。肝臟的增殖疾病可以是良性或惡性疾病，例如癌症、肝細胞癌(HCC)、肝轉移或肝母細胞瘤。肝臟血液學或炎症疾病 可以是涉及凝血因子、補體介導的炎症或纖維化的疾病。肝臟的代謝疾病包括血脂異常和葡萄糖調節的不規則性。在一些實施方案中，該方法包括施用一種或多種具有與參與肝病的基因序列高度同源的寡核苷酸。
按照本公開一些實施方式，本公開提供了一種抑制肝細胞中特定基因表達的方法，該方法包括將本公開的siRNA綴合物與所述肝細胞進行接觸。
藉由將本公開的寡核苷酸綴合物給予有需要的患者，可以藉由對基因表達進行調控的機制達到預防和/或治療由肝細胞中特定基因的表達而引起的病理狀況或疾病的目的。因此，本公開的寡核苷酸綴合物可用於預防和/或治療本文公開的病理狀況或疾病、或用於製備用於預防和/或治療本文公開的病理狀況或疾病的藥物。
本文所使用的術語“給藥/給予”是指藉由使得至少部分地將綴合物如寡核苷酸綴合物定位於期望的位點以產生期望效果的方法或途徑，將綴合物遞送至受試者體內。適於本公開方法的給藥途徑包括但並不僅限於局部給藥和全身給藥。一般而言，局部給藥導致與受試者體循環相比將更多寡核苷酸綴合物遞送至特定位點；而全身給藥導致將所述寡核苷酸綴合物遞送至患者的體循環。考慮到本公開旨在提供預防和/或治療由肝細胞中特定基因的表達而引起的病理狀況或疾病的手段，在一些實施方式中採用能夠將藥物遞送至肝臟的給藥方式。
可藉由本領域已知的任何合適途徑向患者給藥，所述途徑包括但不僅限於：口服或胃腸外途徑，例如靜脈內給藥、肌肉內給藥、皮下給藥、經皮給藥、氣道給藥(氣霧劑)、肺部給藥、鼻部給藥、直腸給藥和局部給藥(包括口腔含化給藥和舌下給藥)。給藥頻率可以是每天、每週、每兩周、每個月或每年1次或多次。
本公開所述的寡核苷酸綴合物的使用劑量可為本領域常規的劑量，所述劑量可以根據各種參數、尤其是患者的年齡、體重和性別來確定。可在細胞培養或實驗動物中藉由標準藥學程序測定毒性和療效，例如測定LD50(使50%的群體死亡的致死劑量)和ED50(在量反應中指能引起50%最大反應強度的劑量，在質反應中，指能引起50%實驗對象出現陽性反應時的劑量)。可基於由細胞培養分析和動物研究得到的數據得出人用劑量的範圍。
在給予本公開所述的綴合物時，例如，對於雄性或雌性、6-12周齡、體重18-25g的C57BL/6J或C3H/HeNCrlVr小鼠，以所述寡核苷酸綴合物中的寡核苷酸的量計：對於遞送功能性寡核苷酸與綴合分子形成的寡核苷酸綴合物，被綴合物遞送的寡核苷酸用量可以為0.001-100mg/kg體重，在一些實施方式中為0.01-50mg/kg體重，在一些實施方式中為0.05-20mg/kg體重，另一些實施方式中為0.1-15mg/kg體重，在另一些實施方式中為0.1-10mg/kg體重。在給予本公開所述的寡核苷酸綴合物時，可參考上述用量。
另外，藉由將本公開的寡核苷酸綴合物導入特定基因異常表達的肝細胞，還可以藉由基因表達調控的機制達到抑制肝細胞中該特定基因的表達這一目的。在一些實施方式中，所述肝細胞為肝炎細胞，在一些實施方式中為HepG2.2.15細胞。在一些實施方式中，所述肝細胞可以選自Hep3B、HepG2、Huh7等肝癌細胞系或分離的肝原代細胞，在一些實施方式中為Huh7肝癌細胞。
採用本公開提供的方法抑制特定基因在肝細胞中表達的情況下，所提供的寡核苷酸綴合物中的功能性寡核苷酸的用量是所屬技術領域具有通常知識者根據期望獲得的效果容易確定的。例如，在一些實施方式中，所述寡核苷酸綴合物是siRNA綴合物，所提供的siRNA綴合物中的siRNA用量是這樣的量：其足以減少靶基因的表達，並導致1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或0.05nM至約5nM的細胞外濃度。達到該局部濃度所需的 量將隨各種因素而變化，所述因素包括遞送方法、遞送部位、在遞送部位和靶細胞或組織之間的細胞層的數目、遞送途徑(局部還是全身)等。在遞送部位處的濃度可以顯著高於在靶細胞或組織的表面處的濃度。
有益效果
在一些實施方式中，本公開提供的綴合物在體內具有更高的寡核苷酸遞送效率、更低的毒性、更好的穩定性和/或更高的活性。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的靶基因表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的HBV基因表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的肝內HBV基因表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的動物模型中肝內HBV基因表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的人類對象中HBV表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的HBV表面抗原表達抑制率。在一些實施方式中，本公開提供的siRNA、siRNA組合物或siRNA綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的ANGPTL3基因表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的肝內ANGPTL3基因表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的動物模型中肝內ANGPTL3基因表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的人類對象中ANGPTL3基因表達抑制率。在一 些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的APOC3基因表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的肝內APOC3基因表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的動物模型中肝內APOC3基因表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的人類對象中APOC3基因表達抑制率。在一些實施方式中，本公開的綴合物未顯示出明顯脫靶效應。脫靶效應可以是例如抑制非靶基因的基因表達。如果脫靶基因表達的結合/抑制與在靶基因效果相比低於50%、40%、30%、20%或10%的水平，則認為該脫靶效應就是不顯著的。
根據本公開的一些實施方式，本公開的綴合物可有效地將siRNA遞送至肝臟，並表現出優異的抑制HBV基因表達性質。例如，在具有低脫靶效應的同時，在1mg/kg的劑量下抑制B肝模型小鼠肝臟中87.4%-92.2%的HBV基因表達。在一些實施方式中，本公開的siRNA綴合物有效地降低B肝模型小鼠中的HBV表面抗原表達，在3mg/kg的劑量下可以達到96.9%的HBV表面抗原表達抑制率和95.4%的HBV DNA抑制率。在一些實施方式中，本發明提供的綴合物在最長達140天的時間內在低劑量下對HBV表達表現出優異的抑制作用。
根據本公開的一個實施方案，本公開提供的綴合物可有效地將siRNA遞送至肝臟，並且表現出優異的抑制HBV基因表達的性質，例如，在具有低脫靶效應的同時，在1mg/kg的劑量下抑制B肝模型小鼠肝臟中至少69.3%、或78.1-89.1%的HBV基因表達。在一些實施方式中，本公開的綴合物有效地降低B肝模型小鼠中的HBV表面抗原表達，在3mg/kg的劑量下達到98.4%的HBV 表面抗原表達抑制率和95.8%的HBV DNA抑制率。在一些實施方式中，相比於參比綴合物，本發明提供的特異性綴合物在最長達84天的時間內在低劑量下對HBV表達表現出優異的抑制作用。
根據本公開的一個實施方案，本公開提供的綴合物可有效地將siRNA遞送至肝臟，並且表現出優異的抑制HBV基因表達的性質，例如，在具有低脫靶效應的同時，能夠在1mg/kg的劑量下抑制B肝模型小鼠肝臟中至少48.5%、或76.8-80.0%的HBV基因表達。在一些實施方式中，本公開的綴合物還有效地降低B肝模型小鼠中的HBV表面抗原表達，甚至在3mg/kg的劑量下達到84.6%的HBV表面抗原表達抑制率和85.6%的HBV DNA抑制率。在一些實施方式中，相比於參比綴合物，本發明提供的綴合物在最長達21天的時間內在低劑量下對HBV表達表現出更高的抑制作用。
根據本公開的一個實施方案，本公開提供的綴合物可有效地將siRNA遞送至肝臟，並且表現出優異的抑制HBV基因表達的性質，例如，在具有低脫靶效應的同時，能夠在1mg/kg的劑量下抑制B肝模型小鼠肝臟中至少60.1%、或在一個實施方式中為80.7-84.5%的HBV X基因區基因表達。在一些實施方式中，本公開的綴合物還有效地降低B肝模型小鼠中的HBV表面抗原表達，甚至在3mg/kg的劑量下達到94.8%的HBV表面抗原表達抑制率和95.8%的HBV DNA抑制率。在一些實施方式中，相比於參比綴合物，本發明提供的綴合物在最長達56天的時間內在低劑量下對HBV表達表現出優異的抑制作用。
根據本公開的一個實施方案，本公開提供的綴合物可有效地將siRNA遞送至肝臟，並且表現出優異的抑制ANGPTL3基因表達的性質，例如，在1mg/kg的劑量下抑制高脂模型小鼠肝臟中至少57.3%的ANGPTL3基因表達；3mg/kg劑量下，基因抑制率最高為90.4%。在一些實施方案中，與參考綴 合物相比，本公開提供的綴合物在低劑量和低施用頻率下在最長為49天的時間內表現出優異的ANGPTL3表達抑制和降血脂作用。
根據本公開的一個實施方案，本公開提供的綴合物可有效地將siRNA遞送至肝臟，並且表現出優異的抑制ApoC3基因表達的性質，例如，在3mg/kg的劑量下抑制高脂模型小鼠肝臟中至少75%的APOC3基因表達。在一些實施方案中，與參考綴合物相比，本公開提供的綴合物在低劑量和低施用頻率下在最長為65天的時間內表現出優異血脂抑制作用。
在某些實施方式中，本公開所述的綴合物在動物模型中表現出低毒性，這表明良好的安全性。例如，在一些實施方式中，對於本公開的綴合物，即使在C57BL/6J小鼠中給予高達起效濃度的100倍(按起效濃度3mg/kg計)，也未觀察到明顯的毒性反應。
上述示例說明，本文提供的綴合物對靶細胞表面受體有效，並將負載的活性劑遞送到表達受體的細胞。設想綴合物分子可適應於額外的細胞表面受體和額外的活性劑，以標靶表達這些受體的細胞的活性劑。
試劑盒
在另一方面，本文提供了包含如上所述的綴合物的試劑盒。
在一些實施方案中，本文提供的試劑盒在一個容器中包含的綴合物。在一些實施方式中，本文提供的試劑盒包含容器，其包含藥學上可接受的輔料。在一些實施方式中，本文提供的試劑盒進一步包括藥學上可接受的輔料，比如穩定劑或防腐劑。在一些實施方式中，本文提供的試劑盒包含至少一種附加的治療劑。在一些實施方式中，該試劑盒包含至少一種容器中的附加治療劑，其不同於包含本公開所述綴合物的治療劑。在一些實施方式中，所述試劑盒包含用於將綴合物與藥學上可接受的輔料或其它成分(如果存在)進行混合的說明書。
在本公開的試劑盒中，所述綴合物和/或藥學上可接受的輔料可以任何形式提供，例如液體形式、乾燥形式或凍乾形式。在一些實施方式中，綴合物和/或藥學上可接受的輔料基本上純淨和/或無菌。在一些實施方式中，在本公開的試劑盒中提供無菌水。
實施例
以下將藉由實施例對本公開進行詳細描述。除非另外說明，以下實施例中所用到的試劑、培養基均為市售商品，所用到的核酸電泳、real-time PCR等操作均參照Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LBboratory Press(1989))所記載的方法進行。
HEK239A細胞由北京大學分子醫學研究所核酸技術實驗室提供，用含由20%胎牛血清(FBS，Hyclone)、0.2v%藍莓素雙抗(青黴素-鏈黴素，Gibco，Invitrogen)的DMEM完全培養基(Hyclone)於37℃在含5% CO2/95%空氣的培養箱中培養。
Huh7細胞購自中國科學院幹細胞庫，用含有10%的胎牛血清(FBS，Hyclone)、1%非必需氨基酸(NEAA，Corning)的DMEM完全培養基(Hyclone)於37℃在含5% CO2/95%空氣的培養箱中培養。
若無其它說明，用以下製備例12-製備例15中合成的siRNA綴合物轉染細胞時，使用LipofectamineTM2000(Invitrogen)作為轉染試劑，具體操作參照製造商提供的說明書。
若無其它說明，以下提供的試劑比例均按體積比(v/v)計算。
若無其它說明，所使用的動物模型如下：C57BL/6J小鼠：購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；SD大鼠：由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供； HBV轉基因小鼠C57B/6N-Tg(1.28 HBV)/Vst(genotype A)，購自北京維通達生物技術有限公司。於實驗前選擇COI>104的小鼠(以下也簡稱為1.28copy小鼠)；HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J：購自北京大學醫學部實驗動物科學部。於實驗前選擇S/CoV>10的小鼠；HBV轉基因小鼠：命名為M-TgHBV，購自上海市公共衛生中心動物部，轉基因小鼠的製備方法如Ren J.等，J.Medical Virology.2006,78：551-560所述；AAV-HBV轉基因小鼠：其按照文獻方法(董小岩等，Chin J Biotech 2010,May 25；26(5)：679-686)製備。將rAAV8-1.3HBV，D型(ayw)病毒(購於北京五加和分子醫學研究所有限公司，1×1012病毒基因組(v.g.)/mL，批號2016123011)用無菌PBS將rAAV8-1.3HBV稀釋至5×1011v.g./mL，每隻小鼠注射200μL稀釋後的rAAV8-1.3HBV，(即每隻小鼠注射1×1011v.g.)。病毒注射後第28天，所有小鼠藉由眼眶採血(約100μL)用於收集血清以檢測HBsAg和HBV DNA；低濃度AAV-HBV轉基因小鼠：採用與上述基本相同的造模方法，區別之處在於，病毒在實驗前用無菌PBS稀釋至1×1011v.g./mL，每隻小鼠注射100μL病毒，即每隻小鼠注射1×1010v.g.；BALB/c小鼠：6-8周齡，購於北京維通利華實驗動物技術有限公司；ob/ob小鼠：6-8周齡，購於常州卡文斯實驗動物有限公司；人APOC3轉基因小鼠：B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，購於Jackson Lab； 代謝症候群猴：全部為雄性，由北京大學分子醫學研究所非人靈長類研究中心提供。
製備例1 L-9綴合分子(綴合分子1)的製備
本製備例中，按照以下方法，合成了綴合分子1(以下，也稱為L-9綴合分子)。
(1-1)GAL-5的合成(L-9綴合分子的末端段的分子)
Figure 107142925-A0305-02-0117-161
(1-1a)GAL-2的合成
將100.0g GAL-1(N-乙醯-D-半乳糖胺鹽酸鹽，CAS號：1772-03-8，購自寧波弘翔生化公司，463.8mmol)溶於1000ml無水吡啶，冰水浴下加入540ml乙酸酐(購自Enox公司，5565.6mmol)，室溫攪拌反應1.5小時。將反應液倒入10L冰水中，減壓抽濾，濾餅用2L冰水洗滌後，加乙腈/甲苯混合溶劑(體積比乙腈：甲苯=1：1)至完全溶解，蒸乾溶劑，得到白色固體產品GAL-2 130.0g。
(1-1b)GAL-3的合成
將步驟(1-1a)中獲得的GAL-2(35.1g，90.0mmol)溶解於213ml無水1,2-二氯乙烷中，在冰水浴且氮氣保護條件下，加入24.0g TMSOTf(CAS號：27607-77-8，購自麥克林公司，108.0mmol)，室溫反應過夜。
在反應液中加入400ml二氯甲烷稀釋，以矽藻土過濾，再加入1L飽和碳酸氫鈉水溶液，攪拌均勻，分出有機相，水相用二氯乙烷萃取兩次，每次300ml，合併有機相，分別用300ml飽和碳酸氫鈉水溶液和300ml飽和食鹽水洗滌，分出洗滌獲得的有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾溶劑，得到淺黃色黏稠糖稀狀產品GAL-3 26.9g。
(1-1c)GAL-4的合成
將步驟(1-1b)中獲得的GAL-3(26.9g，81.7mmol)溶於136ml無水1,2-二氯乙烷中，加入乾燥的4Å分子篩粉末30g，再加入9.0g 5-己烯-1-醇(CAS號：821-41-0，購自Adamas-beta公司，89.9mmol)，室溫下攪拌30分鐘，冰浴和氮氣保護下加入9.08g TMSOTf(40.9mmol)，室溫下攪拌反應過夜。過濾除去4Å分子篩粉末，濾液中加入300ml二氯乙烷稀釋，以矽藻土過濾，再加入500ml飽和碳酸氫鈉水溶液攪拌10分鐘洗滌，分出有機相，剩餘水相用300ml二氯乙烷萃取一次，合併全部有機相並分別用300ml飽和碳酸氫鈉水溶液和300ml飽和食鹽水洗滌，分出洗滌獲得的有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾溶劑，得到黃色糖稀狀產品GAL-4 41.3g，不進行純化直接進行下一步氧化反應。
(1-1d)GAL-5的合成
將按照步驟(1-1c)中描述的方法得到的GAL-4(14.9g，34.7mmol)溶於77ml二氯甲烷和77ml乙腈的混合溶劑中，分別加入103ml去離子水和29.7g高碘酸鈉(CAS號：7790-28-5，購自阿拉丁公司，138.8mmol)，冰水浴下攪拌 10分鐘，加入三氯化釕(CAS號：14898-67-0，購自安耐吉公司，238mg，1.145mmol)，室溫反應過夜。反應液加入300ml水稀釋攪拌，加飽和碳酸氫鈉調pH約為7.5，分出並棄去有機相，剩餘水相用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，棄去萃取得到的有機相。萃取得到的水相用檸檬酸固體調節pH約為3，用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾溶劑，得到白色泡沫狀固體產品GAL-5 6.85g。
以下，使用按照上述方法得到的GAL-5化合物，藉由以下製程路徑合成了L-9綴合分子：
Figure 107142925-A0305-02-0120-162
(1-2)M-11-T3的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0120-163
將J-0(1.883g，10mmol，商購自阿法埃莎公司)溶於25ml乙腈中，加入三乙胺(4.048g，40mmol)冰水浴冷卻至0℃，加入三氟乙酸乙酯(5.683g，40mmol)，室溫下反應22h，減壓蒸乾溶劑，用真空油泵使殘餘物發泡並乾燥18h，得到5.342g粗品固體M-11-T3，不經進一步純化地直接用於後續反應。MS m/z：C15H22F9N4O3，[M+H]+，理論值：477.35，實測值：477.65。
(1-3)M-11-T3-Tr的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0121-164
將M-11-T3粗品(5.342g，10mmol)溶於50ml二氯甲烷，向所得反應液中加入TrCl(3.345g，12mmol)和三乙胺(1.518g，15mmol)，室溫下攪拌反應20h，將反應溶液洗滌兩次，每次使用20ml飽和碳酸氫鈉，再用20ml飽和食鹽水洗滌一次，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾有機溶劑，用真空油泵使殘餘物發泡並乾燥過夜，得到粗品固體M-11-T3-Tr 7.763g。MS m/z：C34H36F9N4O3，[M+Na]+，理論值：741.25，實測值：741.53。粗品固體M-11-T3-Tr不經純化地繼續用於下一步M-18-Tr的合成。
(1-4)M-18-Tr的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0121-165
將步驟(1-3)中獲得的M-11-T3-Tr粗品(7.763g，10mmol)溶於100ml甲醇，再加入100ml甲胺水溶液(40質量%)，在50℃攪拌反應23h，過濾除去不溶顆粒物，減壓蒸乾溶劑，向殘餘物加入200ml體積比為1：1的DCM：甲醇混合溶劑，用50ml飽和碳酸氫鈉洗滌，水相再用二氯甲烷萃取3次，每次 50ml，合併全部有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑，用真空油泵使殘餘物發泡並乾燥過夜，用200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，以二氯甲烷：甲醇：氨水(25wt%)=1：1：0.05-1：1：0.25梯度沖提，收集沖提液，減壓蒸乾溶劑，用真空油泵使殘餘物發泡並乾燥得到純品M-18-Tr 2.887g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.47-7.39(m,6H),7.32-7.24(m,6H),7.19-7.12(m,3H),2.60-2.47(m,4H),2.46-2.19(m,13H),1.70-1.55(m,4H),1.40(p,J=6.8Hz,2H).MS m/z：C28H39N4，[M+H]+，理論值：431.65，實測值：432.61。
(1-5)L-5-Tr的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0122-166
將步驟(1-4)中獲得的M-18-Tr(2.02g，4.69mmol)與步驟(1-1)中獲得的GAL-5(6.93g，15.48mmol)混合溶於47ml乙腈，加入N-甲基嗎啉(3.13g，30.96mmol)和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMTMM，4.28g，15.48mmol)，室溫攪拌反應2h。以200ml二氯甲烷稀釋反應液，100ml飽和碳酸氫鈉溶液洗滌有機相，100ml飽和食鹽水洗滌有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑得粗品。200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，以二氯甲烷：甲醇=100：5-100：7梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾得到純品L-5-Tr 7.49g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.83-7.10(m,4H),7.67-7.60(m,1H),7.44-7.34(m,6H),7.33-7.24(m,6H),7.20-7.15(m,3H),5.22(s,3H),4.97(d,J=11.3Hz,3H),4.49(d,J=8.4Hz, 3H),4.06-3.07(m,9H),3.95-3.83(m,3H),3.77-3.64(m,3H),3.45-3.35(m,3H),3.12-2.87(m,8H),2.30-2.15(m,3H),2.11-1.98(m,22H),1.95-1.84(m,11H),1.81-1.61(m,14H),1.54-1.36(m,14H).MS m/z：C85H119N7O30，[M+H]+，理論值：1718.81，實測值：1718.03。
(1-6)L-8的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0123-167
將步驟(1-5)中得到的L-5-Tr(5.94g，3.456mmol)溶於69ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(13.367g，103.67mmol)，室溫下反應2h，加入100ml二氯甲烷稀釋所得反應液，再加飽和碳酸氫鈉溶液洗滌調節pH=7-8，分離出的水相以二氯甲烷萃取6次，每次30ml，合併全部有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑得粗品。純化使用200-300目正相矽膠，以10wt%三乙胺中和矽膠酸性，1wt‰三乙胺平衡管柱，以二氯甲烷：甲醇=100：30-100：40梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品L-8 4.26g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ 7.84(d,J=9.0Hz,3H),7.27-7.23(m,1H),7.13-7.18(m,1H),5.22(d,J=3.1Hz,3H),4.97(dd,J=11.3,3.1Hz,3H),4.48(d,J=8.4Hz,3H),4.09-3.98(m,9H),3.88(dd,J=19.3,9.3Hz,3H),3.75-3.66(m,3H),3.44-3.38(m,3H),3.17-3.30(m,4H),3.10-2.97(m,4H),2.35-2.20(m,6H),2.15-2.08(m,9H),2.07-1.98(m, 13H),1.94-1.87(m,9H),1.81-1.74(m,9H),1.65-1.42(m,18H).MS m/z：C85H119N7O30，[M+H]+，理論值：1477.59，實測值：1477.23。
(1-7a)A-1的合成
Figure 107142925-A0305-02-0124-168
將DMTrCl(4,4’-雙甲氧基三苯甲基氯，38.12g，112.5mmol)溶於450ml無水吡啶中，加入DL-甘油酸鈣水合物(12.88g，45.0mmol)，在45℃反應22h，將所得反應液過濾，濾餅用200ml DCM淋洗，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物用500ml二氯甲烷重新溶解，0.5M三乙胺磷酸鹽(pH=7-8)洗滌2次，每次200ml，分離出的水相以二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓蒸乾溶劑，殘餘物用200-300目正相矽膠柱純化，以石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷：甲醇=1：1：1：0.35-1：1：1：0.55梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑，殘餘物用500ml二氯甲烷重新溶解，以200ml 0.5M三乙胺磷酸鹽洗滌1次，水相用二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合併全部有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓蒸乾溶劑，用真空油泵使殘餘物減壓乾燥過夜，得到白色固體產品A-1 20.7g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.46(ddd,J=6.5,2.3,1.1Hz,1H),7.40-7.28(m,7H),6.89-6.81(m,4H),4.84(d,J=5.0Hz,1H),4.36-4.24(m,1H),4.29(s,6H),3.92(dd,J=12.4,7.0Hz,1H),3.67(dd,J=12.3,7.0Hz,1H),2.52(q,J=6.3Hz,6H),1.03(t,J=6.3Hz,9H).MS m/z：C24H23O6，[M-H]-，理論值：407.15，實測值：406.92。
(1-7b)L-7的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0125-169
將步驟(1-6)中獲得的L-8(2.262g，1.532mmol)和步驟(1-7a)中獲得的A-1(2.342g，4.596mmol)混合，溶於16ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯並三嗪4(3H)-酮(DEPBT，1.375g，4.596mmol)，再加入二異丙基乙胺(1.188g，9.191mmol)，25℃下攪拌反應2h，用10ml飽和碳酸氫鈉洗滌有機相，水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，合併全部有機相，以10ml飽和食鹽水洗滌有機相，分離出的水相以二氯甲烷萃取2次，每次10ml，合併所得有機相並以無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑，殘餘物用真空油泵發泡乾燥過夜，得到粗品4.900g。粗品進行柱純化，使用120g 200-300目正相矽膠，以20ml三乙胺中和矽膠酸性，以含1wt%三乙胺的石油醚平衡管柱，以石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷：N,N-二甲基甲醯胺=1：1：1：0.5-1：1：1：0.6梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品L-7 2.336g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.90-7.78(m,4H),7.75-7.64(m,1H),7.38-7.18(m,9H),6.91-6.83(m,4H),5.25-5.10(m,4H),4.97(dd,J=11.2,3.2Hz,3H),4.48-4.30(m,4H),4.02(s,9H),3.93-3.84(m,3H),3.76-3.66(m,9H),3.45-3.35(m,3H),3.24-2.98(m,10H),2.30-2.20(m,2H),2.11-1.88(m,31H),1.80-1.40(m,28H).MS m/z：C90H128N7O35，[M-DMTr]+，理論值：1564.65，實測值：1564.88。
(1-8)L-9的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0126-170
將步驟(1-7b)中獲得的L-7(2.300g，1.26mmol)、丁二酸酐(0.378g，3.78mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.462g，3.78mmol)混合溶於13ml二氯甲烷，再加入DIPEA(0.814g，6.30mmol)，25℃下攪拌24h。5ml 0.5M三乙胺磷酸鹽洗滌所得反應液，分離出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次5ml，合併全部有機相減壓蒸乾得到2.774g粗品。粗品進行柱純化，使用60g 200-300目正相矽膠，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，以二氯甲烷平衡管柱，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷：甲醇=100：18-100：：20梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品L-9綴合分子(綴合分子1)1.874g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ 8.58(d,J=4.2Hz,1H),7.94-7.82(m,3H),7.41-7.29(m,5H),7.22(d,J=8.1Hz,5H),6.89(d,J=8.3Hz,4H),5.49-5.37(m,1H),5.21(d,J=3.0Hz,3H),4.97(d,J=11.1Hz,3H),4.49(d,J=8.2Hz,3H),4.02(s,9H),3.88(dd,J=19.4,9.4Hz,3H),3.77-3.65(m,9H),3.50-3.39(m,6H),3.11-2.90(m,5H),2.61-2.54(m,4H),2.47-2.41(m,2H),2.26-2.17(m,2H),2.15-1.95(m,22H),1.92-1.84(m,9H),1.80-1.70(m,10H),1.65-1.35(m,17H),1.31-1.19(m,4H),0.96(t,J=7.1Hz,9H).MS m/z：C94H132N7O38，[M-DMTr]+，理論值：1664.72，實測值：1665.03。所得到的L-9綴合分子的結構如式(503)所示。
製備例2 P-9綴合分子(綴合分子2)的製備
本製備例中，按照以下方法，合成了綴合分子2(以下，也稱為P-9綴合分子)：
Figure 107142925-A0305-02-0127-171
(2-1)GAL5-C4-1的合成
向40ml N,N-二甲基甲醯胺中加入按照上述(1-1)中描述的方法得到的GAL-5(13.43g，30.0mmol)、4-氨基酸叔丁酯鹽酸鹽(5.87g，30.0mmol)、O-苯並三唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(13.65g，36.0mmol)和二異丙基乙胺(11.63g，90.0mmol)，溶解均一後室溫攪拌反應5小時。向所得反應液中加入300ml飽和碳酸氫鈉水溶液，用乙酸乙酯萃取分離出的水相3次，每次200ml，合併洗滌獲得的有機相，用200ml飽和食鹽水洗滌一次，分出洗滌獲得的有機相，再用無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸除溶劑至乾得到30.3g油狀物粗品GAL5-C4-1，直接進行下一步反應。
(2-2)GAL5-C4-2的合成
將步驟(2-1)中獲得的GAL5-C4-1粗品(30.3g，30mmol)溶於180ml甲酸中，室溫攪拌反應16小時。蒸發溶劑至乾，粗品藉由柱層析純化(200-300目正相矽膠，二氯甲烷：甲醇=100：18-100：20梯度沖提)，收集沖提液，濃縮除去溶劑，得到目標產物GAL5-C4-2共14.84g。
(2-3)P-6的合成：
將按照步驟(1-4)中描述的方法得到的M-18-Tr(2.02g，4.69mmol)與將步驟(2-2)中獲得的GAL5-C4-2(8.24g，15.48mmol)混合溶於47ml乙腈，再加入N-甲基嗎啉(3.13g，30.96mmol)，最後加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMTMM，4.28g，15.48mmol)，室溫攪拌反應2h。以200ml二氯甲烷稀釋所得反應液，分別以100ml飽和碳酸氫鈉溶液和100ml飽和食鹽水洗滌有機相，合併全部有機相並以無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑得粗品，200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，以二氯甲烷：甲醇=100：5-100：7梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾得到純品P-6共8.27g。
(2-4)P-7的合成：
將按照上述(2-3)中得到的P-6(6.82g，3.456mmol)溶於69ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(13.367g，103.67mmol)，室溫下反應2h。加入100ml二氯甲烷稀釋所得反應液，再加入飽和碳酸氫鈉溶液洗滌並調節pH=7-8，分離出的水相以二氯甲烷萃取6次，每次30ml，合併全部有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑得粗品。用200-300目正相矽膠純化，以10wt%三乙胺中和矽膠酸性，以1wt‰三乙胺平衡管柱，二氯甲烷：甲醇=100：30-100：40梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑得到P-7共4.82g。MS m/z：C78H127N10O33，[M+H]+，理論值：1732.91，實測值：1735.73。
(2-5)P-8的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0129-172
將P-7(2.653g，1.532mmol)和A-1(2.342g，4.596mmol)混合溶於16ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷醯基-1,2,3-苯並三唑4(3H)-酮(DEPBT)(1.375g，4.596mmol)，再加入二異丙基乙胺(1.188g，9.191mmol)，25℃下攪拌反應2h。用10ml飽和碳酸氫鈉洗滌有機相，水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，合併全部有機相並用10ml飽和食鹽水洗滌，分離出的水相以二氯甲烷萃取2次，每次10ml，合併所得有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑，殘餘物用真空油泵發泡乾燥過夜得到粗品。粗品進行柱純化，使用120g 200-300目正相矽膠，以20ml三乙胺中和矽膠酸性，以含1wt%三乙胺的石油醚平衡管柱，以石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷：N,N-二甲基甲醯胺=1：1：1：0.5-1：1：1：0.6梯度沖提，收集沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品P-8共2.793g。
(2-6)P-9的合成：
將P-8(490mg，0.231mmol)、丁二酸酐(69mg，0.693mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，68mg，0.554mmol)混合溶於2.3ml二氯甲烷，再加入二異丙基乙胺(DIPEA，149mg，1.155mmol)，25℃下攪拌反應21h。50ml二氯甲烷稀釋所得反應液，再用100ml 0.5M三乙胺磷酸鹽洗滌反應液，分離出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，合併全部有機相，減壓蒸乾得到粗品。粗品進行柱純化，使用80g 200-300目正相矽膠，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，以二氯甲烷平衡管柱，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷：甲醇=100：18-100：20梯度沖提，收集沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品P-9綴合分子(綴合分子2)共200mg。MS m/z：C106H153N10O41，[M-DMTr]+，理論值：1921.05，實測值：1920.97。所得到的P-9綴合分子的結構如式(504)所示。
製備例3 R-4綴合分子(綴合分子3)的製備
本製備例中，按照以下方法，合成了綴合分子3(以下，也稱為R-4綴合分子)。
Figure 107142925-A0305-02-0131-173
(3-1)GAL-C7-1的合成
將按照步驟(1-1b)中描述的方法得到的GAL-3(26.4g，80.2mmol)溶於134ml無水1,2-二氯乙烷中，加入4Å分子篩粉末60g，再加入7-辛烯-1-醇(11.3g，88.2mmol)，室溫下攪拌反應10分鐘，冰浴和氮氣保護下加入三氟甲基磺酸三甲基甲矽烷基酯(TMSOTf，8.9g，40.1mmol)，室溫攪拌反應24小時。過濾除去4Å分子篩粉末，濾液中加入500ml飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，分出有機相，剩餘水相用100ml二氯甲烷萃取一次。合併全部有機相並用250ml飽和食鹽水洗滌一次，分出洗滌獲得的有機相，用無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸除溶劑至乾得到黃色糖稀狀產品GAL-C7-1 33.3g，不進行純化直接進行下一步氧化反應。
(3-2)GAL-C7-2的合成
將步驟(3-1)中得到的GAL-C7-1(33.3g，72.8mmol)溶於160ml二氯甲烷和160ml乙腈的混合溶劑中，分別加入216ml水和高碘酸鈉固體(62.3g，291.2mmol)，冰水浴下攪拌10分鐘，加入催化劑三氯化釕(498mg，2.4mmol)自然升至室溫攪拌反應23小時。所得反應液加入200ml水稀釋，攪拌，加飽和碳酸氫鈉調節pH值為7.5，分掉有機相，剩餘水相再用二氯甲烷萃取三次，棄去萃取獲得的有機相，萃取獲得的水相用檸檬酸固體調節pH約為3，用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，合併所得有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸除溶劑後柱層析(200-300目正相矽膠，二氯甲烷：甲醇=100：18-100：20梯度沖提)純化得到白色泡沫狀固體產品GAL-C7-2 22.4g。MS m/z：C21H32NO11，[M+H]+，理論值：476.50，實測值：475.94。
(3-3)R-1的合成：
將按照步驟(1-4)中描述的方法得到的M-18-Tr(2.02g，4.69mmol)與GAL-C7-2(7.36g，15.48mmol)混合溶於47ml乙腈，再加入N-甲基嗎啉(3.13g，30.96mmol)，最後加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽 (DMTMM，4.28g，15.48mmol)，室溫攪拌反應2h。以200ml二氯甲烷稀釋所得反應液，分別用100ml飽和碳酸氫鈉溶液和100ml飽和食鹽水洗滌有機相，合併全部有機相並以無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑得粗品，200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，二氯甲烷：甲醇=100：5-100：7梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾得到純品R-1 7.82g。
(3-4)R-2的合成：
將R-1(6.23g，3.456mmol)溶於69ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(13.367g，103.67mmol)，室溫下反應2h。加入100ml二氯甲烷稀釋所得反應液，再加飽和碳酸氫鈉溶液洗滌並調節pH=7-8，分離出的水相以二氯甲烷萃取6次，每次30ml。合併全部有機相並以無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑得粗品。粗品用200-300目正相矽膠純化，以10wt%三乙胺中和矽膠酸性，以1wt‰三乙胺平衡管柱，二氯甲烷：甲醇=100：30-100：40梯度沖提，減壓蒸乾溶劑得到純品R-2 4.49g。
(3-5)R-3的合成：
將R-2(2.391g，1.532mmol)和A-1(2.342g，4.596mmol)混合溶於16ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯並三嗪4(3H)-酮(DEPBT，1.375g，4.596mmol)，再加入二異丙基乙胺(1.188g，9.191mmol)，25℃下攪拌反應2h。用10ml飽和碳酸氫鈉洗滌有機相，分離出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml。合併全部有機相並以10ml飽和食鹽水洗滌，分離出的水相以二氯甲烷萃取2次，每次10ml，合併所得有機相並以無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑，用真空油泵使殘餘物減壓乾燥過夜得到粗品。粗品進行柱純化，使用120g 200-300目正相矽膠，以20ml三乙胺中和矽膠酸性，以含1wt%三乙胺的石油醚平衡管柱，石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷：N,N-二甲基甲醯胺=1：1：1：0.5-1：1：1：0.6梯度沖提，減壓蒸乾溶劑得到純品R-3 2.642g。
(3-6)R-4的合成：
將R-3(795mg，0.4074mmol)、丁二酸酐(82mg，0.8148mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，100mg，0.8148mmol)混合溶於4ml二氯甲烷，再加入二異丙基乙胺(DIPEA，100mg，0.8148mmol)，25℃下攪拌反應18h。5ml 0.5M三乙胺磷酸鹽洗滌所得反應液，水相以二氯甲烷萃取3次，每次5ml，合併全部有機相減壓蒸乾溶劑得到粗品。粗品進行柱純化，使用30g 200-300目正相矽膠，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，以二氯甲烷平衡管柱，含1wt‰三乙胺的二氯甲烷：甲醇=100：18-100：20梯度沖提，收集沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品R-4綴合分子(綴合分子3)505mg。所得到的R-4綴合分子的結構如式(507)所示。
製備例4 LA-4綴合分子(綴合分子4)的製備
按照以下製程路徑，預期能夠合成綴合分子4(以下，也稱為LA-4綴合分子)，所得LA-4綴合分子的結構如式(512)所示。
Figure 107142925-A0305-02-0135-174
綴合分子綴合分子
製備例5 LB-4綴合分子(綴合分子5)的製備
本製備例中，按照以下方法，合成了綴合分子5(以下，也稱為LB-4綴合分子)：
Figure 107142925-A0305-02-0136-175
(5-1)LB-1的合成：
將按照步驟(1-6)中描述的方法得到的L-8(5.0g，3.386mmol)、己二酸酐(870mg，6.772mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，827mg，6.772mmol)混合溶於130ml二氯甲烷，再加入二異丙基乙胺(DIPEA，2.2g，16.931mmol)，25℃下攪拌反應4h。加入70ml二氯甲烷稀釋所得反應液，以0.5M三乙胺磷酸鹽洗滌反應液，分離出的水相以二氯甲烷萃取4次，每次10ml，合併全部有機相，減壓蒸乾溶劑得到粗品。粗品進行柱純化，使用120g 200-300目正相矽膠，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，以二氯甲烷平衡管柱，石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷：甲醇=1：1：1：0.2-1：1：1：1梯度沖提。減壓蒸乾溶劑得到純品LB-1 4.267g。
(5-2)LB-2的合成：
將按照步驟(5-1)中描述的方法得到的LB-1(4.697g，2.753mmol，由兩批次產物合併而得)、3-氨基-1,2-丙二醇(313mg，3.442mmol)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMTMM，953mg，3.442mmol)和N-甲基嗎啉(700mg，6.884mmol)先後加入30ml乙腈和3ml甲醇的混合物中，室溫攪拌反應過夜。蒸發溶劑至乾，殘餘物用柱層析(200-300目正相矽膠，二氯甲烷：甲醇=1：0.07-1：0.5梯度沖提)純化，收集沖提液，濃縮除去溶劑，得到目標產物LB-2 3.27g。
(5-3)LB-3的合成：
將LB-2(2.27g，1.353mmol)用14ml無水吡啶溶解。再加入4,4’-雙甲氧基三苯甲基氯(688mg，2.03mmol)室溫下攪拌反應過夜。加150ml甲醇淬滅反應，蒸發溶劑至幹。殘餘物進行柱層析(200-300目正相矽膠，二氯甲烷：甲醇=1：0.05-1：0.2梯度沖提)純化，收集沖提液，濃縮除去溶劑，得到目標產物LB-3 1.647g。
(5-4)LB-4的合成：
將LB-3(822mg，0.415mmol)、丁二酸酐(83g，0.83mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，102mg，0.83mmol)混合溶於4ml二氯甲烷，再加入DIPEA(270mg，2.075mmol)，25℃下攪拌反應過夜。0.5M三乙胺磷酸鹽洗滌所得反應液3次，分離出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次2ml。合併全部有機相減壓蒸乾溶劑得到粗品。粗品進行柱純化，使用200-300目正相矽膠，以5wt%三乙胺中和矽膠酸性，以石油醚平衡管柱，用含1wt‰三乙胺的二氯甲烷：甲醇=100：5-100：20梯度沖提，減壓蒸乾溶劑得到純品LB-4綴合分子(綴合分子5)787mg。所得到的LB-4綴合分子的結構如式(513)所示。
製備例6 V-7綴合分子(綴合分子6)的合成
按照以下製程路徑，預期能夠合成綴合分子6(以下，也稱為V-7綴合分子)，所得V-7綴合分子結構如式(514)所示。
Figure 107142925-A0305-02-0138-176
製備例7 W-7綴合分子(綴合分子7)的製備
本製備例中，按照以下方法，合成了綴合分子7(以下，也稱為W-7綴合分子)。
Figure 107142925-A0305-02-0139-177
(7-1)W-1的合成：
將W-0(2.024g，10mmol)溶於25ml乙腈中，再加三乙胺(4.048g，40mmol)，冰水浴冷卻至0℃左右，加入三氟乙酸乙酯(5.683g，40mmol)， 室溫下反應22h。減壓蒸乾溶劑，用真空油泵使殘餘物發泡乾燥18h，得到5.835g粗品固體W-1。
(7-2)W-2的合成：
將W-1粗品(5.835g，10mmol)溶於50ml二氯甲烷，向反應液中加入TrCl(3.345g，12mmol)和三乙胺(1.518g，15mmol)，室溫下攪拌反應20h。用20ml飽和碳酸氫鈉洗滌所得反應液2次，再用20ml飽和食鹽水洗滌1次。合併全部有機相並以無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾有機溶劑，用真空油泵使殘餘物發泡乾燥過夜，得到粗品固體W-2 8.012g。粗品固體W-2不經處理，進行下一步脫保護反應。
(7-3)W-3的合成：
將W-2粗品(8.012g，10mmol)溶於100ml甲醇，再加入100ml甲胺水溶液(40wt%)，在50℃下攪拌反應23h。過濾除去不溶顆粒物，減壓蒸乾溶劑，殘餘物加入200ml體積比為1：1的DCM-甲醇混合溶劑，以50ml飽和碳酸氫鈉洗滌所得有機相，分離出的水相再用二氯甲烷萃取3次，每次50ml。合併全部有機相並以無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑，用真空油泵使殘餘物發泡乾燥過夜，用200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，以二氯甲烷：甲醇：氨水(25wt%)=1：1：0.05-1：1：0.25梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑，殘餘物用真空油泵發泡乾燥得到純品W-3 3.062g。
(7-4)W-4的合成：
將W-3(675mg，1.517mmol)與GAL-C7-2(2.60g，5.46mmol)混合溶於47ml乙腈，再加二異丙基乙胺(1.57g，12.14mmol)，最後加入3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯並三嗪-4(3H)-酮(DEPBT，1.816g，6.04mmol)，室溫攪拌反應2.5h。以100ml二氯甲烷稀釋所得反應液。分別用80ml飽和碳酸氫 鈉溶液和80ml飽和食鹽水洗滌有機相。合併全部有機相並以無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑得粗品。粗品進行200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，以二氯甲烷：甲醇=100：5-100：7梯度沖提，收集沖提液，減壓蒸乾得到純品W-4 1.610g。
(7-5)W-5的合成：
將W-4(1.61g，0.886mmol)溶於125ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(3.5ml，42.43mmol)，室溫下反應1h。加入150ml吡啶中和所得反應液，減壓蒸乾溶劑得粗品。粗品進行柱純化，使用200-300目正相矽膠，10wt%三乙胺中和矽膠酸性，1wt‰三乙胺平衡管柱，二氯甲烷：甲醇=100：30-100：40梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品W-5 1.26g。
(7-6)W-6的合成：
將W-5(1.25g，0.793mmol)和按照步驟(1-7a)中描述的方法得到的A-1(1.21g，2.38mmol)混合溶於12ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯並三嗪-4(3H)-酮(DEPBT，0.712g，2.38mmol)，再加入二異丙基乙胺(0.615g，4.76mmol)，25℃下攪拌反應3h。用80ml飽和碳酸氫鈉洗滌有機相，分離出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml。合併全部有機相並以10ml飽和食鹽水洗滌，合併所得有機相並以無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑，殘餘物用真空油泵發泡乾燥過夜得到粗品。粗品進行柱純化，使用185g 200-300目正相矽膠，20ml三乙胺中和矽膠酸性，以含1wt%三乙胺的石油醚平衡管柱，以石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷：N,N-二甲基甲醯胺=1：1：1：0.1-1：1：0.7梯度沖提，收集沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品W-6 1.57g。
(7-7)W-7的合成：
將W-6(1.238g，0.63mmol)、丁二酸酐(0.189g，1.89mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.231g，1.89mmol)混合溶於7ml二氯甲烷，再加 入DIEA(0.407g，3.15mmol)，25℃下攪拌反應24h。以5ml 0.5M三乙胺磷酸鹽洗滌所得反應液，分離出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次5ml。合併全部有機相減壓蒸乾得到粗品。粗品進行柱純化，使用30g 200-300目正相矽膠，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，二氯甲烷平衡管柱，以含1wt%三乙胺的二氯甲烷：甲醇=100：18-100：20梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品W-7綴合分子(綴合分子7)1.033g。MS m/z：C101H146N7O38，[M-DMTr]+，理論值：1763.92，實測值：1763.21。所得到的W-7綴合分子的結構如式(515)所示。
製備例8 X-7綴合分子(綴合分子8)的製備
按照以下製程路徑，預期能夠合成綴合分子8(以下，也稱為X-7綴合分子)，所得X-7綴合分子結構如式(521)所示。
Figure 107142925-A0305-02-0143-178
製備例9 K-3綴合分子(對比綴合分子1)的製備
本製備例中，按照以下方法，合成了K-3綴合分子(以下，也稱為對比綴合分子1)。
Figure 107142925-A0305-02-0144-179
(9-1)K-1的合成：
向60ml二氯甲烷中加入按照步驟(1-7a)中描述的方法得到的A-1(3.0g，6.0mmol)、PyBOP(6.2g，12.0mmol)、HOBt(1.6g，2.0mmol)和二異丙基乙胺(DIPEA，3.9g，30.0mmol)，室溫攪拌反應10分鐘，隨後將上述溶液加入到K-0(5.6g，30.0mmol)中，室溫反應1小時50分鐘。將反應液倒入30ml飽和碳酸氫鈉溶液中，分離出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次30ml。合併全部有機相並以飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥後過濾濃縮。粗品進行柱純化，以200-300目正相矽膠柱純化，以二氯甲烷：甲醇：氨水(25wt%)=10：2：0.1-4：4：1梯度沖提，收集產物沖提液，濃縮除去溶劑，殘餘物用真空油泵發泡乾燥，得到白色固體產品K-1 2.2g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.02(s,1H),7.43(d,J=7.8Hz,2H),7.34-7.17(m,7H),6.87(d,J=8.6Hz,4H),4.05(d,J=5.2Hz,1H),3.74(s,6H),3.20-3.01(m,5H),2.60-2.38(m,12H),1.60-1.39(m,8H),1.24(s,1H).MS m/z：C33H47N4O5，[M+H]+，理論值：579.35，實測值：579.26。
(9-2)K-2的合成：
向3ml二氯甲烷中加入按照(1-1)中描述的方法得到的GAL-5(483mg，1.08mmol)、3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯並三嗪-4(3H)-酮(359mg，1.2mmol)、二異丙基乙胺(DIPEA，310mg，2.4mmol)，室溫攪拌30分鐘，隨後加入K-1(174mg，0.3mmol)，室溫反應16小時。將反應液倒入10ml飽和碳酸氫鈉溶液中，分離出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，合併全部有機相並以10ml飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥後過濾濃縮。以200-300目正相矽膠柱純化，二氯甲烷：甲醇=20：1沖提，收集沖提液，濃縮除去溶劑，真空油泵乾燥發泡，得到黃色固體產品K-2 205mg。
(9-3)K-3的合成：
向1.1ml二氯甲烷中加入K-2(205mg，0.11mmol)、丁二酸酐(22mg，0.22mmol)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，27mg，0.22mmol)和二異丙基乙胺(DIPEA，71mg，0.55mmol)，室溫攪拌反應過夜。反應液用0.5M三乙胺磷酸鹽溶液洗3次，每次0.5ml，並且每次洗滌獲得的水相用0.5ml二氯甲烷反萃一次。合併全部有機相並用無水硫酸鈉乾燥，濃縮除去溶劑，真空油泵乾燥發泡，得到淺黃色固體產品K-3綴合分子(對比綴合分子1)218mg。
製備例10 本製備例用於說明(GalNAc)3綴合分子(對比綴合分子2)的合成
本製備例中，按照WO2014025805A1中實施例1-4所述的製備方法合成了化合物47，所述化合物47的結構如下式所示，本文中將其稱為(GalNAc)3綴合分子(對比綴合分子2)：
Figure 107142925-A0305-02-0146-180
製備例11 本製備例用於說明FIN-2綴合分子(對比綴合分子3)的製備
在本製備例中，參照Rajeev等人，ChemBioChem 2015,16,903-908中描述的製備方法，按照以下製程路徑，合成了FIN-2綴合分子(對比綴合分子3)：
(11-1)PRO-10化合物的合成
Figure 107142925-A0305-02-0146-181
(11-1-1)PRO-7的合成
將2.93g PRO-6(L-羥基脯氨酸，CAS號：51-35-4，購自安耐吉公司，22.4mmol)溶於22.5ml 1,4-二氧六環(1,4-dioxane)中，加入34ml 10%(w/w)Na2CO3的水溶液，將6.954g Fmoc-Cl(氯甲酸-9-芴基甲酯，CAS號：28920-43-6，購自安耐吉公司，26.8mmol)溶於56.5ml 1,4-二氧六環，冰浴下加入到反應混合物中，自然升至室溫反應過夜。反應液倒入150ml冰水中，用甲基叔丁基醚萃取三次，每次100ml，棄去所得有機相，剩餘水相用濃HCl調節pH
Figure 107142925-A0305-02-0147-320
5，用100ml乙酸乙酯萃取兩次，合併所得有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾溶劑得到白色泡沫狀固體產品PRO-7 7.83g。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.91(t,J=7.2Hz,2H),7.67(d,J=7.5Hz,2H),7.48-7.39(m,2H),7.38-7.27(m,2H),5.17(s,1H),4.27(s,2H),4.23-4.11(m,2H),3.55-3.41(m,3H),2.31-2.10(m,1H),2.08-1.88(m,1H).HRMS(ESI)m/z calcd for C20H19NO5[M-H]-352.1190，實測值352.1033.
(11-1-2)PRO-8的合成
將7.83g PRO-7(22.2mmol)溶於80ml THF中，油浴加熱到65℃，回流狀態下加入36.6ml 2mol/L的BH3-Me2S的THF溶液(CAS號13292-87-0，購自百靈威公司，73.2mmol)，繼續回流反應3小時。倒出反應液，用甲醇溶解剩餘固體，攪拌下加入甲醇至反應液無氣體放出並繼續攪拌30分鐘，減壓蒸除溶劑後，殘餘物用石油醚提純三次後得白色固體產物PRO-8 7.1g。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.91(t,J=6.7Hz,2H),7.67(d,J=7.2Hz,2H),7.49-7.39(m,2H),7.38-7.26(m,2H),5.18(dd,J=6.1,3.8Hz,1H),4.28(s,2H),4.23-4.13(m,2H),3.55-3.38(m,2H),2.32-2.11(m,1H),2.08-1.89(m,1H).HRMS(ESI)m/z calcd for C20H21NO4[M+Na]+ 362.1368，實測值362.1012.
(11-1-3)PRO-9的合成
將7.1g PRO-8(21mmol)溶於100ml吡啶中，加入14.2g DMTr-Cl(4,4’-雙甲氧基三苯甲基氯，42mmol)，室溫下攪拌反應5小時。減壓蒸除溶劑，粗品用乙酸乙酯溶解後過濾除去鹽類雜質，減壓蒸除溶劑後，用矽膠柱純化殘餘物。為了純化，將溶解在DCM中的粗產物加載到用吡啶預處理以鹼化的矽膠柱上。先用含1%(v/v)吡啶的DCM沖提DMTr-Cl，隨後用乙酸乙酯沖提產物，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑，得白色固體產物PRO-9 8.2g；HRMS(ESI)m/z calcd for C41H39NO6[M+Na]+ 664.2675，實測值664.2348；C18 RP-HPLC(批號JJS160324-1)純度94.20%。
(11-1-4)PRO-10的合成
將8.2g PRO-9(12.8mmol)溶於64ml DMF中，加入40ml呱啶(384mmol)，室溫下攪拌反應30分鐘。反應液倒入300ml冰水中，乙酸乙酯萃取三次，每次150ml，合併所得有機相，用200ml飽和食鹽水洗滌後，洗滌獲得的有機相以無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸除溶劑後，將殘餘物用矽膠柱純化，為了純化，將溶解在DCM中的粗產物加載到用吡啶預處理以鹼化的矽膠柱上。先用含1%(v/v)吡啶的DCM沖提Fmoc，隨後用乙酸乙酯沖提產物，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑，得白色固體產物PRO-10 4.65g。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.40(d,J=7.2Hz,2H),7.35-7.18(m,7H),6.93-6.84(m,4H),4.56(d,J=3.9Hz,1H),4.12(s,1H),3.74(s,6H),3.46-3.37(m,1H),2.88(ddd,J=18.5,10.0,5.5Hz,2H),2.75(dd,J=8.7,5.8Hz,1H),2.62(dd,J=11.0,2.7Hz,1H),1.74-1.65(m,1H),1.40(ddd,J=12.9,8.5,5.9Hz,1H)；HRMS(ESI)m/z calcd for C26H29NO4[M+Na]+ 442.1994，實測值442.1999；C18 RP-HPLC(批號JJS160329-1)純度97.07%。
(11-2)FIN-1的合成
Figure 107142925-A0305-02-0149-182
將按照(1-1)中描述的方法得到的GAL-5(4.5g，10mmol)溶於40ml DMF中，依次加入3.9g DIPEA(N,N-二異丙基乙胺，CAS號：7087-68-5，購自阿拉丁公司，30mmol)和3.8g HBTU(苯並三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽，CAS號：94790-37-2，商購自阿拉丁公司，11mmol)，室溫下攪拌10分鐘獲得反應液。將步驟(12-4)中獲得的PRO-10(4.2g，10mmol)溶於40mlDMF中，隨後加入到上述反應液中，反應液中加入無水硫酸鈉乾燥，室溫攪拌2小時。將反應液倒入120ml冰水中，用乙酸乙酯萃取三次，每次60ml，合併有所得機相，分別用20ml水、20ml飽和食鹽水洗滌，分出有洗滌獲得的機相並以無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸除溶劑，殘餘物矽膠柱純化。為了純化，將樣品加載到用吡啶預處理以鹼化的矽膠柱上。用含1%(v/v)三乙胺和1%(v/v)甲醇的二氯甲烷(DCM)溶液沖提，收集沖提液，減壓蒸乾溶劑，得到淺黃色泡沫狀固體產品FIN-1 6.5g。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.83(d,J=9.2Hz,1H),7.32(t,J=6.6Hz,4H),7.20(td,J=8.9,3.5Hz,5H),6.93-6.84(m,4H),5.21(d,J=3.2Hz,1H),5.04-4.90(m,2H),4.49(s,1H),4.40(d,J=4.4Hz,0.8H),4.31(d,J=5.0Hz,0.2H),4.15(s,1H),4.03(s,3H),3.93(s,1H),3.74(s,7H),3.59(dt,J=12.0,6.0Hz,1H),3.50-3.40(m,1H),3.39-3.25(m,3H),3.13(dd,J=8.9,5.2Hz,1H),3.00(dq,J=9.3,5.3,4.3Hz,1H),2.22(s,2H),2.07(s,3H),1.99(s,3H),1.90(s,4H),1.74(s,3H),1.50(s,3H),1.36(s,1H)。C18 RP-HPLC(批號LJ160422)純度95.45%。
(11-3)FIN-2的合成
Figure 107142925-A0305-02-0150-183
將步驟(11-2)中獲得的FIN-1(3.0g，3.53mmol)溶於10ml DMF，氮氣保護下加入2.13g PA(雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦，Adamas公司，商品編號11356B，7.06mmol)、346mg四唑(CAS號：288-94-8，購自阿拉丁公司，4.94mmol)，室溫下攪拌反應，補加10ml DMF，繼續攪拌反應1小時。減壓蒸除溶劑後，殘餘物以矽膠柱層析純化。為了純化，將溶解在DCM中的粗產物加載到用吡啶預處理以鹼化的矽膠柱上，乙酸乙酯沖提，收集沖提液，減壓蒸除溶劑，得無色糖漿狀粗品4.5g。粗品用50%(v/v)乙腈水溶液溶解至完全溶解，用(C-18，330g，300Å)中壓純化柱純化樣品，柱預先用含1%(v/v)吡啶的乙腈溶液鹼化，梯度沖提收集產品，減壓蒸除溶劑得白色粉末產品FIN-2綴合分子(對比綴合分子3)2.2g。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ 148.04,147.94,147.62,147.19，磷譜純度92%；C18 RP-HPLC純度90.54%。
製備例12 本製備例用於說明Z-4綴合分子(綴合分子153)的製備
本製備例中，按照以下方法，合成了綴合分子153(以下，也稱為Z-4綴合分子)。
Figure 107142925-A0305-02-0151-184
(12-1)Z-1的合成：
將按照步驟(7-3)中描述的方法得到的W-3(1.50g，3.37mmol)與按照步驟(2-2)中描述的方法得到的GAL5-C4-2(7.18g，13.48mmol)混合溶於34ml二氯甲烷，再加入二異丙基乙胺(3.48g，26.96mmol)，之後加入3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯並三嗪-4(3H)-酮(DEPBT，4.04g，13.48mmol)，室溫攪拌反應4.5小時。以100ml二氯甲烷稀釋所得反應液，用80ml飽和碳酸氫鈉溶液和80ml飽和食鹽水分別洗滌有機相，合併全部有機相並以無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑得粗品，粗品用200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，以二氯甲烷：甲醇=30：1-15：1梯度沖提，收集沖提液，減壓蒸乾得到純品Z-1 3.97g。MS m/z：C98H143N10O33，[M+H]+，理論值：1987.98，實測值：1987.90。
(12-2)Z-2的合成：
將Z-1(3.97g，2.00mmol)溶於250ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(10.941g，84.85mmol)，室溫下反應1小時。加入吡啶中和所得反應液至中性，減壓蒸乾溶劑得粗品。200g 200-300目正相矽膠裝柱，10%吡啶中和矽膠酸性，1‰吡啶平衡管柱，二氯甲烷：甲醇=10：1-2：1梯度沖提，收集沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品Z-2 3.49g。MS m/z：C79H129N10O33，[M+H]+，理論值：1746.94，實測值：1746.90。
(12-3)Z-3的合成：
將按步驟(1-7a)所述方法得到的Z-2(3.49g，2.0mmol)和A-1(3.06g，6.0mmol)混合溶解於30ml二氯甲烷中，加入3-(二乙氧基磷醯氧基)-1，2，3-苯並三嗪-4(3H)-酮(DEPBT，1.80g，6.0mmol)，然後加入二異丙基乙胺(1.55g，12.0mmol)，25℃下攪拌反應3小時。加入100ml二氯甲烷稀釋所得反應液，用飽和碳酸氫鈉洗滌有機相2次，每次30ml，水相以10ml二氯甲烷萃取。合併全部有機相並以50ml飽和食鹽水洗滌，合併所得有機相並用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸乾溶劑，殘餘物用真空油泵發泡乾燥過夜得到粗品。粗品進行柱純化，使用200g 200-300目正相矽膠，20ml三乙胺中和矽膠酸性，以含1wt%三乙胺的石油醚平衡管柱，二氯甲烷：甲醇=25：1-15：1梯度沖提，收集沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品Z-3 2.2g。MS m/z：C103H151N10O38，[M+H]+，理論值：2136.02，實測值：2136.20。
(12-4)Z-4的合成：
將Z-3(2.10g，0.983mmol)溶解在含有DIEA(635mg，4.915mmol)的14.8ml二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，240mg，1.966mmol)攪拌澄清後，加入丁二酸酐(197mg，1.966mmol)，25℃下攪拌反應18小時。加入50ml二氯甲烷稀釋所得反應液，以80ml 0.5M三乙胺磷酸鹽洗滌有機相，水相以二氯甲烷萃取2次，每次50ml。合併全部有機相減壓蒸乾得到粗品。粗品 進行柱純化，使用188g 200-300目正相矽膠，以1wt%三乙胺中和矽膠酸性，二氯甲烷平衡管柱，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷：甲醇=10：1-3：1梯度沖提，收集沖提液，減壓蒸乾溶劑得到純品Z-4綴合分子(綴合分子12)1.95g。MS m/z：C107H155N10O41，[M+H]+，理論值：1935.07，實測值：1935.29。所得到的Z-4綴合分子的結構如式(422)所示。
製備例13 L10-siHBa1綴合物(綴合物9)的製備
本製備例中，以L-9綴合分子(綴合分子1)出發，按照以下方法製備了L10-siHBa1綴合物(以下，也稱為綴合物9)。
(13-1)L-10化合物的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0153-185
此步驟中，藉由將L-9綴合分子連接至固相載體，製備了L-10化合物。
將步驟(1-8)中獲得的L-9綴合分子(0.233g，0.1126mmol)、O-苯並三唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，0.064g，0.1689mmol)和二異丙基乙胺(DIPEA，0.029g，0.2252mmol)混合，溶於19ml乙腈，室溫攪拌5分鐘。加入氨甲基樹脂(0.901g，100-200目，氨基載量400μmol/g，購自南開和成公司)至反應液中，25℃下於震盪進行反應，轉速220轉/分鐘，反應15h後過濾。將殘留物用DCM淋洗2次，每次30ml；乙腈淋洗3次，每次30ml；30ml乙醚淋洗1次，真空油泵乾燥2h。再按照表2中示出的投料配比進行蓋帽反應。
Figure 107142925-A0305-02-0154-186
其中，Cap1和Cap2為蓋帽試劑溶液，Cap1為20%(v/v)N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合物中的溶液，吡啶與乙腈的體積比為3：5；Cap2為20%(v/v)乙酸酐的乙腈溶液；將Cap1、Cap2、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和乙腈加入到上述反應混合物中，25℃下在震盪進行反應，轉速200轉/分鐘，反應5小時。反應液過濾，將殘留物用乙腈淋洗3次，每次30ml，使溶劑蒸發至乾，用真空油泵使混合物減壓下乾燥過夜，得到L-10化合物(即，連接固相載體的L-9綴合分子)1.100g，載量90.8μmol/g。L-10化合物的結構如式(523)所示。
(13-2)合成L10-siHBa1綴合物正義鏈
本步驟中，siRNA綴合物的siRNA為編號為siHBa1的序列：siHBa1正義鏈：5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(SEQ ID NO：1)，反義鏈：5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(SEQ ID NO：2)；藉由亞磷醯胺固相合成的方法，由上述步驟製備的L-10化合物起始，按照上述序列順序按照3’-5’的方向逐一連接核苷單體。每連接一個核苷單體都包括脫保護、偶聯、蓋帽、和氧化四步反應。合成條件給定如下：核苷單體以0.1M濃度的乙腈溶液提供，每一步的脫保護反應的條件相同，即溫度為25℃，反應時間為70秒，脫保護試劑為二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3%v/v)，二氯乙酸與固相載體上4,4’-二甲氧基三苯甲基保護基的莫耳比為5：1。
每一步偶聯反應條件均相同，包括溫度為25℃，固相載體上連接的核酸序列與核苷單體的莫耳比為1：10，固相載體上連接的核酸序列和偶聯試劑的莫耳比為1：65，反應時間為600秒，偶聯試劑為5-乙基硫-1H-四唑的0.5M乙腈溶液。
每一步蓋帽條件均相同，包括溫度為25℃，反應時間為15秒。蓋帽試劑溶液為莫耳比為1：1的Cap1和Cap2的混合溶液，蓋帽試劑與固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為乙酸酐：N-甲基咪唑：固相載體上連接的核酸序列=1：1：1。
每一步氧化反應條件相同，包括溫度為25℃，反應時間為15秒，氧化試劑為0.05M的碘水。碘與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為30：1。反應在四氫呋喃：水：吡啶=3：1：1的混合溶劑中進行。
切割和脫保護條件如下：將合成的連接有載體的核苷酸序列加入25wt%的氨水中，氨水用量為0.5ml/μmol，在55℃反應16h，除去液體，將殘餘物真空濃縮至乾。在氨水處理後，對於單鏈核酸的量，以0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解產品，隨後加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氫氟酸鹽，從而脫除核糖上的2’-TBDMS保護。純化與脫鹽：利用製備型離子層析柱(Source 15Q)，藉由NaCl的梯度沖提來實現核酸的純化。具體而言為：沖提劑A：20mM磷酸鈉(pH 8.1)，溶劑為水/乙腈=9：1(體積比)；沖提劑B：1.5M氯化鈉，20mM磷酸鈉(pH 8.1)，溶劑為水/乙腈=9：1(體積比)；沖提梯度：沖提劑A：沖提劑B=100：0-50：50梯度沖提。收集產品沖提液後合併，採用反相層析純化柱進行脫鹽，具體條件包括採用Sephadex柱進行脫鹽，填料為Sephadex-G25，以去離子水沖提。
檢測：使用離子交換層析(IEX-HPLC)檢測的純度為92.4%；採用液質聯用(LC-MS)分析分子量，理論值7253.96，實測值7253.12。
從而，該步驟中將L-9綴合分子連接至所得到的正義鏈的3’末端，得到L-9綴合分子綴合在siRNA 3’末端的siRNA正義鏈S。
(13-3)合成反義鏈
本步驟中，利用通用固相載體(UnyLinkerTM loaded NittoPhase®HL Solid Supports，Kinovate Life SciencesInc.)，合成了L10-siHB1綴合物的反義鏈AS。藉由與正義鏈合成相同的條件獲得siRNA的反義鏈AS，包括固相合成方法中的脫保護、偶聯、蓋帽、氧化反應條件，脫保護和切割，分離條件。
檢測：採用離子交換層析(IEX-HPLC)進行檢測的純度為93.2%；分子量採用液質聯用(LC-MS)進行分析。理論值6675.04，實測值6674.50。
(13-4)合成L10-siHBa1綴合物
將S鏈和AS鏈分別溶於注射用水溶液中，得到40mg/ml的溶液。它們以等莫耳比混合，在50℃下加熱15分鐘，冷卻至室溫後，使它們藉由氫鍵形成雙鏈結構。
在上述合成完成後，用超純水(Milli-Q超純水儀自製，電阻率18.2MΩ*cm(25℃))將綴合物稀釋至0.2mg/mL的濃度。利用液質聯用儀(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，購於Waters公司，型號：LCT Premier)進行分子量檢測。其結果，分子量理論值S：7253.96，AS：6675.04；分子量實測值S：7253.24，AS：6674.61，實測值與理論值一致，從而確定所合成的綴合物是目標設計的帶有L-9綴合分子的雙鏈核酸序列。L10-siHBa1綴合物(綴合物9)的結構如式(3)所示。
製備例14 綴合物16-18、24-26、42-43、62、78、105、109、111、115、144以及154-171的製備
採用與製備例13相同的方法製備題述綴合物，不同的是：1)綴合的siRNA具有表3A-3G中所示的對應於綴合物16-18、24-26、42-43、62、78、 105、109、111、115、144、157-163以及167-171的序列；2)當目標序列中兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯連接時，用以下硫化反應步驟代替該兩個核苷酸中後一個核苷酸的連接中的氧化反應步驟；每一步硫化反應的條件相同，包括溫度為25℃，反應時間為300秒，硫化試劑為氫化黃原素。硫化試劑與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為120：1。反應在乙腈：吡啶=1：1的混合溶劑中進行；並且3)當目標序列中的全部核苷酸的2’-位均為修飾的羥基基團時，切割與脫保護條件中不包括脫除核糖上的2’-TBDMS保護的步驟。從而，製備得到本公開的綴合物16-18、24-26、42-43、62、78、105、109、111、115、144、157-163以及167-171。
另外，採用與製備例13相同的方法製備綴合物154-156和164-166，區別在於分別用如下綴合分子代替L-9綴合分子：使用上述製備例2獲得的P-9綴合分子(綴合分子2)製備綴合物164、使用上述製備例7獲得的W-7綴合分子(綴合分子7)製備綴合物155、156和165、使用上述製備例12獲得的Z-4綴合分子(綴合分子12)製備綴合物154和166，並且綴合的siRNA分別為表3A-3G中所示的對應於綴合物154-156和164-166的序列，按照表3A-3G對上述綴合物分別進行編號，它們的結構分別如式(3)、式(4)、式(15)和式(22)所示。藉由液質聯用層析儀檢測綴合物分子量，結果如下，綴合物142的理論值S：7649.55，AS：6991.46；實測值S：7649.1，AS：6991；綴合物170的理論值S：7649.55，AS：6995.47，實測值S：7648.8，AS：6994.8；綴合物171的理論值S：7649.55，AS：7011.53，實測值S：7648.8，AS：7010.9；綴合物115的理論值S：7584.5，AS：7007.46，實測值S：7584，AS：7006.2；綴合物109的理論值S：7584.5，AS：6931.47，實測值S：7584，AS：6930.9；綴合物106的理論值S：7572.47，AS：6907.41，實測值S：7571.8，AS：6906.9；綴合物113的理論值S：7584.5，AS：7011.47，實測值S：7584，AS：7011.3； 綴合物17的理論值S：7504.34，AS：6961.52，實測值S：7503.4，AS：6960.9；綴合物25的理論值S：7504.34，AS：7037.51，實測值S：7503.6，AS：7036.9；綴合物18的理論值S：8218.83，AS：7703.05，實測值S：8218，AS：7702.5；綴合物16的理論值S：7516.37，AS：6985.58，實測值S：7516.5，AS：6984.9；綴合物159的理論值S：7504.34，AS：7057.58，實測值S：7503.6，AS：7057；綴合物160的理論值S：7504.34，AS：7041.52，實測值S：7503.6，AS：7040.8；綴合物161的理論值S：7516.37，AS：7065.58，實測值S：7516.6，AS：7064.5；綴合物162的理論值S：7504.34，AS：7139.68，實測值S：7515.6，AS：7138.9；綴合物163的理論值S：7516.37，AS：7081.64，實測值S：7515.6，AS：7080.9；綴合物62的理論值S：7485.3，AS：7161.7，實測值S：7484.4，AS：7160.9；綴合物78的理論值S：7423.22，AS：7207.78，實測值S：7422.6，AS：7207.2；綴合物42的理論值S：7407.22，AS：7208.77，實測值S：7406.4，AS：7208.1；綴合物43的理論值S：7407.22，AS：7170.72，實測值S：7406.5，AS：7170.1，測定值與理論值相符。
表3 siRNA綴合物
Figure 107142925-A0305-02-0158-187
Figure 107142925-A0305-02-0159-188
Figure 107142925-A0305-02-0160-189
Figure 107142925-A0305-02-0160-190
Figure 107142925-A0305-02-0161-191
Figure 107142925-A0305-02-0162-192
Figure 107142925-A0305-02-0162-193
Figure 107142925-A0305-02-0163-194
Figure 107142925-A0305-02-0163-195
Figure 107142925-A0305-02-0164-196
Figure 107142925-A0305-02-0164-197
Figure 107142925-A0305-02-0165-198
Figure 107142925-A0305-02-0166-199
Figure 107142925-A0305-02-0166-200
Figure 107142925-A0305-02-0167-201
Figure 107142925-A0305-02-0168-202
Figure 107142925-A0305-02-0168-203
Figure 107142925-A0305-02-0169-204
注：大寫字母C、G、U、A表示核苷酸的鹼基組成；dT表示脫氧胸腺嘧啶核苷酸；小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為2’-甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為2’-氟修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間的連接為硫代磷酸酯基連接；VP表示該字母VP右側的一個核苷酸為乙烯基磷酸酯修飾的核苷酸；P表示該字母P右側的一個核苷酸為磷酸酯核苷酸；Ps表示該字母Ps右 側的一個核苷酸為硫代磷酸酯修飾的核苷酸，Tmoe表示2’-甲氧乙氧基修飾的胸腺嘧啶核苷酸。
乙烯基磷酸酯和2’-甲氧基修飾的尿嘧啶核苷單體(VP-Um)按照以下方法合成：
Figure 107142925-A0305-02-0170-205
(14-1)VP-U-2的合成
按照以下方法，合成了VP-U-2分子：
Figure 107142925-A0305-02-0170-207
將2’-甲氧基修飾的尿嘧啶核苷(2’-OMe-U，51.30g，91.6mmol)，叔丁基二苯基氯矽烷(TBDPSCl，50.35g，183.2mmol)，咪唑(12.47g，183.2mmol)混合溶於450ml N,N-二甲基甲醯胺(DMF)，室溫下攪拌反應20小時。蒸除DMF，殘餘物用600ml二氯甲烷溶解後加300ml飽和碳酸氫鈉洗滌，分離出的水相再用二氯甲烷(DCM)萃取3次，每次300ml。合併全部有機相，用5%草酸洗滌至水相pH<5，蒸發溶劑至乾後獲得VP-U-1粗品，直接用於隨後VP-U-2的合成。
將VP-U-1粗品用100ml二氯甲烷溶解後，外加冰浴攪拌10分鐘，再加入預先在4℃冰箱預冷好的450ml的2%對甲苯磺酸溶液(溶劑為體積比3：7的甲醇-二氯甲烷混合溶劑)，反應10分鐘。再加入200ml飽和碳酸氫鈉淬滅反應，所得有機相加入飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌至pH=8。合併水相，用二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合併全部有機相，再用200ml飽和食鹽水洗滌一次，蒸發溶劑至乾。殘餘物用200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷：甲醇=1：1：1：0.05-1：1：1：0.25梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑，殘餘物用真空油泵發泡乾燥得到純品VP-U-2共40.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.96(d,J=7.8Hz,1H),7.64(dtd,J=5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41-7.30(m,6H),6.79(d,J=4.7Hz,1H),5.73(d,J=7.6Hz,1H),4.94(t,J=7.0Hz,1H),4.12(td,J=4.6,3.9Hz,1H),4.05(dd,J=4.8,4.0Hz,1H),3.96(t,J=4.7Hz,1H),3.68(ddd,J=11.8,7.0,4.6Hz,1H),3.57-3.46(m,1H),3.39(s,3H),1.05(s,8H).MS m/z：C26H33N2O6Si，[M+H]+，理論值：497.21，實測值：497.45。
(14-2)VP-U-4的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0171-208
將VP-U-2(19.84g，40.0mmol)，二環己基碳二亞胺(DCC，16.48g，80.0mmol)，吡啶(4.20g，53.2mmol)，三氟乙酸(6.61g，53.2mmol)混合溶於200ml二甲基亞碸(DMSO)，室溫下攪拌反應20小時獲得反應液。另取亞甲基二磷酸四乙酯(21.44g，74.4mmol)溶於120ml THF，冰浴降溫，在冰浴溫度下加入t-BuOK(11.36g，101.2mmol)，先在冰浴溫度下反應10分鐘，再升至室溫反應0.5小時，然後加入至前述反應液中，約1小時加完，冰浴溫度下反 應1h，再升至室溫反應18小時。加水淬滅反應，分離出的水相以二氯甲烷提取3次，每次200ml。合併全部有機相，用200ml飽和食鹽水水洗一次後蒸發溶劑至幹。用200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以石油醚：乙酸乙酯=1：1-1：4梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑，殘餘物用真空油泵發泡乾燥得到純品VP-U-4共14.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.96(d,J=7.8Hz,1H),7.64(dtd,J=5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41-7.30(m,6H),6.82-6.71(m,2H),5.90(ddd,J=25.9,15.0,1.0Hz,1H),5.73(d,J=7.6Hz,1H),4.36-4.21(m,3H),4.18(t,J=4.9Hz,1H),4.05(ddq,J=9.7,8.5,6.9Hz,2H),3.87(t,J=4.8Hz,1H),3.39(s,3H),1.32(td,J=6.9,0.7Hz,6H),1.05(s,8H).MS m/z：C31H42N2O8PSi，[M+H]+，理論值：629.24，實測值：629.51。
(14-3)VP-U-5的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0172-209
將VP-U-4(14.00g，22.29mmol)溶於100ml四氫呋喃，加入三乙胺三氫氟酸鹽(17.96g，111.45mmol)，室溫攪拌20小時至反應完全。直接蒸發溶劑至乾燥，再用二氯甲烷溶解隨後蒸乾2次，每次使用50ml二氯甲烷，得到粗品。粗品用200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷：甲醇=1：1：1：0.05-1：1：1：0.25梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑，殘餘物用真空油泵發泡乾燥得到純品VP-U-5共6.70g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.96(d,J=7.8Hz,1H),6.77(dd,J=15.0,6.2Hz,1H),5.99-5.82(m,2H),5.73(d,J=7.6Hz,1H),5.27(d,J=5.1Hz,1H),5.10(dd,J=5.3,4.7Hz,1H),4.29(ddq,J=9.8,8.6,7.0Hz,2H),4.17(ddd,J=6.2,5.2,1.0Hz,1H),4.12-3.98(m, 3H),3.39(s,2H),1.32(td,J=6.9,0.6Hz,6H).MS m/z：C15H24N2O8P，[M+H]+，理論值：391.13，實測值：391.38。
(14-4)VP-U-6的合成：
Figure 107142925-A0305-02-0173-630
在氬氣保護條件下向10ml無水二氯甲烷中加入VP-U-5(391mg，1.0mmol)、三氟乙酸吡啶鹽(0.232g，1.2mmol)、N-甲基咪唑(0.099g，1.2mmol)，雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(0.452g，1.5mmol)，室溫攪拌反應5小時。蒸除溶劑至幹，殘餘物用柱層析純化(200-300目正相矽膠，二氯甲烷：乙腈(含0.5wt%三乙胺)=3：1-1：3梯度沖提)，收集產物沖提液，濃縮除去溶劑，得到目標產物VP-U-6共508mg。31P NMR(161MHz,DMSO-d6)δ 150.34,150.29,17.07,15.50.MS m/z：C24H41N4O9P2，[M+H]+，理論值：591.23，實測值：591.55。表明VP-U-6是目標產物VP-Um，作為核苷單體參與RNA鏈合成。
使用如下方法將5’-磷酸酯修飾連接至反義鏈5’末端：原料為具有如下式CPR-I結構的磷酸化結構單體，由蘇州吉瑪提供，貨號Cat#13-2601-XX：
Figure 107142925-A0305-02-0173-211
在反義鏈全部核苷單體連接完畢後，按照亞磷醯胺核酸固相合成的方法，經脫保護、偶聯、蓋帽、氧化四步反應將式CPR-I單體連接至反義鏈5’末端。隨後按照如下條件進行切割與脫保護，獲得反義鏈： 將合成的連接有載體的核苷酸序列加入濃度為25wt%的氨水中，相對於核苷酸序列，氨水用量為0.5ml/μmol，在55℃反應16小時，除去液體，殘餘物用真空濃縮至乾。在氨水處理後，相對於單鏈核酸的量，以0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解產品，隨後加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氫氟酸鹽，從而脫除核糖上的2’-TBDMS保護。純化與脫鹽：利用製備型離子層析柱(Source 15Q)，藉由NaCl的梯度沖提純化核酸。具體而言為：沖提劑A：20mM磷酸鈉(pH 8.1)，溶劑為水/乙腈=9：1(體積比)；沖提劑B：1.5M氯化鈉，20mM磷酸鈉(pH 8.1)，溶劑為水/乙腈=9：1(體積比)；沖提梯度：沖提劑A：沖提劑B=100：0-50：50梯度沖提。收集產品沖提液後合併，採用反相層析純化柱進行脫鹽，具體條件包括採用Sephadex柱進行脫鹽，填料為Sephadex-G25，以去離子水沖提。
對於目標產物具有5’-硫代磷酸酯修飾的情況，使用與上述同樣的步驟，區別在於在連接時，以硫化反應條件代替上述氧化反應條件，從而進行硫化反應。
對於上述合成的正義鏈和反義鏈，使用離子交換層析(IEX-HPLC)檢測純度，並以液質聯用層析(LC-MS)分析分子量，確認所合成的核酸序列是對應於表5中各實施例與對比例的siRNA。
製備例15 表3A-3G中其餘綴合物的製備
另外地，採用與製備例13中相同的方法，預期能夠製備表3A-3G中其餘的siRNA綴合物，不同之處在於：1)對於綴合物31-37、52-58、68-74、84-90、121-127和146-152以及對比綴合物4-5、7-8和10-13，以上述製備例2-10或12獲得的綴合分子2-8或12和對比綴合分子1-2代替L-9綴合分子(例如，以P-9綴合分子(綴合分子2)代替L-9綴合分子時，預期獲得的是綴合物31、52、68、84、121和146這些編號標注有P10的綴合物，以R-4綴合分子(綴合 分子3)代替L-9綴合分子時，預期獲得的是綴合物32、53、69、85、122和147這些編號標注有R5的綴合物，依此類推)；2)綴合的siRNA具有表3A-3G中所示的對應於綴合物10-15、19-23、27-41、44-61、63-77、79-104、106-108、110、112-114、116-141和143-152以及對比綴合物4-5、7-8和10-17的序列；3)當目標序列中兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯連接時，用製備例13中描述的硫化反應步驟代替該兩個核苷酸中後一個核苷酸的連接中的氧化反應步驟；並且4)當目標序列中的全部核苷酸的2’-位均為修飾的羥基基團時，切割與脫保護條件中不包括脫除核糖上的2’-TBDMS保護的步驟。從而，預期能夠製備得到綴合物10-15、19-23、27-41、44-61、63-77、79-104、106-108、110、112-114、116-141和143-152以及對比綴合物4-5、7-8和10-17，按照表3A-3G對其分別進行編號。這些本公開的綴合物結構分別如式(3)、(4)、(7)、(12)、(13)、(14)、(15)、(21)或(22)所示，各對比綴合物結構分別如式(901)、式(902)所示：
Figure 107142925-A0305-02-0175-212
Figure 107142925-A0305-02-0176-213
其中，Nu為對比綴合物4-5、7-8和10-13中的siRNA。
製備例16 對比綴合物6和9的合成
使用上述步驟(11-3)中得到的FIN-2合成對比綴合物6和9。RNA固相合成條件、脫保護條件與前述步驟(11-2)所述的核酸固相合成一致，區別僅在於需要使用通用固相載體(UnyLinkerTM loaded NittoPhase®HL Solid Supports)，先藉由FIN-2的三次反應循環將FIN_FIN_FIN綴合在RNA正義鏈的3’末端，隨後再進行固相合成。
參照Rajeev等人，ChemBioChem 2015,16,903-908中描述的方法進行FIN_FIN_FIN綴合基團的連接，具體而言，首先脫除上述通用固相載體上的羥基保護基團，在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下與FIN-2綴合分子接觸發生偶聯，經蓋帽反應和氧化反應後，獲得連接至固相載體的FIN綴合分子。另外脫除該連接至固相載體的FIN綴合分子上的羥基保護基團DMTr，與另一FIN-2綴合分子接觸發生偶聯，進行蓋帽反應和氧化反應，並再重複一次上述脫保護-偶聯-蓋帽-氧化步驟，連接第三個FIN-2綴合分子，由此獲得連接在固相載體上的的綴合基團(FIN_FIN_FIN)。之後由連接至固相載體綴合基團開始，由此連 接核苷酸單體，並最終獲得具有綴合至3’末端的綴合基團(FIN_FIN_FIN)的RNA正義鏈。
上述反應中，所述的脫保護、偶聯、蓋帽、氧化反應的條件、溶劑和試劑與步驟(11-2)中描述的核酸固相合成方法相同。
隨後，藉由與製備例12中相同的方法進行切割與脫保護、純化與脫鹽、檢測、退火，最終獲得對比綴合物6和9(以下有時也簡稱為FIN綴合物)。利用液質聯用儀(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，購於WatersCorp.，型號：LCT Premier)進行分子量檢測。其結果，實測值與理論值相符，從而確定所合成的FIN-siHBa1M1SP綴合物是目標設計的化合物，其結構式如以下式(903)所示：
Figure 107142925-A0305-02-0177-214
其中，Nu為對比綴合物6或9中的siRNA。
在上述綴合物製備後，使用標準手段凍乾為固體粉末保存備用。在需要時，可使用例如注射用水或生理鹽水將其重新溶解為所需濃度的溶液使用。
實驗例1 本實驗說明本公開的綴合物的毒性。
在C57BL/6J小鼠上，分別向每隻小鼠皮下單次給予100mg/kg或200mg/kg(以siRNA計，為0.9%氯化鈉水溶液的形式，各自以濃度10mg/mL或20mg/mL施用10mL/kg)的綴合物24，在持續觀察期間，未出現動物死亡，也未觀察到與藥物不良反應相關的臨床症狀；給藥24h後，臨床病理學檢驗和大體解剖也均未發現異常。上述結果表明，本公開的綴合物具有較低的動物水平毒性。
實驗例2 本實驗說明本公開的綴合物的穩定性
實驗例2-1 在體外溶酶體裂解液中的穩定性
將綴合物24、25、42、43、62、78以及對比序列1(分別以siRNA濃度為20μM的0.9%氯化鈉水溶液形式提供，每組12μl)分別與27.2μL檸檬酸鈉水溶液(pH5.0)、4.08μL去離子水和2.72μL鼠Tritosomes(商購自XenotechInc.，貨號R0610LT，No.1610069，終濃度為0.2mU/μL)混勻，並在37℃恆溫孵育。分別在0h、5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h中的每個時間點取出5μl樣本，分別加入到15μL的9M的尿素水溶液中變性，隨後加入4μl上樣緩衝液(索萊寶公司，貨號20160830)，立即冷凍於-80℃冰箱終止反應。0小時表示將待測樣品與溶酶體裂解液混勻後，立即取出的時刻。未經溶酶體裂解液處理的參比樣品製備：取等莫耳量的上述綴合物(20μM)各1.5μl分別與7.5μL檸檬酸鈉水溶液(pH5.0)、1μL去離子水混勻，分別加入15μL 9M的尿素水溶液變性，隨後加入4μL上樣緩衝液(索萊寶公司，貨號20160830)混勻，立即冷凍於-80℃冰箱終止反應。各綴合物參比樣品在電泳圖中標記為Con。
配製16重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，將冷凍保藏樣品中每一組的全部樣品分別與4μl上樣緩衝液(商購自索萊寶公司，20mM EDTA，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍的水溶液)混合，然後取20μl混合液裝載至前述凝 膠中，在20mA下電泳10分鐘，然後40mA下電泳30分鐘。電泳結束後，凝膠用Gelred染料(BioTium，Cat.13G1203)染色10分鐘後成相，結果如第1A圖所示。
所述對比序列1如下：正義鏈：5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(SEQ ID NO：250)；反義鏈：5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(SEQ ID NO：251)。
按照同樣方法，對綴合物105、109、111和115在6h內的穩定性進行了測量，結果示於第1B圖中。
第1A圖至第1B圖顯示了siRNA綴合物在體外Tritosome中的穩定性半定量檢測結果。結果顯示，本公開的綴合物在Tritosome中可維持長時間不降解，顯示出很好的穩定性。
實驗例2-2 在人血漿中的體外穩定性
將綴合物24、25、42、43、62、78以及對比序列1(分別以siRNA濃度為20μM的0.9wt%氯化鈉水溶液形式提供，每組12μl)分別與108μL 90%人血漿(Human plasma，PBS稀釋)混勻並在37℃恆溫孵育。分別在0、2、4、6、8、24、48、72小時中的每個時間點取出10μL樣本，立即進行液氮速凍於-80℃冰箱中凍存備用。同時，取等莫耳量的各綴合物(2μM，2μl)與8μl 1×PBS混勻獲得10μL未經人血漿處理的樣品(記為Con)。配製20重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，將冷凍保藏樣品中每一組的全部樣品分別與4μL上樣緩衝液(20mM EDTA，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍的水溶液)混合，然後上樣至前述凝膠，在80mA恆流條件下電泳60分鐘。電泳結束後，凝膠用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)染色15分鐘後成相，結果如第2A圖所示。所述對比序列1如下：正義鏈：5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(SEQ ID NO：250)； 反義鏈：5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(SEQ ID NO：251)。
按照同樣方法，對綴合物105、109、111和115在72h內的穩定性進行了測量，結果示於第2B圖中。
由第2A圖和第2B圖顯示了測試的siRNA綴合物在體外人血漿中的穩定性半定量檢測結果。結果顯示，本公開的綴合物在人血漿中最高72h時仍未降解，顯示出優異的在人血漿中的穩定性。
實驗例2-3 在猴血漿中的體外穩定性
將綴合物24、25、42、43、62、78和對比序列2(分別以siRNA濃度為20μM的0.9wt%氯化鈉水溶液形式提供，每組12μl，所述對比序列2為正義鏈和反義鏈分別具有SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81所示序列、但未與任何綴合分子綴合的siRNA)分別與108μL 90%食蟹猴血漿(Monkey plasma，購自鴻泉生物，HQ70082，PBS稀釋)混勻並在37℃恆溫孵育。分別在0、2、4、6、8、24、48、72小時中的每個時間點取出10μL樣本，立即進行液氮速凍於-80℃冰箱中凍存。待各時間點取樣完畢後，各樣品以1×PBS(pH7.4)稀釋5倍後取10μL備用。同時，取等莫耳量的以上各綴合物(2μM，2μl)與8μl 1×PBS混勻獲得10μL未經猴血漿處理的樣品(記為Con)。配製20重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，將上述稀釋過樣品中每一組的全部樣品與4μL上樣緩衝液(20mM EDTA，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍的水溶液)混合，然後上樣至前述凝膠，在80mA恆流條件下電泳60分鐘。電泳結束後，凝膠用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)染色15分鐘後成相，結果如第3A圖所示。
按照同樣方法，對綴合物105、109、111和115以及對比序列2在72h內的穩定性進行了測量，結果示於圖3B中。
第3A圖和第3B圖示出了所測試siRNA在體外猴血漿中的穩定性半定量檢測結果。可以看出，本公開的siRNA綴合物在食蟹獼猴血漿中最高為72h仍未降解，顯示出優異的在猴血漿中的穩定性。
實驗例3 本實驗說明綴合物24和25在大鼠體內的藥代動力學
在本實驗例中，分別向各實驗組的大鼠(每組10隻大鼠，雌雄各半)皮下注射給予綴合物24和綴合物25，單次劑量按照10mg/kg和50mg/kg實施。隨後檢測各時間點的大鼠血漿藥物濃度和肝腎組織藥物濃度。
首先，將SD大鼠採用PRISTIMA 7.2.0版數據系統根據大鼠體重分性別隨機分組，隨後按照設計的劑量分別給予綴合物。所有動物根據體重計算藥量，皮下單次給藥，劑量為10和50mg/kg，以1mg/ml和5mg/ml的0.9%氯化鈉水溶液的形式，體積為10ml/kg。給藥前及給藥後5分鐘(±30秒)、30分鐘(±1分鐘)、1小時(±2分鐘)、2小時(±2分鐘)、6小時(±5分鐘)、24小時(±10分鐘)、48小時(±20分鐘)、72小時(±20分鐘)、120小時(±30分鐘)、168小時(±30分鐘)分別從頸靜脈採集大鼠全血。之後全血樣品於2~8℃在離心力1800×g下離心10分鐘分離血漿，血漿樣品在一管中放置約70μL，剩餘的同一樣品放置於另一管中，二者均在-70~-86℃凍存待檢。分別在給藥後約24、48、72、120、168小時採集大鼠肝腎組織，採集方法包括根據大鼠體重以戊巴比妥鈉麻醉(腹腔注射60mg/kg)，腹主動脈採血使大鼠安樂死，對其進行大體解剖。對各大鼠肝臟、腎臟取樣，並保存在1mL凍存管中，-68℃以下保存至檢測分析。
採用HPLC-FLD(高效液相螢光層析法)定量檢測大鼠血漿及肝腎組織中的綴合物24和25的濃度，具體依據以下步驟： (1)研磨組織至組織塊不大於80mg，隨後加入組織和細胞裂解液(Tissue and Cell Lysis Solution，供應商：Epicentre，貨號：MTC096H)配製成66.7mg/mL的組織勻漿；(2)對組織勻漿進行超聲(150W，30s)以破碎細胞；(3)對於每組組織樣品，取75μL組織樣品加至96孔PCR板，加入5μL蛋白酶K(供應商：Invitrogen，貨號：25530-015)和10μL的10wt%乙腈和0.01wt%吐溫20混合水溶液；對於血漿樣品，取20μL血漿加至96孔PCR板，加入45μL組織和細胞裂解液，5μL蛋白酶K和20μL的10wt%乙腈和0.01wt%吐溫20混合液；(4)封板，置於PCR儀(供應商：Applied Biosystems，型號：GeneAmp® PCR system 9700)中，在65℃下孵育45分鐘；(5)孵育結束後，加入10μL 3M KCl水溶液(供應商：Sigma-aldrich，貨號：60135-250ML)，搖勻，在4℃，3200rcf離心15分鐘；(6)對於每組組織樣品，取80μL上清液加入到120μL雜交混合物中(配方：0.5mL 6μM PNA探針(供應商：杭州泰禾生物科技有限公司)，1mL 200mM的Trizma/pH=8，5mL 8M尿素水溶液，3.5mL H2O，2mL乙腈)；對於每組血漿樣品，取40μL上清液加入到160μL雜交混合液物(配方：0.5mL 6μM PNA探針，1mL 200mM的Trizma/pH=8，5mL 8M尿素水溶液，7.5mL H2O，2mL乙腈)；(7)封板，置於PCR儀中，95℃孵育15分鐘；立即置於冰上5分鐘；(8)將樣品轉移至新的錐形底96孔板，搖勻，以3200rcf離心1分鐘； (9)進樣檢測，使用HPLC-FLD定量分析(液相系統供應商：Thermo Fisher，層析儀型號：ultimate 3000)。
分析結果參見第4圖至第11圖。第4圖至第7圖分別示出了綴合物24在大鼠血漿中PK/TK血漿濃度的經時代謝曲線以及在大鼠肝臟及腎臟中PK/TK組織濃度的經時代謝曲線；第8圖至第11圖則示出了綴合物25在大鼠血漿中PK/TK血漿濃度的經時代謝曲線以及在大鼠肝臟及腎臟中PK/TK組織濃度的經時代謝曲線。具體而言， 第4圖是給藥量為10mg/kg時，綴合物24在大鼠血漿中PK/TK血漿濃度的經時代謝曲線。
第5圖是給藥量為10mg/kg時，綴合物24在大鼠肝臟及腎臟中PK/TK組織濃度的經時代謝曲線。
第6圖是給藥量為50mg/kg時，綴合物24在大鼠血漿中PK/TK血漿濃度的經時代謝曲線。
第7圖是給藥量為50mg/kg時，綴合物24在大鼠肝臟及腎臟中PK/TK組織濃度的經時代謝曲線。
第8圖是給藥量為10mg/kg時，綴合物25在大鼠血漿中PK/TK血漿濃度的經時代謝曲線。
第9圖是給藥量為10mg/kg時，綴合物25在大鼠肝臟及腎臟中PK/TK組織濃度的經時代謝曲線。
第10圖是給藥量為50mg/kg時，綴合物25在大鼠血漿中PK/TK血漿濃度的經時代謝曲線。
第11圖是給藥量為50mg/kg時，綴合物25在大鼠肝臟及腎臟中PK/TK組織濃度的經時代謝曲線。
由第4圖至第11圖的結果可以看出，無論是在低劑量(10mg/kg)還是在相對更高劑量(50mg/kg)下，綴合物24和25在大鼠血漿中的濃度均迅速在數小時內降低至檢測限以下；而在肝臟組織中則均在至少168h維持了較高穩定水平的濃度。這表明，藉由綴合L-9綴合分子，所得到的siRNA綴合物能夠特異性地在肝臟中顯著富集並保持穩定，具有高度的標靶性。
實驗例4 本實驗說明由不同綴合分子形成的綴合物在C57BL/6J小鼠中的靶mRNA抑制效果。
首先，將C57BL/6J小鼠隨機分組(均為雌性)。實驗組分別以綴合物158(5隻小鼠)和對比綴合物14進行編號(5隻小鼠)，和PBS對照組(8隻小鼠)進行編號。所有動物根據體重計算藥量，分別以1mg/kg或0.1mg/kg的不同單次劑量皮下給藥。給藥體積為5ml/kg。為獲得不同劑量，綴合物以0.2mg/ml和0.02mg/ml溶於0.9%氯化鈉水溶液。給藥後72h將動物處死，收集肝臟；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用RNAVzol(VIGOROUS,lot：161G)根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。
採用即時螢光定量PCR檢測肝組織中TTR mRNA的表達水平，具體地：使用Reverse Transcription System(Promega,Lot#0000223677，REF：A3500)按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。接著用螢光定量PCR儀(ABI Step One)檢測siRNA對肝組織中的mTTR mRNA表達的抑制效率。在該檢測方法中，以GAPDH基因作為內參基因，使用針對TTR的引子(primer)和針對GAPDH的引子分別對mTTR和GAPDH進行檢測。
檢測引子的序列參見表4。
Figure 107142925-A0305-02-0184-215
Figure 107142925-A0305-02-0185-216
在該即時PCR法中，mTTR mRNA的表達量用TTR基因表達剩餘量百分比表示，按如下等式計算：TTR基因表達剩餘量=(測試組TTR基因的拷貝數/測試組GAPDH的拷貝數)/(對照組TTR基因的拷貝數/對照組GAPDH的拷貝數)×100%，隨後根據下式計算綴合物對mRNA的抑制率：mRNA抑制率=(1-TTR基因表達剩餘量)×100%，其中，對照組為本實驗中施以PBS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同siRNA綴合物的給藥組小鼠。結果示於表5中。
Figure 107142925-A0305-02-0185-217
根據結果可見，儘管所使用的siRNA序列及修飾均相同，然而綴合物158的靶mRNA抑制率顯著高於對比綴合物14。
在以下實驗例5至實驗例11中，根據siRNA靶位置和序列相關性實驗驗證表3A至3F中siRNA綴合物的性質和效果。
實驗例5 對表3A的siRNA綴合物的效果進行驗證的實驗
實驗例5-1 對綴合物26的脫靶效果進行驗證的實驗
根據Kumico Ui-Tei et.al.,Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution：modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect.Nucleic Acids Research,2008.36(7),2136-2151描述的方法，構建檢測質粒，與被檢測的siRNA綴合物共轉染至HEK293A細胞中，使用雙螢光報告者基因檢測試劑盒，檢測雙螢光報告者基因的表達水平。具體步驟如下：
1，構建檢測質粒
採用psiCHECKTM-2(PromegaTM)質粒構建了4種重組質粒，其中GSCM表示在靶質粒，PSCM、GSSM、PSSM表示脫靶質粒：
(1)GSCM，含有目標序列，該目標序列與被檢測綴合物的反義鏈的所有21個核苷酸序列完全互補；
(2)PSCM，含有目標序列，該目標序列與被檢測綴合物的正義鏈的所有21個核苷酸序列完全互補；
(3)GSSM，含有目標序列，該目標序列與被檢測綴合物的反義鏈5’末端的1-8位核苷酸序列完全互補。被檢測的綴合物中反義鏈的5’末端9-21位的核苷酸序列與其相應的目標序列互補錯配。錯配的規則是，被檢測綴合物的反義鏈5’末端第9-21位的任意位置的G、C、A或U核苷酸，分別在目標序列的對應位置與核苷酸T、A、C或G錯配。
(4)PSSM，含有目標序列，該目標序列與被檢測綴合物的反義鏈的5’末端1-8位核苷酸序列完全互補。被檢測的綴合物中正義鏈的5’末端9-21位的核苷酸序列與其相應的目標序列互補錯配。錯配的規則是，被檢測綴合物的正義鏈5’末端第9-21位的任意位置的G、C、A或U核苷酸，分別在目標序列的對應位置與核苷酸T、A、C或G錯配。
將目標序列嵌入到psiCHECKTM-2質粒的Xho I/Not I位點。
轉染
在96孔板中，根據LipofectamineTM 2000(Invitrogen)的使用說明，共轉染siRNA和上述每一種質粒，每種質粒分別對應11組一定濃度的siRNA。具體地，每孔轉染質粒10ng，每孔使用LipofectamineTM 2000 0.2μL，每孔共轉染的siRNA終濃度為100nM至0.0001nM(4倍系列稀釋物)，每組3個複孔。
3，檢測
共轉染24小時後，將HEK293A細胞使用雙螢光報告者基因檢測試劑盒(Dual luciferase reporter gene assay kit，Promega公司，cat.E2940)，根據使用說明書裂解，以檢測雙螢光報告者基因的表達水平。每一特定濃度的測試組以無綴合物處理為對照(con)。以海腎螢光素酶蛋白水平(Ren)相對於螢火蟲螢光素酶蛋白水平(Fir)進行標準化。藉由採用不同siRNA濃度所測得的活性結果來繪製劑量-效應曲線，使用Graphad5.0軟體的函數log(Inhibitor)與響應-變化斜率用以下公式進行曲線建模：
Figure 107142925-A0305-02-0187-218
式中：Y是殘留mRNA的表達水平，X為轉染siRNA濃度的對數值，Bot是穩態期底部的Y值，Top是穩態期頂部的Y值，LogIC50是當Y在穩態期底部到頂部之間一半時的X值，而HillSlope則是曲線的斜率。
藉由基於劑量效應曲線的計算，確定與GSCM相對應的待測綴合物的IC50值，並與PSCM、GSSM或PSSM進行比較。
對於綴合物24，結果如第12A圖至第12D圖所示，對應於GSCM，綴合物24的IC50值計算為0.0019nM；與PSCM、GSSM或PSSM相比，綴合物24在各siRNA濃度下均無明顯抑制作用，說明本公開的siRNA綴合物在體外具有較高的活性和較低的脫靶效應。
實驗例5-2 本實驗說明表3A中siRNA綴合物在體內對HBV mRNA表達量的抑制效率
在本實驗例中，對綴合物16和24在HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中對HBV mRNA表達量的抑制效率進行了考察。
首先，將C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量隨機分組(均為雌性，每組4隻小鼠)，分別以綴合物16和綴合物24進行編號，並增加生理鹽水(NS)對照組。所有動物根據體重計算藥量，皮下施用1mg/kg的單次劑量，綴合物濃度分別為0.9%氯化鈉水溶液中的0.2mg/ml以及0.02mg/ml，給藥體積為5ml/kg。給藥後第14天將動物處死，收集肝臟，用RNA Later(Sigma Aldrich)保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織。再用Trizol根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。
採用即時螢光定量PCR檢測肝組織中HBV mRNA的表達水平。具體地：使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒(Promega)按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。接著用螢光定量PCR試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)檢測siRNA對肝組織中的HBV mRNA表達的抑制效率。在該螢光定量PCR法中，以β-肌動蛋白(β-actin)基因作為內參基因，使用針對HBV的引子和針對β-肌動蛋白的引子分別對HBV和β-肌動蛋白進行檢測。
檢測引子的序列參見表5A。
Figure 107142925-A0305-02-0188-219
在該螢光定量PCR法中，HBV mRNA的表達量用HBV基因表達剩餘量表示，按如下等式計算： HBV基因表達剩餘量=(測試組HBV基因的拷貝數/測試組β-肌動蛋白的拷貝數)/(對照組HBV基因的拷貝數/對照組β-肌動蛋白的拷貝數)×100%，圖中標識為HBV X/β-肌動蛋白mRNA表達量。
隨後根據下式計算綴合物對mRNA的抑制率：對mRNA的抑制率=(1-HBV基因表達剩餘量)×100%，其中，對照組為本實驗中施以NS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同siRNA綴合物的給藥組小鼠。結果示於第13圖中。
在其它實驗中，根據下面的條件再進行兩次實驗：採用與上述相同的方法，不同之處在於給予的siRNA綴合物更換為綴合物17、25、159和160進行實驗，在第7天收集數據；以及採用與上述相同的方法，不同之處在於給予的siRNA綴合物更換為綴合物24、161、162和163進行實驗，在第28天收集數據，對於每一綴合物，按照1mg/kg和0.3mg/kg兩個劑量給藥(給藥體積保持不變，相應調整綴合物溶液濃度)，結果分別示於第14圖至第15圖中。
由上述結果可見，在測試時間點不同的多次實驗中，全部上述本公開的綴合物均顯示出了高的小鼠體內HBV mRNA表達抑制活性。
實驗例5-3 本實驗說明表3A的具有不同綴合分子的siRNA綴合物在HBV轉基因小鼠中對mRNA的抑制效果
按照實驗例4的方法，在44Bri HBV小鼠中，以表5A的檢測序列作為引子對綴合物25、164、165和166的靶mRNA抑制效率進行了檢測，結果分別示於表6A中：
Figure 107142925-A0305-02-0189-220
Figure 107142925-A0305-02-0190-221
由表6A可見，由本公開的各種綴合分子形成的siRNA綴合物具有優異的小鼠體內靶mRNA抑制效率。
實驗例5-4 本實驗說明表3A的siRNA綴合物在HBV轉基因小鼠血清中對HBsAg和HBV DNA的抑制效率的時間相關性測試
使用AAV-HBV小鼠模型，在動物造模成功後，按血清HBsAg含量隨機分組(每組5隻)，每組分別給予綴合物24、25和對比綴合物15，以及NS用作空白對照。所有動物根據體重計算藥量，皮下單次給藥，給藥劑量為3mg/kg，藥物以0.6mg/ml的0.9wt%氯化鈉水溶液的形式提供，給藥體積為5ml/kg。在給藥前(記為D0)與給藥後第7、14、21、28、56、84、112、140、154、168、182天對小鼠眼眶靜脈叢取血，在各時間點檢測血清HBsAg水平。期間，一旦檢測結果中血清HBsAg含量已經接近或超過初始值，則終止該對象的檢測。
眼眶取血每次約100μl，離心後血清不少於20μl。利用HBsAg CLIA試劑盒(安圖生物，CL0310)檢測血清中HBsAg的表達水平。參照QIAamp 96 DNA Blood Kit說明書提取血清中DNA，進行定量PCR，檢測HBV DNA的表達水平。
標準化的HBsAg的表達水平=(給藥後HBsAg含量/給藥前HBsAg含量)×100%。
HBsAg抑制率=(1-給藥後HBsAg含量/給藥前HBsAg含量)×100%。其中，HBsAg含量用每毫升(ml)血清含多少當量(UI)HBsAg表示。
標準化的HBV DNA的表達=(給藥後HBV DNA含量/給藥前HBV DNA含量)×100%。
HBV DNA抑制率=(1-給藥後HBV DNA含量/給藥前HBV DNA含量)×100%。
其中，HBV DNA含量用每毫升(ml)血清含多少拷貝HBV DNA表示。
結果如第16圖和第17圖所示。由第16圖的結果可以看出，在給藥後不同時間點，NS陰性對照組未顯示出任何抑制作用；與之相比，綴合物24和25在給藥後不同時間點均體現出了優異的HBsAg抑制效果。特別在3mg/kg劑量下，在最長140天期間，綴合物24始終顯示出高的血清中HBsAg的抑制率，說明在較長時間內，綴合物24能夠穩定有效地抑制HBV基因的表達。
由第17圖的結果可以看出，各實施例的siRNA綴合物同樣顯示出高效的HBV DNA表達抑制，並且在最長84天的時間內均保持了較高的抑制率。
相比之下，儘管對比綴合物15在最初的28天內在每個實施例中實現了近似的mRNA抑制效果，然而此後抑制效果明顯下降，從而第16圖和第17圖中所示的其抑制效果的持續時間與相同劑量水平下的綴合物24和25相比明顯較短。
採用與上述相同的方法又進行了四次實驗，對血清HBsAg進行檢測，區別之處在於：採用AAV-HBV低濃度小鼠模型，使用綴合物25，給藥劑量分別為3mg/kg和1mg/kg，對照組給予生理鹽水NS，測試至第140天，結果參見第18圖； 採用M-Tg模型，使用綴合物17和25，給藥劑量分別為3mg/kg和1mg/kg，對照組給予PBS，測試至第70天，結果參見第19圖；採用M-Tg模型，綴合物26的給藥劑量分別為5mg/kg、1mg/kg、0.2mg/kg，對比綴合物15的給藥劑量為5mg/kg，對照組給予PBS，測試至第78天，結果參見第20圖；採用1.28copy模型，使用綴合物24，給藥劑量為3mg/kg和1mg/kg，測試至第210天，結果參見第21圖。
對於上述各種劑量，每種綴合物以相同的劑量體積施用，同時單獨調節綴合物溶液的濃度，以便相應地給藥。
由第18圖至第21圖可以看出，本公開的siRNA綴合物在多種動物模型中均顯示出持久高效的血清HBsAg抑制效率，並呈現出較規律的劑量依賴性。
實驗例6 驗證表3B-3D的siRNA綴合物效果的實驗
實驗例6-1 綴合物43、62和78的脫靶效應測試
按照實驗例5-1描述的方法，分別對綴合物43、62和78的脫靶效應進行了驗證，區別僅在於：對於每個綴合物，利用與相應綴合物中的siRNA反義鏈序列完全互補配對的目標序列構建在靶質粒GSCM，而使用分別與相應綴合物的siRNA反義鏈序列完全相同、與相應綴合物的siRNA反義鏈序列的1-8位互補配對或與相應綴合物的siRNA反義鏈序列的1-8位相同的目標序列構建脫靶質粒GSSM、PSCM和PSSM。結果分別如第22圖至第24圖所示。從第22圖至第24圖的結果可以看出，以上所有的綴合物不僅對靶mRNA有很好的抑制作用，而且脫靶效應也很低。
實驗例6-2 本實驗說明本公開的綴合物在小鼠體內對HBV mRNA表達的抑制效果
在本實驗例中，關於綴合物25、42、43、62和78在HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中對HBV mRNA表達的抑制效率進行了考察。
首先，將C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量隨機分組(均為雌性，每組4隻小鼠)，分別進行編號，並增加NS組作為對照組。所有動物根據體重計算藥量。分別以1mg/kg以及0.1ml/kg的劑量皮下給予綴合物25和綴合物42，以0.2mg/ml以及0.02mg/ml的綴合物的0.9%氯化鈉水溶液的形式給藥，給藥體積為5ml/kg。給藥後第7天將動物處死，收集肝臟，用RNA Later(Sigma Aldrich)保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織。然後用Trizol根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。
採用即時螢光定量PCR檢測肝組織中HBV mRNA的表達水平，具體地：使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒(Promega)按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，接著用螢光定量PCR試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)檢測siRNA對肝組織中的HBV mRNA表達的抑制效率。在該螢光定量PCR法中，以β-肌動蛋白(β-actin)基因作為內參基因，使用針對HBV的引子和針對β-肌動蛋白的引子分別對HBV和β-肌動蛋白進行檢測。
檢測引子的序列參見表5A。
在該螢光定量PCR法中，HBV mRNA的表達量以及綴合物對mRNA的抑制率的計算方法與實驗例5-2相同。
其中，對照組為本實驗中施以NS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同siRNA綴合物的給藥組小鼠。結果示於第25圖中。
在另外的實驗中，按照以下條件再進行兩次實驗： 採用與上述相同的方法，不同之處在於：給予的siRNA綴合物更換為綴合物43、62、78和25進行實驗，在第7天收集檢測數據，結果示於第26圖；以及採用與上述相同的方法，不同之處在於：給予的siRNA綴合物更換為綴合物42、43和25進行實驗，對於綴合物42和25，各自分別以1mg/kg和0.1mg/kg(其中，劑量體積保持不變，綴合物溶液濃度分別進行調整)的劑量給藥，且用於檢測的引子序列更換為表5B所示的序列，結果示於第27圖：
Figure 107142925-A0305-02-0194-222
由第26圖和第27圖可見，全部上述本公開的綴合物對於小鼠體內HBV mRNA表達均具有高抑制活性。另外對於不同HBV mRNA的抑制效果基本一致。
實驗例6-3 本實驗說明表3B的siRNA綴合物在HBV轉基因小鼠血清中對HBsAg表達和HBV DNA的抑制效率的時間相關性測試
使用AAV-HBV低濃度模型小鼠。成功建立動物模型之後，按血清HBsAg含量隨機分組(每組5隻小鼠)。每組分別給予綴合物43，PBS用作空白對照。所有動物根據體重計算藥量。皮下單次給藥，給藥劑量為3mg/kg或1mg/kg兩個組別，使用濃度分別為0.6mg/ml或0.2mg/ml的綴合物的0.9%氯化鈉水溶液，給藥體積為5ml/kg。在給藥前與給藥後第7、14、21、28、56、84、112、126和140天對小鼠眼眶靜脈叢取血，在各時間點檢測血清HBsAg水平。
眼眶取血每次約100μl，離心後血清不少於20μl。利用HBsAg CLIA試劑盒(安圖生物，CL0310)檢測血清中HBsAg的含量。
標準化的HBsAg的表達=(給藥後HBsAg含量/給藥前HBsAg含量)×100%。
HBsAg抑制率=(1-給藥後HBsAg含量/給藥前HBsAg含量)×100%。其中，HBsAg含量用每毫升(ml)血清含多少當量(UI)HBsAg表示。
結果如第28圖所示。由第28圖的結果可以看出，在給藥後不同時間點，NS陰性對照組未顯示出抑制作用；與之相比，綴合物43在給藥後不同時間點均體現出了優異的HBsAg抑制效果，在最長達100天的時間內持續顯示出高的血清HBsAg抑制率，表明其能夠在較長時間內穩定高效地抑制HBV基因的表達。
在進一步的實驗中，按照上述方法，在M-Tg模型小鼠中，綴合物24、62和78，分別按3mg/kg和1mg/kg劑量給藥，使用濃度為0.6mg/ml或0.2mg/ml的綴合物的0.9wt%氯化鈉水溶液，給藥體積為5ml/kg。測試持續至第85天，結果示於第29圖和第30圖。
由第29圖的結果可以看出，綴合物24、62和78均最長85天內顯示出延長且有效的血清HBsAg抑制效果；由第30圖可知，在給藥後第85天，3mg/kg劑量組的綴合物24和78分別顯示出68.6%和62%的HBV mRNA抑制率。
在進一步的實驗中，按照上述方法，在1.28copy模型小鼠中，分別按3mg/kg和1mg/kg劑量施用綴合物43，使用濃度分別為0.6mg/ml或0.2mg/ml的綴合物的0.9%氯化鈉水溶液，給藥體積為5ml/kg，測試持續至第85天。按照實驗例5-4的方法對HBsAg和HBV DNA的抑制效果進行檢測，結果示於第31圖和第32圖。
由第31圖和第32圖的結果可知，在1.28copy小鼠中，本公開的綴合物43在最長85天的時間內持續顯示出對HBV表達以及HBV DNA的高效抑制。
實驗例7 驗證綴合物167和168效果的實驗
實驗例7-1 本實驗說明本公開的siRNA綴合物在體外具有較高活性的同時，還具有低脫靶效應。
本實驗例考察了綴合物168在體外psiCHECK系統中的在靶活性(on-target activity)及脫靶效應。具體來說，測定了綴合物168標靶完全匹配目標序列(其核苷酸序列與綴合物168的反義鏈的全長核苷酸序列完全互補或一致)或標靶種子區域匹配目標序列(其核苷酸序列與綴合物168的反義鏈的1-8位核苷酸序列互補或一致)的活性。
按照實驗例5-1的方法，對綴合物168進行了驗證，區別僅在於，使用完全與綴合物168中的siRNA反義鏈的序列互補的目標序列以構建在靶質粒GSCM，而使用與綴合物168中siRNA的反義鏈序列完全相同的目標序列、與綴合物168中siRNA的反義鏈序列的1-8位互補配對的目標序列或與綴合物168中siRNA的反義鏈序列的1-8位相同的目標序列分別構建脫靶質粒GSSM、PSCM和PSSM。從實驗結果可以看出，以上所有的綴合物不僅對靶mRNA有很好的抑制作用(IC50=0.0513nM)，還顯示出低的脫靶效應。
實驗例7-2 本實驗說明本公開的siRNA綴合物在溶酶體裂解液中的體外穩定性
將製備例1中得到的綴合物167和對比序列1(以siRNA濃度計算，分別為20μM的0.9wt%氯化鈉水溶液，每組6μl，將對比序列1標記為NC)分別與27.2μL檸檬酸鈉水溶液(pH5.0)、4.08μL去離子水和2.72μL鼠源溶酶體裂解液(商購自Xenotech Inc.，貨號R0610LT，終濃度為0.2mU/μL)混勻並 在37℃恆溫孵育。分別在0、1、2、4、6、24小時中的每個時間點取出5μl樣本，分別加入到15μL 9M的尿素水溶液中變性，立即於-80℃冰箱中凍存備用。0小時表示將siRNA綴合物與溶酶體裂解液混勻後，立即取出測試的時刻。平行地，對於綴合物167和對比序列1，分別取等莫耳量的siRNA(20μM，1.5μl)，與7.5μL檸檬酸鈉水溶液(pH 5.0)和1μL去離子水混勻，再加入到30μl 9M的尿素水溶液中變性，接著和8μL的6x上樣緩衝液(20mM EDTA水溶液，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍)混勻，並立即於-80℃冰箱中凍存淬滅反應。由此制得未經溶酶體裂解液處理的待測樣品(在電泳圖中標記為M)。配製16重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠。將20μL每個用於測試的樣品上樣到凝膠，在80mA恆流條件下電泳60分鐘。電泳結束後，凝膠用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)染色15分鐘後成相，結果如第33圖所示。
採用相同的方法測定綴合物167和對比序列1(第34圖中標記為NC)中鼠源溶酶體裂解液的穩定性，除了用鼠源裂解液代替人源溶酶體裂解液(Rat Liver Tritosomes，商購自Xenotech Inc.，貨號R0610.LT，終濃度為0.2mU/μL)，結果如第34圖所示。
由第33圖和第34圖表明，本公開的綴合物無論在人源溶酶體裂解液還是在鼠源溶酶體裂解液中，都表現出令人滿意的穩定性，至少能夠維持24小時不降解。
實驗例7-3 本實驗說明本公開的綴合物在小鼠體內對HBV mRNA表達的抑制效率
本實驗例考察了綴合物167和綴合物168的siRNA綴合物在HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中對HBV mRNA表達的抑制效率。
首先，將C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HBsAg含量隨機分組(均為雌性，每組5隻小鼠)，分別給予PBS和綴合物167、綴合物 168。其中，PBS組，每隻動物皮下施用5ml/kg的1×PBS；對於綴合物167或綴合物168，單次皮下給藥，各自的給藥劑量為1mg/kg，綴合物以0.2mg/ml濃度的0.9%氯化鈉水溶液提供，給藥體積為5ml/kg。給藥後第28天將所有動物處死。收集肝臟，用RNA Later(Sigma Aldrich)保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。
採用即時螢光定量PCR檢測肝組織中HBV mRNA的表達水平，具體地：使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒(Promega)按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，接著用螢光定量PCR試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)檢測siRNA對肝組織中的HBV mRNA表達的抑制效率。在該螢光定量PCR法中，以β-肌動蛋白(β-actin)基因作為內參基因，使用針對HBV的引子和針對β-肌動蛋白的引子分別對HBV和β-肌動蛋白進行檢測。
檢測引子的序列參見表5G。
Figure 107142925-A0305-02-0198-223
在該螢光定量PCR法中，HBV mRNA的表達量以及綴合物對mRNA的抑制率的計算方法與實驗例5-2相同。結果示於以下表6G中。
在其他實驗中，採用與上述相同的方法，所不同的是以綴合物167和168替換用於檢測的給予的siRNA綴合物，並且給藥劑量改變，結果示於以下表6G中。
Figure 107142925-A0305-02-0198-224
由上述結果可見，本公開全部綴合物均顯示出了高的小鼠體內HBV mRNA表達抑制活性。這也說明本公開的siRNA綴合物具有良好的體內遞送效率。
實驗例7-4 本實驗說明表3B中的siRNA綴合物在HBV轉基因小鼠血清中對HBsAg和HBV DNA表達量的抑制效率的時間相關性測試
在1.28copy模型中，將這些小鼠隨機分組(每組6隻小鼠，雌雄各半)。各組分別給予生理鹽水和不同劑量的綴合物168。生理鹽水組皮下注射5ml/kg的生理鹽水。對於綴合物組，所有動物根據體重計算藥量。皮下單次給藥，給藥劑量分別為3mg/kg或1mg/kg，綴合物分別以0.6mg/ml或0.2mg/ml的0.9wt%氯化鈉水溶液提供，給藥體積為5ml/kg。在給藥前與給藥後第7、13、21、28、42、56、70、84、98、112、126、140和154天對小鼠眼眶靜脈叢取血，在各時間點檢測血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平。
眼眶取血每次約100μl，離心後血清不少於20μl。利用HBsAg CLIA試劑盒(安圖生物，CL0310)檢測血清中HBsAg的含量；利用HBeAg CLIA試劑盒(安圖生物，CL0310)檢測血清中HBeAg的含量；參照QIAamp 96 DNA Blood Kit說明書提取血清中DNA，進行定量PCR，檢測HBV DNA的表達水平。
標準化的HBsAg的表達=(給藥後HBsAg含量/給藥前HBsAg含量)×100%。
HBsAg抑制率=(1-給藥後HBsAg含量/給藥前HBsAg含量)×100%。其中，HBsAg含量用每毫升(ml)血清含多少當量(UI)HBsAg表示。
標準化的HBeAg的表達=(給藥後HBeAg含量/給藥前HBeAg含量)×100%。
HBeAg抑制率=(1-給藥後HBeAg含量/給藥前HBeAg含量)×100%。其中，HBeAg含量用每毫升(ml)血清含多少當量(UI)HBeAg表示。
標準化的HBV DNA的表達=(給藥後HBV DNA含量/給藥前HBV DNA含量)×100%。
HBV DNA抑制率=(1-給藥後HBV DNA含量/給藥前HBV DNA含量)×100%。
其中，HBV DNA含量用每毫升(ml)血清含多少HBV DNA拷貝表示。
結果如第35圖至第37圖所示。由第35圖可以看出，在給藥後不同時間點，施以生理鹽水的陰性對照組未顯示出抑制作用；與之相比，綴合物168在給藥後不同時間點對HBsAg均體現出了優異的HBsAg抑制效果。特別是3mg/kg組在最長達100天的時間內始終顯示出90%以上的血清HBsAg抑制率，表明其能夠在較長時間內穩定高效地抑制HBV基因的表達。
由第36圖可以看出，siRNA綴合物同樣可以抑制HBeAg的表達，其中3mg/kg劑量組在最長達70天內，對血清HBeAg的表達抑制率始終在50%以上。
由第37圖的結果可以看出，siRNA綴合物還可以高效抑制HBV DNA的表達，在最長達154天的時間內始終保持了較高的抑制率。
實驗例8 驗證表3E的siRNA綴合物效果的實驗
實驗例8-1 本實驗說明表3E的siRNA綴合物在體內對ANGPTL3 mRNA表達量的抑制效率的影響
在本實驗例中，考察綴合物105、109、111和115對於正常BALB/c小鼠肝臟組織中ANGPTL3 mRNA的抑制率。
將正常BALB/c小鼠(6-8周齡，購於北京維通利華實驗動物技術有限公司)隨機分組(每組5隻)，分別向每組小鼠給予綴合物105、109、111和115以及PBS。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，siRNA綴合物給藥劑量(以siRNA的量計)為3mg/kg和0.3mg/kg，綴合物分別以0.3mg/ml和0.03mg/ml濃度的0.9wt%氯化鈉水溶液提供，給藥給藥體積為10mL/kg。給藥後14天和第28天各自處死一批小鼠，收集肝臟，用RNA Later(Sigma Aldrich)保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol(Thermo Fisher公司)根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。
採用即時螢光定量PCR檢測肝組織中ANGPTL3 mRNA的表達水平，具體地：使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒(Promega)按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，接著用螢光定量PCR試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)檢測siRNA對肝組織中的ANGPTL3 mRNA表達的抑制效率。在該螢光定量PCR法中，以GAPDH基因作為內參基因，使用針對ANGPTL3的引子和GAPDH的引子分別對ANGPTL3和GAPDH進行檢測。
檢測引子的序列參見表5E。
Figure 107142925-A0305-02-0201-225
ANGPTL3 mRNA的表達量按如下等式計算：ANGPTL3 mRNA表達量=(測試組ANGPTL3 mRNA的表達量/測試組GAPDH mRNA的表達量)/(對照組ANGPTL3 mRNA的表達量/對照組GAPDH mRNA的表達量)×100%。
綴合物對ANGPTL3 mRNA表達量的抑制率按如下等式計算：ANGPTL3 mRNA表達量抑制率=[1-(測試組ANGPTL3 mRNA的表達量/測試組GAPDH mRNA的表達量)/(對照組ANGPTL3 mRNA的表達量/對照組GAPDH mRNA的表達量)]×100%。對照組為本實驗中施以PBS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同siRNA綴合物的給藥組小鼠。結果示於第38A圖和第38B圖中。
第38A圖和第38B圖的結果表明，上述siRNA綴合物均顯示出優異的ANGPTL3 mRNA表達抑制活性。
將上述實驗對象眼眶採集的血液(約100μl)進行離心得到血清，進一步使用PM1P000/3全自動血清生化儀(SABA，意大利)檢測血清中總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)的含量，血脂結果進行標準化處理，血脂水平的抑制率按如下等式計算：抑制率=(1-給藥後測試組血脂含量/給藥前測試組血脂含量)×100%。血脂指總膽固醇或三酸甘油酯。檢測結果示於第39A圖和第39B圖中。
由第39A圖和第39B圖的結果可見，經不同劑量下的綴合物105、109、111和115治療後的小鼠血清中的CHO和TG的含量明顯下降，並且至少在給藥後28天時仍觀察到血脂水平降低。
實驗例8-2 本公開的siRNA綴合物對血脂的影響
對於Tg(APOC3)3707Bres模型小鼠，將其按照TG含量>2mmol/L進行隨機分組(每組5隻小鼠)，給予綴合物115，以及PBS空白對照。所有動物根據體重計算藥量，皮下單次給藥，給藥劑量為3mg/kg或1mg/kg，綴合物分別以0.6mg/ml和0.2mg/ml濃度的0.9%氯化鈉水溶液提供，給藥體積為5ml/kg。在給藥前與給藥後第7、14、21、28、35、56、70、84、98、112、126、140、154和168天對小鼠眼眶取血，檢測血清CHO和TG水平。
眼眶取血每次約0.1ml，離心後血清不少於20μl。使用PM1P000/3全自動血清生化儀(SABA，意大利)檢測血清中總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)的含量。
血脂結果進行標準化處理，標準化的血脂水平=(給藥後測試組血脂含量/給藥前測試組血脂含量)。
血脂水平的抑制率=(1-給藥後測試組血脂含量/給藥前測試組血脂含量)×100%。
結果如第40A圖和第40B圖所示。
由第40A圖和第40B圖可以看出，在給藥後不同時間點，在最長達168天的時間，綴合物115有明顯地降TG和CHO效果；表明其能夠在長時間內穩定高效地抑制小鼠體內ANGPTL3基因的表達。
在另外的實驗中，採用與上述相同的方法，區別在於：採用ob/ob模型小鼠，單獨給予綴合物111、綴合物115和對比綴合物16，每一綴合物按照3mg/kg和1mg/kg分別給藥；在給藥後第0、7、14、21、28、35和41天採集數據。其結果示於第41A圖至第41B圖中。
由第41A圖至第41B圖的結果可見，本公開的綴合物111和115能夠在41天的時間內持續降低ob/ob小鼠體內的血脂水平，顯示出優異的抑制活性。
在另外的實驗中，採用與上述相同的實驗方法，區別在於：單獨給予綴合物111和對比綴合物16，每一綴合物按照3mg/kg和1mg/kg分別給藥，綴合物分別以0.6mg/ml和0.2mg/ml濃度的0.9wt%氯化鈉水溶液提供，給藥體積5ml/kg；在給藥後第0、7、14、21、28、35、42、56和70天檢測CHO值和TG值。其結果示於第42A圖至第42D圖中。
由第42A圖至第42D圖可見，本公開的綴合物111能夠在70天內持續降低血脂，且優於同等劑量下的對比綴合物16。
實驗例8-3 本實驗說明表3A中具有不同綴合分子的siRNA綴合物對ANGPTL3 mRNA表達的抑制效率以及對非人類靈長類動物血脂的影響
對於患有代謝症候群的猴(全部為雄性)，將12隻進行分組，8隻為給予綴合物169的實驗組，4隻為給予綴合物25的對照組；對猴子的基礎數據進行測定和觀察，時間為3周，每週取血一次，檢測血脂水平(TG、CHO、HDL)。隨後，給予綴合物169和綴合物25(作為對比綴合物，因為其siRNA標靶完全不相關的mRNA)，所有動物按照體重計算藥物劑量。單次皮下注射，劑量為9mg/kg(按siRNA數量計)，以100mg/ml的0.9wt%NaCl水溶液形式給藥，每個給藥部位的劑量體積不超過2ml。在給藥前與給藥後第7、14、21、28、35天取血，在各時間點檢測血清TG和CHO水平。
血脂結果進行標準化處理，標準化的血脂水平=(給藥後測試組血脂含量/給藥前測試組血脂含量)。
血脂水平的抑制率=(1-給藥後測試組血脂含量/給藥前測試組血脂含量)×100%。
給藥前測試組血脂含量：給藥前3周的血脂含量均值。第43A圖和第43B圖中標記為D0。
在第0天(給藥當天)和第28天進行肝臟穿刺活檢檢測肝臟組織ANGPTL3 mRNA表達水平。收集肝臟，用RNA Later(Sigma Aldrich)保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol(Thermo Fisher公司)根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。
採用即時螢光定量PCR檢測肝組織中ANGPTL3 mRNA的表達水平。具體地：使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒(Promega公司)按其說明書將提 取的總RNA逆轉錄為cDNA，接著用螢光定量PCR試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)檢測siRNA對肝組織中的ANGPTL3 mRNA表達的抑制效率。在該螢光定量PCR法中，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因作為內參基因，使用針對ANGPTL3的引子和針對GAPDH的引子分別對ANGPTL3和GAPDH進行檢測。
檢測引子的序列參見表6E。
Figure 107142925-A0305-02-0205-226
ANGPTL3 mRNA的表達量以及對ANGPTL3 mRNA的抑制率計算與實驗例8-1相同。對照組為本實驗中施以PBS的對照組猴，測試組為分別施以不同siRNA綴合物的給藥組猴。結果如第43A圖至第43C圖所示。
由第43A圖至第43C圖可以看出，綴合物169顯示出明顯的降低TG效果以及ANGPTL3基因的表達抑制，在給藥後第28天降低了82.7%的ANGPTL3基因mRNA。
實驗例9 表3F的siRNA綴合物效果的實驗
實驗例9-1 本實驗說明表3F的siRNA綴合物在體內對APOC3 mRNA表達的抑制效率
在本實驗例中，考察綴合物144在人APOC3轉基因小鼠(B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，購於Jackson Lab)體內對肝臟組織中APOC3表達水平的抑制率。
將人APOC3轉基因小鼠(6-8周齡，甘油三酸酯>2mmol/L)隨機分組，每組5隻小鼠，分別向每組小鼠給予綴合物144和綴合物25(作為對 比綴合物，因為其siRNA標靶完全不相關的mRNA)。所有動物根據體重計算藥量，皮下單次給藥，siRNA綴合物給藥劑量(以siRNA的量計)分別為1mg/kg和0.1mg/kg，綴合物分別以0.2mg/ml和0.02mg/ml濃度的0.9wt%氯化鈉水溶液提供，給藥體積為5mL/kg。給藥後14天處死小鼠，收集肝臟，用RNA Later(Sigma Aldrich)保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol(Thermo Fisher公司)根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。
採用即時螢光定量PCR檢測肝組織中APOC3 mRNA的表達水平。具體地：使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒(Promega)按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，接著用螢光定量PCR試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)檢測siRNA對肝組織中的APOC3 mRNA表達的抑制效率。在該螢光定量PCR法中，以β-肌動蛋白(β-actin)基因作為內參基因，使用針對APOC3的引子和針對β-肌動蛋白的引子分別對APOC3和β-肌動蛋白進行檢測。
檢測引子的序列參見表7F。
Figure 107142925-A0305-02-0206-227
APOC3 mRNA表達量按如下等式計算：APOC3 mRNA表達量=(測試組APOC3 mRNA的表達量/測試組β-肌動蛋白mRNA的表達量)/(對照組APOC3 mRNA的表達量/對照組β-肌動蛋白mRNA的表達量)×100%。
綴合物對APOC3 mRNA表達量的抑制率藉由下式計算：抑制率=[1-(測試組APOC3 mRNA的表達量/測試組β-肌動蛋白mRNA的表達量)/(對照組APOC3 mRNA的表達量/對照組β-肌動蛋白mRNA的表達量)]×100%。其中， 對照組為本實驗中施以PBS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同siRNA綴合物的給藥組小鼠。結果示於第44A圖中。
第44A圖的結果顯示，綴合物144對轉基因鼠中的人APOC3基因顯示出顯著的體內抑制活性。
實驗例9-2 本實驗說明實施例144的siRNA綴合物在體內對血脂含量的影響
在本實驗例中，考察實施例144的siRNA綴合物在人APOC3轉基因小鼠(B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，購於Jackson Lab)體內對血清中總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)含量的影響。
將人APOC3轉基因小鼠(6-8周齡，TG含量>2mmol/L)進行隨機分組(每組7隻小鼠)：(1)NS控制組；(2)綴合物144 3mg/kg組；(3)綴合物144 1mg/kg組。所有動物根據體重計算藥量，皮下單次給藥，siRNA綴合物分別以0.6mg/ml和0.2mg/ml濃度的0.9wt%氯化鈉水溶液提供，給藥體積為5mL/kg。
分別於給藥前(記為第0天)，及給藥後第7、14、21、28、35、42、49、63、77、91、112、133、147、154、161、175和189天進行眼眶採血(約100μL)，離心得到血清。進一步使用PM1P000/3全自動血清生化儀(SABA，意大利)檢測血清中總膽固醇(CHO)和三酸甘油酯(TG)的含量，血脂結果進行標準化處理，標準化的血脂水平和血脂水平的抑制率的計算方法與實驗例8-3相同。檢測結果示於第44B圖和第44C圖中。
由第44B圖和第44C圖可以看出，在最長189天，實施例的siRNA綴合物有明顯地下調TG和CHO效果，表明其能夠在長時間內穩定高效地抑制人APOC3基因的表達。
在另外的實驗中，使用與以上相同的方法，區別在於，給予綴合物170；以0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg分別給藥(給藥體積不變，相應調整綴合物溶液濃度)；在給藥後第112天採集數據。結果示於第45A圖和第45B圖中。
由第45A圖和第45B圖的結果可知，綴合物170能夠在最長達112天的時間內持續降低轉基因小鼠體內的血脂和ANGPTL3 mRNA水平，並且該降低效果顯示出明顯的劑量依賴效應。
在另外的實驗中，採用與上述相同的方法對小鼠血清總膽固醇(CHO)和總血脂(TG)進行測量，區別在於：給予綴合物144、170和171以及對比綴合物17，每一綴合物按1mg/kg和3mg/kg給藥(給藥體積不變，相應調整綴合物溶液濃度)。在給藥後第112天採集數據。結果參見第46A圖至第46D圖。
由第46A圖至第46D圖的結果可知，在最長達112天的時間內，綴合物144、170和171均顯示出對轉基因小鼠中血脂的持續降低作用，其持續降低效果總體上優於對比綴合物17。
以上詳細描述了本公開的具體實施方式，但是，本公開並不限於上述實施方式中的具體細節，在本公開的技術構思範圍內，可以對本公開的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬本公開的保護範圍。
需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以藉由任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本公開不再描述各種可能的組合方式。
此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以任意組合來實施，只要其不違背本公開的思想，其同樣應當視為本公開所公開的內容。
<110> 蘇州瑞博生物技術有限公司
<120> 化合物、綴合物及其用途
<130> EP1F182408ZX/CNSZRB/GG-TW
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> siHBa1M2反義鏈
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa2M2正義鏈
<400> 11
Figure 107142925-A0305-02-0217-238
<210> 12
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa2M2反義鏈
<400> 12
Figure 107142925-A0305-02-0218-240
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa1M1S正義鏈
<400> 13
Figure 107142925-A0305-02-0218-239
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa1M1S反義鏈
<400> 14
Figure 107142925-A0305-02-0219-241
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa1M2S正義鏈
<400> 15
Figure 107142925-A0305-02-0220-243
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa1M2S反義鏈
<400> 16
Figure 107142925-A0305-02-0220-242
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa2M1S正義鏈
<400> 17
Figure 107142925-A0305-02-0221-244
<210> 18
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa2M1S反義鏈
<400> 18
Figure 107142925-A0305-02-0222-246
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa2M2S正義鏈
<400> 19
Figure 107142925-A0305-02-0222-245
<210> 20
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa2M2S反義鏈
<400> 20
Figure 107142925-A0305-02-0223-247
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa1M1P1反義鏈
<400> 21
Figure 107142925-A0305-02-0224-248
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa1M2P1反義鏈
<400> 22
Figure 107142925-A0305-02-0224-249
<210> 23
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa2M1P1反義鏈
<400> 23
Figure 107142925-A0305-02-0225-251
<210> 24
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa2M2P1反義鏈
<400> 24
Figure 107142925-A0305-02-0225-250
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa1M1SP1反義鏈
<400> 25
Figure 107142925-A0305-02-0226-252
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa1M2SP1反義鏈
<400> 26
Figure 107142925-A0305-02-0227-253
<210> 27
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa2M1SP1反義鏈
<400> 27
Figure 107142925-A0305-02-0227-254
<210> 28
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBa2M2SP1反義鏈
<400> 28
Figure 107142925-A0305-02-0228-255
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1正義鏈
<400> 29
Figure 107142925-A0305-02-0229-256
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1反義鏈
<400> 30
Figure 107142925-A0305-02-0229-257
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb2反義鏈
<400> 31
Figure 107142925-A0305-02-0230-259
<210> 32
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M1正義鏈
<400> 32
Figure 107142925-A0305-02-0230-258
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M1反義鏈
<400> 33
Figure 107142925-A0305-02-0231-260
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb2M1反義鏈
<400> 34
Figure 107142925-A0305-02-0232-262
<210> 35
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M2正義鏈
<400> 35
Figure 107142925-A0305-02-0232-261
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M2反義鏈
<400> 36
Figure 107142925-A0305-02-0233-263
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb2M2反義鏈
<400> 37
Figure 107142925-A0305-02-0234-264
<210> 38
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M1S正義鏈
<400> 38
Figure 107142925-A0305-02-0234-265
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M1S反義鏈
<400> 39
Figure 107142925-A0305-02-0235-266
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb2M1S反義鏈
<400> 40
Figure 107142925-A0305-02-0236-267
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M2S正義鏈
<400> 41
Figure 107142925-A0305-02-0236-268
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M2S反義鏈
<400> 42
Figure 107142925-A0305-02-0237-269
<210> 43
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb2M2S反義鏈
<400> 43
Figure 107142925-A0305-02-0237-270
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M1P1反義鏈
<400> 44
Figure 107142925-A0305-02-0238-271
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb2M1P1反義鏈
<400> 45
Figure 107142925-A0305-02-0239-272
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M2P1反義鏈
<400> 46
Figure 107142925-A0305-02-0239-273
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb2M2P1反義鏈
<400> 47
Figure 107142925-A0305-02-0240-274
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M1SP1反義鏈
<400> 48
Figure 107142925-A0305-02-0241-275
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb2M1SP1反義鏈
<400> 49
Figure 107142925-A0305-02-0241-276
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb1M2SP1反義鏈
<400> 50
Figure 107142925-A0305-02-0242-278
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBb2M2SP1反義鏈
<400> 51
Figure 107142925-A0305-02-0242-277
<210> 52
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1正義鏈
<400> 52
Figure 107142925-A0305-02-0243-279
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1反義鏈
<400> 53
Figure 107142925-A0305-02-0244-281
<210> 54
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M1正義鏈
<400> 54
Figure 107142925-A0305-02-0244-280
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M1反義鏈
<400> 55
Figure 107142925-A0305-02-0245-282
<210> 56
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M2正義鏈
<400> 56
Figure 107142925-A0305-02-0246-283
<210> 57
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M2反義鏈
<400> 57
Figure 107142925-A0305-02-0246-284
<210> 58
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M1S正義鏈
<400> 58
Figure 107142925-A0305-02-0247-285
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M1S反義鏈
<400> 59
Figure 107142925-A0305-02-0248-286
<210> 60
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M2S正義鏈
<400> 60
Figure 107142925-A0305-02-0248-287
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M2S反義鏈
<400> 61
Figure 107142925-A0305-02-0249-289
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M1P1反義鏈
<400> 62
Figure 107142925-A0305-02-0249-288
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M2P1反義鏈
<400> 63
Figure 107142925-A0305-02-0250-290
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M1SP1反義鏈
<400> 64
Figure 107142925-A0305-02-0251-292
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBc1M2SP1反義鏈
<400> 65
Figure 107142925-A0305-02-0251-291
<210> 66
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1正義鏈
<400> 66
Figure 107142925-A0305-02-0252-293
<210> 67
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1反義鏈
<400> 67
Figure 107142925-A0305-02-0253-295
<210> 68
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M1正義鏈
<400> 68
Figure 107142925-A0305-02-0253-294
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M1反義鏈
<400> 69
Figure 107142925-A0305-02-0254-296
<210> 70
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M2正義鏈
<400> 70
Figure 107142925-A0305-02-0254-297
<210> 71
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M2反義鏈
<400> 71
Figure 107142925-A0305-02-0255-298
<210> 72
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M1S正義鏈
<400> 72
Figure 107142925-A0305-02-0256-300
<210> 73
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M1S反義鏈
<400> 73
Figure 107142925-A0305-02-0256-299
<210> 74
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M2S正義鏈
<400> 74
Figure 107142925-A0305-02-0257-301
<210> 75
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M2S反義鏈
<400> 75
Figure 107142925-A0305-02-0258-303
<210> 76
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M1P1反義鏈
<400> 76
Figure 107142925-A0305-02-0258-302
<210> 77
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M2P1反義鏈
<400> 77
Figure 107142925-A0305-02-0259-304
<210> 78
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M1SP1反義鏈
<400> 78
Figure 107142925-A0305-02-0260-305
<210> 79
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siHBd1M2SP1反義鏈
<400> 79
Figure 107142925-A0305-02-0260-306
<210> 80
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1正義鏈
<400> 80
Figure 107142925-A0305-02-0261-307
<210> 81
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1反義鏈
<400> 81
Figure 107142925-A0305-02-0261-308
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2正義鏈
<400> 82
Figure 107142925-A0305-02-0262-309
<210> 83
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2反義鏈
<400> 83
Figure 107142925-A0305-02-0263-310
<210> 84
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M1正義鏈
<400> 84
Figure 107142925-A0305-02-0263-311
<210> 85
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M1反義鏈
<400> 85
Figure 107142925-A0305-02-0264-312
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M1正義鏈
<400> 86
Figure 107142925-A0305-02-0265-314
<210> 87
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M1反義鏈
<400> 87
Figure 107142925-A0305-02-0265-313
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M2反義鏈
<400> 88
Figure 107142925-A0305-02-0266-315
<210> 89
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M2反義鏈
<400> 89
Figure 107142925-A0305-02-0266-316
<210> 90
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M3正義鏈
<400> 90
Figure 107142925-A0305-02-0267-317
<210> 91
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M3正義鏈
<400> 91
Figure 107142925-A0305-02-0268-318
<210> 92
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M1S正義鏈
<400> 92
Figure 107142925-A0305-02-0268-319
<210> 93
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M1S反義鏈
<400> 93
Figure 107142925-A0305-02-0269-320
<210> 94
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M1S正義鏈
<400> 94
Figure 107142925-A0305-02-0270-321
<210> 95
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M1S反義鏈
<400> 95
Figure 107142925-A0305-02-0270-322
<210> 96
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M2S反義鏈
<400> 96
Figure 107142925-A0305-02-0271-323
<210> 97
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M2S反義鏈
<400> 97
Figure 107142925-A0305-02-0272-324
<210> 98
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M3S正義鏈
<400> 98
Figure 107142925-A0305-02-0272-325
<210> 99
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M3S正義鏈
<400> 99
Figure 107142925-A0305-02-0273-327
<210> 100
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M1P1反義鏈
<400> 100
Figure 107142925-A0305-02-0273-326
<210> 101
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M1P1反義鏈
<400> 101
Figure 107142925-A0305-02-0274-328
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M2P1反義鏈
<400> 102
Figure 107142925-A0305-02-0275-329
<210> 103
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M2P1反義鏈
<400> 103
Figure 107142925-A0305-02-0275-330
<210> 104
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M1SP1反義鏈
<400> 104
Figure 107142925-A0305-02-0276-331
<210> 105
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M1SP1反義鏈
<400> 105
Figure 107142925-A0305-02-0277-332
<210> 106
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN1M3SP1反義鏈
<400> 106
Figure 107142925-A0305-02-0277-333
<210> 107
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAN2M3SP1反義鏈
<400> 107
Figure 107142925-A0305-02-0278-335
<210> 108
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1正義鏈
<400> 108
Figure 107142925-A0305-02-0278-334
<210> 109
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1反義鏈
<400> 109
Figure 107142925-A0305-02-0279-336
<210> 110
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2正義鏈
<400> 110
Figure 107142925-A0305-02-0280-339
<210> 111
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2反義鏈
<400> 111
Figure 107142925-A0305-02-0280-337
<210> 112
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M1正義鏈
<400> 112
Figure 107142925-A0305-02-0281-340
<210> 113
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M1反義鏈
<400> 113
Figure 107142925-A0305-02-0282-341
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M1正義鏈
<400> 114
Figure 107142925-A0305-02-0282-342
<210> 115
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M1反義鏈
<400> 115
Figure 107142925-A0305-02-0283-343
<210> 116
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M2正義鏈
<400> 116
Figure 107142925-A0305-02-0284-344
<210> 117
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M2反義鏈
<400> 117
Figure 107142925-A0305-02-0284-345
<210> 118
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M2正義鏈
<400> 118
Figure 107142925-A0305-02-0285-347
<210> 119
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M2反義鏈
<400> 119
Figure 107142925-A0305-02-0285-346
<210> 120
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M1S正義鏈
<400> 120
Figure 107142925-A0305-02-0286-348
<210> 121
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M1S反義鏈
<400> 121
Figure 107142925-A0305-02-0287-350
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M1S正義鏈
<400> 122
Figure 107142925-A0305-02-0287-349
<210> 123
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M1S反義鏈
<400> 123
Figure 107142925-A0305-02-0288-351
<210> 124
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M2S正義鏈
<400> 124
Figure 107142925-A0305-02-0289-352
<210> 125
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M2S反義鏈
<400> 125
Figure 107142925-A0305-02-0289-353
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M2S正義鏈
<400> 126
Figure 107142925-A0305-02-0290-355
<210> 127
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M2S反義鏈
<400> 127
Figure 107142925-A0305-02-0290-354
<210> 128
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M1P1反義鏈
<400> 128
Figure 107142925-A0305-02-0291-356
<210> 129
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M1P1反義鏈
<400> 129
Figure 107142925-A0305-02-0292-357
<210> 130
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M2P1反義鏈
<400> 130
Figure 107142925-A0305-02-0292-358
<210> 131
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M2P1反義鏈
<400> 131
Figure 107142925-A0305-02-0293-359
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M1SP1反義鏈
<400> 132
Figure 107142925-A0305-02-0294-360
<210> 133
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M1SP1反義鏈
<400> 133
Figure 107142925-A0305-02-0294-361
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP1M2SP1反義鏈
<400> 134
Figure 107142925-A0305-02-0295-362
<210> 135
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siAP2M2SP1反義鏈
<400> 135
Figure 107142925-A0305-02-0296-363
<210> 136
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M1P反義鏈
<400> 136
Figure 107142925-A0305-02-0296-364
<210> 137
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M2P反義鏈
<400> 137
Figure 107142925-A0305-02-0297-366
<210> 138
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa2M1P反義鏈
<400> 138
Figure 107142925-A0305-02-0297-365
<210> 139
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa2M2P反義鏈
<400> 139
Figure 107142925-A0305-02-0298-367
<210> 140
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M1SP反義鏈
<400> 140
Figure 107142925-A0305-02-0299-368
<210> 141
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M2SP反義鏈
<400> 141
Figure 107142925-A0305-02-0299-369
<210> 142
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa2M1SP反義鏈
<400> 142
Figure 107142925-A0305-02-0300-370
<210> 143
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa2M2SP反義鏈
<400> 143
Figure 107142925-A0305-02-0301-371
<210> 144
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M3SP正義鏈
<400> 144
Figure 107142925-A0305-02-0301-372
<210> 145
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M4SP反義鏈
<400> 145
Figure 107142925-A0305-02-0302-373
<210> 146
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBb1M1SP反義鏈
<400> 146
Figure 107142925-A0305-02-0302-374
<210> 147
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBb2M1SP反義鏈
<400> 147
Figure 107142925-A0305-02-0303-375
<210> 148
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBb1M2SP反義鏈
<400> 148
Figure 107142925-A0305-02-0304-376
<210> 149
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBb2M2SP反義鏈
<400> 149
Figure 107142925-A0305-02-0304-377
<210> 150
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBb1M3SP正義鏈
<400> 150
Figure 107142925-A0305-02-0305-378
<210> 151
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBb1M4SP反義鏈
<400> 151
Figure 107142925-A0305-02-0306-379
<210> 152
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBb4M1SP正義鏈
<400> 152
Figure 107142925-A0305-02-0306-380
<210> 153
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBb4M1SP反義鏈
<400> 153
Figure 107142925-A0305-02-0307-381
<210> 154
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBc1M1SP反義鏈
<400> 154
Figure 107142925-A0305-02-0308-382
<210> 155
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBc1M2SP反義鏈
<400> 155
Figure 107142925-A0305-02-0308-383
<210> 156
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBc1M3SP正義鏈
<400> 156
Figure 107142925-A0305-02-0309-385
<210> 157
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBc1M4SP反義鏈
<400> 157
Figure 107142925-A0305-02-0309-384
<210> 158
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBc2M1SP正義鏈
<400> 158
Figure 107142925-A0305-02-0310-386
<210> 159
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBc2M1SP反義鏈
<400> 159
Figure 107142925-A0305-02-0311-388
<210> 160
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBd1M1SP反義鏈
<400> 160
Figure 107142925-A0305-02-0311-387
<210> 161
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBd1M2SP反義鏈
<400> 161
Figure 107142925-A0305-02-0312-389
<210> 162
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBd1M3SP正義鏈
<400> 162
Figure 107142925-A0305-02-0313-391
<210> 163
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBd1M4SP反義鏈
<400> 163
Figure 107142925-A0305-02-0313-390
<210> 164
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBd2M1SP正義鏈
<400> 164
Figure 107142925-A0305-02-0314-392
<210> 165
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBd2M1SP反義鏈
<400> 165
Figure 107142925-A0305-02-0314-393
<210> 166
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN1M1P反義鏈
<400> 166
Figure 107142925-A0305-02-0315-394
<210> 167
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN2M1P反義鏈
<400> 167
Figure 107142925-A0305-02-0316-395
<210> 168
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN1M2P反義鏈
<400> 168
Figure 107142925-A0305-02-0316-397
<210> 169
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN2M2P反義鏈
<400> 169
Figure 107142925-A0305-02-0317-398
<210> 170
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN1M1SP反義鏈
<400> 170
Figure 107142925-A0305-02-0318-399
<210> 171
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN2M1SP反義鏈
<400> 171
Figure 107142925-A0305-02-0318-400
<210> 172
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN1M2SP反義鏈
<400> 172
Figure 107142925-A0305-02-0319-401
<210> 173
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN2M2SP反義鏈
<400> 173
Figure 107142925-A0305-02-0320-402
<210> 174
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN1M4S反義鏈
<400> 174
Figure 107142925-A0305-02-0320-403
<210> 175
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN1M4SP反義鏈
<400> 175
Figure 107142925-A0305-02-0321-405
<210> 176
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN1M5S正義鏈
<400> 176
Figure 107142925-A0305-02-0321-404
<210> 177
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN1M5S反義鏈
<400> 177
Figure 107142925-A0305-02-0322-406
<210> 178
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN1M5SP反義鏈
<400> 178
Figure 107142925-A0305-02-0323-408
<210> 179
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP1M1P反義鏈
<400> 179
Figure 107142925-A0305-02-0323-407
<210> 180
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP2M1P反義鏈
<400> 180
Figure 107142925-A0305-02-0324-409
<210> 181
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP1M2P反義鏈
<400> 181
Figure 107142925-A0305-02-0325-411
<210> 182
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP2M2P反義鏈
<400> 182
Figure 107142925-A0305-02-0325-410
<210> 183
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP1M1SP反義鏈
<400> 183
Figure 107142925-A0305-02-0326-412
<210> 184
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP2M1SP反義鏈
<400> 184
Figure 107142925-A0305-02-0326-413
<210> 185
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP1M2SP反義鏈
<400> 185
Figure 107142925-A0305-02-0327-414
<210> 186
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP2M2SP反義鏈
<400> 186
Figure 107142925-A0305-02-0328-415
<210> 187
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mTTR上游引物
<400> 187
Figure 107142925-A0305-02-0328-416
<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mTTR下游引物
<400> 188
Figure 107142925-A0305-02-0329-417
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH上游引物
<400> 189
Figure 107142925-A0305-02-0330-418
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH下游引物
<400> 190
Figure 107142925-A0305-02-0330-419
<210> 191
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-actin上游引物
<400> 191
Figure 107142925-A0305-02-0331-420
<210> 192
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-actin下游引物
<400> 192
Figure 107142925-A0305-02-0332-421
<210> 193
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV上游引物
<400> 193
Figure 107142925-A0305-02-0332-422
<210> 194
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV下游引物
<400> 194
Figure 107142925-A0305-02-0333-423
<210> 195
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD-65695正義鏈
<400> 195
Figure 107142925-A0305-02-0333-424
<210> 196
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD-65695反義鏈
<400> 196
Figure 107142925-A0305-02-0334-426
<210> 197
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD-69535正義鏈
<400> 197
Figure 107142925-A0305-02-0335-427
<210> 198
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD-69535反義鏈
<400> 198
Figure 107142925-A0305-02-0335-428
<210> 199
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠ANGPTL3上游引物
<400> 199
Figure 107142925-A0305-02-0336-429
<210> 200
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠ANGPTL3下游引物
<400> 200
Figure 107142925-A0305-02-0336-430
<210> 201
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠GAPDH上游引物
<400> 201
Figure 107142925-A0305-02-0337-431
<210> 202
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠GAPDH下游引物
<400> 202
Figure 107142925-A0305-02-0338-432
<210> 203
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> W8-siAN1M3SPs反義鏈
<400> 203
Figure 107142925-A0305-02-0338-433
<210> 204
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-simTTR正義鏈
<400> 204
Figure 107142925-A0305-02-0339-434
<210> 205
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-simTTR反義鏈
<400> 205
Figure 107142925-A0305-02-0340-435
<210> 206
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M2Sps正義鏈
<400> 206
Figure 107142925-A0305-02-0340-436
<210> 207
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M2Sps反義鏈
<400> 207
Figure 107142925-A0305-02-0341-437
<210> 208
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M2Sp正義鏈
<400> 208
Figure 107142925-A0305-02-0341-438
<210> 209
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M2Sp反義鏈
<400> 209
Figure 107142925-A0305-02-0342-439
<210> 210
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M1Sp正義鏈
<400> 210
Figure 107142925-A0305-02-0343-441
<210> 211
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M1Sp反義鏈
<400> 211
Figure 107142925-A0305-02-0343-440
<210> 212
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M1SpsT正義鏈
<400> 212
Figure 107142925-A0305-02-0344-442
<210> 213
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M1SpsT反義鏈
<400> 213
Figure 107142925-A0305-02-0345-444
<210> 214
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M1Sps正義鏈
<400> 214
Figure 107142925-A0305-02-0345-443
<210> 215
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siHBa1M1Sps反義鏈
<400> 215
Figure 107142925-A0305-02-0346-445
<210> 216
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-siHBa1M2SP正義鏈
<400> 216
Figure 107142925-A0305-02-0347-446
<210> 217
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-siHBa1M2SP反義鏈
<400> 217
Figure 107142925-A0305-02-0347-447
<210> 218
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> W8-siHBa1M2SP正義鏈
<400> 218
Figure 107142925-A0305-02-0348-449
<210> 219
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> W8-siHBa1M2SP反義鏈
<400> 219
Figure 107142925-A0305-02-0348-448
<210> 220
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Z5-siHBa1M2SP正義鏈
<400> 220
Figure 107142925-A0305-02-0349-450
<210> 221
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Z5-siHBa1M2SP反義鏈
<400> 221
Figure 107142925-A0305-02-0350-452
<210> 222
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siP1M1Sp正義鏈
<400> 222
Figure 107142925-A0305-02-0350-451
<210> 223
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siP1M1Sp反義鏈
<400> 223
Figure 107142925-A0305-02-0351-453
<210> 224
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siP1M1SP正義鏈
<400> 224
Figure 107142925-A0305-02-0352-455
<210> 225
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siP1M1SP反義鏈
<400> 225
Figure 107142925-A0305-02-0352-454
<210> 226
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN2M1Sp正義鏈
<400> 226
Figure 107142925-A0305-02-0353-456
<210> 227
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAN2M1Sp反義鏈
<400> 227
Figure 107142925-A0305-02-0353-457
<210> 228
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP1M1Sp正義鏈
<400> 228
Figure 107142925-A0305-02-0354-458
<210> 229
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP1M1Sp反義鏈
<400> 229
Figure 107142925-A0305-02-0355-459
<210> 230
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP1M1Sps正義鏈
<400> 230
Figure 107142925-A0305-02-0355-460
<210> 231
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L10-siAP1M1Sps反義鏈
<400> 231
Figure 107142925-A0305-02-0356-461
<210> 232
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K4-simTTR正義鏈
<400> 232
Figure 107142925-A0305-02-0357-462
<210> 233
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K4-simTTR反義鏈
<400> 233
Figure 107142925-A0305-02-0357-463
<210> 234
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD-66810正義鏈
<400> 234
Figure 107142925-A0305-02-0358-464
<210> 235
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD-66810反義鏈
<400> 235
Figure 107142925-A0305-02-0359-465
<210> 236
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> X2M2正義鏈
<400> 236
Figure 107142925-A0305-02-0359-466
<210> 237
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> X2M2反義鏈
<400> 237
Figure 107142925-A0305-02-0360-468
<210> 238
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV上游引物
<400> 238
Figure 107142925-A0305-02-0360-467
<210> 239
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV下游引物
<400> 239
Figure 107142925-A0305-02-0361-469
<210> 240
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-actin上游引物
<400> 240
Figure 107142925-A0305-02-0362-471
<210> 241
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-actin下游引物
<400> 241
Figure 107142925-A0305-02-0362-470
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子ANGPTL3上游引物
<400> 242
Figure 107142925-A0305-02-0363-472
<210> 243
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子ANGPTL3下游引物
<400> 243
Figure 107142925-A0305-02-0364-474
<210> 244
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子GAPDH上游引物
<400> 244
Figure 107142925-A0305-02-0364-473
<210> 245
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子GAPDH下游引物
<400> 245
Figure 107142925-A0305-02-0365-475
<210> 246
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠β-actin上游引物
<400> 246
Figure 107142925-A0305-02-0366-476
<210> 247
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠β-actin下游引物
<400> 247
Figure 107142925-A0305-02-0366-477
<210> 248
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人APOC3上游引物
<400> 248
Figure 107142925-A0305-02-0367-478
<210> 249
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人APOC3下游引物
<400> 249
Figure 107142925-A0305-02-0367-479
<210> 250
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 對比序列1正義鏈
<400> 250
Figure 107142925-A0305-02-0368-480
<210> 251
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 對比序列1反義鏈
<400> 251
Figure 107142925-A0305-02-0369-481
Figure 107142925-A0305-02-0001-2

Claims (37)

  1. 一種化合物，該化合物具有式(321)所示的結構：
    Figure 107142925-A0305-02-0370-482
     其中，n1為1-2的整數，n3為0-1的整數，並且n1+n3=2-3；每個m1、m2和m3各自獨立地為2-10的整數；每個R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地選自H、C1-C10烷基、C1-C10鹵代烷基和C1-C10烷氧基；R4為能夠藉由磷酸二酯鍵連接到寡核苷酸的基團；每個L1是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的群組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C6-C10亞芳基、C3-C18亞雜環基和C5-C10亞雜芳基；並且其中，L1任選地具有由以下基團所組成的群組中的任何一個或多個的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10雜芳基、C1-C10鹵代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10鹵代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、 -CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10鹵代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10鹵代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10鹵代烷基)；其中，每個L1獨立地選自於由基團A1-A26及其任意組合所組成的群組：
    Figure 107142925-A0305-02-0371-483
    Figure 107142925-A0305-02-0372-484
     其中，每個j1獨立地為1-20的整數；每個j2獨立地為1-20的整數；每個R’獨立地為C1-C10烷基；每個Ra獨立地選自於由基團A27-A45及其任意組合所組成的群組：
    Figure 107142925-A0305-02-0372-631
    Figure 107142925-A0305-02-0373-486
     每個Rb獨立地為C1-C10烷基；
    Figure 107142925-A0305-02-0373-623
    表示基團連接至分子其餘部分的位點；每個S1獨立地為M1，其中任何活性羥基，如果有的話，都被羥基保護基團保護；每個M1獨立地選自能夠和哺乳動物肝細胞表面的去唾液酸糖蛋白受體結合的配體，其中，每個M1獨立地選自於由以下所組成的群組：D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-三氟乙醯基半乳糖胺、 N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺、N-異丁醯基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脫氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脫氧-4-甲醯胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脫氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇醯基-α-神經氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙醯基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙醯基-2-脫氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脫水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖和L-4-硫代核糖。
  2. 如請求項1所述的化合物，其中，L1選自於由基團A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13及其連接組合所組成的群組；或者L1為基團A1、A4、A8、A10和A11中至少2個的連接組合。
  3. 如請求項1或2任一項所述的化合物，其中，L1的長度為3-25個原子，其中該L1的長度指L1中由與含氮骨架中的N原子連接的原子到與S1連接的原子形成的最長的原子鏈上的成鏈原子的個數。
  4. 如請求項1或2所述的化合物，其中，L1的長度為4-15個原子。
  5. 如請求項1所述的化合物，其中，每個m1、m2和m3各自獨立地為2-5的整數；或者m1=m2=m3。
  6. 如請求項1所述的化合物，其中，R4包括第1官能團，該第1官能團可以與寡核苷酸或核苷酸上的基團反應以形成磷酸酯鍵；或者R4還包括第2官能團，該第2官能團能夠和羥基基團或氨基基團形成共價鍵，或者為藉由與羥基基團或氨基基團形成的共價鍵而連接於分子其 餘部分的固相載體。
  7. 如請求項6所述的化合物，其中，該第1官能團為亞磷醯胺、羥基或受保護的羥基。
  8. 如請求項6所述的化合物，其中，該第2官能團為亞磷醯胺、羧基或羧酸鹽。
  9. 如請求項6所述的化合物，其中，該化合物具有式(403)-(442)所示的結構：
    Figure 107142925-A0305-02-0375-487
    Figure 107142925-A0305-02-0375-488
    Figure 107142925-A0305-02-0375-489
    Figure 107142925-A0305-02-0376-490
    Figure 107142925-A0305-02-0376-491
    Figure 107142925-A0305-02-0376-492
    Figure 107142925-A0305-02-0376-493
    Figure 107142925-A0305-02-0377-494
    Figure 107142925-A0305-02-0377-495
    Figure 107142925-A0305-02-0377-496
    Figure 107142925-A0305-02-0377-497
    Figure 107142925-A0305-02-0378-498
    Figure 107142925-A0305-02-0378-499
    Figure 107142925-A0305-02-0378-500
    Figure 107142925-A0305-02-0379-501
    Figure 107142925-A0305-02-0379-502
    Figure 107142925-A0305-02-0379-503
    Figure 107142925-A0305-02-0380-504
    Figure 107142925-A0305-02-0380-505
    Figure 107142925-A0305-02-0380-506
    Figure 107142925-A0305-02-0381-507
    Figure 107142925-A0305-02-0381-508
    Figure 107142925-A0305-02-0381-509
    Figure 107142925-A0305-02-0381-512
    Figure 107142925-A0305-02-0382-513
    Figure 107142925-A0305-02-0382-514
    Figure 107142925-A0305-02-0382-516
    Figure 107142925-A0305-02-0382-517
    Figure 107142925-A0305-02-0383-518
    Figure 107142925-A0305-02-0383-519
    Figure 107142925-A0305-02-0383-520
    Figure 107142925-A0305-02-0383-521
    Figure 107142925-A0305-02-0384-522
    Figure 107142925-A0305-02-0384-523
    Figure 107142925-A0305-02-0384-524
    Figure 107142925-A0305-02-0385-525
    Figure 107142925-A0305-02-0385-526
    Figure 107142925-A0305-02-0385-527
    Figure 107142925-A0305-02-0386-528
    Figure 107142925-A0305-02-0386-529
     其中，X為O或NH，M+為陽離子，Rk為羥基保護基團，SPS表示固相載體。
  10. 如請求項9所述的化合物，其中，M+為鹼金屬陽離子、銨陽離子、三級胺形成的陽離子或季銨陽離子，Rk為三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-雙甲氧基三苯甲基或4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基，SPS表示樹脂。
  11. 一種綴合物，所述綴合物具有式(1)所示的結構：
    Figure 107142925-A0305-02-0387-530
     其中，n1為1-2的整數，n3為0-1的整數，並且n1+n3=2-3；每個m1、m2和m3各自獨立地為2-10的整數；每個R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地選自H、C1-C10烷基、C1-C10鹵代烷基和C1-C10烷氧基；R3為活性藥物；R2是長度為1-20個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的群組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C6-C10亞芳基、C3-C18亞雜環基和C5-C10亞雜芳基；並且其中，R2任選地具有由以下基團所組成的群組中的任何一個或多個的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10雜芳基、C1-C10鹵代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10鹵代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10鹵代烷基、 -OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10鹵代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10鹵代烷基)；每個L1獨立地是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的群組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C6-C10亞芳基、C3-C18亞雜環基和C5-C10亞雜芳基；並且其中，L1任選地具有由以下基團所組成的群組中的任何一個或多個的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10雜芳基、C1-C10鹵代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10鹵代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10鹵代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10鹵代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10鹵代烷基)；其中，每個L1獨立地選自於由基團A1-A26及其任意組合所組成的群組：
    Figure 107142925-A0305-02-0388-531
    Figure 107142925-A0305-02-0389-532
     其中，每個j1獨立地為1-20的整數；每個j2獨立地為1-20的整數；每個R’獨立地為C1-C10烷基；每個Ra獨立地選自於由A27-A45及其任意組合所組成的群組：
    Figure 107142925-A0305-02-0390-533
     每個Rb獨立地為C1-C10烷基；
    Figure 107142925-A0305-02-0391-624
    表示基團連接至分子其餘部分的位點；每個M1選自能夠和哺乳動物肝細胞表面的去唾液酸糖蛋白受體結合的配體之一，其中，每個M1獨立地為單糖、二糖、三糖或多糖；或者每個M1獨立地選自於由以下所組成的群組：D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺、N-異丁醯基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脫氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脫氧-4-甲醯胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脫氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇醯基-α-神經氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙醯基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙醯基-2-脫氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脫水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖和L-4-硫代核糖。
  12. 如請求項11所述的綴合物，其中，L1選自於由基團A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13及其連接組合所組成的群組；或者L1為基團A1、A4、A8、A10和A11中至少2個的連接組合。
  13. 如請求項11或12任一項所述的綴合物，其中，L1的長度為3-25個原子。
  14. 如請求項11或12所述的綴合物，其中，L1的長度進一步為4-15個原子。
  15. 如請求項11所述的綴合物，其中，m1、m2和m3各自獨立地為2-5的整數；或者m1=m2=m3。
  16. 如請求項11所述的綴合物，其中，R3包括功能性寡核苷酸；或者R3進一步為具有式A59所示結構的基團：
    Figure 107142925-A0305-02-0392-632
     其中，E1為OH、SH或BH2，Nu為功能性寡核苷酸。
  17. 如請求項16所述的綴合物，其中，R2與R3中的P原子形成磷酸酯鍵。
  18. 如請求項11所述的綴合物，其中，所述綴合物具有式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)或(22)所示的結構：
    Figure 107142925-A0305-02-0392-535
    Figure 107142925-A0305-02-0393-536
    Figure 107142925-A0305-02-0393-537
    Figure 107142925-A0305-02-0393-538
    Figure 107142925-A0305-02-0393-539
    Figure 107142925-A0305-02-0394-540
    Figure 107142925-A0305-02-0394-541
    Figure 107142925-A0305-02-0394-542
    Figure 107142925-A0305-02-0394-543
    Figure 107142925-A0305-02-0395-544
    Figure 107142925-A0305-02-0395-545
    Figure 107142925-A0305-02-0395-546
    Figure 107142925-A0305-02-0395-548
    Figure 107142925-A0305-02-0396-549
    Figure 107142925-A0305-02-0396-550
    Figure 107142925-A0305-02-0396-551
    Figure 107142925-A0305-02-0396-552
    Figure 107142925-A0305-02-0397-553
    Figure 107142925-A0305-02-0397-554
    Figure 107142925-A0305-02-0397-555
  19. 如請求項16所述的綴合物，其中，該功能性寡核苷酸選自於由以下所組成的群組：小干擾RNA、微小RNA、抗微小RNA、微小RNA拮抗劑、微小RNA模擬物、誘餌寡核苷酸、免疫刺激物、G-四極子、可變剪接體、單鏈RNA、反義核酸、核酸適配體、莖環RNA、mRNA片段、激活RNA或DNA。
  20. 如請求項19所述的綴合物，其中，該功能性寡核苷酸為單鏈寡核苷酸，式A59中的P原子連接到該單鏈寡核苷酸的3'末端；或者該功能性寡核苷酸為雙鏈寡核苷酸，該雙鏈寡核苷酸包含正義鏈和反義鏈，式A59中的P原子連接到該正義鏈的3'末端區域。
  21. 如請求項19所述的綴合物，其中，該siRNA中的每個核苷酸獨立地為修飾或未修飾的核苷酸；該siRNA含有正義鏈和反義鏈，其中，該正義鏈包含核苷酸序列1，該反義鏈包含核苷酸序列2，該核苷酸序列1和該核苷酸序列2的長度均為19個核苷酸，並且至少部分地反向互補形成雙鏈互補區；該核苷酸序列2與第一段核苷酸序列至少部分互補，該第一段核苷酸序列為靶mRNA中的一段核苷酸；該靶mRNA指在肝細胞中異常表達的基因的mRNA。
  22. 如請求項21所述的綴合物，其中，該靶mRNA為對應於ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV或HCV的mRNA。
  23. 如請求項21所述的綴合物，其中，該核苷酸序列1與該第一段核苷酸序列長度相等，且不超過3個核苷酸差異；該核苷酸序列2與核苷酸序列B長度相等，且不超過3個核苷酸差異；該核苷酸序列B為與該第一段核苷酸序列完全反向互補的核苷酸序列。
  24. 如請求項23所述的綴合物，其中，該核苷酸序列2與該核苷酸序列B之間的核苷酸差異包括按照5'末端到3'末端的方向，該核苷酸序列2上的第一個核苷酸Z'位置上的差異。
  25. 如請求項21所述的綴合物，其中，該正義鏈進一步含有核苷酸序列3，該反義鏈進一步含有核苷酸序列4；該核苷酸序列3和該核苷酸序列4的長度相等且均為1-4個核苷酸；該核苷酸序列3連接 在該核苷酸序列1的5'末端，並且該核苷酸序列4連接在該核苷酸序列2的3'末端；該核苷酸序列4與第二段核苷酸序列互補；該第二段核苷酸序列是指靶mRNA中與該第一段核苷酸序列相鄰、且長度與該核苷酸序列4相同的核苷酸序列；並且該核苷酸序列3和該核苷酸序列4基本上完全反向互補或完全反向互補。
  26. 如請求項21或25所述的綴合物，其中，該siRNA進一步含有核苷酸序列5，該核苷酸序列5的長度為1至3個核苷酸，連接在該反義鏈的3'末端，從而構成該反義鏈的3'突出端。
  27. 如請求項21所述的綴合物，其中，該正義鏈和該反義鏈中的每一個核苷酸獨立地為氟代修飾的核苷酸或非氟代修飾的核苷酸，該氟代修飾的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取代形成的核苷酸；該非氟代修飾的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物，該核苷酸類似物為能夠替換核酸上核苷酸的基團，並具有與腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸或胸腺嘧啶核苷酸中任何一個不同的結構。
  28. 如請求項27所述的綴合物，其中，該正義鏈和該反義鏈均包含氟代修飾的核苷酸和非氟代修飾的核苷酸，該氟代修飾的核苷酸存在於核苷酸序列1和核苷酸序列2中，該核苷酸序列1中氟代修飾的核苷酸不多於5個，並且，按照5'末端到3'末端的方向，該核苷酸序列1的第7、8和9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸；該核苷酸序列2中氟代修飾的核苷酸不多於7個，並且，按照5'末端到3'末端的方向，該核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸。
  29. 如請求項27所述的綴合物，其中，每一個非氟代修飾的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸，其中該甲氧基修飾的核苷酸指該核苷酸中核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
  30. 如請求項21所述的綴合物，其中，該siRNA中，至少一個磷酸酯基為硫代磷酸酯基，並且硫代磷酸酯連接存在於以下至少一處：該正義鏈的5'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；該正義鏈的5'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；該正義鏈的3'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；該正義鏈的3'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；該反義鏈的5'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；該反義鏈的5'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；該反義鏈的3'末端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及該反義鏈的3'末端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。
  31. 如請求項21所述的綴合物，其中，該反義鏈的5'末端核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸。
  32. 一種如請求項11至31任一項所述的綴合物在製備用於治療和/或預防由肝細胞中特定基因的表達而引起的病理狀況或疾病的藥物中的用途。
  33. 如請求項32所述的用途，其中，該特定基因選自於由以下基因所組成的群組：B型肝炎病毒基因、血管生成素樣蛋白3基因和載脂蛋白C3基因。
  34. 如請求項32所述的用途，其中，該疾病選自於由以下疾病所組成的群組：慢性肝病、肝炎、肝纖維化、肝增生性疾病和血脂異常。
  35. 如請求項34所述的用途，其中，該血脂異常為高膽 固醇血症、高三酸甘油酯血症或動脈粥樣硬化。
  36. 一種抑制肝細胞中特定基因表達的方法，該方法包括在活體外將如請求項11至31任一項所述的綴合物與該肝細胞進行接觸；其中，該特定基因為ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV或HCV。
  37. 如請求項36所述的方法，其中，該特定基因選自於由以下基因所組成的群組：B型肝炎病毒基因、血管生成素樣蛋白3基因和載脂蛋白C3基因。
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