JPWO2014178152A1 - 局所投与用リポソームおよびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
一方、RNA干渉(以下、「RNAi」と記載する)を引き起こすRNAi分子は、腫瘍などを治療するための有用なツールとして注目されており、腫瘍の増殖を抑制することが可能な様々なRNAi分子が開発されている。また、RNAi分子とリポソームからなる複合体(リポプレックス)を用いて、活性成分であるRNAi分子を腫瘍細胞へ送達する方法が開発されている(非特許文献1−3)。
本発明者らはこれまでに、DNA合成に関与しているチミジル酸合成酵素(以下、「TS」と記載する)を標的とするRNAi分子を開発し(特許文献1)、当該RNAi分子をPEGで修飾され、かつコレステロールを所定の割合で含むリポソームを用いて、静脈内投与により腫瘍に送達することによって、TSを発現する腫瘍の増殖を抑制できること、さらに当該リポソームを化学療法剤と併用することによって、腫瘍への指向性を高めRNAi分子による抗腫瘍効果を顕著に向上させることができることを報告した(特許文献2)。
しかしながら、当該分野においては依然として、腫瘍の増殖を抑制することが可能なRNAi分子を腫瘍細胞へさらに効率的に導入することが可能な手段が求められている。
より詳細には、本発明は、腫瘍の増殖を抑制することが可能なRNAi分子を腫瘍細胞に効率的に送達することが可能な新たなリポソームを提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質からなり、PEGで修飾されておらず、かつコレステロールを含まないリポソームに活性成分を担持させ、標的細胞を含む部位又はその近傍に局所投与することにより、標的細胞に活性成分を効率的に送達できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
[1] ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質からなり、該ホスファチジルコリンが以下の(i)−(iii)より選択される一以上の特徴を有する、局所投与用リポソーム:
(i)炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む;
(ii)シス型の炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む;
(iii)相転移温度が0℃未満。
[2] カチオン性脂質が0,0’−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)ジエタノールアミンクロリド(DC−6−14)である、[1]のリポソーム。
[3] ホスファチジルコリンが1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DOPC)、パルミトイルオエオイルホスファチジルコリン(POPC)、又は1,2−ジエイコセノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DEPC)である、[1]のリポソーム。
[4] ホスファチジルコリンがDOPCである、[1]のリポソーム。
[5] DOPE、DOPC及びDC−6−14からなる、[1]のリポソーム。
[6] DOPE、DOPC及びDC−6−14が、3:2:5のモル比で含まれる、[5]のリポソーム。
[7] [1]〜[6]のいずれかのリポソームと活性化合物を含む組成物。
[8] 活性化合物が核酸である、[7]の組成物。
[9] 核酸がリポソームの外膜表面に結合している、[8]の組成物。
[10] [1]〜[6]のいずれかのリポソームとRNAi作用によりチミジル酸合成酵素の発現を抑制することができるショートヘアピンRNA(shRNA)とを含む、抗腫瘍剤。
[11] shRNAがリポソームの外膜表面に結合されている、[10]の抗腫瘍剤。
[12] shRNAが配列番号8で表される塩基配列からなる、[10]の抗腫瘍剤。
[13] 癌化学療法又は癌化学療法剤と併用される、[10]の抗腫瘍剤。
[14] [10]〜[13]のいずれかの抗腫瘍剤と癌化学療法剤とを含む、組み合わせ物。
[15] 癌化学療法剤が、TS阻害作用を有する抗腫瘍剤である、[14]の組み合わせ物。
[16] TS阻害作用を有する抗腫瘍剤が、5−FU系抗腫瘍剤又はペメトレキセドナトリウム水和物である、[15]の組み合わせ物。
本発明によれば、局所投与により、標的とする細胞に活性成分を効率的に送達することが可能な新たなリポソームを提供することができる。
より詳細には、本発明によれば、局所投与により、腫瘍の増殖を抑制することが可能なRNAi分子を腫瘍細胞に効率的に送達することが可能な新たなリポソームを提供することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013−095950号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図2は、TS−shRNA及びNS−shRNAによる、ヒト悪性胸膜中皮腫細胞におけるTS発現抑制効果を示す。(A)ウェスタンブロッティングの結果を示す。(B)ウェスタンブロッティングの結果に基づく、TS発現量の定量結果を示す。TS/β−アクチンはshRNA未処理の対照を100%とする相対値にて示す。
図3は、Dual−luciferase assayによる各種カチオニックリポソームによるLuc−shRNA導入効果の比較結果を示す。
図4は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍増殖の結果を示す写真図である。各写真の日数は悪性胸膜中皮腫細胞の移植後の日数を示す。
図5−1は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する各種カチオニックリポソームによるLuc−shRNA導入効果の比較結果を示す写真図である。(A)対照:9%スクロースの結果を示す。(B)DEPC:DEPCを含むリポソームの結果を示す。(C)DMPC:DMPCを含むリポソームの結果を示す。(D)DOPC:DOPCを含むリポソームの結果を示す。(E)POPC:POPCを含むリポソームの結果を示す。
図5−2は、図5−1の結果に基づく、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する各種カチオニックリポソームによるLuc−shRNA導入効果の定量結果を示す。*:p<0.005。
図6−1は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する、DC−6−14の含有量の異なるカチオニックリポソームのLuc−shRNA導入効果の比較結果を示す写真図である。写真は上から、モル比にして、(A)20%のDC−6−14を含むリポソーム、(B)35%のDC−6−14を含むリポソーム、(C)50%のDC−6−14を含むリポソームの結果を示す。
図6−2は、図6−1の結果に基づく、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する、DC−6−14の含有量の異なるカチオニックリポソームのLuc−shRNA導入効果の定量結果を示す。*:p<0.005。
図7−1は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する、PEG修飾された、及びPEG修飾されていない、各種カチオニックリポソームのLuc−shRNA導入効果の比較結果を示す写真図である。(A)PEG修飾POPC:PEG修飾された、POPCを含むリポソームの結果を示す。(B)PEG未修飾POPC:PEG修飾されてない、POPCを含むリポソームの結果を示す。(C)PEG修飾DOPC:PEG修飾された、DOPCを含むリポソームの結果を示す。(D)PEG未修飾DOPC:PEG修飾されてない、DOPCを含むリポソームの結果を示す。
図7−2は、図7−1の結果に基づく、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する各種カチオニックリポソームのLuc−shRNA導入効果の定量結果を示す。**:p<0.01。
図8−1は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する、TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックス及びNS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックス、癌化学療法剤(PMX)、並びにリポプレックスと癌化学療法剤(PMX)との併用、による腫瘍成長抑制効果の比較結果を示す写真図である。(A)対照:9%スクロースの結果を示す。(B)NS−shRNA:NS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスのみで処理した結果を示す。(C)TS−shRNA:TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスのみで処理した結果を示す。(D)PMX:癌化学療法剤のみで処理した結果を示す。(E)PMX+NS−shRNA:癌化学療法剤とNS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスとの併用で処理した結果を示す。(F)PMX+TS−shRNA:癌化学療法剤とTS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスとの併用で処理した結果を示す。
図8−2は、図8−1の結果に基づく、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する各種処置による腫瘍成長抑制効果の定量結果を示す。*:p<0.05、***:p<0.01。
図8−3は、対照(9%スクロース)、癌化学療法剤(PMX)のみ、NS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、又はリポプレックスと癌化学療法剤(PMX)との併用、により処置された悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの生存率(%)を示す。
図8−4は、対照(9%スクロース)、TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、NS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、癌化学療法剤(PMX)のみ、又はリポプレックスと癌化学療法剤(PMX)との併用、により処置された悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの平均生存期間(MST)及び生存期間増加率(ILS)を示す。
図9は、対照(9%スクロース)、NS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、癌化学療法剤(PMX)のみ、又はリポプレックスと癌化学療法剤(PMX)との併用、により処置された悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの腫瘍細胞におけるTS mRNA発現量の定量結果を示す。TS mRNA発現量は対照を100%とする相対値にて示す。*:p<0.05、**:p<0.01。
図10は、Dual−luciferase assayによる各種カチオニックリポソーム及びカチオニックプレソームによるLuc−shRNA導入効果の比較結果を示す。
図11は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する、TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックス及びTS−shRNAを外膜表面に結合するプレプレックス、癌化学療法剤(PMX)、並びに、リポプレックス又はプレプレックスと癌化学療法剤(PMX)との併用、による腫瘍成長抑制効果の比較結果を示す写真図である。(A)対照:9%スクロースの結果を示す。(B)PMX:癌化学療法剤のみで処理した結果を示す。(C)TSプレプレックス:TS−shRNAを外膜表面に結合するプレプレックスのみで処理した結果を示す。(D)PMX+TSプレプレックス:癌化学療法剤とNS−shRNAを外膜表面に結合するプレプレックスとの併用で処理した結果を示す。(E)TSリポプレックス:TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスのみで処理した結果を示す。(F)PMX+TSリポプレックス:癌化学療法剤とNS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスとの併用で処理した結果を示す。
図12は、癌化学療法剤、並びに/あるいは、TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックス又はプレプレックスで処理された悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの体重の測定結果を示す。
本発明のリポソームは、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質からなる脂質二重膜よりなる球状の中空体である。
本発明において利用可能な「ホスファチジルコリン」としては、以下の(i)−(iii)より選択される一以上の特徴を有する:
(i)炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む;
(ii)シス型の炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む;
(iii)相転移温度が低い(例えば、0℃未満、−10℃未満、−20℃未満)。
このような「ホスファチジルコリン」としては、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DOPC)、パルミトイルオエオイルホスファチジルコリン(POPC)、1,2−ジエイコセノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DEPC)が挙げられる。好ましくはDOPCである。
本発明において利用可能な「カチオン性脂質」としては、0,0′−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)ジエタノールアミンクロライド(DC−6−14)、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロライド(DODAC)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N−(1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライド(DOTAP)、N−(1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)、N,N−ジメチル−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピルアミン(DODMA)、及びこれらの誘導体より選択されるいずれか1つを利用することができる。好ましくは、カチオン性脂質はDC−6−14である。
好ましくは本発明におけるリポソームは、DOPE、DOPCおよびDC−6−14からなる。
リポソームにおけるDOPE、ホスファチジルコリンおよびカチオン性脂質の含有比(モル比)は、DOPE:ホスファチジルコリン:カチオン性脂質=2〜4:1〜3:4〜6の範囲より選択することが可能である。好ましくはDOPE:DOPC:DC−6−14=3:2:5である。
本発明のリポソームは公知の手法、例えば薄膜振とう法(Bangham法)に基づいて作製することができる(A.D.Bangham et al.,J.Mol.Biol.,13,238−252(1965);A.D.Bangham and R.W.Horne,J.Mol.Biol.,8,660−668(1964))。すなわち、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質をそれぞれクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、上記所定量となるようにそれぞれを分取しフラスコ等の容器内にて混合する。次いで、有機溶媒を揮発させて容器の底部に脂質膜を形成させた後、そこに緩衝液等の水溶液を入れて攪拌することによって、リポソームを含む懸濁液を得ることができる。なお、本明細書において「リポソーム」を「カチオニックリポソーム」と呼ぶ場合があるが、これらの用語は相互互換的に使用される。
あるいは本発明のリポソームは、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質をそれぞれクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、上記所定量となるようにそれぞれを分取し、有機溶媒(例えば、総脂質の5〜30倍重量、好ましくは5〜15倍重量、さらに好ましくは10倍重量のシクロヘキサンとシクロヘキサンの1〜10重量%、好ましくは1〜5重量%、さらに好ましくは2重量%のアルコール(好ましくはエタノール)を加えて50〜80℃、好ましくは65〜75℃に加温して混合・溶解する。次いで、得られた溶液を濾過して、有機溶媒をドライアイス及びアセトンを用いて凍結し、乾燥操作によって除去した後(必要に応じて粉砕し)、そこに緩衝液等の水溶液を入れて混合することによって、リポソームを含む懸濁液を得ることができる。このようにして得られたリポソームを、本明細書において「プレソーム」又は「カチオニックプレソーム」と呼ぶ場合がある。プレソームは凍結乾燥した形態で保存することができる。
本発明のリポソームは、粒径が80nm〜200nm、好ましくはおよそ100nmである。また、本発明のリポソームのゼータ電位は、40〜60mV、好ましくはおよそ50mVである。本発明のリポソームが上記プレソームである場合には、粒径が100nm〜600nm、好ましくはおよそ100nm〜200nmである。
本発明のリポソームは、活性成分を局所投与するためのキャリアとして利用することができる。ここで「局所投与」とは活性成分を直接患部/病巣及び/又はその近傍に投与し、当該活性成分を患部/病巣に作用させることを目的とする。したがって、本発明において「局所投与」とは、静脈注射等を用いて活性成分を全身に作用させることを意図するものではない。局所投与には、例えば、筋肉内、腹腔内、胸腔内、皮下、皮内、眼内、脳内、脳脊髄腔内、膣内、直腸内、臓器内、腫瘍内への注射、表皮への塗布等が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは「局所投与」とは腔内投与であり、さらに好ましくは胸腔内投与又は腹腔内投与である。「活性成分」としては、医薬品又は化粧品の有効成分を意味し、例えば、DNA、RNA、DNA・RNAハイブリッド、タンパク質、ペプチド、化合物等が挙げられる。
2.組成物
本発明の組成物は、上記本発明のリポソームと活性成分とを含み、当該活性成分を局所投与するために利用できる。
活性成分は上記したものが挙げられ、特に限定はされないが例えば、腫瘍細胞において発現しかつ腫瘍細胞の増殖に関与する因子をコードする遺伝子の発現をRNAi作用により抑制することが可能なsiRNA又はshRNA等が挙げられる。「腫瘍細胞において発現しかつ腫瘍細胞の増殖に関与する因子をコードする遺伝子」としては、例えばチミジル酸合成酵素、VEGF、EGFR、PDGF、HGF、Wint、Bcl−2、サバイビンなどの増殖調節因子群、リボヌクレオチドレダクターゼ、DNAポリメラーゼなどの核酸合成関連酵素群などをコードする遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。これら遺伝子の遺伝子情報はGenBank等の公知のデータベースに開示されており、これらの遺伝子情報に基づいてsiRNA又はshRNAを設計・合成することができる。チミジル酸合成酵素の発現をRNAi作用により抑制することが可能なshRNAについては下に詳述されるものを使用することができる。また、活性成分として、抗癌剤や癌化学療法剤を用いることもできる。
本発明の組成物において、活性成分はリポソームの脂質二重膜に囲まれた中空部に含めてもよいし、あるいは脂質二重膜の外膜表面に結合させてもよい。好ましくは活性成分はリポソームの脂質二重膜の外膜表面に結合されている。
本発明の組成物はまた、リポソームと活性成分と共に、医薬品又は化粧品の製造において通常用いられている、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、pH調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、ヒスチジン等を含んでも良い。
賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴムおよびこれらの混合物等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物等が挙げられる。結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウムおよびこれらの混合物等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖およびこれらの混合物等が挙げられる。希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類およびこれらの混合物等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸およびこれらの混合物等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリンおよびこれらの混合物等が挙げられる。pH調整剤および緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびこれらの混合物等が挙げられる。
本発明の組成物は局所投与に適した剤形とすることができ、注射剤、懸濁剤、乳化剤、軟膏剤、クリーム剤錠剤等の各種製剤形態に調製することができる。
3.抗腫瘍剤
本発明の抗腫瘍剤は、上記本発明のリポソームと活性成分として、RNAi作用によりチミジル酸合成酵素(以下、「TS」と記載する)の発現を抑制することができるshRNAを含む。
本発明におけるTSの発現を抑制することができるshRNAは、TSのmRNAを標的とすることにより、TS特異的にRNAi作用を奏し、TSの発現を顕著に抑制することができる。ここで「mRNAを標的とする」とは、下記に詳述するshRNAのアンチセンス鎖が、標的mRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできることをいう。
ストリンジェントな条件下とは、常法に従ってハイブリッドを形成する核酸の融解温度(Tm)に基づいて求めることができる。例えば、ハイブリダイズ状態を維持できる洗浄条件として通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件、より厳格には「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度の条件、さらに厳格には「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の条件が挙げられる。
本発明におけるshRNAは、TSをコードするORFの塩基配列又はその一部に同一な塩基配列を有するセンス鎖と、当該センス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンス鎖を含む。ここで「ORFの塩基配列又はその一部に同一な塩基配列」とは、ORFの塩基配列中のチミンをウラシルに置換して表される塩基配列又はその一部に同一である塩基配列を意味する。
当該センス鎖は15〜25塩基、好ましくは19塩基からなる。センス鎖の塩基配列は、TSをコードするORFの塩基配列と同一であることが望ましいが、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。すなわち、センス鎖の塩基配列は、ORFの塩基配列において1又は複数、すなわち、1〜3の塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基の置換、欠失、挿入及び/又は付加があってもよい。
当該アンチセンス鎖は、センス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を有する。アンチセンス鎖は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる限り、1〜3の塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基の置換、欠失、挿入および/または付加を含むミスマッチを有するものであってもよい。好ましくは、アンチセンス鎖は、センス鎖と完全に相補的な塩基配列からなる。
センス鎖およびアンチセンスの塩基配列は、TSをコードする公知の塩基配列(GenBank:CR601528.1)に基づいて選択することができる。これらの塩基配列を選択する方法として種々の方法が知られており、例えば、siRNA Design Support System(タカラバイオ株式会社)などを用いることが可能である。
本発明において、センス鎖として以下の塩基配列からなるものが挙げられるがこれらに限定されない:5’−GUAACACCAUCGAUCAUGA−3’(配列番号1);5’−GAAUACAGAGAUAUGGAAU−3’(配列番号3);5’−CGAUCAUGAUGUAGAGUGU−3’(配列番号5);5’−GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT−3’(配列番号9)。
好ましくは本発明におけるshRNAは、センス鎖5’−GUAACACCAUCGAUCAUGA−3’(配列番号1)とアンチセンス鎖5’−UCAUGAUCGAUGGUGUUAC−3’(配列番号2);センス鎖5’−GAAUACAGAGAUAUGGAAU−3’(配列番号3)とアンチセンス鎖5’−AUUCCAUAUCUCUGUAUUC−3’(配列番号4);またはセンス鎖5’−CGAUCAUGAUGUAGAGUGU−3’(配列番号5)とアンチセンス鎖5’−ACACUCUACAUCAUGAUCG−3’(配列番号6);センス鎖5’−GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT−3’(配列番号9)とアンチセンス鎖5’−AACAACUCCUCCAAAACACCC−3’(配列番号10)を含む。
さらに好ましくは、本発明におけるshRNAは、配列番号1で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号2で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖を含む。
センス鎖とアンチセンス鎖は、リンカー部分を介して連結され、当該リンカー部分がループを形成することにより折りたたまれ、当該アンチセンス鎖と当該センス鎖がハイブリダイズして、二本鎖部分を形成する。shRNA分子に含まれるリンカー部分は、センス鎖とアンチセンス鎖を連結しステムループ構造を形成し得る限り、ポリヌクレオチドリンカーであっても、非ポリヌクレオチドリンカーであってもよく、特に限定しないが、当業者に公知である2〜22塩基のポリヌクレオチドリンカーが好ましい。具体的には、UAGUGCUCCUGGUUG(配列番号7)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCCおよびUUCGが例示でき、UAGUGCUCCUGGUUG(配列番号7)が好ましい。
本発明におけるshRNAは3’末端に少なくとも2塩基からなるオーバーハングを有する。
本発明において、オーバーハングとは、アンチセンス鎖の3’末端に付加された塩基であって、センス鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。アンチセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有していない場合、オーバーハングを有している場合と比べて、本発明のリポソームを用いたトランスフェクションにおいて、shRNAによるTSの発現抑制の程度がおよそ40〜60%低下する。当該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、1〜5、好ましくは1〜3、さらに好ましくは1若しくは2塩基からなる配列が挙げられ、例えば、TTT、UUやTTが挙げられる。好ましくは、UUである。
本発明において、好ましいshRNAとしては、配列番号8で表される塩基配列からなる一本鎖RNAである。
また、センス鎖またはアンチセンス鎖は必要に応じて、5’末端がリン酸化されていてもよく、5’末端に三リン酸(ppp)が結合していても良い。
上記shRNAは、本発明のリポソームの脂質二重膜の外膜表面に共有結合または非共有結合によって結合している。上記shRNAとリポソームの結合に際しては、上記shRNAとリポソームを含む混合液を1〜15分間、好ましくは10分間程度激しく攪拌(例えば超音波撹拌等)することが好ましい。攪拌を加えることによって、得られるshRNAを備えたリポソームの粒径を数百nmのサイズに調製できる(Barichello,J.M.,et al.,Int.J.Pharm.(2011))。また、攪拌を加えることによって、リポソーム上に上記shRNAを均一に分散させ結合させることができ、shRNAの不均一な結合によってもたらされる組織によるリポソーム取り込みの不均一性を防ぐことができる。あるいは、リポソームがプレソームである場合には、上記プレソームを含む懸濁液にshRNAを添加して混合(例えばボルテックス操作等)することにより、プレソームの脂質二重膜の外膜表面にshRNAを結合させることができる。
本発明において、shRNAを備えたリポソームは粒径が200〜600nm、好ましくはおよそ300〜400nmである。また、本発明において、shRNAを備えたプレソームは粒径が200nm〜2μm、好ましくはおよそ300nm〜1μmである。本発明において、shRNAを備えたリポソームはゼータ電位が、0〜50mV、好ましくはおよそ25〜35mVである。
本発明におけるshRNAを備えたリポソームは、TSの発現を抑制することができるshRNAに加えて、腫瘍細胞において発現しかつ腫瘍細胞の増殖に関与する因子をコードする遺伝子の発現をRNAi作用により抑制することが可能なsiRNA又はshRNAを含んでも良い。このようなsiRNA又はshRNAとしては、上に定義したものを使用することができる。TSの発現を抑制することができるshRNAとその他のsiRNA又はshRNAは、同一のリポソームに結合していても良いし、それぞれ別個のリポソームに結合していても良い。
なお、本明細書において、shRNAを備えたリポソームを、「リポプレックス」と呼ぶ場合がある。また、shRNAを備えたプレソームを、「プレプレックス」と呼ぶ場合がある。
下記実施例にて詳述されるように、局所投与により上記shRNAを備えたリポソームは腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能であり、癌を治療するために利用することができる。
本発明の抗腫瘍剤を用いて治療できる癌としては、TSを高発現している癌が挙げられ、特に制限されるものではないが、例えば、結腸・直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、膀胱癌、前立腺癌、悪性胸膜中皮腫、精巣腫瘍、卵巣癌、骨・軟部肉腫、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。また、癌性胸膜炎や癌性腹膜炎も本抗腫瘍剤で治療可能である。治療候補として、好ましくは胃癌、肺癌、胆道癌、肝臓癌、悪性胸膜中皮腫、卵巣癌、癌性胸膜炎や腹膜炎であり、特に好ましくは悪性胸膜中皮腫、遠隔転移のない非小細胞肺癌、癌性胸膜炎、胃癌の腹膜播種転移、卵巣癌の腹膜播種転移、癌性腹膜炎である。
本発明の抗腫瘍剤はまた、shRNAを備えたリポソームと共に、医薬の製造において通常用いられている、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、pH調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、ヒスチジン等を含んでも良い。賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、安定化剤、等張化剤、pH調整剤としては、上に定義したものを使用することができる。
本発明の抗腫瘍剤は、局所投与によって、投与することができる。局所投与には上に定義したものが挙げられる。また、本発明の組成物は局所投与に適した剤形とすることができ、注射剤、懸濁剤、乳化剤、スプレー剤等の各種製剤形態に調製することができる。
本発明の抗腫瘍剤の効果は、上記癌に由来する細胞や組織、および上記癌に罹患する個体に当該抗腫瘍剤を投与し、腫瘍の大きさが当該抗腫瘍剤を投与していない(または投与前の)細胞や組織、および個体における腫瘍の大きさと比較して、腫瘍が縮小または消滅していることを指標にして評価することが可能である。また、本発明の抗腫瘍剤の効果は、上記癌に由来する細胞や組織、および上記癌に罹患する個体に当該抗腫瘍剤を投与し、当該抗腫瘍剤を投与していない個体と比較して、生存率の向上(延命効果)、胸水や腹水が減少または消滅していることを指標にして評価することが可能である。
本発明の抗腫瘍剤は、既存の癌化学療法や癌化学療法剤と共に使用することができる。本発明の抗腫瘍剤と併用し得る癌化学療法や癌化学療法剤としては、本発明のリポソームが腫瘍組織に侵入しやすいように腫瘍環境を改変し得るものであればよく、例えば既存の癌化学療法としては、以下に記載する「TS阻害作用を有する抗腫瘍剤」を用いた化学療法が挙げられ、既存の癌化学療法剤としては、TS阻害作用を有する抗腫瘍剤が挙げられる。
「TS阻害作用を有する抗腫瘍剤」としては、TSの機能を阻害しうる限り特に限定されず、例えば、5−FU系抗腫瘍剤、ペメトレキセドナトリウム水和物、ラルチトレキセド(Tomudex)、メトトレキサート(MTX)などが挙げられる。
TSの発現量と5−FU系抗腫瘍剤の感受性の関係が報告されている(Patrick G.Johnston et al.,Cancer Res 1995;55:1407−12.及びKun−Huei Yeh et al.,Cancer 1998;82:1626−31)。癌患者の中でもTSの発現が比較的低い癌患者は、5−FU系抗腫瘍剤が顕著に奏効する一方で、癌患者の中でもTSの発現が比較的亢進している癌患者の多くは、5−FU系抗腫瘍剤に対して耐性を有する。ペメトレキセドナトリウム水和物についても、TSの発現量との間に同様の関係がみられる。本発明の抗腫瘍剤を投与することによって、腫瘍組織内のTSの産生を抑えることができ、当該腫瘍組織のTS阻害作用を有する抗腫瘍剤の感受性を高めることができる。また、本発明の抗腫瘍剤は、TS阻害作用を有する抗腫瘍剤と併用した場合に、腫瘍内に選択的に蓄積され、shRNAを腫瘍細胞に効率的に送達することができる。これによって、TS阻害作用を有する抗腫瘍剤と併用した場合に、本発明の抗腫瘍剤は、TS阻害作用を有する抗腫瘍剤または本発明の抗腫瘍剤を単独で用いた場合と比べて、顕著に高い抗腫瘍効果を得ることができる。
「5−FU系抗腫瘍剤」としては、5−FUおよび活性代謝物質が5−FUである5−FU誘導体が挙げられる。5−FU誘導体としては例えば、テガフールを含有するものを挙げることができる。5−FU誘導体としては好ましくは、テガフール含有配合剤であり、具体的には、テガフール・ウラシル配合剤(例えば、ユーエフティ(登録商標)(大鵬薬品工業株式会社))、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤などが例示できる。この中でも、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、例えばティーエスワン(登録商標)(大鵬薬品工業株式会社)が特に好ましい。
また、ペメトレキセドナトリウム水和物としては、アリムタ(登録商標)(日本イーライリリー株式会社)が挙げられる。ペメトレキセドナトリウム水和物も、上記5−FU系抗腫瘍剤と同様に、本発明の抗腫瘍剤との併用により、当該ペメトレキセドナトリウム水和物又は本発明の抗腫瘍剤を単独で用いた場合と比べて、顕著に高い抗腫瘍効果を得ることができる。
本発明の抗腫瘍剤は、上記TS阻害作用を有する抗腫瘍剤に加えて、または変えて、他の既存の癌化学療法剤と共に使用することができる。このような癌化学療法剤としては、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタードN−オキシド、イホスファサミド、メルファラン、ブスルファン、ミトブロニトール、カルボコン、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、テモゾロミド、カルムスチン、ペメトレクスドジソディウム、メトトレキサート、6−メルカプトプリンリボシド、メルカプトプリン、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、ペメトレキセド、シスプラチン、カルボプラチン、オキザリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、塩酸イリノテカン、カペシタビンなどが挙げられ、これらから選択される一または複数の癌化学療法剤を用いることができる。これらの癌化学療法剤も、上記TS阻害作用を有する抗腫瘍剤と同様に、本発明の抗腫瘍剤との併用により、shRNAを腫瘍細胞に効率的に送達することができ、また当該癌化学療法剤または本発明の抗腫瘍剤を単独で用いた場合と比べて、顕著に高い抗腫瘍効果を得ることができる。
本発明の抗腫瘍剤と、上記既存の癌化学療法剤とは併用投与される限り、組み合わせ物として提供することができる。
本発明の抗腫瘍剤は上記既存の癌化学療法剤とともに「組み合わせ物」の形態とすることができる。「組み合わせ物」は、本発明の抗腫瘍剤と上記既存の癌化学療法剤とを有効成分として含む配合剤であっても良いし、ならびに本発明の抗腫瘍剤と上記既存の癌化学療法剤を併用投与に適した単一のパッケージ(キット製剤)として製造・包装・流通されるものでもあっても良い。
「併用投与」には、本発明の抗腫瘍剤と上記既存の癌化学療法剤とを同時に投与する場合だけではなく、本発明の抗腫瘍剤および上記既存の癌化学療法剤を間隔をあけて投与する場合も含まれる。本発明の抗腫瘍剤と上記既存の癌化学療法剤の投与経路及び投与手段は同一であってもよいし、異なっていてもよい。
本発明の抗腫瘍剤の投与量および投与回数は、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、shRNAの量にして1回につき体重1kgあたり0.0001mg〜100mgの範囲から適宜選択される量を、1日に1〜3回、毎日または1〜21日毎に投与することができる。
上記既存の癌化学療法剤の投与量は、有効成分である化学物質の種類、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、1回につき体重1kgあたり0.0001mg〜1000mgの範囲から適宜選択される量を、1日に1〜3回、毎日または1〜14日毎に投与することができる。例えば、既存の癌化学療法剤が5−FU系抗腫瘍剤である場合、1日にテガフールにして60〜160mgを毎日または1〜7日毎に投与することができる。また、既存の癌化学療法剤がペメトレキセドナトリウム水和物である場合、1日に500〜1000mgを毎日または1〜7日毎に投与することができる。上記既存の癌化学療法剤は単独で用いる場合と比べて、低用量かつ頻回投与することができる。これによって、上記既存の癌化学療法剤の投与により引き起こされ得る副作用(例えば、骨髄抑制、溶血性貧血、播種性血管内凝固症候群、劇症肝炎、脱水症状、腸炎、間質性肺炎、口内炎、消化管潰瘍、消化管出血、消化管穿孔、急性腎不全、皮膚粘膜眼症候群、中毒性表皮壊死症、精神神経障害、急性膵炎、横紋筋融解症、嗅覚脱失など、これらに限定されない)の発症を抑制または遅延することができる。
4.治療方法
本発明はまた、上記本発明の抗腫瘍剤を用いた癌の治療方法に関する。当該方法により治療し得る癌としては、上に定義したような癌が含まれる。また、当該方法において上記本発明の抗腫瘍剤および既存の癌化学療法剤の用法および用量は上記したとおりである。
[実施例1]
In vitroにおけるTSを標的とするshRNAとアリムタ併用による細胞増殖抑制効果
(TSを標的とするshRNA)
TSを標的とするshRNA(以下、「TS−shRNA」と記載する)は、TSの発現を抑制することができ、かつ抗腫瘍効果が既に確認されている公知のshRNA(WO2012/161196を参照)に基づいて、以下の配列を有するものを合成した。
TS−shRNA:
一方、対照として標的となるmRNAが存在しない以下の配列を有するshRNAを用いた。以下、対照のshRNAを「NS−shRNA」と記載する。
NS−shRNA:
(MTTアッセイ)
本実験では96ウェルプレートスケールで実験を行った。トランスフェクションは、カチオニックリポソームの一種であるLipofectamine(登録商標)RNAi MAX(Lf RNAi MAX)を、製造元の指示書に従い使用して行った。
300pmolの上記shRNA(TS−shRNA又はNS−shRNA)と15μLのLf RNAi MAXをそれぞれ500μLになるようにOptiMEMで希釈し、両溶液を混合して10〜20分間室温で放置し複合体(リポプレックス)を形成させた。あらかじめ24時間前にヒト悪性胸膜中皮腫細胞(MSTO−211H)懸濁液(2,000細胞/100μL)を播種しておいたウェルに、50μLのリポプレックスを添加し、最終合計容積を150μLとした(ウェル中のshRNA最終濃度は5nMと10nMになるように調整した)。トランスフェクション開始から24時間後、培地を除去し、既存の癌化学療法剤「アリムタ(ペメトレキセドナトリウム水和物:PMX)」(イーライリリー)を0.01μg/mLの濃度で含む、又は当該癌化学療法剤を含まない新しい培地を200μL添加した。新しい培地を添加して0、24、48、72、96時間後、培地を除去し、0.5% MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)溶液を50μL加え、4時間、37℃、5% CO2条件下でインキュベーションした。また細胞の入っていないウェルにも0.5% MTT溶液を加えバックグラウンドとした。
インキュベーション終了後、それぞれのウェルに酸性イソプロパノール150μLを加え、シェイカーを用いホルマザン結晶を溶解し、プレートリーダーを用いて、570nmの波長で吸光度を測定し、細胞の増殖率を以下の式を用いて算出した。
細胞の増殖率(%)=[A570(新しい培地を添加してX時間後)/A570(新しい培地を添加して0時間後)]×100
結果を図1に示す。
図1に示すとおり、TS−shRNAはPMXの存在下において、MSTO−211H細胞の増殖を時間依存的に顕著に阻害した。
[実施例2]
TS−shRNAによるTS発現抑制
(トランスフェクション)
トランスフェクションは、カチオニックリポソームの一種であるLipofectamine(登録商標)RNAi MAX(Lf RNAi MAX)を、製造元の指示書に従い使用して行った。
実施例1で調製したリポプレックスを本実施例においても用いた。
MSTO−211H細胞懸濁液10mLを10cmディッシュに500,000細胞/ディッシュとなるように添加し、あらかじめ24時間培養を行った。これに各リポプレックスを直接添加し(最終合計容積は15mL)とし、トランスフェクションを行った。このとき、TS−shRNAまたはNS−shRNAの最終濃度が5nM又は10nMとなるように調整した。対照はshRNAで処理しなかった。トランスフェクションを開始してから37℃、5% CO2条件下、培地中で72時間培養し、その後、以下の方法により細胞抽出液を調製した。
(細胞抽出液の調製)
トランスフェクションを開始してから72時間後、培地を除去し、冷PBS(−)で洗浄した後、トリプシン溶液を用いて細胞をはがし、遠心して上清を取り除いた。さらに冷PBS(−)で洗浄後、冷Lysis buffer(50mM Tris−HCl(pH7.4),1% NP−40,0.25% デオキシコール酸ナトリウム,150mM NaClおよびProtease Inhibitor Cocktail(Sigma−Aldrich,MO,USA))を100〜150μL添加し、1時間、氷上(4℃)の条件下インキュベートして細胞を溶解した。その後、遠心分離し(15,000×g、15分間、4℃)、得られた上清を細胞抽出液とした。
(SDS−PAGE用サンプルの調製)
上記細胞抽出液と2×サンプルバッファーを等量ずつ混合し、95℃に設定したマイクロチューブ用ホットプレートを用いて3分間加熱した。その後30秒間遠心し、室温で冷ましてSDS−PAGE用サンプルとした。
(SDS−PAGE)
上記サンプルを6μL(9μgタンパク質/レーン)ずつ12%ポリアクリルアミドゲルにアプライし、パワーサプライ(Bio−Rad laboratories)とつないでゲル2枚で40mA(ゲル1枚では20mA)の定電流で約80分間電気泳動した。
(ウェスタンブロッティング)
適当な大きさに切ったろ紙及びHybond−ECLを、前処理としてブロッティングバッファーに浸した。SDS−PAGE後、トランスファー装置を用いてタンパクをHybond−ECLに転写した。転写したHybond−ECLをブロッキングバッファー(5%スキムミルク)に浸して室温で1時間ブロッキングし、Tween bufferで5分間3回洗浄した。
TS及びβ−アクチンを検出するために、Tween bufferで希釈したそれぞれの一次抗体(Mouse monoclonal anti−human TS antibody(1:1000)(ANASPEC,Inc.CA,USA)、Mouse monoclonal anti−human β−actin antibody(1:500)(Abcam,Tokyo,Japan))を4℃で一晩反応させた。Tween bufferで5分間3回洗浄後、Tween bufferで希釈した二次抗体(HRP−conjugated goat anti−mouse secondary antibody(1:2000)(ICN Biomedical,CA,USA))溶液を室温で1時間反応させた。Tween bufferで5分間3回洗浄後、ECL Chemiluminescence Reagent(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)と約1分間反応させた。目的タンパク質のバンドはLAS−4000EPUVmini(Fujifilm)を用いて可視化、撮影し、ソフトウエア(Multi Gauge v.3.2(FujiFilm,Tokyo,Japan))を用いて定量化した。
結果を図2に示す。
図2に示されるとおり、実施例1で調製したTS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスが配列特異的かつ濃度依存的にMSTO−211H細胞におけるTSの発現を顕著に抑制できることが明らかとなった。
[実施例3]
In vitroにおけるLuciferase−shRNAによるルシフェラーゼ発現抑制
(ルシフェラーゼ発現細胞株の作製)
ホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発現プラスミド(pGL3−control、プロメガ社)及びウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発現プラスミド(pRL−TK、プロメガ社)のトランスフェクションは、カチオニックリポソームの一種であるLipofectamine(登録商標)2000(Lf 2000)を用い、製造元の指示書に従い行った。
HT−1080細胞懸濁液を12ウェル細胞培養用プレートに100,000細胞/ウェル(1mL)となるように添加し、あらかじめ12時間培養を行った。培養上清液の除去、PBSを用いた一回洗浄を行った後、それぞれのウェルに両ルシフェラーゼ発現プラスミドを含むトランスフェクション溶液(200μL)を添加し、ルシフェラーゼ発現プラスミドのトランスフェクションを行った。このとき、各プラスミドの最終濃度が1μg/200μLとなるよう調整した。トランスフェクションを開始してから37℃、5% CO2条件下、培養を行った。
(カチオニックリポソームの調製)
以下に示す方法によってカチオニックリポソームを調製した。
リポソームを構成する脂質は以下より選択して使用した:DOPC(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、POPC(1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DC−6−14(0,0′−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチル−アンモニオアセチル)ジエタノールアミンクロリド)。これらの脂質はあらかじめクロロホルムで溶解させ、ストック溶液とした。
脂質組成がDOPE:X:DC−6−14=3:2:5(モル比,X=DOPC又はPOPC)となるようにそれぞれストック溶液からガラスシリンジを用いて正確に量り取り、栓付き試験管に入れ、混合した(総脂質量として200mmol)。次に、ロータリーエバポレーター(IWAKI、東京)を用いて減圧下クロロホルムを除去し、その後、完全にクロロホルムを取り除くために試験管を一晩真空ポンプに入れ、試験管内に脂質薄膜を形成させた。この脂質薄膜に内水相として2mLの9% スクロース溶液(30mL,pH7.4)を加え、37℃で激しく攪拌することで脂質薄膜を完全に水和させ、MLV(multilamellar vesicle)を得た(最終脂質濃度は100mM)。この溶液を37℃に加温しながら、200nm、100nm、50nmのポリカーボネート膜(Nucleopore,CA、USA)を用いてエクストリュージョン法により粒子径が約100nmとなるLUV(large unilamellar vesicle)を調製した。
(ルシフェラーゼ(Luc)を標的とするshRNA)
Lucを標的とするshRNA(以下、「Luc−shRNA」と記載する)は、以下の配列を有する。
Luc−shRNA:
(リポプレックスの調製)
リポプレックスは、上記カチオニックリポソームとshRNAとをカチオニックリポソーム:shRNA=800,400又は200:1(モル比)となるように混合し、10分間激しく攪拌することで調製した。shRNAがカチオニックリポソームに完全に吸着しているかは、2%アガロースゲル上で電気泳動し、遊離のshRNAが存在していないことで確認した。
(In vitroにおけるルシフェラーゼ発現抑制)
上記ルシフェラーゼ発現細胞株に、各リポプレックスをshRNA量の最終濃度が50nMとなるようにそれぞれ投与し、37℃、5% CO2条件下、48時間培養した。培養終了後、Dual Luciferase Reporter Assay System(プロメガ社)を用いて、製造元の指示書に用いて、細胞抽出液の調製、及びルシフェラーゼ活性の測定を行った。すなわち、培養終了後、培地を除去し、冷PBS(−)で洗浄した後、Passive Lysis Bufferを150μL/ウェル添加し、旋回型シェーカーにより振盪しながら室温にて15分間インキュベートして細胞を溶解した。その後サンプルチューブに移し、−80℃、30分間冷却した後、室温へと戻した。遠心分離し(9,000×g、30秒間、4℃)、得られた上清を細胞抽出液とした。次いで、Luciferase Assay Reagent II溶液を50μLずつ分注した96ウェル白色マイクロプレートに対し、前述した細胞抽出液を10μLずつ加え、ピペットを用いて混和した。マイクロプレートをルミノメーターInfinite M200 Pro(Tecan社)にセットし、ホタルルシフェラーゼ活性による化学発光を10秒間測定した。測定後プレートを取り出し、各ウェルにStop&Glo Reagent溶液を50μLずつ加え、軽くボルテックスして混和後、すぐにルミノメーターを用いてウミシイタケルシフェラーゼ活性による化学発光を同様に測定した。データ解析には、ウミシイタケルシフェラーゼ活性値を内部コントロールとして標準化し、shRNA処理をしていない対照群に対する相対的ホタルルシフェラーゼ活性を求めて評価した。
結果を図3に示す。なお、図3の結果は対照のルシフェラーゼ活性を100%とする相対値にて示す。
図3に示されるとおり、Luc−shRNA処理を行っていない対照群に比べ、DOPC又はPOPCを含むいずれのリポプレックスを用いた場合においてもルシフェラーゼ活性の低下がみられた。このことはLuc−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスが、HT−1080細胞におけるルシフェラーゼ発現を抑制できることを示している。さらにPOPC含むリポプレックスと比べて、DOPCを含むリポプレックスのほうがLuc−shRNAによる発現抑制効果が高いことが示された。さらに、Luc−shRNA:カチオニックリポソームのモル比は1:800である場合に、Luc−shRNAによる発現抑制効果が高いことが示された。
[実施例4]
悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの確立
2,2,2−トリブロモエタノール(Avertin;Sigma−Aldrich)麻酔下、ヌードマウス(5週齢、オス)の左胸腔内にルシフェラーゼを安定発現させたMSTO−211H細胞(MSTO−211H−Luc細胞)懸濁液を100μL投与し、移植を行った。細胞の移植後3、7、14、21日後にイソフルランを用いた麻酔下、D−luciferin potassium salt(Wako Pure Chemical)溶液100μl(7.5mg/ml)を腹腔内に投与し、胸腔内で増殖したMSTO−211H−Luc細胞の活性に依存した生物発光の強さをIVIS(Xenogen,Alameda,CA,USA)を用いて評価した。
結果を図4に示す。
図4に示されるとおり、移植後3日目にMSTO−211H−Luc細胞の増殖に伴う生物発光が僅かに観察され、その後経時的に生物発光が増強した。本検討から、移植したMSTO−211H−Luc細胞が胸腔内で十分増殖している事が明らかとなり、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスを確立することができた。
[実施例5]
In vivoでのshRNA導入効果が高いカチオニックリポソームの選定
(カチオニックリポソームの調製)
以下に示す方法によってカチオニックリポソームを調製した。
リポソームを構成する脂質は以下より選択して使用した:DOPC(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、POPC(1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DMPC(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホリルコリン)、DEPC(1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DC−6−14(0,0′−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチル−アンモニオアセチル)ジエタノールアミンクロリド)。これらの脂質はあらかじめクロロホルムで溶解させ、ストック溶液とした。
脂質組成がDOPE:X:DC−6−14=3:2:5(モル比)となるようにそれぞれストック溶液からガラスシリンジを用いて正確に量り取り、上記実施例3に示す方法に従ってカチオニックリポソームを調製した。リポソームの粒子径(動的光散乱法)及びゼータ電位(電気泳動光散乱法)はNICOMP 370(Particle Sizing System、CA、USA)により測定した。リポソームの表面電荷は全て約+50mVであった。
(ルシフェラーゼ(Luc)を標的とするshRNA)
上記実施例3に示すLuc−shRNAを使用した。
(リポプレックスの調製)
リポプレックスは、上記カチオニックリポソームとshRNAとをカチオニックリポソーム:shRNA=2000:1(モル比)となるように混合し、10分間激しく攪拌することで調製した。shRNAがカチオニックリポソームに完全に吸着しているかは、2%アガロースゲル上で電気泳動し、遊離のshRNAが存在していないことで確認した。
調製したリポプレックスの平均粒子径及びゼータ電位は、それぞれ約350nm及び約+15mVであった。
(同所移植モデルマウスを用いたin vivoでのルシフェラーゼ発現抑制)
2,2,2−トリブロモエタノール(Avertin;Sigma−Aldrich)麻酔下、ヌードマウス(5週齢、オス)の左胸腔内にルシフェラーゼを安定発現させたMSTO−211H細胞(MSTO−211H−Luc細胞)懸濁液を100μL投与した。細胞移植後、10、13、16、19日目に、胸腔内にリポプレックスをshRNA量にして20μg(50μL)ずつ直接投与した。リポプレックスの最終投与2日後、イソフルランを用いた麻酔下、D−ルシフェリンカリウム塩溶液100μL(7.5mg/mL)を腹腔内に投与し、胸腔内で増殖したMSTO−211H−Luc細胞の活性に依存した生物発光の強さをIVIS(Xenogen,Alameda,CA,USA)で評価した。
対照には9%スクロース溶液を投与した。
結果を図5−1及び図5−2に示す。
図5−1及び図5−2に示されるとおり、用いたカチオニックリポソームの脂質組成に応じてルシフェラーゼの発現抑制に差が生じる事が明らかとなり、DOPE/DOPC/DC−6−14(3:2:5)の脂質組成を持つカチオニックリポソームを用いて調製したリポプレックスが有意に最も強く胸腔内に移植したMSTO−211H−Luc細胞中のルシフェラーゼの発現を抑制することが示された。
[実施例6]
In vivoでのshRNA導入における正電荷脂質(DC−6−14含量)の影響
(カチオニックリポソームの調製)
実施例3に示した方法に従って、リポソームを調製した。ただし、リポソームの脂質組成は、DOPE:POPC:DC−6−14=3:2+X:5−X(モル比,X=0,1.5,3.0)とした。リポソームの粒子径および表面電荷はNICOMP 370(Particle Sizing System、CA、USA)により測定した。調製したLUV(large unilamellar vesicle)の粒子径はすべて約100nmであることを確認した。また、その表面電荷はそれぞれ、20%のDC−6−14を含むリポソームが約+25mV、35%のDC−6−14を含むリポソームが約+35mV、50%のDC−6−14を含むリポソームが約+50mVであることを確認した。
(リポプレックスの調製)
リポプレックスは、実施例3に示すLuc−shRNAを実施例3に示す方法でリポソームと混合して調製した。リポプレックスの粒子径(動的光散乱法)及びゼータ電位(電気泳動光散乱法)はNICOMP 370(Particle Sizing System、CA、USA)により測定した。20%のDC−6−14を含むリポプレックスの粒子径は約350nm、表面電荷は約+25mVであり、35%のDC−6−14を含むリポプレックスの粒子径は約350nm、表面電荷は約+30mVであり、50%のDC−6−14を含むリポプレックスの粒子径は約350nm、表面電荷は約+35mVであった。
(同所移植モデルマウスを用いたin vivoでのルシフェラーゼ発現抑制)
実施例5に示した方法にしたがい、調製したリポプレックスのin vivo遺伝子発現抑制効果(shRNA細胞内導入効率)を評価した。
結果を図6−1及び図6−2に示す。
図6−1及び図6−2に示されるとおり、リポソーム中の正電荷脂質(DC−6−14)の量が増加するにつれ、リポプレックスのin vivoにおけるルシフェラーゼ発現抑制効果が亢進されることが分かった。表面電荷の増加は、負に帯電したshRNAと複合体を形成する際に有利であるだけでなく、負に帯電した腫瘍細胞とも相互作用しやすくなり、結果として多量にかつ効率よくshRNAを細胞内に導入することができる。
[実施例7]
In vivoでのshRNA導入におけるPEG修飾の影響
(PEG修飾カチオニックリポソームの調製)
実施例3に示した方法に従って、リポソームを調製した。
構成脂質は以下のものを使用した:DOPC、POPC、DOPE、DC−6−14及び1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−2000](mPEG2000−DSPE)。PEG修飾リポソームの脂質組成はDOPE:X:DC−6−14:mPEG−DSPE=3:2:5:0.1(モル比,X=DOPC又はPOPC)とし、PEG未修飾リポソームの脂質組成はDOPE:X:DC−6−14=3:2:5(モル比,X=DOPC又はPOPC)とし、LUV(large unilamellar vesicle)を調製した。リポソームの粒子径はNICOMP 370(Particle Sizing System、CA、USA)により測定した。DOPCを含むリポソーム(PEG未修飾リポソーム)の粒子径は約100nmであり、表面電荷は約+50mVであった。POPCを含むリポソーム(PEG未修飾リポソーム)の粒子径は約110nmであり、表面電荷は約+50mVであった。PEG修飾したDOPCを含むリポソーム(PEG修飾リポソーム)の粒子径は約106nmであり、表面電荷は約+50mVであった。PEG修飾したPOPCを含むリポソーム(PEG修飾リポソーム)の粒子径は約100nmであり、表面電荷は約+50mVであった。
(リポプレックスの調製)
リポプレックスは、実施例3に示すLuc−shRNAをPEG修飾リポソーム又はPEG未修飾リポソームと実施例3に示す方法で混合して調製した。リポプレックスの粒子径(動的光散乱法)及びゼータ電位(電気泳動光散乱法)はNICOMP 370(Particle Sizing System、CA、USA)により測定した。DOPCを含むリポプレックスの粒子径は約350nmであり、表面電荷は約+30mVであった。POPCを含むリポプレックスの粒子径は約360nmであり、表面電荷は約+30mVであった。DOPCを含むPEG修飾したリポプレックスの粒子径は約370nmであり、表面電荷は約+30mVであった。POPCを含むPEG修飾したリポプレックスの粒子径は約370nmであり、表面電荷は約+30mVであった。
(同所移植モデルマウスを用いたin vivoでのルシフェラーゼ発現抑制)
実施例5に示した方法にしたがい、調製したPEG修飾リポプレックス又はPEG未修飾リポプレックスのin vivo遺伝子発現抑制効果(shRNA細胞内導入効率)を評価した。
結果を図7−1及び図7−2に示す。
図7−1及び図7−2に示されるとおり、用いたカチオニックリポソームの脂質組成によらず、PEG修飾を施すことにより、リポプレックスのルシフェラーゼの発現抑制効果が抑制されることが明らかとなった。静脈内投与時にはPEG化は必須であるが、胸腔内投与時にはPEG修飾は寧ろshRNAの細胞内導入効率を抑制することが示された。
[実施例8]
TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスの胸腔内投与による悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍増殖抑制効果
(悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの確立)
MSTO−211H−Luc細胞を用いた悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスは実施例3に示した方法で作製し、移植細胞が十分定着した移植7日目のマウスをin vivo実験に供した。
(カチオニックリポソームの調製)
実施例3に示した方法に従って、リポソームを調製した。ただし、リポソームの脂質組成は、DOPE:POPC:DC−6−14=3:2:5とした。
(リポプレックスの調製)
リポプレックスは、実施例1に示すshRNAを上記リポソームと実施例3に示す方法で混合して調製した。リポプレックスの粒子径(動的光散乱法)及びゼータ電位(電気泳動光散乱法)はNICOMP 370(Particle Sizing System、CA、USA)により測定した。TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックス(以下、「TS−shRNAリポプレックス」と記載する)の粒子径は約400nm、表面電荷は約+30mVであった。一方、NS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックス(以下、「NS−shRNAリポプレックス」と記載する)の粒子径は約400nm、表面電荷は約+30mVであった。
(TS−shRNAリポプレックスの腫瘍増殖抑制効果の評価)
上記MSTO−211H−Luc細胞担がんマウスに対し、TS−shRNAリポプレックス又はNS−shRNAリポプレックスを腫瘍移植後7日目から17日目まで隔日に合計6回胸腔内に直接投与した。一回の投与あたり、20μg shRNA/100μLを投与した。
既存の癌化学療法剤「アリムタ(ペメトレキセドナトリウム水和物(PMX))」(イーライリリー)を併用する場合には、25mg/kgの用量で、腫瘍移植後7日目から11日目まで毎日、その後2日あけて同量を14日目から18日目まで毎日、合計10回腹腔内に投与した。
対照には9%スクロース溶液を投与した。
制がん活性(細胞増殖抑制活性)は、実施例5に示すように、MSTO−211H−Luc細胞移植後21日目にイソフルランを用いた麻酔下、D−ルシフェリンカリウム塩溶液100μL(7.5mg/mL)を腹腔内に投与し、胸腔内で増殖したMSTO−211H−Luc細胞の活性に依存した生物発光の強さをIVIS(Xenogen,Alameda,CA,USA)で評価した。
制がん効果に基づく延命効果に関しては、上述のIVISによる評価に供したモデルマウスをそのまま治療なしの状態で細胞移植後47日目まで継続して飼育することで評価した。
平均生存期間(Mean survival time(MST)(day))は以下の式に基づいて算出した。
MST(day)=最初の死亡日+最後の死亡日/2
生存期間増加率(Increased life span(%))は以下の式に基づいて算出した。
ILS(%)=[処置群の平均生存期間/対照群の平均生存期間]×100
結果を図8−1及び図8−2、並びに図8−3及び図8−4に示す。
図8−1及び図8−2に示されるとおり、対照群と比較して、NS−shRNAリポプレックスを単独で用いて処置した群では、全く腫瘍増殖抑制効果は示されなかった。一方、TS−shRNAリポプレックス又はPMXを単独で用いて処置した群では約50%の腫瘍増殖抑制効果が確認された。また、NS−shRNAリポプレックスをPMXと併用して処置した群では、PMX単独投与群で見られたのとほぼ同じ腫瘍増殖抑制効果が見られただけであったが、TS−shRNAリポプレックス及びPMXを併用して処置した群においては約90%という有意に顕著な腫瘍増殖抑制効果が示された。
延命効果に関しては、図8−3及び図8−4に示されるとおり、対照群と比較して、NS−shRNAリポプレックスを単独で用いて処置した群では、ほとんど延命効果は示されなかった。一方、TS−shRANリポプレックス又はPMXを単独で用いて処置した群ではわずかに延命効果(120〜126%)が示された。また、NS−shRNAリポプレックスをPMXと併用して処置した群では、PMX単独投与群で見られたのとほぼ同じ延命効果(122%)が見られただけであったが、TS−shRNAリポプレックス及びPMXを併用して処置した群において上述の腫瘍増殖抑制効果を反映した最大の延命効果(178%)が確認された。
なお、いずれの処置群においても体重増加抑制を含む、重篤な毒性は認められなかった。
[実施例9]
TS−shRNAリポプレックスの胸腔内投与による標的遺伝子発現抑制の検討
実施例8と同様に処置された各群のマウスについて、MSTO−211H−Luc細胞移植後21日目にIVISによる評価を行った後、マウスを犠牲死させ、胸腔より腫瘍細胞を回収し、回収した腫瘍細胞内のTS遺伝子の発現抑制状況を定量的RT−PCR法を用いて評価した。
腫瘍細胞からのRNAの抽出はRNaqueous−micro kit(Ambion,Austin,TX,USA)を用い、製造元が推奨する方法にしたがって行った。RNAのcDNAへの逆転写は、RNAに対してOligo(dT)20、dNTP、RNase inhibitor、ReverTra Ace(Toyobo,Osaka,Japan)を添加して行った。Real−time PCRはStepOnePlus real−time PCR system(Applied Biosystems,CA,USA)を用い、逆転写したcDNAを鋳型として用い、試薬としてFastStart TaqMan Probe Master(ROX)とUniversal ProbeLibrary(Roche Diagnostics GmbH,Manheim,Germany)、を用い、製造元が推奨する方法にしたがって行った。GAPDHを内部標準として用いた。
結果を図9に示す。
図9に示されるとおり、対照群と比較して、NS−shRNAリポプレックスを単独で処置した群では、全くTS遺伝子の抑制効果は見られなかった。一方、TS−shRNAリポプレックス又はPMXを単独で用いて処置した群ではそれぞれ約50%、約25%のTS遺伝子抑制効果が見られた。また、NS−shRNAリポプレックスをPMXと併用して処置した群では、PMX単独投与群とほぼ同じ約20%程度のTS遺伝子抑制効果が確認されただけであった。一方、実施例8において最も高い腫瘍増殖抑制効果を示したTS−shRNAリポプレックスとPMXを併用して処置した群では、高い効果を反映し、残胸腔内にほとんど腫瘍細胞が残っていなかったことから、TS遺伝子の発現変化を測定することはできなかった。
[実施例10]
In vitroでのshRNA導入における脂質混合物の形態が与える影響
カチオニックプレソームの調製
構成脂質組成比は前述の実施例3と同じく、DOPE:X:DC−6−14=3:2:5(X=DOPC又はPOPC)を用いた。
脂質組成が上記のものとなるようそれぞれの脂質を量り取り、総脂質の10倍重量のシクロヘキサン、およびシクロヘキサンの2重量%のエタノールを加え、70℃の温水中で溶解した。溶解液を0.2μmのPTFEメンブレンフィルターを用いてろ過し、ろ過された溶液をドライアイス/アセトンにて凍結させた。完全に凍結させた後、真空ポンプを用いて12時間以上真空乾燥を行ない、カチオニックプレソームを得た。
実験に用いるカチオニックプレソーム溶液は、上記の方法で得られたカチオニックプレソームに、最終脂質濃度が100mMとなるよう9%スクロース溶液(pH7.4)を加え、10分間激しく撹拌することにより調製した。このカチオニックプレソームの平均粒子径は約440±210(平均±標準偏差)nmであった。
リポプレックス、プレプレックスの調製
リポプレックス及びプレプレックスの調製には、それぞれ実施例3で示したカチオニックリポソーム、及び上記カチオニックプレソームを使用した。リポプレックス及びプレプレックスに搭載するshRNAは、ルシフェラーゼを標的とする、実施例3で記したLuc−shRNAを用いた。
カチオニックリポソームまたはカチオニックプレソームと、Luc−shRNAをモル比にして1600:1または800:1となるよう混合し、10分間激しく撹拌することによりLuc−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックス及びプレプレックスをそれぞれ調製した。
HT−1080細胞に対するトランスフェクション
トランスフェクション試薬にはカチオニックリポソームの一種であるLipofectamineTM 2000(以下、「Lf2000」と記載)を使用した。また、ホタル由来およびウミウシ由来のルシフェラーゼを発現する発現プラスミドとしてpGL3−C、及びpRL−TK(プロメガ)をそれぞれ使用した。
両ルシフェラーゼ発現プラスミド15μg+15μg、及びLf2000 30μLにそれぞれ750μLになるようにOptiMEMを加えて希釈し、次いで両溶液を混合して10−20分間室温で放置しLuc−lipoplexを形成させた。
予め24時間前にヒト線維肉腫細胞(HT−1080)懸濁液(10,000 cell/ml)を播種しておいた12wellプレートより培養液を除いた後、上記Luc−lipoplex 100μLを加え、37℃、5% CO2条件下で5時間培養した。
5時間後、培養液を除き、冷PBS(−)で一回洗浄後、新しいDMEM培地900μLと共に、Luc−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックス溶液又はLuc−shRNAを外膜表面に結合するプレプレックス溶液100μL(各well中のshRNA最終濃度は50nM)を加え、37℃、5% CO2条件下でさらに48時間培養した。
ルシフェラーゼ活性測定
ルシフェラーゼ活性の測定にはDual−Luciferase Reporter Assay System(Promega)、および96wellマイクロプレートを使用した。48時間培養後、培地を除去し、冷PBS(−)で一回洗浄後、Passive Lysis Buffer 150μLをウェルに直接添加し細胞を溶解した。凍結融解を一度行ない、遠心分離(10,000xg、30秒、4℃)後、得られた上清を細胞抽出液とした。
各ウェルにLuciferase Assay Reagent II 50μLと細胞抽出液10μLを加え、マイクロプレートリーダーInfinite200(登録商標)Pro(Tecan社)を用いてホタルルシフェラーゼ活性による生物発光量を測定した。その後、Stop & Glo(登録商標)Reagent 50μLをさらに加え、同様にウミウシルシフェラーゼ活性を同様に測定した。
ホタル由来ルシフェラーゼの相対活性は、Luc−shRNA未処理のものと比較して以下のような式を用いて算出した。
ホタル由来ルシフェラーゼ相対活性(%)=(ホタルルシフェラーゼ活性/ウミウシルシフェラーゼ活性)/(Luc−shRNA未処理群のホタルルシフェラーゼ活性/Luc−shRNA未処理群のウミウシルシフェラーゼ活性)x 100
結果を図10に示す。
図10に示すようにDOPC、POPCのどちらを含む場合においても、Luc−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスに比べLuc−shRNAを外膜表面に結合するプレプレックスの形態の方がルシフェラーゼの発現をより抑制した。またプレプレックス投与群において、POPCよりもDOPCを含むプレプレックスの方が発現抑制効率が若干高かった。
[実施例11]
TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスおよびプレプレックスの胸腔内投与による悪性胸膜中皮腫同所移植モデルにおける腫瘍増殖抑制効果
悪性胸膜中皮腫同所移植モデルの確立
MSTO−211H−Luc細胞を用いた悪性胸膜中皮腫同所移植モデルは前述の実施例4に示した方法を用いて作製し、移植4日日のマウスをin vivo実験に供した。
TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスおよびプレプレックスの調製
上述の実施例10で示す方法に従い、脂質組成がDOPE:DOPC:DC−6−14=3:2:5からなるカチオニックリポソームおよびカチオニックプレソームを調製した。また実施例1に記すTSに対するshRNAと混合し、リポプレックス(TS−リポプレックス)およびプレプレックス(TS−プレプレックス)を調製した。なおリポソームまたはプレソームとshRNAとのモル比は2000:1とした。調製したTS−リポソーム、TS−プレプレックスの平均粒子径はそれぞれ約210±100、630±400(平均±標準偏差)nmであった。
TS−shRNAを外膜表面に結合するリポプレックスおよびプレプレックスの腫瘍増殖抑制効果の評価
腫瘍移植後、4、7、10、13、16日目において、TS−リポプレックス又はTS−プレプレックスをshRNA量で20μg(50μL)を胸腔内に直接投与した。
既存の化学療法剤「アリムタ(ペメトレキセドナトリウム水和物(PMX))」(イーライリリー)を併用する場合には、25mg/kgの用量で、腫瘍移植後4日目から8日目まで毎日、その後2日あけて同量を11日目から15日目まで毎日、合計10回腹腔内投与を行なった。
TS−リポプレックスまたはTS−プレプレックスの最終投与の2日後(腫瘍移植後18日日)、isofluraneを用いた麻酔下、D−luciferin potassium salt溶液100μL(7.5mg/ml)を腹腔内に投与し、胸腔内で増殖したMSTO−211H−Luc細胞におけるルシフェラーゼ活性に依存した生物発光の強さをIVIS(Xenogen,Alameda,CA,USA)で評価した。
実施結果を図11に示す。
未処置の対照群と比較して、PMX単独を用いて処置した群ではあまり腫瘍増殖抑制効果が見られなかった。一方、TS−リポプレックス又はTS−プレプレックス単独を用いた群においては、対照群およびPMX単独投与群に比べ、明らかに高い腫瘍抑制効果が見られた。さらに、TS−リポプレックス又はTS−プレプレックスとPMXを併用した群において最も高い腫瘍抑制効果が観察されたが、リポプレックスとプレプレックスで効果に大きな違いは確認されなかった。
図12は上述のIVISによる評価を行なった時点でのマウス体重を測定したものであるが、すべての群において統計学的な差は得られず、このことは今回用いた投与法に重篤な毒性が見られないことが示唆された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
Claims (16)
- ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質からなり、該ホスファチジルコリンが以下の(i)−(iii)より選択される一以上の特徴を有する、局所投与用リポソーム:
(i)炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む;
(ii)シス型の炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む;
(iii)相転移温度が0℃未満。 - カチオン性脂質が0,0’−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)ジエタノールアミンクロリド(DC−6−14)である、請求項1に記載のリポソーム。
- ホスファチジルコリンが1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DOPC)、パルミトイルオエオイルホスファチジルコリン(POPC)、又は1,2−ジエイコセノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DEPC)である、請求項1に記載のリポソーム。
- ホスファチジルコリンがDOPCである、請求項1に記載のリポソーム。
- DOPE、DOPC及びDC−6−14からなる、請求項1に記載のリポソーム。
- DOPE、DOPC及びDC−6−14が、3:2:5のモル比で含まれる、請求項5に記載のリポソーム。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のリポソームと活性化合物を含む組成物。
- 活性化合物が核酸である、請求項7に記載の組成物。
- 核酸がリポソームの外膜表面に結合している、請求項8に記載の組成物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のリポソームとRNAi作用によりチミジル酸合成酵素の発現を抑制することができるショートヘアピンRNA(shRNA)とを含む、抗腫瘍剤。
- shRNAがリポソームの外膜表面に結合されている、請求項10に記載の抗腫瘍剤。
- shRNAが配列番号8で表される塩基配列からなる、請求項10に記載の抗腫瘍剤。
- 癌化学療法又は癌化学療法剤と併用される、請求項10に記載の抗腫瘍剤。
- 請求項10〜13のいずれか1項に記載の抗腫瘍剤と癌化学療法剤とを含む、組み合わせ物。
- 癌化学療法剤が、TS阻害作用を有する抗腫瘍剤である、請求項14に記載の組み合わせ物。
- TS阻害作用を有する抗腫瘍剤が、5−FU系抗腫瘍剤又はペメトレキセドナトリウム水和物である、請求項15に記載の組み合わせ物。
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