WO2014178152A1 - 局所投与用リポソームおよびその用途 - Google Patents

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竜弘 石田
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to a liposome for topical administration and an antitumor agent utilizing the liposome.
  • Liposomes are composed of phospholipids that make up the cell membranes of living organisms, have high biocompatibility, and can be transported in vivo while protecting drugs and active ingredients from degrading enzymes. It is attracting attention as.
  • PEG polyethylene glycol
  • Liposomes containing cholesterol that increase the transition temperature have been developed and are widely used.
  • RNAi molecules that cause RNA interference hereinafter referred to as “RNAi”) are attracting attention as useful tools for treating tumors and the like, and various RNAi molecules that can suppress tumor growth. has been developed.
  • Non-Patent Documents 1-3 a method of delivering an RNAi molecule as an active ingredient to a tumor cell using a complex (lipoplex) composed of an RNAi molecule and a liposome has been developed (Non-Patent Documents 1-3).
  • the present inventors have so far developed an RNAi molecule that targets a thymidylate synthase (hereinafter referred to as “TS”) involved in DNA synthesis (Patent Document 1).
  • TS thymidylate synthase
  • RNAi molecules can be remarkably improved by increasing the directivity to tumor (Patent Document 2).
  • Patent Document 2 there remains a need in the art for a means that can more efficiently introduce RNAi molecules that can inhibit tumor growth into tumor cells.
  • An object of the present invention is to provide a new delivery means capable of efficiently delivering an active ingredient to a target cell. More specifically, the present invention aims to provide a new liposome capable of efficiently delivering RNAi molecules capable of suppressing tumor growth to tumor cells.
  • the present inventors have made a liposome comprising dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), phosphatidylcholine and a cationic lipid, not modified with PEG, and containing no cholesterol. It has been found that the active ingredient can be efficiently delivered to the target cell by carrying the active ingredient on the target cell and locally administering it at or near the site containing the target cell, thereby completing the present invention.
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • Liposomes for topical administration comprising dioleyl phosphatidylethanolamine (DOPE), phosphatidylcholine and a cationic lipid, wherein the phosphatidylcholine has one or more characteristics selected from the following (i)-(iii): (I) containing at least one unsaturated fatty chain containing a carbon-carbon double bond; (Ii) at least one unsaturated fatty chain containing a cis-type carbon-carbon double bond; (Iii) The phase transition temperature is less than 0 ° C.
  • DOPE dioleyl phosphatidylethanolamine
  • phosphatidylcholine has one or more characteristics selected from the following (i)-(iii): (I) containing at least one unsaturated fatty chain containing a carbon-carbon double bond; (Ii) at least one unsaturated fatty chain containing a cis-type carbon-carbon double bond; (Iii)
  • the phase transition temperature is less than
  • the phosphatidylcholine is 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), palmitoyl oil phosphatidylcholine (POPC), or 1,2-diecocenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DEPC).
  • DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • POPC palmitoyl oil phosphatidylcholine
  • DEPC 1,2-diecocenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • a composition comprising the liposome according to any one of [1] to [6] and an active compound.
  • the composition according to [8], wherein the nucleic acid is bound to the outer membrane surface of the liposome.
  • an antitumor agent comprising the liposome according to any one of [1] to [6] and a short hairpin RNA (shRNA) capable of suppressing the expression of thymidylate synthase by RNAi action.
  • shRNA short hairpin RNA
  • the antitumor agent according to [10] wherein shRNA is bound to the outer membrane surface of the liposome.
  • shRNA consists of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the antitumor agent according to [10] which is used in combination with cancer chemotherapy or a cancer chemotherapeutic agent.
  • a combination comprising the antitumor agent according to any one of [10] to [13] and a cancer chemotherapeutic agent.
  • the cancer chemotherapeutic agent is an antitumor agent having a TS inhibitory action.
  • the antitumor agent having a TS inhibitory action is a 5-FU antitumor agent or pemetrexed sodium hydrate.
  • RNAi molecule capable of suppressing tumor growth by local administration.
  • This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2013-095950, which is the basis of the priority of the present application.
  • FIG. 1 shows the tumor growth inhibitory effect of a cancer chemotherapeutic agent, TS-shRNA, NS-shRNA, and a combination of these shRNAs and a cancer chemotherapeutic agent on human malignant pleural mesothelioma cells.
  • A shows the results of shRNA with a final concentration of 5 nM.
  • B shows the results for shRNA with a final concentration of 10 nM.
  • FIG. 2 shows the TS expression inhibitory effect in human malignant pleural mesothelioma cells by TS-shRNA and NS-shRNA.
  • A shows the results of Western blotting.
  • FIG. 4 is a photographic diagram showing the results of tumor growth in malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model mice. The number of days in each photograph indicates the number of days after transplantation of malignant pleural mesothelioma cells.
  • FIG. 4 is a photographic diagram showing the results of tumor growth in malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model mice. The number of days in each photograph indicates the number of days after transplantation of malignant pleural mesothelioma cells.
  • 5-1 is a photograph showing comparative results of Luc-shRNA introduction effects by various cationic liposomes against tumor cells in malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model mice.
  • A Control: 9% sucrose results are shown.
  • B DEPC: shows the results of liposomes containing DEPC.
  • C DMPC: The results of liposomes containing DMPC are shown.
  • D DOPC: The result of the liposome containing DOPC is shown.
  • E POPC: shows the results of liposomes containing POPC.
  • FIG. 5-1 is a photographic diagram showing the comparison results of Luc-shRNA introduction effects of cationic liposomes having different contents of DC-6-14 on tumor cells in malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model mice. From the top, the photograph shows, in molar ratio, (A) liposome containing 20% DC-6-14, (B) liposome containing 35% DC-6-14, and (C) 50% DC-6-6. The results for liposomes containing 14 are shown.
  • FIG. 1 is a photographic diagram showing the comparison results of Luc-shRNA introduction effects of cationic liposomes having different contents of DC-6-14 on tumor cells in malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model mice. From the top, the photograph shows, in molar ratio, (A) liposome containing 20% DC-6-14, (B) liposome containing 35% DC-6-14, and (C) 50% DC-6-6. The results for liposomes containing 14 are shown.
  • FIG. 7-1 is a photographic diagram showing the comparison results of Luc-shRNA introduction effects of various cation-modified and non-PEG-modified cationic liposomes on tumor cells in malignant pleural mesothelioma orthograft model mice. It is.
  • PEG modified POPC shows the results of PEG modified liposomes containing POPC.
  • FIG. 7-2 shows quantification results of Luc-shRNA introduction effects of various cationic liposomes on tumor cells in malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model mice based on the results of FIG. 7-1. **: p ⁇ 0.01.
  • TS-shRNA shows the result of treating TS-shRNA only with lipoplex that binds to the outer membrane surface.
  • PMX shows the result of treatment only with a cancer chemotherapeutic agent.
  • PMX + NS-shRNA shows the result of treatment with a combination of a cancer chemotherapeutic agent and a lipoplex that binds NS-shRNA to the outer membrane surface.
  • PMX + TS-shRNA shows the result of treatment with a combination of a cancer chemotherapeutic agent and a lipoplex that binds TS-shRNA to the outer membrane surface.
  • FIG. 8-2 shows the quantification results of the tumor growth inhibitory effect by various treatments on tumor cells in malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model mice based on the results of FIG. 8-1. *: P ⁇ 0.05, ***: p ⁇ 0.01.
  • FIG. 8-3 shows only control (9% sucrose), cancer chemotherapeutic agent (PMX), only lipoplex that binds NS-shRNA to the outer membrane surface, only lipoplex that binds TS-shRNA to the outer membrane surface, Or the survival rate (%) of the malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model mouse
  • FIG. 8-4 shows the control (9% sucrose), only the lipoplex that binds TS-shRNA to the outer membrane surface, only the lipoplex that binds NS-shRNA to the outer membrane surface, only the cancer chemotherapeutic agent (PMX), 3 shows the mean survival time (MST) and survival rate increase (ILS) of malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model mice treated with a combination of lipoplex and cancer chemotherapeutic agent (PMX).
  • MST mean survival time
  • ILS survival rate increase
  • FIG. 10 shows a comparison result of Luc-shRNA introduction effect by various cationic liposomes and cationic presomes by Dual-luciferase assay.
  • FIG. 11 shows a lipoplex that binds TS-shRNA to the outer membrane surface, a preplex that binds TS-shRNA to the outer membrane surface, and a cancer chemotherapeutic agent against tumor cells in a malignant pleural mesothelioma orthotopic transplant model mouse (FIG. It is a photograph figure which shows the comparison result of the tumor growth inhibitory effect by the combined use of PMX) and a lipoplex or a preplex, and a cancer chemotherapeutic agent (PMX).
  • A Control: 9% sucrose results are shown.
  • PMX shows the result of treatment only with a cancer chemotherapeutic agent.
  • C TS preplex: shows the result of treating TS-shRNA only with a preplex that binds to the outer membrane surface.
  • D PMX + TS preplex: shows the result of treatment with a combination of a cancer chemotherapeutic agent and NS-shRNA binding to the outer membrane surface.
  • E TS lipoplex: shows the result of treating TS-shRNA only with lipoplex that binds to the outer membrane surface.
  • F PMX + TS lipoplex: shows the results of treatment with a combination of a cancer chemotherapeutic agent and a lipoplex that binds NS-shRNA to the outer membrane surface.
  • FIG. 12 shows the measurement results of the body weights of malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation mice treated with a cancer chemotherapeutic agent and / or a lipoplex or preplex that binds TS-shRNA to the outer membrane surface.
  • Liposome is a spherical hollow body composed of a lipid bilayer composed of dioleyl phosphatidylethanolamine (DOPE), phosphatidylcholine and a cationic lipid.
  • DOPE dioleyl phosphatidylethanolamine
  • the “phosphatidylcholine” that can be used in the present invention has one or more characteristics selected from the following (i) to (iii): (I) containing at least one unsaturated fatty chain containing a carbon-carbon double bond; (Ii) at least one unsaturated fatty chain containing a cis-type carbon-carbon double bond; (Iii) Low phase transition temperature (for example, less than 0 ° C, less than -10 ° C, less than -20 ° C).
  • phosphatidylcholine examples include 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), palmitoyl oilyphosphatidylcholine (POPC), 1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DEPC). Is mentioned. DOPC is preferable.
  • Examples of the “cationic lipid” that can be used in the present invention include 0,0′-ditetradecanoyl-N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) diethanolamine chloride (DC-6-14), N, N-dioleyl- N, N-dimethylammonium chloride (DODAC), N, N-distearyl-N, N-dimethylammonium bromide (DDAB), N- (1- (2,3-dioleoyloxy) propyl) -N, N , N-trimethylammonium chloride (DOTAP), N- (1- (2,3-dioleyloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA), N, N-dimethyl- (2,3 -Using any one selected from dioleyloxy) propylamine (DODMA) and derivatives thereof It is possible.
  • DC-6-14 N, N-dioleyl- N, N-dimethylammonium chloride
  • the cationic lipid is DC-6-14.
  • the liposome in the present invention consists of DOPE, DOPC and DC-6-14.
  • it is DOPE: DOPC: DC-6-14 3: 2: 5.
  • the liposome of the present invention can be prepared based on a known method, for example, a thin film shaking method (Bangham method) (AD Bangham et al., J. Mol. Biol., 13, 238-252 (1965).
  • phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and cationic lipid are each dissolved in an organic solvent such as chloroform, and each is taken and mixed in a container such as a flask so as to have the predetermined amount. Subsequently, after volatilizing the organic solvent to form a lipid film at the bottom of the container, an aqueous solution such as a buffer solution is added thereto and stirred to obtain a suspension containing liposomes.
  • liposomes are sometimes referred to as “cationic liposomes”, but these terms are used interchangeably.
  • phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and cationic lipid are dissolved in an organic solvent such as chloroform, respectively, and each is separated so as to have the above-mentioned predetermined amount.
  • an organic solvent such as chloroform
  • 30 times by weight preferably 5 to 15 times by weight, more preferably 10 times by weight cyclohexane and cyclohexane 1 to 10% by weight, preferably 1 to 5% by weight, more preferably 2% by weight alcohol (preferably ethanol)
  • alcohol preferably ethanol
  • the liposome of the present invention has a particle size of 80 nm to 200 nm, preferably about 100 nm.
  • the zeta potential of the liposome of the present invention is 40 to 60 mV, preferably about 50 mV.
  • the particle size is 100 nm to 600 nm, preferably about 100 nm to 200 nm.
  • the liposome of the present invention can be used as a carrier for locally administering an active ingredient.
  • “local administration” is intended to administer the active ingredient directly to the affected area / lesion and / or the vicinity thereof and to cause the active ingredient to act on the affected area / lesion. Therefore, “local administration” in the present invention is not intended to cause the active ingredient to act systemically using intravenous injection or the like.
  • topical administration for example, intramuscular, intraperitoneal, intrathoracic, subcutaneous, intradermal, intraocular, intracerebral, intracerebral spinal cavity, intravaginal, intrarectal, intraorgan, intratumoral injection, into the epidermis Although application etc. are mentioned, it is not limited to these.
  • “Local administration” is preferably intracavitary administration, more preferably intrathoracic administration or intraperitoneal administration.
  • the “active ingredient” means an active ingredient of pharmaceuticals or cosmetics, and examples thereof include DNA, RNA, DNA / RNA hybrid, protein, peptide, compound and the like. 2.
  • Composition The composition of the present invention contains the liposome of the present invention and an active ingredient, and can be used for local administration of the active ingredient. Examples of the active ingredient include those described above, and are not particularly limited. For example, siRNA or shRNA capable of suppressing the expression of a gene that is expressed in tumor cells and encodes a factor involved in the growth of tumor cells by RNAi action. Etc.
  • Examples of “genes encoding factors that are expressed in tumor cells and are involved in the growth of tumor cells” include, for example, growth regulatory factor groups such as thymidylate synthase, VEGF, EGFR, PDGF, HGF, Wint, Bcl-2, and survivin And genes encoding nucleic acid synthesis-related enzymes such as ribonucleotide reductase and DNA polymerase, but are not limited thereto.
  • the gene information of these genes is disclosed in known databases such as GenBank, and siRNA or shRNA can be designed and synthesized based on these gene information.
  • shRNA capable of suppressing the expression of thymidylate synthase by RNAi action those described in detail below can be used.
  • an anticancer agent and a cancer chemotherapeutic agent can also be used as an active ingredient.
  • the active ingredient may be contained in the hollow portion surrounded by the lipid bilayer membrane of the liposome, or may be bound to the outer membrane surface of the lipid bilayer membrane.
  • the active ingredient is bound to the outer membrane surface of the lipid bilayer of the liposome.
  • the composition of the present invention also comprises an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, a diluent, a solubilizer, a suspension, which are commonly used in the manufacture of pharmaceuticals or cosmetics, together with liposomes and active ingredients.
  • tonicity agents pH adjusters, buffers, stabilizers, colorants, flavoring agents, flavoring agents, histidine, and the like.
  • excipient include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, maltose, mannitol, erythritol, xylitol, maltitol, inositol, dextran, sorbitol, albumin, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silica
  • acids include acid, methylcellulose, glycerin, sodium alginate, gum arabic, and mixtures thereof.
  • Examples of the lubricant include purified talc, stearate, borax, polyethylene glycol, and a mixture thereof.
  • Examples of the binder include simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, polyvinyl pyrrolidone, carboxymethyl cellulose, shellac, methyl cellulose, ethyl cellulose, water, ethanol, potassium phosphate, and a mixture thereof. Can be mentioned.
  • disintegrant examples include dry starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, starch, lactose and mixtures thereof. Is mentioned.
  • diluent examples include water, ethyl alcohol, macrogol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and mixtures thereof.
  • Examples of the stabilizer include sodium pyrosulfite, ethylenediaminetetraacetic acid, thioglycolic acid, thiolactic acid, and a mixture thereof.
  • Examples of the isotonic agent include sodium chloride, boric acid, glucose, glycerin and a mixture thereof.
  • Examples of the pH adjuster and buffer include sodium citrate, citric acid, sodium acetate, sodium phosphate, and mixtures thereof.
  • the composition of the present invention can be made into a dosage form suitable for topical administration, and can be prepared in various pharmaceutical forms such as an injection, suspension, emulsifier, ointment, cream tablet and the like. 3.
  • the antitumor agent of the present invention contains shRNA capable of suppressing the expression of thymidylate synthase (hereinafter referred to as “TS”) by RNAi action as the liposome of the present invention and the active ingredient.
  • the shRNA capable of suppressing the expression of TS in the present invention can exhibit an RNAi action in a TS-specific manner and can remarkably suppress the expression of TS by targeting the mRNA of TS.
  • targeting mRNA means that the antisense strand of shRNA described in detail below can hybridize with the target mRNA under stringent conditions.
  • the stringent condition can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid that forms a hybrid according to a conventional method.
  • the shRNA in the present invention includes a sense strand having the same base sequence as the ORF base sequence encoding TS or a part thereof, and an antisense strand that hybridizes with the sense strand under stringent conditions.
  • the “base sequence identical to the ORF base sequence or a part thereof” means a base sequence identical to the base sequence represented by substituting uracil for thymine in the base sequence of the ORF or a part thereof.
  • the sense strand consists of 15 to 25 bases, preferably 19 bases.
  • the base sequence of the sense strand is preferably the same as the base sequence of the ORF encoding TS, but it may be substantially the same, that is, a homologous sequence. That is, the base sequence of the sense strand is one or more in the ORF base sequence, that is, 1 to 3 bases, preferably 1 to 2 bases, more preferably 1 base substitution, deletion, insertion and / or addition. There may be.
  • the antisense strand has a base sequence that can hybridize with the sense strand under stringent conditions.
  • the antisense strand has a mismatch including substitution, deletion, insertion and / or addition of 1 to 3 bases, preferably 1 to 2 bases, more preferably 1 base as long as it can hybridize under stringent conditions. It may be a thing.
  • the antisense strand consists of a base sequence that is completely complementary to the sense strand.
  • the base sequence of the sense strand and the antisense can be selected based on a known base sequence (GenBank: CR601528.1) encoding TS. Various methods are known as a method for selecting these base sequences. For example, siRNA Design Support System (Takara Bio Inc.) can be used.
  • examples of the sense strand include, but are not limited to, those consisting of the following base sequences: 5'-GUAACACCCAUCGAUCAUGA-3 '(SEQ ID NO: 1); 5'-GAAUACAGAGAUAUUGGAAU-3' (SEQ ID NO: 3); '-CGAUCAUGAUGUAGAGGUGU-3' (SEQ ID NO: 5); 5'-GGGUGUUUGUGAGGAGUUGTT-3 '(SEQ ID NO: 9).
  • the shRNA of the present invention comprises sense strand 5′-GUAACACCCAUCGAUCAUGA-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and antisense strand 5′-UCAUGAUCGAUGGUGUAC-3 ′ (SEQ ID NO: 2); sense strand 5′-GAAUACAGAGAUAUGAGAAU-3 ′ (sequence No.
  • the shRNA in the present invention comprises a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an antisense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the sense strand and the antisense strand are connected via a linker portion, the linker portion is folded by forming a loop, and the antisense strand and the sense strand are hybridized to form a double-stranded portion.
  • the linker part contained in the shRNA molecule may be a polynucleotide linker or a non-polynucleotide linker as long as it can link the sense strand and the antisense strand to form a stem loop structure, and is not particularly limited.
  • polynucleotide linkers of 2 to 22 bases known to those skilled in the art are preferred. Specifically, UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7), UUCAAGGAGA, CCACC, CUCGAG, CCACACC, UUCAGAGAGA, AUG, CCC and UUCG can be exemplified, and UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7) is preferable.
  • the shRNA in the present invention has an overhang consisting of at least 2 bases at the 3 ′ end.
  • the term “overhang” refers to a base added to the 3 ′ end of the antisense strand that does not have a base that can complementarily bind to the corresponding position of the sense strand.
  • the degree of suppression of TS expression by shRNA is approximately in the transfection using the liposome of the present invention, compared with the case where there is an overhang. It decreases by 40 to 60%.
  • the type and number of bases of the overhang are not limited, and examples include sequences consisting of 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2 bases, such as TTT, UU, and TT. . Preferably, it is UU.
  • a preferred shRNA is a single-stranded RNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the sense strand or the antisense strand may be phosphorylated at the 5 ′ end as necessary, and triphosphate (ppp) may be bound to the 5 ′ end.
  • the shRNA is bound to the outer membrane surface of the lipid bilayer of the liposome of the present invention by a covalent bond or a non-covalent bond.
  • the particle size of the liposomes with the resulting shRNA can be adjusted to a size of several hundred nm (Barrichello, JM, et al., Int. J.
  • the shRNA can be uniformly dispersed and bound on the liposome, and the heterogeneous incorporation of the liposome by the tissue caused by the heterogeneous binding of shRNA can be prevented.
  • the liposome is a presome
  • the shRNA is bound to the outer membrane surface of the lipid bilayer of the presome by adding shRNA to the suspension containing the presome and mixing (for example, vortex operation). be able to.
  • the liposome provided with shRNA has a particle size of 200 to 600 nm, preferably about 300 to 400 nm.
  • the presome provided with shRNA has a particle size of 200 nm to 2 ⁇ m, preferably about 300 nm to 1 ⁇ m.
  • the liposome provided with shRNA has a zeta potential of 0 to 50 mV, preferably about 25 to 35 mV.
  • the liposome provided with the shRNA in the present invention suppresses the expression of a gene encoding a factor that is expressed in tumor cells and is involved in the growth of the tumor cells by RNAi action.
  • ShRNA capable of suppressing the expression of TS and other siRNA or shRNA may be bound to the same liposome, or may be bound to separate liposomes.
  • a liposome provided with shRNA may be referred to as “lipoplex”.
  • a presome provided with shRNA may be referred to as a “preplex”.
  • liposomes provided with the above-mentioned shRNA by local administration can suppress the growth of tumor cells and can be used to treat cancer.
  • cancers that can be treated using the antitumor agent of the present invention include cancers that highly express TS, and are not particularly limited. Examples thereof include colon and rectal cancers, liver cancers, kidney cancers, head and neck cancers.
  • Cancer esophageal cancer, stomach cancer, biliary tract cancer, gallbladder / bile duct cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, bladder cancer, prostate cancer, malignant pleural mesothelioma, testicular tumor, ovary
  • Examples include cancer, bone / soft tissue sarcoma, skin cancer, brain tumor and the like. Cancerous pleurisy and cancerous peritonitis can also be treated with the antitumor agent.
  • Treatment candidates are preferably gastric cancer, lung cancer, biliary tract cancer, liver cancer, malignant pleural mesothelioma, ovarian cancer, cancerous pleurisy or peritonitis, particularly preferably malignant pleural mesothelioma, non-small cell lung cancer without distant metastasis Cancerous pleurisy, peritoneal dissemination metastasis of gastric cancer, peritoneal dissemination metastasis of ovarian cancer, and cancerous peritonitis.
  • the antitumor agent of the present invention is usually used in the manufacture of medicines, excipients, binders, disintegrants, lubricants, diluents, solubilizers, suspensions. Agents, tonicity agents, pH adjusters, buffers, stabilizers, colorants, flavoring agents, flavoring agents, histidine, and the like. As the excipient, lubricant, binder, disintegrant, diluent, stabilizer, tonicity agent, and pH adjuster, those defined above can be used.
  • the antitumor agent of the present invention can be administered by local administration. Topical administration includes those defined above.
  • composition of the present invention can be made into a dosage form suitable for topical administration, and can be prepared in various preparation forms such as injections, suspensions, emulsifiers and sprays.
  • the effect of the antitumor agent of the present invention is that the antitumor agent is administered to cells and tissues derived from the cancer and the individual suffering from the cancer, and the tumor size is not administered to the antitumor agent ( Alternatively, it can be evaluated by using as an index that the tumor is shrinking or disappearing as compared with the size of the tumor in the cells and tissues and the individual before administration.
  • the effect of the antitumor agent of the present invention is that the antitumor agent is administered to cells and tissues derived from the cancer, and the individual suffering from the cancer, and compared to an individual who is not administered the antitumor agent.
  • the antitumor agent of the present invention can be used together with an existing cancer chemotherapy or cancer chemotherapeutic agent.
  • the cancer chemotherapy or cancer chemotherapeutic agent that can be used in combination with the antitumor agent of the present invention may be any one that can modify the tumor environment so that the liposome of the present invention can easily enter the tumor tissue.
  • Chemotherapy includes chemotherapy using “antitumor agents having TS inhibitory activity” described below, and existing cancer chemotherapeutic agents include antitumor agents having TS inhibitory activity.
  • the “antitumor agent having a TS inhibitory action” is not particularly limited as long as it can inhibit the function of TS.
  • 5-FU antitumor agent pemetrexed sodium hydrate, raltitrexed (Tomudex), methotrexate (MTX)
  • MTX methotrexate
  • cancer patients whose TS expression is relatively low are markedly effective by 5-FU antitumor agents, while many cancer patients whose TS expression is relatively enhanced among cancer patients are Resistant to 5-FU antitumor agents.
  • a similar relationship is observed between pemetrexed sodium hydrate and the expression level of TS.
  • the antitumor agent of the present invention is selectively accumulated in a tumor when used in combination with an antitumor agent having a TS inhibitory action, and can efficiently deliver shRNA to tumor cells.
  • the antitumor agent of the present invention is compared with the case of using the antitumor agent having a TS inhibitory action or the antitumor agent of the present invention alone, A remarkably high antitumor effect can be obtained.
  • the “5-FU antitumor agent” include 5-FU and 5-FU derivatives whose active metabolite is 5-FU.
  • 5-FU derivatives include those containing tegafur.
  • the 5-FU derivative is preferably a tegafur-containing compounding agent, specifically, a tegafur-uracil compounding agent (for example, UFT (registered trademark) (Takuma Pharmaceutical Co., Ltd.)), tegafur gimeracil oteracil A potassium compounding agent etc. can be illustrated.
  • a tegafur, gimeracil, and oteracil potassium compounding agent for example, TS-1 (registered trademark) (Takuma Pharmaceutical Co., Ltd.) is particularly preferable.
  • TS-1 registered trademark
  • As a pemetrexed sodium hydrate Alimta (trademark) (Eli Lilly Japan) is mentioned.
  • Pemetrexed sodium hydrate can also be used in combination with the antitumor agent of the present invention in the same manner as the 5-FU antitumor agent, when the pemetrexed sodium hydrate or the antitumor agent of the present invention is used alone. In comparison, a significantly higher antitumor effect can be obtained.
  • the antitumor agent of the present invention can be used together with other existing cancer chemotherapeutic agents in addition to or in place of the antitumor agent having a TS inhibitory action.
  • cancer chemotherapeutic agents include cyclophosphamide, nitrogen mustard N-oxide, ifosfamide, melphalan, busulfan, mitobronitol, carbocon, thiotepa, ranimustine, nimustine, temozolomide, carmustine, pemetrex dosodymium, methotrexate, 6-mercaptopurine riboside, mercaptopurine, doxyfluridine, carmofur, cytarabine, cytarabine ocphosphate, enositabine, gemcitabine, fludarabine, pemetrexed, cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, paclitaxel, docetaxel, etc.
  • One or more selected cancer chemotherapeutic agents can be used. These cancer chemotherapeutic agents can also deliver shRNA efficiently to tumor cells in combination with the antitumor agent of the present invention in the same manner as the antitumor agent having the TS inhibitory action. Compared with the case where the therapeutic agent or the antitumor agent of the present invention is used alone, a significantly higher antitumor effect can be obtained. As long as the antitumor agent of the present invention and the existing cancer chemotherapeutic agent are administered in combination, they can be provided as a combination.
  • the antitumor agent of the present invention can be in the form of a “combination” together with the above existing cancer chemotherapeutic agents.
  • the “combination” may be a combination drug containing the antitumor agent of the present invention and the above existing cancer chemotherapeutic agent as active ingredients, and the antitumor agent of the present invention and the above existing cancer chemotherapeutic agent. May be manufactured, packaged and distributed as a single package (kit formulation) suitable for combined administration.
  • “Combination administration” includes not only the administration of the antitumor agent of the present invention and the above-mentioned existing cancer chemotherapeutic agent simultaneously, but also the antitumor agent of the present invention and the above-mentioned existing cancer chemotherapeutic agent at intervals. The case of administration is also included.
  • the administration route and administration means of the antitumor agent of the present invention and the existing cancer chemotherapeutic agent may be the same or different.
  • the dose and frequency of administration of the antitumor agent of the present invention may vary depending on factors such as the patient's age, weight, disease severity, etc., but the amount of shRNA is 0.0001 mg to 100 mg per kg body weight at a time. An amount appropriately selected from these ranges can be administered 1 to 3 times a day, every day, or every 1 to 21 days.
  • the dose of the above existing cancer chemotherapeutic agent may vary depending on factors such as the type of chemical substance that is an active ingredient, the age, weight of the patient, severity of the disease, etc., but 0.0001 mg per kg of body weight per time
  • An amount appropriately selected from the range of ⁇ 1000 mg can be administered 1 to 3 times a day, every day, or every 1 to 14 days.
  • the existing cancer chemotherapeutic agent is a 5-FU antitumor agent
  • 60 to 160 mg of tegafur can be administered daily or every 1 to 7 days.
  • the existing cancer chemotherapeutic agent is pemetrexed sodium hydrate, 500 to 1000 mg can be administered daily or every 1 to 7 days.
  • the existing cancer chemotherapeutic agent can be administered at a lower dose and more frequently than when used alone.
  • side effects that can be caused by administration of the above existing cancer chemotherapeutic agents for example, myelosuppression, hemolytic anemia, disseminated intravascular coagulation syndrome, fulminant hepatitis, dehydration, enteritis, interstitial pneumonia, stomatitis, Gastrointestinal ulcer, gastrointestinal hemorrhage, gastrointestinal perforation, acute renal failure, mucocutaneous ocular syndrome, toxic epidermal necrosis, neuropsychiatric disorder, acute pancreatitis, rhabdomyolysis, loss of olfactory, etc.) Can be suppressed or delayed. 4).
  • the present invention also relates to a method for treating cancer using the antitumor agent of the present invention.
  • Cancers that can be treated by the method include cancers as defined above.
  • the usage and dosage of the antitumor agent of the present invention and the existing cancer chemotherapeutic agent are as described above.
  • TS-shRNA In Vitro Inhibition of Cell Growth by Combined Use of shRNA Targeting TS and Alimta (ShRNA targeting TS)
  • ShRNA that targets TS (hereinafter referred to as “TS-shRNA”) is a known shRNA that can suppress the expression of TS and has already been confirmed to have an antitumor effect (see WO2012 / 161196). Based on the above, one having the following sequence was synthesized.
  • TS-shRNA On the other hand, shRNA having the following sequence without target mRNA was used as a control.
  • the control shRNA is referred to as “NS-shRNA”.
  • NS-shRNA (MTT assay)
  • MTT assay MTT assay
  • RNAi MAX Lipofectamine (registered trademark) RNAi MAX (Lf RNAi MAX)
  • OptiMEM OptiMEM
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium Add 50 ⁇ L of bromide) solution for 4 hours at 37 ° C., 5% CO 2 Incubated under conditions. In addition, 0.5% MTT solution was added to wells without cells to make a background. After the incubation, 150 ⁇ L of acidic isopropanol was added to each well, the formazan crystals were dissolved using a shaker, the absorbance was measured at a wavelength of 570 nm using a plate reader, and the cell growth rate was calculated using the following formula: did.
  • TS-shRNA significantly inhibited the proliferation of MSTO-211H cells in a time-dependent manner in the presence of PMX.
  • TS expression suppression by TS-shRNA (Transfection) Transfection was performed using Lipofectamine (registered trademark) RNAi MAX (Lf RNAi MAX), which is a kind of cationic liposome, according to the manufacturer's instructions.
  • the lipoplex prepared in Example 1 was also used in this example.
  • sample for SDS-PAGE The cell extract and 2 ⁇ sample buffer were mixed in equal amounts and heated for 3 minutes using a microplate hotplate set at 95 ° C. Thereafter, the sample was centrifuged for 30 seconds and cooled at room temperature to obtain a sample for SDS-PAGE.
  • each primary antibody diluted in Tween buffer (Mouse monoclonal anti-human TS antibody (1: 1000) (ANASPEC, Inc. CA, USA), Mouse monoclonal anti-human ⁇ - Actin antibody (1: 500) (Abcam, Tokyo, Japan) was reacted overnight at 4 ° C. After washing 3 times with Tween buffer for 5 minutes, a secondary antibody diluted with Tween buffer (HRP-conjugate goat anti-mouse secondary antibody (1: 2000) (ICN Biomedical, CA, USA)) was allowed to react at room temperature for 1 hour. It was.
  • Example 3 Suppression of luciferase expression by Luciferase-shRNA in vitro (Preparation of luciferase-expressing cell line) Transfection of an expression plasmid introduced with a firefly-derived luciferase gene (pGL3-control, Promega) and an expression plasmid introduced with a Renilla luciferase gene (pRL-TK, Promega) is Lipofectamine (registered) which is a kind of cationic liposome. (Trademark) 2000 (Lf 2000) was used according to the manufacturer's instructions.
  • the HT-1080 cell suspension was added to a 12-well cell culture plate at 100,000 cells / well (1 mL), and cultured for 12 hours in advance. After removing the culture supernatant and washing once with PBS, a transfection solution (200 ⁇ L) containing both luciferase expression plasmids was added to each well, and the luciferase expression plasmid was transfected. At this time, the final concentration of each plasmid was adjusted to 1 ⁇ g / 200 ⁇ L. 37 ° C, 5% CO after starting transfection 2 Cultivation was performed under conditions. (Preparation of cationic liposomes) Cationic liposomes were prepared by the following method.
  • Lipids constituting the liposome were selected from the following: DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). , DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DC-6-14 (0,0'-ditetradecanoyl-N- ( ⁇ -trimethyl-ammonioacetyl) diethanolamine chloride) . These lipids were previously dissolved in chloroform to prepare a stock solution.
  • DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • POPC 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DC-6-14 (0,0'-ditetradecanoy
  • chloroform was removed under reduced pressure using a rotary evaporator (IWAKI, Tokyo). Thereafter, in order to completely remove chloroform, the test tube was put in a vacuum pump overnight, and a lipid thin film was formed in the test tube.
  • lipid thin film To this lipid thin film, 2 mL of 9% sucrose solution (30 mL, pH 7.4) was added as an inner aqueous phase, and the lipid thin film was completely hydrated by vigorous stirring at 37 ° C., thereby obtaining MLV (multicellular vesicle) ( Final lipid concentration is 100 mM). While this solution was heated to 37 ° C., LUV (large unilamellar vesicle) having a particle size of about 100 nm was prepared by an extrusion method using polycarbonate films of 200 nm, 100 nm, and 50 nm (Nucleopore, CA, USA). .
  • MLV multicellular vesicle
  • Luc-shRNA ShRNA targeting luciferase (Luc)
  • ShRNA targeting Luc has the following sequence.
  • Luc-shRNA: (Preparation of lipoplex) The lipoplex was prepared by mixing the cationic liposome and shRNA such that the cationic liposome: shRNA 800,400 or 200: 1 (molar ratio) and stirring vigorously for 10 minutes. Whether the shRNA was completely adsorbed on the cationic liposome was confirmed by electrophoresis on a 2% agarose gel and the absence of free shRNA.
  • each lipoplex was administered to the above luciferase-expressing cell line so that the final concentration of shRNA was 50 nM. 2
  • the culture was performed for 48 hours under the conditions. After completion of the culture, the cell extract was prepared and the luciferase activity was measured using the Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) according to the manufacturer's instructions. That is, after completion of the culture, the medium was removed, washed with cold PBS ( ⁇ ), Passive Lysis Buffer was added at 150 ⁇ L / well, and the cells were lysed by incubation at room temperature for 15 minutes while shaking with a swirling shaker. .
  • the sample was transferred to a sample tube, cooled at ⁇ 80 ° C. for 30 minutes, and then returned to room temperature. Centrifugation was performed (9,000 ⁇ g, 30 seconds, 4 ° C.), and the resulting supernatant was used as a cell extract.
  • 10 ⁇ L of the cell extract was added to a 96-well white microplate into which 50 ⁇ L of Luciferase Assay Reagent II solution was dispensed, and mixed using a pipette.
  • the microplate was set in a luminometer Infinite M200 Pro (Tecan), and chemiluminescence due to firefly luciferase activity was measured for 10 seconds.
  • Renilla luciferase activity value was standardized as an internal control, and the relative firefly luciferase activity relative to a control group not treated with shRNA was determined and evaluated. The results are shown in FIG. In addition, the result of FIG. 3 is shown by the relative value which makes control luciferase activity 100%. As shown in FIG.
  • MSTO-211H cells (MSTO-211H-Luc cells) stably expressing luciferase in the left thoracic cavity of nude mice (5 weeks old, male) under anesthesia of 2,2,2-tribromoethanol (Avertin; Sigma-Aldrich) ) 100 ⁇ L of the suspension was administered and transplanted. 3, 7, 14, and 21 days after cell transplantation, 100 ⁇ l (7.5 mg / ml) of D-luciferin potassium salt (Wako Pure Chemical) solution was intraperitoneally administered under anesthesia using isoflurane and proliferated in the thoracic cavity.
  • Avertin 2,2,2-tribromoethanol
  • the intensity of bioluminescence depending on the activity of the MSTO-211H-Luc cells was evaluated using IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA). The results are shown in FIG. As shown in FIG. 4, a slight amount of bioluminescence accompanying the growth of MSTO-211H-Luc cells was observed on the third day after transplantation, and thereafter bioluminescence was enhanced over time. From this study, it was revealed that the transplanted MSTO-211H-Luc cells were sufficiently proliferated in the thoracic cavity, and a malignant pleural mesothelioma orthotopic transplant model mouse could be established.
  • Cationic liposomes were prepared by the following method. Lipids constituting the liposome were selected from the following: DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine).
  • DMPC 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine
  • DEPC 1,2-dielcoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- Phosphoethanolamine
  • DC-6-14 (0,0'-ditetradecanoyl-N- ( ⁇ -trimethyl-ammonioacetyl) diethanolamine chloride).
  • the liposome particle size (dynamic light scattering method) and zeta potential (electrophoretic light scattering method) were measured by NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, USA).
  • the surface charge of all liposomes was about +50 mV. (ShRNA targeting luciferase (Luc)) Luc-shRNA shown in Example 3 above was used.
  • the average particle size and zeta potential of the prepared lipoplex were about 350 nm and about +15 mV, respectively.
  • MSTO-211H cells (MSTO-211H-Luc cells) stably expressing luciferase in the left thoracic cavity of nude mice (5 weeks old, male) under anesthesia of 2,2,2-tribromoethanol (Avertin; Sigma-Aldrich) ) 100 ⁇ L of the suspension was administered. On day 10, 13, 16, and 19 after cell transplantation, 20 ⁇ g (50 ⁇ L) of lipoplex was directly administered into the thoracic cavity in an amount of shRNA.
  • Avertin 2,2,2-tribromoethanol
  • the liposome particle size and surface charge were measured by NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, USA). It was confirmed that the particle diameters of all prepared LUVs (large unilamellar vesicles) were about 100 nm.
  • the surface charge is about +25 mV for liposomes containing 20% DC-6-14, about +35 mV for liposomes containing 35% DC-6-14, and liposomes containing 50% DC-6-14, respectively. It was confirmed that the voltage was about +50 mV.
  • the lipoplex was prepared by mixing Luc-shRNA shown in Example 3 with liposomes by the method shown in Example 3.
  • the lipoplex particle size (dynamic light scattering method) and zeta potential (electrophoretic light scattering method) were measured by NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, USA).
  • the lipoplex containing 20% DC-6-14 has a particle size of about 350 nm and the surface charge is about +25 mV
  • the lipoplex containing 35% DC-6-14 has a particle size of about 350 nm and the surface charge is about
  • the particle size of the lipoplex containing +30 mV and 50% DC-6-14 was about 350 nm, and the surface charge was about +35 mV.
  • Example 7 Effect of PEG modification on shRNA introduction in vivo (Preparation of PEG-modified cationic liposomes)
  • Liposomes were prepared according to the method shown in Example 3. The following lipids were used: DOPC, POPC, DOPE, DC-6-14 and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000]. (MPEG2000-DSPE).
  • the particle diameter of the liposome was measured by NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, USA).
  • Liposomes containing DOPC had a particle size of about 100 nm and a surface charge of about +50 mV.
  • Liposomes containing POPC had a particle size of about 110 nm and a surface charge of about +50 mV.
  • Liposomes containing PEG-modified DOPC had a particle size of about 106 nm and a surface charge of about +50 mV.
  • Liposomes containing PEG-modified POPC had a particle size of about 100 nm and a surface charge of about +50 mV.
  • the lipoplex was prepared by mixing Luc-shRNA shown in Example 3 with PEG-modified liposomes or PEG-unmodified liposomes by the method shown in Example 3.
  • the lipoplex particle size (dynamic light scattering method) and zeta potential (electrophoretic light scattering method) were measured by NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, USA).
  • the particle size of the lipoplex containing DOPC was about 350 nm, and the surface charge was about +30 mV.
  • the particle size of the lipoplex containing POPC was about 360 nm, and the surface charge was about +30 mV.
  • the particle size of the PEG-modified lipoplex containing DOPC was about 370 nm, and the surface charge was about +30 mV.
  • the particle size of the PEG-modified lipoplex containing POPC was about 370 nm, and the surface charge was about +30 mV.
  • Example 8 Inhibition of tumor growth in malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model mice by intrathoracic administration of lipoplex binding TS-shRNA to outer membrane surface (Establishment of orthotopic transplantation mouse model of malignant pleural mesothelioma)
  • Malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model mice using MSTO-211H-Luc cells were prepared by the method shown in Example 3, and mice on the 7th day after transplantation in which transplanted cells were sufficiently established were subjected to in vivo experiments. .
  • Preparation of cationic liposomes Liposomes were prepared according to the method shown in Example 3.
  • the lipoplex was prepared by mixing the shRNA shown in Example 1 with the liposomes by the method shown in Example 3.
  • the lipoplex particle size (dynamic light scattering method) and zeta potential (electrophoretic light scattering method) were measured by NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, USA).
  • the lipoplex that binds TS-shRNA to the outer membrane surface (hereinafter referred to as “TS-shRNA lipoplex”) had a particle size of about 400 nm and a surface charge of about +30 mV.
  • the lipoplex that binds NS-shRNA to the outer membrane surface had a particle size of about 400 nm and a surface charge of about +30 mV.
  • TS-shRNA lipoplex or NS-shRNA lipoplex was directly administered into the thoracic cavity a total of 6 times every other day from the 7th day to the 17th day after tumor transplantation to the MSTO-211H-Luc cell-bearing mice. 20 ⁇ g shRNA / 100 ⁇ L was administered per administration.
  • the existing cancer chemotherapeutic agent “Alimta (pemetrexed sodium hydrate (PMX))” (Eli Lilly) is used in combination, at a dose of 25 mg / kg, daily from day 7 to day 11 after tumor implantation, Two days later, the same amount was administered intraperitoneally a total of 10 times daily from the 14th day to the 18th day.
  • the control received a 9% sucrose solution.
  • the antitumor activity was 100 ⁇ L (7.5 mg) of D-luciferin potassium salt solution under anesthesia using isoflurane on the 21st day after the transplantation of MSTO-211H-Luc cells.
  • ILS (%) [mean survival of treatment group / mean survival of control group] ⁇ 100
  • FIGS. 8-1 and 8-2, and FIGS. 8-3 and 8-4 The results are shown in FIGS. 8-1 and 8-2, and FIGS. 8-3 and 8-4.
  • the group treated with NS-shRNA lipoplex alone showed no tumor growth inhibitory effect as compared to the control group.
  • TS-shRNA lipoplex or PMX alone about 50% of the tumor growth inhibitory effect was confirmed.
  • RNA from tumor cells was carried out according to the method recommended by the manufacturer using RNequeous-micro kit (Ambion, Austin, TX, USA).
  • Reverse transcription of RNA to cDNA was performed by adding Oligo (dT) 20, dNTP, RNase inhibitor, and ReverseTra Ace (Toyobo, Osaka, Japan) to RNA.
  • Real-time PCR was performed using StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems, CA, USA), reverse-transcribed cDNA as a template, FastStart TaqmanProbM Master Probe Master (ROX) and UniverseRibs Germany), and according to the method recommended by the manufacturer.
  • GAPDH was used as an internal standard. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 9, the TS gene suppressive effect was not seen at all in the group treated with NS-shRNA lipoplex alone as compared to the control group. On the other hand, in the group treated with TS-shRNA lipoplex or PMX alone, TS gene suppression effects of about 50% and about 25% were observed, respectively. In addition, in the group treated with NS-shRNA lipoplex in combination with PMX, only about 20% of the TS gene suppression effect was confirmed, which was almost the same as the group administered with PMX alone.
  • Example 10 Effect of lipid mixture morphology on shRNA introduction in vitro Cationic presome preparation
  • lipid was weighed so that the lipid composition was as described above, cyclohexane 10 times the total lipid was added, and 2% ethanol by weight of cyclohexane was added and dissolved in warm water at 70 ° C.
  • the lysate was filtered using a 0.2 ⁇ m PTFE membrane filter, and the filtered solution was frozen with dry ice / acetone. After freezing completely, vacuum drying was performed for 12 hours or more using a vacuum pump to obtain cationic presomes.
  • the cationic presome solution used in the experiment was prepared by adding 9% sucrose solution (pH 7.4) to the cationic presome obtained by the above method so that the final lipid concentration was 100 mM, and stirring vigorously for 10 minutes. Prepared.
  • the average particle size of this cationic presome was about 440 ⁇ 210 (mean ⁇ standard deviation) nm.
  • Preparation of lipoplex and preplex For the preparation of the lipoplex and the preplex, the cationic liposome shown in Example 3 and the above cationic presome were used, respectively.
  • Luc-shRNA described in Example 3 targeting luciferase was used as the shRNA to be loaded on the lipoplex and the preplex.
  • Lipoplex that binds Luc-shRNA to the outer membrane surface by mixing cationic liposomes or cationic presomes with Luc-shRNA in a molar ratio of 1600: 1 or 800: 1 and stirring vigorously for 10 minutes And plexes were prepared respectively.
  • TM 2000 (hereinafter referred to as “Lf2000”) was used.
  • pGL3-C and pRL-TK Promega were used as expression plasmids for expressing firefly-derived and sea slug-derived luciferase, respectively.
  • OptiMEM was added to both luciferase expression plasmids 15 ⁇ g + 15 ⁇ g and 30 ⁇ L of Lf2000 to 750 ⁇ L for dilution, then both solutions were mixed and allowed to stand at room temperature for 10-20 minutes to form Luc-lipoplex.
  • Luciferase activity measurement For the measurement of luciferase activity, a Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) and a 96-well microplate were used. After culturing for 48 hours, the medium was removed, and after washing once with cold PBS ( ⁇ ), 150 ⁇ L of Passive Lysis Buffer was directly added to the wells to lyse the cells. Freezing and thawing was performed once, and after centrifugation (10,000 ⁇ g, 30 seconds, 4 ° C.), the obtained supernatant was used as a cell extract.
  • Firefly-derived luciferase relative activity (Firefly luciferase activity / Renilla luciferase activity) / (Luc-shRNA untreated group Firefly luciferase activity / Luc-shRNA untreated group Renilla luciferase activity) ⁇ 100
  • luciferase is more in the form of a preplex that binds Luc-shRNA to the outer membrane surface than a lipoplex that binds Luc-shRNA to the outer membrane surface. Expression was further suppressed.
  • Example 11 Tumor growth-inhibiting effect in orthotopic transplantation model of malignant pleural mesothelioma by intrathoracic administration of lipoplexes and preplexes that bind TS-shRNA to the outer membrane surface
  • orthotopic transplantation model for malignant pleural mesothelioma A malignant pleural mesothelioma orthotopic transplantation model using MSTO-211H-Luc cells was prepared using the method shown in Example 4 above, and mice on the 4th day of transplantation were subjected to in vivo experiments.
  • TS-lipoplex or TS-preplex Two days after the final administration of TS-lipoplex or TS-preplex (18 days after tumor implantation), 100 ⁇ L (7.5 mg / ml) of D-luciferin potassium salt solution was administered intraperitoneally under anesthesia using isoflrane Then, the intensity of bioluminescence depending on the luciferase activity in MSTO-211H-Luc cells grown in the thoracic cavity was evaluated by IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA). An implementation result is shown in FIG. Compared to the untreated control group, the group treated with PMX alone showed less tumor growth inhibitory effect.
  • FIG. 12 shows mouse body weights measured at the time of evaluation by the above-mentioned IVIS, but no statistical difference was obtained in all groups, which is serious for the administration method used this time. It was suggested that no toxicity was observed.
  • the liposome according to the present invention can efficiently deliver the active ingredient to the administration site and / or the localized cells in the vicinity thereof by loading and locally administering the active ingredient.
  • RNAi molecules capable of suppressing the growth of tumors as active ingredients are mounted on the liposome according to the present invention, and the RNAi molecules are efficiently delivered to tumor cells by local administration to the tumor and / or its surroundings. And the growth of the tumor can be efficiently suppressed.
  • the present invention is expected to contribute greatly in the field of drug delivery and in the field of cancer treatment. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

　本発明は、標的とする細胞に活性成分を効率的に送達することが可能な新たな送達手段を提供するこ とを目的とする。　ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質からなり、PEGで修飾されておらず、かつコレステロールを含まない、局所投与用リポソーム。

Description

局所投与用リポソームおよびその用途
　本発明は、局所投与用リポソーム及び当該リポソームを利用する抗腫瘍剤に関する。
　リポソームは、生体の細胞膜を構成しているリン脂質からなり生体適合性が高く、また生体内では薬物や活性成分を分解酵素等から保護しながら運搬することができ、ドラッグデリバリーシステムの有用なツールとして注目されている。今日では、血中滞留性を向上させるためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたリポソームや、血中安定性及び強度を高めるために構成脂質として不飽和結合を含まない水素添加ホスファチジルコリンや膜の相転移温度を高めるコレステロールを含むリポソームが開発され、汎用されている。
　一方、ＲＮＡ干渉（以下、「ＲＮＡｉ」と記載する）を引き起こすＲＮＡｉ分子は、腫瘍などを治療するための有用なツールとして注目されており、腫瘍の増殖を抑制することが可能な様々なＲＮＡｉ分子が開発されている。また、ＲＮＡｉ分子とリポソームからなる複合体（リポプレックス）を用いて、活性成分であるＲＮＡｉ分子を腫瘍細胞へ送達する方法が開発されている（非特許文献１−３）。
　本発明者らはこれまでに、ＤＮＡ合成に関与しているチミジル酸合成酵素（以下、「ＴＳ」と記載する）を標的とするＲＮＡｉ分子を開発し（特許文献１）、当該ＲＮＡｉ分子をＰＥＧで修飾され、かつコレステロールを所定の割合で含むリポソームを用いて、静脈内投与により腫瘍に送達することによって、ＴＳを発現する腫瘍の増殖を抑制できること、さらに当該リポソームを化学療法剤と併用することによって、腫瘍への指向性を高めＲＮＡｉ分子による抗腫瘍効果を顕著に向上させることができることを報告した（特許文献２）。
　しかしながら、当該分野においては依然として、腫瘍の増殖を抑制することが可能なＲＮＡｉ分子を腫瘍細胞へさらに効率的に導入することが可能な手段が求められている。
ＷＯ　２０１０／１１３８４４ ＷＯ　２０１２／１６１１９６
Ｑｉｘｉｎ　Ｌｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｒｕｇ　Ｆｕｔｕｒｅ．２００９　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；３４（９）：７２１． Ｓｈｅｒｒｙ　Ｙ．Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　ＡＡＰＳ　Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．４，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２００９． Ｂ．Ｏｚｐｏｌａｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２６７；４４−５３２００９．
　本発明は、標的とする細胞に活性成分を効率的に送達することが可能な新たな送達手段を提供することを目的とする。
　より詳細には、本発明は、腫瘍の増殖を抑制することが可能なＲＮＡｉ分子を腫瘍細胞に効率的に送達することが可能な新たなリポソームを提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質からなり、ＰＥＧで修飾されておらず、かつコレステロールを含まないリポソームに活性成分を担持させ、標的細胞を含む部位又はその近傍に局所投与することにより、標的細胞に活性成分を効率的に送達できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち本発明は、以下のとおりである。
［１］　ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質からなり、該ホスファチジルコリンが以下の（ｉ）−（ｉｉｉ）より選択される一以上の特徴を有する、局所投与用リポソーム：
（ｉ）炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む；
（ｉｉ）シス型の炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む；
（ｉｉｉ）相転移温度が０℃未満。
［２］　カチオン性脂質が０，０’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４）である、［１］のリポソーム。
［３］　ホスファチジルコリンが１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、パルミトイルオエオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、又は１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）である、［１］のリポソーム。
［４］　ホスファチジルコリンがＤＯＰＣである、［１］のリポソーム。
［５］　ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ及びＤＣ−６−１４からなる、［１］のリポソーム。
［６］　ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ及びＤＣ−６−１４が、３：２：５のモル比で含まれる、［５］のリポソーム。
［７］　［１］~［６］のいずれかのリポソームと活性化合物を含む組成物。
［８］　活性化合物が核酸である、［７］の組成物。
［９］　核酸がリポソームの外膜表面に結合している、［８］の組成物。
［１０］　［１］~［６］のいずれかのリポソームとＲＮＡｉ作用によりチミジル酸合成酵素の発現を抑制することができるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）とを含む、抗腫瘍剤。
［１１］　ｓｈＲＮＡがリポソームの外膜表面に結合されている、［１０］の抗腫瘍剤。
［１２］　ｓｈＲＮＡが配列番号８で表される塩基配列からなる、［１０］の抗腫瘍剤。
［１３］　癌化学療法又は癌化学療法剤と併用される、［１０］の抗腫瘍剤。
［１４］　［１０］~［１３］のいずれかの抗腫瘍剤と癌化学療法剤とを含む、組み合わせ物。
［１５］　癌化学療法剤が、ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤である、［１４］の組み合わせ物。
［１６］　ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤が、５−ＦＵ系抗腫瘍剤又はペメトレキセドナトリウム水和物である、［１５］の組み合わせ物。
　本発明によれば、局所投与により、標的とする細胞に活性成分を効率的に送達することが可能な新たなリポソームを提供することができる。
　より詳細には、本発明によれば、局所投与により、腫瘍の増殖を抑制することが可能なＲＮＡｉ分子を腫瘍細胞に効率的に送達することが可能な新たなリポソームを提供することができる。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１３−０９５９５０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１は、ヒト悪性胸膜中皮腫細胞に対する、癌化学療法剤、ＴＳ−ｓｈＲＮＡ、ＮＳ−ｓｈＲＮＡ、並びにこれらｓｈＲＮＡと癌化学療法剤との併用、による腫瘍成長抑制効果を示す。（Ａ）最終濃度を５ｎＭとするｓｈＲＮＡの結果を示す。（Ｂ）最終濃度を１０ｎＭとするｓｈＲＮＡの結果を示す。＊＊＊：ｐ＜０．００５。
　図２は、ＴＳ−ｓｈＲＮＡ及びＮＳ−ｓｈＲＮＡによる、ヒト悪性胸膜中皮腫細胞におけるＴＳ発現抑制効果を示す。（Ａ）ウェスタンブロッティングの結果を示す。（Ｂ）ウェスタンブロッティングの結果に基づく、ＴＳ発現量の定量結果を示す。ＴＳ／β−アクチンはｓｈＲＮＡ未処理の対照を１００％とする相対値にて示す。
　図３は、Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙによる各種カチオニックリポソームによるＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ導入効果の比較結果を示す。
　図４は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍増殖の結果を示す写真図である。各写真の日数は悪性胸膜中皮腫細胞の移植後の日数を示す。
　図５−１は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する各種カチオニックリポソームによるＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ導入効果の比較結果を示す写真図である。（Ａ）対照：９％スクロースの結果を示す。（Ｂ）ＤＥＰＣ：ＤＥＰＣを含むリポソームの結果を示す。（Ｃ）ＤＭＰＣ：ＤＭＰＣを含むリポソームの結果を示す。（Ｄ）ＤＯＰＣ：ＤＯＰＣを含むリポソームの結果を示す。（Ｅ）ＰＯＰＣ：ＰＯＰＣを含むリポソームの結果を示す。
　図５−２は、図５−１の結果に基づく、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する各種カチオニックリポソームによるＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ導入効果の定量結果を示す。＊：ｐ＜０．００５。
　図６−１は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する、ＤＣ−６−１４の含有量の異なるカチオニックリポソームのＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ導入効果の比較結果を示す写真図である。写真は上から、モル比にして、（Ａ）２０％のＤＣ−６−１４を含むリポソーム、（Ｂ）３５％のＤＣ−６−１４を含むリポソーム、（Ｃ）５０％のＤＣ−６−１４を含むリポソームの結果を示す。
　図６−２は、図６−１の結果に基づく、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する、ＤＣ−６−１４の含有量の異なるカチオニックリポソームのＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ導入効果の定量結果を示す。＊：ｐ＜０．００５。
　図７−１は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する、ＰＥＧ修飾された、及びＰＥＧ修飾されていない、各種カチオニックリポソームのＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ導入効果の比較結果を示す写真図である。（Ａ）ＰＥＧ修飾ＰＯＰＣ：ＰＥＧ修飾された、ＰＯＰＣを含むリポソームの結果を示す。（Ｂ）ＰＥＧ未修飾ＰＯＰＣ：ＰＥＧ修飾されてない、ＰＯＰＣを含むリポソームの結果を示す。（Ｃ）ＰＥＧ修飾ＤＯＰＣ：ＰＥＧ修飾された、ＤＯＰＣを含むリポソームの結果を示す。（Ｄ）ＰＥＧ未修飾ＤＯＰＣ：ＰＥＧ修飾されてない、ＤＯＰＣを含むリポソームの結果を示す。
　図７−２は、図７−１の結果に基づく、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する各種カチオニックリポソームのＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ導入効果の定量結果を示す。＊＊：ｐ＜０．０１。
　図８−１は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する、ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックス及びＮＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックス、癌化学療法剤（ＰＭＸ）、並びにリポプレックスと癌化学療法剤（ＰＭＸ）との併用、による腫瘍成長抑制効果の比較結果を示す写真図である。（Ａ）対照：９％スクロースの結果を示す。（Ｂ）ＮＳ−ｓｈＲＮＡ：ＮＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスのみで処理した結果を示す。（Ｃ）ＴＳ−ｓｈＲＮＡ：ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスのみで処理した結果を示す。（Ｄ）ＰＭＸ：癌化学療法剤のみで処理した結果を示す。（Ｅ）ＰＭＸ＋ＮＳ−ｓｈＲＮＡ：癌化学療法剤とＮＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスとの併用で処理した結果を示す。（Ｆ）ＰＭＸ＋ＴＳ−ｓｈＲＮＡ：癌化学療法剤とＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスとの併用で処理した結果を示す。
　図８−２は、図８−１の結果に基づく、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する各種処置による腫瘍成長抑制効果の定量結果を示す。＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．０１。
　図８−３は、対照（９％スクロース）、癌化学療法剤（ＰＭＸ）のみ、ＮＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、又はリポプレックスと癌化学療法剤（ＰＭＸ）との併用、により処置された悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの生存率（％）を示す。
　図８−４は、対照（９％スクロース）、ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、ＮＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、癌化学療法剤（ＰＭＸ）のみ、又はリポプレックスと癌化学療法剤（ＰＭＸ）との併用、により処置された悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの平均生存期間（ＭＳＴ）及び生存期間増加率（ＩＬＳ）を示す。
　図９は、対照（９％スクロース）、ＮＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスのみ、癌化学療法剤（ＰＭＸ）のみ、又はリポプレックスと癌化学療法剤（ＰＭＸ）との併用、により処置された悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの腫瘍細胞におけるＴＳ　ｍＲＮＡ発現量の定量結果を示す。ＴＳ　ｍＲＮＡ発現量は対照を１００％とする相対値にて示す。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
　図１０は、Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙによる各種カチオニックリポソーム及びカチオニックプレソームによるＬｕｃ−ｓｈＲＮＡ導入効果の比較結果を示す。
　図１１は、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍細胞に対する、ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックス及びＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するプレプレックス、癌化学療法剤（ＰＭＸ）、並びに、リポプレックス又はプレプレックスと癌化学療法剤（ＰＭＸ）との併用、による腫瘍成長抑制効果の比較結果を示す写真図である。（Ａ）対照：９％スクロースの結果を示す。（Ｂ）ＰＭＸ：癌化学療法剤のみで処理した結果を示す。（Ｃ）ＴＳプレプレックス：ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するプレプレックスのみで処理した結果を示す。（Ｄ）ＰＭＸ＋ＴＳプレプレックス：癌化学療法剤とＮＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するプレプレックスとの併用で処理した結果を示す。（Ｅ）ＴＳリポプレックス：ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスのみで処理した結果を示す。（Ｆ）ＰＭＸ＋ＴＳリポプレックス：癌化学療法剤とＮＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスとの併用で処理した結果を示す。
　図１２は、癌化学療法剤、並びに／あるいは、ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックス又はプレプレックスで処理された悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの体重の測定結果を示す。
１．リポソーム
　本発明のリポソームは、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質からなる脂質二重膜よりなる球状の中空体である。
　本発明において利用可能な「ホスファチジルコリン」としては、以下の（ｉ）−（ｉｉｉ）より選択される一以上の特徴を有する：
（ｉ）炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む；
（ｉｉ）シス型の炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む；
（ｉｉｉ）相転移温度が低い（例えば、０℃未満、−１０℃未満、−２０℃未満）。
　このような「ホスファチジルコリン」としては、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、パルミトイルオエオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）が挙げられる。好ましくはＤＯＰＣである。
　本発明において利用可能な「カチオン性脂質」としては、０，０′−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロライド（ＤＣ−６−１４）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、及びこれらの誘導体より選択されるいずれか１つを利用することができる。好ましくは、カチオン性脂質はＤＣ−６−１４である。
　好ましくは本発明におけるリポソームは、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣおよびＤＣ−６−１４からなる。
　リポソームにおけるＤＯＰＥ、ホスファチジルコリンおよびカチオン性脂質の含有比（モル比）は、ＤＯＰＥ：ホスファチジルコリン：カチオン性脂質＝２~４：１~３：４~６の範囲より選択することが可能である。好ましくはＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＤＣ−６−１４＝３：２：５である。
　本発明のリポソームは公知の手法、例えば薄膜振とう法（Ｂａｎｇｈａｍ法）に基づいて作製することができる（Ａ．Ｄ．Ｂａｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３，２３８−２５２（１９６５）；Ａ．Ｄ．Ｂａｎｇｈａｍ　ａｎｄ　Ｒ．Ｗ．Ｈｏｒｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８，６６０−６６８（１９６４））。すなわち、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質をそれぞれクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、上記所定量となるようにそれぞれを分取しフラスコ等の容器内にて混合する。次いで、有機溶媒を揮発させて容器の底部に脂質膜を形成させた後、そこに緩衝液等の水溶液を入れて攪拌することによって、リポソームを含む懸濁液を得ることができる。なお、本明細書において「リポソーム」を「カチオニックリポソーム」と呼ぶ場合があるが、これらの用語は相互互換的に使用される。
　あるいは本発明のリポソームは、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質をそれぞれクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、上記所定量となるようにそれぞれを分取し、有機溶媒（例えば、総脂質の５~３０倍重量、好ましくは５~１５倍重量、さらに好ましくは１０倍重量のシクロヘキサンとシクロヘキサンの１~１０重量％、好ましくは１~５重量％、さらに好ましくは２重量％のアルコール（好ましくはエタノール）を加えて５０~８０℃、好ましくは６５~７５℃に加温して混合・溶解する。次いで、得られた溶液を濾過して、有機溶媒をドライアイス及びアセトンを用いて凍結し、乾燥操作によって除去した後（必要に応じて粉砕し）、そこに緩衝液等の水溶液を入れて混合することによって、リポソームを含む懸濁液を得ることができる。このようにして得られたリポソームを、本明細書において「プレソーム」又は「カチオニックプレソーム」と呼ぶ場合がある。プレソームは凍結乾燥した形態で保存することができる。
　本発明のリポソームは、粒径が８０ｎｍ~２００ｎｍ、好ましくはおよそ１００ｎｍである。また、本発明のリポソームのゼータ電位は、４０~６０ｍＶ、好ましくはおよそ５０ｍＶである。本発明のリポソームが上記プレソームである場合には、粒径が１００ｎｍ~６００ｎｍ、好ましくはおよそ１００ｎｍ~２００ｎｍである。
　本発明のリポソームは、活性成分を局所投与するためのキャリアとして利用することができる。ここで「局所投与」とは活性成分を直接患部／病巣及び／又はその近傍に投与し、当該活性成分を患部／病巣に作用させることを目的とする。したがって、本発明において「局所投与」とは、静脈注射等を用いて活性成分を全身に作用させることを意図するものではない。局所投与には、例えば、筋肉内、腹腔内、胸腔内、皮下、皮内、眼内、脳内、脳脊髄腔内、膣内、直腸内、臓器内、腫瘍内への注射、表皮への塗布等が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは「局所投与」とは腔内投与であり、さらに好ましくは胸腔内投与又は腹腔内投与である。「活性成分」としては、医薬品又は化粧品の有効成分を意味し、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッド、タンパク質、ペプチド、化合物等が挙げられる。
２．組成物
　本発明の組成物は、上記本発明のリポソームと活性成分とを含み、当該活性成分を局所投与するために利用できる。
　活性成分は上記したものが挙げられ、特に限定はされないが例えば、腫瘍細胞において発現しかつ腫瘍細胞の増殖に関与する因子をコードする遺伝子の発現をＲＮＡｉ作用により抑制することが可能なｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ等が挙げられる。「腫瘍細胞において発現しかつ腫瘍細胞の増殖に関与する因子をコードする遺伝子」としては、例えばチミジル酸合成酵素、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、Ｗｉｎｔ、Ｂｃｌ−２、サバイビンなどの増殖調節因子群、リボヌクレオチドレダクターゼ、ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸合成関連酵素群などをコードする遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。これら遺伝子の遺伝子情報はＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに開示されており、これらの遺伝子情報に基づいてｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを設計・合成することができる。チミジル酸合成酵素の発現をＲＮＡｉ作用により抑制することが可能なｓｈＲＮＡについては下に詳述されるものを使用することができる。また、活性成分として、抗癌剤や癌化学療法剤を用いることもできる。
　本発明の組成物において、活性成分はリポソームの脂質二重膜に囲まれた中空部に含めてもよいし、あるいは脂質二重膜の外膜表面に結合させてもよい。好ましくは活性成分はリポソームの脂質二重膜の外膜表面に結合されている。
　本発明の組成物はまた、リポソームと活性成分と共に、医薬品又は化粧品の製造において通常用いられている、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、ヒスチジン等を含んでも良い。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴムおよびこれらの混合物等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物等が挙げられる。結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウムおよびこれらの混合物等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖およびこれらの混合物等が挙げられる。希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類およびこれらの混合物等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸およびこれらの混合物等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリンおよびこれらの混合物等が挙げられる。ｐＨ調整剤および緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびこれらの混合物等が挙げられる。
　本発明の組成物は局所投与に適した剤形とすることができ、注射剤、懸濁剤、乳化剤、軟膏剤、クリーム剤錠剤等の各種製剤形態に調製することができる。
３．抗腫瘍剤
　本発明の抗腫瘍剤は、上記本発明のリポソームと活性成分として、ＲＮＡｉ作用によりチミジル酸合成酵素（以下、「ＴＳ」と記載する）の発現を抑制することができるｓｈＲＮＡを含む。
　本発明におけるＴＳの発現を抑制することができるｓｈＲＮＡは、ＴＳのｍＲＮＡを標的とすることにより、ＴＳ特異的にＲＮＡｉ作用を奏し、ＴＳの発現を顕著に抑制することができる。ここで「ｍＲＮＡを標的とする」とは、下記に詳述するｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的ｍＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできることをいう。
　ストリンジェントな条件下とは、常法に従ってハイブリッドを形成する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて求めることができる。例えば、ハイブリダイズ状態を維持できる洗浄条件として通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件、より厳格には「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件、さらに厳格には「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件が挙げられる。
　本発明におけるｓｈＲＮＡは、ＴＳをコードするＯＲＦの塩基配列又はその一部に同一な塩基配列を有するセンス鎖と、当該センス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンス鎖を含む。ここで「ＯＲＦの塩基配列又はその一部に同一な塩基配列」とは、ＯＲＦの塩基配列中のチミンをウラシルに置換して表される塩基配列又はその一部に同一である塩基配列を意味する。
　当該センス鎖は１５~２５塩基、好ましくは１９塩基からなる。センス鎖の塩基配列は、ＴＳをコードするＯＲＦの塩基配列と同一であることが望ましいが、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。すなわち、センス鎖の塩基配列は、ＯＲＦの塩基配列において１又は複数、すなわち、１~３の塩基、好ましくは１~２塩基、より好ましくは１塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加があってもよい。
　当該アンチセンス鎖は、センス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を有する。アンチセンス鎖は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる限り、１~３の塩基、好ましくは１~２塩基、より好ましくは１塩基の置換、欠失、挿入および／または付加を含むミスマッチを有するものであってもよい。好ましくは、アンチセンス鎖は、センス鎖と完全に相補的な塩基配列からなる。
　センス鎖およびアンチセンスの塩基配列は、ＴＳをコードする公知の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＲ６０１５２８．１）に基づいて選択することができる。これらの塩基配列を選択する方法として種々の方法が知られており、例えば、ｓｉＲＮＡ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｓｕｐｐｏｒｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社）などを用いることが可能である。
　本発明において、センス鎖として以下の塩基配列からなるものが挙げられるがこれらに限定されない：５’−ＧＵＡＡＣＡＣＣＡＵＣＧＡＵＣＡＵＧＡ−３’（配列番号１）；５’−ＧＡＡＵＡＣＡＧＡＧＡＵＡＵＧＧＡＡＵ−３’（配列番号３）；５’−ＣＧＡＵＣＡＵＧＡＵＧＵＡＧＡＧＵＧＵ−３’（配列番号５）；５’−ＧＧＧＵＧＵＵＵＵＧＧＡＧＧＡＧＵＵＧＴＴ−３’（配列番号９）。
　好ましくは本発明におけるｓｈＲＮＡは、センス鎖５’−ＧＵＡＡＣＡＣＣＡＵＣＧＡＵＣＡＵＧＡ−３’（配列番号１）とアンチセンス鎖５’−ＵＣＡＵＧＡＵＣＧＡＵＧＧＵＧＵＵＡＣ−３’（配列番号２）；センス鎖５’−ＧＡＡＵＡＣＡＧＡＧＡＵＡＵＧＧＡＡＵ−３’（配列番号３）とアンチセンス鎖５’−ＡＵＵＣＣＡＵＡＵＣＵＣＵＧＵＡＵＵＣ−３’（配列番号４）；またはセンス鎖５’−ＣＧＡＵＣＡＵＧＡＵＧＵＡＧＡＧＵＧＵ−３’（配列番号５）とアンチセンス鎖５’−ＡＣＡＣＵＣＵＡＣＡＵＣＡＵＧＡＵＣＧ−３’（配列番号６）；センス鎖５’−ＧＧＧＵＧＵＵＵＵＧＧＡＧＧＡＧＵＵＧＴＴ−３’（配列番号９）とアンチセンス鎖５’−ＡＡＣＡＡＣＵＣＣＵＣＣＡＡＡＡＣＡＣＣＣ−３’（配列番号１０）を含む。
　さらに好ましくは、本発明におけるｓｈＲＮＡは、配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖を含む。
　センス鎖とアンチセンス鎖は、リンカー部分を介して連結され、当該リンカー部分がループを形成することにより折りたたまれ、当該アンチセンス鎖と当該センス鎖がハイブリダイズして、二本鎖部分を形成する。ｓｈＲＮＡ分子に含まれるリンカー部分は、センス鎖とアンチセンス鎖を連結しステムループ構造を形成し得る限り、ポリヌクレオチドリンカーであっても、非ポリヌクレオチドリンカーであってもよく、特に限定しないが、当業者に公知である２~２２塩基のポリヌクレオチドリンカーが好ましい。具体的には、ＵＡＧＵＧＣＵＣＣＵＧＧＵＵＧ（配列番号７）、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＣＣＡＣＣ、ＣＵＣＧＡＧ、ＣＣＡＣＡＣＣ、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＡＵＧ、ＣＣＣおよびＵＵＣＧが例示でき、ＵＡＧＵＧＣＵＣＣＵＧＧＵＵＧ（配列番号７）が好ましい。
　本発明におけるｓｈＲＮＡは３’末端に少なくとも２塩基からなるオーバーハングを有する。
　本発明において、オーバーハングとは、アンチセンス鎖の３’末端に付加された塩基であって、センス鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有していない場合、オーバーハングを有している場合と比べて、本発明のリポソームを用いたトランスフェクションにおいて、ｓｈＲＮＡによるＴＳの発現抑制の程度がおよそ４０~６０％低下する。当該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、１~５、好ましくは１~３、さらに好ましくは１若しくは２塩基からなる配列が挙げられ、例えば、ＴＴＴ、ＵＵやＴＴが挙げられる。好ましくは、ＵＵである。
　本発明において、好ましいｓｈＲＮＡとしては、配列番号８で表される塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡである。
　また、センス鎖またはアンチセンス鎖は必要に応じて、５’末端がリン酸化されていてもよく、５’末端に三リン酸（ｐｐｐ）が結合していても良い。
　上記ｓｈＲＮＡは、本発明のリポソームの脂質二重膜の外膜表面に共有結合または非共有結合によって結合している。上記ｓｈＲＮＡとリポソームの結合に際しては、上記ｓｈＲＮＡとリポソームを含む混合液を１~１５分間、好ましくは１０分間程度激しく攪拌（例えば超音波撹拌等）することが好ましい。攪拌を加えることによって、得られるｓｈＲＮＡを備えたリポソームの粒径を数百ｎｍのサイズに調製できる（Ｂａｒｉｃｈｅｌｌｏ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（２０１１））。また、攪拌を加えることによって、リポソーム上に上記ｓｈＲＮＡを均一に分散させ結合させることができ、ｓｈＲＮＡの不均一な結合によってもたらされる組織によるリポソーム取り込みの不均一性を防ぐことができる。あるいは、リポソームがプレソームである場合には、上記プレソームを含む懸濁液にｓｈＲＮＡを添加して混合（例えばボルテックス操作等）することにより、プレソームの脂質二重膜の外膜表面にｓｈＲＮＡを結合させることができる。
　本発明において、ｓｈＲＮＡを備えたリポソームは粒径が２００~６００ｎｍ、好ましくはおよそ３００~４００ｎｍである。また、本発明において、ｓｈＲＮＡを備えたプレソームは粒径が２００ｎｍ~２μｍ、好ましくはおよそ３００ｎｍ~１μｍである。本発明において、ｓｈＲＮＡを備えたリポソームはゼータ電位が、０~５０ｍＶ、好ましくはおよそ２５~３５ｍＶである。
　本発明におけるｓｈＲＮＡを備えたリポソームは、ＴＳの発現を抑制することができるｓｈＲＮＡに加えて、腫瘍細胞において発現しかつ腫瘍細胞の増殖に関与する因子をコードする遺伝子の発現をＲＮＡｉ作用により抑制することが可能なｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含んでも良い。このようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡとしては、上に定義したものを使用することができる。ＴＳの発現を抑制することができるｓｈＲＮＡとその他のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、同一のリポソームに結合していても良いし、それぞれ別個のリポソームに結合していても良い。
　なお、本明細書において、ｓｈＲＮＡを備えたリポソームを、「リポプレックス」と呼ぶ場合がある。また、ｓｈＲＮＡを備えたプレソームを、「プレプレックス」と呼ぶ場合がある。
　下記実施例にて詳述されるように、局所投与により上記ｓｈＲＮＡを備えたリポソームは腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能であり、癌を治療するために利用することができる。
　本発明の抗腫瘍剤を用いて治療できる癌としては、ＴＳを高発現している癌が挙げられ、特に制限されるものではないが、例えば、結腸・直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、膀胱癌、前立腺癌、悪性胸膜中皮腫、精巣腫瘍、卵巣癌、骨・軟部肉腫、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。また、癌性胸膜炎や癌性腹膜炎も本抗腫瘍剤で治療可能である。治療候補として、好ましくは胃癌、肺癌、胆道癌、肝臓癌、悪性胸膜中皮腫、卵巣癌、癌性胸膜炎や腹膜炎であり、特に好ましくは悪性胸膜中皮腫、遠隔転移のない非小細胞肺癌、癌性胸膜炎、胃癌の腹膜播種転移、卵巣癌の腹膜播種転移、癌性腹膜炎である。
　本発明の抗腫瘍剤はまた、ｓｈＲＮＡを備えたリポソームと共に、医薬の製造において通常用いられている、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、ヒスチジン等を含んでも良い。賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤としては、上に定義したものを使用することができる。
　本発明の抗腫瘍剤は、局所投与によって、投与することができる。局所投与には上に定義したものが挙げられる。また、本発明の組成物は局所投与に適した剤形とすることができ、注射剤、懸濁剤、乳化剤、スプレー剤等の各種製剤形態に調製することができる。
　本発明の抗腫瘍剤の効果は、上記癌に由来する細胞や組織、および上記癌に罹患する個体に当該抗腫瘍剤を投与し、腫瘍の大きさが当該抗腫瘍剤を投与していない（または投与前の）細胞や組織、および個体における腫瘍の大きさと比較して、腫瘍が縮小または消滅していることを指標にして評価することが可能である。また、本発明の抗腫瘍剤の効果は、上記癌に由来する細胞や組織、および上記癌に罹患する個体に当該抗腫瘍剤を投与し、当該抗腫瘍剤を投与していない個体と比較して、生存率の向上（延命効果）、胸水や腹水が減少または消滅していることを指標にして評価することが可能である。
　本発明の抗腫瘍剤は、既存の癌化学療法や癌化学療法剤と共に使用することができる。本発明の抗腫瘍剤と併用し得る癌化学療法や癌化学療法剤としては、本発明のリポソームが腫瘍組織に侵入しやすいように腫瘍環境を改変し得るものであればよく、例えば既存の癌化学療法としては、以下に記載する「ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤」を用いた化学療法が挙げられ、既存の癌化学療法剤としては、ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤が挙げられる。
　「ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤」としては、ＴＳの機能を阻害しうる限り特に限定されず、例えば、５−ＦＵ系抗腫瘍剤、ペメトレキセドナトリウム水和物、ラルチトレキセド（Ｔｏｍｕｄｅｘ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）などが挙げられる。
　ＴＳの発現量と５−ＦＵ系抗腫瘍剤の感受性の関係が報告されている（Ｐａｔｒｉｃｋ　Ｇ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１９９５；５５：１４０７−１２．及びＫｕｎ−Ｈｕｅｉ　Ｙｅｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　１９９８；８２：１６２６−３１）。癌患者の中でもＴＳの発現が比較的低い癌患者は、５−ＦＵ系抗腫瘍剤が顕著に奏効する一方で、癌患者の中でもＴＳの発現が比較的亢進している癌患者の多くは、５−ＦＵ系抗腫瘍剤に対して耐性を有する。ペメトレキセドナトリウム水和物についても、ＴＳの発現量との間に同様の関係がみられる。本発明の抗腫瘍剤を投与することによって、腫瘍組織内のＴＳの産生を抑えることができ、当該腫瘍組織のＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤の感受性を高めることができる。また、本発明の抗腫瘍剤は、ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤と併用した場合に、腫瘍内に選択的に蓄積され、ｓｈＲＮＡを腫瘍細胞に効率的に送達することができる。これによって、ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤と併用した場合に、本発明の抗腫瘍剤は、ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤または本発明の抗腫瘍剤を単独で用いた場合と比べて、顕著に高い抗腫瘍効果を得ることができる。
　「５−ＦＵ系抗腫瘍剤」としては、５−ＦＵおよび活性代謝物質が５−ＦＵである５−ＦＵ誘導体が挙げられる。５−ＦＵ誘導体としては例えば、テガフールを含有するものを挙げることができる。５−ＦＵ誘導体としては好ましくは、テガフール含有配合剤であり、具体的には、テガフール・ウラシル配合剤（例えば、ユーエフティ（登録商標）（大鵬薬品工業株式会社））、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤などが例示できる。この中でも、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、例えばティーエスワン（登録商標）（大鵬薬品工業株式会社）が特に好ましい。
　また、ペメトレキセドナトリウム水和物としては、アリムタ（登録商標）（日本イーライリリー株式会社）が挙げられる。ペメトレキセドナトリウム水和物も、上記５−ＦＵ系抗腫瘍剤と同様に、本発明の抗腫瘍剤との併用により、当該ペメトレキセドナトリウム水和物又は本発明の抗腫瘍剤を単独で用いた場合と比べて、顕著に高い抗腫瘍効果を得ることができる。
　本発明の抗腫瘍剤は、上記ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤に加えて、または変えて、他の既存の癌化学療法剤と共に使用することができる。このような癌化学療法剤としては、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、イホスファサミド、メルファラン、ブスルファン、ミトブロニトール、カルボコン、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、テモゾロミド、カルムスチン、ペメトレクスドジソディウム、メトトレキサート、６−メルカプトプリンリボシド、メルカプトプリン、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、ペメトレキセド、シスプラチン、カルボプラチン、オキザリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、塩酸イリノテカン、カペシタビンなどが挙げられ、これらから選択される一または複数の癌化学療法剤を用いることができる。これらの癌化学療法剤も、上記ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤と同様に、本発明の抗腫瘍剤との併用により、ｓｈＲＮＡを腫瘍細胞に効率的に送達することができ、また当該癌化学療法剤または本発明の抗腫瘍剤を単独で用いた場合と比べて、顕著に高い抗腫瘍効果を得ることができる。
　本発明の抗腫瘍剤と、上記既存の癌化学療法剤とは併用投与される限り、組み合わせ物として提供することができる。
　本発明の抗腫瘍剤は上記既存の癌化学療法剤とともに「組み合わせ物」の形態とすることができる。「組み合わせ物」は、本発明の抗腫瘍剤と上記既存の癌化学療法剤とを有効成分として含む配合剤であっても良いし、ならびに本発明の抗腫瘍剤と上記既存の癌化学療法剤を併用投与に適した単一のパッケージ（キット製剤）として製造・包装・流通されるものでもあっても良い。
　「併用投与」には、本発明の抗腫瘍剤と上記既存の癌化学療法剤とを同時に投与する場合だけではなく、本発明の抗腫瘍剤および上記既存の癌化学療法剤を間隔をあけて投与する場合も含まれる。本発明の抗腫瘍剤と上記既存の癌化学療法剤の投与経路及び投与手段は同一であってもよいし、異なっていてもよい。
　本発明の抗腫瘍剤の投与量および投与回数は、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、ｓｈＲＮＡの量にして１回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ~１００ｍｇの範囲から適宜選択される量を、１日に１~３回、毎日または１~２１日毎に投与することができる。
　上記既存の癌化学療法剤の投与量は、有効成分である化学物質の種類、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、１回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ~１０００ｍｇの範囲から適宜選択される量を、１日に１~３回、毎日または１~１４日毎に投与することができる。例えば、既存の癌化学療法剤が５−ＦＵ系抗腫瘍剤である場合、１日にテガフールにして６０~１６０ｍｇを毎日または１~７日毎に投与することができる。また、既存の癌化学療法剤がペメトレキセドナトリウム水和物である場合、１日に５００~１０００ｍｇを毎日または１~７日毎に投与することができる。上記既存の癌化学療法剤は単独で用いる場合と比べて、低用量かつ頻回投与することができる。これによって、上記既存の癌化学療法剤の投与により引き起こされ得る副作用（例えば、骨髄抑制、溶血性貧血、播種性血管内凝固症候群、劇症肝炎、脱水症状、腸炎、間質性肺炎、口内炎、消化管潰瘍、消化管出血、消化管穿孔、急性腎不全、皮膚粘膜眼症候群、中毒性表皮壊死症、精神神経障害、急性膵炎、横紋筋融解症、嗅覚脱失など、これらに限定されない）の発症を抑制または遅延することができる。
４．治療方法
　本発明はまた、上記本発明の抗腫瘍剤を用いた癌の治療方法に関する。当該方法により治療し得る癌としては、上に定義したような癌が含まれる。また、当該方法において上記本発明の抗腫瘍剤および既存の癌化学療法剤の用法および用量は上記したとおりである。
　以下に実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］
Ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＴＳを標的とするｓｈＲＮＡとアリムタ併用による細胞増殖抑制効果
（ＴＳを標的とするｓｈＲＮＡ）
　ＴＳを標的とするｓｈＲＮＡ（以下、「ＴＳ−ｓｈＲＮＡ」と記載する）は、ＴＳの発現を抑制することができ、かつ抗腫瘍効果が既に確認されている公知のｓｈＲＮＡ（ＷＯ２０１２／１６１１９６を参照）に基づいて、以下の配列を有するものを合成した。
　ＴＳ−ｓｈＲＮＡ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　一方、対照として標的となるｍＲＮＡが存在しない以下の配列を有するｓｈＲＮＡを用いた。以下、対照のｓｈＲＮＡを「ＮＳ−ｓｈＲＮＡ」と記載する。
　ＮＳ−ｓｈＲＮＡ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
（ＭＴＴアッセイ）
　本実験では９６ウェルプレートスケールで実験を行った。トランスフェクションは、カチオニックリポソームの一種であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｌｆ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸ）を、製造元の指示書に従い使用して行った。
　３００ｐｍｏｌの上記ｓｈＲＮＡ（ＴＳ−ｓｈＲＮＡ又はＮＳ−ｓｈＲＮＡ）と１５μＬのＬｆ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸをそれぞれ５００μＬになるようにＯｐｔｉＭＥＭで希釈し、両溶液を混合して１０~２０分間室温で放置し複合体（リポプレックス）を形成させた。あらかじめ２４時間前にヒト悪性胸膜中皮腫細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）懸濁液（２，０００細胞／１００μＬ）を播種しておいたウェルに、５０μＬのリポプレックスを添加し、最終合計容積を１５０μＬとした（ウェル中のｓｈＲＮＡ最終濃度は５ｎＭと１０ｎＭになるように調整した）。トランスフェクション開始から２４時間後、培地を除去し、既存の癌化学療法剤「アリムタ（ペメトレキセドナトリウム水和物：ＰＭＸ）」（イーライリリー）を０．０１μｇ／ｍＬの濃度で含む、又は当該癌化学療法剤を含まない新しい培地を２００μＬ添加した。新しい培地を添加して０、２４、４８、７２、９６時間後、培地を除去し、０．５％　ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）溶液を５０μＬ加え、４時間、３７℃、５％　ＣＯ２条件下でインキュベーションした。また細胞の入っていないウェルにも０．５％　ＭＴＴ溶液を加えバックグラウンドとした。
　インキュベーション終了後、それぞれのウェルに酸性イソプロパノール１５０μＬを加え、シェイカーを用いホルマザン結晶を溶解し、プレートリーダーを用いて、５７０ｎｍの波長で吸光度を測定し、細胞の増殖率を以下の式を用いて算出した。
　細胞の増殖率（％）＝［Ａ５７０（新しい培地を添加してＸ時間後）／Ａ５７０（新しい培地を添加して０時間後）］×１００
　結果を図１に示す。
　図１に示すとおり、ＴＳ−ｓｈＲＮＡはＰＭＸの存在下において、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞の増殖を時間依存的に顕著に阻害した。
［実施例２］
ＴＳ−ｓｈＲＮＡによるＴＳ発現抑制
（トランスフェクション）
　トランスフェクションは、カチオニックリポソームの一種であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｌｆ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸ）を、製造元の指示書に従い使用して行った。
　実施例１で調製したリポプレックスを本実施例においても用いた。
　ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞懸濁液１０ｍＬを１０ｃｍディッシュに５００，０００細胞／ディッシュとなるように添加し、あらかじめ２４時間培養を行った。これに各リポプレックスを直接添加し（最終合計容積は１５ｍＬ）とし、トランスフェクションを行った。このとき、ＴＳ−ｓｈＲＮＡまたはＮＳ−ｓｈＲＮＡの最終濃度が５ｎＭ又は１０ｎＭとなるように調整した。対照はｓｈＲＮＡで処理しなかった。トランスフェクションを開始してから３７℃、５％　ＣＯ２条件下、培地中で７２時間培養し、その後、以下の方法により細胞抽出液を調製した。
（細胞抽出液の調製）
　トランスフェクションを開始してから７２時間後、培地を除去し、冷ＰＢＳ（−）で洗浄した後、トリプシン溶液を用いて細胞をはがし、遠心して上清を取り除いた。さらに冷ＰＢＳ（−）で洗浄後、冷Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１％　ＮＰ−４０，０．２５％　デオキシコール酸ナトリウム，１５０ｍＭ　ＮａＣｌおよびＰｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ））を１００~１５０μＬ添加し、１時間、氷上（４℃）の条件下インキュベートして細胞を溶解した。その後、遠心分離し（１５，０００×ｇ、１５分間、４℃）、得られた上清を細胞抽出液とした。
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルの調製）
　上記細胞抽出液と２×サンプルバッファーを等量ずつ混合し、９５℃に設定したマイクロチューブ用ホットプレートを用いて３分間加熱した。その後３０秒間遠心し、室温で冷ましてＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
　上記サンプルを６μＬ（９μｇタンパク質／レーン）ずつ１２％ポリアクリルアミドゲルにアプライし、パワーサプライ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とつないでゲル２枚で４０ｍＡ（ゲル１枚では２０ｍＡ）の定電流で約８０分間電気泳動した。
（ウェスタンブロッティング）
　適当な大きさに切ったろ紙及びＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬを、前処理としてブロッティングバッファーに浸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、トランスファー装置を用いてタンパクをＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬに転写した。転写したＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬをブロッキングバッファー（５％スキムミルク）に浸して室温で１時間ブロッキングし、Ｔｗｅｅｎ　ｂｕｆｆｅｒで５分間３回洗浄した。
　ＴＳ及びβ−アクチンを検出するために、Ｔｗｅｅｎ　ｂｕｆｆｅｒで希釈したそれぞれの一次抗体（Ｍｏｕｓｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　ＴＳ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：１０００）（ＡＮＡＳＰＥＣ，Ｉｎｃ．ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｍｏｕｓｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　β−ａｃｔｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５００）（Ａｂｃａｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））を４℃で一晩反応させた。Ｔｗｅｅｎ　ｂｕｆｆｅｒで５分間３回洗浄後、Ｔｗｅｅｎ　ｂｕｆｆｅｒで希釈した二次抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２０００）（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＣＡ，ＵＳＡ））溶液を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ　ｂｕｆｆｅｒで５分間３回洗浄後、ＥＣＬ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ　Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）と約１分間反応させた。目的タンパク質のバンドはＬＡＳ−４０００ＥＰＵＶｍｉｎｉ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて可視化、撮影し、ソフトウエア（Ｍｕｌｔｉ　Ｇａｕｇｅ　ｖ．３．２（ＦｕｊｉＦｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））を用いて定量化した。
　結果を図２に示す。
　図２に示されるとおり、実施例１で調製したＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスが配列特異的かつ濃度依存的にＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞におけるＴＳの発現を顕著に抑制できることが明らかとなった。
［実施例３］
Ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ｓｈＲＮＡによるルシフェラーゼ発現抑制
（ルシフェラーゼ発現細胞株の作製）
　ホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発現プラスミド（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ、プロメガ社）及びウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発現プラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ、プロメガ社）のトランスフェクションは、カチオニックリポソームの一種であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌｆ　２０００）を用い、製造元の指示書に従い行った。
　ＨＴ−１０８０細胞懸濁液を１２ウェル細胞培養用プレートに１００，０００細胞／ウェル（１ｍＬ）となるように添加し、あらかじめ１２時間培養を行った。培養上清液の除去、ＰＢＳを用いた一回洗浄を行った後、それぞれのウェルに両ルシフェラーゼ発現プラスミドを含むトランスフェクション溶液（２００μＬ）を添加し、ルシフェラーゼ発現プラスミドのトランスフェクションを行った。このとき、各プラスミドの最終濃度が１μｇ／２００μＬとなるよう調整した。トランスフェクションを開始してから３７℃、５％　ＣＯ２条件下、培養を行った。
（カチオニックリポソームの調製）
　以下に示す方法によってカチオニックリポソームを調製した。
　リポソームを構成する脂質は以下より選択して使用した：ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＣ−６−１４（０，０′−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチル−アンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド）。これらの脂質はあらかじめクロロホルムで溶解させ、ストック溶液とした。
　脂質組成がＤＯＰＥ：Ｘ：ＤＣ−６−１４＝３：２：５（モル比，Ｘ＝ＤＯＰＣ又はＰＯＰＣ）となるようにそれぞれストック溶液からガラスシリンジを用いて正確に量り取り、栓付き試験管に入れ、混合した（総脂質量として２００ｍｍｏｌ）。次に、ロータリーエバポレーター（ＩＷＡＫＩ、東京）を用いて減圧下クロロホルムを除去し、その後、完全にクロロホルムを取り除くために試験管を一晩真空ポンプに入れ、試験管内に脂質薄膜を形成させた。この脂質薄膜に内水相として２ｍＬの９％　スクロース溶液（３０ｍＬ，ｐＨ７．４）を加え、３７℃で激しく攪拌することで脂質薄膜を完全に水和させ、ＭＬＶ（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）を得た（最終脂質濃度は１００ｍＭ）。この溶液を３７℃に加温しながら、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍのポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ，ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてエクストリュージョン法により粒子径が約１００ｎｍとなるＬＵＶ（ｌａｒｇｅ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）を調製した。
（ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を標的とするｓｈＲＮＡ）
　Ｌｕｃを標的とするｓｈＲＮＡ（以下、「Ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ」と記載する）は、以下の配列を有する。
　Ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ：
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（リポプレックスの調製）
　リポプレックスは、上記カチオニックリポソームとｓｈＲＮＡとをカチオニックリポソーム：ｓｈＲＮＡ＝８００，４００又は２００：１（モル比）となるように混合し、１０分間激しく攪拌することで調製した。ｓｈＲＮＡがカチオニックリポソームに完全に吸着しているかは、２％アガロースゲル上で電気泳動し、遊離のｓｈＲＮＡが存在していないことで確認した。
（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるルシフェラーゼ発現抑制）
　上記ルシフェラーゼ発現細胞株に、各リポプレックスをｓｈＲＮＡ量の最終濃度が５０ｎＭとなるようにそれぞれ投与し、３７℃、５％　ＣＯ２条件下、４８時間培養した。培養終了後、Ｄｕａｌ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて、製造元の指示書に用いて、細胞抽出液の調製、及びルシフェラーゼ活性の測定を行った。すなわち、培養終了後、培地を除去し、冷ＰＢＳ（−）で洗浄した後、Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒを１５０μＬ／ウェル添加し、旋回型シェーカーにより振盪しながら室温にて１５分間インキュベートして細胞を溶解した。その後サンプルチューブに移し、−８０℃、３０分間冷却した後、室温へと戻した。遠心分離し（９，０００×ｇ、３０秒間、４℃）、得られた上清を細胞抽出液とした。次いで、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＩＩ溶液を５０μＬずつ分注した９６ウェル白色マイクロプレートに対し、前述した細胞抽出液を１０μＬずつ加え、ピペットを用いて混和した。マイクロプレートをルミノメーターＩｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００　Ｐｒｏ（Ｔｅｃａｎ社）にセットし、ホタルルシフェラーゼ活性による化学発光を１０秒間測定した。測定後プレートを取り出し、各ウェルにＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ　Ｒｅａｇｅｎｔ溶液を５０μＬずつ加え、軽くボルテックスして混和後、すぐにルミノメーターを用いてウミシイタケルシフェラーゼ活性による化学発光を同様に測定した。データ解析には、ウミシイタケルシフェラーゼ活性値を内部コントロールとして標準化し、ｓｈＲＮＡ処理をしていない対照群に対する相対的ホタルルシフェラーゼ活性を求めて評価した。
　結果を図３に示す。なお、図３の結果は対照のルシフェラーゼ活性を１００％とする相対値にて示す。
　図３に示されるとおり、Ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ処理を行っていない対照群に比べ、ＤＯＰＣ又はＰＯＰＣを含むいずれのリポプレックスを用いた場合においてもルシフェラーゼ活性の低下がみられた。このことはＬｕｃ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスが、ＨＴ−１０８０細胞におけるルシフェラーゼ発現を抑制できることを示している。さらにＰＯＰＣ含むリポプレックスと比べて、ＤＯＰＣを含むリポプレックスのほうがＬｕｃ−ｓｈＲＮＡによる発現抑制効果が高いことが示された。さらに、Ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ：カチオニックリポソームのモル比は１：８００である場合に、Ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡによる発現抑制効果が高いことが示された。
［実施例４］
悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの確立
　２，２，２−トリブロモエタノール（Ａｖｅｒｔｉｎ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）麻酔下、ヌードマウス（５週齢、オス）の左胸腔内にルシフェラーゼを安定発現させたＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞）懸濁液を１００μＬ投与し、移植を行った。細胞の移植後３、７、１４、２１日後にイソフルランを用いた麻酔下、Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｓａｌｔ（Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）溶液１００μｌ（７．５ｍｇ／ｍｌ）を腹腔内に投与し、胸腔内で増殖したＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞の活性に依存した生物発光の強さをＩＶＩＳ（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて評価した。
　結果を図４に示す。
　図４に示されるとおり、移植後３日目にＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞の増殖に伴う生物発光が僅かに観察され、その後経時的に生物発光が増強した。本検討から、移植したＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞が胸腔内で十分増殖している事が明らかとなり、悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスを確立することができた。
［実施例５］
Ｉｎ　ｖｉｖｏでのｓｈＲＮＡ導入効果が高いカチオニックリポソームの選定
（カチオニックリポソームの調製）
　以下に示す方法によってカチオニックリポソームを調製した。
　リポソームを構成する脂質は以下より選択して使用した：ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン）、ＤＥＰＣ（１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＣ−６−１４（０，０′−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチル−アンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド）。これらの脂質はあらかじめクロロホルムで溶解させ、ストック溶液とした。
　脂質組成がＤＯＰＥ：Ｘ：ＤＣ−６−１４＝３：２：５（モル比）となるようにそれぞれストック溶液からガラスシリンジを用いて正確に量り取り、上記実施例３に示す方法に従ってカチオニックリポソームを調製した。リポソームの粒子径（動的光散乱法）及びゼータ電位（電気泳動光散乱法）はＮＩＣＯＭＰ　３７０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定した。リポソームの表面電荷は全て約＋５０ｍＶであった。
（ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を標的とするｓｈＲＮＡ）
　上記実施例３に示すＬｕｃ−ｓｈＲＮＡを使用した。
（リポプレックスの調製）
　リポプレックスは、上記カチオニックリポソームとｓｈＲＮＡとをカチオニックリポソーム：ｓｈＲＮＡ＝２０００：１（モル比）となるように混合し、１０分間激しく攪拌することで調製した。ｓｈＲＮＡがカチオニックリポソームに完全に吸着しているかは、２％アガロースゲル上で電気泳動し、遊離のｓｈＲＮＡが存在していないことで確認した。
　調製したリポプレックスの平均粒子径及びゼータ電位は、それぞれ約３５０ｎｍ及び約＋１５ｍＶであった。
（同所移植モデルマウスを用いたｉｎ　ｖｉｖｏでのルシフェラーゼ発現抑制）
　２，２，２−トリブロモエタノール（Ａｖｅｒｔｉｎ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）麻酔下、ヌードマウス（５週齢、オス）の左胸腔内にルシフェラーゼを安定発現させたＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞）懸濁液を１００μＬ投与した。細胞移植後、１０、１３、１６、１９日目に、胸腔内にリポプレックスをｓｈＲＮＡ量にして２０μｇ（５０μＬ）ずつ直接投与した。リポプレックスの最終投与２日後、イソフルランを用いた麻酔下、Ｄ−ルシフェリンカリウム塩溶液１００μＬ（７．５ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内に投与し、胸腔内で増殖したＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞の活性に依存した生物発光の強さをＩＶＩＳ（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で評価した。
　対照には９％スクロース溶液を投与した。
　結果を図５−１及び図５−２に示す。
　図５−１及び図５−２に示されるとおり、用いたカチオニックリポソームの脂質組成に応じてルシフェラーゼの発現抑制に差が生じる事が明らかとなり、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ／ＤＣ−６−１４（３：２：５）の脂質組成を持つカチオニックリポソームを用いて調製したリポプレックスが有意に最も強く胸腔内に移植したＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞中のルシフェラーゼの発現を抑制することが示された。
［実施例６］
Ｉｎ　ｖｉｖｏでのｓｈＲＮＡ導入における正電荷脂質（ＤＣ−６−１４含量）の影響
（カチオニックリポソームの調製）
　実施例３に示した方法に従って、リポソームを調製した。ただし、リポソームの脂質組成は、ＤＯＰＥ：ＰＯＰＣ：ＤＣ−６−１４＝３：２＋Ｘ：５−Ｘ（モル比，Ｘ＝０，１．５，３．０）とした。リポソームの粒子径および表面電荷はＮＩＣＯＭＰ　３７０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定した。調製したＬＵＶ（ｌａｒｇｅ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）の粒子径はすべて約１００ｎｍであることを確認した。また、その表面電荷はそれぞれ、２０％のＤＣ−６−１４を含むリポソームが約＋２５ｍＶ、３５％のＤＣ−６−１４を含むリポソームが約＋３５ｍＶ、５０％のＤＣ−６−１４を含むリポソームが約＋５０ｍＶであることを確認した。
（リポプレックスの調製）
　リポプレックスは、実施例３に示すＬｕｃ−ｓｈＲＮＡを実施例３に示す方法でリポソームと混合して調製した。リポプレックスの粒子径（動的光散乱法）及びゼータ電位（電気泳動光散乱法）はＮＩＣＯＭＰ　３７０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定した。２０％のＤＣ−６−１４を含むリポプレックスの粒子径は約３５０ｎｍ、表面電荷は約＋２５ｍＶであり、３５％のＤＣ−６−１４を含むリポプレックスの粒子径は約３５０ｎｍ、表面電荷は約＋３０ｍＶであり、５０％のＤＣ−６−１４を含むリポプレックスの粒子径は約３５０ｎｍ、表面電荷は約＋３５ｍＶであった。
（同所移植モデルマウスを用いたｉｎ　ｖｉｖｏでのルシフェラーゼ発現抑制）
　実施例５に示した方法にしたがい、調製したリポプレックスのｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子発現抑制効果（ｓｈＲＮＡ細胞内導入効率）を評価した。
　結果を図６−１及び図６−２に示す。
　図６−１及び図６−２に示されるとおり、リポソーム中の正電荷脂質（ＤＣ−６−１４）の量が増加するにつれ、リポプレックスのｉｎ　ｖｉｖｏにおけるルシフェラーゼ発現抑制効果が亢進されることが分かった。表面電荷の増加は、負に帯電したｓｈＲＮＡと複合体を形成する際に有利であるだけでなく、負に帯電した腫瘍細胞とも相互作用しやすくなり、結果として多量にかつ効率よくｓｈＲＮＡを細胞内に導入することができる。
［実施例７］
Ｉｎ　ｖｉｖｏでのｓｈＲＮＡ導入におけるＰＥＧ修飾の影響
（ＰＥＧ修飾カチオニックリポソームの調製）
　実施例３に示した方法に従って、リポソームを調製した。
　構成脂質は以下のものを使用した：ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−６−１４及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）。ＰＥＧ修飾リポソームの脂質組成はＤＯＰＥ：Ｘ：ＤＣ−６−１４：ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ＝３：２：５：０．１（モル比，Ｘ＝ＤＯＰＣ又はＰＯＰＣ）とし、ＰＥＧ未修飾リポソームの脂質組成はＤＯＰＥ：Ｘ：ＤＣ−６−１４＝３：２：５（モル比，Ｘ＝ＤＯＰＣ又はＰＯＰＣ）とし、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）を調製した。リポソームの粒子径はＮＩＣＯＭＰ　３７０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定した。ＤＯＰＣを含むリポソーム（ＰＥＧ未修飾リポソーム）の粒子径は約１００ｎｍであり、表面電荷は約＋５０ｍＶであった。ＰＯＰＣを含むリポソーム（ＰＥＧ未修飾リポソーム）の粒子径は約１１０ｎｍであり、表面電荷は約＋５０ｍＶであった。ＰＥＧ修飾したＤＯＰＣを含むリポソーム（ＰＥＧ修飾リポソーム）の粒子径は約１０６ｎｍであり、表面電荷は約＋５０ｍＶであった。ＰＥＧ修飾したＰＯＰＣを含むリポソーム（ＰＥＧ修飾リポソーム）の粒子径は約１００ｎｍであり、表面電荷は約＋５０ｍＶであった。
（リポプレックスの調製）
　リポプレックスは、実施例３に示すＬｕｃ−ｓｈＲＮＡをＰＥＧ修飾リポソーム又はＰＥＧ未修飾リポソームと実施例３に示す方法で混合して調製した。リポプレックスの粒子径（動的光散乱法）及びゼータ電位（電気泳動光散乱法）はＮＩＣＯＭＰ　３７０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定した。ＤＯＰＣを含むリポプレックスの粒子径は約３５０ｎｍであり、表面電荷は約＋３０ｍＶであった。ＰＯＰＣを含むリポプレックスの粒子径は約３６０ｎｍであり、表面電荷は約＋３０ｍＶであった。ＤＯＰＣを含むＰＥＧ修飾したリポプレックスの粒子径は約３７０ｎｍであり、表面電荷は約＋３０ｍＶであった。ＰＯＰＣを含むＰＥＧ修飾したリポプレックスの粒子径は約３７０ｎｍであり、表面電荷は約＋３０ｍＶであった。
（同所移植モデルマウスを用いたｉｎ　ｖｉｖｏでのルシフェラーゼ発現抑制）
　実施例５に示した方法にしたがい、調製したＰＥＧ修飾リポプレックス又はＰＥＧ未修飾リポプレックスのｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子発現抑制効果（ｓｈＲＮＡ細胞内導入効率）を評価した。
　結果を図７−１及び図７−２に示す。
　図７−１及び図７−２に示されるとおり、用いたカチオニックリポソームの脂質組成によらず、ＰＥＧ修飾を施すことにより、リポプレックスのルシフェラーゼの発現抑制効果が抑制されることが明らかとなった。静脈内投与時にはＰＥＧ化は必須であるが、胸腔内投与時にはＰＥＧ修飾は寧ろｓｈＲＮＡの細胞内導入効率を抑制することが示された。
［実施例８］
ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスの胸腔内投与による悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスにおける腫瘍増殖抑制効果
（悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスの確立）
　ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞を用いた悪性胸膜中皮腫同所移植モデルマウスは実施例３に示した方法で作製し、移植細胞が十分定着した移植７日目のマウスをｉｎ　ｖｉｖｏ実験に供した。
（カチオニックリポソームの調製）
　実施例３に示した方法に従って、リポソームを調製した。ただし、リポソームの脂質組成は、ＤＯＰＥ：ＰＯＰＣ：ＤＣ−６−１４＝３：２：５とした。
（リポプレックスの調製）
　リポプレックスは、実施例１に示すｓｈＲＮＡを上記リポソームと実施例３に示す方法で混合して調製した。リポプレックスの粒子径（動的光散乱法）及びゼータ電位（電気泳動光散乱法）はＮＩＣＯＭＰ　３７０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定した。ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックス（以下、「ＴＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックス」と記載する）の粒子径は約４００ｎｍ、表面電荷は約＋３０ｍＶであった。一方、ＮＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックス（以下、「ＮＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックス」と記載する）の粒子径は約４００ｎｍ、表面電荷は約＋３０ｍＶであった。
（ＴＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックスの腫瘍増殖抑制効果の評価）
　上記ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞担がんマウスに対し、ＴＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックス又はＮＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックスを腫瘍移植後７日目から１７日目まで隔日に合計６回胸腔内に直接投与した。一回の投与あたり、２０μｇ　ｓｈＲＮＡ／１００μＬを投与した。
　既存の癌化学療法剤「アリムタ（ペメトレキセドナトリウム水和物（ＰＭＸ））」（イーライリリー）を併用する場合には、２５ｍｇ／ｋｇの用量で、腫瘍移植後７日目から１１日目まで毎日、その後２日あけて同量を１４日目から１８日目まで毎日、合計１０回腹腔内に投与した。
　対照には９％スクロース溶液を投与した。
　制がん活性（細胞増殖抑制活性）は、実施例５に示すように、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞移植後２１日目にイソフルランを用いた麻酔下、Ｄ−ルシフェリンカリウム塩溶液１００μＬ（７．５ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内に投与し、胸腔内で増殖したＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞の活性に依存した生物発光の強さをＩＶＩＳ（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で評価した。
　制がん効果に基づく延命効果に関しては、上述のＩＶＩＳによる評価に供したモデルマウスをそのまま治療なしの状態で細胞移植後４７日目まで継続して飼育することで評価した。
　平均生存期間（Ｍｅａｎ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｔｉｍｅ（ＭＳＴ）（ｄａｙ））は以下の式に基づいて算出した。
　ＭＳＴ（ｄａｙ）＝最初の死亡日＋最後の死亡日／２
　生存期間増加率（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｌｉｆｅ　ｓｐａｎ（％））は以下の式に基づいて算出した。
　ＩＬＳ（％）＝［処置群の平均生存期間／対照群の平均生存期間］×１００
　結果を図８−１及び図８−２、並びに図８−３及び図８−４に示す。
　図８−１及び図８−２に示されるとおり、対照群と比較して、ＮＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックスを単独で用いて処置した群では、全く腫瘍増殖抑制効果は示されなかった。一方、ＴＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックス又はＰＭＸを単独で用いて処置した群では約５０％の腫瘍増殖抑制効果が確認された。また、ＮＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックスをＰＭＸと併用して処置した群では、ＰＭＸ単独投与群で見られたのとほぼ同じ腫瘍増殖抑制効果が見られただけであったが、ＴＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックス及びＰＭＸを併用して処置した群においては約９０％という有意に顕著な腫瘍増殖抑制効果が示された。
　延命効果に関しては、図８−３及び図８−４に示されるとおり、対照群と比較して、ＮＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックスを単独で用いて処置した群では、ほとんど延命効果は示されなかった。一方、ＴＳ−ｓｈＲＡＮリポプレックス又はＰＭＸを単独で用いて処置した群ではわずかに延命効果（１２０~１２６％）が示された。また、ＮＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックスをＰＭＸと併用して処置した群では、ＰＭＸ単独投与群で見られたのとほぼ同じ延命効果（１２２％）が見られただけであったが、ＴＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックス及びＰＭＸを併用して処置した群において上述の腫瘍増殖抑制効果を反映した最大の延命効果（１７８％）が確認された。
　なお、いずれの処置群においても体重増加抑制を含む、重篤な毒性は認められなかった。
［実施例９］
ＴＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックスの胸腔内投与による標的遺伝子発現抑制の検討
　実施例８と同様に処置された各群のマウスについて、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞移植後２１日目にＩＶＩＳによる評価を行った後、マウスを犠牲死させ、胸腔より腫瘍細胞を回収し、回収した腫瘍細胞内のＴＳ遺伝子の発現抑制状況を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて評価した。
　腫瘍細胞からのＲＮＡの抽出はＲＮａｑｕｅｏｕｓ−ｍｉｃｒｏ　ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を用い、製造元が推奨する方法にしたがって行った。ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写は、ＲＮＡに対してＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を添加して行った。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ　ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、逆転写したｃＤＮＡを鋳型として用い、試薬としてＦａｓｔＳｔａｒｔ　ＴａｑＭａｎ　Ｐｒｏｂｅ　Ｍａｓｔｅｒ（ＲＯＸ）とＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、を用い、製造元が推奨する方法にしたがって行った。ＧＡＰＤＨを内部標準として用いた。
　結果を図９に示す。
　図９に示されるとおり、対照群と比較して、ＮＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックスを単独で処置した群では、全くＴＳ遺伝子の抑制効果は見られなかった。一方、ＴＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックス又はＰＭＸを単独で用いて処置した群ではそれぞれ約５０％、約２５％のＴＳ遺伝子抑制効果が見られた。また、ＮＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックスをＰＭＸと併用して処置した群では、ＰＭＸ単独投与群とほぼ同じ約２０％程度のＴＳ遺伝子抑制効果が確認されただけであった。一方、実施例８において最も高い腫瘍増殖抑制効果を示したＴＳ−ｓｈＲＮＡリポプレックスとＰＭＸを併用して処置した群では、高い効果を反映し、残胸腔内にほとんど腫瘍細胞が残っていなかったことから、ＴＳ遺伝子の発現変化を測定することはできなかった。
［実施例１０］
Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのｓｈＲＮＡ導入における脂質混合物の形態が与える影響
カチオニックプレソームの調製
　構成脂質組成比は前述の実施例３と同じく、ＤＯＰＥ：Ｘ：ＤＣ−６−１４＝３：２：５（Ｘ＝ＤＯＰＣ又はＰＯＰＣ）を用いた。
　脂質組成が上記のものとなるようそれぞれの脂質を量り取り、総脂質の１０倍重量のシクロヘキサン、およびシクロヘキサンの２重量％のエタノールを加え、７０℃の温水中で溶解した。溶解液を０．２μｍのＰＴＦＥメンブレンフィルターを用いてろ過し、ろ過された溶液をドライアイス／アセトンにて凍結させた。完全に凍結させた後、真空ポンプを用いて１２時間以上真空乾燥を行ない、カチオニックプレソームを得た。
　実験に用いるカチオニックプレソーム溶液は、上記の方法で得られたカチオニックプレソームに、最終脂質濃度が１００ｍＭとなるよう９％スクロース溶液（ｐＨ７．４）を加え、１０分間激しく撹拌することにより調製した。このカチオニックプレソームの平均粒子径は約４４０±２１０（平均±標準偏差）ｎｍであった。
リポプレックス、プレプレックスの調製
　リポプレックス及びプレプレックスの調製には、それぞれ実施例３で示したカチオニックリポソーム、及び上記カチオニックプレソームを使用した。リポプレックス及びプレプレックスに搭載するｓｈＲＮＡは、ルシフェラーゼを標的とする、実施例３で記したＬｕｃ−ｓｈＲＮＡを用いた。
　カチオニックリポソームまたはカチオニックプレソームと、Ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡをモル比にして１６００：１または８００：１となるよう混合し、１０分間激しく撹拌することによりＬｕｃ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックス及びプレプレックスをそれぞれ調製した。
ＨＴ−１０８０細胞に対するトランスフェクション
　トランスフェクション試薬にはカチオニックリポソームの一種であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　２０００（以下、「Ｌｆ２０００」と記載）を使用した。また、ホタル由来およびウミウシ由来のルシフェラーゼを発現する発現プラスミドとしてｐＧＬ３−Ｃ、及びｐＲＬ−ＴＫ（プロメガ）をそれぞれ使用した。
　両ルシフェラーゼ発現プラスミド１５μｇ＋１５μｇ、及びＬｆ２０００　３０μＬにそれぞれ７５０μＬになるようにＯｐｔｉＭＥＭを加えて希釈し、次いで両溶液を混合して１０−２０分間室温で放置しＬｕｃ−ｌｉｐｏｐｌｅｘを形成させた。
　予め２４時間前にヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）懸濁液（１０，０００　ｃｅｌｌ／ｍｌ）を播種しておいた１２ｗｅｌｌプレートより培養液を除いた後、上記Ｌｕｃ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ　１００μＬを加え、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で５時間培養した。
　５時間後、培養液を除き、冷ＰＢＳ（−）で一回洗浄後、新しいＤＭＥＭ培地９００μＬと共に、Ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックス溶液又はＬｕｃ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するプレプレックス溶液１００μＬ（各ｗｅｌｌ中のｓｈＲＮＡ最終濃度は５０ｎＭ）を加え、３７℃、５％　ＣＯ２条件下でさらに４８時間培養した。
ルシフェラーゼ活性測定
　ルシフェラーゼ活性の測定にはＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および９６ｗｅｌｌマイクロプレートを使用した。４８時間培養後、培地を除去し、冷ＰＢＳ（−）で一回洗浄後、Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　１５０μＬをウェルに直接添加し細胞を溶解した。凍結融解を一度行ない、遠心分離（１０，０００ｘｇ、３０秒、４℃）後、得られた上清を細胞抽出液とした。
　各ウェルにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＩＩ　５０μＬと細胞抽出液１０μＬを加え、マイクロプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ２００（登録商標）Ｐｒｏ（Ｔｅｃａｎ社）を用いてホタルルシフェラーゼ活性による生物発光量を測定した。その後、Ｓｔｏｐ　＆　Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ　５０μＬをさらに加え、同様にウミウシルシフェラーゼ活性を同様に測定した。
　ホタル由来ルシフェラーゼの相対活性は、Ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ未処理のものと比較して以下のような式を用いて算出した。
　ホタル由来ルシフェラーゼ相対活性（％）＝（ホタルルシフェラーゼ活性／ウミウシルシフェラーゼ活性）／（Ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ未処理群のホタルルシフェラーゼ活性／Ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ未処理群のウミウシルシフェラーゼ活性）ｘ　１００
　結果を図１０に示す。
　図１０に示すようにＤＯＰＣ、ＰＯＰＣのどちらを含む場合においても、Ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスに比べＬｕｃ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するプレプレックスの形態の方がルシフェラーゼの発現をより抑制した。またプレプレックス投与群において、ＰＯＰＣよりもＤＯＰＣを含むプレプレックスの方が発現抑制効率が若干高かった。
［実施例１１］
ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスおよびプレプレックスの胸腔内投与による悪性胸膜中皮腫同所移植モデルにおける腫瘍増殖抑制効果
悪性胸膜中皮腫同所移植モデルの確立
　ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞を用いた悪性胸膜中皮腫同所移植モデルは前述の実施例４に示した方法を用いて作製し、移植４日日のマウスをｉｎ　ｖｉｖｏ実験に供した。
ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスおよびプレプレックスの調製
　上述の実施例１０で示す方法に従い、脂質組成がＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＤＣ−６−１４＝３：２：５からなるカチオニックリポソームおよびカチオニックプレソームを調製した。また実施例１に記すＴＳに対するｓｈＲＮＡと混合し、リポプレックス（ＴＳ−リポプレックス）およびプレプレックス（ＴＳ−プレプレックス）を調製した。なおリポソームまたはプレソームとｓｈＲＮＡとのモル比は２０００：１とした。調製したＴＳ−リポソーム、ＴＳ−プレプレックスの平均粒子径はそれぞれ約２１０±１００、６３０±４００（平均±標準偏差）ｎｍであった。
ＴＳ−ｓｈＲＮＡを外膜表面に結合するリポプレックスおよびプレプレックスの腫瘍増殖抑制効果の評価
　腫瘍移植後、４、７、１０、１３、１６日目において、ＴＳ−リポプレックス又はＴＳ−プレプレックスをｓｈＲＮＡ量で２０μｇ（５０μＬ）を胸腔内に直接投与した。
　既存の化学療法剤「アリムタ（ペメトレキセドナトリウム水和物（ＰＭＸ））」（イーライリリー）を併用する場合には、２５ｍｇ／ｋｇの用量で、腫瘍移植後４日目から８日目まで毎日、その後２日あけて同量を１１日目から１５日目まで毎日、合計１０回腹腔内投与を行なった。
　ＴＳ−リポプレックスまたはＴＳ−プレプレックスの最終投与の２日後（腫瘍移植後１８日日）、ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅを用いた麻酔下、Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｓａｌｔ溶液１００μＬ（７．５ｍｇ／ｍｌ）を腹腔内に投与し、胸腔内で増殖したＭＳＴＯ−２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ活性に依存した生物発光の強さをＩＶＩＳ（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で評価した。
　実施結果を図１１に示す。
　未処置の対照群と比較して、ＰＭＸ単独を用いて処置した群ではあまり腫瘍増殖抑制効果が見られなかった。一方、ＴＳ−リポプレックス又はＴＳ−プレプレックス単独を用いた群においては、対照群およびＰＭＸ単独投与群に比べ、明らかに高い腫瘍抑制効果が見られた。さらに、ＴＳ−リポプレックス又はＴＳ−プレプレックスとＰＭＸを併用した群において最も高い腫瘍抑制効果が観察されたが、リポプレックスとプレプレックスで効果に大きな違いは確認されなかった。
　図１２は上述のＩＶＩＳによる評価を行なった時点でのマウス体重を測定したものであるが、すべての群において統計学的な差は得られず、このことは今回用いた投与法に重篤な毒性が見られないことが示唆された。
　本発明に係るリポソームは、活性成分を搭載させ局所投与することにより、投与部及び／又はその周辺の限局した細胞に効率的に活性成分を送達することができる。また、本発明に係るリポソームに、活性成分として腫瘍の増殖を抑制することができるＲＮＡｉ分子を搭載させ、腫瘍及び／又はその周辺に局所投与することにより、腫瘍細胞に効率的にＲＮＡｉ分子を送達することができ、当該腫瘍の増殖を効率的に抑制することができる。本発明はドラッグデリバリーの分野において、また癌治療の分野において大いに貢献することが期待される。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (16)

  1. 　ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルコリン及びカチオン性脂質からなり、該ホスファチジルコリンが以下の（ｉ）−（ｉｉｉ）より選択される一以上の特徴を有する、局所投与用リポソーム：
    （ｉ）炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む；
    （ｉｉ）シス型の炭素‐炭素間の二重結合を含む不飽和脂肪鎖を少なくとも一つ含む；
    （ｉｉｉ）相転移温度が０℃未満。
  2. 　カチオン性脂質が０，０’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４）である、請求項１に記載のリポソーム。
  3. 　ホスファチジルコリンが１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、パルミトイルオエオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、又は１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）である、請求項１に記載のリポソーム。
  4. 　ホスファチジルコリンがＤＯＰＣである、請求項１に記載のリポソーム。
  5. 　ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ及びＤＣ−６−１４からなる、請求項１に記載のリポソーム。
  6. 　ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ及びＤＣ−６−１４が、３：２：５のモル比で含まれる、請求項５に記載のリポソーム。
  7. 　請求項１~６のいずれか１項に記載のリポソームと活性化合物を含む組成物。
  8. 　活性化合物が核酸である、請求項７に記載の組成物。
  9. 　核酸がリポソームの外膜表面に結合している、請求項８に記載の組成物。
  10. 　請求項１~６のいずれか１項に記載のリポソームとＲＮＡｉ作用によりチミジル酸合成酵素の発現を抑制することができるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）とを含む、抗腫瘍剤。
  11. 　ｓｈＲＮＡがリポソームの外膜表面に結合されている、請求項１０に記載の抗腫瘍剤。
  12. 　ｓｈＲＮＡが配列番号８で表される塩基配列からなる、請求項１０に記載の抗腫瘍剤。
  13. 　癌化学療法又は癌化学療法剤と併用される、請求項１０に記載の抗腫瘍剤。
  14. 　請求項１０~１３のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤と癌化学療法剤とを含む、組み合わせ物。
  15. 　癌化学療法剤が、ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤である、請求項１４に記載の組み合わせ物。
  16. 　ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤が、５−ＦＵ系抗腫瘍剤又はペメトレキセドナトリウム水和物である、請求項１５に記載の組み合わせ物。
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