KR101831205B1 - 국소 투여용 리포솜 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표적 세포에 활성 성분을 효율적으로 송달할 수 있는 새로운 송달 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
디오레오일포스파티딜에타놀아민(DOPE), 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질로 구성되며, PEG로 변형되어 있지 않고, 또 한편 콜레스테롤을 포함하지 않는, 국소 투여용 리포솜.

Description

국소 투여용 리포솜 및 이의 용도{LOCALLY ADMINISTERED LIPOSOME AND APPLICATION THEREFOR}
본 발명은 국소 투여용 리포솜 및 해당 리포솜을 이용하는 항종양제에 관한 것이다.
리포솜은 생체의 세포막을 구성하는 인지질로 구성되어 생체 적합성이 높고, 또한 생체 내에서 약물과 활성 성분을 분해 효소 등으로부터 보호하면서 운반할 수 있으며, 약물 전달 시스템의 유용한 도구로 주목받고 있다. 오늘날 혈중 체류성을 향상시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 변형된 리포솜과, 혈중 안정성 및 강도를 높이기 위해 구성 지질로서 불포화 결합을 포함하지 않는 수소 첨가 포스파티딜콜린과 막의 상전이 온도를 높이는 콜레스테롤을 포함하는 리포솜이 개발되어 범용되고 있다.
한편, RNA 간섭(이하 「RNAi」라고 기재한다)를 일으키는 RNAi 분자 종양 등을 치료하기 위한 유용한 도구로 주목받고 있으며, 종양의 증식을 억제할 수 있는 다양한 RNAi분자가 개발되고 있다. 또한 RNAi 분자와 리포좀으로 이루어진 복합체(리포플렉스)를 이용하여 활성 성분인 RNAi 분자를 암세포에 전달하는 방법이 개발되고 있다(비특허 문헌 1-3).
본 발명자들은 지금까지 DNA 합성에 관여하는 티미딜산 합성 효소(이하, 「TS」라고 기재한다)를 대상으로 RNAi 분자를 개발하고(특허 문헌 1), 해당 RNAi 분자를 PEG로 수식하고, 또한 콜레스테롤을 소정의 비율로 포함하는 리포솜을 이용하여 정맥 내 투여에 의해 종양에 전달하여 TS를 발현하는 종양의 성장을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 해당 리포솜을 화학요법제와 병용하는 것에 의해서, 종양에 대한 지향성을 높여 RNAi 분자에 의한 항종양 효과를 현저하게 향상시킬 수 있음을 보고 하였다(특허 문헌 2).
그러나 해당 분야에 있어서는 여전히 종양의 증식을 억제할 수 있는 RNAi 분자를 종양 세포에 보다 효율적으로 도입할 수 있는 수단이 요구되고 있다.
특허문헌 1: WO 2010/113844 특허문헌 2: WO 2012/161196
비특허문헌 1: Qixin Leng et al., Drug Future. 2009 September; 34(9): 721. 비특허문헌 2: Sherry Y. Wu et al., The AAPS Journal, Vol.11, No.4, December 2009. 비특허문헌: 3 B. Ozpolat et al., Journal of Internal Medicine 267; 44-53 2009.
본 발명은 표적 세포에 활성 성분을 효율적으로 전달할 수 있는 새로운 송달 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
보다 상세하게는, 본 발명은 종양의 증식을 억제할 수 있는 RNAi 분자를 종양 세포에 효율적으로 전달할 수 있는 새로운 리포솜을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭 한 결과, 디오레오일포스파티딜에타놀아민(DOPE), 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질로 구성되며, PEG로 수식되어 있지 않고, 한편 콜레스테롤을 포함하지 않는 리포솜에 활성 성분을 담지시켜, 표적 세포를 포함한 부위 또는 그 근방에 국소 투여함으로써 표적 세포에 활성 성분을 효율적으로 전달할 수 있는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉 본 발명은 다음과 같다.
[1] 디오레오일포스파티딜에타놀아민(DOPE), 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질로 구성되며, 상기 포스파티딜콜린이 하기 (i)-(iii)에서 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는, 국소 투여용 리포솜 :
(i) 탄소-탄소 간 이중 결합을 포함하는 불포화 지방 사슬을 적어도 하나 포함;
(ii) 시스(cis) 형의 탄소-탄소 간 이중 결합을 포함하는 불포화 지방 사슬을 적어도 하나 포함;
(iii) 상전이 온도가 0℃ 미만.
[2] 양이온성 지질이 O,O'-디테트라데카노일-N-(α-트리메틸암모니오 아세틸)디에탄올아민 클로라이드[ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonio acetyl)diethanolamine chloride](DC-6-14)인, [1]의 리포솜.
[3] 포스파티딜콜린이 1,2-디오레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DOPC), 팔미토일오레오일포스파티딜콜린(Palmitoyloleoylphosphatidylcholine; POPC) 또는 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC)인, [1]의 리포솜.
[4] 포스파티딜콜린이 DOPC인, [1]의 리포솜.
[5] DOPE, DOPC 및 DC-6-14로 이루어진, [1]의 리포솜.
[6] DOPE, DOPC 및 DC-6-14가, 3 : 2 : 5의 몰비로 포함된, [5]의 리포솜.
[7] [1] ~ [6] 중 어느 하나의 리포솜과 활성 화합물을 포함하는 조성물.
[8] 활성 화합물이 핵산인, [7]의 조성물.
[9] 핵산이 리포솜의 외막 표면에 결합하고있는, [8]의 조성물.
[10] [1] ~ [6] 중 어느 하나의 리포솜과 RNAi 작용에 의해 티미딜산 합성 효소의 발현을 억제할 수 있는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하는, 항종양제.
[11] shRNA가 리포솜의 외막 표면에 결합되어 있는, [10]의 항종양제.
[12] shRNA가 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어진, [10]의 항종양제.
[13] 암화학요법 또는 암화학요법제와 병용되는, [10]의 항종양제.
[14] [10] ~ [13] 중 어느 하나의 항종양제와 암화학요법제를 포함하는, 조합물.
[15] 암화학요법제는 TS 저해 작용을 갖는 항종양제인, [14]의 조합물.
[16] TS 저해 작용을 갖는 항종양제는, 5-FU 계 항종양제 또는 페메트렉스드 나트륨 수화물(Pemetrexed Sodium Hydrate)인, [15]의 조합물.
본 발명에 의하면, 국소 투여로 표적 세포에 활성 성분을 효율적으로 전달할 수 있는 새로운 리포솜을 제공할 수 있다.
보다 상세하게는, 본 발명에 의하면, 국소 투여로 종양의 증식을 억제할 수 있는 RNAi 분자 종양 세포에 효율적으로 전달할 수 있는 새로운 리포솜을 제공할 수 있다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2013-095950 호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함하고 있다.
도 1은, 인간 악성 흉막 중피종 세포에 대한 암화학요법제, TS-shRNA, NS-shRNA, 및 이들 shRNA 및 암화학요법제와 병용에 의한 종양 성장 억제 효과를 나타낸다. (A) 최종 농도를 5 nM로 하는 shRNA의 결과를 나타낸다. (B) 최종 농도를 10 nM로 하는 shRNA의 결과를 나타낸다. *** : p <0.005.
도 2는, TS-shRNA 및 NS-shRNA에 따른, 인간 악성 흉막 중피종 세포에서 TS 발현 억제 효과를 나타낸다. (A) 웨스턴블로팅의 결과를 나타낸다. (B) 웨스턴블로팅의 결과에 따라, TS 발현량의 정량 결과를 나타낸다. TS/β-액틴은 shRNA 처리되지 않은 대조군을 100%로 하는 상대값으로 나타낸다.
도 3은, Dual-luciferase assay에 의한 각종 양이온 리포솜에 의한 Luc-shRNA 도입 효과의 비교 결과를 나타낸다.
도 4는, 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델에서 종양 증식의 결과를 나타내는 도이다. 각 사진의 날짜는 악성 흉막 중피종 세포 이식 후 일수를 나타낸다.
도 5-1은, 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델에서 종양 세포에 대한 각종 양이온 리포솜에 의한 Luc-shRNA 도입 효과의 비교 결과를 나타내는 도이다. (A) 대조: 9% 자당의 결과를 나타낸다. (B) DEPC: DEPC를 포함하는 리포솜의 결과를 나타낸다. (C) DMPC: DMPC를 포함하는 리포솜의 결과를 나타낸다. (D) DOPC: DOPC을 포함하는 리포솜의 결과를 나타낸다. (E) POPC: POPC를 포함하는 리포솜의 결과를 나타낸다.
도 5-2은, 도 5-1의 결과를 기반으로 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델에서 종양 세포에 대한 각종 양이온 리포솜에 의한 Luc-shRNA 도입 효과의 정량 결과를 나타낸다. * : p <0.005.
도 6-1은, 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델에서 종양 세포에 대한 DC-6-14의 함량이 다른 양이온 리포솜의 Luc-shRNA 도입 효과의 비교 결과를 나타내는 도이다. 사진은 위에서부터 몰비이며, (A) 20%의 DC-6-14을 포함하는 리포솜, (B) 35%의 DC-6-14을 포함하는 리포솜, (C) 50% DC-6- 14를 포함하는 리포솜의 결과를 나타낸다.
도 6-2은, 도 6-1의 결과를 기반으로 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델에서 종양 세포에 대한 DC-6-14의 함량이 다른 양이온 리포솜의 Luc-shRNA 도입 효과 정량 결과를 나타낸다. * : p <0.005.
도 7-1은, 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델에서 종양 세포에 대한, PEG 수식이 되었거나 PEG 수식이 되지 않은, 각종 양이온 리포솜의 Luc-shRNA 도입 효과의 비교 결과를 나타내는 도이다. (A) PEG 수식 POPC: PEG 수식된, POPC를 포함하는 리포솜의 결과를 나타낸다. (B) PEG 미수식 POPC: PEG 수식되지 않은, POPC를 포함하는 리포솜의 결과를 나타낸다. (C) PEG 수식 DOPC: PEG 수식된, DOPC을 포함하는 리포솜의 결과를 나타낸다. (D) PEG 미수식 DOPC: PEG 수식되지 않은, DOPC을 포함하는 리포솜의 결과를 나타낸다.
도 7-2은, 도 7-1의 결과를 기반으로 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델에서 종양 세포에 대한 각종 양이온 리포솜의 Luc-shRNA 도입 효과의 정량 결과를 나타낸다. ** : p <0.01.
도 8-1은, 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델에서 종양 세포에 대한, TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 및 NS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스, 암화학요법제(PMX), 그리고 리포플렉스 및 암화학요법제(PMX)와의 병용에 의한 종양 성장 억제 효과 비교 결과를 나타내는 도이다. (A) 대조: 9% 자당(sucrose)의 결과를 나타낸다. (B) NS-shRNA: NS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스만 처리한 결과를 나타낸다. (C) TS-shRNA: TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스만 처리한 결과를 나타낸다. (D) PMX: 암화학요법제만 처리한 결과를 나타낸다. (E) PMX + NS-shRNA: 암화학요법제 및 NS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스와의 병용으로 처리한 결과를 나타낸다. (F) PMX + TS-shRNA: 암화학요법제 및 TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스와의 병용으로 처리한 결과를 나타낸다.
도 8-2는, 도 8-1의 결과를 기반으로 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델에서 종양 세포에 대한 각종 조치에 의한 종양 성장 억제 효과의 정량 결과를 나타낸다. * : p <0.05, *** : p <0.01.
도 8-3은, 대조(9% 자당), 암화학요법제(PMX) 단독, NS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 단독, TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 단독, 또는 리포플렉스와 암화학요법제(PMX)과의 병용에 의해 처리된 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 모델 마우스의 생존율(%)을 나타낸다.
도 8-4은, 대조(9% 자당), TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 단독, NS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 단독, 암화학요법제(PMX) 단독 또는 리포플렉스와 암화학요법제(PMX)와의 병용에 의해 처리된 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델의 평균 생존기간(MST) 및 생존기간 증가율(ILS)을 나타낸다.
도 9는, 대조(9% 자당), NS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 단독, TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 단독, 암화학요법제(PMX) 단독 또는 리포플렉스와 암화학요법제(PMX)와 병용에 의하여 처리된 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 모델 마우스의 종양 세포에서 TS mRNA 발현 량의 정량 결과를 나타낸다. TS mRNA 발현 량은 대조군을 100%로 하는 상대 값으로 나타낸다. * : p <0.05, ** : p <0.01.
도 10은, Dual-luciferase assay에 의한 각종 양이온 리포솜 및 양이온 프레솜(presome) 의한 Luc-shRNA 도입 효과의 비교 결과를 나타낸다.
도 11은, 악성 흉막 중 피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델에서 종양 세포에 대한, TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 및 TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 프리플렉스, 암화학요법제(PMX) 및 리포플렉스 또는 프리플렉스와 암화학요법제(PMX)와의 병용에 의한 종양 성장 억제 효과 비교 결과를 나타내는 도이다. (A) 대조: 9% 자당의 결과를 나타낸다. (B) PMX : 암화학요법제만으로 처리 한 결과를 나타낸다. (C) TS 프리플렉스: TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 프리플렉스 만 처리한 결과를 나타낸다. (D) PMX + TS 프리플렉스: 암화학요법제와 NS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 프리플렉스와의 병용으로 처리한 결과를 나타낸다. (E) TS 리포플렉스: TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스만 처리한 결과를 나타낸다. (F) PMX + TS 리포플렉스: 암화학요법제와 NS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스와 병용으로 처리한 결과를 나타낸다.
도 12는, 암화학요법제, 및/또는 TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 또는 프리플렉스로 처리된 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 모델 마우스의 체중의 측정 결과를 나타낸다.
1. 리포솜
본 발명의 리포솜은 디오레오일포스파티딜에타놀아민(DOPE), 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질로 이루어진 지질 이중막으로 이루어진 구형의 중공체이다.
본 발명에서 사용할 수 있는 「포스파티딜콜린」은 이하 (i)-(iii)에서 선택되는 하나 이상의 특징이 있다:
(i) 탄소-탄소 간 이중 결합을 포함하는 불포화 지방 사슬을 적어도 하나 포함;
(ii) 시스(cis)형의 탄소-탄소 간 이중 결합을 포함하는 불포화 지방 사슬을 적어도 하나 포함;
(iii) 상전이 온도가 낮음(예를 들어, 0℃ 미만, -10℃ 미만, -20℃ 이하).
이러한 「포스파티딜콜린」으로는 1,2-디오레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DOPC), 팔미토일오레오일포스파티딜콜린(Palmitoyloleoylphosphatidylcholine; POPC), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC)을 꼽을 수 있다. 바람직하게는 DOPC이다.
본 발명에서 사용 가능한 「양이온성 지질」로는 O,O'-디테트라데카노일-N-(α-트리메틸암모니오 아세틸)디에탄올아민 클로라이드[ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonio acetyl)diethanolamine chloride](DC-6-14), N,N-디오레일-N,N-디메틸 암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸 암모늄 브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디오레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드(DOTAP), N-(1-(2,3-디오레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디메틸-(2,3-디오레일옥시)프로필 아민(DODMA) 및 이들의 유도체에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다. 바람직하게는 양이온성 지질은 DC-6-14이다.
바람직하게는 본 발명의 리포솜은 DOPE, DOPC 및 DC-6-14로 구성된다.
리포솜의 DOPE, 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질의 함유 비율(몰비)은 DOPE : 포스파티딜콜린 : 양이온성 지질 = 2~4 : 1~3 : 4~6의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 바람직하게는 DOPE : DOPC : DC-6-14 = 3 : 2 : 5 이다.
본 발명의 리포솜은 공지의 방법, 예를 들면 박막 진탕법(Bangham 법)에 따라 제조할 수 있다(AD Bangham et al., J. Mol. Biol. 13, 238-252 (1965); AD Bangham and RW Horne, J. Mol. Biol., 8, 660-668 (1964)). 즉, 포스파티딜 에탄올 아민, 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질을 각각 클로로포름 등의 유기 용매에 용해하고, 상기 소정량이 되도록 각각 취하여 플라스크 등의 용기 내에서 혼합한다. 이어서, 유기 용매를 휘발시켜 용기의 바닥에 지질 막을 형성시킨 후 거기에 완충액 등의 수용액을 넣고 교반하여 리포솜을 포함하는 현탁액을 얻을 수 있다. 또한, 본 명세서에서 「리포솜」를 「양이온 리포솜」이라고 부르는 경우가 있는데, 이 용어는 상호 호환적으로 사용된다.
또는 본 발명의 리포솜은 포스파티딜 에탄올 아민, 포스파티딜콜린 및 양이온성 지질을 각각 클로로포름 등의 유기 용매에 용해하고, 상기 소정량이 되도록 각각 취하여 유기 용매(예를 들어, 총 지질의 5 ~ 30 배 무게, 바람직하게는 5 ~ 15 배 무게, 더욱 바람직하게는 10 배 중량의 시클로헥산 및 시클로헥산의 1 내지 10 중량 %, 바람직하게는 1 내지 5 중량 %, 더욱 바람직하게는 2 중량 %의 알코올 (바람직하게는 에탄올))을 넣어 50 ~ 80℃, 바람직하게는 65 ~ 75℃로 가온하여 혼합 용해한다. 이어서, 얻어진 용액을 여과하여 유기 용매를 드라이 아이스 및 아세톤을 이용하여 동결 건조 작업으로 제거한 후(필요에 따라 분쇄) 거기에 완충액 등의 수용액을 넣고 혼합하여 리포솜을 포함한 현탁액을 얻을 수 있다. 이렇게 하여 얻은 리포솜을 본 명세서에서 「프리솜」또는 「양이온 프리솜」이라고 부르는 경우가 있다. 프리솜은 동결 건조 형태로 저장할 수 있다.
본 발명의 리포솜은 입경이 80 nm ~ 200 nm, 바람직하게는 약 100 nm이다. 또한, 본 발명의 리포솜의 제타 전위는 40 ~ 60 mV, 바람직하게는 약 50 mV이다. 본 발명의 리포솜이 상기 프리솜인 경우에는 입경이 100 nm ~ 600 nm, 바람직하게는 약 100 nm ~ 200 nm이다.
본 발명의 리포솜은, 활성 성분을 국소 투여하는 담체로 이용할 수 있다. 여기에서 「국소 투여」란 활성 성분을 직접 환부/병소 및/또는 그 근방에 투여하여, 해당 활성 성분을 환부/병소에 작용시키는 것을 목적으로 한다. 따라서, 본 발명에서 「국소 투여」는 정맥 주사 등을 이용하여 활성 성분을 전신에 작용시키는 것을 의도하는 것은 아니다. 국소 투여는 예를 들면, 근육 내, 복강 내, 흉강 내, 피하, 피 내, 안구 내, 뇌 내, 뇌 척추 강 내, 질 내, 직장 내 장기에 종양 내로 주사 표피에 도포 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 「국소 투여」는 강 내 투여이며, 더욱 바람직하게는 흉강 내 투여 또는 복강 내 투여이다. 「활성 성분」으로 의약품 또는 화장품의 유효 성분을 의미하며, 예를 들면, DNA, RNA, DNA·RNA 하이브리드, 단백질, 펩타이드, 화합물 등을 들 수 있다.
2. 조성물
본 발명의 조성물은 상기 본 발명의 리포솜과 활성 성분을 포함하고, 상기 활성 성분을 국소 투여하는 데 이용할 수 있다.
활성 성분은 상기 기재한 것을 들 수 있고, 특별히 한정되지 않지만 예를 들어, 종양 세포에서 발현하고 종양 세포의 증식에 관여하는 인자를 코딩하는 유전자의 발현을 RNAi 작용에 의해 억제할 수 있는 siRNA 또는 shRNA 등을 들 수 있다. 「종양 세포에서 발현하고 종양 세포의 증식에 관여하는 인자를 코딩하는 유전자」로는, 예를 들어 티미딜산 합성 효소, VEGF, EGFR, PDGF, HGF, Wint, Bcl-2, 서바이빈(survivin) 등의 증식 조절 인자군, 리보 뉴클레오티드 환원 효소, DNA 중합 효소 등의 핵산 합성 관련 효소군 등을 코드하는 유전자가 있으나 이에 한정되지 않는다. 이러한 유전자의 유전자 정보는 GenBank 등의 공지의 데이터베이스에 개시되어 있으며, 이러한 유전자 정보를 바탕으로 siRNA 또는 shRNA를 설계·합성할 수 있다. 티미딜산 합성 효소의 발현을 RNAi 작용에 의해 억제할 수 있는 shRNA 대해서는 아래에 설명되는 것을 사용할 수 있다. 또한 활성 성분으로, 항암제 및 암화학요법제를 사용할 수도 있다.
본 발명의 조성물에서, 활성 성분은 리포솜의 지질 이중 막에 둘러싸인 중공 부에 포함될 수 있고, 혹은 지질 이중 막의 외막 표면에 결합시켜도 좋다. 바람직하게는 활성 성분은 리포솜의 지질 이중 막의 외막 표면에 결합되어 있다.
본 발명의 조성물은 또한 리포솜과 활성 성분과 함께, 의약품 또는 화장품의 제조에 일반적으로 이용되고 있는, 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 희석액, 용해 보조제, 현탁제, 등장화제, pH 조절제, 완충제, 안정제, 착색제, 교미제, 교취제, 히스티딘 등을 포함할 수 있다.
부형제로서는 예를 들면, 유당, 자당, 염화나트륨, 포도당, 맥아당, 만니톨, 에리스리톨, 자일리톨, 말티톨, 이노시톨, 덱스트란, 소르비톨, 알부민, 요소, 전분, 탄산 칼슘, 카올린, 결정 셀룰로오스, 케이산, 메틸 셀룰로오스, 글리세린, 알긴산 나트륨, 아라비아 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 활택제로는, 예를 들어 정제 탈크, 스테아르산염, 붕사, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 결합제로는, 예를 들어, 단 시럽, 포도당액, 전분액, 젤라틴 용액, 폴리 비닐 알코올, 폴리 비닐 에테르, 폴리 비닐 피롤리돈, 카르복시 메틸 셀룰로오스, 셸락, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 물, 에탄올, 인산 칼륨 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 붕괴제로는 예를 들면, 건조 전분, 알긴산 나트륨, 한천 분말, 라미나란 분말, 탄산 수소 나트륨, 탄산 칼슘, 폴리 옥시 에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 류, 라우릴 황산나트륨, 스테아린산 모노글리세리드, 전분, 유당 및 이들의 혼합물 등이 꼽힌다. 희석제로는, 예를 들어 물, 에틸 알코올, 매크로 골, 프로필렌 글리콜, 에톡시화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시 에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 류 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 안정화제로는 예를 들면, 피로 아황산 나트륨, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산, 티오 글리콜 산, 티오 유산 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 등장화제로서, 예를 들면, 염화나트륨, 붕산, 포도당, 글리세린 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. pH 조정제 및 완충제로는, 예를 들어, 구연산 나트륨, 구연산, 초산 나트륨, 인산 나트륨 및 이들의 혼합물 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 국소 투여에 적합한 제형으로 할 수 있어, 주사제, 현탁 제, 유화제, 연고제, 크림제 정제 등의 각종 제제 형태로 제조할 수 있다.
3. 항종양제
본 발명의 항종양제는 상기 본 발명의 리포솜과 활성 성분으로, RNAi 작용에 의해 티미딜산 합성 효소 (이하, 「TS」라고 기재한다)의 발현을 억제할 수 있는 shRNA를 포함한다.
본 발명에서의 TS의 발현을 억제할 수 있는 shRNA는 TS의 mRNA를 표적으로 하여 TS 특이적으로 RNAi 작용을 나타내고, TS의 발현을 현저하게 억제할 수 있다. 여기에서 「mRNA를 표적으로 한다」는, 아래에 설명하는 shRNA의 안티센스 가닥이 표적 mRNA와 스트린젠트(stringent) 조건 하에서 하이브리다이즈 할 수 있는 것을 말한다.
스트린젠트 조건은 통상적인 방법에 따라 하이브리드를 형성하는 핵산의 융해 온도(Tm)에 따라 구할 수 있다. 예를 들어, 하이브리다이즈 상태를 유지할 수있는 세정 조건으로 보통 「1 x SSC, 0.1% SDS, 37℃」정도의 조건, 보다 엄격한 것은「0.5 x SSC, 0.1% SDS, 42℃」정도의 조건, 더 엄격하게는 「0.1 x SSC, 0.1% SDS, 65℃」정도의 조건을 들 수 있다.
본 발명의 shRNA는, TS를 코드하는 ORF의 염기 서열 또는 그 일부에 동일한 염기 서열을 갖는 센스 가닥과 해당 센스 가닥과 스트린젠트 조건 하에서 하이브 리다이즈하는 안티센스 가닥을 포함한다. 여기에서 「ORF의 염기 서열 또는 그 일부에 동일한 염기 서열」은 ORF의 염기 서열 중 티민을 우라실로 치환하여 표현되는 염기 서열 또는 그 일부에 동일한 염기 서열을 의미한다.
해당 센스 가닥은 15 ~ 25 염기, 바람직하게는 19 염기로 구성된다. 센스 가닥의 염기 서열은 TS를 코드하는 ORF의 염기 서열과 동일한 것이 바람직하지만, 실질적으로 동일한, 즉 상동 배열 이어도 좋다. 즉, 센스 가닥의 염기 서열은 ORF의 염기 서열에서 1 이상 즉 1 ~ 3의 염기, 바람직하게는 1 ~ 2 염기, 보다 바람직하게는 1 염기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가가 있어도 좋다.
해당 안티센스 가닥은 센스 가닥 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 가진다. 안티센스 가닥은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈 가능한 1 ~ 3의 염기, 바람직하게는 1 ~ 2 염기, 보다 바람직하게는 1 염기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 불일치를 가지는 것이어도 좋다. 바람직하게는 안티센스 가닥은 센스 가닥과 완전히 상보적인 염기 서열로 구성된다.
센스 가닥과 안티센스의 염기 서열은 TS를 코드하는 공지의 염기 서열(GenBank : CR601528.1)에 따라 선택할 수 있다. 이러한 염기 서열을 선택하는 방법으로 다양한 방법이 알려져 있으며, 예를 들어, siRNA Design Support System(다카라 바이오 주식회사) 등을 이용하는 것이 가능하다.
본 발명에서 센스 가닥으로 다음의 염기 서열로 이루어진 것을 들 수 있지만 이에 국한되지 않는다: 5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3'(서열번호 1); 5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3'(서열번호 3); 5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3'(서열번호 5); 5'-GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3'(서열번호 9).
바람직하게는 본 발명의 shRNA는 센스 가닥 5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3'(서열번호 1)와 안티센스 가닥 5'-UCAUGAUCGAUGGUGUUAC-3'(서열번호 2); 센스 가닥 5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3'(서열번호 3)와 안티센스 가닥 5'-AUUCCAUAUCUCUGUAUUC-3'(서열번호 4); 또는 센스 가닥 5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3'(서열번호 5)와 안티센스 가닥 5'-ACACUCUACAUCAUGAUCG-3'(서열번호 6); 센스 가닥 5'-GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3'(서열번호 9)와 안티센스 가닥 5'-AACAACUCCUCCAAAACACCC-3'(서열번호 10)를 포함한다.
더욱 바람직하게는 본 발명의 shRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 가닥 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 포함한다.
센스 가닥과 안티센스 가닥은 링커 부분을 통해 연결되며, 해당 링커 부분이 루프를 형성함으로써 축소되어, 해당 안티센스 가닥과 해당 센스 가닥이 하이브리다이즈하여 이중 가닥 부분을 형성한다. shRNA 분자에 포함된 링커 부분은 센스 가닥과 안티센스 가닥을 연결하고 시스템 루프 구조를 형성할 수 있는 한 폴리뉴클레오티드 링커이어도, 비 폴리뉴클레오티드 링커 이어도 좋고, 특별히 한정하지 않지만, 당업자에게 공지된 2 ~ 22 염기의 폴리뉴클레오티드 링커가 바람직하다. 구체적으로는 UAGUGCUCCUGGUUG(서열번호 7), UUCAAGAGA, CCACC, CUCGAG, CCACACC, UUCAAGAGA, AUG, CCC 및 UUCG로 예시할 수 있으며, UAGUGCUCCUGGUUG(서열번호 7)이 바람직하다.
본 발명의 shRNA는 3'말단에 적어도 2 염기로 구성된 오버행을 가진다.
본 발명에서 오버행은 안티센스 가닥의 3'말단에 부가된 염기이며, 센스 가닥의 해당 위치에 상보적으로 결합할 수 있는 염기가 존재하지 않는 염기를 말한다. 안티센스 가닥의 3'말단에 오버행을 가지고 있지 않은 경우, 오버행을 가지고있는 경우에 비해 본 발명의 리포솜을 이용힌 트랜스펙션(transfection)에서, shRNA에 따른 TS의 발현 억제의 정도가 약 40 ~ 60% 감소한다. 해당 오버행의 염기의 종류와 숫자가 제한되지 않고, 예를 들어 1 ~ 5, 바람직하게는 1 ~ 3, 더욱 바람직하게는 1 또는 2 염기로 구성된 배열을 들 수 있으며, 예를 들어, TTT, UU 또는 TT를 들 수 있다. 바람직하게는 UU이다.
본 발명에서 바람직한 shRNA로는 서열번호 8로 표시되는 염기 서열로 이루어진 단일 가닥 RNA이다.
또한, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 필요에 따라 5' 말단이 인산화되어 있어도 좋고, 5' 말단에 삼인산(ppp)이 결합되어 있어도 좋다.
상기 shRNA는 본 발명의 리포솜의 지질 이중 막의 외막 표면에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하고 있다. 상기 shRNA와 리포솜의 결합시에는 상기 shRNA와 리포솜을 포함한 혼합액을 1 ~ 15 분간, 바람직하게는 10 분 정도 격렬하게 교반(예를 들어 초음파 교반 등) 하는 것이 바람직하다. 교반을 추가하여, 얻어진 shRNA를 갖춘 리포솜의 입경을 수백 nm 크기로 조제할 수 있다(Barichello, JM, et al., Int. J. Pharm. (2011)). 또한 교반을 추가하여 리포솜에 상기 shRNA를 균일하게 분산시켜 결합시킬 수 있으며, shRNA 불균일한 결합으로 인해 침전된 조직에 의한 리포솜 수확 불균일성을 방지할 수 있다. 또는 리포솜이 프리솜인 경우에는 상기 프리솜을 포함한 현탁액에 shRNA를 첨가하여 혼합(예를 들어 복텍스 작업 등)하여 프리솜 지질 이중 막의 외막 표면에 shRNA를 결합시킬 수 있다.
본 발명에서 shRNA를 갖춘 리포솜은 입경이 200 ~ 600 nm, 바람직하게는 약 300 ~ 400 nm이다. 또한 본 발명에서 shRNA를 갖춘 프리솜는 입경이 200 nm ~ 2㎛, 바람직하게는 약 300 nm ~ 1 ㎛이다. 본 발명에서 shRNA를 갖춘 리포솜은 제타 전위가 0 ~ 50 mV, 바람직하게는 약 25 ~ 35 mV이다.
본 발명의 shRNA를 갖춘 리포솜은 TS의 발현을 억제할 수 있는 shRNA에 더해서, 종양 세포에서 발현하고 종양 세포의 증식에 관여하는 인자를 코딩하는 유전자의 발현을 RNAi 작용에 의해 억제 가능한 siRNA 또는 shRNA를 포함할 수 있다. 이러한 siRNA 또는 shRNA로는 상기에 정의된 것을 사용할 수 있다. TS의 발현을 억제할 수 있는 shRNA 및 이 외의 siRNA 또는 shRNA,는 동일한 리포솜에 결합하고 있어도 좋고, 별도의 리포솜에 결합하고 있어도 좋다.
또한, 본 명세서에서 shRNA를 갖춘 리포솜을 「리포플렉스」라고 부르는 경우가 있다. 또한 shRNA를 갖춘 프리솜을 「프리플렉스」라고 부르는 경우가 있다.
하기 실시 예에서 기술 한 바와 같이, 국소 투여에 의해 상기 shRNA를 갖춘 리포솜은 종양 세포의 증식을 억제할 수 있으며, 암을 치료하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 항종양제를 사용하여 치료할 수 있는 암으로는, TS를 고발현하는 암을 들 수 있고, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 결장·직장암, 간암, 신장암, 두경부암, 식도암, 위암, 담도암, 담낭·담관암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 방광암, 전립선암, 악성 흉막 중피종, 고환 종양, 난소암, 뼈·연부 육종, 피부암, 뇌종양 등을 들 수 있다. 또한 암성 늑막염과 암성 복막염도 본 항종양제로 치료 가능하다. 치료 후보로서, 바람직하게는 위암, 폐암, 담도암, 간암, 악성 흉막 중피종, 난소암, 암 늑막염과 복막염이며, 특히 바람직하게는 악성 흉막 중피종 원격 전이가 없는 비소 세포 폐암, 암성 흉막염, 위암의 복막 파종 전이, 난소암의 복막 파종 전이, 암 성 복막염이다.
본 발명의 항종양제는 또한 shRNA를 갖춘 리포솜과 함께 의약의 제조에 통상적으로 사용되는, 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 희석액, 용해 보조제, 현탁 제, 등장화제, pH 조절제, 완충제, 안정제, 착색제, 교미제, 교취제, 히스티딘 등을 포함할 수 있다. 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 희석제, 안정제, 등장화제, pH 조정제로는 위에 정의된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 항종양제는 국소 투여하여 투여할 수 있다. 국소 투여는 위에 정의된 것을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 국소 투여에 적합한 제형으로 할 수 있으며, 주사제, 현탁제, 유화제, 스프레이제 등의 각종 제제 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 항종양제의 효과는 상기 암에서 유래하는 세포나 조직, 및 상기 암에 이환하는 개체에 해당 항종양제를 투여하여 종양의 크기가 해당 항종양제를 투여하지 않은(또는 투여 전) 세포와 조직, 및 개인의 종양의 크기와 비교하여 종양이 축소 또는 소멸하고 있음을 지표로 하여 평가하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 항종양제의 효과는 상기 암에서 유래한 세포나 조직, 및 상기 암에 이환하는 개체에 해당 항종양제를 투여하고, 해당 항종양제를 투여하지 않은 개체와 비교하여, 생존율의 향상(연명 효과), 흉수와 복수가 감소 또는 소멸하고 있는지를 지표로 하여 평가하는 것이 가능하다.
본 발명의 항종양제는 기존의 암화학요법과 암화학요법제와 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 항종양제와 병용할 수 있는 암화학요법과 암화학요법제로는 본 발명의 리포솜이 종양 조직에 침투하기 쉽도록 종양 환경을 개변할 수 있는 것이면 좋고, 예를 들면 기존의 암화학요법은 하기에 기재하는 「TS 저해 작용을 갖는 항종양제」를 이용한 화학 요법을 들 수 있으며, 기존의 암화학요법제로는 TS 저해 작용을 갖는 항종양제를 들 수 있다.
「TS 저해 작용을 갖는 항종양제」로서, TS의 기능을 저해할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 5-FU 계 항종양제, 페메트렉스드 나트륨 수화물(Pemetrexed Sodium Hydrate), 랄티트렉스드(raltitrexed; Tomudex), 메토트렉스에이트(Methotrexate; MTX) 등을 들 수 있다.
TS의 발현과 5-FU 계 항종양제의 감수성의 관계가 보고되고 있다(Patrick G. Johnston et al., Cancer Res 1995; 55 : 1407-12. 그리고 Kun-Huei Yeh et al., Cancer 1998; 82 : 1626-31). 암 환자 중에서도 TS의 발현이 상대적으로 낮은 암 환자는 5-FU 계 항종양제가 현저하게 효과가 나타나면서도, 암 환자 중에서도 TS의 발현이 상대적으로 항진하고 있는 암 환자의 대부분은, 5-FU 계 항종양제에 내성을 가진다. 페메트렉스드 나트륨 수화물에 대해서도 TS의 발현량 사이에 유사한 관계가 보인다. 본 발명의 항종양제를 투여하여 종양 조직의 TS의 생산을 억제할 수 있으며, 해당 종양 조직의 TS 저해 작용을 갖는 항종양제의 감수성을 높일 수 있다. 또한, 본 발명의 항종양제는 TS 저해 작용을 갖는 항종양제와 병용한 경우, 종양 내에 선택적으로 축적되어 shRNA를 종양 세포에 효율적으로 전달할 수 있다. 따라서 TS 저해 작용을 갖는 항종양제와 병용한 경우, 본 발명의 항종양제는 TS 저해 작용을 갖는 항종양제 또는 본 발명의 항종양제를 단독으로 사용한 경우에 비해 현저하게 높은 항종양 효과를 얻을 수 있다.
「5-FU 계 항종양제」로써는, 5-FU 및 활성 대사 산물이 5-FU인 5-FU 유도체를 들 수 있다. 5-FU 유도체로는 예를 들어, 테가푸르(Tegafur)를 함유하는 것을 들 수 있다. 5-FU 유도체로는 바람직하게는 테가푸르 함유 배합제이며, 구체적으로는 테가푸르·우라실 배합제(예를 들어, 유-에프티(등록 상표)(대호 약품 공업 주식회사)), 테가푸르·기메라실·오테라실칼륨(Tegafur·Gimeracil·Oteracil potassium) 배합제 등이 예시될 수 있다. 이 중에서도 테가푸르·기메라시루·오테라실칼륨 배합제, 예를 들어 티-에스원(등록 상표)(대호 약품 공업 주식회사)가 특히 바람직하다.
또한 페메트렉스드 나트륨 수화물로는 알림타(alimta)(등록 상표)(일본 이-라이릴리 주식회사)를 들 수 있다. 페메트렉스드 나트륨 수화물도 상기 5-FU 계 항종양제와 마찬가지로, 본 발명의 항종양제와 병용하면 해당 페메트렉스드 나트륨 수화물 또는 본 발명의 항종양제를 단독으로 사용한 경우와 비교하여 현저하게 높은 항종양 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 항종양제는 상기 TS 저해 작용을 갖는 항종양제에 더해서, 또는 교환하여, 다른 기존의 암화학요법제와 함께 사용할 수 있다. 이러한 암화학요법제로는 시클로포스파미드, 니트로겐 머스타드 N- 옥사이드, 이호스파사미드, 멜파란, 부스르판, 미토부로니톨, 칼보콘, 티오테파, 라니머스틴, 니머스틴, 테모조로미드, 카르머스틴, 페메트렉스드 디소듐, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린 리보사이드, 머캅토퓨린, 독시플루오리딘(Doxifluridine), 카르모푸르(carmofur), 시타라빈, 시타라빈 옥포스페이트(cytarabine ocfosfate), 에노시타빈, 겜시타빈, 후루다라빈, 페메트렉스드, 시스플라틴, 카루보플라틴, 옥사리플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 염산이리노테칸, 카페시타빈 등을 들 수 있으며, 이들로부터 선택되는 하나 이상의 암화학요법제를 사용할 수 있다. 이러한 암화학요법제에도 상기 TS 저해 작용을 갖는 항종양제와 마찬가지로, 본 발명의 항종양제와 병용하면 shRNA를 종양 세포에 효율적으로 전달 할 수 있으며 해당 암화학요법제 또는 본 발명의 항종양제를 단독으로 사용한 경우에 비해 현저하게 높은 항종양 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 항종양제 및 상기 기존의 암화학요법제와 병용 투여되는 한 조합 물로 제공할 수 있다.
본 발명의 항종양제는 상기 기존의 암화학요법제와 함께 「조합물」의 형태로 할 수 있다. 「조합물」은 본 발명의 항종양제 및 상기 기존의 암화학요법제를 유효 성분으로 함유하는 배합제 이어도 좋고, 또한 본 발명의 항종양제 및 상기 기존의 암화학요법제를 병용 투여에 적합한 단일 패키지(키트 제제)로 제조·포장·유통되는 것이어도 좋다.
「병용투여」는 본 발명의 항종양제 및 상기 기존의 암화학요법제를 동시에 투여하는 경우뿐만 아니라, 본 발명의 항종양제 및 상기 기존의 암화학요법제를 간격을 두고 투여하는 경우도 포함된다. 본 발명의 항종양제 및 상기 기존의 암화학요법제 투여 경로 및 투여 방법은 동일하여도 좋고, 차이가 나도 좋다.
본 발명의 항종양제 투여량 및 투여 횟수는 환자의 나이, 체중, 질환의 위독도 등의 요인에 따라 달라질 수 있지만, shRNA 양에서 1 회에 체중 1 kg 당 0.0001 mg ~ 100 mg의 범위에서 적절히 선택되는 양을 하루에 1 ~ 3 회 매일 또는 1 ~ 21 일마다 투여할 수 있다.
상기 기존의 암화학요법제의 투여량은 유효 성분인 화학 물질의 종류, 환자의 나이, 체중, 질환의 위독도 등의 요인에 따라 달라질 수 있지만 1회에 체중 1 kg 당 0.0001 mg ~ 1000 mg 범위에서 적절히 선택되는 양을 하루에 1 ~ 3 회 매일 또는 1 ~ 14 일마다 투여할 수 있다. 예를 들어, 기존의 암화학요법제 5-FU 계 항종양제 경우 하루에 테가푸르를 60 ~ 160 mg을 매일 또는 1-7 일마다 투여할 수 있다. 또한 기존의 암화학요법제를 페메트렉스드 나트륨 수화물인 경우 하루에 500 ~ 1000 mg을 매일 또는 1-7 일마다 투여할 수 있다. 상기 기존의 암화학요법제는 단독으로 사용하는 경우에 비해 저용량에 여러 차례 투여가 가능하다. 따라서 상기 기존의 암화학요법제 투여에 의해 나타나는 부작용(예를 들어, 골수 억제, 용혈성 빈혈, 파종 성 혈관 내 응고 증후군, 극증간염, 탈수증상, 장염, 간질성 폐렴, 구내염, 소화관 궤양, 소화관 출혈, 소화관 천공, 급성 신부전, 피부 점막 눈 증후군, 중독성 표피 괴사증, 정신 신경 장애, 급성 췌장염, 횡문근 융해증, 후각 탈실 등 이에 국한되지 않음)의 발병을 억제 또는 지연되게 할 수 있다.
4. 치료 방법
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 항종양제를 이용한 암 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법으로 치료할 수 있는 암은 위에 정의된 것과 같은 암이 포함된다. 또한 해당 방법에 있어서 상기 본 발명의 항종양제 및 기존 암화학요법제의 용법 및 용량은 상기 기술한 바와 같다.
(실시 예)
이하 실시 예를 나타내고, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시 예에 제한되는 것은 아니다.
[실시 예 1]
In vitro 에서 TS 를 표적으로 하는 shRNA 와 알림타 병용에 의한 세포 증식 억제 효과
(TS를 표적으로 하는 shRNA)
TS를 표적으로 하는 shRNA(이하 「TS-shRNA」라고 기재한다)는 TS의 발현을 억제 할 수 있으며, 또한 항종양 효과가 이미 확인된 공지의 shRNA(WO 2012/161196 참조)에 따라, 하기의 서열을 갖는 것을 합성하였다.
TS-shRNA :
5'-GUAACACCAUCGAUCAUGAUAGUGCUCCUGGUUGUCAUGAUCGAUGGUGUUACUU-3 '(서열번호 8)
한편 대조군으로써 표적이 되는 mRNA가 존재하지 않는 하기의 서열을 갖는 shRNA를 사용하였다. 이하, 대조 shRNA를 「NS-shRNA」라고 기재한다.
NS-shRNA :
5'-UCUUAAUCGCGUAUAAGGCUAGUGCUCCUGGUUGGCCUUAUACGCGAUUAAGAUU-3 '(서열번호 11)
(MTT 분석)
본 실험에서는 96 웰 플레이트 스케일에서 실험을 실시했다. 트랜스펙션(transfection)은, 양이온 리포솜의 일종인 Lipofectamine(등록 상표) RNAi MAX(Lf RNAi MAX)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 수행하였다.
300 pmol의 상기 shRNA(TS-shRNA 또는 NS-shRNA)와 15 ㎕의 Lf RNAi MAX를 각각 500 ㎕가 되도록 OptiMEM으로 희석하여, 두 용액을 혼합하여 10 ~ 20 분간 실온에서 방치하여 복합체(리포플렉스)을 형성시켰다. 미리 24 시간 전에 인간 악성 흉막 중피종 세포(MSTO-211H) 현탁액(2,000 세포/100 ㎕)를 파종해 놓은 웰에 50 ㎕의 리포플렉스를 첨가하여 최종 합계 용적을 150 ㎕로 하였다(웰에서 shRNA 최종 농도는 5 nM과 10 nM이 되도록 조정했다). 트랜스펙션(transfection)의 시작에서 24 시간 후 배지를 제거하고, 기존의 암화학요법제 「알림타(페메트렉스드 나트륨 수화물 : PMX)」(이-라이릴리)를 0.01 ㎍/mL의 농도로 포함하거나 해당 암화학요법제를 포함하지 않는 새로운 배지를 200 ㎕ 첨가하였다. 새로운 배지를 첨가하여 0, 24, 48, 72, 96 시간 후 배지를 제거하고 0.5% MTT(3-(4,5-디메틸 티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라 졸륨 브로마이드) 용액을 50 ㎕ 추가하고, 4 시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양했다. 또한 세포가 들어 있지 않은 웰에도 0.5% MTT 용액을 첨가하여 백그라운드로 하였다.
배양 종료 후, 각 웰에 산성 이소프로판올 150 ㎕을 넣고 쉐이커를 이용하여 포르마잔 결정을 용해하여 플레이트 리더를 이용하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 세포의 증식률을 다음 식을 이용하여 계산하였다.
세포의 증식률(%) = [A570(새로운 배지를 첨가하여 X 시간 후)/A570(새로운 배지를 첨가하여 0 시간 후)] × 100
결과를 도 1에 나타낸다.
도 1에서와 같이 TS-shRNA는 PMX의 존재 하에서, MSTO-211H 세포의 증식을 시간 의존적으로 현저히 저해했다.
[실시 예 2]
TS - shRNA 에 따른 TS 발현 억제
(트랜스펙션)
트랜스펙션(transfection)은 양이온 리포솜의 일종인 Lipofectamine(등록 상표) RNAi MAX(Lf RNAi MAX)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 수행하였다.
실시 예 1에서 제조한 리포플렉스를 본 실시 예에서도 사용하였다.
MSTO-211H 세포 현탁액 10 mL를 10 cm 접시에 500,000 세포/접시가 되도록 첨가하고, 미리 24 시간 배양하였다. 여기에 각 리포플렉스를 직접 첨가(최종 합계 양은 15 mL)로 트랜스펙션을 수행하였다. 이때, TS-shRNA 또는 NS-shRNA의 최종 농도가 5 nM 또는 10 nM이 되도록 조정했다. 대조는 shRNA으로 처리하지 않았다. 트랜스펙션 시작 후 37℃, 5% CO2 조건하의 배지에서 72 시간 배양 한 후, 다음 방법으로 세포 추출액을 제조하였다.
(세포 추출액의 조제)
트랜스펙션을 시작하고 72 시간 후 배지를 제거하고 차가운 PBS(-)로 세척 한 후 트립신 용액을 사용하여 세포를 떼어내고 원심 분리하여 상청을 제거했다. 또한 차가운 PBS(-)로 세정한 후, 냉 Lysis buffer(50 mM Tris-HCl(pH7.4), 1% NP-40, 0.25% 데옥시콜산 나트륨, 150 mM NaCl 및 Protease Inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich, MO, USA))를 100 ~ 150 ㎕ 첨가하여 1 시간 얼음(4℃)의 조건하에서 배양하여 세포를 용해시켰다. 그 후, 원심 분리(15,000×g, 15 분, 4℃)하여 얻어진 상층액을 세포 추출액으로 하였다.
(SDS-PAGE 샘플의 조제)
상기 세포 추출액과 2×샘플 버퍼를 동량 혼합하여 95℃로 설정한 마이크로 튜브용 핫플레이트를 이용하여 3 분간 가열했다. 그 후 30 초간 원심 분리하여 실온에서 식혀 SDS-PAGE 용 샘플로 하였다.
(SDS-PAGE)
상기 샘플을 6 ㎕ (9 ㎍ 단백질/레인) 씩 12% 폴리아크릴아미드겔에 적용하여 전원 공급 장치(Bio-Rad laboratories)와 연결하여 젤 2 장 40 mA(겔 1 장에서 20 mA)의 정전류에서 약 80 분간 전기 영동 하였다.
(웨스턴 블로킹)
적당한 크기로 자른 여과지 및 Hybond-ECL을 전처리로써 블로킹 버퍼에 침지하였다. SDS-PAGE 후, 전송 장치를 이용하여 단백질을 Hybond-ECL에 전사하였다. 전사한 Hybond-ECL을 블로킹 버퍼(5% 탈지)에 담가 실온에서 1 시간 블로킹하고 Tween buffer로 5 분간 3 회 세척하였다.
TS 및 β-액틴을 검출하기 위해 Tween buffer로 희석한 각각의 일차 항체(Mouse monoclonal anti-human TS antibody (1 : 1000) (ANASPEC, Inc. CA, USA) Mouse monoclonal anti-human β-actin antibody (1 : 500)(Abcam, Tokyo, Japan))를 4℃에서 밤새 반응시켰다. Tween buffer로 5 분간 3 회 세척 후 Tween buffer에 희석한 이차 항체(HRP-conjugated goat anti-mouse secondary antibody (1 : 2000) (ICN Biomedical, CA, USA)) 용액을 실온에서 1 시간 반응시켰다. Tween buffer로 5 분간 3 회 세척 후 ECL Chemiluminescence Reagent(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)로 약 1 분간 반응시켰다. 목적 단백질의 밴드는 LAS-4000 EPUVmini(Fujifilm)을 사용하여 가시화, 촬영, 소프트웨어(Multi Gauge v.3.2 (FujiFilm, Tokyo, Japan))을 이용하여 정량화하였다.
결과를 도 2에 나타낸다.
도 2에 나타난 바와 같이, 실시 예 1에서 제조한 TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스가 서열 특이적이고 농도 의존적으로 MSTO-211H 세포에서 TS의 발현을 현저하게 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
[실시 예 3]
In vitro 에서 Luciferase - shRNA 의한 루시페라제 발현 억제
(루시페라제 발현 세포주 제작)
반딧불 유래 루시페라제 유전자를 도입한 플라스미드(pGL3-control, 프로메가 사) 및 표고버섯 유래 루시페라제 유전자를 도입한 플라스미드(pRL-TK, 프로메가 사)의 트랜스펙션은, 양이온 리포솜의 일종인 Lipofectamine(등록 상표) 2000(Lf 2000)을 이용하여 제조업체의 지시 사항을 따라 수행하였다.
HT-1080 세포 현탁액을 12 웰 세포 배양용 접시에 100,000 세포/웰(1 mL)이되도록 첨가하고, 미리 12 시간 배양하였다. 배양 상청액의 제거, PBS를 이용한 1회 세척 후, 각 웰에 두 루시페라아제 플라스미드를 포함하는 트랜스펙션 용액(200 ㎕)을 첨가하여, 루시페라제 발현 플라스미드의 트랜스펙션을 실시했다. 이때, 각 플라스미드의 최종 농도가 1 ㎍/200 ㎕가 되도록 조정했다. 트랜스펙션 시작 후 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
(양이온 리포솜의 조제)
하기와 같은 방법으로 양이온 리포솜을 조제하였다.
리포솜을 구성하는 지질은 하기에서 선택하여 사용했다: DOPC(1,2-디오레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), POPC (1-팔미토일-2-오레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DOPE(1,2-디오레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DC-6-14(O,O'-디테트라데카노일-N-(α-트리메틸 암모니오아세틸)디에탄올 아민 클로라이드). 이러한 지질은 미리 클로로포름에 용해시켜 스톡 용액으로 하였다.
지질 조성이 DOPE : X : DC-6-14 = 3 : 2 : 5 (몰비, X = DOPC 또는 POPC)가 되도록 각각 스톡 용액에서 유리 주사기를 사용하여 정확하게 달아 취하여 마개 달린 시험관에 넣고 혼합하였다(총 지질량으로 200 mmol). 다음은 회전식 감압 농축기(IWAKI 도쿄)를 이용하여 감압 하에서 클로로포름을 제거한 다음 완전히 클로로포름을 제거하기 위해 시험관을 밤새 진공 펌프에 넣고 시험관 내에 지질 박막을 형성시켰다. 이 지질 박막에 내수 상으로 2 mL의 9% 자당 용액(30 mL, pH 7.4)을 가하여 37℃에서 격렬하게 교반하여 지질 박막을 완전히 수화하여, MLV(multilamellar vesicle)을 얻었다(최종 지질 농도는 100 mM). 이 용액을 37℃로 가온하면서 200 nm, 100 nm, 50 nm의 폴리카보네이트 막(Nucleopore, CA, USA)을 이용하여 extrusion 법에 의해 입자 지름이 약 100 nm가 되는 LUV(large unilamellar vesicle)을 준비했다.
(루시페라제(Luc)을 대상으로 하는 shRNA)
Luc을 표적으로 하는 shRNA(이하 「Luc-shRNA」라고 기재한다)은 이하의 배열을 가진다.
Luc-shRNA :
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAUAGUGCUCCUGGUUGUCGAAGUACUCAGCGUAAGUU-3 '(서열번호 12)
(리포플렉스의 조제)
리포플렉스는 상기 양이온 리포솜과 shRNA를 양이온 리포솜 : shRNA = 800, 400 또는 200 : 1 (몰비)가 되도록 혼합하여 10 분 동안 격렬하게 교반하여 제조하였다. shRNA가 양이온 리포솜에 완전히 흡착하는지는 2% 아가로오스겔에서 전기 영동하여 유리 shRNA가 존재하지 않는 것으로 확인했다.
(In vitro에서 루시페라제 발현 억제)
상기 루시페라제 발현 세포주에 각 리포플렉스 shRNA 량의 최종 농도 50 nM이 되도록 각각 투여하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 48 시간 배양하였다. 배양 종료 후, Dual Luciferase Reporter Assay System(프로메가 사)를 이용하여 제조업체의 지침을 사용하여 세포 추출액의 조제 및 루시페라아제 활성을 측정하였다. 즉, 배양 종료 후, 배지를 제거하고 차가운 PBS(-)로 세척 한 후, Passive Lysis Buffer 150 ㎕/웰 첨가하고, 선회형 셰이커에 의해 진탕하면서 실온에서 15 분간 배양하여 세포를 용해하였다. 그리고 샘플 튜브에 옮겨 -80℃에서 30 분간 냉각시킨 후 실온으로 되돌렸다. 원심 분리(9,000×g, 30 초 동안 4℃)하여 얻어진 상층액을 세포 추출액으로 하였다. 이어 Luciferase Assay Reagent II 용액을 50 ㎕ 씩 분주 한 96 웰 백색 마이크로 플레이트에 대하여, 전술한 세포 추출액을 10 ㎕ 씩 첨가하여 피펫을 사용하여 혼합했다. 마이크로 플레이트를 루미노미터 Infinite M200 Pro(Tecan 사)로 설정하여, 반딧불 유래 Luciferase 활성에 의한 화학 발광을 10 초 동안 측정했다. 측정 후 접시를 꺼내 각 웰에 Stop & Glo Reagent 용액을 50 ㎕ 씩 첨가하여 가볍게 소용돌이하여 혼합한 후 즉시 루미노미터를 이용한 바다 표고 버섯 유래 루시페라아제 활성에 의한 화학 발광을 동일하게 측정했다. 데이터 분석에는 바다 표고 버섯 루시페라아제 활성 값을 내부 컨트롤로 표준화하고 shRNA 처리를 하지 않은 대조군에 대한 상대적인 반딧불 Luciferase 활성을 측정하여 평가했다.
결과를 도 3에 나타낸다. 또한,도 3의 결과는 대조 루시페라아제 활성을 100%로 하는 상대 값으로 나타낸다.
도 3에 표시된 대로 Luc-shRNA 처리를 하지 않은 대조군에 비해 DOPC 또는 POPC을 포함한 어느 리포플렉스를 이용한 경우에도 루시페라아제 활성의 저하가 보였다. 이것은 Luc-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스가 HT-1080 세포의 루시페라아제 발현을 억제할 수 있음을 보여주고 있다. 또한 POPC 포함 리포플렉스에 비해 DOPC을 포함하는 리포플렉스 쪽이 Luc-shRNA 의한 발현 억제 효과가 높은 것으로 나타났다. 또한 Luc-shRNA : 양이온 리포솜의 몰비가 1 : 800 인 경우, Luc-shRNA 의한 발현 억제 효과가 높은 것으로 나타났다.
[실시 예 4]
악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델의 확립
2,2,2-트리 브로모 에탄올(Avertin; Sigma-Aldrich) 마취하에, 누드 마우스(5 주령 수컷)의 왼쪽 흉강 내에 루시페라아제를 안정 발현시킨 MSTO-211H 세포(MSTO-211H-Luc 세포) 현탁액을 100 ㎕ 투여하고, 이식을 실시했다. 세포 이식 후 3, 7, 14, 21일 후에 이소푸루란을 이용한 마취 후, D-luciferin potassium salt(Wako Pure Chemical) 용액 100 ㎕(7.5 mg/ml)을 복강 내에 투여하고, 흉강 내에서 증식 한 MSTO-211H-Luc 세포의 활성에 의존하는 생물 발광 강도를 IVIS(Xenogen, Alameda, CA, USA)를 이용하여 평가하였다.
결과를 도 4에 나타낸다.
도 4에 표시된 대로 이식 후 3 일째에 MSTO-211H-Luc 세포의 증식에 따른 생물 발광이 약간 관찰된 후 시간 경과에 따른 생물 발광이 강화되었다. 본 검사에서 이식한 MSTO-211H-Luc 세포가 흉강 내에서 충분히 증식하고 있는 것이 분명해졌으며 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델을 확립할 수 있었다.
[실시 예 5]
In vivo 에서 shRNA 도입 효과가 높은 양이온 리포솜의 선정
(양이온 리포솜의 제조)
다음과 같은 방법으로 양이온 리포솜을 제조하였다.
리포솜을 구성하는 지질은 아래에서 선택하여 사용했다: DOPC(1,2-디오레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), POPC(1-팔미토일-2-오레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린), DMPC(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DEPC(1,2-디엘코일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DOPE(1,2-디오레오일-sn-글리세로-3-포스포 에탄올 아민), DC-6-14(O,O'-디테트라데카 노일-N-(α-트리메틸-암모니오 아세틸)디에탄올 아민 클로라이드). 이러한 지질은 미리 클로로포름에 용해시켜 스톡 용액으로 하였다.
지질 조성이 DOPE : X : DC-6-14 = 3 : 2 : 5 (몰비)가 되도록 각각 스톡 용액에서 유리 주사기를 사용하여 정확하게 취하여 상기 실시 예 3에 나타낸 방법에 따라 양이온 리포솜을 제조하였다. 리포솜 입자 지름(동적 광산란법) 및 제타 전위(전기 영동 광산란법)은 NICOMP 370(Particle Sizing System, CA, USA)로 측정했다. 리포솜의 표면 전하는 전부 약 + 50 mV 였다.
(루시페라제(Luc)을 표적으로하는 shRNA)
상기 실시 예 3에 나타낸 Luc-shRNA를 사용했다.
(리포플렉스의 조제)
리포플렉스는 상기 양이온 리포솜과 shRNA를 양이온 리포솜 : shRNA = 2000 : 1 (몰비)가 되도록 혼합하여 10 분 동안 격렬하게 교반하여 제조하였다. shRNA가 양이온 리포솜에 완전히 흡착하는지는 2% 아가로오스겔에서 전기 영동하여 유리 shRNA가 존재하지 않는 것으로 확인했다.
조제한 리포플렉스의 평균 입자 직경 및 제타 전위는 각각 약 350 nm 및 약 +15 mV 였다.
(동일한 부위 이식 모델 마우스를 이용한 in vivo에서의 루시페라제 발현 억제)
2,2,2-트리 브로모 에탄올(Avertin; Sigma-Aldrich) 마취 누드 마우스(5 주령 수컷)의 왼쪽 흉강 내에 루시페라아제를 안정 발현시킨 MSTO-211H 세포(MSTO-211H-Luc 세포) 현탁액을 100 ㎕ 투여했다. 세포 이식 후 10, 13, 16, 19 일째 흉강 내에 리포플렉스 shRNA 양으로 20 ㎍(50 ㎕) 씩 직접 투여했다. 리포플렉스의 최종 투여 2일 후 이소푸루란을 이용한 마취 하에, D-루시페린 칼륨염 용액 100 ㎕(7.5 mg/mL)을 복강 내에 투여하고, 흉강 내에서 증식 한 MSTO-211H-Luc 세포의 활성에 의존하는 생물 발광 강도를 IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA)로 평가했다.
반면에 9% 자당 용액을 투여했다.
결과를 도 5-1 및 도 5-2과 같다.
도 5-1 및 도 5-2에 나타낸 대로, 이용한 양이온 리포솜의 지질 조성에 따라 루시페라아제의 발현 억제에 차이가 발생하는 것이 분명해 졌으며, DOPE/DOPC/DC-6-14(3 : 2 : 5)의 지질 성분을 가진 양이온 리포솜을 이용하여 제조한 리포플렉스가 유의하게 가장 강하게 흉강 내에 이식한 MSTO-211H-Luc 세포에서의 루시페라아제의 발현을 억제하는 것으로 나타났다.
[실시 예 6]
In vivo 에서 shRNA 도입에 있어서 양전하 지질( DC -6-14 함량)의 영향
(양이온 리포솜의 제조)
실시 예 3에 나타낸 방법에 따라 리포솜을 제조하였다. 그러나 리포솜의 지질 조성은 DOPE : POPC : DC-6-14 = 3 : 2 + X : 5-X (몰비, X = 0, 1.5, 3.0)로 하였다. 리포솜 입자 크기 및 표면 전하는 NICOMP 370(Particle Sizing System, CA, USA)로 측정하였다. 조제한 LUV(large unilamellar vesicle)의 입자 지름은 모두 약 100 nm임을 확인했다. 또한 그 표면 전하가 각각 20%의 DC-6-14을 포함하는 리포솜이 약 +25 mV, 35%의 DC-6-14을 포함하는 리포솜이 약 +35 mV, 50%의 DC-6-14를 포함하는 리포솜이 약 +50 mV임을 확인했다.
(리포플렉스의 조제)
리포플렉스는 실시 예 3에 나타낸 Luc-shRNA를 실시 예 3에서 나타내는 방법으로 리포솜과 혼합하여 제조하였다. 리포플렉스의 입자 지름(동적 광산란법) 및 제타 전위(전기영동 광산란법)은 NICOMP 370(Particle Sizing System, CA, USA)로 측정하였다. 20%의 DC-6-14을 포함하는 리포플렉스의 입자 지름은 약 350 nm, 표면 전하 약 +25 mV이며, 35%의 DC-6-14을 포함하는 리포플렉스의 입자 지름은 약 350 nm, 표면 전하 약 +30 mV이고, 50%의 DC-6-14을 포함하는 리포플렉스의 입자 지름은 약 350 nm, 표면 전하 약 +35 mV였다.
(동일한 부위 이식 모델 마우스를 이용한 in vivo에서의 루시페라제 발현 억제)
실시 예 5에 나타낸 방법에 따라 조제한 리포플렉스의 in vivo 유전자 발현 억제 효과(shRNA 세포 내 도입 효율)을 평가했다.
결과를 도 6-1 및 도 6-2와 같다.
도 6-1 및 도 6-2에 나타낸 대로 리포솜 중의 양전하 지질(DC-6-14)의 양이 증가함에 따라 리포플렉스의 in vivo에서 루시페라제 발현 억제 효과가 항진되는 것을 확인하였다. 표면 전하의 증가는 음으로 대전된 shRNA과 복합체를 형성하는 데 유리하다 뿐만 아니라 음전기로 대전된 종양 세포와 상호 작용하기 쉬워져, 결과적으로 다량으로 또한 효율적으로 shRNA를 세포 내로 도입할 수 있다.
[실시 예 7]
In vivo 에서 shRNA 도입에 따른 PEG 수식의 영향
(PEG 수식 양이온 리포솜의 제조)
실시 예 3에 나타낸 방법에 따라 리포솜을 제조 하였다.
구성 지질는 다음의 것을 사용했다: DOPC, POPC, DOPE DC-6-14 및 1,2- 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포 에탄올 아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](mPEG2000-DSPE). PEG 수식 리포솜의 지질 조성은 DOPE : X : DC-6-14 : mPEG-DSPE = 3 : 2 : 5 : 0.1 (몰비, X = DOPC 또는 POPC)로 하고, PEG 미수식 리포솜의 지질 조성은 DOPE : X : DC-6-14 = 3 : 2 : 5 (몰비, X = DOPC 또는 POPC)로 하여, LUV(large unilamellar vesicle)를 제조하였다. 리포솜 입자 지름은 NICOMP 370(Particle Sizing System, CA, USA)로 측정했다. DOPC을 포함하는 리포솜(PEG 미수식 리포솜)의 입자 지름은 약 100 nm이며, 표면 전하는 약 +50 mV 였다. POPC를 포함하는 리포솜(PEG 미수식 리포솜)의 입자 지름은 약 110 nm이며, 표면 전하는 약 +50 mV 였다. PEG 수식한 DOPC을 포함한 리포솜(PEG 수식 리포솜)의 입자 지름은 약 106 nm이며, 표면 전하 약 +50 mV였다. PEG 수식한 POPC를 포함한 리포솜(PEG 수식 리포솜)의 입자 지름은 약 100 nm이며, 표면 전하 약 +50 mV였다.
(리포플렉스의 조제)
리포플렉스는 실시 예 3에 나타낸 Luc-shRNA를 PEG 수식 리포솜 또는 PEG 미수식 리포솜과 실시 예 3에 나타내는 방법으로 혼합하여 제조하였다. 리포플렉스의 입자 지름(동적 광산란법) 및 제타 전위(전기영동 광산란법)은 NICOMP 370(Particle Sizing System, CA, USA)로 측정했다. DOPC을 포함하는 리포플렉스의 입자 지름은 약 350 nm이며, 표면 전하 약 +30 mV였다. POPC를 포함하는 리포플렉스의 입자 지름은 약 360 nm이며, 표면 전하 약 +30 mV였다. DOPC를 포함하는 PEG 수식한 리포플렉스의 입자 지름은 약 370 nm이며, 표면 전하 약 +30 mV였다. POPC를 포함하는 PEG 수식한 리포플렉스의 입자 지름은 약 370 nm이며, 표면 전하 약 +30 mV였다.
(동일한 부위 이식 모델 마우스를 이용한 in vivo에서의 루시페라제 발현 억제)
실시 예 5에 나타낸 방법에 따라 제조된 PEG 수식 리포플렉스 또는 PEG 미수식 리포플렉스의 in vivo 유전자 발현 억제 효과(shRNA 세포 내 도입 효율)을 평가했다.
결과를 도 7-1 및 도 7-2에 나타내었다.
도 7-1 및 도 7-2에 나타낸 대로, 이용한 양이온 리포솜의 지질 조성에 관계없이 PEG 수식을 실시함으로써, 리포플렉스 루시페라제의 발현 억제 효과가 억제될 수 있음을 확인하였다. 정맥 투여시에는 PEG화는 필수이지만, 흉강 내 투여시에는 PEG 수식은 오히려 shRNA의 세포 내 도입 효율을 억제하는 것으로 나타났다.
[실시 예 8]
TS - shRNA 를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스의 흉강 내 투여에 의한 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델에서 종양 증식 억제 효과
(악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 마우스 모델의 확립)
MSTO-211H-Luc 세포를 이용한 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 모델 마우스는 실시 예 3에 나타낸 방법으로 제작하고, 이식 세포가 충분히 정착한 이식 7 일째 마우스를 in vivo 실험에 사용하였다 .
(양이온 리포솜의 제조)
실시 예 3에 나타낸 방법에 따라 리포솜을 제조하였다. 그러나 리포솜의 지질 조성은 DOPE : POPC : DC-6-14 = 3 : 2 : 5로 하였다.
(리포플렉스의 조제)
리포플렉스는 실시 예 1에 나타내는 shRNA를 상기 리포솜과 실시 예 3에 나타낸 방법으로 혼합하여 제조하였다. 리포플렉스의 입자 지름(동적 광산란법) 및 제타 전위(전기영동 광산란법)은 NICOMP 370(Particle Sizing System, CA, USA)로 측정했다. TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스(이하 「TS-shRNA 리포플렉스」라고 기재한다)의 입자 지름은 약 400 nm, 표면 전하는 약 +30 mV였다. 한편, NS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스(이하 「NS-shRNA 리포플렉스」라고 기재한다)의 입자 지름은 약 400 nm, 표면 전하는 약 +30 mV였다.
(TS-shRNA 리포플렉스 종양 증식 억제 효과의 평가)
상기 MSTO-211H-Luc 세포 암보유(tumor-bearing) 마우스에 비하여, TS-shRNA 리포플렉스 또는 NS-shRNA 리포플렉스를 종양 이식 후 7 일째부터 17 일째까지 격일로 총 6 회 흉강 내에 직접 투여했다. 한 번의 투여 당 20 ㎍ shRNA/ 100 ㎕를 투여했다.
기존의 암화학요법제 「알림타(페메트렉스드 나트륨 수화물 (PMX))」(일라이 릴리)를 병용하는 경우에는 25 mg/kg의 용량에서 종양 이식 후 7 일째부터 11 일째까지 매일, 다음 2 일 간격을 두고 동일 분량을 14 일에서 18 일까지 매일 총 10 회 복강 내에 투여했다.
대조로써 9% 자당 용액을 투여했다.
제암활성(세포증식 억제활성)은 실시 예 5에 나타낸 바와 같이, MSTO-211H-Luc 세포 이식 후 21 일째에 이소푸르란을 이용한 마취 하에, D- 루시페린 칼륨염 용액 100 ㎕(7.5 mg/mL)을 복강 내에 투여하고, 흉강 내에서 증식한 MSTO-211H-Luc 세포의 활성에 의존하는 생물 발광 강도를 IVIS(Xenogen, Alameda, CA, USA)로 평가했다.
제암 효과를 기반으로 연명 효과에 관해서는 상기의 IVIS 의한 평가를 제공한 마우스 모델을 그대로 치료하지 않은 상태에서 세포 이식 후 47 일째까지 계속해서 사육하는 것으로 평가했다.
평균 생존기간(Mean survival time(MST)(day))은 다음 식에 따라 계산되었다.
MST(day) = 첫 번째 사망일 + 마지막 사망일/2
생존기간 증가(Increased life span(%))는 다음 식에 따라 계산되었다.
ILS(%) = [처리 군의 평균 생존기간 / 대조군의 평균 생존기간] × 100
결과를 도 8-1 및 도 8-2, 및 도 8-3 및 도 8-4에 나타내었다.
도 8-1 및 도 8-2에 표시된 대로 대조군과 비교하여 NS-shRNA 리포플렉스를 단독으로 사용하여 처리한 군에서는 전혀 종양 증식 억제 효과는 나타나지 않았다. 한편, TS-shRNA 리포플렉스 또는 PMX를 단독으로 사용하여 처리한 군에서는 약 50%의 종양 증식 억제 효과가 확인되었다. 또한 NS-shRNA 리포플렉스를 PMX와 병용하여 치료한 군에서는 PMX 단독 투여군에서 보고된 것과 거의 같은 종양 증식 억제 효과를 보였을 뿐이지만, TS-shRNA 리포플렉스 및 PMX을 병용하여 치료한 군에서는 약 90%라는 상당히 현저한 종양 증식 억제 효과가 나타났다.
연명 효과는 도 8-3 및 도 8-4에 표시된 대로 대조군과 비교하여 NS-shRNA 리포플렉스를 단독으로 사용하여 처리한 군에서는 거의 연명 효과는 나타나지 않았다. 한편, TS-shRAN 리포플렉스 또는 PMX를 단독으로 사용하여 처리한 군에서는 약간의 연명 효과(120 ~ 126%)가 나타났다. 또한 NS-shRNA 리포플렉스를 PMX와 병용하여 치료한 군에서는 PMX 단독 투여군에서 보고된 것과 거의 같은 연명 효과(122%)를 보였을 뿐이지만, TS-shRNA 리포플렉스와 PMX을 병용하여 치료한 군에서 상기의 종양 증식 억제 효과를 반영한 최대의 연명 효과(178%)가 확인되었다.
아울러, 어떠한 처리군에 있어서도 체중 증가 억제를 포함한, 심각한 독성은 관찰되지 않았다.
[실시 예 9]
TS - shRNA 리포플렉스의 흉강 내 투여에 의한 표적 유전자 발현 억제 검토
실시 예 8과 동일하게 처리된 각 군의 마우스는, MSTO-211H-Luc 세포 이식 후 21 일째에 IVIS 의한 평가를 실시한 후, 마우스를 희생시켜 흉강으로부터 종양 세포를 회수하고 회수한 종양 세포의 TS 유전자의 발현 억제 상황을 정량적 RT-PCR 법을 이용하여 평가하였다.
종양 세포에서 RNA의 추출은 RNaqueous-micro kit(Ambion, Austin, TX, USA)을 이용하여 제조업체에서 권장하는 방법에 따라서 수행하였다. RNA의 cDNA로의 역전사는 RNA에 Oligo(dT)20, dNTP, RNase inhibitor, ReverTra Ace(Toyobo, Osaka, Japan)를 첨가하여 수행하였다. Real-time PCR은 StepOnePlus real-time PCR system(Applied Biosystems, CA, USA)을 이용하여 역전사된 cDNA를 주형으로 사용하고, 시약으로써 FastStart TaqMan Probe Master(ROX)와 Universal ProbeLibrary(Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Germany)를 이용하여 제조업체에서 권장하는 방법에 따라서 수행하였다. GAPDH를 내부 표준으로 사용하였다.
결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이 대조군과 비교하여 NS-shRNA 리포플렉스를 단독으로 처리한 군에서는 전혀 TS 유전자의 억제 효과는 보이지 않았다. 한편, TS-shRNA 리포플렉스 또는 PMX를 단독으로 사용하여 처리한 군에서는 각각 약 50%, 약 25%의 TS 유전자 억제 효과를 보였다. 또한 NS-shRNA 리포플렉스를 PMX와 병용하여 치료한 군에서는 PMX 단독 투여군과 비슷한 약 20% 정도의 TS 유전자 억제 효과가 확인되었다. 한편, 실시 예 8에서 가장 높은 종양 증식 억제 효과를 나타내었던 TS-shRNA 리포플렉스와 PMX을 병용하여 치료한 군에서는 높은 효과를 반영하여, 나머지 흉강 내에 대부분 종양 세포가 남아 있지 않은 것으로부터 TS 유전자의 발현 변화를 측정할 수 없었다.
[실시 예 10]
In vitro 에서 shRNA 도입에 따른 지질 혼합물의 형태가 미치는 영향
양이온 프리솜의 조제
구성 지질 조성비는 전술한 실시 예 3과 마찬가지로 DOPE : X : DC-6-14 = 3 : 2 : 5 (X = DOPC 또는 POPC)를 사용하였다.
지질 성분이 상기와 같도록 각각의 지질의 무게를 달아 취해서, 총 지질의 10 배 무게의 시클로헥산 및 시클로헥산의 2 중량 %의 에탄올을 첨가하고 70℃의 온수 중에 용해시켰다. 용해액을 0.2 ㎛의 PTFE 멤브레인 필터를 이용하여 여과하고 여과하고, 여과된 용액을 드라이 아이스/아세톤에서 동결시켰다. 완전히 동결시킨 후, 진공 펌프를 사용하여 12 시간 이상 진공 건조를 수행하고, 양이온 프리솜을 얻었다.
실험에 사용하는 양이온 프리솜 용액은 상기 방법으로 얻어진 양이온 프리솜에 최종 지질 농도가 100 mM이 되도록 9% 자당 용액(pH 7.4)을 넣어 10 분간 격렬하게 교반함으로써 준비했다. 이 양이온 프리솜의 평균 입자 지름은 약 440±210(평균±표준편차) nm였다.
리포플렉스, 프리플렉스의 조제
리포플렉스 및 프리플렉스의 준비는 각각 실시 예 3에서 나타낸 양이온 리포솜 및 상기 양이온 프리솜을 사용했다. 리포플렉스 및 프리플렉스에 탑재하는 shRNA는 루시페라제를 표적으로 하는, 실시 예 3에서 기재한 Luc-shRNA를 사용하였다.
양이온 리포솜 또는 양이온 프리솜과 Luc-shRNA를 몰비로써 1600 : 1 또는 800 : 1이 되도록 혼합하여 10 분 동안 격렬하게 교반함으로써 Luc-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 및 프리플렉스를 각각 준비했다.
HT-1080 세포에 트랜스펙션(transfection)
트랜스펙션의 시약은 양이온 리포솜의 일종인 LipofectamineTM 2000(이하 「Lf2000」라고 기재)을 사용했다. 또한 반딧불 유래 및 해우 유래의 루시페라아제를 발현하는 플라스미드로써 pGL3-C 및 pRL-TK(프로메가)을 각각 사용했다.
두 루시페라아제 플라스미드 15 ㎍ + 15 ㎍, 및 Lf2000 30 ㎕에 각각 750 ㎕가 되도록 OptiMEM을 가하여 희석하고, 이어서 두 용액을 혼합하여 10-20 분간 실온에서 방치하여 Luc-lipoplex을 형성시켰다.
미리 24 시간 전에 인간의 섬유 육종 세포(HT-1080) 현탁액(10,000 cell/ml)을 파종해 놓은 12 웰 플레이트에서 배양액을 제거한 후 상기 Luc-lipoplex 100 ㎕를 추가 37℃, 5% CO2 조건에서 5 시간 동안 배양하였다.
5 시간 후, 배양액을 제거하고, 차가운 PBS(-)로 한번 세척 후 새로운 DMEM 배지 900 ㎕과 함께 Luc-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 용액 또는 Luc-shRNA를 외막 표면에 결합하는 프리플렉스 용액 100 ㎕(각 웰 중의 shRNA 최종 농도는 50 nM)을 넣고 37℃, 5% CO2 조건에서 더 48 시간 배양하였다.
루시페라아제 활성 측정
루시페라아제 활성 측정은 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega) 및 96 웰 마이크로 플레이트를 사용했다. 48 시간 배양 후 배지를 제거하고 차가운 PBS(-)로 한번 세척 후 Passive Lysis Buffer 150 ㎕를 웰에 직접 첨가하여 세포를 용해시켰다. 동결 융해를 한 번 수행하고, 원심 분리(10,000xg, 30 초, 4℃) 후, 얻어진 상층액을 세포 추출액으로 하였다.
각 웰에 Luciferase Assay Reagent II 50 ㎕ 과 세포 추출액 10 ㎕를 더해, 마이크로 플레이트 리더 Infinite 200(R) Pro(Tecan 사)를 이용하여 반딧불 Luciferase 활성에 의한 생물 발광량을 측정했다. 그 후, Stop & Glo(등록 상표) Reagent 50 ㎕를 더 추가하고, 동일하게 해우 루시페라아제 활성을 측정했다.
반딧불 유래 루시페라아제의 상대 활성은, Luc-shRNA 처리되지 않은 것과 비교하여 하기와 같은 식을 이용하여 산출했다.
반딧불 유래 루시페라아제 상대 활성(%) = (반딧불 루시페라아제 활성/해우 루시페라아제 활성) / (Luc-shRNA 미처리 군의 반딧불 루시페라아제 활성/Luc-shRNA 미처리 군의 해우 루시페라아제 활성) × 100
결과를 도 10에 나타내었다.
도 10과 같이 DOPC, POPC 중 어떤 것을 포함한 경우에도 Luc-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스에 비해 Luc-shRNA를 외막 표면에 결합하는 프리플렉스 형태의 것이 루시페라제의 발현을 더 억제했다. 또한 프리플렉스 투여군에서 POPC보다 DOPC을 포함하는 프리플렉스 쪽이 발현 억제 효율이 약간 높았다.
[실시 예 11]
TS - shRNA 를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 및 프리플렉스 의 흉강 내 투여에 의한 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 모델에서 종양 증식 억제 효과
악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 모델의 확립
MSTO-211H-Luc 세포를 이용한 악성 흉막 중피종과 동일한 부위 이식 모델은 전술한 실시 예 4에 나타낸 방법을 이용하여 제작하여, 이식 4 일째 마우스를 in vivo 실험에 사용하였다.
TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 및 프리플렉스의 조제
상기 실시 예 10에서 나타내는 방법에 따라 지질 조성이 DOPE : DOPC : DC-6-14 = 3 : 2 : 5로 이루어진 양이온 리포솜 및 양이온 프리솜을 준비했다. 또한 실시 예 1에 기재한 TS 대한 shRNA와 혼합하여 리포플렉스(TS-리포플렉스) 및 프리플렉스(TS-프리플렉스)를 준비했다. 또한 리포솜 또는 프리솜과 shRNA과의 몰비는 2000 : 1로 했다. 조제한 TS-리포솜, TS-프리플렉스의 평균 입자 직경은 각각 210±100, 630±400 (평균±표준 편차) nm였다.
TS-shRNA를 외막 표면에 결합하는 리포플렉스 및 프리플렉스 종양 증식 억제 효과의 평가
종양 이식 후 4, 7, 10, 13, 16 일째에서 TS-리포플렉스 또는 TS-프리플렉스 shRNA 량으로 20 ㎍(50 ㎕)을 흉강 내에 직접 투여했다.
기존의 화학요법제 「알림타(페메트렉스드 나트륨 수화물 (PMX))」(일라이릴리)를 병용하는 경우에는 25 mg/kg의 용량에서 종양 이식 후 4 일째부터 8 일까지 매일, 그 후 2 일 간격을 두고 동일 분량을 11 일에서 15 일까지 매일 총 10 회 복강 투여하였다.
TS-리포플렉스 또는 TS-프리플렉스의 최종 투여 2 일 후(종양 이식 후 18 일째), 이소푸르란(isoflurane)을 이용한 마취 후, D-luciferin potassium salt 용액 100 ㎕(7.5 mg/ml)을 복강 내에 투여하고, 흉강 내에서 증식한 MSTO-211H-Luc 세포의 루시페라아제 활성에 의존하는 생물 발광 강도를 IVIS(Xenogen, Alameda, CA, USA)로 평가했다.
실시 결과를 도 11에 나타내었다.
미처리 대조군과 비교하여 PMX 단독을 사용하여 처리한 군에서는 그다지 종양 증식 억제 효과를 볼 수 없었다. 한편, TS-리포플렉스 또는 TS-프리플렉스 단독을 사용한 군에서는 대조군과 PMX 단독 투여군에 비해 분명히 높은 종양 억제 효과가 보였다. 또한 TS-리포플렉스 또는 TS-프리플렉스와 PMX을 병용한 군에서 가장 높은 종양 억제 효과가 관찰되었지만, 리포플렉스와 프리플렉스 효과에 큰 차이는 확인되지 않았다.
도 12는 상술한 IVIS 의한 평가를 실시한 시점에서의 마우스 체중을 측정한 것이지만, 모든 군에서 통계학적 차이는 나타나지 않았고, 이는 이번에 이용한 투여법에 심각한 독성이 없음을 나타낸 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 리포솜은 활성 성분을 탑재시켜 국소 투여함으로써, 투여부 및/또는 그 주변의 국한된 세포에 효율적으로 활성 성분을 전달할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 리포솜에 활성 성분으로 종양의 증식을 억제할 수 있는 RNAi 분자를 탑재시켜 종양 및/또는 그 주변에 국소 투여함으로써 종양 세포에 효율적으로 RNAi 분자를 전달할 수 있어, 해당 종양의 증식을 효과적으로 억제할 수 있다. 본 발명은 약물 전달 분야에서, 또한 암 치료 분야에서 크게 공헌할 것으로 기대된다.
본 명세서에서 인용 한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 본원에 도입한다.
<110> Delta-Fly Pharma, Inc. <120> LOCALLY ADMINISTERED LIPOSOME AND APPLICATION THEREFOR <130> 2015FPI-06-007 <150> JP 2013-095950 <151> 2013-04-30 <150> PCT/JP 2013/080367 <151> 2013-11-01 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense1 <400> 1 guaacaccau cgaucauga 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense1 <400> 2 ucaugaucga ugguguuac 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense2 <400> 3 gaauacagag auauggaau 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense2 <400> 4 auuccauauc ucuguauuc 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense3 <400> 5 cgaucaugau guagagugu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense3 <400> 6 acacucuaca ucaugaucg 19 <210> 7 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 7 uagugcuccu gguug 15 <210> 8 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 8 guaacaccau cgaucaugau agugcuccug guugucauga ucgauggugu uacuu 55 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense4 <400> 9 ggguguuuug gaggaguugt t 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense4 <400> 10 aacaacuccu ccaaaacacc c 21 <210> 11 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS-shRNA <400> 11 ucuuaaucgc guauaaggcu agugcuccug guuggccuua uacgcgauua agauu 55 <210> 12 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc-shRNA <400> 12 cuuacgcuga guacuucgau agugcuccug guugucgaag uacucagcgu aaguu 55

Claims (16)

  1. 디오레오일포스파티딜에타놀아민(Dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 및 양이온성 지질로 이루어지는 국소 투여용 리포솜(liposome)으로서,
    상기 양이온성 지질은 O,O'-디테트라데카노일-N-(α-트리메틸암모니오 아세틸)디에탄올아민 클로라이드[ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonio acetyl)diethanolamine chloride](DC-6-14) 이고, 상기 포스파티딜콜린은 1,2-디오레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DOPC), 팔미토일오레오일포스파티딜콜린(Palmitoyloleoylphosphatidylcholine; POPC) 또는 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC)인, 국소 투여용 리포솜.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린이 DOPC인 리포솜.
  3. 제 1 항에 있어서, DOPE, DOPC 및 DC-6-14로 이루어지는 리포솜.
  4. 제 3 항에 있어서, DOPE, DOPC 및 DC-6-14가 3 : 2 : 5의 몰비로 포함되는 리포솜.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 리포솜과 활성 화합물을 포함하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 활성 화합물은 핵산인 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 핵산은 리포솜의 외막 표면에 결합되어 있는 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 리포솜과 RNAi 작용에 의해 티미딜산 합성 효소(TS)의 발현을 억제할 수 있는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)을 포함하는 항종양제.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 shRNA는 리포솜의 외막 표면에 결합되어 있는 항종양제.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 항종양제.
  11. 제 8 항에 있어서, 암 화학요법 또는 암 화학요법제와 병용되는 항종양제.
  12. 제 8 항에 기재된 항종양제와 암 화학요법제를 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 암 화학요법제는 TS 저해작용을 갖는 항종양제인, 약제학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, TS 저해작용을 갖는 항종양제는 5-FU 계 항종양제 또는 페메트렉스드 나트륨 수화물(Pemetrexed Sodium Hydrate)인 약제학적 조성물.
  15. 제 12 항에 있어서, 항종양제에 포함되는 shRNA가 리포솜의 외막 표면에 결합되어 있는 약제학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 약제학적 조성물.
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