TW202417049A - 寡核苷酸遞送劑、藥物組合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
公開了一種寡核苷酸遞送劑，其包括直接或間接偶聯到單鏈寡核苷酸的至少一個脂質部分，所述脂質部分包含至少一個直鏈烷基或直鏈烯基，所述寡核苷酸遞送劑可被遞送到各種物件，例如肌肉、心臟、肝等，並且具有增強的效率，並因此改進靶基因的表達調控。還公開了包含寡核苷酸遞送劑的藥物組合物以及使用藥物組合物調控靶基因的表達的方法。
Description
本公開涉及基因表達調控技術領域，具體涉及用於有效遞送寡核苷酸的獨特的寡核苷酸遞送劑。
寡核苷酸是目前正在積極開發的一類新興治療劑，用於通過多種不同的作用機制（MOA）治療多種疾病。寡核苷酸治療劑的主要類別包括單鏈反義寡核苷酸（ASO）和雙鏈體（雙鏈）RNA（dsRNA），例如siRNA和saRNA。
ASO有兩種主要類型。一種被稱為「gapmer」 ASO，其通過RNA酶H機制降解靶mRNA，從而抑制基因表達。gapmer ASO具有支持RNA酶H活性所需的中心DNA區域和兩個核糖核苷酸翼以增加ASO對靶序列的結合親和力。另一類ASO是空間位阻劑，其通常由具有硫代磷酸酯(PS)主鏈的核糖核苷酸均勻組成，並與細胞核中的前體mRNA結合，通過阻止某些蛋白質與mRNA結合（例如剪接因數）而改變mRNA加工（例如，mRNA剪接、翻譯和核輸出）。此類ASO已成功治療可通過糾正異常剪接錯誤來改善的疾病，並已獲得美國食品和藥品監督管理局(FDA)的批准，包括用於治療脊髓性肌萎縮症(SMA)的含外顯子的ASO藥品SPINRAZA®和用於治療杜氏肌營養不良症(DMD)的4外顯子跳躍ASO藥品。
ASO是可自我遞送的分子，無需額外遞送促進劑，其在幾種類型的器官和組織中生物利用度有限。然而，它們通常需要高的系統或組織濃度才能達到治療有效性，如此高的濃度通常與毒性相關，導致治療窗口較小。到目前為止，批准的PS-ASO藥品主要是局部給藥，包括眼睛和CNS（中樞神經系統），因此可以實現高的局部濃度而不必擔心全身毒性[Vitravene研究組，Safety of intravitreous fomivirsen for treatment of cytomegalovirus retinitis in patients with AIDS（玻璃體內注射福米韋森治療愛滋病患者巨細胞病毒性視網膜炎的安全性）
. Am J Ophthalmol(2002);
US20180273943A1;及Stein, C. A. 和D. Castanotto. 2017年FDA批准的寡核苷酸療法（FDA-Approved Oligonucleotide Therapies in 2017）.
Mol Thera(2017)]。全身性ASO藥品主要是通過IV給藥的基於嗎啉基的低聚物（PMO），用於治療杜氏肌營養不良症（DMD）。由於其分子結構中的中性嗎啉基環，PMO與PS-ASO相比通常具有更寬的安全範圍，並且可以以非常高的劑量給予患者。儘管如此，治療功效仍然有限[P Duda、GA Laforet等人，evelopment of Phosphorodiamidate Morpholino Oligomers (PMOs) for the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD)（開發用於治療杜氏肌營養不良症 (DMD)的磷酸二醯胺嗎啉低聚物 (PMO)）(S42.008)，
Neurology(2017)]。長期以來不斷需要改進的基於寡核苷酸的遞送機制來應對這些挑戰。
經過不懈的探索，本發明人開發了一種獨特的寡核苷酸遞送劑，其可以增強ASO的體內活性，特別是在存在巨大未滿足醫療需求的肌肉中。
本公開提供了一種寡核苷酸遞送劑，其包括直接或間接偶聯到寡核苷酸的一個或多個脂質部分，其中，至少一個脂質部分包含至少一個C
6-C
22直鏈烷基和/或烯基，優選至少一個C12、C14、C15、C16、C18或C20直鏈烷基或烯基，並且寡核苷酸是單鏈寡核苷酸，優選反義寡核苷酸（ASO）。在一個特定的實施方式中，提供了一種寡核苷酸遞送劑，其具有由式A表示的結構：
式A
其中，脂質部分包含至少一個C
6-C
22直鏈烷基或烯基，M是1至5的整數，寡核苷酸是至少一個單鏈寡核苷酸，並且N是1、2或3的整數；並且遞送增強化合物（DEC）部分是包含至少一個含氮雜環、至少一個含氮直鏈基團、至少一個含氮直鏈碳環基團或其組合的二價到六價部分，並且脂質部分和寡核苷酸各自直接或間接偶聯到遞送增強化合物部分。
本文還提供了一種包含本公開的寡核苷酸遞送劑的藥物組合物，所述藥物組合物可以任選地包括附加成分，例如藥學上可接受的載體、賦形劑、溶劑、稀釋劑、穩定劑、分散劑、緩衝劑、增容劑、防腐劑及其組合。
本文還提供了一種調控物件的靶基因表達的方法，其中，所述方法包括：在測定或治療性處理的情況中，向物件給予本公開的藥物組合物的步驟，或者在測定的情況中，使藥物組合物與細胞接觸的步驟。
應理解，前面的一般性描述和下面的具體實施方式都只是示例性和解釋性的，不對要求保護的本發明構成限制。
與現有技術的寡核苷酸遞送技術相比，新開發的寡核苷酸遞送劑能夠將所需量或更高水準的寡核苷酸更有效地遞送到上述所指示的靶標組織處的作用位元點，並因此可以改善生物活性和藥理學特性(例如，生物分佈、生物利用度、藥代動力學、活性、效力等）。在一些實施方式中，通過改善生物屏障的通過、更高的蛋白質結合、更好的細胞攝取、內體中更少的截留、更少的溶酶體降解、更高的效力和/或更長的持續時間/半衰期，可以引起生物活性特性的改善。在一些實施方式中，藥理學性質的改善還可以得到較低的毒性、較低的劑量、較低的給藥頻率和較少的不期望的免疫應答。在一些實施方式中，本公開的寡核苷酸遞送劑涉及更簡單的合成過程，因此在製造上有更好的可加工性和擴展性。在一些實施方式中，本公開的寡核苷酸遞送劑具有遊離苯並咪唑或苯並咪唑衍生物的固有藥理學特性，其是質子泵或者以質子泵(作為可逆和不可逆質子泵抑制劑，PPI)、多巴胺受體(例如，DRD)、血管緊張素II 1型受體(AT1)、組胺受體(HRH)、雙特異性有絲分裂原啟動蛋白激酶(例如，MEK)和/或細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)等為靶標。在一些實施方式中，固有的藥理學性質能夠使本公開的寡核苷酸遞送劑潛在地用於藥物中，包括消化性潰瘍、高血壓、精神分裂症、寄生蟲感染、細菌感染、病毒感染、癌症等。
在一些實施方式中，本文公開的新開發的寡核苷酸遞送劑可促進遞送有效量的寡核苷酸，以在靶標組織或細胞中實現功能，例如，在中樞神經系統（例如，腦和脊髓）、心臟、眼、耳、肝、肺、腎、脾、脂肪組織、腸、胰腺、膽囊、肌肉（例如，平滑肌、骨骼肌和心肌）、隔膜、胸主動脈和骨骼中。在一些實施方式中，與現有技術的技術相比，寡核苷酸遞送劑的調控活性，例如上調或下調細胞中靶基因的表達，可以得到改善。因此，根據本文提供的發現，本領域技術人員應理解，使用本文所述的寡核苷酸遞送劑可以促進治療性寡核苷酸在如上所述的各種靶標或細胞中具有改善的生物分佈，以預防、治療和/或延遲各種疾病、失調和/或病症的發作。
除非另有說明，本文所用的所有科技術語與本發明所屬領域普通技術人員所理解的通常含義相同。而且，本文中提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都通過引用納入。
如本文所公開的，諸如「一個/種」和「該」包括複數物件，除非在上下文中另行明確規定。
如本文所公開的，術語「大約」、「約」、「基本上」和類似術語旨在具有與本公開主題所涉及的領域中的普通技術人員通常可接受的用法相一致的廣泛含義。
如本文所公開的，「和/或」表示「和，或作為替代」。如果給出任何數值範圍，則範圍包括該範圍中的任何數值（包括上限值和下限值），並且包括該範圍中的任何子範圍。例如，從1到3的範圍可以包括數值1、2和3中的任何數值，以及從1到2和從2到3的子範圍。
如本文所使用的，術語「寡核苷酸」、「多核苷酸」或「寡聚物」可互換使用，且指核苷酸的聚合物，具體指DNA、RNA或DNA/RNA雜合體的單鏈核酸分子，含有規則和不規則交替去氧核糖基部分和核糖基部分的寡核苷酸鏈，以及針對此類寡核苷酸的經修飾和天然或非天然存在的框架，例如，磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸（PMO）。
如本文所使用的，術語「互補」指在兩個寡核苷酸鏈之間形成堿基對的能力。堿基對一般通過反向平行的寡核苷酸鏈中的核苷酸之間的氫鍵形成。互補的寡核苷酸鏈的堿基可以Watson-Crick方式（例如A對T、A對U和C對G）或以允許形成同源或異源雙鏈體的任何其他方式（例如通過Hoogsteen或反向Hoogsteen堿基配對的RNA-RNA或DNA-RNA雙鏈體）來配對。
如本文所使用的，術語「
SMN2FLmRNA」或「
SMN2 Δ 7mRNA」是指由
SMN2基因的表達或者
SMN2基因的轉錄所產生的信使RNA (mRNA)。
如本文所使用的，大寫的「
SCN9A」或「
SCN9A基因」是指人類基因；而首字母大寫的「
Scn9a」或「
Scn9a基因」是指小鼠基因。
如本文所使用的，術語「
SCN9AmRNA」是指由
SCN9A基因的表達或者
SCN9A基因的轉錄所產生的信使RNA (mRNA)。
如本文所使用的，大寫的「
DMD」或「
DMD基因」是指人類基因。
本公開至少部分還涉及一種反義寡核苷酸(ASO)，其包含長度範圍為12至30個連續核苷酸的寡核苷酸序列，其中
SMN2基因的寡核苷酸序列選自SEQ ID NO:1和他們的寡核苷酸遞送劑SEQ ID NO:2-21，其中ASO以
SMN2基因的前體mRNA為靶標，通過將外顯子7包含到成熟mRNA中來調節其剪接，從而將細胞中的SMN2Δ7（即，刪除了外顯子7的SMN2)「轉化」為SMN2FL (即，包括外顯子7的全長
SMN2) mRNA，從而提高SMN2FL mRNA編碼的SMN蛋白水準。
本公開至少部分還涉及一種反義寡核苷酸（ASO），其包含長度範圍為12至30個連續核苷酸的寡核苷酸序列，其中所述寡核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 22的等長部分具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%互補性的核苷酸序列，其中，相比於
SCN9AmRNA水準的基線，ASO抑制至少50%的
SCN9A基因的mRNA轉錄物。
本發明人還發現，
SCN9AmRNA轉錄物中包含3'-UTR區域的最佳反義寡核苷酸(ASO)序列所包括的序列具有：(1) 40%至70%的GC含量；(2) 少於5個連續相同核苷酸；(3) 少於3個二核苷酸或三核苷酸重複；和(4)不在
SCN9AmRNA的5’ UTR區域上。作為有益結果，與
SCN9AmRNA水準的基線相比，靶序列(例如，包含靶序列的分離的核酸序列)抑制至少50%的
SCN9A基因的mRNA轉錄物。
本申請的某些實施方式涉及
SCN9AmRNA轉錄物中包含3'-UTR區域的ASO靶序列，其中該mRNA轉錄物中的靶序列與選自SEQ ID NO: 23-141的核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或至少100%的同源性。
本申請的某些實施方式還涉及包含單鏈寡核苷酸序列的ASO，所述單鏈寡核苷酸序列與選自化學修飾的SEQ ID NO: 261-379和SEQ ID NO: 388及SEQ ID NO: 390的核苷酸序列，以及它們的未修飾的裸序列SEQ ID NO: 142-260具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的同源性或者100%相同，其中，相比於
SCN9AmRNA水準的基線，所述ASO將
SCN9A基因的mRNA轉錄物抑制至少50%。
本申請的某些實施方式還涉及包含單鏈寡核苷酸序列的ASO，所述單鏈寡核苷酸序列與選自寡核苷酸遞送劑SEQ ID NO: 389和SEQ ID NO: 391的核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的同源性或者100%相同，其中，相比於
SCN9AmRNA水準的基線，所述ASO將
SCN9A基因的mRNA轉錄物抑制至少50%。
本公開至少部分還涉及反義寡核苷酸（ASO），其包含長度範圍為12至30個連續核苷酸的寡核苷酸序列，其中寡核苷酸序列包含的核苷酸序列與SEQ ID NO:392的等長部分具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、95%或100%的互補性，其中，相比於
DMD外顯子51跳躍水準的基線，所述ASO使
DMD基因的外顯子51跳躍水準增強至少30%。
發明人還發現，
DMD外顯子51區域內的最佳反義寡核苷酸（ASO）序列所包括的序列具有：(1)40%至70%的GC含量；(2)少於5個連續相同核苷酸；(3)少於3個二核苷酸或三核苷酸重複。作為有益結果，與
DMD外顯子51跳躍水準的基線相比，靶序列(例如，包含靶序列的分離的核酸序列)使
DMD基因的外顯子51跳躍水準增強至少30%。
本申請的某些實施方式涉及
DMD外顯子51區域中的ASO靶序列，其中，外顯子51區域中的靶序列與選自SEQ ID NO: 393-442的核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或至少100%的同源性。
本申請的某些實施方式還涉及包含單鏈寡核苷酸序列的ASO，所述單鏈寡核苷酸序列與選自寡核苷酸遞送劑SEQ ID NO: 493-542及它們的未經修飾的裸序列SEQ ID NO: 443-492的核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的同源性或者100%相同，其中，相比於
DMD外顯子51跳躍水準的基線，所述ASO使
DMD基因的外顯子51跳躍水準增強至少30%。
本文還提供了包含本公開的寡核苷酸遞送劑的載體和細胞。在一些實施方式中，細胞是哺乳動物細胞，任選是人細胞。在一些實施方式中，細胞是宿主細胞。在一些實施方式中，細胞是體外的。在一些實施方式中，細胞存在於哺乳動物體內。
在各個實施方式中，寡核苷酸遞送劑包含長度為15至35個核苷酸的單鏈寡核苷酸，例如，長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個核苷酸的單鏈寡核苷酸。
在各個實施方式中，寡核苷酸遞送劑包含脂質部分，其是C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20直鏈的飽和或不飽和烴基，例如，直鏈烷基或直鏈烯基。所述直鏈烯基可以包含一至四個烯屬不飽和基團，例如一個或兩個烯屬不飽和基團。在示例性實施方式中，脂質部分包含2-十二烯基、3-十二烯基、4-十二烯基、5-十二烯基、6-十二烯基、7-十二烯基、8-十二烯基、9-十二烯基、10-十二烯基、2-十六烯基、3-十六烯基、4-十六烯基、5-十六烯基、6-十六烯基、7-十六烯基、8-十六烯基、9-十六烯基、10-十六烯基、11-十六烯基、12-十六烯基、2-十八烯基、3-十八烯基、4-十八烯基、5-十八烯基、6-十八烯基、7-十八烯基、8-十八烯基、9-十八烯基、10-十八烯基、11-十八烯基、12-十八烯基、4,7-十六碳二烯基、5,8-十六碳二烯基、6,9-十六碳二烯基、7,10-十六碳二烯基、5,8-十八碳二烯基、6,9-十八碳二烯基或7,10-十八碳二烯基。
在某些實施方式中，不飽和脂質部分包含在烯基中的至少一個順式不飽和雙鍵。在某些實施方式中，不飽和脂質部分包含在烯基中的至少一個反式不飽和雙鍵。
在各個實施方式中，寡核苷酸遞送劑包含直接或間接偶聯到寡核苷酸的一 個或多個脂質部分。如本文中所使用的，術語「間接偶聯到寡核苷酸的脂質部分」是指脂質和寡核苷酸均偶聯到相同的DEC部分的實施方式，其中，DEC部分與寡核苷酸之間的連接可以是共價鍵或連接部分，例如下文中所列的那些。
另一方面，術語「直接偶聯到寡核苷酸的脂質部分」是指寡核苷酸遞送劑不包括DEC部分，因此脂質和寡核苷酸通過共價鍵或者連接部分（例如下文所列的那些）彼此連接的實施方式。
在一些實施方式中，寡核苷酸遞送劑具有由式A表示的結構，其中，脂質部分通過DEC部分與寡核苷酸偶聯，其中，M是指脂質部分的數目，其是1、2、3、4或5的整數，N是指偶聯到寡核苷酸的DEC化合物的數目，其是1、2或3的整數。在一個示例性實施方式中，遞送增強化合物部分是包含至少一個含氮雜環的二價到六價部分，並且脂質部分和寡核苷酸各自偶聯到遞送增強化合物部分。在另一個實施方式中，遞送增強化合物部分是二價、三價、四價、五價或六價部分。優選地，遞送增強化合物部分的價態等於M+1。更優選地，遞送增強化合物部分是二價、三價或四價部分。
如本文所用，術語「遞送增強化合物」和「DEC」可互換使用並且指能夠衍生出遞送增強化合物部分的化合物。
在示例性實施方式中，DEC中包含的含氮雜環可以具有下式中任一者所示的核心結構，其中，為了簡化起見，省略了與核心結構的環原子連接的所有化學鍵、原子和取代基：
上述所示的核心結構包括不同的環原子，並且稠環核心結構可以是電中性或者以例如鋶或季銨的形式局部帶電。可以看出，由於離域π電子共軛效應，稠環核心結構中的一個或多個不飽和雙鍵可能會發生移動，並且所有取代基，包括存在/不存在的任何取代基，可根據取代基所連接的每個環原子的類別和價態而變化。例如，另外的取代基可以連接至作為稠合環核心結構的環原子存在的鋶或季銨離子。所有這些變化都在本公開的構思之內。
在一個實施方式中，所述至少一個脂質部分與DEC部分的連接（即，脂質部分和遞送增強化合物部分的組合，LDEC）可形成由式A’表示的結構
式A’
其中脂質部分包含至少一個C
6-C
22直鏈烷基或烯基，例如至少一個C
8-C
18直鏈烷基或烯基、或至少一個（例如，一個、兩個或三個）C
10-C
12直鏈烷基或烯基，DEC部分和M如上文所定義。
衍生出式A’表示的結構的示例性化合物具體如下文所定義，並且DEC部分的定義可通過從式A’表示的結構中減去所述至少一個脂質部分而清楚且毫無疑義地確定。
在一個實施方式中，由式A’表示的結構源自由式I或式II表示的結構，例如，通過從式I或式II表示的結構中減去至少一個氫原子或至少一個末端基團得到。根據實施方式，末端基團可以選自羥基、羧基、酯基、醚基、烷基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基、硫酸酯基、磺酸酯基、醯胺基、醯基及其組合。
式I 式II
其中，每個
獨立地表示共價單鍵或雙鍵；每次出現的X是選自碳、氮、氧和硫的原子；F、G、H和I各自獨立地選自碳、氮、氧和硫。
在一個實施方式中， m是1、2或3的整數，n是1、2或3的整數，並且m+n=4。在一些示例性實施方式中， m=1且n=3; or m=2且n=2; or m=3且n=1.
在一個實施方式中，C在每次出現時或者不存在或者選自下組：氫；鹵原子，例如氟、氯、溴或碘；羥基；(C
1-C
20)烷基，例如-(C
2-C
19)烷基、或-(C
3-C
18)烷基、或-(C
4-C
16)烷基、或-(C
6-C
12)烷基、或-(C
8-C
10)烷基；(C
1-C
20)烷氧基，例如-(C
2-C
19)烷氧基、或-(C
3-C
18)烷氧基、或-(C
4-C
16)烷氧基、或-(C
6-C
12)烷氧基；鹵代(C
1-C
20)烷基，例如鹵代(C
2-C
19)烷基、或鹵代(C
3-C
18)烷基、或鹵代(C
4-C
16)烷基、或鹵代(C
6-C
12)烷基、或鹵代(C
8-C
10)烷基；和鹵代(C
1-C
20)烷氧基，例如鹵代(C
1-C
20)烷氧基，例如鹵代(C
2-C
19)烷氧基、或鹵代(C
3-C
18)烷氧基、或鹵代(C
4-C
16)烷氧基、或鹵代(C
6-C
12)烷氧基、或鹵代(C
8-C
10)烷氧基；其中 「鹵代」可以是氟化、氯代、溴代、碘代或其組合。在一個實施方式中，在式I表示的結構中，每個B連接到F、G、H和I中的任一者，而C連接到F、G、H和I中的剩餘者。在一個實施方式中，B連接到H且三個C'分別連接到F、G和I中的每一者。在另一個實施方式中，B連接到G且三個C'分別連接到F、H和I中的每一者。在另一個實施方式中，B連接到F且三個C'分別連接到G、H和I中的每一者。在另一個實施方式中，B連接到I且三個C'分別連接到F、G和H中的每一者。在另一個實施方式中，兩個B'分別連接到G和H，且兩個C’分別連接到F和I中的每一者。
在一個實施方式中，B在每次出現時獨立地選自下組：羥基；-C(O)OH；-P(O)
2-OH；-P(O)-OH；-P(O)(S)-OH；-CN；-(C
1-C
22)烷基，例如-(C
2-C
20)烷基、或-(C
3-C
16)烷基、或-(C
6-C
12)烷基；-O-(C
1-C
22)烷基，例如-O-(C
2-C
20)烷基、或-O-(C
3-C
16)烷基、或-O-(C
6-C
12)烷基；-(C
1-C
22)烯基，例如-(C
2-C
20)烯基、或-(C
3-C
16)烯基、或-(C
6-C
12)烯基；-(C
1-C
22)亞烷基-OH，例如-(C
2-C
20)亞烷基-OH、或-(C
3-C
16)亞烷基-OH、或-(C
6-C
12)亞烷基-OH；-(C
3-C
22)亞環烷基-OH，例如-(C
5-C
16)亞環烷基-OH、或-(C
6-C
12)亞環烷基-OH、或-(C
6-C
10)亞環烷基-OH；-(C
6-C
22)亞芳基-OH；-(C
6-C
22)亞雜芳基-OH；-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH，例如-(C
2-C
18)亞烷基-C(O)OH、或-(C
3-C
16)亞烷基-C(O)OH、或-(C
6-C
12)亞烷基-C(O)OH；-(C
3-C
22)亞環烷基-C(O)OH；-(C
6-C
22)亞芳基-C(O)OH；-(C
5-C
22)亞雜芳基-C(O)OH；-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)NH
2，例如-O-C(O)-(C
2-C
18)亞烷基-C(O)NH
2、或-O-C(O)-(C
3-C
16)亞烷基-C(O)NH
2、或-O-C(O)-(C
6-C
12)亞烷基-C(O)NH
2；-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)NH
2，例如-(C
2-C
18)亞烷基-O-C(O)-(C
2-C
18)亞烷基-C(O)NH
2、或-(C
3-C
16)亞烷基-O-C(O)-(C
3-C
16)亞烷基-C(O)NH
2、或-(C
6-C
12)亞烷基-O-C(O)-(C
6-C
12)亞烷基-C(O)NH
2；-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH；-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH；-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)NH
2；-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)NH
2；-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-OH；-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH；-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH；-(C
1-C
30)亞烷基-P(O)
2-OH；-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN，例如-(C
2-C
18)亞烷基-O-P(-N(C
2-C
18烷基)
2)-O-(C
2-C
18)亞烷基-CN、或-(C
3-C
16)亞烷基-O-P(-N(C
3-C
16烷基)
2)-O-(C
3-C
16)亞烷基-CN、或-(C
6-C
12)亞烷基-O-P(-N(C
6-C
12烷基)
2)-O-(C
6-C
12)亞烷基-CN；-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH；-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2；-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH；-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN；-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH；-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
30)亞烷基-C(O)OH；-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2；-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN；-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH；-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH；-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2；-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)-OH；-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)(S)-OH和-(C
1-C
22)亞烷基-CN。B中包含的(C
1-C
22)烷基或(C
1-C
22)亞烷基各自可以是包含1至22個碳原子、或2至20個碳原子、或3至16個碳原子、或4至12個碳原子、或6至12個碳原子、或8至10個碳原子的烷基或亞烷基。
在一個實施方式中，A
1、A
2和A
3中的每一者或者不存在或者是獨立選自下組的取代基：-H、-OH、-O-R
1、-SH、-(C
1-C
22)烷基、鹵代-(C
1-C
22)烷基、-(C
2-C
22)烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烯基-OH、-(C
3-C
22)環烷基、-(C
3-C
22)環烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
3-C
22)環烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烯基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-R
1、-(C
1-C
22)亞烯基-O-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-COOR
1、-(C
1-C
22)亞烯基-COOR
1、-C(O)O-R
1、-O-(C
1-C
22)烷基、-S-(C
1-C
22)烷基、-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-O-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-O-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-R
1、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-O-金剛烷基、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C
1-C
22)烷基、-CH(NH-CO-(C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-CH(NH-CO-鹵代(C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C
1-C
22)烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
1-C
6環氧烷基)
(1-20)-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-C(O)NH-(C
1-C
22)烷基、-C(O)NH-R
1、-C(O)NR
2-R
1、-C(O)NH-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-C(O)NH-(C
1-C
22)亞烷基-COOH、-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-NH-C(O)-R
1、-NR
2-C(O)-R
1、-O-P(O)
2-O-R
1、-OP(O)(S)-O-R
1、-O-P(O)-O-R
1、-NH-R
1、-NR
2-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)O-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)- NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
30)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)(S)-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-CN、取代或未取代的吡咯、取代或未取代的吡咯啉、取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的吡唑啉、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的咪唑、取代或未取代的噁唑、取代或未取代的噻唑、取代或未取代的苯並吡咯、取代或未取代的苯並吡咯啉、取代或未取代的苯並吡咯烷、取代或未取代的苯並吡唑、取代或未取代的苯並吡唑啉、取代或未取代的苯並吡唑烷、取代或未取代的苯並咪唑、取代或未取代的苯並噁唑、取代或未取代的苯並噻唑，其中，當上述環被取代時，取代基可以包括羥基、鹵原子（例如氟、氯、溴或碘）、(C
1-C
16)烷基、(C
1-C
12)烷氧基；以及由式III表示的取代基，
式III
在一個實施方式中，Y選自碳、氮、氧和硫；並且P、Q、S和T中的每一者獨立地選自碳、氮、氧和硫；並且星號是指由式III表示的取代基與由式I或式II表示的結構連接的位元點。
在一個實施方式中，R
3、R
4和R
5中的每一者或者不存在或者是獨立選自下組的取代基：-H、-OH、-O-R
1、-SH、-(C
1-C
22)烷基、鹵代-(C
1-C
22)烷基、-(C
2-C
22)烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
3-C
22)環烷基、-(C
3-C
22)環烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
3-C
22)環烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-COOR
1、-C(O)O-R
1、-O-(C
1-C
22)烷基、-S-(C
1-C
22)烷基、-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-O-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-O-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-R
1、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-O-金剛烷基、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C
1-C
22)烷基、-CH(NH-CO-(C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-CH(NH-CO-鹵代(C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C
1-C
22)烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
1-C
6環氧烷基)
(1-20)-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-C(O)NH-(C
1-C
22)烷基、-C(O)NH-R
1、-C(O)NR
2-R
1、-C(O)NH-(C
1-C
22)亞烷基-OH、 -C(O)NH-(C
1-C
22)亞烷基-COOH、-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-NH-C(O)-R
1、-NR
2-C(O)-R
1、-O-P(O)
2-O-R
1、-OP(O)(S)-O-R
1、-O-P(O)-O-R
1、-NH-R
1、-NR
2-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)O-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)- NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
30)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)(S)-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-CN、取代或未取代的吡咯、取代或未取代的吡咯啉、取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的吡唑啉、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的咪唑、取代或未取代的噁唑、取代或未取代的噻唑、取代或未取代的苯並吡咯、取代或未取代的苯並吡咯啉、取代或未取代的苯並吡咯烷、取代或未取代的苯並吡唑、取代或未取代的苯並吡唑啉、取代或未取代的苯並吡唑烷、取代或未取代的苯並咪唑、取代或未取代的苯並噁唑和取代或未取代的苯並噻唑，其中當上述環被取代時，取代基可以包括羥基、鹵原子（例如氟、氯、溴或碘）、(C
1-C
16)烷基、(C
1-C
12)烷氧基。
在一個實施方式中，R
7在每次出現時連接到P、Q、S和T中的任一者，並且其或者不存在或者選自氫、鹵原子、羥基、(C
1-C
20)烷基、(C
1-C
20)烷氧基、鹵代(C
1-C
20)烷基和鹵代(C
1-C
20)烷氧基。
在一個實施方式中，p是0、1、2或3的整數。
在一個實施方式中，R
6連接到P、Q、S和T中的任一者，並且其選自直接鍵、-O-、-C(O)O-、-O-C(O)-、-P(O)
2-O-、-O-P(O)
2-O-、-P(O)(S)-O-、-O-P(O)(S)-O-、-O-P(O)-O-、-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-O-、-O-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-、-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-C(O)-O-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
30)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-、-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、 -C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、 -C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-、-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、 -(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-O-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-O-、-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-O-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、 -NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-、-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、 -(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)
2-O-、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(O)
2-O-、-(C
3-C
22)亞環烷基-、-(C
3-C
22)亞環烷基-O-、-O-(C
3-C
22)亞環烷基-、-(C
6-C
22)亞芳基-、-(C
6-C
22)亞芳基-O-、-O-(C
6-C
22)亞芳基-、-(C
6-C
22)亞芳基-NH-、-NH-(C
6-C
22)亞芳基-、-C(O)-(C
6-C
22)亞芳基-、-(C
6-C
22)亞芳基-C(O)-、-C(O)-O-(C
6-C
22)亞芳基-、-(C
6-C
22)亞芳基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C
6-C
22)亞芳基-和-C(O)-NH-(C
6-C
22)亞芳基-C(O)-O-。
在一個實施方式中，R
1在每次出現時獨立地選自氫、羥基、-(C
1-C
22)烷基、-(C
3-C
22)環烷基、-(C
6-C
22)芳基、-(C
1-C
22)烷氧基、-(C
3-C
22)環烷氧基、-(C
6-C
22)芳氧基、-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-OC(O)(C
1-C
22)烷基、-C(O)-O-(C
1-C
22)烷基、-C(O)-(C
3-C
22)環烷基、-OC(O)-(C
3-C
22)環烷基、-C(O)-O-(C
3-C
22)環烷基、-C(O)-(C
6-C
22)芳氧基、-OC(O)-(C
6-C
22)芳氧基、-C(O)-O-(C
6-C
22)芳氧基、-C(O)-磷酸酯基團、磷酸二酯基團、亞磷醯胺基團、飽和脂肪酸基團、不飽和脂肪酸基團、脂質、PEG、類固醇、親脂物質、碳水化合物、膽固醇、金剛烷、胺基酸、肽、氯喹和生物鹼。
在一個實施方式中，R
2在每次出現時獨立地選自下組：鹵原子、(C
1-C
12)烷基、(C
1-C
12)烷氧基、(C
1-C
12)烷氧基羰基、(C
6-C
16)芳基或(C
6-C
16)芳氧基羰基。
在一個實施方式中，A
1、A
2、A
3、B、C、R
1、R
2、R
3、R
4、R
5、R
6和R
7中包含的一個或多個羥基、羧基、氨基、腈基和磷酸基團可被末端保護基R
P保護，所述末端保護基R
P選自下組：(C
1-C
22)烷基、(C
1-C
22)烷氧基、(C
1-C
22)烷基羰基、(C
1-C
22)烷氧基羰基、(C
6-C
22)芳基、(C
6-C
22)芳氧基、(C
6-C
22)芳基羰基、(C
6-C
22)芳氧基羰基、三((C
1-C
22)烷基)甲矽烷基和三((C
1-C
22)烷氧基)甲矽烷基，其中保護基R
p中包含的(C
1-C
22)烷基可以是包含1至22個碳原子，例如2至20個碳原子、或3至18個碳原子、或4至16個碳原子、或6至12個碳原子的烷基；R
p中包含的(C
1-C
22)烷氧基可以是包含1至22個碳原子，例如2至20個碳原子、或3至18個碳原子、或4至16個碳原子、或6至12個碳原子的烷氧基；R
p中包含的(C
6-C
22)芳基可以是包含6至22個碳原子，例如6至20個碳原子、或6至18個碳原子、或6至16個碳原子、或6至12個碳原子、或8-10個碳原子的芳基；R
p中包含的(C
6-C
22)芳氧基可以是包含6至22個碳原子，例如6至20個碳原子、或6至18個碳原子、或6至16個碳原子、或6至12個碳原子、或8-10個碳原子的芳氧基。
在一個實施方式中，A
1、A
2和A
3不同時為氫並且R
3、R
4和R
5不同時為氫。在一個示例性實施方式中，X是碳，且A
1、A
2和A
3均存在。在另一個實施方式中，X是氮，A
1和A
2均存在並且A
3不存在。在另一個實施方式中，X是帶正電荷的氮（即，季銨），並且A
1、A
2和A
3均存在。在另一個實施方式中，X是硫或氧，A
1和A
3均不存在且A
2存在。在另一個實施方式中，X是帶正電荷的硫（即，鋶），A
2和A
3均存在且A
1不存在。
在一個實施方式中，A
1、A
2、A
3、R
1、R
2、R
3、R
4、R
5、R
6和R
7中包含的(C
1-C
22)烷基或(C
1-C
22)亞烷基各自可以是包含1至22個碳原子、或2至20個碳原子、或3至16個碳原子、或4至12個碳原子、或6至12個碳原子、或8至10個碳原子的烷基或亞烷基。
在一個實施方式中，A
1、A
2、A
3、B、C、R
1、R
2、R
3、R
4、R
5、R
6和R
7中包含的一個或多個羥基、羧基、氨基、腈基和磷酸基團可與支援材料連接，所述支援材料選自下組：二氧化矽、矽膠、玻璃、陶瓷、聚合物、纖維素及其組合。在一些實施方式中，固體材料是珠的形式。.所述珠可以由任何材料製造，包括但不限於磁珠、順磁珠、矽膠珠、瓊脂糖珠等。
在一個實施方式中，A
1、A
2、A
3、R
3、R
4和R
5中的至少一者對應於如上所述的脂質部分。在另一個實施方式中，A
1、A
2、A
3、R
3和R
4中的一者、二者或三者對應於如上所述的脂質部分。在另一個實施方式中，式A’的結構不包括R
3、R
4和R
5並且A
1、A
2和A
3中的至少一者對應於脂質部分。
在另一個實施方式中，本公開的化合物可以具有由式IV至式XIII中任一者表示的結構：
式IV 式V 式VI 式VII
式VIII 式IX 式X
式XI 式XII 式XIII。
其中A
1、A
2、A
3、B、C、F、G、H、I、m和n如上文所定義。
在一些實施方式中，寡核苷酸遞送劑是包含至少一個含氮直鏈基團、至少一個含氮直鏈-碳環基團或其組合的化合物。在一些示例性實施方式中，遞送增強化合物部分可以包括選自下組的結構：-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
3-C
12)亞環烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
16)亞烷基-(C
3-C
12)亞環烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
16)亞烷基-(C
3-C
12)亞環烷基-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
3-C
12)亞環烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
16)亞烷基-(C
3-C
12)亞環烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
16)亞烷基-(C
3-C
12)亞環烷基-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-；例如-(C
2-C
12)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
2-C
12)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
2-C
12)亞烷基-O-(C
2-C
12)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
2-C
12)亞烷基-O-(C
2-C
12)亞烷基-O-(C
2-C
12)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
3-C
8)亞環烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
12)亞烷基-(C
3-C
8)亞環烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
12)亞烷基-(C
3-C
8)亞環烷基-(C
1-C
12)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
2-C
12)亞烷基-O-(C
2-C
12)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
2-C
12)亞烷基-O-(C
1-C
12)亞烷基-O-(C
1-C
12)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
3-C
8)亞環烷基-C(O)-NH-、-(C
2-C
12)亞烷基-(C
3-C
8)亞環烷基-C(O)-NH-、-(C
2-C
12)亞烷基-(C
3-C
8)亞環烷基-(C
2-C
12)亞烷基-C(O)-NH-；或-(C
1-C
6)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
6)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
6)亞烷基-O-(C
1-C
6)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
6)亞烷基-O-(C
1-C
6)亞烷基-O-(C
1-C
6)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
3-C
6)亞環烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
6)亞烷基-(C
3-C
6)亞環烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
6)亞烷基-(C
3-C
6)亞環烷基-(C
1-C
6)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
6)亞烷基-O-(C
1-C
6)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
6)亞烷基-O-(C
1-C
6)亞烷基-O-(C
1-C
6)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
3-C
6)亞環烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
6)亞烷基-(C
3-C
6)亞環烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
6)亞烷基-(C
3-C
6)亞環烷基-(C
1-C
6)亞烷基-C(O)-NH-。
在另一個實施方式中，當上述所指的取代基中的任何一個或多個取代基包含至少一個雙鍵時，雙鍵及連接到雙鍵的原子或部分各自可以是E形式或Z形式。
在一些實施方式中，脂質部分和/或遞送增強化合物部分中包含的至少一個氫原子（即，H）被氘原子（即，D）取代。在一個示例性實施方式中，脂質部分和/或遞送增強化合物部分包含1至20個氘原子，例如，1至15、或1至12、或1至10、或1至8、或1至6、或1至3、或1至2個氘原子。在一個示例性實施方式中，脂質部分和/或遞送增強化合物部分中包含的1摩爾%至100摩爾%、或2摩爾%至90摩爾%、或5摩爾%至80摩爾%、或10摩爾%至70摩爾%、或20摩爾%至60摩爾%、或30摩爾%至50摩爾%、或40摩爾%至45摩爾%的氫原子被氘原子取代。在另一個示例性實施方式中，氘取代率可在通過組合上文所述的端點值中的任何兩個端點值所獲得的數值範圍內。
在一個示例性實施方式中，式A’表示的脂質部分和遞送增強化合物部分的組合例如可通過從下述化合物C1至化合物C71中任一者中減去至少一個氫原子或末端基團得到：
其中
表示如上文所定義的支持材料。
在一個實施方式中，本公開的寡核苷酸遞送劑中包含的寡核苷酸可選自反義寡核苷酸(ASO)、反義RNA、短幹擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小啟動RNA(saRNA)、dsRNA、小嚮導RNA(sgRNA)和磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸（PMO）。優選地，所述寡核苷酸是反義寡核苷酸（ASO）。
根據本公開的另一些實施方式，式A’所表示的結構通過共價鍵與寡核苷酸連接或者通過至少一個連接部分與寡核苷酸連接，以形成寡核苷酸遞送劑。根據本公開的另一些實施方式，所述至少一個脂質（即，所述直鏈烷基或烯基）通過共價鍵或者通過至少一個連接部分與寡核苷酸連接，以形成寡核苷酸遞送劑。 在一個實施方式中，當存在時，連接部分可選自下組：-O-、-S-、-C(O)-、-NH-、-N((C
1-C
12)烷基)-、-N((C
1-C
12)烷基)-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-O-、-C(O)-NH-、-OP(O)
2O-、-P(O)(O
-)O-、-OP(O)O-、-OP(O)(S)O-、-OP(O)(S
-)O-、-O-S(O)
2-O-、-S(O)
2-O-、-S(O)-O-、-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-、-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-、-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-NH-(C
1-C
22)亞烷基-NH-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)O-、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-O-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)
2O-、-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)(O
-)O-、-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)(O
-)O-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)O-、-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)(S)O-、-(C
1-C
22)亞烷基-O-S(O)
2-O-、-(C
1-C
22)亞烷基-S(O)
2-O-、-(C
1-C
22)亞烷基-S(O)-O-、-O-P(O)
2-O-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)
2O-、-O-P(O)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)O-、-OP(O)(S)O-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)(S)O-、-O-S(O)
2-O-(C
1-C
22)亞烷基-O-S(O)
2-O-、-S(O)
2-O-(C
1-C
22)亞烷基-S(O)
2-O-和-O-S(O)-(C
1-C
22)亞烷基-S(O)-O-；其中，連接部分中包含的-(C
1-C
22)亞烷基-可以是包含1至22個碳原子，例如2至20個碳原子、或3至18個碳原子、或4至16個碳原子、或5至12個碳原子、或6至10個碳原子的亞烷基。
在一個實施方式中，寡核苷酸遞送劑可以包括一個、兩個或三個（即，N=1、2或3）個式A’的結構，它們各自分別通過一個、兩個或三個如上所述的連接部分與寡核苷酸連接。例如，寡核苷酸遞送劑可以具有由下式AI至AVII中任一者表示的結構：
式AI 式AII
式AIII 式AIV 式AV
式AVI 式AVII
其中，L表示連接部分，
表示由式A’表示的脂質部分和遞送增強化合物部分的組合，
表示單鏈寡核苷酸，並且a、b和c各自獨立地為1至50的整數，例如2至45的整數、或3至40的整數、或4至35的整數、或5至30的整數、或10至20的整數。各個連接部分，以及式A’表示的脂質部分和遞送增強化合物部分的組合可以在單鏈寡核苷酸的3’端、5’端或者任何中間位置，例如第n個核苷酸處連接。
在一個實施方式中，遞送增強化合物的取代基A
1、A
2、A
3、B和C中的一者或多者可以與連接部分連接或者與寡核苷酸連接（當連接部分是直接鍵時）。例如，A
1、A
2、A
3、B中的任一者，優選A
2或B與連接部分或寡核苷酸連接。不限於任何理論，上述取代基中的一種或多種末端基團（例如DMTrO-C
1-C
22亞烷基-或-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN）可以裂解或水解以暴露活性位點（例如-(C
1-C
22)亞烷基-OH基團），其接著通過連接部分（例如-P(O)(O
-)O-或-OP(O)(S
-)O-）與寡核苷酸連接。例如，寡核苷酸遞送劑的示例性結構包括O1至O20，在如下所示的隨後的實施例和附圖中，它們分別被稱為RD-14644、RD-14645、RD-14646、RD-15865、RD-16070、RD-16071、RD-16072、RD-16073、RD-16074、RD-16075、RD-16076、RD-16077、RD-16078、RD-16079、RD-16080、RD-16081、RD-16098、RD-16935、RD-16936和RD-16937，其中，Y表示O或S原子。
O1 (RD-14644, 源自化合物C1)
O2 (RD-14645, 源自化合物C2)
O3 (RD-14646, 源自化合物C1 and C2)
O4 (RD-15865, 源自C55)
O5 (RD-16070, 源自C56)
O6 (RD-16071, 源自C57)
O7 (RD-16072, 源自C58)
O8 (RD-16073, 源自C59)
O9 (RD-16074, 源自C60)
O10 (RD-16075, 源自C61)
O11 (RD-16076, 源自C62)
O12 (RD-16077, 源自C63)
O13 (RD-16078, 源自C64)
O14 (RD-16079, 源自C65)
O15 (RD-16080, 源自C66)
O16 (RD-16081, 源自C67)
O17 (RD-16098, 源自C68)
O18 (RD-16935, 源自C69)
O19 (RD-16936, 源自C70)
O20 (RD-16937, 源自C71)
可見在寡核苷酸遞送劑O1、O2和O3的結構中，遞送增強化合物各自通過連接部分，例如–OP(O)
2O-、(–P(O)(O
-)-O-)或(-P(O)(S
-)-O-，在3’端和5’端中的一者或兩者處連接到單鏈RNA（包括但不限於ASO）。
本公開的另一實施方式提供了包含寡核苷酸遞送劑的藥物組合物。在另一實施方式中，所述藥物組合物可以包含一種或多種附加成分，例如藥學上可接受的載體、賦形劑、溶劑、稀釋劑、穩定劑、分散劑、緩衝劑、增容劑、防腐劑及其組合。
本公開的另一實施方式提供了一種在體外或體內調控靶基因的表達的方法，所述方法包括向物件給予藥物組合物，或者使物件的細胞與藥物組合物接觸的步驟。例如，估計寡核苷酸遞送劑和藥物組合物可施用到各種器官、組織和細胞中，例如中樞神經系統（例如腦和脊髓）、心臟、眼、耳、肝、肺、腎、脾、脂肪組織、腸、胰腺、膽囊、肌肉（例如平滑肌、骨骼肌和心肌）、隔膜、胸主動脈和骨骼，並且調控其細胞中的一個或多個靶基因的表達。在一些實施方式中，寡核苷酸遞送劑中包含的寡核苷酸以選自
SMN2、
SCN9A、
Scn9a和
DMD的一個或多個基因為靶標
。在一些具體的實施方式中，以
SMN2為靶標的寡核苷酸遞送劑中包含的寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:1的寡核苷酸序列的至少部分。在一些具體的實施方式中，以
SCN9A為靶標的寡核苷酸遞送劑中包含的寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:142-260、SEQ ID NO:261-379、SEQ ID NO:388和SEQ ID NO:390的寡核苷酸序列的至少部分。在一些具體的實施方式中，以
DMD為靶標的寡核苷酸遞送劑中包含的寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:443-492的寡核苷酸序列的至少部分。
本公開的另一實施方式提供了包含寡核苷酸遞送劑的藥物組合物，其能夠治療肌肉系統疾病。在另一個實施方式中，肌肉系統疾病包括原發性肌肉系統疾病，例如多發性肌炎，皮肌炎，肌營養不良，例如，杜氏（Duchenne）肌營養不良症、貝克爾（Becker）肌營養不良症、先天性肌營養不良症、強直性肌營養不良症、肢帶型肌營養不良症、埃默里-德賴弗斯（Emery-Dreifuss）肌營養不良症、遠端肌營養不良症和眼咽肌營養不良症，重症肌無力,肌萎縮側索硬化症（ALS），脊髓性肌萎縮症（SMA），橫紋肌溶解症,心肌病和肌少症。在另一個實施方式中，肌肉系統疾病包括繼發性肌肉系統疾病，例如由傳染病、內分泌紊亂或腺體疾病、代謝性疾病如糖尿病、免疫性疾病如HIV/AIDS和血管疾病引起的肌肉疾病。
本公開的另一個實施方式提供了包含寡核苷酸遞送劑的藥物組合物在製備治療肌肉疾病的藥物中的應用，所述肌肉疾病包括肌肉癌，例如肉瘤，神經肌肉疾病如肌萎縮側索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎縮症(SMA)，自身免疫性疾病，如重症肌無力(MG)，以及各種類型的肌病、多發性肌炎引起的炎性肌無力、心血管疾病如冠狀動脈疾病、慢性疼痛性疾病如纖維肌痛、遺傳性疾病如肌營養不良症（例如杜氏肌營養不良症、貝克爾肌營養不良症、先天性肌營養不良症、強直性肌營養不良症、肢帶型肌營養不良症、埃默里-德賴弗斯（Emery-Dreifuss）肌營養不良症、遠端肌營養不良症和眼咽肌營養不良症、肌纖維感染性損傷如萊姆（Lyme）病、瘧疾和洛磯山斑疹熱、損傷引起的肌肉拉傷和癱瘓，以及由藥物或對藥物或有毒物質的嚴重過敏反應引起的肌肉疼痛。
具體實施方式
一個具體的實施方式包括一種寡核苷酸遞送劑，其包括直接或間接偶聯到寡核苷酸的一個或多個脂質部分，其中，至少一個脂質部分包含至少一個C
6-C
22直鏈烷基、至少一個C
6-C
22直鏈烯基或其組合，並且寡核苷酸是單鏈寡核苷酸。
在另一個具體的實施方式中，脂質部分包含C
12-C
20直鏈烷基、C
12-C
20烯基或其組合，並且C
12-C
20烯基包含一個或多個烯屬不飽和基團。
在另一個具體的實施方式中，C
6-C
22直鏈烷基選自：直鏈十二烷基、直鏈十四烷基、直鏈十五烷基、直鏈十六烷基、直鏈十八烷基、直鏈二十烷基、直鏈十二烯基、直鏈十四烯基、直鏈十五烯基、直鏈十六烯基、直鏈十八烯基、直鏈二十烯基、直鏈十二碳二烯基、直鏈十四碳二烯基、直鏈十五碳二烯基、直鏈十六碳二烯基、直鏈十八碳二烯基、直鏈二十碳二烯基。
在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸是單鏈寡核苷酸。
在另一個具體的實施方式中，單鏈寡核苷酸的長度為15至35個寡核苷酸。
在另一個具體的實施方式中，脂質部分通過共價鍵直接偶聯到單鏈寡核苷酸或者通過具有以下結構的連接部分連接到單鏈寡核苷酸：
其中Y
1是氧或硫，星號（*）是指連接部分連接到單鏈寡核苷酸的位置，並且雙星號（**）是指連接部分連接到脂質部分的位置。
在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸遞送劑具有由式A表示的結構：
式A
其中脂質部分包含至少一個C
6-C
22直鏈烷基、至少一個C
6-C
22直鏈烯基或其組合，並且M是1至5的整數，寡核苷酸是單鏈寡核苷酸，並且N是1、2或3的整數；並且
遞送增強化合物部分是包含至少一個含氮雜環、至少一個含氮直鏈基團、至少一個含氮直鏈-碳環基團或其組合的二價到六價部分，並且脂質部分和寡核苷酸各自直接或間接偶聯到遞送增強化合物部分。
在另一個具體的實施方式中，脂質部分是C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20直鏈的飽和或不飽和烴基，並且M是1、2、3、4或5的整數。
在另一個具體的實施方式中，不飽和脂質部分具有在烴基中的至少一個順式或反式不飽和雙鍵。
在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸是至少一個單鏈寡核苷酸，其選自反義寡核苷酸(ASO)、反義RNA、短幹擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、細胞質小RNA(scRNA)、小嚮導RNA(sgRNA)和磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸（PMO）。
在另一個具體的實施方式中，式A’表示的脂質部分和遞送增強化合物部分的組合具有的結構可通過從式I或式II表示的結構減去至少一個氫原子或末端基團獲得，其中，末端基團選自羥基、羧基、酯基、醚基、磷酸酯基、膦酸酯基、硫酸酯基、磺酸酯基、醯胺基、醯基及其組合，並且前提是A
1、A
2、A
3、R
3、R
4和R
5中的至少一者是C
6-C
22直鏈烷基，優選直鏈十六烷基。
式A’
式I 式II
其中，每個
獨立地表示共價單鍵或雙鍵；每次出現的X選自碳、氮、氧和硫；F、G、H和I各自獨立地選自碳、氮、氧和硫；
其中m是1、2或3的整數，n是1、2或3的整數，並且m+n=4；
其中C在每次出現時或者不存在或者選自下組：氫、鹵原子、羥基、(C
1-C
20)烷基、(C
1-C
20)烷氧基、鹵代(C
1-C
20)烷基和鹵代(C
1-C
20)烷氧基；
其中B在每次出現時獨立地選自下組：羥基、-C(O)OH、-P(O)
2-OH、-P(O)-OH、-P(O)(S)-OH、-CN、-(C
1-C
22)烷基、-(C
1-C
22)烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
3-C
22)亞環烷基-OH、-(C
6-C
22)亞芳基-OH、-(C
6-C
22)亞雜芳基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-(C
3-C
22)亞環烷基-C(O)OH、-(C
6-C
22)亞芳基-C(O)OH、-(C
5-C
22)亞雜芳基-C(O)OH、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)NH
2、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)NH
2、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-(C
1-C
30)亞烷基-P(O)
2-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
30)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)(S)-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-CN，
其中，A
1、A
2和A
3中的每一者或者不存在或者是獨立選自下組的取代基：-H、-OH、-O-R
1、-SH、-(C
1-C
22)烷基、鹵代-(C
1-C
22)烷基、-(C
2-C
22)烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
3-C
22)環烷基、-(C
3-C
22)環烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
3-C
22)環烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烯基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-R
1、-(C
1-C
22)亞烯基-O-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-COOR
1、-(C
1-C
22)亞烯基-COOR
1、-C(O)O-R
1、-O-(C
1-C
22)烷基、-S-(C
1-C
22)烷基、-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-O-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-O-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-R
1、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-O-金剛烷基、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C
1-C
22)烷基、-CH(NH-CO-(C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-CH(NH-CO-鹵代(C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C
1-C
22)烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
1-C
6環氧烷基)
(1-20)-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-C(O)NH-(C
1-C
22)烷基、-C(O)NH-R
1、-C(O)NR
2-R
1、-C(O)NH-(C
1-C
22)亞烷基-OH、 -C(O)NH-(C
1-C
22)亞烷基-COOH、 -NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-NH-C(O)-R
1、-NR
2-C(O)-R
1、-O-P(O)
2-O-R
1、-OP(O)(S)-O-R
1、-O-P(O)-O-R
1、-NH-R
1、-NR
2-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)O-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)- NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
30)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)(S)-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-CN、取代或未取代的吡咯、取代或未取代的吡咯啉、取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的吡唑啉、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的咪唑、取代或未取代的噁唑、取代或未取代的噻唑、取代或未取代的苯並吡咯、取代或未取代的苯並吡咯啉、取代或未取代的苯並吡咯烷、取代或未取代的苯並吡唑、取代或未取代的苯並吡唑啉、取代或未取代的苯並吡唑烷、取代或未取代的苯並咪唑、取代或未取代的苯並噁唑、取代或未取代的苯並噻唑以及式III表示的結構：
式III
其中，Y選自碳、氮、氧和硫；並且P、Q、S和T中的每一者獨立地選自碳、氮、氧和硫；並且星號是指由式III表示的取代基與由式I或式II表示的結構連接的位元點；
其中，R
3、R
4和R
5中的每一者或者不存在或者是獨立選自下組的取代基：-H、-OH、-O-R
1、-SH、-(C
1-C
22)烷基、鹵代-(C
1-C
22)烷基、-(C
2-C
22)烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
3-C
22)環烷基、-(C
3-C
22)環烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
3-C
22)環烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烯基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-R
1、-(C
1-C
22)亞烯基-O-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-COOR
1、-(C
1-C
22)亞烯基-COOR
1、-C(O)O-R
1、-O-(C
1-C
22)烷基、-S-(C
1-C
22)烷基、-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-O-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-O-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-R
1、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-O-金剛烷基、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C
1-C
22)烷基、-CH(NH-CO-(C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-CH(NH-CO-鹵代(C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C
1-C
22)烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
1-C
6環氧烷基)
(1-20)-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-C(O)NH-(C
1-C
22)烷基、-C(O)NH-R
1、-C(O)NR
2-R
1、-C(O)NH-(C
1-C
22)亞烷基-OH、 -C(O)NH-(C
1-C
22)亞烷基-COOH、 -NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-NH-C(O)-R
1、-NR
2-C(O)-R
1、-O-P(O)
2-O-R
1、-OP(O)(S)-O-R
1、-O-P(O)-O-R
1、-NH-R
1、-NR
2-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)O-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-R
1、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)- NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
30)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)(S)-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-CN、取代或未取代的吡咯、取代或未取代的吡咯啉、取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的吡唑啉、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的咪唑、取代或未取代的噁唑、取代或未取代的噻唑、取代或未取代的苯並吡咯、取代或未取代的苯並吡咯啉、取代或未取代的苯並吡咯烷、取代或未取代的苯並吡唑、取代或未取代的苯並吡唑啉、取代或未取代的苯並吡唑烷、取代或未取代的苯並咪唑、取代或未取代的苯並噁唑和取代或未取代的苯並噻唑，
其中，R
7在每次出現時連接到P、Q、S和T中的任一者，並且其或者不存在或者選自氫、鹵原子、羥基、(C
1-C
20)烷基、(C
1-C
20)烷氧基、鹵代(C
1-C
20)烷基和鹵代(C
1-C
20)烷氧基；
其中，p是0、1、2或3的整數；
其中，R
6連接到P、Q、S和T中的任一者，並且其選自直接鍵、-O-、-C(O)O-、-O-C(O)-、-P(O)
2-O-、-O-P(O)
2-O-、-P(O)(S)-O-、-O-P(O)(S)-O-、-O-P(O)-O-、-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-O-、-O-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-、-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-C(O)-O-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
30)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-、-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、 -C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、 -C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-、-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-N((C
1-C
22)烷基)-、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、 -(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-O-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-O-、-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-O-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、 -NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-、-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-N((C
1-C
22)烷基)-C(O)-、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、 -(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
22)亞烷基-P(O)
2-O-、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(O)
2-O-、-(C
3-C
22)亞環烷基-、-(C
3-C
22)亞環烷基-O-、-O-(C
3-C
22)亞環烷基-、-(C
6-C
22)亞芳基-、-(C
6-C
22)亞芳基-O-、-O-(C
6-C
22)亞芳基-、-(C
6-C
22)亞芳基-NH-、-NH-(C
6-C
22)亞芳基-、-C(O)-(C
6-C
22)亞芳基-、-(C
6-C
22)亞芳基-C(O)-、-C(O)-O-(C
6-C
22)亞芳基-、-(C
6-C
22)亞芳基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C
6-C
22)亞芳基-並且-C(O)-NH-(C
6-C
22)亞芳基-C(O)-O-；
其中，R
1在每次出現時獨立地選自氫、羥基、-(C
1-C
22)烷基、-(C
3-C
22)環烷基、-(C
6-C
22)芳基、-(C
1-C
22)烷氧基、-(C
3-C
22)環烷氧基、-(C
6-C
22)芳氧基、-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-OC(O)(C
1-C
22)烷基、-C(O)-O-(C
1-C
22)烷基、-C(O)-(C
3-C
22)環烷基、-OC(O)-(C
3-C
22)環烷基、-C(O)-O-(C
3-C
22)環烷基、-C(O)-(C
6-C
22)芳氧基、-OC(O)-(C
6-C
22)芳氧基、-C(O)-O-(C
6-C
22)芳氧基、-C(O)-磷酸酯基團、磷酸二酯基團、亞磷醯胺基團、飽和脂肪酸基團、不飽和脂肪酸基團、脂質、PEG、類固醇、親脂物質、碳水化合物、膽固醇、金剛烷、胺基酸、肽、氯喹和生物鹼，
其中，R
2在每次出現時獨立地選自下組：鹵原子、(C
1-C
12)烷基、(C
1-C
12)烷氧基、(C
1-C
12)烷氧基羰基、(C
6-C
16)芳基或(C
6-C
16)芳氧基羰基；並且
其中，A
1、A
2、A
3、B、C、R
1、R
2、R
3、R
4、R
5、R
6和R
7中包含的一個或多個羥基、羧基、氨基、腈基和磷酸基團任選連接到支援材料或被末端保護基保護。
在另一個具體的實施方式中，A
1、A
2、A
3、B、C、R
1、R
2、R
3、R
4、R
5、R
6和R
7各自中包含的一個或多個羥基、羧基、氨基、腈基和磷酸基團任選地被末端保護基R
P保護，所述末端保護基R
P選自下組：(C
1-C
22)烷基、(C
1-C
22)烷氧基、(C
1-C
22)烷基羰基、(C
1-C
22)烷氧基羰基、(C
6-C
22)芳基、(C
6-C
22)芳氧基、(C
6-C
22)芳基羰基、(C
6-C
22)芳氧基羰基、三((C
1-C
22)烷基)甲矽烷基和三((C
1-C
22)烷氧基)甲矽烷基；並且
其中，支援材料選自二氧化矽、矽膠、玻璃、陶瓷、聚合物、纖維素及其組合。
在另一個具體的實施方式中，式A’表示的脂質部分和遞送增強化合物部分的組合所具有的結構可通過從式IV至式XIII表示的結構中減去至少一個氫原子或末端基團得到：
式IV 式V 式VI 式VII
式VIII 式IX 式X
式XI 式XII 式XIII。
在另一個具體的實施方式中，F、G、H和I各自是碳，m是1且n是3，B連接到G或者H、P、Q、S和T中的每一者是碳，R
6連接到Q和S中的任一者；
其中，保護基R
P選自下組：苄氧基羰基(Cbz)、叔丁基二甲基甲矽烷基(TBS)、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、叔丁氧羰基(Boc)、苄基(Bn)和苄氧基(BnO)；
其中，每次出現的C選自下組：氫、鹵原子、羥基、(C
1-C
12)烷基、(C
1-C
12)烷氧基、鹵代(C
1-C
12)烷基和鹵代(C
1-C
12)烷氧基；
其中，每次出現的B是-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-O-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)NH
2、-(C
1-C
16)亞烷基-O-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)NH
2、-O-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)OH、-(C
1-C
16)亞烷基-O-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)NH
2、-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)NH
2、-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)OH、-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)OH、-(C
1-C
16)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
16烷基)
2)-O-(C
1-C
16)亞烷基-CN、-(C
1-C
16)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
16烷基)
2)-O-(C
1-C
16)亞烷基-OH、-(C
1-C
16)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
16烷基)
2)-O-(C
1-C
16)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
16)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
16烷基)
2)-O-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
16烷基)
2)-O-(C
1-C
16)亞烷基-CN，
其中，A
1、A
2和A
3中的每一者或者不存在或者是獨立選自下組的取代基：-H、-OH、直鏈或支鏈-(C
6-C
22)烷基、直鏈或支鏈-(C
2-C
22)烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烯基-OH、-(C
3-C
22)環烷基、-(C
3-C
22)環烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
3-C
22)環烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烯基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-R
1、-(C
1-C
22)亞烯基-O-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-COOR
1、-(C
1-C
22)亞烯基-COOR
1、-O-(C
1-C
22)烷基、-(C
6-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
1-C
6環氧烷基)
(1-20)-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-C(O)NH-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、取代或未取代的吡咯、取代或未取代的吡咯啉、取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的吡唑啉、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的咪唑、取代或未取代的噁唑、取代或未取代的噻唑、取代或未取代的苯並吡咯、取代或未取代的苯並吡咯啉、取代或未取代的苯並吡咯烷、取代或未取代的苯並吡唑、取代或未取代的苯並吡唑啉、取代或未取代的苯並吡唑烷、取代或未取代的苯並咪唑、取代或未取代的苯並噁唑、取代或未取代的苯並噻唑以及式III表示的取代基，
其中，Y選自碳、氮、氧和硫；並且P、Q、S和T中的每一者是碳；
其中，R
3、R
4和R
5中的每一者或者不存在或者是獨立選自下組的取代基：-H, -OH、直鏈或支鏈-(C
6-C
22)烷基、直鏈或支鏈-(C
2-C
22)烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
3-C
22)環烷基、-(C
3-C
22)環烯基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
3-C
22)環烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-COOR
1、-O-(C
1-C
22)烷基、-(C
6-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-NR
2-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-(C
1-C
22)亞烷基-(C
1-C
6環氧烷基)
(1-20)-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-金剛烷基、-C(O)NH-R
1、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OH、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-NH
2、-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-O-P(-N(C
1-C
22烷基)
2)-O-(C
1-C
22)亞烷基-CN、取代或未取代的吡咯、取代或未取代的吡咯啉、取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的吡唑啉、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的咪唑、取代或未取代的噁唑、取代或未取代的噻唑、取代或未取代的苯並吡咯、取代或未取代的苯並吡咯啉、取代或未取代的苯並吡咯烷、取代或未取代的苯並吡唑、取代或未取代的苯並吡唑啉、取代或未取代的苯並吡唑烷、取代或未取代的苯並咪唑、取代或未取代的苯並噁唑和取代或未取代的苯並噻唑，
其中，R
7在每次出現時連接到P、Q、S和T中的任一者，並且或者不存在或者選自氫、鹵原子、羥基、(C
1-C
20)烷基、(C
1-C
20)烷氧基、鹵代(C
1-C
20)烷基和鹵代(C
1-C
20)烷氧基；
其中p是0、1、2或3的整數；
其中R
6連接到P、Q、S和T中的任一者，並且其選自：-(C
1-C
16)亞烷基-、-(C
1-C
16)亞烷基-O-、-O-(C
1-C
16)亞烷基-、-(C
1-C
16)亞烷基-NH-、-NH-(C
1-C
16)亞烷基-、-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-、-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-、-C(O)-O-(C
1-C
16)亞烷基-、-(C
1-C16)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-、-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-O-C(O)-、-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-O-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-O-、-C(O)-N((C
1-C
16)烷基)-(C
1-C
16)亞烷基-、-C(O)-N((C
1-C
16)烷基)-(C
1-C
16)亞烷基-O-、-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-、 -C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-、 -C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-、-C(O)-N((C
1-C
16)烷基)-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-N((C
1-C
16)烷基)-(C
1-C
16)亞烷基-、-C(O)-N((C
1-C
16)烷基)-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-N((C
1-C
16)烷基)-、-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-、 -(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-、-NH-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-、-NH-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-O-、-NH-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-、-NH-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-O-、-N((C
1-C
16)烷基)-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-、-N((C
1-C
16)烷基)-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-O-、-NH-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-、 -NH-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-、-N((C
1-C
16)烷基)-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-N((C
1-C
16)烷基)-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-、-N((C
1-C
16)烷基)-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-N((C
1-C
16)烷基)-C(O)-、-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-、-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-；並且
條件是A
1、A
2、A
3、R
3、R
4和R
5中的至少一者是C
6-C
22直鏈烷基，優選直鏈十六烷基。
在另一個具體的實施方式中，遞送增強化合物部分包含選自下組的結構：-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
3-C
12)亞環烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
16)亞烷基-(C
3-C
12)亞環烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
16)亞烷基-(C
3-C
12)亞環烷基-(C
1-C
16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-O-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-、-(C
3-C
12)亞環烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
16)亞烷基-(C
3-C
12)亞環烷基-C(O)-NH-、-(C
1-C
16)亞烷基-(C
3-C
12)亞環烷基-(C
1-C
16)亞烷基-C(O)-NH-，和/或
其中，遞送增強化合物部分通過共價鍵直接偶聯到單鏈寡核苷酸或者通過具有以下結構的連接部分連接到單鏈寡核苷酸：
其中Y
1是氧或硫，星號（*）是指連接部分連接到單鏈寡核苷酸的位置，並且雙星號（**）是指連接部分連接到遞送增強化合物部分的位置。
在另一個具體的實施方式中，脂質部分中包含的至少一個氫原子被氘原子取代。
在另一個具體的實施方式中，脂質部分和/或遞送增強化合物部分中包含的至少一個氫原子被氘原子取代。
在另一個具體的實施方式中，式A’表示的脂質部分和遞送增強化合物部分的組合所具有的結構可通過從化合物C1至化合物C71中任一者減去至少一個氫原子或末端基團得到：
其中
表示支持材料。
在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸通過至少一個連接部分連接到遞送增強化合物部分，所述連接部分選自下組：-O-、-S-、-C(O)-、-NH-、-N((C
1-C
12)烷基)-、-N((C
1-C
12)烷基)-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-O-、-C(O)-NH-、-OP(O)
2O-、-P(O)(O
-)O-、-OP(O)O-、-OP(O)(S)O-、-OP(O)(S
-)O-、-O-S(O)
2-O-、-S(O)
2-O-、-S(O)-O-、-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-、-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-、-NH-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-NH-(C
1-C
22)亞烷基-NH-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)O-、-O-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-O-(C
1-C
22)亞烷基-O-C(O)-、-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-、-NH-C(O)-(C
1-C
22)亞烷基-C(O)-NH-、-C(O)-NH-(C
1-C
22)亞烷基-NH-C(O)-、-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)
2O-、-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)(O
-)O-、-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)(O
-)O-(C
1-C
22)亞烷基-、-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)O-、-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)(S)O-、-(C
1-C
22)亞烷基-O-S(O)
2-O-、-(C
1-C
22)亞烷基-S(O)
2-O-、-(C
1-C
22)亞烷基-S(O)-O-、-O-P(O)
2-O-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)
2O-、-O-P(O)-O-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)O-、-OP(O)(S)O-(C
1-C
22)亞烷基-OP(O)(S)O-、-O-S(O)
2-O-(C
1-C
22)亞烷基-O-S(O)
2-O-、-S(O)
2-O-(C
1-C
22)亞烷基-S(O)
2-O-和-O-S(O)-(C
1-C
22)亞烷基-S(O)-O-。
在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸遞送劑具有由式AI至AVII中任一者表示的結構：
式AI 式AII
式AIII 式AIV 式AV
式AVI 式AVII
其中，L表示連接部分，
表示由式A’表示的脂質部分和遞送增強化合物部分的組合，
表示5’到3’方向或或3’到5’方向的單鏈寡核苷酸，並且a、b和c各自獨立地為1至50的整數。
在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸遞送劑具有式O1至O20中任一者表示的結構：
O1
O2
O3
O4
O5
O6
O7
O8
O9
O10
O11
O12
O13
O14
O15
O16
O17
O18
O19
O20
其中Y表示氧或硫。
在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸以包含選自
SMN2、
SCN9A、
Scn9a和
DMD的寡核苷酸序列的至少部分的基因為靶標。
在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:142-260和SEQ ID NO:443-492的寡核苷酸序列的至少部分。在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:261-379、SEQ ID NO: 388和SEQ ID NO: 390的寡核苷酸序列的至少部分。在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸與包含選自SEQ ID NO:23-141和SEQ ID NO: 393-442的寡核苷酸序列的至少部分的連續靶序列互補。在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:2-21、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:391和SEQ ID NO:493-542的寡核苷酸序列的至少部分。
本另一個具體的實施方式中，本公開提供了一種藥物組合物，其包含：a) 如本文所述的寡核苷酸遞送劑；和b) 任選地，選自下組的一種或多種成分：藥學上可接受的載體、賦形劑、溶劑、稀釋劑、穩定劑、分散劑、緩衝劑、增容劑、防腐劑及其組合。
在另一個具體的實施方式中，本公開提供了一種調控物件的靶基因的表達的方法，所述方法包括給予如本文所述的藥物組合物的步驟。
在另一個具體的實施方式中，向物件的心肌、骨骼肌、平滑肌和肝中的至少一者給予所述藥物組合物。
在另一個具體的實施方式中，藥物組合物增加了靶基因的表達。
在另一個具體的實施方式中，藥物組合物降低了靶基因的表達。
在另一個具體的實施方式中，物件是哺乳動物。
在另一個具體的實施方式中，哺乳動物是齧齒動物。
在另一個具體的實施方式中，齧齒動物是小鼠或大鼠。
在另一個具體的實施方式中，哺乳動物是非人靈長動物。
在另一個具體的實施方式中，哺乳動物是人。
在另一個具體的實施方式中，靶基因與疾病或失調相關。
在另一個具體的實施方式中，靶基因與中樞神經系統、眼、脾、肌肉、心臟、腎或肝的疾病或失調相關。
在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸以包含選自
SMN2、
SCN9A、
Scn9a和
DMD的寡核苷酸序列的至少部分的基因為靶標。
在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:142-260和SEQ ID NO:443-492的寡核苷酸序列的至少部分。在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:261-379、SEQ ID NO: 388和SEQ ID NO: 390的寡核苷酸序列的至少部分。在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸與包含選自SEQ ID NO:23-141和SEQ ID NO: 393-442的寡核苷酸序列的至少部分的連續靶序列互補。在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:2-21、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:391和SEQ ID NO:493-542的寡核苷酸序列的至少部分。
在另一個具體的實施方式中，所述方法包括使細胞與本文所述的藥物組合物接觸。
在另一個具體的實施方式中，細胞來自骨骼肌、心肌、平滑肌或肝。
在另一個具體的實施方式中，藥物組合物增加了靶基因的表達。
在另一個具體的實施方式中，藥物組合物降低了靶基因的表達。
在另一個具體的實施方式中，所述細胞是哺乳動物細胞。
在另一個具體的實施方式中，哺乳動物細胞是小鼠細胞或大鼠細胞。
在另一個具體的實施方式中，哺乳動物細胞是非人靈長動物細胞。
在另一個具體的實施方式中，所述哺乳動物細胞是人細胞。
在另一個具體的實施方式中，靶基因與疾病或失調相關。
在另一個具體的實施方式中，靶基因與中樞神經系統、眼、脾、肌肉、心臟、腎或肝的疾病或失調相關。
在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸以包含選自
SMN2、
SCN9A、
Scn9a和
DMD的寡核苷酸序列的至少部分的基因為靶標。
在另一個具體的實施方式中，其中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:142-260和SEQ ID NO:443-492的寡核苷酸序列的至少部分。在另一個具體的實施方式中，其中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:261-379、SEQ ID NO: 388和SEQ ID NO: 390的寡核苷酸序列的至少部分。在另一個具體的實施方式中，其中，寡核苷酸與包含選自SEQ ID NO:23-141和SEQ ID NO: 393-442的寡核苷酸序列的至少部分的連續靶序列互補。在另一個具體的實施方式中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:2-21、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:391和SEQ ID NO:493-542的寡核苷酸序列的至少部分。
實施例
現將在以下實施例中描述本發明的一些實施方式，其中，除非另外規定，否則所有的份數和百分比以重量計。然而，本公開的範圍當然不局限於這些實施例中所述的製劑。更確切來說，實施例僅是本公開的發明體現。
提供以下實施例的目的是向本領域普通技術人員完整地公開和描述如何製備和使用本發明，這些實施例不意在限制發明人認為的發明範圍，也不代表下述實驗是所進行的所有或僅有的實驗。努力保證所用數值（如量、溫度等）的準確性，但應允許一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，份數是重量份數，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。可以使用標準縮寫，例如，bp：堿基對；kb：千堿基；nM：納摩爾；s或sec：秒；min：分鐘；h或hr：小時；aa：胺基酸；nt：核苷酸；i.m.：肌內；i.p.：腹膜內；s.c.：皮下；ivt或IVT：玻璃體內；iv或IV：尾靜脈、靜脈內；i.c.v.或icv或ICV：腦室內等。
除非另有說明，否則下文使用的所有起始材料、試劑和溶劑從商業來源獲得，並原樣使用。反應產物的純化使用矽膠柱色譜法進行，包括矽膠（200-300目）及己烷/乙酸乙酯、DCM/MeOH洗脫劑。使用預塗覆的矽膠GF板進行薄層色譜法（TLC）並且使用KMnO
4染色來視覺化。使用CDCl
3和TMS，在400或500 MHz（Varian/瓦裡安公司）下記錄
1H-NMR波譜。通過ESI或基質輔助鐳射解吸/電離（MALDI）在LC/MS（安捷倫技術公司（Agilent Technologies） 1260 Infinity II/6120四極杆）和飛行時間質譜儀上記錄高解析度質譜(HRMS)。
實施例1：製備化合物C1
在本實施例中，使用下述程式製備化合物C1：
(1)製備化合物
5
在氮氣氛下，向2-(4-氟-3-硝基苯基)乙酸甲酯
4(17.3 g, 81 mmol, 1.0當量)和K
2CO
3(11.2 g, 81 mmol)在無水DMF(200 mL)中的溶液加入化合物3
(19.56 g, 81 mmol, 1.0當量)。在55 °C下攪拌反應混合物6 h，然後加入冷水(100 mL)。混合物用乙酸乙酯萃取三次，接著有機相用飽和LiCl溶液洗滌三次以及用鹽水洗滌一次。然後，有機相經無水Na
2SO
4乾燥並減壓濃縮以形成化合物
5，為黃色油狀物，其不進一步純化而直接用於下一步驟。
(2)製備化合物
6
在冰浴下，向化合物5
(35.18 g, 81 mmol, 1.0當量)在THF/H
2O (9:1, 280 mL)中的溶液加入HCOONH
4(30.67 g, 486 mmol, 6.0當量)和Zn粉 (31.78 g, 486 mmol, 6.0當量)。攪拌10分鐘後，從冰浴移出反應混合物並室溫攪拌過夜。然後，過濾反應混合物並減壓濃縮。在這之後，將水(200 mL)加入到混合物中，接著混合物用乙酸乙酯萃取三次，用鹽水洗滌有機相一次。在經Na
2SO
4乾燥並減壓濃縮後，形成產物6，其接著不經進一步純化而直接用於下一步驟。化合物
6通過質譜法表徵。MW計算：404.34; MW實際：405.3 [M+H]
+。
(3)製備化合物
8
在氮氣氛下，向化合物6 (19.36 g, 48 mmol, 1.0當量)在EtOH (200 mL)中的溶液加入3-((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)丙醛
7(9.0 g, 48 mmol, 1.0當量)和AcOH (11 mL, 192 mmol, 4.0當量)。在80°C下攪拌反應混合物過夜，然後減壓濃縮。接著加入飽和NaHCO
3溶液(100 mL)，混合物用乙酸乙酯萃取三次，然後合併有機相並用鹽水洗滌，經Na
2SO
4乾燥並濃縮。所得到的殘餘化合物
8不經進一步純化而直接用於下一步驟。
(4)製備化合物
9
在氮氣氛下，向化合物8 (10 g, 17.5 mmol, 1.0當量)在無水THF (50 mL)中的溶液加入1 M TBAF THF溶液 (26.3 mL, 26.3 mmol, 1.5當量)。室溫攪拌反應混合物1 h，然後減壓濃縮。接著加入水(100 mL)，用DCM萃取混合物三次，然後合併有機相並用鹽水洗滌，經Na
2SO
4乾燥並濃縮。將所得的殘餘物溶於50 mL吡啶，並在其中加入DMTrCl (7.12 g, 21 mmol, 1.2當量)。室溫攪拌反應混合物6 h，在此之後減壓濃縮。所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-3%的MeOH/DCM)純化以提供化合物
9(8.1 g, 61%收率)，為黃色固體。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：760.48; MW實際：761.8 [M + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 7.59 – 7.53 (m, 1H), 7.38 – 7.31 (m, 2H), 7.23 - 7.19 (m, 6H), 7.18 – 7.14 (m, 3H), 6.76 (dd,
J= 7.8, 5.6 Hz, 4H), 4.17 – 4.02 (m, 2H), 3.76 (s, 6H), 3.73 (s, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.59 (t,
J= 7.0 Hz, 2H), 3.19 – 3.05 (m, 2H), 1.29 – 1.25 (m, 28H), 0.88 (t,
J= 6.5 Hz, 3H).
(5)製備化合物C
1
在氮氣氛和冰浴下，向化合物
9(2.7 g, 3.55 mmol, 1.0當量)在無水THF (20 mL)中的溶液加入LiAlH
4(202 mg, 5.33 mmol, 1.5當量)。10分鐘後，將混合物移至室溫並攪拌1 h。然後將反應移至冰浴，將飽和酒石酸鈉鉀溶液(20 mL)緩慢加入到混合物中。30分鐘後，用Et
2O萃取反應三次，然後合併有機相並用鹽水洗滌，經Na
2SO
4乾燥並濃縮。將粗產物(300 mg, 0.41 mmol, 1.0當量)溶於無水DCM (5 mL)，然後在25°C、氮氣氛下，加入DIPEA (204 μL, 1.23 mmol, 3.0當量)、3-((氯(二異丙基氨基)膦)氧基)丙腈(274 μL, 1.23 mmol, 3.0 eq.)。攪拌反應混合物1 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層並且所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM, 1% Et
3N)純化以提供化合物C
1(299 mg, 78%收率)，其為無色油狀物。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 7.62 (s, 1H), 7.32 (dd,
J= 7.6, 4.1 Hz, 2H), 7.27 – 7.11 (m, 9H), 6.73 (dd,
J= 7.9, 5.6 Hz, 4H), 4.34 – 4.31 (m, 2H), 4.10 – 4.06 (m, 2H), 3.75 (s, 6H), 3.64 – 3.61 (m, 2H), 3.58 (dd,
J= 11.8, 5.1 Hz, 2H), 3.24 – 3.18 (m, 2H), 3.09 – 2.88 (m, 4H), 2.65 –2.55 (m, 4H), 1.37 – 1.28 (m, 28H), 1.22 (dd,
J= 6.8, 3.2 Hz, 12H), 0.88 (t,
J= 6.5 Hz, 3H)。
實施例2：製備化合物C2
在本實施例中，使用下述程式製備化合物C2：
(1)製備化合物
11
在氮氣氛下，向4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯
10(15 g, 75.3 mmol, 1.0當量)和K
2CO
3(10.4 g, 75.3 mmol, 1.0當量)在無水DMF (240 mL)中的溶液加入化合物3 (18.18 g, 75.3 mmol, 1.0當量)。在25 °C下攪拌反應混合物6 h，然後加入冷水(100 mL)。混合物用乙酸乙酯萃取三次，接著有機相用飽和LiCl溶液洗滌三次以及用鹽水洗滌一次。然後經無水Na
2SO
4乾燥並減壓濃縮以形成化合物
11，為棕色油狀物，其不進一步純化而直接用於下一步驟。
(2)製備化合物
12
在冰浴下，向化合物1
1(31.65 g, 75.3 mmol, 1.0當量)在THF/H
2O (9:1, 300 mL)中的溶液加入HCOONH
4(28.5 g, 451.8 mmol, 6.0當量)和Zn粉 (29.5 g, 451.8 mmol, 6.0當量)。10分鐘後，將反應混合物移至室溫並攪拌過夜。然後，過濾反應混合物並減壓濃縮。在這之後，將水(100 mL)加入到混合物中，然後用乙酸乙酯萃取三次，用鹽水洗滌有機相一次。在經Na
2SO
4乾燥並減壓濃縮後，形成棕色固體化合物1
2，其接著不經進一步純化而直接用於下一步驟。
(3)製備化合物
14
在氮氣氛下，向化合物1
2(6.0 g, 15.4 mmol, 1.0當量)在EtOH (90 mL)中的溶液加入化合物1
3(1.57 g, 15.4 mmol, 1.0當量)和AcOH (3.54 mL, 61.6 mmol, 4.0當量)。在80°C下攪拌反應混合物過夜，然後減壓濃縮。接著加入飽和NaHCO
3溶液(80 mL)，混合物用乙酸乙酯萃取三次，然後合併有機相並用鹽水洗滌，經Na
2SO
4乾燥並濃縮。所得的殘餘物不經進一步純化而直接用於下一步驟。所得的殘餘物通過質譜法表徵。MW計算：472.37; MW實際：473.4 [M+H]
+。
將所得的殘餘物(1.0 g, 2.12 mol, 1.0當量)溶於10 mL DCM，並且在其中加入Et
3N (0.44 mL, 3.17 mmol, 1.5當量)、DMTrCl (860 mg, 2.54 mmol, 1.2當量)。室溫攪拌反應混合物6 h，在此之後減壓濃縮。所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM)純化以提供化合物
14(1.27 g, 77%收率)，為黃色固體。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：774.50; MW實際：303.2 [DMT]
-, 473.4 [DMT off + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 8.42 (d,
J= 0.9 Hz, 1H), 7.97 (dd,
J= 8.5, 1.4 Hz, 1H), 7.42 (d,
J= 7.4 Hz, 2H), 7.33 – 7.28 (m, 5H), 7.25 (d,
J= 6.8 Hz, 2H), 7.19 (t,
J= 7.3 Hz, 1H), 6.80 (dd,
J= 9.4, 2.4 Hz, 4H), 4.05 (t,
J= 7.5 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.78 (s, 6H), 3.12 (t,
J= 6.3 Hz, 2H), 2.92 – 2.80 (m, 2H), 2.07 – 1.97 (m, 2H), 1.82 – 1.71 (m, 4H), 1.28 - 1.24 (m, 26H), 0.88 (t,
J= 6.8 Hz, 3H)。
(4)製備化合物
15
在氮氣氛和冰浴下，向化合物1
4(1.27 g, 1.64 mmol, 1.0當量)在無水THF (10 mL)中的溶液加入LiAlH
4(93 mg, 2.46 mmol, 1.5當量)。10分鐘後，將混合物移至室溫並攪拌1 h。然後將反應移至冰浴，將飽和酒石酸鈉鉀溶液(10 mL)緩慢加入到混合物中。30分鐘後，用Et
2O萃取反應三次，然後合併有機相並用鹽水洗滌，經Na
2SO
4乾燥並濃縮。將粗產物(500 mg, 0.67 mmol, 1.0當量)溶於DCM (10 mL)，然後在氮氣氛下將DMAP (286 mg, 2.34 mmol, 3.5當量)、琥珀酸酐(134 mg, 1.34 mmol, 2.0當量)加入其中。室溫攪拌反應混合物過夜,然後將H
2O (10 mL)加入到反應中，用DCM萃取混合物 (3*10 mL)併合並有機相，經Na
2SO
4乾燥並濃縮。所得的殘餘物通過快速色譜法純化。所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-10%的MeOH/DCM)純化以提供化合物
15(425 mg, 62%收率)，其為無色油狀物。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：846.52; MW實際：303.2 [DMT]
-, 545.4 [DMT off + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 7.81 (s, 1H), 7.42 (d,
J= 7.5 Hz, 2H), 7.30 (d,
J= 8.8 Hz, 4H), 7.25 (d,
J= 7.6 Hz, 3H), 7.19 (dd,
J= 14.9, 7.9 Hz, 2H), 6.80 (d,
J= 8.8 Hz, 4H), 5.26 (s, 2H), 4.03 (t,
J= 7.4 Hz, 2H), 3.77 (s, 6H), 3.11 (t,
J= 6.1 Hz, 2H), 2.90 (t,
J= 7.7 Hz, 2H), 2.73 – 2.66 (m, 4H), 1.99 (dt,
J= 15.3, 7.7 Hz, 2H), 1.74 (dd,
J= 13.5, 6.9 Hz, 4H), 1.29 – 1.25 (m, 26H), 0.87 (t,
J= 6.7 Hz, 3H)。
(5)製備化合物C
2
在氮氣氛下，向化合物1
5(114 mg, 0.134 mmol, 1.0當量)、控孔玻璃(CPG) (2.36 g)、DIPEA (67 µL, 0.4 mmol, 3.0當量)在乙腈(18 mL)中的溶液加入HBTU (102 mg, 0.268 mmol, 2.0當量)。在25°C下攪拌混合物過夜，隨後用DCM和乙醚洗滌以產生粗品固體支持物。在氮氣氛下，向乙酸酐(8.04 mL)、吡啶 (15.5 mL)、NEt
3(241 μL)在乙腈(10 mL)中的溶液加入粗品固體支持物。在25 °C下攪拌反應混合物過夜，隨後用DCM和乙醚洗滌以產生本公開的化合物
C2(2.2 g)。
實施例3：製備本公開的化合物C55
在本實施例中，使用下述程式製備化合物C55：
(1)製備化合物
5
在氮氣氛下，向2-(4-氟-3-硝基苯基)乙酸甲酯
4(9.9 g, 46.4 mmol, 1.0當量)和K
2CO
3(6.4 g, 46.4 mmol, 1.0當量)在無水DMF (80 mL)中的溶液加入化合物3
(11.2 g, 46.4 mmol, 1.0當量)。在55 °C下攪拌反應混合物8 h，然後加入冷水(100 mL)。混合物用乙酸乙酯萃取三次，接著有機相用飽和LiCl溶液洗滌三次以及用鹽水洗滌一次。然後，有機相經無水Na
2SO
4乾燥並減壓濃縮以形成化合物
5，為黃色油狀物，其不進一步純化而直接用於下一步驟。
(2)製備化合物
16
在氮氣氛和冰浴下，向化合物5 (15.58 g, 35.87 mmol, 1.0當量)在無水THF (160 mL)中的溶液緩慢加入LiAlH
4(1.36 g, 35.87 mmol, 1.0當量)。10分鐘後，將混合物移至室溫並攪拌1 h。然後將反應移至冰浴，將飽和酒石酸鈉鉀溶液(30 mL)緩慢加入到混合物中。30分鐘後，用EtOAc萃取反應三次，然後合併有機相並用鹽水洗滌，經Na
2SO
4乾燥並濃縮。然後將粗品殘餘物溶於在無水DMF (140 mL)。接著，在氮氣氛下加入咪唑 (3.66 g, 53.8 mmol, 1.5當量)和TBSCl (6.5 g, 43.04 mmol, 1.2當量)。室溫攪拌反應混合物2 h，然後加入H
2O (100 mL)。用乙酸乙酯萃取混合物三次，接著，用飽和LiCl溶液洗滌有機相三次以及用鹽水洗滌一次，然後通過無水Na
2SO
4乾燥並減壓濃縮。所得的殘餘物
16不經進一步純化而直接用於下一步驟。產物通過質譜法表徵。MW計算：520.41; MW實際：521.4 [M + H]
+。
(3)製備化合物
17
在冰浴下，向化合物1
6(35.87 mmol, 1.0當量)在THF/H
2O (9:1, 178 mL)中的溶液加入HCOONH
4(13.58 g, 215.2 mmol, 6.0當量)和Zn粉 (14.1 g, 215.2 mmol, 6.0當量)。攪拌10分鐘後，從冰浴移出反應混合物並室溫攪拌過夜。然後，過濾反應混合物並減壓濃縮。在這之後，將水(200 mL)加入到混合物中，然後混合物用乙酸乙酯萃取三次，用鹽水洗滌有機相一次。在經Na
2SO
4乾燥並減壓濃縮後，形成產物
17，其接著不經進一步純化而直接用於下一步驟。化合物1
7通過質譜法表徵。MW計算：490.43; MW實際：491.40 [M+H]
+。
(4)製備化合物
18
在氮氣氛下，向化合物1
7(5 g, 10.2 mmol, 1.0當量)在EtOH (25 mL)中的溶液加入5-羥基戊醛 (1.04 g, 10.2 mmol, 1.0當量)和AcOH (2.35 mL, 40.8 mmol, 4.0當量)。在80°C下攪拌反應混合物過夜，然後減壓濃縮。然後加入飽和NaHCO
3溶液(25 mL)，混合物用乙酸乙酯萃取三次，然後合併有機相並用鹽水洗滌，經Na
2SO
4乾燥並濃縮。所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM)純化以提供化合物
18(1.9 g, 33%收率)。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：572.47; MW實際：573.61 [M + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 7.53 (s, 1H), 7.21 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 1H), 4.07 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.84 (dd, J = 9.3, 5.6 Hz, 2H), 3.69 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.93 (dt, J = 19.8, 7.3 Hz, 4H), 2.13 – 2.03 (m, 2H), 1.84 – 1.70 (m, 4H), 1.40 – 1.21 (m, 26H), 0.93 – 0.85 (m, 12H), 0.03 (s, 6H)。
(5)製備化合物
19
在氮氣氛下，向化合物1
8(1.9 g, 3.32 mmol, 1.0當量)在DCM (10 mL)中的溶液加入Dess-Martin過碘烷 (DMP) (1.69 g, 3.98 mmol, 1.2當量)。攪拌反應混合物6 h。反應後，將NaHCO
3溶液(20 mL)加入到混合物中並且攪拌混合物30 min。 用DCM萃取混合物三次，接著，有機相用鹽水洗滌一次。通過無水Na
2SO
4乾燥並減壓濃縮後，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM)純化以提供化合物
19(619 mg, 33%收率)，為棕色油狀物。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：570.46; MW實際：571.61 [M + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 7.98 (s, 1H), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.30 (s, 1H), 4.25 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.89 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.18 – 3.12 (m, 2H), 3.01 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.55 – 2.50 (m, 2H), 2.32 – 2.24 (m, 2H), 1.85 (dd, J = 14.3, 7.2 Hz, 2H), 1.36 - 1.28 (m, 26H), 0.93 – 0.86 (m, 12H), 0.03 (s, 6H).
(6)製備化合物
20
在氮氣氛、冰浴下，向化合物8 (733 mg, 1.16 mmol, 1.2當量)在無水THF (5 mL)中的溶液中加入NaH (60%礦物油中的分散體,77 mg, 1.93 mmol, 2.0當量)。在冰浴下攪拌反應混合物15 min，然後將化合物1
9(550 mg, 0.964 mmol, 1.0當量)加入到反應混合物中。室溫攪拌混合物2 h，然後將反應移至冰浴，將飽和氯化銨 (5 mL)緩慢加入到混合物中。5分鐘後，用乙酸乙酯萃取反應兩次，有機相用鹽水洗滌一次。然後通過無水Na
2SO
4乾燥並減壓濃縮。所得的殘餘物通過快速色譜法(矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM)純化以提供化合物
20(699 mg, 81%收率)。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：876.58; MW實際：877.96 [M + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 7.54 (s, 1H), 7.22 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.15 – 7.10 (m, 1H), 6.97 – 6.84 (m, 1H), 5.73 – 5.65 (m, 5H), 4.07 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.85 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.96 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.88 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.18 – 2.06 (m, 2H), 1.85 – 1.70 (m, 3H), 1.33 – 1.18 (m, 48H), 0.90 (s, 9H), 0.03 (s, 6H)。
(7)製備化合物
21
向化合物20 (690 mg, 0.77 mmol, 1.0當量)在THF (2 mL)中的溶液加入2 M HCl (2 mL)。室溫攪拌反應混合物4 h。將5 mL H
2O加入到反應中。接著用乙酸乙酯萃取混合物兩次，用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層並且所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM)純化以提供化合物21 (488 mg, 82%收率)。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：762.49; MW實際：763.76 [M+H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 7.72 (s, 1H), 7.33 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.87 – 6.74 (m, 1H), 5.75 – 5.59 (m, 5H), 4.14 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.91 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.09 – 2.95 (m, 4H), 2.46 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.17 (dt, J = 14.4, 7.3 Hz, 2H), 1.87 – 1.75 (m, 3H), 1.31 – 1.17 (m, 44H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
(8)製備化合物
C55
在氮氣氛、室溫下，向化合物2
1(480 mg, 0.62 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (212 mg, 1.24 mmol, 2.0當量)在無水DCM (5 mL)中的溶液加入 3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (374 mg, 1.24 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物4 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，並且所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-3%的MeOH/DCM, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C55(514 mg, 84%收率)，為黃色油狀物。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：962.60; MW實際：880.82 [M – 83+ H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 7.53 (s, 1H), 7.22 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 8.2, 1H), 6.95 – 6.82 (m, 1H), 5.83 – 5.59 (m, 5H), 4.05 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.83 – 3.73 (m, 2H), 3.51 – 3.46 (m, 2H), 3.04 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.86 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.76 (td, J = 6.2, 1.9 Hz, 5H), 2.10 (dd, J = 15.1, 7.6 Hz, 2H), 1.81 – 1.72 (m, 3H), 1.26 – 1.24 (m, 26H), 1.21 (s, 18H), 1.18 -1.34 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
實施例4：製備本公開的化合物C5
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
56 ：
(1)製備化合物
C56
在氮氣氛、室溫下，向化合物2
2(1.00 g, 5.37 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.83 g, 10.73 mmol, 2.0當量)在無水DCM (27 mL)中溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (3.4 mL, 10.73 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物4 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-2%的乙酸乙酯/石油醚, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C56(1.3 g, 63%收率)，其為無色油狀物。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：386.13; MW實際：387.56 [M + H]
+。
1 H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ
3.90 – 3.78 (m, 2H), 3.69 – 3.51 (m, 4H), 2.64 (t,
J= 6.6 Hz, 2H), 1.65 – 1.57 (m, 2H), 1.27 – 1.24 (m, 18H), 1.22 – 1.15 (m, 12H), 0.88 (t, 3H)。
實施例5：製備本公開的化合物C57
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
57：
(1)製備化合物
C57
在氮氣氛、室溫下，向化合物2
3(1.0 g, 4.7 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.6 g, 9.4 mmol, 2.0當量)在無水DCM (10 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (2.8 g, 9.4 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物4 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 3-5%的乙酸乙酯/石油醚, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C57(1.8 g, 93%收率)。產物通過
1H NMR表徵。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 3.90 – 3.76 (m, 2H), 3.70 – 3.53 (m, 4H), 2.64 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.64 – 1.57 (m, 2H), 1.29 – 1.25 (m, 22H), 1.21 – 1.16 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
實施例6：製備本公開的化合物C58
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
58：
(1)製備化合物
C58
在氮氣氛、室溫下，向化合物2
4(1.00 g, 4.12 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.41 g, 8.25 mmol, 2.0當量)在無水DCM (21 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (2.61 mL, 8.25 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物4 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-2%的乙酸乙酯/石油醚, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C58(1.7 g, 94%收率)，其為無色油狀物。產物通過
1H NMR表徵。
1 H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ
3.89 – 3.77 (m, 2H), 3.70 – 3.52 (m, 4H), 2.64 (t,
J= 6.6 Hz, 2H), 1.65 – 1.56 (m, 2H), 1.33 – 1.23 (m, 26H), 1.22 – 1.14 (m, 12H), 0.87 (t, 3H)。
實施例7：製備本公開的化合物C59
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
59：
(1)製備化合物
C59
在氮氣氛、室溫下，向化合物2
5(1.0 g, 4.2 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.4 g, 8.4 mmol, 2.0當量)在無水DCM (10 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (2.5 g, 8.4 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物4 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 2-5%的乙酸乙酯/石油醚, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C59(1.4 g, 77%收率)。產物通過
1H NMR表徵。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 5.37 – 5.32 (m, 2H), 3.87 – 3.77 (m, 2H), 3.67 – 3.51 (m, 4H), 2.68 – 2.60 (m, 2H), 2.06 – 1.99 (m, 4H), 1.63 – 1.56 (m, 2H), 1.30 – 1.25 (m, 18H), 1.21 – 1.15 (m, 12H), 0.89 (t,
J= 7.0 Hz, 3H)。
實施例8：製備本公開的化合物C60
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
60：
(1)製備化合物
C60
在氮氣氛、室溫下，向化合物2
6(1.00 g, 4.20 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.43 g, 8.40 mmol, 2.0當量)在無水DCM (18 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (2.66 mL, 8.40 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物4 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-2%的乙酸乙酯/石油醚, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C60(1.6 g, 88%收率)，其為無色油狀物。產物通過
1H NMR表徵。
1 H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ
6.28 – 6.15 (m, 1H), 6.13 – 5.98 (m, 1H), 3.87 – 3.77 (m, 2H), 3.69 – 3.44 (m, 4H), 2.70 – 2.62 (m, 2H), 1.65 – 1.57 (m, 2H), 1.39 – 1.36 (m, 6H), 1.26 – 1.25 (m, 24H), 1.21 – 1.15 (m, 6H), 0.89 (t,
J= 6.5 Hz, 3H)。
實施例9：製備本公開的化合物C61
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
61：
(1)製備化合物
C61
在氮氣氛、室溫下，向化合物25 (1.0 g, 3.7 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.3 g, 7.4 mmol, 2.0當量)在無水DCM (10 mL) 中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (2.2 g, 7.4 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物4 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 2-5%的乙酸乙酯/石油醚, 1% Et
3N)純化以提供化合物C61 (860 mg, 49%收率)。產物通過
1H NMR表徵。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 3.94 – 3.73 (m, 2H), 3.72 – 3.48 (m, 4H), 2.64 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.60 (t, J = 13.7 Hz, 3H), 1.39 – 1.22 (m, 30H), 1.21 – 1.15 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 1H)。
實施例10：製備本公開的化合物C62
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
62：
(1)製備化合物
C62
在氮氣氛、室溫下，向化合物2
8(1.00 g, 3.73 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.27 g, 7.45 mmol, 2.0當量)在無水DCM (19 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (2.36 mL, 7.45 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物8 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-2%的乙酸乙酯/石油醚, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C62(1.6 g, 91%收率)，其為無色油狀物。產物通過
1H NMR表徵。
1 H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ
6.28 – 6.15 (m, 1H), 6.13 – 5.98 (m, 1H), 3.87 – 3.77 (m, 2H), 3.69 – 3.44 (m, 4H), 2.70 – 2.62 (m, 2H), 1.65 – 1.57 (m, 2H), 1.39 – 1.36 (m, 6H), 1.26 – 1.25 (m, 24H), 1.21 – 1.15 (m, 6H), 0.89 (t,
J= 6.5 Hz, 3H)。
實施例11：製備本公開的化合物C63
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
63：
(1)製備化合物
C63
在氮氣氛、室溫下，向化合物2
9(1.00 g, 3.35 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.15 g, 6.70 mmol, 2.0當量)在無水DCM (17 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (2.12 mL, 6.70 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物4 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-2%的乙酸乙酯/石油醚, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C63(1.3 g, 78%收率)，其為無色油狀物。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：498.78; MW實際：613.55 [M-二異丙基+ H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 3.84 – 3.74 (m, 2H), 3.61 – 3.51 (m, 4H), 2.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.63 – 1.57 (m, 2H), 1.38 – 1.22 (m, 34H), 1.20 – 1.17 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3H)。
實施例12：製備本公開的化合物C64
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
64：
(1)製備化合物
31
在氮氣氛下，向化合物4
0(2 g, 19.4 mmol, 1.0當量)、化合物3
0(5.97 g, 23.28 mmol, 1.2當量)、DIPEA (4.82 mL, 29.1 mmol, 1.5當量) 在DCM (40 mL)中的溶液加入HBTU (11 g, 29.1 mmol, 1.5當量)。攪拌反應混合物過夜。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM)純化以提供化合物3
1(4.63 g, 70%收率)，其為白色固體。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：341.33; MW實際：342.39 [M + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 3.64 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.25 (dd, J = 13.0, 6.9 Hz, 2H), 2.19 – 2.10 (m, 2H), 1.59 (dd, J = 14.3, 7.3 Hz, 4H), 1.52 (dd, J = 15.0, 7.9 Hz, 2H), 1.44 – 1.38 (m, 2H), 1.27 – 1.21 (m, 26H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
(2)製備化合物
C64
在氮氣氛、室溫下，向化合物3
1(1 g, 2.9 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (745 mg, 4.35 mmol, 1.5當量)在無水DCM (10 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (1.31 g, 4.35 mmol, 1.5當量)。攪拌反應混合物2 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C64(1.25 g, 79%收率)。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：541.44; MW實際：459.41 [M – 83 + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 3.55 – 3.51 (m, 2H), 3.19 – 3.16 (m, 2H), 2.69 (td, J = 6.3, 1.7 Hz, 1H), 2.65 – 2.45 (m, 3H), 2.14 – 2.02 (m, 2H), 1.54 (dt, J = 11.8, 4.8 Hz, 4H), 1.49 – 1.39 (m, 2H), 1.38 – 1.30 (m, 2H), 1.22 – 1.15 (m, 26H), 1.12 – 1.09 (m, 12H), 0.81 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
實施例13：製備本公開的化合物C65
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
65：
(1)製備化合物
33
在氮氣氛下，向化合物3
2(5.85 g, 22.83 mmol, 1.2當量)、化合物4
1(2 g, 19.02 mmol, 1.0當量)、DIPEA (4.73 mL, 28.53 mmol, 1.5當量)在DCM (50 mL)中的溶液加入HBTU (10.82 g, 28.53 mmol, 1.5當量)。攪拌反應混合物過夜。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-8%的MeOH/DCM)純化以提供化合物3
3(2.3 g, 35%收率)，其為白色固體。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：343.31; MW實際：344.37 [M + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 5.85 (s, 1H), 3.78 – 3.73 (m, 2H), 3.62 – 3.54 (m, 4H), 3.47 (dd, J = 10.5, 5.2 Hz, 2H), 2.21 – 2.15 (m, 2H), 1.62 – 1.60 (m, 2H), 1.33 – 1.21 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
(2)製備化合物
C65
在氮氣氛、室溫下，向化合物3
3(1.5 g, 4.37 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.5 g, 8.74 mmol, 2.0當量)在無水DCM (28 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (2.63 g, 8.74 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物2 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C65(2.02 g, 85%收率)。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：543.42; MW實際：485.35 [M – 81 + Na]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 3.64 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 3.57 – 3.53 (m, 4H), 3.50 – 3.43 (m, 4H), 2.78 – 2.74 (m, 4H), 2.66 – 2.64 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.19 – 2.15 (m, 2H), 1.26 - 1.25 (m, 24H), 1.20 – 1.17 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
實施例14：製備本公開的化合物C66
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
66：
(1)製備化合物
35
在氮氣氛下，向化合物3
4(2.06 g, 8.04 mmol, 1.2當量)、化合物4
2(1 g, 6.7 mmol, 1.0當量)、DIPEA (1.67 mL, 10.05 mmol, 1.5當量)在DCM (15 mL)中的溶液加入HBTU (3.81 g, 10.05 mmol, 1.5當量)。攪拌反應混合物過夜。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-8%的MeOH/DCM)純化以提供化合物3
5(2.2 g, 85%收率)，其為白色固體。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：387.33; MW實際：388.93 [M + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 6.05 (s, 1H), 3.77 – 3.73 (m, 2H), 3.70 – 3.66 (m, 2H), 3.66 – 3.61 (m, 4H), 3.59 – 3.55 (m, 2H), 3.46 (dd, J = 10.4, 5.2 Hz, 2H), 2.21 – 2.14 (m, 2H), 1.66 – 1.58 (m, 2H), 1.27 (d, J = 11.8 Hz, 24H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
(2)製備化合物
C66
在氮氣氛、室溫下，向化合物3
5(2.0 g, 5.17 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.77 g, 10.34 mmol, 2.0當量)在無水DCM (40 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (3.12 g, 10.34 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物2 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C66(2.43 g, 80%收率)。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：587.44; MW實際：505.32 [M – 83 + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 3.68 – 3.65 (m, 4H), 3.64 – 3.58 (m, 4H), 3.55 (dd, J = 9.6, 3.9 Hz, 4H), 3.44 (dd, J = 9.7, 5.3 Hz, 2H), 2.77 (td, J = 6.3, 1.5 Hz, 2H), 2.68 – 2.63 (m, 2H), 2.20 – 2.14 (m, 2H), 1.61 (dd, J = 14.5, 7.1 Hz, 2H), 1.27 – 1.24 (m, 24H), 1.19 – 1.15 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
實施例15：製備本公開的化合物C67
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
67：
(1)製備化合物
37
在氮氣氛下，向化合物3
6(1.07 g, 4.19 mmol, 1.2當量)、化合物4
3(500 mg, 3.49 mmol, 1.0當量)、DIPEA (866 µL, 5.23 mmol, 1.5當量)在DCM (10 mL)中的溶液加入HBTU (1.98 g, 5.23 mmol, 1.5當量)。攪拌反應混合物過夜。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM)純化以提供化合物3
7(998 mg, 75%收率)，其為白色固體。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：381.36; MW實際：405.10 [M + Na]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 5.48 (s, 1H), 3.46 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.11 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.24 – 2.09 (m, 2H), 1.88 – 1.74 (m, 4H), 1.65 – 1.57 (m, 2H), 1.45 (dd, J = 11.3, 7.8 Hz, 2H), 1.33 – 1.20 (m, 24H), 0.96 (t, J = 10.9 Hz, 4H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
(2)製備化合物
C67
在氮氣氛、室溫下，向化合物3
7(900 mg, 2.36 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (606 mg, 3.54 mmol, 1.5當量)在無水DCM (10 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (1.07 g, 3.54 mmol, 1.5當量)。攪拌反應混合物2 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C67(1.09 g, 80%收率)。產物通過
1H NMR表徵。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 3.88 – 3.76 (m, 2H), 3.58 – 3.45 (m, 4H), 3.10 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.76 (tt, J = 6.1, 3.1 Hz, 2H), 2.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.19 – 2.13 (m, 2H), 1.86 – 1.73 (m, 4H), 1.69 - 1.60 (m, 2H), 1.26 - 1.23 (m, 24 H), 1.20 - 1.15 (m, 12H), 0.96 (t, J = 10.5 Hz, 4H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
實施例16：製備本公開的化合物C68
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
68：
(1)製備化合物
39
在氮氣氛下，向化合物3
8(2.19 g, 8.53 mmol, 1.0當量)、化合物4
4(1 g, 8.53 mmol, 1.0當量)、DIPEA (2.12 mL, 12.8 mmol, 1.5當量)在DCM (50 mL)中的溶液加入HBTU (4.85 g, 12.8 mmol, 1.5當量)。攪拌反應混合物過夜。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層以提供化合物3
9(2.44 g, 80%收率)，其為白色固體。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：355.35; MW實際：356.16 [M + H]
+。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 5.43 (s, 1H), 3.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.25 (dd, J = 13.1, 7.0 Hz, 2H), 2.18 – 2.11 (m, 2H), 1.67 – 1.48 (m, 6H), 1.46 – 1.34 (m, 4H), 1.33 – 1.16 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
(2)製備化合物
C68
在氮氣氛、室溫下，向化合物3
9(1 g, 2.82 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (724 mg, 4.23 mmol, 1.5當量)在無水DCM (10 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (1.27 g, 4.23 mmol, 1.5當量)。攪拌反應混合物2 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-5%的MeOH/DCM, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C68(1.29 g, 82%收率)，其為白色固體。產物通過
1H NMR表徵。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 3.90 – 3.75 (m, 2H), 3.63 – 3.57 (m, 2H), 3.23 (dd, J = 13.1, 6.9 Hz, 2H), 2.65 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.19 – 2.10 (m, 2H), 1.67 – 1.57 (m, 4H), 1.54 – 1.45 (m, 2H), 1.39 – 1.34 (m, 2H), 1.33 – 1.22 (m, 28H), 1.20 – 1.15 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。
實施例17：製備化合物C69
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
69：
(1)製備化合物4
5
在氮氣氛下，向2-(4-氟-3-硝基苯基)乙酸甲酯
4(5 g, 23.5 mmol, 1.0當量)和K
2CO
3(4.9 g, 35.3 mmol, 1.5當量)在無水DMF中的 (80 mL)中的溶液加入化合物5
1(6.9 g, 25.8 mmol, 1.1當量)。在55 °C下攪拌反應混合物6 h，然後加入冷水 (200 mL)。混合物用乙酸乙酯萃取三次，接著有機相用飽和LiCl溶液洗滌三次以及用鹽水洗滌一次。接著，有機相經無水Na
2SO
4乾燥並減壓濃縮以形成化合物
45，為黃色油狀物其不進一步純化而直接用於下一步驟。
(2)製備化合物
46
在冰浴下，向化合物4
5(10.8 g, 23.5 mmol, 1.0當量)在THF/H
2O (9:1, 130 mL)中的溶液加入HCOONH
4(8.9 g, 141 mmol, 6.0當量)和Zn粉 (9.2 g, 141 mmol, 6.0當量)。攪拌10分鐘後，從冰浴移出反應混合物並室溫攪拌過夜。然後，過濾反應混合物並減壓濃縮。在這之後，將水(200 mL)加入到混合物中，接著，混合物用乙酸乙酯萃取三次，用鹽水洗滌有機相一次。在經Na
2SO
4乾燥並減壓濃縮後，形成產物4
6，其接著不經進一步純化而直接用於下一步驟。
(3)製備化合物
47
在氮氣氛下，向化合物4
6(5 g, 11.6 mmol, 1.0當量)在EtOH (60 mL)中的溶液加入3-((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)丙醛
7(3.3 g, 17.4 mmol, 1.5當量)和AcOH (2.7 mL, 46.4 mmol, 4.0當量)。在80°C下攪拌反應混合物過夜，然後減壓濃縮。接著加入飽和NaHCO
3溶液(100 mL)，混合物用乙酸乙酯萃取三次，然後合併有機相並用鹽水洗滌，經Na
2SO
4乾燥並濃縮。所得到的殘餘化合物通過快速色譜法(矽膠, 梯度洗脫劑: 10-40%的乙酸乙酯/石油醚)純化以提供化合物
47(1.5 g, 22%收率)，其為淡黃色油狀物。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：598.99; MW實際：599.72 [M + H]
+。
1 H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 7.59 (s, 1H), 7.24 (d,
J= 8.3 Hz, 1H), 7.16 (d,
J= 8.3 Hz, 1H), 5.40 – 5.31 (m, 2H), 4.17 – 4.09 (m, 4H), 3.74 (s, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.09 (t,
J= 6.9 Hz, 2H), 2.06 – 1.92 (m, 4H), 1.81 – 1.72 (m, 2H), 1.39 – 1.19 (m, 22H), 0.88 (t,
J= 6.5 Hz, 3H), 0.86 (s, 9H) , 0.01 (s, 6H)。
(4)製備化合物
48
在氮氣氛下，向化合物4
7(1.5 g, 2.5 mmol, 1.0當量)在THF (10 mL)中的溶液加入2 M HCl溶液(10 mL)。室溫攪拌反應混合物2 h。將20 mL飽和NaHCO
3溶液加入到反應中。接著用乙酸乙酯萃取混合物兩次，用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層。將所得的殘餘物溶於DCM (10 mL)，將三乙胺 (0.4 g, 3.8 mmol, 1.5當量)和DMTrCl (1.1 g, 3.3 mmol, 1.3當量)加入其中。室溫攪拌反應混合物6 h，在此之後減壓濃縮。所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 20-50%的乙酸乙酯/石油醚)純化以提供化合物
48(1.5 g, 76%收率)，其為淡黃色油狀物。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：787.1; MW實際：788.1 [M + H]
+。
1 H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 7.56 (s, 1H), 7.34 (d,
J= 7.1 Hz, 2H), 7.25 – 7.13 (m, 9H), 6.75 (d,
J= 8.8 Hz, 4H), 5.41 – 5.30 (m, 2H), 4.13 – 4.07 (m, 2H), 3.76 (s, 6H), 3.73 (s, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.60 (t,
J= 7.0 Hz, 2H), 3.11 (t,
J= 6.9 Hz, 2H), 1.99 (t,
J= 15.9 Hz, 4H), 1.77 – 1.65 (m, 2H), 1.33 – 1.23 (m, 22H), 0.87 (t,
J= 6.8 Hz, 3H).
(5)製備化合物C
69
在氮氣氛和冰浴下，向化合物4
8(1.5 g, 1.9 mmol, 1.0當量)在無水THF (20 mL)中的溶液加入LiAlH
4(73 mg, 1.9 mmol, 1.0當量)。10分鐘後，將混合物移至室溫並攪拌1 h。然後將反應移至冰浴，將飽和酒石酸鈉鉀溶液(10 mL)緩慢加入到混合物中。30分鐘後，用乙酸乙酯萃取反應三次，然後合併有機相並用鹽水洗滌，經Na
2SO
4乾燥並濃縮。在氮氣氛、室溫下，將粗產物(1.3 g, 1.7 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (587 mg, 3.4 mmol, 2當量)溶於無水DCM (10 mL)，加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (1.0 g, 3.4 mmol, 2當量)。攪拌反應混合物6 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 10-30%的乙酸乙酯/石油醚, 1% Et
3N)純化以提供化合物C
69(1.2 g, 78%收率)，其為淡黃色油狀物。產物通過質譜法和
1H NMR表徵。MW計算：959.31; MW實際：876.75 [M-二異丙基 + H]
+。
1 H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ 7.50 (s, 1H), 7.34 (d,
J= 7.2 Hz, 2H), 7.25 – 7.14 (m, 8H), 7.09 (d,
J= 8.2 Hz, 1H), 6.75 (d,
J= 8.8 Hz, 4H), 5.41 – 5.31 (m, 2H), 4.13 – 4.05 (m, 2H), 3.93 – 3.83 (m, 1H), 3.81 – 3.70 (m, 9H), 3.64 – 3.54 (m, 4H), 3.11 (t,
J= 7.0 Hz, 2H), 3.03 (t,
J= 7.3 Hz, 2H), 2.57 – 2.47 (m, 2H), 2.07 – 1.92 (m, 4H), 1.77 – 1.66 (m, 2H), 1.34 – 1.24 (m, 22H), 1.18 – 1.12 (m, 12H), 0.87 (t,
J= 6.7 Hz, 3H)。
實施例18：製備本公開的化合物C70
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
70 ：
(1)製備化合物
C70
在氮氣氛、室溫下，向化合物4
9(1.00 g, 3.73 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.27 g, 7.45 mmol, 2.0當量)在無水DCM (19 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (2.36 mL, 7.45 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物8 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-2%的乙酸乙酯/石油醚, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C70(1.65 g, 94%收率)，其為無色油狀物。產物通過
1H NMR表徵。
1 H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ
5.40 – 5.36 (m, 2H), 3.86 – 3.76 (m, 2H), 3.62 – 3.52 (m, 4H), 2.65 (t, 2H), 1.99 – 1.91 (m, 4H), 1.66 – 1.59 (m, 2H), 1.35 – 1.25 (m, 22H), 1.20 – 1.18 (m, 12H), 0.88 (t,
J= 6.8 Hz, 3H)。
實施例19：製備本公開的化合物C71
在本實施例中，使用以下程式製備化合物C
71：
(1)製備化合物
C71
在氮氣氛、室溫下，向化合物5
0(1.00 g, 3.75 mmol, 1.0當量)和二異丙基銨鹽四氮唑 (1.28 g, 7.51 mmol, 2.0當量)在無水DCM (20 mL)中的溶液加入3-((雙(二異丙基氨基)膦基)氧基)丙腈 (2.38 mL, 7.51 mmol, 2.0當量)。攪拌反應混合物6 h。混合物用DCM萃取兩次，然後用鹽水洗滌並用無水Na
2SO
4乾燥。減壓濃縮有機層，所得的殘餘物通過快速色譜法 (矽膠, 梯度洗脫劑: 1-2%的乙酸乙酯/石油醚, 1% Et
3N)純化以提供化合物
C71(1.5 g, 90%收率)，其為無色油狀物。產物通過
1H NMR表徵。
1 H NMR (400 MHz, CDCl
3) δ
5.45 – 5.28 (m, 4H), 3.85 – 3.75 (m, 2H), 3.64 – 3.53 (m, 4H), 2.65 (t,
J= 6.6 Hz, 2H), 2.09 – 2.00 (m, 4H), 1.64 – 1.58 (m, 2H), 1.41 – 1.24 (m, 18H), 1.21 – 1.17 (m, 12H), 0.89 (t,
J= 6.7 Hz, 3H)。
實施例20:LDEC偶聯的ASO的合成和設計
RD-10004 (ASO-10-27, SEQ ID NO: 1)是以SMN2基因的前體mRNA為靶標的ASO，通過將外顯子7包含到成熟mRNA中，並因此將細胞中的
SMN2 Δ 7(缺失外顯子7的
SMN2)「轉換」成
SMN2FL(即，包含外顯子7的全長
SMN2) mRNA來調控其剪接，由此提高
SMN2FLmRNA編碼的SMN蛋白的水準。它是通過藥物化學（即，2'MOE和PS修飾）合成的，並且沒有脂質偶聯。
當通過將LDEC分別共價連接至RD-10004的5'端、3'端或3'和5'端來合成示例性LDEC偶聯物時，RD-10004的序列和化學修飾保持不變。下表1示出了寡核苷酸序列和偶聯物。
表1：ASO和LDEC-ASO序列
注：大寫字母，RNA；*，硫代磷酸酯（PS）主鏈修飾；me, 2'-O-甲氧基乙基（2'MOE）；C，5-甲基胞嘧啶；
U ，5-甲基尿嘧啶。
| 寡核苷酸名稱 | 靶基因 | LDEC | SEQ ID NO | 序列 (5'-3') | 大小 (nt) |
| RD-10004 | SMN2 | n/a | 1 | me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-14644 | SMN2 | 化合物C1 (C5x5) | 2 | C5x5-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-14645 | SMN2 | 化合物C2 (C5x8) | 3 | me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG-C5x8 | 18 |
| RD-14646 | SMN2 | 化合物C1 &C2 (C5x5&C5x8) | 4 | C5x5-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG-C5x8 | 18 |
| RD-15865 | SMN2 | 化合物C55 (C5x17) | 5 | C5x17-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16070 | SMN2 | 化合物C56 (C5x18) | 6 | C5x18-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16071 | SMN2 | 化合物C57 (C5x19) | 7 | C5x19-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16072 | SMN2 | 化合物C58 (C5x20) | 8 | C5x20-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16073 | SMN2 | 化合物C59 (C5x21) | 9 | C5x21-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16074 | SMN2 | 化合物C60 (C5x22) | 10 | C5x22-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16075 | SMN2 | 化合物C61 (C5x23) | 11 | C5x23-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16076 | SMN2 | 化合物C62 (C5x24) | 12 | C5x24-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16077 | SMN2 | 化合物C63 (C5x25) | 13 | C5x25-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16078 | SMN2 | 化合物C64 (C5x26) | 14 | C5x26-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16079 | SMN2 | 化合物C65 (C5x27) | 15 | C5x27-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16080 | SMN2 | 化合物C66 (C5x28) | 16 | C5x28-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16081 | SMN2 | 化合物C67 (C5x29) | 17 | C5x29-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16198 | SMN2 | 化合物C68 (C5x30) | 18 | C5x30-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16935 | SMN2 | 化合物C69 (C5x31) | 19 | C5x31-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16936 | SMN2 | 化合物C70 (C5x32) | 20 | C5x32-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
| RD-16937 | SMN2 | 化合物C71 (C5x33) | 21 | C5x33-me U *me C *meA*me C *me U *me U *me U *me C *meA*me U *meA*meA*me U *meG*me C *me U *meG*meG | 18 |
實施例21:LDEC-ASO在外顯子7包含中的體內活性以及通過SC給藥在III型SMA小鼠骨骼肌中的
SMN2FLmRNA的誘導
為了比較LDEC-ASO (即，RD-14644)和非偶聯的RD-10004在骨骼肌組織中調控
SMN2剪接方面的活性，通過SC注射，在PND 40-50時，用10 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg劑量的RD-14644或RD-10004處理Ш型SMA雌性小鼠。僅用生理鹽水的處理被用作載劑對照以建立
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA的基線表達水準。處理後第14天處死小鼠，並通過RT-qPCR對二頭肌（圖1A）、半腱肌（圖1B）、頸闊肌（圖1C）和臀肌（圖1D）肌肉組織中的
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA水準進行定量。在所有劑量下，與RD-10004相比，RD-14644在每種肌肉組織中測量到
SMN2FL mRNA水準高於SMN2Δ7 mRNA水準（圖1A-D）。表2總結了SC處理後相對於生理鹽水對照組的SMN2FL和SMN2Δ7轉錄物水準的平均倍數變化。總體而言，與非偶聯的ASO（即，RD-10004）相比，LDEC偶聯增強的ASO（例如RD-14644）在肌肉組織中對外顯子7包含和SMN2FL轉錄物誘導具有改善的效力。
表2：經LDEC-ASO體內處理後骨骼肌中的
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA水準
| 二頭肌 | |||||||
| 組 | 劑量 (mg/kg) | SMN2FL (倍數變化) | P 值 | SMN2Δ7 (倍數變化) | P值 | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | ||||
| 生理鹽水 (n=4) | - | 1.00 | 0.036 | - | 1.00 | 0.015 | - |
| RD-10004 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.04 | 0.080 | ns | 0.86 | 0.088 | ns |
| 30 | 1.04 | 0.095 | ns | 0.78 | 0.064 | ns | |
| 100 | 1.57 | 0.039 | * | 0.66 | 0.012 | # | |
| RD-14644 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.41 | 0.007 | ns | 0.78 | 0.025 | ns |
| 30 | 1.62 | 0.078 | ** | 0.39 | 0.020 | #### | |
| 100 | 1.94 | 0.082 | *** | 0.10 | 0.008 | #### | |
| 半腱肌 | |||||||
| 組 | 劑量(mg/kg) | SMN2FL (倍數變化) | P 值 | SMN2Δ7 (倍數變化) | P值 | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | ||||
| 生理鹽水 (n=4) | - | 1.00 | 0.040 | - | 1.00 | 0.030 | - |
| RD-10004 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.32 | 0.086 | ns | 1.13 | 0.039 | ns |
| 30 | 1.20 | 0.050 | ns | 1.11 | 0.045 | ns | |
| 100 | 1.58 | 0.055 | * | 0.83 | 0.042 | ns | |
| RD-14644 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.45 | 0.030 | ns | 1.11 | 0.073 | ns |
| 30 | 1.79 | 0.075 | ** | 0.66 | 0.022 | # | |
| 100 | 2.11 | 0.170 | *** | 0.21 | 0.012 | #### | |
| 頸闊肌 | |||||||
| 組 | 劑量 (mg/kg) | SMN2FL (倍數變化) | P值 | SMN2Δ7 (倍數變化) | P值 | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | ||||
| 生理鹽水 (n=4) | - | 1.00 | 0.028 | - | 1.00 | 0.026 | - |
| RD-10004 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.60 | 0.039 | ns | 1.00 | 0.032 | ns |
| 30 | 1.86 | 0.122 | ** | 0.60 | 0.022 | ### | |
| 100 | 1.97 | 0.034 | ** | 0.43 | 0.054 | #### | |
| RD-14644 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 2.45 | 0.100 | **** | 0.52 | 0.012 | #### |
| 30 | 2.10 | 0.103 | ** | 0.23 | 0.018 | #### | |
| 100 | 2.37 | 0.180 | *** | 0.11 | 0.004 | #### | |
| 臀肌 | |||||||
| 組 | 劑量 (mg/kg) | SMN2FL (倍數變化) | P值 | SMN2Δ7 (倍數變化) | P值 | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | ||||
| 生理鹽水 (n=4) | - | 1.00 | 0.036 | - | 1.00 | 0.020 | - |
| RD-10004 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.32 | 0.050 | ns | 0.96 | 0.055 | ns |
| 30 | 1.18 | 0.005 | ns | 0.84 | 0.019 | ns | |
| 100 | 1.54 | 0.015 | ** | 0.62 | 0.018 | ## | |
| RD-14644 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.47 | 0.061 | * | 0.93 | 0.056 | ns |
| 30 | 1.92 | 0.075 | **** | 0.53 | 0.030 | #### | |
| 100 | 2.21 | 0.110 | **** | 0.15 | 0.020 | #### |
注：「SEM」表示平均值的標準誤差。*/#表示
p＜ 0.05, ** /##表示
p＜ 0.01, *** /###表示
p＜ 0.001, ****/#### 表示
p＜ 0.0001, 並且"ns"表示沒有統計學顯著性（相比於生理鹽水組）。
實施例22:通過SC給予LDEC-ASO，將III型SMA小鼠的外周組織（即，心臟和肝）中的
SMN2Δ7轉化為
SMN2FL轉錄物
為了比較LDEC-ASO (即，RD-14644、RD-14645和RD-14646)和非偶聯的RD-10004在肝中調控
SMN2剪接方面的活性，通過SC注射，在給藥後14天，通過RT-qPCR對III型SMA雌性小鼠的組織中的
SMN2FL 和 SMN2Δ7表達進行定量。如圖2A所示，與RD-10004相比，每種LDEC-ASO（即RD-14644、RD-14645和RD-14646）在增加
SMN2FL產量方面具有劑量依賴性回應，對於RD-10004，僅測量了最高劑量（即，100 mg/kg）時剪接活性的統計差異。
在心臟中，與RD-10004相比，用LDEC-ASO（即，RD-14644）處理還測量到
SMN2FLmRNA水準高於
SMN2 Δ 7mRNA水準（圖2B）。事實上，僅LDEC偶聯物（即，RD-14644）證明瞭劑量依賴性剪接活性，而RD-10004在所測度的劑量（即，10 mg/kg、30 mg/kg和100 mg/kg）下沒有或幾乎沒有活性。
表3總結了相對於生理鹽水對照組，用所指示的LDEC-ASO處理後，在肝和心臟中的
SMN2FL和
SMN2Δ7表達結果。類似於肌肉組織中的結果，資料表明，LDEC偶聯在外周組織（即，心臟和肝）中也增強了遞送以及隨後的RD-10004的剪接活性。
表3：經LDEC-ASO體內處理後肝或心臟中的
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA水準
注：「SEM」表示平均值的標準誤差。*/#表示
p＜ 0.05, ** /##表示
p＜ 0.01, *** /###表示
p＜ 0.001, ****/#### 表示
p＜ 0.0001,並且"ns"表示沒有統計學顯著性（相比於生理鹽水組）。
| 肝 | |||||||
| 組 | 劑量(mg/kg) | SMN2FL (倍數變化) | P值 | SMN2Δ7 (倍數變化) | P值 | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | ||||
| 生理鹽水 (n=4) | - | 1.00 | 0.028 | - | 1.00 | 0.03 | - |
| RD-10004 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.33 | 0.096 | ns | 0.79 | 0.04 | ns |
| 30 | 1.37 | 0.066 | ns | 1.02 | 0.05 | ns | |
| 100 | 2.49 | 0.130 | ** | 0.69 | 0.05 | ns | |
| RD-14644 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.60 | 0.084 | ns | 1.01 | 0.03 | ns |
| 30 | 2.49 | 0.071 | ** | 0.24 | 0.01 | #### | |
| 100 | 3.20 | 0.067 | **** | 0.08 | 0.01 | #### | |
| RD-14645 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.51 | 0.096 | ns | 1.12 | 0.13 | ns |
| 30 | 2.98 | 0.319 | **** | 0.64 | 0.03 | # | |
| 100 | 3.31 | 0.180 | **** | 0.08 | 0.01 | #### | |
| RD-14646 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.50 | 0.098 | ns | 0.84 | 0.04 | ns |
| 30 | 2.42 | 0.181 | ** | 0.85 | 0.04 | ns | |
| 100 | 3.06 | 0.225 | **** | 0.38 | 0.02 | #### | |
| 心臟 | |||||||
| 組 | 劑量(mg/kg) | SMN2FL (倍數變化) | P值 | SMN2Δ7 (倍數變化) | P值 | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | ||||
| 生理鹽水 (n=4) | - | 1.00 | 0.009 | - | 1.00 | 0.017 | - |
| RD-10004 (n=3只小鼠/劑量) | 10 | 1.24 | 0.022 | *** | 0.92 | 0.016 | ns |
| 30 | 1.12 | 0.008 | ns | 0.93 | 0.016 | ns | |
| 100 | 1.22 | 0.028 | *** | 0.84 | 0.039 | ns | |
| RD-14644 (n=2-3只小鼠/劑量) | 10 | 1.12 | 0.023 | ns | 0.81 | 0.038 | # |
| 30 | 1.40 | 0.007 | **** | 0.49 | 0.010 | #### | |
| 100 | 1.75 | 0.046 | **** | 0.17 | 0.020 | #### |
實施例23：通過SC給予LDEC-ASO，將III型SMA小鼠的外周組織和骨骼肌中的
SMN2Δ7轉化為
SMN2FL轉錄物
為了進一步比較LDEC-ASO (即，RD-14644)和非偶聯的RD-10004在外周組織和骨骼肌中調控
SMN2剪接方面的活性，通過SC注射，在PND 40-50時，將30 mg/kg的LDEC-ASO (即
，RD-14644)或非偶聯對照（即，RD-10004）給藥到Ш型SMA雌性小鼠中。僅aCSF的處理被用作載劑對照以建立
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA的基線表達水準。在通過SC注射後14天時，通過RT-qPCRC對III型SMA雌性小鼠的組織中的
SMN2FL和
SMN2Δ7表達進行定量。治療動物的外周組織(即，心臟、肝、脂肪組織、膈膜、帶靜脈的胸主動脈)和骨骼肌(即，二頭肌、半腱肌、頸闊肌和臀肌)中
SMN2FL或
SMN2Δ7的平均表達水準顯示於圖3A-3B，其表明LDEC偶聯還增強了RD-10004在外周組織和骨骼肌中的遞送和隨後的剪接活性。
實施例24:通過IV給予LDEC-ASO，將III型SMA小鼠的外周組織中的
SMN2Δ7轉化為
SMN2FL轉錄物
為了比較LDEC-ASO (即，RD-14644和RD-14645)和非偶聯的RD-10004在調控
SMN2剪接方面的活性，在股靜脈（IV）注射後第14天，通過RT-qPCR利用III型SMA雌性小鼠的組織，對
SMN2FL 和 SMN2Δ7表達進行定量。僅用生理鹽水的處理被用作載劑對照以建立
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA的基線表達水準。如圖4A-4F所示，在外周組織（即，肝、脂肪組織、胸主動脈、心臟、膈膜和肺）中，與RD-10004相比，每種LDEC-ASO（即，RD-14644和RD-14645）均增加了
SMN2FL產生。表4示出了相對於生理鹽水對照組，用所指示的LDEC-ASO處理後的
SMN2FL和
SMN2Δ7表達結果。
表4：經LDEC-ASO體內處理後的SMN2FL和SMN2Δ7 mRNA水準
| 肝 | ||||
| 組 (n=2-3/組) | SMN2FL mRNA (倍數變化) | SMN2Δ7 mRNA (倍數變化) | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | |
| 生理鹽水 | 1.00 | 0.04 | 1.00 | 0.04 |
| RD-10004 | 1.53 | 0.07 | 0.71 | 0.04 |
| RD-14644 | 2.79 | 0.01 | 0.14 | 0.01 |
| RD-14645 | 1.97 | 0.01 | 0.58 | 0.03 |
| 脂肪組織 (附睾脂肪) | ||||
| 組 (n=2-3/組) | SMN2FL mRNA (倍數變化) | SMN2Δ7 mRNA (倍數變化) | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | |
| 生理鹽水 | 1.00 | 0.17 | 1.00 | 0.09 |
| RD-10004 | 1.28 | 0.28 | 0.98 | 0.05 |
| RD-14644 | 3.81 | 0.58 | 0.47 | 0.02 |
| RD-14645 | 2.51 | 0.15 | 0.81 | 0.01 |
| 胸主動脈 | ||||
| 組 (n=2-3/組) | SMN2FL mRNA (倍數變化) | SMN2Δ7 mRNA (倍數變化) | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | |
| 生理鹽水 | 1.00 | 0.06 | 1.00 | 0.03 |
| RD-10004 | 0.93 | 0.01 | 1.15 | 0.03 |
| RD-14644 | 1.92 | 0.00 | 0.39 | 0.01 |
| RD-14645 | 1.63 | 0.06 | 0.79 | 0.03 |
| 心臟 | ||||
| 組 (n=3/組) | SMN2FL mRNA (倍數變化) | SMN2Δ7 mRNA (倍數變化) | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | |
| 生理鹽水 | 1.00 | 0.05 | 1.00 | 0.02 |
| RD-10004 | 1.03 | 0.04 | 1.13 | 0.03 |
| RD-14644 | 1.60 | 0.05 | 0.69 | 0.03 |
| 隔膜 | ||||
| 組 (n=3/組) | SMN2FL mRNA (倍數變化) | SMN2Δ7 mRNA (倍數變化) | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | |
| 生理鹽水 | 1.00 | 0.05 | 1.00 | 0.06 |
| RD-10004 | 1.00 | 0.01 | 0.89 | 0.03 |
| RD-14644 | 1.52 | 0.05 | 0.66 | 0.03 |
| 肺 | ||||
| 組 (n=3/組) | SMN2FL mRNA (倍數變化) | SMN2Δ7 mRNA (倍數變化) | ||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | |
| 生理鹽水 | 1.00 | 0.02 | 1.00 | 0.05 |
| RD-10004 | 0.93 | 0.04 | 0.91 | 0.02 |
| RD-14644 | 1.31 | 0.02 | 0.66 | 0.02 |
| 注：「SEM」表示平均值的標準誤差。 |
實施例25:通過LDEC-ASO處理，將GM03813和GM09677細胞中的
SMN2Δ7轉化為
SMN2FL轉錄物
為了測試各種LDEC-ASO的體外活性，分別將所指示的LDEC-ASO（即，RD-15865、RD-16070、RD-16071、RD-16072、RD-16073、RD-16074、RD-16075、RD-16076、RD-16077、RD-16078、RD-16079、RD-16080、RD-16081和RD-16098）以0.1 nM、1 nM和10 nM轉染到GM03813和GM09677細胞中，持續3天。類比處理是不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。dsCon2作為非特異性雙鏈體對照。
SMN2FL和
SMN2Δ7的mRNA水準通過RT-qPCR確定。圖5A-5B示出了在1nM和10 nM下，
SMN2FL和
SMN2Δ7的mRNA表達。表5總結了GM03813細胞中的
SMN2FL和
SMN2Δ7的表達結果。
表5：經LDEC-ASO處理後GM03813細胞中的
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA水準（倍數變化）
注：「SEM」表示平均值的標準誤差。
| ASO (n=2/組) | 濃度(1 nM) | 濃度(10 nM) | ||||||
| SMN2FL mRNA | SMN2Δ7 mRNA | SMN2FL mRNA | SMN2Δ7 mRNA | |||||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | |
| 模擬 | 1.00 | 0.017 | 1.00 | 0.023 | 1.00 | 0.017 | 1.000 | 0.023 |
| dsCon2 | 1.05 | 0.015 | 1.02 | 0.006 | 1.05 | 0.015 | 1.018 | 0.006 |
| RD-10004 | 1.36 | 0.055 | 0.71 | 0.030 | 1.91 | 0.058 | 0.313 | 0.029 |
| RD-15865 | 1.97 | 0.019 | 0.20 | 0.007 | 2.47 | 0.036 | 0.004 | 0.0005 |
| RD-16070 | 2.14 | 0.081 | 0.32 | 0.025 | 2.50 | 0.129 | 0.026 | 0.001 |
| RD-16071 | 2.14 | 0.160 | 0.19 | 0.007 | 2.20 | 0.046 | 0.011 | 0.0002 |
| RD-16072 | 2.40 | 0.129 | 0.16 | 0.013 | 2.38 | 0.009 | 0.004 | 0.001 |
| RD-16073 | 2.17 | 0.090 | 0.21 | 0.014 | 2.83 | 0.003 | 0.005 | 0.001 |
| RD-16074 | 2.33 | 0.006 | 0.22 | 0.005 | 2.51 | 0.101 | 0.006 | 0.001 |
| RD-16075 | 2.31 | 0.003 | 0.15 | 0.003 | 2.33 | 0.102 | 0.003 | 0.0003 |
| RD-16076 | 1.60 | 0.045 | 0.52 | 0.012 | 2.40 | 0.085 | 0.075 | 0.004 |
| RD-16077 | 2.19 | 0.005 | 0.19 | 0.011 | 2.40 | 0.044 | 0.003 | 0.0004 |
| RD-16078 | 2.44 | 0.108 | 0.04 | 0.004 | 3.02 | 0.052 | 0.004 | 0.000 |
| RD-16079 | 2.22 | 0.068 | 0.16 | 0.002 | 2.78 | 0.109 | 0.008 | 0.001 |
| RD-16080 | 2.04 | 0.035 | 0.15 | 0.008 | 2.43 | 0.006 | 0.006 | 0.0004 |
| RD-16081 | 2.28 | 0.217 | 0.07 | 0.003 | 2.59 | 0.051 | 0.046 | 0.029 |
| RD-16098 | 2.48 | 0.015 | 0.06 | 0.002 | 2.46 | 0.036 | 0.004 | 0.0003 |
進一步地，圖6A-6B示出了在GM09677和GM03813細胞中，在0.1 nM和1 nM時的
SMN2FL和
SMN2 Δ 7的mRNA表達，並且結果於表6。
表6：經LDEC-ASO處理後GM09677和GM03813細胞中的
SMN2FL和
SMN2 Δ 7mRNA水準（倍數變化）
注：「SEM」表示平均值的標準誤差。
| ASO (n=2/組) | ASO 濃度(0.1 nM) | ASO 濃度(1 nM) | ||||||
| SMN2FL mRNA | SMN2Δ7 mRNA | SMN2FL mRNA | SMN2Δ7 mRNA | |||||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | |
| GM09677 細胞 | ||||||||
| 模擬 | 1.00 | 0.053 | 1.00 | 0.074 | 1.00 | 0.053 | 1.00 | 0.074 |
| dsCon2 | 0.67 | 0.000 | 0.92 | 0.053 | 0.67 | 0.000 | 0.92 | 0.053 |
| RD-10004 | 3.95 | 0.021 | 0.71 | 0.035 | 3.92 | 0.152 | 0.60 | 0.085 |
| RD-15865 | 3.65 | 0.152 | 0.53 | 0.039 | 5.48 | 0.392 | 0.32 | 0.028 |
| RD-16070 | 3.99 | 0.308 | 0.68 | 0.057 | 5.58 | 0.293 | 0.56 | 0.035 |
| RD-16071 | 2.79 | 0.453 | 0.58 | 0.088 | 4.15 | 0.223 | 0.39 | 0.000 |
| RD-16072 | 3.83 | 0.081 | 0.77 | 0.025 | 5.21 | 0.134 | 0.49 | 0.014 |
| RD-16073 | 3.02 | 0.438 | 0.57 | 0.071 | 3.81 | 0.537 | 0.40 | 0.103 |
| RD-16074 | 2.70 | 0.046 | 0.65 | 0.046 | 3.42 | 0.240 | 0.42 | 0.025 |
| RD-16075 | 2.78 | 0.053 | 0.67 | 0.000 | 4.12 | 0.237 | 0.50 | 0.028 |
| RD-16076 | 2.97 | 0.117 | 0.72 | 0.004 | 3.69 | 0.138 | 0.74 | 0.046 |
| RD-16077 | 2.85 | 0.177 | 0.70 | 0.025 | 3.61 | 0.156 | 0.37 | 0.021 |
| RD-16078 | 3.45 | 0.011 | 0.56 | 0.007 | 5.14 | 0.233 | 0.17 | 0.004 |
| RD-16079 | 3.42 | 0.170 | 0.75 | 0.021 | 5.81 | 0.000 | 0.20 | 0.060 |
| RD-16080 | 3.33 | 0.000 | 0.67 | 0.011 | 5.04 | 0.060 | 0.27 | 0.011 |
| RD-16081 | 3.54 | 0.095 | 0.64 | 0.000 | 5.17 | 0.191 | 0.23 | 0.018 |
| RD-16098 | 3.86 | 0.000 | 0.61 | 0.000 | 5.20 | 0.000 | 0.15 | 0.000 |
| - | GM03813 細胞 | |||||||
| 模擬 | 1.00 | 0.014 | 1.00 | 0.007 | 1.00 | 0.014 | 1.00 | 0.007 |
| dsCon2 | 0.96 | 0.039 | 0.98 | 0.007 | 0.96 | 0.039 | 0.98 | 0.007 |
| RD-10004 | 1.01 | 0.011 | 0.65 | 0.014 | 1.22 | 0.011 | 0.53 | 0.018 |
| RD-15865 | 1.53 | 0.269 | 0.37 | 0.138 | 1.44 | 0.230 | 0.32 | 0.113 |
| RD-16070 | 1.11 | 0.028 | 0.61 | 0.011 | 1.77 | 0.088 | 0.23 | 0.004 |
| RD-16071 | 1.04 | 0.000 | 0.62 | 0.049 | 1.67 | 0.004 | 0.23 | 0.007 |
| RD-16072 | 1.03 | 0.049 | 0.56 | 0.014 | 1.63 | 0.011 | 0.19 | 0.004 |
| RD-16073 | 1.07 | 0.021 | 0.58 | 0.004 | 1.73 | 0.011 | 0.25 | 0.007 |
| RD-16074 | 1.12 | 0.014 | 0.65 | 0.014 | 1.74 | 0.057 | 0.21 | 0.004 |
| RD-16075 | 1.04 | 0.074 | 0.70 | 0.064 | 1.61 | 0.092 | 0.25 | 0.014 |
| RD-16076 | 1.10 | 0.021 | 0.66 | 0.025 | 1.49 | 0.028 | 0.47 | 0.000 |
| RD-16077 | 1.08 | 0.099 | 0.71 | 0.081 | 1.73 | 0.067 | 0.26 | 0.011 |
| RD-16078 | 1.32 | 0.035 | 0.33 | 0.014 | 2.02 | 0.085 | 0.05 | 0.004 |
| RD-16079 | 1.31 | 0.000 | 0.64 | 0.004 | 1.75 | 0.018 | 0.12 | 0.000 |
| RD-16080 | 1.31 | 0.004 | 0.57 | 0.042 | 1.91 | 0.081 | 0.16 | 0.014 |
| RD-16081 | 1.33 | 0.004 | 0.46 | 0.028 | 1.86 | 0.018 | 0.10 | 0.004 |
| RD-16098 | 1.44 | 0.039 | 0.45 | 0.035 | 2.16 | 0.134 | 0.06 | 0.007 |
實施例26:通過LDEC-ASO處理，將GM03813細胞中的
SMN2Δ7轉化為
SMN2FL轉錄物
為了測試其中的脂質含有18個碳原子的LDEC-ASO的體外活性，以1 nM和10 nM將所指示的LDEC-ASO（即，RD-16935、RD-16936和RD-16937）轉染到GM03813細胞中，持續3天。轉染RD-10004並用作非偶聯對照。如圖7A所示，在1nM時，所有LDEC-ASO呈現出類似或優於非偶聯物RD-10004的剪接活性。如圖7B所示，當濃度增加至10nM時，與非偶聯物RD-10004相比，所有LDEC-ASO呈現相似的剪接活性，這表明ASO的剪接活性可能在10nM時達到平臺期。GM03813細胞中相對於模擬對照，在1 nM和10 nM時
SMN2FL和
SMN2Δ7的mRNA表達總結於表7。
表7：經LDEC-ASO處理後的GM03813細胞中
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA水準
注：「SEM」表示平均值的標準誤差。
| ASO (n=4/組) | 濃度(1 nM) | 濃度(10 nM) | ||||||
| SMN2FL mRNA | SMN2Δ7 mRNA | SMN2FL mRNA | SMN2Δ7 mRNA | |||||
| 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | 平均值 | SEM | |
| 模擬 | 1.00 | 0.019 | 1.00 | 0.009 | 1.00 | 0.019 | 1.00 | 0.009 |
| RD-10004 | 1.29 | 0.027 | 0.62 | 0.028 | 2.09 | 0.095 | 0.16 | 0.043 |
| RD-16935 | 1.21 | 0.033 | 0.77 | 0.031 | 2.03 | 0.026 | 0.03 | 0.006 |
| RD-16936 | 1.46 | 0.094 | 0.72 | 0.019 | 2.05 | 0.013 | 0.02 | 0.001 |
| RD-16937 | 1.44 | 0.051 | 0.61 | 0.059 | 1.87 | 0.013 | 0.01 | 0.000 |
實施例27:以人
SCN9A轉錄物為靶標的ASO的設計和合成
使用PFRD程式針對SCN9A mRNA序列（ENST00000409672，SEQ ID NO：22，參見表8）設計20個核苷酸（nt）的Gapmer ASO，其具有10 nt DNA 間隙和兩個5 nt翼）（Sciabola等人，PFRED: A computational platform for siRNA and antisense oligonucleotides design（siRNA 和反義寡核苷酸設計的計算平臺）.
PLoS One. 2021;16(1):e0238753. 2021年1月22日出版. doi:10.1371/journal.pone.0238753）。
表8：用於ASO設計的人
SCN9AcDNA序列
首先採用以下標準篩選所得到的ASO：(i) 40%至70%的GC含量；(ii) 少於5個連續相同的核苷酸；(iii) 少於3個二核苷酸或三核苷酸重複；和(iv)不在
SCN9AmRNA的5’ UTR區域上。然後根據程式提供的每個ASO的PLSpred_optimized分數從最大到最小對剩餘的ASO進行排序，選擇前119個ASO作為體外篩選的候選者。ASO序列是通過化學修飾合成的，與它們的同源靶序列一起列於表9中。
表9：人
SCN9A轉錄物中的ASO序列和同源靶點
注：大寫字母，RNA；小寫字母，DNA；*，硫代磷酸酯（PS）主鏈修飾；me, 2'-O-甲氧基乙基（2'MOE）；
C ，5-甲基胞嘧啶；
U ，5-甲基尿嘧啶。"/"表示未示出。
| 寡核苷酸名稱 | 靶基因 | SEQ ID NO | 靶序列（ 5'-3' ） | SEQ ID NO | 未經修飾的裸序列 (5'-3') | SEQ ID NO | 經化學修飾的 ASO 序列 (5'-3') | 大小 (nt) | SCN9A mRNA 敲低活性 % | |
| 25 nM | 100 nM | |||||||||
| RD-12752 | SCN9A | 23 | gggtacacctgtgtgaaaat | 142 | AUUUUCaCaCaggtgUACCC | 261 | meA*me U *me U *me U *me U *C*a*C*a*C*a*g*g*t*g*me U *meA*me C *me C *me C | 20 | 52 | 41 |
| RD-12753 | SCN9A | 24 | tacacctgtgtgaaaattgg | 143 | CCAAUtttCaCaCagGUGUA | 262 | me C *me C *meA*meA*me U *t*t*t*C*a*C*a*C*a*g*meG*me U *meG*me U *meA | 20 | 51 | 50 |
| RD-12754 | SCN9A | 25 | acctgtgtgaaaattggcag | 144 | CUGCCaattttCaCaCAGGU | 263 | me C *me U *meG*me C *me C *a*a*t*t*t*t*C*a*C*a*me C *meA*meG*meG*me U | 20 | 63 | 58 |
| RD-12755 | SCN9A | 26 | gtgtgaaaattggcagaaac | 145 | GUUUCtgCCaattttCACAC | 264 | meG*me U *me U *me U *me C *t*g*C*C*a*a*t*t*t*t*me C *meA*me C *meA*me C | 20 | 46 | 45 |
| RD-12756 | SCN9A | 27 | ttcaacagatgttagaccgt | 146 | ACGGUCtaaCatCtgUUGAA | 265 | meA*me C *meG*meG*me U *C*t*a*a*C*a*t*C*t*g*me U *me U *meG*meA*meA | 20 | 48 | 45 |
| RD-12757 | SCN9A | 28 | tcaacagatgttagaccgtc | 147 | GACGGtCtaaCatCtGUUGA | 266 | meG*meA*me C *meG*meG*t*C*t*a*a*C*a*t*C*t*meG*me U *me U *meG*meA | 20 | 45 | 47 |
| RD-12758 | SCN9A | 29 | agagagttcttctgaaacat | 148 | AUGUUtCagaagaaCUCUCU | 267 | meA*me U *meG*me U *me U *t*C*a*g*a*a*g*a*a*C*me U *me C *me U *me C *me U | 20 | 29 | 21 |
| RD-12759 | SCN9A | 30 | agaagctctccagtggagag | 149 | CUCUCCaCtggagagCUUCU | 268 | me C *me U *me C *me U *me C *C*a*C*t*g*g*a*g*a*g*me C *me U *me U *me C *me U | 20 | 55 | 32 |
| RD-12760 | SCN9A | 31 | aaatgcacagtgctgtggac | 150 | GUCCACagCaCtgtgCAUUU | 269 | meG*me U *me C *me C *meA*C*a*g*C*a*C*t*g*t*g*me C *meA*me U *me U *me U | 20 | 68 | 44 |
| RD-12761 | SCN9A | 32 | atgcacagtgctgtggactg | 151 | CAGUCCaCagCaCtgUGCAU | 270 | me C *meA*meG*me U *me C *C*a*C*a*g*C*a*C*t*g*me U *meG*me C *meA*me U | 20 | 60 | 61 |
| RD-12762 | SCN9A | 33 | tgcacagtgctgtggactgc | 152 | GCAGUCCaCagCaCtGUGCA | 271 | meG*me C *meA*meG*me U *C*C*a*C*a*g*C*a*C*t*meG*me U *meG*me C *meA | 20 | 61 | 39 |
| RD-12763 | SCN9A | 34 | gcacagtgctgtggactgca | 153 | UGCAGtCCaCagCaCUGUGC | 272 | me U *meG*me C *meA*meG*t*C*C*a*C*a*g*C*a*C*me U *meG*me U *meG*me C | 20 | 66 | 60 |
| RD-12764 | SCN9A | 35 | cacagtgctgtggactgcaa | 154 | UUGCAgtCCaCagCaCUGUG | 273 | me U *me U *meG*me C *meA*g*t*C*C*a*C*a*g*C*a*me C *me U *meG*me U *meG | 20 | 38 | 36 |
| RD-12765 | SCN9A | 36 | acagtgctgtggactgcaac | 155 | GUUGCagtCCaCagCACUGU | 274 | meG*me U *me U *meG*me C *a*g*t*C*C*a*C*a*g*C*meA*me C *me U *meG*me U | 20 | 39 | 36 |
| RD-12766 | SCN9A | 37 | cagtgctgtggactgcaacg | 156 | CGUUGCagtCCaCagCACUG | 275 | me C *meG*me U *me U *meG*C*a*g*t*C*C*a*C*a*g*me C *meA*me C *me U *meG | 20 | 32 | 37 |
| RD-12767 | SCN9A | 38 | tgctgtggactgcaacggtg | 157 | CACCGttgCagtCCaCAGCA | 276 | me C *meA*me C *me C *meG*t*t*g*C*a*g*t*C*C*a*me C *meA*meG*me C *meA | 20 | 38 | 38 |
| RD-12768 | SCN9A | 39 | gctgtggactgcaacggtgt | 158 | ACACCgttgCagtCCACAGC | 277 | meA*me C *meA*me C *me C *g*t*t*g*C*a*g*t*C*C*meA*me C *meA*meG*me C | 20 | 30 | 44 |
| RD-12769 | SCN9A | 40 | ctgtggactgcaacggtgtg | 159 | CACACCgttgCagtCCACAG | 278 | me C *meA*me C *meA*me C *C*g*t*t*g*C*a*g*t*C*me C *meA*me C *meA*meG | 20 | 36 | 39 |
| RD-12773 | SCN9A | 41 | tgtggactgcaacggtgtgg | 160 | CCACACCgttgCagtCCACA | 279 | me C *me C *meA*me C *meA*C*C*g*t*t*g*C*a*g*t*me C *me C *meA*me C *meA | 20 | 34 | 35 |
| RD-12774 | SCN9A | 42 | gtggactgcaacggtgtggt | 161 | ACCACaCCgttgCagUCCAC | 280 | meA*me C *me C *meA*me C *a*C*C*g*t*t*g*C*a*g*me U *me C *me C *meA*me C | 20 | 22 | 26 |
| RD-12775 | SCN9A | 43 | tggactgcaacggtgtggtc | 162 | GACCACaCCgttgCaGUCCA | 281 | meG*meA*me C *me C *meA*C*a*C*C*g*t*t*g*C*a*meG*me U *me C *me C *meA | 20 | 44 | 30 |
| RD-12776 | SCN9A | 44 | ccaatggacagcttctgcca | 163 | UGGCAgaagCtgtCCAUUGG | 282 | me U *meG*meG*me C *meA*g*a*a*g*C*t*g*t*C*C*meA*me U *me U *meG*meG | 20 | 55 | 44 |
| RD-12777 | SCN9A | 45 | caatggacagcttctgccag | 164 | CUGGCagaagCtgtCCAUUG | 283 | me C *me U *meG*meG*me C *a*g*a*a*g*C*t*g*t*C*me C *meA*me U *me U *meG | 20 | 55 | 50 |
| RD-12778 | SCN9A | 46 | aacaaacactgtggaagaac | 165 | GUUCUtCCaCagtgtUUGUU | 284 | meG*me U *me U *me C *me U *t*C*C*a*C*a*g*t*g*t*me U *me U *meG*me U *me U | 20 | 57 | 55 |
| RD-12779 | SCN9A | 47 | acaaacactgtggaagaact | 166 | AGUUCttCCaCagtgUUUGU | 285 | meA*meG*me U *me U *me C *t*t*C*C*a*C*a*g*t*g*me U *me U *me U *meG*me U | 20 | 60 | 63 |
| RD-12780 | SCN9A | 48 | caaacactgtggaagaactt | 167 | AAGUUCttCCaCagtGUUUG | 286 | meA*meA*meG*me U *me U *C*t*t*C*C*a*C*a*g*t*meG*me U *me U *me U *meG | 20 | 61 | 44 |
| RD-12781 | SCN9A | 49 | gaaatttggtctttactgga | 168 | UCCAGtaaagaCCaaAUUUC | 287 | me U *me C *me C *meA*meG*t*a*a*a*g*a*C*C*a*a*meA*me U *me U *me U *me C | 20 | 36 | 45 |
| RD-12782 | SCN9A | 50 | agttggcaaaatcctggcca | 169 | UGGCCaggattttgCCAACU | 288 | me U *meG*meG*me C *me C *a*g*g*a*t*t*t*t*g*C*me C *meA*meA*me C *me U | 20 | 47 | 53 |
| RD-12783 | SCN9A | 51 | gttggcaaaatcctggccaa | 170 | UUGGCCaggattttgCCAAC | 289 | me U *me U *meG*meG*me C *C*a*g*g*a*t*t*t*t*g*me C *me C *meA*meA*me C | 20 | 18 | 28 |
| RD-12784 | SCN9A | 52 | ttggcaaaatcctggccaac | 171 | GUUGGCCaggattttGCCAA | 290 | meG*me U *me U *meG*meG*C*C*a*g*g*a*t*t*t*t*meG*me C *me C *meA*meA | 20 | 25 | 32 |
| RD-12792 | SCN9A | 53 | tggcaaaatcctggccaaca | 172 | UGUUGgCCaggatttUGCCA | 291 | me U *meG*me U *me U *meG*g*C*C*a*g*g*a*t*t*t*me U *meG*me C *me C *meA | 20 | 22 | 33 |
| RD-12793 | SCN9A | 54 | gcaaaatcctggccaacatt | 173 | AAUGUtggCCaggatUUUGC | 292 | meA*meA*me U *meG*me U *t*g*g*C*C*a*g*g*a*t*me U *me U *me U *meG*me C | 20 | 36 | 34 |
| RD-12794 | SCN9A | 55 | actgtatggaggtcgctggt | 174 | ACCAGCgaCCtCCatACAGU | 293 | meA*me C *me C *meA*meG*C*g*a*C*C*t*C*C*a*t*meA*me C *meA*meG*me U | 20 | 38 | 51 |
| RD-12795 | SCN9A | 56 | ctgtatggaggtcgctggtc | 175 | GACCAgCgaCCtCCaUACAG | 294 | meG*meA*me C *me C *meA*g*C*g*a*C*C*t*C*C*a*me U *meA*me C *meA*meG | 20 | 47 | 59 |
| RD-12796 | SCN9A | 57 | tgtatggaggtcgctggtca | 176 | UGACCagCgaCCtCCAUACA | 295 | me U *meG*meA*me C *me C *a*g*C*g*a*C*C*t*C*C*meA*me U *meA*me C *meA | 20 | 50 | 65 |
| RD-12797 | SCN9A | 58 | gtatggaggtcgctggtcaa | 177 | UUGACCagCgaCCtCCAUAC | 296 | me U *me U *meG*meA*me C *C*a*g*C*g*a*C*C*t*C*me C *meA*me U *meA*me C | 20 | 45 | 53 |
| RD-12798 | SCN9A | 59 | gttttggaagcagcgtggac | 178 | GUCCACgCtgCttCCAAAAC | 297 | meG*me U *me C *me C *meA*C*g*C*t*g*C*t*t*C*C*meA*meA*meA*meA*me C | 20 | 61 | 58 |
| RD-12799 | SCN9A | 60 | ttttggaagcagcgtggaca | 179 | UGUCCaCgCtgCttCCAAAA | 298 | me U *meG*me U *me C *me C *a*C*g*C*t*g*C*t*t*C*me C *meA*meA*meA*meA | 20 | 50 | 61 |
| RD-12800 | SCN9A | 61 | tttggaagcagcgtggacaa | 180 | UUGUCCaCgCtgCttCCAAA | 299 | me U *me U *meG*me U *me C *C*a*C*g*C*t*g*C*t*t*me C *me C *meA*meA*meA | 20 | 50 | 53 |
| RD-12801 | SCN9A | 62 | ttggaagcagcgtggacaaa | 181 | UUUGUCCaCgCtgCtUCCAA | 300 | me U *me U *me U *meG*me U *C*C*a*C*g*C*t*g*C*t*me U *me C *me C *meA*meA | 20 | 31 | 50 |
| RD-12802 | SCN9A | 63 | tggaagcagcgtggacaaac | 182 | GUUUGtCCaCgCtgCUUCCA | 301 | meG*me U *me U *me U *meG*t*C*C*a*C*g*C*t*g*C*me U *me U *me C *me C *meA | 20 | 53 | 63 |
| RD-12803 | SCN9A | 64 | ggaagcagcgtggacaaaca | 183 | UGUUUgtCCaCgCtgCUUCC | 302 | me U *meG*me U *me U *me U *g*t*C*C*a*C*g*C*t*g*me C *me U *me U *me C *me C | 20 | 44 | 53 |
| RD-12804 | SCN9A | 65 | gaagcagcgtggacaaacac | 184 | GUGUUtgtCCaCgCtGCUUC | 303 | meG*me U *meG*me U *me U *t*g*t*C*C*a*C*g*C*t*meG*me C *me U *me U *me C | 20 | 68 | 72 |
| RD-12805 | SCN9A | 66 | aagcagcgtggacaaacact | 185 | AGUGUttgtCCaCgCUGCUU | 304 | meA*meG*me U *meG*me U *t*t*g*t*C*C*a*C*g*C*me U *meG*me C *me U *me U | 20 | 64 | 66 |
| RD-12806 | SCN9A | 67 | agcagcgtggacaaacactt | 186 | AAGUGtttgtCCaCgCUGCU | 305 | meA*meA*meG*me U *meG*t*t*t*g*t*C*C*a*C*g*me C *me U *meG*me C *me U | 20 | 47 | 53 |
| RD-12807 | SCN9A | 68 | gcagcgtggacaaacacttg | 187 | CAAGUgtttgtCCaCGCUGC | 306 | me C *meA*meA*meG*me U *g*t*t*t*g*t*C*C*a*C*meG*me C *me U *meG*me C | 20 | 52 | 58 |
| RD-12808 | SCN9A | 69 | cagcgtggacaaacacttga | 188 | UCAAGtgtttgtCCaCGCUG | 307 | me U *me C *meA*meA*meG*t*g*t*t*t*g*t*C*C*a*me C *meG*me C *me U *meG | 20 | 48 | 51 |
| RD-12809 | SCN9A | 70 | agcgtggacaaacacttgat | 189 | AUCAAgtgtttgtCCACGCU | 308 | meA*me U *me C *meA*meA*g*t*g*t*t*t*g*t*C*C*meA*me C *meG*me C *me U | 20 | 48 | 35 |
| RD-12810 | SCN9A | 71 | gcgtggacaaacacttgatg | 190 | CAUCAagtgtttgtCCACGC | 309 | me C *meA*me U *me C *meA*a*g*t*g*t*t*t*g*t*C*me C *meA*me C *meG*me C | 20 | 55 | 56 |
| RD-12813 | SCN9A | 72 | cgtggacaaacacttgatgg | 191 | CCAUCaagtgtttgtCCACG | 310 | me C *me C *meA*me U *me C *a*a*g*t*g*t*t*t*g*t*me C *me C *meA*me C *meG | 20 | 49 | 56 |
| RD-12815 | SCN9A | 73 | gtggacaaacacttgatgga | 192 | UCCAUCaagtgtttgUCCAC | 311 | me U *me C *me C *meA*me U *C*a*a*g*t*g*t*t*t*g*me U *me C *me C *meA*me C | 20 | 39 | 49 |
| RD-12816 | SCN9A | 74 | tggacaaacacttgatggaa | 193 | UUCCAtCaagtgtttGUCCA | 312 | me U *me U *me C *me C *meA*t*C*a*a*g*t*g*t*t*t*meG*me U *me C *me C *meA | 20 | 32 | 52 |
| RD-12817 | SCN9A | 75 | ggacaaacacttgatggaag | 194 | CUUCCatCaagtgttUGUCC | 313 | me C *me U *me U *me C *me C *a*t*C*a*a*g*t*g*t*t*me U *meG*me U *me C *me C | 20 | 42 | 46 |
| RD-12818 | SCN9A | 76 | gacaaacacttgatggaaga | 195 | UCUUCCatCaagtgtUUGUC | 314 | me U *me C *me U *me U *me C *C*a*t*C*a*a*g*t*g*t*me U *me U *meG*me U *me C | 20 | 33 | 49 |
| RD-12819 | SCN9A | 77 | acaaacacttgatggaagac | 196 | GUCUUCCatCaagtgUUUGU | 315 | meG*me U *me C *me U *me U *C*C*a*t*C*a*a*g*t*g*me U *me U *me U *meG*me U | 20 | 38 | 48 |
| RD-12820 | SCN9A | 78 | caaacacttgatggaagaca | 197 | UGUCUtCCatCaagtGUUUG | 316 | me U *meG*me U *me C *me U *t*C*C*a*t*C*a*a*g*t*meG*me U *me U *me U *meG | 20 | 37 | 39 |
| RD-12821 | SCN9A | 79 | aaacacttgatggaagacag | 198 | CUGUCttCCatCaagUGUUU | 317 | me C *me U *meG*me U *me C *t*t*C*C*a*t*C*a*a*g*me U *meG*me U *me U *me U | 20 | 41 | 51 |
| RD-12822 | SCN9A | 80 | aacacttgatggaagacagt | 199 | ACUGUCttCCatCaaGUGUU | 318 | meA*me C *me U *meG*me U *C*t*t*C*C*a*t*C*a*a*meG*me U *meG*me U *me U | 20 | 53 | 45 |
| RD-12823 | SCN9A | 81 | acacttgatggaagacagtg | 200 | CACUGtCttCCatCaAGUGU | 319 | me C *meA*me C *me U *meG*t*C*t*t*C*C*a*t*C*a*meA*meG*me U *meG*me U | 20 | 64 | 66 |
| RD-12824 | SCN9A | 82 | cacttgatggaagacagtga | 201 | UCACUgtCttCCatCAAGUG | 320 | me U *me C *meA*me C *me U *g*t*C*t*t*C*C*a*t*C*meA*meA*meG*me U *meG | 20 | 59 | 52 |
| RD-12825 | SCN9A | 83 | acttgatggaagacagtgat | 202 | AUCACtgtCttCCatCAAGU | 321 | meA*me U *me C *meA*me C *t*g*t*C*t*t*C*C*a*t*me C *meA*meA*meG*me U | 20 | 43 | 43 |
| RD-12826 | SCN9A | 84 | cttgatggaagacagtgatg | 203 | CAUCACtgtCttCCaUCAAG | 322 | me C *meA*me U *me C *meA*C*t*g*t*C*t*t*C*C*a*me U *me C *meA*meA*meG | 20 | 56 | 52 |
| RD-12827 | SCN9A | 85 | ttgatggaagacagtgatgg | 204 | CCAUCaCtgtCttCCAUCAA | 323 | me C *me C *meA*me U *me C *a*C*t*g*t*C*t*t*C*C*meA*me U *me C *meA*meA | 20 | 53 | 50 |
| RD-12828 | SCN9A | 86 | tgatggaagacagtgatggt | 205 | ACCAUCaCtgtCttCCAUCA | 324 | meA*me C *me C *meA*me U *C*a*C*t*g*t*C*t*t*C*me C *meA*me U *me C *meA | 20 | 54 | 48 |
| RD-12829 | SCN9A | 87 | gatggaagacagtgatggtc | 206 | GACCAtCaCtgtCttCCAUC | 325 | meG*meA*me C *me C *meA*t*C*a*C*t*g*t*C*t*t*me C *me C *meA*me U *me C | 20 | 72 | 64 |
| RD-12830 | SCN9A | 88 | atggaagacagtgatggtca | 207 | UGACCatCaCtgtCtUCCAU | 326 | me U *meG*meA*me C *me C *a*t*C*a*C*t*g*t*C*t*me U *me C *me C *meA*me U | 20 | 65 | 56 |
| RD-12831 | SCN9A | 89 | tggaagacagtgatggtcaa | 208 | UUGACCatCaCtgtCUUCCA | 327 | me U *me U *meG*meA*me C *C*a*t*C*a*C*t*g*t*C*me U *me U *me C *me C *meA | 20 | 45 | 64 |
| RD-12832 | SCN9A | 90 | ggaagacagtgatggtcaat | 209 | AUUGACCatCaCtgtCUUCC | 328 | meA*me U *me U *meG*meA*C*C*a*t*C*a*C*t*g*t*me C *me U *me U *me C *me C | 20 | 37 | 35 |
| RD-12833 | SCN9A | 91 | cccagcctcacagtgacagt | 210 | ACUGUCaCtgtgaggCUGGG | 329 | meA*me C *me U *meG*me U *C*a*C*t*g*t*g*a*g*g*me C *me U *meG*meG*meG | 20 | 70 | 59 |
| RD-12834 | SCN9A | 92 | ccagcctcacagtgacagtg | 211 | CACUGtCaCtgtgagGCUGG | 330 | me C *meA*me C *me U *meG*t*C*a*C*t*g*t*g*a*g*meG*me C *me U *meG*meG | 20 | 65 | 57 |
| RD-12835 | SCN9A | 93 | cagcctcacagtgacagtgc | 212 | GCACUgtCaCtgtgaGGCUG | 331 | meG*me C *meA*me C *me U *g*t*C*a*C*t*g*t*g*a*meG*meG*me C *me U *meG | 20 | 76 | 25 |
| RD-12836 | SCN9A | 94 | agcctcacagtgacagtgcc | 213 | GGCACtgtCaCtgtgAGGCU | 332 | meG*meG*me C *meA*me C *t*g*t*C*a*C*t*g*t*g*meA*meG*meG*me C *me U | 20 | 74 | 60 |
| RD-12837 | SCN9A | 95 | gcctcacagtgacagtgcca | 214 | UGGCACtgtCaCtgtGAGGC | 333 | me U *meG*meG*me C *meA*C*t*g*t*C*a*C*t*g*t*meG*meA*meG*meG*me C | 20 | 69 | 63 |
| RD-12838 | SCN9A | 96 | aggaaaaatctggtggaaca | 215 | UGUUCCaCCagatttUUCCU | 334 | me U *meG*me U *me U *me C *C*a*C*C*a*g*a*t*t*t*me U *me U *me C *me C *me U | 20 | 37 | 32 |
| RD-12839 | SCN9A | 97 | tgctcagcagtggtgccctg | 216 | CAGGGCaCCaCtgCtGAGCA | 335 | me C *meA*meG*meG*meG*C*a*C*C*a*C*t*g*C*t*meG*meA*meG*me C *meA | 20 | 55 | 53 |
| RD-12840 | SCN9A | 98 | tagtcaaaatgtgcgatgga | 217 | UCCAUCgCaCattttGACUA | 336 | me U *me C *me C *meA*me U *C*g*C*a*C*a*t*t*t*t*meG*meA*me C *me U *meA | 20 | 36 | 49 |
| RD-12841 | SCN9A | 99 | agtcaaaatgtgcgatggaa | 218 | UUCCAtCgCaCatttUGACU | 337 | me U *me U *me C *me C *meA*t*C*g*C*a*C*a*t*t*t*me U *meG*meA*me C *me U | 20 | 25 | 36 |
| RD-12842 | SCN9A | 100 | gtcaaaatgtgcgatggaaa | 219 | UUUCCatCgCaCattUUGAC | 338 | me U *me U *me U *me C *me C *a*t*C*g*C*a*C*a*t*t*me U *me U *meG*meA*me C | 20 | 32 | 37 |
| RD-12843 | SCN9A | 101 | tcaaaatgtgcgatggaaaa | 220 | UUUUCCatCgCaCatUUUGA | 339 | me U *me U *me U *me U *me C *C*a*t*C*g*C*a*C*a*t*me U *me U *me U *meG*meA | 20 | 34 | 36 |
| RD-12844 | SCN9A | 102 | aatgtgcgatggaaaaacct | 221 | AGGUUtttCCatCgCACAUU | 340 | meA*meG*meG*me U *me U *t*t*t*C*C*a*t*C*g*C*meA*me C *meA*me U *me U | 20 | 47 | 52 |
| RD-12845 | SCN9A | 103 | cacaaaagccaattcctcga | 222 | UCGAGgaattggCttUUGUG | 341 | me U *me C *meG*meA*meG*g*a*a*t*t*g*g*C*t*t*me U *me U *meG*me U *meG | 20 | 48 | 51 |
| RD-12846 | SCN9A | 104 | acaaaagccaattcctcgac | 223 | GUCGAggaattggCtUUUGU | 342 | meG*me U *me C *meG*meA*g*g*a*a*t*t*g*g*C*t*me U *me U *me U *meG*me U | 20 | 32 | 43 |
| RD-12847 | SCN9A | 105 | caaaagccaattcctcgacc | 224 | GGUCGaggaattggCUUUUG | 343 | meG*meG*me U *me C *meG*a*g*g*a*a*t*t*g*g*C*me U *me U *me U *me U *meG | 20 | 39 | 34 |
| RD-12848 | SCN9A | 106 | ttttgggtgagagtggggag | 225 | CUCCCCaCtCtCaCCCAAAA | 344 | me C *me U *me C *me C *me C *C*a*C*t*C*t*C*a*C*C*me C *meA*meA*meA*meA | 20 | 11 | 30 |
| RD-12849 | SCN9A | 107 | tttgggtgagagtggggaga | 226 | UCUCCCCaCtCtCaCCCAAA | 345 | me U *me C *me U *me C *me C *C*C*a*C*t*C*t*C*a*C*me C *me C *meA*meA*meA | 20 | 17 | 27 |
| RD-12850 | SCN9A | 108 | ttgggtgagagtggggagat | 227 | AUCUCCCCaCtCtCaCCCAA | 346 | meA*me U *me C *me U *me C *C*C*C*a*C*t*C*t*C*a*me C *me C *me C *meA*meA | 20 | 13 | 21 |
| RD-12851 | SCN9A | 109 | tgggtgagagtggggagatg | 228 | CAUCUCCCCaCtCtCACCCA | 347 | me C *meA*me U *me C *me U *C*C*C*C*a*C*t*C*t*C*meA*me C *me C *me C *meA | 20 | 14 | 25 |
| RD-12852 | SCN9A | 110 | gggtgagagtggggagatgg | 229 | CCAUCtCCCCaCtCtCACCC | 348 | me C *me C *meA*me U *me C *t*C*C*C*C*a*C*t*C*t*me C *meA*me C *me C *me C | 20 | 20 | 29 |
| RD-12853 | SCN9A | 111 | ggtgagagtggggagatgga | 230 | UCCAUCtCCCCaCtCUCACC | 349 | me U *me C *me C *meA*me U *C*t*C*C*C*C*a*C*t*C*me U *me C *meA*me C *me C | 20 | 17 | 26 |
| RD-12854 | SCN9A | 112 | gtgagagtggggagatggat | 231 | AUCCAtCtCCCCaCtCUCAC | 350 | meA*me U *me C *me C *meA*t*C*t*C*C*C*C*a*C*t*me C *me U *me C *meA*me C | 20 | 15 | 23 |
| RD-12855 | SCN9A | 113 | tgagagtggggagatggatt | 232 | AAUCCatCtCCCCaCUCUCA | 351 | meA*meA*me U *me C *me C *a*t*C*t*C*C*C*C*a*C*me U *me C *me U *me C *meA | 20 | 6 | 24 |
| RD-12856 | SCN9A | 114 | gagagtggggagatggattc | 233 | GAAUCCatCtCCCCaCUCUC | 352 | meG*meA*meA*me U *me C *C*a*t*C*t*C*C*C*C*a*me C *me U *me C *me U *me C | 20 | 16 | 29 |
| RD-12857 | SCN9A | 115 | agagtggggagatggattct | 234 | AGAAUCCatCtCCCCACUCU | 353 | meA*meG*meA*meA*me U *C*C*a*t*C*t*C*C*C*C*meA*me C *me U *me C *me U | 20 | 11 | 12 |
| RD-12858 | SCN9A | 116 | gagtggggagatggattctc | 235 | GAGAAtCCatCtCCCCACUC | 354 | meG*meA*meG*meA*meA*t*C*C*a*t*C*t*C*C*C*me C *meA*me C *me U *me C | 20 | 20 | 22 |
| RD-12859 | SCN9A | 117 | agtggggagatggattctct | 236 | AGAGAatCCatCtCCCCACU | 355 | meA*meG*meA*meG*meA*a*t*C*C*a*t*C*t*C*C*me C *me C *meA*me C *me U | 20 | 13 | 25 |
| RD-12860 | SCN9A | 118 | gtggggagatggattctctt | 237 | AAGAGaatCCatCtCCCCAC | 356 | meA*meA*meG*meA*meG*a*a*t*C*C*a*t*C*t*C*me C *me C *me C *meA*me C | 20 | 11 | 20 |
| RD-12861 | SCN9A | 119 | tcgttcacagatggaagaaa | 238 | UUUCUtCCatCtgtgAACGA | 357 | me U *me U *me U *me C *me U *t*C*C*a*t*C*t*g*t*g*meA*meA*me C *meG*meA | 20 | 25 | 28 |
| RD-12862 | SCN9A | 120 | cgttcacagatggaagaaag | 239 | CUUUCttCCatCtgtGAACG | 358 | me C *me U *me U *me U *me C *t*t*C*C*a*t*C*t*g*t*meG*meA*meA*me C *meG | 20 | 24 | 24 |
| RD-12863 | SCN9A | 121 | gttcacagatggaagaaagg | 240 | CCUUUCttCCatCtgUGAAC | 359 | me C *me C *me U *me U *me U *C*t*t*C*C*a*t*C*t*g*me U *meG*meA*meA*me C | 20 | 16 | 32 |
| RD-12864 | SCN9A | 122 | ttcacagatggaagaaaggt | 241 | ACCUUtCttCCatCtGUGAA | 360 | meA*me C *me C *me U *me U *t*C*t*t*C*C*a*t*C*t*meG*me U *meG*meA*meA | 20 | 24 | 26 |
| RD-12865 | SCN9A | 123 | caaaatattctcgaaggcag | 242 | CUGCCttCgagaataUUUUG | 361 | me C *me U *meG*me C *me C *t*t*C*g*a*g*a*a*t*a*me U *me U *me U *me U *meG | 20 | 35 | 43 |
| RD-12866 | SCN9A | 124 | aaatattctcgaaggcagtg | 243 | CACUGCCttCgagaaUAUUU | 362 | me C *meA*me C *me U *meG*C*C*t*t*C*g*a*g*a*a*me U *meA*me U *me U *me U | 20 | 37 | 41 |
| RD-12867 | SCN9A | 125 | aatattctcgaaggcagtgc | 244 | GCACUgCCttCgagaAUAUU | 363 | meG*me C *meA*me C *me U *g*C*C*t*t*C*g*a*g*a*meA*me U *meA*me U *me U | 20 | 49 | 41 |
| RD-12868 | SCN9A | 126 | atattctcgaaggcagtgca | 245 | UGCACtgCCttCgagAAUAU | 364 | me U *meG*me C *meA*me C *t*g*C*C*t*t*C*g*a*g*meA*meA*me U *meA*me U | 20 | 54 | 46 |
| RD-12869 | SCN9A | 127 | tattctcgaaggcagtgcag | 246 | CUGCACtgCCttCgaGAAUA | 365 | me C *me U *meG*me C *meA*C*t*g*C*C*t*t*C*g*a*meG*meA*meA*me U *meA | 20 | 55 | 31 |
| RD-12870 | SCN9A | 128 | attctcgaaggcagtgcagt | 247 | ACUGCaCtgCCttCgAGAAU | 366 | meA*me C *me U *meG*me C *a*C*t*g*C*C*t*t*C*g*meA*meG*meA*meA*me U | 20 | 34 | 33 |
| RD-12871 | SCN9A | 129 | ttctcgaaggcagtgcagtc | 248 | GACUGCaCtgCCttCGAGAA | 367 | meG*meA*me C *me U *meG*C*a*C*t*g*C*C*t*t*C*meG*meA*meG*meA*meA | 20 | 31 | 35 |
| RD-12872 | SCN9A | 130 | tctcgaaggcagtgcagtca | 249 | UGACUgCaCtgCCttCGAGA | 368 | me U *meG*meA*me C *me U *g*C*a*C*t*g*C*C*t*t*me C *meG*meA*meG*meA | 20 | 46 | 44 |
| RD-12873 | SCN9A | 131 | ctcgaaggcagtgcagtcac | 250 | GUGACtgCaCtgCCtUCGAG | 369 | meG*me U *meG*meA*me C *t*g*C*a*C*t*g*C*C*t*me U *me C *meG*meA*meG | 20 | 49 | 50 |
| RD-12874 | SCN9A | 132 | tcgaaggcagtgcagtcact | 251 | AGUGACtgCaCtgCCUUCGA | 370 | meA*meG*me U *meG*meA*C*t*g*C*a*C*t*g*C*C*me U *me U *me C *meG*meA | 20 | 40 | 39 |
| RD-12875 | SCN9A | 133 | tacacaggtagaatgtagtt | 252 | AACUACattCtaCCtGUGUA | 371 | meA*meA*me C *me U *meA*C*a*t*t*C*t*a*C*C*t*meG*me U *meG*me U *meA | 20 | 20 | 31 |
| RD-12876 | SCN9A | 134 | tacagaaaggcagttacact | 253 | AGUGUaaCtgCCtttCUGUA | 372 | meA*meG*me U *meG*me U *a*a*C*t*g*C*C*t*t*t*me C *me U *meG*me U *meA | 20 | 32 | 37 |
| RD-12877 | SCN9A | 135 | acagaaaggcagttacactg | 254 | CAGUGtaaCtgCCttUCUGU | 373 | me C *meA*meG*me U *meG*t*a*a*C*t*g*C*C*t*t*me U *me C *me U *meG*me U | 20 | 34 | 39 |
| RD-12878 | SCN9A | 136 | cagaaaggcagttacactga | 255 | UCAGUgtaaCtgCCtUUCUG | 374 | me U *me C *meA*meG*me U *g*t*a*a*C*t*g*C*C*t*me U *me U *me C *me U *meG | 20 | 35 | 33 |
| RD-12879 | SCN9A | 137 | agaaaggcagttacactgaa | 256 | UUCAGtgtaaCtgCCUUUCU | 375 | me U *me U *me C *meA*meG*t*g*t*a*a*C*t*g*C*C*me U *me U *me U *me C *me U | 20 | 23 | 36 |
| RD-12880 | SCN9A | 138 | gaaaggcagttacactgaag | 257 | CUUCAgtgtaaCtgCCUUUC | 376 | me C *me U *me U *me C *meA*g*t*g*t*a*a*C*t*g*C*me C *me U *me U *me U *me C | 20 | 34 | 41 |
| RD-12881 | SCN9A | 139 | aggatggccagggaattggc | 258 | GCCAAttCCCtggCCAUCCU | 377 | meG*me C *me C *meA*meA*t*t*C*C*C*t*g*g*C*C*meA*me U *me C *me C *me U | 20 | 25 | 27 |
| RD-12882 | SCN9A | 140 | ggatggccagggaattggcc | 259 | GGCCAattCCCtggCCAUCC | 378 | meG*meG*me C *me C *meA*a*t*t*C*C*C*t*g*g*C*me C *meA*me U *me C *me C | 20 | 22 | 22 |
| RD-12883 | SCN9A | 141 | gatggccagggaattggcct | 260 | AGGCCaattCCCtggCCAUC | 379 | meA*meG*meG*me C *me C *a*a*t*t*C*C*C*t*g*g*me C *me C *meA*me U *me C | 20 | 14 | 20 |
| RD-12746 | SCN9A | N/A | N/A | N/A | N/A | 380 | CUUGAAGAGUCCAGACAAA | 19 | / | |
| 381 | UUUGUCUGGACUCUUCAAGuu | 21 | ||||||||
| RD-10750 | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | 382 | me C *me C meTmeAmeT*a*g*g*a*C*t*a*t*C*C*meAmeGmeGmeA*meA | 20 |
實施例28：以人
SCN9A轉錄物為靶標的ASO的篩選
為了評估
SCN9AASO的敲低活性，以25 nM和100 nM，用前述ASO中的每一者轉染SK-N-AS細胞，持續24小時。類比處理在沒有寡核苷酸的情況下轉染(未顯示)。RD-10750用作非特異性對照（未示出）。轉染RD-12746以用作沉默dsRNA對照（未示出）。在每個PCR反應中使用基因特異性引子組通過一步RT-qPCR來定量
SCN9AmRNA水準。
表8總結了由ASO處理引起的
SCN9A表達的相對變化，並繪製在圖8A中。圖8B示出了在25 nM和100 nM之間，ASO對
SCN9AmRNA的E
最大敲低活性。矩形實線框標記出了表現最佳的32個ASO。結果顯示出，4個(3.4%)和34個(28.6%) ASO對
SCN9A表達具有高 (≥70%)和中等(50-70%)的敲低活性，並且總結於表10中。
表10：SK-N-AS細胞中篩選的ASO對
SCN9AmRNA的敲低活性總結。
| ASO 活性 | SCN9A mRNA 敲低(KD) 活性 | ASO 數目 | 百分比(%) |
| 高敲低 | 70% ≤ KD ≤ 100% | 4 | 3.4 |
| 中等敲低 | 50% ≤ KD ＜ 70% | 34 | 28.6 |
實施例29:SK-N-AS細胞中ASO對
SCN9AmRNA的敲低活性
為了證實針對
SCN9A敲低活性的篩選結果，將32個功能性
SCN9AASO以濃度梯度（即0.02、0.1、0.39、1.56、6.25、25、100和400 nM）轉染至SK-N-AS細胞中，持續24小時，以通過RT-qPCR產生劑量回應曲線，如圖9A-9D所示。外推IC
50值和E
最大敲低水準，以定義證明瞭
SCN9A的劑量依賴性敲低活性的每個測試的ASO的最大活性的效力。表11概括了EC
50值和E
最大敲低水準。
表11：ASO處理後的SK-N-AS細胞中的IC
50值和E
最大敲低水準。
| ASO名稱 | IC 50(nM) | SCN9A mRNA的E 最大敲低活性% |
| RD-12836 | 1.02 | 82 |
| RD-12835 | 1.27 | 79 |
| RD-12760 | 3.18 | 86 |
| RD-12833 | 3.41 | 75 |
| RD-12837 | 3.47 | 80 |
| RD-12763 | 3.53 | 88 |
| RD-12830 | 4.48 | 85 |
| RD-12754 | 5.04 | 90 |
| RD-12805 | 5.65 | 80 |
| RD-12831 | 5.66 | 82 |
| RD-12829 | 5.83 | 86 |
| RD-12810 | 5.89 | 79 |
| RD-12761 | 5.94 | 82 |
| RD-12762 | 6.7 | 80 |
| RD-12834 | 6.87 | 76 |
| RD-12779 | 6.88 | 84 |
| RD-12804 | 6.94 | 76 |
| RD-12780 | 8.81 | 80 |
| RD-12759 | 9.97 | 82 |
| RD-12796 | 10.03 | 81 |
| RD-12826 | 12.13 | 66 |
| RD-12802 | 13.63 | 79 |
| RD-12817 | 15.01 | 76 |
| RD-12799 | 15.54 | 81 |
| RD-12794 | 16.52 | 75 |
| RD-12795 | 18.07 | 71 |
| RD-12822 | 18.41 | 73 |
| RD-12798 | 18.52 | 83 |
| RD-12824 | 26.3 | 80 |
| RD-12803 | 27.64 | 71 |
| RD-12823 | 31.4 | 78 |
| RD-12752 | 34.83 | 85 |
實施例30:SD大鼠中的LDEC偶聯的ASO的熱敏感性功能測試
為了測試
SCN9AASO的熱敏感性，通過IT注射，將0.5和1 mg的所指示的LDEC-ASO（即，RD-13767和RD-15069）和非偶聯的ASO（即，RD-12835和RD-15064）給藥到成年雌性SD大鼠中。以1 mg處理RD-15873並用作陽性對照。表12列出了前述ASO序列。僅用aCSF的處理被用作載劑對照以建立甩尾反應潛伏期的基線。圖10示出了在第27天通過熱水甩尾測試來測試甩尾反應潛伏期以評估熱敏感性，並且平均值總結在表13中。
表12：人
SCN9AASO序列
注：大寫字母，RNA；小寫字母，DNA；d, DNA；*，硫代磷酸酯（PS）主鏈修飾；f, 2'-氟；me, 2'-O-甲氧基乙基（2'MOE）；E, cET(限制性乙基)；
C ，5-甲基胞嘧啶；
U ，5-甲基尿嘧啶。
| ASO名稱 | 靶基因 | LDEC | SEQ ID NO | 序列(5'-3') | 大小 (nt) |
| RD-15873 | SCN9A | N/A | 387 | meG*EAmeGEA*da*dt*dt*dt*dg*dt*dc*da*meGmeGmeG*me U *me C | 17 |
| RD-12835 | SCN9A | N/A | 388 | meG*me C *meA*me C *me U *g*t*c*a*c*t*g*t*g*a*meG*meG*me C *me U *meG | 20 |
| RD-13767 | SCN9A | 化合物C1 (C5x5) | 389 | C5x5-meG*me C *meA*me C *me U *g*t*c*a*c*t*g*t*g*a*meG*meG*me C *me U *meG | 20 |
| RD-15064 | SCN9A | N/A | 390 | meG*me C *a*me C *me U *g*t*c*a*c*t*g*t*g*meA*meG*meG | 17 |
| RD-15069 | SCN9A | 化合物C1 (C5x5) | 391 | C5x5-meG*me C *a*me C *me U *g*t*c*a*c*t*g*t*g*meA*meG*meG | 17 |
表13：SD大鼠IT注射後第27天的甩尾反應潛伏期的值
注：「SEM」表示平均值的標準誤差。
| 組(IT注射) | 劑量(mg) | 甩尾反應潛伏期 (sec) | |
| 平均值 | SEM | ||
| aCSF (n=5) | - | 4.44 | 0.17 |
| RD-15873 (n=5) | 1 | 7.62 | 0.45 |
| RD-12835 (n=4) | 0.5 | 5.82 | 0.52 |
| RD-13767 (n=5) | 1 | 8.96 | 0.52 |
| RD-15064 (n=5) | 0.5 | 5.75 | 0.51 |
| RD-15064 (n=4) | 1 | 7.36 | 0.78 |
| RD-15069 (n=5) | 0.5 | 9.06 | 0.42 |
實施例31:SD大鼠中LDEC偶聯的ASO介導的大鼠
Scn9amRNA敲低活性
為了評估LDEC-ASO對大鼠
Scn9amRNA的敲低活性，通過IT注射，給予0.5和1 mg的所指示的LDEC-ASO（即，RD-13767和RD-15069）和非偶聯的ASO（即，RD-12835和RD-15064）。以1 mg處理RD-15873並用作陽性對照。僅用aCSF的處理被用作載劑對照以建立
Scn9amRNA的基線表達。給藥後第27天處死大鼠，並通過RT-qPCR對
Scn9amRNA水準進行定量。圖11A-11B示出了在腦(即，大腦)、脊髓(即，頸椎、胸椎和腰椎)和背根神經節(DRG)的組織中所定量的剩餘
Scn9amRNA。表14總結了SD大鼠中ASO處理後第27天對
Scn9amRNA的平均敲低活性。
表14：ASO處理後第27天對
Scn9amRNA的平均敲低活性
注：「/」意為未測試。
| 組(n=5/組) | 劑量(mg) | 對Scn9a mRNA的平均敲低活性% | ||||
| 大腦 | 頸椎 | 胸椎 | 腰椎 | DRG | ||
| aCSF | - | 0 | 5 | 1 | 2 | 0 |
| RD-15873 | 1 | 0 | 37 | 68 | 79 | 51 |
| RD-12835 | 0.5 | 21 | 0 | 37 | 57 | 20 |
| RD-13767 | 1 | 33 | 75 | 91 | 94 | 67 |
| RD-15064 | 0.5 | 0 | 0 | 64 | 65 | 0 |
| RD-15064 | 1 | 23 | 22 | 62 | 70 | 40 |
| RD-15069 | 0.5 | 31 | 24 | 76 | 82 | / |
| RD-15069 | 1 | 47 | 72 | 92 | 95 | / |
實施例32:以人
DMD外顯子51轉錄物為靶標的ASO的設計和合成
為了評估ASO的敲低活性，從UCSC基因組資料庫檢索人
DMD外顯子51轉錄物的編碼鏈序列(SEQ ID NO:392，如表15所示)。
表15：用於ASO設計的人
DMDcDNA序列
基於下述標準，設計長度為20個核苷酸（nt）的五十種ASO：(1)40%至70%的GC含量；(2)少於5個連續相同核苷酸；(3)少於3個二核苷酸或三核苷酸重複。ASO是通過化學修飾合成的，並且它們的序列（包括人
DMD外顯子51轉錄物中的同源靶點）列於表16中。
表16：人
DMD轉錄物中的ASO序列和同源靶點
注：大寫字母，RNA；小寫字母，DNA；d, DNA；*，硫代磷酸酯（PS）主鏈修飾；m，2'-O-甲基 (2'-OMe)；me, 2'-O-甲氧基乙基（2'MOE）；E, 限制性乙基(cET)；C，5-甲基胞嘧啶；U，5-甲基尿嘧啶。"/"表示未示出。
| 寡核苷酸編號 | SEQ ID NO | 靶序列 (5'-3') | SEQ ID NO | 未經修飾的裸序列 (5'-3') | SEQ ID NO | 經化學修飾的 ASO 序列 (5'-3') | 大小 (nt) | 外顯子 51 跳躍的 % |
| RD-15895 | 393 | ctcctactcagactgttact | 443 | AGUAACAGUCUGAGUAGGAG | 493 | C5x5-meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU*meC*meU*meG*meA*meG*meU*meA*meG*meG*meA*meG | 20 | 32 |
| RD-15896 | 394 | tcctactcagactgttactc | 444 | GAGUAACAGUCUGAGUAGGA | 494 | C5x5-meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU*meC*meU*meG*meA*meG*meU*meA*meG*meG*meA | 20 | 17 |
| RD-15897 | 395 | cctactcagactgttactct | 445 | AGAGUAACAGUCUGAGUAGG | 495 | C5x5-meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU*meC*meU*meG*meA*meG*meU*meA*meG*meG | 20 | 25 |
| RD-15898 | 396 | ctactcagactgttactctg | 446 | CAGAGUAACAGUCUGAGUAG | 496 | C5x5-meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU*meC*meU*meG*meA*meG*meU*meA*meG | 20 | 19 |
| RD-15899 | 397 | tactcagactgttactctgg | 447 | CCAGAGUAACAGUCUGAGUA | 497 | C5x5-meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU*meC*meU*meG*meA*meG*meU*meA | 20 | 12 |
| RD-15900 | 398 | actcagactgttactctggt | 448 | ACCAGAGUAACAGUCUGAGU | 498 | C5x5-meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU*meC*meU*meG*meA*meG*meU | 20 | 6 |
| RD-15901 | 399 | ctcagactgttactctggtg | 449 | CACCAGAGUAACAGUCUGAG | 499 | C5x5-meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU*meC*meU*meG*meA*meG | 20 | 25 |
| RD-15902 | 400 | tcagactgttactctggtga | 450 | UCACCAGAGUAACAGUCUGA | 500 | C5x5-meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU*meC*meU*meG*meA | 20 | 13 |
| RD-15903 | 401 | cagactgttactctggtgac | 451 | GUCACCAGAGUAACAGUCUG | 501 | C5x5-meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU*meC*meU*meG | 20 | 9 |
| RD-15904 | 402 | agactgttactctggtgaca | 452 | UGUCACCAGAGUAACAGUCU | 502 | C5x5-meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU*meC*meU | 20 | 6 |
| RD-15905 | 403 | gactgttactctggtgacac | 453 | GUGUCACCAGAGUAACAGUC | 503 | C5x5-meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU*meC | 20 | 37 |
| RD-15906 | 404 | actgttactctggtgacaca | 454 | UGUGUCACCAGAGUAACAGU | 504 | C5x5-meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG*meU | 20 | 21 |
| RD-15907 | 405 | ctgttactctggtgacacaa | 455 | UUGUGUCACCAGAGUAACAG | 505 | C5x5-meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA*meG | 20 | 22 |
| RD-15908 | 406 | tgttactctggtgacacaac | 456 | GUUGUGUCACCAGAGUAACA | 506 | C5x5-meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meA | 20 | 16 |
| RD-15909 | 407 | gttactctggtgacacaacc | 457 | GGUUGUGUCACCAGAGUAAC | 507 | C5x5-meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA*meC | 20 | 1 |
| RD-15910 | 408 | ttactctggtgacacaacct | 458 | AGGUUGUGUCACCAGAGUAA | 508 | C5x5-meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA*meA | 20 | 11 |
| RD-15911 | 409 | tactctggtgacacaacctg | 459 | CAGGUUGUGUCACCAGAGUA | 509 | C5x5-meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU*meA | 20 | 15 |
| RD-15912 | 410 | actctggtgacacaacctgt | 460 | ACAGGUUGUGUCACCAGAGU | 510 | C5x5-meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG*meU | 20 | 15 |
| RD-15913 | 411 | ctctggtgacacaacctgtg | 461 | CACAGGUUGUGUCACCAGAG | 511 | C5x5-meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA*meG | 20 | 15 |
| RD-15914 | 412 | tctggtgacacaacctgtgg | 462 | CCACAGGUUGUGUCACCAGA | 512 | C5x5-meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG*meA | 20 | 10 |
| RD-15915 | 413 | ctggtgacacaacctgtggt | 463 | ACCACAGGUUGUGUCACCAG | 513 | C5x5-meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA*meG | 20 | 8 |
| RD-15916 | 414 | tggtgacacaacctgtggtt | 464 | AACCACAGGUUGUGUCACCA | 514 | C5x5-meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC*meA | 20 | 7 |
| RD-15917 | 415 | ggtgacacaacctgtggtta | 465 | UAACCACAGGUUGUGUCACC | 515 | C5x5-meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC*meC | 20 | 14 |
| RD-15918 | 416 | gtgacacaacctgtggttac | 466 | GUAACCACAGGUUGUGUCAC | 516 | C5x5-meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA*meC | 20 | 12 |
| RD-15919 | 417 | tgacacaacctgtggttact | 467 | AGUAACCACAGGUUGUGUCA | 517 | C5x5-meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC*meA | 20 | 15 |
| RD-15920 | 418 | gacacaacctgtggttacta | 468 | UAGUAACCACAGGUUGUGUC | 518 | C5x5-meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU*meC | 20 | 7 |
| RD-15921 | 419 | acacaacctgtggttactaa | 469 | UUAGUAACCACAGGUUGUGU | 519 | C5x5-meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG*meU | 20 | 1 |
| RD-15922 | 420 | cacaacctgtggttactaag | 470 | CUUAGUAACCACAGGUUGUG | 520 | C5x5-meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU*meG | 20 | 3 |
| RD-15923 | 421 | acaacctgtggttactaagg | 471 | CCUUAGUAACCACAGGUUGU | 521 | C5x5-meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG*meU | 20 | 9 |
| RD-15924 | 422 | caacctgtggttactaagga | 472 | UCCUUAGUAACCACAGGUUG | 522 | C5x5-meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU*meG | 20 | 16 |
| RD-15925 | 423 | aacctgtggttactaaggaa | 473 | UUCCUUAGUAACCACAGGUU | 523 | C5x5-meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU*meU | 20 | 11 |
| RD-15926 | 424 | acctgtggttactaaggaaa | 474 | UUUCCUUAGUAACCACAGGU | 524 | C5x5-meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG*meU | 20 | 16 |
| RD-15927 | 425 | cctgtggttactaaggaaac | 475 | GUUUCCUUAGUAACCACAGG | 525 | C5x5-meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG*meG | 20 | 22 |
| RD-15928 | 426 | ctgtggttactaaggaaact | 476 | AGUUUCCUUAGUAACCACAG | 526 | C5x5-meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA*meG | 20 | 24 |
| RD-15929 | 427 | tgtggttactaaggaaactg | 477 | CAGUUUCCUUAGUAACCACA | 527 | C5x5-meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC*meA | 20 | 22 |
| RD-15930 | 428 | gtggttactaaggaaactgc | 478 | GCAGUUUCCUUAGUAACCAC | 528 | C5x5-meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA*meC | 20 | 32 |
| RD-15931 | 429 | tggttactaaggaaactgcc | 479 | GGCAGUUUCCUUAGUAACCA | 529 | C5x5-meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC*meA | 20 | 16 |
| RD-15932 | 430 | ggttactaaggaaactgcca | 480 | UGGCAGUUUCCUUAGUAACC | 530 | C5x5-meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC*meC | 20 | 25 |
| RD-15933 | 431 | gttactaaggaaactgccat | 481 | AUGGCAGUUUCCUUAGUAAC | 531 | C5x5-meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA*meC | 20 | 22 |
| RD-15934 | 432 | ttactaaggaaactgccatc | 482 | GAUGGCAGUUUCCUUAGUAA | 532 | C5x5-meG*meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA*meA | 20 | 29 |
| RD-15935 | 433 | tactaaggaaactgccatct | 483 | AGAUGGCAGUUUCCUUAGUA | 533 | C5x5-meA*meG*meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU*meA | 20 | 43 |
| RD-15936 | 434 | actaaggaaactgccatctc | 484 | GAGAUGGCAGUUUCCUUAGU | 534 | C5x5-meG*meA*meG*meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG*meU | 20 | 34 |
| RD-15937 | 435 | ctaaggaaactgccatctcc | 485 | GGAGAUGGCAGUUUCCUUAG | 535 | C5x5-meG*meG*meA*meG*meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA*meG | 20 | 21 |
| RD-15938 | 436 | taaggaaactgccatctcca | 486 | UGGAGAUGGCAGUUUCCUUA | 536 | C5x5-meU*meG*meG*meA*meG*meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU*meA | 20 | 23 |
| RD-15939 | 437 | aaggaaactgccatctccaa | 487 | UUGGAGAUGGCAGUUUCCUU | 537 | C5x5-meU*meU*meG*meG*meA*meG*meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU*meU | 20 | 14 |
| RD-15940 | 438 | aggaaactgccatctccaaa | 488 | UUUGGAGAUGGCAGUUUCCU | 538 | C5x5-meU*meU*meU*meG*meG*meA*meG*meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC*meU | 20 | 29 |
| RD-15941 | 439 | ggaaactgccatctccaaac | 489 | GUUUGGAGAUGGCAGUUUCC | 539 | C5x5-meG*meU*meU*meU*meG*meG*meA*meG*meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC*meC | 20 | 45 |
| RD-15942 | 440 | gaaactgccatctccaaact | 490 | AGUUUGGAGAUGGCAGUUUC | 540 | C5x5-meA*meG*meU*meU*meU*meG*meG*meA*meG*meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU*meC | 20 | 58 |
| RD-15943 | 441 | aaactgccatctccaaacta | 491 | UAGUUUGGAGAUGGCAGUUU | 541 | C5x5-meU*meA*meG*meU*meU*meU*meG*meG*meA*meG*meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU*meU | 20 | 55 |
| RD-15944 | 442 | aactgccatctccaaactag | 492 | CUAGUUUGGAGAUGGCAGUU | 542 | C5x5-meC*meU*meA*meG*meU*meU*meU*meG*meG*meA*meG*meA*meU*meG*meG*meC*meA*meG*meU*meU | 20 | 54 |
| RD-15945 | / | 543 | mU*mC*mA*mA*mG*mG*mA*mA*mG*mA*mU*mG*mG*mC*mA*mU*mU*mU*mC*mU | 20 | / | |||
| RD-15946 | 544 | C5x5-mU*mC*mA*mA*mG*mG*mA*mA*mG*mA*mU*mG*mG*mC*mA*mU*mU*mU*mC*mU | 20 | 33 | ||||
| RD-16271 | 545 | EG*EA*EC*dg*dc*dg*dc*dc*dt*dg*da*da*dg*EG*EU*EU | 16 | 2 | ||||
| RD-16272 | 546 | EG*EG*EC*dt*da*dc*dt*da*dc*dg*dc*dc*dg*EU*EC*EA | 16 | 1 |
實施例33:RD細胞中由LDEC-ASO介導的人
DMDmRNA的跳躍水準
為了評估LDEC-ASO介導的人
DMDmRNA的外顯子51跳躍水準，以25 nM將50種LDEC-ASO單獨轉染到RD細胞中，持續48小時。轉染RD-16271和RD-16272並作為非特異性對照。轉染RD-15946並作為LDEC-ASO陽性對照。使用兩個基因特異性引子組通過巢式PCR對外顯子51跳躍水準進行定量，繪製在圖12中並總結在表16中。如圖12所示，與LDEC-ASO陽性對照（RD-15946）相比，7種LDEC-ASO（即，RD-15905、RD-15935、RD-15936、RD-15941、RD-15942、RD-15943和RD-15944）呈現高的外顯子51跳躍水準。
實施例34：RD細胞中由LDEC-ASO介導的人
DMDmRNA的劑量依賴性外顯子51跳躍水準
為了進一步驗證外顯子51跳躍水準，以10 nM、25 nM和100 nM將表現最好的7種LDEC-ASO（即，RD-15905、RD-15935、RD-15936、RD-15941、RD-15942、RD-15943和RD-15944）分別轉染到RD細胞中，持續48小時。RD-16271用作非特異性對照。轉染RD-15945並作為非偶聯ASO陽性對照。轉染RD-15946並作為LDEC-ASO陽性對照。使用兩個基因特異性引子組通過巢式PCR對外顯子51跳躍水準進行定量。如圖13所示，幾乎所有LDEC-ASO顯示出外顯子51跳躍的劑量依賴性增加。
材料和方法
寡核苷酸的一般合成方法
單鏈合成方法
通過固相合成技術在K&A DNA合成儀（K&A Laborgeraete公司，德國沙夫海姆市）上合成單鏈寡核苷酸。
起始材料是通用固體支持物或特殊固體支持物，其可商購或如先前上下文中公開的來合成。一般地，將包括各種接頭和偶聯物的亞磷醯胺單體（0.1M在乙腈或二氯甲烷中）按順序添加到DNA合成儀中的固相支持物上，以產生所需的全長寡核苷酸。每個亞醯胺化物添加迴圈由四個化學反應組成，包括脫三苯甲基化、偶聯、氧化/硫醇化和封端（加帽）。在第一步中，使用3%二氯乙酸（TCA）的DCM溶液進行脫三苯甲基化，持續45秒。在第二步中，以12當量對所有亞醯胺化物進行亞磷醯胺偶聯，持續6分鐘；在第三步中，使用0.02 M碘的THF:吡啶:水(70:20:10, v/v/v)溶液進行氧化，持續1分鐘；如果需要硫代磷酸酯修飾，則用硫醇化代替氧化，硫醇化是用0.1 M氫化黃原素的吡啶:ACN (50:50, v/v)溶液進行3分鐘。在第四步中，使用THF:乙酸酐:吡啶 (80:10:10, v/v/v) (CAP A)和N-甲基咪唑:THF (10:90, v/v), (CAP B)進行封端，持續20秒。四個化學反應的迴圈數將取決於單個寡核苷酸的長度。
脫保護I（核堿基脫保護）：完成合成後，將固體支持物轉移到螺旋蓋微量離心管中。對於1 µmol的合成規模，添加1 ml的甲胺和氫氧化銨的混合物。然後將含有固體支持物的試管在60℃至65℃的烘箱中加熱15分鐘，接著冷卻至室溫。收集裂解溶液並在speedvac中蒸發至乾燥以提供粗品單鏈寡核苷酸。
脫保護II（去除2’-TBDMS基）：將仍帶有2'-TBDMS基團的粗制RNA寡核苷酸溶解在0.1 ml的DMSO中。添加1 ml三乙胺三氫氟酸鹽後，蓋上試管，劇烈搖動混合物以確保完全溶解，然後在65℃的烘箱中加熱15分鐘。從烘箱取出試管並冷卻至室溫。在乾冰上冷卻含有完全去甲矽烷基化的寡核苷酸的溶液。以每份0.5 ml小心添加2 ml冰冷的正丁醇（-20°C），以沉澱寡核苷酸。過濾沉澱並用1 ml冰冷的正丁醇洗滌，然後將沉澱溶解在0.01M 三(羥基甲基)氨基甲醇鹽酸緩衝液中。
(2) 單鏈純化
寡核苷酸的純化在配備Source 15Q 4.6/100 PE柱的AKTA explorer 10上使用以下條件進行：緩衝液A：(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), B: (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2M NaCl, pH 7.5), 梯度: 10% B至60% B, 在25 min內, 流速: 1 ml/min。收集純寡核苷酸並通過HiPrep 26/10脫鹽柱脫鹽，隨後凍幹成粉末。
細胞培養和處理
SMA患者來源的成纖維細胞獲自Coriell研究所（美國新澤西州卡姆登），包括GM03813（SMA II型，帶有3個SMN2基因拷貝）和GM09677（SMA I型，帶有3個SMN2基因拷貝），其在補充有15%小牛血清（西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich））、1% NEAA（吉布可公司（Gibco））和1%青黴素/鏈黴素（吉布可公司）的改良型MEM培養基（吉布可公司，賽默飛世爾科學公司（Thermo Fisher Scientific），加利福尼亞州卡爾斯巴德）中以5% CO2和37°C培養。SK-N-AS（Procell（普諾賽公司），中國武漢，目錄號CL-0621）細胞和RD細胞（TCHu 45，中國科學院分子細胞科學卓越中心）在37°C、5% CO
2條件下於補充有10%小牛血清(Sigma-Aldrich)和1%青黴素/鏈黴素(Gibco)的改良型DMEM培養基(吉布可公司，賽默飛世爾科學公司，加利福尼亞州卡爾斯巴德)中培養。根據製造商說明，使用Lipofectamine RNAiMax（賽默飛世爾公司，美國麻塞諸塞州沃爾瑟姆）在不含抗生素的生長培養基中進行轉染。
動物程序
所有動物程序均由經過認證的實驗室人員使用符合當地和州法規並經機構動物護理和使用委員會批准的協議進行。SMA樣小鼠通過純合敲除小鼠
Smn外顯子7得到，其具有人
SMN2轉基因(
Smn − / − SMN2
+/- )，如Hsieh-Li等人先前所述（Hsieh-Li, H. M.等人，2000），該SMA樣小鼠獲自傑克遜實驗室公司（Jackson Laboratories）。生成Ш型SMA雌性小鼠[
Smn1
-/-, SMN2
+/+ （基因分型參見WO2022022617A1 專利）]並給予測試化合物。斯潑累格-多雷（Sprague-Dawley, SD）雌性大鼠（A102，SPF，中國）購自SPF（蘇州）生物科技有限公司。將動物隨機分配到研究組。
股靜脈（IV）
在定制的室中使用5%異氟烷麻醉小鼠。將麻醉小鼠置於37°C的加熱墊上，並通過面罩吸入濃度為2%的異氟烷來維持麻醉。小鼠後肢用膠帶固定成輕微外展，小腿腹股溝區剃毛，用70%乙醇消毒，暴露進行手術。通過腹股溝韌帶下方平行3到4mm的皮膚切口，暴露股靜脈，然後與周圍組織分離。在2分鐘內緩慢地在股靜脈中靜脈輸注200μL的測試化合物溶液。輸注結束時，用棉簽用力按壓股靜脈注射部位，以防止給藥溶液和/或血液回流。用1mL 0.9%生理鹽水沖洗傷口，並用6-0線封閉切口。
鞘內（IT）注射
在誘導室中使用3.0%異氟烷持續麻醉10分鐘。將尾根部注射部位周圍的毛髮剃去，並用75%乙醇清洗。確定L5-L6棘突之間的空間，並將連接到含有適當藥物製劑的微升注射器的30號針頭緩慢插入硬膜內空間，直到觀察到甩尾。隨後固定針頭位置，在1分鐘內注入總體積為30 μL的溶液。
熱水甩尾測試
甩尾測試測量對55°C熱水的疼痛反應（甩尾反應潛伏期）。拾取大鼠並暴露其尾巴。將大鼠置於水浴上方並將1cm的尾巴遠端浸入水浴中。記錄大鼠做出反應（例如甩尾）所需的時間。如果10秒內沒有回應，則測試終止。對於每只動物，計算3次獨立測量的平均回應時間。
組織收穫
通過吸入二氧化碳將處理過的動物安樂死並放置在有支撐的板上。將動物的前肢、後肢、頸部和臀部的毛剃掉。用75%乙醇消毒動物皮膚。根據解剖示意圖分離骨骼肌（即二頭肌、半腱肌、頸闊肌和臀肌）並立即浸入RNAlater
TM（Ro118-500 mL，Beyotime（碧雲天公司），中國）中。分離所指示的腦、脊髓和外周組織並儲存在RNAlater
TM中。
RNA分離
在樣品處理之前，將動物組織浸沒並儲存在RNAlater
TM中。將動物組織切成厚度小於0.5見方的2-3片切片，並將所得碎片轉移至含有1 mL RNAVzol（Biosharp(白鯊公司)，BS259A，中國）和6-8個陶瓷珠（ALLSHENG（奧盛公司）陶瓷珠，中國）的2 mL微量管中。組織用Bioprep-24勻漿器（ALLSHENG Bioprep-24，中國）勻漿。將200 μL氯仿移液至勻漿物中，然後渦旋並孵育5分鐘，然後在12000 g下離心15分鐘。將200µL頂部水相移液至新的試管中。然後使用MagPure Total RNA Micro LQ試劑盒（Magen公司，R6621，中國廣東），按照製造商提供的說明，在Auto-pure96機器（ALLSHENG公司，中國浙江）中分離RNA。RNA濃度通過酶標儀系統（Infinite M2000 Pro, Tecan）確定。
逆轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)
使用包含gDNA Eraser的PrimeScript RT 試劑盒（寶生物公司（Takara），日本志賀）將所得RNA（~1 μg）逆轉錄成cDNA。所得cDNA在Roche LightCycler 480多孔板384(羅氏公司（Roche），參考號：4729749001, 美國)中使用SYBR Premix Ex Taq II (寶生物公司，RR820A，日本志賀)試劑和引子(其特異性擴增感興趣的靶基因)擴增。實驗條件如下：逆轉錄反應(第1階段)：42°C持續5分鐘，95°C持續10秒；PCR反應(第2階段)：95°C持續5秒，60°C持續30秒，72°C持續10秒；40個擴增迴圈；和，解鏈曲線(第3階段)。PCR反應條件如表17和表18所示。引子序列列於表19。
表17：RT反應
| 反應 -1 (Takara, RR047A) | 體積 (μL) |
| 5 × gDNA Eraser緩衝液 | 2 |
| gDNA Eraser | 1 |
| 總RNA (1 μg) + 無RNA酶的dH 2O | 7 |
| 總體積 | 10 |
| 42°C 5 min, 儲存在 4°C | |
| 反應 -2 (Takara, RR047A) | 體積 (μL) |
| 5 × PrimeScript緩衝液2 | 4 |
| PrimeScript RT 酶混合物I | 1 |
| RT引子混合物 | 1 |
| 無RNA酶的dH 2O | 4 |
| 反應-1 | 10 |
| 總體積 | 20 |
| 37°C 15 min, 85°C 5 sec, 儲存在 4°C, 稀釋10倍 |
表18:RT-qPCR反應
| 試劑 (Takara, RR820A) | 體積 (μL) |
| SYBR Premix Ex Taq II (2 ×) PCR引子 (正向 + 反向) 5 μM cDNA (RT產物) | 5 1 4 |
| 總計 | 10 |
表19：用於RT-qPCR測定的引子序列
| 引子 | 基因 | SEQ ID NO | 序列 (5'-3') | 產物大小(bp) |
| SMN2FL F | 人SMN2 | 547 | TCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | 95 |
| SMN2FL R | 548 | TGCTCTATGCCAGCATTTCTC | ||
| SMN2Δ7 F | 人SMN2 | 549 | GCTATTATATGGAAATGCTGGCATAG | 73 |
| SMN2Δ7 R | 550 | TTCCAGATCTGTCTGATCGTTTCT | ||
| Tbp F | 小鼠Tbp | 551 | GCTCTGGAATTGTACCGCAG | 126 |
| Tbp R | 552 | CTGCAGCAAATCGCTTGGGA | ||
| SDHA F | 人SDHA | 553 | AGAACATCGGAACTGCGACT | 155 |
| SDHA R | 554 | CAGACCATTCCCCGGTCG | ||
| SCN9A F | 人SCN9A | 555 | TTCAGCACAGATTCAGGTCAGT | 188 |
| SCN9A R | 556 | ATGTAGGTTTTGCCAGCAGC | ||
| HPRT1 F | 人HPRT1 | 557 | AAAGATGGTCAAGGTCGCAAG | 120 |
| HPRT1 R | 558 | TAGTCAAGGGCATATCCTACAAC | ||
| HMBS F | 人HMBS | 559 | TATGAAGGATGGGCAACTGTACCT | 70 |
| HMBS R | 560 | CTCTTGTATGCTATCTGAGCCGT | ||
| Scn9a F | 大鼠Scn9a | 561 | AGAAACGGAACCGATCAAGC | 134 |
| Scn9a R | 562 | TCTCCTCACACAACCATCTGTA | ||
| Tbp F | 大鼠Tbp | 563 | CTTCGTGCCAGAAATGCTGA | 141 |
| Tbp R | 564 | TCTGGATTGTTCTTCACTCTTGG | ||
| B2m F | 大鼠B2m | 565 | ACCGTGATCTTTCTGGTGCT | 72 |
| B2m R | 566 | CACTTGAATTTGGGGAGTTTTCTG |
單參照基因
為計算dsRNA或ASO處理樣品中靶mRNA相對於對照處理的表達水準(E
rel)，將靶基因和內參基因的Ct值代入式BI：
(式BI)
其中CtT
m是來自對照處理樣品的靶基因的Ct值；CtT
s是來自dsRNA或ASO處理樣品的靶基因的Ct值；CtR
m是來自對照處理樣品的內參基因的Ct值；CtR
s是來自dsRNA或ASO處理樣品的內參基因的Ct值。
雙參照基因
為計算dsRNA處理樣品中靶基因mRNA相對於對照處理的表達水準(
E
rel )，將靶基因和兩個內參基因的Ct值代入下式BII：
(式BII)
其中CtT
m是來自對照處理樣品的靶基因的Ct值；CtT
s是來自dsRNA處理樣品的靶基因的Ct值；CtR1
m是來自對照處理樣品的內參基因1的Ct值；CtR1
s是來自dsRNA處理樣品的內參基因1的Ct值；CtR2
m是來自對照處理樣品的內參基因2的Ct值；而CtR2
s是來自dsRNA處理樣品的內參基因2的Ct值。
巢式PCR和凝膠電泳分析
根據製造商說明，使用RNeasy Plus Mini試劑盒（凱傑公司（Qiagen），德國希爾登）從細胞培養物中分離總細胞RNA。使用如表17所示的包含gDNA Eraser的PrimeScript RT試劑盒（寶生物公司（Takara），日本志賀）將所得RNA（500 ng）逆轉錄成cDNA。然後使用如下表20所示的SYBR Premix Ex Taq II（寶生物公司，日本志賀）試劑和引子對組，在Roche LightCycler 480多孔板384（羅氏公司，參考號：4729749001，美國）中進行引子特異性、外顯子特異性、優化的巢式PCR擴增。所指示的引子對如表21所示，其是分別對應於一次或二次擴增的正向或反向(F/R)以及外側或內側引子對(O/I)。二次擴增產物隨後加入10 ×載樣緩衝液（寶生物公司，日本志賀），通過2%瓊脂糖凝膠在180 V下分離30分鐘，並通過GelRed®核酸凝膠染色劑（Biotium，美國弗里蒙特）視覺化。由ChemiDoc XRS+系統（伯樂公司（Biorad），美國赫拉克勒斯）捕獲圖像，並由Image J進行量化。
表20：巢式PCR反應
| 反應 -1 (Takara, RR820A) | 體積 (μL) |
| SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNA酶H Plus) (2 ×) 外側PCR引子組(正向+反向) 5 μM cDNA (稀釋的RT產物) | 5 1 4 |
| 總計 | 10 |
| 95°C持續30 sec; 95°C持續5 sec, 60°C持續60 sec, 15個迴圈；稀釋40倍 |
| 反應 -2 (Takara, RR820A) | 體積 (μL) |
| SYBR Premix Ex Taq II (TliRAN酶H Plus) (2 ×) 內側PCR引子組(正向+反向) 5 μM cDNA (稀釋的一次PCR產物) | 5 1 4 |
| 總計 | 10 |
| 95°C持續30 sec; 95°C持續5 sec, 60°C持續60 sec, 30個迴圈; |
表21：用於巢式PCR測定的引子序列
| 引子 | 基因 | O/I | SEQ ID NO | 序列 (5'-3') | 外顯子 | 產物大小(bp) |
| Homo-DMD-TS-F1 | 人DMD | I | 383 | AAGAGCTGAGGGCAAAGCAG | 50 | 323 |
| Homo-DMD-TS-R1 | I | 384 | GGGACGCCTCTGTTCCAAAT | 52 | ||
| Homo-DMD-TS-F5 | O | 385 | CTCTGAGTGGAAGGCGGTAA | 50 | 418 | |
| Homo-DMD-TS-R5 | O | 386 | AGCCTCTTGATTGCTGGTCT | 52 |
統計分析
採用單向方差分析(ANOVA)和Dunnett多重比較來比較連續變數組之間的差異。小於0.05的P值被認為兩組之間具有統計學意義。*/#代表p ＜ 0.05；** /##代表p ＜ 0.01；** /###代表p ＜ 0.001；並且****/####代表p ＜ 0.0001。
雖然已參照優選實施方式和各種替代實施方式具體示出和描述了本發明，但相關領域的技術人員應當理解，可在不脫離本發明精神和範圍的情況下在形式和細節上進行各種改變。
參考文獻
1.Vitravene研究組：Safety of intravitreous fomivirsen for treatment of cytomegalovirus retinitis in patients with AIDS（玻璃體內注射福米韋森治療愛滋病患者巨細胞病毒性視網膜炎的安全性），Am J Ophthalmol，2002年4月;133(4):484-98。
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3.Stein, C. A.和D. Castanotto. FDA-Approved Oligonucleotide Therapies in 2017（FDA於2017年批准的寡核苷酸療法）. Mol Thera, 2017年5月3日;25(5):1069-1075。
4.P Duda, GA Laforet, C DiJohnson, H Eliopoulos, A Narayana, DE Frank, S Ruff, JR Mendell. Development of Phosphorodiamidate Morpholino Oligomers (PMOs) for the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) (S42.008)（開發用於治療杜氏肌營養不良症 (DMD) 的磷酸二醯胺嗎啉代低聚物 (PMO)(S42.008)。），Neurology, 2017年4月18日; 88 (16增刊)。
5.H M Hsieh-Li 1, J G Chang, Y J Jong, M H Wu, N M Wang, C H Tsai, H Li. A mouse model for spinal muscular atrophy（脊髓性肌萎縮症小鼠模型）. Nature Genet, 2000年1；月；24(1):66-70。
無
可參考闡述了示例性實施方式的以下具體實施方式和附圖更好地理解本發明的特徵和優點，在所述示例性實施方式中運用了本發明的原理，在所述附圖中：
圖1A-1D比較了在III型SMA小鼠的骨骼肌中，示例性「脂質-DEC-ASO」(LDEC-ASO)與非偶聯物對照在將
SMN2前體mRNA轉化為全長轉錄物(
SMN2FL)時相對於其外顯子7去除的同種型(
SMN2Δ7)的剪接活性。在出生後40-50天（PND 40-50），通過皮下（SC）注射將指定劑量（即，10 mg/kg、30 mg/kg和100 mg/kg）的LDEC-ASO（即，RD-14644）或非偶聯物對照（即，RD-10004）給藥到雌性III型SMA小鼠（n = 3只小鼠/劑量）中。僅用生理鹽水（saline）的處理(n = 4只小鼠/組)用作載劑對照，從而建立
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA同種型的基線表達水準。給藥後14天處死小鼠，其中，使用同種型特異性引子組，通過RT-qPCR對來自不同骨骼肌的組織樣品中的
SMN2FL和
SMN2Δ7水準進行定量，所述不同骨骼肌包括二頭肌(圖1A)、半腱肌(圖1B)、頸闊肌(圖1C)和臀肌(圖1D)。擴增
Tbp以作為用於表達資料的標準化的內參。資料代表了相對於生理鹽水對照組，經處理的動物的肌肉組織中的
SMN2FL或
SMN2Δ7的平均表達水準。使用單向ANOVA計算統計學顯著性。
圖2A-2B比較了在包括肝(圖2A)和心臟(圖2B)的外周組織中，LDEC-ASO與非偶聯ASO在將
SMN2前體mRNA轉化為
SMN2FL時相對於
SMN2Δ7mRNA同種型的剪接活性。在圖2A中，在PND40-50時，通過皮下(SC)注射將指定劑量（即，10 mg/kg、30 mg/kg和100 mg/kg）的LDEC-ASO(即，RD-14644、RD-14645和RD-14646)或非偶聯物對照(即，RD-10004)給藥到雌性III型SMA中小鼠（n = 2-3只小鼠/劑量）中。而在心臟中，僅將LDEC偶聯物RD-14644處理與RD-10004進行比較（圖2B）。僅用生理鹽水的處理(n = 4只小鼠/組)用作載劑對照，從而建立
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA同種型的基線表達水準。給藥後第14天處死大鼠，並通過RT-qPCR使用同種型特異性引子組對
SMN2FL和
SMN2Δ7水準進行定量。擴增
Tbp以作為用於表達資料的標準化的內參。資料代表了相對於生理鹽水對照組，經處理的動物的肝（圖2A）或心臟（圖2B）中的
SMN2FL或
SMN2Δ7的平均表達水準。使用單向ANOVA計算統計學顯著性。
圖3A-3B比較了雌性III型SMA小鼠的外周組織和骨骼肌中，LDEC-ASO與非偶聯ASO在將
SMN2前體mRNA轉化為
SMN2FL時相對於
SMN2Δ7mRNA同種型的剪接活性。在PND 40-50時，通過SC注射將30 mg/kg的LDEC-ASO（即，RD-14644）或非偶聯物對照（即，RD-10004）給藥到雌性III型SMA小鼠中。僅用aCSF的處理用作載劑對照，從而建立
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA同種型的基線表達水準。給藥後第14天處死大鼠，其中通過RT-qPCR使用同種型特異性引子組對
SMN2FL和
SMN2Δ7水準進行定量。擴增
Tbp以作為用於表達資料的標準化的內參。圖3A-3B示出了相對於aCSF對照組，經處理的動物的外周組織(即，心臟、肝、脂肪組織、膈膜、具有靜脈的胸主動脈)和骨骼肌（即，二頭肌、半腱肌、頸闊肌和臀肌）中的
SMN2FL或
SMN2Δ7的平均表達水準。資料表示為每組3只小鼠的平均值 ± SEM。
圖4A-4F比較了III型SMA小鼠的各個組織中，LDEC-ASO與非偶聯ASO在將
SMN2前體mRNA轉化為
SMN2FL時相對於
SMN2Δ7mRNA同種型的剪接活性。在圖4A-4C中，在PND 40-50時，通過股靜脈（IV）注射將10 mg/kg的LDEC-ASO（即，RD-14644和RD-14645）或非偶聯物對照（即，RD-10004）給藥到雌性III型SMA小鼠中。在圖4D-4F中，在心臟、隔膜和肺中，僅將LDEC偶聯物RD-14644處理與RD-10004進行比較。僅用生理鹽水的處理用作載劑對照，從而建立
SMN2FL和
SMN2Δ7mRNA同種型的基線表達水準。給藥後第14天處死大鼠，並通過RT-qPCR使用同種型特異性引子組對
SMN2FL和
SMN2Δ7水準進行定量。擴增
Tbp以作為用於表達資料的標準化的內參。資料代表了相對於生理鹽水對照組，經處理的動物的肝、脂肪組織（附睾脂肪）、胸主動脈、心臟、隔膜和肺中的
SMN2FL或
SMN2Δ7的平均表達水準（每組2-3只小鼠的平均值 ± SEM）。
圖5A-5B比較了LDEC-ASO和非偶聯的ASO在GM03813細胞中將
SMN2前體mRNA轉化為
SMN2FL時相對於
SMN2 Δ 7mRNA同種型的剪接活性。以1 nM和10 nM將所指示的LDEC-ASO（即，RD-15865、RD-16070、RD-16071、RD-16072、RD-16073、RD-16074、RD-16075、RD-16076、RD-16077、RD-16078、RD-16079、RD-16080、RD-16081和RD-16098）轉染到GM03813細胞中，持續3天。轉染RD-10004並用作非偶聯物對照。模擬(Mock)處理是不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。dsCon2作為非特異性雙鏈體對照。圖5A-5B示出了在每個PCR反應中使用基因特異性引子組通過RT-qPCR定量的
SMN2FL和
SMN2Δ7的mRNA水準。擴增
SDHA以作為用於表達資料的標準化的內參。資料代表了標準化到
SDHA後相對於模擬處理，
SMN2FL或
SMN2Δ7的平均表達水準值（兩個重複轉染孔的平均值 ±SEM）。
圖6A-6B比較了LDEC-ASO和非偶聯的ASO在GM09677和GM03813細胞中將
SMN2前體mRNA轉化為
SMN2FL時相對於
SMN2 Δ 7mRNA同種型的剪接調控活性。以0.1 nM和1 nM將所指示的LDEC-ASO（即，RD-15865、RD-16070、RD-16071、RD-16072、RD-16073、RD-16074、RD-16075、RD-16076、RD-16077、RD-16078、RD-16079、RD-16080、RD-16081和RD-16098）轉染到GM09677細胞（圖6A）和GM03813細胞（圖6B）中，持續3天。轉染RD-10004並用作非偶聯物對照。類比處理是不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。dsCon2作為非特異性雙鏈體對照。圖6A-6B示出了在每個PCR反應中使用基因特異性引子組通過RT-qPCR定量的
SMN2FL和
SMN2Δ7的mRNA水準。擴增
SDHA以作為用於表達資料的標準化的內參。資料代表了標準化到
SDHA後相對於模擬處理，
SMN2FL或
SMN2Δ7的平均表達水準值（兩個重複轉染孔的平均值 ±SEM）。
圖7A-7B比較了LDEC-ASO和非偶聯的ASO在GM03813細胞中將
SMN2前體mRNA轉化為
SMN2FL時相對於
SMN2 Δ 7mRNA同種型的剪接調控活性。以1 nM和10 nM將所指示的LDEC-ASO（即，RD-16935、RD-16936和RD-16937）轉染到GM03813細胞中，持續3天。轉染RD-10004並用作非偶聯物對照。類比處理是不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。圖7A-7B示出了在每個PCR反應中使用基因特異性引子組通過RT-qPCR定量的
SMN2FL和
SMN2Δ7的mRNA水準。擴增
SDHA以作為用於表達資料的標準化的內參。資料代表了標準化到
SDHA後相對於模擬處理，
SMN2FL或
SMN2Δ7的平均表達水準值（四個重複轉染孔的平均值 ±SEM）。
圖8A-8B示出了人神經母細胞瘤細胞系(SK-N-AS)中由ASO介導的人
SCN9AmRNA表達水準的變化。以25 nM和100 nM將人SCN9A轉錄物上的119個ASO分別轉染至SK-N-AS細胞中，持續24小時。類比處理是不存在寡核苷酸的情況下進行轉染（未示出）。RD-10750用作非特異性對照（未示出）。RD-12746作為沉默dsRNA對照來轉染（未顯示）。在每個PCR反應中使用基因特異性引子組通過一步RT-qPCR對
SCN9AmRNA水準進行定量。
HPRT1和
HMBS的mRNA水準的幾何平均值用作內參。圖8A示出了標準化到
HPRT1和
HMBS後相對於模擬處理，25 nM和100 nM的
SCN9AmRNA的平均表達水準。ASO在x軸上按其敲除SCN9A mRNA表達的活性以降冪排列（兩個重複轉染孔的平均值 ± SEM）。圖8B示出了在25和100nM之間，ASO對SCN9A mRNA的E
最大敲低活性。表現最好的32個ASO用長方型實線框標記。
圖9A-9D示出了在SK-N-AS細胞中，ASO對
SCN9AmRNA的劑量依賴性敲低活性。基於SCN9A敲低活性的篩選結果，選擇前32個功能性ASO並以指定濃度梯度（即0.02nM、0.1nM、0.39nM、1.56nM、6.25nM、25nM、100 nM和400 nM）轉染至SK-N-AS細胞中，持續24小時。類比處理是不存在寡核苷酸的情況下進行轉染（未示出）。RD-10750用作非特異性對照（未示出）。RD-12746作為沉默dsRNA對照來轉染（未顯示）。圖9A-9D示出了在每個PCR反應中使用基因特異性引子組通過一步RT-qPCR對
SCN9AmRNA水準進行定量。
HPRT1和
HMBS的mRNA水準的幾何平均值用作內參。資料（y軸）代表了標準化到
HPRT1和
HMBS後相對於模擬處理，劑量回應的
SCN9AmRNA表達（兩個重複轉染孔的平均值±SEM）。
圖10示出了鞘內(IT)注射LDEC-ASO後SD大鼠的甩尾反應潛伏期。通過IV注射，將0.5 mg和1 mg的所指示的LDEC-ASO（即，RD-13767和RD-15069）和非偶聯的ASO（即，RD-12835和RD-15064）注射到成年雌性SD大鼠中。以1 mg處理RD-15873並用作陽性對照。僅用aCSF的處理用作載劑對照，從而建立甩尾反應潛伏期的基線。如材料和方法部分中所述，在第27天通過熱水尾部浸泡測試來測試甩尾反應潛伏期。資料表示經處理的組相對於aCSF組的平均甩尾反應潛伏期（每組4-5只小鼠的平均值 ± SEM）。
圖11A至11B比較了LDEC-ASO和非偶聯的ASO對SD大鼠中的大鼠
Scn9amRNA表達的敲低活性。通過IV注射給予0.5 mg和1 mg的所指示的LDEC-ASO（即，RD-13767和RD-15069）和非偶聯的ASO（即，RD-12835和RD-15064）。以1 mg處理RD-15873並用作陽性對照。僅用aCSF的處理用作載劑對照，從而建立
Scn9amRNA的基線表達。圖11A示出了通過RT-qPCR，在腦(即，大腦)、脊髓(即，頸椎、胸椎和腰椎)的組織中定量的剩餘
Scn9amRNA。圖11B示出了通過RT-qPCR，在背根神經節（DRG）中定量的剩餘
Scn9amRNA。給藥後第27天處死大鼠，並通過RT-qPCR對
Scn9amRNA水準進行定量。
Tbp和
B2m的mRNA水準的幾何平均值被用作內參以對表達資料進行標準化。資料表示經處理的動物相對於aCSF對照組的
Scn9amRNA的平均表達（每組4-5只小鼠的平均值 ± SEM）。
圖12示出了人惡性胚胎橫紋肌瘤細胞系(RD)中由LDEC-ASO介導的人
DMDmRNA的外顯子51跳躍水準。以25 nM將50個人LDEC-ASO單獨轉染至RD細胞中，持續48小時。類比處理是不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。轉染RD-16271和RD-16272並用作非特異性對照。轉染RD-15946並用作LDEC-ASO陽性對照。使用兩個基因特異性引子組通過巢式PCR對外顯子51跳躍水準進行定量（表21中所示）。資料代表相對於類比處理的外顯子51跳躍平均表達水準（兩個重複轉染孔的平均值±SEM）。
圖13示出了RD細胞中由LDEC-ASO介導的人
DMDmRNA的劑量依賴性外顯子51跳躍水準。以10 nM、25 nM和100 nM將所指示的LDEC-ASO（即，RD-15905、RD-15935、RD-15936、RD-15941、RD-15942、RD-15943和RD-15944）單獨轉染到RD細胞中，持續48小時。類比處理是不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。RD-16271用作非特異性對照。轉染RD-15945並用作非偶聯ASO陽性對照。轉染RD-15946並用作LDEC-ASO陽性對照。使用兩個基因特異性引子組通過巢式PCR對外顯子51跳躍水準進行定量（表21中所示）。資料代表相對於類比處理的外顯子51跳躍平均表達水準（兩個重複轉染孔的平均值±SEM）。
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Claims (52)
- 一種寡核苷酸遞送劑，其包括直接或間接偶聯到寡核苷酸的一個或多個脂質部分，其中，所述脂質部分中的至少一個脂質部分包含至少一個C 6-C 22直鏈烷基、至少一個C 6-C 22直鏈烯基或其組合，並且寡核苷酸是單鏈寡核苷酸。
- 如請求項1所述之寡核苷酸遞送劑，其中，脂質部分包含C 12-C 20直鏈烷基、C 12-C 20直鏈烯基或其組合，並且C 12-C 20直鏈烯基包含一個或兩個烯屬不飽和基團。
- 如請求項1所述之寡核苷酸遞送劑，其中，C 6-C 22直鏈烷基選自直鏈十二烷基、直鏈十四烷基、直鏈十五烷基、直鏈十六烷基、直鏈十八烷基、直鏈二十烷基、直鏈十二烯基、直鏈十四烯基、直鏈十五烯基、直鏈十六烯基、直鏈十八烯基、直鏈二十烯基、直鏈十二碳二烯基、直鏈十四碳二烯基、直鏈十五碳二烯基、直鏈十六碳二烯基、直鏈十八碳二烯基、直鏈二十碳二烯基。
- 如請求項1至3中任一項所述之寡核苷酸遞送劑，其中，寡核苷酸是單鏈寡核苷酸。
- 如請求項4所述之寡核苷酸遞送劑，其中單鏈寡核苷酸的長度為15至35個核苷酸。
- 如請求項1所述之寡核苷酸遞送劑，其中，脂質部分通過共價鍵直接偶聯到單鏈寡核苷酸或者通過具有以下結構的連接部分連接到單鏈寡核苷酸： 其中Y 1是氧或硫，星號（*）是指連接部分連接到單鏈寡核苷酸的位置，並且雙星號（**）是指連接部分連接到脂質部分的位置。
- 如請求項1所述之寡核苷酸遞送劑，其具有由式A表示的結構： 式A 其中脂質部分包含至少一個C 6-C 22直鏈烷基、至少一個C 6-C 22直鏈烯基或其組合，並且M是1至5的整數，寡核苷酸是單鏈寡核苷酸，並且N是1、2或3的整數；並且 遞送增強化合物部分是包含至少一個含氮雜環、至少一個含氮直鏈基團、至少一個含氮直鏈-碳環基團或其組合的二價到六價部分，並且脂質部分和寡核苷酸各自直接或間接偶聯到遞送增強化合物部分。
- 如請求項7所述之寡核苷酸遞送劑，其中，脂質部分是C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20直鏈的飽和或不飽和烴基，並且 M是1、2、3、4或5的整數。
- 如請求項8所述之寡核苷酸遞送劑，其中，不飽和脂質部分具有在烴基中的至少一個順式或反式不飽和雙鍵。
- 如請求項1-3和7中任一項所述之寡核苷酸遞送劑，其中，寡核苷酸是至少一個單鏈寡核苷酸，其選自反義寡核苷酸(ASO)、反義RNA、短幹擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小啟動RNA(saran)、細胞質小RNA(scRNA)、小嚮導RNA(sgRNA)和磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸（PMO）。
- 如請求項7所述之寡核苷酸遞送劑，其中，式A’表示的脂質部分和遞送增強化合物部分的組合具有的結構能夠通過從式I或式II表示的結構減去至少一個氫原子或末端基團獲得，其中，末端基團選自羥基、羧基、酯基、醚基、磷酸酯基、膦酸酯基、硫酸酯基、磺酸酯基、醯胺基、醯基及其組合，並且前提是A 1、A 2、A 3、R 3、R 4和R 5中的至少一者是C 6-C 22直鏈烷基，優選直鏈十六烷基， 式A’ 式I 式II 其中，每個 獨立地表示共價單鍵或雙鍵；每次出現的X選自碳、氮、氧和硫；F、G、H和I各自獨立地選自碳、氮、氧和硫； 其中m是1、2或3的整數，n是1、2或3的整數，並且m+n=4； 其中C在每次出現時或者不存在或者選自下組：氫、鹵原子、羥基、(C 1-C 20)烷基、(C 1-C 20)烷氧基、鹵代(C 1-C 20)烷基和鹵代(C 1-C 20)烷氧基； 其中B在每次出現時獨立地選自下組：羥基、-C(O)OH、-P(O) 2-OH、-P(O)-OH、-P(O)(S)-OH、-CN、-(C 1-C 22)烷基、-(C 1-C 22)烯基、-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 3-C 22)亞環烷基-OH、-(C 6-C 22)亞芳基-OH、-(C 6-C 22)亞雜芳基-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-(C 3-C 22)亞環烷基-C(O)OH、-(C 6-C 22)亞芳基-C(O)OH、-(C 5-C 22)亞雜芳基-C(O)OH、-O-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-O-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)NH 2、-O-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-(C 1-C 22)亞烷基-O-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)NH 2、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-(C 1-C 30)亞烷基-P(O) 2-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 30)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-P(O)-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-P(O)(S)-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-CN， 其中A 1、A 2和A 3中的每一者或者不存在或者是獨立選自下組的取代基：-H、-OH、-O-R 1、-SH、-(C 1-C 22)烷基、鹵代-(C 1-C 22)烷基、-(C 2-C 22)烯基、-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 3-C 22)環烷基、-(C 3-C 22)環烯基、-(C 1-C 22)亞烷基-(C 3-C 22)環烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烯基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-O-R 1、-(C 1-C 22)亞烯基-O-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-COOR 1、-(C 1-C 22)亞烯基-COOR 1、-C(O)O-R 1、-O-(C 1-C 22)烷基、-S-(C 1-C 22)烷基、-C(O)-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-O-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-O-C(O)-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-O-C(O)-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-R 1、-O-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-O-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-O-金剛烷基、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C 1-C 22)烷基、-CH(NH-CO-(C 1-C 22)烷基)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-CH(NH-CO-鹵代(C 1-C 22)烷基)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C 1-C 22)烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-(C 1-C 6環氧烷基) (1-20)-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-C(O)NH-(C 1-C 22)烷基、-C(O)NH-R 1、-C(O)NR 2-R 1、-C(O)NH-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-C(O)NH-(C 1-C 22)亞烷基-COOH、 -NH-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-NH-C(O)-R 1、-NR 2-C(O)-R 1、-O-P(O) 2-O-R 1、-OP(O)(S)-O-R 1、-O-P(O)-O-R 1、-NH-R 1、-NR 2-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)O-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-C(O)-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)- NH-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 30)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-P(O)-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-P(O)(S)-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-CN、取代或未取代的吡咯、取代或未取代的吡咯啉、取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的吡唑啉、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的咪唑、取代或未取代的噁唑、取代或未取代的噻唑、取代或未取代的苯並吡咯、取代或未取代的苯並吡咯啉、取代或未取代的苯並吡咯烷、取代或未取代的苯並吡唑、取代或未取代的苯並吡唑啉、取代或未取代的苯並吡唑烷、取代或未取代的苯並咪唑、取代或未取代的苯並噁唑、取代或未取代的苯並噻唑以及式III表示的取代基： 式III 其中Y選自碳、氮、氧和硫；並且P、Q、S和T中的每一者獨立地選自碳、氮、氧和硫；並且星號是指由式III表示的取代基與由式I或式II表示的結構連接的位元點； 其中R 3、R 4和R 5中的每一者或者不存在或者是獨立選自下組的取代基：-H、-OH、-O-R 1、-SH、-(C 1-C 22)烷基、鹵代-(C 1-C 22)烷基、-(C 2-C 22)烯基、-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 3-C 22)環烷基、-(C 3-C 22)環烯基、-(C 1-C 22)亞烷基-(C 3-C 22)環烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烯基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-O-R 1、-(C 1-C 22)亞烯基-O-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-COOR 1、-(C 1-C 22)亞烯基-COOR 1、-C(O)O-R 1、-O-(C 1-C 22)烷基、-S-(C 1-C 22)烷基、-C(O)-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-O-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-O-C(O)-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-O-C(O)-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-R 1、-O-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-O-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-O-金剛烷基、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C 1-C 22)烷基、-CH(NH-CO-(C 1-C 22)烷基)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-CH(NH-CO-鹵代(C 1-C 22)烷基)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-鹵代(C 1-C 22)烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-(C 1-C 6環氧烷基) (1-20)-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-C(O)NH-(C 1-C 22)烷基、-C(O)NH-R 1、-C(O)NR 2-R 1、-C(O)NH-(C 1-C 22)亞烷基-OH、 -C(O)NH-(C 1-C 22)亞烷基-COOH、-NH-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-NH-C(O)-R 1、-NR 2-C(O)-R 1、-O-P(O) 2-O-R 1、-OP(O)(S)-O-R 1、-O-P(O)-O-R 1、-NH-R 1、-NR 2-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)O-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-R 1、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-C(O)-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)- NH-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 30)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-P(O)-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-P(O)(S)-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-CN、取代或未取代的吡咯、取代或未取代的吡咯啉、取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的吡唑啉、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的咪唑、取代或未取代的噁唑、取代或未取代的噻唑、取代或未取代的苯並吡咯、取代或未取代的苯並吡咯啉、取代或未取代的苯並吡咯烷、取代或未取代的苯並吡唑、取代或未取代的苯並吡唑啉、取代或未取代的苯並吡唑烷、取代或未取代的苯並咪唑、取代或未取代的苯並噁唑和取代或未取代的苯並噻唑， 其中R 7在每次出現時連接到P、Q、S和T中的任一者，並且其或者不存在或者選自氫、鹵原子、羥基、(C 1-C 20)烷基、(C 1-C 20)烷氧基、鹵代(C 1-C 20)烷基和鹵代(C 1-C 20)烷氧基； 其中p是0、1、2或3的整數； 其中R 6連接到P、Q、S和T中的任一者，並且其選自直接鍵、-O-、-C(O)O-、-O-C(O)-、-P(O) 2-O-、-O-P(O) 2-O-、-P(O)(S)-O-、-O-P(O)(S)-O-、-O-P(O)-O-、-(C 1-C 22)亞烷基-、-(C 1-C 22)亞烷基-O-、-O-(C 1-C 22)亞烷基-、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-、-NH-(C 1-C 22)亞烷基-、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-、-C(O)-O-(C 1-C 22)亞烷基-、-(C 1-C 30)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-C(O)-、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-、-C(O)-N((C 1-C 22)烷基)-(C 1-C 22)亞烷基-、-C(O)-N((C 1-C 22)烷基)-(C 1-C 22)亞烷基-O-、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-、 -C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-、-C(O)-N((C 1-C 22)烷基)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-N((C 1-C 22)烷基)-(C 1-C 22)亞烷基-、-C(O)-N((C 1-C 22)烷基)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-N((C 1-C 22)烷基)-、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-、 -(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-、-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-、-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-O-、-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-、-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-O-、-N((C 1-C 22)烷基)-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-、-N((C 1-C 22)烷基)-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-O-、-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-、-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-、-N((C 1-C 22)烷基)-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-N((C 1-C 22)烷基)-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-、-N((C 1-C 22)烷基)-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-N((C 1-C 22)烷基)-C(O)-、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-、-(C 1-C 22)亞烷基-P(O) 2-O-、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(O) 2-O-、-(C 3-C 22)亞環烷基-、-(C 3-C 22)亞環烷基-O-、-O-(C 3-C 22)亞環烷基-、-(C 6-C 22)亞芳基-、-(C 6-C 22)亞芳基-O-、-O-(C 6-C 22)亞芳基-、-(C 6-C 22)亞芳基-NH-、-NH-(C 6-C 22)亞芳基-、-C(O)-(C 6-C 22)亞芳基-、-(C 6-C 22)亞芳基-C(O)-、-C(O)-O-(C 6-C 22)亞芳基-、-(C 6-C 22)亞芳基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C 6-C 22)亞芳基- 和-C(O)-NH-(C 6-C 22)亞芳基-C(O)-O-； 其中R 1在每次出現時獨立地選自氫、羥基、-(C 1-C 22)烷基、-(C 3-C 22)環烷基、-(C 6-C 22)芳基、-(C 1-C 22)烷氧基、-(C 3-C 22)環烷氧基、-(C 6-C 22)芳氧基、-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-OC(O)(C 1-C 22)烷基、-C(O)-O-(C 1-C 22)烷基、-C(O)-(C 3-C 22)環烷基、-OC(O)-(C 3-C 22)環烷基、-C(O)-O-(C 3-C 22)環烷基、-C(O)-(C 6-C 22)芳氧基、-OC(O)-(C 6-C 22)芳氧基、-C(O)-O-(C 6-C 22)芳氧基、-C(O)-磷酸酯基團、磷酸二酯基團、亞磷醯胺基團、飽和脂肪酸基團、不飽和脂肪酸基團、脂質、PEG、類固醇、親脂物質、碳水化合物、膽固醇、金剛烷、胺基酸、肽、氯喹和生物鹼， 其中R 2在每次出現時獨立地選自下組：鹵原子、(C 1-C 12)烷基、(C 1-C 12)烷氧基、(C 1-C 12)烷氧基羰基、(C 6-C 16)芳基或(C 6-C 16)芳氧基羰基；並且 其中A 1、A 2、A 3、B、C、R 1、R 2、R 3、R 4、R 5、R 6和R 7中包含的一個或多個羥基、羧基、氨基、腈基和磷酸基團任選連接到支援材料或被末端保護基保護。
- 如請求項11所述之寡核苷酸遞送劑，其中A 1、A 2、A 3、B、C、R 1、R 2、R 3、R 4、R 5、R 6和R 7各自中包含的一個或多個羥基、羧基、氨基、腈基和磷酸基團任選地被末端保護基R P保護，所述末端保護基R P選自下組：(C 1-C 22)烷基、(C 1-C 22)烷氧基、(C 1-C 22)烷基羰基、(C 1-C 22)烷氧基羰基、(C 6-C 22)芳基、(C 6-C 22)芳氧基、(C 6-C 22)芳基羰基、(C 6-C 22)芳氧基羰基、三((C 1-C 22)烷基)甲矽烷基和三((C 1-C 22)烷氧基)甲矽烷基；並且 其中，支援材料選自二氧化矽、矽膠、玻璃、陶瓷、聚合物、纖維素及其組合。
- 如請求項11所述之寡核苷酸遞送劑，其中，式A’表示的脂質部分和遞送增強化合物部分的組合所具有的結構能夠通過從式IV至式XIII表示的結構中減去至少一個氫原子或末端基團得到： 式IV 式V 式VI 式VII 式VIII 式IX 式X 式XI 式XII 式XIII。
- 如請求項11所述之寡核苷酸遞送劑，其中，F、G、H和I各自是碳，m是1且n是3，B連接到G或H，P、Q、S和T中的每一者是碳，R 6連接到Q和S中的任一者； 其中保護基R P選自苄氧基羰基(Cbz)、叔丁基二甲基甲矽烷基(TBS)、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、叔丁氧羰基(Boc)、苄基(Bn)和苄氧基(BnO)； 其中每次出現的C選自下組：氫、鹵原子、羥基、(C 1-C 12)烷基、(C 1-C 12)烷氧基、鹵代(C 1-C 12)烷基和鹵代(C 1-C 12)烷氧基； 其中每次出現的B是-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-O-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)NH 2、-(C 1-C 16)亞烷基-O-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)NH 2、-O-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)OH、-(C 1-C 16)亞烷基-O-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)NH 2、-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)NH 2、-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-OH、-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)OH、-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)OH、-(C 1-C 16)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 16烷基) 2)-O-(C 1-C 16)亞烷基-CN、-(C 1-C 16)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 16烷基) 2)-O-(C 1-C 16)亞烷基-OH、-(C 1-C 16)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 16烷基) 2)-O-(C 1-C 16)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 16)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 16烷基) 2)-O-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 16烷基) 2)-O-(C 1-C 16)亞烷基-CN， 其中A 1、A 2和A 3中的每一者或者不存在或者是獨立選自下組的取代基：-H、-OH、直鏈或支鏈-(C 6-C 22)烷基、直鏈或支鏈-(C 2-C 22)烯基、-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 1-C 22)亞烯基-OH、-(C 3-C 22)環烷基、-(C 3-C 22)環烯基、-(C 1-C 22)亞烷基-(C 3-C 22)環烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烯基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-O-R 1、-(C 1-C 22)亞烯基-O-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-COOR 1、-(C 1-C 22)亞烯基-COOR 1、-O-(C 1-C 22)烷基、-(C 6-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-(C 1-C 6環氧烷基) (1-20)-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-C(O)NH-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、取代或未取代的吡咯、取代或未取代的吡咯啉、取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的吡唑啉、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的咪唑、取代或未取代的噁唑、取代或未取代的噻唑、取代或未取代的苯並吡咯、取代或未取代的苯並吡咯啉、取代或未取代的苯並吡咯烷、取代或未取代的苯並吡唑、取代或未取代的苯並吡唑啉、取代或未取代的苯並吡唑烷、取代或未取代的苯並咪唑、取代或未取代的苯並噁唑、取代或未取代的苯並噻唑以及由式III表示的取代基， 其中Y選自碳、氮、氧和硫；並且P、Q、S和T中的每一者是碳； 其中R 3、R 4和R 5中的每一者或者不存在或者是獨立選自下組的取代基：-H、-OH、直鏈或支鏈-(C 6-C 22)烷基、直鏈或支鏈-(C 2-C 22)烯基、-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 3-C 22)環烷基、-(C 3-C 22)環烯基、-(C 1-C 22)亞烷基-(C 3-C 22)環烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-O-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-COOR 1、-O-(C 1-C 22)烷基、-(C 6-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-NR 2-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-(C 1-C 22)亞烷基-(C 1-C 6環氧烷基) (1-20)-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-金剛烷基、-C(O)NH-R 1、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OH、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-NH 2、-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)OH、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-O-P(-N(C 1-C 22烷基) 2)-O-(C 1-C 22)亞烷基-CN、取代或未取代的吡咯、取代或未取代的吡咯啉、取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的吡唑啉、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的咪唑、取代或未取代的噁唑、取代或未取代的噻唑、取代或未取代的苯並吡咯、取代或未取代的苯並吡咯啉、取代或未取代的苯並吡咯烷、取代或未取代的苯並吡唑、取代或未取代的苯並吡唑啉、取代或未取代的苯並吡唑烷、取代或未取代的苯並咪唑、取代或未取代的苯並噁唑和取代或未取代的苯並噻唑， 其中R 7在每次出現時連接到P、Q、S和T中的任一者，並且其或者不存在或者選自氫、鹵原子、羥基、(C 1-C 20)烷基、(C 1-C 20)烷氧基、鹵代(C 1-C 20)烷基和鹵代(C 1-C 20)烷氧基； 其中p是0、1、2或3的整數； 其中R 6連接到P、Q、S和T中的任一者，並且選自-(C 1-C 16)亞烷基-、-(C 1-C 16)亞烷基-O-、-O-(C 1-C 16)亞烷基-、-(C 1-C 16)亞烷基-NH-、-NH-(C 1-C 16)亞烷基-、-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-、-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-、-C(O)-O-(C 1-C 16)亞烷基-、-(C 1-C16)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-、-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-O-C(O)-、-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-O-C(O)-O-、-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-O-、-C(O)-N((C 1-C 16)烷基)-(C 1-C 16)亞烷基-、-C(O)-N((C 1-C 16)烷基)-(C 1-C 16)亞烷基-O-、-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-、 -C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-、 -C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-NH-、-C(O)-N((C 1-C 16)烷基)-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-N((C 1-C 16)烷基)-(C 1-C 16)亞烷基-、-C(O)-N((C 1-C 16)烷基)-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-N((C 1-C 16)烷基)-、-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-、-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-NH-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-NH-、-NH-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-、-NH-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-O-、-NH-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-、-NH-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-O-、-N((C 1-C 16)烷基)-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-、-N((C 1-C 16)烷基)-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-O-、-NH-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-、 -NH-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-NH-C(O)-、-N((C 1-C 16)烷基)-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-N((C 1-C 16)烷基)-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-、-N((C 1-C 16)烷基)-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-N((C 1-C 16)烷基)-C(O)-、-(C 1-C 16)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-、-(C 1-C 16)亞烷基-NH-C(O)-(C 1-C 16)亞烷基-NH-C(O)-；和 條件是，A 1、A 2、A 3、R 3、R 4和R 5中的至少一者是C 6-C 22直鏈烷基，優選直鏈十六烷基。
- 如請求項7所述之寡核苷酸遞送劑，其中遞送增強化合物部分包含選自下組的結構：-(C 1-C 16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-NH-、-(C 1-C 16)亞烷基-O-(C 1-C 16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C 1-C 16)亞烷基-O-(C 1-C 16)亞烷基-O-(C 1-C 16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C 3-C 12)亞環烷基-NH-C(O)-、-(C 1-C 16)亞烷基-(C 3-C 12)亞環烷基-NH-C(O)-、-(C 1-C 16)亞烷基-(C 3-C 12)亞環烷基-(C 1-C 16)亞烷基-NH-C(O)-、-(C 1-C 16)亞烷基-O-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-NH-、-(C 1-C 16)亞烷基-O-(C 1-C 16)亞烷基-O-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-NH-、-(C 3-C 12)亞環烷基-C(O)-NH-、-(C 1-C 16)亞烷基-(C 3-C 12)亞環烷基-C(O)-NH-、-(C 1-C 16)亞烷基-(C 3-C 12)亞環烷基-(C 1-C 16)亞烷基-C(O)-NH-，和/或 其中，遞送增強化合物部分通過共價鍵直接偶聯到單鏈寡核苷酸或者通過具有以下結構的連接部分連接到單鏈寡核苷酸： 其中Y 1是氧或硫，星號（*）是指連接部分連接到單鏈寡核苷酸的位置，並且雙星號（**）是指連接部分連接到遞送增強化合物部分的位置。
- 如請求項1至6中任一項所述之寡核苷酸遞送劑，其中，脂質部分中包含的至少一個氫原子被氘原子取代。
- 如請求項7至15中任一項所述之寡核苷酸遞送劑，其中脂質部分、遞送增強化合物部分和/或單鏈寡核苷酸中包含的至少一個氫原子被氘原子取代。
- 如請求項7所述之寡核苷酸遞送劑，其中，式A’表示的脂質部分和遞送增強化合物部分的組合所具有的結構能夠通過從化合物C1至化合物C71中任一者中減去至少一個氫原子或末端基團得到： 其中 表示支持材料。
- 如請求項7所述之寡核苷酸遞送劑，其中寡核苷酸通過至少一個連接部分連接到遞送增強化合物部分，所述連接部分選自下組：直接鍵、-O-、-S-、-C(O)-、-NH-、-N((C 1-C 12)烷基)-、-N((C 1-C 12)烷基)-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-O-、-C(O)-NH-、-OP(O) 2O-、-P(O)(O -)O-、-OP(O)O-、-OP(O)(S)O-、-OP(O)(S -)O-、-O-S(O) 2-O-、-S(O) 2-O-、-S(O)-O-、-(C 1-C 22)亞烷基-、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-、-NH-(C 1-C 22)亞烷基-、-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-、-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-、-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-、-NH-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-、-NH-(C 1-C 22)亞烷基-NH-、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)O-、-O-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-O-、-C(O)-O-(C 1-C 22)亞烷基-O-C(O)-、-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-、-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-、-NH-C(O)-(C 1-C 22)亞烷基-C(O)-NH-、-C(O)-NH-(C 1-C 22)亞烷基-NH-C(O)-、-(C 1-C 22)亞烷基-OP(O) 2O-、-(C 1-C 22)亞烷基-OP(O)(O -)O-、-(C 1-C 22)亞烷基-OP(O)(O -)O-(C 1-C 22)亞烷基-、-(C 1-C 22)亞烷基-OP(O)O-、-(C 1-C 22)亞烷基-OP(O)(S)O-、-(C 1-C 22)亞烷基-O-S(O) 2-O-、-(C 1-C 22)亞烷基-S(O) 2-O-、-(C 1-C 22)亞烷基-S(O)-O-、-O-P(O) 2-O-(C 1-C 22)亞烷基-OP(O) 2O-、-O-P(O)-O-(C 1-C 22)亞烷基-OP(O)O-、-OP(O)(S)O-(C 1-C 22)亞烷基-OP(O)(S)O-、-O-S(O) 2-O-(C 1-C 22)亞烷基-O-S(O) 2-O-、-S(O) 2-O-(C 1-C 22)亞烷基-S(O) 2-O- and -O-S(O)-(C 1-C 22)亞烷基-S(O)-O-。
- 如請求項19所述之寡核苷酸遞送劑，其具有由式AI至AVII中任一者表示的結構： 式AI 式AII 式AIII 式AIV 式AV 式AVI 式AVII 其中，L表示連接部分， 表示由式A’表示的脂質部分和遞送增強化合物部分的組合， 表示5’到3’方向或或3’到5’方向的單鏈寡核苷酸，並且a、b和c各自獨立地為1至50的整數。
- 如請求項19所述之寡核苷酸遞送劑，其具有由式O1至O20中任一者表示的結構： O1 O2 O3 O4 O5 O6 O7 O8 O9 O10 O11 O12 O13 O14 O15 O16 O17 O18 O19 O20 其中Y表示氧或硫。
- 如請求項1至21中任一項所述之寡核苷酸遞送劑，其中，寡核苷酸以包含選自 SMN2、 SCN9A、 Scn9a和 DMD的寡核苷酸序列的至少部分的基因為靶標。
- 如請求項1至22中任一項所述之寡核苷酸遞送劑，其中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:142-260和SEQ ID NO:443-492的寡核苷酸序列的至少部分；和/或 其中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:261-379、SEQ ID NO: 388和SEQ ID NO: 390的寡核苷酸序列的至少部分；和/或 其中，寡核苷酸與包含選自SEQ ID NO:23-141和SEQ ID NO: 393-442的寡核苷酸序列的至少部分的連續靶序列互補。
- 如請求項1至23中任一項所述之寡核苷酸遞送劑，其中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:2-21、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:391和SEQ ID NO:493-542的寡核苷酸序列的至少部分。
- 一種藥物組合物，其包含： a) 如請求項1至24中任一項所述之寡核苷酸遞送劑；和 b) 任選地，選自下組的一種或多種成分：藥學上可接受的載體、賦形劑、溶劑、稀釋劑、穩定劑、分散劑、緩衝劑、增容劑、防腐劑及其組合。
- 一種調控物件的靶基因的表達的方法，所述方法包括向物件給予如請求項25所述之藥物組合物的步驟。
- 如請求項26所述之方法，其中，向物件的心肌、骨骼肌、平滑肌和肝中的至少一者給予所述藥物組合物。
- 如請求項26所述之方法，其中，藥物組合物增加了靶基因的表達。
- 如請求項26所述之方法，其中，藥物組合物降低了靶基因的表達。
- 如請求項26至29中任一項所述之方法，其中，所述物件是哺乳動物。
- 如請求項30所述之方法，其中，所述哺乳動物是齧齒動物。
- 如請求項31所述之方法，其中，所述齧齒動物是小鼠或大鼠。
- 如請求項32所述之方法，其中所述哺乳動物是非人靈長類動物。
- 如請求項30所述之方法，其中所述哺乳動物是人。
- 如請求項26至29中任一項所述之方法，其中，靶基因與疾病或失調相關。
- 如請求項35所述之方法，其中，靶基因與中樞神經系統、眼、脾、肌肉、心臟、腎或肝的疾病或失調相關。
- 如請求項26至36中任一項所述之方法，其中，寡核苷酸以包含選自 SMN2、 SCN9A、 Scn9a和 DMD的寡核苷酸序列的至少部分的基因為靶標。
- 如請求項26至37中任一項所述之方法，其中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:142-260和SEQ ID NO:443-492的寡核苷酸序列的至少部分；和/或 其中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:261-379、SEQ ID NO: 388和SEQ ID NO: 390的寡核苷酸序列的至少部分；和/或 其中，寡核苷酸與包含選自SEQ ID NO:23-141和SEQ ID NO: 393-442的寡核苷酸序列的至少部分的連續靶序列互補。
- 如請求項26至38中任一項所述之方法，其中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:2-21、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:391和SEQ ID NO:493-542的寡核苷酸序列的至少部分。
- 一種調控靶基因的表達的方法，所述方法包括使細胞與請求項22的藥物組合物接觸。
- 如請求項40所述之方法，其中，細胞來自骨骼肌、心肌、平滑肌或肝。
- 如請求項40所述之方法，其中，藥物組合物增加了靶基因的表達。
- 如請求項40所述之方法，其中，藥物組合物降低了靶基因的表達。
- 如請求項41所述之方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
- 如請求項44所述之方法，其中，所述哺乳動物細胞是小鼠細胞或大鼠細胞。
- 如請求項44所述之方法，其中所述哺乳動物是非人靈長類動物。
- 如請求項44所述之方法，其中所述哺乳動物細胞是人細胞。
- 如請求項40至47中任一項所述之方法，其中，靶基因與疾病或失調相關。
- 如請求項48所述之方法，其中，靶基因與中樞神經系統、眼、脾、肌肉、心臟、腎或肝的疾病或失調相關。
- 如請求項40至49中任一項所述之方法，其中，寡核苷酸以包含選自 SMN2、 SCN9A、 Scn9a和 DMD的寡核苷酸序列的至少部分的基因為靶標。
- 如請求項40至50中任一項所述之方法，其中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:142-260和SEQ ID NO:443-492的寡核苷酸序列的至少部分；和/或 其中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:261-379、SEQ ID NO: 388和SEQ ID NO: 390的寡核苷酸序列的至少部分；和/或 其中，寡核苷酸與包含選自SEQ ID NO:23-141和SEQ ID NO: 393-442的寡核苷酸序列的至少部分的連續靶序列互補。
- 如請求項40至51中任一項所述之方法，其中，寡核苷酸包含選自SEQ ID NO:2-21、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:391和SEQ ID NO:493-542的寡核苷酸序列的至少部分。
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