CN109913455A

CN109913455A - 一种能够治疗癌症的小干扰rna

Info

Publication number: CN109913455A
Application number: CN201910210155.0A
Authority: CN
Inventors: 巫满香; 王平
Original assignee: Yichun Lianze Biotechnology Development Co Ltd
Current assignee: Zuo Zhijun
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: CN109913455B

Abstract

本发明提供一种能够治疗癌症的小干扰RNA，该小干扰RNA为针对DD3基因具有改进的抑制效果的修饰的siRNA，能够大幅度的提高针对癌细胞的生殖抑制率，同时也提高了血清学的稳定性，具有极高的应用价值以及应用前景。

Description

一种能够治疗癌症的小干扰RNA

技术领域

本发明涉及一种siRNA及其应用。具体而言，本发明涉及一种抑制DDK3 基因表达的小干扰RNA及其特异性修饰用于延长血清半衰期中的应用。

背景技术

DD3定位于第9号染色体上(9q21-22),全长约25kb,包含3个内含子和4 个外显子。1号内含子较长(20kb)；2号内含子(873bp)和3号内含子(227bp)较短。外显子4由3个亚单位4a、4b和4c所组成。Northernblot分析发现外显子1、 3和4a都存在3种不同的转录产物分别为0.6kb、2kb和4kb,而外显子4c则仅存在于最大的转录产物中,4b出现在两个较大的转录产物中(4kb)。虽然外显子2也是3种转录产物的一部分,但其转录产物有限(5％),而外显子1、3、4a和 4b在克隆中的频率较高(60％)。

DD3开放阅读框架(openreadingframe,ORF)分析显示DD3序列中含有高密度的终止信号,表明DD3是编码的RNA,但其蛋白产物非常少。Grail软件(可检测到人类RNA编码区)分析发现DD3与其他基因不存在同源性,DD3基因中分布着数个小的开放阅读框架,DD3最有可能的ORF位于外显子3和4a。外显子2的交替拼接或使用CTG(或ACG)作为翻译的启动子不能明显加长任何ORF。DD3 被表达为接合和多聚腺苷酸化的RNA分子,表明DD3是一种非编码RNA基因, 而不是一种假基因。DD3是一种非编码RNA基因,而不是一种假基因。

目前DD3基因的第一个作用为在临床检测应用。(1)DD3的前列腺特异性研究Liag等用差异显示PCR分析胚胎细胞在mRNA水平的分子表达,DD3Pca3 mRNA在不同组织细胞中的表达不同,并且在前列腺细胞的不同阶段和状态中的DD3Pca3mRNA表达也有差异。有文献报道用RT-PCR方法,在健康男性和女性供血者血液和前列腺及其他器官的不同的肿瘤及非瘤组织调查了在人类细胞系中D3P基因的表达,发现DD3的唯一前列腺特异区域为外显子4。DD3在正常前列腺中表达水平较低,在其他正常组织、血液或其他肿瘤标本中不表达。 Schalken等报道DD3Pca3对前列腺癌高度特异,在其他人体正常组织如乳腺、膀胱、睾丸、胃肠器官、肌骨胳组织中不表达,在正常前列腺组织中低水平表达, 肾脏组织中有极低水平的表达。这些研究表明DD3Pca3最适合作为前列腺癌特异性标志物。

(2)前列腺组织中DD3Pca3的检测Landers等用实时定量PCR检测前列腺癌组织中的DD3mRNA表达,证实前列腺癌组织中DD3是良性前列腺增生组织的140倍。Thelen等对激光显微解剖分离的前列腺正常组织和癌组织进行cDNA 微阵列分析证实DD3在所有病例的癌组织中均过表达。在Bussemakers等发现前列腺癌DD3mRNA的表达水平与前列腺癌Gleason病理分级相关。(3)尿液和其它标本中DD3Pca3检测Gandini用PCR方法除了对前列腺组织、不同的细胞系、外周血前列腺癌细胞的RNA进行检测外还对前列腺按摩或穿刺后尿液进行了DD3Pca3RNA检测,为了减少样本间RNA提取效率、逆转录及扩增的差异对PCR结果带来的误差,用β-肌动蛋白(β-actin)基因作内参对照,结果发现, 不同分化程度的前列腺癌DD3Pca3mRNA均呈阳性。Tinzl对直肠触诊后脱落进入尿液的前列腺癌细胞进行了DD3检测。用核酸序列分析(uPM3)检测尿标本 DD3RNA和PSAmRNA。在201例病人中,158例(78.6％)尿标本含足量的前列腺细胞,能满足DD3分析,其中62例(39％)发现前列腺。uPM3分析的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为82％、76％、67％和87％,相应的tPSA分析别为98％、5％、40％和83％(参考值2.5ng/ml),uPM3分析DD3远优于tPSA分析的特异性。Hessels等用定量RT-PCR在研究了108例PSA>3ng/ml的非恶性和恶性前列腺疾病患者前列腺按摩后尿沉渣中定量检测DD3转录,同时做前列腺活检组织检查。从血清PSA>3ng/ml的结果108例患者中24例活检组织发现有前列腺癌,在这24例中16例尿沉渣检查DD3阳性,敏感性为67％,阴性预期值 90％。因此定量RT-PCR检测DD3作为一种分子尿液分析的工具具有很大的运用前景。除尿液外也可对临床中前列腺针剌组织或其他体液如精液或前列腺按摩液等标本进行DD3检测。(4)前列腺癌细胞系中DD3Pca3的研究vanBokhoven等观察了21个前列腺癌细胞系,发现8个(4对)与原发性癌相关,9例显示出AR(androgenreceptor,AR)表达。前列腺特异性抗原和DD3在AR表达的细胞系中特别地检测到,这些细胞系由前列腺癌的不同类型和阶段组成,部分地反映了这些恶性变的不同类型的特征。

DD3基因的第二个作用与前列腺癌基因治疗有关。DD3具有高度的前列腺癌特异性,且在DD3阳性的前列腺癌细胞中该启动子具有高活性。理论上通过合适载体把自杀基因送入肿瘤目标细胞,与肿瘤特异性启动子结合,在细胞内装配成适当的转录启动复合物,编码产生酶-前药激活物,进入肿瘤细胞中的前药在激活物作用下活化并具备杀伤肿瘤细胞作用,并最终可能使肿瘤目标细胞死亡。Schalken等认为增强子可以使启动子的表达提高到20倍,这也使DD3为基础的结构域成为未来前列腺癌基因治疗的理想候选对象。未来研究中还需要明确与启动子结合的转录因子、其结合位点、活化和抑制物质以及复合物构型变化等。

在针对DD3进行疾病治疗中，可以针对DD3基因进行敲除。比如 CN104357451A公开一种针对DD3基因的小干扰RNA及其表达载体构建与应用。其正义链序列为SEQ ID NO.1；反义链序列为SEQ ID NO.2；并成功构建了 pGLV3/H1/GFP+Puro Vector-DD3-siRNA真核表达载体。本发明将成功构建的真核表达载体感染LNCaP细胞及RWPE-1细胞，结果显示，DD3基因被干扰后能明显降低LNCaP细胞增殖速率，而对RWPE-1细胞无明显影响；将成功构建的真核表达载体注射到前列腺癌动物实体瘤中，结果显示，DD3基因被干扰后能有效抑制LNCaP细胞实体瘤的增殖。因此，通过siRNA干扰DD3基因在前列腺癌细胞中的表达，从而抑制了癌细胞的增殖。但是该方法抑制效率还有待提高，同时血清学稳定性也不高，仍有大幅提高的空间。

发明内容

本发明的目的在于提供用于抑制DD3基因表达的siRNA、含有所述siRNA 作为药物活性成分的药物组合物、利用所述siRNA或药物组合物抑制DD3基因表达的方法，以及所述siRNA或药物组合物在治疗和/或预防癌症疾病中的应用。即，本发明通过提供以下技术方案得以实现本发明的上述目的。

一方面，本发明提供一种具有双链结构的siRNA，所述双链结构由完全互补的第一单链和第二单链组成。其中，所述siRNA为DD3-137：所述第一单链具有与由SEQ ID NO：11表示的DD3mRNA序列中的靶位点序列相同且由 SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列，第二单链组成为SEQ ID NO：2。

进一步的，所述siRNA为DD3-335：所述第一单链具有与由SEQ ID NO： 11表示的DD3mRNA序列中的靶位点序列相同且由SEQ ID NO：5表示的核苷酸序列，第二单链组成为SEQ ID NO：6。

根据本发明的另一种实施方式，所述寡聚核酸进行如下一种化学修饰：2' 甲氧基(2'-OMe),2/氟代(2'-F)、硫代和2'-脱氧(2’-deoxy)，5'胆固醇(5' -Cholesterol)，溴代(2'-Br)，DNP修饰。然后经冻干处理得到寡聚核酸粉末，用于实施例中的实验。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其中含有所述抑制DD3基因表达的siRNA作为药物活性成分，以及还含有阳离子组分、非阳离子组分和药学上可接受的载体。

根据本发明中的一种实施方式，所述阳离子组分选自N，N-二羟乙基-N- 甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵、(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、 N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵、聚乙烯亚胺、聚β-氨基酯和壳聚糖季铵盐中的至少一种，所述非阳离子组分选自聚乙二醇-聚乳酸两嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物、聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)两嵌段共聚物和聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)三嵌段共聚物中的至少一种，所述药学上可接受的载体选自pH值为4.0-9.0的磷酸盐缓冲液、pH值为7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液、生理盐水或质量百分比浓度为7-15％的蔗糖溶液。

另一方面，本发明提供一种抑制哺乳动物细胞内DD3基因表达的方法，该方法包括向哺乳动物细胞内导入如上所述的siRNA的处置，从而使所述siRNA 能够序列特异性地诱导所述plk1基因表达的抑制。

根据本发明的一种实施方式，所述处置是将所述siRNA直接地进行导入，或以如上所述的含有siRNA的药物组合物的形式进行导入。

另一方面，本发明提供如上所述的siRNA、及药物组合物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。其中，所述肿瘤为DD3基因异常高表达的前列腺癌。

有益效果

本发明提供一组针对DD3基因具有改进的抑制效果的修饰的siRNA，能够大幅度的提高针对癌细胞的生殖抑制率，同时也提高了血清学的稳定性，具有极高的应用价值以及应用前景。

附图说明

图1示出siRNA对细胞抑制效果验证。

具体实施方式

对于本说明书中使用的术语，其定义如下。

术语DD3为Differentialdisplay code 3。本发明中所使用的DD3mRNA序列为SEQID NO：11所示的序列。

术语“mRNA(messenger RNA，信使RNA)”意指作为体内蛋白质翻译的模板将基因的编码信息由DNA传导至蛋白质产物的RNA分子。

术语“RNA干扰(RNA interference)”或“RNAi”指一种存在生物体内的转录后基因表达调控现象，该现象由单链或双链RNA介导的靶mRNA特异性降解而引起。关于RNAi调控机制的细节可参见Biotech.Adv.2008，26(3)：202-等文献的描述。

本发明中，如无特殊说明，术语“小干扰NA”、或“siRNA”意指能够序列特异性地诱导RNAi现象、且由两条长度为15-27个核苷酸的单链RNA组成、及具有部分或完全互补的双链结构的RNA分子。本发明所涉及的siRNA中，互补双链结构的长度可以为17-25个、18-22个、或19-21个碱基对。本发明所涉及的siRNA可以是由两条长度为15-27个核苷酸的单链RNA组成的平末端的双链RNA结构，或也可以是在双链结构的至少一个末端具有由1-3个连续的核苷酸组成的3`突出端的结构。本发明中，作为所述3`突出端，优选由两个连续的脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT、或由两个连续的尿嘧啶核苷酸UU组成。

本发明中，如无特殊说明，术语“第一单链”、或“正义链”是指siRNA两条单链中的一条单链，该单链具有与靶mRNA中的该siRNA作用位点核苷酸序列部分或完全相同的核苷酸序列；术语“第二单链”、或“反义链”则指在siRNA两条单链中的另一条单链，该单链具有与靶mRNA中的该siRNA作用位点核苷酸序列部分或完全互补的核苷酸序列。本发明中提到siRNA的第一单链(或正义链)可与相应的第二单链(或反义链)形成部分或完全互补的双链结构。

术语“互补”意指两条核酸链的碱基根据鸟嘌呤G与胞嘧啶C、腺嘌呤A与尿嘧啶U/胸腺嘧啶T碱基配对原则形成反平行互补配对的情况。

本发明中，如无特殊说明，术语“抑制(suppress/suppressing， inhibit/inhibiting)”意指由于siRNA、或其他小干扰核酸 (small-interfering nucleic acid，siNA)抑制剂介导的mRNA降解而使靶基因表达得以显著下调(down-regulation)的情况。所述“显著下调”指靶基因表达相对于正常或处理前水平下降5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％以上或100％的情况。

术语“系统给药”、或“系统输送”意指将siRNA等药物活性成分输送至体内广泛组织区域的一种给药方式。为了达到系统给药的效果，通常需要药物活性成分、或药物组合物具有较长的血液滞留时间，且不易被肝、肾等主要代谢器官吸收清除。作为siRNA的系统给药方式，可采用静脉注射、皮下注射、腹腔内注射、或口服等方式。本发明中，优选采用静脉注射方式进行siRNA的系统给药。

术语“局部给药”、“局部输送”意指将siRNA等药物活性成分输送至局部组织区域的一种给药方式。例如，可以通过将siRNA等药物活性成分直接注射或涂覆在病变组织区域中来实现siRNA的局部给药。作为适于siRNA等药物活性成分局部给药的组织区域，例如为皮肤、眼部玻璃体腔、肝、肾、肺等器官组织。

本发明中，siRNA的设计是以DD3的mRNA序列为模板，从而得到相应的 siRNA。本发明的siRNA的设计按以下原则进行。

首先，在DD3mRNA的全长序列范围内选取15-27个核苷酸长度的序列。 15-27个核苷酸长度的序列的选取主要参考以下几项原则：1)GC含量在35-60％之间，2)避免处于重复序列或低复杂性序列区域内，3)避免出现4个以上的连续核苷酸序列，4)避免处于包含读码框起始密码和终止密码的50-100个核苷酸序列区域之内。除此之外，还要分析核苷酸序列的组成和热力学性质，确保进入体内后双链容易解链，并避免免疫反应的发生。随后，通过BLAST分析，将候选siRNA的靶位点序列同人类基因组序列进行同一性比对，排除同其它基因具有16个核苷酸长度以上同一性的序列，以确保候选siRNA的靶位点序列不与其他非相关基因的序列之间具有高相似性，从而保证设计的siRNA仅对靶基因DD3具有特异的抑制作用。

本发明中，siRNA的设计包括与plk1mRNA中的靶作用位点相同的第一单链的设计、以及与DD3mRNA中的靶作用位点互补的第二单链的设计。本发明中，siRNA的第二单链(或反义链)与plk1mRNA序列中的靶作用位点序列互补，并通过RNAi机制序列特异性地诱导DD3mRNA的降解，从而对DD3基因表达形成抑制。本发明所设计的第一单链和第二单链彼此完全互补，经退火可形成平末端的，即，不具有3`突出端的双链结构。

本发明的一个实施方式中，在根据上述原则设计的15-27个核苷酸长度的一条RNA单链的3′末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT，互补的另一条RNA 单链同样也做3′末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT的处理。这样，两条互补的RNA单链退火形成双链结构后，在所述双链结构的两端可分别形成由两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT构成的3′突出端。本发明的另一个实施方式中，只在siRNA的一条RNA单链的末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT，由此，两条互补的RNA单链退火形成双链结构后，在所述双链结构的一个末端形成由两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT构成的3′突出端。

本发明的siRNA的一条RNA单链可以通过固相或液相核酸合成方法进行合成，该方法中的技术细节为本领域技术人员所公知，可以直接在生物公司合成获得，在此不再赘述。

除化学合成外，本发明的siRNA也可通过质粒和/或病毒载体的表达而得到。例如，设计一个长度为50-90个核苷酸的DNA序列，并在其两端加上两个不同的限制酶切位点。由所设计的DNA编码的RNA转录产物具有中间一段序列可形成环(loop)结构，经U字折返(U-turn)后的环两端的序列可形成互补配对的双链结构。通过克隆技术将所设计的DNA插入到用相应限制酶酶切过的表达载体中。将表达载体导入至细胞中，由所设计的DNA序列生成的RNA转录产物可被细胞固有的siRNA加工机制加工成成熟的siRNA。由此，即可在细胞中一时或稳定地表达siRNA。

本发明对siRNA进行的化学修饰可以是以下一种或一种以上化学修饰的组合：

1)对RNA链骨架结构中连接核苷酸残基的磷酸二酯键的修饰，

2)对RNA链骨架结构中核糖的修饰，

3)对RNA的核苷酸残基中碱基的修饰。

例如，本发明提到的磷酸基团的修饰是指对磷酸基团中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰(Phosphorthioate)和硼烷化磷酸盐修饰(Boranophosphate)。如下式所示分别用硫和硼烷基置换磷酸基团中的氧，两种修饰都能稳定核酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

在本发明的一个实施方式中，为了促进siRNA的脂溶性，可以在siRNA的正义链的5′或3′末端引入如胆固醇、脂蛋白、维生素E、脂肪链等亲脂性基团，这些亲脂性基团可以通过共价键与siRNA结合。所述亲脂性基团也可通过非共价键与siRNA结合，例如，siRNA通过疏水键或离子键与中性磷脂分子、多肽、多糖等结合。已知在siRNA上通过共价结合或非共价结合引入亲脂性基团可以增加siRNA的体内稳定性、血液代谢特性和生物学活性。在本发明的一个实施方式中，siRNA的第一单链(或正义链)的5′末端和/或3′末端连接有5′-和/或3′ -帽子(5`-and/or 3′-cap)。所述5′-和/或3′-帽子结构可以使siRNA抵御核酸外切酶的攻击，进而提高siRNA的体内稳定性。作为所述5′-和/或3′-帽子，可以列举但不限于甘油、无碱基反向脱氧异核苷(inverted deoxy abasic moiety)、4′， 5′-亚乙基核苷(4′，5′-methylene nucleotide)等。在本发明的一个实施方式中， siRNA的第二单链(或反义链)的5′末端连接有磷酸基团。已知siRNA的反义链的 5′端磷酸基团可以提高siRNA的活性。

本发明中，所述抑制DD3基因表达的siRNA可与协助药物体内输送的载体体系形成药物组合物，并以药物组合物形式在哺乳动物体内施用。所述载体体系包括但不限于阳离子组分、非阳离子组分、以及药学上可接受的载体。本发明中，所述阳离子组分可以是但不限于带正电的多肽或蛋白质、阳离子脂质、带正电的聚合物等。作为所述带正电的多肽或蛋白质，可列举寡聚精氨酸、寡聚赖氨酸、鱼精蛋白等。作为所述阳离子脂质，可以是选自二甲基二(十八烷基) 溴化铵盐(DDAB)、1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷甲基硫酸盐、1，2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵盐(DMRIE)、二油酰氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵(DORIE)、二甲基二(十二烷基)溴化铵、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酰胺盐酸盐、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-O，O’-双-(1H，1H，2H，2H-全氟癸烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、O，O’-二(十二烷酰基)N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化铵、N-{p-(w-三甲基铵基丁基氧基)-苯甲酰基}-二(十二烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、9-(w-三甲基铵基丁基)-3，6-双(十二烷酰基)咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)铵盐酸盐、N-w-三甲基铵基癸酰基 -二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N-{p-(w-三甲基铵基己基氧基)-苯甲酰基}- 二(十四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、p-(w-三甲基铵基癸基氧基)-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-1-0810)、p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-3-0810)、O，O’，O”-三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷澳化物盐(TC-1-12)、1，2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰基- 甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二硬脂酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、N， N-二羟乙基-N-甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(BHEM-Chol)、(2，3- 二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)和N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N， N-三甲基氯化铵中的至少一种阳离子脂质。作为所述带正电的聚合物，可以是选自聚乙烯亚胺、聚β-氨基酯、壳聚糖季铵盐中的至少一种正电性聚合物。本发明中，优选N，N-二羟乙基-N-甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵、 (2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N- 三甲基氯化铵、或聚己内酯-聚(N，N-二甲氨乙基甲基丙烯酸酯)嵌段共聚物类聚β-氨基酯作为阳离子组分。

本发明所述的药物组合物中，所述非阳离子组分可以是但不限于中性的膜融合脂质(fusogenic lipid)、阴离子脂质、两亲性聚合物等。作为所述膜融合脂质，可以列举二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱、反式磷脂酰基乙醇胺、 1，2-双(10，12-二十三烷二酰基)-磷酸乙醇胺、1，2-二反油酰基磷酸乙醇胺、 1，2-二(十六烷基)磷酸乙醇胺、1，2-二己酰基磷酸乙醇胺、1，2-二月桂酰基磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、 1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1，2-二植烷酰磷酸乙醇胺、1，2-二硬脂酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-(10，12-二十三烷二酰基)磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N- 己酰胺、N，N-二甲基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N，N-二甲基-1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1， 2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-乳糖、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐]、二棕榈酰磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酸亚胺甲基)环己烷-羧酸盐]、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酰胺]、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺 -N-[4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸盐]、N-甲基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N- 甲基-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫) 丙酸盐、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸盐]、N-(琥珀酰)-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-(琥珀酰)-1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺等。本发明的药物组合物中，通过含有上述膜融合脂质，能够进一步提高所述药物组合物在哺乳动物体内的转运及输送效率。作为所述两亲性聚合物，可以列举聚乙二醇-聚乳酸两嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物、聚乙二醇- 聚(乳酸-乙醇酸)两嵌段共聚物、或聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)三嵌段共聚物、聚己内酯-聚磷酸酯两嵌段共聚物、聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己内酯两嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己内酯三嵌段共聚物等。其中，在本发明的药物组合物中优选使用二油酰基磷脂酰乙醇胺、或聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作为非阳离子组分。

本发明的药物组合物中，所述药学上可接受的载体可以是pH值为4.0-9.0 的磷酸盐缓冲液、pH值为7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液、生理盐水、或7-15％的蔗糖溶液，其中，优选使用pH值为4.0-9.0的磷酸缓冲液作为本发明的药学上可接受的载体。本发明的药物组合物中还可以含有保护剂和/ 或渗透压调节剂。保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种，渗透压调节剂可以是氯化钠和/或氯化钾。以注射用液体制剂形式的药物组合物为例，所述保护剂的含量可以是0.01-30重量％。对于渗透压调节剂的含量没有特殊限定，只要可保持液体制剂的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克即可。向动物或人类个体施用本发明的液体制剂形式的药物组合物时，其剂量可以为本领域常用的剂量。例如，单次注射的剂量可以是在1-10g/kg体重的范围内。具体使用时，剂量选择可以由各种参数、尤其根据待动物或人类个体的年龄、体重和症状等来确定。

本发明中，以所述siRNA作为活性成分的药物组合物中还可以包含可增强药物组合物的稳定性、维持和增强siRNA的抑制效果、可促进药物组合物的代谢特性及组织靶向性的辅助组分。作为辅助组分，可列举但不限于胆固醇、多肽、蛋白质、多糖、脂肪链、中性磷脂、及聚乙二醇-脂质(PEG-lipid)中的一种或几种。对于这些辅助组分在本发明的药物组合物中的用量没有特别的限制，只要能够增强药物组合物的稳定性、血液代谢性能、靶向输送效果即可。

以下，结合实施例进一步说明本发明。除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基等实验材料均为市售商品。

实施例1：siRNA的设计与合成

首先根据SEQ ID NO：11的的模板，设计了300个siRNA。对于上述经由设计得到的300个siRNA进一步进行优选。最终优选出4个siRNA序列，结果示于表1。siRNA的寡聚核苷酸单链按照本领域公知的方法进行化学合成。合成的寡聚核苷酸的序列示于表1。合成时，在寡聚核苷酸单链的3′末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT。将该siRNA进行修饰，所述修饰也是通过众多修饰筛选获得。具体为委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成下表1中所述的寡核苷酸序列。其中修饰(OMe)代表它左边的核苷酸残基中戊糖集团的2’羟基被甲氧基取代。(F)代表它左边的核苷酸残基中戊糖基团的2’羟基被氟取代。(DNP)代表它左边的核苷酸残基中戊糖基团的2’羟基被DNP取代。(Br)表示左边的尿嘧啶为5’-溴尿嘧啶。

表1 siRNA序列以及取代

实施例2：siRNA血清稳定性的影响的评价

对制备例1中得到的DD3-137,DD3-256,DD3-335,DD3-424,DD3-D, DD3-137(X),DD3-335(X)测定其在血清环境中的稳定性。具体步骤如下。

将10μl上述修饰和未修饰的siRNA(20mmol)分别与50μl胎牛血清(Gibco 胎牛血清(Gibco：16000-044)和40μl PBS混合后，在37℃下孵育0、2、4、8、 24、48和72小时后得到处理样品。处理样品取样10μl进行20％的PAGE凝胶电泳。由上述处理样品的电泳条带光强度与0小时的电泳条带光强度的比值计算降解率，结果如表2所示。表2中列出的降解率为由72小时的电泳条带光强度与0小时的电泳条带光强度的比值算出的降解率。由表2可以看出，在血清环境中，修饰的siRNA的稳定性相比未修饰的siRNA的稳定性明显提高。

表2血清稳定性结果

编号	降解率(100％)
		DD3-137	87.49±8.41
DD3-256	81.66±15.12
		DD3-335	90.12±7.49
DD3-424	74.54±6.42
		DD3-D	87.56±10.25
DD3-137(X)	3.45±1.03
		DD3-335(X)	4.58±0.79

实施例3siRNA对细胞抑制效果验证

LNCaP clone FGC(人前列腺癌细胞)货号：CL-0143，购买自武汉普诺赛生命科技有限公司。按照说明书进行细胞培养，培养得到细胞密度为1X 105个/mL。以人正常前列腺上皮细胞RWPE-1(货号：CL-0200)为对照细胞，按照说明书进行细胞培养，培养得到细胞密度为1X 105个/mL

每孔1X 10⁴个细胞接种96孔板，分别感染siRNA、NC阴性对照及设立空白对照组(control)，然后继续培养约24小时、48小时、72小时，每孔加50μl 1 ×MTT溶液，置入解箱解育箱4h，使MTT还原。吸出上清液，每孔加150μL DMSO，用平板摇床摇匀。用酶标仪在490nm处测每孔的光密度，进而计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率(％)＝[(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组0D值]X 100％。

siRNA感染细胞(24、48、72小时)后，能有效抑制LNCaP细胞增殖，其中 DD3-335(X)在72h具有最大的增殖抑制率，达到了95.63±3.20％，其次是 DD3-137(X)在72h具有增殖抑制率为90.12±1.72％，而没有修饰的DD3-335 在72h的增殖抑制率达到了84.31±3.23％，而没有修饰的DD3-137在72h的增殖抑制率达到了78.46±4.66％。而对人正常前列腺上皮细胞RWPE-1作用与NC 阴性对照以及空白对照组相似，作用不明显(见图1)。从以上结果可以看出，通过针对DD3-137和DD3-335特异性修饰，可以显著的提高细胞的增殖抑制率，具有较好的抑制效果。

实施例4：通过尾静脉注射给药siRNA药物组合物时对于宫颈癌细胞生长的抑制

(siRNA药物组合物的制备)

采用聚己内酯-聚(N，N-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯)嵌段共聚物 (PCL-PDMAEMA)、聚乙二醇嵌段修饰有叶酸的聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(folaUe-PEG-PGA)制备siRNA药物组合物。其中，PCL-PDMAEMA为聚β-氨基酯类两亲性阳离子聚合物，PEG-PGA为辅助性的聚合物。siRNA药物组合物的制备步骤参考了Huang YY.，eU al.BiomaUerials.2012，(18)：4653-中的方法。即，20μl siRNA脱离子水溶液(含约1μgsiRNA)与50μl PCL₅₀₀₀-PDMAEMA₂₀₀₀的 PBS溶液混合，室温静置20分钟后，再加入50μlfolaUe-PEG₅₀₀₀-PGA₄₆₀₀₀的水溶液充分混合，室温孵育20分钟，之后用PBS调整体系即得到所需的药物组合物。其中，PCL₅₀₀₀-PDMAEMA₂₀₀₀的氮(N)、siRNA的磷(P)、PEG₅₀₀₀-PGA₄₆₀₀₀的碳(C) 的摩尔比为5∶1∶8。

(siRNA药物组合物尾静脉注射给药对于前列腺癌细胞生长的抑制)

在BALB/c裸鼠右腋皮下接种LNCaP(5×10⁶个细胞)，10天左右后形成可见肿瘤，肿瘤体积平均约为60mm³。将裸鼠随机分成10组，每组为10只裸鼠，分别通过尾静脉注射进行给药。给药剂量以有效siRNA的量计算为2mg/kg(约 40μg siRNA/每只小鼠)，每三天给药一次，共给药7次。作为阴性对照组，通过尾静脉注射200μl空白PBS溶液(阴性对照组1)。作为处理组，通过尾静脉注射通过上述步骤制备的、含40μg siRNA药物组合物的PBS溶液200μl。注射结束后，对肿瘤大小进行测量，得到肿瘤生长数据。肿瘤的大小按以下公式计算：V＝0.5×a×b²，其中，a指肿瘤长径，b指肿瘤短径。由表3可以看出，与阴性对照组相比，通过尾静脉注射系统给药的药物组合物可以有效促进前列腺癌细胞凋亡，并抑制肿瘤组织生长。

表3肿瘤体积

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有双链结构的siRNA，所述双链结构由完全互补的第一单链和第二单链组成，其中，

所述第一和第二链分别如SEQ ID NO：1和2、或SEQ ID NO：3和4、或SEQ ID NO：5和6、或SEQ ID NO：7和8、或SEQ ID NO：9和10、或SEQ ID NO：11和12、或SEQ ID NO：13和14中任一所示。

2.一种药物组合物，其中，含有权利要求1中所述的siRNA作为药物活性成分，以及还含有阳离子组分、非阳离子组分和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，所述阳离子组分选自N，N-二羟乙基-N-甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵、(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵、聚乙烯亚胺、聚β-氨基酯和壳聚糖季铵盐中的至少一种，所述非阳离子组分选自聚乙二醇-聚乳酸两嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物、聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)两嵌段共聚物和聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)三嵌段共聚物中的至少一种，所述药学上可接受的载体选自pH值为4.0-9.0的磷酸盐缓冲液、pH值为7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液、生理盐水或质量百分比浓度为7-15％的蔗糖溶液。

4.一种抑制哺乳动物细胞内DD3基因表达的方法，该方法包括向哺乳动物细胞内导入权利要求1中所述的siRNA，从而使所述siRNA能够序列特异性地诱导所述DD3基因表达的抑制。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述导入的方式包括将所述siRNA直接地进行导入，或以权利要求2或3所述的药物组合物的形式进行导入。

6.权利要求1-3中任意一项所述的siRNA或药物组合物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述肿瘤为DD31基因异常高表达的前列腺癌。