KR101836877B1 - 국소 투여용 리포플렉스의 신규 제조 방법 및 상기 리포플렉스를 사용하는 항 종양제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 세포에 활성 성분을 효율적으로 전달하는 것이 가능한 새로운 전달 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.
디올레일 포스파티딜 에탄올 아민(DOPE), 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질, 그리고 RNAi 분자를 포함하는 리포플렉스 및 이의 공업적 제조 방법.
디올레일 포스파티딜 에탄올 아민(DOPE), 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질, 그리고 RNAi 분자를 포함하는 리포플렉스 및 이의 공업적 제조 방법.
Description
본 발명은 국소 투여용 리포플렉스의 신규 제조 방법 및 상기 리포플렉스를 사용하는 항 종양제에 관한 것이다.
리포솜은, 생체의 세포막을 구성하는 인지질로 구성되어 생체 적합성이 높고, 또한 생체 내에서 약물과 활성 성분을 분해 효소 등으로부터 보호하면서 운반할 수 있으며, 약물 전달 시스템의 유용한 도구로 주목 받고있다.
한편, RNA 간섭(이하, 「RNAi」라고 기재한다)을 일으키는 RNAi 분자는, 종양 등을 치료하기 위한 유용한 도구로 주목받고 있으며, 종양의 증식을 억제할 수 있는 다양한 RNAi 분자가 개발되고 있다. 또한, RNAi 분자 및 지질 혼합물로 이루어진 복합체(리포플렉스)를 이용하여, 활성 성분인 RNAi 분자를 종양세포에 전달하는 방법이 개발되어있다(비특허문헌 1-3).
본 발명자들은 지금까지 종양의 증식에 관여하는 티미딜산(thymidylic acid) 합성 효소(이하, 「TS」라고 기재한다)를 표적으로 하는 RNAi 분자를 개발(특허문헌 1), 해당 RNAi 분자를 소정의 비율로 이루어진 양이온성 지질 혼합물에 탑재한 복합체(리포플렉스)를 이용하여, 예를 들어, 정맥 내 투여하여 종양에 송달함으로써 TS를 발현하는 종양의 증식을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 해당 리포플렉스를 화학 요법제와 병용하여 종양에 타겟팅 효율을 높이고, RNAi 분자에 의한 항 종양 효과를 현저하게 향상시킬 수 있음을 보고 하였다(특허문헌 2).
[비특허문헌 1] Qixin Leng et al. , Drug Future. 2009 September; 34(9): 721.
[비특허문헌 2] Sherry Y. Wu et al. , The AAPS Journal, Vol. 11, No. 4, December 2009.
[비특허문헌 3] B. Ozpolat et al. , Journal of Internal Medicine 267; 44-53 2009.
기존의 리포플렉스의 제조에 있어서, 지질 혼합물의 제조 방법은 구성 성분 인 인지질 등을 클로로포름과 시클로헥산 등의 유기 용매에 미리 용해하는 단계를 포함하는 것이었다. 그러나, 클로로포름 및 시클로헥산 등의 유기 용매를 이용하는 공업적인 제조 방법에 있어서는 위험물 취급 시설과 방폭 장비 등의 대규모 설비가 필요하다. 또한 기존 리포플렉스의 제조시에는 병원 약제 부서에 있는 암 환자에게 투약 전에 RNAi 분자의 수용액을 조제하고, 별도로 지질 혼합물을 제조한 후, 양자를 혼합하는 복잡한 공정을 필요로하며, 많은 노력이 필요했다.
따라서, 본 발명은 많은 양의 클로로포름과 시클로헥산 등의 유기 용매를 사용하여, 또한 동결 건조 후 생성된 지질 혼합물을 물 등의 용매 중에 분산하고 RNAi 분자의 수용액 등과 혼합하는 등 번잡한 리포플렉스 제조 공정을 필요로 하지 않고, 물 등의 용매에 현탁시키는 것만으로 쉽게 리포플렉스를 생성하는 분체(粉體)를 단번에 제조하는 리포플렉스의 공업적 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 병원 약제 부분에 있어서 복잡하고 많은 노력을 필요로하는 리포플렉스의 조제 공정을 해소하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 디오 레일 포스파티딜 에탄올 아민(Dioleylphosphatidylethanolamine; DOPE), 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine) 및 양이온성 지질을 생체 허용성이 높고, 폭발성이 없는 알코올에 용해하여, 상기 알코올 용액을 교반하면서 RNAi 분자의 용액에 적하한 후, 상기 용액을 동결 건조하여 알코올 등의 용매를 제거하여 리포플렉스의 동결건조물을 제조할 수 있었다. 그리고 상기 방법에 의해 얻어진 리포플렉스의 동결건조물을 완충액 중에 혼합하여 암을 발병하는 표적 장기의 국소 투여를 시행함으로써, 상기 암 환자의 치료가 효과적임을 발견했다. 본 발명은 이러한 결과에 근거한다.
본 발명은, 다음과 같다.
[1] 디올레일 포스파티딜 에탄올 아민(Dioleylphosphatidylethanolamine; DOPE), 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine) 및 양이온성 지질, 및 RNAi 분자를 포함하는 리포플렉스(LIPOPLEX)의 제조 방법으로서,
(a) 디올레일 포스파티딜 에탄올 아민(DOPE), 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질을 알코올에 용해하는 공정,
(b) RNAi 분자를 용해한 용액에, 교반 하에서, (a)에서 얻은 알코올 용액을 적하하는 공정, 및
(c)(b)에서 얻어진 용액을 동결 건조하는 공정,
을 포함하고, 상기 포스파티딜콜린이 하기(i) 내지(iii)에서 선택되는 하나 이상의 특징을 가지는 상기 방법:
(i) 탄소-탄소 간 이중 결합을 포함하는 불포화 지방쇄를 적어도 하나 포함;
(ii) 시스형의 탄소-탄소 간 이중 결합을 포함하는 불포화 지방쇄를 적어도 하나 포함;
(iii) 상전이 온도(Phase shift temperature)가 0℃ 미만.
[2] 양이온성 지질이 O, O'-디테트라 데카노일-N-(α-트리메틸 암모니오아세틸) 디 에탄올아민 클로라이드(DC-6-14)[O, O'-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl) diethanolamine chloride(DC-6-14)]인, 상기 [1]의 방법.
[3] 포스파티딜콜린이 1,2-디올레오일-sn- 글리세로-3-포스포콜린[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)], 팔미토일 올레오일포스파티딜콜린[Palmitoyl Oleoylphosphatidylcholine(POPC)] 또는 1,2- 디에코세노일-sn-글리세로-3-포스포코린[1,2-diecosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DEPC)]인, 상기 [1] 또는 [2]의 방법.
[4] 포스파티딜콜린이 DOPC인, 상기 [3]의 방법.
[5] 공정(a)에서 DOPE, DOPC 및 DC-6-14를 알코올에 용해하여 혼합하는 것을 포함하는 것인, 상기 [1]의 방법.
[6](d) (c)에서 얻어진 동결 건조물을 완충액에 혼합하는 공정을 더 포함하는 것인, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 방법.
[7] 디올레일 포스파티딜 에탄올 아민(DOPE), 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질로 구성되며, 상기 포스파티딜콜린이 하기(i) 내지(iii)에서 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 지질 혼합물:
(i) 탄소-탄소 간 이중 결합을 포함하는 불포화 지방쇄를 적어도 하나 포함;
(ii) 시스형 탄소-탄소 간 이중 결합을 포함하는 불포화 지방쇄를 적어도 하나 포함;
(iii) 상전이 온도가 0℃ 미만, 및
RNAi 작용에 의해 티미딜산 합성 효소의 발현을 억제할 수 있는 짧은 헤어핀 RNA(TS-shRNA)를 포함하는 위암, 난소암 및 췌장암의 복막 파종 전이를 치료하기 위한 국소 투여용 의약조성물.
[8] 양이온성 지질이 O, O'- 디테트라 데카노일-N-(α-트리메틸 암모니오아세틸) 디 에탄올아민 클로라이드(DC-6-14)인, 상기 [7]의 의약조성물.
[9] 포스파티딜콜린이 DOPC인, 상기 [7]의 의약조성물.
[10] 지질 혼합물이 DOPE, DOPC 및 DC-6-14로 이루어진, 상기 [7]의 의약조성물.
[11] DOPE, DOPC 및 DC-6-14이 3:2:5의 몰비로 포함하는, 상기 [10]의 의약조성물.
[12] shRNA가 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 이루어진, 상기 [7] 내지 [11] 중 어느 하나의 의약조성물.
[13] 암 화학요법제와 병용되는, 상기 [7] 내지 [12] 중 어느 하나의 의약조성물.
[14] [7] 내지 [13] 중 어느 하나의 의약조성물, 및 암 화학요법제(cancer chemotherapeutic agent)를 포함하는 조합물(combined product).
[15] 암 화학요법이 미세소관(microtubules)의 탈중합 저해 작용을 갖는 항 종양제, 디옥시사이티딘(deoxycytidine) 유도체 및 TS 저해 작용을 갖는 항 종양제 이루어진 군에서 선택되는, 상기 [14]의 조합물.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본특허 출원번호 2014-221062호의 개시내용을 포함한다.
본 발명에 의하면, 대량의 클로로포름과 시클로헥산 등의 유기 용매를 사용하여, 또한 동결 건조 후 생성된 지질 혼합물을 물 등의 용매 중에 분산하고, RNAi 분자의 수용액 등과 혼합하는 것과 같은 번잡한 리포플렉스 제조 공정을 필요로 하지 않고, 물 등의 용매에 현탁시키는 것만으로 쉽게 리포플렉스를 생성하는 분체(粉體)를 단번에 제조하는 리포플렉스의 공업적 제조 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 병원 약 제조 부분에 있어서 복잡하고 많은 노력을 필요로 하는 리포플렉스 조제 공정을 해소할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 얻어진 리포플렉스에 따르면 종양의 증식을 억제할 수 있는 RNAi 분자 종양 세포에 효율적으로 송달할 수 있다.
[도 1] 도 1은 종래 공지의 방법으로 얻은 DOPC, DOPE 및 DC-6-14로 이루어진 지질 혼합물을 유기 용매[헥산/에탄올(95/5(V/V))]에 용해 후 얻어진 용액을 동결 건조하여 얻은 건조물을 물에 분산시켜 제조한 용액에 RNAi 분자의 수용액을 혼합하여 제조한 제제(기존 제제), 및 본 발명의 방법에 의해 얻은, DOPC, DOPE 및 DC-6-14로 이루어진 지질 혼합물을 유기 용매[헥산/에탄올(95/5(V/V))]에 용해하여 얻은 용액을 동결 건조하여 얻은 건조물을, 에탄올에 균일 용해시켜 제조한 용액을 RNAi 분자의 균일 수용액 중에 교반 하에 적하하고 얻어진 용액을 동결 건조하여 얻은 건조물을 물에 분산시켜 제작한 제제(신규제제(1)), 그리고 DOPC, DOPE 및 DC-6-14 각각의 지질을 에탄올에 균일 용해시켜 균일 용액을 RNAi 분자의 균일 수용액 중에 교반 하에서 적하한 물/에탄올 용액을 동결 건조하여 얻은 건조물을 물에 분산시켜 제조한 제제(신규제제(2))의 물성(입자 지름, 다 분산 지수 및 제타 전위)의 비교 결과를 나타내는 표이다.
[도 2] 도 2는 종래 공지의 방법으로 얻은 기존 제제와 본 발명의 방법에 의해 얻어진 신규제제(1) 및 신규제제(2)와의, TS-shRNA 유지 기능 비교 결과를 나타내는 사진도이다.
[도 3] 도 3은 종래 공지의 방법으로 얻은 기존 제제와 본 발명의 방법에 의해 얻어진 신규제제(1) 및 신규제제(2)과의, 위암의 복막 파종 전이 모델 마우스에 복강 내 투여에 의한 종양 표적 유전자(TS의 mRNA)의 억제 효과를 실시간 RT-PCR 법에 의해 비교 검토한 결과를 나타내는 그래프도이다.
* : P <0.05, ** : P <0.01.
[도 4] 도 4는 위암의 복막 파종 전이 모델 마우스의 복강 내에 기존 제제, 신규제제(1) 및 신규제제(2)를 각각 투여한 군과 대조군의 루시퍼라아제 활성(즉, 종양의 증식 억제 효과)을 정량화한 그래프도이다.
*** : P <0.005
[도 5-1] 도 5-1은 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))의 단독 투여, 파클리탁셀(Paclitaxel) 단독 투여, 및 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2 )) 및 파클리탁셀과의 병용 투여에 의한 난소암의 복막 파종 전이 모델 마우스에 대한 종양 증식 억제 효과의 IVIS 의한 분석 결과를 나타내는 사진도이다.
[도 5-2] 도 5-2는 도 5-1의 영상 데이터에 따라 복강에서 종양의 증식을 정량화한 결과를 나타내는 그래프도이다.
[도 5-3] 도 5-3은 도 5-2에 표시된 결과를 대수 그래프로 나타냈다.
[도 5-4] 도 5-4는 도 5-1에 나타난 동물 실험에 있어서, 대조군, TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2)) 단독 투여군, 파클리탁셀 단독 투여군, 및 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))와의 병용 투여군 사이에서 연명 효과를 나타낸 그래프도이다.
[도 5-5] 도 5-5는 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))를 난소암의 복막 파종 전이 모델 마우스에 복강 내 투여한 후, TS-shRNA의 복수 및 혈중의 농도 추이를 RT-PCR 법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프도이다.
[도 6-1] TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))의 단독 투여, 파클리탁셀 단독 투여, 및 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2)) 및 파클리탁셀과의 병용 투여한 췌장암의 복막 파종 전이 모델 마우스에서 종양의 성장을 IVIS 의한 영상 데이터에 기초하여 정량화한 결과를 나타내는 그래프도이다.
[도 6-2] 도 6-2는 도 6-1에 표시된 결과를 대수 그래프로 나타냈다.
[도 6-3] 도 6-3은 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))의 단독 투여, 파클리탁셀 단독 투여, 및 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2)) 및 파클리탁셀과의 병용 투여에 의한 췌장암의 복막 파종 전이 모델 마우스의 사이에서 연명 효과를 나타낸 그래프도이다.
[도 2] 도 2는 종래 공지의 방법으로 얻은 기존 제제와 본 발명의 방법에 의해 얻어진 신규제제(1) 및 신규제제(2)와의, TS-shRNA 유지 기능 비교 결과를 나타내는 사진도이다.
[도 3] 도 3은 종래 공지의 방법으로 얻은 기존 제제와 본 발명의 방법에 의해 얻어진 신규제제(1) 및 신규제제(2)과의, 위암의 복막 파종 전이 모델 마우스에 복강 내 투여에 의한 종양 표적 유전자(TS의 mRNA)의 억제 효과를 실시간 RT-PCR 법에 의해 비교 검토한 결과를 나타내는 그래프도이다.
* : P <0.05, ** : P <0.01.
[도 4] 도 4는 위암의 복막 파종 전이 모델 마우스의 복강 내에 기존 제제, 신규제제(1) 및 신규제제(2)를 각각 투여한 군과 대조군의 루시퍼라아제 활성(즉, 종양의 증식 억제 효과)을 정량화한 그래프도이다.
*** : P <0.005
[도 5-1] 도 5-1은 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))의 단독 투여, 파클리탁셀(Paclitaxel) 단독 투여, 및 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2 )) 및 파클리탁셀과의 병용 투여에 의한 난소암의 복막 파종 전이 모델 마우스에 대한 종양 증식 억제 효과의 IVIS 의한 분석 결과를 나타내는 사진도이다.
[도 5-2] 도 5-2는 도 5-1의 영상 데이터에 따라 복강에서 종양의 증식을 정량화한 결과를 나타내는 그래프도이다.
[도 5-3] 도 5-3은 도 5-2에 표시된 결과를 대수 그래프로 나타냈다.
[도 5-4] 도 5-4는 도 5-1에 나타난 동물 실험에 있어서, 대조군, TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2)) 단독 투여군, 파클리탁셀 단독 투여군, 및 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))와의 병용 투여군 사이에서 연명 효과를 나타낸 그래프도이다.
[도 5-5] 도 5-5는 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))를 난소암의 복막 파종 전이 모델 마우스에 복강 내 투여한 후, TS-shRNA의 복수 및 혈중의 농도 추이를 RT-PCR 법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프도이다.
[도 6-1] TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))의 단독 투여, 파클리탁셀 단독 투여, 및 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2)) 및 파클리탁셀과의 병용 투여한 췌장암의 복막 파종 전이 모델 마우스에서 종양의 성장을 IVIS 의한 영상 데이터에 기초하여 정량화한 결과를 나타내는 그래프도이다.
[도 6-2] 도 6-2는 도 6-1에 표시된 결과를 대수 그래프로 나타냈다.
[도 6-3] 도 6-3은 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))의 단독 투여, 파클리탁셀 단독 투여, 및 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2)) 및 파클리탁셀과의 병용 투여에 의한 췌장암의 복막 파종 전이 모델 마우스의 사이에서 연명 효과를 나타낸 그래프도이다.
본 발명의 리포플렉스는 디올레일 포스파티딜 에탄올 아민(DOPE), 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질로 이루어진 지질 혼합물 및 RNAi 분자를 포함하거나 이들로 이루어진 복합체이다.
본 발명에서 사용할 수 있는 '포스파티딜콜린'은 다음(i) -(iii)에서 선택되는 하나 이상의 특징이 있다:
(i) 탄소-탄소 간 이중 결합을 포함하는 불포화 지방쇄를 적어도 하나 포함;
(ii) 시스형 탄소-탄소 간 이중 결합을 포함하는 불포화 지방쇄를 적어도 하나 포함;
(iii) 상전이 온도가 낮음(예를 들면, 0℃ 미만, -10℃ 미만, -20℃ 이하).
이러한 '포스파티딜콜린'으로는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포코린 [1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)], 팔미토일 올레오일 포스파티딜콜린 [Palmitoyl Oleoylphosphatidylcholine(POPC)], 1,2-디에코세노일-sn-글리세로-3-포스포코린 [1,2-diecosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DEPC)]이 꼽힌다. 바람직하게는 DOPC이다.
본 발명에서 사용 가능한 '양이온성 지질'로는 O, O'- 디 테트라 데카노일-N-(α-트리메틸 암모니오 아세틸) 디 에탄올 아민 클로라이드 [O, O'-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl) diethanolamine chloride(DC-6-14)], N, N-디올레일-N, N-디메틸 암모늄 클로라이드 [N, N-dioleyl-N, N-dimethylammonium chloride(DODAC)], N, N- 디스테아릴-N, N- 디메틸 암모늄 브로마이드 [N, N-distearyl-N, N-dimethylammonium bromide(DDAB)], N-(1-(2,3-디올레오일옥시) 프로필)-N, N, N-트리메틸 암모늄 클로라이드 [N-(1-(2,3-dioleoyloxy) propyl)-N, N, N-trimethylammonium chloride(DOTAP)], N-(1-(2,3-디올레일옥시) 프로필)-N, N, N-트리메틸 암모늄 클로라이드 [N-(1-(2,3-dioleyloxy) propyl)-N, N, N-trimethylammonium chloride(DOTMA)], N, N-디메틸-(2,3-디올레일옥시) 프로필 아민 [N, N-dimethyl-(2,3-dioleyloxy) propylamine(DODMA)] 및 이들의 유도체에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다. 바람직하게는 양이온성 지질은 DC-6-14이다.
바람직하게는 본 발명의 리포플렉스는 DOPE, DOPC 및 DC-6-14로 이루어진 지질 혼합물을 포함한다.
리포플렉스의 DOPE, 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질의 함유 비율(몰비)은 DOPE : 포스파티딜콜린 : 양이온성 지질 = 2 ~ 4 : 1 ~ 3 : 4 ~ 6의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 바람작하게는 DOPE : DOPC : DC-6-14 = 3 : 2 : 5이다.
본 발명의 리포플렉스는 입자 크기가 200 nm ~ 2000 nm, 바람직하게는 약 400 nm ~ 700 nm이다. 또한, 본 발명의 리포플렉스의 제타 전위는 30 ~ 60 mV, 바람직하게는 약 30 ~ 40 mV이다.
본 발명의 리포플렉스는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
즉, 포스파티딜 에탄올 아민, 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질의 혼합물의 동결 건조물 혹은 각각의 성분을 알코올에 용해한다.
알코올로는 에탄올, 메탄올을 이용할 수 있으며, 특히 바람직하게는 생체 허용성이 높은 에탄올이다. 포스파티딜 에탄올 아민, 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질은 어떤 형태의 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 각 분말 형태의 것을 사용할 수있다.
포스파티딜 에탄올 아민, 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질은 각각 미리 별도로 알코올에 녹인 후, 상기 소정량이 되도록 각각 분취하여 혼합하여도 좋고, 또는 상기 소정량이되는 포스파티딜 에탄올 아민, 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질로 이루어진 지질 혼합물의 동결 건조물을 알코올에 용해할 수 있다.
포스파티딜 에탄올 아민, 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질 알코올을 포함한 알코올 혼합액에는 포스파티딜 에탄올 아민, 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질을 각각 독립적으로 1 ~ 100 mM, 바람직하게는 10 ~ 80 mM로 포함할 수 있다.
포스파티딜 에탄올 아민, 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질 알코올에 용해하는 것은 가열하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 35℃ ~ 60℃, 바람직하게는 40℃ ~ 50℃로 가열할 수 있다.
이어서, 얻어진 알코올 용액을 RNAi 분자를 용해한 용액(예: 물에 용해된 수용액)에 교반하에 적하하고, 얻어진 용액을 동결 건조하여 리포플렉스의 동결 건조물을 얻을 수 있다. 알코올 용액 및 RNAi 분자를 용해한 용액은 1 ~ 3 : 7 ~ 9의 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.
얻어진 동결 건조물은 또한 완충액 등의 수용액을 넣고 혼합하여 리포플렉스 현탁액을 얻을 수 있으며, 이를 생체에 투여할 수 있다. 완충액으로는 생체에 투여 가능한 수용액이면 가능하고, 예를 들면, 생리 식염수나 당질 수액 등을 이용할 수 있다. 혼합은 1 ~ 15 분, 바람직하게는 5 분 정도, 볼텍스 믹서 등으로 교반하는 것이 바람직하다. 해당 교반을 추가하여 리포플렉스의 입자를 상기 원하는 크기로 제조할 수 있다.
본 발명의 리포플렉스의 제조 방법은 독성이 높고, 폭발성 높은 클로로포름 또는 시클로헥산을 사용할 필요가 없기 때문에 방폭용의 중장기 설비를 상기 제제의 제조 공장 내에 구비할 필요가 없고, 또한 극소량의 잔류 용매가 있어도 생체 허용성이 높은 에탄올 뿐이며 환자에게 투여에의 문제가 적다.
또한, 본 발명에 따르면 병원의 조제 부문 등의 의료 현장에서 간편하게 리포플렉스를 제조하는 것이 가능하다. 즉, 상기 리포플렉스의 동결 건조물을 충전한 주사제용 유리병 등을 의료 현장에 제공함으로써 환자에게 투약 전에 병원 조제 부문에서 이에 완충액을 추가하기만 하면 리포플렉스를 포함하는 투여액(물 분산용액)을 사용시 조제할 수 있다.
본 발명의 리포플렉스는 환자에게 국소 투여하기 위해 이용할 수 있다. 본 발명에서 ‘국소 투여’는 정맥 주사 등의 전신 투여를 의도하는 것은 아니다. 국소 투여는 예를 들어, 복강, 흉강, 근육 내, 피하, 피 내, 눈 내, 뇌 내, 뇌 척추 강내, 질 내, 직장 내, 장기 내, 표피에 도포 등을 들 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 ‘국소 투여’는 강 내 투여이며, 더욱 바람직하게는 흉강 내 투여 또는 복강 내 투여이다.
본 발명의 리포플렉스는, 활성 성분으로 종양 세포에서 발현하고 종양 세포의 증식에 관여하는 인자를 코딩하는 유전자의 발현을 RNAi 작용에 의해 억제할 수 있는 RNAi 분자(siRNA 또는 shRNA 등)를 포함한다. ‘종양 세포에서 발현하고 종양 세포의 증식에 관여하는 인자를 코딩하는 유전자’로는, 예를 들어 티미딜산 합성 효소, VEGF, EGFR, PDGF, HGF, Wint, Bcl-2, 사바이빈(Survivin) 등의 증식 조절인자군, 리보뉴클레오티드 환원 효소, DNA 중합 효소 등의 핵산 합성 관련 효소군 등을 코드하는 유전자를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 유전자의 유전자 정보는 GenBank 등의 공지의 데이터베이스에 개시되어 있으며, 이러한 유전자 정보에 따라 siRNA 또는 shRNA를 설계 및 합성할 수 있다. 티미딜산 합성 효소의 발현을 RNAi 작용에 의해 억제할 수 있는 shRNA 대해서는 아래에 설명되는 것을 사용할 수 있다. 또한 활성 성분으로 암 화학요법제를 사용할 수도 있다.
본 발명의 리포플렉스에서 RNAi 분자는 지질 혼합물의 지질 이중막으로 둘러싸인 중공부에 포함할 수도 있고, 혹은 지질 이중막의 외막 표면에 결합시킬 수 있으나, 바람직하게는 지질 이중막의 외막 표면에 결합되어 있다. RNAi 분자의 지질 이중막의 외막 표면에 결합은 상기 제조 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 리포플렉스는 항 종양제로서 이용할 수 있다.
한 구체 예에서, 본 발명의 리포플렉스는 RNAi 작용에 의해 티미딜산 합성 효소(이하, 「TS」라고 기재한다)의 발현을 억제할 수 있는 shRNA를 포함한다.
본 발명에서 TS의 발현을 억제할 수 있는 shRNA는 TS의 mRNA를 표적으로 하여 TS 특이적으로 RNAi 작용을 세워, TS의 발현을 현저하게 억제할 수 있다. 여기에서 'mRNA를 표적으로한다'라는 것은 아래에 설명하는 shRNA의 안티센스 가닥이 표적 mRNA와 스트린전트 조건(Stringent conditions) 하에서 혼성화(Hybridizing)할 수 있는 것을 말한다.
스트린전트 조건은 통상적인 방법에 따라 하이브리드를 형성하는 핵산의 융해 온도(Tm)에 따라 구할 수 있다. 예를 들어, 혼성 상태를 유지할 수 세정 조건으로 보통 '1 × SSC, 0.1% SDS, 37℃' 정도의 조건, 보다 엄격하게는 '0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42℃' 정도의 조건, 더욱 엄격하게는 '0.1 × SSC, 0.1% SDS, 65℃' 정도의 조건이 있다.
본 발명의 shRNA는 TS를 코딩하는 ORF의 염기서열 또는 그 일부에 동일한 염기서열을 갖는 센스 가닥과 해당 센스 가닥과 스트린전트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 안티센스 가닥을 포함한다. 여기에서 'ORF의 염기서열 또는 그 일부에 동일한 염기서열'은 ORF의 염기서열 중 티민을 우라실로 치환하여 표현하는 염기서열 또는 그 일부에 동일한 염기서열을 의미한다.
해당 센스 가닥은 15 ~ 25 염기, 바람직하게는 19 염기로 구성된다. 센스 가닥의 염기서열은 TS를 코딩하는 ORF의 염기서열과 동일한 것이 바람직하지만, 실질적으로 동일한, 즉 상동 배열이어도 좋다. 즉, 센스 가닥의 염기서열은 ORF의 염기서열에서 1 이상 즉 1 ~ 3의 염기, 바람직하게는 1 ~ 2 염기, 보다 바람직하게는 1 염기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가가 있어도 좋다.
해당 안티센스 가닥은 센스 가닥과 스트린전트 조건 하에서 하이브리다이즈 가능한 염기서열을 가진다. 안티센스 가닥은 스트린전트 조건 하에서 하이브리다이즈 가능한 1 ~ 3의 염기, 바람직하게는 1 ~ 2 염기, 보다 바람직하게는 1 염기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하여 불일치를 갖는 것이라도 좋다. 바람직하게는 안티센스 가닥은 센스 가닥과 완벽하게 상호 보완적인 염기서열로 구성된다.
센스 가닥 및 안티센스의 염기서열은 TS를 코드하는 공지의 염기서열(GenBank : CR601528.1)에 따라 선택할 수 있다. 이러한 염기서열을 선택하는 방법으로 다양한 방법이 알려져 있으며, 예를 들어, siRNA Design Support System(다카라 바이오 주식회사) 등을 이용하는 것이 가능하다.
본 발명에서 센스 가닥으로 하기의 염기서열로 이루어진 것을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다: 5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3'(서열번호 1); 5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3'(서열번호 3); 5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3'(서열번호 5).
바람직하게는 본 발명의 shRNA는 센스 가닥 5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3'(서열번호 1)와 안티센스 가닥 5'-UCAUGAUCGAUGGUGUUAC-3'(서열번호 2); 센스 가닥 5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3'(서열번호 3)와 안티센스 가닥 5'-AUUCCAUAUCUCUGUAUUC-3'(서열번호 4); 또는 센스 가닥 5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3'(서열번호 5)와 안티센스 가닥 5'-ACACUCUACAUCAUGAUCG-3'(서열번호 6)를 포함한다.
더욱 바람직하게는 본 발명의 shRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 센스 가닥 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 안티센스 가닥을 포함한다.
센스 가닥과 안티센스 가닥은 링커 부분을 통해 연결되며, 해당 링커 부분이 루프를 형성하여 축소된 해당 안티센스 가닥과 해당 센스 가닥이 잡종하여 이중 가닥 부분을 형성한다. shRNA 분자에 포함되는 링커 부분은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 연결하고 시스템 루프 구조를 형성할 수 있는 한 폴리 뉴클레오티드 링커도 비-폴리 뉴클레오티드 링커여도 좋고, 특별히 한정하지 않지만, 당업자에게 공지된 2 ~ 22 염기의 폴리뉴클레오티드 링커가 바람직하다. 구체적으로는 UAGUGCUCCUGGUUG(서열번호 7) UUCAAGAGA, CCACC, CUCGAG, CCACACC, UUCAAGAGA, AUG, CCC 및 UUCG가 예시되며, UAGUGCUCCUGGUUG(서열번호 7)이 바람직하다.
본 발명의 shRNA는 3' 말단에 적어도 2 염기로 구성된 오버행이 있다.
본 발명에서 오버행은 안티센스 가닥의 3' 말단에 부가된 염기이며, 센스 가닥의 대응하는 위치에 상보적으로 결합할 수 있는 염기가 존재하지 않는 염기를 말한다. 안티센스 가닥의 3' 말단에 오버행을 가지고 있지 않은 경우, 오버행을 가지고 있는 경우에 비해 shRNA에 따른 TS의 발현 억제의 정도가 약 40 ~ 60% 감소한다. 해당 오버행의 염기의 종류와 숫자가 제한되지 않고, 예를 들어 1 ~ 5, 바람직하게는 1 ~ 3, 더욱 바람직하게는 1 또는 2 염기로된 배열을 들 수 있으며, 예를 들어, TTT, UU 나 TT를 들 수 있다. 바람직하게는 UU이다.
본 발명에서 바람직한 shRNA로는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 단일 가닥 RNA이다.
또한 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 필요에 따라 5' 말단이 인산화되어 있어도 좋고, 5' 말단에 삼인산(ppp)이 결합되어 있어도 좋다.
본 발명의 shRNA를 갖춘 리포플렉스는 TS의 발현을 억제할 수 있는 shRNA뿐만 아니라, “종양 세포에서 발현하고 종양 세포의 증식에 관여하는 인자를 코딩하는 유전자”의 발현을 RNAi 작용에 의해 억제할 수 있는 siRNA 또는 shRNA를 포함할 수 있다. 이러한 siRNA 또는 shRNA로는 상기 정의된 것을 사용할 수 있다. TS의 발현을 억제할 수 있는 shRNA 및 기타 siRNA 또는 shRNA는 동일한 리포플렉스에 존재해도 좋고, 또는 별도의 리포플렉스에 존재할 수 있다.
하기 실시예에서 기술한 바와 같이, 국소 투여에 의해 상기 shRNA를 갖춘 리포플렉스는 종양 세포의 증식을 억제할 수 있으며, 암을 치료하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 항 종양제를 사용하여 치료할 수 있는 암으로는 TS를 고 발현하는 암을 들 수 있고, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 결장·직장암, 간암, 신장암, 두경부암, 식도암, 위암, 담도암, 담낭·담관암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁 경부암, 자궁내막암, 방광암, 전립선암, 악성 흉막 중피종, 고환암, 난소암, 뼈·연부 육종, 피부암, 뇌종양 등이 꼽힌다. 또한 암성 늑막염과 암성 복막염도 본 항 종양제로 치료 가능하다. 치료 후보로 구체적으로는 위암, 폐암, 담도암, 간암, 악성 흉막 중피종, 난소암, 암성 늑막염과 복막염이며, 특히 바람직하게는 위암, 난소암 및 췌장암의 복막 파종 전이, 흉막 악성 중피종, 흉강 내에 주로 병소가 있는 폐암 및 암성 폐렴이다.
본 발명의 항 종양제는 또한, 리포플렉스와 함께 의약의 제조에 있어서 일반적으로 사용되고 있는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 희석제, 용해 보조제, 현탁 화제, 등장화제, pH 조절제, 완충제, 안정제, 착색제, 교미제, 교취제, 히스티딘 등을 포함할 수 있다.
부형제로는, 예를 들어, 유당, 자당, 염화나트륨, 포도당, 말토오스, 만니톨, 에리스리톨, 자일리톨, 말티톨, 이노시톨, 덱스트란, 소르비톨, 알부민, 요소, 전분, 탄산칼슘, 카올린, 결정 셀룰로오스, 케이산, 메틸 셀룰로오스, 글리세린, 알긴산나트륨, 아라비아 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 활택제로는, 예를 들어 정제 탈크, 스테아르산염, 붕사, 폴리에틸렌글리콜 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 결합제로는, 예를 들어, 단 시럽, 포도당액, 전분액, 젤라틴 용액, 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스, 셸락(sellac), 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 물, 에탄올, 인산칼륨 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 붕괴제로는 예를 들면, 건조 전분, 알긴산나트륨, 한천 분말, 라미나란(laminaran) 분말, 탄산수소나트륨, 탄산칼슘, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르류, 라우릴황산나트륨, 스테아린산 모노글리세리드, 전분, 유당 및 이들의 혼합물 등이 꼽힌다. 희석제로는, 예를 들어 물, 에틸알코올, 매크로골, 프로필렌글리콜, 에톡시화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시화인스테아릴알콜, 폴리옥신에틸렌소르비탄 지방산 에스테르류 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 안정화제로는 예를 들어, 피로아황산 나트륨, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산, 티오글리콜산, 티오유산 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 등장화제로서, 예를 들면, 염화나트륨, 붕산, 포도당, 글리세린 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. pH 조절제 및 완충제로는, 예를 들어, 구연산 나트륨, 구연산, 초산나트륨, 인산나트륨 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다.
본 발명의 항 종양제는 국소 투여에 의해 투여할 수 있다. 국소 투여는 상기에 정의된 것을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 국소 투여에 적합한 제형으로 할 수 있어, 주사제, 현탁제, 유화제, 스프레이제 등의 각종 제제 형태로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 항 종양제는 동결 건조된 형태로 제공할 수 있어 사용할 때 완충액(예를 들어, 생리 식염수)을 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 항 종양제의 효과는 상기 암에서 유래하는 세포 및 조직, 및 위 암에 이환하는 개체에 해당 항 종양제를 투여하여 종양의 크기가 해당 항 종양제를 투여하지 않은(또는 투여 전) 세포와 조직 및 개체에서 종양의 크기와 비교하여 종양이 축소 또는 소멸하고 있는 것을 지표로 평가하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 항 종양제의 효과는 상기 암에서 유래하는 세포와 조직 및 상기 암에 이환하는 개체에 해당 항 종양제를 투여하고 해당 항 종양제를 투여하지 않은 개체와 비교하여 생존율의 향상(연명 효과), 흉수와 복수가 감소 또는 소멸하고 있는 것을 지표로 평가하는 것이 가능하다.
본 발명의 항 종양제는 기존의 암 화학요법과 암 화학요법제와 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 항 종양제와 병용할 수 있는 암 화학요법과 암 화학요법제로는 본 발명의 리포플렉스가 종양 조직에 침투하기 쉽도록 종양 환경을 개변할 수 있는 것이면 좋고, 예를 들면, 기존 암 화학요법제로는 위암이나 난소암의 복막 파종 전이 환자에 활성화되어 있는 탁솔(taxol)(등록 상표)(브리스톨 마이어 스퀴브)와 타키소텔(등록 상표)(사노피 아벤티스) 등의 미세 소관의 탈중합 저해 작용을 갖는 항 종양제, 췌장암 및 상기 복막 파종 전이의 치료에 유용한 젬시타빈(등록 상표)(일라일리) 등의 디옥시사이티딘 유도체로 이루어진 항 종양제, 가 꼽힌다.
또한, 본 발명의 항 종양제는 상기 암 화학요법제에 추가하거나 바꾸고, 다른 기존의 암 화학요법제와 함께 사용할 수 있다. 이러한 암 화학요법제로는 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 나이트로젠 머스터드 N- 옥사이드(Nitrogen mustard N-oxide), 이포스파사미드(Ifosfasamide), 멜팔란(Melphalan), 부슬판(Busulfan), 미토브로니톨(Mitobronitol), 카르보콘(Carboncon), 티오테파(Thiotepa), 라니무스틴(Ranimustine), 니머스틴(Nimustine), 테모졸로미드(Temozolomide), 카무스틴(Carmustine), 페메트렉시드 디소듐(Pemetrex Disodium), 메토트렉세이트(Methotrexate), 6- 메르캅토푸린 리보사이드(6-mercaptopurine riboside), 메르캅토퓨린(Mercaptopurine), 독시플루리딘(Doxifluridine), 카르모 풀(Carmo Fool), 시트라빈(Cytarabine), 시타라빈 옥포스페이트(Cytarabine oxephosphate), 에노시타빈(Enocitabine), 플루다라빈(Fludarabine), 페메트렉시드(Pemetrexed), 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 도세탁셀(Docetaxel), 이리노테칸 하이드로클로라이드(Irinotecan hydrochloride), 카페시타빈(Capecitabine) 등이 열거되며, 이들로부터 선택되는 하나 이상의 암 화학요법제를 사용할 수 있다. 이러한 암 화학요법도 상기 암 화학요법제와 마찬가지로, 본 발명의 항 종양제와의 병용으로 shRNA를 종양 세포에 효율적으로 송달할 수 있으며 상기 암 화학요법제 또는 본 발명의 항 종양제를 단독으로 사용한 경우에 비해 현저하게 높은 항 종양 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 항 종양제 및 상기 기존의 암 화학요법제와 병용 투여되는 한 조합물로써 제공할 수 있다.
본 발명의 항 종양제는 상기 기존의 암 화학요법제와 함께 “조합물”의 형태가 가능하다. “조합물”은 본 발명의 항 종양제 및 상기 기존의 암 화학요법제를 유효 성분으로 함유하는 복합제여도 좋고, 또한 본 발명의 항 종양제 및 상기 기존의 암 화학요법제를 병용 투여에 적합한 단일 패키지(키트 제제)로 제조·포장·유통되는 것일 수도 있다.
“병용투여”로는, 본 발명의 항 종양제 및 상기 기존의 암 화학요법제를 동시에 투여하는 경우 뿐만 아니라, 본 발명의 항 종양제 및 상기 기존의 암 화학요법제를, 간격을두고 투여하는 경우도 포함된다. 본 발명의 항 종양제 및 상기 기존의 암 화학요법제 투여 경로 및 투여 방법은 동일하여도 좋고, 달라도 좋다.
본 발명의 항 종양제 투여량 및 투여 횟수는 환자의 나이, 체중, 질환의 경중 등의 요인에 따라 달라질 수 있지만, shRNA의 양으로 1 회 체중 1 kg 당 0.0001 mg ~ 100 mg의 범위에서 적절히 선택되는 양을 1 일 1 ~ 3 회 매일 또는 1 ~ 21 일 마다 투여할 수 있다.
상기 기존의 암 화학요법제의 투여량은 유효 성분인 화학 물질의 종류, 환자의 나이, 체중, 질환의 경중 등의 요인에 따라 달라질 수 있지만 한 회 체중 1 kg 당 0.0001 mg ~ 1000 mg 범위에서 적절히 선택되는 양을 1 일 1 ~ 3 회 매일 또는 1 ~ 14 일마다 투여할 수 있다. 예를 들어, 기존의 암 화학요법제는 파클리탁셀인 경우, 1 일 500 ~ 1000 mg을 1 ~ 21 일마다 복강 내 또는 정맥 투여할 수 있다. 기존의 화학 요법제를 페메트렉시드 나트륨(Pemetrexed sodium) 수화물인 경우, 1 일 500 ~ 1000 mg을 1 ~ 21 일마다 정맥 주사할 수 있다. 기존의 화학 요법 제 5-FU 계 경구 항암제 티 에스원인 경우, 1 일 1 ~ 3 회 매일 또는 2 ~ 3 일 간격으로 투여할 수 있다. 상기 기존의 암 화학요법제는 단독으로 사용하는 경우에 비해 저용량, 그리고 여러 차례 투여할 수 있다. 따라서 상기 기존의 암 화학요법제의 투여에 의해 일어날 수 있는 부작용(예를 들어, 골수 억제, 용혈성 빈혈, 파종성 혈관 내 응고, 극증 간염, 탈수 증상, 장염, 간질성 폐렴, 구내염, 소화관 궤양, 소화관 출혈, 소화관 천공, 급성 신부전, 피부 점막안 증후군, 중독성 표피 괴사증, 정신 신경 장애, 급성 췌장염, 횡문근 융해증, 후각 손실 등 이에 국한되지 않음)의 발병을 억제 또는 지연할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 항 종양제를 이용한 암 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법으로 치료할 수 있는 암으로는 상기 정의된 바와 같은 암이 포함된다. 또한 상기 방법에 있어서 상기 본 발명의 항 종양제 및 기존의 암 화학요법제의 용법 및 용량은 상기한 바와 같다.
실시예
다음에 나타내는 실시예는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
리포플렉스의
제조
본 실시예에서, 시약은 다음에 기재하는 것을 이용했다.
디올레일 포스파티딜 에탄올 아민(DOPE) : Nipponseika
1,2- 디올레오일 -sn- 글리세로 -3- 포스포코린(DOPC) : Nipponseika
O, O'- 디 테트라 데카노일-N-(α- 트리메틸 암모니오 아세틸) 디 에탄올 아민 클로라이드(DC-6-14) : Pharmaron
에탄올 : Wako Pure Chemical Industries
염화나트륨 : Wako Pure Chemical Industries
(TS를 대상으로하는 shRNA)
TS를 대상으로하는 shRNA(이하 “TS-shRNA”라고 기재한다)는 TS의 발현을 억제할 수 있으며, 또한 항 종양 효과가 이미 확인된 공지의 shRNA(WO2012/161196 참조) 에 기초하여 다음의 서열을 갖는 것을 합성하였다.
TS-shRNA :
5'-GUAACACCAUCGAUCAUGAUAGUGCUCCUGGUUGUCAUGAUCGAUGGUGUUACUU-3'(서열번호 8)
(1) 본 발명의 방법에 의한 리포플렉스(신규제제)의 제조
(1-1) 지질 혼합물의 동결 건조물로부터 리포플렉스(신규제제(1))의 조제
Nipponseika 제 프리폼(preform) DF1(DOPE/DOPC/DC-6-14를 3/2/5의 몰비로 포함하는 지질 혼합물)(100 mg)을 칭량하고 실온에서 에탄올 1.842 mL에 용해함으로써 지질 혼합물의 에탄올 용액을 얻었다.
RNase free water(66.2 μL)에 300 μM TS-shRNA를 3.8 μL 첨가하여 TS-shRNA 수용액을 얻었다.
그 다음 천천히 교반하면서 상기 지질 혼합물의 에탄올 용액(30 μL)을 상기 TS-shRNA 수용액(70 μL)을 서서히 적하함으로써 리포플렉스의 에탄올/수용액을 얻었다.
얻어진 리포플렉스의 에탄올/수용액을 -40℃ 이하에서 냉동시킨 후 진공 동결 건조기(LABCONCO FZ-4.5, 아사히 생명 과학)를 이용하여 동결 건조했다.
얻어진 동결 건조품에 RNase free water로 조제한 식염수(0.9v/w% 염화나트륨 수용액)를 100 μL 플러스 PresentMixer2013에서 10 초간 교반하여 리포플렉스(TS-shRNA 양으로 20 μg/100 μL)를 얻었다.
이하, 이렇게 얻어진 리포플렉스를 “신규제제(1)”라고 기재한다.
(1-2) DOPE, DOPC 및 DC-6-14의 각 지질 분말에서 리포플렉스(신규제제(2))의 조제
DOPE(55.8mg), DOPC(78.6mg) 및 DC-6-14(66.0mg)의 분말을 각각 무게 에탄올 1mL를 각각 첨가한 후 40℃로 가온하여 75mM DOPE, 100mM DOPC, 100mM DC-6-14의 용액을 얻었다.
에탄올(4.777μL)에 대해 상기 75mM DOPE 용액(9.172μL), 100mM DOPC 용액(4.586μL) 및 100mM DC-6-14 용액(11.465μL)를 첨가하여 DOPE/DOPC/DC-6-14를 3/2/5의 몰비로 포함하는 지질 혼합물의 에탄올 용액을 얻었다.
그 다음 천천히 교반하면서 상기 지질 혼합물의 에탄올 용액(30μL)을 상기 TS-shRNA 수용액(70μL)을 서서히 적하하여 리포플렉스의 에탄올/수용액을 얻었다.
얻어진 리포플렉스의 에탄올/수용액을 상기(1-1)과 마찬가지로 동결 건조하여 RNase free water로 제조한 식염수를 가하여 교반하여 리포플렉스(TS-shRNA 양으로 20μg/100μL)를 얻었다.
이하, 이렇게 얻어진 리포플렉스를 “신규제제(2)”라고 기재한다.
(2) 종래 공지의 방법에 의한 리포플렉스의 준비
DOPE(0.51mg), DOPC(0.36mg) 및 DC-6-14(0.76mg) 분말을 각각 칭량하고 시클로헥산/에탄올 혼합액(95%/5%(V/V)) 1.0mL에서 혼합하여 용해시켰다. 이어서, 얻어진 용액을 동결 건조 처리하고 시클로헥산 에탄올을 제거한 후 생리 식염수(50μL)를 추가하여 볼텍스 믹서를 사용하여 10 분 동안 격렬하게 교반하여 현탁시킨 후, TS-shRNA 포함(0.4μg/μL) 수용액(50μL)을 넣고 혼합하여 리포플렉스(TS-shRNA 양으로 20μg/100μL)을 얻었다.
이하, 이렇게 얻어진 리포플렉스를 "종래제제"라고 기재한다.
각
리포플렉스의
물성에 관한 동등성 비교
Zetasizer Nano ZS(Malvern)을 이용하여 실시예 1에서 얻어진 신규제제(1), 신규제제(2) 및 종래제제의 입도(d.nm), 다분산지수(polydispersity index : PdI) 및 제타 전위(mV)를 측정했다.
결과를 도 1에 나타내었다.
이 결과, 종래 공지의 방법에 의해 얻어진 종래제제와 본 발명의 방법에서 얻어진 신규제제(1) 및 신규제제(2)와는 그 물성에 유의한 차이가 없고, 종래 공지 방법에 의해 얻어진 프리플렉스와 본 발명의 방법에서 얻은 프리플렉스와의 물성에 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
리포플렉스의
TS-
shRNA
유지 기능 평가
본 실시예에서, 시약은 하기에 기재하는 것을 이용했다.
Tris : Wako Pure Chemical Industries
붕산 : Wako Pure Chemical Industries
EDTA·2Na : Sigma-Aldrich
아가로스 : Sigma-Aldrich
Ethidium bromide(EtBr) : Wako Pure Chemical Industries
실시예 1에서 얻어진 신규제제(1), 신규제제(2) 및 종래제제 각각에 대해 shRNA 유지 기능에 대해 평가했다.
Tris(5.4g), 붕산(2.75g), EDTA·2Na(0.185g)을 각각 칭량하여 증류수 1L 메스 업하여 TBE 완충 용액을 제조하였다. 아가로스(0.4g)에 TBE 완충 용액(40mL)을 넣고 끓여 아가로스를 완전히 용해시킨 후 1mg/mL EtBr(4μL)을 가하고 이를 젤 판에 흘려 넣어 실온에 되돌림으로써 1% 아가로오스 겔을 제조하였다.
전기영동 장치(PLUS-2, 시마 바이오텍)에 젤 버전을 설치하고 종래제제, 신규제제(1) 및 신규제제(2)를 각각 10 배 희석하여 아가로스 젤에 적용하고 TBE 완충액을 영동조에 가한 후, 100V에서 15 분간 영동했다. 그 후, TS-shRNA 밴드 AE-9000N E-Graph(아토)으로 관찰했다. 또한 각 리포플렉스 조제 1 일 후 및 3 일 후에도 마찬가지로 평가했다.
결과를 도 2에 나타냈다.
조제 직후의 종래제제 및 신규제제(1) 및 신규제제(2)에서 유리형(Free type)의 TS-shRNA와 같은 위치에 밴드는 전혀 관찰되지 않고, 각 리포플렉스를 포함한 샘플에서 유리형 TS-shRNA는 대부분 존재하지 않는 것을 추정되었다. 또한 조제 3 일 후까지도 TS-shRNA와 같은 위치의 밴드가 관찰되지 않았던 것으로부터 종래제제 및, 신규제제(1) 및 신규제제(2)는 조제 3 일 후까지 TS-shRNA를 계속 유지하는 것으로 확인되었다.
이러한 결과로부터 종래 공지의 방법에 의해 얻어진 리포플렉스와 본 발명의 방법에서 얻어진 리포플렉스 사이에서 shRNA 유지 기능에 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다.
각
리포플렉스의
복강 내 투여에 의한 종양의 표적 유전자 억제 효과의 평가
(Real Time RT-PCR)
본 실시예에서, 시약은 하기에 기재하는 것을 이용했다.
TaqMan(등록 상표) Reverse Transcription Reagents : Life Technologies
FastStart Universal Probe Master(ROX) : Roche
Universal ProveLibrary # 64 : Roche
Universal ProveLibrary # 60 : Roche
Forward primer for TS mRNA : Life Technologies
염기서열 : 5'-CCC CTT CTT CTC TGG TGG A-3 '(서열번호 9)
Reverse primer for TS mRNA : Life Technologies
염기서열 : 5'-AGG AGT TGC TGT GGT TTA TCA AG-3 '(서열번호 10)
Forward primer for GAPDH mRNA : Life Technologies
염기서열 : 5'-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC-3 '(서열번호 11)
Reverse primer for GAPDH mRNA : Life Technologies
염기서열 : 5'-ACG ACC AAA TCC GTT GAC TC-3 '(서열번호 12)
실시예 1에서 얻어진 신규제제(1) 신규제제(2) 및 종래제제의 종양의 표적 유전자 억제 효과에 대해 실시간 RT-PCR 법에 의해 평가했다.
MKN45 인간 위암 세포(이화학 연구소)를 배양하고 BALB/c nu/nu 마우스(5 주령 수컷)의 복강에 5x106 개(세포)/마우스가 되도록 이식했다. 이식 당일 및 이식 6 일 후 마우스의 체중을 각각 측정하고 체중이 감소하고 있는(이식 세포가 생착하고 있다고 생각되는) 마우스를 MKN45 복막 파종 모델 마우스로서 실험에 제공했다.
세포 이식 후 7일, 9일, 11 일 총 3 회, 종래제제, 신규제제(1) 또는 신규제제(2)를 TS-shRNA 복용량이 20μg/mouse/da가 되도록 각 모델 마우스 에 각각 복강 내 투여했다. 세포 이식 13 일 후 각 모델 마우스에서 종양을 적출하고 MULTI-BEADS SHOCKER(등록 상표)(Yasui Machinery)에서 종양을 균질화한 후 RNeasy(등록 상표) Mini Kit(QIAGEN)을 이용하여 RNA를 추출했다.
얻어진 RNA 추출액의 RNA 농도를 NanoDrop 8000(Thermo Fisher Scientific)에서 측정한 후 RNA 농도 1μg/7.7μL가 되도록 RNase free water로 희석하여 TaqMan(등록 상표) Reverse Transcription Reagents를 사용하여 역전사를 수행하였다(16℃에서 30 분 동안 42℃에서 30 분 동안 85℃에서 5 분간).
얻어진 cDNA 용액 5μL에 대해 다음과 같은 TS PCR mix 또는 GAPDH PCR mix를 15μL 플러스 StepOnePlusTM(Life Technologies)을 이용하여 실시간 RT-PCR(1 사이클 : 50℃에서 2 분; 95℃에 밖으로 10 분 동안 40주기 : 95℃에서 15 초; 60℃에서 1 분간)을 실시하는 것으로, TS mRNA 양 및 GAPDH mRNA 양을 측정했다.
결과를 도 3에 나타냈다. 도 3은 Real Time RT-PCR로 측정한 TS mRNA의 값을 GAPDH mRNA의 값으로 보정한 데이터를 “TS mRNA 발현 수준”으로 하여, 리포플렉스를 투여하지 않고 9% 자당 용액을 투여한 마우스 모델(대조군)의 값을 100%로 하는 상대값으로 나타내었다.
대조군과 비교하여 종래제제, 신규제제(1) 및 신규제제(2)의 모든 군에서 약 30% 정도의 상당한 TS mRNA의 발현 수준의 저하가 확인되었다. 이로부터 종래 공지의 방법에 의해 얻어진 리포플렉스 및 본 발명의 방법에서 얻어진 리포플렉스는 복막 파종 전이된 종양의 표적 유전자 발현을 유의하게 억제할 수 있는 것으로 나타나고, 또한 그 효과는 종래 공지의 방법에 의해 얻어진 리포플렉스와 본 발명의 방법에서 얻어진 리포플렉스 사이에서 우위한 차이가 없는 것으로 나타났다.
각
리포플렉스의
복강 내 투여에 의한 종양의 표적 유전자 억제 효과의 평가
(In Vivo Imaging Systems : IVIS)
본 실시예에서, 시약은 하기에 기재하는 것을 이용했다.
루시페린 : Wako Pure Chemical Industries
PBS : Nissui Pharmaceutical
(루시퍼라제(Luc)를 대상으로 하는 shRNA)
Luc을 대상으로 하는 shRNA(이하 “"Luc-shRNA”라고 기재한다)는 다음의 서열을 가진다.
Luc-shRNA :
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAUAGUGCUCCUGGUUGUCGAAGUACUCAGCGUAAGUU-3'(서열번호 13)
본 실시예에서, 루시퍼라제에 대한 shRNA(Luc-shRNA)를 사용하여, 상기 실시예 1에 기재된 리포플렉스의 제조 방법에 있어서, shRNA를 Luc-shRNA에 대체되는 것 이외에는 동일하게 하여 Luc-shRNA를 담지하는 리포플렉스를 준비하고 신규제제(1), 신규제제(2) 및 종래제제의 종양의 표적 유전자 억제 효과에 대해, IVIS로 평가했다.
루시퍼라제 발현 NCI-N87 인간 위암 세포(NCI-N87-Luc, 주상 Pharma International)를 배양하고 BALB/c nu/nu 마우스(5 주령 수컷 일본 SLC)의 복강에 4x106 개(세포)/마우스가 되도록 이식하여 NCI-N87-Luc 복막 파종 모델 마우스를 제작하였다.
세포 이식 후 8일, 11일, 14일, 17일, 20 일 총 5 회에 종래제제, 신규제제(1) 또는 신규제제(2)를 Luc-shRNA 복용량이 20μg/mouse/day 이 되도록 각 모델 마우스에 각각 복강 내 투여했다. 또한 루시페린을 7.5mg/mL가 되도록 PBS로 용해하여, 세포 이식 후 7일, 10일, 13일, 16일, 19일, 22 일에 각각 루시페린 10μL를 복강 내 투여한 후 종양의 루시퍼라아제 활성을 IVIS(Xenogen, Alameda, CA, USA)에서 관찰했다. 리포플렉스를 투여하지 않고 9% 자당 용액을 투여한 마우스 모델을 대조군으로 사용하였다.
얻어진 결과의 영상 데이터를 이용하여 복강의 루시퍼라아제 활성을 정량화 한 그래프(도 4)를 나타내었다.
대조군에서는 시간이 지남에 따라 루시퍼라아제 활성의 상승이 확인되어 종양이 복강 내에서 증식하고 있는 것으로 나타났다. 한편, Luc-shRNA를 담지하는 종래제제, 신규제제(1) 및 신규제제(2) 각각의 복강 투여군에서는 1 회 투여 후에서 현저한 루시퍼라제의 활성 저하가 확인되었고, 실험을 실시한 기간(세포 이식 22 일 후까지)에서 루시퍼라아제 활성이 다시 상승하지 않았다(도 4).
본 실시예에서는 루시퍼라아제에 대한 Luc-shRNA를 이용하였지만, 이것이 종양의 증식에 영향을 미치는 것이라고 생각하기는 어렵다. 실제로 세포 이식 24 일 후의 각 군의 종양 중량을 측정한 결과, 군간에 현저한 차이는 확인되지 않았다. 이로부터 Luc-shRNA를 담지하는 각 리포플렉스를 투여하여 종양의 루시퍼라제의 활성만을 억제한 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 종래 공지의 방법에 의해 얻어진 리포플렉스와 본 발명의 방법에서 얻어진 신규 리포플렉스 사이에서 같은 TS-shRNA 활성을 보유하고 있는 것으로 밝혀졌다.
리포플렉스(신규제제(2))의
복강 내 투여에 의한 난소암 복막
파종에 대한 치료 평가
상기 실시예 1과 동일하게 제조한 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))의 난소암 복막 파종에 대한 치료 효과를 평가했다.
루시퍼라제 발현 OVCAR-3 인간 난소암 세포(OVCAR-3-luc, Pharmaron)을 배양하고 BALB/c nu/nu 마우스(6-8 주령 암컷, Beijing HFK Bio-Technology Co., LTD)의 복강에 1.5x107 개(세포)/마우스가되도록 이식하여 OVCAR-3-luc 복막 파종 모델 마우스를 제작하였다.
본 실시예에서는 모델 마우스에 대해 리포플렉스(신규제제(2)), 파클리탁셀(탁솔, Pharmaron), 또는 리포플렉스(신규제제(2)) 및 파클리탁셀을 투여했다. 대조군으로 9% 자당 용액을 투여했다.
세포 이식 후 8일, 11일, 14일, 17일 총 4회, 리포플렉스(신규제제(2))를 TS-shRNA 복용량이 20μg/mouse/day가 되도록 모델 마우스에 복강 투여했다. 파클리탁셀을 투여하는 군은 세포 이식 후 8일, 11일, 14일, 17일 총 4회, 15mg/kg이 되도록 모델 마우스에 복강 내 투여했다.
루시페린을 7.5mg/mL가 되도록 PBS로 용해한 후, 세포 이식 후 7일, 14일, 21일, 26일에 각각 루시페린 10μL를 복강 내 투여한 후 종양의 루시퍼라아제 활성을 IVIS으로 관찰하였다.
결과를 도 5-1에 나타내었다. 또한 도 5-1의 영상 데이터를 이용하여 복강의 루시퍼라아제 활성을 정량화한 그래프(도 5-2) 및 그 대수 그래프(도 5-3)를 각각 나타낸다.
대조군에서는 시간이 지남에 따라 루시퍼라아제 활성의 상승이 확인되어 종양이 복강 내에서 증식하고 있는 것으로 나타났다. 한편, TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스를 복강 내 투여한 군에서는 대조군에 비해 루시퍼라아제 활성의 상승이 억제되고, 즉 복강 내에서 종양의 증식이 억제되는 것이 확인되었다. 또한 리포플렉스와 파클리탁셀을 병용한 군에서 가장 높은 종양 억제 효과가 관찰되었다.
또한 각 모델 마우스의 생존 기간을 도 5-4에 나타내었다.
대조군과 비교하여 리포플렉스와 파클리탁셀을 병용한 군에서 현저하게 높은 연명 효과가 확인되었다.
또한 리포플렉스를 투여한 마우스 모델의 혈중 및 복수중 TS-shRNA의 농도 추이를 RT-PCR 법으로 측정한 결과를 도 5-5에 나타내었다.
이 결과 복수에서 8시간 정도의 긴 반감기가 관찰된 반면 혈중에서는 TS-shRNA이 새어 나와 있지 않은 것이 확인되었다.
리포플렉스(신규제제(2))의
복강 내 투여에 의한 췌장암 복막
파종에 대한 치료 평가
상기 실시예 1과 동일하게 제조한 TS-shRNA를 담지하는 리포플렉스(신규제제(2))의 췌장암 복막 파종에 대한 치료 효과를 평가했다.
루시퍼라제 발현 PANC-1 인간 췌장암 세포(PANC-1-luc, Pharmaron)을 배양하고 BALB/c nu/nu 마우스(6-8 주령 암컷, Beijing HFK Bio-Technology Co., LTD)의 복강 안에 1.0x107 개(세포)/마우스가 되도록 이식하여 PANC-1-luc 복막 파종 모델 마우스를 제작하였다.
본 실시예에서는 모델 마우스에 대해 리포플렉스(신규제제(2)), 파클리탁셀(탁솔, Pharmaron), 또는 리포플렉스(신규제제(2)) 및 파클리탁셀을 투여했다. 대조군으로 9% 자당 용액을 투여했다.
세포 이식 후 8일, 11일, 14일, 17일 총 4회, 리포플렉스(신규제제(2))를 TS-shRNA 복용량이 20μg/mouse/day가 되도록 모델 마우스에 복강 투여했다. 파클리탁셀을 투여하는 군은 세포 이식 후 8일, 11일, 14일, 17일 총 4회, 10mg/kg이 되도록 모델 마우스에 복강 내 투여했다.
루시페린을 7.5mg/mL가 되도록 PBS로 용해하여 세포 이식 후 7일, 14일, 21일, 25일에 각각 루시페린 10μL를 복강 내 투여한 후 종양의 루시퍼라아제 활성을 IVIS으로 관찰하였다.
IVIS 이미징 데이터를 기반으로 복강의 루시퍼라아제 활성을 정량화한 그래프(도 6-1) 및 그 대수 그래프(도 6-2)를 각각 나타낸다.
대조군에서는 시간이 지남에 따라 루시퍼라아제 활성의 상승이 확인되어 종양이 복강 내에서 증식하고 있는 것으로 나타났다. 한편, 리포플렉스(신규제제(2)), 파클리탁셀(탁솔, Pharmaron) 또는 리포플렉스(신규제제(2)) 및 파클리탁셀을 투여한 군에서는 대조군에 비해 루시퍼라아제 활성의 상승이 억제되고 있으며, 즉 복강 내에서 종양의 증식이 억제되는 것이 확인되었다. 특히 파클리탁셀을 투여한 군, 및 리포플렉스와 파클리탁셀을 병용한 군에서 높은 종양 억제 효과가 관찰되었다.
또한 각 모델 마우스의 생존 기간을 도 6-3에 나타내었다.
대조군과 비교하여 리포플렉스와 파클리탁셀을 병용한 군에서 현저하게 높은 연명 효과가 확인되었다.
본 발명에 의하면, 클로로포름 또는 시클로헥산과 같이 독성이 높고, 폭발의 위험성이 높은 유기 용매를 사용하지 않고 생체 허용성이 높은 용매만을 사용하여 리포플렉스를 제조할 수 있기 때문에 의약품 제제의 공업적 제법에 최적이다. 또한 병원 약제부 등의 의료 현장에서 지질 혼합물의 분산액 및 RNAi 분자의 수용액을 각각 준비하고, 양자를 혼합하는 복잡한 분배가 불가피해 리포플렉스 분말 소금물이나 당질 수액을 가하여 가볍게 교반하는 것만으로 환자에의 투여액이 준비될 수 있기 때문에 병원 약제부의 조제에 관한 노력과 비용을 크게 줄일 수 있다.
또한, 위암이나 난소암 또는 췌장암 등의 복막 파종 전이(각 암의 말기에 가까운 상태)에 복강 내 투여를, 또한, 흉강 내에 주된 병소가 인정되는 흉막 악성 중피종과 폐암 혹은 암성 폐렴에 대해서는 흉강 내 투여를 시행하는 등, 합목적인 국소 투여를 함으로써 종양 세포에 효율적으로 RNAi 분자를 송달할 수 있으며, 해당 종양의 증식을 효율적으로 억제할 수 있다. 본 발명은 약물 전달 분야에서, 또한 암 치료 분야에서 크게 공헌할 것으로 기대된다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
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Claims (15)
- 디오레일 포스파티딜 에탄올 아민(Dioleylphosphatidylethanolamine; DOPE), 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine) 및 양이온성 지질로 구성되는 지질 혼합물, 및 RNAi 분자를 포함하는 리포플렉스(LIPOPLEX)의 제조 방법으로서,
(a) 디오레일 포스파티딜 에탄올 아민(DOPE), 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질을 에탄올에 용해하는 공정으로써, 포스파티딜콜린이 1,2-디올레오일-sn- 글리세로-3-포스포콜린[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)], 팔미토일 올레오일포스파티딜콜린[Palmitoyl Oleoylphosphatidylcholine(POPC)] 또는 1,2- 디에코세노일-sn-글리세로-3-포스포코린[1,2-diecosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DEPC)]이며, 양이온성 지질이 O, O'-디테트라 데카노일-N-(α-트리메틸 암모니오아세틸) 디 에탄올아민 클로라이드[O, O'-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl) diethanolamine chloride(DC-6-14)]인 상기 공정,
(b) RNAi 분자를 물에 용해한 용액에, 교반 하에서, (a)에서 얻은 에탄올 용액을 적하하는 공정, 및
(c)(b)에서 얻어진 용액을 동결 건조하는 공정,
을 포함하는 상기 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 포스파티딜콜린이 DOPC인, 방법.
- 제 1항에 있어서, 공정(a)에서 DOPE, DOPC 및 DC-6-14를 에탄올에 용해하여 혼합하는 것을 포함하는 것인, 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, (d) (c)에서 얻어진 동결 건조물을 완충액에 혼합하는 공정을 더 포함하는 것인, 방법.
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
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