CN103073726B - 嵌段共聚物与液体组合物和核酸制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

嵌段共聚物与液体组合物和核酸制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种聚己内酯-聚磷酸酯嵌段共聚物、由该嵌段共聚物组成的液体组合物、一种核酸制剂以及上述共聚物和液体组合物的制备方法和它们在核酸药物给药系统中的应用。本发明得到的嵌段共聚物具有良好的生物相容性、低细胞毒性和可降解性。本发明提供的胶束，在水溶液中自组装形成纳米颗粒，具有良好的稳定性、生物相容性、低细胞毒性和可降解性，而且制备方法简单，可重复性高，作为载体能保护siRNA等小核酸免于降解，又能结合纳米颗粒本身的尺度效应，用于不同疾病的治疗。此外，通过键合靶向基团还能够实现对不同癌细胞的特异性识别。

Description

嵌段共聚物与液体组合物和核酸制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种嵌段共聚物，一种含有所述嵌段共聚物的液体组合物，一种核酸制剂，以及所述嵌段共聚物、液体组合物和核酸制剂的制备方法及应用。
背景技术
RNA干扰是一种由大约二十多个核苷酸组成的双链小分子干扰RNA(siRNA)介导的基因沉默技术，它具有序列特异性，因而基于RNA干扰的小核酸在疾病治疗中极具应用前景。然而，由于包括siRNA在内的小核酸分子本身不具备对组织或细胞的靶向能力，穿透细胞膜的能力差，在生理环境中极不稳定，因此其给药体系，尤其载体是亟需解决的关键问题，这也是小核酸药物能否最终顺利应用于临床的最关键的因素之一。目前国际上用于治疗实体瘤的小核酸药物正在进行临床试验，如Tekmira公司研发的TKM-D80301，Silence Therapeutics研发的ATU027，以及CalandoPharmaceutics公司研发的CALAA-01等。
因此，发展毒副作用小、生物相容性好的小核酸给药系统和制剂用于疾病的治疗非常重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚己内酯-聚磷酸酯嵌段共聚物、由该嵌段共聚物组成的液体组合物，它们可以作为小核酸药物的载体且具有良好的稳定性、生物相容性和可降解性；此外，本发明还提供了一种核酸制剂，以及提供上述共聚物和液体组合物的制备方法，和在核酸药物给药系统中的应用。
根据第一方面，本发明提供一种嵌段共聚物，其特征在于，该嵌段共聚物由A嵌段和B嵌段组成，其中，所述A嵌段为聚己内酯嵌段，所述B嵌段为聚磷酸酯嵌段，且所述聚磷酸酯嵌段具有式I所示的结构单元，
其中，R1为任选取代的C2-C10的亚烷基，X为卤素；
所述嵌段共聚物中，A嵌段与B嵌段的重量比为1∶0.1-5.30。
根据第二方面，本发明提供一种嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤，
(1)在开环聚合反应条件下，在开环聚合催化剂存在下，将聚己内酯、式III所示的化合物和第一有机溶剂接触，得到第一产物，
其中，R3为任选取代的C2-C10的亚烷基，R4为氨基的保护基，所述聚己内酯与式III所示的化合物的加入重量比为1∶1-30；
(2)在酸性条件下，去除第一产物中的氨基的保护基R4。
根据第三方面，本发明提供由上述的方法制得的嵌段共聚物。
根据第四方面，本发明提供一种液体组合物，其特征在于，该液体组合物含有水和胶束纳米颗粒，所述胶束纳米颗粒由第二嵌段共聚物形成或由第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物共同形成，其中，所述第一嵌段共聚物为聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物，所述第二嵌段共聚物为上述的嵌段共聚物，且所述第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物的摩尔比为0-100∶1。
根据第五方面，本发明提供一种液体组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括，将第二嵌段共聚物与第二有机溶剂接触、或将第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物与第二有机溶剂接触，得到第一溶液，在搅拌条件下，将第一溶液与水接触，其中，所述第一嵌段共聚物为聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物，所述第二嵌段共聚物为上述的嵌段共聚物，且所述第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物的摩尔比为0-100∶1；所述第二有机溶剂与水互溶。
根据第六方面，本发明提供由上述的方法制得的液体组合物。
根据第七方面，本发明提供一种核酸制剂，其特征在于，该核酸制剂包括载体和作为活性成分的核酸，所述载体为胶束纳米颗粒，所述胶束纳米颗粒由第二嵌段共聚物形成或由第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物共同形成，所述第一嵌段共聚物为聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物，所述第二嵌段共聚物为上述的嵌段共聚物，且所述第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物的摩尔比为0-100∶1，所述第二嵌段共聚物和核酸的摩尔比为0.1-1000∶1。
根据第八方面，本发明提供上述的嵌段共聚物、上述的液体组合物或上述的核酸制剂在制备核酸药物给药系统中的应用。
本发明的聚己内酯-聚磷酸酯嵌段共聚物中，聚己内酯作为疏水部分，具有如下优点和作用：①相对疏水性，在聚合物链之间的疏水-疏水相互作用促进共聚物自组装；②可生物降解；③生物相容；④合成方法简单可控；⑤原料较为廉价，节约成本。聚磷酸酯作为亲水部分，其带有正电荷，主要利用聚磷酸酯易官能化的优点得到侧基带有胺基官能团的共聚物，为负载核酸奠定基础。
本发明得到的嵌段共聚物以及含有该嵌段共聚物的胶束纳米颗粒具有良好的生物相容性、低的细胞毒性和可降解性，调节共聚物的组成和聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物的加入比例还可以改变其物理、化学性能。本发明提供的胶束，在水溶液中自组装形成纳米颗粒，具有良好的稳定性，制备方法简单，可重复性高，作为载体能保护siRNA等小核酸免于降解，又能结合纳米颗粒本身的尺度效应，用于不同疾病的治疗。
此外，加入聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物还能够进一步提高胶束的稳定性；并且，通过在聚乙二醇上键合不同的靶向基团，还能够实现对不同癌细胞的特异性识别。
本发明证明了在多种癌症模型中使用这种胶束纳米颗粒包载不同的治疗siRNA可以起到明显的抑制肿瘤细胞增殖和迁移、抑制血管增生和实现癌细胞周期阻滞的效果。并进一步通过在胶束纳米颗粒上修饰半乳糖基，从而特异性靶向肝脏，在体外和体内水平上实现了siRNA的靶向输送和对靶基因的有效沉默。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明一种实施方式中聚己内酯-聚磷酸酯(PCL-PPEEA)的合成路线；
图2A为N-叔丁氧羰基胺基乙醇的1H NMR谱，图2B为2-(N-叔丁氧羰基胺基)乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷的1H NMR谱，图2C为2-(N-叔丁氧羰基胺基)乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷的13C-NMR谱；
图3为PCL3300-PPEEA3500和PCL4400-PEG2000在摩尔比为1∶1.5(MMP1.5)时制备得到的混合胶束粒径和电势的分布图；
图4为不同比例的PCL3300-PPEEA3500和PCL4400-PEG2000制备的混合胶束在含有10％血清的培养基中培养时，颗粒粒径随培养时间的变化趋势图；
图5为利用MMP1.5携载siCDK4在A549和H661肺癌细胞中沉默目的基因的效果图；
图6A为利用MMP1.5携载siCDK4在A549肺癌细胞中对细胞周期的阻滞效果图，图6B为利用MMP1.5携载siCDK4在H661肺癌细胞中对细胞周期的阻滞效果图；
图7A为利用MMP1.5携载siCDK4在A549肺癌细胞中对细胞克隆形成能力的抑制效果图，图7B为利用MMP1.5携载siCDK4在H661肺癌细胞中对细胞克隆形成能力的抑制效果图；
图8为利用MMP1.5胶束携载siHIF在A549肺癌细胞中沉默目的基因的效果图；
图9为利用MMP1.5携载siHIF转染PC3前列腺癌细胞24小时后取细胞上清，验证其对HUVEC血管内皮细胞的血管形成能力的抑制效果图；
图10为利用MMP1.5携载siHIF转染PC3前列腺癌细胞后，在细胞层上刮出一道伤痕，验证对细胞迁移能力的抑制效果图；
图11为利用流式细胞仪检测乙酰半乳糖修饰的混合纳米胶束(GalNAc-MMP1.5)、葡萄糖修饰的混合纳米胶束(Glu-MMP1.5)结合FAM-siRNA后在肝实质细胞和NIH3T3细胞中的内吞效果图；
图12为结合siApoB的不同纳米胶束颗粒在肝实质细胞中沉默目的基因的效果图；
图13A为对小鼠进行尾静脉注射PBS，游离Cy5-siRNA，Glu-MMP1.5Cy5-siRNA和GalNAc-MMP1.5Cy5-siRNA后，纳米胶束颗粒在肝脏的富集效果图，图13B为对肝脏进行切片后，胶束纳米颗粒进入肝实质细胞的效果图；
图14为对小鼠进行尾静脉注射结合siApoB的不同纳米胶束颗粒，经过5次注射后检测肝脏中目的基因沉默的效果图。
具体实施方式
本发明提供一种嵌段共聚物，其特征在于，该嵌段共聚物由A嵌段和B嵌段组成，其中，所述A嵌段为聚己内酯嵌段，所述B嵌段为聚磷酸酯嵌段，且所述聚磷酸酯嵌段具有式I所示的结构单元，
其中，R1为C2-C10的亚烷基；X为卤素，优选为Cl、Br或I，优选为Cl；所述嵌段共聚物中，A嵌段与B嵌段的重量比为1∶0.1-5.3。
本发明中，所述C2-C10的亚烷基优选为任选取代的亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基，进一步优选为C2-C4的亚烷基，最优选为亚乙基。
本发明中，所述聚己内酯(PCL)为聚ε-己内酯。
所述嵌段共聚物中，A嵌段与B嵌段的重量比优选为1∶0.11-5.0，进一步优选为1∶0.12-4.0。
其中，优选地，所述聚己内酯嵌段具有式II所示的结构，且所述嵌段共聚物为A-B两嵌段共聚物，
m为大于1的整数，优选为大于5的整数，
其中，R2为任选取代的C1-C10的烷基。
本发明中，所述任选取代的C1-C10的烷基包括任选取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基或正己基，优选为甲基、乙基或异丙基。
所述聚己内酯嵌段的平均分子量优选为500-40000，进一步优选为1000-25000。所述聚磷酸酯嵌段的平均分子量优选为500-10000，进一步优选为1000-8000。本发明中，所述平均分子量通过1H NMR测得。
本发明提供一种嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤，
(1)在开环聚合反应条件下，在开环聚合催化剂存在下，将聚己内酯、式III所示的化合物和第一有机溶剂接触，得到第一产物，其中，聚己内酯作为大分子引发剂，
其中，R3为任选取代的C2-C10的亚烷基；R4为氨基的保护基，优选为叔丁氧羰基(Boc)保护基；所述聚己内酯与式III所示的化合物的加入重量比为1∶1-30，优选为1∶2-30；
(2)在酸性条件下，去除第一产物中的氨基的保护基R4，所述酸性条件为本领域技术人员公知，例如通过加入无机酸，如盐酸等实现。
其中，优选地，所述聚己内酯具有式IV所示的结构，
其中，R5为任选取代的C1-C10的烷基，m为大于1的整数，优选为大于5的整数。
根据本发明，所述聚己内酯的平均分子量优选为500-40000，进一步优选为1000-25000。
根据本发明，所述开环聚合反应条件可以为本领域常规的环状磷酸酯的开环聚合反应条件，优选地，所述开环聚合反应条件包括，温度为20-50℃，时间为1-10小时；所述开环聚合催化剂为异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)；所述第一有机溶剂为四氢呋喃(THF)、二甲亚砜、甲苯中的至少一种，优选为四氢呋喃。
根据本发明，所述式III所示的化合物可通过如下的合成方法合成，该方法包括：在酰氯醇解条件下，将式V所示的化合物与2-氯-2氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷接触，
其中，R6为任选取代的C2-C10的亚烷基。
所述酰氯醇解反应条件为本领域常规的条件，例如，在三乙基胺和四氢呋喃存在下，在惰性气体保护下，常温反应过夜。
所述任选取代的C2-C10的亚烷基的定义和优选范围与前述相同。
式V所示的化合物可以通过图1中步骤B所示的方法合成得到，其合成方法为本领域技术人员公知。
所述2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷可以通过商购获得，如购自sigma-aldrich公司；也可以通过如图1步骤A所示的方法合成得到，其合成方法为本领域技术人员公知。
简而言之，最优选地，聚己内酯聚磷酸酯两嵌段共聚物是由异辛酸亚锡作为催化剂，以不同分子量的一端为羟基、另一端为烷基封端的聚己内酯为大分子引发剂，通过环状磷酸酯单体的开环聚合反应得到的。
本发明提供由上述的方法制得的嵌段共聚物，所述嵌段共聚物优选为PCL-PPEEA，包括但不限于PCL1000-PPEEA5600，PCL3300-PPEEA1000，PCL3300-PPEEA5600，PCL3300-PPEEA8000，PCL25000-PPEEA5600中的至少一种，其中，所述PPEEA为聚氨乙基-乙撑磷酸酯，下标的数字表示由1H NMR测得的该共聚物的平均分子量，下文与此相同。
本发明提供一种液体组合物，其特征在于，该液体组合物含有水和胶束纳米颗粒，所述胶束纳米颗粒由第二嵌段共聚物形成或由第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物共同形成，其中，所述第一嵌段共聚物为聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物，所述第二嵌段共聚物为上述的嵌段共聚物，且所述第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物的摩尔比为0-100∶1，优选为0.1-50∶1，进一步优选为1.1-30∶1，最优选为1.2-10∶1。
根据本发明，所述胶束纳米颗粒的颗粒直径优选为10-250纳米，进一步优选为20-200纳米；Zeta电势优选为10-100mV，进一步优选为30-60mV。其中，所述胶束纳米颗粒的颗粒直径为通过动态光散射检测到的颗粒直径。
根据本发明，所述第一嵌段共聚物优选为聚己内酯-聚乙二醇两嵌段共聚物(PCL-PEG)。
根据本发明，所述第一嵌段共聚物中，聚己内酯嵌段的平均分子量优选为200-25000，进一步优选为400-20000；聚乙二醇嵌段的平均分子量为200-10000，进一步优选为500-5000，所述PCL-PEG包括但不限于PEG550-PCL4600，PEG2000-PCL1000，PEG2000-PCL4600，PEG2000-PCL25000，PEG10000-PCL4600中的至少一种。
根据本发明，优选地，以该液体组合物的体积为基准，所述液体组合物中，第一嵌段共聚物的浓度为0-5×10-3M，进一步优选为1×10-5-5×10-3M，最优选为1×10-4-1×10-3M；第二嵌段共聚物的浓度为1×10-5-5×10-3M，最优选为1×10-4-1×10-3M。
根据本发明，以液体组合物的体积为基准，所述胶束纳米颗粒的浓度优选为10-100μg/ml，进一步优选为20-50μg/ml。
根据本发明，所述聚乙二醇嵌段中的聚乙二醇可以为修饰的聚乙二醇，优选地，至少部分聚乙二醇嵌段为被靶向性物质修饰的聚乙二醇嵌段，所述靶向性物质为叶酸、糖、具有导向作用的短肽、单克隆抗体和适配子中的至少一种。通过修饰靶向性物质可以使嵌段共聚物靶向目标组织和细胞，如本发明使用的乙酰半乳糖，可以引导嵌段共聚物靶向肝脏。
本发明中，所述聚乙二醇嵌段为被靶向性物质修饰是指二者之间形成共价键，因此，本领域技术人员能够理解，所述靶向性物质修饰的聚乙二醇嵌段是简化的说法，例如，乙酰半乳糖修饰的聚乙二醇嵌段是指乙酰半乳糖基取代聚乙二醇的端基所得到的化合物。
本发明对所述靶向性物质修饰的位置没有特别的限定，为了合成的方便性，优选地，所述靶向性物质修饰在聚二乙醇嵌段的端基上，修饰的方法已为本领域技术人员公知。
本发明提供一种液体组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括，将第二嵌段共聚物与第二有机溶剂接触、或将第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物与第二有机溶剂接触，得到第一溶液，在搅拌条件下，将第一溶液与水接触，其中，所述第一嵌段共聚物为聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物，所述第二嵌段共聚物为上述的嵌段共聚物，且所述第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物的摩尔比为0-100∶1，优选为0.1-50∶1，进一步优选为1.1-30∶1，最优选为1.2-10∶1；所述第二有机溶剂与水互溶，优选地，所述第二有机溶剂包括但不限于二甲基亚砜、乙腈、C1-C6的醇中的至少一种，所述C1-C6的醇优选为甲醇或乙醇，所述第二有机溶剂优选为二甲基亚砜或甲醇-乙腈混合溶剂(等体积混合)。
根据本发明，优选地，以所述水的量为基准，所述液体组合物中，第一嵌段共聚物的加入量为0-5×10-3M，进一步优选为1×10-5-5×10-3M，最优选为1×10-4-1×10-3M；所述第二嵌段共聚物的加入量优选为1×10-5-5×10-3M，进一步优选为1×10-4-1×10-3M。
对所述第一嵌段共聚物、其嵌段的平均分子量以及聚乙二醇嵌段上靶向性物质的修饰与前述相同，在此不再赘述。
根据本发明，该方法还优选包括，将第一溶液与水接触后得到的溶液进行透析，去除其中的第二有机溶剂。所述透析的方法为本领域技术人员公知。
本发明提供由上述的方法制得的液体组合物。
除常用的液体组合物的形式外，混合或独立存放的上述第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物的固体粉末也是可存在的形式，因此，也属于本发明公开的内容。
本发明提供一种核酸制剂，其特征在于，该核酸制剂包括载体和作为活性成分的核酸，所述载体为胶束纳米颗粒，所述胶束纳米颗粒由第二嵌段共聚物形成或由第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物共同形成，所述第一嵌段共聚物为聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物，所述第二嵌段共聚物为上述的嵌段共聚物，且所述第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物的摩尔比为0-100∶1，优选为0.1-50∶1，进一步优选为1.1-30∶1，最优选为1.2-10∶1；所述第二嵌段共聚物和所述核酸的摩尔比为0.1-1000∶1，优选为5-250∶1。
根据本发明，优选地，所述载体中的氮原子与所述核酸的主链中的磷原子的摩尔比为1-100∶1，进一步优选1-30∶1，最优选为2-10∶1。
对所述胶束纳米颗粒的粒径和Zeta电势的限定与前述相同，在此不再赘述。
对所述第一嵌段共聚物、其嵌段的平均分子量以及聚乙二醇嵌段上靶向性物质的修饰与前述相同，在此不再赘述。
根据本发明，所述作为活性成分的核酸可以为单链或双链的DNA、单链或双链的RNA、寡核苷酸、多核苷酸，优选地，为非编码RNA，更优选地，所述核酸为siRNA、microRNA、shRNA、反义RNA和适配子中的至少一种。
根据本发明，所述核酸制剂中还可以含有可增强小干扰RNA的稳定性、维持和增强小干扰RNA的抑制效果、可促进小干扰RNA的靶向性的辅助组分。作为辅助组分，可列举的有磷脂、多肽、蛋白质、多糖、及其他高分子和大分子材料中的至少一种。例如，为了促进小干扰RNA进入细胞，在小干扰RNA的一条单链的3’-末端引入亲脂性的胆固醇、脂蛋白、维生素E等基团。亲脂性的基团可以以共价键形式与小干扰RNA结合，以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜与细胞内的靶mRNA发生作用。小干扰RNA也可以通过非共价键形式，如通过疏水键或离子键结合磷脂分子、多肽、多糖等以增加稳定性和生物学活性。辅助组分在组合物中的用量没有特别的限制，只要能够维持和/或增强小干扰RNA的导入效率、稳定性和抑制效果即可。
本发明中，所述核酸制剂优选为液体制剂。所述液体制剂可以采用pH值为4.0-9.0的磷酸缓冲液、pH值为7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液、生理盐水或pH为5.5-8.5的磷酸盐缓冲液等制成。优选用pH值为4.0-9.0的磷酸缓冲液制备本发明的液体制剂。液体制剂中还可以含有保护剂和/或渗透压调节剂。保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种，渗透压调节剂可以是氯化钠和/或氯化钾。以注射用液体制剂为例，保护剂的含量可以是0.01-30重量％。渗透压调节剂的含量没有特殊限定，只要可保持液体制剂的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克即可。将液体形式的核酸制剂给药动物或人类个体时，其剂量可以为本领域常用的剂量。例如，单次注射的剂量可以是在1-10g/kg体重的范围内。具体使用时，剂量选择可以由各种参数、尤其根据待动物或人类个体的年龄、体重和症状等来确定。
当所述核酸制剂为液体制剂时，以核酸制剂的体积为基准，所述胶束纳米颗粒的浓度优选为10-100μg/ml，进一步优选为20-50μg/ml。
本发明还提供上述嵌段共聚物、上述液体组合物或上述核酸制剂在制备核酸药物给药系统中的应用。
所述核酸药物可以为能够治疗癌症的核酸药物；优选地，所述核酸药物能够治疗肺癌、前列腺癌或肝癌。
通过以下实施例对本发明做更详细的说明。
本发明的实施例中，ε-己内酯(CL，Acros)，纯度≥99％，在N2气氛下用CaH2回流24h，使用前减压蒸出。三异丙醇铝(国药集团化学试剂有限公司)减压蒸馏三遍，在150℃下保温两小时后用液氮淬冷，溶于无水甲苯备用。异辛酸亚锡(国药集团化学试剂有限公司)，先用对二甲苯共沸两次，然后再减压蒸馏，收集152℃(20-40Pa)的馏分用于聚合反应。三氯化磷、乙二醇，使用前重蒸。二氯甲烷，用五氧化二磷回流24h，使用前蒸出。三乙胺，先后用邻苯二甲酸酐，NaOH和CaH2分别回流24h，使用前蒸出。四氢呋喃，用钠钾合金回流，使用前蒸出。乙醚、甲苯用钠砂回流干燥，均在使用前蒸出。所使用的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯均购自长沙巴溪仪器有限公司。其余化学试剂均为分析纯，常规分子生物学步骤参考《分子克隆》(冷泉港出版社，第三版)或根据商购试剂的产品说明书进行。
实施例1
本实施例用于说明聚己内酯-聚磷酸酯(PCL-PPEEA)的合成和表征。
(一)2-(N-叔丁氧羰基胺基)乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(PEEABoc)环状磷酸酯单体的合成与表征
(1)2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(COP)的合成
COP合成路线如图1的步骤A所示。具体步骤为：在300mL、含有3.26mol/L三氯化磷的二氯甲烷溶液中，滴加301mL、含有3.25mol/L乙二醇的二氯甲烷溶液；待滴完后，在室温下，继续反应0.5小时；减压蒸去溶剂，再连续两次减压蒸出产物后，将产物溶解在苯中，通3天O2进行氧化直到反应完全，减压蒸馏(20Pa)，收集72℃的馏分，得到COP。
(2)N-叔丁氧羰基胺基乙醇(EABoc)的合成和表征
合成路线如图1的步骤B所示。具体步骤为：在250mL的三口瓶中依次加入6.1克(0.10mol)乙醇胺、100mL四氢呋喃、100mL超纯水，搅拌待其完全溶解后，连续加入8.4g(0.1mol)碳酸氢钠和21.8g(0.1mol)二碳酸二叔丁酯。在0℃下反应30分钟后，自然升至室温并反应过夜。反应液用100mL乙醚萃取2次，有机相用无水硫酸钠干燥。减压下除去溶剂，得到产物，产率为95％。
对产物进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，1H NMR谱如图2A所示。由图2A可见，各种质子均得到相应归属，积分比例吻合，确认产物为EABoc。
(3)2-(N-叔丁氧羰基胺基)乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(PEEABoc)的合成和表征
合成路线如图1的步骤C所示。具体步骤为：在-5℃的低温反应浴下，将制得的COP(14.25g，0.1mol)的四氢呋喃(30ml)溶液滴加到EABoc(16.10g，0.1mol)和三乙胺(10.12g，0.1mol)的四氢呋喃(120ml)溶液中，反应过夜。然后在N2保护下，过滤反应溶液得到滤液，将滤液浓缩后，用400mL干燥的冷乙醚沉淀，移去上清液，沉淀物用油泵抽干。
对抽干的沉淀物进行核磁共振氢谱(1H NMR)和核磁共振碳谱(13C-NMR)分析，1H NMR谱见图2B，13C-NMR谱见图2C。
从图2B可以观察到，1.43ppm的单峰归属为叔丁基的9个氢核，3.36ppm和4.12ppm的三重峰分别归属为-OCH2CH 2NH--和-OCH 2CH2NH-片段上的2个氢核，4.36ppm的多重峰归属为磷酸酯环-OCH 2CH 2O-上的4个氢核。在图2C中，各种碳的化学位移已在图中标明。以上的核磁共振谱证明了抽干的沉淀物即为PEEABoc。
(二)聚己内酯-聚磷酸酯两嵌段共聚物(PCL-PPEEA)的合成和表征
(1)聚己内酯PCL大分子引发剂的合成和表征
各种分子量的端羟基聚己内酯大分子引发剂是以异丙醇铝为引发剂和催化剂，在甲苯、室温下引发己内酯单体聚合而成。通过调节己内酯与异丙醇铝的投料比，可以得到不同分子量的聚己内酯聚合物。
以异丙醇铝为引发剂制备聚合物，聚合反应在手套箱中进行，其合成的具体实验步骤如下：
1)将进行反应的圆底烧瓶经多次的抽真空火焰干燥和充氮气的处理后，放入手套箱；
2)按表1的配比进行投料：向烧瓶中加入己内酯(CL)单体和甲苯，在室温搅拌下加入异丙醇铝开始聚合；
3)反应若干小时后，将产物移出手套箱，加入重量为异丙醇铝10倍的醋酸终止反应，将甲苯浓缩后沉淀到冷的乙醚中，收集沉淀物，用油泵抽干至恒重为止，即得产物。
调节投料比(摩尔比)可得到不同分子量的PCL产物，用核磁共振氢谱(1H NMR)分析，测定其平均分子量，如表1所示。
表1
  CL单体∶异丙醇铝(摩尔比)   PCLa
  9∶1   PCL1000
  30∶1   PCL3300
  220∶1   PCL25000
a聚合物右下角的数字代表聚合物根据1H NMR得到的分子量
用凝胶渗透色谱(GPC)法以聚苯乙烯为标准分析PCL的数均分子量Mn和分子量分布PDI(分子量分布宽度指数)，见表2。
表2
  PCL   Mn(g/mol)a   Mn(g/mol)b   PDIa
  PCL1000   2200   1000   1.09
  PCL3300   6100   3300   1.06
  PCL25000   54300   24800   1.05
a表示用GPC测定；b表示用1HNMR测定。
(2)聚己内酯-聚磷酸酯两嵌段共聚物的合成和表征
以PCL为引发剂，异辛酸亚锡为催化剂制备聚合物，聚合反应在手套箱中进行。在反应前，PCL大分子引发剂用干燥的甲苯共沸两次，减压抽干。合成路线如图1的步骤D所示。具体步骤如下：
1)将进行反应的圆底烧瓶经多次的抽真空火焰干燥和充氮气的处理后，放入手套箱；
2)按表2的比例进行投料：往圆底烧瓶中加入PCL、PEEABoc和THF，保证PEEABoc的起始浓度为2mol/L。在30℃下搅拌30分钟后，加入Sn(Oct)2；
3)反应3小时后，将反应液浓缩，在0℃下沉淀到10∶1(v/v)的乙醚/甲醇混合溶剂中，过滤，将固体抽干，即得到PCL-PPEEABoc；
4)取1g上述聚合物溶于10mL无水THF中，加入20mL的6M的HCl/THF溶液使得HCl的终浓度为4M。在0℃下搅拌反应2小时后，将反应液浓缩，用冷的乙醚沉淀，过滤，抽干固体，即得到PCL-PPEEA聚合物，通过不同投料比(摩尔比)可以合成不同的PCL-PPEEABoc聚合物，如表3所示。
表3
  PCL   PPEEABoc∶PCL∶Sn(Oct)2(摩尔比)   PCL-PPEEABoca
  PCL1000   60∶1∶1   PCL1000-PPEEABoc5300
  PCL3300   20∶1∶1   PCL3300-PPEEABoc1600
  PCL3300   60∶1∶1   PCL3300-PPEEABoc5600
  PCL3300   90∶1∶1   PCL3300-PPEEABoc8000
  PCL25000   60∶1∶1   PCL25000-PPEEABoc4800
用GPC法以聚苯乙烯为标准分析PCL-PPEEABoc共聚物的数均分子量和分子量分布PDI。需要指出，由于脱保护后的PCL-PPEEA很难用GPC表征，所以所列的分子量及分子量分布都是指脱保护前的PCL-PPEEABoc。对PCL-PPEEABoc和PCL-PPEEA进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，测定其平均分子量。PCL-PPEEABoc的聚合度、数均分子量Mn和分子量分布PDI见表4。
表4
a表示用GPC测定；b表示用1H NMR测定。
实施例2
本实施例用于说明PCL-PPEEA和PCL-PEG混合胶束的制备和表征。
(1)混合胶束纳米颗粒的制备
混合胶束纳米颗粒可以通过透析法制备：将两种嵌段聚合物PCL-PPEEA和PCL-PEG按照不同的摩尔比混合(比例如表5所示)，溶于乙腈∶甲醇＝1∶1的有机溶剂中，于搅拌下滴入超纯水中(1mg/mL)，搅拌半小时后，于透析袋(截留分子量为2k)中透析除去有机溶剂。
(2)混合胶束的粒径和Zeta电势测量
利用型号为Malvern Zetasizer Nanao ZS90的动态光散射仪检测不同的混合胶束纳米颗粒的粒径和电势分布，纳米颗粒浓度为0.1mg/mL。
表5示出了不同聚合物在不同摩尔比(PCL-PPEEA∶PCL-PEG)混合条件下的粒径和电势，从表5可见，制备得到的混合胶束纳米颗粒集中于20-200nm之间，Zeta电势集中于30-60mV之间，而在相同条件下测得的仅有PCL4400-PEG2000的纳米颗粒的粒径为260nm，Zeta电势为2.3。
其中PCL3300-PPEEA3500和PCL4400-PEG2000在摩尔比为1∶1.5时制备得到的混合胶束粒径和电势的分布图如图3所示，可见混合胶束纳米颗粒的粒径和电势分布都表现出良好的均一性。
表5
  PCL-PPEEA   PCL-PEG   摩尔比   粒径(nm)   电势(mV)
  PCL3300-PPEEA3500   PCL4400-PEG2000   1∶0   80   56
  PCL3300-PPEEA3500   PCL4400-PEG2000   1∶0.3   85   60
  PCL3300-PPEEA3500   PCL4400-PEG2000   1∶0.6   83   57
  PCL3300-PPEEA3500   PCL4400-PEG2000   1∶1   81   55
  PCL3300-PPEEA3500   PCL4400-PEG2000   1∶1.5   40   54
  PCL3300-PPEEA3500   PCL2500-PEG500   1∶1.5   156   58
  PCL3300-PPEEA3500   PCL400-PEG2000   1∶1.5   105   50
  PCL3300-PPEEA3500   PCL13500-PEG2000   1∶1.5   198   36
  PCL3300-PPEEA3500   PCL4000-PEG5000   1∶1.5   145   32
  PCL1000-PPEEA3300   PCL4400-PEG2000   1∶1.5   65   58
  PCL1000-PPEEA3300   PCL2500-PEG500   1∶1.5   48   55
  PCL1000-PPEEA3300   PCL400-PEG2000   1∶1.5   29   42
  PCL1000-PPEEA3300   PCL13500-PEG2000   1∶1.5   83   33
  PCL1000-PPEEA3300   PCL4000-PEG5000   1∶1.5   56   47
  PCL3300-PPEEA1000   PCL4400-PEG2000   1∶1.5   92   45
  PCL3300-PPEEA1000   PCL2500-PEG500   1∶1.5   130   54
  PCL3300-PPEEA1000   PCL400-PEG2000   1∶1.5   112   39
  PCL3300-PPEEA1000   PCL13500-PEG2000   1∶1.5   187   31
  PCL3300-PPEEA1000   PCL4000-PEG5000   1∶1.5   103   42
  PCL3300-PPEEA5000   PCL4400-PEG2000   1∶1.5   96   50
  PCL3300-PPEEA5000   PCL2500-PEG500   1∶1.5   128   59
  PCL3300-PPEEA5000   PCL400-PEG2000   1∶1.5   110   52
  PCL3300-PPEEA5000   PCL13500-PEG2000   1∶1.5   192   37
  PCL3300-PPEEA5000   PCL4000-PEG5000   1∶1.5   164   45
  PCL25000-PPEEA3000   PCL4400-PEG2000   1∶1.5   113   43
  PCL25000-PPEEA3000   PCL2500-PEG500   1∶1.5   132   57
  PCL25000-PPEEA3000   PCL400-PEG2000   1∶1.5   108   52
  PCL25000-PPEEA3000   PCL13500-PEG2000   1∶1.5   185   31
  PCL25000-PPEEA3000   PCL4000-PEG5000   1∶1.5   96   38
(3)混合胶束纳米颗粒在血清中稳定性检测
利用PCL3300-PPEEA3500和PCL4400-PEG2000制备摩尔比例不同的混合胶束。根据摩尔比PCL4400-PEG2000/PCL3300-PPEEA3500＝x，将混合胶束纳米颗粒命名为MMPx，将单独利用PCL3300-PPEEA3500制备的胶束命名为MP。混合胶束纳米颗粒重悬在含10体积％血清的DMEM培养基中，其中混合胶束纳米颗粒的浓度为1mg/mL。
通过Malvern Zetasizer Nanao ZS90动态光散射仪检测MP、MMP0.3、MMP0.6、MMP1和MMP1.5的粒径随时间的变化，设置三次重复试验，使用Malvern Dispersion Technology Software 4.2软件进行分析并取平均值，以粒径对时间作图，得到图4。
从图4可见，不含有PCL4400-PEG2000的胶束MP在含血清的培养基中很快团聚，通过将PCL3300-PPEEA3500和PCL4400-PEG2000以不同比例制备成混合胶束(MMP0.3、MMP0.6、MMP1和MMP1.5)，则可以明显提高颗粒在含血清培养基中的稳定性，在长时间的培养中都没有团聚的产生。并且PCL4400-PEG2000所占比例越大，混合胶束在血清中的稳定越好，粒径随培养时间增大的趋势越不明显。稳定性排序：MMP0.3＜MMP0.6＜MMP1＜MMP1.5。说明将PCL3300-PPEEA3500和PCL4400-PEG2000以不同比例制备成混合胶束纳米颗粒作为核酸制剂中的载体是本发明的优选实施方式。
实施例3
本实施例用于说明包载CDK4siRNA的混合胶束纳米颗粒作为siRNA给药系统的性能评价。
用实施例2制备的，PCL4400-PEG2000和PCL3300-PPEEA3500的摩尔比为1.5，命名为MMP1.5的混合胶束纳米颗粒，进行如下实验。
(1)混合胶束纳米颗粒MMP1.5与siRNA形成的核酸制剂对肺癌细胞内源性基因CDK4的mRNA表达的影响
针对CDK4的siRNA(siCDK4)以及阴性对照组siRNA均由上海吉玛公司提供，siRNA的正义链序列为5’-CAUCGUUCACCGAGAUCUGdTdT-3’(siCDK4，SEQ ID No：1)、5’-CAGAUCUCGGUGAACGAUGdTdT-3’(阴性对照组siRNA，SEQ  ID No：2)，反义链序列为5’-CAGAUCUCGGUGAACGAUGdTdT-3’(siCDK4，SEQ ID No：2)、5’-CAUCGUUCACCGAGAUCUGdTdT-3’(阴性对照组siRNA，SEQ ID No：1)。
将A549细胞(KRAS突变肺癌细胞株)、H661细胞(KRAS野生型肺癌细胞株)、以3×105/孔的密度接种于六孔板中24小时后，用载有或未载有siCDK4的各种载体的溶液处理细胞，每组所用混合胶束纳米颗粒溶液的体积为50μl，处理后孔中液体的总体积均为2ml，各组处理中的载体、载体终浓度、siRNA的类型和终浓度以及纳米颗粒中的氨基和核酸中的磷酸根的摩尔比(N/P)如下表6所示。
表6
在转染培养24h后，用RNeasy mini-kits(Qiagen)提取细胞中的总RNA，在用紫外分光光度计测定提取的RNA样品的OD280和OD260的吸光度，并利用公式I：RNA浓度(μg/μL)＝0.04×OD260×稀释倍数(公式I)，计算RNA样品的浓度，然后用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)合成第一链cDNA，每个样品使用2μg总RNA。在合成cDNA后，按照下面的反应体系(Takara)进行PCR反应，反应体系包括：5μl 10×PCR Buffer(含MgCl2)，1μl dNTP混合物(200mM)，1μl正向引物F1(0.2mM，序列为5’-ATCAAGAAG GTG GTGAAG CAG GCA-3’(GADPH，SEQ ID No：3)，5’-GCC TTC CCA TCA GCA CAG TTC-3’(CDK4，SEQ ID No：4))，1μl反向引物R1(0.2mM，序列为5’-TGG AAG AGT GGG AGT TGC TGTTGA-3’(GADPH，SEQ ID No：5)，5’-CAA AGA TAC AGC CAA CACTCC-3’(CDK4，SEQ ID No：6))，0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/μL)，2μl cDNA，补40.5μl灭菌蒸馏水至50μl。
PCR反应条件：对于GADPH：1)94℃加热变性5分钟；2)94℃加热变性30秒；3)57℃加热退火30秒；4)72℃加热延伸1分钟；20个循环；5)72℃加热延伸10分钟。对于CDK4：1)94℃加热变性5分钟；2)94℃加热变性30秒；3)57℃加热退火30秒；4)72℃加热延伸90秒；22个循环；5)72℃加热延伸10分钟。
PCR的产物用1重量％琼脂糖凝胶电泳检验，结果如图5所示：不经过siRNA处理的对照组细胞内CDK4mRNA表达量很高，当N/P＝5，siCDK4浓度为100nM时，MMP1.5siCDK4即可有效沉默CDK4的表达，且随着siCDK4剂量的增大，沉默效果增强。提高N/P至7.5或10，均可观察到实验组MMP1.5siCDK4中CDK4表达量有所降低。混合胶束纳米颗粒在不同的N/P比条件下结合siRNA都可以实现对目的基因CDK4的有效下调。而实验对照组MMP1.5以及MMP1.5siN.C.组中CDK4mRNA表达量与对照组相比没有显著性差异，说明CDK4mRNA表达量的降低是具有特异性的，并不是由于纳米颗粒或者siRNA本身的性质所造成。
(2)混合胶束纳米颗粒与siRNA的核酸制剂对肺癌细胞周期的影响
将A549细胞、H661细胞以3×105/孔的密度接种于六孔板中24小时后，用载有或未载有siCDK4的各种载体的溶液处理细胞，每组所用混合胶束纳米颗粒溶液的体积为50μl，处理后孔中液体的总体积均为2ml，各组处理中的载体、载体终浓度、siRNA的类型和终浓度以及N/P值如下表7所示。
表7
处理48小时后，使用0.25重量％的胰酶消化液消化每孔细胞，然后每孔加入2mL新鲜培养基终止反应，将细胞收集到10mL的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去培养液后用PBS重悬细胞，1000rpm离心5分钟。离心结束后，弃上清，每管细胞使用2mL、75重量％的乙醇(-40℃预冷)重悬，放置4度冰箱过夜。乙醇穿膜固定结束后，1000rpm离心5分钟，弃去上清并用PBS洗涤2次。每管细胞使用500μL染液进行标记(50μg/mL PI、100μg/mL RNase A、0.2％Triton X-100)，4℃避光孵育30分钟后，通过流式细胞仪进行上机分析，结果如图6所示。
从图6可以看到，对于A549细胞而言，MMP1.5siCDK4处理后的实验组和阳性对照组LiposiCDK4组，其细胞主要停留在G1期，G2期细胞比例较少，且S期细胞比例明显低于实验对照组，单纯使用MMP1.5纳米颗粒或MMP1.5siN.C.处理的细胞后，细胞的周期并没有发生明显变化。对于H661细胞而言，单纯的沉默CDK4表达并不会引起细胞的周期变化，主要体现为实验组MMP1.5siCDK4和阳性对照组LiposiCDK4的G1、G2、S期比例均并未发生显著的变化。
(3)混合胶束纳米颗粒与siRNA的核酸制剂对肺癌细胞增殖的影响
将A549细胞、H661细胞以7×104/孔的密度接种于24孔板中，24小时后，用载有或未载有siCDK4的各种载体的溶液处理细胞，每组所用混合胶束纳米颗粒溶液的体积为50μl，处理后孔中液体的总体积均为2ml，各组处理中的载体、载体终浓度、siRNA的类型和终浓度以及N/P值如下表8所示。
表8
处理72小时后，使用0.25重量％的胰酶消化液消化每孔细胞。以每孔1000个细胞的密度将各实验组种于6孔板中，37℃培养7天，PBS洗涤后，结晶紫染色后拍照，结果如图7所示。
图7显示，对于A549细胞而言，对照组中细胞正常生长，形成多数克隆；而MMP1.5siCDK4处理后的实验组和阳性对照组LiposiCDK4组中，细胞克隆数与实验对照组相比有明显的减少；单纯使用MMP1.5纳米颗粒或MMP1.5siN.C.处理细胞后，细胞的克隆数与对照组相比没有显著性差异。而对于H661细胞而言，单纯的沉默CDK4表达并不会影起细胞克隆数的减少，实验组MMP1.5siCDK4和阳性对照组LiposiCDK4的细胞克隆数均与对照组相当。
实施例4
本实施例用于说明包载HIF-1αsiRNA的混合胶束纳米颗粒作为siRNA给药系统的性能评价。
用实施例2制备的，PCL4400-PEG2000和PCL3300-PPEEA3500摩尔比为1.5，命名为MMP1.5的混合胶束纳米颗粒，进行如下实验。
(1)混合胶束纳米颗粒传递HIF-1αsiRNA(siHIF)对肺癌细胞内基因表达的作用
针对HIF-1α的siRNA以及阴性对照组siRNA均由上海吉玛公司提供，正义链序列分别为5’-CGAUCAUGCAGCUACUACAdTdT-3’(siHIF，SEQ IDNo：7)、5’-AGUUCAACGACCAGUAGUCdTdT-3’(阴性对照组siRNA，SEQID No：8)，反义链序列分别为5’-UGUAGUAGCUGCAUGAUCGdTdT-3’(siHIF，SEQ ID No：9)、5’-GACUACUGGUCGUUGAACUdTdT-3’(阴性对照组siRNA，SEQ ID No：10)。
检测MMP1.5与HIF-1αsiRNA复合物对肺癌细胞内HIF-1αmRNA的沉默，采用RT-PCR方法检测分别经过下述处理并在模拟缺氧条件下培养24小时后的A549细胞中的HIF-1αmRNA的表达水平，结果如图8所示。
图8：MMPs/HIF-1αsiRNA可以在模拟缺氧条件下降低A549细胞内HIF-1αmRNA的表达水平。
所述处理为：将A549细胞以3×104细胞/孔的密度接种于24孔板中，37℃培养24小时后，用载有或未载有siCDK4的各种载体的溶液处理细胞，每组所用混合胶束纳米颗粒溶液的体积为50μl，处理后孔中液体的总体积均为2ml，各组处理中的载体、载体终浓度、siRNA的类型和终浓度以及N/P值如下表9所示，每个处理组设置1个复孔：
表9
在培养基中添加CoCl2，使其终浓度为100μM，模拟缺氧培养条件。在转染培养24小时后，用RNAiso Plus总RNA提取试剂盒(Takara)提取细胞中的总RNA，利用紫外分光光度计测定提取的RNA样品的OD260和OD280的吸光度，并利用公式I计算RNA样品的浓度，然后用Reverse TranscriptaseM-MLV(Takara)合成第一链cDNA，每个样品使用1μg总RNA。在合成cDNA后，按照下面的反应体系进行PCR反应：5μL的10×PCR Buffer(含MgCl2)，1μl的10mM dNTP混合物，1μl正向引物F2(20μM，序列为5’-ATCAAG AAG GTG GTG AAG CAG GCA(GADPH，SEQ ID No：3)-3’，5’-GCAAGC CCT GAAAGC G-3’(HIF-1α，SEQ ID No：11))，1μl反向引物R2(20μM，序列为5’-TGGAAGAGT GGGAGT TGC TGT TGA-3’(GADPH，SEQID No：5)，5’-GGC TGT CCG ACT TTG A-3’(HIF-1α，SEQ ID No：12))，0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/μL)，1μl cDNA，补41.5μl灭菌蒸馏水至50μl。
PCR反应：对于GADPH与前述相同；对于HIF-1α：1)94℃加热变性5分钟；2)94℃加热变性30秒；3)51℃加热退火30秒；4)72℃加热延伸30秒；23个循环；5)72℃加热延伸10分钟。
PCR的产物用1重量％琼脂糖凝胶电泳检验，结果显示不用siRNA处理的对照组细胞内的HIF-1αmRNA表达量很高，阳性对照组Lipo siRNA处理的细胞内HIF-1αmRNA表达量有所降低，利用MMP1.5运输siRNA的四组中，细胞中的HIF-1αmRNA表达量与对照组相比有明显的降低，并且在siRNA的浓度从50nM提高至100nM时HIF-1αmRNA表达量下降得最为明显，继续增加siRNA的浓度则HIF-1αmRNA沉默效果提高不明显。
(2)混合胶束传递HIF-1αsiRNA对血管增生的抑制作用
检测混合胶束纳米颗粒与HIF-1αsiRNA复合物对前列腺癌细胞转染后，在模拟缺氧条件下培养24小时后，取其培养基验证对人的脐带内皮细胞HUVEC血管形成的影响，结果如图9所示。
由图9可以看出，在模拟缺氧条件下经过MMP1.5siHIF转染的PC3细胞培养基上清可以抑制HUVEC细胞在Matrigel上形成血管结构。
将PC3细胞以5×104细胞/孔的密度接种于24孔板中，37℃培养24小时后，用载有或未载有siCDK4的各种载体的溶液处理细胞，每组所用混合胶束纳米颗粒溶液的体积为50μl，处理后孔中液体的总体积均为2ml，各组处理中的载体、载体终浓度、siRNA的类型和终浓度以及N/P值如表9所示，每个处理组设置1个复孔。
转染使用的培养基为含有0.1重量％BSA的DMEM/F12培养基，在其中添加CoCl2，使其终浓度为100μM，模拟缺氧培养条件。
利用Matrigel对96孔板进行铺板，在室温条件下稳定30min以上。将HUVEC细胞种在Matrigel上，种入的密度为1×104cells/孔。加入为上述经过不同处理24小时的PC3细胞培养基，在37℃条件下培养6小时，对Matrigel上HUVEC细胞血管形成进行拍照。在模拟缺氧条件下，由于HIF-1α蛋白被稳定，促进下游VEGF蛋白表达分泌，HUVEC细胞在Matrigel上能够形成明显的网状血管结构。但如果使用混合胶束携载HIF-1αsiRNA转染PC3细胞，由于HIF-1α表达被显著下调，其下游调控的VEGF蛋白分泌也随之减少，与其细胞上清培养的HUVEC细胞血管形成能力明显减弱。在HIF-1αsiRNA浓度为50nM时还能观察到少量的网状结构存在，进一步将siRNA浓度提高到100nM以上时，只能观察到短而断裂的管状结构，说明HUVEC细胞在缺少HIF-1α下游调控的VEGF分泌蛋白的条件下不能形成有效的血管。
(3)混合胶束纳米颗粒传递HIF-1αsiRNA对细胞迁移的抑制作用
检测混合胶束纳米颗粒与HIF-1αsiRNA复合物对前列腺癌细胞转染后，在模拟缺氧条件下培养24小时后，利用划痕修复的方法验证对细胞迁移能力的影响，结果如图10所示。
从图10可以看出：在模拟缺氧条件下经过MMP1.5siHIF转染的PC3细胞，其细胞迁移能力被抑制。
将PC3细胞以5×104细胞/孔的密度接种于24孔板中，37℃培养24小时后，用载有或未载有siCDK4的各种载体的溶液处理细胞，每组所用混合胶束纳米颗粒溶液的体积为50μl，处理后孔中液体的总体积均为2ml，各组处理中的载体、载体终浓度、siRNA的类型和终浓度以及N/P如表10所示，每个处理组设置1个复孔。
表10
在DMEM/F12培养基中添加CoCl2，使其终浓度为100μM，模拟缺氧培养条件。在转染培养24小时后，使用1mL枪头在细胞层上刮出一道伤痕。继续在模拟缺氧条件的培养基中培养12小时和24小时，对细胞的迁移效果进行拍照观察。在模拟缺氧条件下，对照组和阴性对照组中的HIF-1α可以被有效地稳定下来，在HIF-1αsiRNA实验组中由于HIF-1αmRNA被沉默，HIF-1α蛋白含量相对于其它组来说要少，因此不能体现出作为重要的转录调控因子HIF-1α在缺氧条件下促进肿瘤生长的效果，“伤痕”的愈合效果要差得多。
实施例5
本实施例用于说明乙酰半乳糖修饰的混合胶束纳米颗粒用作肝脏siRNA载体沉默肝脏内源性基因的表达。
在实施例2制备的，PCL4400-PEG2000和PCL3300-PPEEA3500摩尔比为1.5，命名为MMP1.5的混合胶束纳米颗粒表面的PEG2000末端分别进行乙酰半乳糖修饰和葡萄糖修饰，命名为GalNAc-MMP1.5和Glu-MMP1.5，进行如下实验。
(1)乙酰半乳糖修饰的混合胶束纳米颗粒和siRNA的核酸制剂在体外水平上具备肝实质细胞靶向性
灌流分离肝实质细胞，以5×104细胞/孔的密度种于24孔板，37℃培养24小时后进行细胞内吞实验。将包载FAM-siRNA的混合胶束GalNAc-MMP1.5和Glu-MMP1.5与肝实质细胞在37℃孵育1h。用PBS清洗两次，用流式细胞仪(FACS，BD Bioscience，Bedford，MA)检测各组细胞中FAM的荧光强度。
竞争性抑制实验中，在加入GalNAc-MMP1.5和Glu-MMP1.5之前，将半乳糖胺(终浓度60mM)与肝实质细胞预结合1小时，其余操作同上。
结果如图11所示，与对照组以及Glu-MMP1.5组相比，GalNAc-MMP1.5实验组细胞中荧光强度最高，说明混合胶束纳米颗粒表面修饰有乙酰半乳糖可以促使颗粒更多的将siRNA带入肝实质细胞中，在非肝细胞系NIH3T3中则不会出现这种差异；培养基中含有60mM半乳糖胺明显抑制GalNAc-MMP1.5进入肝实质细胞量，说明颗粒靶向优势依赖于去唾液酸半乳糖受体介导的特异性内吞。
(2)乙酰半乳糖修饰的混合胶束纳米颗粒和siRNA的核酸制剂在体外水平上具备沉默肝脏内源性基因的能力
载脂蛋白B是肝细胞特异性表达并分泌至细胞外的蛋白，通过沉默该蛋白表达来检测肝靶向混合胶束纳米颗粒和siRNA的核酸制剂沉默基因的能力。
针对ApoB的siRNA以及阴性对照组siRNA均由苏州瑞博公司提供，正义链序列分别为5’-GUfCfAUfCfACACUGAAUACfCfAAUfdTdT-3’(针对ApoB的siRNA，SEQ ID No：13)、5’-UmUCmUCmCGAACGUGmUCmAmCGUdTdT-3’(阴性对照组，SEQ ID No：14)，反义链序列分别为5’-PAUfUfGGUAUUCAGUGUGAUfGACfACdTdT-3’(针对ApoB的siRNA，SEQ ID No：15)、5’-ACmGUfGACfACGUUCfGGAGAAdTdT-3’(阴性对照组，SEQ ID No：16)。
原代肝实质细胞以5×104细胞/孔的密度种于24孔板，37℃培养24小时后，用载有或未载有siCDK4的各种载体的溶液处理细胞，每组所用混合胶束纳米颗粒溶液的体积为50μl，处理后孔中液体的总体积均为2ml，各组处理中的载体、载体终浓度、siRNA的类型和终浓度以及N/P如表11所示，每个处理组设置1个复孔：
表11
在转染培养24小时后，用RNAiso总RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取细胞中的总RNA，再用紫外分光光度计测定提取的RNA样品的OD280和OD260的吸光度，并利用公式I计算RNA样品的浓度，然后用ReverseTranscriptase M-MLV(RNase H-)(TaKaRa)合成第一链cDNA，每个样品使用2μg总RNA。在合成cDNA后，使用RealMasterMix(SYBR Green)进行三步法荧光定量PCR，以作为内参，对cDNA进行均一化。
荧光定量PCR引物：
GADPH：正向引物：5’-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCA-3’(SEQID No：3)
反向引物：5’-TGGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTGA-3’(SEQID No：5)
ApoB：正向引物：5’-TTCCAGCCATGGGCAACTTTACCT-3’(SEQ IDNo：17)
反向引物：5’-TACTGCAGGGCGTCAGTGACAAAT-3’(SEQ IDNo：18)
荧光定量PCR反应：1)94℃加热变性1分钟；2)94℃加热变性15秒；3)59℃加热退火15秒；4)68℃加热延伸1分钟；40个循环。
图12的结果显示从对照组、游离siApoB处理组和GalNAc-MMP1.5siN.C.组细胞内的ApoB表达量很高，而用Lipofectamine 2000处理的细胞内ApoBmRNA表达量有所降低，GalNAc-MMP1.5siApoB细胞中的ApoB mRNA表达量与几个对照组相比有明显的降低，并且比Glu-MMP1.5siApoB组细胞中ApoBmRNA表达量低，说明乙酰半乳糖修饰混合纳米胶束siRNA复合物可以高效特异的沉默肝实质细胞基因表达，具备肝靶向优势。
(3)乙酰半乳糖修饰的混合胶束纳米颗粒和siRNA的核酸制剂在体内水平上具备肝实质细胞靶向性
采用7～8周Balb/c雄性小鼠，按以下方式进行处理：
1)尾静脉注射200μL无菌PBS缓冲溶液(pH＝7.4)；2)尾静脉注射200μL游离Cy5-siRNA等渗溶液，其中Cy5-siRNA作用浓度为2mg/kg；3)尾静脉注射200μL Glu-MMP1.5Cy5-siRNA等渗溶液，其中Cy5-siRNA作用浓度为2mg/kg；4)尾静脉注射200μL GalNAc-MMP1.5Cy5-siRNA等渗溶液，其中Cy5-siRNA作用浓度为2mg/kg。
在12小时后用驱血法处死小鼠，取其各脏器进行荧光观察，肝脏经4重量％多聚甲醛(pH＝7.4)固定后切片，使用激光共聚焦显微镜对肝组织内部荧光分布进行观察。
实验结果见图13A，通过各组小鼠的脑、心、肺、肝、肾脏和脾脏荧光强度比较，游离Cy5-siRNA组和Glu-MMP1.5Cy5-siRNA组Cy5-siRNA几乎全部经肾脏清除，而GalNAc-MMP1.5Cy5-siRNA实验组在肝脏有较多的荧光滞留；之后对肝脏组织进行切片，通过荧光显微镜观察肝脏内部荧光分布，GalNAc-MMP1.5Cy5-siRNA实验组荧光平均分布于肝脏的各种细胞中，而对照组和游离Cy5-siRNA组无法观察到荧光的存在，Glu-MMP1.5Cy5-siRNA组荧光更多的存在于Kupffer细胞中，而非肝实质细胞中，结果见图13B。通过此实验，证实半乳糖修饰的混合胶束纳米颗粒GalNAc-MMP1.5具备很好的肝脏靶向性，具有体内应用的能力。
(4)乙酰半乳糖修饰的混合胶束纳米颗粒和siRNA的核酸制剂在体内水平上具备沉默肝脏内源性基因的能力
通过静脉系统给药沉默肝脏内源性蛋白ApoB表达来观察肝靶向混合纳米胶束和siRNA复合物体内应用的潜力。选用7～8周Balb/c雄性小鼠，每个实验组6只小鼠，各组按以下方式进行处理，隔日给药，共给药5次。
1)尾静脉注射400μL无菌5％葡萄糖缓冲溶液(pH＝7.4)；2)尾静脉注射400μL游离siApoB等渗溶液，其中siApoB剂量为8mg/kg；3)尾静脉高压注射2mL siApoB等渗溶液，其中siApoB作用浓度为40mg/kg，只注射一次，48小时后处死，其余指标检测相同；4)尾静脉注射400μLGalNAc-MMP1.5等渗溶液，其中GalNAc-MMP1.5浓度与5及6组相同；5)尾静脉注射400μL GalNAc-MMP1.5siN.C.等渗溶液，其中siN.C.作用浓度为8mg/kg；6)尾静脉注射400μL GalNAc-MMP1.5siApoB等渗溶液，其中siApoB作用浓度为8mg/kg；7)尾静脉注射400μL Glu-MMP1.5siApoB等渗溶液，其中siApoB作用浓度为8mg/kg。
在最后一次给药后48小时驱血法处死小鼠，取肝脏研磨，使用RNAiso总RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取细胞中的总RNA。通过逆转录和荧光定量PCR的方法检测ApoB的含量(同实施例5中体外水平检测ApoB含量的相关步骤)。
图14显示了给药后各组小鼠肝脏ApoB mRNA表达的变化，阳性对照高压静脉注射组ApoB mRNA表达量明显下调；GalNAc-MMP1.5siApoB实验组ApoB mRNA表达量下调显著，沉默效率高达49.6％，而非靶向纳米颗粒siApoB复合物组则只能下调11.2％，说明靶向修饰纳米胶束可以更高效的将siRNA带入肝实质细胞，行使RNAi作用下调目的基因的表达，是优良的肝脏siRNA输运体系，在未来肝脏疾病治疗中有巨大应用潜能。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (29)

1.一种液体组合物，其特征在于，该液体组合物含有水和胶束纳米颗粒，所述胶束纳米颗粒由第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物共同形成，其中，所述第一嵌段共聚物为聚已内酯-聚乙二醇嵌段共聚物，且所述第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物的摩尔比为0.1-100：1，
其中，所述第二嵌段共聚物由A嵌段和B嵌段组成，所述A嵌段为聚己内酯嵌段，所述B嵌段为聚磷酸酯嵌段，且所述聚磷酸酯嵌段具有式I所示的结构单元，
其中，R1为任选取代的C2-C10的亚烷基，X为卤素；所述第二嵌段共聚物中，A嵌段与B嵌段的重量比为1：0.1-5.3。
2.根据权利要求1所述的液体组合物，其中，所述A嵌段具有式II所示的结构，且所述第二嵌段共聚物为A-B两嵌段共聚物，
其中，R2为任选取代的C1-C10的烷基，m为大于1的整数。
3.根据权利要求1或2所述的液体组合物，其中，所述第二嵌段共聚物中，A嵌段的平均分子量为500-40000。
4.根据权利要求1或2所述的液体组合物，其中，所述第二嵌段共聚物中，聚磷酸酯嵌段的平均分子量为500-10000。
5.根据权利要求1所述的液体组合物，其中，所述第一嵌段共聚物为聚已内酯-聚乙二醇两嵌段共聚物。
6.根据权利要求1或5所述的液体组合物，其中，所述第一嵌段共聚物中，聚己内酯嵌段的平均分子量为200-25000；聚乙二醇嵌段的平均分子量为200-10000。
7.根据权利要求1所述的液体组合物，其中，所述胶束纳米颗粒的颗粒直径为10-250纳米，Zeta电势为10-100mV。
8.根据权利要求1所述的液体组合物，其中，以该液体组合物的体积为基准，所述液体组合物中，第一嵌段共聚物的浓度为1×10-5-5×10-3M；第二嵌段共聚物的浓度1×10-5-5×10-3M。
9.根据权利要求1、5、7和8中任意一项所述的液体组合物，其中，至少部分聚乙二醇嵌段为被靶向性物质修饰的聚乙二醇嵌段，所述靶向性物质为叶酸、糖、具有导向作用的短肽、单克隆抗体和适配子中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的液体组合物，其中，所述糖为乙酰半乳糖。
11.一种液体组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括，将第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物与第二有机溶剂接触，得到第一溶液，在搅拌条件下，将第一溶液与水接触，其中，所述第一嵌段共聚物为聚已内酯-聚乙二醇嵌段共聚物，所述第二嵌段共聚物为权利要求1-4中任意一项所定义的第二嵌段共聚物，且所述第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物的摩尔比为0.1-100：1；所述第二有机溶剂与水互溶。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第一嵌段共聚物为聚已内酯-聚乙二醇两嵌段共聚物。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第一嵌段共聚物中，聚己内酯嵌段的平均分子量为200-25000；聚乙二醇嵌段的平均分子量为200-10000。
14.根据权利要求11所述的方法，其中，以所述水的量为基准，所述液体组合物中，第一嵌段共聚物的加入量为1×10-5-5×10-3M；第二嵌段共聚物的加入量为1×10-5-5×10-3M。
15.根据权利要求11-14中任意一项所述的方法，其中，所述第二有机溶剂为二甲基亚砜、乙腈、C1-C6的醇中的至少一种。
16.根据权利要求11-14中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括，将第一溶液与水接触后得到的溶液进行透析，去除其中的第二有机溶剂。
17.根据权利要求11-14中任意一项所述的方法，其中，至少部分聚乙二醇嵌段为被靶向性物质修饰的聚乙二醇嵌段，所述靶向性物质为叶酸、糖、具有导向作用的短肽、单克隆抗体和适配子中的至少一种。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述糖为乙酰半乳糖。
19.由权利要求11-18中任意一项所述的方法制得的液体组合物。
20.一种核酸制剂，其特征在于，该核酸制剂包括载体和作为活性成分的核酸，所述载体为胶束纳米颗粒，所述胶束纳米颗粒由第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物共同形成，所述第一嵌段共聚物为聚已内酯-聚乙二醇嵌段共聚物，所述第二嵌段共聚物为权利要求1-4中任意一项所定义的第二嵌段共聚物，且所述第一嵌段共聚物和第二嵌段共聚物的摩尔比为0.1-100：1，所述第二嵌段共聚物和核酸的摩尔比为0.1-1000：1。
21.根据权利要求20所述的核酸制剂，其中，所述载体中的氮原子与所述核酸的主链中的磷原子的摩尔比为1-100：1。
22.根据权利要求20所述的核酸制剂，其中，所述胶束纳米颗粒的颗粒直径为10-250纳米，Zeta电势为10-100mV。
23.根据权利要求20所述的核酸制剂，其中，所述第一嵌段共聚物为聚已内酯-聚乙二醇两嵌段共聚物。
24.根据权利要求20所述的核酸制剂，其中，所述第一嵌段共聚物中，聚己内酯嵌段的平均分子量为200-25000；聚乙二醇嵌段的平均分子量为200-10000。
25.根据权利要求20-24中任意一项所述的核酸制剂，其中，至少部分聚乙二醇嵌段为被靶向性物质修饰的聚乙二醇嵌段，所述靶向性物质为叶酸、糖、具有导向作用的短肽、单克隆抗体和适配子中的至少一种。
26.根据权利要求25所述的核酸制剂，其中，所述糖为乙酰半乳糖。
27.根据权利要求20-24和26中任意一项所述的核酸制剂，其中，所述核酸为siRNA、microRNA、shRNA、反义RNA和适配子中的至少一种。
28.权利要求1-10和19中任意一项所述的液体组合物或权利要求20-27中任意一项所述的核酸制剂在制备核酸药物给药系统中的应用。
29.根据权利要求28所述的应用，其中，所述核酸药物能够治疗肺癌、前列腺癌或肝癌。
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