CN112004928A - 寡核苷酸组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本披露尤其提供了设计的寡核苷酸、组合物、及其使用方法。在一些实施例中，本披露提供了可用于降低转录物水平的技术。在一些实施例中，本披露提供了可用于调节转录物剪接的技术。在一些实施例中，提供的技术可以改变肌营养不良蛋白(DMD)转录物的剪接。在一些实施例中，本披露提供了用于治疗疾病的方法，这些疾病是如杜氏肌肉营养不良、贝克肌肉营养不良等。

Description

寡核苷酸组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年4月12日提交的美国临时申请号62/656,949、于2018年5月11日提交的美国临时申请号62/670,709、于2018年8月07日提交的美国临时申请号62/715,684、于2018年8月27日提交的美国临时申请号62/723,375、以及于2018年12月06日提交的美国临时申请号62/776,432的优先权，其各自的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
寡核苷酸可用于治疗、诊断、研究、和纳米材料应用。天然存在的核酸(例如，未经修饰的DNA或RNA)用于治疗的用途可能受限，例如，因为天然存在的核酸对细胞外和细胞内核酸酶的不稳定性和/或天然存在的核酸的细胞渗透和分布不良。需要新的且改善的寡核苷酸以及寡核苷酸组合物，例如像，能够调节用于治疗肌肉营养不良的肌营养不良蛋白外显子跳读的新寡核苷酸和寡核苷酸组合物。
发明内容
除其他事项外，本披露涵盖了以下认识：寡核苷酸的结构元件(例如，碱基序列、化学修饰(例如糖、碱基和/或核苷酸间键联的修饰及其模式)、和/或立体化学(例如骨架手性中心(手性核苷酸间键)的立体化学和/或其模式))可以对寡核苷酸特性(例如活性、毒性(例如，如可由蛋白质结合特征介导)、稳定性、剪接改变能力等)产生重大影响。在一些实施例中，本披露证明了包含具有受控的结构元件(例如，受控的化学修饰和/或受控的骨架立体化学模式)的寡核苷酸的寡核苷酸组合物提供了意想不到的特性，包括但不限于某些活性、毒性等。在一些实施例中，本披露证明了寡核苷酸特性(例如，活性、毒性等)可通过化学修饰(例如，糖、碱基、核苷酸间键等的修饰)、手性结构(例如手性核苷酸间键的立体化学及其模式等)和/或其组合来调节。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸或寡核苷酸组合物。在一些实施例中，寡核苷酸或寡核苷酸组合物是DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸组合物。在一些实施例中，DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸组合物是能够调节靶基因肌营养不良蛋白(DMD)的一个或多个外显子的跳读的寡核苷酸或寡核苷酸组合物。在一些实施例中，DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸组合物可用于治疗肌肉营养不良。在一些实施例中，寡核苷酸或寡核苷酸组合物是包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸或寡核苷酸组合物。在一些实施例中，包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸或寡核苷酸组合物能够调节基因靶标或其基因产物的表达、水平和/或活性，包括但不限于经由以下任何机制增加或减少基因靶标或其基因产物的表达、水平和/或活性，该机制包括但不限于：RNA酶H(RNase H)依赖性机制、位阻、RNA干扰、调节一个或多个外显子的跳读等。在一些实施例中，本披露涉及寡核苷酸或寡核苷酸组合物，该寡核苷酸或寡核苷酸组合物包含与本文所述的任何其他结构或化学部分组合的非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及包含非负电荷的核苷酸间键联的DMD寡核苷酸或DMD寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，本披露提供了用于降低转录物和/或由其编码的蛋白质的水平、与寡核苷酸或寡核苷酸组合物有关的技术。在一些实施例中，如由本文所述的示例数据所证明的，提供的技术对于降低mRNA和/或由其编码的蛋白质的水平特别有用。
在一些实施例中，本披露提供了用于改变转录物的基因表达、水平和/或剪接的技术，例如寡核苷酸、组合物和方法等。在一些实施例中，转录物是肌营养不良蛋白(DMD)。转录物如前mRNA的剪接是该转录物在许多高级真核生物中执行其生物学功能的必不可少的步骤。在一些实施例中，本披露认识到靶向剪接，特别是通过包含具有本披露中所述的碱基序列和/或化学修饰和/或立体化学模式(和/或其模式)的寡核苷酸的组合物，可以有效地纠正疾病相关突变和/或异常剪接、和/或引入和/或增强有益剪接，该有益剪接产生可以修复、恢复或添加新的所希望的生物学功能(例如肌营养不良蛋白的一种或多种功能)的所希望的产物，例如mRNA、蛋白质等。
在一些实施例中，本披露提供了用于改变DMD转录物的剪接的组合物和方法，其中改变的剪接缺失或补偿了一个或多个包含疾病相关突变的外显子。
例如，在一些实施例中，肌营养不良蛋白基因可以包含外显子，该外显子包含与例如肌肉营养不良(包括但不限于杜氏肌肉营养不良(Duchenne(Duchenne’s)musculardystrophy，DMD)和贝克肌肉营养不良(Becker(Becker’s)muscular dystrophy，BMD))的疾病相关的一种或多种突变。在一些实施例中，疾病相关的外显子包含外显子中的突变(例如，错义突变、移码突变、无义突变、提前终止密码子等)。在一些实施例中，本披露提供了用于有效地跳读一个或多个疾病相关的肌营养不良蛋白外显子、和/或不同或相邻的外显子、同时保留或恢复读框使得可以产生较短的(例如，内部截短的)、但是具有部分功能的肌营养不良蛋白的组合物和方法。本领域普通技术人员应理解，提供的技术(寡核苷酸、组合物、方法等)也可以依照本披露用于跳读其他外显子(例如，WO 2017/062862中描述并通过引用并入本文的那些)以治疗疾病和/或病症。
除其他事项外，本披露证明了可以使用化学修饰和/或立体化学来调节由寡核苷酸组合物剪接的转录物。在一些实施例中，本披露提供了化学修饰和立体化学的组合来改善寡核苷酸的特性，例如，它们改变转录物的剪接的能力。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的(chirally controlled)寡核苷酸组合物，当与参考条件(例如，不存在组合物、存在参考组合物(例如，具有相同的构造(如本领域技术人员所理解的，除非另外指明，否则构造通常是指分子实体中原子的同一性和连接性(以及对应的键多重性)的描述，但是省略了由它们的空间排列引起的任何区别)的寡核苷酸的立体随机组合物、不同的手性受控的寡核苷酸组合物等)、及其组合等)相比时，这些手性受控的寡核苷酸组合物提供了改变的剪接，该改变的剪接可以递送一种或多种所希望的生物效应，例如增加所希望的蛋白质的产量、通过产生具有移码突变和/或提前终止密码子的mRNA来敲低基因、敲低表达具有移码突变和/或提前终止密码子的mRNA的基因等。在一些实施例中，与参考条件相比，提供的手性受控的寡核苷酸组合物出人意料地有效。在一些实施例中，所希望的生物效应(例如，如通过所希望的mRNA、蛋白质等的增加的水平，不希望的mRNA、蛋白质等的降低的水平所测量的)可以被增强超过5、10、15、20、25、30、40、50或100倍。
本披露认识到提供低毒性寡核苷酸组合物及其使用方法的挑战。在一些实施例中，本披露提供了具有降低的毒性的寡核苷酸组合物和方法。在一些实施例中，本披露提供了具有减少的免疫应答的寡核苷酸组合物和方法。在一些实施例中，本披露认识到由寡核苷酸诱导的各种毒性与细胞因子和/或补体活化有关。在一些实施例中，本披露提供了具有降低的细胞因子和/或补体活化的寡核苷酸组合物和方法。在一些实施例中，本披露提供了经由可替代途径降低补体活化的寡核苷酸组合物和方法。在一些实施例中，本披露提供了经由传统途径降低补体活化的寡核苷酸组合物和方法。在一些实施例中，本披露提供了具有减少的药物诱导的血管损伤的寡核苷酸组合物和方法。在一些实施例中，本披露提供了具有减少的注射位点炎症的寡核苷酸组合物和方法。在一些实施例中，可以通过本领域普通技术人员广泛已知和实践的一种或多种测定(例如，评估完全活化产物、蛋白质结合等的水平)来评估降低的毒性。
在一些实施例中，本披露提供了具有增强的hTLR9活性拮抗作用的寡核苷酸。在一些实施例中，某些疾病(例如DMD)与例如肌肉组织中的炎症相关。在一些实施例中，提供的技术(例如，寡核苷酸、组合物、方法等)提供了增强的活性(例如，外显子跳读活性)和hTLR9拮抗剂活性两者，这些活性可以对与炎症相关的一种或多种病症和/或疾病有效。在一些实施例中，提供的寡核苷酸和/或其组合物提供了外显子跳读能力以及降低的毒性和/或炎症水平两者。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸，其中该寡核苷酸与另外的在其他方面相同且不包含非负电荷的核苷酸间键联或包含较少非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸相比，对TLR9活性的刺激更弱。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸，其中该寡核苷酸与在其他方面相同的不包含非负电荷的核苷酸间键联或包含较少非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸相比，对TLR9活性的刺激更弱。在一些实施例中，本披露涉及包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间选自：n001、n002、n003、n004、n005、n006、n007、n008、n009、或n010，或n001、n002、n003、n004、n005、n006、n007、n008、n009、或n010的手性受控的立体异构体。在一些实施例中，本披露涉及包含至少两个非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸，其中这些键联彼此不同。在一些实施例中，本披露涉及包含CpG基序的寡核苷酸，其中CpG中的至少一个核苷酸间键联(例如，CpG中的p)或紧靠CpG的上游(朝向寡核苷酸的5′端)或紧靠CpG的下游(朝向寡核苷酸的3′端)的至少一个核苷酸间键联是非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，TLR9是人TLR9。在一些实施例中，TLR9是小鼠TLR9。
在一些实施例中，本披露证明可以通过化学修饰调节寡核苷酸特性(例如活性、毒性等)。在一些实施例中，本披露提供了包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸具有共同的碱基序列且包含一个或多个经修饰的核苷酸间键联(或发现于天然DNA和RNA中的“非天然核苷酸间键联”，这些键联不是天然磷酸酯核苷酸间键联(-OP(O)(OH)O-，在生理pH下可能以盐形式(-OP(O)(O-)O-)存在)但可以用于代替该天然磷酸盐核苷酸间键联)、一个或多个经修饰的糖部分和/或一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸可以包含两个或更多个类型的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，中性核苷酸间键联包含三唑、炔基或胍(例如环状胍)部分。此类部分任选地被取代。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含中性核苷酸间键联和另一个不是中性骨架的核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含中性核苷酸间键联和硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物是手性受控的，并且组合物中该多种寡核苷酸的水平是受控或预定的，并且该多种寡核苷酸在一个或多个手性核苷酸间键联处共享共同的立体化学构型。例如，在一些实施例中，多种中的寡核苷酸在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或更多个手性核苷酸间键联(其各自独立地是Rp或Sp)处共享共同的立体化学构型；在一些实施例中，多种中的寡核苷酸在每个手性核苷酸间键联处共享共同的立体化学构型。在一些实施例中，其中组合物的受控水平的寡核苷酸共享共同的立体化学构型(独立地是Rp或Sp构型)的手性核苷酸间键联称为手性受控的核苷酸间键联。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是非负电荷的(中性或阳离子的)核苷酸间键联，因为在pH(例如，人生理pH(约7.4)、递送位点(例如，细胞器、细胞、组织、器官、生物体等)的pH等)下，其主要(例如，至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％等；在一些实施例中，至少30％；在一些实施例中，至少40％；在一些实施例中，至少50％；在一些实施例中，至少60％；在一些实施例中，至少70％；在一些实施例中，至少80％；在一些实施例中，至少90％；在一些实施例中，至少99％；等；)分别以中性形式或阳离子形式存在(与阴离子形式，例如-O-P(O)(O-)-O-(天然磷酸酯键联的阴离子形式)、-O-P(O)(S-)-O-(硫代磷酸酯键联的阴离子形式)等相比)。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，因为在pH下，其主要以中性形式存在。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是阳离子核苷酸间键联，因为在pH下，其主要以阳离子形式存在。在一些实施例中，pH为人的生理pH(约7.4)。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，因为在水溶液中在pH 7.4下，至少90％的核苷酸间键联以其中性形式存在。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，因为在寡核苷酸的水溶液中，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的核苷酸间键联以其中性形式存在。在一些实施例中，百分比为至少90％。在一些实施例中，百分比为至少95％。在一些实施例中，百分比为至少99％。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联，例如中性核苷酸间键联，当处于其中性形式时不具有pKa小于8、9、10、11.12、13或14的部分。在一些实施例中，本披露中的核苷酸间键联的pKa可通过CH3-核苷酸间键联-CH3(即，用两个-CH3基团替换通过核苷酸间键联连接的两个核苷单元)的pKa来表示。不希望受任何特定理论的束缚，在至少一些情况下，与不包含中性核苷酸间键联的相当的核酸相比，寡核苷酸中的中性核苷酸间键联可以提供改善的特性和/或活性，例如改善的递送、对外切核酸酶和内切核酸酶改善的抗性、改善的细胞摄取、改善的内体逃逸和/或改善的核摄取等。
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有例如式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含三唑或炔基部分。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含胍部分。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含环状胍部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含具有以下结构的环状胍部分：
Figure BPA0000295055720000071
在一些实施例中，包含环状胍部分的中性核苷酸间键联是手性受控的。在一些实施例中，本披露涉及包含寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸包含至少一个中性核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是n001、n002、n003、n004、n005、n006、n007、或n008。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是手性受控的，例如，n001R、n002R、n003R、n004R、n005R、n006R、n007R、n008R、n009R、n001S、n002S、n003S、n004S、n005S、n006S、n007S、n008S、n009S等。
在一些实施例中，本披露涉及包含寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸包含至少一个中性核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中该硫代磷酸酯核苷酸间键联是Sp构型的手性受控的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及包含寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸包含至少一个中性核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中该硫代磷酸酯核苷酸间键联是Rp构型的手性受控的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及包含寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸包含至少一个中性核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联，该中性核苷酸间键联选自包含任选地经取代的三唑基基团的中性核苷酸间键联、包含任选地经取代的炔基基团的中性核苷酸间键联和包含部分
Figure BPA0000295055720000072
的中性核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及包含寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸包含至少一个中性核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联，该中性核苷酸间键联选自包含任选地经取代的三唑基基团的中性核苷酸间键联、包含任选地经取代的炔基基团的中性核苷酸间键联和包含Tmg基团
Figure BPA0000295055720000073
的中性核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是n001。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联和硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性受控的。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联和硫代磷酸酯核苷酸间键联各自独立地是手性受控的。
在一些实施例中，本披露涉及包含寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸包含至少一个中性核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸酯，该中性核苷酸间键联选自包含任选地经取代的三唑基基团的中性核苷酸间键联、包含任选地经取代的炔基基团的中性核苷酸间键联和包含Tmg基团的中性核苷酸间键联，其中该硫代磷酸酯是Sp构型的手性受控的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及包含寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸包含至少一个中性核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸酯，该中性核苷酸间键联选自包含任选地经取代的三唑基基团的中性核苷酸间键联、包含任选地经取代的炔基基团的中性核苷酸间键联和包含Tmg基团的中性核苷酸间键联，其中该硫代磷酸酯是Rp构型的手性受控的核苷酸间键联。
多种类型的核苷酸间键联在特性上不同。不希望受任何理论束缚，本披露指出天然磷酸酯键联(磷酸二酯核苷酸间键联)是阴离子的，并且当在体内以其自身使用而没有其他化学修饰时可以是不稳定的；硫代磷酸酯核苷酸间键联是阳离子的，通常在体内比天然磷酸酯键联更稳定，并且通常更具疏水性；中性核苷酸间键联(如本披露中例示的包含环状胍部分的中性核苷酸间键联)在生理pH下是中性的、在体内可以比天然磷酸酯键联更稳定、并且更具疏水性。
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联、手性受控的非负电荷的核苷酸间键联等)是在生理pH下中性的、手性受控的、在体内稳定、具有疏水性，并可增加内体逃逸。
在一些实施例中，寡核苷酸或寡核苷酸组合物是：DMD寡核苷酸或寡核苷酸组合物；包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸或寡核苷酸组合物；或包含非负电荷的核苷酸间键联的DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸具有(作为非限制性实例)翼-核心-翼、翼-核心、核心-翼、翼-翼-核心-翼-翼、翼-翼-核心-翼、或翼-核心-翼-翼结构(在一些实施例中，翼-翼包含第一翼和第二翼或由其组成，其中该第一翼与该第二翼不同，并且第一翼和第二翼与核心不同)。翼或核心可以由任何结构元件和/或模式和/或其组合定义。在一些实施例中，翼和核心由核苷修饰、糖修饰和/或核苷酸间键联定义，其中翼包含核苷修饰、糖修饰和/或核苷酸间键联和/或模式和/或其组合，而核心区域没有这些(反之亦然)。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含5′-端区域、中间区域和3′-端区域或由其组成。在一些实施例中，5′-端区域是5′-翼区域。在一些实施例中，5′-翼区域是5′-端区域。在一些实施例中，3′-端区域是3′-翼区域。在一些实施例中，3′-翼区域是3′-端区域。在一些实施例中，核心区域是中间区域。
在一些实施例中，每个翼区域(或5′-端区域和3′-端区域中每一个)独立地包含一个或多个经修饰的磷酸酯键联并且不包含天然磷酸酯键联，并且核心区域(中间区域)包含一个或多个经修饰的核苷酸间键联和一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，每个翼区域(或5′-端区域和3′-端区域中每一个)独立地包含一个或多个天然磷酸酯键联和任选地一个或多个经修饰的核苷酸间键联，并且核心(或中间区域)包含一个或多个经修饰的核苷酸间键联和任选地一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，翼(或5′-端区域或3′-端区域)包含经修饰的糖部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
除其他事项外，本披露涵盖了以下认识：立体随机寡核苷酸制剂含有多个不同的化学实体，这些化学实体例如，在寡核苷酸链内的单独的骨架手性中心的立体化学结构上彼此不同。在不控制骨架手性中心的立体化学的情况下，立体随机寡核苷酸制剂提供包含未确定水平的寡核苷酸立体异构体的不受控制的(或立体随机)组合物。即使这些立体异构体可以具有相同的碱基序列和/或化学修饰，但是至少由于其骨架立体化学不同，它们是不同的化学实体，并且它们可以具有如本文所证明的不同特性，例如活性、毒性、分布等。除其他事项外，本披露提供了手性受控的组合物，其是或含有目的寡核苷酸的特定立体异构体；与手性不受控的组合物相比，手性受控的组合物包含受控水平的寡核苷酸的特定的立体异构体。在一些实施例中，特定的立体异构体可以通过以下来定义，例如，通过其碱基序列、其骨架键联模式、其骨架手性中心模式、和骨架磷修饰模式等。如本领域所理解的，在一些实施例中，碱基序列可以仅是指碱基的序列和/或是指寡核苷酸中的核苷残基(例如，相对于标准天然存在的核苷(如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、胸腺嘧啶、和尿嘧啶)的糖和/或碱基组分)的同一性和/或修饰状态和/或是指此类残基的杂交特征(即，与特定的互补性残基杂交的能力)。在一些实施例中，本披露证明了通过在寡核苷酸内包含和/或定位特定的手性结构而实现的特性改善(例如，改善的活性、较低的毒性等)可以与通过以下实现的那些相当或者甚至更好：使用化学修饰(例如，特定的骨架键联、残基修饰等(例如，通过使用某些类型的经修饰的磷酸酯[例如，硫代磷酸酯、经取代的硫代磷酸酯等]、糖修饰[例如，2′-修饰等]、和/或碱基修饰[例如，甲基化等])。在一些实施例中，本披露证明了包含某些化学修饰(例如，2′-F、2′-OMe、硫代磷酸酯核苷酸间键联、脂质缀合等)的寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸组合物证明了出乎意料高的外显子跳读效率。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸是嵌段体。在一些实施例中，嵌段体是包含一个或多个嵌段的寡核苷酸。
在一些实施例中，嵌段是寡核苷酸的一部分。在一些实施例中，嵌段是翼或核心。在一些实施例中，嵌段体包含一个或多个嵌段。在一些实施例中，5′-嵌段是5′-端区域或5′-翼。在一些实施例中，3′-嵌段是3′-端区域或3′-翼。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸是交替体。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是包含交替嵌段的交替体。在一些实施例中，嵌段体或交替体可由例如碱基修饰、糖修饰、核苷酸间键联修饰的化学修饰(包括存在或不存在)、立体化学定义。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含：含有不同核苷酸间键联的嵌段。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含：含有经修饰的核苷酸间键联和/或天然磷酸酯键联的嵌段。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含：含有糖修饰的嵌段。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含：一个或多个含有一个或多个2′-F修饰的嵌段(2′-F嵌段)。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含：含有连续的2′-F修饰的嵌段。在一些实施例中，嵌段包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续的2′-F修饰。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含：一个或多个含有一个或多个2′-OR1修饰的嵌段(2′-OR1嵌段)，其中R1独立地如本文和下文所定义和描述。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含2′-F和2′-OR1嵌段两者。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含交替的2′-F和2′-OR1嵌段。在一些实施例中，提供的寡核苷酸在5′-端包含第一2′-F嵌段并且在3′-端包含第二2′-F嵌段，这些嵌段各自独立地包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续的2′-F修饰。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含5′-嵌段，其中该5′-嵌段的每个糖部分均包含2′-F修饰。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含3′-嵌段，其中该3′-嵌段的每个糖部分均包含2′-F修饰。在一些实施例中，此类提供的寡核苷酸在5′和3′2′-F嵌段之间包含一个或多个2′-OR1嵌段和任选地一个或多个2′-F嵌段。在一些实施例中，此类提供的寡核苷酸在5′和3′2′-F嵌段(例如，WV-3047、WV-3048等)之间包含一个或多个2′-OR1嵌段和一个或多个2′-F嵌段。
在一些实施例中，嵌段是立体化学嵌段。在一些实施例中，嵌段是Rp嵌段，因为该嵌段的每个核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，5′-嵌段是Rp嵌段。在一些实施例中，3′-嵌段是Rp嵌段。在一些实施例中，嵌段是Sp嵌段，因为该嵌段的每个核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，5′-嵌段是Sp嵌段。在一些实施例中，3′-嵌段是Sp嵌段。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含Rp嵌段和Sp嵌段两者。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个Rp嵌段，但不包含Sp嵌段。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个Sp嵌段，但不包含Rp嵌段。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个PO嵌段，其中每个核苷酸间键联在天然磷酸酯键联中。
在一些实施例中，5′-嵌段是Sp嵌段，其中每个糖部分包含2′-F修饰。在一些实施例中，5′-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联，并且每个糖部分包含2′-F修饰。在一些实施例中，5′-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联，并且每个糖部分包含2′-F修饰。在一些实施例中，5′-嵌段包含4个或更多个核苷单元。
在一些实施例中，3′-嵌段是Sp嵌段，其中每个糖部分包含2′-F修饰。在一些实施例中，3′-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联，并且每个糖部分包含2′-F修饰。在一些实施例中，3′-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联，并且每个糖部分包含2′-F修饰。在一些实施例中，3′-嵌段包含4个或更多个核苷单元。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含交替的嵌段，这些交替的嵌段包含不同的经修饰的糖部分和/或未经修饰的糖部分。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含交替的嵌段，这些交替的嵌段包含不同的经修饰的糖部分和未经修饰的糖部分。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含交替的嵌段，这些交替的嵌段包含不同的经修饰的糖部分。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含交替的嵌段，这些交替的嵌段包含不同的经修饰的糖部分，其中这些经修饰的糖部分包含不同的2′-修饰。例如，在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含交替的嵌段，这些交替的嵌段分别包含2′-OMe和2′-F。
在一些实施例中，本披露提供了包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸：
1)具有与转录物中的靶序列互补的共同的碱基序列；并且
2)包含一个或多个经修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间键联。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
在一些实施例中，参考条件是不存在组合物。在一些实施例中，参考条件是存在参考组合物。包含参考多种寡核苷酸的示例参考组合物在本披露中广泛地描述。在一些实施例中，与提供的组合物中的多种寡核苷酸相比，参考多种寡核苷酸具有不同的结构元件(化学修饰、立体化学等)。在一些实施例中，参考组合物是具有相同的化学修饰的寡核苷酸的立体随机制剂。在一些实施例中，参考组合物是立体异构体的混合物，而提供的组合物是一个立体异构体的手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，参考多种寡核苷酸与提供的组合物中的多种寡核苷酸具有相同的碱基序列、相同的糖修饰、相同的碱基修饰、相同的核苷酸间键联修饰、和/或相同的立体化学，但是不同的化学修饰(例如，碱基修饰、糖修饰、核苷酸间键联修饰等)。
示例剪接系统是本领域广泛已知的。在一些实施例中，剪接系统是体内或体外系统，其包括足以实现相关靶转录物的剪接的组分。在一些实施例中，剪接系统是或包含剪接体(例如，蛋白质和/或其RNA组分)。在一些实施例中，剪接系统是或包含细胞器膜(例如，核膜)和/或细胞器(例如，细胞核)。在一些实施例中，剪接系统是或包含细胞或其群体。在一些实施例中，剪接系统是或包含组织。在一些实施例中，剪接系统是或包含生物体，例如，动物，例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、猴子、狗、人等。
在一些实施例中，本披露提供了包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸：
1)具有与转录物中的靶序列互补的共同的碱基序列；并且
2)包含一个或多个经修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间键联，
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，这些参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸组合物，该寡核苷酸组合物包含通过以下定义的特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸组合物，该寡核苷酸组合物包含通过以下定义的特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
该组合物是手性受控的，并且相对于具有相同碱基序列的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该组合物富集特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，这些参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸组合物，该手性受控的寡核苷酸组合物包含特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型的特征在于：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
该组合物是单一寡核苷酸的基本上纯的制剂，因为该组合物中至少约10％的寡核苷酸具有共同的碱基序列和长度、共同的骨架键联模式和共同的骨架手性中心模式。
在一些实施例中，寡核苷酸的每个区域(例如，嵌段、翼、核心、5′-端、3′-端或中间区域等)独立地包含3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个碱基。在一些实施例中，每个区域独立地包含3个或更多个碱基。在一些实施例中，每个区域独立地包含4个或更多个碱基。在一些实施例中，每个区域独立地包含5个或更多个碱基。在一些实施例中，每个区域独立地包含6个或更多个碱基。在一些实施例中，区域中的每个糖部分是经修饰的。在一些实施例中，修饰是2′-修饰。在一些实施例中，每个修饰是2′-修饰。在一些实施例中，修饰是2′-F。在一些实施例中，每个修饰是2′-F。在一些实施例中，修饰是2′-OR1。在一些实施例中，每个修饰是2′-OR1。在一些实施例中，修饰是2′-OR1。在一些实施例中，每个修饰是2′-OMe。在一些实施例中，每个修饰是2′-OMe。在一些实施例中，每个修饰是2′-MOE。在一些实施例中，每个修饰是2′-MOE。在一些实施例中，修饰是LNA糖修饰。在一些实施例中，每个修饰是LNA糖修饰。在一些实施例中，区域中的每个核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，翼或5′-端或3′-端区域中的每个核苷酸间键联是Sp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。在一些实施例中，核心或中间区域包含一个或多个天然磷酸酯键联以及一个或多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，核心或中间区域包含一个或多个天然磷酸酯键联以及一个或多个手性核苷酸间键联。在一些实施例中，核心区域包含一个或多个天然磷酸酯键联以及一个或多个Sp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，核心或中间区域包含一个或多个天然磷酸酯键联以及一个或多个Sp硫代磷酸酯键联。
在一些实施例中，寡核苷酸的区域(例如，嵌段、翼、核心、5′-端、3′-端、中间区域等)包含例如式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等的非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含中性核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含核苷酸间键联，该核苷酸间键联包含三唑或炔基部分。在一些实施例中，区域包含核苷酸间键联，该核苷酸间键联包含环状胍胍。在一些实施例中，区域包含核苷酸间键联，该核苷酸间键联包含环状胍部分。在一些实施例中，区域包含具有结构
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的核苷酸间键联。在一些实施例中，此类核苷酸间键联是手性受控的。
在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列，例如特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸的碱基序列，是或包含本文披露的碱基序列(例如，示例寡核苷酸的碱基序列(例如，在表、实例等中所列的那些)、靶序列等)(或其至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基长的部分)。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有碱基序列，该碱基序列包含任何示例寡核苷酸的碱基序列或本文披露的另一碱基序列，并且长度高达30个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有碱基序列，该碱基序列包含任何示例寡核苷酸的碱基序列或本文披露的另一碱基序列，并且长度高达40个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有碱基序列，该碱基序列包含任何示例寡核苷酸的碱基序列或本文披露的另一碱基序列，并且长度高达50个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有碱基序列，该碱基序列包含寡核苷酸实例的碱基序列或本文披露的另一序列的至少15个连续碱基，并且长度高达30个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有碱基序列，该碱基序列包含寡核苷酸实例的碱基序列或本文披露的另一序列的至少15个连续碱基，并且长度高达40个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有碱基序列，该碱基序列包含寡核苷酸实例的碱基序列或本文披露的另一序列的至少15个连续碱基，并且长度高达50个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有碱基序列，该碱基序列包含与示例寡核苷酸的碱基序列或本文披露的另一序列具有不超过5个错配的序列，并且长度高达30个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有碱基序列，该碱基序列包含与示例寡核苷酸的碱基序列或本文披露的另一序列具有不超过5个错配的序列，并且长度高达40个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有碱基序列，该碱基序列包含与示例寡核苷酸的碱基序列或本文披露的另一序列具有不超过5个错配的序列，并且长度高达50个碱基。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸的碱基序列是示例寡核苷酸的碱基序列或本文披露的另一序列，并且骨架手性中心模式包含至少一个手性受控的中心，该中心是硫代磷酸酯键联的Sp键联磷(linkage phosphorus)。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的碱基序列是示例寡核苷酸的碱基序列或本文披露的另一序列，该寡核苷酸的长度高达30个碱基，并且骨架手性中心模式包含至少一个手性受控的中心，该中心是硫代磷酸酯键联的Sp键联磷。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的碱基序列是示例寡核苷酸的碱基序列或本文披露的另一序列，该寡核苷酸的长度高达40个碱基，并且骨架手性中心模式包含至少一个手性受控的中心，该中心是硫代磷酸酯键联的Sp键联磷。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的碱基序列包含任何示例寡核苷酸或本文披露的另一序列的至少15个连续碱基，该寡核苷酸的长度高达30、40、或50个碱基，并且骨架手性中心模式包含至少一个手性受控的中心，该中心是硫代磷酸酯键联的Sp键联磷。
在一些实施例中，错配是当两个序列被最大程度地比对和比较时在碱基序列或长度之间的差异。作为非限制性实例，如果一个序列中特定位置的碱基与另一序列中相应位置的碱基之间存在差异，则算作错配。因此，例如，如果一个序列中的位置具有特定碱基(例如，A)，而另一序列中的相应位置具有不同的碱基(例如，G、C或U)，则算作错配。例如，如果一个序列中的位置具有碱基(例如，A)，而另一序列中的相应位置没有碱基(例如，该位置是包含磷酸酯-糖骨架但不含碱基的无碱基核苷酸)或该位置被跳读，则也算作错配。在任一序列(或有义链或反义链)中具有单链切口可以不算作错配，例如，如果一个序列包含序列5′-AG-3′，而另一序列包含在A和G之间具有单链切口的5′-AG-3’，不算错配。碱基修饰通常不认为是错配，例如，如果一个序列包含C，而另一序列包含在相同位置的经修饰的C(例如，具有2′-修饰)，可以不算作错配。
在一些实施例中，特定类型的寡核苷酸在化学上是相同的，因为它们具有相同的碱基序列(包括长度)、相同的对糖和碱基部分的化学修饰模式、相同的骨架键联模式(例如，天然磷酸酯键联、硫代磷酸酯键联、硫代磷酸三酯键联、非负电荷键联的模式，及其组合)、相同的骨架手性中心模式(例如，手性核苷酸间键联的立体化学(Rp/Sp)模式)、和相同的骨架磷修饰模式(例如，对核苷酸间磷原子(例如式I的-S-和-L-R1)修饰模式)。
在一些实施例中，本披露提供了包含多个(例如，多于5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联的寡核苷酸并且特别是包含多个(例如，多于5、6、7、8、9或10个)手性核苷酸间键联的寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸组合物，其中这些寡核苷酸包含至少一个(在一些实施例中，多于5、6、7、8、9或10个)手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，在手性受控的寡核苷酸的组合物中，寡核苷酸的每个手性核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，在寡核苷酸的立体随机或外消旋组合物中，形成具有小于90∶10、95∶5、96∶4、97∶3、或98∶2非对映选择性的每个手性核苷酸间键联。在一些实施例中，在寡核苷酸的立体选择性或手性受控的组合物中，寡核苷酸的每个手性受控的核苷酸间键联在其手性键联磷处独立地具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的非对映纯度(diastereopurity)(Rp或Sp)。除其他事项外，本披露提供了制备高非对映纯度的寡核苷酸的技术。在一些实施例中，寡核苷酸中的手性核苷酸间键联的非对映纯度可通过模型反应测量，例如在基本上相同或相当的条件下形成二聚体，其中二聚体与手性核苷酸间键联具有相同的核苷酸间键联、二聚体的5′-核苷与手性核苷酸间键联的5′-端的核苷相同、二聚体的3′-核苷与手性核苷酸间键联的3′-端的核苷相同。
如本文所述，提供的组合物和方法能够改变转录物的剪接。在一些实施例中，提供的组合物和方法提供了与参考条件相比改善的转录物的剪接模式，这些参考条件选自由以下组成的组：不存在组合物、存在参考组合物、及其组合。改善可以是任何所希望的生物学功能的改善。在一些实施例中，例如，在DMD中，改善是产生mRNA，从中产生具有改善的生物活性的肌营养不良蛋白质。
在一些实施例中，本披露提供了用于改变靶转录物的剪接的方法，该方法包括施用提供的组合物，其中靶转录物的剪接与参考条件相比得到改变，这些参考条件选自由以下组成的组：不存在组合物、存在参考组合物、及其组合。
在一些实施例中，本披露提供了从靶转录物产生一组剪接产物的方法，该方法包括以下步骤：
将含有靶转录物的剪接系统与包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物(例如，提供的手性受控的寡核苷酸组合物)以一定量并且在足以产生一组剪接产物的条件下接触一定时间，该组剪接产物不同于在参考条件下产生的一组产物，这些参考条件选自由以下组成的组：不存在组合物、存在参考组合物、及其组合。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗或预防疾病的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗或预防疾病的方法，该方法包括向受试者施用包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物，该多种寡核苷酸：
1)具有与转录物中的靶序列互补的共同的碱基序列；以及
2)包含一个或多个经修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间键联，
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，这些参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗或预防疾病的方法，该方法包括向受试者施用手性受控的寡核苷酸组合物，该手性受控的寡核苷酸组合物包含通过以下定义的特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
该组合物是手性受控的，并且相对于具有相同碱基序列的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该组合物富集特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，其中：
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，这些参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
在一些实施例中，疾病是在施用提供的组合物后，一个或多个剪接转录物修复、恢复或引入新的有益功能的疾病。例如，在DMD中，跳读一个或多个外显子后，肌营养不良蛋白的功能可以通过截短的但(至少部分)具有活性的版本恢复或部分恢复。在一些实施例中，疾病是在施用提供的组合物后，一个或多个剪接转录物修复、基因通过改变基因转录物的剪接而有效地敲低的疾病。
在一些实施例中，疾病是肌肉营养不良，包括但不限于杜氏肌肉营养不良(DMD)和贝克肌肉营养不良(BMD)。
在一些实施例中，转录物是肌营养不良蛋白基因或其变体。
在一些实施例中，本披露提供了通过施用组合物治疗疾病的方法，该组合物包含共享共同的碱基序列的多种寡核苷酸，该碱基序列包含核苷酸序列，该核苷酸序列与靶转录物中的靶序列互补，
改善包括使用手性受控的寡核苷酸组合物作为寡核苷酸组合物，该手性受控的寡核苷酸组合物的特征在于，当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，这些参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
在一些实施例中，共同序列包含表A1中任何寡核苷酸的序列(或其至少15个碱基长的部分)。
在一些实施例中，本披露提供了施用包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物的方法，这些寡核苷酸具有共同的核苷酸序列，改善包含：
施用包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸各自独立地包含一个或多个负电荷的核苷酸间键联和一个或多个非负电荷的核苷酸间键联，其中该寡核苷酸组合物是任选地手性受控的。
在一些实施例中，本披露提供了施用包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物的方法，这些寡核苷酸具有共同的核苷酸序列，改善包含：
施用包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物，该寡核苷酸组合物是手性受控的并且特征在于相对于相同的共同核苷酸序列的参考寡核苷酸组合物而言毒性降低。
在一些实施例中，本披露提供了施用包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物的方法，这些寡核苷酸具有共同的核苷酸序列，改善包含：
施用寡核苷酸组合物，其中该多种中的每个寡核苷酸包括一个或多个天然磷酸酯键联和一个或多个经修饰的磷酸酯键联；
其中该寡核苷酸组合物的特征在于：当在至少一种测定中进行测试时，观察到相对其中寡核苷酸不含天然磷酸酯键联的其他相当的参考组合物而言毒性降低。
在一些实施例中，寡核苷酸可引起促炎反应。在一些实施例中，本披露提供了用于减少炎症的组合物和方法。在一些实施例中，本披露提供了用于降低促炎反应的组合物和方法。在一些实施例中，本披露提供了用于使用提供的组合物减少注射位点炎症的方法。在一些实施例中，本披露提供了用于使用提供的组合物减少药物诱导的血管损伤的方法。
在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括施用包含共同的碱基序列的多种寡核苷酸的组合物，该组合物与参考组合物相比显示出减少的注射部位炎症，该参考组合物包含多种寡核苷酸，该参考组合物的这些寡核苷酸也各自具有该组合物的共同的碱基序列，但在结构上与该组合物的多种寡核苷酸的不同之处在于：
参考多种内单独的寡核苷酸在立体化学结构上彼此不同；和/或
参考多种内至少一些寡核苷酸具有与该组合物的多种寡核苷酸表示的结构不同的结构；和/或
参考多种内至少一些寡核苷酸不包含翼区域和核心区域。
在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括施用包含共同的碱基序列的多种寡核苷酸的组合物，该组合物与参考组合物相比显示出改变的蛋白质结合，该参考组合物包含多种寡核苷酸，该参考组合物的这些寡核苷酸也各自具有该组合物的共同的碱基序列，但在结构上与该组合物的多种寡核苷酸的不同之处在于：
参考多种内单独的寡核苷酸在立体化学结构上彼此不同；和/或
参考多种内至少一些寡核苷酸具有与该组合物的多种寡核苷酸表示的结构不同的结构；和/或
参考多种内至少一些寡核苷酸不包含翼区域和核心区域。
在一些实施例中，本披露提供了施用包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物的方法，这些寡核苷酸具有共同的核苷酸序列，改善包含：
施用包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物，该寡核苷酸组合物的特征在于相对于相同的共同核苷酸序列的参考寡核苷酸组合物而言改变的蛋白质结合。
在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括施用包含共同的碱基序列的多种寡核苷酸的组合物，该组合物与参考组合物相比显示出改善的递送，该参考组合物包含参考多种寡核苷酸，该参考组合物的这些寡核苷酸也各自具有该组合物的共同的碱基序列，但在结构上与该组合物的多种寡核苷酸的不同之处在于：
参考多种内单独的寡核苷酸在立体化学结构上彼此不同；和/或
参考多种内至少一些寡核苷酸具有与该组合物的多种寡核苷酸表示的结构不同的结构；和/或
参考多种内至少一些寡核苷酸不包含翼区域和核心区域。
在一些实施例中，本披露提供了施用包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物的方法，这些寡核苷酸具有共同的核苷酸序列，改善包含：
施用包含多种寡核苷酸的寡核苷酸，其特征在于递送相对于相同的共同核苷酸序列的参考寡核苷酸组合物而言改善。
在一些实施例中，本披露提供了包含本文披露的任何寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，本披露提供了包含本文披露的任何手性受控的寡核苷酸的组合物。
在一些实施例中，本披露提供了包含本文披露的寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸能够介导肌营养不良蛋白外显子45的跳读。在一些实施例中，本披露提供了包含本文披露的寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸能够介导肌营养不良蛋白外显子51的跳读。在一些实施例中，本披露提供了包含本文披露的寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸能够介导肌营养不良蛋白外显子53的跳读。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个本文披露的寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸能够介导多个肌营养不良蛋白外显子的跳读。在一些实施例中，这种组合物是手性受控的寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，本披露涉及能够介导一个或多个DMD外显子的跳读的寡核苷酸或寡核苷酸组合物。在一些实施例中，DMD外显子是外显子51。在一些实施例中，DMD外显子是外显子53。在一些实施例中，DMD外显子是外显子45。在一些实施例中，本披露涉及能够介导DMD外显子53的跳读的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含至少一个手性受控的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导DMD外显子45的跳读。在一些实施例中，本披露涉及能够介导DMD外显子45的跳读的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含至少一个手性受控的核苷酸间键联并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导DMD外显子45的跳读并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及能够介导DMD外显子45的跳读的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导DMD外显子45的跳读并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导DMD外显子51的跳读。在一些实施例中，本披露涉及能够介导DMD外显子51的跳读的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含至少一个手性受控的核苷酸间键联并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导DMD外显子51的跳读并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及能够介导DMD外显子51的跳读的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导DMD外显子51的跳读并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导DMD外显子53的跳读。在一些实施例中，本披露涉及能够介导DMD外显子53的跳读的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含至少一个手性受控的核苷酸间键联并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导DMD外显子53的跳读并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及能够介导DMD外显子53的跳读的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导DMD外显子53的跳读并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导多个DMD外显子的跳读。在一些实施例中，本披露涉及能够介导多个DMD外显子的跳读的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含至少一个手性受控的核苷酸间键联并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导多个DMD外显子的跳读并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及能够介导DMD外显子的跳读的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导DMD外显子的跳读并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导多个DMD外显子的跳读。在一些实施例中，本披露涉及能够介导多个DMD外显子的跳读的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含至少一个手性受控的核苷酸间键联并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导多个DMD外显子的跳读并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，DMD外显子是本文披露的任何DMD外显子，包括但不限于外显子45、外显子51、外显子52、外显子53、外显子55、外显子56和外显子57。
在一些实施例中，本披露涉及能够介导多个DMD外显子的跳读的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸能够介导多个DMD外显子的跳读并且包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露提供了能够介导肌营养不良蛋白外显子51的跳读的寡核苷酸的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了能够介导肌营养不良蛋白外显子51的跳读的且本文披露的寡核苷酸的手性受控的组合物。
在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列是、包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU，或包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU的碱基序列的具有15个碱基的部分，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列是UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU的碱基序列的具有15个碱基的部分，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列是以下、包含以下、或包含以下中任一个的具有15个碱基的部分：UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU、UCAAGGAAGAUGGCAUUUC、UCAAGGAAGAUGGCAUUU、UCAAGGAAGAUGGCAUU、UCAAGGAAGAUGGCAU、UCAAGGAAGAUGGCA、CAAGGAAGAUGGCAUUUCU、AAGGAAGAUGGCAUUUCU、AGGAAGAUGGCAUUUCU、GGAAGAUGGCAUUUCU、GAAGAUGGCAUUUCU、CAAGGAAGAUGGCAUUUC、CAAGGAAGAUGGCAUUU、AAGGAAGAUGGCAUUUC、AAGGAAGAUGGCAUUU、AGGAAGAUGGCAUUU、或AAGGAAGAUGGCAUU，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。
在一些实施例中，本披露提供了能够介导肌营养不良蛋白外显子53的跳读的寡核苷酸的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了能够介导肌营养不良蛋白外显子53的跳读的且本文披露的寡核苷酸的手性受控的组合物。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9517的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9519的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9521的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9524的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9714的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9715的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9747的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9748的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9749的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9897的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9898的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9899的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9900的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9906的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-9912的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-10670的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-10671的手性受控的组合物。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸WV-10672的手性受控的组合物。
在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列是、包含CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC，或包含其碱基序列的具有15个碱基的部分，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列是CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列包含CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列是、包含CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC，或包含其的具有15个碱基的部分，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列是或包含CUCCGGUUCUGAAGGUGUUCC、UCCGGUUCUGAAGGUGUUC、UCCGGUUCUGAAGGUGUUC、CCGGUUCUGAAGGUGUUC、CGGUUCUGAAGGUGUUC、GGUUCUGAAGGUGUUC、GUUCUGAAGGUGUUC、CUCCGGUUCUGAAGGUGUU、CUCCGGUUCUGAAGGUGU、CUCCGGUUCUGAAGGUG、CUCCGGUUCUGAAGGU、CUCCGGUUCUGAAGG、UCCGGUUCUGAAGGUGUU、CCGGUUCUGAAGGUGUU、UCCGGUUCUGAAGGUGU、CCGGUUCUGAAGGUGU、UCCGGUUCUGAAGGUG、CGGUUCUGAAGGUGU、UCCGGUUCUGAAGGU、CCGGUUCUGAAGGUG、CGGUUCUGAAGGUGUU、UCCGGUUCUGAAGGUGUUC、UCCGGUUCUGAAGGUG、UCCGGUUCUGAAGGU、CGGUUCUGAAGGUGUU、GGUUCUGAAGGUGUU、或GGUUCUGAAGGUGUU，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列是、包含UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC，或包含其碱基序列的具有15个碱基的部分，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列是UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列包含UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列包含UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC的碱基序列的具有15个碱基的部分，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。在一些实施例中，本披露提供了具有碱基序列的寡核苷酸的组合物，该碱基序列是或包含UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC、UCUGAAGGUGUUCUUGUAC、CUGAAGGUGUUCUUGUAC、UGAAGGUGUUCUUGUAC、GAAGGUGUUCUUGUAC、AAGGUGUUCUUGUAC、UUCUGAAGGUGUUCUUGUA、UUCUGAAGGUGUUCUUGU、UUCUGAAGGUGUUCUUG、UUCUGAAGGUGUUCUU、UUCUGAAGGUGUUCU、UCUGAAGGUGUUCUUGUA、UCUGAAGGUGUUCUUGU、UCUGAAGGUGUUCUUG、UCUGAAGGUGUUCUU、CUGAAGGUGUUCUUGUA、CUGAAGGUGUUCUUGU、CUGAAGGUGUUCUUG、UGAAGGUGUUCUUGU、或UGAAGGUGUUCUUGUA，其中每个U可以任选地并且独立地被T替换，并且其中该组合物是任选地手性受控的。
在一些实施例中，本披露提供了选自任何表的寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了选自任何表的寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸缀合至脂质或靶向部分。
在一些实施例中，寡核苷酸是至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个碱基长，并且任选地不超过25、30、35、40、45、50、55或60个碱基长。在一些实施例中，寡核苷酸不超过25个碱基长。在一些实施例中，寡核苷酸不超过30个碱基长。在一些实施例中，寡核苷酸不超过35个碱基长。在一些实施例中，寡核苷酸不超过40个碱基长。在一些实施例中，寡核苷酸不超过45个碱基长。在一些实施例中，寡核苷酸不超过50个碱基长。在一些实施例中，寡核苷酸不超过55个碱基长。在一些实施例中，寡核苷酸不超过60个碱基长。在一些实施例中，每个碱基独立地是任选地经取代的A、T、C、G或U，或A、T、C、G或U的任选地经取代的互变异构体。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸除其寡核苷酸链(寡核苷酸骨架和碱基)外还包含另外的化学部分，例如脂质部分、靶向部分等。在一些实施例中，脂质是脂肪酸。在一些实施例中，寡核苷酸与脂肪酸缀合。在一些实施例中，脂肪酸包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个碳原子。
在一些实施例中，脂质是硬脂酸或喇叭藻酸(turbinaric acid)。在一些实施例中，脂质是硬脂酸。在一些实施例中，脂质是喇叭藻酸。
在一些实施例中，脂质包含任选地经取代的C10-C80、C10-C60或C10-C40饱和或部分不饱和的脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、C1-C6杂脂肪族部分、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、和-C(O)O-，其中每个变量独立地如本文所定义和描述。
在一些实施例中，脂质选自由以下组成的组：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(DHA或顺-DHA)、喇叭藻酸和二亚油基。
在一些实施例中，脂质任选地通过一个或多个接头部分与寡核苷酸链缀合。在一些实施例中，脂质不与寡核苷酸链缀合。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸任选地通过接头缀合至化学部分，例如脂质部分、肽部分、靶向部分、碳水化合物部分、磺酰胺部分、抗体或其片段。在一些实施例中，提供的化合物，例如寡核苷酸，具有以下结构：
Ac-[-LLD-(RLD)a]b、Ac-[-LM-(RD)a]b、[(Ac)a-LM]b-RD、(Ac)a-LM-(Ac)b、或(Ac)a-LM-(RD)b，
或其盐，其中：
Ac是寡核苷酸链(例如，H-Ac、[H]a-Ac或[H]b-Ac是寡核苷酸)；
a是1-1000；
b是1-1000；
LLD和LM各自独立地是接头部分；
RLD是脂质部分；以及
每个RD独立地是脂质部分或靶向部分。
在一些实施例中，提供的化合物，例如寡核苷酸，具有以下结构：
Ac-[-LLD-(RLD)a]b、Ac-[-LM-(RD)a]b、[(Ac)a-LM]b-RD、(Ac)a-LM-(Ac)b、或(Ac)a-LM-(RD)b，
或其盐，其中：
Ac是寡核苷酸链(例如，H-Ac、[H]a-Ac或[H]b-Ac是寡核苷酸)；
a是1-1000；
b是1-1000；
每个RD独立地是RLD、RCD或RTD；
RCD是任选地经取代的直链或支链基团，该基团选自C1-100脂肪族基团和具有1-30个杂原子的C1-100杂脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-；并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换；
RLD是任选地经取代的直链或支链C1-100脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-；并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换；
RTD是靶向部分；
LLD和LM各自独立地是共价键、或任选地经取代的直链或支链二价或多价基团，该基团选自C1-100脂肪族基团和具有1-30个杂原子的C1-100杂脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-；并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个R’独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；以及
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居于它们之间的该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
在一些实施例中，本披露提供了包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸各自具有以下结构：
Ac-[-LLD-(RLD)a]b、Ac-[-LM-(RD)a]b、[(Ac)a-LM]b-RD、(Ac)a-LM-(Ac)b、或(Ac)a-LM-(RD)b，
或其盐。
在一些实施例中，[H]b-Ac(其中b是1-1000)是表中任一个的寡核苷酸。在一些实施例中，[H]b-Ac是表A1的寡核苷酸。
在一些实施例中，a是1-100。在一些实施例中，a是1-50。在一些实施例中，a是1-40。在一些实施例中，a是1-30。在一些实施例中，a是1-20。在一些实施例中，a是1-15。在一些实施例中，a是1-10。在一些实施例中，a是1-9。在一些实施例中，a是1-8。在一些实施例中，a是1-7。在一些实施例中，a是1-6。在一些实施例中，a是1-5。在一些实施例中，a是1-4。在一些实施例中，a是1-3。在一些实施例中，a是1-2。在一些实施例中，a是1。在一些实施例中，a是2。在一些实施例中，a是3。在一些实施例中，a是4。在一些实施例中，a是5。在一些实施例中，a是6。在一些实施例中，a是7。在一些实施例中，a是8。在一些实施例中，a是9。在一些实施例中，a是10。在一些实施例中，a大于10。在一些实施例中，b是1-100。在一些实施例中，b是1-50。在一些实施例中，b是1-40。在一些实施例中，b是1-30。在一些实施例中，b是1-20。在一些实施例中，b是1-15。在一些实施例中，b是1-10。在一些实施例中，b是1-9。在一些实施例中，b是1-8。在一些实施例中，b是1-7。在一些实施例中，b是1-6。在一些实施例中，b是1-5。在一些实施例中，b是1-4。在一些实施例中，b是1-3。在一些实施例中，b是1-2。在一些实施例中，b是1。在一些实施例中，b是2。在一些实施例中，b是3。在一些实施例中，b是4。在一些实施例中，b是5。在一些实施例中，b是6。在一些实施例中，b是7。在一些实施例中，b是8。在一些实施例中，b是9。在一些实施例中，b是10。在一些实施例中，b大于10。在一些实施例中，寡核苷酸具有Ac-LLD-RLD的结构。在一些实施例中，Ac通过其糖、碱基和/或核苷酸间键联部分中的一个或多个缀合。在一些实施例中，Ac通过其5′-OH(5′-O-)缀合。在一些实施例中，Ac通过其3′-OH(3′-O-)缀合。在一些实施例中，在缀合之前，Ac-(H)b(b是1-1000的整数，取决于Ac的化合价)是如本文所述的寡核苷酸，例如，任一表中描述的那些中的一个。在一些实施例中，LM是-L-。在一些实施例中，LM包含硫代磷酸酯基团。在一些实施例中，LM是-C(O)NH-(CH2)6-OP(＝O)(S-)-O-。在一些实施例中，-C(O)NH端连接至RLD，并且-O-端连接至寡核苷酸，例如通过5′-端或3′-端。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、或C25至C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C35、C40、C45、C50、C60、C70、或C80脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-80脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-80脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-70脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-70脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-60脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-60脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-50脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-50脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-40脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-40脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-30脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-30脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24或C25至C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C35、C40、C45、C50、C60、C70或C80脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-80脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-80脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-70脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-70脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-60脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-60脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-50脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-50脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-40脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-40脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-30脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-30脂肪族。
在一些实施例中，与在其他方面相同的不含脂质部分的寡核苷酸相比，将脂质部分掺入寡核苷酸中改善了寡核苷酸的至少一种特性。在一些实施例中，改善的特性包括增加的活性(例如，增加诱导有害外显子的所希望跳读的能力)、降低的毒性和/或改善的向组织的分布。在一些实施例中，组织是肌肉组织。在一些实施例中，组织是骨骼肌、腓肠肌、三头肌、心脏或膈肌。在一些实施例中，改善的特性包括降低的hTLR9激动剂活性。在一些实施例中，改善的特性包括hTLR9拮抗剂活性。在一些实施例中，改善的特性包括增加的hTLR9拮抗剂活性。
在一些实施例中，寡核苷酸或寡核苷酸组合物是：DMD寡核苷酸或寡核苷酸组合物；包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸或寡核苷酸组合物；或包含非负电荷的核苷酸间键联的DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露涉及包含DMD寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸包含至少一个Rp或Sp构型的手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联、至少一个天然磷酸酯核苷酸间键联、和至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及包含DMD寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联、至少一个天然磷酸酯核苷酸间键联、和至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及包含DMD寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联、至少一个天然磷酸酯核苷酸间键联、和至少一个手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露涉及包含DMD寡核苷酸的组合物，该寡核苷酸包含至少一个Rp或Sp构型的手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联、至少一个天然磷酸酯核苷酸间键联、和至少一个手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸(例如，当与具有相同长度的DMD转录物或DMD遗传序列的一部分杂交时，其碱基序列含有不超过5、4、3、2或1个错配的寡核苷酸)能够介导肌营养不良蛋白转录物的一个或多个外显子的跳读。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸具有由本文披露的示例寡核苷酸(例如，表中列出的寡核苷酸)的碱基序列组成的碱基序列、或包含本文披露的示例寡核苷酸核苷酸的具有15个碱基的部分的碱基序列。在一些实施例中，DMD寡核苷酸具有15至50个碱基的长度。
在一些实施例中，寡核苷酸包含核碱基修饰、糖修饰和/或核苷酸间键联。在一些实施例中，DMD寡核苷酸具有本文所述的示例寡核苷酸(或其具有至少5个碱基长度的任何部分)的核碱基修饰、糖修饰和/或核苷酸间键联模式。
在一些实施例中，寡核苷酸包含核碱基修饰，该核碱基修饰是BrU。
在一些实施例中，寡核苷酸包含糖修饰，该糖修饰是2′-OMe、2′-F、2′-MOE或LNA。
在一些实施例中，寡核苷酸包含核苷酸间键联，该核苷酸间键联是天然磷酸酯键联或硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，硫代磷酸酯核苷酸间键联不是手性受控的。在一些实施例中，硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联(例如，Sp或Rp)。
在一些实施例中，寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，DMD寡核苷酸包含中性核苷酸间键联。在一些实施例中，中性核苷酸间键联是或包含三唑、炔基或环状胍部分。
在一些实施例中，在提供的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)中包含三唑部分(例如任选地经取代的三唑基基团)的核苷酸间键联具有以下结构：
Figure BPA0000295055720000341
在一些实施例中，包含三唑部分的核苷酸间键联具有下式：
Figure BPA0000295055720000342
其中W是O或S。在一些实施例中，包含炔基部分(例如任选地经取代的炔基基团)的核苷酸间键联具有下式：
Figure BPA0000295055720000343
其中W是O或S。在一些实施例中，核苷酸间键联包含胍部分。在一些实施例中，核苷酸间键联包含环状胍部分。在一些实施例中，核苷酸间键联包含具有以下结构的环状胍部分：
Figure BPA0000295055720000344
在一些实施例中，中性核苷酸间键联或包含环状胍部分的核苷酸间键联是立体化学受控的。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸包含脂质部分。在一些实施例中，核苷酸间键联包含Tmg基团
Figure BPA0000295055720000345
在一些实施例中，核苷酸间键联包含Tmg基团并具有
Figure BPA0000295055720000346
的结构(“Tmg核苷酸间键联”)。在一些实施例中，中性核苷酸间键联包括PNA和PMO的核苷酸间键联以及Tmg核苷酸间键联。
通常，如本文所述的寡核苷酸组合物的特性可使用任何适当测定评估。对于不同的组合物(例如，立体控制的与非立体控制的、和/或不同的立体控制的组合物)的相对毒性和/或蛋白质结合特性通常理想地在相同的测定中确定，在一些实施例中基本上同时，并且在一些实施例中参考历史结果。
本领域内普通技术人员将清楚和/或将能够容易地开发出用于特定寡核苷酸组合物的适当测定。本披露提供了某些特定测定的描述，例如可用于评估寡核苷酸组合物行为的一个或多个特征，例如补体活化、注射位点炎症、蛋白质结合等。
例如，可用于评估寡核苷酸组合物的毒性和/或蛋白质结合特性的某些测定可以包括本文描述和/或示例的任何测定。
除其他事项外，在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸组合物，该寡核苷酸组合物包含通过以下定义的特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个手性受控的核苷酸间键联；以及
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
在一些实施例中，本披露提供了组合物，该组合物包含通过以下定义的特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
该组合物是手性受控的，并且相对于具有相同的碱基序列、骨架键联模式、和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该组合物富集特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，其中：
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，该转录物的剪接发生改变，因为相对于在参考条件下所观察到的，外显子的跳读水平增加，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
在一些实施例中，本披露提供了组合物，该组合物包含通过以下定义的特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；以及
3)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个非负电荷的核苷酸间键联；
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，该转录物的剪接发生改变，因为相对于在参考条件下所观察到的，外显子的跳读水平增加，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
在一些实施例中，本披露提供了组合物，该组合物包含通过以下定义的特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；以及
3)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含：
1)5′-端区域，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的核苷单元；
2)3′-端区域，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的核苷单元；以及
3)在5′-端区域和3′-端区域之间的中间区域，该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含磷酸二酯键联的核苷酸单元。
在一些实施例中，本披露提供了组合物，该组合物包含通过以下定义的特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个手性受控的核苷酸间键联；以及
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露提供了组合物，该组合物包含通过以下定义的特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含胆固醇；左旋肉碱(酰胺和氨基甲酸酯键)；叶酸；可切割脂质(1，2-甘油二月桂酸酯和酯键)；胰岛素受体配体；藤黄酸；CPP；葡萄糖(三触角和六触角)或甘露糖(三触角和六触角，α和β)。
在一些实施例中，本披露提供了药物组合物，该药物组合物包含本披露的寡核苷酸或寡核苷酸组合物、和药学上可接受的载体。
在一些实施例中，本披露提供了用于改变靶转录物的剪接的方法，该方法包括施用本披露的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了用于降低转录物或其产物的水平的方法，该方法包括施用本披露的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了用于增加转录物或其产物的水平的方法，该方法包括施用本披露的寡核苷酸组合物。一种用于治疗肌肉营养不良、杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的方法，该方法包括向易患该疾病或患有该疾病的受试者施用本披露中所述的组合物。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗肌肉营养不良、杜氏肌肉营养不良(DMD)、或贝克肌肉营养不良(BMD)的方法，该方法包括向易患该疾病或患有该疾病的受试者施用包含本文披露的任何DMD寡核苷酸的组合物。
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗肌肉营养不良、杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的方法，该方法包括(a)向易患该疾病或患有该疾病的受试者施用包含本文披露的任何寡核苷酸的组合物，和(b)向该受试者施用另外的治疗，该另外的治疗能够预防、治疗、减轻或减缓肌肉营养不良、杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的进展。
附图说明
图1.图1示出了多个外显子跳读的实例。
图2.图2示出了用于检测多个外显子跳读的方法的图像。
图3.图3示出了多个外显子跳读的各种策略。
定义
如本文所用，除非另外指明，应用下列定义。出于此披露的目的，化学元素根据以下来鉴别：Periodic Table of the Elements[元素周期表]，CAS版本，Handbook ofChemistry and Physics[化学与物理手册]，第75版。另外，有机化学的一般原理描述于：“Organic Chemistry[有机化学]”，Thomas Sorrell，University Science Books[大学科学书籍]，索萨利托：1999及“March′s Advanced Organic Chemistry[马奇高级有机化学]”，第5版，编辑：Smith，M.B.和March，J.，John Wiley & Sons[约翰威利父子公司]，纽约：2001。
脂肪族：如本文所用，术语“脂肪族”或“脂肪族基团”意指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元的直链(即非支链)或支链的经取代或未经取代的烃链，或完全饱和或含有一个或多个不饱和单元(但非芳族)的单环烃、或双环或多环烃(本文也称为“碳环”、“环脂肪族”或“环烷基”)，或其组合。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-100个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-20个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-10个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-9个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-8个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-7个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-6个脂肪族碳原子。在还其他实施例中，脂肪族基团含有1-5个脂肪族碳原子，且在又其他实施例中，脂肪族基团含有1、2、3或4个脂肪族碳原子。在一些实施例中，“环脂肪族”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元但非芳族的单环或双环或多环烃。在一些实施例中，“环脂肪族”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元但非芳族的单环C3-C6烃。合适的脂肪族基团包括但不限于直链或支链的经取代或未经取代的烷基、烯基、炔基基团及其杂合物，如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
烯基：如本文所用，术语“烯基”是指如本文所定义的具有一个或多个双键的脂肪族基团。
烷基：如本文所用，术语“烷基”以本技术领域中的其一般含义给出，且可包括饱和脂肪族基团，包括直链烷基基团、支链烷基基团、环烷基(脂环族)基团、经烷基取代的环烷基基团及经环烷基取代的烷基基团。在一些实施例中，烷基具有1-100个碳原子。在某些实施例中，直链或支链烷基的骨架中具有约1至20个碳原子(例如，直链是C1-C20，支链是C2-C20)，且可替代地具有约1至10个碳原子。在一些实施例中，环烷基环在这类环为单环、双环或多环时在其环结构中具有约3-10个碳原子，且可替代地在环结构中具有约5、6或7个碳原子。在一些实施例中，烷基基团可以是低级烷基基团，其中低级烷基基团包含1至4个碳原子(例如，直链低级烷基是C1-C4)。
炔基：如本文所用，术语“炔基”是指如本文所定义的具有一个或多个三键的脂肪族基团。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施例中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可是转基因动物、经基因工程改造的动物和/或克隆。
大约：如本文所用，关于数字的术语“大约”或“约”通常用于包括在任一方向上(大于或小于)落入所述数字的5％、10％、15％、或20％范围内的数字，除非另有指明或另外从上下文明显可见(除了会小于可能值的0％或者超过可能值的100％的这种数字)。在一些实施例中，关于剂量使用的术语“约”意指±5mg/kg/天。
芳基：如本文所用，单独使用或作为较大部分如“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”的一部分使用的术语“芳基”是指总共具有例如五个至三十个环成员的单环、双环或多环系统，其中系统中的至少一个环是芳族。在一些实施例中，芳基基团为总共具有五个至十四个环成员的单环、双环或多环体系，其中体系中的至少一个环是芳族的，并且其中体系中的各环含有3至7个环成员。在一些实施例中，芳基为联芳基基团。术语“芳基”与术语“芳基环”可互换使用。在本披露的某些实施例中，“芳基”是指包括但不限于苯基、联苯基、萘基、联萘基、蒽基等的芳环体系，其可具有一个或多个取代基。如本文所用，还包括在术语“芳基”的范围内的是与一个或多个非芳环稠合的芳环，如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘啶基、啡啶基或四氢萘基等。
特征序列：“特征序列”是在多肽或核酸家族的所有成员中发现的序列，因此，本领域普通技术人员可以使用其来定义该家族的成员。
相当的：术语“相当的”在本文中用于描述两组(或更多组)彼此充分相似的条件或环境，以允许比较所获得的结果或观察到的现象。在一些实施例中，相当的条件或环境的组的特征在于多个基本相同的特征和一个或少数变化的特征。本领域普通技术人员将理解，当由足够数量和类型的基本相同的特征表征时，条件的组彼此是相当的，以保证合理的结论，即在不同组的条件或环境下获得的结果或观察到的现象的差异是由那些变化的特征的变化引起或指示的。
环脂肪族：术语“环脂肪族(cycloaliphatic)”、“碳环(carbocycle)”、“碳环基(carbocyclyl)”、“碳环基团(carbocyclic radical)”和“碳环(carbocyclic ring)”可互换使用，且如本文所用，是指具有3至30个环成员的如本文所述的饱和或部分不饱和但非芳族的环脂肪族单环、双环或多环系统，除非另有说明。环脂肪族基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、环辛基、环辛烯基、降莰基、金刚烷基和环辛二烯基。在一些实施例中，环脂肪族基团具有3-6个碳原子。在一些实施例中，环脂肪族基团为饱和的且为环烷基。术语“环脂肪族”还可包括与一个或多个芳族或非芳族环稠合的脂肪族环，如十氢萘基或1，2，3，4-四氢萘-1-基。在一些实施例中，环脂肪族基团为双环。在一些实施例中，环脂肪族基团为三环。在一些实施例中，环脂肪族基团为多环。在一些实施例中，“环脂肪族”是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元但非芳族的C3-C6单环烃或C8-C10双环或多环烃，或完全饱和或含有一个或多个不饱和单元但非芳族的C9-C16多环烃。
给药方案：如本文所用，“给药方案”或“治疗方案”是指单独地向受试者施用且通常相隔一定时间段施用的一组单位剂量(通常超过一个)。在一些实施例中，给定治疗剂具有推荐的给药方案，其可涉及一个或多个剂量。在一些实施例中，给药方案包括多个剂量，每个剂量彼此分开相同长度的时间段；在一些实施例中，给药方案包含多个剂量及至少两个用于隔开单独剂量的不同时间段。在一些实施例中，给药方案内的所有剂量具有相同的单位剂量的量。在一些实施例中，给药方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施例中，给药方案包含以第一剂量的量的第一剂量，然后是以不同于第一剂量的量的第二剂量的量的一个或多个另外的剂量。在一些实施例中，给药方案包含以第一剂量的量的第一剂量，然后是以与第一剂量的量相同的第二剂量的量的一个或多个另外的剂量。
杂脂肪族：术语“杂脂肪族”是指其中选自C、CH、CH2和CH3的一个或多个单元独立地被一个或多个杂原子替换的脂肪族基团。在一些实施例中，杂脂肪族基团为杂烷基。在一些实施例中，杂脂肪族基团为杂烯基。
杂芳基：如本文所用，单独使用或作为较大部分例如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”的一部分使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”是指总共具有例如五个至三十个环成员的单环、双环或多环系统，其中系统中的至少一个环是芳族且至少一个芳环原子为杂原子。在一些实施例中，杂芳基基团是具有5至10个环原子的基团(即，单环、双环或多环)，在一些实施例中具有5、6、9或10个环原子。在一些实施例中，杂芳基基团具有在环状阵列中共享的6、10或14个π电子；并且除碳原子外，还具有一至五个杂原子。杂芳基基团包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。在一些实施例中，杂芳基为杂联芳基基团，如联吡啶基等。如本文所用，术语“杂芳基”和“杂芳-”还包括其中杂芳环与一个或多个芳基环、环脂肪族环或杂环基环稠合的基团，其中附接基团或附接点在杂芳环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、以及吡啶并[2，3-b]-1，4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基基团可以是单环的、双环的或多环的。术语“杂芳基”可以与术语“杂芳基环”、“杂芳基基团”或“杂芳族”互换使用，这些术语中的任一个包括任选地经取代的环。术语“杂芳烷基”是指被杂芳基基团取代的烷基基团，其中烷基部分和杂芳基部分独立地任选地被取代。
杂原子：术语“杂原子”意指不是碳或氢的原子。在一些实施例中，杂原子是氧、硫、氮、磷、硼或硅(包括氮、硫、磷、或硅的任何氧化的形式；任何碱性氮或杂环的可取代氮的季铵化形式(例如，如在3，4-二氢-2H-吡咯基中的N)、NH(如在吡咯烷基中)或NR+(如在N-取代的吡咯烷基中)；等)。在一些实施例中，杂原子是硼、氮、氧、硅、硫、或磷。在一些实施例中，杂原子是氮、氧、硅、硫、或磷。在一些实施例中，杂原子是氮、氧、硫、或磷。在一些实施例中，杂原子是氮、氧、或硫。
杂环：如本文所用，术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基(heterocyclyl)”、“杂环基基团(heterocyclic radical)”和“杂环(heterocyclic ring)”可互换使用，并且是指饱和或部分不饱和且具有一个或多个杂原子环原子的单环、双环或多环部分(例如，3-30元)。在一些实施例中，杂环基基团是稳定的5元至7元单环或7元至10元双环杂环部分，其是饱和或部分不饱和的且除碳原子外具有一个或多个、优选地一至四个如以上所定义的杂原子。当关于杂环的环原子使用时，术语“氮”包括经取代的氮。作为实例，在具有0-3个选自氧、硫和氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，氮可以是N(如在3，4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或+NR(如在经N-取代的吡咯烷基中)。杂环可以在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处与其侧基附接，并且任何环原子可以任选地被取代。此类饱和或部分不饱和的杂环基团的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮杂
Figure BPA0000295055720000431
基、氧氮杂
Figure BPA0000295055720000432
基、硫氮杂
Figure BPA0000295055720000433
基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基(heterocyclyl)”、“杂环基环(heterocyclyl ring)”、“杂环基团(heterocyclic group)”、“杂环部分(heterocyclic moiety)”和“杂环基团(heterocyclic radical)”在本文中可互换使用，并且还包括与一个或多个芳基、杂芳基或环脂肪族环稠合的杂环基环，如吲哚啉基、3H-吲哚基、苯并二氢吡喃基、菲啶基或四氢喹啉基。杂环基基团可以是单环的、双环的或多环的。术语“杂环基烷基”是指被杂环基取代的烷基基团，其中烷基部分和杂环基部分独立地任选地被取代。
腹膜内：如本文所用的短语“腹膜内施用(intraperitoneal administration和administered intraperitonealy)”具有其领域所理解的含义，是指将化合物或组合物施用至受试者的腹膜。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人造环境中发生的事件，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在生物体(例如，动物、植物和/或微生物)内。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在生物体(例如，动物、植物和/或微生物)内发生的事件。
低级烷基：术语“低级烷基”是指C1-4直链或支链烷基基团。低级烷基基团的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
低级卤代烷基：术语“低级卤代烷基”是指被一个或多个卤素原子取代的C1-4直链或支链烷基基团。
任选地经取代的：如本文所述，本披露的化合物，例如寡核苷酸、脂质、碳水化合物等，可含有“任选地经取代的”部分。通常，术语“经取代的”，无论前面是否有术语“任选地”，均意指指定部分的一个或多个氢被合适的取代基替换。除非另外指明，否则“任选地经取代的”基团可以在该基团的每个可取代位置处具有合适的取代基，且当任何给定结构中的超过一个位置可以被选自指定基团的超过一个取代基取代时，在每一位置处的取代基可以相同或不同。本披露所设想的取代基的组合优选是导致形成稳定的或化学上可行的化合物的组合。如本文所用，术语“稳定”是指如下化合物，在出于本文所披露的一个或多个目的而经历其制备、检测以及在某些实施例中经历其回收、纯化和使用的条件时，它们基本上不发生改变。
合适的单价取代基是卤素；-(CH2)0-4R○；-(CH2)0-4OR○；-O(CH2)0-4R○、-O-(CH2)0-4C(O)OR○；-(CH2)0-4CH(OR○)2；-(CH2)0-4Ph，其可经R○取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph，其可经R○取代；-CH＝CHPh，其可经R○取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1-吡啶基，其可经R○取代；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(R○)2；-(CH2)0-4N(R○)C(O)R○；-N(R○)C(S)R○；-(CH2)0-4N(R○)C(O)N(R○)2；-N(R○)C(S)N(R○)2；-(CH2)0-4N(R○)C(O)OR○；-N(R○)N(R○)C(O)R○；-N(R○)N(R○)C(O)N(R○)2；-N(R○)N(R○)C(O)OR○；-(CH2)0-4C(O)R○；-C(S)R○；-(CH2)0-4C(O)OR○；-(CH2)0-4C(O)SR○；-(CH2)0-4C(O)OSi(R○)3；-(CH2)0-4OC(O)R○；-OC(O)(CH2)0-4SR○、-SC(S)SR○；-(CH2)0-4SC(O)R○；-(CH2)0- 4C(O)N(R○)2；-C(S)N(R○)2；-C(S)SR○；-SC(S)SR○、-(CH2)0-4OC(O)N(R○)2；-C(O)N(OR○)R○；-C(O)C(O)R○；-C(O)CH2C(O)R○；-C(NOR○)R○；-(CH2)0-4SSR○；-(CH2)0-4S(O)2R○；-(CH2)0-4S(O)2OR○；-(CH2)0-4OS(O)2R○；-S(O)2N(R○)2；-(CH2)0-4S(O)R○；-N(R○)S(O)2N(R○)2；-N(R○)S(O)2R○；-N(OR○)R○；-C(NH)N(R○)2；-Si(R○)3；-OSi(R○)3；-P(R○)2；-P(OR○)2；-P(R○)(OR○)；-OP(R○)2；-OP(OR○)2；-OP(R○)(OR○)；-P[N(R○)2]2-P(R○)[N(R○)2]；-P(OR○)[N(R○)2]；-OP[N(R○)2]2；-OP(R○)[N(R○)2]；-OP(OR○)[N(R○)2]；-N(R○)P(R○)2；-N(R○)P(OR○)2；-N(R○)P(R○)(OR○)；-N(R○)P[N(R○)2]2；-N(R○)P(R○)[N(R○)2]；-N(R○)P(OR○)[N(R○)2]；-B(R○)2；-B(R○)(OR○)；-B(OR○)2；-OB(R○)2；-OB(R○)(OR○)；-OB(OR○)2；-P(O)(R○)2；-P(O)(R○)(OR○)；-P(O)(R○)(SR○)；-P(O)(R○)[N(R○)2]；-P(O)(OR○)2；-P(O)(SR○)2；-P(O)(OR○)[N(R○)2]；-P(O)(SR○)[N(R○)2]；-P(O)(OR○)(SR○)；-P(O)[N(R○)2]2；-OP(O)(R○)2；-OP(O)(R○)(OR○)；-OP(O)(R○)(SR○)；-OP(O)(R○)[N(R○)2]；-OP(O)(OR○)2；-OP(O)(SR○)2；-OP(O)(OR○)[N(R○)2]；-OP(O)(SR○)[N(R○)2]；-OP(O)(OR○)(SR○)；-OP(O)[N(R○)2]2；-SP(O)(R○)2；-SP(O)(R○)(OR○)；-SP(O)(R○)(SR○)；-SP(O)(R○)[N(R○)2]；-SP(O)(OR○)2；-SP(O)(SR○)2；-SP(O)(OR○)[N(R○)2]；-SP(O)(SR○)[N(R○)2]；-SP(O)(OR○)(SR○)；-SP(O)[N(R○)2]2；-N(R○)P(O)(R○)2；-N(R○)P(O)(R○)(OR○)；-N(R○)P(O)(R○)(SR○)；-N(R○)P(O)(R○)[N(R○)2]；-N(R○)P(O)(OR○)2；-N(R○)P(O)(SR○)2；-N(R○)P(O)(OR○)[N(R○)2]；-N(R○)P(O)(SR○)[N(R○)2]；-N(R○)P(O)(OR○)(SR○)；-N(R○)P(O)[N(R○)2]2；-P(R○)2[B(R○)3]；-P(OR○)2[B(R○)3]；-P(NR○)2[B(R○)3]；-P(R○)(OR○)[B(R○)3]；-P(R○)[N(R○)2][B(R○)3]；-P(OR○)[N(R○)2][B(R○)3]；-OP(R○)2[B(R○)3]；-OP(OR○)2[B(R○)3]；-OP(NR○)2[B(R○)3]；-OP(R○)(OR○)[B(R○)3]；-OP(R○)[N(R○)2][B(R○)3]；-OP(OR○)[N(R○)2][B(R○)3]；-N(R○)P(R○)2[B(R○)3]；-N(R○)P(OR○)2[B(R○)3]；-N(R○)P(NR○)2[B(R○)3]；-N(R○)P(R○)(OR○)[B(R○)3]；-N(R○)P(R○)[N(R○)2][B(R○)3]；-N(R○)P(OR○)[N(R○)2][B(R○)3]；-P(OR′)[B(R′)3]-；-(C1-4直链或支链亚烷基)O-N(R○)2；或-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)O-N(R○)2，其中每个R○可如下文所定义取代且独立地是氢，C1-20脂肪族，具有1-5个独立地选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的C1-20杂脂肪族，-CH2-(C6-20芳基)，-O(CH2)0-1(C6-20芳基)，-CH2-(具有1-5个独立选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的5-20元杂芳基环)；具有0-5个独立地选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的5-20元单环、双环或多环的饱和环、部分不饱和环或芳基环；或者尽管有上述定义，两个独立出现的R○与居于它们之间的一个或多个原子一起形成具有0-5个独立地选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的3-20元单环、双环或多环的饱和环、部分不饱和环或芳基环，其可如下文所定义取代。
R○(或由两个独立出现的R○与居于它们之间的原子共同形成的环)上的适合的单价取代基独立地是卤素、-(CH2)0-2R●、-(卤代R●)、-(CH2)0-2OH、-(CH2)0-2OR●、-(CH2)0-2CH(OR●)2、-O(卤代R●)、-CN、-N3、-(CH2)0-2C(O)R●、-(CH2)0-2C(O)OH、-(CH2)0-2C(O)OR●、-(CH2)0-2SR●、-(CH2)0-2SH、-(CH2)0-2NH2、-(CH2)0-2NHR●、-(CH2)0-2NR● 2、-NO2、-SiR● 3、-OSiR● 3、-C(O)SR●、-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)OR●或-SSR●，其中每个R●是未经取代的或在前面有“卤代”的情况下仅被一个或多个卤素取代，且独立地选自C1-4脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph以及具有0-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。在R○的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括＝O及＝S。
例如在合适的碳原子、氮原子上的合适的二价取代基独立地是以下：＝O、＝S、＝CR* 2、＝NNR* 2、＝NHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*、-O(C(R* 2))2-3O-、或-S(C(R* 2))2-3S-，其中每个R*可如下文所定义取代且独立地是氢，C1-20脂肪族，具有1-5个独立地选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的C1-20杂脂肪族，-CH2-(C6-20芳基)，-O(CH2)0-1(C6-20芳基)，-CH2-(具有1-5个独立选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的5-20元杂芳基环)；具有0-5个独立地选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的5-20元单环、双环或多环的饱和环、部分不饱和环或芳基环；或者尽管有上述定义，两个独立出现的R*与居于它们之间的一个或多个原子一起形成具有0-5个独立地选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的3-20元单环、双环或多环的饱和环、部分不饱和环或芳基环，其可如下文所定义取代。与“任选地经取代的”基团的邻位可取代原子结合的合适的二价取代基包括：-O(CR* 2)2-3O-。
R*(或由两个独立出现的R*与居于它们之间的原子共同形成的环)上的适合的单价取代基独立地是卤素、-(CH2)0-2R●、-(卤代R●)、-(CH2)0-2OH、-(CH2)0-2OR●、-(CH2)0-2CH(OR●)2、-O(卤代R●)、-CN、-N3、-(CH2)0-2C(O)R●、-(CH2)0-2C(O)OH、-(CH2)0-2C(O)OR●、-(CH2)0-2SR●、-(CH2)0-2SH、-(CH2)0-2NH2、-(CH2)0-2NHR●、-(CH2)0-2NR● 2、-NO2、-SiR● 3、-OSiR● 3、-C(O)SR●、-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)OR●或-SSR●，其中每个R●是未经取代的或在前面有“卤代”的情况下仅被一个或多个卤素取代，且独立地选自C1-4脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph以及具有0-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。在R*的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括＝O和＝S。
在一些实施例中，“任选地经取代的”基团的可取代氮上的合适取代基包括
Figure BPA0000295055720000461
Figure BPA0000295055720000462
或
Figure BPA0000295055720000463
其中每个
Figure BPA0000295055720000464
独立地是氢，可按以下定义经取代的C1-6脂肪族，未经取代的-OPh或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环，或者尽管有上述定义，但两个独立出现的
Figure BPA0000295055720000471
与居于它们之间的一个或多个原子一起形成未经取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元饱和的、部分不饱和的或芳基的单环或双环。
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720000472
的脂肪族基团上的合适的取代基独立地是卤素、-R●、-(卤代R●)、-OH、-OR●、-O(卤代R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2、或-NO2，其中每个R●是未经取代的或在前面有“卤代”的情况下仅被一个或多个卤素取代，且独立地是C1-4脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。
口服：如本文所用的短语“口服施用(oral administration和administeredorally)”具有其领域所理解的含义，是指通过口施用化合物或组合物。
肠胃外：如本文所用的短语“肠胃外施用(parenteral administration和administered parenterally)”具有其领域所理解的含义，是指除了肠内和局部施用之外的施用方式，通常是通过注射，并且包括但不局限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内以及胸骨内注射和输注。
部分不饱和的：如本文所用，术语“部分不饱和的”是指包括至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和的”意在涵盖具有多个不饱和位点的环，但是不意在包括如本文所定义的芳基或杂芳基部分。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的活性剂。在一些实施例中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量存在，其显示当施用相关群体时实现受控制的治疗效果的统计学显著概率。在一些实施例中，药物组合物能以固体或液体形式被特别配制以进行施用，包括适用于以下的那些：口服施用，例如，浸液(drench)(水性或非水溶液或悬浮液)、片剂(例如针对口腔、舌下和全身吸收的那些)、丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂(应用于舌)；肠胃外施用，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放的配制品通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；局部应用，例如，作为乳膏剂、软膏剂、或控制释放贴剂或喷雾剂应用于皮肤、肺或口腔；阴道内或直肠内，例如作为阴道栓剂、乳膏剂或泡沫剂；舌下；眼部；透皮；或经鼻、肺以及应用于其他粘膜表面。
药学上可接受的：如本文所用，短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适合于与人和动物的组织接触使用而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。
药学上可接受的载体：如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，其涉及将主题化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的一部分。在与配制品的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及在药物配制品中采用的其他无毒相容的物质。
药学上可接受的盐：如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指适合于在制药环境中使用的此类化合物的盐，即，在合理医学判断的范围内，适合于与人和低等动物的组织接触使用而无不当毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的效益/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志]，66：1-19(1977)中详细地描述了药学上可接受的盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐包括但不限于，无毒的酸加成盐，其是使用无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或使用有机酸(如乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域中所使用的其他方法(如离子交换)形成的氨基基团的盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐包括但不限于己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。在一些实施例中，药学上可接受的盐适当地包括使用平衡离子(如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有从1至6个碳原子的烷基、磺酸根以及芳基磺酸根)形成的无毒铵、季铵以及胺阳离子。在一些实施例中，提供的化合物(例如寡核苷酸)包含一个或多个酸性基团，且药学上可接受的盐是碱金属盐、碱土金属盐或铵盐(例如，N(R)3的铵盐，其中每个R独立地如本披露所定义和描述)。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等的盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钠盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钾盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钙盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐适当地包括使用平衡离子(如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有从1至6个碳原子的烷基、磺酸根以及芳基磺酸根)形成的无毒铵、季铵以及胺阳离子。在一些实施例中，提供的化合物包含多于一个酸性基团，例如，提供的寡核苷酸可以包含两个或更多个酸性基团(例如，天然磷酸酯键联和/或经修饰的核苷酸间键联)。在一些实施例中，这种化合物的药学上可接受的盐(或者通常，盐)包含两个或更多个阳离子，该两个或更多个阳离子可以是相同的或不同的。在一些实施例中，在药学上可接受的盐(或通常，盐)中，具有足够酸度的每个酸性基团以其盐形式独立地存在(例如，在包含天然磷酸酯键联和硫代磷酸酯核苷酸间键联的寡核苷酸中，天然磷酸酯键联和硫代磷酸酯核苷酸间键联的每个以其盐形式独立地存在)。在一些实施例中，寡核苷酸的药学上可接受的盐是提供的寡核苷酸的钠盐。在一些实施例中，寡核苷酸的药学上可接受的盐是提供的寡核苷酸的钠盐，其中每个酸性键联(例如，每个天然磷酸酯键联和硫代磷酸酯核苷酸间键联)以钠盐形式(所有钠盐)存在。
保护基团：如本文所用，术语“保护基团，”是本领域熟知的并且包括在ProtectingGroups in Organic Synthesis[有机合成中的保护基团]T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，John Wiley&Sons[约翰威立父子公司]，1999(其全部内容通过引用并入本文)中详细描述的那些。还包括那些特别适用于核苷和核苷酸化学的保护基团，例如，在CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry[当前的核酸化学方案](由Serge L.Beaucage等人编辑，06/2012，章节2的全部内容通过引用并入本文)中描述的那些。合适的氨基-保护基团包括氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-芴基氨基甲酸甲酯(Fmoc)、9-(2-磺酸基)芴基氨基甲酸甲酯、9-(2，7-二溴)芴基氨基甲酸甲酯、2，7-二-叔丁基-[9-(10，10-二氧代-10，10，10，10-四氢噻吨基)]氨基甲酸甲酯(DBD-Tmoc)、4-甲氧基苯酰基氨基甲酸酯(Phenoc)、2，2，2-三氯乙基氨基甲酸酯(Troc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、2-苯基乙基氨基甲酸酯(hZ)、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(Adpoc)、1，1-二甲基-2-卤代乙基氨基甲酸酯、1，1-二甲基-2，2-二溴乙基氨基甲酸酯(DB-t-BOC)、1，1-二甲基-2，2，2-三氯乙基氨基甲酸酯(TCBOC)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙基氨基甲酸酯(Bpoc)、1-(3，5-二-叔丁基苯基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(t-Bumeoc)、2-(2’-和4’-吡啶基)乙基氨基甲酸酯(Pyoc)、2-(N，N-二环己基甲酰胺基)乙基氨基甲酸酯、氨基甲酸叔丁酯(BOC)、1-金刚烷基氨基甲酸酯(Adoc)、氨基甲酸乙烯基酯(Voc)、氨基甲酸烯丙基酯(Alloc)、1-异丙基烯丙基氨基甲酸酯(Ipaoc)、肉桂基氨基甲酸酯(Coc)、4-硝基肉桂基氨基甲酸酯(Noc)、8-喹啉基氨基甲酸酯、N-羟基哌啶基氨基甲酸酯、烷基二硫氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯(Cbz)、对甲氧基苄基氨基甲酸酯(Moz)、对硝基苄基氨基甲酸酯、对溴苄基氨基甲酸酯、对氯苄基氨基甲酸酯、2，4-二氯苄基氨基甲酸酯、4-甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯(Msz)、9-蒽基氨基甲酸甲酯、联苯基氨基甲酸甲酯、2-甲硫基乙基氨基甲酸酯、2-甲基磺酰基乙基氨基甲酸酯、2-(对甲苯磺酰基)乙基氨基甲酸酯、[2-(1，3-二噻烷基)]氨基甲酸甲酯(Dmoc)、4-甲硫基苯基氨基甲酸酯(Mtpc)、2，4-二甲硫基苯基氨基甲酸酯(Bmpc)、2-磷鎓基乙基氨基甲酸酯(Peoc)、2-三苯基磷鎓基异丙基氨基甲酸酯(Ppoc)、1，1-二甲基-2-氰基乙基氨基甲酸酯、间-氯-对酰氧基苄基氨基甲酸酯、对(二羟基硼烷基)苄基氨基甲酸酯、5-苯并异噁唑基氨基甲酸甲酯、2-(三氟甲基)-6-色酮基氨基甲酸甲酯(Tcroc)、间-硝基苯基氨基甲酸酯、3，5-二甲氧基苄基氨基甲酸酯、邻-硝基苄基氨基甲酸酯、3，4-二甲氧基-6-硝基苄基氨基甲酸酯、苯基(邻-硝基苯基)甲基氨基甲酸酯、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N’-对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、N’-苯基氨基硫代羰基衍生物、氨基甲酸叔戊酯、S-苯基硫氨基甲酸酯、对氰基苄基氨基甲酸酯、环丁基氨基甲酸酯、环己基氨基甲酸酯、环戊基氨基甲酸酯、环丙基氨基甲酸甲酯、对-癸氧基苄基氨基甲酸酯、2，2-二甲氧基羰基乙烯基氨基甲酸酯、邻-(N，N-二甲基甲酰胺基)苄基氨基甲酸酯、1，1-二甲基-3-(N，N-二甲基甲酰胺基)丙基氨基甲酸酯、1，1-二甲基丙炔基氨基甲酸酯、二(2-吡啶基)氨基甲酸甲酯、2-呋喃基氨基甲酸甲酯、2-碘乙基氨基甲酸酯、异冰片基氨基甲酸酯、异丁基氨基甲酸酯、异烟基氨基甲酸酯、对-(对’-甲氧基苯基偶氮基)苄基氨基甲酸酯、1-甲基环丁基氨基甲酸酯、1-甲基环己基氨基甲酸酯、1-甲基-1-环丙基氨基甲酸甲酯、1-甲基-1-(3，5-二甲氧基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(对苯基偶氮基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-苯基乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、对-(苯基偶氮基)苄基氨基甲酸酯、2，4，6-三-叔丁基苯基氨基甲酸酯、4-(三甲基铵)苄基氨基甲酸酯、2，4，6-三甲基苄基氨基甲酸酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、氮苯酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯基丙氨酰衍生物、苯甲酰胺、对-苯基苯甲酰胺、邻-硝基苯基乙酰胺、邻-硝基苯氧基乙酰胺、乙酰基乙酰胺、(N’-二硫苄氧基羰基氨基)乙酰胺、3-(对-羟基苯基)丙酰胺、3-(邻-硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻-硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻-苯基偶氮基苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻-硝基肉桂酰胺、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、邻-硝基苯甲酰胺、邻-(苯甲酰基氧基甲基)苯甲酰胺、4，5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫琥珀酰亚胺(Dts)、N-2，3-二苯基马来酰亚胺、N-2，5-二甲基吡咯、N-1，1，4，4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1，3-二甲基-1，3，5-三氮杂环己烷-2-酮、5-取代的1，3-二苄基-1，3，5-三氮杂环己烷-2-酮、1-取代的3，5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲基胺、N-烯丙基胺、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙基胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧基-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、N-苄基胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲基胺、N-5-二苯并环庚胺、N-三苯基甲基胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)联苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基芴基胺(PhF)、N-2，7-二氯-9-芴基亚甲胺、N-二茂铁基甲基氨基(Fcm)、N-2-吡啶甲基氨基N’-氧化物、N-1，1-二甲硫基亚甲胺、N-苄基亚甲胺、N-对甲氧基苄基亚甲胺、N-二苯基亚甲胺、N-[(2-吡啶基)三甲苯基]亚甲胺、N-(N’，N’-二甲基氨基亚甲基)胺、N，N’-异亚丙二胺、N-对-硝基苄基亚甲胺、N-亚水杨酸基胺、N-5-氯亚水杨酸基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲胺、N-环己基亚甲胺、N-(5，5-二甲基-3-氧基-1-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基二取代硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基铬-或钨)羰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝胺、N-硝基胺、N-氧化胺、联苯基膦酰胺(Dpp)、二甲硫基膦酰胺(Mpt)、联苯基硫代膦酰胺(Ppt)、二烷基氨基磷酸酯、联苄基氨基磷酸酯、联苯基氨基磷酸酯、苯次磺酰胺、邻-硝基苯次磺酰胺(Nps)、2，4-二硝基苯次磺酰胺、五氯苯次磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯次磺酰胺、三苯基甲基次磺酰胺、3-硝基吡啶次磺酰胺(Npys)、对-甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2，3，6，-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2，4，6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2，6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2，3，5，6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2，4，6-三甲基苯磺酰胺(Mts)、2，6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(iMds)、2，2，5，7，8-戊甲基色满-6-磺酰胺(Pmc)、甲磺酰胺(Ms)、β-三甲基甲硅烷基乙磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4’，8’-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺、和苯酰基磺酰胺。
适当保护的羧酸进一步包括但不限于甲硅烷基-、烷基-、烯基-、芳基-、和芳基烷基-保护的羧酸。合适的甲硅烷基基团的实例包括三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基联苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基等。合适的烷基基团的实例包括甲基、苄基、对甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、三苯甲基、叔丁基、四氢吡喃-2-基。合适的烯基基团的实例包括烯丙基。合适的芳基基团的实例包括任选地经取代的苯基、联苯基、或萘基。合适的芳基烷基基团的实例包括任选地经取代的苄基(例如，对甲氧基苄基(MPM)、3，4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2，6-二氯苄基、对氰基苄基)、以及2-吡啶甲基和4-吡啶甲基。
合适的羟基保护基团甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲基硫代甲基(MTM)、叔丁基硫代甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(BOM)、对甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(对-AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(POM)、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2，2，2-三氯乙氧基甲基、二(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S，S-二氧化物、1-[(2-氯代-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1，4-二噁烷-2-基、四氢呋喃基、四氢噻吩基(tetrahydrothiofuranyl)、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢-7，8，8-三甲基-4，7-桥亚甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基氢硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2，6-二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧化基、二苯基甲基、p，p’-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯酰基氧基苯基)二苯基甲基、4，4’，4”-三(4，5-二氯邻苯二甲酰亚胺基苯基)甲基、4，4’，4”-三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4，4’，4”-三(苯甲酰基氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)二(4’，4”-二甲氧基苯基)甲基、1，1-二(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1，3-苯并二硫烷-2-基、苯并异噻唑基S，S-二氧化基、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基叔己基(thexyl)甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4，4-(亚乙基二硫代)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫代乙缩醛)、新戊酸酯、金刚酸酯(adamantoate)、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2，4，6-三甲基苯甲酸酯(菜酸酯(mesitoate))、烷基甲基碳酸酯、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、烷基2，2，2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2-(苯基磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2-(三苯基磷鎓基)乙基碳酸酯(Peoc)、烷基异丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基对硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基对甲氧基苄基碳酸酯、烷基3，4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基邻硝基苄基碳酸酯、烷基对硝基苄基碳酸酯、烷基S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、二硫代碳酸甲酯、2-碘苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲硫基甲氧基)乙基、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2，6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2，6-二氯-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2，4-二(1，1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、对-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N，N，N’，N’-四甲基二氨基磷酸酯、烷基N-苯基氨基甲酸酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、烷基2，4-二硝基苯基次磺酸酯、硫酸酯、甲磺酸酯(methanesulfonate、mesylate)、苄基磺酸酯以及甲苯磺酸酯(Ts)。为了保护1，2-二醇或1，3-二醇，保护基团包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯基亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2，2，2-三氯亚乙基缩醛、缩丙酮、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、亚苄基缩醛、对-甲氧基亚苄基缩醛、2，4-二甲氧基亚苄基缩酮、3，4-二甲氧基亚苄基缩醛、2-硝基亚苄基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基亚乙基原酸酯、1，2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基亚苄基原酸酯、1-(N，N-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(N，N’-二甲基氨基)亚苄基衍生物、2-氧杂亚环戊基原酸酯、二-叔丁基亚甲硅烷基基团(DTBS)、1，3-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷亚基)衍生物(TIPDS)、四-叔丁氧基二硅氧烷-1，3-二亚基衍生物(TBDS)、碳酸酯、环硼酸酯、乙基硼酸酯、和苯基硼酸酯。
在一些实施例中，羟基保护基团是乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、对氯苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、2，6-二氯苄基、联苯基甲基、对硝基苄基、三苯基甲基(三苯甲基)、4，4′-二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基联苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰、9-芴基甲基碳酸酯、甲磺酸、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基(MMTr)、4，4′-二甲氧基三苯甲基、(DMTr)和4，4′，4″-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、2-氰基乙基(CE或Cne)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基(TSE)、2-(2-硝基苯基)乙基、2-(4-氰基苯基)乙基2-(4-硝基苯基)乙基(NPE)、2-(4-硝基苯基磺酰基)乙基、3，5-二氯苯基、2，4-二甲基苯基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、2，4，6-三甲基苯基、2-(2-硝基苯基)乙基、丁基硫代羰基、4，4′，4″-三(苯甲酰基氧基)三苯甲基、联苯基氨基甲酰基、乙酰丙酰基(levulinyl)、2-(二溴甲基)苯甲酰基(Dbmb)、2-(异丙基硫代甲氧基甲基)苯甲酰基(Ptmt)、9-苯基氧杂蒽-9-基(苯基
Figure BPA0000295055720000551
吨基(pixyl))或9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在一些实施例中，每个羟基保护基团独立地选自乙酰基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基联苯基甲硅烷基、和4，4′-二甲氧基三苯甲基。在一些实施例中，羟基保护基团选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基和4，4′-二甲氧基三苯甲基基团。
在一些实施例中，磷保护基团是在整个寡核苷酸合成中与核苷酸间磷键联附接的基团。在一些实施例中，磷保护基团与核苷酸间硫代磷酸酯键联的硫原子附接。在一些实施例中，磷保护基团与核苷酸间硫代磷酸酯键联的氧原子附接。在一些实施例中，磷保护基团与核苷酸间磷酸酯键联的氧原子附接。在一些实施例中，磷保护基团是2-氰基乙基(CE或Cne)、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-硝基乙基、2-磺酰基乙基、甲基、苄基、邻硝基苄基、2-(对硝基苯基)乙基(NPE或Npe)、2-苯基乙基、3-(N-叔丁基甲酰胺基)-1-丙基、4-氧代戊基、4-甲硫基-1-丁基、2-氰基-1，1-二甲基乙基、4-N-甲基氨基丁基、3-(2-吡啶基)-1-丙基、2-[N-甲基-N-(2-吡啶基)]氨基乙基、2-(N-甲酰基，N-甲基)氨基乙基、4-[N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]丁基。
蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽(即，通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串)。在一些实施例中，蛋白质仅包括天然存在的氨基酸。在一些实施例中，蛋白质包括一个或多个非天然存在的氨基酸(例如，与相邻的氨基酸形成一个或多个肽键的部分)。在一些实施例中，蛋白质链中的一个或多个残基含有非氨基酸部分(例如，聚糖等)。在一些实施例中，蛋白质包括多于一条个多肽链，例如一个或多个二硫键连接或通过其他方式缔结。在一些实施例中，蛋白质含有1-氨基酸、d-氨基酸、或两者；在一些实施例中，蛋白质含有一个或多个氨基酸修饰或本领域已知的类似物。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。术语“肽”通常用于指具有小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸、或小于10个氨基酸的长度的多肽。
受试者：如本文所用，术语“受试者”或“测试受试者”是指任何生物体，向该生物体中依照本披露施用提供的化合物或组合物，例如，用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。通常的受试者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物、和人；昆虫；蠕虫；等)和植物。在一些实施例中，受试者可能患有和/或易患疾病、障碍和/或病症。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出一个目的特征或特性的总体的或接近总体的范围或程度的定性的状态。生物领域的普通技术人员应当理解的是生物学和化学现象(如果有的话)很少会达到完成和/或进行到完成或实现或避免一个绝对的结果。因此，本文使用术语“基本上”来获得在许多生物学和/或化学现象中潜在地缺少的内在的完全性。
患有：“患有”疾病、障碍和/或病症的个体已经诊断为和/或显示出疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状。
易患：“易患”疾病、障碍和/或病症的个体是比一般公众成员具有更高的发展疾病、障碍和/或病症的风险的个体。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体可以未被诊断出患有该疾病、障碍和/或病症。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体可以表现出该疾病、障碍和/或病症的症状。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体可以不表现出该疾病、障碍和/或病症的症状。在一些实施例中，易患疾病、障碍、和/或病症的个体将会发展该疾病、障碍、和/或病症。在一些实施例中，易患疾病、障碍、和/或病症的个体将不会发展该疾病、障碍、和/或病症。
全身：如本文所用的短语“全身施用”、“全身地施用”、“外周施用”、和“外周地施用”具有其领域所理解的含义，是指施用化合物或组合物使其进入受体的系统。
互变异构形式：本文所用和本领域通常理解的短语“互变异构形式”用于描述能够容易地相互转化的有机化合物的不同异构形式。互变异构体的特征可在于氢原子或质子的形式迁移，伴随着单键和相邻双键的转换。在一些实施例中，互变异构体可以由质子互变异构体(即，质子的重新定位)产生。在一些实施例中，互变异构体可以由价态互变(即，成键电子的快速重组)产生。所有此类互变异构形式旨在包括在本披露的范围内。在一些实施例中，化合物的互变异构形式彼此以移动平衡存在，因此制备单独物质的尝试导致形成混合物。在一些实施例中，化合物的互变异构形式是可分离和可离析的化合物。在本披露的一些实施例中，可以提供化学组合物，其是或包括化合物的单个互变异构形式的纯的制剂。在本披露的一些实施例中，可以提供作为化合物的两个或更多个互变异构形式的混合物的化学组合物。在某些实施例中，此类混合物含有等量的不同的互变异构形式；在某些实施例中，此类混合物含有不同量的化合物的至少两个不同的互变异构形式。在本披露的一些实施例中，化学组合物可以含有化合物的所有互变异构形式。在本披露的一些实施例中，化学组合物可以含有化合物的少于所有互变异构形式。在本披露的一些实施例中，化学组合物可以含有化合物的一个或多个互变异构形式，因为互变现象其量随着时间的推移而变化。在本披露的一些实施例中，互变异构体是酮-烯醇互变异构体。化学领域的技术人员将认识到，可以使用化学领域中已知的任何合适的试剂“捕获”(即，化学修饰以使其保持“烯醇”形式)酮-烯醇互变异构体，以提供烯醇衍生物，其随后可以使用本领域已知的一种或多种合适的技术分离。除非另外指明，否则本披露涵盖相关化合物的所有互变异构形式，无论是纯的形式还是彼此的混合物。
治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗效果和/或引发所希望的生物学和/或药理学效果的药剂。在一些实施例中，治疗剂是任何物质，该物质可用于缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟疾病、障碍、和/或病症的一个或多个症状或特征的发作，降低疾病、障碍、和/或病症的一个或多个症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、障碍、和/或病症的一个或多个症状或特征的发生率。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指当作为治疗方案的一部分施用时引发所希望的生物反应的物质(例如，治疗剂、组合物和/或配制品)的量。在一些实施例中，物质的治疗有效量是当施用于患有或易患疾病、障碍、和/或病症的受试者时，足以治疗、诊断、预防、和/或延迟疾病、障碍、和/或病症的发作的量。如本领域的普通技术人员将理解，物质的有效量可取决于以下这类因素变化：如所希望的生物学终点、待递送的物质、靶细胞或组织等。例如，用于治疗疾病、障碍、和/或病症的配制品中化合物的有效量是缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的发作，降低疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的发病率的量。在一些实施例中，以单个剂量施用治疗有效量；在一些实施例中，需要多个单位剂量来递送治疗有效量。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treat、treatment、或treating)”是指用于部分地或完全缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的发作，降低疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特征的发生率的任何方法。治疗可以施用于未表现出疾病、障碍、和/或病症的迹象的受试者。在一些实施例中，治疗可以施用给仅表现出疾病、障碍、和/或病症的早期迹象的受试者，例如出于降低与疾病、障碍、和/或病症相关的病理学风险的目的。
单位剂量：如本文所用，表述“单位剂量”是指作为单个剂量和/或以药物组合物的物理离散单位施用的量。在很多实施例中，单位剂量含有预定量的活性剂。在一些实施例中，单位剂量含有整个单个剂量的药剂。在一些实施例中，施用多于一个单位剂量以实现总单个剂量。在一些实施例中，需要或预期需要施用多个单位剂量，以实现预期的效果。单位剂量可以是例如含有预定量的一种或多种治疗剂、预定量的固体形式的一种或多种治疗剂的一定体积的液体(例如，可接受的载体)，含有预定量的一种或多种治疗剂等的持续释放配制品或药物递送装置。应当理解，单位剂量可以存在于配制品中，该配制品除了一种或多种治疗剂之外，还包括任何各种组分。例如，如下文所述，可包括可接受的载体(例如，药学上可接受的载体)、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂等。本领域技术人员将理解，在很多实施例中，特定的治疗剂的总适当日剂量可包含一部分或多个单位剂量，并且可由例如在合理的医学判断范围内的主治医师决定。在一些实施例中，对于任何特定受试者或生物体的特定的有效剂量水平将取决于多种因素，这些因素包括正在治疗的障碍和障碍的严重程度；所采用的特定的活性化合物的活性；所采用的特定的组合物；受试者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用时间，和所采用的特定的活性化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所采用的特定化合物组合或一致使用的药物和/或另外的疗法，以及医学领域中熟知的相似因素。
不饱和的：如本文所用，术语“不饱和的”意指具有一个或多个不饱和单元的部分。
野生型：如本文所用的术语“野生型”具有其本领域理解的含义，是指具有在“正常”(与突变体、患病、改变等对比)状态或背景中在自然界中发现的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员将理解，野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如，等位基因)存在。
核酸：术语“核酸”包括任何核苷酸、其类似物、和其聚合物。如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)或其类似物)的聚合形式。这些术语是指分子的一级结构，并且包括双链DNA和单链DNA、以及双链RNA和单链RNA。这些术语包括作为RNA或DNA的等效物、类似物，其由核苷酸类似物和经修饰的多核苷酸(例如但不限于甲基化、保护和/或加帽的核苷酸或多核苷酸)制成。这些术语涵盖聚或寡核糖核苷酸(RNA)、和聚或寡脱氧核糖核苷酸(DNA)；衍生自核碱基和/或经修饰的核碱基的N-糖苷或C-糖苷的RNA或DNA；衍生自糖和/或经修饰的糖的核酸；以及衍生自磷酸酯桥和/或经修饰的磷原子桥(在本文中也称为“核苷酸间键联”)的核酸。该术语涵盖含有核碱基、经修饰的核碱基、糖、经修饰的糖、天然的天然磷酸核苷酸间键联或非天然核苷酸间键联的任何组合的核酸。实例包括但不限于含有核糖部分的核酸、含有脱氧核糖部分的核酸、含有核糖和脱氧核糖两者部分的核酸、含有核糖和经修饰核糖部分的核酸。除非另有说明，否则前缀“多(poly-)”是指含有2至约10,000个核苷酸单体单元的核酸，并且其中前缀“寡(oligo-)”是指含有2至约200个核苷酸单体单元的核酸。
核苷酸：如本文所用，术语“核苷酸”是指多核苷酸的单体单元，其由杂环碱基、糖、和一个或多个磷酸基团、或含磷的核苷酸间键联组成。天然存在的碱基(鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、和尿嘧啶(U))是嘌呤或嘧啶的衍生物，但应该理解为还包括天然地和非天然存在的碱基类似物。天然存在的糖包括戊糖(五碳糖)脱氧核糖(发现于天然DNA中)或核糖(发现于天然RNA中)，但应理解为还包括天然和非天然存在的糖类似物，如具有2′-修饰的糖、锁核酸(LNA)中的糖、和磷二酰胺吗啉代寡聚物(phosphorodiamidatemorpholino oligomer，PMO)。将核苷酸经由核苷酸间键联进行连接以形成核酸、或多核苷酸。许多核苷酸间键联是本领域已知的(例如但不限于天然磷酸酯键联、硫代磷酸酯键联、硼烷磷酸酯键联等)。人工核酸包括PNA(肽核酸)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、H-膦酸酯、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、甲基膦酸酯、膦酰基乙酸酯(phosphonoacetate)、硫代膦酰基乙酸酯、及天然核酸的磷酸酯骨架的其他变体等。在一些实施例中，核苷酸是包含天然存在的核碱基、天然存在的糖、和天然磷酸酯键联的天然核苷酸。在一些实施例中，核苷酸是经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，其是可用于代替天然核苷酸的结构类似物。
经修饰的核苷酸：术语“经修饰的核苷酸”包括在结构上与天然核苷酸不同但能执行天然核苷酸的至少一种功能的任何化学部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包含在糖、碱基和/或核苷酸间键联处的修饰。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包含经修饰的糖、经修饰的核碱基、和/或经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸能够具有核苷酸的至少一种功能，例如，在能够与包含至少互补碱基序列的核酸碱基配对的聚合物中形成亚基。
类似物：术语“类似物”包括在结构上与参考化学部分或部分的类别不同但能执行此类参考化学部分或部分的类别的至少一种功能的任何化学部分。作为非限制性实例，核苷酸类似物在结构上与核苷酸不同，但能执行核苷酸的至少一种功能；核碱基类似物在结构上与核碱基不同，但能执行核碱基的至少一种功能；糖类似物在结构上与核碱基不同，但能执行糖的至少一种功能等。
核苷：术语“核苷”是指其中核碱基或经修饰的核碱基与糖或经修饰的糖共价结合的部分。
经修饰的核苷：术语“经修饰的核苷”是指与天然核苷在化学上不同的，但能执行核苷的至少一种功能的化学部分。在一些实施例中，经修饰的核苷衍生自天然核苷或与天然核苷在化学上相似，但其包含使其与天然核苷有区别的化学修饰。经修饰的核苷的非限制性实例包括在碱基和/或糖处包含修饰的那些。经修饰的核苷的非限制性实例包括在糖上具有2′-修饰的那些。经修饰的核苷的非限制性实例还包括无碱基核苷(其缺乏核碱基)。在一些实施例中，经修饰的核苷能够具有核苷的至少一种功能，例如，在能够与包含至少互补碱基序列的核酸碱基配对的聚合物中形成部分。
核苷类似物：术语“核苷类似物”是指与天然核苷在化学上不同但能执行核苷的至少一种功能的化学部分。在一些实施例中，核苷类似物包含糖的类似物和/或核碱基的类似物。在一些实施例中，经修饰的核苷能够具有核苷的至少一种功能，例如，在能够与包含互补碱基序列的核酸碱基配对的聚合物中形成部分。
糖：术语“糖”是指呈封闭和/或开放形式的单糖或多糖。在一些实施例中，糖是单糖。在一些实施例中，糖是多糖。糖包括但不限于核糖、脱氧核糖、戊呋喃糖、戊吡喃糖、和己吡喃糖部分。如本文所用，术语“糖”还涵盖用于代替常规糖分子的结构类似物，如二醇、形成核酸类似物的骨架的聚合物、二醇核酸(“GNA”)等。如本文所用，术语“糖”还涵盖用于代替天然核苷酸或天然存在的核苷酸的结构类似物，如经修饰的糖和核苷酸糖。在一些实施例中，糖是D-2-脱氧核糖。在一些实施例中，糖是β-D-脱氧呋喃核糖。在一些实施例中，糖部分是β-D-脱氧呋喃核糖部分。在一些实施例中，糖是D-核糖。在一些实施例中，糖是β-D-呋喃核糖。在一些实施例中，糖部分是β-D-呋喃核糖部分。在一些实施例中，糖是任选地经取代的β-D-脱氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖。在一些实施例中，糖部分是任选地经取代的β-D-脱氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖部分。在一些实施例中，寡核苷酸、核酸等中的糖部分/单元是包含各自独立地与核苷酸间键联连接的一个或多个碳原子的糖，例如，任选地经取代的β-D-脱氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖，这些糖5′-C和/或3′-C各自独立地与核苷酸间键联(例如，天然磷酸酯键联、经修饰的核苷酸间键联、手性受控的核苷酸间键联等)连接。
经修饰的糖：术语“经修饰的糖”是指可以替换糖的部分。经修饰的糖模拟糖的空间排列、电子特性、或一些其他物理化学特性。在一些实施例中，经修饰的糖是经取代的β-D-脱氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖。在一些实施例中，经修饰的糖包含2′-修饰。在一些实施例中，经修饰的糖包含与两个糖碳原子(例如，C2和C4)连接的接头(例如，任选地经取代的二价杂脂肪族)，例如，发现于LNA中。在一些实施例中，接头是-O-CH(R)-，其中R如本披露中所述。在一些实施例中，接头是-O-CH(R)-，其中O与C2连接，并且-CH(R)-与糖的C4连接，并且R如本披露中所述。在一些实施例中，R是甲基。在一些实施例中，R是-H。在一些实施例中，-CH(R)-是S构型。在一些实施例中，-CH(R)-是R构型。
核碱基：术语“核碱基”是指参与氢键合的核酸部分，氢键合以序列特异性方式将一条核酸链与另一条互补链结合。最常见的天然存在的核碱基是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、和胸腺嘧啶(T)。在一些实施例中，经修饰的核碱基是经取代的核碱基，该核碱基选自A、T、C、G、U、及其互变异构体。在一些实施例中，天然存在的核碱基是经修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些实施例中，天然存在的核碱基是甲基化的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些实施例中，核碱基是“经修饰的核碱基”，例如，除腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、和胸腺嘧啶(T)之外的核碱基。在一些实施例中，经修饰的核碱基是甲基化的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些实施例中，经修饰的核碱基模拟核碱基的空间排列、电子特性或一些其他物理化学特性，并保留氢键合的特性，氢键合以序列特异性方式将一条核酸链与另一条核酸链结合。在一些实施例中，经修饰的核碱基可与所有五种天然存在的碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、或鸟嘌呤)配对，而基本上不影响熔解行为、被细胞内酶识别、或寡核苷酸双链体的活性。如本文所用，术语“核碱基”还涵盖用于代替天然核苷酸或天然存在的核苷酸的结构类似物，如经修饰的核碱基和核碱基类似物。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的A、T、C、G、或U、或者经取代的核碱基，该核碱基选自A、T、C、G、或U及其互变异构体。
经修饰的核碱基：术语“经修饰的核碱基”、“经修饰的碱基”等是指与核碱基化学上不同的，但是能执行核碱基的至少一种功能的化学部分。在一些实施例中，经修饰的核碱基是包含修饰的核碱基。在一些实施例中，经修饰的核碱基能够具有核碱基的至少一种功能，例如，在能够与包含至少互补碱基序列的核酸碱基配对的聚合物中形成部分。在一些实施例中，经修饰的核碱基是经取代的核碱基，该核碱基选自A、T、C、G、U、及其互变异构体。
手性配体：术语“手性配体”或“手性助剂”是指为手性的部分并且可以结合到反应中，使得反应能以某些立体选择性进行。在一些实施例中，术语还可以是指包含此类部分的化合物。
阻断基团：术语“阻断基团”是指掩蔽官能团反应性的基团。随后可以通过去除阻断基团来掩蔽官能团。在一些实施例中，阻断基团是保护基团。
部分：术语“部分”是指分子的特定的区段或官能团。化学部分通常是嵌入或附加于分子的公认的化学实体。在一些实施例中，化合物的部分是通过从化合物中去除一个或多个-H和/或其等效物而由化合物形成的单价、二价或多价基团。在一些实施例中，取决于其上下文，“部分”还可以指化合物或实体，从该化合物或实体衍生出部分。
固体支持物：当核酸、寡核苷酸、或其他化合物的制剂的上下文中使用时，术语“固体支持物”是指能够合成核酸、寡核苷酸、或其他化合物的任何支持物。在一些实施例中，该术语是指玻璃或聚合物，其不溶于在合成核酸进行的反应步骤中使用的介质，并且衍生化以包含反应性基团。在一些实施例中，固体支持物是高度交联的聚苯乙烯(HCP)或可控孔度玻璃(CPG)。在一些实施例中，固体支持物是可控孔度玻璃(CPG)。在一些实施例中，固体支持物是可控孔度玻璃(CPG)和高度交联的聚苯乙烯(HCP)的杂合支持物。
读框：术语“读框”是指双链的DNA分子的六个可能的读框之一，每个方向三个。用于确定哪些密码子用于编码氨基酸的读框在DNA分子编码序列内。
反义：如本文所用，“反义”核酸分子包含核苷酸序列，其与编码蛋白质的“有义”核酸互补，例如与双链cDNA分子的编码链互补、与mRNA序列互补或与基因的编码链互补。因此，反义核酸分子可以经由氢与有义核酸分子键合。在一些实施例中，可以从两条链产生转录物。在一些实施例中，转录物可以编码或可以不编码蛋白质产物。在一些实施例中，当针对或靶向特定的核酸序列时，“反义”序列可以是指与特定的核酸序列互补的序列。
寡核苷酸：术语“寡核苷酸”是指核苷酸单体的聚合物或低聚物，该核苷酸单体含有核碱基、经修饰的核碱基、糖、经修饰的糖、天然磷酸酯键联、或非天然核苷酸间键联的任何组合。
寡核苷酸可以是单链或双链的。如本文所用，术语“寡核苷酸链”涵盖单链寡核苷酸。单链寡核苷酸可以具有双链区域，而双链寡核苷酸可以具有单链区域。示例寡核苷酸包括但不限于结构基因、包含控制区和终止区的基因、自我复制系统(如病毒DNA或质粒DNA)、单链和双链siRNA和其他RNA干扰试剂(RNAi剂或iRNA试剂)、shRNA、反义寡核苷酸、核酶、微小RNA、微小RNA模拟物、supermir、适体、antimir、antagomir、Ul衔接子、形成三链体的寡核苷酸、G-四链体寡核苷酸、RNA激活子、免疫刺激性寡核苷酸和诱饵寡核苷酸。
有效诱导RNA干扰的双链和单链寡核苷酸也可以称为siRNA、RNAi剂或iRNA剂。在一些实施例中，这些诱导RNA干扰的寡核苷酸与细胞质多蛋白复合物(称为RNAi诱导的沉默复合物(RISC))缔合。在许多实施例中，单链和双链RNAi剂足够长以至于它们可以被内源性分子(例如Dicer)切割，以产生较小的寡核苷酸，这些寡核苷酸可以进入RISC机制并参与RISC介导的靶序列(例如，靶mRNA)的切割。
本披露的寡核苷可具有各种长度。在特定的实施例中，寡核苷的长度范围可以从约2至约200个核苷。在多个相关实施例中，(单链的、双链的、和三链的)寡核苷的长度范围可以从约4至约10个核苷、从约10至约50个核苷、从约20至约50个核苷、从约15至约30个核苷、从约20至约30个核苷。在一些实施例中，寡核苷的长度为从约9至约39个核苷。在一些实施例中，寡核苷的长度为至少15个核苷。在一些实施例中，寡核苷的长度为至少20个核苷。在一些实施例中，寡核苷的长度为至少25个核苷。在一些实施例中，寡核苷的长度为至少30个核苷。在一些实施例中，寡核苷是长度为至少18个核苷的互补链的双链体。在一些实施例中，寡核苷是长度为至少21个核苷的互补链的双链体。在一些实施例中，出于寡核苷酸长度的目的，独立计数的每个核苷包含选自A、T、C、G、U及其互变异构体的任选地经取代的核碱基。
核苷酸间键联：如本文所用，短语“核苷酸间键联”通常是指核酸的或者寡核苷酸的核苷酸单元之间的键联(通常含磷的键联)，并且与如上文和本文使用的“糖间键联”、“核苷间键联”、和“磷原子桥”可互换地使用。如本领域技术人员所理解的，天然DNA和RNA含有天然磷酸酯键联。在一些实施例中，核苷酸间键联是天然磷酸酯键联(-OP(O)(OH)O-，在pH例如约7.4下以其阴离子形式-OP(O)(O-)O-存在)，如在天然存在的DNA和RNA分子中发现的。在一些实施例中，核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联(或非天然核苷酸间键联)，其在结构上与天然磷酸酯键联不同，但是可以代替天然磷酸酯键联(例如硫代磷酸酯核苷酸间键联、PMO键联等)使用。在一些实施例中，核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联，其中天然磷酸二酯键联的一个或多个氧原子独立地被一个或多个有机或无机部分替换。在一些实施例中，这种有机或无机部分选自但不限于＝S、＝Se、＝NR′、-SR′、-SeR′、-N(R′)2、B(R′)3、-S-、-Se-、和-N(R′)-，其中每个R’独立地如下文所定义和描述的。在一些实施例中，核苷酸间键联是磷酸三酯键联。在一些实施例中，核苷酸间键联是硫代磷酸二酯键联(硫代磷酸酯核苷酸间键联
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通常以其阴离子形式-OP(O)(S-)O-在pH例如约7.4下存在)。本领域普通技术人员理解，由于键联中存在酸或碱部分，核苷酸间键联可以在给定pH下作为阴离子或阳离子存在。在一些实施例中，核苷酸间键联是在给定pH下的非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，核苷酸间键联是在给定pH下的中性核苷酸间键联。在一些实施例中，给定pH为pH约7.4。在一些实施例中，给定pH在pH约0、1、2、3、4、5、6或7至pH约7、8、9、10、11、12、13或14的范围内。在一些实施例中，给定pH在pH 5-9的范围内。在一些实施例中，给定pH在pH 6-8的范围内。在一些实施例中，核苷酸间键联具有如本披露中所述的式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有如本披露中所述的式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等的结构。在一些实施例中，核苷酸间键联是例如PNA(肽核酸)或PMO(磷二酰胺吗啉代寡聚物)键联之一。在一些实施例中，核苷酸间键联包含手性键联磷。在一些实施例中，核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，核苷酸间键联选自：s(硫代磷酸酯)、s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7、s8、s9、s10、s11、s12、s13、s14、s15、s16、s17或s18，其中s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7、s8、s9、s10、s11、s12、s13、s14、s15、s16、s17和s18各自独立地如WO 2017/062862中所述。
除非另有说明，否则寡核苷酸序列之前的Rp/Sp标识描述了在手性受控的核苷酸间键联(寡核苷酸序列的按顺序从5′至3′)中的键联磷的构型。例如，在(Rp，Sp)-ATsCs1GA中，位于T和C之间的“s”键联中的磷具有Rp构型，并且位于C和G之间的“s1”键联中的磷具有Sp构型。在一些实施例中，“全-(Rp)”或“全-(Sp)”分别用于指示手性受控的核苷酸间键联中的所有手性键联磷原子具有相同的Rp或Sp构型。例如，全-(Rp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC指示寡核苷酸中的所有手性键联磷原子均具有Rp构型；全-(Sp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC指示寡核苷酸中的所有手性键联磷原子均具有Sp构型。
寡核苷酸类型：如本文所用，短语“寡核苷酸类型”用于定义具有以下的寡核苷酸：特定碱基序列、骨架键联模式(即，核苷酸间键联类型(例如，天然磷酸酯键联、硫代磷酸酯核苷酸间键联、非负电荷的核苷酸间键联、中性核苷酸间键联等)模式)、骨架手性中心模式(即，键联磷立体化学(Rp/Sp)模式)、和骨架磷修饰模式(例如，式I中的“-X-L-R1”基团模式)。在一些实施例中，具有共同指定的“类型”的寡核苷酸彼此在结构上相同。
本领域技术人员将理解，本披露的合成方法在合成寡核苷酸链期间提供一定程度的控制，使得可以提前设计和/或选择寡核苷酸链的每个核苷酸单元以在键联磷处具有特定的立体化学和/或在键联磷处具有特定的修饰、和/或具有特定的碱基、和/或具有特定的糖。在一些实施例中，提前设计和/或选择寡核苷酸链以在键联磷处具有立体中心的特定组合。在一些实施例中，设计和/或确定寡核苷酸链以在键联磷处具有修饰的特定组合。在一些实施例中，设计和/或选择寡核苷酸链以具有碱基的特定组合。在一些实施例中，设计和/或选择寡核苷酸链以具有一个或多个以上结构特征的特定组合。本披露提供了包含多种寡核苷酸分子(例如，手性受控的寡核苷酸组合物)或由其组成的组合物。在一些实施例中，所有此类分子是相同的类型。在一些实施例中，所有此类分子彼此在结构上相同。在一些实施例中，提供的组合物包含不同类型的多种寡核苷酸，通常以预定的(非随机)相对量。
手性受控：如本文所用，“手性受控”是指控制寡核苷酸内的手性核苷酸间键联中的手性键联磷的立体化学标识。在一些实施例中，通过寡核苷酸的糖和碱基部分中不存在的手性元件实现控制，例如，在一些实施例中，通过在寡核苷酸制备期间使用一种或多种手性助剂实现控制，如在本披露中例示的，手性助剂通常是寡核苷酸制备期间使用的手性亚磷酰胺的一部分。与手性受控相比，本领域普通技术人员认识到，如果使用常规寡核苷酸合成来形成手性核苷酸间键联，则不使用手性助剂的这样的常规寡核苷酸合成不能控制手性核苷酸间键联处的立体化学。在一些实施例中，控制了寡核苷酸内手性核苷酸间键联中每个手性键联磷的立体化学标识。
手性受控的寡核苷酸组合物：如本文所用，术语“手性受控(立体控制的或立体定义的)的寡核苷酸组合物”、“手性受控(立体控制的或立体定义的)的核酸组合物”等是指包含多种寡核苷酸(或核酸、手性受控的寡核苷酸或手性受控的核酸)的组合物，该多种寡核苷酸(或核酸、手性受控的寡核苷酸或手性受控的核酸)共享：1)共同的碱基序列，2)共同的骨架键联模式；3)共同的骨架手性中心模式以及4)共同的骨架磷修饰模式(特定类型的寡核苷酸)，其中该多种寡核苷酸(或核酸)在一个或多个手性核苷酸间键联(手性受控的核苷酸间键联，其手性键联磷呈Rp或Sp，而非如同非手性受控的核苷酸间键联一样的随机Rp和Sp混合物)处共享相同的立体化学。手性受控的寡核苷酸组合物中多种寡核苷酸(或核酸)的水平是非随机的(预先确定的、受控制的)。手性受控的寡核苷酸组合物通常通过手性受控的寡核苷酸制剂进行制备，以立体选择性地形成一个或多个手性核苷酸间键联(例如，使用本披露中例示的手性助剂，与非手性受控的(立体随机、非立体选择性、外消旋)寡核苷酸合成(如，使用非手性助剂或手性催化剂的传统的基于亚磷酰胺的寡核苷酸合成)相比以有目的地控制立体选择性)。相对于具有共同的碱基序列、共同的骨架键联模式、和共同的骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，手性受控的寡核苷酸组合物富集多种寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物包含通过以下定义的特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸：1)碱基序列；2)骨架键联模式；3)骨架手性中心模式；以及4)骨架磷修饰模式，其中相对于具有相同的碱基序列、骨架键联模式、和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该手性受控的寡核苷酸组合物富集特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。如本领域普通技术人员容易理解的，这种富集的特征在于：与基本上外消旋制剂相比，在每个手性受控的核苷酸间键联处，较高水平的键联磷具有所希望的构型。在一些实施例中，每个手性受控的核苷酸间键联相对于其手性键联磷独立地具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的非对映纯度。在一些实施例中，各自独立地具有至少90％的非对映纯度。在一些实施例中，各自独立地具有至少95％的非对映纯度。在一些实施例中，各自独立地具有至少97％的非对映纯度。在一些实施例中，各自独立地具有至少98％的非对映纯度。在一些实施例中，多种中的寡核苷酸具有相同的构造。在一些实施例中，多种中的寡核苷酸具有相同的构造和立体化学，并且在结构上相同。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的多种寡核苷酸共享相同的碱基序列，如果有的话，相同的核碱基、糖、和核苷酸间键联修饰，以及独立地在一个或多个手性受控的核苷酸间键联的键联磷手性中心处的相同的立体化学(Rp或Sp)，尽管某些键联磷手性中心的立体化学可以不同。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的所有寡核苷酸的约0.1％-100％(例如，约1％-100％、5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％、或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)是该多种寡核苷酸。在一些实施例中，在共享共同的碱基序列的手性受控的寡核苷酸组合物中的所有寡核苷酸的约0.1％-100％(例如，约1％-100％、5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％、或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)是该多种寡核苷酸。在一些实施例中，在共享共同的碱基序列、共同的骨架键联模式、和共同的骨架磷修饰模式的手性受控的寡核苷酸组合物中的所有寡核苷酸的约0.1％-100％(例如，约1％-100％、5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％、或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)是该多种寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的所有寡核苷酸的，或在共享共同的碱基序列的组合物中的所有寡核苷酸(例如，多种寡核苷酸或寡核苷酸类型)的，或在共享共同的碱基序列、共同的骨架键联模式、和共同的骨架磷修饰模式的组合物中的所有寡核苷酸(例如，多种寡核苷酸或寡核苷酸类型)的，或在共享共同的碱基序列、共同的碱基修饰模式、共同的糖修饰模式、共同的核苷酸间键联类型模式、和/或共同的核苷酸间键联修饰模式生物组合物中的所有寡核苷酸(例如，多种寡核苷酸或寡核苷酸类型)的，或在共享相同的构造的组合物中的所有寡核苷酸的约0.1％-100％(例如，约1％-100％、5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％、或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)是该多种寡核苷酸。在一些实施例中，百分比为至少(DP)NCI，其中DP是选自85％-100％的百分比，并且NCI是手性受控的核苷酸间键联的数量。在一些实施例中，DP是至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。在一些实施例中，DP是至少85％。在一些实施例中，DP是至少90％。在一些实施例中，DP是至少95％。在一些实施例中，DP是至少96％。在一些实施例中，DP是至少97％。在一些实施例中，DP是至少98％。在一些实施例中，DP是至少99％。在一些实施例中，DP反映了键联磷手性中心手性受控的核苷酸间键联的非对映纯度。在一些实施例中，可以通常使用包含这种核苷酸间键联和适当的二聚体(被核苷酸间键联连接的两个核苷单元)来评估核苷酸间键联的键联磷手性中心的非对映纯度。在一些实施例中，多种寡核苷酸在约1-50个(例如，约1-10、1-20、5-10、5-20、10-15、10-20、10-25、10-30，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个)手性核苷酸间键联处共享相同的立体化学。在一些实施例中，多种寡核苷酸在约0.1％-100％(例如，约1％-100％、5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％、约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％、或至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％)的手性核苷酸间键联处共享相同的立体化学。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联，并且组合物是完全手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，不是所有的手性核苷酸间键联都是手性受控的核苷酸间键联，并且组合物是部分地手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物包含预定水平的单独的寡核苷酸或核酸类型。例如，在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物包含在预定水平的(例如，如上文描述的)一个寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物包含超过一种寡核苷酸类型，各自独立地在预定水平。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物包含多种寡核苷酸类型，各自独立地在预定水平。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是寡核苷酸类型的寡核苷酸的组合物，该组合物包含预定水平的寡核苷酸类型的多种寡核苷酸。
手性纯：如本文所用，短语“手性纯”用于描述寡核苷酸或其组合物，其中全部或几乎所有的寡核苷酸分子(其余为杂质)相对于键联磷原子以单个非对映异构形式存在。在很多实施例中，如本领域技术人员所理解的，手性纯寡核苷酸组合物基本上是纯的，因为组合物中基本上所有寡核苷酸在结构上相同(是相同的立体异构体)。
键联磷：如本文所定义，短语“键联磷”用于指示所提及的特定磷原子是核苷酸间键联中存在的磷原子，该磷原子对应于天然磷酸酯键联的磷原子，如在天然存在的DNA和RNA中存在。在一些实施例中，键联磷原子在经修饰的核苷酸间键联中。在一些实施例中，键联磷原子是式I的PL中的P。在一些实施例中，键联磷原子是手性的。
P-修饰：如本文所用，术语“P-修饰”是指在键联磷处除立体化学修饰以外的任何修饰。在一些实施例中，P-修饰包含添加、取代或移除与键联磷共价附接的侧基部分。在一些实施例中，“P-修饰”是式I的W、Y、Z或X-L-R1。
嵌段体(Blockmer)：如本文所用，术语“嵌段体”是指寡核苷酸，其表征每个单独的核苷酸单元的结构特征模式的特征在于，在核碱基、糖和/或核苷酸间键联处存在至少两个共享共同的结构特征的连续核苷酸单元。共同的结构特征意指共同的化学和/或立体化学，例如，核碱基、糖和/或核苷酸间键联处的共同修饰和在键联磷手性中心处的共同的立体化学。在一些实施例中，该至少两个共享共同的结构特征的连续核苷酸单元被称为“嵌段”。
在一些实施例中，嵌段体是“立体嵌段体”，例如至少两个连续核苷酸单元在键联磷处具有相同的立体化学。这样的至少两个连续核苷酸单元形成“立体嵌段”。例如，(Sp，Sp)-ATsCs1GA是立体嵌段体，因为至少两个连续核苷酸单元Ts和Cs1在键联磷处具有相同的立体化学(均为Sp)。在(Sp，Sp)-ATsCs1GA的同一寡核苷酸中，TsCs1形成嵌段，且该嵌段是立体嵌段。
在一些实施例中，嵌段体是“P-修饰嵌段体”，例如至少两个连续核苷酸单元在键联磷处具有相同的修饰。这样的至少两个连续核苷酸单元形成“P-修饰嵌段”。例如，(Rp，Sp)-ATsCsGA是P-修饰嵌段体，因为至少两个连续核苷酸单元Ts和Cs具有相同的P-修饰(即，均为硫代磷酸二酯)。在(Rp，Sp)-ATsCsGA的同一寡核苷酸中，TsCs形成嵌段，且该嵌段是P-修饰嵌段。
在一些实施例中，嵌段体是“键联嵌段体(linkage blockmer)”，例如至少两个连续核苷酸单元在键联磷处具有相同的立体化学和相同的修饰。至少两个连续核苷酸单元形成“键联嵌段(linkage block)”。例如，(Rp，Rp)-ATsCsGA是键联嵌段体，因为至少两个连续核苷酸单元Ts和Cs具有相同的立体化学(均为Rp)及P-修饰(均为硫代磷酸酯)。在(Rp，Rp)-ATsCsGA的同一寡核苷酸中，TsCs形成嵌段，且该嵌段是键联嵌段。
在一些实施例中，嵌段体是“糖修饰嵌段体”，例如至少两个连续核苷酸单元具有相同的糖修饰。在一些实施例中，糖修饰嵌段体是2′-F嵌段体，其中至少两个连续核苷酸单元在其糖上具有2′-F修饰。在一些实施例中，糖修饰嵌段体是2′-OR嵌段体，其中至少两个连续核苷酸单元在其糖处独立地具有2′-OR修饰，其中每个R独立地如本披露中所述。在一些实施例中，糖修饰嵌段体是2′-OMe嵌段体，其中至少两个连续核苷酸单元在其糖上具有2′-OMe修饰。在一些实施例中，糖修饰嵌段体是2′-MOE嵌段体，其中至少两个连续核苷酸单元在其糖上具有2′-MOE修饰。在一些实施例中，糖修饰嵌段体是LNA嵌段体，其中至少两个连续核苷酸单元具有LNA糖。
在一些实施例中，嵌段体包含一个或多个独立地选自糖修饰嵌段、立体嵌段、P-修饰嵌段和键联嵌段的嵌段。在一些实施例中，嵌段体就一个嵌段而言是立体嵌段体，和/或就另一嵌段而言是P-修饰嵌段体，和/或就又另一嵌段而言是键联嵌段体。
交替体(altmer)：如本文所用，术语“交替体”是指寡核苷酸，其表征每个单独的核苷酸单元的结构特征模式的特征在于：该寡核苷酸链中没有两个连续核苷酸单元在核碱基、糖和/或核苷酸间磷键联处共享特定的结构特征。在一些实施例中，将交替体设计成使得其包含重复模式。在一些实施例中，将交替体设计成使得其不包含重复模式。
在一些实施例中，交替体是“立体交替体”，例如没有两个连续核苷酸单元在键联磷处具有相同的立体化学。例如(Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp，Sp，Rp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC。
缺口体(gapmer)：如本文所用，术语“缺口体”是寡核苷酸，其指特征在于一个或多个核苷酸单元(缺口)不具有在该一个或多个核苷酸单元两端侧接的核苷酸单元所含有的结构特征(例如，核碱基修饰、糖修饰、核苷酸间键联修饰，键联磷立体化学等)。在一些实施例中，缺口体包含在两端独立地侧接非天然核苷酸间键联的一个或多个天然磷酸酯键联的缺口。在一些实施例中，缺口体是糖修饰缺口体，其中该缺口体包含一个或多个核苷酸单元的缺口，该一个或多个核苷酸单元的两端均不包含糖修饰，而两端侧接的核苷酸含有糖修饰。在一些实施例中，缺口体包含缺口，其中缺口区域中的每个核苷酸单元不含2′-修饰，而在两端侧接缺口的核苷酸单元中包含该修饰。在一些实施例中，提供了包含缺口的寡核苷酸，其中缺口区域中的每个核苷酸单元不含2′-OR修饰，而在每端侧接缺口的核苷酸单元独立地包含2′-OR修饰。在一些实施例中，提供了包含缺口的寡核苷酸，其中缺口区域中的每个核苷酸单元不含2′-F修饰，而在每端侧接缺口的核苷酸单元独立地包含2′-F修饰。
跳过体(skipmer)：如本文所用，术语“跳过体”是指一种类型的缺口体，其中寡核苷酸链中所有其他核苷酸间磷键联是磷酸二酯键联(天然磷酸酯键联)，例如像天然存在的DNA或RNA中所发现的那些，并且寡核苷酸链中所有其他核苷酸间磷键联是经修饰的核苷酸间键联(非天然核苷酸间键联)。
出于本披露的目的，化学元素根据以下来鉴别：Periodic Table of theElements[元素周期表]，CAS版本，Handbook of Chemistry and Physics[化学与物理手册]，第67版，1986-87，内封面。
除非另有说明，否则包括化合物(例如，寡核苷酸、药剂等)的盐(如，药学上可接受的酸或碱加成盐)、立体异构形式、和互变异构形式。除非另有说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确地指示(反之亦然)。因此，例如，提及的“一种化合物”可以包括多种此类化合物。
具体实施方式
合成的寡核苷酸在各种应用中提供有用的分子工具。例如，寡核苷酸可用于治疗、诊断、研究、和新的纳米材料应用。天然存在的核酸(例如，未经修饰的DNA或RNA)的使用受到限制，例如，它们对内切核酸酶和外切核酸酶的易感性。因此，已研发出各种合成对应物来避开这些缺点。这些包括合成的寡核苷酸，这些合成的寡核苷酸含有化学修饰(例如，碱基修饰、糖修饰、骨架修饰等)，这些化学修饰尤其使这些分子不易降解并改善寡核苷酸的其他特性。化学修饰也可能导致某些不希望的效果，例如增加的毒性等。从结构的角度来看，对天然磷酸酯键联的修饰可以引入手性，并且寡核苷酸的某些特性可能受到形成寡核苷酸的骨架的磷原子构型的影响。
在一些实施例中，寡核苷酸或寡核苷酸组合物是：DMD寡核苷酸或寡核苷酸组合物；包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸或寡核苷酸组合物；或包含非负电荷的核苷酸间键联的DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，骨架(例如，磷原子的构型)的手性、或包括在骨架中的天然磷酸酯键联或非天然核苷酸间键联、和/或糖和/或核碱基的修饰、和/或添加化学部分可以影响寡核苷酸的特性和活性，例如DMD寡核苷酸(例如，与肌营养不良蛋白(DMD)转录物序列反义的寡核苷酸)跳读一个或多个外显子的能力，和/或DMD寡核苷酸的其他特性(包括但不限于增加的稳定性、改善的药代动力学、和/或减少的免疫原性等)。用于评估提供的化合物(例如，寡核苷酸)及其组合物的特性和/或活性的适合的测定是本领域广泛已知的，并且可以依照本披露利用。例如，为了测试免疫原性，在小鼠血清中体内测试了各种DMD寡核苷酸并证明了最小的细胞因子激活，并且在人PBMC(外周血单核细胞)中离体测试了各种DMD寡核苷酸的细胞因子活性(例如IL-12p40、IL-12p70、IL-1α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、和TNF-α)。
在一些实施例中，本披露的技术(例如，寡核苷酸、组合物及其使用方法)可以用于靶向各种核酸(例如，通过与靶核酸的靶序列杂交和/或提供靶核酸等的水平降低、降解、剪接调节、转录抑制等)。在一些实施例中，提供的技术对于调节转录物的剪接(例如增加所希望的剪接产物的水平和/或降低不希望的剪接产物的水平)特别有用。在一些实施例中，提供的技术特别可用于降低转录物(例如，前mRNA、RNA等)的水平，并且在许多情况下，降低由此类转录物(如mRNA、蛋白质等)产生或编码的产物的水平。
在一些实施例中，转录物是前mRNA。在一些实施例中，剪接产物是成熟RNA。在一些实施例中，剪接产物是mRNA。在一些实施例中，剪接调节或改变包含一个或多个外显子的跳读。在一些实施例中，转录物的剪接得到改善，因为与不存在外显子跳读相比，外显子跳读增加了具有改善的有益活性的mRNA和蛋白质的水平。在一些实施例中，跳读引起移码的外显子。在一些实施例中，跳读包含不希望的突变的外显子。在一些实施例中，跳读包含提前终止密码子的外显子。不希望的突变可能是引起蛋白质序列变化的突变；它也可以是沉默突变。在一些实施例中，转录物是肌营养不良蛋白(DMD)的转录物。
在一些实施例中，转录物的剪接得到改善，因为与不存在外显子跳读相比，外显子跳读降低了具有不希望的活性的mRNA和蛋白质的水平。在一些实施例中，通过跳读外显子敲低靶标，其通过跳读一个或多个外显子而引起提前终止密码子和/或移码突变。在一些实施例中，提供的组合物中的提供的寡核苷酸(例如，多种中的寡核苷酸)包含碱基修饰、糖修饰和/或核苷酸间键联修饰。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含碱基修饰和糖修饰。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含碱基修饰和核苷酸间键联修饰。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含糖修饰和核苷酸间修饰。在一些实施例中，提供的组合物包含碱基修饰、糖修饰和核苷酸间键联修饰。示例化学修饰(如碱基修饰、糖修饰、核苷酸间键联修饰等)是本领域广泛已知的，其包括但不限于此披露中描述的那些。在一些实施例中，经修饰的碱基是经取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，糖修饰是2′-修饰。在一些实施例中，2′-修饰是2-F修饰。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OR1，其中R1不是氢。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OR1，其中R1是任选地经取代的烷基。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OMe。在一些实施例中，2′-修饰是2′-MOE。在一些实施例中，经修饰的糖部分是桥连双环或多环。在一些实施例中，经修饰的糖部分是具有5-20个环原子的桥连双环或多环，其中一个或多个环原子任选地且独立地是杂原子。示例环结构是本技术领域中广泛已知的，如BNA、LNA等中发现的那些环结构。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷酸间键联和一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，包含经修饰的核苷酸间键联及天然磷酸酯键联两者的寡核苷酸及其组合物提供改善的特性，例如活性和毒性等。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是经取代的硫代磷酸酯键联。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是带正电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联)包含任选地经取代的三唑基。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联)包含任选地经取代的炔基。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含三唑或炔基部分。在一些实施例中，三唑部分(例如三唑基基团)任选地被取代。在一些实施例中，三唑部分(例如三唑基基团)被取代。在一些实施例中，三唑部分是未经取代的。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含任选地经取代的胍部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含任选地经取代的环状胍部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含任选地经取代的环状胍部分，并且具有以下结构：
Figure BPA0000295055720000761
Figure BPA0000295055720000762
其中W是O或S。在一些实施例中，W是O。在一些实施例中，W是S。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是立体化学受控的。
在一些实施例中，包含任选地经取代的胍部分的核苷酸间键联是如本文所述的式I-n-2、I-n-3、I-n-4、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、或II-d-2的核苷酸间键联。在一些实施例中，包含任选地经取代的环状胍部分的核苷酸间键联是式II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、或II-d-2的核苷酸间键联。
除其他事项外，本披露涵盖了以下认识：立体随机寡核苷酸制剂含有多个不同的化学实体，这些化学实体例如，在寡核苷酸链内的单独的骨架键联磷手性中心的立体化学结构上彼此不同。在不控制骨架手性中心的立体化学的情况下，立体随机寡核苷酸制剂提供了不受控的组合物，该不受控的组合物包含相对于不受控的手性中心(例如，手性键联磷)的未确定水平的寡核苷酸立体异构体。即使这些立体异构体可以具有相同的碱基序列，但是至少由于其骨架立体化学不同，它们是不同的化学实体，并且它们可以具有如本文所证明的不同特性，例如活性、毒性等。除其他事项外，本披露提供了新的寡核苷酸组合物，其中一个或多个键联磷手性中心的立体化学独立地是受控的(例如，在手性受控的核苷酸间键联中)。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸组合物，这些手性受控的寡核苷酸组合物是或含有目的寡核苷酸的特定的立体异构体。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含水平增加的一种或多种同位素。在一些实施例中，提供的寡核苷酸例如经一种或多种元素(例如氢、碳、氮等)的一种或多种同位素标记。在一些实施例中，提供的组合物中的提供的寡核苷酸(例如，多种中的寡核苷酸)包含碱基修饰、糖修饰和/或核苷酸间键联修饰，其中这些寡核苷酸含有富集水平的氘。在一些实施例中，提供的寡核苷酸在一个或多个位置被氚标记(用-2H替换-1H)。在一些实施例中，寡核苷酸或与该寡核苷酸缀合的任何部分(例如靶向部分、脂质等)中的一个或多个1H被2H取代。此类寡核苷酸可用于本文所述的任何组合物或方法中。
在一些实施例中，在寡核苷酸中，骨架手性中心模式可以提供改善的一种或多种活性或一种多种特征，这些活性或特征包括但不限于：一个或多个外显子的改善的跳读、增加的稳定性、增加的活性、增加的稳定性和活性、低毒性、低免疫应答、改善的蛋白质结合特征、与某些蛋白质增加的结合、和/或增强的递送。
在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含S、SS、SSS、SSSS、SSSSS、SSSSSS、SSSSSSS、SOS、SSOSS、SSSOSSS、SSSSOSSSS、SSSSSOSSSSS、SSSSSSOSSSSSS、SSSSSSSOSSSSSSS、SSSSSSSSOSSSSSSSS、SSSSSSSSSOSSSSSSSSS、SOSOSOSOS、SSOSOSOSOSS、SSSOSOSOSOSSS、SSSSOSOSOSOSSSS、SSSSSOSOSOSOSSSSS、SSSSSSOSOSOSOSSSSSS、SOSOSSOOS、SSOSOSSOOSS、SSSOSOSSOOSSS、SSSSOSOSSOOSSSS、SSSSSOSOSSOOSSSSS、SSSSSSOSOSSOOSSSSSS、SOSOOSOOS、SSOSOOSOOSS、SSSOSOOSOOSSS、SSSSOSOOSOOSSSS、SSSSSOSOOSOOSSSSS、SSSSSSOSOOSOOSSSSSS、SOSOSSOOS、SSOSOSSOOSO、SSSOSOSSOOSOS、SSSSOSOSSOOSOSS、SSSSSOSOSSOOSOSSS、SSSSSSOSOSSOOSOSSSS、SOSOOSOOSO、SSOSOOSOOSOS、SSSOSOOSOOSOS、SSSSOSOOSOOSOSS、SSSSSOSOOSOOSOSSS、SSSSSSOSOOSOOSOSSSS、SSOSOSSOO、SSSOSOSSOOS、SSSSOSOSSOOS、SSSSSOSOSSOOSS、SSSSSSOSOSSOOSSS、OSSSSSSOSOSSOOSSS、OOSSSSSSOSOSSOOS、OOSSSSSSOSOSSOOSS、OOSSSSSSOSOSSOOSSS、OOSSSSSSOSOSSOOSSSS、OOSSSSSSOSOSSOOSSSSS、和/或OOSSSSSSOSOSSOOSSSSSS、RS、SR、SRS、SRSS、SSRS、RR、RRR、RRRR、RRRRR、SRR、RRS、SRRS、SSRRS、SRRSS、SRRR、RRRS、SRRRS、SSRRRS、SSRRRS、RSRRR、SRRRSR、SSSRSSS、SSSSRSSSS、SSSSSRSSSSS、SSSSSSRSSSSSS、SSSSSSSRSSSSSSS、SSSSSSSSRSSSSSSSS、SSSSSSSSSRSSSSSSSSS、SRSRSRSRS、SSRSRSRSRSS、SSSRSRSRSRSSS、SSSSRSRSRSRSSSS、SSSSSRSRSRSRSSSSS、SSSSSSRSRSRSRSSSSSS、SRSRSSRRS、SSRSRSSRRSS、SSSRSRSSRRSSS、SSSSRSRSSRRSSSS、SSSSSRSRSSRRSSSSS、SSSSSSRSRSSRRSSSSSS、SRSRRSRRS、SSRSRRSRRSS、SSSRSRRSRRSSS、SSSSRSRRSRRSSSS、SSSSSRSRRSRRSSSSS、SSSSSSRSRRSRRSSSSSS、SRSRSSRRS、SSRSRSSRRSR、SSSRSRSSRRSRS、SSSSRSRSSRRSRSS、SSSSSRSRSSRRSRSSS、SSSSSSRSRSSRRSRSSSS、SRSRRSRRSR、SSRSRRSRRSRS、SSSRSRRSRRSRS、SSSSRSRRSRRSRSS、SSSSSRSRRSRRSRSSS、SSSSSSRSRRSRRSRSSSS、SSRSRSSRR、SSSRSRSSRRS、SSSSRSRSSRRS、SSSSSRSRSSRRSS、SSSSSSRSRSSRRSSS、RSSSSSSRSRSSRRSSS、RRSSSSSSRSRSSRRS、RRSSSSSSRSRSSRRSS、RRSSSSSSRSRSSRRSSS、RRSSSSSSRSRSSRRSSSS、RRSSSSSSRSRSSRRSSSSS、(R)n(S)m、(S)t(R)n、(O)t(R)n(S)m、(S)t(O)m、(O)m(S)t、(S)t(R)n(S)m、(S)t(O)m(S)n、(S)t(O)m，其中t、m和n独立地是1至20，O是非手性核苷酸间键联，R是Rp手性核苷酸间键联，而S是Sp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，非手性中心为磷酸二酯键联。在一些实施例中，呈Sp构型的手性中心是硫代磷酸酯键联。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸的5′-端区域(例如5′-翼)包含S、SS、SSS、SSSS、SSSSS、SSSSSS、或SSSSSS的立体化学模式。在一些实施例中，每个S是或表示Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的5′-端区域(例如5′-翼)包含S、SS、SSS、SSSS、SSSSS、SSSSSS、或SSSSSS的立体化学模式，其中第一个S表示提供的寡核苷酸的第一个(5′-端)核苷酸间键联。在一些实施例中，在5′-端区域中包含Sp核苷酸间键联的一个或多个核苷酸单元独立地包含-F。在一些实施例中，在5′-端区域中包含Sp核苷酸间键联的每个核苷酸单元独立地包含-F。在一些实施例中，在5′-端区域中包含Sp核苷酸间键联的一个或多个核苷酸单元独立地包含糖修饰。在一些实施例中，在5′-端区域中包含Sp核苷酸间键联的每个核苷酸单元独立地包含糖修饰。在一些实施例中，每个2′-修饰均相同。在一些实施例中，糖修饰是2′-修饰。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OR1。在一些实施例中，2′-修饰是2′-F。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的3′-端区域(例如3′-翼)包含S、SS、SSS、SSSS、SSSSS、SSSSSS、或SSSSSS的立体化学模式。在一些实施例中，每个S是或表示Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的3′-端区域(例如3′-翼)包含S、SS、SSS、SSSS、SSSSS、SSSSSS、或SSSSSS的立体化学模式，其中最后一个S表示提供的寡核苷酸的最后一个(3′-端)核苷酸间键联。在一些实施例中，每个S表示Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，在3′-端区域中包含Sp核苷酸间键联的一个或多个核苷酸单元独立地包含-F。在一些实施例中，在3′-端区域中包含Sp核苷酸间键联的每个核苷酸单元独立地包含-F。在一些实施例中，在3′-端区域中包含Sp核苷酸间键联的一个或多个核苷酸单元独立地包含糖修饰。在一些实施例中，在3′-端区域中包含Sp核苷酸间键联的每个核苷酸单元独立地包含糖修饰。在一些实施例中，每个2′-修饰均相同。在一些实施例中，糖修饰是2′-修饰。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OR1。在一些实施例中，2′-修饰是2′-F。在一些实施例中，提供的寡核苷酸同时包含如本文所述的5′-端区域(例如5′-翼)和3′-端区域(例如3′-端翼)两者。在一些实施例中，5′-端区域包含SS的立体化学模式，其中第一个S表示提供的寡核苷酸的第一个核苷酸间键联；3′-端区域包含SS的立体化学模式，其中在5′-或3′-端区域中包含Sp核苷酸间键联的一个或多个核苷酸单元包含-F。在一些实施例中，5′-端区域包含SS的立体化学模式，其中第一个S表示提供的寡核苷酸的第一个核苷酸间键联；3′-端区域包含SS的立体化学模式，其中在5′-或3′-端区域中包含Sp核苷酸间键联的一个或多个核苷酸单元包含2′-F糖修饰。在一些实施例中，提供的寡核苷酸还包含在5′-端和3′-端区域之间的中间区域，例如核心区域，其包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸还包含在5′-端和3′-端区域之间的中间区域，例如核心区域，其包含一个或多个天然磷酸酯键联和一个或多个核苷酸间键联。在一些实施例中，中间区域包含一个或多个糖部分，其中每个糖部分独立地包含2′-OR1修饰。在一些实施例中，中间区域包含一个或多个糖部分，这些糖部分不包含2′-F修饰。在一些实施例中，中间区域包含一个或多个Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，中间区域包含一个或多个Sp核苷酸间键联以及一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，中间区域包含一个或多个Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，中间区域包含一个或多个Rp核苷酸间键联以及一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，中间区域包含一个或多个Rp核苷酸间键联以及一个或多个Sp核苷酸间键联。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个手性经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个手性受控的手性经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷酸间键联和一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含三唑、经取代的三唑、炔基或Tmg。
在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的核酸，该经修饰的核苷酸间键联包含三唑或炔基部分。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的核酸，该经修饰的核苷酸间键联包含任选地经取代的三唑基或炔基。在一些实施例中，这种核酸是siRNA、双链siRNA、单链siRNA、寡核苷酸、缺口体、跳过体、嵌段体、反义寡核苷酸、antagomir、微小RNA、前微小RNA、antimir、supermir、核酶、Ul衔接子、RNA激活子、RNAi剂、诱饵寡核苷酸、形成三链体的寡核苷酸、适体或助剂。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸，该经修饰的核苷酸间键联包含三唑或炔基部分。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的DMD寡核苷酸，该经修饰的核苷酸间键联包含三唑或炔基部分。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的核酸，该经修饰的核苷酸间键联包含三唑部分。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的核酸，该经修饰的核苷酸间键联包含任选地经取代的三唑基。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的核酸，该经修饰的核苷酸间键联包含经取代的三唑部分。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的核酸，该经修饰的核苷酸间键联包含炔基部分。在一些实施例中，本披露涉及核酸或寡核苷酸，其在5’端包含以下式的结构：
Figure BPA0000295055720000801
其中W是O或S。在一些实施例中，寡核苷酸是单链siRNA，其在5′端包含以下式的结构：
Figure BPA0000295055720000811
其中W是O或S。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是在以下中描述的任何经修饰的核苷酸间键联：Krishna等人，2012J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]134：11618-11631。
在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的核酸，该经修饰的核苷酸间键联包含胍部分。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的核酸，该经修饰的核苷酸间键联包含环状胍部分。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的核酸，该经修饰的核苷酸间键联包含环状胍部分并且具有以下结构：
Figure BPA0000295055720000812
其中W是O或S。在一些实施例中，中性核苷酸间键联或包含环状胍的核苷酸间键联是手性受控的。在一些实施例中，包含非负电荷的核苷酸间键联或经修饰的核苷酸间键联(含有环状胍部分)的核酸是siRNA、双链siRNA、单链siRNA、寡核苷酸、缺口体、跳过体、嵌段体、反义寡核苷酸、antagomir、微小RNA、前微小RNA、antimir、supermir、核酶、Ul衔接子、RNA激活子、RNAi剂、诱饵寡核苷酸、形成三链体的寡核苷酸、适体或助剂。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸，该经修饰的核苷酸间键联包含环状胍部分。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸，该经修饰的核苷酸间键联具有以下结构：
Figure BPA0000295055720000813
其中W是O或S。在一些实施例中，中性核苷酸间键联或包含环状胍部分的核苷酸间键联是手性受控的。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的DMD寡核苷酸，该经修饰的核苷酸间键联包含环状胍部分。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的DMD寡核苷酸，该经修饰的核苷酸间键联具有以下结构：
Figure BPA0000295055720000814
其中W是O或S。在一些实施例中，中性核苷酸间键联或包含环状胍部分的核苷酸间键联是手性受控的。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的核酸，该经修饰的核苷酸间键联包含环状胍部分。在一些实施例中，本披露涉及包含经修饰的核苷酸间键联的核酸，该经修饰的核苷酸间键联具有以下结构：
Figure BPA0000295055720000821
其中W是O或S。在一些实施例中，本披露涉及核酸或寡核苷酸，其在5’端包含含有环状胍部分的结构。在一些实施例中，本披露涉及核酸或寡核苷酸，其在5’端包含以下式的结构：
Figure BPA0000295055720000822
其中W是O或S。在一些实施例中，寡核苷酸是单链siRNA，其在5’端包含含有环状胍部分的结构。在一些实施例中，寡核苷酸是单链siRNA，其在5′端包含以下式的结构：
Figure BPA0000295055720000823
其中W是O或S。在一些实施例中，核苷酸间键联包含
Figure BPA0000295055720000824
(其中W是O或S)并且是手性受控的。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸可结合至转录物并改变转录物的剪接模式。在一些实施例中，提供的寡核苷酸提供了外显子的外显子跳读，效率大于在一个或多个合适的条件(例如，如本文所述的条件)下相当的寡核苷酸。在一些实施例中，提供的跳读效率是在一个或多个合适的条件(例如，如本文所述的条件)下相当的寡核苷酸的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或更多，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多倍。在一些实施例中，相当的寡核苷酸是在其他方面相同但具有较少或不具有手性受控的核苷酸间键联、和/或具有较少或不具有非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露证明了2′-F修饰尤其可以改善外显子跳读效率。在一些实施例中，本披露证明，在5’和及3′-端的Sp核苷酸间键联尤其可改善寡核苷酸稳定性。在一些实施例中，本披露证明，天然磷酸酯键联和/或Rp核苷酸间键联尤其可改善寡核苷酸自系统的移除。如本领域普通技术人员所理解的，可采用本技术领域中已知的各种测定来评定依照本披露的此类特性。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的糖部分。在一些实施例中，经修饰的糖部分包含2′-修饰。在一些实施例中，经修饰的糖部分包含2′-修饰。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OR1。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OMe。在一些实施例中，2′-修饰是2′-MOE。在一些实施例中，2′-修饰是LNA糖修饰。在一些实施例中，2′-修饰是2′-F。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-修饰。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F，其中R1是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F，其中至少一个是2′-F。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F，其中R1是任选地经取代的C1-6烷基，并且其中至少一个是2′-OR1。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F，其中至少一个是2′-F，且至少一个是2′-OR1。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F，其中R1是任选地经取代的C1-6烷基，并且其中至少一个是2′-F，且至少一个是2′-OR1。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸中5％或更多的糖部分经修饰。在一些实施例中，提供的寡核苷酸中5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的糖部分经修饰。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的每个糖部分是经修饰的。在一些实施例中，经修饰的糖部分包含2′-修饰。在一些实施例中，经修饰的糖部分包含2′-修饰。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OR1。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OMe。在一些实施例中，2′-修饰是2′-MOE。在一些实施例中，2′-修饰是LNA糖修饰。在一些实施例中，2′-修饰是2′-F。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-修饰。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F，其中R1是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F，其中至少一个是2′-F。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F，其中R1是任选地经取代的C1-6烷基，并且其中至少一个是2′-OR1。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F，其中至少一个是2′-F，且至少一个是2′-OR1。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2′-OR1或2′-F，其中R1是任选地经取代的C1-6烷基，并且其中至少一个是2′-F，且至少一个是2′-OR1。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个2′-F。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含两个或更多个2′-F。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含交替的经2′-F修饰的糖部分和经2′-OR1修饰的糖部分。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含交替的经2′-F修饰的糖部分和经2′-OMe修饰的糖部分，例如[(2′-F)(2′-OMe)]x、[(2′-OMe)(2′-F)]x等，其中x是1-50。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含至少两对交替的2′-F及2′-OMe修饰。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含交替的磷酸二酯及硫代磷酸酯核苷酸间键联，例如[(PO)(PS)]x、[(PS)(PO)]x等，其中x是1-50。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含至少两对交替的磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个天然磷酸酯键联和一个或多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个天然磷酸酯键联和一个或多个经修饰的核苷酸间键联以及一个或多个非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露提供了包含多种寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中：
该多种寡核苷酸具有相同的碱基序列；并且
该多种中的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的糖部分，或包含一个或多个天然磷酸酯键联和一个或多个经修饰的核苷酸间键联。
在一些实施例中，多种中的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的糖部分。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的糖部分。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含2个或更多个经修饰的糖部分。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含3个或更多个经修饰的糖部分。
在一些实施例中，提供的组合物改变转录物剪接，使得不希望的靶标和/或生物学功能被抑制。
在一些实施例中，提供的组合物改变转录物剪接，从而增强了所希望的靶标和/或生物学功能。
在一些实施例中，多种中每个寡核苷酸包含一个或多个经修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间键联。
在一些实施例中，多种中每个寡核苷酸包含不超过约25个连续未经修饰的糖部分
在一些实施例中，多种中每个寡核苷酸包含不超过约95％的未经修饰的糖部分。在一些实施例中，多种中每个寡核苷酸包含不超过约90％的未经修饰的糖部分。在一些实施例中，多种中每个寡核苷酸包含不超过约85％的未经修饰的糖部分。在一些实施例中，多种中每个寡核苷酸包含不超过约15个连续未经修饰的糖部分。
在一些实施例中，多种中每个寡核苷酸包含不超过约95％的未经修饰的糖部分。
在一些实施例中，多种中每个寡核苷酸包含两个或更多个经修饰的核苷酸间键联。
在一些实施例中，多种中每个寡核苷酸中约5％的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
在一些实施例中，多种中每个寡核苷酸包含不超过约25个连续天然磷酸酯键联。在一些实施例中，多种中每个寡核苷酸包含不超过约20个天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，多种中的寡核苷酸不包含天然DNA核苷酸单元。在一些实施例中，多种中的寡核苷酸包含不超过30个天然DNA核苷酸。在一些实施例中，多种中的寡核苷酸包含不超过30个连续DNA核苷酸。
在一些实施例中，与参考条件相比，提供的手性受控的寡核苷酸组合物出人意料地有效。在一些实施例中，所希望的生物效应(例如，如通过所希望的mRNA、蛋白质等的增加的水平，不希望的mRNA、蛋白质等的降低的水平所测量的)可以被增强超过5、10、15、20、25、30、40、50或100倍。在一些实施例中，通过相比于参考条件的所希望的mRNA水平的增加来测量改变。在一些实施例中，通过相比于参考条件的不希望的mRNA水平的降低来测量改变。在一些实施例中，参考条件是不存在寡核苷酸处理。在一些实施例中，参考条件是具有相同碱基序列和化学修饰的寡核苷酸的立体随机组合物。
在一些实施例中，所希望的生物效应是：一个或多个外显子的改善的跳读、增加的稳定性、增加的活性、增加的稳定性和活性、低毒性、低免疫应答、改善的蛋白质结合特征、与某些蛋白质增加的结合、和/或增强的递送。在一些实施例中，所希望的生物效应增强超过2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、或500倍。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸的结构是或包含翼-核心-翼、翼-核心、或核心-翼结构。在一些实施例中，5′-翼是5′-端区域。在一些实施例中，3′-翼是3′-端区域。在一些实施例中，核心是中间区域。在一些实施例中，5′-端区域是5′-翼区域。在一些实施例中，3′-端区域是3′-翼区域。在一些实施例中，中间区域是核心区域。
在一些实施例中，具有翼-核心-翼结构的寡核苷酸称为缺口体。在一些实施例中，缺口体是不对称的，因为一个翼的化学不同于另一翼的化学。在一些实施例中，缺口体是不对称的，因为一个翼的化学不同于另一翼的化学，其中这些翼的糖修饰和/或核苷酸间键联或其模式不同。在一些实施例中，缺口体是不对称的，因为一个翼的化学不同于另一翼的化学，其中这些翼的糖修饰不同，其中一个翼包含在另一翼中不存在的糖修饰；或两个翼各自包含另一翼中未发现的糖修饰；或两个翼均包含相同类型糖修饰的不同模式；或一个翼仅包含一种类型的糖修饰，而另一翼包含两种类型的糖修饰；等。
在一些实施例中，翼区域和核心区域之间的核苷酸间键联被认为是翼区域的一部分。在一些实施例中，5′-翼区域和核心区域之间的核苷酸间键联被认为是翼区域的一部分。在一些实施例中，3′-翼区域和核心区域之间的核苷酸间键联被认为是翼区域的一部分。在一些实施例中，翼区域和核心区域之间的核苷酸间键联被认为是核心区域的一部分。在一些实施例中，5′-翼区域和核心区域之间的核苷酸间键联被认为是核心区域的一部分。在一些实施例中，3′-翼区域和核心区域之间的核苷酸间键联被认为是核心区域的一部分。
在一些实施例中，区域(例如，翼区域、核心区域、5′-端区域、中间区域、3′-端区域等)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷单元。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含两个翼和一个核心区域。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含5′-翼-核心-翼-3’结构。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有5′-翼-核心-翼-3’缺口体结构。在一些实施例中，两个翼区域是相同的。在一些实施例中，两个翼区域是不同的。在一些实施例中，两个翼区域在化学修饰方面是相同的。在一些实施例中，两个翼区域在2′-修饰方面是相同的。在一些实施例中，两个翼区域在核苷酸间键联修饰方面是相同的。在一些实施例中，两个翼区域在骨架手性中心模式方面是相同的。在一些实施例中，两个翼区域在骨架键联模式方面是相同的。在一些实施例中，两个翼区域在骨架键联类型模式方面是相同的。在一些实施例中，两个翼区域在骨架磷修饰模式方面是相同的。
可以将翼区域与核心区域区分开，因为翼区域含有与核心区域不同的结构特征。例如，在一些实施例中翼区域与核心区域的不同之处在于它们具有不同的糖修饰、碱基修饰、核苷酸间键联、核苷酸间键联立体化学等。在一些实施例中，翼区域与核心区域的不同之处在于它们具有不同的糖的2′-修饰。
在一些实施例中，区域(例如，翼区域、核心区域、5′-端区域、中间区域、3′-端区域等)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含2个或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含3个或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含4个或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含5个或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含6个或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含7个或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含8个或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含9个或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含10个或更多个经修饰的核苷酸间键联。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含连续的核苷单元，每个连续的核苷单元不包含2′-OR1修饰(其中R1不是氢)。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含连续的核苷单元，这些核苷单元的2′-位置独立地未经取代或经2′-F取代。在一些实施例中，这种寡核苷酸是DMD寡核苷酸。在一些实施例中，每个连续的核苷单元独立地在经修饰的核苷酸间键联之前和/或之后。在一些实施例中，每个连续的核苷单元独立地在硫代磷酸酯键联之前和/或之后。在一些实施例中，每个连续的核苷单元独立地在手性受控的经修饰的核苷酸间键联之前和/或之后。在一些实施例中，每个连续的核苷单元独立地在手性受控的硫代磷酸酯键联之前和/或之后。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III等或其盐形式。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联具有式I或其盐形式的结构。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联具有式I-a或其盐形式的结构。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是带正电的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等或其盐形式。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的3-20元杂环基或杂芳基基团。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的3-20元杂环基或杂芳基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，此类杂环基或杂芳基基团具有5元环。在一些实施例中，此类杂环基或杂芳基基团具有6元环。
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂芳基基团。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂芳基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5-6元杂芳基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5元杂芳基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，杂芳基基团直接与键联磷键合。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含任选地经取代的三唑基基团。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含未经取代的三唑基基团，例如，
Figure BPA0000295055720000891
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含经取代的三唑基基团，例如，
Figure BPA0000295055720000892
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂环基基团。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂环基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5-6元杂环基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5元杂环基基团，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，至少两个杂原子是氮。在一些实施例中，杂环基基团直接与键联磷键合。在一些实施例中，当杂环基基团是通过其＝N-直接与键联磷键合的胍部分的一部分时，杂环基基团通过接头(例如＝N-)与键联磷键合。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含任选地经取代的
Figure BPA0000295055720000893
基团。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含任选地经取代的
Figure BPA0000295055720000894
基团。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含经取代的
Figure BPA0000295055720000895
基团。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含
Figure BPA0000295055720000896
基团。在一些实施例中，每个R1独立地是任选地经取代的C1-20烷基。在一些实施例中，每个R1独立地是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个R1独立地是甲基。在一些实施例中，两个R1基团不同；例如，在一些实施例中，一个R1为甲基，而另一个为-CH2(CH2)10CH3。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联)包含三唑或炔基部分，其各自任选地被取代。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含三唑部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含未经取代的三唑部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含经取代的三唑部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含烷基部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含任选地经取代的炔基基团。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含未经取代的炔基基团。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含经取代的炔基基团。在一些实施例中，炔基基团直接与键联磷键合。
在一些实施例中，包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸可包含本文所述的任何结构、形式或其部分。在一些实施例中，包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸可包含本文所述的作为DMD寡核苷酸的组分的任何结构、形式或其部分。在一些实施例中，被描述为任何DMD寡核苷酸的组分的任何结构、形式或其部分可以用于包含非负电荷的核苷酸间键联的任何寡核苷酸中，无论该寡核苷酸是否靶向DMD，或该寡核苷酸是否能够介导DMD外显子的跳读。在一些实施例中，包含非负电荷的核苷酸间的寡核苷酸是双链或单链的。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，这些参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。在一些实施例中，所希望的剪接产物增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000倍或更多。在一些实施例中，在参考条件下不存在所希望的剪接参考(例如，不能通过定量PCR可靠地检测)。在一些实施例中，如本披露中所例示，在提供的组合物中的多个寡核苷酸(例如多种寡核苷酸)的水平是预定的。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸(例如，提供的组合物中的多种中的寡核苷酸)包含两个或更多个区域。在一些实施例中，提供了包含5′-端区域、3′-端区域以及在它们之间的中间区域。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有两个翼和一个核心区域。在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有翼-核心-翼结构。在一些实施例中，两个翼区域是相同的。在一些实施例中，两个翼区域是不同的。在一些实施例中，5′-端区域是5′-翼区域。在一些实施例中，5′-翼区域是5′-端区域。在一些实施例中，3′-端区域是3′-翼区域。在一些实施例中，3′-翼区域是3′-端区域。在一些实施例中，核心区域是中间区域。
在一些实施例中，区域(例如，5′-翼区域、3′-翼区域、核心区域、5′-端区域、中间区域等)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷单元。在一些实施例中，区域包含2个或更多个核苷单元。在一些实施例中，区域包含3个或更多个核苷单元。在一些实施例中，区域包含4个或更多个核苷单元。在一些实施例中，区域包含5个或更多个核苷单元。在一些实施例中，区域包含6个或更多个核苷单元。在一些实施例中，区域包含7个或更多个核苷单元。在一些实施例中，区域包含8个或更多个核苷单元。在一些实施例中，区域包含9个或更多个核苷单元。在一些实施例中，区域包含10个或更多个核苷单元。
在一些实施例中，区域(例如，5′-翼区域、3′-翼区域、核心区域、5′-端区域、中间区域等)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含2个或更多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，一个或多个经修饰的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，区域包含2个或更多个连续的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域中的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联，其中每个手性核苷酸间键联任选地并且独立地是手性受控的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联或经修饰的核苷酸间键联具有式I或其盐形式的结构。在一些实施例中，手性核苷酸间键联或经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联或经修饰的核苷酸间键联独立地具有式I或其盐形式的结构。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联或经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，区域包含3个或连续的经修饰的核苷酸间键联。
在一些实施例中，翼区域包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，核心区域包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，5′-端区域包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，3′-端区域包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，中间区域包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，一个或多个天然磷酸酯键联是连续的。
在一些实施例中，天然磷酸酯键联在其中糖部分包含2′-OR1修饰(其中R1不是氢)的核苷单元之后(例如，连接至糖部分的3′-位置)或之前(例如，连接至糖部分的5′-位置)。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联全部或大部分(例如，55％、60％、70％、80％、90％、95％等)在其中糖部分不包含2′-OR1修饰(其中R1不是氢)的核苷单元(例如，在2′-位置具有两个2′-H的那些、在2′-位置具有2′-H和2′-F的(经2′-F修饰的)那些等)之后(例如，连接至糖部分的3′-位置)或之前(例如，连接至糖部分的5′-位置)。
在一些实施例中，区域包含一个或多个核苷单元，这些核苷单元包含糖修饰，例如2′-F、2′-OR1、LNA糖修饰等。在一些实施例中，区域中的每个糖独立地经修饰。在一些实施例中，翼、5′-端区域和/或3′-端区域中的每个糖部分经修饰。在一些实施例中，修饰是2′-修饰。在一些实施例中，修饰可以增加稳定性，例如其中R1不是-H(例如，是任选地经取代的C1-6脂肪族)的2′-OR1、LNA糖修饰等。在一些实施例中，区域(例如，核心区域或中间区域)不包含糖修饰(或不包含2′-OR1糖修饰/LNA修饰等)。在一些实施例中，这种核心/中间区域可以与RNA形成双链体以用于识别/结合蛋白质(例如RNA酶H)，以使蛋白质执行其一个或多个功能(例如，在RNA酶H的情况下，其与DNA/RNA双链体的结合和切割)。
区域和/或提供的寡核苷酸可以具有各种骨架手性中心模式。在一些实施例中，区域中的每个核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联并且是Sp。在一些实施例中，5′-端和/或3′-端核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联并且是Sp。在一些实施例中，翼区域、5′-端区域和/或3′-端区域的骨架手性中心模式是或包含5′-端和/或3′-端核苷酸间键联，其是手性受控的核苷酸间键联并且是Sp，该区域中的其他核苷酸间键联独立地是天然磷酸酯键联、经修饰的核苷酸间键联或手性受控的核苷酸间键联(Sp或Rp)。在一些实施例中，此类模式提供稳定性。在本披露中描述了许多示例骨架手性中心模式。
在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸组合物，其包含由具有以下而定义的多种寡核苷酸：
1)共同的碱基序列；
2)共同的骨架键联模式；和
3)共同的骨架手性中心模式，该组合物是单一寡核苷酸的基本上纯的制剂，因为该组合物中受控水平的寡核苷酸具有共同的碱基序列和长度、共同的骨架键联模式、和共同的骨架手性中心模式。
在一些实施例中，具有共同的碱基序列的寡核苷酸可以具有相同的核苷修饰(例如糖修饰、碱基修饰等)模式。在一些实施例中，核苷修饰模式可以由位置和修饰的组合表示。在一些实施例中，可以省略所有非手性键联(例如，PO)。在一些实施例中，具有相同的碱基序列的寡核苷酸具有相同的构造。
如本领域普通技术人员所理解的，通过核苷酸单体的非立体选择性和/或低立体选择性偶联来制备寡核苷酸的立体随机或外消旋制剂，通常不使用任何手性助剂、手性修饰试剂、和/或手性催化剂。在一些实施例中，在基本上外消旋(或手性不受控的)的寡核苷酸制剂中，所有或大多数偶联步骤不是手性受控的，因为偶联步骤没有特异性地进行以提供增强的立体选择性。寡核苷酸的示例基本上外消旋制剂是从常用的亚磷酰胺寡核苷酸合成(本领域熟知的方法)，通过用二硫代四乙基秋兰姆或(TETD)或3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物(BDTD)硫化亚磷酸三酯来制备硫代磷酸酯寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸的基本上外消旋制剂提供了基本上外消旋的寡核苷酸组合物(或手性不受控的寡核苷酸组合物)。在一些实施例中，核苷酸单体的至少一个偶联具有低于约60∶40、70∶30、80∶20、85∶15、90∶10、91∶9、92∶8、97∶3、98∶2、或99∶1的非对映选择性。在一些实施例中，每个核苷酸间键联独立地具有小于约60∶40、70∶30、80∶20、85∶15、90∶10、91∶9、92∶8、97∶3、98∶2、或99∶1的非对映选择性。在一些实施例中，非对映选择性小于约60∶40。在一些实施例中，非对映选择性小于约70∶30。在一些实施例中，非对映选择性小于约80∶20。在一些实施例中，非对映选择性小于约90∶10。在一些实施例中，非对映选择性小于约91∶9。在一些实施例中，至少一个核苷酸间键联具有小于约90∶10的非对映选择性。在一些实施例中，至少两个核苷酸间键联具有小于约90∶10的非对映选择性。在一些实施例中，至少三个核苷酸间键联具有小于约90∶10的非对映选择性。在一些实施例中，至少四个核苷酸间键联具有小于约90∶10的非对映选择性。在一些实施例中，至少五个核苷酸间键联具有小于约90∶10的非对映选择性。在一些实施例中，每个核苷酸间键联独立地具有小于约90∶10的非对映选择性。在一些实施例中，非手性受控的核苷酸间键联具有不超过90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、或55％的非对映异构体纯度。在一些实施例中，纯度不超过90％。在一些实施例中，纯度不超过85％。在一些实施例中，纯度不超过80％。
相反，在手性受控的寡核苷酸组合物中，相对于手性键联磷，至少一种且通常每种手性受控的核苷酸间键联(如，手性受控的寡核苷酸组合物的寡核苷酸的那些)独立地具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的非对映异构体纯度。在一些实施例中，非对映异构体纯度是95％或更多。在一些实施例中，非对映异构体纯度是96％或更多。在一些实施例中，非对映异构体纯度是97％或更多。在一些实施例中，非对映异构体纯度是98％或更多。在一些实施例中，非对映异构体纯度是99％或更多。除其他事项外，本披露的技术通常提供具有高非对映异构体纯度的手性受控的核苷酸间键联。
如本领域普通技术人员所理解的，可以通过二聚体形成的非对映选择性/在相同的或相当的条件下形成的二聚体的核苷酸间键联的非对映异构体纯度来评估偶联的非对映选择性或核苷酸间键联的非对映异构体纯度(diastereomeric purity)(非对映纯度)，其中二聚体具有相同的5′-和3′-核苷和核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露提供了手性受控的(和/或立体化学纯的)寡核苷酸组合物，其包含由具有以下而定义的多种寡核苷酸：
1)共同的碱基序列；
2)共同的骨架键联模式；和
3)共同的骨架手性中心模式，该组合物是单一寡核苷酸的基本上纯的制剂，因为该组合物中至少约10％的寡核苷酸具有共同的碱基序列和长度、共同的骨架键联模式、和共同的骨架手性中心模式。
在一些实施例中，本披露提供了多种寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸组合物，其中相对于相同的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该组合物富集单一寡核苷酸类型的寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了多种寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸组合物，其中相对于相同的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该组合物富集通过以下定义的单一寡核苷酸类型的寡核苷酸：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式。
在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸组合物，该手性受控的寡核苷酸组合物包含通过以下定义的特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式。
其中相对于具有相同碱基序列和长度的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该组合物富集特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。
在一些实施例中，具有共同的碱基序列、共同的骨架键联模式和共同的骨架手性中心模式的寡核苷酸具有共同的骨架磷修饰模式和共同的碱基修饰模式。在一些实施例中，具有共同的碱基序列、共同的骨架键联模式和共同的骨架手性中心模式的寡核苷酸具有共同的骨架磷修饰模式和共同的核苷修饰模式。在一些实施例中，具有共同的碱基序列、共同的骨架键联模式和共同的骨架手性中心模式的寡核苷酸具有相同的结构。
在一些实施例中，寡核苷酸类型的寡核苷酸具有共同的骨架磷修饰模式和共同的糖修饰模式。在一些实施例中，寡核苷酸类型的寡核苷酸具有共同的骨架磷修饰模式和共同的碱基修饰模式。在一些实施例中，寡核苷酸类型的寡核苷酸具有共同的骨架磷修饰模式和共同的核苷修饰模式。在一些实施例中，特定类型的寡核苷酸具有相同的构造。在一些实施例中，寡核苷酸类型的寡核苷酸是相同的。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是寡核苷酸类型的基本上纯的制剂，因为该组合物中并非该寡核苷酸类型的寡核苷酸在所述寡核苷酸类型的制备过程中(在一些情况下在某些纯化步骤之后)是杂质形式。
在一些实施例中，组合物中的寡核苷酸的至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％具有共同的碱基序列、共同的骨架键联模式和共同的骨架手性中心模式。
在一些实施例中，具有共同的碱基序列、共同的骨架键联模式和共同的骨架手性中心模式的寡核苷酸具有共同的骨架磷修饰模式。在一些实施例中，具有共同的碱基序列、共同的骨架键联模式和共同的骨架手性中心模式的寡核苷酸具有共同的骨架磷修饰模式和共同的核苷修饰模式。在一些实施例中，具有共同的碱基序列、共同的骨架键联模式和共同的骨架手性中心模式的寡核苷酸具有共同的骨架磷修饰模式和共同的糖修饰模式。在一些实施例中，具有共同的碱基序列、共同的骨架键联模式和共同的骨架手性中心模式的寡核苷酸具有共同的骨架磷修饰模式和共同的碱基修饰模式。在一些实施例中，具有共同的碱基序列、共同的骨架键联模式和共同的骨架手性中心模式的寡核苷酸是相同的。
在一些实施例中，寡核苷酸类型的手性受控的寡核苷酸组合物的纯度表示为组合物中的寡核苷酸是该寡核苷酸类型的百分比。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约10％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约20％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约30％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约40％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约50％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约60％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约70％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约80％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约90％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约92％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约94％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约95％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约96％的寡核苷酸是相同寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约97％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约98％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中的至少约99％的寡核苷酸是该寡核苷酸类型。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物的纯度可以通过其制备过程中的每个偶联步骤的立体选择性而控制。在一些实施例中，偶联步骤具有60％的立体选择性(例如，非对映选择性)(由偶联步骤形成的新的核苷酸间键联的60％具有预期的立体化学)。在这种偶联步骤后，形成的新的核苷酸间键联可以被称为具有60％的纯度。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少60％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少70％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少80％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少85％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少90％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少91％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少92％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少93％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少94％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少95％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少96％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少97％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少98％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少99％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有至少99.5％的立体选择性。在一些实施例中，每个偶联步骤具有几乎100％的立体选择性。在一些实施例中，偶联步骤具有几乎100％的立体选择性，因为根据分析方法(例如，NMR、HPLC、使用立体选择性地切割硫代磷酸酯的核酸酶等)，来自偶联步骤的所有可检测产物都具有预期的立体选择性。在一些实施例中，寡核苷酸中的手性核苷酸间键联的立体选择性可通过模型反应测量，例如在基本上相同或相当的条件下形成二聚体，其中二聚体与手性核苷酸间键联具有相同的核苷酸间键联、二聚体的5′-核苷与手性核苷酸间键联的5′-端的核苷相同、并且二聚体的3′-核苷与手性核苷酸间键联的3′-端的核苷相同(例如，对于fU*SfU＊SfC*SfU，通过fU*SfC的二聚体)。如本领域普通技术人员所理解的，制剂中具有n个手性受控的核苷酸间键联的特定类型寡核苷酸的百分比可以计算为DP1*DP2*DP3*...DPn，其中DP1、DP2、DP3......和DPn各自独立地是第1、第2、第3......和第n个手性受控的核苷酸间键联的非对映异构体纯度。在一些实施例中，DP1、DP2、DP3......和DPn各自独立地是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97％或99％或更高。在一些实施例中，DP1、DP2、DP3......和DPn各自独立地是95％或更高。
在一些实施例中，在提供的组合物中，具有特定寡核苷酸类型(由1)碱基序列；2)骨架键联模式；3)骨架手性中心模式；和4)骨架磷修饰模式定义)的碱基序列的寡核苷酸的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97％或99％是特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。在一些实施例中，具有特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式、和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97％或99％是特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中特定类型的寡核苷酸与寡核苷酸的立体随机制剂(特定类型的寡核苷酸在通常被认为占1/2n部分的具有特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式(其中n是手性核苷酸间键联的数目)的寡核苷酸、以及具有特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式但并非特定寡核苷酸类型的寡核苷酸时，通常被认为占[1-(1/2n)]部分的具有特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的寡核苷酸)相比，富集至少5倍(特定类型的寡核苷酸在占5*(1/2n)部分的具有特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式(其中n是手性核苷酸间键联的数目)的寡核苷酸、或具有特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式但并非特定寡核苷酸类型的寡核苷酸时，占不超过[1-(1/2n)]/5部分的具有特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的寡核苷酸)。在一些实施例中，富集是至少20倍。在一些实施例中，富集是至少30倍。在一些实施例中，富集是至少40倍。在一些实施例中，富集是至少50倍。在一些实施例中，富集是至少60倍。在一些实施例中，富集是至少70倍。在一些实施例中，富集是至少80倍。在一些实施例中，富集是至少90倍。在一些实施例中，富集是至少100倍。在一些实施例中，富集是至少20,000倍。在一些实施例中，富集是至少(1.5)n。在一些实施例中，富集是至少(1.6)n。在一些实施例中，富集是至少(1.7)n。在一些实施例中，富集是至少(1.1)n。在一些实施例中，富集是至少(1.8)n。在一些实施例中，富集是至少(1.9)n。在一些实施例中，富集是至少2n。在一些实施例中，富集是至少3n。在一些实施例中，富集是至少4n。在一些实施例中，富集是至少5n。在一些实施例中，富集是至少6n。在一些实施例中，富集是至少7n。在一些实施例中，富集是至少8n。在一些实施例中，富集是至少9n。在一些实施例中，富集是至少10n。在一些实施例中，富集是至少15n。在一些实施例中，富集是至少20n。在一些实施例中，富集是至少25n。在一些实施例中，富集是至少30n。在一些实施例中，富集是至少40n。在一些实施例中，富集是至少50n。在一些实施例中，富集是至少100n。在一些实施例中，通过在具有特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的寡核苷酸中，特定寡核苷酸类型的寡核苷酸部分的增加来测量富集。在一些实施例中，通过在具有特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的寡核苷酸中，具有特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式但并非特定寡核苷酸类型的寡核苷酸部分的减少来测量富集。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸是反义寡核苷酸。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是siRNA寡核苷酸。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸组合物是如下寡核苷酸，这些寡核苷酸可以是：反义寡核苷酸、antagomir、微小RNA、前微小RNA、antimir、supermir、核酶、U1衔接子、RNA激活子、RNAi剂、诱饵寡核苷酸、形成三链体的寡核苷酸、适体或助剂。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是反义寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是siRNA寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是antagomir寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是微小RNA寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是前微小RNA寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是antimir寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是supermir寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是核酶寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是U1衔接子寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是RNA激活子寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是RNAi剂寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是诱饵寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是形成三链体的寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是适体寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是助剂寡核苷酸。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个手性经修饰的磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有包括一个或多个经修饰的骨架键联、碱基和/或糖的寡核苷酸。
在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约80％的立体化学纯度。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约85％的立体化学纯度。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约90％的立体化学纯度。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约91％的立体化学纯度。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约92％的立体化学纯度。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约93％的立体化学纯度。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约94％的立体化学纯度。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约95％的立体化学纯度。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约96％的立体化学纯度。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约97％的立体化学纯度。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约98％的立体化学纯度。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)制剂具有大于约99％的立体化学纯度。
在一些实施例中，寡核苷酸中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，所有手性经修饰的核苷酸间键联都是手性硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，除了非负电荷的核苷酸间键联外的所有手性经修饰的核苷酸间键联都是手性硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联是手性受控的。在一些实施例中，寡核苷酸中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的手性核苷酸间键联是手性受控的并且具有Sp构型。在一些实施例中，寡核苷酸中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性受控的并且具有Sp构型。在一些实施例中，百分比为至少约10％。在一些实施例中，百分比为至少约20％。在一些实施例中，百分比为至少约30％。在一些实施例中，百分比为至少约40％。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。
在一些实施例中，寡核苷酸中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的手性核苷酸间键联是手性受控的并且具有Rp构型。在一些实施例中，寡核苷酸中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的手性硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性受控的并且具有Rp构型。在一些实施例中，百分比为至少约10％。在一些实施例中，百分比为至少约20％。在一些实施例中，百分比为至少约30％。在一些实施例中，寡核苷酸中不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的手性核苷酸间键联是手性受控的并且具有Rp构型。在一些实施例中，寡核苷酸中不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的硫代磷酸酯核苷酸间键联具有Rp构型。在一些实施例中，百分比不超过10％。在一些实施例中，百分比不超过20％。在一些实施例中，百分比不超过30％。
在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)组合物具有含一个或多个经修饰的碱基的寡核苷酸。在一些实施例中，提供的手性受控的(和/或立体化学纯的)组合物具有不含经修饰的碱基的寡核苷酸。如本领域技术人员所理解的，可以依照本披露利用多种类型的经修饰的碱基。本文描述了示例经修饰的碱基。
在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含至少两个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含至少三个天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含一个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含两个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含三个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含四个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含五个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含六个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含七个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含八个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含九个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含十个天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含至少两个连续天然磷酸酯键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含至少三个连续天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，本披露的寡核苷酸的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个核碱基。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个核碱基长度，其中每个核碱基独立地是任选地经取代的A、T、C、G、U或其互变异构体。
在一些实施例中，提供的组合物包含含有一个或多个在糖部分经修饰的残基的寡核苷酸。在一些实施例中，提供的组合物包含寡核苷酸，这些寡核苷酸含有一个或多个在糖部分的2′位置经修饰(本文中称为“2′-修饰”)的残基。此类修饰的实例在本文描述并且包括(但不限于)2′-OMe、2′-MOE、2′-LNA、2′-F、FRNA、FANA、S-cEt等。在一些实施例中，提供的组合物包含含有一个或多个经2′-修饰的残基的寡核苷酸。例如，在一些实施例中，提供的寡核苷酸含有一个或多个残基，该一个或多个残基是经2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)修饰的残基。在一些实施例中，提供的组合物包含不合任何2′-修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，提供的组合物是不含任何2′-MOE残基的寡核苷酸。即，在一些实施例中，提供的寡核苷酸未经MOE修饰。另外的示例糖修饰描述于本披露中。
在一些实施例中，一个或多个是一个。在一些实施例中，一个或多个是两个。在一些实施例中，一个或多个是三个。在一些实施例中，一个或多个是四个。在一些实施例中，一个或多个是五个。在一些实施例中，一个或多个是六个。在一些实施例中，一个或多个是七个。在一些实施例中，一个或多个是八个。在一些实施例中，一个或多个是九个。在一些实施例中，一个或多个是十个。在一些实施例中，一个或多个是至少一个。在一些实施例中，一个或多个是至少两个。在一些实施例中，一个或多个是至少三个。在一些实施例中，一个或多个是至少四个。在一些实施例中，一个或多个是至少五个。在一些实施例中，一个或多个是至少六个。在一些实施例中，一个或多个是至少七个。在一些实施例中，一个或多个是至少八个。在一些实施例中，一个或多个是至少九个。在一些实施例中，一个或多个是至少十个。
在一些实施例中，碱基序列(例如，多种寡核苷酸的共同的碱基序列、特定寡核苷酸类型的碱基序列等)包含或是与基因或转录物(例如，肌营养不良蛋白或DMD)互补的序列。在一些实施例中，共同的碱基序列包含或是与基因100％互补的序列。在一些实施例中，共同的碱基序列包含或是与基因的特征序列元件互补的序列，特征序列将该基因和与该基因具有同源性的相似序列区分开。在一些实施例中，共同的碱基序列包含或是与基因的特征序列元件100％互补的序列，特征序列将该基因和与该基因的另一等位基因区分开。在一些实施例中，共同的碱基序列包含或是与基因的特征序列元件100％互补的序列，特征序列将该基因和与该基因具有同源性的相似序列区分开。在一些实施例中，共同的碱基序列包含或是与靶基因的特征序列元件互补的序列，特征序列包含在该基因的其他拷贝(例如，该基因的野生型拷贝、该基因的另一个突变拷贝等)中未发现的突变。在一些实施例中，共同的碱基序列包含或是与靶基因的特征序列元件100％互补的序列，特征序列包含在该基因的其他拷贝(例如，该基因的野生型拷贝、该基因的另一个突变拷贝等)中未发现的突变。在一些实施例中，共同的碱基序列包含或是与基因的特征序列元件100％互补的序列，特征序列将该基因和与该基因的另一等位基因区分开。在一些实施例中，特征序列元件是突变。在一些实施例中，特征序列元件是SNP。
在一些实施例中，手性核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、H-c-2、II-d-1、II-d-2、III等或其盐形式。在一些实施例中，手性核苷酸间键联的键联磷是手性受控的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸中的每个手性核苷酸间键联独立地具有式I的结构。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸中的每个手性核苷酸间键联独立地具有式II的结构。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸中的每个手性核苷酸间键联独立地具有式III的结构。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸中的每个手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
如本领域技术人员所理解的，核苷酸间键联(例如具有式I的那些)、天然磷酸酯键联、硫代磷酸酯核苷酸间键联等能以其盐形式(取决于它们的环境pH)存在。除非另外指明，否则当提及此类核苷酸间键联时，此类盐形式包括在本申请中。
在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的糖部分。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的碱基部分。如本领域技术人员所知的并描述在本披露中的，可以将各种修饰引入糖和碱基部分。例如，在一些实施例中，修饰是US 9006198、WO 2014/012081、WO/2015/107425、和WO/2017/062862中描述的修饰，其各自的糖修饰和碱基修饰通过引用并入本文。
在一些实施例中，糖修饰是2′-修饰。常用的2′-修饰包括但不限于2′-OR1，其中R1不是氢。在一些实施例中，修饰是2′-OR，其中R是任选地经取代的脂肪族。在一些实施例中，修饰是2′-OMe。在一些实施例中，修饰是2′-O-MOE。在一些实施例中，本披露证明，特定手性纯核苷酸间键联的包含和/或位置可提供相当于或优于通过使用经修饰的骨架键联、碱基和/或糖达到的稳定性改善。在一些实施例中，提供的组合物中提供的单一寡核苷酸不具有糖上的修饰。在一些实施例中，提供的组合物中提供的单一寡核苷酸不具有糖的2′-位置上的修饰(即，2′-位置处的两个基团是-H/-H或-H/-OH)。在一些实施例中，提供的组合物中提供的单一寡核苷酸不具有任何2′-MOE修饰。
在一些实施例中，2′-修饰是-O-L-或-L-，其将糖部分的2′-碳连接至糖部分的另一个碳。在一些实施例中，2′-修饰是-O-L-或-L-，其将糖部分的2′-碳连接至糖部分的4′-碳。在一些实施例中，2′-修饰是S-cEt。在一些实施例中，经修饰的糖部分是LNA糖部分。
在一些实施例中，2′-修饰是-F。在一些实施例中，2′-修饰是FANA。在一些实施例中，2′-修饰是FRNA。
在一些实施例中，糖修饰是5′-修饰。在一些实施例中，修饰是5′-R1，其中R1不是氢。在一些实施例中，糖修饰是5′-R，其中R不是氢并且另外如本披露中所述。在一些实施例中，糖修饰是5′-R，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，糖修饰是5′-R，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，糖修饰是5′-R，其中R是任选地经取代的甲基。在一些实施例中，糖修饰是5′-R，其中R是任选地经取代的甲基，其中甲基基团的取代基不包含碳原子。在一些实施例中，5′-修饰是甲基。在一些实施例中，每个取代基独立地是卤素。在一些实施例中，经取代的5′-碳是非对映异构体纯的。在一些实施例中，经取代的5′-碳具有R构型。在一些实施例中，经取代的5′-碳具有S构型。在一些实施例中，5′-修饰是5′-(R)-Me。在一些实施例中，5′-修饰是5′-(S)-Me。
在一些实施例中，糖部分在位置(例如2′-位置、5′-位置等)处具有一个且不超过一个修饰。在一些实施例中，2′-修饰发生在与天然RNA糖部分中2′-OH位置对应的位置。在一些实施例中，2′-修饰发生在与天然RNA糖部分中2′-H位置对应的位置。
在一些实施例中，糖修饰改变糖环的大小。在一些实施例中，糖修饰改变糖环的构型。在一些实施例中，糖修饰是FHNA中的糖部分。
在一些实施例中，糖修饰用另一个环状或无环状部分替换糖部分。此类部分的实例是本领域广泛已知的，包括但不限于吗啉代、二醇核酸等中所使用的那些。
核苷酸间键联、手性受控的寡核苷酸和手性受控的寡核苷酸组合物的某些实施例
除其他事项外，本披露提供了手性受控的寡核苷酸和手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供具有高粗品纯度的手性受控的寡核苷酸和手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供具有高非对映异构体纯度的手性受控的寡核苷酸和手性受控的寡核苷酸组合物。手性受控的寡核苷酸是包含一个或多个手性受控的核苷酸间键联的寡核苷酸，例如在手性受控的寡核苷酸组合物中的多种中的寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸中5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的手性核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸中的每个手性核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联，并且手性受控的寡核苷酸是非对映异构体纯的。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是寡核苷酸类型的基本上纯的组合物，因为该组合物中并非该寡核苷酸类型的寡核苷酸是杂质。在一些实施例中，在一些情况下，在某些纯化程序之后，在所述寡核苷酸类型的寡核苷酸的制备过程期间形成此类杂质。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含一个或多个相对于手性键联磷(例如，手性受控的核苷酸间键联的键联磷)的非对映异构体纯的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含一个或多个非对映异构体纯的核苷酸间键联，这些核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III等或其盐形式。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含一个或多个相对于手性键联磷的非对映异构体纯的核苷酸间键联、和一个或多个天然磷酸酯键联(除非另外指明，在本申请中提及核苷酸间键联，例如天然磷酸酯键联和其他类型的核苷酸间键联(如适用)包括此类键联的盐形式)。因此，本文非对映异构体纯的核苷酸间键联包括非对映异构体纯的核苷酸间键联的盐形式；本文天然磷酸酯键联包括天然磷酸酯键联的盐形式。本领域普通技术人员理解，当处于生理pH下、在许多缓冲液(例如，pH约为7(例如，PH 7.4)的PBS缓冲液等)中时，许多核苷酸间键联(例如天然磷酸酯键联)以盐形式存在。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含一个或多个非对映异构体纯的核苷酸间键联和一个或多个天然磷酸酯键联，这些核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III等或其盐形式。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含一个或多个具有式I-c结构的非对映异构体纯的核苷酸间键联以及一个或多个磷酸二酯键联。在一些实施例中，通过使用如本申请中所述的立体选择性寡核苷酸合成来形成相对于手性键联磷是设计的非对映异构体纯的核苷酸间键联，从而制备此类寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露的寡核苷酸在该寡核苷酸的末端(例如5′或3′)内或在该末端处包含至少一个核苷酸间键联，例如经修饰的(非天然)核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联)。在一些实施例中，寡核苷酸在该寡核苷酸的末端(例如5′或3′)内或在该末端处包含P-修饰部分。
在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含在该寡核苷酸内的至少一个手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含在该寡核苷酸内的至少一个手性受控的核苷酸间键联、和至少一个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含在该寡核苷酸内的至少一个手性受控的核苷酸间键联、至少一个天然磷酸酯键联和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含在该寡核苷酸内的至少一个手性受控的核苷酸间键联、和至少一个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含在该寡核苷酸内的至少一个手性受控的核苷酸间键联、至少一个天然磷酸酯键联和至少一个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含在该寡核苷酸内的至少两个手性受控的核苷酸间键联，其相对于彼此具有不同的立体化学和/或不同的P-修饰。在一些实施例中，这样的至少两个核苷酸间键联具有不同的立体化学。在一些实施例中，这样的至少两个核苷酸间键联具有不同的P-修饰。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含在该寡核苷酸内的至少两个手性受控的核苷酸间键联(其相对于彼此具有不同的P-修饰)和至少一个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含在该寡核苷酸内的至少两个手性受控的核苷酸间键联(其相对于彼此具有不同的P-修饰)、至少一个天然磷酸酯键联和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含在该寡核苷酸内的至少两个手性受控的核苷酸间键联(其相对于彼此具有不同的P-修饰)和至少一个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含在该寡核苷酸内的至少两个手性受控的核苷酸间键联(其相对于彼此具有不同的P-修饰)、至少一个天然磷酸酯键联和至少一个硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
在某些实施例中，核苷酸间键联(例如当式I不是天然磷酸酯键联时的经修饰的(非天然)核苷酸间键联)具有式I的结构：
Figure BPA0000295055720001081
或其盐形式，其中：
PL是P(＝W)、P或P→B(R′)3；
W是O、N(-L-R5)、S或Se；
R1和R5各自独立地是-H、-L-R’、卤素、-CN、-NO2、-L-Si(R’)3、-OR’、-SR’或-N(R’)2；
X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R5)-或L；
每个L独立地是共价键或选自具有1-10个杂原子的C1-30脂肪族基团和C1-30杂脂肪族基团的二价任选地经取代的直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被以下替换：CyL；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个R′独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居于它们之间的该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
在一些实施例中，式I的键联在键联磷处是手性的(PL中的P)。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个经修饰的式I核苷酸间键联的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个经修饰的式I核苷酸间键联的手性受控的寡核苷酸，并且其中该寡核苷酸内单独的式I核苷酸间键联相对于彼此具有不同的P-修饰。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个经修饰的式I核苷酸间键联的手性受控的寡核苷酸，并且其中该寡核苷酸内单独的式I核苷酸间键联相对于彼此具有不同的-X-L-R1。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个经修饰的式I核苷酸间键联的手性受控的寡核苷酸，并且其中该寡核苷酸内单独的式I核苷酸间键联相对于彼此具有不同的X。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个经修饰的式I核苷酸间键联的手性受控的寡核苷酸，并且其中该寡核苷酸内单独的式I核苷酸间键联相对于彼此具有不同的-L-R1。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是具有特定寡核苷酸类型的提供的组合物中的寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是具有共同的碱基序列及长度、共同的骨架键联模式及共同的骨架手性中心模式的提供的组合物中的寡核苷酸。
如本文广泛描述的，在一些实施例中，-X-L-R1是可用于寡核苷酸制备的部分。例如，在一些实施例中，-X-L-R1是-OCH2CH2CN(例如，在非手性受控的核苷酸间键联中)；在一些实施例中，-X-L-R1具有如下结构使得H-X-L-R1是手性助剂，任选地被加帽，如本文所述的(例如，DPSE、PSM等；特别是在手性受控的核苷酸间键联中，尽管也可以在非手性受控的核苷酸间键联中(例如，天然磷酸酯键联的前体))。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是具有特定寡核苷酸类型的手性受控的组合物中的寡核苷酸，且手性受控的寡核苷酸具有该类型。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是提供的组合物中的寡核苷酸，该寡核苷酸包含受控水平的多种寡核苷酸，该多种寡核苷酸共享共同的碱基序列、共同的骨架键联模式、共同的骨架手性中心模式和共同的骨架磷修饰模式，并且手性受控的寡核苷酸共享共同的碱基序列、共同的骨架键联模式、共同的骨架手性中心模式和共同的骨架磷修饰模式。
在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸，其中该寡核苷酸内的至少两个手性受控的核苷酸间键联相对于彼此具有不同的P-修饰，因为它们在其-XLR1部分中具有不同的X原子、和/或它们在其-XLR1部分中具有不同的L基团、和/或它们在其-XLR1部分中具有不同的R1原子、和/或它们具有不同的XLR1部分。
在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸，其中该寡核苷酸内单独的核苷酸间键联中的至少两个相对于彼此具有不同的立体化学和/或不同的P-修饰，且该寡核苷酸具有由下式表示的结构：
[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]
其中：
每个RB独立地表示在键联磷处具有R构型的核苷酸单元嵌段；
每个SB独立地表示在键联磷处具有S构型的核苷酸单元嵌段；
n1-ny中的每一个是零或整数，其要求是至少一个奇数n及至少一个偶数n必须不是零，使得寡核苷酸包括至少两个相对于彼此具有不同立体化学的单独的核苷酸间键联；并且
其中n1至ny的总和在2与200之间，且在一些实施例中，在选自由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更大数目组成的组的下限值与选自由5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190及200组成的组的上限值之间，上限值大于下限值。
在一些此类实施例中，每个n具有相同值；在一些实施例中，每个偶数n与每个另一偶数n具有相同值；在一些实施例中，每个奇数n与每个另一奇数n具有相同值；在一些实施例中，至少两个偶数n具有不同彼此的值；在一些实施例中，至少两个奇数n具有不同彼此的值。
在一些实施例中，至少两个相邻n彼此相等，使得提供的寡核苷酸包括相等长度的S立体化学键联及R立体化学键联的相邻嵌段。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包括相等长度的S及R立体化学键联的重复嵌段。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包括S及R立体化学键联的重复嵌段，其中至少两个此类嵌段具有彼此不同的长度；在一些此类实施例中，每个S立体化学嵌段具有相同长度，且具有与每个R立体化学长度不同的长度，每个R立体化学长度可任选是彼此相同的长度。
在一些实施例中，至少两个不相邻的n彼此相等，使得提供的寡核苷酸包括至少两个具有第一立体化学的键联嵌段，该至少两个键联嵌段彼此长度相等且由具有另一立体化学的键联嵌段间隔开，该间隔嵌段的长度可与具有第一立体化学的嵌段的长度相同或不同。
在一些实施例中，与提供的寡核苷酸端处的键联嵌段相关的ns具有相同长度。在一些实施例中，提供的寡核苷酸含有具有相同键联立体化学的末端嵌段。在一些此类实施例中，末端嵌段由具有另一键联立体化学的中间嵌段彼此隔开。
在一些实施例中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]的寡核苷酸是立体嵌段体。在一些实施例中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]的寡核苷酸是立体跳过体。在一些实施例中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]的寡核苷酸是立体交替体。在一些实施例中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]的寡核苷酸是缺口体。
在一些实施例中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]的寡核苷酸具有以上所述模式中的任一个且还包含P-修饰模式。例如，在一些实施例中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]的寡核苷酸是立体跳过体和P-修饰跳过体。在一些实施例中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]的寡核苷酸是立体嵌段体和P-修饰交替体。在一些实施例中，提供的式[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny]的寡核苷酸是立体交替体和P-修饰嵌段体。
在一些实施例中，式I核苷酸间键联具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001121
其中：
P*是不对称磷原子且为Rp或Sp；
W是O、S或Se；
X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R1)-或L；
L是共价键、或任选地经取代的直链或支链C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、C1-C6杂脂肪族部分、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2--SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、和-C(O)O-；
R1是卤素、R或任选地经取代的C1-C50脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、C1-C6杂脂肪族部分、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2--SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、和-C(O)O-；
每个R’独立地是-R、-C(O)R、-CO2R、或-SO2R，或：
两个R’与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的芳基环、碳环、杂环或杂芳基环；
-Cy-是选自亚苯基、亚碳环基、亚芳基、杂亚芳基和亚杂环基的任选地经取代的二价环；
每个R独立地是氢，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-C6脂肪族、碳环基、芳基、杂芳基和杂环基；并且
每个
Figure BPA0000295055720001131
独立地表示与核苷的连接。
在一些实施例中，L是共价键或任选地经取代的直链或支链C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-；
R1是卤素、R或任选地经取代的C1-C50脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-；
每个R’独立地是-R、-C(O)R、-CO2R、或-SO2R，或：
同一氮上的两个R’与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的杂环或杂芳基环，或
同一碳上的两个R’与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的芳基环、碳环、杂环或杂芳基环；
-Cy-是选自亚苯基、亚碳环基、亚芳基、杂亚芳基或亚杂环基的任选地经取代的二价环；
每个R独立地是氢，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-C6脂肪族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基；并且
每个
Figure BPA0000295055720001132
独立地表示与核苷的连接。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含例如硫代磷酸酯或硫代磷酸三酯核苷酸间键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含手性受控的硫代磷酸三酯键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个手性受控的硫代磷酸三酯核苷酸间键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联(-O-P(O)(SH)-O-或其盐形式)。
在一些实施例中，寡核苷酸包含不同类型的核苷酸间磷键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个经修饰的(非天然)核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个硫代磷酸酯。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联和至少一个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联、至少一个天然磷酸酯键联和至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，核苷酸间键联包含手性助剂。在一些实施例中，式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等的核苷酸间键联包含手性助剂，其中PL是P＝S。在一些实施例中，式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等的核苷酸间键联包含手性助剂，其中PL是P＝O。在一些实施例中，硫代磷酸三酯键联包含手性助剂，其例如用于控制反应的立体选择性。在一些实施例中，硫代磷酸三酯键联不包含手性助剂。可以依照本披露利用的合适的手性助剂包括以下中描述的那些：US9394333、US 9744183、US 9605019、US 20130178612、US 20150211006、US 9598458、US20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2018/237194、WO 2019/055951，其各自的手性助剂通过引用并入本文。在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1独立地包含或是任选地经取代的手性助剂。在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1各自独立地具有如下结构使得H-X-L-R1是本文所述的手性试剂/手性助剂(例如，具有式3-I、式3-AA等的结构的手性试剂/手性助剂)。在一些实施例中，H-X-L-R1是本文所述的加帽的手性试剂/手性助剂(例如，具有式3-I、式3-AA等的结构的手性试剂/手性助剂)，其被加帽，因为手性试剂/手性助剂的氨基基团(例如，H-W1和H-W2是或包含H-NG5-)被加帽(例如，形成R1-NG5-(例如，R′C(O)-NG5-、RS(O)2-NG5-等))。在一些实施例中，R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R′是甲基。在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1各自独立地具有如下结构使得H-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001151
Figure BPA0000295055720001152
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1各自独立地具有如下结构使得H-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001153
Figure BPA0000295055720001154
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1各自独立地具有如下结构使得H-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001155
Figure BPA0000295055720001156
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1各自独立地具有如下结构使得H-X-L-R1是选自表CA-1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、CA-6、CA-7、CA-8、CA-9、CA-10、CA-11、CA-12、或CA-13的化合物，或其相关的(具有相同构造的)非对映异构体或对映异构体。在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1各自独立地具有如下结构使得H-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001157
Figure BPA0000295055720001158
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1各自独立地具有如下结构使得H-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001161
Figure BPA0000295055720001162
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1各自独立地具有如下结构使得H-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001163
Figure BPA0000295055720001164
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1各自独立地具有如下结构使得H-X-L-R1是选自表CA-1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、CA-6、CA-7、CA-8、CA-9、CA-10、CA-11、CA-12、或CA-13的化合物，或其相关的(具有相同构造的)非对映异构体或对映异构体，其中5元吡咯烷基的-NH-被-N(R1)-替换。在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001165
Figure BPA0000295055720001166
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001167
Figure BPA0000295055720001168
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001169
Figure BPA00002950557200011610
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1各自独立地具有如下结构使得H-X-L-R1是选自表CA-1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、CA-6、CA-7、CA-8、CA-9、CA-10、CA-11、CA-12、或CA-13的化合物，或其相关的(具有相同构造的)非对映异构体或对映异构体，其中与键联磷通过醇羟基基团而连接。在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001171
Figure BPA0000295055720001172
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001173
Figure BPA0000295055720001174
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001175
Figure BPA0000295055720001176
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1各自独立地具有如下结构使得H-X-L-R1是选自表CA-1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、CA-6、CA-7、CA-8、CA-9、CA-10、CA-11、CA-12、或CA-13的化合物，或其相关的(具有相同构造的)非对映异构体或对映异构体，其中5元吡咯烷基的-NH-被-N(R1)-替换，并且其中与键联磷通过醇羟基基团而连接。在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001177
Figure BPA0000295055720001178
并且一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001179
Figure BPA0000295055720001181
Figure BPA0000295055720001182
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001183
Figure BPA0000295055720001184
并且一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001185
Figure BPA0000295055720001186
在一些实施例中，一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001187
Figure BPA0000295055720001188
并且一个或多个-X-L-R1独立地是
Figure BPA0000295055720001189
Figure BPA00002950557200011810
在一些实施例中，R1是用于寡核苷酸合成的加帽基团。在一些实施例中，R1是-C(O)-R′。在一些实施例中，R1是-C(O)-R′，其中R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R1是-C(O)CH3。
在一些实施例中，寡核苷酸(例如手性受控的寡核苷酸，多种中的寡核苷酸等)连接到固体支持物。在一些实施例中，寡核苷酸没有连接至固体支持物。
在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少两个连续的手性受控的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少两个连续的手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是嵌段体。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是立体嵌段体。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是P-修饰嵌段体。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是键联嵌段体。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是交替体。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是立体交替体。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是P-修饰交替体。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是键联交替体。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是单聚体。
在一些实施例中，在单聚体中，链内的所有核苷酸单元在核苷酸间磷键联处共享至少一个共同的结构特征。在一些实施例中，共同的结构特征是在键联磷处的共同立体化学或在键联磷处的共同修饰。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是立体单聚体。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是P-修饰单聚体。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是键联单聚体。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是缺口体。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸是跳过体。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含一个或多个经修饰的核苷酸间键联，这些核苷酸间键联独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、H-d-1、II-d-2、III或其盐形式。
在一些实施例中，L是共价键或任选地经取代的直链或支链C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-；
R1是卤素、R或任选地经取代的C1-C50脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-；
每个R’独立地是-R、-C(O)R、-CO2R、或-SO2R，或：
同一氮上的两个R’与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的杂环或杂芳基环，或
同一碳上的两个R’与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的芳基环、碳环、杂环或杂芳基环；
-Cy-是选自亚苯基、亚碳环基、亚芳基、杂亚芳基或亚杂环基的任选地经取代的二价环；
每个R独立地是氢，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-C6脂肪族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基；并且
每个
Figure BPA0000295055720001201
独立地表示与核苷的连接。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷酸间磷键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含例如硫代磷酸酯或硫代磷酸三酯键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含硫代磷酸三酯键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少两个硫代磷酸三酯键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少三个硫代磷酸三酯键联。本文中进一步描述了示例经修饰的核苷酸间磷键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含不同的核苷酸间磷键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少一个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少一个硫代磷酸三酯键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少两个硫代磷酸三酯键联。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷酸间键联和至少三个硫代磷酸三酯键联。
在一些实施例中，P*是不对称磷原子且为Rp或Sp。在一些实施例中，P*为Rp。在其他实施例中，P*为Sp。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个式I核苷酸间键联，其中每个P*独立地是Rp或Sp。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个式I核苷酸间键联，其中每个P*是Rp。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个式I核苷酸间键联，其中每个P*是Sp。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中P*是Rp。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中P*是Sp。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个其中P*是Rp的式I核苷酸间键联和至少一个其中P*是Sp的式I核苷酸间键联。
在一些实施例中，W是O、S或Se。在一些实施例中，W是O。在一些实施例中，W是S。在一些实施例中，W是Se。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中W是O。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中W是S。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中W是Se。
在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中W是O。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中W是S。
在一些实施例中，X是-O-。在一些实施例中，X是-S-。在一些实施例中，X是-O-或-S-。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中X是-O-。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式I核苷酸间键联，其中X是-S-。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个其中X是-O-的式I核苷酸间键联和至少一个其中X是-S-的式I核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个其中X为-O-的式I核苷酸间键联、和至少一个其中X为-S-的式I核苷酸间键联、以及至少一个其中L是任选地经取代的直链或支链C1-C10亚烷基的式I核苷酸间键联，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-。
在一些实施例中，X是-N(-L-R1)-。在一些实施例中，X是-N(R1)-。在一些实施例中，X是-N(R′)-。在一些实施例中，X是-N(R)-。在一些实施例中，X是-NH-。
在一些实施例中，X是L。在一些实施例中，X是共价键。在一些实施例中，X是或任选地经取代的直链或支链C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-。在一些实施例中，X是任选地经取代的C1-C10亚烷基或C1-C10亚烯基。在一些实施例中，X是亚甲基。
在一些实施例中，Y是-O-。在一些实施例中，Y是-S-。
在一些实施例中，Y是-N(-L-R1)-。在一些实施例中，Y是-N(R1)-。在一些实施例中，Y是-N(R′)-。在一些实施例中，Y是-N(R)-。在一些实施例中，Y是-NH-。
在一些实施例中，Y是L。在一些实施例中，Y是共价键。在一些实施例中，Y是或任选地经取代的直链或支链C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-。在一些实施例中，Y是任选地经取代的C1-C10亚烷基或C1-C10亚烯基。在一些实施例中，Y是亚甲基。
在一些实施例中，Z是-O-。在一些实施例中，Z是-S-。
在一些实施例中，Z是-N(-L-R1)-。在一些实施例中，Z是-N(R1)-。在一些实施例中，Z是-N(R′)-。在一些实施例中，Z是-N(R)-。在一些实施例中，Z是-NH-。
在一些实施例中，Z是L。在一些实施例中，Z是共价键。在一些实施例中，Z是或任选地经取代的直链或支链C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-。在一些实施例中，Z是任选地经取代的C1-C10亚烷基或C1-C10亚烯基。在一些实施例中，Z是亚甲基。
在一些实施例中，L是共价键或任选地经取代的直链或支链C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-。
在一些实施例中，L是共价键。在一些实施例中，L是任选地经取代的直链或支链C1-C10亚烷基，其中L的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-。
在一些实施例中，L具有-L1-V-的结构，其中：
L1是选自以下的任选地经取代的基团：
Figure BPA0000295055720001231
Figure BPA0000295055720001232
C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚碳环基、亚芳基、C1-C6杂亚烷基、亚杂环基和杂亚芳基；
V选自-O-、-S-、-NR′-、C(R′)2、-S-S-、-B-S-S-C-、
Figure BPA0000295055720001233
或选自以下的任选地经取代的基团：C1-C6亚烷基、亚芳基、C1-C6杂亚烷基、亚杂环基、和杂亚芳基；
A是＝O、＝S、＝NR′、或＝C(R′)2；
B和C各自独立地是-O-、-S-、-NR′-、-C(R′)2-、或选自以下的任选地经取代的基团：C1-C6亚烷基、亚碳环基、亚芳基、亚杂环基或杂亚芳基并且
每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L1是
Figure BPA0000295055720001241
Figure BPA0000295055720001242
在一些实施例中，L1是
Figure BPA0000295055720001243
其中环Cy′是任选地经取代的亚芳基、亚碳环基、杂亚芳基或亚杂环基。在一些实施例中，L1是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720001244
在一些实施例中，L1是
Figure BPA0000295055720001245
在一些实施例中，L1连接至X。在一些实施例中，L1是选自以下的任选地经取代的基团：
Figure BPA0000295055720001246
Figure BPA0000295055720001247
在一些实施例中，L1是选自以下的任选地经取代的基团：
Figure BPA0000295055720001248
Figure BPA0000295055720001249
Figure BPA00002950557200012410
并且碳原子连接至X。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001251
其中：
E是-O-、-S-、-NR′-或-C(R′)2-；
Figure BPA0000295055720001254
是单键或双键；
两个RL1与它们所键合的两个碳原子一起形成任选地经取代的芳基、碳环、杂芳基或杂环；并且每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001252
其中：
G是-O-、-S-、或-NR′；
Figure BPA0000295055720001255
是单键或双键；并且
两个RL1与它们所键合的两个碳原子一起形成任选地经取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001253
其中：
E是-O-、-S-、-NR′-或-C(R′)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-；并且
每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001261
其中：
G是-O-、-S-、或-NR′；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001262
其中：
E是-O-、-S-、-NR′-或-C(R′)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-；并且
每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001263
其中：
G是-O-、-S-、或-NR′；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001264
其中：
E是-O-、-S-、-NR′-或-C(R′)2-；
Figure BPA0000295055720001271
是单键或双键；
两个RL1与它们所键合的两个碳原子一起形成任选地经取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环；
并且每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001272
其中：
G是-O-、-S-、或-NR′；
Figure BPA0000295055720001273
是单键或双键；
两个RL1与它们所键合的两个碳原子一起形成任选地经取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环；
并且每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001274
其中：
E是-O-、-S-、-NR′-或-C(R′)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-；并且
每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001281
其中：
G是-O-、-S-、或-NR′；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-；并且
每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001282
其中：
E是-O-、-S-、-NR′-或-C(R′)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-；并且
每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001283
其中：
G是-O-、-S-、或-NR′；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-；并且
每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001291
其中：
E是-O-、-S-、-NR′-或-C(R′)2-；
Figure BPA0000295055720001292
是单键或双键；
两个RL1与它们所键合的两个碳原子一起形成任选地经取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环；并且每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001293
其中：
G是-O-、-S-、或-NR′；
Figure BPA0000295055720001294
是单键或双键；
两个RL1与它们所键合的两个碳原子一起形成任选地经取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环；并且每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001295
其中：
E是-O-、-S-、-NR′-或-C(R′)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-；并且
每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001301
其中：
G是-O-、-S-、或-NR′；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-；并且
R′如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001302
其中：
E是-O-、-S-、-NR′-或-C(R′)2-；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-；并且
每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001303
其中：
G是-O-、-S-、或-NR′；
D是＝N-、＝C(F)-、＝C(Cl)-、＝C(Br)-、＝C(I)-、＝C(CN)-、＝C(NO2)-、＝C(CO2-(C1-C6脂肪族))-、或＝C(CF3)-；并且
R′如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001311
其中苯环任选地被取代。在一些实施例中，苯环未经取代。在一些实施例中，苯环被取代。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001312
其中苯环任选地被取代。在一些实施例中，苯环未经取代。在一些实施例中，苯环被取代。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001313
其中：
Figure BPA0000295055720001316
是单键或双键；并且
两个RL1与它们所键合的两个碳原子一起形成任选地经取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001314
其中：
G是-O-、-S-、或-NR′；
Figure BPA0000295055720001315
是单键或双键；并且
两个RL1与它们所键合的两个碳原子一起形成任选地经取代的芳基、C3-C10碳环、杂芳基或杂环。
在一些实施例中，E是-O-、-S-、-NR′-或-C(R′)2-，其中每个R′独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，E是-O-、-S-、或-NR′-。在一些实施例中，E是-O-、-S-、或-NH-。在一些实施例中，E是-O-。在一些实施例中，E是-S-。在一些实施例中，E是-NH-。
在一些实施例中，G是-O-、-S-或-NR′，其中每个R′独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，G是-O-、-S-、或-NH-。在一些实施例中，G是-O-。在一些实施例中，G是-S-。在一些实施例中，G是-NH-。
在一些实施例中，L是-L3-G-，其中：
L3是任选地经取代的C1-C5亚烷基或亚烯基，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：-O-、-S-，-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-S(O)-、-S(O)2-、或
Figure BPA0000295055720001321
并且
其中G、R′和环Cy′各自独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L是-L3-S-，其中L3如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，L是-L3-O-，其中L3如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，L是-L3-N(R′)-，其中L3和R各自独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，L是-L3-NH-，其中L3和R′各自独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L3是任选地经取代的C5亚烷基或亚烯基，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：-O-、-S-，-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-S(O)-、-S(O)2-、或
Figure BPA0000295055720001322
并且R′和环Cy’各自独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，L3是任选地经取代的C5亚烷基。在一些实施例中，-L3-G-是
Figure BPA0000295055720001323
在一些实施例中，L3是任选地经取代的C4亚烷基或亚烯基，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：-O-、-S-，-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-S(O)-、-S(O)2-、或
Figure BPA0000295055720001331
并且R′和Cy’各自独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L3-G-是
Figure BPA0000295055720001332
Figure BPA0000295055720001333
在一些实施例中，L3是任选地经取代的C3亚烷基或亚烯基，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：-O-、-S-，-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-S(O)-、-S(O)2-、或
Figure BPA0000295055720001334
并且R′和Cy’各自独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L3-G-是
Figure BPA0000295055720001335
Figure BPA0000295055720001336
在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001337
在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001338
Figure BPA0000295055720001339
在一些实施例中，L是
Figure BPA00002950557200013310
在一些实施例中，L3是任选地经取代的C2亚烷基或亚烯基，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：-O-、-S-，-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-S(O)-、-S(O)2-、或
Figure BPA00002950557200013311
并且R′和Cy’各自独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L3-G-是
Figure BPA0000295055720001341
其中G和Cy′各自独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001342
在一些实施例中，L是-L4-G-，其中L4是任选地经取代的C1-C2亚烷基；并且G如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，L是-L4-G-，其中L4是任选地经取代的C1-C2亚烷基；G如上文所定义和本文所述；并且G连接至R1。在一些实施例中，L是-L4-G-，其中L4是任选地经取代的亚甲基；G如上文所定义和本文所述；并且G连接至R1。在一些实施例中，L是-L4-G-，其中L4是亚甲基；G如上文所定义和本文所述；并且G连接至R1。在一些实施例中，L是-L4-G-，其中L4是任选地经取代的-(CH2)2-；G如上文所定义和本文所述；并且G连接至R1。在一些实施例中，L是-L4-G-，其中L4是-(CH2)2-；G如上文所定义和本文所述；并且G连接至R1。
在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001343
其中G如上文所定义和本文所述，并且G连接至R1。在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001344
其中G如上文所定义和本文所述，并且G连接至R1。在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001345
其中G如上文所定义和本文所述，并且G连接至R1。在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001346
其中硫原子连接至R1。在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001347
其中氧原子连接至R1。
在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001348
其中G如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，其中RL3是任选地经取代的直链或支链C1-C9亚烷基，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-，其中R’和-Cy-各自独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，其中RL3是任选地经取代的C1-C6亚烷基。在一些实施例中，L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，其中RL3是任选地经取代的C1-C6亚烯基。在一些实施例中，L是-S-RL3-或-S-C(O)-RL3-，其中RL3是任选地经取代的C1-C6亚烷基，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烯基、亚芳基或杂亚芳基。在一些实施例中，在一些实施例中，RL3是任选地经取代的-S-(C1-C6亚烯基)-、-S-(C1-C6亚烷基)-、-S-(C1-C6亚烷基)-亚芳基-(C1-C6亚烷基)-、-S-CO-亚芳基-(C1-C6亚烷基)-、或-S-CO-(C1-C6亚烷基)-亚芳基-(C1-C6亚烷基)-。
在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001351
Figure BPA0000295055720001352
在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001353
在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720001354
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720001355
在一些实施例中，上述和本文所述的L实施例中的硫原子连接至X。在一些实施例中，上述和本文所述的L实施例中的硫原子连接至R1。
在一些实施例中，R1是卤素、R或任选地经取代的C1-C50脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-，其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，R1是卤素、R或任选地经取代的C1-C10脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-，其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，R1是氢。在一些实施例中，R1是卤素。在一些实施例中，R1是-F。在一些实施例中，R1是-Cl。在一些实施例中，R1是-Br。在一些实施例中，R1是-I。
在一些实施例中，R1是R，其中R如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，R1是氢。在一些实施例中，R1是选自以下的任选地经取代的基团：C1-C50脂肪族、苯基、碳环基、芳基、杂芳基或杂环基。
在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C50脂肪族。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C10脂肪族。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C6脂肪族。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C6烷基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的直链或支链己基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的直链或支链戊基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的直链或支链丁基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的直链或支链丙基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的乙基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的甲基。
在一些实施例中，R1是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R1是经取代的苯基。在一些实施例中，R1是苯基。
在一些实施例中，R1是任选地经取代的碳环基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C3-C10碳环基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的单环碳环基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的环庚基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的环己基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的环戊基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的环丁基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的环丙基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的双环碳环基。
在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C50多环烃。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C50多环烃，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-，其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，R1是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720001371
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001372
在一些实施例中，R1是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720001373
在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C50脂肪族，其包含一个或多个任选地经取代的多环烃部分。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C50脂肪族(其包含一个或多个任选地经取代的多环烃部分)，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-，其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C50脂肪族，其包含一个或多个任选地经取代的
Figure BPA0000295055720001374
Figure BPA0000295055720001375
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001376
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001377
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001381
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001382
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001383
在一些实施例中，R1是任选地经取代的芳基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的双环芳基环。
在一些实施例中，R1是任选地经取代的杂芳基。在一些实施例中，R1是具有1-3个独立地选自氮、硫或氧的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳基环。在一些实施例中，R1是具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的经取代的5-6元单环杂芳基环。在一些实施例中，R1是具有1-3个独立地选自氮、硫或氧的杂原子的未经取代的5-6元单环杂芳基环。
在一些实施例中，R1是具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5元单环杂芳基环。在一些实施例中，R1是具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6元单环杂芳基环。
在一些实施例中，R1是具有1个选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5元单环杂芳基环。在一些实施例中，R1选自吡咯基、呋喃基或噻吩基。
在一些实施例中，R1是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5元杂芳基环。在某些实施例中，R1是具有1个氮原子以及选自硫或氧的另外杂原子的任选地经取代的5元杂芳基环。示例R1基团包括任选地经取代的吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基或异噁唑基。
在一些实施例中，R1是具有1-3个氮原子的6元杂芳基环。在其他实施例中，R1是具有1-2个氮原子的任选地经取代的6元杂芳基环。在一些实施例中，R1是具有2个氮原子的任选地经取代的6元杂芳基环。在某些实施例中，R1是具有1个氮的任选地经取代的6元杂芳基环。示例R1基团包括任选地经取代的吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基或四嗪基。
在某些实施例中，R1是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳基环。在一些实施例中，R1是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在其他实施例中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在某些实施例中，R1是具有1个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R1是任选地经取代的吲哚基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的氮杂双环[3.2.1]辛烷基。在某些实施例中，R1是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R1是任选地经取代的氮杂吲哚基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的苯并咪唑基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的苯并噻唑基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的苯并噁唑基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的吲唑基。在某些实施例中，R1是具有3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。
在某些实施例中，R1是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在其他实施例中，R1是具有1个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R1是任选地经取代的喹啉基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的异喹啉基。根据一个方面，R1是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R1是喹唑啉或喹喔啉。
在一些实施例中，R1是任选地经取代的杂环基。在一些实施例中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的3-7元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的经取代的3-7元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的3-7元饱和或部分不饱和的杂环。
在一些实施例中，R1是任选地经取代的杂环基。在一些实施例中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R1是具有2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R1是具有2个氧原子的任选地取代的6元部分不饱和的杂环。
在某些实施例中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和的杂环。在某些实施例中，R1是环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基、硫杂环丙烷基、硫杂环丁烷基、四氢苯硫基、四氢硫代吡喃基、硫杂环庚烷基、二氧戊环基、氧硫杂环戊烷基、噁唑烷基、咪唑烷基、噻唑烷基、二硫杂环戊烷基、二氧杂环己烷基、吗啉基、氧硫杂环己烷基、哌嗪基、硫代吗啉基、二噻烷基、二氧杂环庚烷基、氧氮杂环庚烷基、氧硫杂环庚基、二硫杂环庚基、二氮杂环庚基、二氢呋喃酮基、四氢吡喃酮基、氧杂环庚酮基、吡咯烷酮基、哌啶酮基、氮杂环庚酮基、二氢噻吩酮基、四氢硫代吡喃酮基、硫杂环庚酮基、噁唑烷酮基、氧氮杂环己酮基、氧氮杂环庚酮基、二氧杂环戊酮基、二氧杂环己酮基、二氧杂环庚酮基、氧硫杂环戊酮基、氧杂噻喃酮基、氧硫杂环庚酮基、噻唑烷酮基、噻嗪酮基、硫氮杂环庚酮基、咪唑烷酮基、四氢嘧啶酮基、二氮杂环庚酮基、咪唑烷二酮基、噁唑烷二酮基、噻唑烷二酮基、二氧杂环戊烷二酮基、氧硫杂环戊烷二酮基、哌嗪二酮基、吗啉二酮基、硫代吗啉二酮基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、吗啉基、硫代吗啉基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、四氢苯硫基或四氢硫代吡喃基。在一些实施例中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5元饱和或部分不饱和的杂环。
在某些实施例中，R1是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地取代的5-6元部分不饱和单环。在某些实施例中，R1是任选地经取代的四氢吡啶基、二氢噻唑基、二氢噁唑基或噁唑啉基基团。
在一些实施例中，R1是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R1是任选地经取代的吲哚啉基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的异吲哚啉基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的1，2，3，4-四氢喹啉。在一些实施例中，R1是任选地经取代的1，2，3，4-四氢异喹啉。
在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C10脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-，其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C10脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-OC(O)-、或-C(O)O-，其中每个R′独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-C10脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-OC(O)-、或-C(O)O-，其中每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001411
Figure BPA0000295055720001412
Figure BPA0000295055720001421
在一些实施例中，R1是CH3-、
Figure BPA0000295055720001422
Figure BPA0000295055720001423
在一些实施例中，R1包含连接至L的末端任选地经取代的-(CH2)2-部分。此类R1基团的实例如下所示：
Figure BPA0000295055720001431
在一些实施例中，R1包含连接至L的末端任选地经取代的-(CH2)-部分。示例此类R1基团如下所示：
Figure BPA0000295055720001432
在一些实施例中，R1是-S-RL2，其中RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-，并且R’和-Cy-各自独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，R1是-S-RL2，，其中硫原子与L基团中的硫原子连接。
在一些实施例中，R1是-C(O)-RL2，其中RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-，并且R′和-Cy-各自独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，R1是-C(O)-RL2，其中羰基基团与L基团中的G连接。在一些实施例中，R1是-C(O)-RL2，其中羰基基团与L基团中的硫原子连接。
在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族。在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9烷基。在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9烯基。在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9炔基。在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：-Cy-或-C(O)-。在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：-Cy-。在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的亚杂环基。在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的亚芳基。在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的杂亚芳基。在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C3-C10亚碳环基。在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族，其中两个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：-Cy-或-C(O)-。在一些实施例中，RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族，其中两个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：-Cy-或-C(O)-。示例RL2基团如下所示：
Figure BPA0000295055720001441
在一些实施例中，R1是氢，或选自以下的任选地经取代的基团：
Figure BPA0000295055720001442
Figure BPA0000295055720001443
-S-(C1-C10脂肪族)、C1-C10脂肪族、芳基、C1-C6杂烷基、杂芳基和杂环基。在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001451
Figure BPA0000295055720001452
或-S-(C1-C10脂肪族)。在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001453
Figure BPA0000295055720001454
在一些实施例中，R1是选自以下的任选地经取代的基团：-S-(C1-C6脂肪族)、C1-C10脂肪族、C1-C6杂脂肪族、芳基、杂环基和杂芳基。
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001455
Figure BPA0000295055720001456
在一些实施例中，上述和本文所述的R1实施例中的硫原子与上述和本文所述的L实施例中的硫原子、G、E、或-C(O)-部分连接。在一些实施例中，上述和本文所述的R1实施例中的-C(O)-部分与上述和本文所述的L实施例中的硫原子、G、E、或-C(O)-部分连接。
在一些实施例中，-L-R1是上述和本文所述的L实施例和R1实施例的任何组合。
在一些实施例中，-L-R1是-L3-G-R1，其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1是-L4-G-R1，其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1是-L3-G-S-RL2，其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1是-L3-G-C(O)-RL2，其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1是
Figure BPA0000295055720001461
Figure BPA0000295055720001462
其中RL2是任选地经取代的C1-C9脂肪族，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：任选地经取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-、或-C(O)O-，并且每个G独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1是-RL3-S-S-RL2，其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，-L-R1是-RL3-C(O)-S-S-RL2，其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001463
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001464
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001471
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001472
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001473
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001474
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001475
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001481
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001482
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001483
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001484
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001485
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001491
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001492
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001493
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001494
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001495
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001501
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001502
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001503
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001504
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，L具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001505
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-X-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001506
其中：
苯环是任选地经取代的，并且
每个R1和X独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，-L-R1是
Figure BPA0000295055720001511
Figure BPA0000295055720001512
Figure BPA0000295055720001521
在一些实施例中，-L-R1是：
Figure BPA0000295055720001522
在一些实施例中，-L-R1是CH3-、
Figure BPA0000295055720001523
Figure BPA0000295055720001524
在一些实施例中，-L-R1是
Figure BPA0000295055720001525
Figure BPA0000295055720001526
在一些实施例中，-L-R1包含连接至X的末端任选地经取代的-(CH2)2-部分。在一些实施例中，-L-R1包含连接至X的末端-(CH2)2-部分。此类-L-R1部分的实例如下所示：
Figure BPA0000295055720001531
在一些实施例中，-L-R1包含连接至X的末端任选地经取代的-(CH2)-部分。在一些实施例中，-L-R1包含连接至X的末端-(CH2)-部分。此类-L-R1部分的实例如下所示：
Figure BPA0000295055720001532
在一些实施例中，-L-R1是
Figure BPA0000295055720001533
在一些实施例中，-L-R1是CH3-、
Figure BPA0000295055720001541
Figure BPA0000295055720001542
并且X是-S-。
在一些实施例中，-L-R1是CH3-、
Figure BPA0000295055720001543
Figure BPA0000295055720001544
X是-S-，W是O，Y是-O-，并且Z是-O-。
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001545
Figure BPA0000295055720001546
或-S-(C1-C10脂肪族)。
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001547
Figure BPA0000295055720001548
在一些实施例中，X是-O-或-S-，并且R1是
Figure BPA0000295055720001549
Figure BPA00002950557200015410
或-S-(C1-C10脂肪族)。
在一些实施例中，X是-O-或-S-，并且R1是
Figure BPA0000295055720001551
Figure BPA0000295055720001552
Figure BPA0000295055720001553
-S-(C1-C10脂肪族)或-S-(C1-C50脂肪族)。
在一些实施例中，L是共价键且-L-R1是R1。
在一些实施例中，-L-R1不是氢。
在一些实施例中，-X-L-R1是，R1是
Figure BPA0000295055720001554
Figure BPA0000295055720001555
Figure BPA0000295055720001556
-S-(C1-C10脂肪族)或-S-(C1-C50脂肪族)。
在一些实施例中，-X-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001561
其中
Figure BPA0000295055720001562
部分任选地被取代。在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001563
在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001564
在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001565
在一些实施例中，-X-L-R1具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001566
其中X′是O或S，Y′是-O-、-S-或-NR′-，并且
Figure BPA0000295055720001567
部分任选地被取代。在一些实施例中，Y′是-O-、-S-或-NH-。在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720001568
是
Figure BPA0000295055720001569
在一些实施例中，
Figure BPA00002950557200015610
是
Figure BPA00002950557200015611
在一些实施例中，
Figure BPA00002950557200015612
是
Figure BPA00002950557200015613
在一些实施例中，-X-L-R1具有以下结构：
Figure BPA00002950557200015614
其中X′是O或S，并且
Figure BPA00002950557200015615
部分任选地被取代。在一些实施例中，
Figure BPA00002950557200015616
是
Figure BPA00002950557200015617
在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA00002950557200015618
其中
Figure BPA00002950557200015619
任选地被取代。在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA00002950557200015620
其中
Figure BPA00002950557200015621
被取代。在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA00002950557200015622
其中
Figure BPA00002950557200015623
是未经取代的。
在一些实施例中，-X-L-R1是R1-C(O)-S-Lx-S-，其中Lx是选自以下的任选地经取代的基团：
Figure BPA0000295055720001571
在一些实施例中，Lx是
Figure BPA0000295055720001572
在一些实施例中，-X-L-R1是(CH3)3C-S-S-Lx-S-。在一些实施例中，-X-L-R1是R1-C(＝X′)-Y′-C(R)2-S-Lx-S-。在一些实施例中，-X-L-R1是R-C(＝X′)-Y′-CH2-S-Lx-S-。在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001573
本领域的普通技术人员将理解，许多本文所述的-X-L-R1基团是可切割的并且可以在施用给受试者后转化为-X-。在一些实施例中，-X-L-R1是可切割的。在一些实施例中，-X-L-R1是-S-L-R1，并且在施用于受试者后转化为-S-。在一些实施例中，转化是通过受试者的酶促进的。如本领域的技术人员所理解的，确定-S-L-R1基团是否在施用后转化为-S-的方法是本领域广泛已知和实践的，包括用于研究药物代谢和药代动力学的那些。
在一些实施例中，具有式I的结构的核苷酸间键联是
Figure BPA0000295055720001574
Figure BPA0000295055720001575
在一些实施例中，式I核苷酸间键联具有式I-a的结构：
Figure BPA0000295055720001576
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，式I核苷酸间键联具有式I-b的结构：
Figure BPA0000295055720001581
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，式I核苷酸间键联是具有式I-c结构的硫代磷酸三酯键联：
Figure BPA0000295055720001582
其中当L是共价键时，R1不是-H。
在一些实施例中，具有式I的结构的核苷酸间键联是
Figure BPA0000295055720001583
Figure BPA0000295055720001584
在一些实施例中，具有式I-c的结构的核苷酸间键联是
Figure BPA0000295055720001585
Figure BPA0000295055720001591
在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸，其包含一个或多个天然磷酸酯键联，和一个或多个具有式I-a、式I-b或式I-c的经修饰的核苷酸间键联。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联具有I的结构。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联具有I-a的结构。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联具有I-b的结构。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联具有I-c的结构。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。可以依照本披露利用的具有式I结构的核苷酸间键联的实例包括以下中描述的那些：US 9394333、US9744183、US 9605019、US 20130178612、US 20150211006、US 9598458、US 20170037399、WO2017/015555、WO 2017/062862，其各自的核苷酸间键联通过引用并入本文。
可以依照本披露利用的核苷酸间键联的非限制性实例还包括本领域中所述的那些，包括但不限于以下任一项中所述的那些：Gryaznov，S.；Chen，J.-K.J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1994，116，3143，Jones等人J.Org.Chem.[有机化学杂志]1993，58，2983，Koshkin等人1998 Tetrahedron[四面体]54：3607-3630，Lauritsen等人2002 Chem.Comm.[化学通讯]5：530-531，Lauritsen等人2003Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]13：253-256，Mesmaeker等人Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版]1994，33，226，Petersen等人2003 TRENDS Biotech.[生物技术趋势]21：74-81，Schultz等人1996 Nucleic Acids Res.[核酸研究]24：2966，Ts′o等人Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]1988，507，220，以及Vasseur等人J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1992，114，4006。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是不非负电的，因为在给定pH下在水溶液中，少于50％、40％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的核苷酸间键联以非负电荷的盐形式存在。在一些实施例中，pH为约pH 7.4。在一些实施例中，pH为约4-9。在一些实施例中，百分比小于10％。在一些实施例中，百分比小于5％。在一些实施例中，百分比小于1％。在一些实施例中，核苷酸间键联是非负电荷的核苷酸间键联，因为核苷酸间键联的中性形式于水中不具有不超过约1、2、3、4、5、6或7的pKa。在一些实施例中，没有pKa为7或更小。在一些实施例中，没有pKa为6或更小。在一些实施例中，没有pKa为5或更小。在一些实施例中，没有pKa为4或更小。在一些实施例中，没有pKa为3或更小。在一些实施例中，没有pKa为2或更小。在一些实施例中，没有pKa为1或更小。在一些实施例中，核苷酸间键联的中性形式的pKa可表示为具有结构CH3-核苷酸间键联-CH3的化合物的中性形式的pKa。例如，具有式I结构的中性形式的核苷酸间键联的pKa可以由具有结构
Figure BPA0000295055720001601
的中性形式的化合物的pKa表示，
Figure BPA0000295055720001602
的pKa可以表示为
Figure BPA0000295055720001603
的pKa。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是带正电的核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含胍部分。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含杂芳基碱基部分。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含三唑部分。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含炔基部分。
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联(例如中性核苷酸间键联)包含-PL(-N＝)-，其中PL如本披露中所述。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联)包含-P(-N＝)-。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联)包含-P(＝)(-N＝)-。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联)包含-P(＝O)(-N＝)-。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联)包含-P(＝S)(-N＝)-。
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联(例如中性核苷酸间键联)包含
Figure BPA0000295055720001611
Figure BPA0000295055720001612
其中PL如本披露中所述。例如，在一些实施例中，PL是P；在一些实施例中，PL是P(O)；在一些实施例中，PL是P(S)；等。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联)包含
Figure BPA0000295055720001613
Figure BPA0000295055720001614
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式(不是负电荷)的结构。在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联)具有式I-n-1或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001615
在一些实施例中，X是共价键且-X-Cy-R1是-Cy-R1。在一些实施例中，-Cy-是任选地经取代的二价基团，其选自具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环和具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环。在一些实施例中，-Cy-是具有1-10个杂原子的任选地经取代的二价5-20元杂芳基环。在一些实施例中，-Cy-R1是具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂芳基环，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，-Cy-R1是具有1-4个杂原子的任选地经取代的5元杂芳基环，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，-Cy-R1是具有1-4个杂原子的任选地经取代的6元杂芳基环，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，-Cy-R1是任选地经取代的三唑基。
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联)具有式I-n-2或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001621
在一些实施例中，R1是R′。在一些实施例中，L是共价键。在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联)具有式I-n-3或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001622
在一些实施例中，不同氮原子上的两个R′一起形成如所述的环。在一些实施例中，所形成的环是5元的。在一些实施例中，所形成的环是6元的。在一些实施例中，所形成的环被取代。在一些实施例中，并未一起形成环的两个R′基团各自独立地是R。在一些实施例中，并未一起形成环的两个R′基团各自独立地是氢或任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，并未一起形成环的两个R′基团各自独立地是氢或任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，并未一起形成环的两个R′基团是相同的。在一些实施例中，并未一起形成环的两个R′基团是不同的。在一些实施例中，两者均为-CH3。
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联)具有式I-n-4或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001631
其中La和Lb各自独立地是L或-N(R1)-，且其他变量各自独立地如本披露中所述。在一些实施例中，L是共价键，并且式I-n-4的核苷酸间键联具有以下结构：
Figure BPA0000295055720001632
或其盐形式，其中每个变量独立地如本披露中所述。
在一些实施例中，La是-N(R1)-。在一些实施例中，La是如本披露中所述的L。在一些实施例中，La是共价键。在一些实施例中，La是-N(R′)-。在一些实施例中，La是-N(R)-。在一些实施例中，La是-O-。在一些实施例中，La是-S-。在一些实施例中，La是-S(O)-。在一些实施例中，La是-S(O)2-。在一些实施例中，La是-S(O)2N(R′)-。在一些实施例中，Lb是-N(R1)-。在一些实施例中，Lb是如本披露中所述的L。在一些实施例中，Lb是共价键。在一些实施例中，Lb是-N(R′)-。在一些实施例中，Lb是-N(R)-。在一些实施例中，Lb是-O-。在一些实施例中，Lb是-S-。在一些实施例中，Lb是-S(O)-。在一些实施例中，Lb是-S(O)2-。在一些实施例中，Lb是-S(O)2N(R′)-。在一些实施例中，La和Lb是相同的。在一些实施例中，La和Lb是不同的。在一些实施例中，La和Lb中的至少一个是-N(R1)-。在一些实施例中，La和Lb中的至少一个是-O-。在一些实施例中，La和Lb中的至少一个是-S-。在一些实施例中，La和Lb中的至少一个是共价键。在一些实施例中，如本文所述，R1是R。在一些实施例中，R1是-H。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-10脂肪族。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-10烷基。在一些实施例中，式I-n-4的结构是式I-n-2的结构。在一些实施例中，式I-n-4的结构是式I-n-3的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联(例如中性核苷酸间键联)具有式I的结构。在一些实施例中，例如在式I、II等中的X是-N(-L-R5)-，其中R5是如本文所述的R。在一些实施例中，X是-NH-。在一些实施例中，例如在式I、II等的-X-L-中的L包含-SO2-。在一些实施例中，L是-SO2-。在一些实施例中，L是共价键。在一些实施例中，L是-C(O)O-(C1-4亚烷基)-，其中亚烷基任选地经取代。在一些实施例中，L是-C(O)OCH2-。在一些实施例中，例如在式I、III等中的R1包含任选地经取代的环。在一些实施例中，R1是如本文所述的R。在一些实施例中，R1是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R1是4-甲基苯基。在一些实施例中，R1是4-甲氧基苯基。在一些实施例中，R1是4-氨基苯基。在一些实施例中，R1是任选地经取代的杂脂肪族环。在一些实施例中，R1是任选地经取代的3-10(例如，3、4、5、6、7、或8)元杂脂肪族环。在一些实施例中，R1是任选地经取代的、具有1-3个杂原子的5或6元饱和单环杂脂肪族环。在一些实施例中，环是5元的。在一些实施例中，环是6元的。在一些实施例中，一个或多个环杂原子的数目为1。在一些实施例中，环杂原子的数目为2。在一些实施例中，杂原子是氧。在一些实施例中，R1是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720001641
在一些实施例中，R1是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720001642
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720001643
在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-30脂肪族。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-10烷基。
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联)具有式II或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001644
或其盐形式，其中：
PL是P(＝W)、P或P→B(R′)3；
W是O、N(-L-R5)、S或Se；
X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R5)-或L；
R5是-H、-L-R′、卤素、-CN、-NO2、-L-Si(R′)3、-OR′、-SR′、或-N(R′)2；
环AL是具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环；
每个Rs独立地是-H、卤素、-CN、-N3、-NO、-NO2、-L-R′、-L-Si(R)3、-L-OR′、-L-SR′、-L-N(R′)2、-O-L-R′、-O-L-Si(R)3、-O-L-OR′、-O-L-SR′或-O-L-N(R′)2；
g是0-20；
每个L独立地是共价键或选自具有1-10个杂原子的C1-30脂肪族基团和C1-30杂脂肪族基团的二价任选地经取代的直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被以下替换：CyL；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个R′独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居于它们之间的该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
在一些实施例中，在本披露的各种结构中的环AL是任选地经取代的芳基环。在一些实施例中，环AL是任选地经取代的苯环。在一些实施例中，环AL是任选地经取代的3-10(例如，3、4、5、6、7、或8)元杂脂肪族环。在一些实施例中，环AL是任选地经取代的、具有1-3个杂原子的5或6元饱和单环杂脂肪族环。在一些实施例中，环是5元的。在一些实施例中，环是6元的。在一些实施例中，一个或多个环杂原子的数目为1。在一些实施例中，环杂原子的数目为2。在一些实施例中，杂原子是氧。在一些实施例中，Rs是任选地经取代的C1-C6烷基基团。在一些实施例中，Rs是Me。在一些实施例中，Rs是-OR，其中R是氢或C1-C6烷基基团。在一些实施例中，Rs是OH。在一些实施例中，Rs是OMe。在一些实施例中，Rs是-N(R′)2。在一些实施例中，Rs是-NH2。在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720001661
是
Figure BPA0000295055720001662
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720001663
是
Figure BPA0000295055720001664
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720001665
是
Figure BPA0000295055720001666
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720001667
是
Figure BPA0000295055720001668
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如式I或II的中性核苷酸间键联)是n002
Figure BPA0000295055720001669
如本领域技术人员将理解的，可以在某些条件下以
Figure BPA00002950557200016610
的形式存在)。在一些实施例中，核苷酸间键联(例如式I或II的中性核苷酸间键联)是n005(
Figure BPA0000295055720001671
如本领域技术人员将理解的，可以在某些条件下以
Figure BPA0000295055720001672
的形式存在)。在一些实施例中，核苷酸间键联(例如式I或II的中性核苷酸间键联)是n006(
Figure BPA0000295055720001673
如本领域技术人员将理解的，可以在某些条件下以
Figure BPA0000295055720001674
的形式存在)。在一些实施例中，核苷酸间键联(例如式I或II的中性核苷酸间键联)是n007(
Figure BPA0000295055720001675
如本领域技术人员将理解的，可以在某些条件下以
Figure BPA0000295055720001676
的形式存在)。
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，式II的非负电荷的核苷酸间键联)具有式II-a-1或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001677
或其盐形式。
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，式II的非负电荷的核苷酸间键联)具有式II-a-2或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001681
或其盐形式。
在一些实施例中，AL通过碳原子与-N＝或L键合。在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，式II或II-a-1、II-a-2的非负电荷的核苷酸间键联)具有式II-b-1或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001682
在一些实施例中，式II-a-1或II-a-2的结构可以被称为式II-a的结构。在一些实施例中，式II-b-1或II-b-2的结构可以被称为式II-b的结构。在一些实施例中，式II-c-1或II-c-2的结构可以被称为式II-c的结构。在一些实施例中，式II-d-1或II-d-2的结构可以被称为式II-d的结构。
在一些实施例中，AL通过碳原子与-N＝或L键合。在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，式II或II-a-1、II-a-2的非负电荷的核苷酸间键联)具有式II-b-2或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001683
在一些实施例中，环AL是(除式II-b的两个氮原子外)具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-20元单环。在一些实施例中，环AL是任选地经取代的5元单环饱和环。
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，式II、II-a或II-b的非负电荷的核苷酸间键联)具有式II-c-1或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001691
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，式II、II-a或II-b的非负电荷的核苷酸间键联)具有式II-c-2或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001692
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，式II、II-a、II-b或II-c的非负电荷的核苷酸间键联)具有式II-d-1或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001693
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，式II、II-a、II-b或II-c的非负电荷的核苷酸间键联)具有式II-d-2或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720001694
在一些实施例中，每个R′独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，每个R′独立地是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个R′独立地是-CH3。在一些实施例中，每个Rs是-H。
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001701
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001702
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001703
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001704
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001705
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001706
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001707
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001708
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001709
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA00002950557200017010
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA00002950557200017011
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001711
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001712
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001713
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001714
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001715
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001716
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001717
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001718
的结构。实施例，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001719
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA00002950557200017110
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001721
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001722
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001723
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001724
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001725
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001726
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001727
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001728
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720001729
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA00002950557200017210
的结构。在一些实施例中，W是O。在一些实施例中，W是S。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是手性受控的。在一些实施例中，键联磷是Rp。在一些实施例中，键联磷是Sp。
在一些实施例中，每个非负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联(例如，式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、或II-d-2的那些)在其键联磷处独立地是Rp。在一些实施例中，每个负电荷的手性核苷酸间键联在其键联磷处均为Sp。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯核苷酸间键联在其键联磷处均为Sp。在一些实施例中，每个天然磷酸酯键联独立地与包含2′-OR修饰(其中R不是-H)的糖键合。在一些实施例中，每个天然磷酸酯键联在3′-位置独立地与包含2′-OR修饰(其中R不是-H)的糖键合。在一些实施例中，不含2′-OR修饰(其中R不是-H)的每个糖独立地与至少一个非天然磷酸酯键联键合，在许多情况下，与两个非天然天然磷酸酯键联键合。在一些实施例中，每个经2′-F修饰的糖独立地与至少一个非天然磷酸酯键联键合，在许多情况下，与两个非天然天然磷酸酯键联键合。在一些实施例中，每个非天然磷酸酯键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个非天然磷酸酯键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个与非负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联(例如，式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、或II-d-2的那些)键合的糖独立地不含2′-OR。在一些实施例中，与非负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联(例如，式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、或II-d-2的那些)键合的每个糖是经2′-F修饰的糖。
在一些实施例中，本披露提供了具有以下结构的化合物，例如寡核苷酸、手性受控的寡核苷酸、提供的组合物(例如，多种寡核苷酸)的寡核苷酸：式O-I：
Figure BPA0000295055720001731
或其盐，其中：
R5s独立地是R′或-OR′；
每个BA独立地是选自以下的任选地经取代的基团：C3-30环脂肪族、C6-30芳基、具有1-10个杂原子的C5-30杂芳基、具有1-10个杂原子的C3-30杂环基、天然核碱基部分和经修饰的核碱基部分；
每个Rs独立地是-H、卤素、-CN、-N3、-NO、-NO2、-L-R′、-L-Si(R)3、-L-OR′、-L-SR′、-L-N(R′)2、-O-L-R′、-O-L-Si(R)3、-O-L-OR′、-O-L-SR′或-O-L-N(R′)2；
每个s独立地是0-20；
每个Ls独立地是-C(R5s)2-或L；
每个L独立地是共价键或选自具有1-10个杂原子的C1-30脂肪族基团和C1-30杂脂肪族基团的二价任选地经取代的直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被以下替换：CyL；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个环A独立地是具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环；
每个LP独立地是核苷酸间键联；
z是1-1000；
L3E是L或-L-L-；
R3E是-R′、-L-R′、-OR′或固体支持物；
每个R′独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居于它们之间的该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
在一些实施例中，每个LP独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III或其盐形式。在一些实施例中，每个LP独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式。在一些实施例中，每个LP独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式。在一些实施例中，核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III或其盐形式。在一些实施例中，核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式。在一些实施例中，每个核苷酸间键联独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III或其盐形式。在一些实施例中，每个核苷酸间键联独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式。在一些实施例中，核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式。在一些实施例中，每个核苷酸间键联独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式。
在一些实施例中，每个BA独立地是选自以下的任选地经取代的基团：具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C5-30杂芳基，以及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷、硼和硅的杂原子的C3-30杂环基；
每个环A独立地是具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环；并且
每个LP独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III或其盐形式。在一些实施例中，每个LP独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式。
在一些实施例中，每个BA独立地是具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的C5-30杂芳基，其中该杂芳基包含一个或多个选自氧和氮的杂原子；
每个环A独立地是具有0-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的5-10元单环或双环饱和环，其中该环包含至少一个氧原子；并且
每个LP独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III或其盐形式。在一些实施例中，每个LP独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式。
在一些实施例中，每个BA独立地是任选地经取代的A、T、C、G或U，或A、T、C、G或U的任选地经取代的互变异构体；
每个环A独立地是具有一个或多个氧原子的任选地经取代的5-7元单环或双环饱和环；并且
每个LP独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III或其盐形式。在一些实施例中，每个LP独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式。
在一些实施例中，每个BA独立地是选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、胸腺嘧啶和尿嘧啶以及其互变异构体的任选地经取代的或受保护的核碱基；
每个环A独立地是具有一个或多个氧原子的任选地经取代的5-7元单环或双环饱和环；并且
每个LP独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III或其盐形式。在一些实施例中，每个LP独立地具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、H-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式。
在一些实施例中，BA是选自以下的任选地经取代的基团：C3-30环脂肪族，C6-30芳基，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C5-30杂芳基，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C3-30杂环基，天然核碱基部分和经修饰的核碱基部分。在一些实施例中，BA是选自以下的任选地经取代的基团：具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C5-30杂芳基，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C3-30杂环基，天然核碱基部分和经修饰的核碱基部分。在一些实施例中，BA是选自以下的任选地经取代的基团：具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C5-30杂芳基，天然核碱基部分和经修饰的核碱基部分。在一些实施例中，BA是具有1-10个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的任选地经取代的C5-30杂芳基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的天然核碱基及其互变异构体。在一些实施例中，BA是受保护的天然核碱基及其互变异构体。用于寡核苷酸合成的各种核碱基保护基团是已知的，且可依照本披露利用。在一些实施例中，BA是选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任选地经取代的核碱基及其互变异构体。在一些实施例中，BA是选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任选地受保护的核碱基及其互变异构体。
在一些实施例中，BA是任选地经取代的C3-30环脂肪族。在一些实施例中，BA是任选地经取代的C6-30芳基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的C3-30杂环基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的C5-30杂芳基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的天然碱基部分。在一些实施例中，BA是任选地经取代的经修饰的碱基部分。BA是选自以下的任选地经取代的基团：C3-30环脂肪族、C6-30芳基、C3-30杂环基和C5-30杂芳基。在一些实施例中，BA是选自以下的任选地经取代的基团：C3-30环脂肪族、C6-30芳基、C3-30杂环基、C5-30杂芳基和天然核碱基部分。
在一些实施例中，BA通过芳环连接。在一些实施例中，BA通过杂原子连接。在一些实施例中，BA通过芳环的环杂原子连接。在一些实施例中，BA通过芳环的环氮原子连接。
在一些实施例中，BA是天然核碱基部分。在一些实施例中，BA是任选地经取代的天然核碱基部分。在一些实施例中，BA是经取代的天然核碱基部分。在一些实施例中，BA是任选地经取代的A、T、C、U、或G，或任选地经取代的A、T、C、U、或G的互变异构体。在一些实施例中，BA是天然核碱基A、T、C、U或G。在一些实施例中，BA是选自以下的任选地经取代的基团：天然核碱基A、T、C、U和G。
在一些实施例中，BA是任选地经取代的嘌呤碱基残基。在一些实施例中，BA是受保护的嘌呤碱基残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的腺嘌呤残基。在一些实施例中，BA是受保护的腺嘌呤残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的鸟嘌呤残基。在一些实施例中，BA是受保护的鸟嘌呤残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的胞嘧啶残基。在一些实施例中，BA是受保护的胞嘧啶残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的胸腺嘧啶残基。在一些实施例中，BA是受保护的胸腺嘧啶残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的尿嘧啶残基。在一些实施例中，BA是受保护的尿嘧啶残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的5-甲基胞嘧啶残基。在一些实施例中，BA是受保护的5-甲基胞嘧啶残基。
在一些实施例中，BA是如用于寡核苷酸制备中的受保护碱基残基。在一些实施例中，BA是在US 2011/0294124、US 2015/0211006、US 2015/0197540和WO 2015/107425(将其各自通过引用并入本文)中示出的碱基残基。
在一些实施例中，R5s-Ls-是-CH2OH。在一些实施例中，R5s-Ls-是-CH(R5s)-OH，其中R5s如本披露中所述。在一些实施例中，Ls是-CH2-。在一些实施例中，Ls是-CH(R5s)-，其中R5s不是-H。在一些实施例中，Ls是-CH(R5s)-，其中R5s不是-H，否则是R。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是甲基。在一些实施例中，其中R5s不是-H的-CH(R5s)-具有是R。在一些实施例中，其中R5s不是-H的-CH(R5s)-具有是S。
变量(例如每个式的变量)的示例实施例另外描述于本披露中，并且可以独立地且任选地组合。
在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸和寡核苷酸组合物。例如，在一些实施例中，提供的组合物含有受控水平的一个或多单独的寡核苷酸类型，其中寡核苷酸类型由以下定义：1)碱基序列；2)骨架键联模式；3)骨架手性中心模式；和4)骨架P-修饰模式。在一些实施例中，同一寡核苷酸类型的寡核苷酸是相同的。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸是交替体。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是P-修饰交替体。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是立体交替体。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸是嵌段体。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是P-修饰嵌段体。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是立体嵌段体。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸是缺口体。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸是跳过体。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸是半聚体。在一些实施例中，半聚体是5′-端或3′-端的序列具有寡核苷酸其余部分不具有的结构特征的寡核苷酸。在一些实施例中，5′-端或3′-端具有或包含2至20个核苷酸。在一些实施例中，结构特征是碱基修饰。在一些实施例中，结构特征是糖修饰。在一些实施例中，结构特征是P-修饰。在一些实施例中，结构特征是手性核苷酸间键联的立体化学。在一些实施例中，结构特征是或包含手性核苷酸间键联的碱基修饰、糖修饰、P-修饰或立体化学或其组合。在一些实施例中，半聚体是5′-端序列的每个糖部分共享共同修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，半聚体是3′-端序列的每个糖部分共享共同修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，5′或3′端序列的共同糖修饰不被寡核苷酸中的任何其他糖部分所共享。在一些实施例中，示例半聚体是一种寡核苷酸，其一个末端包含经取代或未经取代的2′-O-烷基糖修饰的核苷、经双环糖修饰的核苷、β-D-核糖核苷或β-D-脱氧核糖核苷(例如经2′-MOE修饰的核苷及经LNATM或ENATM双环糖修饰的核苷)的序列且另一末端包含具有不同糖部分的核苷(例如经取代或未经取代的经2′-O-烷基糖修饰的核苷、经双环糖修饰的核苷或天然核苷)的序列。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是单聚体、交替体、嵌段体、缺口体、半聚体和跳过体中的一个或多个的组合。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是单聚体、交替体、嵌段体、缺口体及跳过体中的一个或多个的组合。例如，在一些实施例中，提供的寡核苷酸是交替体和缺口体两者。在一些实施例中，提供的核苷酸是缺口体和跳过体两者。化学及合成技术中的技术人员将认识到，诸多其他模式组合是可用的且仅受用于依照本披露方法合成所提供寡核苷酸所需的组成部分的商业可获得性和/或合成可行性限制。在一些实施例中，半聚体结构提供有利益处。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是在5′-端序列中包含经修饰的糖部分的5′-半聚体。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是在5′-端序列中包含经修饰的2′-糖部分的5′-半聚体。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的核苷酸。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的核苷。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含LNA的一个或多个任选地经取代的核苷或糖。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的天然核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的经修饰的核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞嘧啶或5-羧基胞嘧啶。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞苷。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的糖。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的天然存在的DNA和RNA中所发现的糖。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的核糖或脱氧核糖。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的核糖或脱氧核糖，其中核糖或脱氧核糖部分的一个或多个羟基基团任选地且独立地被以下替换：卤素、R′、-N(R′)2、-OR′、或-SR′，其中每个R′独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2′位置任选地且独立地被以下取代：R2s、卤素、R′、-N(R′)2、-OR′、或-SR′，其中每个R′独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2′位置任选地且独立地被以下取代：卤素。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2′位置任选地且独立地被以下取代：一个或多个-F卤素。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2′位置任选地且独立地被以下取代：-OR′，其中每个R′独立地如上文所定义和本文所述。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2′位置任选地且独立地被以下取代：-OR′，其中每个R′独立地是任选地经取代的C1-C6脂肪族。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2′位置任选地且独立地被以下取代：-OR′，其中每个R′独立地是任选地经取代的C1-C6烷基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2′位置任选地且独立地被以下取代：-OMe。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2′位置任选地且独立地被以下取代：-O-甲氧基乙基。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸是单链寡核苷酸。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是杂合的寡核苷酸链。在某些实施例中，提供的寡核苷酸是部分杂合的寡核苷酸链。在某些实施例中，提供的寡核苷酸是完全杂合的寡核苷酸链。在某些实施例中，提供的寡核苷酸是双链寡核苷酸。在某些实施例中，提供的寡核苷酸是三链寡核苷酸(例如，三链体)。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸是嵌合的。例如，在一些实施例中，提供的寡核苷酸是DNA-RNA嵌合体、DNA-LNA嵌合体等。
在一些实施例中，寡核苷酸是WO 2012/030683中描述的寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸变体。例如，在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸变体包含WO 2012/030683中不是手性受控的手性核苷酸间键联的手性受控形式。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸变体包含一个或多个手性受控的核苷酸间键联，这些手性受控的核苷酸间键联独立地代替WO2012/030683中的一个或多个天然磷酸酯键联或非手性受控的经修饰的核苷酸间键联。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸是或包含以下部分：GNA、LNA、PNA、TNA或吗啉代。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为约15至约25个核苷酸单元。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸单元。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含可以在键联磷处是手性的、以及是手性受控的一个或多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个LPO、LPA或LPB键联，其中：
每个LPO独立地是
Figure BPA0000295055720001821
或其盐形式；
每个LPA独立地是具有以下结构的核苷酸间键联：
Figure BPA0000295055720001831
Figure BPA0000295055720001832
或其盐形式；
每个LPB独立地是具有以下结构的核苷酸间键联：
Figure BPA0000295055720001833
Figure BPA0000295055720001834
或其盐形式；
Nx是-N(-L-R5)-L-R1、
Figure BPA0000295055720001835
Figure BPA0000295055720001836
并且
WN是＝N-L-R5、
Figure BPA0000295055720001837
Figure BPA0000295055720001838
其中其他变量各自独立地如本文所述。
在一些实施例中，每个LPO独立地是
Figure BPA0000295055720001841
Figure BPA0000295055720001842
或其盐形式。
在一些实施例中，-O-L-R1是-OH。在一些实施例中，-X-L-R1(例如在LPO中)是-OCH2CH2CN。在一些实施例中，-S-L-R1是-SH。在一些实施例中，LPA是具有指定立体化学的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，LPB是具有指定立体化学的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，X是-O-，并且-X-L-R1如本披露中所述，例如，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001843
Figure BPA0000295055720001844
Figure BPA0000295055720001845
其中每个变量独立地依照本披露，或H-X-L-R1是如本文所述的手性助剂。在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001846
其中G4和G5一起形成如本文所述的任选地经取代的环。在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001847
或
Figure BPA0000295055720001851
在一些实施例中，G2是如本文所述的-CH2Si(R)3。在一些实施例中，G2是-CH2Si(Ph)2Me。在一些实施例中，G2包含如本文所述的吸电子基团，例如在一些实施例中，G2是如本文所述的-CH2SO2R。在一些实施例中，G2是-CH2SO2Ph。
在一些实施例中，Nx是-N(-L-R5)-L-R1，并且具有这种Nx基团的核苷酸间键联是具有式I(PL是P＝O，Y和Z是-O-，并且X是-N(-L-R5)-)的结构的核苷酸间键联，其中键联磷的立体化学如所指定。在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001852
并且具有这种Nx基团的核苷酸间键联是具有式II(PL是P＝O，Y和Z是-O-，并且X是-N(-L-R5)-)的结构的核苷酸间键联，其中键联磷的立体化学如所指定。在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001853
在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001854
在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001855
在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001856
在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001857
并且具有这种Nx基团的核苷酸间键联是具有式I-n-3(PL是P＝O，并且Y和Z是-O-)的结构的核苷酸间键联，其中键联磷的立体化学如所指定。在一些实施例中，R1是任选地经取代的烷基。在一些实施例中，R1是甲基。在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001858
在一些实施例中，在同一氮上的两个R1独立地一起形成如本文所述的任选地经取代的环，例如，除氮原子外还具有1-3个杂原子的任选地经取代的5或6元环。在一些实施例中，环是饱和的。在一些实施例中，环是单环的。在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001861
在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001862
在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001863
本领域技术人员将理解，在结构或式中的任两个-N(R1)2基团可以相同或不同。在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001864
并且具有这种Nx基团的核苷酸间键联是具有式I-n-4(PL是P＝O，L是共价键，并且Y和Z是-O-)的结构的核苷酸间键联，其中键联磷的立体化学如所指定。在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001865
并且具有这种Nx基团的核苷酸间键联是具有式II-a-1(PL是P＝O，L是共价键，并且Y和Z是-O-)的结构的核苷酸间键联，其中键联磷的立体化学如所指定。在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001866
并且具有这种Nx基团的核苷酸间键联是具有式II-b-1(PL是P＝O，L是共价键，并且Y和Z是-O-)的结构的核苷酸间键联，其中键联磷的立体化学如所指定。在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001867
并且具有这种Nx基团的核苷酸间键联是具有式II-c-1(PL是P＝O，L是共价键，并且Y和Z是-O-)的结构的核苷酸间键联，其中键联磷的立体化学如所指定。在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001868
并且具有这种Nx基团的核苷酸间键联是具有式II-d-1(PL是P＝O，L是共价键，并且Y和Z是-O-)的结构的核苷酸间键联，其中键联磷的立体化学如所指定。在一些实施例中，R′或Rs是任选地经取代的烷基。在一些实施例中，R′或Rs是-CH3。在一些实施例中，R′或Rs是-CH2(CH2)10CH3。在一些实施例中，Rs是-H。在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001871
在一些实施例中，Nx是
Figure BPA0000295055720001872
在一些实施例中，P＝WN是如本文中所述的PN基团。在一些实施例中，WN是
Figure BPA0000295055720001873
其中每个变量如本文所述(例如，Nx)。在一些实施例中，WN是
Figure BPA0000295055720001874
在一些实施例中，如本文所述的R′或Rs是任选地经取代的烷基或-H。在一些实施例中，R′是-CH3。在一些实施例中，R’是-CH2(CH2)10CH3。在一些实施例中，Rs是-H。在一些实施例中，WN是
Figure BPA0000295055720001875
在一些实施例中，WN是
Figure BPA0000295055720001876
在一些实施例中，WN是＝N-L-R5，其中每个变量如本文所述。例如，在一些实施例中，L是-SO2-。在一些实施例中，L是-C(O)OCH2-。在一些实施例中，如本文所述，R5是或包含任选地经取代的环。在一些实施例中，R5是如本文所述的R。在一些实施例中，R5是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R5是4-甲基苯基。在一些实施例中，R5是4-甲氧基苯基。在一些实施例中，R5是4-氨基苯基。在一些实施例中，R5是任选地经取代的杂脂肪族环。在一些实施例中，R5是任选地经取代的3-10(例如，3、4、5、6、7、或8)元杂脂肪族环。在一些实施例中，R5是任选地经取代的、具有1-3个杂原子的5或6元饱和单环杂脂肪族环。在一些实施例中，环是5元的。在一些实施例中，环是6元的。在一些实施例中，一个或多个环杂原子的数目为1。在一些实施例中，环杂原子的数目为2。在一些实施例中，杂原子是氧。在一些实施例中，R5是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720001877
在一些实施例中，R5是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720001881
在一些实施例中，R5是
Figure BPA0000295055720001882
在一些实施例中，R5是任选地经取代的C1-30脂肪族。在一些实施例中，R5是任选地经取代的C1-10烷基。在一些实施例中，WN是
Figure BPA0000295055720001883
在一些实施例中，WN是
Figure BPA0000295055720001884
在一些实施例中，WN是
Figure BPA0000295055720001885
在一些实施例中，WN是
Figure BPA0000295055720001886
在一些实施例中，WN是
Figure BPA0000295055720001887
在一些实施例中，WN是
Figure BPA0000295055720001888
Q-。在一些实施例中，WN是
Figure BPA0000295055720001889
在一些实施例中，WN是
Figure BPA00002950557200018810
在一些实施例中，WN是
Figure BPA00002950557200018811
在一些实施例中，WN是
Figure BPA00002950557200018812
在一些实施例中，Q-是PF6 -。
在一些实施例中，
Figure BPA00002950557200018813
中的-X-L-R1是
Figure BPA00002950557200018814
在一些实施例中，
Figure BPA00002950557200018815
中的-X-L-R1是
Figure BPA00002950557200018816
在一些实施例中，G2是如本文所述的-CH2Si(R)3。在一些实施例中，G2是-CH2Si(Ph)2Me。在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720001891
中的-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001892
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720001893
中的-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001894
在一些实施例中，G2包含如本文所述的吸电子基团。在一些实施例中，G2是-CH2SO2R，其中R不是-H。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，G2是-CH2SO2Ph。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族，例如叔丁基。在一些实施例中，如本文所述，R1是-C(O)R′。在一些实施例中，R1是-C(O)CH3。在一些实施例中，R1是-H。
在一些实施例中，LPO是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，LPA是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，LPA是Rp非负电荷的核苷酸间键联，例如n001。在一些实施例中，LPB是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，LPB是Sp非负电荷的核苷酸间键联，例如n001。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个LPO键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个LPA键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个LPB键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含独立地选自LPO、LPA或LPB的一个或多个核苷酸间键联。在一些实施例中，每个核苷酸间键联独立地选自LPO、LPA和LPB。在一些实施例中，每个核苷酸间键联独立地选自LPA和LPB。在一些实施例中，至少一个核苷酸间键联是LPA或LPB。在一些实施例中，每个手性受控的核苷酸间键联均独立地选自LPA和LPB。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸(例如，手性受控的寡核苷酸)及其组合物(例如，手性受控的寡核苷酸组合物)，其中寡核苷酸或其区域的核苷酸间键联是或包含以下连续的核苷酸间键联(从5′至3′)：
(LPX/LPO)t[(LPA)n(LPB)m]y、(LPX/LPO)t[(LPO)n(LPB)m]y、(LPX/LPO)t[(LPO/LPA)n(LPB)m]y、[(LPA)n(LPB)m]y、[(LPO)n(LPB)m]y、((LPB)t[(LPA)n(LPB)m]y、(LPB)t[(LPO)n(LPB)m]y、(LPB)t[(LPO/LPA)n(LPB)m]y、[(LPA)n(LPB)m]y、[(LPO)n(LPB)m]y、[(LPO/LPA)n(LPB)m]y、(LPA)t(LPX)n(LPA)m、(LPA)t(LPB)n(LPA)m、(LPA)t[(LPX/LPO)n]y(LPA)m、(LPA)t[(LPB/LPX)n]y(LPA)m、(LPA)t[(LPB/LPO)n]y(LPA)m、(LPX/LPO)t(LPX)n(LPX/LPO)m、(LPX/LPO)t(LPB)n(LPX/LPO)m、(LPX/LPO)t[(LPX/LPO)n]y(LPX/LPO)m、(LPX/LPO)t[(LPB/LPO)n]y(LPX/LPO)m、(LPX/LPO)t[(LPB/LPO)n]y(LPX/LPO)m、(LPA/LPO)t(LPX)n(LPA/LPO)m、(LPA/LPO)t(LPB)n(LPA/LPO)m、(LPA/LPO)t[(LPX/LPO)n]y(LPA/LPO)m、(LPA/LPO)t[(LPB/LPO)n]y(LPA/LPO)m、或(LPA/LPO)t[(LPB/LPO)n]y(LPA/LPO)m或其组合，其中：
每个LPX独立地是LPA或LPB；并且
其他变量各自独立地如本文所述。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸或其区域的核苷酸间键联包含或是连续的核苷酸间键联[(LPA)n(LPB)m]y、[(LPO)n(LPB)m]y、(LPB)t[(LPA)n(LPB)m]y、或(LPB)t[(LPO)n(LPB)m]y。在一些实施例中，提供的寡核苷酸或其区域的核苷酸间键联包含或是连续的核苷酸间键联(LPA)(LPB)m。在一些实施例中，提供的寡核苷酸或其区域的核苷酸间键联包含或是连续的核苷酸间键联[(LPA)(LPB)m]y。在一些实施例中，提供的寡核苷酸或其区域的核苷酸间键联包含或是连续的核苷酸间键联(LPB)t(LPA)(LPB)m。在一些实施例中，两个连续的核苷酸间键联之间的每个糖独立地不含2′-修饰。在一些实施例中，两个连续的核苷酸间键联之间的每个糖独立地是
Figure BPA0000295055720001901
在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，y是1。在一些实施例中，y是2-10。在一些实施例中，t是1。在一些实施例中，t是2-10。在一些实施例中，t是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，n是1，并且m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些实施例中，t是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，n是1，并且m是2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些实施例中，t是2-10，n是1，并且m是2-10。在一些实施例中，每个LPA独立地是
Figure BPA0000295055720001902
或
Figure BPA0000295055720001903
或其盐形式。在一些实施例中，每个LPB独立地是
Figure BPA0000295055720001911
或
Figure BPA0000295055720001912
或其盐形式。在一些实施例中，每个LPA独立地是
Figure BPA0000295055720001913
或其盐形式，并且每个LPB各自独立地是
Figure BPA0000295055720001914
或其盐形式。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸或其区域的核苷酸间键联包含或是连续的核苷酸间键联(从5′至3′)(LPO)m(LPA/LPB)n、LPO(LPA/LPB)n、(LPO)m(LPB)n、LPO(LPB)n、[(LPO)m(LPA/LPB)n]y、[LPO(LPA/LPB)n]y、[(LPO)m(LPB)n]y、[LPO(LPB)n]y、(LPA/LPB)t(LPO)m(LPA/LPB)n、(LPA/LPB)tLPO(LPA/LPB)n、(LPA/LPB)t(LPO)m(LPB)n、(LPA/LPB)tLPO(LPB)n、(LPA/LPB)t[(LPO)m(LPA/LPB)n]y、(LPA/LPB)t[LPO(LPA/LPB)n]y、(LPA/LPB)t[(LPO)m(LPB)n]y、(LPA/LPB)t[LPO(LPB)n]y、(LPO)m(LPA/LPB)n(LPA/LPB)t、LPO(LPA/LPB)n(LPA/LPB)t、(LPO)m(LPB)n(LPA/LPB)t、LPO(LPB)n(LPA/LPB)t、[(LPO)m(LPA/LPB)n]y(LPA/LPB)t、[LPO(LPA/LPB)n]y(LPA/LPB)t、[(LPO)m(LPB)n]y(LPA/LPB)t、[LPO(LPB)n]y(LPA/LPB)t、(LPA/LPB)t[(LPO)m(LPA/LPB)n]y(LPA/LPB)t、LPB(LPA/LPB)t[(LPO)m(LPA/LPB)n]y(LPA/LPB)tLPB、(LPA/LPB)t[(LPO)m(LPB)n]y(LPA/LPB)t、LPB(LPA/LPB)t[(LPO)m(LPB)n]y(LPA/LPB)tLPB、(LPA/LPB)t[(LPO)(LPA/LPB)]y(LPA/LPB)t、LPB(LPA/LPB)t[(LPO)(LPA/LPB)]y(LPA/LPB)tLPB、(LPA/LPB)t[(LPO)(LPB)]y(LPA/LPB)t、LPB(LPA/LPB)t[(LPO)(LPB)]y(LPA/LPB)tLPB或其组合，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，(LPA/LPB)t中至少一个LPA/LPB是LPA。在一些实施例中，(LPA/LPB)t中至少一个LPA/LPB是LPB。在一些实施例中，(LPA/LPB)t中至少一个LPA/LPB是LPA，并且(LPA/LPB)t中至少一个LPA/LPB是LPB。在一些实施例中，(LPA/LPB)m中至少一个LPA/LPB是LPA。在一些实施例中，(LPA/LPB)m中至少一个LPA/LPB是LPB。在一些实施例中，(LPA/LPB)m中至少一个LPA/LPB是LPA，并且(LPA/LPB)m中至少一个LPA/LPB是LPB。在一些实施例中，(LPA/LPB)m中每个LPA/LPB是LPB。在一些实施例中，在其3′-碳处与LPO键联键合的糖包含2′-修饰，其中该2′-修饰不是2′-F。在一些实施例中，在其3′-碳处与LPO键联键合的糖独立地是
Figure BPA0000295055720001921
其中R2s不是-H或-OH。在一些实施例中，在其3′-碳处与LPO键联键合的每个糖独立地是
Figure BPA0000295055720001922
Figure BPA0000295055720001923
其中R2s不是-H或-OH。在一些实施例中，在其3′-碳处与LPO键联键合的每个糖独立地是
Figure BPA0000295055720001924
其中R2s不是-H或-OH。在一些实施例中，R4s是-H。在一些实施例中，R2s不是-H、-F或-OH。在一些实施例中，在其3′-碳处与LPO键联键合的每个糖独立地是
Figure BPA0000295055720001925
其中R2s不是-H、-F或-OH。在一些实施例中，R2s是-OR′，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R2s是-OMe。在一些实施例中，5′-端糖、3′-端糖、和/或LPA/LPB与LPA/LPB之间的糖包含2′-F修饰。在一些实施例中，5′-端糖、3′-端糖、和/或LPA/LPB与LPA/LPB之间的糖是
Figure BPA0000295055720001926
其中R2s是-F。在一些实施例中，包含2′-F的每个糖(例如在其3′-碳处)键合至经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是LPA或LPB。在一些实施例中，每个LPA独立地是
Figure BPA0000295055720001931
或其盐形式。在一些实施例中，每个LPB独立地是
Figure BPA0000295055720001932
或其盐形式。在一些实施例中，t是2-10。在一些实施例中，每个LPA独立地是
Figure BPA0000295055720001933
或其盐形式，并且每个LPB独立地是
Figure BPA0000295055720001934
或其盐形式。在一些实施例中，提供的寡核苷酸中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是LPO(其中-X-L-R1不是-H)、
Figure BPA0000295055720001935
Figure BPA0000295055720001936
或其盐形式。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是
Figure BPA0000295055720001937
Figure BPA0000295055720001941
或其盐形式。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是
Figure BPA0000295055720001942
或其盐形式。在一些实施例中，m是1。在一些实施例中，每个m是1。在一些实施例中，n是2或更大。在一些实施例中，每个n是2或更大。在一些实施例中，t是1。在一些实施例中，t是2或更大。在一些实施例中，t是3。在一些实施例中，t是4。在一些实施例中，t是5。在一些实施例中，t是6。在一些实施例中，t是7。在一些实施例中，t是8。在一些实施例中，t是9。在一些实施例中，t是10。在一些实施例中，每个t独立地是2或更大。在一些实施例中，每个t独立地是3或更大。在一些实施例中，每个t独立地是4或更大。在一些实施例中，每个t独立地是5或更大。
在一些实施例中，LPO、LPA和LPB各自独立地通过其3′碳键合到5′糖以及通过其5′碳键合到3′糖，例如每个LPA独立地是具有以下结构的核苷酸间键联：
Figure BPA0000295055720001943
或其盐形式；每个LPB独立地是具有以下结构的核苷酸间键联：
Figure BPA0000295055720001944
Figure BPA0000295055720001951
或其盐形式。本文描述了示例糖结构，例如，在一些实施例中，每个糖部分独立地具有
Figure BPA0000295055720001952
Figure BPA0000295055720001953
的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。
在一些实施例中，LPO具有如本文针对天然磷酸酯键联所述的模式、位置、数目、百分比等。在一些实施例中，LPA具有如本文针对Rp核苷酸间键联所述的模式、位置、数目、百分比等。在一些实施例中，Rp核苷酸间键联是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，Rp核苷酸间键联是Rp非负电荷的核苷酸间键联(例如n001)。在一些实施例中，LPB具有如本文针对Sp核苷酸间键联所述的模式、位置、数目、百分比等。在一些实施例中，Sp核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，Sp核苷酸间键联是Sp非负电荷的核苷酸间键联(例如n001)。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其中从5′-端第一个核苷酸间键联是O5P的核苷酸间键联，并且其他核苷酸间键联各自独立地选自OP、*PD、*PDS、*PDR、*N、*NS和*NR，其中：
O5P是
Figure BPA0000295055720001954
LPO、LPA、LPB，或其盐形式；
每个OP独立地是LPO；
每个*PD独立地是
Figure BPA0000295055720001961
或其盐形式；
每个*PDS独立地是
Figure BPA0000295055720001962
或其盐形式；
每个*PDR独立地是
Figure BPA0000295055720001963
或其盐形式；
每个*N独立地是
Figure BPA0000295055720001964
Figure BPA0000295055720001965
或其盐形式；
每个*NS独立地是
Figure BPA0000295055720001966
或其盐形式；并且
每个*NR独立地是
Figure BPA0000295055720001971
或其盐形式；
其中每个变量独立地如本文所述，其中-X-L-R1不是-OH。
在一些实施例中，O5P独立地是
Figure BPA0000295055720001972
Figure BPA0000295055720001973
LPO、LPA、LPB，或其盐形式。在一些实施例中，每个OP独立地是LPO。在一些实施例中，每个*PD独立地是或
Figure BPA0000295055720001974
或其盐形式。在一些实施例中，每个*PDS独立地是或
Figure BPA0000295055720001975
或其盐形式。在一些实施例中，每个*PDR独立地是或
Figure BPA0000295055720001976
或其盐形式。在一些实施例中，每个*N独立地是或
Figure BPA0000295055720001981
或其盐形式。在一些实施例中，每个*NS独立地是或
Figure BPA0000295055720001982
或其盐形式。在一些实施例中，每个*NR独立地是或
Figure BPA0000295055720001983
或其盐形式。
在一些实施例中，X是-O-。在一些实施例中，-L-R1含有吸电子基团。在一些实施例中，-L-R1是-CH2G2，其中亚甲基单元任选地被取代。在一些实施例中，-L-R1是-CH(R′)G2。在一些实施例中，G2不包含手性元素，并且G2包含如本文所述的吸电子基团，例如在一些实施例中，G2是-CH2CN(例如，在O5P、OP、*PD、或*N中，其中键联磷不是手性受控的)。在一些实施例中，G2包含手性元素，例如，其中键联磷是手性受控的。在一些实施例中，-X-L-R1具有如下结构使得H-X-L-R1是本文所述的手性试剂或本文所述的加帽手性试剂，其中手性试剂(通常具有-W1-H或-W2-H，其包含氨基基团-NHG5-)的氨基基团被加帽，例如用-C(O)R′(替换-H，例如-N[-C(O)R′]G5-)。在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001984
Figure BPA0000295055720001985
Figure BPA0000295055720001991
其中每个变量独立地依照本披露。在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720001992
Figure BPA0000295055720001993
其中每个变量独立地依照本披露。在一些实施例中，R1是-H或-C(O)R′。在一些实施例中，其中R1是-H，例如在O5P中。在一些实施例中，R1是-C(O)R’(例如，在O5P、OP、*PDS、*PDR、*NS、*NR等中)。在一些实施例中，R1是CH3C(O)-。在一些实施例中，如本文所述，G2是在一些实施例中，G2是-C(R)2Si(R)3，其中-C(R)2-是任选地经取代的-CH2-，并且-Si(R)3的每个R独立地是选自以下的任选地经取代的基团：C1-10脂肪族、杂环基、杂芳基和芳基。在一些实施例中，G2是-CH2Si(Me)(Ph)2。在一些实施例中，例如在*PDS、*PDR等中，G2是-CH2Si(Me)(Ph)2。在一些实施例中，G2包含如本文所述的吸电子基团。在一些实施例中，G2是-C(R)2SO2R′，其中-C(R)2-是任选地经取代的-CH2-，并且R′是选自以下的任选地经取代的基团：C1-10脂肪族、杂环基、杂芳基和芳基。在一些实施例中，R′是苯基。在一些实施例中，例如在*NS、*NR等中，G2是-CH2SO2Ph。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸(“第一寡核苷酸”)，其具有与本文表中描述的寡核苷酸或例如US 20150211006、US 20170037399、US 20180216107、US20180216108、US 20190008986、WO 2017/015555、WO 2017/015575、WO 2017/062862、WO2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/022473、WO2018/067973、WO 2018/098264、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/032612等中描述的寡核苷酸(其各自的寡核苷酸通过引用并入本文)(“第二寡核苷酸”，该第二寡核苷酸包含经修饰的核苷酸间键联)相同的结构，不同之处在于，与该第二寡核苷酸相比，在该第一寡核苷酸中：
从5′-端开始的第一核苷酸间键联是O5P的核苷酸间键联；并且对于其余键联：
在存在第二寡核苷酸中的磷酸酯键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的OP的键联；
在存在第二寡核苷酸中的立体随机的硫代磷酸酯键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*PD的键联；
在存在第二寡核苷酸中的Sp硫代磷酸酯键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*PDS的键联；
在存在第二寡核苷酸中的Rp硫代磷酸酯键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*PDR的键联；
在存在第二寡核苷酸中的立体随机的非负电荷的核苷酸间键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*N的键联；
在存在第二寡核苷酸中的Sp非负电荷的核苷酸间键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*NS的键联；
在存在第二寡核苷酸中的Rp非负电荷的核苷酸间键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*NR的键联，并且
该第一寡核苷酸中的每个核碱基任选地且独立地受保护(例如，如在寡核苷酸合成中)，并且该第一寡核苷酸中的每个另外的化学部分(如果存在)任选地且独立地受保护(例如，碳水化合物部分中的-OH保护为-OAc)。
在一些实施例中，在存在第二寡核苷酸中的磷酸酯键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的OP的键联；在存在第二寡核苷酸中的立体随机的硫代磷酸酯键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*PD的键联；在存在第二寡核苷酸中的Sp硫代磷酸酯键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*PDS的键联；在存在第二寡核苷酸中的Rp硫代磷酸酯键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*PDR的键联；在存在第二寡核苷酸中的立体随机的非负电荷的核苷酸间键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*N的键联；在存在第二寡核苷酸中的Sp非负电荷的核苷酸间键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*NS的键联；在存在第二寡核苷酸中的Rp非负电荷的核苷酸间键联的每个位置处，独立地存在第一寡核苷酸中的*NR的键联，并且第一寡核苷酸中的每个核碱基任选地且独立地受保护(例如，寡核苷酸合成中)，并且第一寡核苷酸中的每个另外的化学部分(如果存在)任选地且独立地受保护(例如，碳水化合物部分中的-OH保护为-OAc)其中O5P、OP、*PD、*PDS、*PDR、*N、*NS和*NR各自独立地如本文所述。在一些实施例中，这种寡核苷酸任选地通过接头(例如CPG的CNA接头)与支持物相连。在一些实施例中，如本领域技术人员所理解的，在-X-L-R1的去除过程后，O5P、OP、*PD、*PDS、*PDR、*N、*NS或*NR的键联变为其替换的键联。在一些实施例中，此类寡核苷酸(例如，第一寡核苷酸)是用于制备其相应的寡核苷酸(例如，第二寡核苷酸)的有用的中间体。在一些实施例中，本披露提供了提供的第一寡核苷酸或其立体异构体的手性受控的寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，如本领域技术人员所理解的，WN具有如下结构使得其N-部分具有与其替换的非负电荷的核苷酸间键联的N-部分相同的非氢原子以及非氢原子的连接(不考虑单键联、双键联或三键联等)。例如，在一些实施例中，*N中的PN是
Figure BPA0000295055720002011
(例如*N是n001P)，其对应的非负电荷的核苷酸间键联是n001。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸具有与本文表(例如，表A1)中列出的寡核苷酸相同的“描述”，不同之处在于：
寡核苷酸包含OP的至少一个键联，和/或在存在磷酸酯键联的寡核苷酸的每个位置处，独立地存在OP的键联，其中OP是
Figure BPA0000295055720002012
在存在立体随机的硫代磷酸酯键联的每个位置处，独立地存在*PD的键联，其中*PD是
Figure BPA0000295055720002013
在存在Sp硫代磷酸酯键联的每个位置处，独立地存在*PDS的键联，其中*PDS是
Figure BPA0000295055720002014
在存在Rp硫代磷酸酯键联的每个位置处，独立地存在*PDR的键联，其中*PDR是
Figure BPA0000295055720002021
在存在立体随机的n001的每个位置处，独立地存在*N的键联，其中*N是
Figure BPA0000295055720002022
(如本领域技术人员所理解的，它与阴离子(例如，Q-，如PF6 -(其可以是在修饰步骤的阴离子)))相关；
在存在Sp n001的每个位置处，独立地存在*NS的键联，其中*NS是
Figure BPA0000295055720002023
(如本领域技术人员所理解的，它与阴离子(例如，Q-，如PF6 -(其可以是在修饰步骤的阴离子)))相关；并且
在存在Rp n001的每个位置处，独立地存在*NR的键联，其中*NR是
Figure BPA0000295055720002024
(如本领域技术人员所理解的，它与阴离子(例如，Q-，如PF6 -(其可以是在修饰步骤的阴离子)))相关；并且
寡核苷酸任选地通过接头连接至固体支持物。
在一些实施例中，寡核苷酸连接至固体支持物，例如CPG、聚苯乙烯支持物等。在一些实施例中，寡核苷酸通过接头(例如，CNA接头)连接至固体支持物。在一些实施例中，这种寡核苷酸是式O-I或其盐形式的寡核苷酸。
骨架手性中心的立体化学和模式的某些实施例
除其他事项外，本披露提供了寡核苷酸，其包含一个或多个手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的每个手性键联磷独立地是手性受控的(立体控制的)(例如，各自独立地具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的立体纯度(stereopurity)(非对映纯度)(例如，如通常使用适当的二聚体所评估的，该二聚体包含：含有键联磷的核苷酸间键联以及两个由核苷酸间键联连接的核苷单元)。在一些实施例中，立体纯度是至少90％。在一些实施例中，立体纯度是至少95％。在一些实施例中，立体纯度是至少96％。在一些实施例中，立体纯度是至少97％。在一些实施例中，立体纯度是至少98％。在一些实施例中，立体纯度是至少99％。在具有完全控制立体化学和其他修饰(例如，碱基修饰、糖修饰、核苷酸间键联修饰等)的能力下，本披露提供了与相应的非手性受控的技术相比具有改善的特性和/或活性的技术。
在一些实施例中，寡核苷酸(例如，多种寡核苷酸中的寡核苷酸)的区域(特别是核心区域或中间区域)的骨架手性中心模式是或包含(Np/Op)t[(Rp)n(Sp)m]y、(Np/Op)t[(Op)n(Sp)m]y、(Np/Op)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Op)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y、[(Rp)n(Sp)m]y、[(Op)n(Sp)m]y、[(Op/Rp)n(Sp)m]y、(Rp)t(Np)n(Rp)m、(Rp)t(Sp)n(Rp)m、(Rp)t[(Np/Op)n]y(Rp)m、(Rp)t[(Sp/Np)n]y(Rp)m、(Rp)t[(Sp/Op)n]y(Rp)m、(Np/Op)t(Np)n(Np/Op)m、(Np/Op)t(Sp)n(Np/Op)m、(Np/Op)t[(Np/Op)n]y(Np/Op)m、(Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m、(Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m、(Rp/Op)t(Np)n(Rp/Op)m、(Rp/Op)t(Sp)n(Rp/Op)m、(Rp/Op)t[(Np/Op)n]y(Rp/Op)m、(Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m、或(Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m(除非另有说明，否则修饰和立体化学模式的描述如本领域通常使用的从5′至3′)，其中Sp指示手性经修饰的核苷酸间键联的手性键联磷的S构型，Rp指示手性经修饰的核苷酸间键联的手性键联磷的R构型，Op指示天然磷酸酯键联的非手性键联磷，每个Np独立地是Rp或Sp，且m、n、t和y各自独立地是1-50，如本披露中所述。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含[(Rp/Op)n(Sp)m]y。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含[(Rp)n(Sp)m]y。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含[(Op)n(Sp)m]y。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Np/Op)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Np/Op)t[(Rp)n(Sp)m]y。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Np/Op)t[(Op)n(Sp)m]y。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Sp)t[(Op)n(Sp)m]y。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Rp)t(Np)n(Rp)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Rp)t(Sp)n(Rp)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Rp)t[(Np/Op)n]y(Rp)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Rp)t[(Sp/Np)n]y(Rp)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Rp)t[(Sp/Op)n]y(Rp)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Np/Op)t(Np)n(Np/Op)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Np/Op)t(Sp)n(Np/Op)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Np/Op)t[(Np/Op)n]y(Np/Op)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Rp/Op)t(Np)n(Rp/Op)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Rp/Op)t(Sp)n(Rp/Op)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Rp/Op)t[(Np/Op)n]y(Rp/Op)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m。在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Rp)(Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m(Rp)。在一些实施例中，n是1。例如，在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Sp)t[Op(Sp)m]y；在一些实施例中，骨架手性中心模式是或包含(Sp)t[Rp(Sp)m]y。在一些实施例中，y是1。在一些实施例中，m是2或更大。在一些实施例中，t是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，n是1，并且m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些实施例中，t是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，n是1，并且m是2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些实施例中，Rp或Op之前存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸间键联，并且之后存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸间键联。在一些实施例中，之前和/或之后存在至少2个核苷酸间键联。在一些实施例中，之前和/或之后存在至少3个核苷酸间键联。在一些实施例中，之前和/或之后存在至少4个核苷酸间键联。在一些实施例中，之前和/或之后存在至少5个核苷酸间键联。在一些实施例中，之前和/或之后存在至少6个核苷酸间键联。在一些实施例中，之前和/或之后存在至少7个核苷酸间键联。在一些实施例中，之前和/或之后存在至少8个核苷酸间键联。在一些实施例中，之前和/或之后存在至少9个核苷酸间键联。在一些实施例中，之前和/或之后存在至少10个核苷酸间键联。在一些实施例中，y是1。在一些实施例中，y是2或更大。在一些实施例中，y是2、3、4或5。在一些实施例中，y是2。在一些实施例中，y是3。在一些实施例中，y是4。在一些实施例中，y是5。在一些实施例中，具有此类骨架手性中心模式的区域在其糖部分上不含2′-修饰，其中该2′-修饰是2′-OR1或2′-O-L-，其中R1不是氢并且L包含碳原子并连接至糖部分的另一个碳原子。在一些实施例中，具有这种骨架手性中心模式的区域的每个糖部分独立地是天然DNA糖部分(
Figure BPA0000295055720002051
如本领域普通技术人员所理解的，对于天然DNA中的天然DNA糖部分，C1连接至碱基，C3和C5各自独立地连接至核苷酸间键联或-OH(当在5′-或3′-端时))。在US 20170037399、WO 2017/015555和WO 2017/062862中描述了由此类骨架手性中心模式提供的某些益处/优势。
在一些实施例中，y、t、n和m各自独立地是1-20，如本披露中所述。在一些实施例中，y是1。在一些实施例中，y是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，y是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些实施例中，y是1。在一些实施例中，y是2。在一些实施例中，y是3。在一些实施例中，y是4。在一些实施例中，y是5。在一些实施例中，y是6。在一些实施例中，y是7。在一些实施例中，y是8。在一些实施例中，y是9。在一些实施例中，y是10。
在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，n是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，n是1-10。在一些实施例中，n是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是2、3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，n是3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，n是4、5、6、7或8。在一些实施例中，n是5、6、7或8。在一些实施例中，n是6、7或8。在一些实施例中，n是7或8。在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是2。在一些实施例中，n是3。在一些实施例中，n是4。在一些实施例中，n是5。在一些实施例中，n是6。在一些实施例中，n是7。在一些实施例中，n是8。在一些实施例中，n是9。在一些实施例中，n是10。
在一些实施例中，m是0-50。在一些实施例中，m是1-50。在一些实施例中，m是1。在一些实施例中，m是2-50。在一些实施例中，m是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，m是2、3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，m是3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，m是4、5、6、7或8。在一些实施例中，m是5、6、7或8。在一些实施例中，m是6、7或8。在一些实施例中，m是7或8。在一些实施例中，m是0。在一些实施例中，m是1。在一些实施例中，m是2。在一些实施例中，m是3。在一些实施例中，m是4。在一些实施例中，m是5。在一些实施例中，m是6。在一些实施例中，m是7。在一些实施例中，m是8。在一些实施例中，m是9。在一些实施例中，m是10。在一些实施例中，m是11。在一些实施例中，m是12。在一些实施例中，m是13。在一些实施例中，m是14。在一些实施例中，m是15。在一些实施例中，m是16。在一些实施例中，m是17。在一些实施例中，m是18。在一些实施例中，m是19。在一些实施例中，m是20。在一些实施例中，m是21。在一些实施例中，m是22。在一些实施例中，m是23。在一些实施例中，m是24。在一些实施例中，m是25。在一些实施例中，m是至少2。在一些实施例中，m是至少3。在一些实施例中，m是至少4。在一些实施例中，m是至少5。在一些实施例中，m是至少6。在一些实施例中，m是至少7。在一些实施例中，m是至少8。在一些实施例中，m是至少9。在一些实施例中，m是至少10。在一些实施例中，m是至少11。在一些实施例中，m是至少12。在一些实施例中，m是至少13。在一些实施例中，m是至少14。在一些实施例中，m是至少15。在一些实施例中，m是至少16。在一些实施例中，m是至少17。在一些实施例中，m是至少18。在一些实施例中，m是至少19。在一些实施例中，m是至少20。在一些实施例中，m是至少21。在一些实施例中，m是至少22。在一些实施例中，m是至少23。在一些实施例中，m是至少24。在一些实施例中，m是至少25。在一些实施例中，m至少大于25。
在一些实施例中，t是1-20。在一些实施例中，t是1。在一些实施例中，t是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，t是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，t是1-5。在一些实施例中，t是2。在一些实施例中，t是3。在一些实施例中，t是4。在一些实施例中，t是5。在一些实施例中，t是6。在一些实施例中，t是7。在一些实施例中，t是8。在一些实施例中，t是9。在一些实施例中，t是10。在一些实施例中，t是11。在一些实施例中，t是12。在一些实施例中，t是13。在一些实施例中，t是14。在一些实施例中，t是15。在一些实施例中，t是16。在一些实施例中，t是17。在一些实施例中，t是18。在一些实施例中，t是19。在一些实施例中，t是20。
在一些实施例中，t和m各自独立地是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少3。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少4。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少5。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少6。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少7。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少8。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少9。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少10。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含：具有t-部分(例如(Sp)t、(Rp)t、(Np/Op)t、(Rp/Op)t等)的骨架手性中心模式或具有包含该部分的骨架手性中心模式的嵌段，例如第一嵌段、5′-翼等；具有y或n部分(例如(Np)n、(Sp)n、[(Np/Op)n]y、[(Rp/Op)n]y、[(Sp/Op)n]y等)的骨架手性中心模式或具有包含该部分的骨架手性中心模式的嵌段，例如第二嵌段、核心等；具有m部分(例如(Sp)m、(Rp)m、(Np/Op)m、(Rp/Op)m等)的骨架手性中心模式或具有包含该部分的骨架手性中心模式的嵌段，例如第三嵌段、3’-翼等。
在一些实施例中，包含Np或Rp的t部分、y部分、n部分、或m部分，例如(Rp)t、(Np/Op)t、(Rp/Op)t、(Np)n、[(Np/Op)n]y、[(Rp/Op)n]y、(Rp)m、(Np/Op)m、(Rp/Op)m等，独立地包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或100％Rp。在一些实施例中，包含Np或Rp的t部分或m部分独立地包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或100％Rp。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或100％Rp。在一些实施例中，百分比为至少10％。在一些实施例中，百分比为至少20％。在一些实施例中，百分比为至少30％。在一些实施例中，百分比为至少40％。在一些实施例中，百分比为至少50％。在一些实施例中，百分比为至少60％。在一些实施例中，百分比为至少70％。在一些实施例中，百分比为至少75％。在一些实施例中，百分比为至少80％。在一些实施例中，百分比为至少85％。在一些实施例中，百分比为至少90％。在一些实施例中，百分比为至少95％。在一些实施例中，百分比为100％。
在一些实施例中，在3’处与Rp或Op键联磷键合的每个糖部分独立地包含修饰。在一些实施例中，在5’处与Rp或Op键联磷键合的每个糖部分独立地包含修饰。在一些实施例中，在3’处与Rp键联磷键合的每个糖部分独立地包含修饰。在一些实施例中，在5’处与Rp键联磷键合的每个糖部分独立地包含修饰。在一些实施例中，在3’处与Op键联磷键合的每个糖部分独立地包含修饰。在一些实施例中，在5’处与Op键联磷键合的每个糖部分独立地包含修饰。在一些实施例中，在3’处与Sp键联磷键合的每个糖部分独立地包含修饰。在一些实施例中，在5’处与Sp键联磷键合的每个糖部分独立地包含修饰。在一些实施例中，每个糖部分独立地包含修饰。在一些实施例中，修饰是2′-修饰。在一些实施例中，修饰是2′-OR，其中R不是氢。在一些实施例中，修饰是2′-OR，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，修饰是2′-OR，其中R是经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，修饰是2′-OR，其中R是任选地经取代的C2-6烷基。在一些实施例中，修饰是2′-OR，其中R是经取代的C2-6烷基。在一些实施例中，R是-CH2CH2OMe。在一些实施例中，修饰是或包含连接两个糖碳的-L-，例如在LNA中发现的那些。在一些实施例中，修饰是连接糖部分的C2与C4的-L-。在一些实施例中，L是-CH2-CH(R)-，其中R如本披露中所述。在一些实施例中，L是-CH2-CH(R)-，其中R如本披露中所述并且不是氢。在一些实施例中，L是-CH2-(R)-CH(R)-，其中R如本披露中所述并且不是氢。在一些实施例中，L是-CH2-(S)-CH(R)-，其中R如本披露中所述并且不是氢。在一些实施例中，嵌段、翼、核心或寡核苷酸具有如本披露中所述的糖修饰。
在一些实施例中，提供的骨架手性中心模式是或包含(Rp/Sp)-(全Rp或全Sp)-(Rp/Sp)，其中每个Rp/Sp独立地是Rp或Sp。在一些实施例中，提供的骨架手性中心模式是或包含(Rp)-(全Sp)-(Rp)。在一些实施例中，提供的骨架手性中心模式是或包含(Sp)-(全Sp)-(Sp)。在一些实施例中，提供的骨架手性中心模式是或包含(Sp)-(全Rp)-(Sp)。在一些实施例中，提供的骨架手性中心模式是或包含(Rp/Sp)-(重复的(Sp)m(Rp)n)-(Rp/Sp)。在一些实施例中，提供的骨架手性中心模式是或包含(Rp/Sp)-(重复的SpSpRp)-(Rp/Sp)。
嵌段
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个嵌段，其特征在于碱基修饰、糖修饰、核苷酸间键联的类型、键联磷的立体化学等。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含或具有5′-第一嵌段-第二嵌段-第三嵌段-3’结构。在一些实施例中，第一嵌段是5′-翼。在一些实施例中，第一嵌段是5′-端区域。在一些实施例中，第二嵌段是核心。在一些实施例中，第二嵌段是5′-端与3′-端区域之间的中间区域。在一些实施例中，第三嵌段是3′-翼。在一些实施例中，第三嵌段是3′-端区域。5′-翼、5′-端区域、核心、中间区域、3′-翼和3′-端区域中的每一个都可以独立地是嵌段。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含或具有5′-翼-核心-翼-3’、5′-翼-核心-3’、或5′-核心-翼-3’结构。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的第一嵌段、第二嵌段、第三嵌段、翼(例如，5′-翼、3′-翼)和/或核心各自独立地是嵌段或包含一个或多个如本披露中所述的嵌段。
可以依照本披露利用各种嵌段、5′-翼、3′-翼和核心，包括在US 20150211006、US20150211006、WO 2017015555、WO 2017015575、WO 2017062862、WO 2017160741中描述的那些，其各自的嵌段、5′-翼，3′-翼和核心通过引用并入本文。
在一些实施例中，嵌段是连锁磷立体化学嵌段。例如，在一些实施例中，嵌段仅包含Rp、Sp或Op键联磷。在一些实施例中，嵌段是仅包含Rp键联磷的Rp嵌段。在一些实施例中，嵌段是仅包含Rp/Op键联磷的Rp/Op嵌段。在一些实施例中，嵌段是仅包含Sp/Op键联磷的Sp/Op嵌段。在一些实施例中，嵌段是Op嵌段。在一些实施例中，寡核苷酸或其区域(第一嵌段、第二嵌段、第三嵌段、翼、核心等)包含Rp嵌段、Sp嵌段、和/或Op嵌段中的一个或多个。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)键联磷。
在一些实施例中，嵌段是糖修饰嵌段。在一些实施例中，嵌段是2′-修饰嵌段，其中嵌段的每个糖部分独立地包含2′-修饰。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OR，其中R如本披露中所述。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OR，其中R不是氢。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OMe。在一些实施例中，2′-修饰是2′-MOE。在一些实施例中，修饰是LNA修饰。在一些实施例中，寡核苷酸或其区域(第一嵌段、第二嵌段、第三嵌段、翼、核心等)包含一个或多个糖修饰嵌段，各自独立于其自身的糖修饰。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)糖部分。
如本文所示，嵌段可以具有各种长度。在一些实施例中，嵌段的长度为1-30，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核碱基。在一些实施例中，5′-第一嵌段-第二嵌段-第三嵌段-3′、或5′-翼-核心-翼-3′为5-10-5、3-10-4、3-10-6、4-12-4等。
在一些实施例中，寡核苷酸或其嵌段或区域(例如，5′-端区域、5′-翼、中间区域、核心区域、3′-端区域、3′-环等)包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)如本披露中所述的非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)连续非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，嵌段和区域包含两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)连续非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，数目是1。在一些实施例中，数目是2。在一些实施例中，数目是3。在一些实施例中，数目是4。在一些实施例中，数目是5。在一些实施例中，数目是6。在一些实施例中，数目是7。在一些实施例中，数目是8。在一些实施例中，数目是9。在一些实施例中，数目是10或更大。在一些实施例中，嵌段(例如5′-端区域、5′-翼)中，除了从嵌段5′-端的嵌段的两个核苷单元之间的第一核苷酸间键联之外，核苷单元之间的每个核苷酸间键联都是非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，嵌段(例如3′-端区域、3′-翼)中，除了从嵌段3′-端的嵌段的两个核苷单元之间的第一核苷酸间键联之外，核苷单元之间的每个核苷酸间键联都是非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域(例如5′-端区域、5′-翼)中，除了从区域5′-端的区域的两个核苷单元之间的第一核苷酸间键联之外，核苷单元之间的每个核苷酸间键联都是非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域(例如3′-端区域、3′-翼)中，除了从区域3′-端的区域的两个核苷单元之间的第一核苷酸间键联之外，核苷单元之间的每个核苷酸间键联都是非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，区域或嵌段(例如，5′-端区域、5′-翼、中间区域、核心区域、3′-端区域、3′-环等)中每个核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联、天然磷酸酯核苷酸间键联或Rp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，区域或嵌段中每个核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联、天然磷酸酯核苷酸间键联或Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸或区域或嵌段(例如，5′-端区域、5′-翼、中间区域、核心区域、3′-端区域、3′-环等)中约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联、天然磷酸酯核苷酸间键联或Rp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸或区域或嵌段中约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联、天然磷酸酯核苷酸间键联或Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸或区域或嵌段中约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联或天然磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸或区域或嵌段中约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，百分比为45％或更高。在一些实施例中，百分比为50％或更高。在一些实施例中，百分比为60％或更高。在一些实施例中，百分比为70％或更高。在一些实施例中，百分比为80％或更高。在一些实施例中，百分比为90％或更高。在一些实施例中，区域或嵌段是翼。在一些实施例中，区域或嵌段是5′-翼。在一些实施例中，区域或嵌段是3′-翼。在一些实施例中，区域或嵌段是核心。在一些实施例中，区域(例如，翼、核心等)可以具有多种长度，例如包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核碱基。在一些实施例中，每个核碱基独立地是任选地经取代的A、T、C、G、U，或A、T、C、G或U的任选地经取代的互变异构体。
长度
如本披露中所述，提供的寡核苷酸可以具有各种长度，例如2-200、10-15、10-25、15-20、15-25、15-40、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、50、60、70、80、90、100、150个核碱基长度，其中每个核碱基独立地是任选地经取代的A、T、C、G或U，或任选地经取代的A、T、C、G或U的互变异构体。在一些实施例中，提供的寡核苷酸(例如，手性受控的寡核苷酸组合物中多种中的寡核苷酸)长度为15个核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为16个核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为17个核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为18个核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为19个核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为20个核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为21个核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为22个核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为23个核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为24个核碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的长度为25个核碱基。
如本披露中所述，提供的寡核苷酸、手性受控的寡核苷酸组合物中的多种中的寡核苷酸可包含各种修饰，例如碱基修饰、糖修饰、核苷酸间键联修饰等。在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含至少一个经修饰的核苷酸、至少一个经修饰的糖部分、至少一个吗啉代部分、至少一个2′-脱氧核糖核苷酸、至少一个锁核苷酸和/或至少一个双环核苷酸。
核碱基
在一些实施例中，核碱基是天然核碱基。在一些实施例中，核碱基是经修饰的核碱基(非天然核碱基)。在一些实施例中，提供的寡核苷酸中的核碱基(例如BA)是天然核碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、胸腺嘧啶或尿嘧啶)或衍生自天然核碱基的经修饰的核碱基，例如任选地经取代的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、胸腺嘧啶或尿嘧啶、或其互变异构形式。实例包括但不限于尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤及其互变异构形式，其相应的氨基基团被保护基团(例如一个或多个-R、-C(O)R等)保护。示例保护基团，包括可用于寡核苷酸合成的保护基团，在本领域中是广泛已知的并且可以依照本披露利用。在一些实施例中，受保护的核碱基和/或衍生物选自具有一个或多个酰基保护基团的核碱基，2-氟尿嘧啶，2-氟胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，2，6-二氨基嘌呤，氮杂胞嘧啶，嘧啶类似物(如假异胞嘧啶和假尿嘧啶)，以及其他经修饰的核碱基(如8-取代的嘌呤、黄嘌呤、或次黄嘌呤，后两个是天然降解产物)。示例经修饰的核碱基还披露于Chiu和Rana，RNA，2003，9，1034-1048，Limbach等人Nucleic Acids Research[核酸研究]，1994，22，2183-2196，以及Revankar和Rao，Comprehensive Natural Products Chemistry[天然产物综合化学]，第7卷313中。在一些实施例中，经修饰的核碱基是经取代的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤。在一些实施例中，经修饰的核碱基是尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤的例如就氢键合和/或碱基配对而言的功能替换物。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或鸟嘌呤。在一些实施例中，核碱基是尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或鸟嘌呤。
在一些实施例中，经修饰的碱基是任选地经取代的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在一些实施例中，经修饰的核碱基是通过以下项而独立地被一个或多个修饰进行修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶：
(1)核碱基被一个或多个独立地选自以下的任选地经取代的基团修饰：酰基、卤素、氨基、叠氮基、烷基、烯基、炔基、芳基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂环基、杂芳基、羧基、羟基、生物素、亲和素、链霉亲和素、取代的甲硅烷基及其组合；
(2)核碱基的一个或多个原子独立地被选自碳、氮或硫的不同原子替换；
(3)核碱基中的一个或多个双键独立地被氢化；或
(4)一个或多个任选地经取代的芳基环或杂芳基环独立地插入核碱基中。
经修饰的核碱基还包括大小扩展的核碱基，其中已添加一个或多个芳基环，如苯环。核碱基替换物(描述于：格伦研究目录(Glen Research catalog)(可从Glen Research网站获得)；Krueger AT等人，Acc.Chem.Res.[化学研究评述]，2007，40，141-150；Kool，ET，Acc.Chem.Res.[化学研究评述]，2002，35，936-943；Benner S.A.等人，Nat.Rev.Genet.[遗传学自然评论]，2005，6，553-543；Romesberg，F.E.等人，Curr.Opin.Chem.Biol.[化学生物学新见]，2003，7，723-733；Hirao，I.，Curr.Opin.Chem.Biol.[化学生物学新见]，2006，10，622-627)考虑为可用于本披露的寡核苷酸。
在一些实施例中，经修饰的核碱基包括结构，例如但不限于咕啉或卟啉衍生的环。卟啉衍生的碱基替换物已描述于：Morales-Rojas，H和Kool，ET，Org.Lett.[有机快报]，2002，4，4377-4380。下面示出的是卟啉衍生的环的实例，其可以用作核碱基替换物：
Figure BPA0000295055720002141
在一些实施例中，经修饰的核碱基是荧光的。此类荧光经修饰的核碱基的实例包括菲、芘、茋、异黄嘌呤、异黄蝶呤(isozanthopterin)、三联苯、三噻吩(terthiophene)、苯并三噻吩(benzoterthiophene)、香豆素、二氧四氢蝶啶、系拴茋(tethered stillbene)、苯并尿嘧啶和萘并尿嘧啶。
在一些实施例中，经修饰的核碱基是通用碱基或简并碱基，例如3-硝基吡咯、5′-硝基吲哚、P、K等。
在一些实施例中，其他核苷也可用于本披露所披露的技术中且包括掺有经修饰的核碱基或与经修饰的糖共价结合的核碱基的核苷。掺有经修饰的核碱基的核苷的一些实例包括4-乙酰基胞苷；5-(羧基羟甲基)尿苷；2′-O-甲基胞苷；5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-羧甲基氨基甲基尿苷；二氢尿苷；2′-O-甲基假尿苷；β，D-半乳糖基Q核苷(beta，D-galactosylqueosine)；2′-O-甲基鸟苷；N6-异戊烯基腺苷；1-甲基腺苷；1-甲基假尿苷；1-甲基鸟苷；1-甲基肌苷；2，2-二甲基鸟苷；2-甲基腺苷；2-甲基鸟苷；N7-甲基鸟苷；3-甲基-胞苷；5-甲基胞苷；5-羟甲基胞苷；5-甲酰基胞嘧啶；5-羧基胞嘧啶；N6-甲基腺苷；7-甲基鸟苷；5-甲基氨基乙基尿苷；5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷；β，D-甘露糖基Q核苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷；N-((9-β，D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸；N-((9-β，D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-N-甲基氨甲酰基)苏氨酸；尿苷-5-氧基乙酸甲酯；尿苷-5-氧基乙酸(v)；假尿苷；Q核苷；2-硫代胞苷；5-甲基-2-硫代尿苷；2-硫代尿苷；4-硫代尿苷；5-甲基尿苷；2′-O-甲基-5-甲基尿苷；以及2′-O-甲基尿苷。
在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U，其中一个或多个-NH2独立地且任选地被-C(-L-R1)3替换，一个或多个-NH-独立地且任选地被-C(-L-R1)2-替换，一个或多个＝N-独立地且任选地被-C(-L-R1)-替换，一个或多个＝CH-独立地且任选地被＝N-替换，且一个或多个＝O独立地且任选地经＝S、＝N(-L-R1)或＝C(-L-R1)2替换，其中两个或更多个-L-R1任选地与居于它们之间的原子一起形成具有0-10个杂原子环原子的3-30元双环或多环。在一些实施例中，经修饰的核碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U，其中一个或多个-NH2独立地且任选地被-C(-L-R1)3替换，一个或多个-NH-独立地且任选地被-C(-L-R1)2-替换，一个或多个＝N-独立地且任选地被-C(-L-R1)-替换，一个或多个＝CH-独立地且任选地被＝N-替换，且一个或多个＝O独立地且任选地被＝S、＝N(-L-R1)或＝C(-L-R1)2替换，其中两个或更多个-L-R1任选地与居于它们之间的原子一起形成具有0-10个杂原子环原子的3-30元双环或多环，其中经修饰的碱基不同于天然A、T、C、G和U。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，经修饰的碱基是经取代的A、T、C、G或U，其中经修饰的碱基不同于天然A、T、C、G和U。
在一些实施例中，经修饰的核碱基可以任选地被取代。在一些实施例中，经修饰的核碱基含有一个或多个，例如杂原子、烷基基团或连接部分(其连接至荧光部分、生物素或亲和素部分)或其他蛋白质或肽。在一些实施例中，核碱基或经修饰的核碱基包含或缀合至一个或多个生物分子结合部分，例如像抗体、抗体片段、生物素、亲和素、链霉亲和素、受体配体或螯合部分。在一些实施例中，经修饰的核碱基通过用荧光部分或生物分子结合部分取代来进行修饰。在一些实施例中，核碱基或经修饰的核碱基上的取代基是荧光部分。在一些实施例中，核碱基或经修饰的核碱基上的取代基是生物素或亲和素。
示例核碱基还描述于US 20110294124、US 20120316224、US 20140194610、US20150211006、US 20150197540、WO 2015107425、WO/2017/015555、WO/2017/015575和WO/2017/062862中，其各自的核碱基通过引用并入本文。
糖
在一些实施例中，寡核苷酸除天然糖部分外还包含一个或多个经修饰的糖部分。在一些实施例中，糖是天然糖。在一些实施例中，糖是经修饰的糖(非天然糖)。最常见的天然存在的核苷酸包含连接至核碱基腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)及胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)的核糖。本披露还包括经修饰的核苷酸，其中核苷酸间键联连接至糖或经修饰的糖的各个位置。作为非限制性实例，核苷酸间键联可以连接至糖的2′、3′、4′或5’位置。
在一些实施例中，糖部分是
Figure BPA0000295055720002161
其中每个变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，糖部分是
Figure BPA0000295055720002162
其中Ls是-C(R5s)2-，其中每个R5s独立地如本披露中所述。在一些实施例中，糖部分具有
Figure BPA0000295055720002163
Figure BPA0000295055720002164
的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，糖部分具有
Figure BPA0000295055720002165
的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，糖部分具有或衍生自
Figure BPA0000295055720002171
Figure BPA0000295055720002172
Figure BPA0000295055720002173
的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，核苷具有
Figure BPA0000295055720002174
Figure BPA0000295055720002175
的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，核苷部分具有或包含
Figure BPA0000295055720002176
Figure BPA0000295055720002177
的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，Ls是-CH(R)-，其中R如本披露中所述。在一些实施例中，R是-H。在一些实施例中，R不是-H，并且Ls是-(R)-CH(R)-。在一些实施例中，R不是-H，并且Ls是-(S)-CH(R)-。在一些实施例中，如本披露中所述的，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是甲基。
各种类型的糖修饰是已知的且可依照本披露利用。在一些实施例中，糖修饰是2′-修饰(例如，R2s(例如，在
Figure BPA0000295055720002181
中))。在一些实施例中，2′-修饰是2′-F。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OR，其中R不是氢。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OR，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，2′-修饰是2′-OMe。在一些实施例中，2′-修饰是2′-MOE。在一些实施例中，2′-修饰是LNA糖修饰(C2-O-CH2-C4)。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-C(R)2-C4)，其中每个R独立地如本披露中所述。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-CHR-C4)，其中R如本披露中所述。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-(E)-CHR-C4)，其中R如本披露中所述并且不是氢。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-(S)-CHR-C4)，其中R如本披露中所述并且不是氢。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是未经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是甲基。在一些实施例中，R是乙基。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-CHR-C4)，其中R是甲基。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-CHR-C4)，其中R是乙基。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-(R)-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-(R)-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-(R)-CHR-C4)，其中R是甲基。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-(R)-CHR-C4)，其中R是乙基。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-(S)-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-(S)-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-(S)-CHR-C4)，其中R是甲基。在一些实施例中，2′-修饰是(C2-O-(S)-CHR-C4)，其中R是乙基。在一些实施例中，2′-修饰是C2-O-(R)-CH(CH2CH3)-C4。在一些实施例中，2′-修饰是C2-O-(S)-CH(CH2CH3)-C4。在一些实施例中，糖部分是天然DNA糖部分。在一些实施例中，糖部分是在2′处修饰的(2′-修饰)天然DNA糖部分。在一些实施例中，糖部分是任选地经取代的天然DNA糖部分。在一些实施例中，糖部分是2′-取代的天然DNA糖部分。
可以将许多经修饰的糖掺入本披露的寡核苷酸内。在一些实施例中，经修饰的糖在2′位置处含有一个或多个取代基，包括以下中的一个：-F；-CF3、-CN、-N3、-NO、-NO2、-OR′、-SR′、或-N(R′)2，其中每个R′独立地如本披露中所述；-O-(C1-C10烷基)、-S-(C1-C10烷基)、-NH-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)2；-O-(C2-C10烯基)、-S-(C2-C10烯基)、-NH-(C2-C10烯基)、或-N(C2-C10烯基)2；-O-(C2-C10炔基)、-S-(C2-C10炔基)、-NH-(C2-C10炔基)、或-N(C2-C10炔基)2；或-O--(C1-C10亚烷基)-O--(C1-C10烷基)、-O-(C1-C10亚烷基)-NH-(C1-C10烷基)或-O-(C1-C10亚烷基)-NH(C1-C10烷基)2、-NH-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)，其中烷基、亚烷基、烯基和炔基可以被取代或未经取代的。取代基的实例包括且不限于-O(CH2)nOCH3和-O(CH2)nNH2(其中n是从1至约10)、MOE、DMAOE、和DMAEOE。某些经修饰的糖描述于：WO 2001/088198，WO/2017/062862，和Martin等人，Helv.Chim.Acta[瑞士化学学报]，1995，78，486-504。在一些实施例中，经修饰的糖包含一个或多个选自以下的基团：经取代的甲硅烷基基团、切割RNA的基团、报告基团、荧光标记、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学特性的基团、用于改善寡核苷酸的药效学特性的基团、或其他具有类似特性的取代基。在一些实施例中，在糖的2′、3′、4′、5′或6′位置中的一个或多个(包括3′-末端核苷上的糖的3′位置或5′-末端核苷的5′位置)处进行修饰。在一些实施例中，RNA包含在2′-位置具有2′-OH或2′-OR1的糖，其中OR1是任选地经取代的烷基，包括2′-OMe。
在一些实施例中，2′-修饰是2′-F。
在一些实施例中，核糖的2′-OH被包括以下之一的取代基(例如，R2s)替换：-H、-F；-CF3、-CN、-N3、-NO、-NO2、-OR′、-SR′、或-N(R′)2，其中每个R′独立地如上文所定义和本文所述；-O-(C1-C10烷基)、-S-(C1-C10烷基)、-NH-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)2；-O-(C2-C10烯基)、-S-(C2-C10烯基)、-NH-(C2-C10烯基)、或-N(C2-C10烯基)2；-O-(C2-C10炔基)、-S-(C2-C10炔基)、-NH-(C2-C10炔基)、或-N(C2-C10炔基)2；或-O--(C1-C10亚烷基)-O--(C1-C10烷基)、-O-(C1-C10亚烷基)-NH-(C1-C10烷基)或-O-(C1-C10亚烷基)-NH(C1-C10烷基)2、-NH-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)，其中烷基、亚烷基、烯基和炔基可以被取代或未经取代的。在一些实施例中，2′-OH被-H(脱氧核糖)替换。在一些实施例中，2′-OH被-F替换。在一些实施例中，2′-OH被-OR′替换。在一些实施例中，2′-OH被-OMe替换。在一些实施例中，2′-OH被-OCH2CH2OMe替换。
在一些实施例中，经修饰的糖是锁核酸(LNA)中的糖。在一些实施例中，糖碳原子上的两个取代基一起形成二价部分。在一些实施例中，两个取代基是在两个不同的糖碳原子上。在一些实施例中，所形成的二价部分具有如本文所定义的结构-L-。在一些实施例中，-L-是-O-CH2-，其中-CH2-任选地被取代。在一些实施例中，-L-是-O-CH2-。在一些实施例中，-L-是-O-CH(Me)-。在一些实施例中，-L-是-O-CH(Et)-。在一些实施例中，-L-介于糖部分的C2与C4之间。在一些实施例中，锁核酸糖具有以下所示的结构，其中R2s是-OCH2C4′-：
Figure BPA0000295055720002201
在一些实施例中，经修饰的糖是ENA糖或经修饰的ENA糖，如在例如以下中描述的那些：Seth等人，J Am Chem Soc.[美国化学学会杂志]2010年10月27日；132(42)：14942-14950。在一些实施例中，经修饰的糖是在XNA(异种核酸(xenonucleic acid))中所发现的那些糖中的任一个，例如阿拉伯糖、无水己糖醇、苏糖、2′氟阿拉伯糖或环己烯。
在一些实施例中，经修饰的糖是WO 2017/062862中描述的经修饰的糖。
在一些实施例中，经修饰的糖是糖模拟物，如代替戊呋喃糖基的环丁基或环戊基部分。传授此类经修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号：4,981,957；5,118,800；5,319,080；和5,359,044。在一些实施例中，经修饰的糖是其中核糖环内的氧原子被氮、硫、硒或碳替换的糖。在一些实施例中，经修饰的糖是经修饰的核糖，其中核糖环内的氧原子被氮替换，并且其中氮任选地被烷基基团(例如甲基、乙基、异丙基等)取代。
经修饰的糖的非限制性实例包括甘油，其形成甘油核酸(GNA)类似物。在一些实施例中，GNA类似物描述于：Zhang，R等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]，2008，130，5846-5847；Zhang L等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]，2005，127，4174-4175和Tsai CH等人，PNAS[美国国家科学院院刊]，2007，14598-14603。
在一些实施例中，GNA衍生的类似物的另一个实例，基于甲酰基甘油的混合乙缩醛缩胺醛的柔性核酸(FNA)描述于Joyce GF等人，PNAS[美国国家科学院院刊]，1987，84，4398-4402以及Heuberger BD和Switzer C，J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]，2008，130，412-413。
经修饰的糖的另外的非限制性实例包括吡喃己糖基(6′至4′)糖、吡喃戊糖基(4′至2′)糖、吡喃戊糖基(4′至3′)糖、或四呋喃糖基(tetrofuranosyl)(3′至2′)糖。
在一些实施例中，糖部分中的一个或多个羟基基团任选地且独立地被以下替换：卤素、R′-N(R′)2、-OR′、或-SR′替换，其中每个R′独立地如上文所定义和本文所述。
在一些实施例中，寡核苷酸(例如手性受控的寡核苷酸、寡核苷酸组合物中多种寡核苷酸中的寡核苷酸等)中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或更多(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)(包括端值)的糖经修饰。在一些实施例中，嘌呤核苷的糖、并且在一些实施例中仅嘌呤核苷经修饰(例如，约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或更多[例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多]的嘌呤核苷经修饰)。在一些实施例中，嘧啶核苷的糖、并且在一些实施例中仅嘧啶核苷经修饰(例如，约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或更多[例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多]的嘧啶核苷经修饰)。在一些实施例中，嘌呤和嘧啶核苷均经修饰。
在一些实施例中，经修饰的糖包括以下中描述的那些：A.Eschenmoser，Science[科学](1999)，284：2118：M.Bohringer等人，Helv.Chim.Acta[瑞士化学学报](1992)，75：1416-1477；M.Egli等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志](2006)，128(33)：10847-56：A.Eschenmoser于Chemical Synthesis：Gnosis to Prognosis[化学合成：灵知到预测]，C.Chatgilialoglu和V. Sniekus编辑，(Kluwer Academic[克卢沃学术出版社]，荷兰，1996)，第293页：K.-U.Schoning等人，Science[科学](2000)，290：1347-1351：A.Eschenmoser等人，Helv.Chim.Acta[瑞士化学学报](1992)，75：218：J.Hunziker等人，Helv.Chim.Acta[瑞士化学学报](1993)，76：259；G.Otting等人，Helv.Chim.Acta[瑞士化学学报](1993)，76：2701：K.Groebke等人，Helv.Chim.Acta[瑞士化学学报](1998)，81：375；和A.Eschenmoser，Scienee[科学](1999)，284：2118。对2′-修饰进行的修饰可以发现于：Verma，S.等人Annu.Rev.Biochem.[生物化学年度综述]1998，67，99-134及其中的所有参考文献中。在一些实施例中，经修饰的糖是WO 2012/030683中描述的经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖是以下任一项中描述的任何经修饰的糖：Gryaznov，S；Chen，J.-K.J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1994，116，3143：Hendrix等人1997 Chem.Eur.J.[欧洲化学杂志]3：110：Hyrup等人1996 Bioorg.Med.Chem.[生物有机化学与医药化学]4：5；Jepsen等人2004 Oligo.[寡核苷酸]14：130-146；Jones等人J.Org.Chem.[有机化学杂志]1993，58，2983；Koizumi等人2003 Nuc.Acids Res.[核酸研究]12：3267-3273：Koshkin等人1998 Tetrahedron[四面体]54：3607-3630；Kumar等人1998 Bioo.Med.Chem.Let.[生物有机化学与医药化学快报]8：2219-2222：Lauritsen等人2002 Chem.Comm.[化学通讯]5：530-531：Lauritsen等人2003 Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]13：253-256：Mesmaeker等人Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版]1994，33，226：Morita等人2001 Nucl.Acids Res.[核酸研究]增刊1：241-242；Morita等人2002Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]12：73-76；Morita等人2003Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]2211-2226；Nielsen等人1997Chem.Soc.Rev.[化学学会综述]73；Nielsen等人1997 J.Chem.Soc.[化学学会杂志]Perkins Transl.[博金斯译版]1：3423-3433；Obika等人1997 Tetrahedron Lett.[四面体快报]38(50)：8735-8；Obika等人1998 Tetrahedron Lett.[四面体快报]39：5401-5404；Pallan等人2012 Chem.Comm.[化学通讯]48：8195-8197；Petersen等人2003 TRENDSBiotech.[生物技术趋势]21：74-81；Rajwanshi等人1999 Chem.Commun.[化学通讯]1395-1396；Schultz等人1996 Nucleic Acids Res.[核酸研究]24：2966；Seth等人2009J.Med.Chem.[药物化学杂志]52：10-13；Seth等人2010 J.Med.Chem.[药物化学杂志]53：8309-8318；Seth等人2010 J.Org.Chem.[有机化学杂志]75：1569-1581；Seth等人2012Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]22：296-299；Seth等人2012Mol.Ther-Nuc.Acids.[分子疗法-核酸]1，e47；Seth，Punit P；Siwkowski，Andrew；Allerson，Charles R；Vasquez，Guillermo；Lee，Sam；Prakash，Thazha P；Kinberger，Garth；Migawa，Michael T；Gaus，Hans；Bhat，Balkrishen；等人，来自Nucleic AcidsSymposium Series[核酸研讨会丛刊](2008)，52(1)，553-554；Singh等人1998 Chem.Comm.[化学通讯]1247-1248；Singh等人1998J.Org.Chem.[有机化学杂志]63：10035-39；Singh等人1998 J.Org.Chem.[有机化学杂志]63：6078-6079；Sorensen 2003 Chem.Comm.[化学通讯]2130-2131；Ts′o等人Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]1988，507，220；VanAerschot等人1995 Angew.Chem.Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版]34：1338；Vasseur等人J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1992，114，4006；WO 20070900071；WO20070900071；或WO 2016/079181。
在一些实施例中，经修饰的糖部分是任选地经取代的戊糖或己糖部分。在一些实施例中，经修饰的糖部分是任选地经取代的戊糖部分。在一些实施例中，经修饰的糖部分是任选地经取代的己糖部分。在一些实施例中，经修饰的糖部分是任选地经取代的核糖或己糖醇部分。在一些实施例中，经修饰的糖部分是任选地经取代的核糖部分。在一些实施例中，经修饰的糖部分是任选地经取代的己糖醇部分。
在一些实施例中，糖是D-2-脱氧核糖。在一些实施例中，糖是β-D-脱氧呋喃核糖。在一些实施例中，糖部分是β-D-脱氧呋喃核糖部分。在一些实施例中，糖是D-核糖。在一些实施例中，糖是β-D-呋喃核糖。在一些实施例中，糖部分是β-D-呋喃核糖部分。在一些实施例中，糖是任选地经取代的β-D-脱氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖。在一些实施例中，糖部分是任选地经取代的β-D-脱氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖部分。在一些实施例中，寡核苷酸、核酸等中的糖部分/单元是包含各自独立地与核苷酸间键联连接的一个或多个碳原子的糖，例如，任选地经取代的β-D-脱氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖，这些糖5′-C和/或3′-C各自独立地与核苷酸间键联(例如，天然磷酸酯键联、经修饰的核苷酸间键联、手性受控的核苷酸间键联等)连接。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸的每个核苷均包含2′-O-甲氧基乙基糖修饰。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含至少一个锁核酸(LNA)核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含至少一个经修饰的核苷酸，该经修饰的核苷酸包含在2′-位置被修饰的经修饰的糖部分。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含经修饰的糖部分，该经修饰的糖部分包含选自由以下组成的组的2′-取代基：H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2和ON，其中R是任选地经取代的C1-C6烷基、烯基或炔基，并且卤素为F、Cl、Br或I。
在一些实施例中，经修饰的核碱基、糖、核苷、核苷酸和/或经修饰的核苷酸间键联选自以下中描述的那些：Ts′o等人Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]1988，507，220；Gryaznov，S.；Chen，J.-K.J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1994，116，3143；Mesmaeker等人Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版]1994，33，226；Jones等人J.Org.Chem.[有机化学杂志]1993，58，2983；Vasseur等人J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1992，114，4006；Van Aerschot等人1995 Angew.Chem.Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版]34：1338；Hendrix等人1997 Chem.Eur.J.[欧洲化学杂志]3：110；Koshkin等人1998Tetrahedron[四面体]54：3607-3630；Hyrup等人1996 Bioorg.Med.Chem.[生物有机化学与医药化学]4：5；Nielsen等人1997 Chem.Soc.Rev.[化学学会综述]73；Schultz等人1996Nucleic Acids Res.[核酸研究]24：2966；Obika等人1997 Tetrahedron Lett.[四面体快报]38(50)：8735-8；Obika等人1998 Tetrahedron Lett.[四面体快报]39：5401-5404；Singh等人1998 Chem.Comm.[化学通讯]1247-1248；Kumar等人1998 Bioo.Med.Chem.Let.[生物有机化学与医药化学快报]8：2219-2222；Nielsen等人1997 J.Chem.Soc.[化学学会杂志]Perkins Transl.[博金斯译版]1：3423-3433；Singh等人1998 J.Org.Chem.[有机化学杂志]63：6078-6079；Seth等人2010 J.Org.Chem.[有机化学杂志]75：1569-1581；Singh等人1998 J.Org.Chem.[有机化学杂志]63：10035-39；Sorensen 2003 Chem.Comm.[化学通讯]2130-2131；Petersen等人2003 TRENDS Biotech.[生物技术趋势]21：74-81；Rajwanshi等人1999 Chem.Commun.[化学通讯]1395-1396；Jepsen等人2004 Oligo.[寡核苷酸]14：130-146；Morita等人2001 Nucl.Acids Res.[核酸研究]增刊1：241-242；Morita等人2002Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]12：73-76；Morita等人2003Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]2211-2226；Koizumi等人2003Nuc.Acids Res.[核酸研究]12：3267-3273；Lauritsen等人2002 Chem.Comm.[化学通讯]5：530-531；Lauritsen等人2003 Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]13：253-256；WO 20070900071；Seth等人，Nucleic Acids Symposium Series[核酸研讨会丛刊](2008)，52(1)，553-554；Seth等人2009 J.Med.Chem.[药物化学杂志]52：10-13；Seth等人2012 Mol.Ther-Nuc.Acids.[分子疗法-核酸]1，e47；Pallan等人2012 Chem.Comm.[化学通讯]48：8195-8197；Seth等人2010 J.Med.Chem.[药物化学杂志]53：8309-8318；Seth等人2012 Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]22：296-299；WO 2016/079181；US 6,326,199；US 6,066,500；和US 6,440,739。
在一些实施例中，糖和核苷分别包括在6′-位置具有(R)或(S)-手性的6′-修饰的双环糖和核苷，例如美国专利号7,399,845中描述的那些。在其他实施例中，糖和核苷分别包括在5′-位置具有(R)或(S)-手性的5′-修饰的双环糖和核苷，例如美国专利申请公开号20070287831中描述的那些。
在一些实施例中，经修饰的糖、核碱基、核苷、核苷酸和/或核苷酸间键联描述于美国专利号3,687,808以及美国专利号4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,457,191；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，其各自的经修饰的糖、核碱基、核苷、核苷酸和核苷酸间键联通过引用并入。
在一些实施例中，经修饰的糖、核碱基、核苷、核苷酸和/或核苷酸间键联是在以下任一项中描述的那些：Gryaznov，S；Chen，J.-K.J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1994，116，3143；Hendrix等人1997 Chem.Eur.J.[欧洲化学杂志]3：110；Hyrup等人1996Bioorg.Med.Chem.[生物有机化学与医药化学]4：5；Jepsen等人2004 Oligo.[寡核苷酸]14：130-146；Jones等人J.Org.Chem.[有机化学杂志]1993，58，2983；Koizumi等人2003Nuc.Acids Res.[核酸研究]12：3267-3273；Koshkin等人1998 Tetrahedron[四面体]54：3607-3630；Kumar等人1998 Bioo.Med.Chem.Let.[生物有机化学与医药化学快报]8：2219-2222；Lauritsen等人2002 Chem.Comm.[化学通讯]5：530-531；Lauritsen等人2003Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]13：253-256；Mesmaeker等人Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版]1994，33，226；Morita等人2001Nucl.Acids Res.[核酸研究]增刊1：241-242；Morita等人2002 Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]12：73-76；Morita等人2003 Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]2211-2226；Nielsen等人1997 Chem.Soc.Rev.[化学学会综述]73；Nielsen等人1997J.Chem.Soc.[化学学会杂志]Perkins Transl.[博金斯译版]1：3423-3433；Obika等人1997 Tetrahedron Lett.[四面体快报]38(50)：8735-8；Obika等人1998Tetrahedron Lett.[四面体快报]39：5401-5404；Pallan等人2012 Chem.Comm.[化学通讯]48：8195-8197；Petersen等人2003 TRENDS Biotech.[生物技术趋势]21：74-81；Rajwanshi等人1999 Chem.Commun.[化学通讯]1395-1396；Schultz等人1996 Nucleic Acids Res.[核酸研究]24：2966；Seth等人2009 J.Med.Chem.[药物化学杂志]52：10-13；Seth等人2010J.Med.Chem.[药物化学杂志]53：8309-8318；Seth等人2010 J.Org.Chem.[有机化学杂志]75：1569-1581；Seth等人2012 Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]22：296-299；Seth等人2012 Mol.Ther-Nuc.Acids.[分子疗法-核酸]1，e47；Seth，Punit P；Siwkowski，Andrew；Allerson，Charles R；Vasquez，Guillermo；Lee，Sam；Prakash，ThazhaP；Kinberger，Garth；Migawa，Michael T；Gaus，Hans；Bhat，Balkrishen；等人，来自NucleicAcids Symposium Series[核酸研讨会丛刊](2008)，52(1)，553-554；Singh等人1998Chem.Comm.[化学通讯]1247-1248；Singh等人1998 J.Org.Chem.[有机化学杂志]63：10035-39；Singh等人1998 J.Org.Chem.[有机化学杂志]63：6078-6079；Sorensen 2003Chem.Comm.[化学通讯]2130-2131；Ts′o等人Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]1988，507，220；Van Aerschot等人1995 Angew.Chem.Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版]34：1338；Vasseur等人J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1992，114，4006；WO 20070900071；WO 20070900071；和WO 2016/079181。
在一些实施例中，经修饰的糖、核碱基、核苷、核苷酸和/或核苷酸间键联包括以下、或包括以下中的那些：HNA、PNA、2′-氟N3′-P5′-氨基磷酸酯、LNA、β-D-氧基-LNA、2′-O，3′-C连接的双环、PS-LNA、β-D-硫代-LNA、β-D-氨基-LNA、木糖-LNA[c]、α-L-LNA、ENA、β-D-ENA、酰胺连接的LNA、甲基膦酸酯-LNA、(R、S)-cEt、(R、S)-cMOE、(R、S)-5′-Me-LNA、S-MecLNA、亚甲基-cLNA、3′-Me-α-L-LNA、R-6′-Me-α-L-LNA、S-5′-Me-α-L-LNA、或R-5′-Me-α-L-LNA。某些经修饰的糖、核碱基、核苷、核苷酸和/或核苷酸间键联描述于US 9394333、US9744183、US 9605019、US 20130178612、US 20150211006、US 9598458、US 20170037399、WO2017/015555、WO 2017/062862，其各自的经修饰的糖、核碱基、核苷、核苷酸和核苷酸间键联通过引用并入本文。
肌营养不良蛋白
在一些实施例中，本披露提供了技术(例如，寡核苷酸、组合物、方法等)，这些技术涉及肌营养不良蛋白(DMD)基因或由其编码的产物(转录物、蛋白质(例如，肌营养不良蛋白质的各种变体)等)。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列是或包含如下序列，该序列是DMD基因或其产物(例如，转录物、mRNA等)(例如，寡核苷酸-DMD寡核苷酸)中的序列，或与其互补(例如85％、90％、95％、100％；在许多实施例中是100％)。在一些实施例中，DMD基因或其产物中的这种序列包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、20、31、32、33、34、35个或更多个核碱基。在一些实施例中，DMD基因或其产物中的这种序列包含至少10个核碱基。在一些实施例中，DMD基因或其产物中的这种序列包含至少15个核碱基。在一些实施例中，DMD基因或其产物中的这种序列包含至少16个核碱基。在一些实施例中，DMD基因或其产物中的这种序列包含至少17个核碱基。在一些实施例中，DMD基因或其产物中的这种序列包含至少18个核碱基。在一些实施例中，DMD基因或其产物中的这种序列包含至少19个核碱基。在一些实施例中，DMD基因或其产物中的这种序列包含至少20个核碱基。在一些实施例中，本披露提供了技术(包括DMD寡核苷酸和组合物及其使用方法)，这些技术用于治疗肌肉营养不良(包括但不限于杜氏肌肉营养不良(也缩写为DMD)和贝克肌肉营养不良(BMD))。在一些实施例中，DMD包含一个或多个突变。在一些实施例中，此类突变与患有或易患肌肉营养不良的受试者中肌营养不良蛋白质的降低的生物学功能相关。
在一些实施例中，肌营养不良蛋白(DMD)基因、或其产物、或其变体或部分可以称为DMD、BMD、CMD3B、DXS142、DXS164、DXS206、DXS230、DXS239、DXS268、DXS269、DXS270、DXS272、MRX85、或肌营养不良蛋白；外部ID：OMIM：300377MGI：94909；同源基因：20856；基因卡(GeneCards)：DMD；在人类中：Entrez：1756；Ensembl：ENSG00000198947；UniProt：P11532；RefSeq(mRNA)：NM_000109；NM_004006；NM_004007；NM_004009；NM_004010；RefSeq(蛋白质)：NP_000100；NP_003997；NP_004000；NP_004001；NP_004002；位置(UCSC)：Chr X：31.1-33.34Mb；在小鼠中：Entrez：13405；Ensembl：ENSMUSG00000045103；UniProt：P11531；RefSeq(mRNA)：NM_007868；NM_001314034；NM_001314035；NM_001314036；NM_001314037；RefSeq(蛋白质)：NP_001300963；NP_001300964；NP_001300965；NP_001300966；NP_001300967；位置(UCSC)：Chr X：82.95-85.21Mb。
据报道，DMD基因含有79个外显子，分布在X染色体上超过230万bp的遗传不动位置(genetic real estate)；然而，据报道仅有大约14,000bp(＜1％)用于翻译成蛋白质(编码序列)。据报道，约99.5％的遗传序列(即内含子序列)从230万bp的初始异核RNA转录物中剪接，以提供成熟的14,000bp mRNA，其包括肌营养不良蛋白质产生的所有关键信息。在一些实施例中，患有DMD的患者在DMD基因中具有一个或多个突变，该DMD基因阻止野生型DMDmRNA的适当构建和/或野生型肌营养不良蛋白质的产生，并且患有DMD的患者在他们的肌肉经常显示出显著的肌营养不良蛋白缺乏。
在一些实施例中，肌营养不良蛋白转录物(例如，mRNA或蛋白质)涵盖与可替代的剪接相关或由其产生的那些。例如，在分析骨骼肌、脑和心脏组织中的DMD基因的剪接模式后，报道了肌营养不良蛋白基因的十六种可替代的转录物。Sironi等人2002 FEBS Letters[FEBS通讯]517：163-166。
据报道，肌营养不良蛋白具有若干种同种型。在一些实施例中，肌营养不良蛋白是指特定的同种型。已经报道了至少三种全长肌营养不良蛋白同种型，各自由组织-特定的启动子控制。Klamut等人1990 Mol.Cell.Biol.[分子生物学杂志]10：193-205；Nudel等人1989 Nature[自然]337：76-78；Gorecki等人1992 Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]1：505-510。据报道，肌肉同种型主要在骨骼肌中表达，但也在平滑肌和心肌中表达[Bies，R.D.，Phelps，S.F.，Cortez，M.D.，Roberts，R.，Caskey，C.T.和Chamberlain，J.S.1992Nucleic Acids Res.[核酸研究]20：1725-1731]，据报道，脑肌营养不良蛋白对皮质神经元具有特异性，但也可在心脏和小脑神经元中检测到，而据报道，浦肯野细胞(Purkinje-cell)类型几乎占了所有小脑肌营养不良蛋白[Gorecki等人1992 Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]1：505-510]。据报道，可替代的剪接提供了肌营养不良蛋白多样化的手段：据报道，基因的3’区域经历了可替代的剪接，该可替代的剪接产生脑神经元、心脏浦肯野纤维、和平滑肌细胞中的组织特异性转录物[Bies等人1992 Nucleic Acids Res.[核酸研究]20：1725-1731；和Feener等人1989 Nature[自然]338：509-511]，而在骨骼肌基因的5’区域已经报道了12种可替代的剪接模式[Surono等人1997 Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理研究通讯]239：895-899]。
在一些实施例中，肌营养不良蛋白mRNA、基因或蛋白质是回复突变型版本。其中，报告了回复突变型肌营养不良蛋白，例如在：Hoffman等人1990J.Neurol.Sci.[神经科学杂志]99：9-25；Klein等人1992 Am.J.Hum.Genet.[美国人类遗传学杂志]50：950-959；以及Chelly等人1990 Cell[细胞]63：1239-1348；Arahata等人1998 Nature[自然]333：861-863；Bonilla等人1988 Cell[细胞]54：447-452；Fanin等人1992 Neur.Disord.[神经发育障碍杂志]2：41-45；Nicholson等人1989 J.Neurol.Sci.[神经科学杂志]94：137-146；Shimizu等人1988 Proc.Jpn.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]64：205-208；Sicinzki等人1989 Science[科学]244：1578-1580；以及Sherratt等人Am.J.Hum.Genet.[美国人类遗传学杂志]53：1007-1015。
DMD基因中的各种突变可以和/或据报道引起肌肉营养不良。
肌肉营养不良
包含本文所述的一个或多个DMD寡核苷酸的组合物可以用于治疗肌肉营养不良。在一些实施例中，肌肉营养不良(MD)是导致(增加)骨骼肌随时间减弱和分解的一组肌肉病症、疾病、或障碍中的任一种。主要影响肌肉的病症、疾病或障碍，当症状开始时的无力程度以及症状恶化的速度。许多MD患者最终将无法行走。在许多情况下，肌肉营养不良是致命的。一些类型也与其他器官(包括中枢神经系统)的问题有关。在一些实施例中，肌肉营养不良是杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)。
在一些实施例中，杜氏肌肉营养不良的症状是与肌肉萎缩相关的肌肉无力，其中随意肌肉首先受到影响，尤其是臀部、骨盆区域、大腿、肩膀和小腿的那些。肌肉无力也会在手臂、颈部和其他部位发生。小腿经常肿大。症状通常出现在六岁之前，并且可能出现在婴儿早期。其他身体症状是：走路、踩踏或跑步的尴尬方式(在一些情况下，由于小腿肌肉张力增加，患者倾向于以前脚行走)，频繁跌倒，疲劳，运动技能(例如，跑步、单脚跳跃、双脚跳跃)困难，腰椎脊柱前凸过度、可能导致髋屈肌缩短，不寻常的整体姿势和/或行走、踩踏或跑步的方式，跟腱和腿筋的肌肉挛缩损害功能，进行性行走困难，肌纤维畸形，舌头和小腿肌肉的假性肥大(肿大)，神经行为障碍(例如，ADHD)、学习障碍(例如，阅读障碍)的高风险，以及特定认知技能(例如，短期言语记忆)的非进行性弱点，被认为是大脑中缺乏肌营养不良蛋白或肌营养不良蛋白功能失调的结果，最终丧失行走能力(通常在12岁时)，骨骼畸形(包括一些情况下的脊柱侧凸)，以及从躺着或坐姿起身麻烦。
在一些实施例中，贝克肌肉营养不良(BMD)是由产生缩短但框内转录物的突变引起，导致产生截短的、但具有部分功能的一种或多种蛋白质。据报道，此类一种或多种具有部分功能的蛋白质保留了关键氨基末端，富含半胱氨酸和C末端结构域，但通常缺乏中心杆结构域的元件，据报道该中心杆结构域的功能意义较小。England等人1990Nature[自然]，343，180-182。
在一些实施例中，BMD表型的范围从轻度DMD到实际上无症状，这取决于精确突变和产生的肌营养不良蛋白的水平。Yin等人2008 Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]17：3909-3918。
在一些实施例中，具有框外突变的营养不良患者通常被诊断为具有更严重的杜氏肌肉营养不良，并且具有框内突变的营养不良患者通常被诊断为具有不太严重的贝克肌肉营养不良。然而，少数患有框架内缺失的患者被诊断患有杜氏肌肉营养不良(包括在外显子50或51开始或结束的缺失突变的那些，其编码部分铰链区，如外显子47至51、48至51、和49至53的缺失)。不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出尽管存在相同的外显子缺失，但据报道患者与患者之间疾病严重程度的可变性可以与以下有关：特定缺失断点对mRNA剪接效率和/或模式的影响；基因组重排后的翻译或转录效率；和截短的蛋白质结构的稳定性或功能。Yokota等人2009 Arch.Neurol.[神经病学年鉴]66：32。
外显子跳读作为用于肌肉营养不良的治疗
在一些实施例中，肌肉营养不良的治疗包含使用能够介导一个或多个肌营养不良蛋白外显子的跳读的DMD寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了用于治疗肌肉营养不良的方法，该方法包括向患有该疾病或易患该疾病的受试者施用DMD寡核苷酸、或包含DMD寡核苷酸的组合物。特别地，除其他事项外，本披露证明了，与在其他方面相同的非手性受控的寡核苷酸/寡核苷酸组合物相比，手性受控的寡核苷酸/手性受控的寡核苷酸组合物出乎意料地有效调节外显子跳读。在一些实施例中，本披露证明了掺入一个或多个非负电荷的核苷酸间键联可以极大地改善递送和/或整体外显子跳读效率。
在一些实施例中，肌肉营养不良的治疗使用DMD寡核苷酸，其中该寡核苷酸能够提供一个或多个外显子的跳读。跳读一个或多个(例如，多种)DMD外显子可以例如去除一个或多个突变的外显子，或在未被跳读的外显子中补偿一个或多个突变(例如，如果该突变是移码突变，则恢复读框)。在一些实施例中，DMD寡核苷酸能够介导外显子的跳读，该外显子包含突变(例如，移码、插入、缺失、错义或无义突变、或其他突变)，其中外显子的跳读维持(或恢复)DMD基因的适当的读框，并且翻译产生截短但具有功能(或大部分功能)的DMD蛋白质。在一些实施例中，DMD寡核苷酸通过提供不同外显子(不是包含移码突变的外显子)的跳读来补偿包含移码突变的外显子，并因此恢复DMD基因的读框。在一些实施例中，患有肌肉营养不良的患者具有DMD基因的一个外显子的移码突变；并且该患者接受了DMD寡核苷酸治疗，该寡核苷酸不会导致具有突变的外显子的跳读，但会导致其他外显子的跳读，从而恢复DMD基因的读框，使得产生了具有功能的DMD蛋白质(并且，如果缺失的外显子位于具有移码突变的外显子到3’处，则具有功能的DMD蛋白通常具有正常DMD蛋白的氨基酸，除了在DMD中通常未发现的氨基酸的序列，范围从移码突变到外显子，该外显子位于缺失的外显子到3’处。
在一些实施例中，包含DMD寡核苷酸的组合物可用于治疗中枢神经系统的肌营养不良蛋白相关的障碍。在一些实施例中，本披露涉及治疗中枢神经系统的肌营养不良蛋白相关的障碍的方法，其中该方法包括向患有中枢神经系统的肌营养不良蛋白相关的障碍的患者施用治疗有效量DMD寡核苷酸的步骤。在一些实施例中，将DMD寡核苷酸在中枢神经系统外部(作为非限制性实例，静脉内或肌肉内)施用患有中枢神经系统的肌营养不良蛋白相关的障碍的患者，并且DMD寡核苷酸能够通过血脑屏障进入中枢神经系统。在一些实施例中，将DMD寡核苷酸直接施用中枢神经系统(作为非限制性实例，经由鞘内、心室内、颅内等递送)。
在一些实施例中，中枢神经系统的肌营养不良蛋白相关的障碍、或其症状可以是以下的任一个或多个：智力下降，长期记忆力下降，短期记忆力下降，语言障碍，癫痫，自闭症谱系障碍，注意缺陷多动障碍(ADHD)，强迫症，学习问题，行为障碍，脑容量减少，灰质体积减小，较低的白质分数各向异性，较高的白质径向扩散率，颅骨形状的异常，或海马体、苍白球、尾壳核、下丘脑、前连合、导水管周围灰质、内囊、杏仁核、胼胝体、隔核、伏隔核、伞部(fimbria)、脑室、或中脑丘脑的体积和结构的有害改变。在一些实施例中，展示肌肉营养不良的肌肉相关的症状的患者还展示中枢神经系统的肌营养不良蛋白相关的障碍的症状。
在一些实施例中，中枢神经系统的肌营养不良蛋白相关的障碍与以下相关、与以下有关系、和/或由以下引起：肌营养不良蛋白基因的基因产物(如全长肌营养不良蛋白或者肌营养不良蛋白的较小同种型，包括但不限于Dp260、Dp140、Dp116、Dp71或Dp40)的水平、活性、表达和/或分布的异常。在一些实施例中，将DMD寡核苷酸施用至肌肉营养不良患者的中枢神经系统中，以改善中枢神经系统的肌营养不良蛋白相关的障碍的一种或多种系统。在一些实施例中，中枢神经系统的肌营养不良蛋白相关的障碍与以下相关、与以下有关系、和/或由以下引起：肌营养不良蛋白基因的基因产物(如全长肌营养不良蛋白或者肌营养不良蛋白的较小同种型，包括但不限于Dp260、Dp140、Dp116、Dp71或Dp40)的水平、活性、表达和/或分布的异常。在一些实施例中，向患有中枢神经系统的肌营养不良蛋白相关的障碍的患者施用DMD寡核苷酸增加肌营养不良蛋白基因的基因产物的水平、活性、和/或表达，和/或改善肌营养不良蛋白基因的基因产物的分布。
在一些实施例中，本披露提供了用于调节肌营养不良蛋白前mRNA剪接的技术，由此切下选择的外显子以去除无义突变或恢复成熟mRNA的移码突变周围的读框。在一些实施例中，能够跳读外显子的DMD寡核苷酸能够恢复读框。
作为非限制性实例，在患有外显子50缺失的杜氏肌肉营养不良的患者中，产生框外转录物，其中外显子49被剪接至外显子51。结果，外显子51中产生了终止密码子，从而提前地终止了肌营养不良蛋白的合成。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其可介导外显子51的跳读，恢复转录物的可读框，并允许产生类似于贝克肌肉营养不良(BMD)患者中的截短的肌营养不良蛋白。
在一些实施例中，在DMD患者中，DMD基因含有包含突变的外显子，并且通过跳读一个或多个外显子(例如，包含突变的外显子或与包含突变的外显子相邻的外显子、或一组连续的外显子(包括包含突变的外显子))来至少部分地治疗该障碍。
在一些实施例中，在DMD患者中，DMD基因或转录物在一个或多个外显子中具有突变，该突变是错义或无义突变和/或缺失、插入、反向、易位或复制。在一些实施例中，在DMD患者中，DMD基因或转录物具有一个或多个外显子中的突变，这导致移码、提前终止密码子、或以其他方式干扰适当的读框。
在一些实施例中，在肌肉营养不良的治疗中，跳读DMD的外显子，其中该外显子编码一串对DMD蛋白功能不是必需的氨基酸，或者其跳读可以提供具有完全功能或具有部分功能的DMD蛋白质。在一些实施例中，在肌肉营养不良的治疗中，跳读DMD的外显子，其中所跳读的一个或多个外显子包括：包含突变的外显子或与包含突变的外显子相邻(例如，侧接)的外显子，或其中多个外显子被跳读，所跳读的外显子任选地包括包含突变的外显子。在一些实施例中，在肌肉营养不良的治疗中，跳读两个或更多个外显子，其中所跳读的外显子包括：包含突变的外显子或与包含突变的外显子相邻(例如，侧接)的外显子。在一些实施例中，在肌肉营养不良的治疗中，外显子包含移码突变，并且不同的外显子的跳读(同时使具有移码突变的外显子保持原位)恢复了适当的读框。
在一些实施例中，在肌肉营养不良的治疗中，DMD寡核苷酸能够介导一个或多个DMD外显子的跳读，从而恢复或维持适当的读框、和/或产生人工内部截短的DMD，其提供至少部分地改善的或完全恢复的生物活性。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸跳读如下一个或多个外显子，该一个或多个外显子不是外显子64和外显子70(据报道这些外显子的部分对于蛋白质功能而言是重要的)和/或不是第一个或最后一个外显子。在一些实施例中，DMD寡核苷酸跳读一个或多个外显子，但是跳读一个或多个外显子不会导致N-末端区域中一个或多个或所有肌动蛋白结合位点的缺失。
在一些实施例中，由具有一个或多个跳读的外显子的肌营养不良蛋白转录物产生的内部截短的DMD蛋白质比末端截短的DMD蛋白质(例如，由具有框外缺失的肌营养不良蛋白转录物产生)更具功能性。
在一些实施例中，由具有一个或多个跳读的外显子的肌营养不良蛋白转录物产生的内部截短的DMD蛋白质对无义介导的衰变更具抗性，其可降解末端截短的DMD蛋白质(例如，由具有框外缺失的肌营养不良蛋白转录物产生)。
在一些实施例中，肌肉营养不良的治疗使用DMD寡核苷酸，其中该寡核苷酸能够提供一个或多个外显子的跳读。跳读一个或多个(例如，多种)DMD外显子可以例如去除突变的外显子，或在未被跳读的外显子中补偿突变(例如，从移码突变恢复)。
在一些实施例中，本披露涵盖了以下认识：可以利用DMD突变的性质和位置来设计外显子跳读策略。在一些实施例中，如果DMD患者在外显子中具有突变，则跳读突变的外显子可以产生内部截短的(内部缩短的)、但至少具有部分功能的DMD蛋白质产物。
在一些实施例中，DMD患者具有改变DMD转录物剪接的突变，例如通过灭活剪接所需的位点、或活化隐蔽位点以使其活化以进行剪接，或通过创建可替代的(例如，不自然)剪接位点。在一些实施例中，这种突变导致产生具有低活性或无活性的蛋白质。在一些实施例中，剪接调节(例如，外显子跳读、抑制这种突变等)可以用于去除或减少这种突变的影响，例如通过恢复适当的剪接以产生具有恢复的活性的蛋白质，或产生具有改善或恢复的活性等的内部截短的肌营养不良蛋白质。
在一些实施例中，DMD患者具有作为一个或若干个外显子的复制的突变，并且本披露提供了外显子跳读技术以缺失复制和/或恢复读框。
在一些实施例中，DMD患者具有导致外显子跳读的突变，这进而可以导致移码。在一些实施例中，本披露提供了可以提供跳读一个或多个另外的外显子以恢复读框的技术。例如，可以通过跳读外显子50或52来解决引起移码的外显子51的缺失，从而恢复读框。在一些实施例中，DMD患者具有一个外显子的突变，从而导致移码，并且一个或多个不同的外显子(例如，不同的外显子，或者紧邻或侧接至突变的外显子的5′或3’的一个或多个外显子)的缺失恢复读框。
在一些实施例中，恢复读框可以将框外突变转换为框内突变；在一些实施例中，在人中，这种变化可以将严重的杜氏肌肉营养不良转化为更温和的贝克肌肉营养不良。
在一些实施例中，在施用包含DMD寡核苷酸的组合物之前，分析DMD患者或怀疑患有DMD的患者的DMD基因型。
在一些实施例中，在施用包含DMD寡核苷酸的组合物之前，分析DMD患者或怀疑患有DMD的患者的DMD表型。
在一些实施例中，分析DMD患者的基因型和表型，以在施用包含DMD寡核苷酸的组合物之前确定DMD基因型和DMD表型的关系。
在一些实施例中，在施用包含DMD寡核苷酸的组合物之前，遗传地证实患者具有营养不良。
在一些实施例中，DMD或患者的DMD基因型或遗传验证的分析包含确定患者是否在DMD中具有一个或多个有害突变。
在一些实施例中，DMD或患者的DMD基因型或遗传验证的分析包含确定患者是否在DMD中具有一个或多个有害突变和/或分析DMD剪接和/或检测DMD的剪接变体，其中通过DMD的异常拼接产生剪接变体。
在一些实施例中，DMD基因型的分析或DMD的遗传验证通知选择包含可用于治疗的DMD寡核苷酸的组合物。
在一些实施例中，从患者或患者的一个或多个细胞或一个或多个组织去除或复制异常或突变DMD基因，并且将异常或突变DMD基因、或包含异常或突变的其部分，或其拷贝插入细胞中。在一些实施例中，此细胞可用于测试包含DMD寡核苷酸的各种组合物，以预测这种组合物是否可用于治疗患者。在一些实施例中，该细胞是成肌细胞或肌小管(myotubule)。
在一些实施例中，个体或患者可以在用DMD寡核苷酸治疗之前产生DMD的一种或多种剪接变体，通常每种变体以非常低的水平产生。在一些实施例中，如实例20中所述的方法可用于检测在施用DMD寡核苷酸之前、期间或之后在患者中产生的低水平的剪接变体。
在一些实施例中，在施用包含DMD寡核苷酸的组合物之前，分析患者和/或其组织产生DMD基因的各种剪接变体。
在一些实施例中，本披露提供了用于设计DMD寡核苷酸(例如，能够介导DMD的一个或多个外显子的跳读的寡核苷酸)的方法。在一些实施例中，本披露利用本文所述的基本原理设计和任选的序列步移来设计寡核苷酸，例如，用于在一种或多种测定和/或条件下测试外显子跳读。在一些实施例中，在合理设计后开发有效的寡核苷酸，包括使用给定生物系统的各种信息。
在一些实施例中，在用于开发DMD寡核苷酸的方法中，设计寡核苷酸以与一个或多个潜在的剪接相关基序退火，然后测试它们介导外显子跳读的能力。在一些实施例中，剪接相关基序包括但不限于以下任一个或多个：靶外显子的受体、外显子识别序列(ERS)、外显子剪接增强子(ESE)位点、剪接增强子序列(SES)、分支点序列和供体剪接位点。在例如以下中报道了可能参与剪接的某些序列：Disset等人2006 Human Mol.Gen.[人类分子遗传学]15：999-1013。
在一些实施例中，如RESCUE-ESE、ESEfinder和PESX服务器的软件包可用于预测推定的ESE位点(Fairbrother等人2002 Science[科学]297：1007-1013；Cartegni等人2003Nat.Struct.Biol.[自然结构与分子生物学]120-125；Zhang和Chasin 2004 Gen.Dev.[基因与发育]18：1241-1250；Smith等人2006 Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]15：2490-2508)。
在一些实施例中，靶向DMD外显子的受体、外显子识别序列(ERS)、外显子剪接增强子(ESE)位点或供体剪接位点，或与其相互作用的DMD寡核苷酸不与另一(例如脱靶)基因的序列相互作用或与其显著相互作用。
在一些实施例中，在合理的DMD寡核苷酸设计方法中，考虑肌营养不良蛋白转录物(例如mRNA)的二级结构来设计寡核苷酸。然后可以评估设计的寡核苷酸的外显子跳读。已经使用本披露中描述的合理方法设计了许多有效的DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，可替代地或另外地，可以进行(例如外显子序列的)序列步移以搜索有效的DMD寡核苷酸序列。
在一些实施例中，提供的方法包括序列步移(sequence walking)。在一些实施例中，产生了一组重叠的寡核苷酸。在一些实施例中，一组中的寡核苷酸具有相同的长度，并且该组中的寡核苷酸的5′端均匀地间隔开。在一些实施例中，一组重叠的寡核苷酸涵盖整个外显子或其一个或多个部分。步移中的寡核苷酸的5′端能以合适的距离(例如，相距1个碱基、相距2个碱基、相距3个碱基等)均匀地间隔开。除其他事项外，本披露证明了可以优化序列并且结合本披露的化学和/或立体化学技术，可以制备高效的寡核苷酸(和其组合物及使用方法)。
用于评估寡核苷酸和寡核苷酸组合物的示例技术
用于评估寡核苷酸的特性和/或活性的各种技术可以依照本披露利用，例如，US20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/015575、WO 2017/192664、WO 2017/062862、WO2017/192679、WO 2017/210647等。
例如，依照本披露，可以评估DMD寡核苷酸在各种测定(包括体外和体内测定)中介导外显子跳读的能力。体外测定可以在本文所述的或本领域已知的各种测试细胞(包括但不限于Δ48-50患者来源的成肌细胞)中进行。体内测试可以在本文所述或本领域已知的测试动物(包括但不限于小鼠、大鼠、猫、猪、狗、猴、或非人灵长类动物)中进行。
作为非限制性实例，下文描述了许多测定用于评估DMD寡核苷酸的特性/活性。各种其他合适的测定可用并且可用于评估寡核苷酸特性/活性，包括未设计用于外显子跳读的寡核苷酸的那些(例如，对于可以涉及RNA酶H以降低靶转录物水平的寡核苷酸的，描述在US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/015575、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO2017/210647等中的测定)。
可以评估DMD寡核苷酸介导肌营养不良蛋白RNA中外显子的跳读的能力，其可以使用巢式PCR、qRT-PCR和/或测序作为非限制性实例进行测试。
可以评估DMD寡核苷酸介导蛋白质恢复的能力(例如，产生缺少与跳读的外显子中编码的密码子对应的氨基酸的内部截短的蛋白质，其与在外显子跳读之前产生的蛋白质(如果有的话)相比具有改善的功能)，其可以通过许多蛋白质检测和/或定量方法(例如蛋白质印迹，免疫染色等)进行评估。肌营养不良蛋白的抗体是可商购的或者(如果希望)可以开发用于所希望的目的。
可以评估DMD寡核苷酸介导稳定恢复蛋白质产生的能力。在非限制性实例中，可以在血清和组织稳定性的测定中测试恢复的蛋白质的稳定性。
可以评估DMD寡核苷酸结合蛋白质(如白蛋白)的能力。示例相关技术包括例如在WO 2017/015555、WO 2017/015575等中描述的那些。
可以例如通过细胞因子活化、补体活化、TLR9活性等的测定来评估DMD寡核苷酸的免疫活性。示例相关技术包括例如在WO 2017/015555、WO 2017/015575、WO 2017/192679、WO 2017/210647等中描述的那些。
在一些实施例中，可以在以下测试DMD寡核苷酸的功效，例如，计算机分析和预测、无细胞提取物、用人工构建体转染的细胞、动物(如具有人肌营养不良蛋白转基因或其部分的小鼠)、正常和营养不良的人肌源性细胞系、和/或临床试验。可能需要利用一种以上的测定，因为正常和营养不良的人肌源性细胞系有时在某些条件下可产生不同的功效结果(Mitrpant等人2009 Mol.Ther.[分子理论]17：1418)。
在一些实施例中，可以在细胞中体外测试DMD寡核苷酸。在一些实施例中，在细胞中体外测试涉及一种或多种寡核苷酸的裸式递送(gymnotic delivery)，或使用递送剂或转染子的递送，其中许多是本领域已知的并且可以依照本披露使用。
在一些实施例中，可以在正常人骨骼肌细胞(hSkMC)中体外测试DMD寡核苷酸。参见，例如，Arechavala等人2007 Hum.Gene Ther.[人类基因疗法]18：798-810。
在一些实施例中，可以在来自DMD患者的肌肉外植体中测试DMD寡核苷酸。来自DMD患者的肌肉外植体报道于例如，Fletcher等人2006 J.Gene Med.[基因医学杂志]8：207-216；McClorey等人2006 Neur.Dis.[临床神经学]16：583-590；以及Arechavala等人2007Hum.Gene Ther.[人类基因疗法]18：798-810。
在一些实施例中，细胞是或包含来自DMD患者的培养的肌肉细胞。参见，例如：Aartsma-Rus等人2003 Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]8：907-914。
在一些实施例中，单独的DMD寡核苷酸可以证明在某些情况下其跳读外显子能力的实验与实验间可变性。在一些实施例中，取决于使用哪种细胞、生长条件和其他实验因子，单独的DMD寡核苷酸可以证明其跳读一个或多个外显子的能力的可变性。为了控制变异，通常在相同或基本相同的条件下测定待测试的寡核苷酸和对照寡核苷酸。
体外实验还包括用患者来源的成肌细胞进行的那些。本文描述了来自这些实验的某些结果。在某些此类实验中，将细胞在骨骼生长培养基中培养以使它们保持在分裂/未成熟的成肌细胞状态。然后将培养基更换为“分化”培养基(含有胰岛素和2％马血清)，同时在培养基中添加寡核苷酸用于给药。细胞分化为肌管，因为它们被给药一段合适的时间，例如，RNA实验总共4d以及蛋白质实验总共6d(此类条件称为‘0d预分化’(RNA为0d+4d，蛋白质为0d+6d))。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，可能需要知道DMD寡核苷酸是否能够进入成熟肌管并诱导这些细胞以及“未成熟”细胞中的跳读。在一些实施例中，本披露提供了测试DMD寡核苷酸在肌管中的作用的测定。在一些实施例中，使用不同于‘0d预分化’的给药方案，其中将成肌细胞在分化培养基中预分化成肌管持续数天(4d或7d或10d)，然后施用DMD寡核苷酸。某些相关的方案在实例19中描述。
在一些实施例中，本披露证明，在预分化实验中，DMD寡核苷酸(不包括为PMO的那些)通常产生约相同水平的RNA跳读和肌营养不良蛋白质恢复，而不管给药前的分化培养基中细胞培养的天数。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其能够进入成肌细胞和肌管中并且在成肌细胞和肌管中有活性。在一些实施例中，在Δ45-52 DMD患者细胞(也称为D45-52或del45-52)或Δ52 DMD患者细胞(也称为D52或del52)中体外测试DMD寡核苷酸，具有0、4或7天的预分化。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸可以在各种动物模型中的任何一种或多种中进行测试，这些动物模型包括非哺乳动物和哺乳动物模型；作为非限制性实例，包括新杆状线虫属(Caenorhabditis)、果蝇属(Drosophila)、斑马鱼、小鼠、大鼠、猫、狗和猪。参见，例如，以下中的综述：McGreevey等人2015Dis.Mod.Mech.[疾病模型和机制]8：195-213。
mdx小鼠的实例用途报道在，例如：Lu等人2003Nat.Med.[自然医学]9：1009；Jearawiriyapaisarn等人2008 Mol.Ther.[分子疗法]，16，1624-1629；Yin等人2008Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]，17，3909-3918；Wu等人2009 Mol.Ther.[分子疗法]，17，864-871；Wu等人2008 Proc.Natl Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，105，14814-14819；Mann等人2001 Proc.Nat.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98：42-47；以及Gebski等人2003 Hum.Mol.Gen.[人类分子遗传学]12：1801-1811。
可以在狗中测试DMD寡核苷酸的功效，如，金毛猎犬肌肉营养不良(GRMD)动物模型。Lu等人2005 Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]102：198-203；Alter等人2006 Nat.Med.[自然医学]12：175-7；McClorey等人2006 Gene Ther.[基因疗法]13：1373-81；以及Yokota等人2012 Nucl.Acid Ther.[核酸疗法]22：306。
可以在测试动物体内评估DMD寡核苷酸有效递送至各种组织(例如，骨骼、心脏和/或膈肌)；在非限制性实例中，这可以通过杂交ELISA和动物组织中的分布测试来测试。
可以在测试动物体内评估DMD寡核苷酸的血浆PK；作为非限制性实例，这可以通过测定AUC(曲线下面积)和半衰期来测试。
在一些实施例中，可以经由肌肉内施用至测试动物的肌肉在体内测试DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，可以经由肌肉内施用进入测试动物的腓肠肌中体内测试DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，可以经由肌肉内施用进入小鼠的腓肠肌中体内测试DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，可以经由肌肉内施用进入小鼠模型(转基因整个人肌营养不良蛋白基因座)的腓肠肌中体内测试DMD寡核苷酸。参见，例如：Bremmer-Bout等人2004Mol.Ther.[分子疗法]10，232-240。
可以进行另外的测试来评估DMO寡核苷酸(包括中心成核纤维计数和肌营养不良蛋白阳性纤维计数、以及功能性握力分析)的功效。作为非限制性实例，参见以下报道的实验方案：Yin等人2009 Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]18：4405-4414。
作为非限制性实例，测试DMD寡核苷酸的另外的方法包括以下中报道的方法：Kinali等人2009 Lancet[柳叶刀]8：918；Bertoni等人2003 Hum.Mol.Gen.[人类分子遗传学]12：1087-1099。
寡核苷酸及其组合物的某些实施例
除其他事项外，本披露提供了可用于靶向多种基因(包括由其编码的产物和/或与其相关的病症、疾病和/或障碍)的寡核苷酸和组合物及其使用方法。在一些实施例中，本披露提供了用于DMD的寡核苷酸和组合物及其使用方法。在一些实施例中，本披露提供了DMD寡核苷酸，其中该DMD寡核苷酸的碱基序列是或包含本文列出的任何DMD寡核苷酸的序列的至少15个连续碱基。在一些实施例中，本披露提供了DMD寡核苷酸，其中该DMD寡核苷酸的碱基序列是或包含本文列出的任何DMD寡核苷酸的序列的至少15个连续碱基，并且其中该DMD寡核苷酸小于约50个碱基长。在一些实施例中，本披露提供了包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸或寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，本披露提供了DMD寡核苷酸(多种DMD寡核苷酸)的手性受控的组合物，其中该DMD寡核苷酸的碱基序列是或包含本文列出的任何DMD寡核苷酸的序列的至少15个连续碱基。在一些实施例中，本披露提供了DMD寡核苷酸的手性受控的组合物，其中该DMD寡核苷酸的碱基序列是或包含本文列出的任何DMD寡核苷酸的序列的至少15个连续碱基，并且其中该DMD寡核苷酸小于约50个碱基长。
在一些实施例中，本披露提供了具有如下序列的手性受控的寡核苷酸，该序列由以下组成或包含以下：表A1中列出的任何寡核苷酸中发现的序列或其15碱基部分，其中一个或多个U可以任选地且独立地被T替换(反之亦然)。
在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸，其包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU、CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC或UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC或其至少15个碱基长的部分的序列，其中每个U可以任选地且独立地被T替换，其中至少一个核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸，其包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU、CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC、或UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC或其至少15个碱基长的部分的序列，其中每个U可以任选地且独立地被T替换，其中至少一个手性受控的核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III，或其盐形式。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸，其包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU、CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC、或UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC或其至少15个碱基长的部分的序列，其中每个U可以任选地且独立地被T替换，其中至少一个手性受控的核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2，或其盐形式。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸，其包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU、CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC、或UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC或其至少15个碱基长的部分的序列，其中每个U可以任选地且独立地被T替换，其中每个手性受控的核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2，或其盐形式。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸，其包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU、CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC或UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC或其至少15个碱基长的部分的序列，其中每个U可以任选地且独立地被T替换，其中至少一个核苷酸间键联具有以下结构：式I-c或其盐形式。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸，其包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU、CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC或UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC或其至少15个碱基长的部分的序列，其中每个U可以任选地且独立地被T替换，其中至少一个核苷酸间键联具有以下结构：式I-c或其盐形式，并且至少一个核苷酸间键联是非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸，其包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU、CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC、或UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC或其至少15个碱基长的部分的序列，其中每个U可以任选地且独立地被T替换，其中至少一个核苷酸间键联是手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且至少一个核苷酸间键联是具有以下结构的非负电荷的核苷酸间键联：式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2，或其盐形式。在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸，其包含UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU、CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC或UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC或其至少15个碱基长的部分的序列，其中每个U可以任选地且独立地被T替换，其中每个核苷酸间键联是磷酸二酯。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个核苷酸间键联，其包含在某些条件下易于“自行释放”的磷修饰。即，在某些条件下，设计特定的磷修饰，使得其从寡核苷酸自行切割以提供例如磷酸二酯，如在天然存在的DNA和RNA中所发现的那些磷酸二酯。在一些实施例中，此类磷修饰具有-O-L-R1的结构，其中L和R1各自独立地如本披露中所述。
在一些实施例中，本披露提供的寡核苷酸包含化学修饰和/或立体化学，其递送期望的特性，例如向靶细胞/组织/器官递送药效学、药代动力学等。
在一些实施例中，寡核苷酸在键联磷处包含修饰，该键联磷可以通过包括但不限于以下的一种或多种酯酶、核酸酶和/或细胞色素P450酶转化为天然磷酸酯键联：CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2A7、CYP2A13、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP2F1、CYP2J2、CYP2R1、CYP2S1、CYP2U1、CYP2W1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP3A43、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4V2、CYP4X1、CYP4Z1、CYP5A1、CYP7A1、CYP7B1、CYP8A1(前列环素合酶)、CYP8B1(胆汁酸生物合成)、CYP11A1、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、CYP19A1、CYP20A1、CYP21A2、CYP24A1、CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1、CYP27A1(胆汁酸生物合成)、CYP27B1(维生素D31-α羟化酶，活化维生素D3)、CYP27C1(功能未知)、CYP39A1、CYP46A1、和CYP51A1(羊毛甾醇14-α脱甲基酶)。
在一些实施例中，寡核苷酸包含在键联磷处的修饰，该键联磷是前药部分，例如有助于在去除前将寡核苷酸递送至所希望位置的P-修饰部分。例如，在一些实施例中，P-修饰部分是由在键联磷处的聚乙二醇化产生。相关领域的技术人员应理解，各种PEG链长都是可用的，且链长的选择将部分地由试图通过聚乙二醇化达成的结果而定。例如，在一些实施例中，为减少RES吸收和延长寡核苷酸的体内循环寿命，进行聚乙二醇化。
在一些实施例中，用于依照本披露使用的聚乙二醇化试剂的分子量为约300g/mol至约100,000g/mol。在一些实施例中，聚乙二醇化试剂的分子量为约300g/mol至约10,000g/mol。在一些实施例中，聚乙二醇化试剂的分子量为约300g/mol至约5,000g/mol。在一些实施例中，聚乙二醇化试剂的分子量为约500g/mol。在一些实施例中，聚乙二醇化试剂的分子量为约1000g/mol。在一些实施例中，聚乙二醇化试剂的分子量为约3000g/mol。在一些实施例中，聚乙二醇化试剂的分子量为约5000g/mol。
在某些实施例中，聚乙二醇化试剂为PEG500。在某些实施例中，聚乙二醇化试剂为PEG1000。在某些实施例中，聚乙二醇化试剂为PEG3000。在某些实施例中，聚乙二醇化试剂为PEG5000。
在一些实施例中，寡核苷酸包含充当PK增强子的P-修饰部分，例如脂质、聚乙二醇化脂质等。
一些实施例中，本披露的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)包含促进细胞进入和/或内体逃逸的P-修饰部分，例如膜破坏性脂质或肽。
在一些实施例中，寡核苷酸包含充当靶向部分的P-修饰部分。在一些实施例中，P-修饰部分是或包含靶向部分(targeting moiety)。在一些实施例中，靶部分(targetmoiety)是一种实体，其与目的负载缔合(例如，与寡核苷酸或寡核苷酸组合物缔合)且也与目的靶位点相互作用，使得目的负载在与靶向部分缔合时靶向目的靶位点，其靶向程度远大于在其他相当的条件下在目的负载不与靶向部分缔合时所观测到的情形。靶向部分可以是或包含多种化学部分中的任一种，这些化学部分包括(例如)小分子部分、核酸、多肽、碳水化合物等。靶向部分由Adarsh等人，“Organelle Specific Targeted Drug Delivery-AReview[细胞器特异性靶向药物递送-综述]”，International Journal of Research inPharmaceutical and Biomedical Sciences[国际药物和生物医学科学研究杂志]，2011，第895页描述。
此类靶向部分的实例包括但不限于蛋白质(例如运铁蛋白)、寡肽(例如含环状及非环状RGD的寡肽)、抗体(单克隆及多克隆抗体，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE抗体)、糖/碳水化合物(例如单糖和/或寡糖(甘露糖、甘露糖-6-磷酸、半乳糖及其类似者))、维生素(例如叶酸盐)或其他小生物分子。在一些实施例中，靶向部分是类固醇分子(例如，胆汁酸，包括胆酸、脱氧胆酸、去氢胆酸；可的松；地高辛(digoxigenin)；睾酮；胆固醇；阳离子类固醇，如在可的松环的3-位置经由双键附接有三甲基氨基甲基酰肼基团的可的松等)。在一些实施例中，靶向部分是亲脂性分子(例如，脂环烃、饱和和不饱和脂肪酸、蜡、萜类和聚脂环烃(如金刚石般化合物(adamantine)和巴克敏斯特富勒烯(buckminsterfullerene))。在一些实施例中，亲脂性分子是萜类，如维生素A、视黄酸、视黄醛或脱氢视黄醛。在一些实施例中，靶向部分是肽。
在一些实施例中，P-修饰部分是具有-X-L-R1结构的靶向部分，其中X、L和R1各自独立地如本披露中所述。
在一些实施例中，P-修饰部分有助于细胞特异性递送。
在一些实施例中，P-修饰部分可以执行一个或多个功能。例如，在一些实施例中，P-修饰部分充当PK增强子和靶向配体。在一些实施例中，P-修饰部分充当前药和内体逃逸剂。许多其他此类组合是可能的并且被包括在本披露中。
寡核苷酸和组合物的某些实例
在一些实施例中，本披露提供了可用于各种目的的寡核苷酸和/或寡核苷酸组合物，这些目的是例如调节跳读，降低转录物水平，改善有益蛋白质的水平，治疗病症、疾病和障碍等。在一些实施例中，本披露提供了具有改善的特性(例如，增加的活性、降低的毒性等)的寡核苷酸组合物。除其他事项外，本披露的寡核苷酸包含可改善寡核苷酸的各种特性和活性的化学修饰、立体化学和/或其组合。表A1中列出了非限制性实例。在一些实施例中，寡核苷酸类型是如表A1中的寡核苷酸的碱基序列、骨架键联模式、骨架手性中心模式、和骨架磷修饰模式定义的类型，其中寡核苷酸包含至少一个手性受控的核苷酸间键联(“立体化学/键联”中的至少一个R或S)。在一些实施例中，特定寡核苷酸类型的多种寡核苷酸类型是表A1中的多种寡核苷酸(例如，多种寡核苷酸是多种WV-1095)。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物中多种寡核苷酸是表A1中的多种寡核苷酸(例如，多种寡核苷酸是多种WV-1095)，其中该寡核苷酸包含至少一个手性受控的核苷酸间键联(“立体化学/键联”中至少一个R或S)。
表A1列出了DMD寡核苷酸的非限制性实例。表A1中的所有寡核苷酸均为DMD寡核苷酸，除了WV-12915、WV-12914、WV-12913、WV-12912、WV-12911、WV-12910、WV-12909、WV-12908、WV-12907、WV-12906、WV-12905、WV-12904、WV-15887、WV-24100、WV-24101、WV-24102、WV-24103、WV-24104、WV-24105、WV-24106、WV-24107、WV-24108、WV-24109、WV-24110、WV-XBD108、WV-XBD 109、WV-XBD 110、WV-XKCD108、WV-XKCD 109、WV-XKCD 110，它们均靶向Malat-1(一种与DMD不同的基因靶标)。
在一些实施例中，本披露涉及寡核苷酸或寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸的碱基序列包含表A1中披露的DMD寡核苷酸的碱基序列的至少15个连续碱基，其中具有1-3个错配。在一些实施例中，本披露涉及寡核苷酸或寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸的碱基序列包含表A1中披露的DMD寡核苷酸的碱基序列的至少15个连续碱基。在一些实施例中，本披露涉及寡核苷酸或寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸的碱基序列包含表A1中披露的DMD寡核苷酸的碱基序列。在一些实施例中，本披露涉及寡核苷酸或寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸的碱基序列是表A1中披露的DMD寡核苷酸的碱基序列。
在一些实施例中，本披露涉及寡核苷酸或寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸的碱基序列包含表A1中披露的DMD寡核苷酸的碱基序列的至少15个连续碱基，其中具有1-3个错配，或其中该寡核苷酸的碱基序列包含表A1中披露的DMD寡核苷酸的碱基序列的至少15个连续碱基，或其中该寡核苷酸的碱基序列包含表A1中披露的DMD寡核苷酸的碱基序列，或其中该寡核苷酸的碱基序列是表A1中披露的DMD寡核苷酸的碱基序列：并且其中该寡核苷酸是立体随机的(例如，非手性受控的)，或该寡核苷酸是手性受控的，和/或该寡核苷酸包含至少一个手性受控的核苷酸间键联，和/或该寡核苷酸任选地包含糖修饰(其是LNA)，和/或该寡核苷酸包含糖(其是天然脱氧核糖、2′-OMe或2′-MOE)。在一些实施例中，本披露涉及能够介导DMD外显子的跳读的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含至少一个LNA。
在下表中，ID指示鉴定或寡核苷酸编号：并且描述指示经修饰的序列。
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Figure BPA0000295055720004471
表中的缩写：
m5Ceo：5-甲基2′-O-甲氧基乙基C
Figure BPA0000295055720004481
5MS：糖部分的5′-(S)-CH3修饰；
5MSfC：2′-F-5′-(S)-甲基C(在寡核苷酸中，
Figure BPA0000295055720004482
其中BA中是核碱基C，且R2s是-F，并且5′和3′位置独立地连接至-OH、核苷酸间键联、接头/键联-H，接头/键联-Mod等；核苷形式是
Figure BPA0000295055720004483
其中BA中是核碱基C，且R2s是-F)；
C6：C6氨基接头(L001，-NH-(CH2)6-，其中-NH-连接至Mod(例如，通过Mod中的-C(O)-)或-H，并且-(CH2)6-通过以下键连接至寡核苷酸链的5′-端(或3′-端，如果指示)：例如磷酸二酯(-O-P(O)(OH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为O或PO)、硫代磷酸酯(-O-P(O)(SH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为*，若硫代磷酸酯是非手性受控的；显示为*S、S或Sp，若是手性受控且具有Sp构型；以及显示为*R、R或Rp，若是手性受控且具有Rp构型)或二硫代磷酸酯(-O-P(S)(SH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为PS2或：或D)键联；也可以称为C6接头或C6胺接头)；
：或D：二硫代磷酸酯(Phosphodithioate，Phosphorodithioate)，以D或冒号(：)表示；
n001：非负电荷的键联
Figure BPA0000295055720004484
(除非另外指明，否则其是立体随机的(例如，作为n001R、或n001S))；
n002：非负电荷的键联
Figure BPA0000295055720004491
(除非另外指明，否则其是立体随机的(例如，作为n002R、或n002S))；
n003：非负电荷的键联
Figure BPA0000295055720004492
(除非另外指明，否则其是立体随机的(例如，作为n003R、或n003S))；
n004：非负电荷的键联
Figure BPA0000295055720004493
(除非另外指明，否则其是立体随机的(例如，作为n004R、或n004S))；
n005：非负电荷的键联
Figure BPA0000295055720004494
(除非另外指明，否则其是立体随机的(例如，作为n005R、或n005S))；
n006：非负电荷的键联
Figure BPA0000295055720004495
(除非另外指明，否则其是立体随机的(例如，作为n006R、或n006S))；
n007：非负电荷的键联
Figure BPA0000295055720004496
(除非另外指明，否则其在键联磷处是立体随机的(例如，作为n007R、或n007S))；
n008：非负电荷的键联
Figure BPA0000295055720004497
(除非另外指明，否则其是立体随机的(例如，作为n008R、或n008S))；
n009：非负电荷的键联
Figure BPA0000295055720004501
(除非另外指明，否则其是立体随机的(例如，作为n009R、或n009S))；
n010：非负电荷的键联
Figure BPA0000295055720004502
(除非另外指明，否则其是立体随机的(例如，作为n010R、或n010S))；
n001R：为手性受控的并且具有Rp构型的n001；
n002R：为手性受控的并且具有Rp构型的n002；
n003R：为手性受控的并且具有Rp构型的n003；
n004R：为手性受控的并且具有Rp构型的n004；
n005R：为手性受控的并且具有Rp构型的n005；
n006R：为手性受控的并且具有Rp构型的n006；
n007R：为手性受控的并且具有Rp构型的n007；
n008R：为手性受控的并且具有Rp构型的n008；
n009R：为手性受控的并且具有Rp构型的n009；
n010R：为手性受控的并且具有Rp构型的n010；
n001S：为手性受控的并且具有Sp构型的n001；
n002S：为手性受控的并且具有Sp构型的n002；
n003S：为手性受控的并且具有Sp构型的n003；
n004S：为手性受控的并且具有Sp构型的n004；
n005S：为手性受控的并且具有Sp构型的n005；
n006S：为手性受控的并且具有Sp构型的n006；
n007S：为手性受控的并且具有Sp构型的n007；
n008S：为手性受控的并且具有Sp构型的n008；
n009S：为手性受控的并且具有Sp构型的n009；
n010S：为手性受控的并且具有Sp构型的n010；
nO、nX：以键联/立体化学，nO或nX指示立体随机n001；
nR：以键联/立体化学，nR指示手性受控的并且具有Rp构型的键联，例如n001、n002、n003、n004、n005、n006、n007、n008、n009等(例如，对于n001，描述中的n001R)；
nS：以键联/立体化学，nS指示手性受控的并且具有Sp构型的键联，例如n001、n002、n003、n004、n005、n006、n007、n008、n009等(例如，对于n001，描述中的n001R)；
BrfU：核苷单元，其中核碱基是BrU
Figure BPA0000295055720004511
并且其中糖具有2′-F(f)修饰
Figure BPA0000295055720004512
BrmU：核苷单元，其中核碱基是BrU
Figure BPA0000295055720004513
并且其中糖具有2′-OMe(m)修饰
Figure BPA0000295055720004514
BrdU：核苷单元，其中核碱基是BrU
Figure BPA0000295055720004515
并且其中的糖是2-脱氧核糖(在天然DNA中广泛发现；2′-脱氧(d))
Figure BPA0000295055720004516
L004：具有结构-NH(CH2)4CH(CH2OH)CH2-的接头，其中-NH-连接至Mod(例如，通过Mod中的-C(O)-)或-H，且-CH2-连接位点连接至键联，例如磷酸二酯(-O-P(O)(OH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为O或PO)、硫代磷酸酯(-O-P(O)(SH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为*，若硫代磷酸酯是非手性受控的；显示为*S、S或Sp，若是手性受控且具有Sp构型；以及显示为*R、R或Rp，若是手性受控且具有Rp构型)或二硫代磷酸酯(-O-P(S)(SH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为PS2或：或D)键联，该键联如所指示的在寡核苷酸链的5′-或3′-端处。例如，紧接L004前的星号(例如*L004)指示键联是硫代磷酸酯键联；并且L004前未紧接任何其他键联的指示时，指示键联是磷酸二酯键联。例如，在以fUL004结束的WV-9858中，接头L004(经由-CH2-位点)连接至3′-末端糖(其是2′-F且连接至核碱基U)处的3′位置处的磷酸二酯键联，且L004接头经由-NH-连接至-H；类似地，在WV-10886、WV-10887、和WV-10888中，L004接头(经由-CH2-位点)连接至3′-末端糖的3′位置处的磷酸二酯键联，且L004经由-NH-连接至Mod012(WV-10886)、Mod085(WV-10887)或Mod086(WV-10888)；
L005：具有结构-NH(CH2)5C(O)N(CH2CH2OH)CH2CH2-的接头，其中-NH-连接至Mod(例如，通过Mod中的-C(O)-)或-H，且-CH2-连接位点连接至键联，例如磷酸二酯(-O-P(O)(OH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为O或PO)、硫代磷酸酯(-O-P(O)(SH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为*，若硫代磷酸酯是非手性受控的；显示为*S、S或Sp，若是手性受控且具有Sp构型；以及显示为*R、R或Rp，若是手性受控且具有Rp构型)或二硫代磷酸酯(-O-P(S)(SH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为PS2或：或D)键联，该键联如所指示的在寡核苷酸链的5′-或3′-端处。例如，紧接L005前的星号(例如*L005)指示键联是硫代磷酸酯键联；并且L005前未紧接任何其他键联的指示时，指示键联是磷酸二酯键联。例如，在WV-12571中，L005连接至-H(在L005之后没有Mod；经由-NH-位点)和在3′-末端糖的3′位置处的磷酸二酯键联(经由-CH2-位点)；以及在WV-12572中，L005连接至Mod020(经由-NH-位点)和在3′-末端糖的3′位置处的磷酸二酯键联(经由-CH2-位点)；
L001L005：具有结构-NH(CH2)5C(O)N(CH2CH2-O-P(O)(OH)-O-(CH2)6NH-)CH2CH2-的接头，其中两个-NH-各自独立地连接至Mod(例如，通过-C(O)-)或-H，且-CH2-连接位点连接至键联，例如磷酸二酯(-O-P(O)(OH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为O或PO)、硫代磷酸酯(-O-P(O)(SH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为*，若硫代磷酸酯是非手性受控的；显示为*S、S或Sp，若是手性受控且具有Sp构型；以及显示为*R、R或Rp，若是手性受控且具有Rp构型)或二硫代磷酸酯(-O-P(S)(SH)-O-，可以盐形式存在，可在表中显示为PS2或：或D)键联，该键联如所指示的在寡核苷酸链的5′-或3′-端处。
eo：之前核苷(例如，Aeo(
Figure BPA0000295055720004531
其中BA是核碱基A))上的2′-MOE(2′-OCH2CH2OCH3)修饰；
F、f：在以下核苷(例如，fA(
Figure BPA0000295055720004532
其中BA是核碱基A))上的2′-F修饰；
m：在以下核苷(例如，mA(
Figure BPA0000295055720004533
其中BA是核碱基A))上的2′-OMe修饰；
r：在以下核苷(例如，rA(
Figure BPA0000295055720004534
其中BA是核碱基A，如天然RNA中存在的))上的2′-OH修饰；
L012：具有-O-P(O)[O(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OH]-O-的结构的核苷酸间键联，可在表中显示为OO；
*、PS：硫代磷酸酯；
PS2：D：二硫代磷酸酯(例如，WV-3078，其中冒号(：)指示二硫代磷酸酯)；
*R、R、Rp：Rp构型的硫代磷酸酯；
*S、S、Sp：Sp构型的硫代磷酸酯；
X：立体随机的硫代磷酸酯；
Acet5fU：
Figure BPA0000295055720004535
Acet5mU：
Figure BPA0000295055720004541
NA：不适用；
O、PO：磷酸二酯(磷酸酯)。当在两个核苷单元之间未指定核苷酸间键联时，核苷酸间键联是磷酸二酯键联(天然磷酸酯键联)。当用于指示Mod与接头(例如L001)之间的键联时，O可以指示-C(O)-(连接Mod和L001，例如：Mod013L001fU*SfC*SfA*SfA*SfG*SfG*SmAfA*SmGmA*SfU*SmGmGfC*SfA*SfU*SfU*SfU*SfC*SfU(描述)，OOSSSSSSOSOSSOOSSSSSS(键联/立体化学)。注意，OOSSSSSSOSOSSOOSSSSSS(键联/立体化学)中的第二个O表示连接L001和寡核苷酸链的5′-末端糖的5′-O-的磷酸二酯键联(参见以下说明。可替代地，可以将5′-O-视为磷酸二酯键联(或另一种类型的键联，如硫代磷酸酯键联)的一部分，在这种情况下，该磷酸二酯键联(或另一种类型的键联，如硫代磷酸酯键联)连接至寡核苷酸链的5′-末端糖的5′位置)。在一些情况下，-C(O)-(连接Mod和L001)中的“O”被省略(例如，对于Mod013L001fU*SfC*SfA*SfA*SfG*SfG*SmAfA*SmGmA*SfU*SmGmGfC*SfA*SfU*SfU*SfU*SfC*SfU，“键联/立体化学”OSSSSSSOSOSSOOSSSSSS)；
各种Mod：
Mod001(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004542
月桂酸(在Mod013中)、肉豆蔻酸(在Mod014中)、棕榈酸(在Mod005中)、硬脂酸(在Mod015中)、油酸(在Mod016中)、亚麻油酸(在Mod017中)、α-亚麻油酸(在Mod018中)、γ-亚麻酸(在Mod019中)、DHA(在Mod006中)、喇叭藻酸(在Mod020中)、二亚油酸(在Mod021中)、TriGlcNAc(在Mod024中)、三α甘露糖(TrialphaMannose)(在Mod026中)、单磺酰胺(在Mod027中)、三磺酰胺(在Mod029中)、月桂酸(在Mod030中)、肉豆蔻酸(在Mod031中)、棕榈酸(在Mod032中)、和硬脂酸(在Mod033中)：月桂酸(对于Mod013)、肉豆蔻酸(对于Mod014)、棕榈酸(对于Mod005)、硬脂酸(对于Mod015)、油酸(对于Mod016)、亚麻油酸(对于Mod017)、α-亚麻酸(对于Mod018)、γ-亚麻酸(对于Mod019)、二十二碳六烯酸(对于Mod006)、喇叭藻酸(对于Mod020)、二亚油基的醇(对于Mod021)、TriGlcNAc的酸(对于Mod024)、三α甘露糖的酸(对于Mod026)、单磺酰胺的酸(对于Mod 027)、三磺酰胺的酸(对于Mod029)、月桂醇(对于Mod030)、肉豆蔻醇(对于Mod031)、棕榈醇(对于Mod032)、和硬脂醇(对于Mod033)各自缀合至寡核苷酸链，例如通过酰胺基团、接头(例如，C6氨基接头(L001))、和/或键联基团(例如，磷酸二酯键联(PO)、硫代磷酸酯键联(PS)等)：例如，Mod013(月桂酸，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod014(肉豆蔻酸，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod005(棕榈酸，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod015(硬脂酸，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod016(油酸，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod017(亚麻油酸，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod018(α-亚麻酸，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod019(γ-亚麻酸，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod006(DHA，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod020(喇叭藻酸，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod021(醇(参见下文)，具有PO或PS)、Mod024(酸(参见下文)，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod026(酸(参见下文)，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod027(酸(参见下文)，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod029(酸(参见下文)，具有C6氨基接头和PO或PS)、Mod030(月桂醇，具有PO或PS)、Mod031(肉豆蔻醇，具有PO或PS)、Mod032(棕榈醇，具有PO或PS)、和Mod033(硬脂醇，具有PO或PS)，表A1中所示的每个寡核苷酸均具有PO或PS。例如，WV-3557硬脂醇经由PS与WV-3473的寡核苷酸链缀合：Mod033*fU*SfC*SfA*SfA*SfG*SfG*SmAfA*SmGmA*SfU*SmGmGfC*SfA*SfU*SfU*SfU*SfC*SfU(描述)，XSSSSSSOSOSSOOSSSSSS(立体化学)；并且
WV-4106硬脂酸经由酰胺基团、C6和PS与WV-3473的寡核苷酸链缀合：Mod015L001*fU*SfC*SfA*SfA*SfG*SfG*SmAfA*SmGmA*SfU*SmGmGfC*SfA*SfU*SfU*SfU*SfC*SfU(描述)，XSSSSSSOSOSSOOSSSSSS(立体化学)。用于缀合的某些部分和示例试剂(其中许多以前是已知的并且是可商购的，或者可以依照本披露使用已知技术容易地制备)，例如月桂酸(对于Mod013)、肉豆蔻酸(对于Mod014)、棕榈酸(对于Mod005)、硬脂酸(对于Mod015)、油酸(对于Mod016)、亚油酸(对于Mod017)、α-亚麻酸(对于Mod018)、γ-亚麻酸(对于Mod019)、二十二碳六烯酸(对于Mod006)、喇叭藻酸(对于Mod020)、二亚油基的醇(对于Mod021)，月桂醇(对于Mod030)、肉豆蔻醇(对于Mod031)、棕榈醇(对于Mod032)、硬脂醇(对于Mod033)等在下文列出。用于与寡核苷酸链缀合的某些示例部分(例如，脂质部分、靶向部分等)和/或示例制备试剂(例如，酸、醇等)包括具有接头的非限制性实例的以下：
Mod005(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及棕榈酸：
Figure BPA0000295055720004561
Mod005L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004562
Mod006(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及DHA：
Figure BPA0000295055720004563
Mod006L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004564
Mod009(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004571
Mod012(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004572
Mod013(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及月桂酸：
Figure BPA0000295055720004573
Mod013L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004574
Mod014(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及肉豆蔻酸：
Figure BPA0000295055720004575
Mod014L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004576
Mod015(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及硬脂酸：
Figure BPA0000295055720004577
Mod015L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004578
Mod016(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及油酸：
Figure BPA0000295055720004581
Mod016L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004582
Mod017(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及亚油酸：
Figure BPA0000295055720004583
Mod 017L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004584
Mod018(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及α-亚麻酸：
Figure BPA0000295055720004585
Mod018L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004586
Mod019(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及γ-亚麻酸：
Figure BPA0000295055720004587
Mod019L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004588
Mod020(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及喇叭藻酸：
Figure BPA0000295055720004589
Mod020L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004591
Mod021(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)，以及醇：
Figure BPA0000295055720004592
Mod024(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及酸：
Figure BPA0000295055720004593
Mod024L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004601
Mod026(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及酸：
Figure BPA0000295055720004602
Mod026L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004611
Mod027(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及酸：
Figure BPA0000295055720004612
Mod027L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004613
Mod028(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004614
Mod029(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)，以及酸：
Figure BPA0000295055720004615
Figure BPA0000295055720004621
Mod029L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004622
Mod030(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)，以及月桂醇：
Figure BPA0000295055720004623
Mod031(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)，以及肉豆蔻醇：
Figure BPA0000295055720004624
Mod032(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)，以及棕榈醇：
Figure BPA0000295055720004625
Mod033(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)，以及硬脂醇：
Figure BPA0000295055720004631
Mod053(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004632
Mod070(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004633
Mod071(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004641
Mod086(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004642
Mod092(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004643
Mod093(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004644
Mod007(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004651
Mod050(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004652
Mod043(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004653
Mod057(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004654
Mod058(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004661
Mod059(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004662
Mod066(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004663
Mod074(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004664
Mod085(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004671
Mod091L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004672
(例如，在WV-11114中，X＝O(PO)并连接至寡核苷酸链的5′-O-)
Mod097(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004673
Mod098(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004674
Mod099(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004681
Mod100(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004682
Mod102(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004683
Mod103(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004691
Mod104(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004692
Mod105(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004693
Mod106(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004701
(例如，在WV-15844中，X＝O(PO)并连接至寡核苷酸链的5′-O-)
Mod107(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004702
(例如，在WV-15845和WV-16011中，X＝O(PO)并连接至寡核苷酸链的5′-O-)
Mod108(其中-C(O)-连接至接头(例如L001)的例如-NH-)：
Figure BPA0000295055720004711
Mod109：
Figure BPA0000295055720004712
Mod109L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004713
(例如，在WV-19792中，X＝O)
Mod110：
Figure BPA0000295055720004721
Mod110L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004722
(例如，在WV-19793中，X＝O)
Mod111：
Figure BPA0000295055720004723
Mod111L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004724
(例如，在WV-19794中，X＝O)
Mod 112：
Figure BPA0000295055720004731
Mod112L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004732
(例如，在WV-19797中，X＝O)
Mod113：
Figure BPA0000295055720004733
Mod113L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004734
(例如，在WV-19796中，X＝O)
Mod114：
Figure BPA0000295055720004735
Mod114L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004736
(例如，在WV-19797中，X＝O)
Mod115：
Figure BPA0000295055720004741
Mod115L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004742
(例如，在WV-19798中，X＝O)
Mod118：
Figure BPA0000295055720004743
Mod118L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004751
Mod119：
Figure BPA0000295055720004752
Mod119L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004753
Mod120：
Figure BPA0000295055720004761
Mod120L001(其中PO或PS连接至寡核苷酸链的5′-O-)：
Figure BPA0000295055720004762
L009n001L009n001L009n001L009：通过以下磷酸二酯连接至寡核苷酸链的5′末端糖(例如，对于WV-23576和WV-23578，fU的糖)的5′-位置：
Figure BPA0000295055720004763
L009n001L009n001L009n001：通过以下n001连接至寡核苷酸链的5′末端糖(例如，对于WV-23577和WV-23579，fU的糖)的5′-位置：
Figure BPA0000295055720004764
L010n001L010n001L010n001L009：通过以下磷酸二酯连接至寡核苷酸链的5′末端糖(例如，对于WV-23936和WV-23938，fU的糖)的5′-位置：
Figure BPA0000295055720004771
L010n001L010n001L010n001：通过以下n001连接至寡核苷酸链的5′末端糖(例如，对于WV-23937和WV-23939，fU的糖)的5′-位置：
Figure BPA0000295055720004772
在一些实施例中，一些官能团任选地受保护，例如对于Mod024和/或Mod 026，在缀合至寡核苷酸链之前和/或期间，羟基基团任选地保护为AcO-；并且官能团(例如羟基基团)可以例如在寡核苷酸切割和/或脱保护期间被脱保护：
Figure BPA0000295055720004773
申请人注意到表A1中显示的是呈现提供的寡核苷酸的结构的示例方式，例如WV-3546(Mod020L001fU*SfC*SfA*SfA*SfG*SfG*SmAfA*SmGmA*SfU*SmGmGfC*SfA*SfU*SfU*SfU*SfC*SfU)可以作为脂质部分(Mod020，
Figure BPA0000295055720004781
)呈现，该脂质部分经由-C(O)-(OOSSSSSSOSOSSOOSSSSSS，其中如表A1中的“O”可省略)连接至-NH-(CH2)6-的-NH-，其中-(CH2)6-经由磷酸二酯键联(OOSSSSSSOSOSSOOSSSSSS)连接至寡核苷酸链的5′-端。本领域普通技术人员理解，提供的寡核苷酸可以许多不同方式呈现为脂质、接头和寡核苷酸链单元的组合，其中每种方式的单元组合都提供相同的寡核苷酸。例如，WV-3546可被认为具有Ac-[-LLD-(RLD)a]b(其中a为1、b为1)的结构，并且具有脂质部分RLD
Figure BPA0000295055720004782
该脂质部分通过具有-C(O)-NH-(CH2)6-OP(＝O)(OH)-O-(其中-C(O)-连接至RLD，并且-O-连接至Ac(作为寡核苷酸链的5′-O-))的结构的接头LLD连接至其寡核苷酸链(Ac)单元；许多替代方式之一是RLD是
Figure BPA0000295055720004783
并且LLD是-NH-(CH2)6-OP(＝O)(OH)-O-，其中-NH-连接至RLD，并且-O-连接至Ac(作为寡核苷酸链的5′-O-)。
在一些实施例中，寡核苷酸的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸组合物是表A1中列出的寡核苷酸类型的手性受控的寡核苷酸组合物，其中寡核苷酸的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露提供了包含多种寡核苷酸分子或由其组成的组合物(例如，手性受控的寡核苷酸组合物)。在一些实施例中，多种中所有寡核苷酸都是相同的类型，即所有均具有相同的碱基序列、骨架键联模式、骨架手性中心模式、和骨架磷修饰模式。在一些实施例中，相同的类型的所有寡核苷酸在结构上相同。在一些实施例中，提供的组合物通常以受控制的量包含多种寡核苷酸类型中的寡核苷酸。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸组合物包含两个或更多个提供的寡核苷酸类型的组合。
在一些实施例中，本披露的寡核苷酸组合物是手性受控的寡核苷酸组合物，其中其多种中的寡核苷酸的序列包含表A1中列出的碱基序列或由其组成。
在一些实验中，提供的寡核苷酸可以提供出人意料地高活性，例如，当与曲萨珀森(Drisapersen)和/或依普勒森(Eteplirsen)中的那些相比时。例如，WV-887、WV-892、WV-896、WV-1714、WV-2444、WV-2445、WV-2526、WV-2527、WV-2528、和WV-2530的手性受控的寡核苷酸组合物和许多其他项，各自在介导肌营养不良蛋白中外显子的跳读方面表现出与曲萨珀森和/或依普勒森相比卓越的能力，在一些实施例中高出许多倍。本披露中作为实例提供了某些数据。
在一些实施例中，本披露涉及包含手性受控的寡核苷酸的组合物，该手性受控的寡核苷酸选自本文列出的任何DMD寡核苷酸、或具有包含本文列出的任何DMD寡核苷酸的至少15个连续碱基的碱基序列的任何DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸不超过25个碱基长。在一些实施例中，提供的寡核苷酸不超过25至60个碱基长。在一些实施例中，U可以被T替换(反之亦然)。
在一些实施例中，当在小鼠中测定示例寡核苷酸时，将寡核苷酸(例如，WV-3473、WV-3545、WV-3546、WV-942等)经由尾静脉向雄性C57BL/10ScSndmdmdx小鼠(4-5周龄)以测试量(例如10mg/kg、30mg/kg等)进行静脉内注射。在一些实施例中，在测试时间(例如在以下天：例如第2天、第7天和/或第14天等)，在注射后收获组织，在一些实施例中，将组织在液氮中新鲜冷冻并在-80℃储存直至分析。
依照本披露，可以使用各种测定来评估寡核苷酸水平。在一些实施例中，使用测试品系列稀释作为标准曲线，使用杂交-ELISA来定量组织中的寡核苷酸水平：例如，在示例程序中，将马来酸酐活化的96孔板(皮尔斯公司(Pierce)15110)用50μl的捕获探针在500nM在2.5％NaHCO3(吉博公司(Gibco)，25080-094)中在37℃涂覆2小时。然后将板用PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗涤3次，并用5％无脂乳-PBST在37℃封闭1小时。测试品寡核苷酸连续稀释到基质中。将该标准品与原始样品一起用裂解缓冲液(4M胍；0.33％N-月桂基肌氨酸；25mM柠檬酸钠；10mM DTT)稀释，使得所有样品中的寡核苷酸量小于100ng/mL。将20μl的稀释的样品与PBST中稀释的180μl的333nM检测探针混合，然后在PCR机器(65℃ 10min，95℃15min，4℃∞)中变性。50μl变性的样品在封闭的ELISA板中一式三份进行分配，并在4℃孵育过夜。在3次PBST洗涤后，添加PBST中的1∶2000链霉亲和素-AP(50μl/孔)，并在室温孵育1小时。用PBST充分洗涤后，添加100μl的AttoPhos(普洛麦格公司(Promega)S1000)，在室温在黑暗中孵育10min，并在平板读数器(分子仪器公司(Molecular Device)，M5)上读取荧光通道：Ex435nm、Em555nm。通过4-参数回归根据标准曲线计算样品中的寡核苷酸。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸在血浆和组织匀浆中都是稳定的。
寡核苷酸和组合物(包括肌营养不良蛋白(DMD)寡核苷酸和组合物)的另外的实施例和实例
除其他事项外，本披露提供了用于调节剪接，降低靶标水平，治疗各种病症、障碍、疾病等的寡核苷酸，组合物和方法。例如，在一些实施例中，本披露提供了肌营养不良蛋白(DMD)寡核苷酸和/或可用于多种目的的DMD寡核苷酸组合物。在一些实施例中，DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导小鼠DMD基因中外显子23的跳读。在一些实施例中，DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导人或小鼠DMD基因中外显子44的跳读。在一些实施例中，DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导人或小鼠DMD基因中外显子46的跳读。在一些实施例中，DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导人或小鼠DMD基因中外显子47的跳读。在一些实施例中，DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导人或小鼠DMD基因中外显子51的跳读。在一些实施例中，DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导人或小鼠DMD基因中外显子52的跳读。在一些实施例中，DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导人或小鼠DMD基因中外显子53的跳读。在一些实施例中，DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导人或小鼠DMD基因中外显子54的跳读。在一些实施例中，DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导人或小鼠DMD基因中外显子55的跳读。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导人或小鼠DMD基因中多个外显子的跳读。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)包含修饰。在一些实施例中，DMD寡核苷酸包含糖修饰。在一些实施例中，DMD寡核苷酸在2′位置包含糖修饰。在一些实施例中，DMD寡核苷酸在选自2′-F、2′-OMe和2′-MOE的2′位置包含糖修饰。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸包含2′-F、2′-OMe和/或2′-MOE。在一些实施例中，DMD寡核苷酸包含2′-F。在一些实施例中，在DMD寡核苷酸中，每个糖包含2′-F。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸包含2′-OMe。在一些实施例中，在DMD寡核苷酸中，每个糖包含2′-OMe。在一些实施例中，DMD寡核苷酸包含2′-MOE。在一些实施例中，在DMD寡核苷酸中，每个糖包含2′-MOE。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)包含2′-OMe和2′-F。在一些实施例中，提供的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)包含2′糖修饰模式，其中该模式包含选自以下的序列：fm、mf、ffm、fffm、ffffm、fffffm、ffffffm、fffffffm、ffffffffm、fffffffffm、mf、mff、mfff、mffff、mfffff、mffffff、mfffffff、mfffffff、fmf、fmmf、fmmmf、fmmmmf、fmmmmmf、fmmmmmmf、fmmmmmmmf、fmmmmmmmmf、fmmmmmmmmmf、ffffffmmmmmmmmffffff、fffffmmmmmmmmmmfffff、ffffmmmmmmmmmmmmffff、fffmmmmmmmmmmmmmmfff、ffmmmmmmmmmmmmmmmmff、fmmmmmmmmmmmmmmmmmmf、ffffffffffmmmmmmmmmm、fffffmmmmmmmmffffff、ffffmmmmmmmmmmfffff、fffmmmmmmmmmmmmffff、ffmmmmmmmmmmmmmmfff、fmmmmmmmmmmmmmmmmff、mmmmmmmmmmmmmmmmmmf、fffffffffmmmmmmmmmm、ffffmmmmmmmmffffff、fffmmmmmmmmmmfffff、ffmmmmmmmmmmmmffff、fmmmmmmmmmmmmmmfff、mmmmmmmmmmmmmmmmff、mmmmmmmmmmmmmmmmmf、ffffffffmmmmmmmmmm、fffmmmmmmmmffffff、ffmmmmmmmmmmfffff、fmmmmmmmmmmmmffff、mmmmmmmmmmmmmmfff、mmmmmmmmmmmmmmmff、mmmmmmmmmmmmmmmmf、fffffffmmmmmmmmmm、ffmmmmmmmmffffff、fmmmmmmmmmmfffff、mmmmmmmmmmmmffff、mmmmmmmmmmmmmfff、mmmmmmmmmmmmmmff、mmmmmmmmmmmmmmmf、ffffffmmmmmmmmmm、fmmmmmmmmffffff、mmmmmmmmmmfffff、mmmmmmmmmmmffff、mmmmmmmmmmmmfff、mmmmmmmmmmmmmff、mmmmmmmmmmmmmmf、fffffmmmmmmmmmm、mmmmmmmmffffff、mmmmmmmmmfffff、mmmmmmmmmmffff、mmmmmmmmmmmfff、mmmmmmmmmmmmff、mmmmmmmmmmmmmf、ffffmmmmmmmmmm、ffffffmmmmmmmmfffff、fffffmmmmmmmmmmffff、ffffmmmmmmmmmmmmfff、fffmmmmmmmmmmmmmmff、ffmmmmmmmmmmmmmmmmf、fmmmmmmmmmmmmmmmmmm、ffffffffffmmmmmmmmm、ffffffmmmmmmmmffff、fffffmmmmmmmmmmfff、ffffmmmmmmmmmmmmff、fffmmmmmmmmmmmmmmf、ffmmmmmmmmmmmmmmmm、fmmmmmmmmmmmmmmmmm、ffffffffffmmmmmmmm、ffffffmmmmmmmmfff、fffffmmmmmmmmmmff、ffffmmmmmmmmmmmmf、fffmmmmmmmmmmmmmm、ffmmmmmmmmmmmmmmm、fmmmmmmmmmmmmmmmm、ffffffffffmmmmmmm、ffffffmmmmmmmmff、fffffmmmmmmmmmmf、ffffmmmmmmmmmmmm、fffmmmmmmmmmmmmm、ffmmmmmmmmmmmmmm、fmmmmmmmmmmmmmmm、ffffffffffmmmmmm、ffffffmmmmmmmmf、fffffmmmmmmmmmm、ffffmmmmmmmmmmm、fffmmmmmmmmmmmm、ffmmmmmmmmmmmmm、fmmmmmmmmmmmmmm、ffffffffffmmmmm、ffffffmmmmmmmm、fffffmmmmmmmmm、ffffmmmmmmmmmm、fffmmmmmmmmmmm、ffmmmmmmmmmmmm、fmmmmmmmmmmmmm、ffffffffffmmmm、ffffffmmmmmmm、fffffmmmmmmmm、ffffmmmmmmmmm、fffmmmmmmmmmm、ffmmmmmmmmmmm、fmmmmmmmmmmmm、ffffffffffmmm、ffffffmmmmmm、fffffmmmmmmm、ffffmmmmmmmm、fffmmmmmmmmm、ffmmmmmmmmmm、fmmmmmmmmmmm、ffffffffffmm、ffffffmmmmm、fffffmmmmmm、ffffmmmmmmm、fffmmmmmmmm、ffmmmmmmmmm、fmmmmmmmmmm、ffffffffffm、mmmmmmmmmmffffffffff、ffffffmmmmmmmmmmmmmm、mmmmmmmmmmmmmmffffff、ffmmmmmmmmfmmfmfffff、mmffffffffmffmfmmmmm、mfmfmfmfmfmfmfmfmfmf、mmmmmmffffffffmmmmmm、ffffffmmmmmmmmffffff、mfmmffmmfmmfffmmmmfm、fmffmmffmffmmmffffmf、fmff、mffm、fmffm、mfmmf、fmmf、fmffmm、mfmmff、mmff、fmmff、mmffm、fmffmmf、mfmmffm、mfmm、mfmmf、mfmmff、fmffmmf、mfmmffm、mmffm、ffmmf、fmfff、mfffm、fmfffm、fmfffmm、mfmmfff、mmfff、fmmfff、mmfffm、fmfffmmf、mfmmfffm、mfmm、mfmmf、mfmmfff、fmfffmmf、mfmmfffm、mmfffm、fffmmf、mfmmmf、fmmmf、fmffmmm、mfmmmff、mmmff、ffmmmff、mmmffm、fmffmmmf、mfmmmffm、mfmmm、mfmmmf、mfmmmff、fmffmmmf、mfmmmffm、mmmffm、ffmmmf，或其包含至少五个连续修饰的部分，其中f是2′-F，并且m是2′-OMe。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)包含模式，该模式包含以下任一种：O、OO、OOO、OOOO、OOOOO、OOOOOO、OOOOOOO、OOOOOOOO、OOOOOOOOO、OOOOOOOOOO、OOOOOOOOOOO、S、SS、SSS、SSSS、SSSSS、SSSSSS、SSSSSSS、SSSSSSSS、SSSSSSSSS、SSSSSSSSSS、SSSSSSSSSSS、X、XX、XXX、XXXX、XXXXX、XXXXXX、XXXXXXX、XXXXXXXX、XXXXXXXXX、XXXXXXXXXX、XXXXXXXXXXX、R、RR、RRR、RRRR、RRRRR、RRRRRR、RRRRRRR、RRRRRRRR、RRRRRRRRR、RRRRRRRRRR、RRRRRRRRRRR、OSOOO、OSOO、OSO、SOOO、OXOOO、OXOO、OXO、XOO、ROOOR、ROROR、ROROR、ROORR、RROOR、ROOR、OOR、RRROR、RRRO、RROR、ROR、SOOOR、ROOOS、ROOO、ROO、RO、OOOS、SOOOS、SOOO、SOOSS、SOSOS、SOSO、OSOS、SOS、SSOOS、SSOO、SSO、SOO、SSSOS、SSSO、SOS、XOOOX、XOOO、XOO、XO、OOOX、OOX、OX、SOOOS、SOOO、SOO、SO、OOOS、OOS、XXXXXXXXXXXXX、XXXXXXXXXXXX、XXXXXXXXXXX、XXXXXXXXXX、XXXXXXXXX、XXXXXXXX、XXXXXXX、XXXXXX、XXXXX、XXXX、SSSSRSSRSS、SSSSRSSRS、SSSSRSSR、SSSSRSS、SSSSRS、SSSS、SSS、SSSRSSRSS、SSRSSRSS、SRSSRSS、RSSRSS、SSRSS、SSRS、SSSRSSRSSS、SSRSSRSSS、SSSRSSRSS、SSRSSRSSSS、SRSSRSSSS、SSRSSRSSS、SSRSSSSSSS、SRSSSSSSS、SSRSSSSSS、SSSSSSRSSS、SSSSSRSSS、SSSSSSRSS、SSO、SOS、OSO、OSSO、SSOS、SSOSS、SSOSSO、SSOSSOS、SSOSSOSS、XO、XXO、XOX、XXOX、XXOXX、XXXOXX、XXXOX、XXOXX、XXXOXXX、XXOXXO、XXOXX、XXOXXOX、或XXOXXOXX，或其包含至少5个连续核苷酸间键联的部分，其中X是立体随机的硫代磷酸酯键联，S是Sp构型的硫代磷酸酯键联，R是Rp构型的硫代磷酸酯键联。
具有这些修饰及其模式或其部分的各种寡核苷酸(包括DMD寡核苷酸)描述于本披露中，包括表A1中列出的那些。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联。这种寡核苷酸的非限制性实例尤其包括：WV-11237、WV-11238、WV-11239、WV-11340、WV-11341、WV-11342、WV-11343、WV-11344、WV-11345、WV-11346、WV-11347、WV-12123、WV-12124、WV-12125、WV-12126、WV-12127、WV-12128、WV-12129、WV-12130、WV-12131、WV-12132、WV-12133、WV-12134、WV-12135、WV-12136、WV-12553、WV-12554、WV-12555、WV-12556、WV-12557、WV-12558、WV-12559、WV-12872、WV-12873、WV-12876、WV-12877、WV-12878、WV-12879、WV-12880、WV-12881、WV-12882、WV-12883、WV-12884、WV-12885、WV-12887、WV-12888、WV-13408、WV-13409、WV-13594、WV-13595、WV-13596、WV-13597、WV-13812、WV-13813、WV-13814、WV-13815、WV-13816、WV-13817、WV-13820、WV-13821、WV-13822、WV-13823、WV-13824、WV-13825、WV-13857、WV-13858、WV-13859、WV-13860、WV-13861、WV-13862、WV-13863、WV-13864、WV-13865、WV-14342、WV-14343、WV-14344、WV-14345、WV-14522、WV-14523、WV-14525、WV-14526、WV-14528、WV-14529、WV-14530、WV-14532、WV-14533、WV-14565、WV-14566、WV-14773、WV-14774、WV-14776、WV-14777、WV-14778、WV-14779、WV-14790、WV-14791、WV-15052、WV-15053、WV-15143、WV-15322、WV-15323、WV-15324、WV-15325、WV-15326、WV-15327、WV-15328、WV-15329、WV-15330、WV-15331、WV-15332、WV-15333、WV-15334、WV-15335、WV-15336、WV-15337、WV-15338、WV-15366、WV-15369、WV-15589、WV-15647、WV-15844、WV-15845、WV-15846、WV-15850、WV-15851、WV-15852、WV-15853、WV-15854、WV-15855、WV-15856、WV-15857、WV-15858、WV-15859、WV-15860、WV-15861、WV-15862、WV-15912、WV-15913、WV-15928、WV-15929、WV-15930、WV-15931、WV-15932、WV-15933、WV-15934、WV-15935、WV-15937、WV-15939、WV-15940、WV-15941、WV-15942、WV-15943、WV-15944、WV-15945、WV-15946、WV-15947、WV-15948、WV-15949、WV-15962、WV-15963、WV-15964、WV-15965、WV-15966、WV-15967、WV-15968、WV-15969、WV-15970、WV-15971、WV-15972、WV-15973、WV-16004、WV-16005、WV-16010、WV-16011、WV-16366、WV-16368、WV-16369、WV-16371、WV-16372、WV-16499、WV-16505、WV-16506、WV-16507、WV-17765、WV-17774、WV-17775、WV-17801、WV-17802、WV-17803、WV-17831、WV-17832、WV-17833、WV-17834、WV-17838、WV-17839、WV-17840、WV-17841、WV-17842、WV-17843、WV-17854、WV-17855、WV-17856、WV-17857、WV-17858、WV-17859、WV-17860、WV-17861、WV-17862、WV-17863、WV-17864、WV-17865、WV-17866、WV-17881、WV-17882、WV-17883、WV-18853、WV-18854、WV-18855、WV-18856、WV-18857、WV-18858、WV-18859、WV-18860、WV-18861、WV-18862、WV-18863、WV-18864、WV-18865、WV-18866、WV-18867、WV-18868、WV-18869、WV-18870、WV-18871、WV-18872、WV-18873、WV-18874、WV-18875、WV-18876、WV-18877、WV-18878、WV-18879、WV-18880、WV-18881、WV-18882、WV-18883、WV-18884、WV-18885、WV-18886、WV-18887、WV-18888、WV-18889、WV-18890、WV-18891、WV-18892、WV-18893、WV-18894、WV-18895、WV-18896、WV-18897、WV-18898、WV-18899、WV-18900、WV-18901、WV-18902、WV-18903、WV-18904、WV-18905、WV-18906、WV-18907、WV-18908、WV-18909、WV-18910、WV-18911、WV-18912、WV-18913、WV-18914、WV-18915、WV-18916、WV-18917、WV-18918、WV-18919、WV-18920、WV-18921、WV-18922、WV-18923、WV-18924、WV-18925、WV-18926、WV-18927、WV-18928、WV-18929、WV-18930、WV-18931、WV-18932、WV-18933、WV-18934、WV-18935、WV-18936、WV-18937、WV-18938、WV-18939、WV-18940、WV-18941、WV-18942、WV-18944、WV-18945、WV-19790、WV-19791、WV-19792、WV-19793、WV-19794、WV-19795、WV-19796、WV-19797、WV-19798、WV-19803、WV-19804、WV-19805、WV-19806、WV-19886、WV-19887、WV-19888、WV-19889、WV-19890、WV-19891、WV-19892、WV-19893、WV-19894、WV-19895、WV-19896、WV-19897、WV-19898、WV-19899、WV-19900、WV-19901、WV-19902、WV-19903、WV-19904、WV-19905、WV-19906、WV-19907、WV-19908、WV-19909、WV-19910、WV-19911、WV-19912、WV-19913、WV-19914、WV-19915、WV-19916、WV-19917、WV-19918、WV-19919、WV-19920、WV-19921、WV-19922、WV-19923、WV-19924、WV-19925、WV-19926、WV-19927、WV-19928、WV-19929、WV-19930、WV-19931、WV-19932、WV-19933、WV-19934、WV-19935、WV-19936、WV-19937、WV-19938、WV-19939、WV-19940、WV-19941、WV-19942、WV-19943、WV-19944、WV-19945、WV-19946、WV-19947、WV-19948、WV-19949、WV-19950、WV-19951、WV-19952、WV-19953、WV-19954、WV-19955、WV-19956、WV-19957、WV-19958、WV-19959、WV-19960、WV-19961、WV-19962、WV-19963、WV-19964、WV-19965、WV-19966、WV-19967、WV-19968、WV-19969、WV-19970、WV-19971、WV-19972、WV-19973、WV-19974、WV-19975、WV-19976、WV-19977、WV-19978、WV-19979、WV-19980、WV-19981、WV-19982、WV-19983、WV-19984、WV-19985、WV-19986、WV-19987、WV-19988、WV-19989、WV-19990、WV-19991、WV-19992、WV-19993、WV-19994、WV-19995、WV-19996、WV-19997、WV-19998、WV-19999、WV-20000、WV-20001、WV-20002、WV-20003、WV-20004、WV-20005、WV-20006、WV-20007、WV-20008、WV-20009、WV-20010、WV-20011、WV-20012、WV-20013、WV-20014、WV-20015、WV-20016、WV-20017、WV-20018、WV-20019、WV-20020、WV-20021、WV-20022、WV-20023、WV-20024、WV-20025、WV-20026、WV-20027、WV-20028、WV-20029、WV-20030、WV-20031、WV-20032、WV-20033、WV-20034、WV-20035、WV-20036、WV-20037、WV-20038、WV-20039、WV-20040、WV-20041、WV-20042、WV-20043、WV-20044、WV-20045、WV-20046、WV-20047、WV-20048、WV-20049、WV-20050、WV-20051、WV-20052、WV-20053、WV-20054、WV-20055、WV-20056、WV-20057、WV-20058、WV-20059、WV-20060、WV-20061、WV-20062、WV-20063、WV-20064、WV-20065、WV-20066、WV-20067、WV-20068、WV-20069、WV-20070、WV-20071、WV-20072、WV-20073、WV-20074、WV-20075、WV-20076、WV-20077、WV-20078、WV-20079、WV-20080、WV-20081、WV-20082、WV-20083、WV-20084、WV-20085、WV-20086、WV-20087、WV-20088、WV-20089、WV-20090、WV-20091、WV-20092、WV-20093、WV-20094、WV-20095、WV-20096、WV-20097、WV-20098、WV-20099、WV-20100、WV-20101、WV-20102、WV-20103、WV-20104、WV-20105、WV-20106、WV-20107、WV-20108、WV-20109、WV-20110、WV-20111、WV-20112、WV-20113、WV-20114、WV-20115、WV-20116、WV-20117、WV-20118、WV-20119、WV-20120、WV-20121、WV-20122、WV-20123、WV-20124、WV-20125、WV-20126、WV-20127、WV-20128、WV-20129、WV-20130、WV-20131、WV-20132、WV-20133、WV-20134、WV-20135、WV-20136、WV-20137、WV-20138、WV-20139、WV-20140、WV-20141、WV-20142、WV-20143、WV-20144、WV-20145、WV-20146、WV-20147、WV-20148、WV-20149、WV-20150、WV-20151、WV-20152、WV-20153、WV-20154、WV-20155、WV-20156、WV-20157、WV-20158、WV-20159、WV-20160、WV-21210、WV-21211、WV-21212、WV-21217、WV-21218、WV-21219、WV-21226、WV-21245、WV-21252、WV-21253、WV-21257、WV-21258、WV-21374、WV-21375、WV-21376、WV-21377、WV-21378、WV-21379、WV-21380、WV-21381、WV-21382、WV-21383、WV-21384、WV-21385、WV-21386、WV-21387、WV-21388、WV-21389、WV-21390、WV-21578、WV-21579、WV-21580、WV-21581、WV-21582、WV-21583、WV-21584、WV-21585、WV-21586、WV-21587、WV-21588、WV-21589、WV-21590、WV-21591、WV-21592、WV-21593、WV-21594、WV-21595、WV-21596、WV-21597、WV-21598、WV-21599、WV-21600、WV-21601、WV-21602、WV-21603、WV-21604、WV-21605、WV-21606、WV-21607、WV-21608、WV-21609、WV-21610、WV-21611、WV-21612、WV-21613、WV-21614、WV-21615、WV-21616、WV-21617、WV-21618、WV-21619、WV-21620、WV-21621、WV-21622、WV-21623、WV-21624、WV-21625、WV-21626、WV-21627、WV-21628、WV-21629、WV-21630、WV-21631、WV-21632、WV-21633、WV-21634、WV-21635、WV-21636、WV-21637、WV-21638、WV-21639、WV-21640、WV-21641、WV-21642、WV-21643、WV-21644、WV-21645、WV-21646、WV-21647、WV-21648、WV-21649、WV-21650、WV-21651、WV-21652、WV-21653、WV-21654、WV-21655、WV-21656、WV-21657、WV-21658、WV-21659、WV-21660、WV-21661、WV-21662、WV-21663、WV-21664、WV-21665、WV-21666、WV-21667、WV-21668、WV-21669、WV-21670、WV-21671、WV-21672、WV-21673、WV-21723、WV-21724、WV-21725、WV-21726、WV-21727、WV-21728、WV-21729、WV-21730、WV-21731、WV-21732、WV-21733、WV-21734、WV-21735、WV-21736、WV-21737、WV-21738、WV-21739、WV-21740、WV-21741、WV-21742、WV-21743、WV-21744、WV-21745、WV-21746、WV-21747、WV-21748、WV-21749、WV-21750、WV-21751、WV-21752、WV-21753、WV-21754、WV-21755、WV-21756、WV-21757、WV-21758、WV-21759、WV-21760、WV-21761、WV-21762、WV-21763、WV-21764、WV-21765、WV-21766、WV-21767、WV-21768、WV-21769、WV-21770、WV-21771、WV-21772、WV-21773、WV-21774、WV-21775、WV-21776、WV-21777、WV-21778、WV-21779、WV-21780、WV-21781、WV-21782、WV-21783、WV-21784、WV-21785、WV-21786、WV-21787、WV-21788、WV-21789、WV-21790、WV-21791、WV-21792、WV-21793、WV-21794、WV-21795、WV-21796、WV-21797、WV-21798、WV-21799、WV-21800、WV-21801、WV-21802、WV-21803、WV-21804、WV-21805、WV-21806、WV-21807、WV-21808、WV-21809、WV-21810、WV-21811、WV-21812、WV-21813、WV-21814、WV-21815、WV-21816、WV-21817、WV-21818、WV-22753、WV-23576、WV-23577、WV-23578、WV-23579、WV-23936、WV-23937、WV-23938、和WV-23939。
用于外显子23的外显子跳读的示例肌营养不良蛋白寡核苷酸和组合物
在一些实施例中，本披露提供了用于介导小鼠DMD中外显子23跳读的寡核苷酸、寡核苷酸组合物及其使用方法。非限制性实例包括寡核苷酸，以及WV-10256、WV-10257、WV-10258、WV-10259、WV-10260、WV-1093、WV-1094、WV-1095、WV-1096、WV-1097、WV-1098、WV-1099、WV-1100、WV-1101、WV-1102、WV-1103、WV-1104、WV-1105、WV-1106、WV-1121、WV-1122、WV-1123、WV-11231、WV-11232、WV-11233、WV-11234、WV-11235、WV-11236、WV-1124、WV-1125、WV-1126、WV-1127、WV-1128、WV-1129、WV-1130、WV-11343、WV-11344、WV-11345、WV-11346、WV-11347、WV-1141、WV-1142、WV-1143、WV-1144、WV-1145、WV-1146、WV-1147、WV-1148、WV-1149、WV-1150、WV-1678、WV-1679、WV-1680、WV-1681、WV-1682、WV-1683、WV-1684、WV-1685、WV-2733、WV-2734、WV-4610、WV-4611、WV-4614、WV-4615、WV-4616、WV-4617、WV-4618、WV-4619、WV-4620、WV-4621、WV-4622、WV-4623、WV-4624、WV-4625、WV-4626、WV-4627、WV-4628、WV-4629、WV-4630、WV-4631、WV-4632、WV-4633、WV-4634、WV-4635、WV-4636、WV-4637、WV-4638、WV-4639、WV-4640、WV-4641、WV-4642、WV-4643、WV-4644、WV-4645、WV-4646、WV-4647、WV-4648、WV-4649、WV-4650、WV-4651、WV-4652、WV-4653、WV-4654、WV-4655、WV-4656、WV-4657、WV-4658、WV-4659、WV-4660、WV-4661、WV-4662、WV-4663、WV-4664、WV-4665、WV-4666、WV-4667、WV-4668、WV-4669、WV-4670、WV-4671、WV-4672、WV-4673、WV-4674、WV-4675、WV-4676、WV-4677、WV-4678、WV-4679、WV-4680、WV-4681、WV-4682、WV-4683、WV-4684、WV-4685、WV-4686、WV-4687、WV-4688、WV-4689、WV-4690、WV-4691、WV-4692、WV-4693、WV-4694、WV-4695、WV-4696、WV-4697、WV-6010、WV-7677、WV-7678、WV-7679、WV-7680、WV-7681、WV-7682、WV-7683、WV-7684、WV-7685、WV-7686、WV-7687、WV-7688、WV-7689、WV-7690、WV-7691、WV-7692、WV-7693、WV-7694、WV-7695、WV-7696、WV-7697、WV-7698、WV-7699、WV-7700、WV-7701、WV-7702、WV-7703、WV-7704、WV-7705、WV-7706、WV-7707、WV-7708、WV-7709、WV-7710、WV-7711、WV-7712、WV-7713、WV-7714、WV-7715、WV-7716、WV-7717、WV-7718、WV-7719、WV-7720、WV-7721、WV-7722、WV-7723、WV-7724、WV-7725、WV-7726、WV-7727、WV-7728、WV-7729、WV-7730、WV-7731、WV-7732、WV-7733、WV-7734、WV-7735、WV-7736、WV-7737、WV-7738、WV-7739、WV-7740、WV-7741、WV-7742、WV-7743、WV-7744、WV-7745、WV-7746、WV-7747、WV-7748、WV-7749、WV-7750、WV-7751、WV-7752、WV-7753、WV-7754、WV-7755、WV-7756、WV-7757、WV-7758、WV-7759、WV-7760、WV-7761、WV-7762、WV-7763、WV-7764、WV-7765、WV-7766、WV-7767、WV-7768、WV-7769、WV-7770、WV-7771、WV-9163、WV-9164、WV-9165、WV-9166、WV-9167、WV-9168、WV-9169、WV-9170、WV-9171、WV-9172、WV-9173、WV-9174、WV-9175、WV-9176、WV-9177、WV-9178、WV-9179、WV-9180、WV-9181、WV-9182、WV-9183、WV-9184、WV-9185、WV-9186、WV-9187、WV-9188、WV-9189、WV-9190、WV-9191、WV-9192、WV-9193、WV-9194、WV-9195、WV-9196、WV-9197、WV-9198、WV-9199、WV-9200、WV-9201、WV-9202、WV-9203、WV-9204、WV-9205、WV-9206、WV-9207、WV-9208、WV-9209、WV-9210、WV-9408、WV-9409、WV-9410、WV-9411、WV-9412、WV-9413、WV-9414、WV-9415、WV-9416、WV-9417、WV-9418、WV-9419、WV-9420、WV-943、WV-9875、WV-9876、WV-9877、WV-9878、和WV-9879的组合物，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他寡核苷酸。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸能够介导外显子23的跳读。此类DMD寡核苷酸的非限制性实例包括：WV-12566、WV-12567、WV-12568、WV-12884、WV-12885、WV-12886、WV-12887、WV-12888、WV-12571、和WV-12572，以及具有碱基序列(包含任何这些DMD寡核苷酸的至少15个连续碱基)的其他DMD寡核苷酸。
可以在患者来源的细胞系和来自mdx小鼠模型的细胞中测定DMD外显子23和其他外显子的外显子跳读(在框内外显子23中携带无义点突变(Sicinski等人1989 Science[科学]244：1578-1580)。通过跳读外显子23，绕过无义突变，同时保持读框。另外的mdx小鼠品系，包括mdx2cv、mdx4cv和mdx5cv等位基因，由以下报道：Wha Bin Im等人1996 Hum.Mol.Gen.[人类分子遗传学]5：1149-1153。
本文表1A.1、表1A.2、表1A.3和表25C.1至表25C.5尤其示出了显示各种DMD寡核苷酸介导外显子23跳读的能力的数据。
靶向外显子44并将内含子区域3′与外显子44相连的示例肌营养不良蛋白寡核苷 酸和组合物
在一些实施例中，DMD寡核苷酸靶向DMD外显子44或将内含子区域3′与DMD外显子44相连。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸靶向DMD外显子44或将内含子区域3’与DMD外显子44相连，并且该寡核苷酸能够介导(例如，外显子45至55、或45至57的)多个外显子跳读。
据报道，可能会发生一种称为反向剪接(back-splicing)的现象，其中例如外显子55的3′端的一部分与外显子45的5′端的一部分相互作用，形成环状RNA(circRNA)，从而可以跳读多个外显子，例如，从外显子45至55(包括端值)的所有外显子。据报道该现象也可能发生在外显子57和外显子45之间，跳读多个外显子，例如，从外显子45至57(包括端值)的所有外显子。反向剪接描述于文献中，例如在Suzuki等人2016 Int.J.Mol.Sci.[国际分子科学杂志]17中。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露提出，靶向DMD外显子44或将内含子区域3’与外显子44相连的DMD寡核苷酸可能可以介导外显子45至55的剪接或外显子45至57的剪接，这些外显子作为单个环状RNA(circRNA)切下，分别称为45-55(或55-45)或45-57(或57-45)。
设计了若干种寡核苷酸以靶向外显子44或内含子44或跨越外显子44和内含子44。在一些实施例中，测试设计用于靶向外显子44或内含子44、或跨越外显子44和内含子44的寡核苷酸，以确定它们是否可以增加回切(backslicing)和/或多个外显子跳读量。
在一些实施例中，本披露提供了用于介导人DMD中的外显子跳读的寡核苷酸、寡核苷酸组合物及其使用方法，其中该寡核苷酸的碱基序列是外显子44或内含子44的序列，或外显子44和内含子44两者的一部分。非限制性实例包括寡核苷酸，以及WV-13963、WV-13964、WV-13965、WV-13966、WV-13967、WV-13968、WV-13969、WV-13970、WV-13971、WV-13972、WV-13973、WV-13974、WV-13975、WV-13976、WV-13977、WV-13978、WV-13979、WV-13980、WV-13981、WV-13982、WV-13983、WV-13984、WV-13985、WV-13986、WV-13987、WV-13988、WV-13989、WV-13990、WV-13991、WV-13992、WV-13993、WV-13994、WV-13995、WV-13996、WV-13997、WV-13998、WV-13999、WV-14000、WV-14001、WV-14002、WV-14003、WV-14004、WV-14005、WV-14006、WV-14007、WV-14008、WV-14009、WV-14010、WV-14011、WV-14012、WV-14013、WV-14014、WV-14015、WV-14016、WV-14017、WV-14018、WV-14019、WV-14020、WV-14021、WV-14022、WV-14023、WV-14024、WV-14025、WV-14026、WV-14027、WV-14028、WV-14029、WV-14030、WV-14031、WV-14032、WV-14033、WV-14034、WV-14035、WV-14036、WV-14037、WV-14038、WV-14039、WV-14040、WV-14041、WV-14042、WV-14043、WV-14044、WV-14045、WV-14046、WV-14047、WV-14048、WV-14049、WV-14050、WV-14051、WV-14052、WV-14053、WV-14054、WV-14055、WV-14056、WV-14057、和WV-14058的组合物，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他寡核苷酸。
表22A.2和表22A.3中示出了数据，该数据显示了靶向外显子44或邻近外显子3′至外显子44的各种DMD寡核苷酸的能力。
表1A.1.某些寡核苷酸的示例数据
体外测试了DMD外显子23的寡核苷酸诱导外显子23跳读的能力。
在分化培养基中向H2K细胞给药寡核苷酸4天。将RNA用Trizol提取，进行pre-amp，然后用TaqMan处理，其中对跳过的和总的DMD转录物进行多路读取(multiplexedreading)；绝对定量经由标准曲线g-Blocks进行。在这些研究和各种其他研究中，数字指示跳读量(即，跳读效率；或跳读的百分比占总mRNA转录物的百分比)。
以10、3.33、1.11、0.37或0.12uM测试寡核苷酸。
Figure BPA0000295055720004921
Figure BPA0000295055720004931
表1A.2.某些寡核苷酸的活性
在此研究中，在单次IV剂量后在MDX小鼠模型中测量了体内跳读活性。
MDX小鼠接受150mg/kg的单次IV剂量。将尸检的快速冷冻组织(四头肌、膈肌等)粉碎，并用Trizol提取RNA。通过多重TaqMan测定来确定“总的”和“外显子23跳读的”DMD转录物的跳读效率，并将其标准化为gBlock标准曲线。
数字指示跳读DMD外显子23的量(占总mRNA的百分比，其中100表示100％跳读)。
Figure BPA0000295055720004932
Figure BPA0000295055720004941
表1A.3.某些寡核苷酸的活性
体外测试了寡核苷酸跳读DMD外显子23的能力。
以10、3.3、1.1、0.3和0.1uM测试寡核苷酸。
数字指示跳读DMD外显子23的量(占总mRNA的百分比，其中100表示100％跳读)。
Figure BPA0000295055720004942
Figure BPA0000295055720004951
用于外显子45的外显子跳读的示例肌营养不良蛋白寡核苷酸和组合物
在一些实施例中，本披露提供了用于介导(例如，小鼠、人等的)DMD中外显子45跳读的寡核苷酸、寡核苷酸组合物及其使用方法。
在一些实施例中，提供的DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导外显子45的跳读。此类DMD寡核苷酸和组合物的非限制性实例包括以下那些：WV-11047、WV-11048、WV-11049、WV-11050、WV-11051、WV-11052、WV-11053、WV-11054、WV-11055、WV-11056、WV-11057、WV-11058、WV-11059、WV-11060、WV-11061、WV-11062、WV-11063、WV-11064、WV-11065、WV-11066、WV-11067、WV-11068、WV-11069、WV-11070、WV-11071、WV-11072、WV-11073、WV-11074、WV-11075、WV-11076、WV-11077、WV-11078、WV-11079、WV-11080、WV-11081、WV-11082、WV-11083、WV-11084、WV-11085、WV-11086、WV-11087、WV-11088、WV-11089、WV-11090、WV-11091、WV-11092、WV-11093、WV-11094、WV-11095、WV-11096、WV-11097、WV-11098、WV-11099、WV-11100、WV-11101、WV-11102、WV-11103、WV-11104、WV-11105、WV-9594、WV-9595、WV-9596、WV-9597、WV-9598、WV-9599、WV-9600、WV-9601、WV-9602、WV-9603、WV-9604、WV-9605、WV-9606、WV-9607、WV-9608、WV-9609、WV-9610、WV-9611、WV-9612、WV-9613、WV-9614、WV-9615、WV-9616、WV-9617、WV-9618、WV-9619、WV-9620、WV-9621、WV-9622、WV-9623、WV-9624、WV-9625、WV-9626、WV-9627、WV-9628、WV-9629、WV-9630、WV-9631、WV-9632、WV-9633、WV-9634、WV-9635、WV-9636、WV-9637、WV-9638、WV-9639、WV-9640、WV-9641、WV-9642、WV-9643、WV-9644、WV-9645、WV-9646、WV-9647、WV-9648、WV-9649、WV-9650、WV-9651、WV-9652、WV-9653、WV-9654、WV-9655、WV-9656、WV-9657、WV-9658、WV-9659、WV-9762、WV-9763、WV-9764、WV-9765、WV-9766、WV-9767、WV-9768、WV-9769、WV-9770、WV-9771、WV-9772、WV-9773、WV-9774、WV-9775、WV-9776、WV-9777、WV-9778、WV-9779、WV-9780、WV-9781、WV-9782、WV-9783、WV-9784、WV-9785、WV-9786、WV-9787、WV-9788、WV-9789、WV-9790、WV-9791、WV-9792、WV-9793、WV-9794、WV-9795、WV-9796、WV-9797、WV-9798、WV-9799、WV-9800、WV-9801、WV-9802、WV-9803、WV-9804、WV-9805、WV-9806、WV-9807、WV-9808、WV-9809、WV-9810、WV-9811、WV-9812、WV-9813、WV-9814、WV-9815、WV-9816、WV-9817、WV-9818、WV-9819、WV-9820、WV-9821、WV-9822、WV-9823、WV-9824、WV-9825、和WV-9826，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他DMD寡核苷酸。
如从表1至表22的各个表(及其部分)中所示，针对跳读各种外显子来测试包含各种修饰模式的各种DMD寡核苷酸。表示出了某些DMD寡核苷酸的测试结果。为了测定DMD的外显子跳读，将某些DMD寡核苷酸在Δ52人患者来源的成肌细胞(也称为DEL52)和/或Δ45-52人患者来源的成肌细胞(人细胞，其中外显子52或外显子45-52已缺失，也称为DEL45-52)体外测试。除非另有说明，否则在各种实验中，寡核苷酸是裸式(gymnotically)递送。在这些表中，通常100.00表示100％跳读，而0.0表示0％跳读。各种DMD寡核苷酸详细描述于表A1中。
下表1A.4示出了跳读外显子45时一些DMD寡核苷酸的示例数据。程序：在分化培养基中用10uM寡核苷酸处理Δ48-50(Del48-50或D48-50)成肌细胞4天。
表1A.4.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读水平，其中100表示100％跳读，而0表示0％跳读。对于本文所述的各种数据，“模拟物”是阴性对照，其中使用水代替寡核苷酸。
Figure BPA0000295055720004971
Figure BPA0000295055720004981
表1B.1.和1B.2.某些寡核苷酸的示例数据。
下表示出了跳读外显子45时一些DMD寡核苷酸的示例数据。程序：在分化培养基中用10或3uM寡核苷酸处理Δ48-50(Del48-50或DEL48-50或D48-50)成肌细胞4天。
在DEL48-50成肌细胞中将寡核苷酸以10μM和3μM给药4天。某些寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联，如表A1详述。
表1B.1.某些寡核苷酸的示例数据。
Figure BPA0000295055720004991
表1B.2.某些寡核苷酸的示例数据。
Figure BPA0000295055720004992
Figure BPA0000295055720005001
表22A.1中示出了与靶向DMD外显子45的DMD寡核苷酸介导的多个外显子跳读有关的另外数据。
靶向外显子46的示例肌营养不良蛋白寡核苷酸和组合物
在一些实施例中，本披露提供了用于在人DMD中靶向外显子46和/或介导外显子46跳读的寡核苷酸、寡核苷酸组合物及其使用方法。非限制性实例包括寡核苷酸，以及WV-13701、WV-13702、WV-13703、WV-13704、WV-13705、WV-13706、WV-13707、WV-13708、WV-13709、WV-13710、WV-13711、WV-13712、WV-13713、WV-13714、WV-13715、WV-13716、WV-13780、和WV-13781的组合物，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他寡核苷酸。
在一些实施例中，首先测试DMD寡核苷酸的单一外显子跳读以选择合适的寡核苷酸，然后组合(与另一种DMD寡核苷酸组合)测试多外显子跳读。
在一些实施例中，首先测试靶向DMD外显子46、47、52、54或55的DMD寡核苷酸的单一外显子跳读以选择合适的寡核苷酸，然后组合(与另一种DMD寡核苷酸组合)测试多外显子跳读。
表2A.某些寡核苷酸的示例数据。数字指示外显子46的跳读百分比。
Figure BPA0000295055720005002
Figure BPA0000295055720005011
靶向外显子47的示例肌营养不良蛋白寡核苷酸和组合物
在一些实施例中，本披露提供了用于在人DMD中靶向外显子47和/或介导外显子47跳读的寡核苷酸、寡核苷酸组合物及其使用方法。非限制性实例包括寡核苷酸、外显子47寡核苷酸的组合物(包括：WV-13717、WV-13718、WV-13719、WV-13720、WV-13721、WV-13722、WV-13723、WV-13724、WV-13725、WV-13726、WV-13727、WV-13728、WV-13729、WV-13730、WV-13731、WV-13732、WV-13788和WV-13789)，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他寡核苷酸。
表3A.某些寡核苷酸的示例数据。数字表示外显子47的跳读百分比。
Figure BPA0000295055720005012
Figure BPA0000295055720005021
用于外显子51的外显子跳读的示例肌营养不良蛋白寡核苷酸和组合物
在一些实施例中，本披露提供了用于介导(例如，小鼠、人等的)DMD中外显子51跳读的寡核苷酸、寡核苷酸组合物及其使用方法。
在一些实施例中，提供的DMD寡核苷酸和/或组合物能够介导外显子51的跳读。此类DMD寡核苷酸和组合物的非限制性实例包括以下那些：ONT-395、WV-10255、WV-10261、WV-10262、WV-10634、WV-10635、WV-10636、WV-10637、WV-10868、WV-10869、WV-10870、WV-10871、WV-10872、WV-10873、WV-10874、WV-10875、WV-10876、WV-10877、WV-10878、WV-10879、WV-10880、WV-10881、WV-10882、WV-10883、WV-10884、WV-10885、WV-10886、WV-10887、WV-10888、WV-1107、WV-1108、WV-1109、WV-1110、WV-1111、WV-1112、WV-1113、WV-1114、WV-1115、WV-1116、WV-1117、WV-1118、WV-1119、WV-1120、WV-11237、WV-11238、WV-11239、WV-1131、WV-1132、WV-1133、WV-1134、WV-1135、WV-1136、WV-1137、WV-1138、WV-1139、WV-1140、WV-1151、WV-1152、WV-1153、WV-1154、WV-1155、WV-1156、WV-1157、WV-1158、WV-1159、WV-1160、WV-1709、WV-1710、WV-1711、WV-1712、WV-1713、WV-1714、WV-1715、WV-1716、WV-2095、WV-2096、WV-2097、WV-2098、WV-2099、WV-2100、WV-2101、WV-2102、WV-2103、WV-2104、WV-2105、WV-2106、WV-2107、WV-2108、WV-2109、WV-2165、WV-2179、WV-2180、WV-2181、WV-2182、WV-2183、WV-2184、WV-2185、WV-2186、WV-2187、WV-2188、WV-2189、WV-2190、WV-2191、WV-2192、WV-2193、WV-2194、WV-2195、WV-2196、WV-2197、WV-2198、WV-2199、WV-2200、WV-2201、WV-2202、WV-2203、WV-2204、WV-2205、WV-2206、WV-2207、WV-2208、WV-2209、WV-2210、WV-2211、WV-2212、WV-2213、WV-2214、WV-2215、WV-2216、WV-2217、WV-2218、WV-2219、WV-2220、WV-2221、WV-2222、WV-2223、WV-2224、WV-2225、WV-2226、WV-2227、WV-2228、WV-2229、WV-2230、WV-2231、WV-2232、WV-2233、WV-2234、WV-2235、WV-2236、WV-2237、WV-2238、WV-2239、WV-2240、WV-2241、WV-2242、WV-2243、WV-2244、WV-2245、WV-2246、WV-2247、WV-2248、WV-2249、WV-2250、WV-2251、WV-2252、WV-2253、WV-2254、WV-2255、WV-2256、WV-2257、WV-2258、WV-2259、WV-2260、WV-2261、WV-2262、WV-2263、WV-2264、WV-2265、WV-2266、WV-2267、WV-2268、WV-2273、WV-2274、WV-2275、WV-2276、WV-2277、WV-2278、WV-2279、WV-2280、WV-2281、WV-2282、WV-2283、WV-2284、WV-2285、WV-2286、WV-2287、WV-2288、WV-2289、WV-2290、WV-2291、WV-2292、WV-2293、WV-2294、WV-2295、WV-2296、WV-2297、WV-2298、WV-2299、WV-2300、WV-2301、WV-2302、WV-2303、WV-2304、WV-2305、WV-2306、WV-2307、WV-2308、WV-2309、WV-2310、WV-2311、WV-2312、WV-2313、WV-2314、WV-2315、WV-2316、WV-2317、WV-2318、WV-2319、WV-2320、WV-2321、WV-2322、WV-2323、WV-2324、WV-2325、WV-2326、WV-2327、WV-2328、WV-2329、WV-2330、WV-2331、WV-2332、WV-2333、WV-2334、WV-2335、WV-2336、WV-2337、WV-2338、WV-2339、WV-2340、WV-2341、WV-2342、WV-2343、WV-2344、WV-2345、WV-2346、WV-2347、WV-2348、WV-2349、WV-2350、WV-2351、WV-2352、WV-2353、WV-2354、WV-2361、WV-2362、WV-2363、WV-2364、WV-2365、WV-2366、WV-2367、WV-2368、WV-2369、WV-2370、WV-2381、WV-2382、WV-2383、WV-2384、WV-2385、WV-2432、WV-2433、WV-2434、WV-2435、WV-2436、WV-2437、WV-2438、WV-2439、WV-2440、WV-2441、WV-2442、WV-2443、WV-2444、WV-2445、WV-2446、WV-2447、WV-2448、WV-2449、WV-2526、WV-2527、WV-2528、WV-2529、WV-2530、WV-2531、WV-2532、WV-2533、WV-2534、WV-2535、WV-2536、WV-2537、WV-2538、WV-2578、WV-2579、WV-2580、WV-2581、WV-2582、WV-2583、WV-2584、WV-2585、WV-2586、WV-2587、WV-2588、WV-2625、WV-2627、WV-2628、WV-2660、WV-2661、WV-2662、WV-2663、WV-2664、WV-2665、WV-2666、WV-2667、WV-2668、WV-2669、WV-2670、WV-2737、WV-2738、WV-2739、WV-2740、WV-2741、WV-2742、WV-2743、WV-2744、WV-2745、WV-2746、WV-2747、WV-2748、WV-2749、WV-2750、WV-2752、WV-2783、WV-2784、WV-2785、WV-2786、WV-2787、WV-2788、WV-2789、WV-2790、WV-2791、WV-2792、WV-2793、WV-2794、WV-2795、WV-2796、WV-2797、WV-2798、WV-2799、WV-2800、WV-2801、WV-2802、WV-2803、WV-2804、WV-2805、WV-2806、WV-2807、WV-2808、WV-2812、WV-2813、WV-2814、WV-3017、WV-3018、WV-3019、WV-3020、WV-3022、WV-3023、WV-3024、WV-3025、WV-3026、WV-3027、WV-3028、WV-3029、WV-3030、WV-3031、WV-3032、WV-3033、WV-3034、WV-3035、WV-3036、WV-3037、WV-3038、WV-3039、WV-3040、WV-3041、WV-3042、WV-3043、WV-3044、WV-3045、WV-3046、WV-3047、WV-3048、WV-3049、WV-3050、WV-3051、WV-3052、WV-3053、WV-3054、WV-3055、WV-3056、WV-3057、WV-3058、WV-3059、WV-3060、WV-3061、WV-3070、WV-3071、WV-3072、WV-3073、WV-3074、WV-3075、WV-3076、WV-3077、WV-3078、WV-3079、WV-3080、WV-3081、WV-3082、WV-3083、WV-3084、WV-3085、WV-3086、WV-3087、WV-3088、WV-3089、WV-3113、WV-3114、WV-3115、WV-3116、WV-3117、WV-3118、WV-3120、WV-3121、WV-3152、WV-3153、WV-3357、WV-3358、WV-3359、WV-3360、WV-3361、WV-3362、WV-3363、WV-3364、WV-3365、WV-3366、WV-3463、WV-3464、WV-3465、WV-3466、WV-3467、WV-3468、WV-3469、WV-3470、WV-3471、WV-3472、WV-3473、WV-3506、WV-3507、WV-3508、WV-3509、WV-3510、WV-3511、WV-3512、WV-3513、WV-3514、WV-3515、WV-3516、WV-3517、WV-3518、WV-3519、WV-3520、WV-3543、WV-3544、WV-3545、WV-3546、WV-3547、WV-3548、WV-3549、WV-3550、WV-3551、WV-3552、WV-3553、WV-3554、WV-3555、WV-3556、WV-3557、WV-3558、WV-3559、WV-3560、WV-3753、WV-3754、WV-3820、WV-3821、WV-3855、WV-3856、WV-3971、WV-4106、WV-4107、WV-4191、WV-4231、WV-4232、WV-4233、WV-4890、WV-6137、WV-6409、WV-6410、WV-6560、WV-6826、WV-6827、WV-6828、WV-7109、WV-7110、WV-7333、WV-7334、WV-7335、WV-7336、WV-7337、WV-7338、WV-7339、WV-7340、WV-7341、WV-7342、WV-7343、WV-7344、WV-7345、WV-7346、WV-7347、WV-7348、WV-7349、WV-7350、WV-7351、WV-7352、WV-7353、WV-7354、WV-7355、WV-7356、WV-7357、WV-7358、WV-7359、WV-7360、WV-7361、WV-7362、WV-7363、WV-7364、WV-7365、WV-7366、WV-7367、WV-7368、WV-7369、WV-7370、WV-7371、WV-7372、WV-7373、WV-7374、WV-7375、WV-7376、WV-7377、WV-7378、WV-7379、WV-7380、WV-7381、WV-7382、WV-7383、WV-7384、WV-7385、WV-7386、WV-7387、WV-7388、WV-7389、WV-7390、WV-7391、WV-7392、WV-7393、WV-7394、WV-7395、WV-7396、WV-7397、WV-7398、WV-7399、WV-7400、WV-7401、WV-7402、WV-7410、WV-7411、WV-7412、WV-7413、WV-7414、WV-7415、WV-7457、WV-7458、WV-7459、WV-7460、WV-7461、WV-7506、WV-7596、WV-8130、WV-8131、WV-8230、WV-8231、WV-8232、WV-8449、WV-8478、WV-8479、WV-8480、WV-8481、WV-8482、WV-8483、WV-8484、WV-8485、WV-8486、WV-8487、WV-8488、WV-8489、WV-8490、WV-8491、WV-8492、WV-8493、WV-8494、WV-8495、WV-8496、WV-8497、WV-8498、WV-8499、WV-8500、WV-8501、WV-8502、WV-8503、WV-8504、WV-8505、WV-8506、WV-8806、WV-884、WV-885、WV-886、WV-887、WV-888、WV-889、WV-890、WV-891、WV-892、WV-893、WV-894、WV-895、WV-896、WV-897、WV-9222、WV-9223、WV-9224、WV-9225、WV-9226、WV-9227、WV-942、WV-9540、WV-9541、WV-9737、WV-9738、WV-9739、WV-9740、WV-9741、WV-9742、WV-9827、WV-9828、WV-9829、WV-9830、WV-9831、WV-9832、WV-9833、WV-9834、WV-9835、WV-9836、WV-9837、WV-9838、WV-9839、WV-9840、WV-9841、WV-9842、WV-9843、WV-9844、WV-9845、WV-9846、WV-9847、WV-9848、WV-9849、WV-9850、WV-9851、WV-9852、WV-9858、和WV-8937，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他DMD寡核苷酸。
此类DMD寡核苷酸和组合物的另外的非限制性实例包括以下那些：WV-2444、WV-2528、WV-2531、WV-2578、WV-2579、WV-2580、WV-2581、WV-2669、WV-2745、WV-3032、WV-3152、WV-3153、WV-3360、WV-3363、WV-3364、WV-3465、WV-3466、WV-3470、WV-3472、WV-3473、WV-3507、WV-3545、WV-3546、WV-3552、WV-4106、WV-4231、WV-4232、WV-4233、WV-887、WV-896、WV-942，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他DMD寡核苷酸。
此类DMD寡核苷酸和组合物的另外的非限制性实例包括以下那些：WV-12494、WV-12130、WV-12131、WV-12132、WV-12133、WV-12134、WV-12135、WV-12136、WV-12496、WV-12495、WV-12123、WV-12124、WV-12125、WV-12126、WV-12127、WV-12128、WV-12129、WV-12553、WV-12554、WV-12555、WV-12556、WV-12557、WV-12558、WV-12559、WV-12872、WV-12873、WV-12876、WV-12877、WV-12878、WV-12879、WV-12880、WV-12881、WV-12882、和WV-12883，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，外显子51跳读的目的区域的序列在小鼠和人之间不同。
依照本披露，可以使用各种测定来评估用于外显子跳读的寡核苷酸。在一些实施例中，为了测试用于人中的外显子51跳读的寡核苷酸的化学和立体化学的特定组合的功效，可以制备具有小鼠序列的相应寡核苷酸，然后在小鼠中进行测试。本披露认识到在外显子51的人和小鼠同源物中存在一些差异(下面加下划线)：
Figure BPA0000295055720005061
其中M是小鼠，nt 7571-7630；并且H是人，nt 7665-7724。
由于这些差异，可以制备用于跳读外显子51的稍微不同的DMD寡核苷酸用于在小鼠和人中进行测试。作为非限制性实例，以下DMD寡核苷酸序列可用于人和小鼠中的测试：
人DMD寡核苷酸序列：UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU
小鼠DMD寡核苷酸序列：GCAAAGAAGAUGGCAUUUCU
对人与小鼠之间的错配加下划线。
可以用碱基序列(例如，UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU)、以及特定的化学模式、核苷酸间键联、立体化学、和另外的化学部分(如果有的话)的特定组合来构建旨在用于治疗人受试者的DMD寡核苷酸。可以在人细胞中体外测试或在人受试者体内测试这种DMD寡核苷酸，但是例如在小鼠中测试可能具有有限的适应性，因为两者的碱基序列具有错配。
可以用对应的小鼠碱基序列(GCAAAGAAGAUGGCAUUUCU)和相同的化学模式、核苷酸间键联、立体化学、和另外的化学部分(如果有的话)构建对应的DMD寡核苷酸。可以在小鼠体内测试这种寡核苷酸。构建并测试了包含小鼠碱基序列的若干种DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，可以在小鼠中测试人DMD外显子跳读寡核苷酸，已经将该寡核苷酸进行修饰以包含DMD基因(包含人序列)。
本文描述了包含各种模式修饰的各种DMD寡核苷酸。下表示出了某些DMD寡核苷酸的测试结果。为了测定DMD的外显子跳读，将DMD寡核苷酸在Δ52人患者来源的成肌细胞和/或Δ45-52人患者来源的成肌细胞(人细胞，其中外显子52或外显子45-52已经被缺失)体外测试。除非另有说明，否则在各种实验中，寡核苷酸是裸式(gymnotically)递送。
表4A.某些寡核苷酸的示例数据。
一式三份，以10uM和3uM体外测试DMD寡核苷酸。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。表A1中提供了此表(和其他表)中测试的寡核苷酸的完整描述。
Figure BPA0000295055720005071
在下表4B中，呈现了用于跳读外显子51的DMD寡核苷酸的另外的数据。
表4B.某些寡核苷酸的示例数据。
一式三份，以10uM和3uM测试DMD寡核苷酸。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005081
在下表4C中，呈现了用于跳读外显子51的DMD寡核苷酸的另外的数据。
表4C.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005082
Figure BPA0000295055720005083
在下表4D中，呈现了用于跳读外显子51的DMD寡核苷酸的另外的数据。
表4D.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005091
在下表5中，呈现了用于跳读外显子51的DMD寡核苷酸的另外的数据。
表5.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005092
Figure BPA0000295055720005101
表6.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。数字为近似值。将寡核苷酸裸式递送至Δ48-50患者来源的成肌细胞(分化后4天)。在此表及与跳读DMD外显子51有关的其他表中，称为“PMO”的寡核苷酸是WV-8806CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG，即完全PMO(吗啉代)。
Figure BPA0000295055720005102
Figure BPA0000295055720005111
在下表7中，呈现了用于跳读外显子51的DMD寡核苷酸的另外的数据。
表7.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。数字为近似值。
Figure BPA0000295055720005112
Figure BPA0000295055720005121
在一些实施例中，本披露涉及本文披露的任何寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)的代谢物或其任何组合。在一些实施例中，寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)的代谢物是寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)被核酸酶(例如，外切核酸酶或内切核酸酶或其他酶，包括那些可以化学处理寡核苷酸的一个或多个修饰的酶)作用的结果。在一些实施例中，寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)的“代谢物”不是被核酸酶代谢或物理处理的寡核苷酸的物理产物，而是化学上对应于被酶(例如核酸酶)代谢或处理的寡核苷酸产物的化合物。在一些实施例中，寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)的代谢物是化学合成的(其中没有任何代谢处理)并且任选地施用于受试者。
在一些实施例中，代谢物是5′端和/或3′端被一个或两个核苷酸或核苷截短的寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)，其对应于本文列出的、但在5′端被一个或两个核苷酸截短的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)，其对应于本文列出的、但在3′端被一个或两个核苷酸截短的寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)，其对应于本文列出的、但在3′端和5′端被一个或两个核苷酸截短的寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)。除其他事项外，此类寡核苷酸可执行各种生物学功能，例如，此类DMD寡核苷酸可介导外显子23、45、51、53或任何其他DMD外显子的跳读。
在一些实施例中，本披露涉及具有本文列出的DMD寡核苷酸的碱基序列(除了该碱基序列在5′端短一个或两个碱基)的DMD寡核苷酸。在一些实施例中，本披露涉及具有本文列出的DMD寡核苷酸的碱基序列(除了该碱基序列在3′端短一个或两个碱基)的DMD寡核苷酸。在一些实施例中，本披露涉及具有本文披露的DMD寡核苷酸的碱基序列(除了该碱基序列在3′端和5′端短一个或两个碱基)的DMD寡核苷酸。此类DMD寡核苷酸尤其可以介导外显子23、45、51、53或任何其他DMD外显子的跳读。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸的代谢物已经从寡核苷酸中除去了另外的部分(例如，脂质或其他缀合部分)。
在一些实施例中，本披露的寡核苷酸可以是另一种寡核苷酸的代谢物。例如，若干种寡核苷酸可能是WV-3473(例如WV-4231(3′ n-1，在3′端被一个核苷酸截短)、WV-4232(3′n-2)、WV-4233(5′ n-1)等)的代谢物。此类“代谢物”寡核苷酸的示例数据呈现于下表9中(重复1、3和10uM)。通常，无论寡核苷酸是否可以是另一种寡核苷酸的代谢物，都可以独立使用。
表9.某些寡核苷酸的示例数据。
示出了重复实验的结果。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。在该表和其他表中，PMO是吗啉代寡核苷酸对照。
Figure BPA0000295055720005131
在一些实施例中，本披露涉及DMD寡核苷酸，其对应于外显子51或本文(例如，表A1中)列出的任何其他外显子的、但在5′端和/或3′端被一个、两个或更多个核苷酸截短的任何DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)的长度为15至45个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)的长度为20至45个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)的长度为20至40个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)的长度为35个碱基。在一些实施例中，提供的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)的长度为20至25个碱基。
在一些实验中，用于跳读外显子51的DMD寡核苷酸的长度为20或25个碱基。
表10A和10B。某些寡核苷酸的示例数据。
表10A示出了跳读DMD外显子51的20-mer的数据；表10B示出了跳读DMD外显子51的25-mer的数据。表A1中提供序列。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
表10A.20-mer
Figure BPA0000295055720005141
表10B.25-mer
Figure BPA0000295055720005142
提供了另外的数据。
表10C.某些寡核苷酸的示例数据。
以10、3和1μM体外测试寡核苷酸。示出了重复实验的结果。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005151
表10D.某些寡核苷酸的示例数据。
以10、3和1μM体外测试寡核苷酸。示出了重复实验的结果。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005152
表10E.某些寡核苷酸的示例数据。
以10、3和1μM体外测试寡核苷酸。示出了重复实验的结果。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005153
表10F.某些寡核苷酸的示例数据。
以10、3和1μM体外测试寡核苷酸。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
10uM 3uM 1uM
模拟物 0.0 0.1 0.0
WV-2531 21.7 8.7 3.2
WV-3360 25.1 10.1 3.3
WV-3363 24.0 7.7 3.4
WV-3364 45.5 9.8 4.0
表10G.某些寡核苷酸的示例数据。
以10、3和1μM体外测试寡核苷酸。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005161
表10H.某些寡核苷酸的示例数据。
以10和3μM体外测试寡核苷酸。在此表中，在一些情况下，添加了血清和/或BSA以测试对外显子跳读的影响。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005162
Figure BPA0000295055720005171
Figure BPA0000295055720005172
Figure BPA0000295055720005173
Figure BPA0000295055720005174
Figure BPA0000295055720005175
Figure BPA0000295055720005181
Figure BPA0000295055720005182
Figure BPA0000295055720005183
Figure BPA0000295055720005184
表10I.某些寡核苷酸的示例数据。
以10、3和1μM体外测试寡核苷酸。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
10uM 3uM 1uM
模拟物 0.0 0.1 0.0
WV-2531 21.7 8.7 3.2
WV-3152 26.1 15.3 5.7
WV-2745 24.0 10.7 4.8
WV-3463 6.6 3.0 0.8
WV-3464 16.1 6.2 2.4
WV-3465 16.4 6.0 1.8
WV-3466 13.0 5.7 2.0
WV-3467 12.6 5.8 2.6
WV-3469 14.2 6.0 1.5
WV-3470 24.9 11.9 6.4
WV-3471 4.9 1.6 1.0
WV-3472 20.1 12.4 7.2
WV-3473 24.9 11.4 7.6
WV-942 3.3 2.1 0.7
表10J.某些寡核苷酸的示例数据。
以10、3和1μM体外测试寡核苷酸。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005191
Figure BPA0000295055720005201
表10K.某些寡核苷酸的示例数据。
以10μM体外测试寡核苷酸。在此表中，数字表示相对于WV-942的跳读效率(ave)；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005202
表10L.某些寡核苷酸的示例数据。
以10和3μM体外测试寡核苷酸。在此表中，数字表示相对于WV-942的跳读效率(ave)；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005203
Figure BPA0000295055720005211
在一些实施例中，可以在体内测试寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)跳读活体动物组织中外显子的能力；在一些实施例中，组织是腓肠肌、三头肌、四头肌、膈肌和/或心脏。在一些实施例中，活体动物是小鼠、大鼠、猴、狗或非人灵长类动物。在一些实施例中，寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)能够介导例如外显子23、45、51、53或任何其他外DMD显子的跳读。示出了各种DMD寡核苷酸介导非人灵长类动物(NHP)组织中DMD外显子51的跳读，其中该组织是腓肠肌、三头肌、四头肌、膈肌或心脏。
在一些实施例中，本披露涉及施用寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)的方法，其中(成肌细胞到肌小管的)预分化的时间线和用寡核苷酸进行的处理被适当地改变。在一些实施例中，体外测试中，用1天或4天的处理测试外显子51的寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)。
表11A.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率。PMO是一种具有如下序列的吗啉代：CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG。
寡核苷酸 组A 组B 组C
PMO 1.3 0.6 3.3
WV-3473 29.3 23.1 81.6
表11A中组A到组C的条件。
组A 组B 组C
预分化 1天 2天 0天
ASO处理 1天 1天 4天
洗脱 2天 2天 -
实例19描述了适于在体外例如在患者来源的成肌细胞中测试寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)的实验的各种时间线。
表11B.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率。PMO是对照寡核苷酸，其是对应于依普勒森的吗啉代。WV-942是对应于依普勒森的寡核苷酸。将寡核苷酸裸式递送。
Figure BPA0000295055720005221
Figure BPA0000295055720005231
Figure BPA0000295055720005232
Figure BPA0000295055720005233
表11C.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率。PMO是对照寡核苷酸，其是对应于依普勒森的吗啉代。WV-942是对应于依普勒森的寡核苷酸。将寡核苷酸裸式递送。
Figure BPA0000295055720005234
Figure BPA0000295055720005235
Figure BPA0000295055720005241
Figure BPA0000295055720005242
在一些实施例中，寡核苷酸包含U的衍生物。在一些实施例中，能够介导DMD外显子的跳读的寡核苷酸包含U的衍生物。在一些实施例中，能够介导DMD外显子的跳读的寡核苷酸包含U的衍生物和至少一个手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸能够介导DMD外显子的跳读并且包含U的衍生物和至少一个手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，U的衍生物是BrU或Acet5U
Figure BPA0000295055720005243
在一些实施例中，寡核苷酸包含BrU。在一些实施例中，能够介导DMD外显子跳读的寡核苷酸包含BrU。在一些实施例中，寡核苷酸能够介导DMD外显子的跳读并且包含BrU和至少一个手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸能够介导DMD外显子的跳读并且包含BrU和至少一个手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，寡核苷酸包含Acet5U。在一些实施例中，Acet5U也称为AcetU或acetU。在一些实施例中，能够介导DMD外显子的跳读的寡核苷酸包含Acet5U。在一些实施例中，在寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)中，任何U或T可以任选地被Acet5U替换(例如，在第一翼、核心、第二翼或在寡核苷酸中的任何地方)。在一些实施例中，能够介导DMD外显子跳读的寡核苷酸包含Acet5mU核苷单元，其中碱基是Acet5U，并且糖是其中2′-OH被2′-OMe替换的普通天然RNA糖。在一些实施例中，寡核苷酸包含Acet5fU核苷单元，其中碱基是Acet5U，并且糖是其中2′-OH被2′-F替换的普通天然RNA糖。在一些实施例中，寡核苷酸能够介导DMD外显子的跳读并且包含Acet5U和至少一个手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸能够介导DMD外显子的跳读并且包含Acet5U和至少一个手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
如表11D、表11E和表A1所示，设计并构建了包括BrU或acet5U的某些寡核苷酸，例如DMD寡核苷酸。在一些寡核苷酸中，在5′端的核苷包含BrU或acet5U。在一些实施例中，寡核苷酸包含BrfU核苷单元，其中碱基是BrU，并且糖是常见的天然RNA糖(其中2′-OH被2′-F替换)。在一些寡核苷酸中，寡核苷酸包含BrdU核苷单元，其中碱基是BrU，并且糖是2-脱氧核糖(普通天然DNA糖)。在一些实施例中，任何U或T可以被BrU替换(例如，在第一翼、核心、第二翼或寡核苷酸内的任何地方)。在一些实施例中，在寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)中，任何数目的U或T可以被BrU和/或Acet5U替换。
在一些实施例中，寡核苷酸包含acet5fU核苷单元，其中碱基是acet5U，并且糖是普通的天然RNA糖(其中2′-OH被2′-F替换)。
表11D示出了介导外显子51的跳读的各种DMD寡核苷酸的数据，包括寡核苷酸WV-7410(包含BrfU)和WV-7413(包含acet5fU)。使用RT-qPCR测量百分比。在Δ48-50患者来源的成肌细胞中(分化后4天)裸式递送10μM和3μM寡核苷酸。实验是以技术重复进行的。
表11D.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率。提供了近似数。
WV-3152 WV-3516 WV-7410 WV-7413
10μM 39 10 49 11
3μM 20 6 34 6
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，例如在寡核苷酸的中心处或附近(例如，在核心区域、中间区域等中)包含BrdU的各种DMD寡核苷酸。在一些实施例中，示例此类寡核苷酸包括WV-2812、WV-2813和WV-2814。这些寡核苷酸的某些外显子跳读数据呈现如下。
表11E.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中1.000表示100％跳读，而0.0表示0％效率。提供了近似数。
Figure BPA0000295055720005261
表11F.某些寡核苷酸的示例数据。
构建了用于跳读外显子51的另外的DMD寡核苷酸。各种DMD寡核苷酸包含BrU。在一些情况下，BrU附接到经2′-F修饰(BrfU)的糖上。在分化培养基中向D48-50成肌细胞以10uM和3uM给药4天。示出了跳读百分比，其中100表示100％跳读，而0表示0％跳读。
Figure BPA0000295055720005262
Figure BPA0000295055720005271
表11G.某些寡核苷酸的活性
体外测试各种DMD外显子51寡核苷酸的活性。
数字指示跳读DMD外显子23的量(占总mRNA的百分比，其中100表示100％跳读)。
测试的量为：10、3.3和1.1uM。
Figure BPA0000295055720005272
表11H.某些寡核苷酸的活性
体外测试用于跳读DMD外显子51的寡核苷酸。
数字指示跳读DMD外显子23的量(占总mRNA的百分比，其中100表示100％跳读)。
使用的寡核苷酸浓度：10、3.3和1.1uM。
Figure BPA0000295055720005281
表11I.某些寡核苷酸的活性
体外测试用于跳读DMD外显子51的寡核苷酸。
数字指示跳读DMD外显子23的量(占总mRNA的百分比，其中100表示100％跳读)。
使用的寡核苷酸浓度：10和3.3uM。
Figure BPA0000295055720005291
Figure BPA0000295055720005301
表11J.某些寡核苷酸的活性
体外测试用于跳读DMD外显子51的寡核苷酸。
以10uM给药寡核苷酸4d。
数字指示跳读DMD外显子51的量(占总mRNA的百分比，其中100表示100％跳读)。
Figure BPA0000295055720005302
Figure BPA0000295055720005311
Figure BPA0000295055720005321
靶向外显子52的示例肌营养不良蛋白寡核苷酸和组合物
在一些实施例中，本披露提供了用于在人DMD中靶向外显子52和/或介导外显子52跳读的寡核苷酸、寡核苷酸组合物及其使用方法。非限制性实例包括寡核苷酸、外显子52寡核苷酸的组合物(包括：WV-13733、WV-13734、WV-13735、WV-13736、WV-13737、WV-13738、WV-13739、WV-13740、WV-13741、WV-13742、WV-13743、和WV-13744、WV-13782、和WV-13783)，以及具有碱基序列(包含任何这些DMD寡核苷酸的至少15个连续碱基)的其他DMD寡核苷酸。
表12A.某些寡核苷酸的示例数据。
各种DMD寡核苷酸的跳读效率，测试DMD外显子52的跳读。
WV-13733 0.3 0.2
WV-13734 0.0 0.0
WV-13735 1.6 0.3
WV-13736 3.9 1.3
WV-13737 0.7 0.4
WV-13738 0.0 0.0
WV-13739 28.3 29.3
WV-13740 29.9 33.3
WV-13741 1.6 1.6
WV-13742 12.9 14.1
WV-13743 0.9 1.0
WV-13744 0.6 0.7
WV-13782 0.1 0.1
WV-13783 0.8 0.0
模拟物 0.0 0.0
模拟物 0.1 0.1
用于外显子53的外显子跳读的示例肌营养不良蛋白寡核苷酸和组合物
在一些实施例中，本披露提供了用于介导(例如，小鼠、人等的)DMD中外显子53跳读的寡核苷酸、寡核苷酸组合物及其使用方法。
在一些实施例中，可以在小鼠中测试寡核苷酸(例如，人DMD外显子53跳读寡核苷酸)，已经将该寡核苷酸进行修饰以包含DMD基因(包含人外显子53序列)。
在一些实施例中，寡核苷酸(例如，DMD寡核苷酸)能够介导外显子53的跳读。此类寡核苷酸的非限制性实例包括：WV-10439、WV-10440、WV-10441、WV-10442、WV-10443、WV-10444、WV-10445、WV-10446、WV-10447、WV-10448、WV-10449、WV-10450、WV-10451、WV-10452、WV-10453、WV-10454、WV-10455、WV-10456、WV-10457、WV-10458、WV-10459、WV-10460、WV-10461、WV-10462、WV-10463、WV-10464、WV-10465、WV-10466、WV-10467、WV-10468、WV-10469、WV-10470、WV-10487、WV-10488、WV-10489、WV-10490、WV-10491、WV-10492、WV-10493、WV-10494、WV-10495、WV-10496、WV-10497、WV-10498、WV-10499、WV-10500、WV-10501、WV-10502、WV-10503、WV-10504、WV-10505、WV-10506、WV-10507、WV-10508、WV-10509、WV-10510、WV-10511、WV-10512、WV-10513、WV-10514、WV-10515、WV-10516、WV-10517、WV-10518、WV-10519、WV-10520、WV-10521、WV-10522、WV-10523、WV-10524、WV-10525、WV-10526、WV-10527、WV-10528、WV-10529、WV-10530、WV-10531、WV-10532、WV-10533、WV-10534、WV-10535、WV-10536、WV-10537、WV-10538、WV-10539、WV-10540、WV-10541、WV-10542、WV-10543、WV-10544、WV-10545、WV-10546、WV-10547、WV-10548、WV-10549、WV-10550、WV-10551、WV-10552、WV-10553、WV-10554、WV-10555、WV-10556、WV-10557、WV-10558、WV-10559、WV-10560、WV-10561、WV-10562、WV-10563、WV-10564、WV-10565、WV-10566、WV-10567、WV-10568、WV-10569、WV-10570、WV-10571、WV-10572、WV-10573、WV-10574、WV-10575、WV-10576、WV-10577、WV-10578、WV-10579、WV-10580、WV-10581、WV-10582、WV-10583、WV-10584、WV-10585、WV-10586、WV-10587、WV-10588、WV-10589、WV-10590、WV-10591、WV-10592、WV-10593、WV-10594、WV-10595、WV-10596、WV-10597、WV-10598、WV-10599、WV-10600、WV-10601、WV-10602、WV-10603、WV-10604、WV-10605、WV-10606、WV-10607、WV-10608、WV-10609、WV-10610、WV-10611、WV-10612、WV-10613、WV-10614、WV-10615、WV-10616、WV-10617、WV-10618、WV-10619、WV-10620、WV-10621、WV-10622、WV-10623、WV-10624、WV-10625、WV-10626、WV-10627、WV-10628、WV-10629、WV-10630、WV-10670、WV-10671、WV-10672、WV-11340、WV-11341、WV-11342、WV-11544、WV-11545、WV-11546、WV-11547、WV-13835、WV-13864、WV-14344、WV-4698、WV-4699、WV-4700、WV-4701、WV-4702、WV-4703、WV-4704、WV-4705、WV-4706、WV-4707、WV-4708、WV-4709、WV-4710、WV-4711、WV-4712、WV-4713、WV-4714、WV-4715、WV-4716、WV-4717、WV-4718、WV-4719、WV-4720、WV-4721、WV-4722、WV-4723、WV-4724、WV-4725、WV-4726、WV-4727、WV-4728、WV-4729、WV-4730、WV-4731、WV-4732、WV-4733、WV-4734、WV-4735、WV-4736、WV-4737、WV-4738、WV-4739、WV-4740、WV-4741、WV-4742、WV-4743、WV-4744、WV-4745、WV-4746、WV-4747、WV-4748、WV-4749、WV-4750、WV-4751、WV-4752、WV-4753、WV-4754、WV-4755、WV-4756、WV-4757、WV-4758、WV-4759、WV-4760、WV-4761、WV-4762、WV-4763、WV-4764、WV-4765、WV-4766、WV-4767、WV-4768、WV-4769、WV-4770、WV-4771、WV-4772、WV-4773、WV-4774、WV-4775、WV-4776、WV-4777、WV-4778、WV-4779、WV-4780、WV-4781、WV-4782、WV-4783、WV-4784、WV-4785、WV-4786、WV-4787、WV-4788、WV-4789、WV-4790、WV-4791、WV-4792、WV-4793、WV-9067、WV-9068、WV-9069、WV-9070、WV-9071、WV-9072、WV-9073、WV-9074、WV-9075、WV-9076、WV-9077、WV-9078、WV-9079、WV-9080、WV-9081、WV-9082、WV-9083、WV-9084、WV-9085、WV-9086、WV-9087、WV-9088、WV-9089、WV-9090、WV-9091、WV-9092、WV-9093、WV-9094、WV-9095、WV-9096、WV-9097、WV-9098、WV-9099、WV-9100、WV-9101、WV-9102、WV-9103、WV-9104、WV-9105、WV-9106、WV-9107、WV-9108、WV-9109、WV-9110、WV-9111、WV-9112、WV-9113、WV-9114、WV-9115、WV-9116、WV-9117、WV-9118、WV-9119、WV-9120、WV-9121、WV-9122、WV-9123、WV-9124、WV-9125、WV-9126、WV-9127、WV-9128、WV-9129、WV-9130、WV-9131、WV-9132、WV-9133、WV-9134、WV-9135、WV-9136、WV-9137、WV-9138、WV-9139、WV-9140、WV-9141、WV-9142、WV-9143、WV-9144、WV-9145、WV-9146、WV-9147、WV-9148、WV-9149、WV-9150、WV-9151、WV-9152、WV-9153、WV-9154、WV-9155、WV-9156、WV-9157、WV-9158、WV-9159、WV-9160、WV-9161、WV-9162、WV-9422、WV-9423、WV-9424、WV-9425、WV-9426、WV-9427、WV-9428、WV-9429、WV-9511、WV-9512、WV-9513、WV-9514、WV-9515、WV-9516、WV-9517、WV-9518、WV-9519、WV-9520、WV-9521、WV-9522、WV-9523、WV-9524、WV-9525、WV-9534、WV-9535、WV-9536、WV-9537、WV-9538、WV-9539、WV-9680、WV-9681、WV-9682、WV-9683、WV-9684、WV-9685、WV-9686、WV-9687、WV-9688、WV-9689、WV-9690、WV-9691、WV-9699、WV-9700、WV-9701、WV-9702、WV-9703、WV-9704、WV-9709、WV-9710、WV-9711、WV-9712、WV-9713、WV-9714、WV-9715、WV-9743、WV-9744、WV-9745、WV-9746、WV-9747、WV-9748、WV-9749、WV-9750、WV-9751、WV-9752、WV-9753、WV-9754、WV-9755、WV-9756、WV-9757、WV-9758、WV-9759、WV-9760、WV-9761、WV-9897、WV-9898、WV-9899、WV-9900、WV-9901、WV-9902、WV-9903、WV-9904、WV-9905、WV-9906、WV-9907、WV-9908、WV-9909、WV-9910、WV-9911、WV-9912、WV-9913、WV-9914、WV-7436、WV-7437、WV-7438、WV-7439、WV-7440、WV-7441、WV-7442、WV-7443、WV-7444、WV-7445、WV-7446、WV-7447、WV-7448、WV-7449、WV-7450、WV-7451、WV-7452、WV-7453、WV-7454、WV-7455、和WV-7456，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他DMD寡核苷酸。
此类DMD寡核苷酸的另外的非限制性实例包括：WV-9422、WV-9425、WV-9426、WV-9517、WV-9519、WV-9521、WV-9522、WV-9524、WV-9710、WV-9714、WV-9715、WV-9743、WV-9744、WV-9745、WV-9746、WV-9747、WV-9748、WV-9749、WV-9750、WV-9751、WV-9756、WV-9757、WV-9758、WV-9759、WV-9760、WV-9761、WV-9897、WV-9898、WV-9899、WV-9900、WV-9906和WV-9912，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他DMD寡核苷酸。
此类DMD寡核苷酸的非限制性实例还包括：WV-12123、WV-12124、WV-12125、WV-12126、WV-12127、WV-12128、WV-12129、WV-12553、WV-12554、WV-12555、WV-12556、WV-12557、WV-12558、WV-12559、WV-12872、WV-12873、WV-12876、WV-12877、WV-12878、WV-12879、WV-12880、WV-12881、WV-12882和WV-12883，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他DMD寡核苷酸。
本披露中描述了用于跳读肌营养不良蛋白外显子53的各种实验的结果。例如，来自序列识别筛选的数据在以下表13A中显示。
表13A.某些寡核苷酸的示例数据。
体外测试了各种DMD寡核苷酸在δ52人成肌细胞中跳读DMD外显子53的跳读效率。测试的寡核苷酸是6-8-6缺口体(2′-F-2′-OMe-2′-F)，其中每个核苷酸间键联是立体随机的硫代磷酸酯。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005361
Figure BPA0000295055720005371
产生了许多寡核苷酸，并体外测试了在人患者来源的成肌细胞中跳读DMD外显子53的功效；某些结果示于下表13B至21(A和B)中。将寡核苷酸以3和10uM的浓度使用，一式两份(R1和R2)。数字指示DMD外显子53的跳读百分比，其中0.0指示无跳读，而100.0指示100％跳读。结合多种化学格式测试了若干种碱基序列。例如，在一些实施例中，碱基序列是GUACUUCAUCCCACUGAUUC、GUGUUCTTGTACTTCAUCCC、UUCUGAAGGTGTTCUUGUAC、或CUCCGGTTCTGAAGGUGUUC，其中U任选地被T取代(反之亦然)。利用各种化学格式，包括例如缺口体(例如6-8-6翼-核心-翼缺口体)。在一些实施例中，两个翼都是2′-F，而核心都是2′-MOE、交替的2′-MOE/2-OMe、交替的2′-OMe/2′-MOE、交替的2′-MOE/2′-F、交替的2′-F/2′-MOE、交替的2′-OMe/2′-F和交替的2′-F/2′-OMe等。在一些实施例中，第一翼为2′-MOE或2′-OMe，而第二个翼为2′-F(一种不对称缺口体类型)。在一些实施例中，每个核苷酸间键联是立体随机的硫代磷酸酯。在一些实施例中，一些交替的硫代磷酸酯键联被磷酸二酯键联替换。在一些实施例中，使用5′-甲基2′-MOE C。表A1中提供了所测试的某些寡核苷酸的描述。
表13B.某些寡核苷酸的示例数据。
各种DMD寡核苷酸在体外的DMD外显子53跳读的功效。数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率。示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005381
Figure BPA0000295055720005391
Figure BPA0000295055720005401
Figure BPA0000295055720005411
Figure BPA0000295055720005412
Figure BPA0000295055720005421
表14.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验(R1和R2)的结果。
Figure BPA0000295055720005422
Figure BPA0000295055720005431
表15.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率。
Figure BPA0000295055720005432
Figure BPA0000295055720005441
产生了另外的寡核苷酸，并体外测试了其在细胞中跳读DMD外显子53。某些数据示于下表16中。将寡核苷酸以3和10uM的浓度使用，一式两份。数字指示DMD外显子53的跳读百分比。如图所示，寡核苷酸可具有与各种化学格式结合的不同碱基序列。在一些实施例中，测试的寡核苷酸为20-mer，每个具有翼-核心-翼的缺口体格式，其中每个翼为2′-F，并且核心为2′-OMe或2′-OMe和2′-F的混合物。在一些实施例中，每个核苷酸间键联是Sp构型的手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含一个或多个5′-甲基2′-F C(5MSfC，
Figure BPA0000295055720005442
核苷是
Figure BPA0000295055720005443
其中BA是核碱基C，R2s是-F)。
表16.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005451
还设计、构建和测试了许多DMD寡核苷酸在分化的成肌细胞中在体外跳读DMD外显子53的功效。某些数据示于下表17中。将寡核苷酸以3和10μM的浓度裸式递送，进行两次生物学重复(R1和R2)。数字指示如通过RT-qPCR所确定的DMD外显子53的跳读百分比。
表17.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验(R1和R2)的结果。
3uM-R1 3uM-R2 10uM-R1 10uM-R2
WV-9422 2.1 2.0 6.2 4.3
WV-9743 4.1 2.4 7.3 6.2
WV-9744 3.4 1.9 4.4 5.1
WV-9745 2.7 2.4 5.6 6.2
模拟物 2.4 1.8 1.7 2.5
设计、构建和测试了许多寡核苷酸在Δ52分化的成肌细胞中在体外跳读DMD外显子53的功效。某些数据示于下表18中。在示例程序中，将细胞预分化4天，然后将寡核苷酸裸式递送4天。分化培养基是DMEM、2％马血清和10μg/ml胰岛素。在一些实施例中，对于某些寡核苷酸，在没有预分化这些细胞的情况下，跳读效率相对较低。将寡核苷酸以1、3和10μM的浓度裸式递送，进行生物学重复(R1和R2)。数字指示如通过RT-qPCR所确定的DMD外显子53的跳读百分比。PMO53是也称为WV-13405、HumDMDEx53或PMO(在DMD外显子53实验中)或PMOSR的寡核苷酸，其碱基序列为GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC并且是完全PMO(吗啉代)。
“-”指示没有该特定样品的可用数据。
表18.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示相对于对照的100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验(R1和R2)的结果。
Figure BPA0000295055720005461
Figure BPA0000295055720005471
设计、构建和测试了许多寡核苷酸在Δ45-52分化的成肌细胞中在体外跳读DMD外显子53的功效。下表19示出了针对SFSR9标准化的某些结果。将寡核苷酸以1、3和10μM的浓度裸式递送，进行生物学重复(R1和R2)。数字指示如通过RT-qPCR所确定的DMD外显子53的跳读百分比。
表19.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验(R1和R2)的结果。
Figure BPA0000295055720005472
Figure BPA0000295055720005481
进行了寡核苷酸的另外的测试，并且结果示于下表20和21中。
表20.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100.0表示100％跳读，而0.0表示0％效率；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005482
Figure BPA0000295055720005491
表21.某些寡核苷酸的示例数据。
在δ52细胞中体外测试寡核苷酸。A，显示10uM处的外显子跳读。B，蛋白质恢复。将不同的重复或实验称为a)、b)、和c)。
A.
Figure BPA0000295055720005492
Figure BPA0000295055720005493
Figure BPA0000295055720005494
Figure BPA0000295055720005495
Figure BPA0000295055720005501
B.
WV-9422 WV-9425 WV-9426 WV-9429 WV-9517
b)4 b)2 b)2 b)1 b)5
测试另外的DMD寡核苷酸其介导DMD外显子的跳读的能力(如以下显示)。完全PMO(吗啉代)寡核苷酸具有以下序列：
PMO SR WV-13405 GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC
PMO WV WV-13406 CTCCGGTTCTGAAGGTGTTC
PMO WV-13407 TGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGTA
WV-13407也称为PMO NS。
表21C.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示跳读效率，其中100表示100％跳读，而0表示0％跳读。示出了重复数据。
Figure BPA0000295055720005502
Figure BPA0000295055720005511
在一些实施例中，寡核苷酸(例如DMD寡核苷酸)被设计为靶向内含子剪接增强子元件，例如，对于外显子53跳读的DMD寡核苷酸，外显子53的4kb内的元件。在一些实施例中，提供的寡核苷酸是30-mer。表21D呈现了某些此类寡核苷酸的示例数据。
表21D.某些寡核苷酸的示例数据。
结果：在Δ45-52患者来源的成肌细胞中(分化后4天)裸式递送10μM内含子ASO。完成生物学重复。数字表示如通过RT-qPCR所确定的外显子跳读的百分比。
Figure BPA0000295055720005512
Figure BPA0000295055720005521
Figure BPA0000295055720005531
表21E.某些寡核苷酸的示例数据。
将预分化7d的Δ45-52 DMD患者来源的成肌细胞在自由摄取条件下、以指定浓度在肌肉分化培养基中用寡核苷酸处理，然后收集并通过qPCR分析RNA跳读效率(4d给药)。相对(SRSF9标准化)量化。以0至10μM的浓度测试寡核苷酸。示出了重复实验的结果。测试的某些寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联(WV-12887和WV-12880)。
Figure BPA0000295055720005532
Figure BPA0000295055720005541
表21F.某些寡核苷酸的示例数据。
将Δ45-52 DMD患者来源的成肌细胞在自由摄取条件下、以指定浓度在肌肉分化培养基中用寡核苷酸处理4d，并通过qPCR分析RNA跳读效率。
Figure BPA0000295055720005542
Figure BPA0000295055720005551
表21G.某些寡核苷酸的示例数据。
将预分化7d的Δ45-52 DMD患者来源的成肌细胞在自由摄取条件下、以指定浓度在肌肉分化培养基中用寡核苷酸处理4d，并通过qPCR分析RNA跳读效率。
Figure BPA0000295055720005552
Figure BPA0000295055720005561
表21H.某些寡核苷酸的示例数据。
测试了人肝匀浆在5天时间点的全长寡核苷酸稳定性。数字是重复，并表示剩余的全长寡核苷酸的百分比，其中100表示剩余100％寡核苷酸(完全稳定性)，而0表示剩余0％寡核苷酸(完全不稳定性)。一些测试的寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联。
Figure BPA0000295055720005562
Figure BPA0000295055720005571
Figure BPA0000295055720005572
表21I.某些寡核苷酸的示例数据。
数字指示相对于对照的跳读量。
Figure BPA0000295055720005573
Figure BPA0000295055720005581
Figure BPA0000295055720005582
表21I.1.某些寡核苷酸的示例数据。
各种DMD寡核苷酸的跳读效率，测试DMD外显子53的跳读。数字表示外显子53的跳读。
将Δ45-52患者成肌细胞分化7天，然后在分化培养基中裸式条件下用寡核苷酸处理4d。通过Trizol提取收获RNA并通过TaqMan分析跳读。
Figure BPA0000295055720005583
Figure BPA0000295055720005591
表21I.2.某些寡核苷酸的示例数据。
各种DMD寡核苷酸的跳读效率，测试DMD外显子53的跳读。数字表示外显子53的跳读。
在分化培养基中裸式条件下，用寡核苷酸处理Δ45-52患者成肌细胞4d(4天)。通过Trizol提取收获RNA并通过TaqMan分析跳读。
Figure BPA0000295055720005601
Figure BPA0000295055720005611
以高达30uM的多种浓度体外测试若干种寡核苷酸(包括WV-9517、WV-13864、WV-13835、和WV-14791)用于在HEK-蓝-TLR9细胞(16小时裸式摄取)中的TLR9活化。WV-13864和WV-14791包含Rp构型的手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。WV-9517、WV-13864、WV-13835、和WV-14791未表现出显著的TLR9活化(小于2-倍TLR9诱导；数据未显示)。与水相比，WV-13864和WV-14791在PBMC细胞因子释放测定中也表现出高达30uM的可忽略信号(数据未显示)。
靶向外显子54的示例肌营养不良蛋白寡核苷酸和组合物
在一些实施例中，本披露提供了用于在人DMD中靶向外显子54和/或介导外显子54跳读的寡核苷酸、寡核苷酸组合物及其使用方法。非限制性实例包括寡核苷酸、外显子54寡核苷酸的组合物(包括：WV-13745、WV-13746、WV-13747、WV-13748、WV-13749、WV-13750、WV-13751、WV-13752、WV-13753、WV-13754、WV-13755、WV-13756、WV-13757、WV-13758、WV-13759、WV-13760、WV-13784和WV-13785)，以及具有碱基序列(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他寡核苷酸。
表21J.某些寡核苷酸的示例数据。
各种DMD寡核苷酸的跳读效率，测试DMD外显子54的跳读。
Figure BPA0000295055720005612
Figure BPA0000295055720005621
靶向外显子55的示例肌营养不良蛋白寡核苷酸和组合物
在一些实施例中，本披露提供了用于在人DMD中靶向外显子55和/或介导外显子55跳读的寡核苷酸、寡核苷酸组合物及其使用方法。非限制性实例包括寡核苷酸、外显子55寡核苷酸的组合物(包括：WV-13761、WV-13762、WV-13763、WV-13764、WV-13765、WV-13766、WV-13767、WV-13768、WV-13769、WV-13770、WV-13771、WV-13772、WV-13773、WV-13774、WV-13775、WV-13776、WV-13777、WV-13778、WV-13779、WV-13786、和WV-13787)，以及具有碱基序列(裸序列)(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他寡核苷酸。
在一些实施例中，能以任何组合使用能够跳读或靶向外显子44、46、47、51、52、53、54和/或55的两个或更多个寡核苷酸来介导多个外显子跳读。
表21K.某些寡核苷酸的示例数据。
各种DMD寡核苷酸的跳读效率，测试DMD外显子55的跳读。
Figure BPA0000295055720005622
Figure BPA0000295055720005631
靶向外显子57的示例肌营养不良蛋白寡核苷酸和组合物
在一些实施例中，本披露提供了用于在人DMD中靶向外显子57和/或介导外显子57跳读的寡核苷酸、寡核苷酸组合物及其使用方法。非限制性实例包括寡核苷酸、外显子57寡核苷酸的组合物(包括：WV-18853、WV-18854、WV-18855、WV-18856、WV-18857、WV-18858、WV-18859、WV-18860、WV-18861、WV-18862、WV-18863、WV-18864、WV-18865、WV-18866、WV-18867、WV-18868、WV-18869、WV-18870、WV-18871、WV-18872、WV-18873、WV-18874、WV-18875、WV-18876、WV-18877、WV-18878、WV-18879、WV-18880、WV-18881、WV-18882、WV-18883、WV-18884、WV-18885、WV-18886、WV-18887、WV-18888、WV-18889、WV-18890、WV-18891、WV-18892、WV-18893、WV-18894、WV-18895、WV-18896、WV-18897、WV-18898、WV-18899、WV-18900、WV-18901、WV-18902、WV-18903、WV-18904).以及具有碱基序列(裸序列)(包含这些DMD寡核苷酸中的任一个的至少15个连续碱基)的其他寡核苷酸。
用于多个外显子的外显子跳读(多外显子跳读)的示例肌营养不良蛋白寡核苷酸和组 合物
在一些实施例中，本披露提供了用于剪接调节(包括多个外显子的跳读)的寡核苷酸、组合物和方法。在一些实施例中，DMD寡核苷酸或其组合物能够介导人或小鼠肌营养不良蛋白基因中多个外显子的跳读。
在一些实施例中，在患有肌肉营养不良的患者中，肌肉营养不良的症状可以通过施用能够跳读一个外显子或多个外显子的DMD寡核苷酸来至少部分缓解和/或至少部分地治疗障碍。不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出具有DMD外显子45至55缺失的BMD患者表现出较轻或无症状的表型。
图1示出了用于多个外显子跳读的方案的非限制性实例。在该图中，各种数字(43至57)指示外显子；并且这些外显子的形状(例如＜、＞或|)指示在每个外显子的5′和3′端表示哪个读框。通常，外显子44连接到外显子45。在多个外显子跳读的非限制性实例中，外显子45至55被跳读，从而允许外显子44加入外显子56。外显子44的3′端由与外显子56的5′端相同的读框(＜)表示；因此，跳读外显子45至55可维持或恢复正确的读框。在一些实施例中，跳读多个外显子可在以下情况下恢复读框：跳读的外显子之一包含改变读框的突变(在许多情况下，例如产生错义或提前截断的蛋白质)。
除其他事项外，本披露指出，各种外显子在其5′和/或3′端表示不同的读框；因此，跳读相邻读框的某些组合而不是其他组合能够保持或恢复读框。在一些实施例中，提供了用于多个外显子跳读的组合物和方法，作为非限制性实例，跳读外显子45-46、45-47、45-48、45-49、45-51、45-53、45-55、47-48、47-49、47-51、47-53、47-55、48-49、48-51、48-53、46-55、50-51、50-53、50-55、49-51、49-53、49-55、52-53、52-55、44-45、44-54、或44-56，其中在每种情况下多个外显子跳读维持或恢复正确的读框。在一些实施例中，跳读非重叠的外显子组能够维持或恢复读框，例如，跳读外显子45-46和外显子49-55；跳读外显子45-47和49-55；跳读外显子45-49和52-55；等。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，一些DMD外显子可以转录剪接，而其他DMD外显子可以转录后剪接。例如，据报道，外显子45至55不被同时剪接，而是先剪接为三组：外显子45至49、50至52和53至55，每个组中的单独的外显子被转录剪接。据报道，剩余的内含子(外显子44/45、49/50、52/53和55/56之间)随后在转录后被剪接。不希望受到任何特定理论的束缚，本披露注意到剪接时间的这种滞后可以被寡核苷酸利用，这些寡核苷酸能够增加其相邻的内含子在转录后被剪接的外显子(例如外显子44和56)之间的剪接。据报道，在自然界中，这种将外显子44连接至外显子56的多个外显子跳读以低的但可检测的频率(约1/600)发生。不希望受任何特定理论的束缚，本披露部分涉及能够在治疗和临床上显著水平跳读多个外显子的DMD寡核苷酸。
在一些实施例中，能够介导多个外显子跳读的组合物包含DMD寡核苷酸。在一些实施例中，能够介导多个外显子跳读的组合物包含(例如，两个或更多个不同的)DMD寡核苷酸的组合。在一些实施例中，能够介导多个外显子跳读的组合物包含(例如，两个或更多个不同的)DMD寡核苷酸的组合，其中至少一个寡核苷酸识别与待跳读的5′外显子的跳读相关的靶标，以及至少一个寡核苷酸识别与待跳读的3′外显子的跳读相关的靶标。在一些实施例中，能够介导多个外显子跳读的组合物包含寡核苷酸，该寡核苷酸能够识别以下两者：(1)与待跳读的5′外显子的跳读相关的靶标，和(2)与待跳读的3′外显子的跳读相关的靶标。
在一些实施例中，能够进行多个外显子跳读的组合物的优势在于其可用于治疗与被跳读的外显子组中包括的任何单独的外显子中的突变相关的营养不良。作为非限制性实例，能够介导外显子48跳读的DMD寡核苷酸仅能够治疗该外显子(或在一些情况下，邻近或附近的外显子)内的突变，而不能治疗其他外显子内的突变。然而，能够介导外显子45至55跳读的组合物能够治疗外显子45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55中任一个的突变。因此，外显子48突变的患者和外显子54突变的患者都可以用能够跳读外显子45至55的组合物进行治疗。在一些实施例中，能够介导外显子45至55跳读的组合物能够治疗高达约63％的DMD患者。
在一些实施例中，组合物包含一个或多个DMD寡核苷酸，其中该组合物能够介导多个(两个或更多个)DMD外显子的跳读。
在一些实施例中，MESO(包含一个或多个寡核苷酸的组合物，该组合物能够介导多个外显子跳读)相对于仅能够跳读一个外显子的DMD寡核苷酸具有优势。在一些实施例中，能够介导跳读单一外显子的组合物仅用于治疗通过跳读该外显子可治疗的患者(例如，在该外显子中具有基因损害的患者)。在一些实施例中，MESO可用于治疗能通过跳读MESO能够跳读的任何外显子而被治疗的患者(可能占患者群体的更大百分比)。在一些实施例中，双外显子或多个外显子跳读可能适用于90％的患者。
此外，在一些实施例中，由于外显子的5′和3′端有时不在同一框中，缺失这种外显子将引起移码。在各种此类情况下，跳读多个外显子可以恢复读框。
在一些实施例中，多个外显子跳读可用于治疗具有缺失、复制和无义突变的DMD患者。
此外，在一些实施例中，跳读多个外显子可以模拟较轻的贝克肌肉营养不良的遗传学。在一些实施例中，由一个外显子中的基因损害介导的更严重的杜氏肌肉营养不良可以被转化为由多个外显子的框内缺失介导的较轻的贝克肌肉营养不良。据报道，一些BMD患者和无症状者人的外显子48至51或外显子45至51缺失。Singh等人1997 Hum.Genet.[人类遗传学杂志]99：206-208；Melacini等人1993 J.Am.Col..Cardiol.[美国心脏病学会杂志]22：1927-1934；Melis等人1998 Eur.J.Paediatr.Neurol.[欧洲儿科神经病学杂志]2：255-261；以及Aartsma-Rus等人2003 Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]8：907-914。
在一些实施例中，某些外显子比其他外显子更具挑战性(challenging)。在一些实施例中，本披露提供例如通过化学修饰、键联磷立体化学及其组合来跳读此类外显子的技术。在一些实施例中，本披露涵盖了以下认识：多个外显子跳读对于跳读此类挑战性外显子(challenging exon)可能是有用的。在一些实施例中，本披露提供了用于跳读此类挑战性外显子的多种外显子跳读技术。
在一些实施例中，外显子跳读，例如DMD外显子跳读，可用于治疗具有环状或环形的RNA转录物(例如，DMD的那些)的患者，例如DMD患者。作为非限制性实例，报道了环状DMD转录物：Gualandi等人2003 J.Med.Gen.[医学遗传杂志]40：e100。
在一些实施例中，能够介导多个外显子跳读(MESO)的组合物包含一种能够介导多个外显子跳读的DMD寡核苷酸。在一些实施例中，能够介导多个外显子跳读(MESO)的组合物包含能够一起(例如，当组合使用时)介导多个外显子跳读的两种DMD寡核苷酸。在一些实施例中，能够介导多个外显子跳读(MESO)的组合物包含DMD寡核苷酸的混合品(例如，三种或更多种的混合物)，它们一起(例如，当组合用作混合品时)能够介导多个外显子的跳读。能够介导多个外显子跳读的寡核苷酸的组合或混合品已报道于例如：Yokota等人2009Arch.Neurol.[神经病学年鉴]66：32；Yokota等人2012 Nucl.Acid Ther.[核酸疗法]22：306；Adkin等人2012 Neur.Dis.[临床神经学]22：297-305；Echigoya等人2013Nucl.Acid.Ther.[核酸疗法]；以及Echigoya等人2015Molecular Therapy-Nucleic Acids[分子疗法-核酸]4：e225。除其他事项外，本披露通过例如选择的序列、化学修饰和/或键联磷化学等提供了更有效的组合。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，这些寡核苷酸在与其他寡核苷酸组合时，与组合之前任一单独的寡核苷酸相比，可以提供明显增加的活性。例如，在一些实施例中，本披露提供了DMD寡核苷酸，其单独地不能介导特定外显子的有效跳读；当与其他寡核苷酸组合时，此类寡核苷酸能够介导多个外显子的跳读。除其他事项外，本披露提供了组合疗法，其中两个或更多个寡核苷酸一起使用以提供所希望的和/或增强的特性和/或活性。当用于组合疗法中时，两种或多种药剂，例如寡核苷酸，可以同时施用或以合适的方式分开施用，以使其达到组合效果。在一些实施例中，组合中的两个或更多个寡核苷酸全部(大部分)用于跳读相同的外显子，并且它们的组合提供了这种外显子的增强的跳读，在一些实施例中显著大于其单独作用的相加。在一些实施例中，组合中的两个或更多个寡核苷酸用于跳读不同外显子，并且它们的组合提供了两个或更多个外显子的有效跳读(有时比寡核苷酸单独可以实现的跳读更多)。在一些实施例中，本披露提供寡核苷酸的组合，寡核苷酸的组合在两个或更多个不同的寡核苷酸之间具有协同作用。在一些实施例中，本披露提供了不同寡核苷酸的组合，其中一个或多个或每个寡核苷酸本身对于外显子跳读无效。某些组合描述于Adams等人2007 BMC Mol.Biol.[BMC分子生物学]8：57中。除其他事项外，本披露通过例如设计控制寡核苷酸的一个或多个或所有结构元件提供了更有效的组合。在一些实施例中，提供的组合提供了DMD外显子45的外显子跳读。在一些实施例中，提供的组合提供了另一种DMD外显子的外显子跳读，包括本文所述的那些或本领域已知的其他希望跳读(例如，用于预防或治疗一种或多种病症、疾病或障碍等)的那些。
在一些实施例中，例如，用于多个外显子跳读的寡核苷酸的混合、组合和混合物与可以进行相同或相当功能的单一寡核苷酸相比可能具有缺点，例如商品成本较高、制造和递送复杂、监管负担增加等。依照FDA规定，组合中的每个组分以及整个组合都需要分别进行毒性测试。在一些实施例中，本披露提供了单一寡核苷酸，其可以实现寡核苷酸组合的相同或相当的功能，并且可以通过对寡核苷酸的一种或多种结构元件(例如，化学修饰、立体化学及其组合)的精确和设计控制来替换寡核苷酸组合。
依照本披露，各种技术适合于评估多个外显子跳读。非限制性实例描述于实例20和图2中。
在一些实施例中，用于跳读多个DMD外显子的组合物包含能够跳读DMD外显子45的DMD寡核苷酸。如表1A所示，测试了各种DMD寡核苷酸跳读外显子45的能力。还测试了用于跳读外显子45的各种DMD寡核苷酸跳读多个外显子的能力，如表22A所示。除其他事项外，本披露证明了若干种寡核苷酸(包括WV-11088和WV-11089)可以提供低水平的外显子45-55的跳读(在外显子44和外显子56或44-56之间产生连接)。
在另一个实验中，寡核苷酸WV-11047、WV-11051至WV-11059在特定的测试条件下未表现出显著的跳读，并且寡核苷酸WV-11062至WV-11069均在特定测试条件下表现出可检测的跳读水平(＜1％)。在特定测试条件下，寡核苷酸WV-11091至WV-11096、WV-11098和WV-11100至WV-11105表现出＜.5％的外显子45跳读。
表22A.某些寡核苷酸的示例数据。
测试了寡核苷酸在Δ48-50细胞中跳读DMD外显子45的能力。
数字指示跳读水平，其中100表示100％跳读，而0表示0％跳读。
WV-11070 1.6
WV-11071 .3
WV-11072 .2
WV-11073 .7
WV-11074 2.2
WV-11075 .2
WV-11076 1.2
WV-11077 1.3
WV-11078 3.3
WV-11079 7.5
WV-11080 1.3
WV-11081 7.2
WV-11082 2.8
WV-11083 3.1
WV-11084 10.1
WV-11085 1.5
WV-11086 15.8
WV-11087 1.1
WV-11088 13
WV-11089 15.1
WV-11090 .9
若干种寡核苷酸(包括WV-11088和WV-11089)显示出可检测水平的多个外显子跳读(特别是外显子45-55)(约0.1％跳读)。
在另一个实验中，在Δ48-50中测试了靶向外显子45的各种DMD寡核苷酸跳读多个外显子(特别是45至53，从而在外显子44和外显子54或44-54之间产生连接)的能力。测试的寡核苷酸是：WV-11047、WV-11051、WV-11052、WV-11053、WV-11054、WV-11055、WV-11056、WV-11057、WV-11058、WV-11059、WV-11062、WV-11063、WV-11064、WV-11065、WV-11066、WV-11067、WV-11068、WV-11069、WV-11070、WV-11071、WV-11072、WV-11073、WV-11074、WV-11075、WV-11076、WV-11077、WV-11078、WV-11079、WV-11080、WV-11081、WV-11082、WV-11083、WV-11084、WV-11085、WV-11086、WV-11087、WV-11088、WV-11089、WV-11090、WV-11091、WV-11092、WV-11093、WV-11094、WV-11095、WV-11096、WV-11098、WV-11100、WV-11101。在一个实验中，所有这些寡核苷酸平均证明外显子44-54的跳读约0.05％或更少(数据未显示)。
还测试了靶向外显子45的寡核苷酸跳读外显子45至57，如表22A.1所示。
表22A.1.某些寡核苷酸的示例数据。
在Δ48-50中测试了寡核苷酸跳读DMD外显子45至57的能力，从而在外显子44和外显子58或44-58之间产生连接。数字指示跳读水平，其中100表示100％跳读，而0表示0％跳读。示出了此表和其他表中的重复数据。
Figure BPA0000295055720005701
Figure BPA0000295055720005711
Figure BPA0000295055720005721
在一些实施例中，DMD寡核苷酸靶向DMD外显子44或将内含子区域3’与DMD外显子44相连，并且能够介导多个外显子跳读。
在一些实施例中，DMD寡核苷酸靶向DMD外显子44或将内含子区域3’与DMD外显子44相连，并且该寡核苷酸能够介导(例如，外显子45至55、或45至57的)多个外显子跳读。
据报道，可能会发生一种称为反向剪接(back-splicing)的现象，其中例如外显子55的3′端的一部分与外显子45的5′端的一部分相互作用，形成环状RNA(circRNA)，从而可以跳读多个外显子，例如，从外显子45至55(包括端值)的所有外显子。据报道该现象也可能发生在外显子57和外显子45之间，跳读多个外显子，例如，从外显子45至57(包括端值)的所有外显子。反向剪接描述于文献中，例如在Suzuki等人2016 Int.J.Mol.Sci.[国际分子科学杂志]17中。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露提出，靶向DMD外显子44或将内含子区域3’与外显子44相连的DMD寡核苷酸可能可以介导外显子45至55的剪接或外显子45至57的剪接，这些外显子作为单个环状RNA(circRNA)切下，分别称为45-55(或55-45)或45-57(或57-45)。
设计了若干种寡核苷酸以靶向外显子44或内含子44或跨越外显子44和内含子44。在一些实施例中，测试设计用于靶向外显子44或内含子44、或跨越外显子44和内含子44的寡核苷酸，以确定它们是否可以增加回切(backslicing)和/或多个外显子跳读量。
如下表22A.2和表22A.3所示，测试靶向外显子44的DMD寡核苷酸增加circRNA 55-45的能力(例如，介导外显子45至55的多个外显子跳读)、或增加circRNA 57-45的能力(例如，介导外显子45至57的多个外显子跳读)。各种DMD寡核苷酸包括各种差异，尤其包括碱基序列和长度(18或20个碱基)。数字指示circRNA 55-45(表22A.2)或circRNA 57-45(表22A.3)的相对量。在此表和各种其他表中，Rep指示重复。
表22A.2.某些寡核苷酸的示例数据。
Figure BPA0000295055720005731
Figure BPA0000295055720005741
表22A.3.某些寡核苷酸的示例数据。
Figure BPA0000295055720005742
Figure BPA0000295055720005751
Figure BPA0000295055720005761
在一些实施例中，能够介导特定DMD外显子的外显子跳读的组合物包含两个或更多个靶向特定外显子的寡核苷酸。在一些实施例中，两个或更多个寡核苷酸的组合提供的跳读水平显著高于每个寡核苷酸单独地跳读水平的相加。在一些实施例中，两个或更多个寡核苷酸的组合提供显著的(1％，5％，10％或更多)和/或可检测的跳读水平，而每个寡核苷酸单独不提供可检测的跳读水平。已经在以下中报道了传统寡核苷酸的组合(例如，立体随机的寡核苷酸和/或本披露中描述的具有非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸)提供了某些改善的作用：例如，Wilton等人2007 Mol.Ther.[分子疗法]7：1288-1296(外显子10、20、34、65等)。除其他事项外，提供的组合包含至少一种寡核苷酸(其包含一个或多个手性受控的核苷酸间键联和/或一个或多个非负电荷的核苷酸间键联)，并可以提供显著增加的外显子跳读水平。
除其他事项外，本披露认识到某些外显子对于跳读特别具有挑战性。例如，在一个报道中，对于外显子47和57，单独的DMD寡核苷酸不能介导外显子跳读，但是成对的寡核苷酸能够介导外显子跳读。在一个报道中，外显子45的有效跳读通过结合两个单独对跳读该外显子无效的DMD寡核苷酸来介导。Aartsma-Rus等人2006 Mol.Ther.[分子疗法]14：401。Aartsma-Rus等人2006 Mol.Ther.[分子疗法]14：401。在一些实施例中，本披露提供了用于跳读此类具有挑战性的外显子的寡核苷酸(例如，手性受控的寡核苷酸)和组合物及其使用方法。用本文描述的化学修饰和/或立体化学技术，本披露提供了具有显著改善的外显子跳读效率的技术。在一些实施例中，本披露提供了用于对一个或多个对于跳读具有挑战性的外显子进行外显子跳读的单一寡核苷酸(例如，手性受控的寡核苷酸)及其组合物(例如，手性受控的寡核苷酸组合物)。在一些实施例中，本披露提供了用于对一个或多个对于跳读具有挑战性的外显子进行外显子跳读的寡核苷酸(例如，手性受控的寡核苷酸)及其组合物(例如，手性受控的寡核苷酸组合物)的组合。在一些实施例中，靶向相同外显子的DMD寡核苷酸的组合相对于单独的DMD寡核苷酸介导的外显子跳读水平增加。
在一些实施例中，组合物包含两个或更多个DMD寡核苷酸，其中每个单独的DMD寡核苷酸介导低水平的外显子跳读，而组合介导更高水平的跳读(高于每个寡核苷酸单独达到的水平的加和)。
在一些实施例中，组合物包含两个或更多个DMD寡核苷酸，其中这些寡核苷酸靶向不同的外显子。
在一些实施例中，靶向不同外显子的多个DMD寡核苷酸的组合能够介导跳读两个或更多个(例如，多种)外显子。
在一些实施例中，组合物包含两个或更多个DMD寡核苷酸。在一些实施例中，组合物包含两个或更多个DMD寡核苷酸，其中至少一个描述于本文或具有本文所述的碱基序列、立体化学或其他化学特征。
包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸可以提供显著改善的活性。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含一个或多个中性核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有以下结构：式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式。
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含三唑部分。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含任选地经取代的三唑基基团。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005771
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005772
的结构。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含经取代的三唑基基团。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005781
的结构，其中W是O或S。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联包含任选地经取代的炔基基团。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005782
的结构，其中W是O或S。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联)，该核苷酸间键联包含环状胍部分。在一些实施例中，核苷酸间键联包含环状胍且具有以下结构：
Figure BPA0000295055720005783
在一些实施例中，包含环状胍的核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联)是立体化学受控的。
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联是或包含选自以下的结构：
Figure BPA0000295055720005784
其中W是O或S。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，中性核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，包含含有环状胍部分的经修饰的核苷酸间键联的核酸或寡核苷酸是siRNA、双链siRNA、单链siRNA、缺口体、跳过体、嵌段体、反义寡核苷酸、antagomir、微小RNA、前微小RNs、antimir、supermir、核酶、U1衔接子、RNA激活子、RNAi剂、诱饵寡核苷酸、形成三链体的寡核苷酸、适体或助剂。
在一些实施例中，寡核苷酸包含中性核苷酸间键联和手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含中性核苷酸间键联和手性受控的核苷酸间键联，手性受控的核苷酸间键联是呈Rp或Sp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联和一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联的寡核苷酸，其中该寡核苷酸中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个中性核苷酸间键联和一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联的寡核苷酸，其中该寡核苷酸中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，中性核苷酸间键联比硫代磷酸酯核苷酸间键联(PS)更具疏水性，而硫代磷酸酯核苷酸间键联比磷酸二酯键联(天然磷酸酯键联，PO)更具疏水性。通常，不同于PS或PO，中性核苷酸间键联携带更少电荷。不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，将一个或多个中性核苷酸间键联掺入寡核苷酸中可以增加寡核苷酸被细胞摄取和/或寡核苷酸逸出内体的能力。不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，掺入一个或多个中性核苷酸间键联可用于调节寡核苷酸与其靶核酸之间的解链温度。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，将一个或多个非负电荷的核苷酸间键联(例如中性核苷酸间键联)掺入寡核苷酸中能够增加寡核苷酸介导如外显子跳读或基因敲低等功能的能力。在一些实施例中，能够改变靶基因中一个或多个外显子的跳读的寡核苷酸包含一个或多个中性核苷酸间键联。在一些实施例中，能够介导靶基因中一个或多个外显子的跳读的寡核苷酸包含一个或多个中性核苷酸间键联。在一些实施例中，能够介导一个或多个DMD外显子的跳读的寡核苷酸包含一个或多个中性核苷酸间键联。
在一些实施例中，能够介导核酸或由其编码的产物的水平的敲低的寡核苷酸包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，能够介导靶基因的表达敲低的寡核苷酸包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，能够介导靶基因的表达敲低的寡核苷酸包含一个或多个中性核苷酸间键联。
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联不是手性受控的。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是手性受控的。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是手性受控的且其键联磷为Rp。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联是手性受控的且其键联磷为Sp。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个中性核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联和/或中性核苷酸间键联各自任选地且独立地是手性受控的。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个非负电荷的核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个中性核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少一个非负电荷的核苷酸间键联/中性核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005801
的结构，其中W是O或S。在一些实施例中，至少一个非负电荷的核苷酸间键联/中性核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005802
的结构。在一些实施例中，至少一个非负电荷的核苷酸间键联/中性核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005803
的结构。在一些实施例中，至少一个非负电荷的核苷酸间键联/中性核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005804
的结构，其中W是O或S。在一些实施例中，至少一个非负电荷的核苷酸间键联/中性核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005805
的结构。在一些实施例中，至少一个非负电荷的核苷酸间键联/中性核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005806
的结构。在一些实施例中，至少一个非负电荷的核苷酸间键联/中性核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005807
的结构，其中W是O或S。在一些实施例中，至少一个非负电荷的核苷酸间键联/中性核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005811
的结构。在一些实施例中，至少一个非负电荷的核苷酸间键联/中性核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720005812
的结构。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含至少一个其中键联磷呈Rp构型的非负电荷的核苷酸间键联和至少一个其中键联磷呈Sp构型的非负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，能够增加靶基因的外显子的跳读频率的寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，能够增加靶基因的外显子的跳读频率的寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联，并且可用于治疗其中外显子包含有害或疾病相关突变的疾病。非限制性实例是DMD基因，其中包含突变的外显子的跳读导致肌肉营养不良。
设计和/或构建和/或测试了包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联/中性核苷酸间键联的各种寡核苷酸(包括DMD寡核苷酸)，例如WV-11343、WV-11344、WV-11345、WV-11346、WV-11347、WV-11237、WV-11238、WV-11239、WV-12130、WV-12131、WV-12132、WV-12133、WV-12134、WV-12135、WV-12136、WV-11340、WV-11341、WV-11342、WV-12123、WV-12124、WV-12125、WV-12126、WV-12127、WV-12128、WV-12129、WV-12553、WV-12554、WV-12555、WV-12556、WV-12557、WV-12558、WV-12559、WV-12872、WV-12873等。用于跳读外显子23并包含非负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联)的示例DMD寡核苷酸包括：WV-11343、WV-11344、WV-11345、WV-11346和WV-11347。用于跳读外显子51并包含非负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联)的示例DMD寡核苷酸包括：WV-11237、WV-11238、WV-11239、WV-12130、WV-12131、WV-12132、WV-12133、WV-12134、WV-12135和WV-12136。用于跳读外显子53并包含非负电荷的核苷酸间键联(例如中性核苷酸间键联)的示例DMD寡核苷酸包括：WV-11340、WV-11341、WV-11342、WV-12123、WV-12124、WV-12125、WV-12126、WV-12127、WV-12128、WV-12129、WV-12553、WV-12554、WV-12555、WV-12556、WV-12557、WV-12558、WV-12559、WV-12872和WV-12873。某些寡核苷酸在表A1中。
设计和/或构建了包含非负电荷的核苷酸间键联的另外的DMD寡核苷酸。这些包括用于跳读DMD外显子45的DMD寡核苷酸(WV-14528、WV-14529、WV-14532和WV-14533)。
本文的表1B.1和表1B.2显示了包含非负电荷的核苷酸间键联的各种DMD寡核苷酸在跳读DMD外显子45中的功效。
在本文的表21E、表21F、表21G和表21H中显示了包含非负电荷的核苷酸间键联的各种DMD寡核苷酸在跳读DMD外显子53中的功效。
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联可以被称为nX(如果是立体随机的)、或nS(手性受控且键联磷处于Sp构型)、或nR(是手性受控的且键联磷处于Rp构型)。
在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联可以被称为n001(如果是立体随机的)、或n001S(手性受控且键联磷处于Sp构型)、或n001R(是手性受控的且键联磷处于Rp构型)(例如，表A1中)。
构建了包含Rp构型的非负电荷的核苷酸间键联的各种DMD寡核苷酸，包括WV-12872、WV-13408、WV-12554、WV-13409、WV-12555和WV-12556。
构建了包含Sp构型的非负电荷的核苷酸间键联的各种DMD寡核苷酸，包括WV-12557、WV-12558、和WV-12559。
表21H、表21I、表21I.1和表21I.2示出了数据，该数据显示了包含Rp或Sp构型的非负电荷的核苷酸间键联的各种寡核苷酸的活性和稳定性
以高达30uM的多种浓度测试若干种寡核苷酸(包括WV-9517、WV-13864、WV-13835、和WV-14791)用于在HEK-蓝-TLR9细胞(16小时裸式摄取)中的TLR9活化。WV-13864和WV-14791包含Rp构型的手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。WV-9517、WV-13864、WV-13835和WV-14791未表现出显著的TLR9活化(数据未显示)。
设计和/或构建了靶向非DMD基因的若干种寡核苷酸，其包含非负电荷的核苷酸间键联。
以下呈现的是包含靶向DMD或Malat-1(Malat1)的环状胍部分的寡核苷酸。DMD寡核苷酸设计用于介导外显子23(在小鼠中)或外显子51或外显子53(在人中)的跳读。Malat-1寡核苷酸设计用于Malat1 mRNA的敲低，例如通过RNA酶H介导。
表22B.包含中性骨架的示例Malat-1寡核苷酸。
所有这些寡核苷酸均具有UGCCAGGCTGGTTATGACUC的碱基序列。
Figure BPA0000295055720005831
还设计、构建和/或测试了包含非负电荷的核苷酸间键联并靶向其他基因靶标的寡核苷酸的特性和活性，包括例如经由RNA酶H介导的敲低来降低靶mRNA和/或蛋白质水平的活性。此类寡核苷酸在降低靶标水平方面具有活性。
设计、构建和测试了各种Malat1寡核苷酸，这些寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联。各种Malat1寡核苷酸在翼和/或核心中包含1、2或3个非负电荷的核苷酸间键联。
表22C.Malat1寡核苷酸
此表中的所有寡核苷酸均具有UGCCAGGCTGGTTATGACUC的碱基序列。
Figure BPA0000295055720005832
Figure BPA0000295055720005841
Figure BPA0000295055720005851
Figure BPA0000295055720005861
表22D.Malat1寡核苷酸的数据
数字表示相对于HPRT1的Malat1 mRNA的敲低，其中1.000表示无(0.0％)敲低，而0.000表示100.0％敲低；示出了重复实验的结果。WV-9491是阴性对照，并非设计为靶向Malat1。
Figure BPA0000295055720005862
Figure BPA0000295055720005871
设计、构建和测试了各种Malat1寡核苷酸，这些寡核苷酸在核心包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联。在Malat1寡核苷酸的各种实施例中，Rp构型的硫代磷酸酯被非负电荷的核苷酸间键联替换。
表22E.Malat1寡核苷酸的数据
数字表示相对于HPRT1的Malat1 mRNA的敲低，其中1.000表示无(0.0％)敲低，而0.000表示100.0％敲低；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005872
Figure BPA0000295055720005881
设计、构建和测试了各种Malat1寡核苷酸，这些寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联。各种Malat1寡核苷酸包含1个或多个非负电荷的核苷酸间键联。
表22F.某些寡核苷酸的数据。
数字表示相对于HPRT1的Malat1 mRNA的敲低，其中1.000表示无(0.0％)敲低，而0.000表示100.0％敲低；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005882
设计、构建和测试了各种Malat1寡核苷酸，这些寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联。各种Malat1寡核苷酸包含1个或多个非负电荷的核苷酸间键联。在不同表和本文的全文中，在寡核苷酸标识中是否存在连字符是无关紧要的。例如，WV8582等效于WV-8582。
表22G.某些寡核苷酸的数据。
数字表示相对于HPRT1的Malat1 mRNA的敲低，其中1.000表示无(0.0％)敲低，而0.000表示100.0％敲低；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005883
Figure BPA0000295055720005891
设计、构建和测试了各种Malat1寡核苷酸，这些寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联。各种Malat1寡核苷酸包含1个或多个非负电荷的核苷酸间键联。
表22H.某些寡核苷酸的数据。
数字表示相对于HPRT1的Malat1 mRNA的敲低，其中1.000表示无(0.0％)敲低，而0.000表示100.0％敲低；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005892
Figure BPA0000295055720005893
Figure BPA0000295055720005901
在一些实施例中，设计、构建寡核苷酸，并针对不包含任何非负电荷的核苷酸间键联的合适的参考寡核苷酸进行体外测试，例如在iCell星形细胞(Astrocytes)中以若干种合适的剂量(例如，0、0.014、0.041、0.123、0.37、1.11、3.33、10uM)裸式进行合适的时间段(例如2天)。
表23、24和25呈现了实验结果。
表23.某些寡核苷酸的数据。
数字表示Malat1 mRNA的敲低，其中1.000表示无(0.0％)敲低，而0.000表示100.0％敲低；示出了重复实验的结果。
Figure BPA0000295055720005902
Figure BPA0000295055720005911
表24.某些Malat1寡核苷酸的IC50。
寡核苷酸 IC50
WV-8587 757nM
WV-9696 806nM
WV-11114 894nM
WV-11533 49nM
除其他事项外，本披露证明了包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸可以提供显著改善的活性(如表24所示)，就IC50而言可实现超过15倍的改善。
在另一个实验中，针对Malat1敲低(通过在RNA酶H的存在下对与测试的寡核苷酸互补的Malat1 RNA(WV-7772)丰度的降低来测量)，评估了若干种Malat1寡核苷酸(包括WV-11533，包含三个中性核苷酸间键联)。
Figure BPA0000295055720005912
Figure BPA0000295055720005921
在45分钟的时间点，在RNA酶H和WV-11533或WV-8587的存在下，剩余的Malat1 RNA不到20％，指示超过80％敲低；以及在RNA酶H和WV-8556(立体随机的且不包含中性骨架)的存在下，剩余约60％的Malat1 RNA。除其他事项外，本披露证明了包含非负电荷的核苷酸间键联和/或手性受控的核苷酸间键联的寡核苷酸在降低靶核酸水平(例如通过RNA酶H介导的敲低)中显示出显著改善的活性。
还测试了某些寡核苷酸在0、1和2天在大鼠肝匀浆中的稳定性。对于WV-11533和WV-8587，在2天时仍然剩余超过80％的全长寡核苷酸；剩余约40％的立体随机的WV-8556。
还用Malat1 RNA(WV-7772)测试了寡核苷酸的Tm。测试条件的一组实例：1X PBS(pH 7.2)中1μM双链体；温度范围：15℃-90℃；升温速率：0.5℃/min；测量间隔：0.5℃。结果示出用WV-7772的以下双链体Tm(℃)：WV-8556，73.52；WV-8587，69.57；和WV-11533，68.67。
在一些实施例中，包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸提供改善的剪接调节活性。制备和/或测试了多种用于介导DMD中外显子跳读的寡核苷酸，其中这些寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联。表A1中列出了包含非负电荷的核苷酸间键联的某些寡核苷酸。
表25A.某些寡核苷酸的示例数据。
数字指示外显子跳读水平；例如，第2列第2行的27.13表示DMD外显子的跳读量为27.13％。在细胞上以10或3uM对寡核苷酸进行了体外测试。
Figure BPA0000295055720005931
表25B.某些寡核苷酸的示例数据。
数字指示相对于对照的跳读水平；数字为近似值。在细胞上以10或3uM对寡核苷酸进行了体外测试。
PMO指示全PMO寡核苷酸。
模拟物 WV-11237 WV-3152 WV-3516 PMO
10uM 1 49 35 7 3
3uM 1 22 16 3 2
构建了用于在小鼠中跳读外显子23的各种DMD寡核苷酸，其中的若干种包含非负电荷的核苷酸间键联，包括WV-11343、WV-11344、WV-11345、WV-11346和WV-11347。如下表所示，测试了这些寡核苷酸并证明了外显子23的跳读。
表25C.1.某些寡核苷酸的示例数据。
数字表示相对于对照的外显子23跳读水平。
10uM 3.3uM
WV-7684 5 2
WV-10256 25 13
WV-11343 44 33
WV-10257 16 10
WV-11344 42 29
WV-10258 22 20
WV-11345 48 39
WV-10259 24 10
WV-11346 43 32
WV-10260 23 14
WV-11347 43 32
在某些实验中，将del45-52细胞(患者来源的成肌细胞)用各种寡核苷酸(包括WV-13405(PMO)、WV-9517和WV-9898)在肌肉分化培养基中、以15、10、3.3、1.1、.3、.1和0uM、在自由摄取条件下处理6天，然后收集，并通过蛋白质印迹法分析肌营养不良蛋白质恢复。WV-9517和WV-9898在3.3uM和更高的浓度下显示出显著的DMD产生；WV-13405在3.3uM的浓度下没有显示出明显的DMD产物，但是在10和15uM的浓度下却显示了DMD产生。对照是黏着斑蛋白(Vinculin)。
如表25D中所示，构建了另外的寡核苷酸，其能够介导外显子53的跳读并且包含至少一个中性核苷酸间键联。
构建了用于在小鼠中跳读外显子23的各种另外的DMD寡核苷酸。如下表所示，测试了这些寡核苷酸并证明了外显子23的跳读。
表25C.2.某些寡核苷酸的示例数据。
体外测试了DMD寡核苷酸在H2K鼠细胞中跳读DMD外显子23的能力。寡核苷酸递送是裸式递送，并且使用4天的处理。
数字表示相对于对照的外显子23跳读水平。100.0表示100％转录物跳读；0表示0％转录物跳读。示出了来自重复的数据。
Figure BPA0000295055720005951
表25C.3.某些寡核苷酸的示例数据。
体外测试了DMD寡核苷酸在H2K鼠细胞中跳读DMD外显子23的能力。寡核苷酸递送是裸式递送，并且使用4天的处理。
数字表示相对于对照的外显子23跳读水平。100.0表示100％转录物跳读；0表示0％转录物跳读。示出了来自重复的数据。
Figure BPA0000295055720005952
Figure BPA0000295055720005961
表25C.4.某些寡核苷酸的示例数据。
体外测试了DMD寡核苷酸在H2K鼠细胞中跳读DMD外显子23的能力。寡核苷酸递送是裸式递送，并且使用4天的处理。一些测试的寡核苷酸包含一个或多个LNA。
数字表示相对于对照的外显子23跳读水平。100.0表示100％转录物跳读；0表示0％转录物跳读。示出了来自重复的数据。
Figure BPA0000295055720005962
表25C.5.某些寡核苷酸的示例数据。
体外测试了DMD寡核苷酸在H2K鼠细胞中跳读DMD外显子23的能力。寡核苷酸递送是裸式递送，并且使用4天的处理。一些测试的寡核苷酸包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联。
数字表示相对于对照的外显子23跳读水平。100.0表示100％转录物跳读；0表示0％转录物跳读。示出了来自重复的数据。
Figure BPA0000295055720005963
Figure BPA0000295055720005971
表25C.6.某些寡核苷酸的示例数据。
体外测试了靶向Malat-1的寡核苷酸(其中这些寡核苷酸包含非负电荷的核苷酸间键联)在4天的处理后敲低GABA神经元中Malat-1的能力。数字表示相对于HPRT1对照和水的Malat-1水平，其中1.0表示100％Malat-1水平(0％敲低)，而0表示0％Malat-1水平(100％敲低)。测试的浓度(Conc.)以[Log(剂量uM)]提供。
示出了来自重复的数据。
Figure BPA0000295055720005972
Figure BPA0000295055720005981
WV-24104的IC50是132nM；而WV-24109的IC50是12nM。
表25D.某些寡核苷酸的示例数据。
将D45-52成肌细胞用10和3uM寡核苷酸处理4天。
此表和各种其他表中的数字指示相对于对照的跳读量。
Figure BPA0000295055720005982
Figure BPA0000295055720005991
Figure BPA0000295055720005992
Figure BPA0000295055720005993
构建了包含手性受控的中性骨架的各种DMD寡核苷酸，包括WV-12555(包含Rp构型的中性核苷酸间键联)和WV-12558(包含Sp构型的中性核苷酸间键联)。如表25E所示，还针对跳读DMD外显子对这些进行了测试。
表25E.某些寡核苷酸的示例数据。
将D45-52成肌细胞用10和3uM寡核苷酸处理4天。将寡核苷酸裸式递送。数字表示相对于对照的跳读量。
Figure BPA0000295055720006001
在一些实施例中，外显子跳读效率提高了＞2倍。
表25F.某些寡核苷酸的示例数据。
将各种用于跳读外显子53或51的DMD寡核苷酸在组织裂解液中孵育5天；通过LC-MS检测全长寡核苷酸。数字表示剩余的全长寡核苷酸的百分比。在孵育5d后，人和MDX肌肉裂解液中剩余超过75％的寡核苷酸。数据来自先前对WV-3473进行的实验，其中在MDX肌肉裂解液中孵育2d。ND：未确定的；未在人肌肉裂解液中进行WV-3473稳定性。
Figure BPA0000295055720006002
Figure BPA0000295055720006011
在一些实施例中，包含中性核苷酸间键联(例如，环状胍型)的寡核苷酸与不包含这种中性核苷酸间键联的相应寡核苷酸相比，表现出更高水平的外显子跳读。
在一些实施例中，本披露涉及能够介导单链RNA干扰的寡核苷酸或寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸或寡核苷酸组合物包含非负电荷的核苷酸间键联。
如本文所述，构建了包含非负电荷的核苷酸间键联并靶向若干个不同基因中任一个的各种寡核苷酸(具有不同的碱基序列、糖修饰模式、骨架化学、以及骨架核苷酸间键联的立体化学模式)，包括但不限于靶向C9orf72(与DMD不同的基因，或Malat1)的各种寡核苷酸。
本文描述了靶向C9orf72(其是与本文提及的其他基因不同的基因)并且包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸的各种非限制性实例。
据报导，C9orf72基因中的六核苷酸重复扩增(染色体9，可读框72)是肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)的最常见遗传原因。包含重复扩增的C9orf72基因变体和/或其产物也与其他C9orf72相关障碍有关，如皮质基底节变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征、橄榄体桥脑小脑变性(OPCD)、原发性侧索硬化症(PLS)、进行性肌萎缩症(PMA)、亨廷顿氏病(HD)拟表型、阿尔兹海默病(AD)、双相障碍、精神分裂症及其他非运动病症。设计和构建了各种寡核苷酸，其包含中性核苷酸间键联并靶向C9orf72靶标(例如，C9orf72寡核苷酸)并且能够敲低或降低C9orf72靶基因和/或其基因产物(转录物、特别是含有重复扩增的转录物，蛋白质等)的表达、水平和/或活性。
设计为靶向C9orf72并包含非负电荷的核苷酸间键联的各种寡核苷酸包括但不限于：WV-11532、WV-13305、WV-13307、WV-13309、WV-13311、WV-13312、WV-13313、WV-13803、WV-13804、WV-13805、WV-13806、WV-13807、WV-13808、WV-14553、和WV-14555。这些描述于下表25G中。
表25G.包含中性核苷酸间键联的靶向C9orf72的寡核苷酸。
Figure BPA0000295055720006021
Figure BPA0000295055720006031
Figure BPA0000295055720006041
C9orf72基因产生了C9orf72 mRNA的若干种变体：V2(不包含有害的六核苷酸重复序列，并且占所有转录物的约90％)；V3(包含六核苷酸重复，并且占所有转录物的约9％)；以及V1(包含六核苷酸重复，并且占所有转录物的约1％)。
据报导，六核苷酸重复引发至少部分地由二肽重复蛋白和病灶形成所介导的功能获得性毒性，病灶由例如含有重复扩增的转录物、和/或剪接掉的含有重复扩增的内含子、和/或含有重复扩增的区域和各种核酸结合蛋白的反义转录形成。
WV-8008和WV-11532都具有相同的碱基序列(或裸序列)CCTCACTCACCCACTCGCCA。它们的不同之处尤其在于后者包含3个连续的中性核苷酸间键联(Xn)，而前者不包含任何中性核苷酸间键联。这些寡核苷酸的结构在下表25H中提供。
表25H.C9orf72寡核苷酸。
Figure BPA0000295055720006051
测试了WV-8008和WV-11532与总转录物(所有V)相比，敲低包含六核苷酸的(即，疾病相关的)转录物V3的表达的能力，如下表25I所示。
表25I和J.各种c9orf72寡核苷酸的活性。
在表25I至25J中，在运动神经元中测试各种c9orf72寡核苷酸，其中将寡核苷酸以0.003至10μM之间的浓度(浓度以exp10的形式提供)裸式递送。测试的c9orf72寡核苷酸WV-11532包含三个中性核苷酸间键联。在表14A及表14B中，示出用c9orf72寡核苷酸处理后，c9orf72转录物[例如所有转录物(所有V)或仅V3]相对于HPRT1的剩余水平，其中1.000将表示100％相对转录物水平(无敲低)且0.000将表示0％相对转录物水平(例如100％敲低)。示出了重复实验的结果。
表25I.各种c9orf72寡核苷酸的活性(所有V C9orf72转录物的剩余水平)
Figure BPA0000295055720006052
Figure BPA0000295055720006061
表25J.各种c9orf72寡核苷酸的活性(V3 C9orf72转录物的剩余水平)
Figure BPA0000295055720006062
如本文和未显示的数据所述，构建了包含非负电荷的核苷酸间键联并靶向不同基因的各种寡核苷酸(具有不同的碱基序列、糖修饰模式、骨架化学、以及骨架核苷酸间键联的立体化学模式)，包括但不限于靶向DMD、Malat1、或C9orf72的各种寡核苷酸。
还构建了包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸，以靶向本文未描述的六个其他基因(其中这六个基因不是DMD、Malat1或C9orf72)；这些寡核苷酸包括设计为靶向这些基因，并降低该基因或其基因产物的表达、水平和/或活性的寡核苷酸。本文所述的包含中性核苷酸间键联的这些和各种寡核苷酸能够执行多种功能，包括降低基因或其基因产物的水平、表达和/或活性(例如，经由RNA酶H或空间位阻介导的机制，或经由单链RNA干扰介导的机制)以及诱导外显子的跳读(例如，跳读调节)。
不希望受任何特定理论的束缚，申请人注意到，非负电荷的核苷酸间键联和/或中性核苷酸间键联可以改善寡核苷酸进入细胞和/或从内体逃逸。
包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸可以提供所希望水平的TLR9活化
除其他事项外，包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸可提供所希望水平的特性和/或活性，例如TLR9拮抗剂或激动剂活性。在一些实施例中，包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸与具有相同碱基序列但不具有非负电荷的核苷酸间的某些相当的寡核苷酸相比，在人和/或动物模型(例如，小鼠)中表现出较低水平的TLR9活化。在一些实施例中，包含非负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸与具有相同碱基序列但不具有非负电荷的核苷酸间键联的某些寡核苷酸相比，具有较低的毒性。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联在CpG基序内，并且是在C和G之间的核苷酸间键联。
在实验中，构建了针对靶基因C的若干种寡核苷酸。基因C是与DMD不同的基因，或SMalat-1。这些寡核苷酸的序列包含CpG，其是已知活化TLR9的基序。
表25K.
此实验表示在HEK293细胞中诱导人TLR9或小鼠TLR9的测试。数字表示相对于阴性对照(水)的相对诱导。测试的浓度：0.93uM、2.77uM、8.33uM、25uM、75uM。阳性对照：WV-BZ21。实验以生物学重复进行。
表25K.此研究中使用的寡核苷酸
Figure BPA0000295055720006071
Figure BPA0000295055720006081
表25L.某些寡核苷酸的活性。
所有测试的寡核苷酸(WV-HZ12、WV-BZ761、WV-BZ762、WV-BZ763、WV-BZ764、WV-BZ765、WV-BZ766、WV-BA207、WV-BA208、和WV-BA209)靶向基因C，并且所有都具有碱基序列，其中每个碱基一般用N表示，除了指示单个CpG基序。阳性对照WV-BZ21具有TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT的碱基序列，其包含多个CpG基序，并且并未设计为靶向基因C。数字指示相对于水的hTLR9活性的相对诱导。
Figure BPA0000295055720006082
Figure BPA0000295055720006091
表25M.某些寡核苷酸的活性。
还测试了这些寡核苷酸对小鼠TLR9的诱导。
数字指示相对于水的mTLR9活性的相对诱导。
Figure BPA0000295055720006092
Figure BPA0000295055720006101
在一些实施例中，在一些情况下观察到，以上不诱导可察觉的TLR9活化或诱导非常低水平的TLR9活化的某些寡核苷酸模拟针对人或小鼠TLR9。
包含另外的部分的示例寡核苷酸
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含一个或多个另外的部分，例如靶向部分、碳水化合物部分等。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其包含一个或多个磺酰胺部分。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个磺酰胺部分。在一些实施例中，本披露提供了可以调节剪接的寡核苷酸，例如可以调节外显子跳读的DMD寡核苷酸，其中这些寡核苷酸包含一个或多个磺酰胺部分。在一些实施例中，本披露提供了介导DMD外显子23、45、51或53或多个DMD外显子的跳读的寡核苷酸，其中这些寡核苷酸包含一个或多个磺酰胺部分。
在一些实施例中，磺酰胺部分具有或包含-L-SO2N(R1)2的结构。在一些实施例中，磺酰胺部分具有或包含-SO2N(R1)2的结构。在一些实施例中，磺酰胺部分具有或包含-Cy-SO2N(R1)2的结构。在一些实施例中，-Cy-是芳族的。在一些实施例中，-Cy-是任选地经取代的苯环。在一些实施例中，-Cy-是
Figure BPA0000295055720006111
在一些实施例中，-Cy-是任选地经取代的杂芳基环。在一些实施例中，-Cy-是具有1-4个杂原子的任选地经取代的5-6元杂芳基环。在一些实施例中，-Cy-是
Figure BPA0000295055720006112
在一些实施例中，每个R1是-H。
磺酰胺部分可以依照本披露经由各种合适的接头(例如，本文和/或WO/2017/062862中所述的那些，其接头通过引用并入本文)连接至寡核苷酸链。示例磺酰胺部分(包括单、双和三磺酰胺部分)描述如下：
Figure BPA0000295055720006113
在一些实施例中，寡核苷酸包含经修饰的核苷酸间键联和磺酰胺部分(任选地通过接头)。在一些实施例中，包含经修饰的核苷酸间键联和磺酰胺部分的寡核苷酸是siRNA、双链siRNA、单链siRNA、缺口体、跳过体、嵌段体、反义寡核苷酸、antagomir、微小RNA、前微小RNs、antimir、supermir、核酶、U1衔接子、RNA激活子、RNAi剂、诱饵寡核苷酸、形成三链体的寡核苷酸、适体或助剂。在一些实施例中，本披露提供了包含经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸，该经修饰的核苷酸间键联包含磺酰胺。在一些实施例中，寡核苷酸包含磺酰胺和手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含磺酰胺和手性受控的核苷酸间键联，该手性受控的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及包含磺酰胺部分或其衍生物或变体的寡核苷酸。在一些实施例中，本披露涉及寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸包含磺酰胺部分或其衍生物或变体，并且该寡核苷酸包含至少一个手性受控的核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露涉及包含磺酰胺部分或其衍生物或变体的寡核苷酸，其中该寡核苷酸能够介导靶基因或其基因产物的表达、水平和/或活性的降低。
在一些实施例中，本披露涉及包含磺酰胺部分或其衍生物或变体的寡核苷酸，其中该寡核苷酸能够介导靶基因外显子跳读的调节。在一些实施例中，本披露涉及包含磺酰胺部分或其衍生物或变体的寡核苷酸，其中该寡核苷酸能够增加靶基因的外显子跳读。
可用于剪接调节(例如外显子跳读)的包含磺酰胺部分的示例寡核苷酸包括WV-3548、WV-3366等。设计、构建和/或测试了包含磺酰胺部分的其他寡核苷酸的各种活性。例如，包含“单磺酰胺”部分的寡核苷酸，例如WV-2836、WV-7419、WV-7421、WV-7422、WV-7408、WV-7409、WV-7427、WV-7863、和WV-7864；包含“双磺酰胺”的寡核苷酸，WV-7423；以及包含“三磺酰胺”的寡核苷酸，WV-7417。
表26A.某些Malat1寡核苷酸。
Figure BPA0000295055720006121
Figure BPA0000295055720006131
Figure BPA0000295055720006141
Figure BPA0000295055720006151
对于此表，描述与表A1中的那些描述匹配，并且
Mod045：
Figure BPA0000295055720006152
Mod046：
Figure BPA0000295055720006153
Mod047：
Figure BPA0000295055720006154
Mod048：
Figure BPA0000295055720006155
Mod049：
Figure BPA0000295055720006156
Mod054：
Figure BPA0000295055720006157
在这些Mod中，-C(O)-连接至接头(例如L001)的-NH-。
测试了包含磺酰胺部分的寡核苷酸敲低Malat1的能力。将测试的寡核苷酸裸式递送至Δ48-50患者来源的肌管，并按3，1、0.3和0.1μM的浓度给药。使细胞分化4天(例如，该实验是分化后4天)。使用qPCR评估Malat-1的敲低。结果示于表26B中。
表26B.Malat1寡核苷酸的示例数据。
数字表示相对的Malat-1 mRNA水平。
Figure BPA0000295055720006161
测试了多种Malat1寡核苷酸(其中许多包含磺酰胺部分)在预分化肌管中敲低Malat1的能力。某些数据示于下表26C中。在以1和0.1μM浓度给药前，将Δ48-50患者来源的成肌细胞分化4天。在处理后48小时收获RNA用于测量。
表26C.Malat1寡核苷酸的示例数据。
数字表示相对的Malat-1 mRNA水平。数字为近似值。
Figure BPA0000295055720006162
Figure BPA0000295055720006163
Figure BPA0000295055720006171
在一些实验中，向动物给药寡核苷酸，包括包含磺酰胺部分的一些寡核苷酸，然后将动物处死并测试其组织中的寡核苷酸水平。
在一些实验中，使用了以下方案：动物：32只雄性Mdx小鼠和32只雄性C57BL/6小鼠(均为8-10周龄)。到达后，使测试动物适应设施至少3天。给药：S.C.在第1、3和5天(5mL/kg)进行(皮下)给药。尸体剖检：最后一次SC注射后72小时，对动物实施安乐死。所有动物均用PBS灌注。收集以下组织：脑、坐骨神经、脊髓、眼睛、肝脏、肾脏、脾脏、心脏、膈肌、腓肠肌、四头肌和三头肌、白色脂肪、棕色脂肪。将新鲜的组织用PBS短暂漂洗、轻轻吸干、称重并在2-mL管中的液氮中速冻，并在-80C保存(在干冰上)。组织学：四头肌和肾脏在10％福尔马林中后固定并加工成片(石蜡包埋的切片)。在一些实验中，使用了此方案的合适变体。
某些结果显示于表27、28和29中。
表27.各种组织中的敲低和寡核苷酸存在。
数字指示相对于mHprt(mHPRT或mHPRT1)的Malat1 mRNA水平，以及寡核苷酸的存在(ug/g)。实验程序：研究物种：5-6周的MDX小鼠；途径：皮下；#剂量：QD，3天；最后一次剂量的时间点：2天；每日剂量水平(ug)：12.5mg/kg。
Figure BPA0000295055720006172
表28.各种组织中的敲低和寡核苷酸存在。
数字指示相对于mHprt的Malat1 mRNA水平，以及寡核苷酸的存在(ug/g)。实验程序：研究物种：10-12周的MDX小鼠；途径：皮下；#剂量：QD，3天；最后一次剂量的时间点：3天；和每日剂量水平(ug)：12mg/kg。
Figure BPA0000295055720006181
Figure BPA0000295055720006182
表29.各种组织中的敲低和寡核苷酸存在。
数字指示相对于mHprt的Malat1 mRNA水平，以及寡核苷酸的存在(ug/g)。实验程序：研究物种：10-12周重量小鼠；途径：皮下；#剂量：QD，3天；最后一次剂量的时间点：3天；和每日剂量水平(ug)：12mg/kg。
Figure BPA0000295055720006191
Figure BPA0000295055720006192
表30.各种组织中的敲低和寡核苷酸存在。
数字指示相对于mHprt的Malat1 mRNA水平，以及寡核苷酸的存在(ug/g)。实验程序：研究物种：5-6周重量小鼠；途径：皮下；#剂量：QD，1天；最后一次剂量的时间点：3天；和每日剂量水平(ug)：200mg/kg。
Figure BPA0000295055720006201
Figure BPA0000295055720006202
用于制备寡核苷酸和组合物的示例方法
除其他事项外，本披露提供了用于制备寡核苷酸和寡核苷酸组合物(包括手性受控的寡核苷酸和手性受控的寡核苷酸核苷酸)的技术(方法、试剂、条件、纯化方法等)。如本文所述，可以依照本披露，利用各种技术(方法、试剂、条件、纯化方法等)制备提供的寡核苷酸及其组合物，包括但不限于以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO2018/237194、和/或WO 2019/055951，其各自的制备技术通过引用并入本文。
在一些实施例中，本披露提供了手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过50％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约55％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约60％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约65％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约70％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约75％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约80％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约85％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约90％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约91％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约92％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约93％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约94％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约95％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约96％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约97％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约98％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约99％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约99.5％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约99.6％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约99.7％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约99.8％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过约99.9％。在一些实施例中，提供的手性受控的寡核苷酸的纯度超过至少约99％。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是设计为包含单一寡核苷酸类型的组合物。在某些实施例中，此类组合物是约50％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约50％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约50％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约55％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约60％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约65％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约70％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约75％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约80％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约85％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约90％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约91％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约92％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约93％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约94％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约95％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约96％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约97％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约98％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约99％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约99.5％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约99.6％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约99.7％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约99.8％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是约99.9％非对映异构体纯的。在一些实施例中，此类组合物是至少约99％非对映异构体纯的。
除其他事项外，本披露认识到寡核苷酸的立体选择性(而非立体随机或外消旋)制备的挑战。除其他事项外，本披露提供了立体选择性制备包含多个(例如，超过5、6、7、8、9、或10个)核苷酸间键联的寡核苷酸，并且特别地包含多个(例如，超过5、6、7、8、9、或10个)手性核苷酸间键联的寡核苷酸的方法和试剂。在一些实施例中，在寡核苷酸的立体随机或外消旋制剂中，形成具有小于90∶10、95∶5、96∶4、97∶3、或98∶2非对映选择性的至少一个手性核苷酸间键联。在一些实施例中，对于立体选择性或手性受控的寡核苷酸制剂，形成具有大于90∶10、95∶5、96∶4、97∶3、或98∶2非对映选择性的每个手性核苷酸间键联。在一些实施例中，对于立体选择性或手性受控的寡核苷酸制剂，形成具有大于95∶5非对映选择性的每个手性核苷酸间键联。在一些实施例中，对于立体选择性或手性受控的寡核苷酸制剂，形成具有大于96∶4非对映选择性的每个手性核苷酸间键联。在一些实施例中，对于立体选择性或手性受控的寡核苷酸制剂，形成具有大于97∶3非对映选择性的每个手性核苷酸间键联。在一些实施例中，对于立体选择性或手性受控的寡核苷酸制剂，形成具有大于98∶2非对映选择性的每个手性核苷酸间键联。在一些实施例中，对于立体选择性或手性受控的寡核苷酸制剂，形成具有大于99∶1非对映选择性的每个手性核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的手性核苷酸间键联的非对映选择性可通过模型反应测量，例如在基本上相同或相当的条件下形成二聚体，其中二聚体与手性核苷酸间键联具有相同的核苷酸间键联、二聚体的5′-核苷与手性核苷酸间键联的5′-端的核苷相同、二聚体的3′-核苷与手性核苷酸间键联的3′-端的核苷相同。
在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸组合物是设计为包含多种寡核苷酸类型的组合物。在一些实施例中，本披露的方法允许产生手性受控的寡核苷酸文库，使得预选量的任何一种或多种手性受控的寡核苷酸类型可以与任何一种或多种其他手性受控的寡核苷酸类型混合，以产生手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，预选量的寡核苷酸类型是具有任一种上述非对映异构体纯度的组合物。
在一些实施例中，本披露提供了用于制得手性受控的寡核苷酸的方法，该方法包括以下步骤：
(1)偶联；
(2)加帽；
(3)任选地修饰；
(4)去封闭；以及
(5)重复步骤(1)-(4)，直至实现所希望的长度。
在一些实施例中，本披露提供了例如用于制备寡核苷酸的方法，该方法包括一个或多个循环，每个循环独立地包含：
(1)偶联步骤；
(2)任选地，修饰前加帽步骤；
(3)修饰步骤；
(4)任选地，修饰后加帽步骤；以及
(5)任选地去封闭步骤。
在一些实施例中，循环包括一个或多个修饰前加帽步骤。在一些实施例中，循环包括一个或多个修饰后加帽步骤。在一些实施例中，循环包括一个或多个修饰前和修饰后加帽步骤。在一些实施例中，循环包括一个或多个解封步骤。在一些实施例中，循环包含偶联步骤、修饰前加帽步骤、修饰步骤、修饰后加帽步骤、和去封闭步骤。在一些实施例中，循环包含偶联步骤、修饰前加帽步骤、修饰步骤、和去封闭步骤。在一些实施例中，循环包含偶联步骤、修饰步骤、修饰后加帽步骤、和去封闭步骤。在一些实施例中，包含偶联步骤、修饰前加帽步骤、修饰步骤、修饰后加帽步骤、和去封闭步骤。在一些实施例中，一个或多个循环包含偶联步骤、修饰前加帽步骤、修饰步骤、和去封闭步骤。在一些实施例中，一个或多个循环包含偶联步骤、修饰步骤、修饰后加帽步骤和去封闭步骤。
当描述提供的方法时，“循环”一词具有本领域普通技术人员所理解的普通含义。在一些实施例中，步骤(1)-(4)的一个轮回称为循环。在一些实施例中，一些循环包含修饰。在一些实施例中，一些循环不包含修饰。在一些实施例中，一些循环包含修饰并且一些循环不包含修饰。在一些实施例中，每个循环独立地包含修饰步骤。在一些实施例中，每个循环不包含循环步骤。
在一些实施例中，为了形成手性受控的核苷酸间键联，利用包含手性助剂的手性纯的亚磷酰胺来立体选择性地形成手性受控的核苷酸间键联。可以依照本披露利用各种亚磷酰胺和手性助剂，例如，以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO2018/237194、和/或WO 2019/055951，其各自的亚磷酰胺和手性助剂通过引用并入本文。
在一些实施例中，偶联步骤提供了寡核苷酸，这些寡核苷酸包含式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等或其盐形式的核苷酸间键联，其中PL是P。在一些实施例中，这种核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，这种核苷酸间键联包含手性助剂部分。
在一些实施例中，修饰步骤提供了寡核苷酸，该寡核苷酸包含式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III等或其盐形式的核苷酸间键联，其中PL是P＝W。在一些实施例中，修饰步骤提供了寡核苷酸，该寡核苷酸包含式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等或其盐形式的核苷酸间键联，其中PL是P＝W。在一些实施例中，W是S。在一些实施例中，W是O。在一些实施例中，这种核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，这种核苷酸间键联包含手性助剂部分。在一些实施例中，修饰步骤提供了非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，非负电荷的核苷酸间键联具有以下结构：式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等或其盐形式。在一些实施例中，这种核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，这种核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，这种核苷酸间键联包含手性助剂部分。在一些实施例中，这种核苷酸间键联不包含手性助剂部分。在一些实施例中，手性助剂部分在修饰期间脱落。
提供的技术提供各种优势。除其他事项外，如本文所证明的，提供的技术可以大大改善寡核苷酸合成粗品纯度和产率，特别是对于经修饰的和/或手性纯的寡核苷酸(其提供对治疗目的而言至关重要的许多特性和活性)。由于能够为治疗上重要的寡核苷酸提供出乎意料地高的粗品纯度和产率，提供的技术可以显著降低制造成本(通过例如简化的纯化、大大提高的总产率等)。在一些实施例中，提供的技术可以容易地按比例放大以产生用于临床目的的足够数量和质量的寡核苷酸。在一些实施例中，在G2中包含吸电子基团的手性助剂(例如，PSM手性助剂)的提供的技术特别可用于制备包含P-N键的手性受控的核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联，如n001、n002、n003、n004、n005、n006、n007、n008、n009、n010等)，并且可以显著简化制造操作、降低成本和/或促进下游形成。
在一些实施例中，提供的技术提供了改善的试剂相容性。例如，如本披露所证明的，提供的技术提供了使用不同试剂系统进行氧化、硫化和/或叠氮化物反应的灵活性，特别是对于手性受控的寡核苷酸合成。
除其他事项外，本披露提供了高粗品纯度的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了高粗品纯度的手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了高粗品纯度的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了高粗品纯度和/或高立体纯度的寡核苷酸。
支持物和接头
在一些实施例中，可以在溶液中制备寡核苷酸。在一些实施例中，可以使用支持物制备寡核苷酸。在一些实施例中，使用固体支持物制备寡核苷酸。可以依照本披露利用的合适的支持物包括，例如，以下中描述的固体支持物：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO2018/237194、和/或WO 2019/055951，其各自的固体支持物通过引用并入本文。
在一些实施例中，利用接头部分在合成期间将寡核苷酸链连接至支持物。合适的接头在本领域中广泛地利用，并且包括以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其各自的接头通过引用并入本文。
在一些实施例中，连接部分是琥珀酰胺酸接头、或琥珀酸酯接头(-CO-CH2-CH2-CO-)、或草酰基接头(-CO-CO-)。在一些实施例中，连接部分和核苷通过酯键而键合在一起。在一些实施例中，连接部分和核苷通过酰胺键而键合在一起。在一些实施例中，连接部分将核苷与另外的核苷酸或核酸连接。合适的接头描述于，例如，Oligonucleotides AndAnalogues A Practical Approach[寡核苷酸和类似物实用的方法]，Ekstein，F.编辑，IRLPress[IRL出版公司]，纽约，1991，章节1，以及Solid-Phase Supports forOligonucleotide Synthesis[用于寡核苷酸合成的固体支持物]，Pon，R.T.，Curr.Prot.Nucleic Acid Chem.[核酸化学中的当前方案]，2000，3.1.1-3.1.28。在一些实施例中，使用通用接头(UnyLinker)将寡核苷酸与固体支持物附接(Ravikumar等人，Org.Process Res.Dev.[有机加工研究与开发]，2008，12(3)，399-410)。在一些实施例中，使用其他通用接头(Pon，R.T.，Curr.Prot.NucleicAcid Chem.[核酸化学中的当前方案]，2000，3.1.1-3.1.28)。在一些实施例中，使用各种正交接头(如二硫化的接头)(Pon，R.T.，Curr.Prot.Nucleic Acid Chem.[核酸化学中的当前方案]，2000，3.1.1-3.1.28)。
除其他事项外，本披露认识到可以选择或设计接头以与寡核苷酸合成中采用的一组反应条件相容。在一些实施例中，为了避免寡核苷酸的降解并避免脱硫，在脱保护之前选择性地去除助剂基团。在一些实施例中，DPSE基团可以通过F离子选择性地去除。在一些实施例中，本披露提供了在DPSE脱保护条件(例如，在MeCN中的0.1M TBAF、在THF或MeCN中的0.5M HF-Et3N等)下稳定的接头。在一些实施例中，提供的接头是如以下例示的接头：
Figure BPA0000295055720006271
溶剂
提供的寡核苷酸的合成通常在非质子有机溶剂中进行。在一些实施例中，溶剂是腈类溶剂，例如像乙腈。在一些实施例中，溶剂是碱性胺溶剂，例如像吡啶。在一些实施例中，溶剂是醚溶剂，例如像四氢呋喃。在一些实施例中，溶剂是卤代烃，例如像二氯甲烷。在一些实施例中，使用溶剂的混合物。在某些实施例中，溶剂是任何一种或多种上述类型溶剂的混合物。
在一些实施例中，当非质子有机溶剂不是碱性时，在反应步骤中存在碱。在存在碱的一些实施例中，碱是胺碱，例如像吡啶、喹啉、或N，N-二甲基苯胺。其他胺碱的实例包括吡咯烷、哌啶、N-甲基吡咯烷、吡啶、喹啉、N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)、或N，N-二甲基苯胺。
在一些实施例中，碱不是胺碱。
在一些实施例中，非质子有机溶剂是无水的。在一些实施例中，新鲜蒸馏无水非质子有机溶剂。在一些实施例中，新鲜蒸馏的无水非质子有机溶剂是碱性胺溶剂，例如像吡啶。在一些实施例中，新鲜蒸馏的无水非质子有机溶剂是醚溶剂，例如像四氢呋喃。在一些实施例中，新鲜蒸馏的无水非质子有机溶剂是腈类溶剂，例如像乙腈。
手性试剂/手性助剂
在一些实施例中，使用手性试剂(也可称为手性助剂)以在手性受控的寡核苷酸的产物中赋予立体选择性。许多手性试剂(也由本领域技术人员和在本文中称为手性助剂)可以依照本披露的方法使用。此类手性试剂的实例在本文和以下中描述：US 9695211、US9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其各自的手性助剂通过引用并入。
在一些实施例中，依照本披露的方法使用的手性试剂具有下式3-I：
Figure BPA0000295055720006281
其中：
W1和W2是-O-、-S-、-NG5-、或-NG5-O-中的任一个；
U1和U3是碳原子，其经由单键、双键或三键与U2(如果存在)键合，或在r为0时与彼此键合；
U2是-C-、-CG8-、-CG8G8-、-NG8-、-N-、-O-、或-S-，其中r是0至5的整数；并且
G1、G2、G3、G4、G5、和G8各自独立地是如本披露中所述的R1。
在一些实施例中，W1和W2是-O-、-S-或-NG5-中的任一个；U1和U3是碳原子，其经由单键、双键或三键与U2(如果存在)键合，或在r为0时与彼此键合。U2是-C-、-CG8-、-CG8G8-、-NG8-、-N-、-O-、或-S-，其中r是0至5的整数，并且不超过两个杂原子是相邻的。当U2中的任一个是C时，必须在U2的第二种情况(即C)之间或与U1或U3中的一个形成三键。类似地，当U2中任一个是CG8时，在U2的第二种情况(即-CG8-或-N-)之间或与U1或U3中的一个形成双键。
在一些实施例中，-U1G3G4-(U2)r-U3G1G2-是-CG3G4-CG1G2-。在一些实施例中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3＝CG1-。在一些实施例中，-U1-(U2)r-U3-是-C≡C-。在一些实施例中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3＝CG8-CG1G2-。在一些实施例中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-O-CG1G2-。在一些实施例中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-NG8-CG1G2-。在一些实施例中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-N-CG2-。在一些实施例中，-U1-(U2)r-U3-是-CG3G4-N＝CG8-CG1G2-。
在一些实施例中，G1、G2、G3、G4、G5、和G8独立地是如本披露中所述的R1。在一些实施例中，G1、G2、G3、G4、G5、和G8独立地是如本披露中所述的R。在一些实施例中，G1、G2、G3、G4、G5、和G8独立地是氢，或选自以下的任选地经取代的基团：脂肪族、烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂脂肪族、杂环基、杂芳基、和芳基；或者G1、G2、G3、G4、和G5中两个是G6(一起形成任选地经取代的饱和的、部分不饱和的、或不饱和的高达约20个环原子的碳环或含杂原子的环，该碳环或含杂原子的环是单环或多环、并且是稠和的或未稠和的)。在一些实施例中，如此形成的环被氧、硫代、烷基、烯基、炔基、杂芳基或芳基部分取代。在一些实施例中，当两个G6一起形成的环被取代时，它被足够大的部分取代以在反应期间赋予立体选择性。
在一些实施例中，G6中的两个一起形成的环是任选地经取代的环戊基、吡咯基、环丙基、环己烯基、环戊烯基、四氢吡喃基或哌嗪基。在一些实施例中，G6中的两个一起形成的环是任选地经取代的环戊基、吡咯基、环丙基、环己烯基、环戊烯基、四氢吡喃基、吡咯烷基或哌嗪基。
在一些实施例中，G1是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，G1是苯基。在一些实施例中，G2是甲基或氢。在一些实施例中，G2是氢。在一些实施例中，G1是任选地经取代的苯基，并且G2是甲基。在一些实施例中，G1是苯基，并且G2是甲基。在一些实施例中，G1是-CH2Si(R)3，其中一个R是任选地经取代的C1-6脂肪族，另外两个R各自独立地是具有0-5个杂原子的、任选地经取代的3-20元单环或多环的饱和环、部分不饱和环或芳环。在一些实施例中，另外两个R各自独立地是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，G1是-CH2SiMePh2。
在一些实施例中，r是0。
在一些实施例中，W1是-NG5-O-。在一些实施例中，W1是-NG5-O-，其中-O-与-H键合。在一些实施例中，W1是-NG5-。在一些实施例中，G3和G4中的一个与G5一起形成任选地经取代的3-10元环。在一些实施例中，G3和G4中的一个与G5一起形成任选地经取代的吡咯烷基环。在一些实施例中，G3和G4中的一个与G5一起形成吡咯烷基环。在一些实施例中，G5是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，G5是甲基。在一些实施例中，G1和G2中的一个以及G3和G4中的一个与居于它们之间的原子一起形成具有0-3个杂原子的任选地经取代的3-10元环。在一些实施例中，所形成的环3元。在一些实施例中，所形成的环4元。在一些实施例中，所形成的环5元。在一些实施例中，所形成的环6元。在一些实施例中，所形成的环7元。在一些实施例中，所形成的环被取代。在一些实施例中，所形成的环是未经取代的。在一些实施例中，所形成的环不具有杂原子。在一些实施例中，所形成的环是饱和的。例如，化合物，参见WV-CA-293和WV-CA-294。
在一些实施例中，W2是-O-。
在一些实施例中，手性试剂是具有式3-AA的化合物：
Figure BPA0000295055720006301
其中每个变量独立地如上文所定义和本文所述。
在式3AA的一些实施例中，W1和W2独立地是-NG5-、-O-、或-S-；G1、G2、G3、G4、和G5独立地是氢，或选自以下的任选地经取代的基团：烷基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂脂肪族、杂环基、杂芳基、或芳基；或者G1、G2、G3、G4、和G5中两个是G6(一起形成任选地经取代的饱和的、部分不饱和的、或不饱和的高达约20个环原子的碳环或含杂原子的环，该碳环或含杂原子的环是单环或多环、稠和的或未稠和的)，并且G1、G2、G3、G4、和G5中不超过四个是G6。与具有式3-I的化合物相似，G1、G2、G3、G4、或G5中任一个任选地被氧代、硫代、烷基、烯基、炔基、杂芳基、或芳基部分取代。在一些实施例中，这种取代包括在手性受控的寡核苷酸产生中的立体选择性。在一些实施例中，含有杂原子的部分(例如，杂脂肪族、杂环基、杂芳基等)具有1-5个杂原子。在一些实施例中，杂原子选自氮、氧、硫和硅。在一些实施例中，至少一个杂原子是氮。
在一些实施例中，W1是-NG5-O-。在一些实施例中，W1是-NG5-O-，其中-O-与-H键合。在一些实施例中，W1是-NG5-。在一些实施例中，G5以及G3和G4之一一起形成具有0-3个杂原子(除W1的氮原子之外)的任选地经取代的3-10元环。在一些实施例中，G5和G3一起形成具有0-3个杂原子(除W1的氮原子之外)的任选地经取代的3-10元环。在一些实施例中，G5和G4一起形成具有0-3个杂原子(除W1的氮原子之外)的任选地经取代的3-10元环。在一些实施例中，所形成的环是任选地经取代的4、5、6、7、或8元环。在一些实施例中，所形成的环是任选地经取代的4元环。在一些实施例中，所形成的环是任选地经取代的5元环。在一些实施例中，所形成的环是任选地经取代的6元环。在一些实施例中，所形成的环是任选地经取代的7元环。
在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006311
的结构。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006312
的结构。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006313
的结构。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006314
的结构。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006315
的结构。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006316
的结构。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006317
的结构。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006318
的结构。
在一些实施例中，W1是-NG5，W2是O，G1和G3各自独立地是氢或选自以下的任选地经取代的基团：C1-10脂肪族、杂环基、杂芳基和芳基，G2是-C(R)2Si(R)3，并且G4和G5一起形成任选地经取代的饱和的、部分不饱和的、或不饱和的高达约20环原子的含杂原子的环，该含杂原子的环是单环或多环、稠和的或未稠和的。在一些实施例中，每个R独立地是氢，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-C6脂肪族、碳环基、芳基、杂芳基、和杂环基。在一些实施例中，G2是-C(R)2Si(R)3，其中-C(R)2-是任选地经取代的-CH2-，并且-Si(R)3的每个R独立地是选自以下的任选地经取代的基团：C1-10脂肪族、杂环基、杂芳基和芳基。在一些实施例中，-Si(R)3的至少一个R独立地是任选地经取代的C1-10烷基。在一些实施例中，-Si(R)3的至少一个R独立地是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，-Si(R)3的一个R独立地是任选地经取代的苯基，并且另外两个R独立地是任选地经取代的C1-10烷基。在一些实施例中，-Si(R)3的一个R独立地是任选地经取代的C1-10烷基，并且另外两个R独立地是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，G2是任选地经取代的-CH2Si(Ph)(Me)2。在一些实施例中，G2是任选地经取代的-CH2Si(Me)(Ph)2。在一些实施例中，G2是-CH2Si(Me)(Ph)2。在一些实施例中，G4和G5一起形成任选地经取代的饱和的含有一个氮原子的5-6元环(G5附接在其上)。在一些实施例中，G4和G5一起形成任选地经取代的饱和的含有一个氮原子的5元环。在一些实施例中，G1是氢。在一些实施例中，G3是氢。在一些实施例中，G1和G3均是氢。
在一些实施例中，W1是-NG5，W2是O，G1和G3各自独立地是R1，G2是-R1，并且G4和G5一起形成任选地经取代的饱和的、部分不饱和的、或不饱和的高达约20环原子的含杂原子的环，该含杂原子的环是单环或多环、稠和的或未稠和的。在一些实施例中，G1和G3各自独立地是R。在一些实施例中，G1和G3各自独立地是-H。在一些实施例中，G2通过碳原子与分子的剩余部分连接，并且该碳原子被一个或多个吸电子基团取代。在一些实施例中，G2是被一个或多个吸电子基团取代的甲基。在一些实施例中，G2是被一个且不超过一个吸电子基团取代的甲基。在一些实施例中，G2是被两个或更多个吸电子基团取代的甲基。除其他事项外，具有包含吸电子基团的G2的手性助剂可以容易地被碱除去(碱不稳定的，例如，在基本上不含水的无水条件下；在很多情况下，优选地在包含含有此类手性助剂的核苷酸间键联的寡核苷酸被暴露于条件/试剂系统(包含大量的水，特定的在碱(例如，使用NH4OH切割条件/试剂系统)的存在下)之前去除，并且提供了如本文所述的各种优势，例如，高粗品纯度、高产率、高立体选择性、更简化的操作、较少的步骤、进一步降低的制造成本、和/或更简化的下游配制品(例如，切割后的少量的一种或多种盐)等。在一些实施例中，如在实例中所示，此类助剂可以提供与其他官能团和/或保护基团的可替代的或另外的化学相容性。在一些实施例中，如实例所证明的，碱基不稳定的手性助剂特别可用于构建手性受控的非负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联，如n001)；在一些情况下，如实例所证明的，它们可以提供显著改善的产率和/或粗品纯度与高立体选择性，例如当在无水条件下使用碱去除时使用。在一些实施例中，这种手性助剂经由氧原子与键联磷键合(例如，其对应于在对应的手性助剂化合物中的-OH基团，例如，具有式I的化合物)，手性助剂中与氧键合的碳原子(α碳)也与-H(除了其他基团；在一些实施例中，仲碳)键合，并且手性助剂中的剩余的碳原子(β碳)与一个或两个吸电子基团键合。在一些实施例中，-W2-H是-OH。在一些实施例中，G1是-H。在一些实施例中，G2包含一个或两个吸电子基团或者可以通过碱基促进手性助剂的去除。在一些实施例中，G1是-H，G2包含一个或两个吸电子基团，-W2-H是-OH。在一些实施例中，G1是-H，G2包含一个或两个吸电子基团，-W2-H是-OH，-W1-H是-NG5-H，并且G3和G4之一与G5一起与居于它们之间的原子形成如本文所述的环(例如，任选地经取代的3-20元单环、二环或多环，该环具有除氮原子(G5在其上)之外的0-5个杂原子(例如，任选地经取代的3、4、5、或6元单环饱和的环，该环除氮原子之外(G5在其上)无其他杂原子))。
如本领域技术人员所理解的，各种吸电子基团是本领域已知的并且可以依照本披露利用。在一些实施例中，吸电子的基团包含和/或通过例如，-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-P(S)R1-、或-C(O)-与碳原子连接。在一些实施例中，吸电子基团是-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2、或-P(S)(R1)2。在一些实施例中，吸电子基团是芳基或杂芳基，例如，被-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2、或-P(S)(R1)2中的一个或多个取代的苯基。
在一些实施例中，G2是-L-R′。在一些实施例中，G2是-L′-L″-R′，其中L′是-C(R)2-或任选地经取代的-CH2-，并且L″是-P(O)(R′)-、-P(O)(R′)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(OR′)O-、-P(O)[N(R′)]-、-P(O)[N(R′)]O-、-P(O)[N(R′)][N(R′)]-、-P(S)(R′)-、-S(O)2-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-S(O)-、-C(O)-、-C(O)N(R′)-、或-S-。在一些实施例中，L’是-C(R)2-。在一些实施例中，L’是任选地经取代的-CH2-。
在一些实施例中，L’是-C(R)2-。在一些实施例中，每个R独立地是氢，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-C6脂肪族、碳环基、芳基、杂芳基、和杂环基。在一些实施例中，L’是-CH2-。在一些实施例中，L″是-P(O)(R′)-、-P(S)(R′)-、-S(O)2-。在一些实施例中，G2是-L′-C(O)N(R′)2。在一些实施例中，G2是-L′-P(O)(R′)2。在一些实施例中，G2是-L′-P(S)(R′)2。在一些实施例中，每个R’独立地是任选地经取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基、或杂芳基，如本披露中所述(例如，针对R描述的那些实施例)。在一些实施例中，每个R’独立地是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，每个R’独立地是任选地经取代的苯基，其中一个或多个取代基独立地选自-CN，-OMe，-Cl，-Br和-F。在一些实施例中，每个R’独立地是经取代的苯基，其中一个或多个取代基独立地选自-CN，-OMe，-Cl，-Br和-F。在一些实施例中，每个R′独立地是经取代的苯基，其中取代基独立地选自-CN，-OMe，-Cl，-Br和-F。在一些实施例中，每个R′独立地是经单取代的苯基，其中取代基独立地选自-CN，-OMe，-Cl，-Br和-F。在一些实施例中，两个R′相同。在一些实施例中，两个R’是不同的。在一些实施例中，G2是-L′-S(O)R′。在一些实施例中，G2是-L′-C(O)N(R′)2。在一些实施例中，G2是-L′-S(O)2R′。在一些实施例中，R’是任选地经取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基、或杂芳基，如本披露中所述(例如，针对R描述的那些实施例)。在一些实施例中，R’是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R′是任选地经取代的苯基，其中一个或多个取代基独立地选自-CN、-OMe、-Cl、-Br和-F。在一些实施例中，R′是经取代的苯基，其中一个或多个取代基独立地选自-CN、-OMe、-Cl、-Br和-F。在一些实施例中，R′是经取代的苯基，其中每个取代基独立地选自-CN、-OMe、-Cl、-Br和-F。在一些实施例中，R′是经单取代的苯基。在一些实施例中，R’是经单取代的苯基，其中取代基独立地选自-CN、-OMe、-Cl、-Br、和-F。在一些实施例中，取代基是吸电子基团。在一些实施例中，吸电子基团是-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2、或-P(S)(R1)2。
在一些实施例中，G2是任选地经取代的-CH2-L″-R，其中L”和R各自独立地如本披露中所述。在一些实施例中，G2是任选地经取代的-CH(-L″-R)2，其中L”和R各自独立地如本披露中所述。在一些实施例中，G2是任选地经取代的-CH(-S-R)2。在一些实施例中，G2任选地被-CH2-S-R取代。在一些实施例中，两个R基团与居于它们之间原子一起形成环。在一些实施例中，所形成的环是任选地经取代的具有0-2个杂原子(除插入杂原子之外)的5、6、7元环。在一些实施例中，G2是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720006351
在一些实施例中，G2是
Figure BPA0000295055720006352
在一些实施例中，-S-可以转化为-S(O)-或-S(O)2-(例如，通过氧化)，例如，以便于通过碱基去除。
在一些实施例中，G2是-L′-R′，其中每个变量如本披露中所述。在一些实施例中，G2是-CH2-R′。在一些实施例中，G2是-CH(R′)2。在一些实施例中，G2是-C(R′)3。在一些实施例中，R’是任选地经取代的芳基或杂芳基。在一些实施例中，R’是经取代的芳基或杂芳基，其中一个或多个取代基独立地是吸电子基团。在一些实施例中，-L’-是任选地经取代的-CH2-，并且R’是R，其中R是任选地经取代的芳基或杂芳基。在一些实施例中，R是经取代的芳基或杂芳基，其中一个或多个取代基独立地是吸电子基团。在一些实施例中，R是经取代的芳基或杂芳基，其中每个取代基独立地是吸电子基团。在一些实施例中，R是被两个或更多个取代基取代的芳基或杂芳基，其中每个取代基独立地是吸电子基团。在一些实施例中，吸电子基团是-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2、或-P(S)(R1)2。在一些实施例中，R’是
Figure BPA0000295055720006353
在一些实施例中，R’是p-NO2Ph-。在一些实施例中，R’是
Figure BPA0000295055720006354
在一些实施例中，R’是
Figure BPA0000295055720006355
在一些实施例中，R’是
Figure BPA0000295055720006356
在一些实施例中，R’是
Figure BPA0000295055720006357
在一些实施例中，R’是
Figure BPA0000295055720006358
在一些实施例中，G2是
Figure BPA0000295055720006359
在一些实施例中，R’是
Figure BPA00002950557200063510
在一些实施例中，R’是
Figure BPA00002950557200063511
在一些实施例中，R’是2，4，6-三氯苯基。在一些实施例中，R’是2，4，6-三氟苯基。在一些实施例中，G2是-CH(4-氯苯基)2。在一些实施例中，G2是-CH(R′)2，其中每个R′是
Figure BPA00002950557200063512
在一些实施例中，G2是-CH(R′)2，其中每个R′是
Figure BPA00002950557200063513
在一些实施例中，R′是-C(O)R。在一些实施例中，R′是CH3C(O)-。
在一些实施例中，G2是-L′-S(O)2R’，其中每个变量如本披露中所述。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2R′。在一些实施例中，G2是-L′-S(O)R’，其中每个变量如本披露中所述。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)R′。在一些实施例中，G2是-L′-C(O)2R’，其中每个变量如本披露中所述。在一些实施例中，G2是-CH2-C(O)2R′。在一些实施例中，G2是-L′-C(O)R′，其中每个变量如本披露中所述。在一些实施例中，G2是-CH2-C(O)R′。在一些实施例中，-L′-是任选地经取代的-CH2-，并且R’是R。在一些实施例中，R是任选地经取代的芳基或杂芳基。在一些实施例中，R是任选地经取代的脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的杂脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的杂芳基。在一些实施例中，R是任选地经取代的芳基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R不是苯基，或单取代的、二取代的、或三取代的苯基，其中每个取代基选自-NO2、卤素、-CN、-C1-3烷基、和C1-3烷氧基。在一些实施例中，R是经取代的芳基或杂芳基，其中一个或多个取代基独立地是吸电子基团。在一些实施例中，R是经取代的芳基或杂芳基，其中每个取代基独立地是吸电子基团。在一些实施例中，R是被两个或更多个取代基取代的芳基或杂芳基，其中每个取代基独立地是吸电子基团。在一些实施例中，吸电子基团是-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2、或-P(S)(R1)2。在一些实施例中，R′是苯基。在一些实施例中，R′是经取代的苯基。在一些实施例中，R’是
Figure BPA0000295055720006361
在一些实施例中，R’是
Figure BPA0000295055720006362
在一些实施例中，R’是
Figure BPA0000295055720006363
在一些实施例中，R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R’是叔丁基。在一些实施例中，R’是异丙基。在一些实施例中，R′是甲基。在一些实施例中，G2是-CH2C(O)OMe。在一些实施例中，G2是-CH2C(O)Ph。在一些实施例中，G2是-CH2C(O)-tBu。
在一些实施例中，G2是-L′-NO2。在一些实施例中，G2是-CH2-NO2。在一些实施例中，G2是-L′-S(O)2N(R′)2。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2N(R′)2。在一些实施例中，G2是-L′-S(O)2NHR′。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2NHR′。在一些实施例中，R′是甲基。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2NH(CH3)。在一些实施例中，R′是-CH2Ph。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2NH(CH2Ph)。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2N(CH2Ph)2。在一些实施例中，R′是苯基。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2NHPh。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2N(CH3)Ph。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2N(CH3)2。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2NH(CH2Ph)。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2NHPh。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2NH(CH2Ph)。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2N(CH3)2。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2N(CH3)Ph。在一些实施例中，G2是-L′-S(O)2N(R′)(OR′)。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2N(R′)(OR′)。在一些实施例中，每个R’是甲基。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2N(CH3)(OCH3)。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2N(Ph)(OCH3)。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2N(CH2Ph)(OCH3)。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2N(CH2Ph)(OCH3)。在一些实施例中，G2是-L′-S(O)2OR′。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2OR′。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2OPh。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2OCH3。在一些实施例中，G2是-CH2-S(O)2OCH2Ph。
在一些实施例中，G2是-L′-P(O)(R′)2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)(R′)2。在一些实施例中，G2是-L′-P(O)[N(R′)2]2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)[N(R′)2]2。在一些实施例中，G2是-L′-P(O)[O(R′)2]2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)[O(R′)2]2。在一些实施例中，G2是-L′-P(O)(R′)[N(R′)2]2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)(R′)[N(R′)2]。在一些实施例中，G2是-L′-P(O)(R′)[O(R′)]。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)(R′)[O(R′)]。在一些实施例中，G2是-L′-P(O)(OR′)[N(R′)2]。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)(OR′)[N(R′)2]。在一些实施例中，G2是-L′-C(O)N(R′)2，其中每个变量如本披露中所述。在一些实施例中，G2是-CH2-C(O)N(R′)2。在一些实施例中，每个R’独立地是R。在一些实施例中，一个R’是任选地经取代的脂肪族，并且一个R是任选地经取代的芳基。在一些实施例中，一个R’是任选地经取代的C1-6脂肪族，并且一个R是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，每个R′独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)(CH3)Ph。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)(CH3)2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)(Ph)2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)(OCH3)2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)(CH2Ph)2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)[N(CH3)Ph]2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)[N(CH3)2]2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)[N(CH2Ph)2]2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)(OCH3)2。在一些实施例中，G2是-CH2-P(O)(OPh)2。
在一些实施例中，G2是-L′-SR′。在一些实施例中，G2是-CH2-SR′。在一些实施例中，R’是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R′是苯基。
在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006381
的结构，其中每个R1独立地如本披露中所述。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006382
的结构，其中每个R1独立地如本披露中所述。在一些实施例中，每个R1独立地是如本披露中所述的R。在一些实施例中，每个R1独立地是R，其中R是如本披露中所述的任选地经取代的脂肪族、芳基、杂脂肪族、或杂芳基。在一些实施例中，每个R1是苯基。在一些实施例中，R1是-L-R′。在一些实施例中，R1是-L-R′，其中L是-O-、-S-、或-N(R′)。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006383
的结构：其中每个X1独立地是-H、吸电子基团、-NO2、-CN、-OR、-Cl、-Br、或-F，并且W是O或S。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006384
的结构，其中每个X1独立地是-H、吸电子基团、-NO2、-CN、-OR、-Cl、-Br、或-F，并且W是O或S。在一些实施例中，每个X1独立地是-CN、-OR、-Cl、-Br或-F，其中R不是-H。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是-CH3。在一些实施例中，一个或多个X1独立地是吸电子基团(例如，-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2、-P(S)(R1)2等)。
在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006391
的结构，其中R1如本披露中所述。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006392
的结构，其中R1如本披露中所述。在一些实施例中，R1是如本披露中所述的R。在一些实施例中，R1是R，其中R是如本披露中所述的任选地经取代的脂肪族、芳基、杂脂肪族、或杂芳基。在一些实施例中，R1是-L-R′。在一些实施例中，R1是-L-R′，其中L是-O-、-S-、或-N(R′)。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006393
的结构：其中X1是-H、吸电子基团、-NO2、-CN、-OR、-Cl、-Br、或-F，并且W是O或S。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006394
的结构，其中X1是-H、吸电子基团、-NO2、-CN、-OR、-Cl、-Br、或-F，并且W是O或S。在一些实施例中，X1是-CN、-OR、-Cl、-Br或-F，其中R不是-H。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是-CH3。在一些实施例中，X1是吸电子基团(例如，-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2、-P(S)(R1)2等)。在一些实施例中，X1为不是-CN、-NO2、或卤素的吸电子基团。在一些实施例中，X1不是-H、-CN、-NO2、卤素、或C1-3烷氧基。
在一些实施例中，G2是-CH(R21)-CH(R22)＝C(R23)(R24)，其中R21、R22、R23、和R24各自独立地是R。在一些实施例中，R22和R23均为R，并且两个R基团与居于它们之间的原子一起形成如本文所述的任选地经取代的芳基环或杂芳基环。在一些实施例中，一个或多个取代基独立地是吸电子基团。在一些实施例中，R21和R24均为R，并且两个R基团与居于它们之间的原子一起形成如本文所述的任选地经取代的环。在一些实施例中，R21和R24均为R，并且两个R基团与居于它们之间的原子一起形成如本文所述的任选地经取代的饱和环或者部分饱和环。在一些实施例中，R22和R23均为R，并且两个R基团与居于它们之间的原子一起形成如本文所述的任选地经取代的芳基环或杂芳基环，并且R21和R24均为R，并且两个R基团与居于它们之间的原子一起形成如本文所述的任选地经取代的部分饱和环。在一些实施例中，R21是-H。在一些实施例中，R24是-H。在一些实施例中，G2是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720006401
在一些实施例中，G2是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720006402
其中每个环A2独立地是如本文所述的3-15元单环、双环或多环。在一些实施例中，环A2是如本文所述的具有1-5个杂原子的任选地经取代的5-10元单环芳基环或杂芳基环。在一些实施例中，环A2是如本文所述的任选地经取代的苯环。在一些实施例中，在一些实施例中，G2是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720006403
在一些实施例中，G2是
Figure BPA0000295055720006404
在一些实施例中，G2是
Figure BPA0000295055720006405
在一些实施例中，G2是
Figure BPA0000295055720006406
用于手性助剂的某些有用的示例化合物呈现于例如表CA-1至CA-13中。在一些实施例中，有用的化合物是例如表CA-1至CA-13中的化合物的对映异构体。在一些实施例中，有用的化合物是例如表CA-1至CA-13中的化合物的非对映异构体。在一些实施例中，可用于在碱性条件下(例如，在无水条件下通过碱)去除的手性助剂的化合物是表CA-1至CA-13的化合物，或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-1的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-2的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-3的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-4的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-5的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-6的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-7的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-8的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-9的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-10的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-11的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-12的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。在一些实施例中，这种化合物是表CA-13的化合物、或其对映异构体或非对映异构体。
在一些实施例中，当与碱接触时，手性助剂部分(例如，核苷酸间键联，其对应的化合物是具有式3-I或3-AA的化合物)可以作为烯烃释放，该烯烃与通过从对应的化合物中去除水分子(消除G2的-W2-H＝-OH和α-H)而形成的产物具有相同的结构。在一些实施例中，这种烯烃具有(吸电子基团)2＝C(R1)-L-N(R5)(R6)、(吸电子基团)H＝C(R1)-L-N(R5)(R6)、CH(-L″-R′)＝C(R1)-L-N(R5)(R6)(其中CH基团是任选地经取代的)、或Cx＝C(R1)-L-N(R5)(R6)(其中Cx是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720006411
)的结构，并且可以与一个或多个任选地经取代的环任选地稠和，并且其他变量各自独立地如本文所述。在一些实施例中，Cx是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720006412
在一些实施例中，Cx是
Figure BPA0000295055720006413
在一些实施例中，这种烯烃是
Figure BPA0000295055720006414
在一些实施例中，这种烯烃是
Figure BPA0000295055720006415
在一些实施例中，这种烯烃是
Figure BPA0000295055720006416
在一些实施例中，手性试剂是氨基醇。在一些实施例中，手性试剂是氨基硫。在一些实施例中，手性试剂是氨基苯酚。在一些实施例中，手性试剂是(S)和(R)-2-甲基氨基-1-苯基乙醇、(1R，2S)-麻黄碱、或(1R，2S)-2-甲基氨基-1，2-联苯基乙醇。
在本披露的一些实施例中，手性试剂是具有以下式之一的化合物：
Figure BPA0000295055720006421
在一些实施例中，有用的手性试剂是选自以下化合物的化合物，或其相关的立体异构体，特别是对映异构体(例如，WV-CA-237是WV--CA-236的相关的立体异构体(相关的非对映异构体，其具有相同的构造，在一个手性中心具有相同的构型而在另一手性中心不具有)；WV-CA-108是WV-CA-236的相关的对映异构体(彼此呈镜像)：
表CA-1。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006422
Figure BPA0000295055720006431
Figure BPA0000295055720006441
Figure BPA0000295055720006451
Figure BPA0000295055720006461
Figure BPA0000295055720006471
Figure BPA0000295055720006481
Figure BPA0000295055720006491
Figure BPA0000295055720006501
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-1的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-1的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-2。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006502
Figure BPA0000295055720006511
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-2的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-2的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-3。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006512
Figure BPA0000295055720006521
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-3的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-3的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-4。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006522
Figure BPA0000295055720006531
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-4的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-4的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-5。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006532
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-5的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-5的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-6。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006541
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-6的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-6的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-7。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006542
Figure BPA0000295055720006551
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-7的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-7的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-8。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006552
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-8的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-8的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-9。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006561
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-9的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-9的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-10。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006562
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-10的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-10的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-11。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006563
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-11的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-11的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-12。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006571
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-12的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-12的化合物的非对映异构体或其盐。
在一些实施例中，有用的手性试剂是如下化合物或其相关的立体异构体、特别是对映异构体，该化合物选自以下化合物：
表CA-13。示例手性助剂。
Figure BPA0000295055720006572
Figure BPA0000295055720006581
在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-13的化合物的对映异构体或其盐。在一些实施例中，提供的化合物是选自表CA-13的化合物的非对映异构体或其盐。
如本领域技术人员所理解的，手性试剂通常是立体纯的或基本上立体纯的，并且通常用作基本上不含其它立体异构体的单一立体异构体。在一些实施例中，本披露的化合物是立体纯的或基本上立体纯的。
如本文所证明的，当用于制备手性核苷酸间键联时，为了获得立体选择性，通常使用立体化学纯的手性试剂。除其他事项外，本披露提供了立体化学纯的手性试剂，包括具有所述结构的那些。
手性试剂的选择，例如，由式Q表示的异构体或其立体异构体(式R)允许特定控制键联磷的手性。因此，可以在每个合成循环中选择Rp或Sp构型，允许控制手性受控的寡核苷酸的整体三维结构。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸具有所有Rp立体中心。在本披露的一些实施例中，手性受控的寡核苷酸具有所有Sp立体中心。在本披露的一些实施例中，手性受控的寡核苷酸中的每个键联磷独立地是Rp或Sp。在本披露的一些实施例中，手性受控的寡核苷酸中的每个键联磷独立地是Rp或Sp，并且至少一个是Rp，以及至少一个使Sp。在一些实施例中，进行Rp和Sp中心的选择以赋予手性受控的寡核苷酸特定的三维超结构。此类选择的实例在本文中进一步详述。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含手性助剂部分，例如，以核苷酸间键联。在一些实施例中，手性助剂与键联磷连接。在一些实施例中，手性助剂通过W2与键联磷连接。在一些实施例中，手性助剂通过W2连接至键联磷，其中W2是O。任选地，例如当W1是-NG5-时，W1在寡核苷酸合成期间被加帽。在一些实施例中，将寡核苷酸中的手性助剂中的W1加帽，例如，通过寡核苷酸合成期间的加帽试剂。在一些实施例中，可以有目的地加帽W1以调节寡核苷酸特性。在一些实施例中，将W1用-R1加帽。在一些实施例中，R1是-C(O)R′。在一些实施例中，R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R′是甲基。
在一些实施例中，以手性试剂在上文描绘的循环中的特定的步骤被去除的能力选择依照本披露使用的手性试剂。例如，在一些实施例中，希望在修饰键联磷的步骤期间去除手性试剂。在一些实施例中，希望在修饰键联磷的步骤之前去除手性试剂。在一些实施例中，希望在修饰键联磷的步骤之后去除手性试剂。在一些实施例中，希望在第一偶联步骤已经发生之后但在第二偶联步骤发生之前去除手性试剂，使得在第二偶联期间(并且同样对于另外的后续的偶联步骤)在生长的寡核苷酸上不存在手性试剂。在一些实施例中，在“去封闭”反应期间去除手性试剂，该“去封闭”在键联磷的修饰之后但在随后的循环开始之前发生。本文描述了用于去除的示例方法和试剂。
在一些实施例中，当进行修饰和/或去封闭步骤时，实现了手性助剂的去除，如方案I中所示。将手性助剂去除与其他转化(如修饰和去封闭)组合在一起可以是有益的。本领域普通技术人员将理解，保存的步骤/转化可以提高合成的总效率(例如，关于产率和产物纯度)，尤其是对于更长的寡核苷酸。方案I示出了在修饰和/或去封闭期间去除手性助剂的一个实例。
在一些实施例中，依照本披露的方法使用的手性试剂特征在于：其在某些条件下是可去除的。例如，在一些实施例中，手性试剂是针对其在酸性条件下被去除的能力来选择的。在某些实施例中，手性试剂是针对其在温和地酸性条件下被去除的能力来选择的。在某些实施例中，手性试剂是针对其通过E1消除反应(例如，由于在酸性条件下在手性试剂上形成阳离子中间体而发生去除，导致手性试剂从寡核苷酸上切割)被去除的能力来选择的。在一些实施例中，手性试剂的特征在于：它具有被认为能够容纳或促进E1消除反应的结构。相关领域的技术人员将理解，可以设想哪些结构倾向于经历此类消除反应。
在一些实施例中，手性试剂是针对其与亲核试剂一起去除的能力来选择的。在一些实施例中，手性试剂是针对其与胺亲核试剂一起去除的能力来选择的。在一些实施例中，手性试剂是针对其与除胺之外的亲核试剂一起去除的能力来选择的。
在一些实施例中，手性试剂是针对其与碱基一起去除的能力来选择的。在一些实施例中，手性试剂是针对其与胺一起去除的能力来选择的。在一些实施例中，手性试剂是针对其与除胺之外的碱基一起去除的能力来选择的。
在一些实施例中，可以在使用前分离包含手性助剂的手性纯的亚磷酰胺。在一些实施例中，可以不分离而使用包含手性助剂的手性纯的亚磷酰胺-在一些实施例中，可以将其在形成后直接使用。
活化
如本领域技术人员所理解的，寡核苷酸制备可以使用各种条件、试剂等，例如在亚磷酰胺制备期间、在循环期间的一个或多个步骤期间、在循环后切割/脱保护期间等活化反应组分。可以依照本披露利用的各种活化技术包括但不限于以下中描述的那些：US9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其各自的活化技术通过引用并入。实例中示出了某些活化技术(例如，试剂、条件、方法等)。
偶联
在一些实施例中，本披露的循环包含立体选择性缩合/偶联步骤以形成手性受控的核苷酸间键联。对于缩合，通常使用活化试剂，例如4，5-二氰基咪唑(DCI)、4，5-二氯咪唑、1-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸酯(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸酯(BIT)、苯并三唑、3-硝基-1，2，4-三唑(NT)、四唑、5-乙基硫代四唑(ETT)、5-苄基硫代四唑(BTT)、5-(4-硝基苯基)四唑、N-氰基甲基吡咯烷鎓三氟甲磺酸酯(CMPT)、N-氰基甲基哌啶鎓三氟甲磺酸酯、N-氰基甲基二甲基铵三氟甲磺酸酯。包括手性亚磷酰胺的合适的条件和试剂包括以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其各自的缩合试剂、条件和方法通过引用并入。实例中示出了某些偶联技术(例如，试剂、条件、方法等)。
在一些实施例中，用于偶联的亚磷酰胺具有
Figure BPA0000295055720006611
Figure BPA0000295055720006612
的结构，其中每个变量独立地如本披露所述。在一些实施例中，每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族。本领域技术人员将理解，在结构或式中的任两个R基团可以相同或不同。在一些实施例中，每个R独立地是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个R独立地是任选地经取代的C1-6烯基。在一些实施例中，每个R独立地是任选地经取代的C1-6炔基。在一些实施例中，每个R独立地是异丙基。在一些实施例中，-X-L-R1包含任选地经取代的三唑基团。在一些实施例中，X是共价键。在一些实施例中，L是共价键。在一些实施例中，-X-L-R1是R1。在一些实施例中，R1包含任选地经取代的环。在一些实施例中，R1是如本文所述的R。在一些实施例中，R1是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720006613
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720006614
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720006615
在一些实施例中，R1是
Figure BPA0000295055720006616
在一些实施例中，-L-包含C1-6亚烷基。在一些实施例中，-L-包含C1-6亚烯基。在一些实施例中，-L-包含
Figure BPA0000295055720006617
在一些实施例中，R1是如本文所述的R。在一些实施例中，-L-是
Figure BPA0000295055720006618
且R1是H。在一些实施例中，-L-R1是
Figure BPA0000295055720006619
在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA00002950557200066110
在一些实施例中，-X-L-R1是-OCH2CH2CN。
在一些实施例中，用于偶联的手性亚磷酰胺具有
Figure BPA0000295055720006621
Figure BPA0000295055720006622
的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，用于偶联的手性亚磷酰胺具有以下结构：
Figure BPA0000295055720006623
Figure BPA0000295055720006624
在一些实施例中，用于偶联的手性亚磷酰胺具有
Figure BPA0000295055720006631
Figure BPA0000295055720006632
Figure BPA0000295055720006633
的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，G1或G2包含如本披露中所述的吸电子基团。在一些实施例中，用于偶联的手性亚磷酰胺具有
Figure BPA0000295055720006634
Figure BPA0000295055720006635
Figure BPA0000295055720006641
Figure BPA0000295055720006642
的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，R1是如本披露中所述的R’。在一些实施例中，R1是如本披露中所述的R。在一些实施例中，R是如本披露中所述的任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R是苯基。在一些实施例中，R是4-甲基苯基。在一些实施例中，R是4-甲氧基苯基。在一些实施例中，R是如本披露中所述的任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R是如本披露中所述的任选地经取代的C1-6烷基。例如，在一些实施例中，R是甲基；在一些实施例中，R是异丙基；在一些实施例中，R是叔丁基；等。
在一些实施例中，R5s-Ls-是R′O-。在一些实施例中，R′O-是DMTrO-。在一些实施例中，R4s是H。在一些实施例中，R4s和R2s一起形成如本披露中所述的桥-L-O-。在一些实施例中，-O-在2’位置与碳连接。在一些实施例中，L是-CH2-。在一些实施例中，L是-CH(Me)-。在一些实施例中，L是-(R)-CH(Me)-。在一些实施例中，L是-(S)-CH(Me)-。在一些实施例中，R2s是-H。在一些实施例中，R2s是-F。在一些实施例中，R2s是-OR’。在一些实施例中，R2s是-OMe。在一些实施例中，R2s是-MOE。如本领域技术人员所理解的，BA可以在合成期间被适当地保护。
在一些实施例中，在偶联步骤中形成的核苷酸间键联具有式I或其盐形式的结构。在一些实施例中，PL是P。在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720006643
Figure BPA0000295055720006644
Figure BPA0000295055720006651
其中每个变量独立地依照本披露。在一些实施例中，-X-L-R1是-CH2CH2CN。
在一些实施例中，偶联形成核苷酸间键联，其具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的立体选择性。在一些实施例中，立体选择性是85％或更多。在一些实施例中，立体选择性是85％或更多。在一些实施例中，立体选择性是90％或更多。在一些实施例中，立体选择性是91％或更多。在一些实施例中，立体选择性是92％或更多。在一些实施例中，立体选择性是93％或更多。在一些实施例中，立体选择性是94％或更多。在一些实施例中，立体选择性是95％或更多。在一些实施例中，立体选择性是96％或更多。在一些实施例中，立体选择性是97％或更多。在一些实施例中，立体选择性是98％或更多。在一些实施例中，立体选择性是99％或更多。
加帽(Capping)
如果最终核酸大于二聚体，则未反应的-OH部分通常用封闭/加帽基团进行加帽。寡核苷酸中的手性助剂也可以用阻断基团被加帽以形成加帽的缩合中间体。合适的加帽技术(例如，试剂、条件等)包括以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO2018/237194、和/或WO 2019/055951，其各自的加帽技术通过引用并入。在一些实施例中，加帽试剂是羧酸或其衍生物。在一些实施例中，加帽试剂是R’COOH。在一些实施例中，加帽步骤将R’COO-引入手性助剂中未反应的5′-OH基团和/或氨基基团。在一些实施例中，循环可以包含两个或更多个加帽步骤。在一些实施例中，循环包含在偶联产物的修饰之前的第一加帽(例如，将P(III)转化为P(V))，以及在偶联产物的修饰之后的另一加帽。在一些实施例中，在酰胺化条件下进行第一加帽，该酰化条件例如包含酰化试剂(例如，具有(RC(O))2O(例如，Ac2O)的酸酐)和碱(例如，2，6-二甲基砒啶)。在一些实施例中，第一加帽对氨基基团(例如，核苷酸间键联中的手性助剂的氨基)进行加帽。在一些实施例中，在偶联步骤中形成的核苷酸间键联具有式I或其盐形式的结构。在一些实施例中，PL是P。在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720006661
Figure BPA0000295055720006662
或
Figure BPA0000295055720006663
其中每个变量独立地依照本披露。在一些实施例中，R1是R-C(O)-。在一些实施例中，R是CH3-。在一些实施例中，每个手性受控的偶联(例如，使用手性助剂)之后进行第一加帽。通常，使用传统亚磷酰胺来构建天然磷酸酯键联的非手性受控的偶联的循环不包含第一加帽。在一些实施例中，进行第二加帽，例如在酯化条件下(例如，传统亚磷酰胺寡核苷酸合成的加帽条件)，其中游离的5’-OH被加帽。
实例中示出了某些加帽技术(例如，试剂、条件、方法等)。
修饰
在一些实施例中，核苷酸间键联(其中其键联磷作为P(III)存在)被修饰以形成另一种经修饰的核苷酸间键联(例如式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III、或其盐形式之一)或天然磷酸酯键联。在很多实施例中，通过与亲电试剂反应修饰P(III)。依照本披露可以使用合适的P(III)的各种类型的反应。合适的修饰技术(例如，试剂(例如，硫化试剂、氧化试剂等)、病症等)包括以下描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每个的修饰技术通过引用结合在此。
在一些实施例中，如实例中说明，本披露提供了用于引入非负电荷的核苷酸间键联(包括中性核苷酸间键联)的修饰剂。
在一些实施例中，修饰在循环内。在一些实施例中，修饰可以再循环之外。例如，在一些实施例中，可以在达到寡核苷酸链之后进行一个或多个修饰步骤以在一个或多个核苷酸间键联和/或其他位置同时引入修饰。
在一些实施例中，修饰包括使用点击化学，例如，其中寡核苷酸(例如，核苷酸间键联)的炔基与叠氮化物反应。依照本披露可以利用用于点击化学的各种试剂和条件。在一些实施例中，叠氮化物具有R1-N3(其中R1是如在本披露中所述的)的结构。在一些实施例中，R1是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R1是异丙基。
在一些实施例中，如在实例中证明，在合适的条件下，通过使P(III)键联与叠氮化物或叠氮基咪唑啉盐反应(例如，包含
Figure BPA0000295055720006671
的化合物；在一些实施例中，称为叠氮化物反应)，可以将P(III)键联转化为非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是PF6 -的盐。在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是
Figure BPA0000295055720006672
的盐。在一些实施例中，有用的试剂，例如叠氮基咪唑啉盐，是
Figure BPA0000295055720006673
的盐。在一些实施例中，有用的试剂是
Figure BPA0000295055720006674
的盐。在一些实施例中，有用的试剂是
Figure BPA0000295055720006675
的盐。在一些实施例中，有用的试剂是
Figure BPA0000295055720006676
的盐。包含氮阳离子的此类试剂也含有抗衡阴离子(例如，如在本披露中所述的Q-)，该抗衡阴离子是本领域广泛已知的并且包含在各种化学试剂中。在一些实施例中，有用的试剂是Q+Q-，其中Q+是
Figure BPA0000295055720006681
并且Q-是抗衡阴离子。在一些实施例中，Q+是
Figure BPA0000295055720006682
在一些实施例中，Q+是
Figure BPA0000295055720006683
在一些实施例中，Q+是
Figure BPA0000295055720006684
在一些实施例中，Q+是
Figure BPA0000295055720006685
在一些实施例中，Q+是
Figure BPA0000295055720006686
如本领域技术人员所理解的，在具有的结构Q+Q-的化合物中，通常Q+中正电荷的数量等于Q-中负电荷的数量。在一些实施例中，Q+是单价阳离子，并且Q-是单价阴离子。在一些实施例中，Q-是F-、Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、TfO-、Tf2N-、AsF6 -、ClO4 -、或SbF6 -。在一些实施例中，Q-是PF6 -。本领域技术人员容易理解，许多其他类型的抗衡阴离子是可获得的并且可以依照本披露使用。在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是2-叠氮基-1，3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐。在一些实施例中，叠氮化物是
Figure BPA0000295055720006687
在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是
Figure BPA0000295055720006688
在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是
Figure BPA0000295055720006689
在一些实施例中，叠氮化物是
Figure BPA00002950557200066810
在一些实施例中，叠氮化物是
Figure BPA00002950557200066811
在一些实施例中，叠氮化物是
Figure BPA00002950557200066812
在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是
Figure BPA0000295055720006691
在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是
Figure BPA0000295055720006692
在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是
Figure BPA0000295055720006693
在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是
Figure BPA0000295055720006694
在一些实施例中，P(III)键联与具有R-GZ的结构的亲电试剂(其中R是如在本披露中所述的，并且GZ是离去基团，例如，-Cl、-Br、-I、-OTf、-Oms、-O甲苯磺酰基等)反应。在一些实施例中，R是-CH3。在一些实施例中，R是-CH2CH3。在一些实施例中，R是-CH2CH2CH3。在一些实施例中，R是-CH2OCH3。在一些实施例中，R是CH3CH2OCH2-。在一些实施例中，R是PhCH2OCH2-。在一些实施例中，R是HC≡C-CH2-。在一些实施例中，R是H3C-C≡C-CH2-。在一些实施例中，R是CH2＝CHCH2-。在一些实施例中，R是CH3SCH2-。在一些实施例中，R是-CH2COOCH3。在一些实施例中，R是-CH2COOCH2CH3。在一些实施例中，R是-CH2CONHCH3。
在一些实施例中，在修饰步骤后，将P(III)键联磷转化为P(V)核苷酸间键联。在一些实施例中，将P(III)键联磷转化为P(V)核苷酸间键联，并且与键联磷结合的所有基团保持不变。在一些实施例中，键联磷从P转化为P(＝O)。在一些实施例中，键联磷从P转化为P(＝S)。在一些实施例中，键联磷从P转化为P(＝N-L-R5)。在一些实施例中，键联磷从P转化为
Figure BPA0000295055720006695
Figure BPA0000295055720006696
其中每个变量独立地如本披露所描述的。在一些实施例中，P转化为
Figure BPA0000295055720006701
在一些实施例中，P转化为
Figure BPA0000295055720006702
在一些实施例中，P转化为
Figure BPA0000295055720006703
在一些实施例中，P转化为
Figure BPA0000295055720006704
在一些实施例中，P转化为
Figure BPA0000295055720006705
如本领域技术人员所理解的，对于每种阳离子，通常存在抗衡阴离子，使得系统(例如，化合物、组合物等)中正电荷的总数等于负电荷的总数。在一些实施例中，抗衡阴离子是如在本披露中所述的Q-(例如，F-、Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、TfO-、Tf2N-、AsF6 -、ClO4 -、SbF6 -等)。在一些实施例中，具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构的核苷酸间键联(其中PL是P)被转化为具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、H-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III、或其盐形式的结构的核苷酸间键联(其中PL是P(＝W)或P→B(R′)3或PN)。在一些实施例中，具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构的核苷酸间键联(其中PL是P)被转化为具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构的核苷酸间键联(其中PL是P(＝W)或P→B(R′)3)。在一些实施例中，键联磷P(其在具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构的核苷酸间键联中是PL)被转化为PL(其是P(＝W)或P→B(R′)3)。在一些实施例中，键联磷P(其在具有式I或其盐形式的结构的核苷酸间键联中是PL)被转化为PL(其是P(＝W)或P→B(R′)3)。在一些实施例中，W是O(例如，对于氧化反应)。在一些实施例中，W是S(例如，对于硫化反应)。在一些实施例中，W是＝N-L-R5(例如，对于叠氮化物反应)。在一些实施例中，具有式I或其盐形式的结构的核苷酸间键联(例如，其中PL是P)被转化为具有式III或其盐形式的结构的核苷酸间键联：
Figure BPA0000295055720006711
其中：
PN是P(＝N-L-R5)、
Figure BPA0000295055720006712
Q-或
Figure BPA0000295055720006713
Q-是阴离子，并且
每个其他变量独立地如本披露中所述。
在一些实施例中，PN是P(＝N-L-R5)。在一些实施例中，PN是
Figure BPA0000295055720006714
Q-。在一些实施例中，PN是
Figure BPA0000295055720006715
在一些实施例中，PN是
Figure BPA0000295055720006716
在一些实施例中，PN是
Figure BPA0000295055720006717
在一些实施例中，PN是
Figure BPA0000295055720006718
在一些实施例中，本披露的核苷酸间键联可以以盐形式存在。在一些实施例中，具有式III的核苷酸间键联可以以盐形式存在。在一些实施例中，在具有式III的核苷酸间键联的盐形式中，PN是
Figure BPA0000295055720006721
Figure BPA0000295055720006722
在一些实施例中，PN是P＝WN，其中WN如本文所述。
在一些实施例中，Y、Z和-X-L-R1在转化期间保持不变。在一些实施例中，X、Y和Z各自独立地是-O-。在一些实施例中，如本文所述，-X-L-R1具有此类结构，使得H-X-L-R1是本文所述的手性试剂或本文所述的加帽手性试剂，其中手性试剂(通常具有-W1-H或-W2-H，其包含氨基基团-NHG5-)的氨基基团被加帽，例如用-C(O)R′(替换-H，例如-N[-C(O)R′]G5-)。在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720006723
Figure BPA0000295055720006724
其中每个变量独立地依照本披露。在一些实施例中，其中R1是-C(O)R。在一些实施例中，R1是CH3C(O)-。在一些实施例中，如本文所述，G2包含吸电子基团。在一些实施例中，G2是-CH2SO2Ph。
在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，经修饰的核苷酸间键联、手性核苷酸间键联、手性受控的核苷酸间键联、非负电荷的核苷酸间键联、中性核苷酸间键联等)具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构，其中PL是P(＝N-L-R5)，或者具有式III或其盐形式的结构。在一些实施例中，这种核苷酸间键联是手性受控的。在一些实施例中，所有此类核苷酸间键联是手性受控的。在一些实施例中，此类核苷酸间键联的至少一个的键联磷是Rp。在一些实施例中，此类核苷酸间键联的至少一个的键联磷是Sp。在一些实施例中，此类核苷酸间键联的至少一个的键联磷是Rp，并且此类核苷酸间键联的至少一个的键联磷是Sp。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含一个或多个(例如，1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-40、1-50、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个等)此类核苷酸间键联。在一些实施例中，此类寡核苷酸进一步包含一个或多个其他类型的核苷酸间键联，例如，一个或多个天然磷酸酯键联、和/或一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联(例如，在一些实施例中，其中的一个或多个独立地是手性受控的；在一些实施例中，其每个独立地是手性受控的；在一些实施例中，至少一个是Rp；在一些实施例中，至少一个是Sp；在一些实施例中，至少一个是Rp，并且至少一个是Sp；等)。在一些实施例中，此类寡核苷酸是立体纯的(基本上不含其他立体异构体)。在一些实施例中，本披露提供了此类寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了此类寡核苷酸的手性纯的寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，修饰以80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的立体选择性进行。在一些实施例中，立体选择性是85％或更多。在一些实施例中，立体选择性是85％或更多。在一些实施例中，立体选择性是90％或更多。在一些实施例中，立体选择性是91％或更多。在一些实施例中，立体选择性是92％或更多。在一些实施例中，立体选择性是93％或更多。在一些实施例中，立体选择性是94％或更多。在一些实施例中，立体选择性是95％或更多。在一些实施例中，立体选择性是96％或更多。在一些实施例中，立体选择性是97％或更多。在一些实施例中，立体选择性是98％或更多。在一些实施例中，立体选择性是99％或更多。在一些实施例中，修饰是立体定向的。
去封闭
在一些实施例中，循环包含循环步骤。在一些实施例中，扩大中的寡核苷酸的5’羟基基团被封闭(即，被保护)并且必须被去封闭以随后与核苷偶联配偶体反应。
在一些实施例中，使用酰化来去除阻断基团。合适的去封闭技术(例如，试剂、病症等)包括以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每个的去封闭技术通过引用结合在此。某些去封闭技术(例如，试剂、条件、方法等)在实例中进行了说明。
切割和脱保护
在某一阶段，例如，在达到所希望的寡核苷酸长度后，进行切割和/或脱保护以使封闭的核碱基等脱保护并从支持物上切割寡核苷酸产物。在一些实施例中，分开进行切割和脱保护。在一些实施例中，在一个步骤中、或在两个或更多个步骤中(但不在其间分离产物)进行切割和脱保护。在一些实施例中，切割和/或脱保护利用碱性条件和升高的温度。在一些实施例中，对于某些手性助剂，需要氟化物条件(例如，TBAF、HF-ET3N等，任选地具有另外的碱)。合适的切割和脱保护技术(例如，试剂、条件等)包括以下中描述的那些：US9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每个的切割和脱保护技术通过引用结合在此。某些切割和脱保护技术(例如，试剂、条件、方法等)在实例中进行了说明。
在一些实施例中，在碱性条件下去除某些手性助剂。在一些实施例中，使寡核苷酸与碱(例如，具有N(R)3的结构的胺)接触以去除某些手性助剂(例如，包含如在本披露中所述的G2中的吸电子的基团的那些)。在一些实施例中，碱是NHR2。在一些实施例中，每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，每个R独立地是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，胺是DEA。在一些实施例中，胺是TEA。在一些实施例中，作为溶液提供胺，例如，乙腈溶液。在一些实施例中，这种接触在无水条件下进行。在一些实施例中，在实现所希望的寡核苷酸长度(例如，合成循环后的第一步骤)之后，立即进行这种接触。在一些实施例中，在去除手性助剂和/或保护基团，和/或从固体支持物切割寡核苷酸之前进行这种接触。在一些实施例中，与碱接触可以去除标准寡核苷酸合成中使用的氰基乙基基团，提供能以盐形式存在的天然磷酸酯键联(其中阳离子是例如铵盐)。在一些实施例中，与碱接触提供具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1或II-d-2、或其盐形式的核苷酸间键联。在一些实施例中，与碱接触使手性助剂自具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1或II-d-2、或其盐形式的核苷酸间键联中去除。在一些实施例中，与碱接触使手性助剂(例如，-X-L-R1)自具有式I或其盐形式的核苷酸间键联(例如，其中PL是P(＝N-L-R5))中去除。在一些实施例中，与碱接触使手性助剂(例如，-X-L-R1)自具有式III或其盐形式的核苷酸间键联中去除。在一些实施例中，在一些实施例中，与碱接触使具有式I或其盐形式的核苷酸间键联(例如，其中PL是P(＝N-L-R5))或者具有式III或其盐形式的核苷酸间键联转化成具有式II-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1或II-d-2、或其盐形式的核苷酸间键联。
循环
用于制备本披露的寡核苷酸的合适的循环包括以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647(例如，方案I、I-b、I-c、I-d、I-e、I-f等)、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每个的循环通过引用结合在此。例如，在一些实施例中，示例循环是方案I-f。在实例中说明了某些循环(例如，用于制备天然磷酸酯键联，利用其他手性助剂等)。
方案I-e.使用DPSE手性助剂的示例循环。
Figure BPA0000295055720006761
在一些实施例中，R2s是H或-OR1，其中R1不是氢。在一些实施例中，R2s是H或-OR1，其中R1是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R2s是H。在一些实施例中，R2s是-OMe。在一些实施例中，R2s是-OCH2CH2OCH3。在一些实施例中，R2s是-F。在一些实施例中，R4s是-H。在一些实施例中，R4s和R2s一起形成如在本披露中所述的桥-L-O-。在一些实施例中，-O-在2’位置与碳连接。在一些实施例中，L是-CH2-。在一些实施例中，L是-CH(Me)-。在一些实施例中，L是-(R)-CH(Me)-。在一些实施例中，L是-(S)-CH(Me)-。
纯化和表征
可以利用各种纯化和/或表征技术(方法、仪器、方案等)来纯化和/或表征依照本披露的寡核苷酸和寡核苷酸组合物。在一些实施例中，使用各种类型的HPLC/UPLC技术进行纯化。在一些实施例中，表征包括MS、NMR、UV等。在一些实施例中，可以一起进行纯化和表征，例如HPLC-MS、UPLC-MS等。示例纯化和表征技术包括以下中描述的那些：US 9695211、US9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194、和/或WO 2019/055951，其每个的纯化和表征技术通过引用结合。
在一些实施例中，本披露提供了用于制备提供的寡核苷酸和寡核苷酸组合物的方法。在一些实施例中，提供的方法包括提供具有式3-I或3-AA的结构的提供的手性试剂。在一些实施例中，提供的方法包括提供具有
Figure BPA0000295055720006771
的结构的提供的手性试剂，其中W1是-NG5，W2是O，G1和G3各自独立地是氢或选自以下的任选地经取代的基团：C1-10脂肪族、杂环基、杂芳基和芳基，G2是-C(R)2Si(R)3，并且G4和G5一起形成具有高达约20个环原子的任选地经取代的饱和的、部分不饱和的、或不饱和的含杂原子的环，该环是单环或多环、稠和的或未稠和的，其中每个R独立地是氢，或者选自以下的任选地经取代的基团：C1-C6脂肪族、碳环基、芳基、杂芳基、和杂环基。在一些实施例中，提供的手性试剂具有
Figure BPA0000295055720006772
Figure BPA0000295055720006773
的结构，其中每个变量独立地如本披露所描述的。在一些实施例中，提供的方法包含提供亚磷酰胺，该亚磷酰胺包含来自具有
Figure BPA0000295055720006774
Figure BPA0000295055720006775
的结构的手性试剂的部分的，其中-W1H和-W2H、或者羟基和氨基基团与亚磷酰胺的磷原子形成键。在一些实施例中，-W1H和-W2H、或者羟基和氨基基团与亚磷酰胺的磷原子形成键，例如，以
Figure BPA0000295055720006776
在一些实施例中，亚磷酰胺具有
Figure BPA0000295055720006777
Figure BPA0000295055720006781
Figure BPA0000295055720006791
的结构，或其中BPRO是如本披露所述的BA，并且每个其他变量是如本披露中所述。在一些实施例中，BPRO是受保护的核碱基。在一些实施例中，BPRO是受保护的A、T、G、C、U或其互变异构体。在一些实施例中，R是保护基团。在一些实施例中，R是DMTr。
在一些实施例中，G2是-C(R)2Si(R)3，其中-C(R)2-是任选地经取代的-CH2-，并且-Si(R)3的每个R独立地是选自以下的任选地经取代的基团：C1-10脂肪族、杂环基、杂芳基和芳基。在一些实施例中，-Si(R)3的至少一个R独立地是任选地经取代的C1-10烷基。在一些实施例中，-Si(R)3的至少一个R独立地是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，-Si(R)3的一个R独立地是任选地经取代的苯基，并且另外两个R独立地是任选地经取代的C1-10烷基。在一些实施例中，-Si(R)3的一个R独立地是任选地经取代的C1-10烷基，并且另外两个R独立地是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，G2是任选地经取代的-CH2Si(Ph)(Me)2。在一些实施例中，G2是任选地经取代的-CH2Si(Me)(Ph)2。在一些实施例中，G2是-CH2Si(Me)(Ph)2。在一些实施例中，G2是-CH2SiMe3。在一些实施例中，G2是-CH2Si(iPr)3。在一些实施例中，G4和G5一起形成任选地经取代的饱和的含有一个氮原子的5-6元环(G5附接在其上)。在一些实施例中，G4和G5一起形成任选地经取代的饱和的含有一个氮原子的5元环。在一些实施例中，G1是氢。在一些实施例中，G3是氢。在一些实施例中，G1和G3均是氢。在一些实施例中，G1和G3均为氢，G2是-C(R)2Si(R)3，其中-C(R)2-是任选地经取代的-CH2-，并且R-Si(R)3的每个独立地是选自以下的任选地经取代的基团：C1-10脂肪族、杂环基、杂芳基和芳基，并且G4和G5一起形成含有一个氮原子的任选地经取代的饱和的5元环。在一些实施例中，提供的方法进一步包括提供含有氟的试剂。在一些实施例中，提供的含有氟的试剂在合成后从寡核苷酸去除手性试剂、或者从手性试剂形成的产物。依照本披露可以利用各种已知的含有氟的试剂(包括用于去除-SiR3基团的那些F-源)，例如，TBAF、HF3-Et3N等。在一些实施例中，与传统的方法(如浓缩氨)相比，含有氟的试剂提供了更好的结果，例如，更短的治疗时间、较低的温度、较少的去硫化等。在一些实施例中，对于某个含有氟的试剂，本披露提供了用于改善结果的接头，例如，在去除手性试剂(或在寡核苷酸合成期间由其形成的产物)期间从支持物较少的切割寡核苷酸。在一些实施例中，提供的接头是SP接头。在一些实施例中，本披露证明可以利用HF-碱复合物(如HF-NR3)，以在去除手性试剂(或在寡核苷酸合成期间由其形成的产物)期间控制切割。在一些实施例中，HF-NR3是HF-NEt3。在一些实施例中，HF-NR3能够使用传统的接头，例如琥珀酰基接头。
在一些实施例中，如本文所述，G2例如，在其α位置包含吸电子基团。在一些实施例中，G2是被一个或多个吸电子基团取代的甲基。在一些实施例中，吸电子的基团包含和/或通过例如，-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-P(S)R1-、或-C(O)-与碳原子连接。在一些实施例中，吸电子基团是-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2、或-P(S)(R1)2。在一些实施例中，吸电子基团是芳基或杂芳基，例如，被-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2、或-P(S)(R1)2中的一个或多个取代的苯基。在一些实施例中，G2是-CH2S(O)R′。在一些实施例中，G2是-CH2S(O)2R′。在一些实施例中，G2是-CH2P(O)(R′)2。描述了另外的示例实施例，例如，对于手性试剂/助剂。
可以使用多种合适的技术来确认立体控制的寡核苷酸(例如，通过本文或本领域所述的方法制备的寡核苷酸)包含预期的立体控制的(手性受控的)核苷酸间键联。立体控制的(手性受控的)寡核苷酸包含至少一个立体控制的核苷酸间键联，该核苷酸间键联可以是例如，包含磷的立体控制的核苷酸间键联，呈Rp构型的立体控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联(PS)、呈Sp构型的PS等。作为非限制性实例，有用的技术包括：NMR(例如1D(一维)和/或2D(二维)1H-31P HETCOR(异核相关光谱法))、HPLC、RP-HPLC、质谱、LC-MS和立体特异性核酸酶。在一些实施例中，立体特异性核酸酶包括：全能核酸酶(benzonase)、微球菌核酸酶、和svPDE(蛇毒磷酸二酯酶)，其对Rp构型的核苷酸间键联(例如，Rp构型的PS)具有特异性；和核酸酶P1、绿豆核酸酶、和核酸酶S1，其对Sp构型的核苷酸间键联(例如，Sp构型的PS)具有特异性。
在一些实施例中，本披露涉及确认或鉴定寡核苷酸的骨架的立体化学模式、和/或特定的核苷酸间键联的立体化学的方法。在一些实施例中，寡核苷酸包含含有磷的立体控制的核苷酸间键联、Rp构型的立体控制的硫代磷酸酯(PS)、或Sp构型的PS。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个立体控制的核苷酸间键联和非立体控制的至少一个核苷酸间键联。在一些实施例中，方法包括用立体特异性核酸酶消化寡核苷酸。在一些实施例中，立体特异性核酸酶选自：全能核酸酶(benzonase)、微球菌核酸酶、和svPDE(蛇毒磷酸二酯酶)，其对Rp构型的核苷酸间键联(例如，Rp构型的PS)具有特异性；和核酸酶P1、绿豆核酸酶、和核酸酶S1，其对Sp构型的核苷酸间键联(例如，Sp构型的PS)具有特异性。在一些实施例中，分析通过用立体特异性核酸酶消化产生的寡核苷酸或其片段。在一些实施例中，通过NMR、1D(一维)和/或2D(二维)1H-31P HETCOR(异核相关光谱法)、HPLC、RP-HPLC、质谱、LC-MS、UPLC等分析寡核苷酸或其片段(例如，通过立体特异性核酸酶产生的)。在一些实施例中，寡核苷酸或其片段与具有已知的立体化学模式的寡核苷酸的化学合成的片段进行比较。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，在至少一些情况下，特定的核酸酶的立体定向性可以通过修饰(例如，2’-修饰)糖、通过碱基序列、或通过立体化学上下文来改变。例如，在一些实施例中，全能核酸酶和微球菌核酸酶(其对Rp核苷酸间键联具有特异性)两者均能够切割分离的PS Rp核苷酸间键联(由PS Sp核苷酸间键联侧翼的)。
可以利用各种技术和材料。在一些实施例中，本披露提供了有用的技术的组合。例如，在一些实施例中，可以通过用立体特异性核酸酶消化寡核苷酸、并通过任何种类技术(例如，基于质荷比的分离、NMR、HPLC、质谱等)分析所得片段(例如，核酸酶消化产物)来确认寡核苷酸的一个或多个特定的核苷酸间键联的立体化学。在一些实施例中，通过例如，经由控制立体化学的技术产生的与化学合成的片段(例如，二聚体、三聚体、四聚体等)进行比较(例如，NMR，HPLC，质谱等)，可以确认用立体特异性核酸酶消化寡核苷酸的产物的立体化学。
在一个实例中，证实寡核苷酸在骨架中具有设计和预期的立体化学模式。所测试的寡核苷酸包含含有2′-脱氧核苷的核心，其中除Rp构型的一个PS外，其他所有核苷酸间键联均为Sp构型的PS；以及两个翼，每个翼包含2′-OMe核苷，其中除了每个翼中Sp构型的一个PS外，每个翼中的其他所有核苷酸间键联都是磷酸二酯(PO)。用立体特异性核酸酶(例如，核酸酶P1)消化寡核苷酸。分析了各种片段(例如，通过LC-MS并通过与已知立体化学的化学合成片段进行比较)。证实寡核苷酸在其骨架中具有预期的立体化学模式。
在另一个实例中，使用立体特异性核酸酶消化并分析所得片段，证实具有不同序列的寡核苷酸在其骨架中具有预期的立体化学模式。该寡核苷酸包含含有2′-脱氧核苷酸的核心，其中除Rp构型的一个PS外，其他所有核苷酸间键联均为Sp构型的PS；以及两个翼，每个翼包含2′-OMe核苷酸，其中除了每个翼中Sp构型的一个PS外，每个翼中的其他所有核苷酸间键联都是磷酸二酯(PO)。
在又一个实例中，测试不同的寡核苷酸以证实核苷酸间键联处于预期的构型。寡核苷酸能够跳读DMD的外显子51；寡核苷酸中的大多数核苷酸是2′-F，并且其余为2’-OMe；寡核苷酸中的大部分核苷酸间键联是Sp构型的PS，并且其余为PO。通过用立体特异性核酸酶消化来测试此寡核苷酸，并分析所得的消化片段(例如，通过LC-MS并通过与已知立体化学的化学合成片段比较)。结果证实寡核苷酸具有立体控制的核苷酸间键联的预期模式。
在一些实施例中，NMR可用于表征和/或确认立体化学。在一组示例实验中，测试包含立体控制的CpG基序的一组寡核苷酸以证实CpG基序的预期立体化学。该组的寡核苷酸包含具有pCpGp的结构的基序，其中C是胞嘧啶，G是鸟嘌呤，并且p是立体随机或立体控制的硫代磷酸酯(例如，以Rp或Sp构型))。例如，一种寡核苷酸包含pCpGp结构，其中硫代磷酸酯(例如，ppp)的立体化学模式是RRR；在另一种寡核苷酸，ppp的立体化学模式是RSS；在另一种寡核苷酸，ppp的立体化学模式是RSR；等。在该组中，表示了ppp的所有可能的立体化学模式。在pCpGp结构外的寡核苷酸部分中，所有核苷酸间键联均为PO；寡核苷酸中的所有核苷均为2’-脱氧基。这些各种寡核苷酸在NMR中测试，没有用立体特异性核酸酶消化，并且观察到独特的峰模式，表明每个PS是Rp或Sp产生的独特的峰，并证实寡核苷酸包含预期的立体化学的立体控制的PS核苷酸间键联。
确认了各种其他立体控制的寡核苷酸的核苷酸间键联的立体化学模式，其中寡核苷酸包含多种化学修饰和立体化学模式。
如本领域的技术人员将理解，在一些实施例中，步骤、循环或制备的产物寡核苷酸是包含如本文所述的O5P、OP、*PD、*PDS、*PDR、*N、*NS和/或*NR的寡核苷酸，该寡核苷酸任选地经由接头(例如，CAN接头)与支持物(例如，CPG)任选地连接。例如，在一些实施例中，在偶联和/或修饰前加帽后且在修饰前，O5P是
Figure BPA0000295055720006831
或其盐形式。在一些实施例中，在修饰后，O5P是LPO、LPA、LPB或其盐形式。
代谢产物
在一些实施例中，DMD寡核苷酸对应于不同的更长的DMD寡核苷酸的片段。在一些实施例中，DMD寡核苷酸对应于通过较长的DMD寡核苷酸的切割(例如，通过核酸酶的酶促切割)(其产生较长的DMD寡核苷酸的片段或部分)产生的代谢产物。在一些实施例中，本披露涉及DMD寡核苷酸，其对应于通过本文所述的DMD寡核苷酸的切割产生的代谢产物。在一些实施例中，本披露涉及对应于本文披露的DMD寡核苷酸的部分或片段的DMD寡核苷酸。
进行了若干实验，其中在包含核酸酶的各种物质中的任何一种的存在下，在体外孵育DMD寡核苷酸。在各种实验中，此类物质包括来自斯普拉格-道利(Sprague-Dawley)大鼠或食蟹猴的脑匀浆、脑脊液或血浆。血浆被肝素化。将寡核苷酸孵育多个时间点(例如对于脑组织匀浆，0、1、2、3、4或5天，其中预孵育时间是0、1或2天；对于脑脊液，0、1、2、4、8、16、24或48小时；或对于血浆，0、1、2、4、8、16或24小时)。预孵育指示在添加寡核苷酸之前，将匀浆在37摄氏度下孵育0、24或48小时以激活酶。寡核苷酸的最终浓度和体积是在200μl中20μM。通过LC/MS分析通过切割寡核苷酸产生的产物。
对于在大鼠脑匀浆中测试的一种长20个碱基的DMD寡核苷酸，主要代谢产物代表寡核苷酸的3′端，这些代谢产物被截短4、10、11、12或13个碱基。
一个测试DMD寡核苷酸的长度是20个碱基，并在大鼠脑匀浆中进行了测试，产生了主要的代谢产物，这些代谢产物在5′端被截短4、10、11、12或13个碱基，剩下的代谢产物代表了寡核苷酸的3′端并且分别长16、10、9、8或7个碱基。该寡核苷酸还产生了代谢产物，该代谢产物是5′片段，长12个碱基(在3′端被截短8个碱基)。
第二测试寡核苷酸的长度是20个碱基，并在大鼠脑匀浆中进行了测试，产生了主要的代谢产物，这些代谢产物在3′端被截短4、8、9或10个碱基，剩下的代谢产物代表了寡核苷酸的5′端并且分别长16、12、11或10个碱基。
所测试的两个寡核苷酸包含核苷酸间键联，其是磷酸二酯、Rp构型的硫代磷酸酯和Sp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，磷酸二酯比Rp构型的硫代磷酸酯或Sp构型的硫代磷酸酯更不稳定。在某些情况下，寡核苷酸的代谢产物代表在磷酸二酯处切割的产物。
在一些实施例中，本披露涉及对应于本文披露的DMD寡核苷酸的代谢产物的DMD寡核苷酸。在一些实施例中，本披露涉及比本文披露的DMD寡核苷酸短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或更多个碱基的DMD寡核苷酸。在一些实施例中，本披露涉及具有以下碱基序列的DMD寡核苷酸，所述碱基序列比本文披露的DMD寡核苷酸的碱基序列短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或更多个碱基。
在一些实施例中，将代谢产物命名为3’-N-#或5′-N-#，其中#表示去除的碱基数，并且3′或5′表示碱基从分子的哪端去除。例如，3′-N-1表示片段或代谢产物，其中从3′端去除了1个碱基。
在一些实施例中，本披露可能是对应于本文披露的DMD寡核苷酸的片段或代谢产物的寡核苷酸，其中所述片段或代谢产物可以描述为对应于本文所述的DMD寡核苷酸的3′-N-1、3′-N-2、3′-N-3、3′-N-4、3′-N-5、3′-N-6、3′-N-7、3′-N-8、3′-N-9、3′-N-10、3′-N-11、3′-N-12、5′-N-1、5′-N-2、5′-N-3、5′-N-4、5′-N-5、5′-N-6、5′-N-7、5′-N-8、5′-N-9、5′-N-10、5′-N-11或5′-N-12。
在一些实施例中，本披露涉及比本文披露的DMD寡核苷酸在5′端短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或更多个碱基的DMD寡核苷酸。在一些实施例中，本披露涉及具有以下碱基序列的DMD寡核苷酸，所述碱基序列在5′端比本文披露的DMD寡核苷酸的碱基序列短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或更多个碱基。在一些实施例中，本披露涉及比本文披露的DMD寡核苷酸在3′端短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或更多个碱基的DMD寡核苷酸。在一些实施例中，本披露涉及具有以下碱基序列的DMD寡核苷酸，所述碱基序列在3′端比本文披露的DMD寡核苷酸的碱基序列短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或更多个碱基。
在一些实施例中，本披露涉及对应于DMD寡核苷酸的代谢产物的DMD，其中所述代谢产物相对于本文披露的DMD寡核苷酸在5′和/或3′端被截短。在一些实施例中，本披露涉及对应于DMD寡核苷酸的代谢产物的DMD，其中所述代谢产物相对于本文披露的DMD寡核苷酸在5′和3′端均被截短。在一些实施例中，本披露涉及比本文披露的DMD寡核苷酸在5′端和/或3′端短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或更多个总碱基的DMD寡核苷酸。在一些实施例中，本披露涉及具有以下碱基序列的DMD寡核苷酸，所述碱基序列在5′端和/或3′端比本文披露的DMD寡核苷酸的碱基序列短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或更多个总碱基。
在一些实施例中，本披露涉及DMD寡核苷酸，所述DMD寡核苷酸将由本文披露的DMD寡核苷酸的切割产物代表，其在磷酸二酯键联处切割。在一些实施例中，本披露涉及DMD寡核苷酸，所述DMD寡核苷酸将由本文披露的DMD寡核苷酸的切割产物代表(如果这样的寡核苷酸在Rp构型的硫代磷酸酯键联处切割)。在一些实施例中，本披露涉及DMD寡核苷酸，所述DMD寡核苷酸将由本文披露的DMD寡核苷酸的切割产物代表(如果这样的寡核苷酸在Rp构型的一个或多个磷酸二酯键联和/或硫代磷酸酯键联处切割)。
生物学应用、示例用途、和给药方案
如本文所述，提供的组合物和方法可用于各种目的，例如，以下中描述的那些：US9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679、和/或WO 2017/210647。除其他事项外，提供的技术可以通过许多化学和/或生物学机制、途径、等起作用和/或提供各种益处(例如，核糖核酸酶H、RNAi、剪接调节(外显子跳读(例如，用于DMD受试者/样品中的DMD)、外显子包含(例如，用于SMA受试者/样品中的SMN2))等)。在一些实施例中，提供的技术降低核酸和/或其产物的水平、活性、表达等。例如，在一些实施例中，提供的技术降低了靶转录物和/或由此编码的产物的水平和/或活性(在一些实施例中，无意通过核糖核酸酶H途径受到任何特定理论的限制)。在一些实施例中，提供的技术增加了靶转录物和/或由此编码的产物的水平和/或活性(在一些实施例中，无意通过外显子跳读受到任何特定理论的限制)。制备了包含各种类型的经修饰的核苷酸间键联(包括许多包含非负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)，其具有各种碱基序列和/或靶向各种核酸(例如，各种基因的转录物))的许多寡核苷酸，并且说明了各种有用的特性、活性和/或优点。某些此类寡核苷酸，包括包含非负电荷的核苷酸间键联的许多寡核苷酸，靶向PNPLA3、C9orf72、SMN2等的转录物并已证明具有多种活性和/或益处。包含非负电荷的核苷酸间键联并靶向多种基因的示例寡核苷酸，以及其组合物和用途包括在WO 2018/223056、WO2019/032607、PCT/US18/55653和WO 2019/032612中所述的那些，其各自通过引用独立地并入本文。
在一些实施例中，本披露提供了用于调节系统中转录物或由其编码的产物的水平的方法，该方法包括施用有效量的提供的寡核苷酸或其组合物。在一些实施例中，本披露提供了用于调节系统中转录物或由其编码的产物的水平的方法，该方法包括使转录物与提供的寡核苷酸或其组合物接触。在一些实施例中，系统是体外系统。在一些实施例中，系统是细胞。在一些实施例中，系统是组织。在一些实施例中，系统是器官。在一些实施例中，系统是生物。在一些实施例中，系统是受试者。在一些实施例中，系统是人。在一些实施例中，转录物的调节水平降低转录物的水平。在一些实施例中，转录物的调节水平提高转录物的水平。
在一些实施例中，本披露提供了用于预防或治疗与核酸序列或由其编码的产物相关的病症、疾病、或障碍的方法，该方法包括向患有或易患其的受试者施用有效量的提供的寡核苷酸或其组合物，其中寡核苷酸或其组合物调节核酸序列的转录物的水平。在一些实施例中，核酸序列是基因。在一些实施例中，转录物的调节水平降低转录物的水平。在一些实施例中，转录物的调节水平提高转录物的水平。
在一些实施例中，例如，通过敲低、外显子跳读等调节的转录物的水平改变为至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、或1000倍。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸和寡核苷酸组合物调节剪接。在一些实施例中，提供的寡核苷酸和寡核苷酸组合物促进外显子跳读，从而产生一定水平的转录物，其在外显子跳读之前具有增加的转录物的有益功能。在一些实施例中，有益功能是编码具有增加的生物学功能的蛋白质。在一些实施例中，本披露提供了用于调节剪接的方法，该方法包括向剪接系统施用提供的寡核苷酸或寡核苷酸组合物，其中改变至少一个转录物的剪接。在一些实施例中，至少一个剪接产物的水平增加至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、或1000倍。在一些实施例中，本披露提供了用于调节DMD剪接的方法，该方法包括向剪接系统施用提供的DMD寡核苷酸或其组合物。
在一些实施例中，本披露提供了用于预防或治疗DMD的方法，该方法包括向易患其或者患有其的受试者施用药物组合物，该药物组合物包含有效量的提供的寡核苷酸或寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，提供的组合物和方法提供了与参考模式相比改进的转录物的剪接模式，该参考模式是来自选自下组的参考条件的模式，该组由以下组成：不存在组合物、存在参考组合物、及其组合。改善可以是任何所希望的生物学功能的改善。在一些实施例中，例如，在DMD中，改善是产生mRNA，从中产生具有改善的生物活性的肌营养不良蛋白质。
在一些实施例中，特别地有用的和有效的是手性受控的寡核苷酸和手性受控的寡核苷酸组合物，其中寡核苷酸(或在手性受控的寡核苷酸组合物中的多个寡核苷酸)任选地包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联。除其他事项外，此类寡核苷酸和寡核苷酸组合物可以提供大大改进的效果、更好的递送、更低的毒性等。
对于杜氏肌肉营养不良，示例性突变和/或用于跳读的合适的DMD外显子在本领域中是众所周知的，包括但不限于美国专利号8,759,507、美国专利号8,486,907以及其中引用的参考文献中描述的那些。
在一些实施例中，一个或多个跳读的外显子选自外显子2、29、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60。在一些实施例中，跳读DMD的外显子2。在一些实施例中，跳读DMD的外显子29。在一些实施例中，跳读DMD的外显子40。在一些实施例中，跳读DMD的外显子41。在一些实施例中，跳读DMD的外显子42。在一些实施例中，跳读DMD的外显子43。在一些实施例中，跳读DMD的外显子44。在一些实施例中，跳读DMD的外显子45。在一些实施例中，跳读DMD的外显子46。在一些实施例中，跳读DMD的外显子47。在一些实施例中，跳读DMD的外显子48。在一些实施例中，跳读DMD的外显子49。在一些实施例中，跳读DMD的外显子50。在一些实施例中，跳读DMD的外显子51。在一些实施例中，跳读DMD的外显子52。在一些实施例中，跳读DMD的外显子53。在一些实施例中，跳读DMD的外显子54。在一些实施例中，跳读DMD的外显子50。在一些实施例中，跳读DMD的外显子55。在一些实施例中，跳读的外显子是其包含降低了DMD的所希望的功能的任何外显子。在一些实施例中，跳读的外显子是其跳读增加了DMD的所希望的功能的任何外显子。
在一些实施例中，跳读超过一个DMD的外显子。在一些实施例中，跳读两个或更多个DMD的外显子。在一些实施例中，跳读两个或更多个DMD的相邻外显子。
在一些实施例中，为了DMD转录物的外显子跳读，或为了治疗DMD，提供的多种寡核苷酸的序列包含本文中的DMD序列表。在一些实施例中，序列包含美国专利号8,759,507的SEQ ID No 1-30之一。在一些实施例中，序列包含美国专利号US 8,486,907的SEQ ID No1-211之一。在一些实施例中，为了DMD转录物的外显子跳读，或为了治疗DMD，提供的多种寡核苷酸的序列是本文披露的DMD序列。在一些实施例中，序列是美国专利号8,759,507的SEQID No 1-30之一。在一些实施例中，序列是美国专利号US 8,486,907的SEQ ID No 1-211之一。在一些实施例中，序列是、包含本文例如表A1中任何寡核苷酸列表的序列或包含该序列的至少15个连续碱基。在一些实施例中，序列是以下中描述的序列：Kemaladewi等人，Dualexon skipping in myostatin and dystrophin for Duchenne muscular dystrophy[针对杜氏肌肉营养不良的肌生长抑制素和肌营养不良蛋白的双重外显子跳读]，BMC MedGenomics[BMC医学基因组学].2011年4月20日；4：36.doi：10.1186/1755-8794-4-36；或Malerba等人，Dual Myostatin and Dystrophin Exon Skipping by Morpholino NucleicAcid Oligomers Conjugated to a Cell-penetrating Peptide Is a PromisingTherapeutic Strategy for the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy[与细胞穿透肽结合的吗啉代核酸低聚物的双重肌生长抑制素和肌营养不良蛋白外显子跳读是一种有前景的治疗方法，用于治疗杜氏肌肉营养不良]，Mol Ther Nucleic Acids[核酸分子治疗].2012年12月18日；1：e62.doi：10.1038/mtna.2012.54。
在一些实施例中，将提供的寡核苷酸组合物以低于其他相当的参考寡核苷酸组合物的剂量和/或频率施用，在改变靶转录物的剪接方面具有相当的效果。在一些实施例中，将立体控制的(手性受控的)寡核苷酸组合物以低于其他相当的立体随机的参考寡核苷酸组合物的剂量和/或频率施用，在改变靶转录物的剪接方面具有相当的效果。如果需要，由于其较低的毒性，所提供的组合物也可以较高的剂量/频率给药。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸、组合物和方法具有低毒性，例如，当与参考组合物相比时。如本领域已知的，寡核苷酸在施用于例如细胞、组织、生物等时可以诱导毒性。在一些实施例中，寡核苷酸可以诱导不希望的免疫应答。在一些实施例中，寡核苷酸可以诱导补体活化。在一些实施例中，寡核苷酸可以诱导补体的可替代的途径的活化。在一些实施例中，寡核苷酸可以诱导炎症。除其他事项外，补体系统具有可以破坏细胞的强烈的细胞溶解活性，因此应调整以减少潜在的伤害。在一些实施例中，寡核苷酸诱导的血管损伤是寡核苷酸开发(例如，药物用途)中的复发攻击。在一些实施例中，当施用高剂量寡核苷酸时，炎症的主要来源涉及活化可替代的补体级联。在一些实施例中，补体活化是与含有硫代磷酸酯的寡核苷酸相关的常见挑战，并且还存在一些硫代磷酸酯序列以诱导先天免疫细胞活化的潜力。在一些实施例中，细胞因子释放与寡核苷酸的施用相关。例如，在一些实施例中，观察到白细胞介素-6(IL-6)单核细胞趋化蛋白(MCP-1)和/或白细胞介素-12(IL-12)的增加。参见例如，Frazier，Antisense Oligonucleotide Therapies：The Promise and theChallenges from a Toxicologic Pathologist′s Perspective[反义寡核苷酸疗法：毒理学病理学家的承诺和挑战].Toxicol Pathol.[毒物病理学]，43：78-89，2015；和Engelhardt等人，Scientific and Regulatory Policy Committee Points-to-considerPaper：Drug-induced Vascular Injury Associated with Nonsmall MoleculeTherapeutics in Preclinical Development：Part 2.Antisense Oligonucleotides[科学与监管政策委员会的重点论文：临床前开发中与非小分子药物治疗相关的药物诱发的血管损伤：第2部分，反义寡核苷酸].Toxicol Pathol.[毒物病理学]43：935-944，2015。
本文提供的寡核苷酸组合物可用作调节许多细胞过程和机制(包括但不限于转录、翻译、免疫应答、表观遗传学等)的药剂。另外，如本文提供的寡核苷酸组合物可用作研究和/或诊断目的的试剂。本领域普通技术人员将容易认识到，本披露的披露内容不限于特定用途，而是适用于需要使用合成寡核苷酸的任何情况。除其他事项外，提供的组合物可用于各种治疗、诊断、农业和/或研究应用。
可以利用各种给药方案来施用提供的手性受控的寡核苷酸组合物，例如，以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO2017/192679、和/或WO 2017/210647，其每个的给药方案通过引用结合在此。
在一些实施例中，由于它们的低毒性，所提供的寡核苷酸和组合物能以更高的剂量和/或更高的频率施用。在一些实施例中，由于其改进的递送(和其他特性)，所提供的组合物能以较低剂量和/或较低频率施用以实现生物学效应，例如临床功效。
单个剂量可含有各种量的寡核苷酸。在一些实施例中，单个剂量可含有各种量的视应用需要适合的一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，单个剂量含有约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300或更多(例如约350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多)mg的一种类型的手性受控的寡核苷酸。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸以单个剂量和/或总剂量按比手性不受控的寡核苷酸低的量施用。在一些实施例中，归因于改善的功效，手性受控的寡核苷酸以单个剂量和/或总剂量按比手性不受控的寡核苷酸低的量施用。在一些实施例中，手性受控的寡核苷酸以单个剂量和/或总剂量按比手性不受控的寡核苷酸高的量施用。在一些实施例中，归因于改善的安全性，手性受控的寡核苷酸以单个剂量和/或总剂量按比手性不受控的寡核苷酸高的量施用。
药物组合物
当用作治疗剂时，将本文所述的所提供的寡核苷酸或寡核苷酸组合物作为药物组合物施用。在一些实施例中，所述药物组合物包含治疗有效量的所提供的寡核苷酸或其药学上可接受的盐、以及至少一种药学上可接受的非活性成分，所述至少一种药学上可接受的非活性成分选自药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂以及药学上可接受的载体。在一些实施例中，在提供的组合物中提供的寡核苷酸能以盐(优选地，药学上可接受的盐，例如，钠盐、铵盐等)存在。在一些实施例中，提供的寡核苷酸的盐包含两个或更多个阳离子，例如，在一些实施例中，高达寡核苷酸中带负电荷的酸性基团(例如，磷酸根、硫代磷酸根等)的数量。如本领域技术人员所理解的，能以盐形式(特别地，药学上可接受的盐形式)提供的和/或利用本文所述的寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露提供了提供的寡核苷酸(例如，手性受控的寡核苷酸)的盐、及其药物组合物。在一些实施例中，盐是药学上可接受的盐。在一些实施例中，可以捐赠给碱的每种氢离子(例如，在水溶液、药物组合物等的条件下)被非H+阳离子替换。例如，在一些实施例中，寡核苷酸的药学上可接受的盐是全金属离子盐，其中每个核苷酸间键联(例如，天然磷酸酯键联、硫代磷酸二酯键联等)的每个氢离子(例如，-OH、-SH等，在水中足够酸性)被金属离子替换。在一些实施例中，所提供的盐是全钠盐。在一些实施例中，所提供的药学上可接受的盐是全钠盐。在一些实施例中，所提供的盐是全钠盐，其中为天然磷酸酯键联(酸形式-O-P(O)(OH)-O-)(如果存在的话)的每个核苷酸间键联以其钠盐形式(-O-P(O)(ONa)-O-)存在，并且为硫代磷酸二酯键联(硫代磷酸酯核苷酸间键联；酸形式-O-P(O)(SH)-O-)(如果存在的话)的每个核苷酸间键联以其钠盐形式(O-P(O)(SNa)-O-)存在。
在一些实施例中，配制药物组合物用于静脉内注射、口服施用、口腔施用、吸入、鼻腔施用、局部施用、眼部施用或耳部施用。在一些实施例中，药物组合物是片剂、丸剂、胶囊、液体、吸入剂、鼻喷雾剂溶液、栓剂、悬浮液、凝胶、胶体、分散体、悬浮液、溶液、乳液、软膏、洗液、滴眼液、或滴耳液。
在一些实施例中，本披露提供了药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的赋形剂混合的手性受控的寡核苷酸或其组合物。本领域技术人员将认识到，药物组合物包括上文所述的手性受控的寡核苷酸的药学上可接受的盐、或其组合物。
多种超分子纳米载体可用于递送核酸。示例纳米载体包括但不限于脂质体、阳离子聚合物复合物、和各种聚合物。核酸与各种聚阳离子的复合是用于细胞内递送的另一种方法；这包括使用聚乙二醇化的聚阳离子、聚乙烯胺(PEI)复合物、阳离子嵌段共聚物、和树状聚合物。若干种阳离子纳米载体(包括PEI和聚酰胺树状聚合物)有助于从内体释放内容物。其他方法包括使用聚合物纳米颗粒、聚合物胶束、量子点和脂质复合物。在一些实施例中，寡核苷酸与另一分子缀合。
除本文所述的示例递送策略以外，还已知另外的核酸递送策略。
在治疗和/或诊断应用中，本披露的化合物可以配制用于多种施用方式，包括全身和局部(topical或localized)施用。技术和配制品通常可以在Remington，The Scienceand Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践](第20版2000年)中找到。
所提供的寡核苷酸及其组合物在宽剂量范围内有效。例如，在治疗成年人时，每天约0.01至约1000mg、约0.5至约100mg、约1至约50mg以及每天约5至约100mg的剂量是可以使用的剂量实例。准确的剂量将取决于施用途径、施用的化合物的形式、待治疗的受试者、待治疗的受试者的体重、以及主治医师的偏好和经验。
药学上可接受的盐通常是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以包括例如但不限于乙酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯磺酸盐(besylate)、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、牛磺酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐(estolate)、酚磺乙胺(esylate)、延胡索酸盐、葡萄糖酸盐(gluceptate)、葡糖酸盐(gluconate)、谷氨酸盐、乙醇酰氨基苯胂酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、海巴明(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘甲酸盐、碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐(pamoate/embonate)、泛酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐(subacetate)、琥珀酸盐、硫酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、或茶氯酸盐(teoclate)。其他药学上可接受的盐可以例如在Remington，The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践](第20版2000年)中找到。优选的药学上可接受的盐包括例如乙酸盐、苯甲酸盐、溴化物、碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、双羟萘酸盐(pamoate/embonate)、磷酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐或酒石酸盐。
如本领域具有普通技术的人所理解的，寡核苷酸可以配制成许多盐，例如用于药物用途。在一些实施例中，盐是金属阳离子盐和/或铵盐。在一些实施例中，盐是寡核苷酸的金属阳离子盐。在一些实施例中，盐是寡核苷酸的铵盐。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。在一些实施例中，盐是寡核苷酸的钠盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐在适当时包括与寡核苷酸形成的无毒铵、季铵、和胺阳离子。如本领域具有普通技术的人所理解的，寡核苷酸的盐可含有多于一个阳离子，例如钠离子，因为在寡核苷酸内可存在多于一种阴离子。
取决于所治疗的具体病症，可将这类药剂配制成液体或固体剂型，并全身或局部施用。如本领域技术人员已知的，可以例如以定时或持续低释放形式递送这些药剂。配制和施用的技术可以在Remington，The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践](第20版2000年)中找到。合适的途径可包括口服、口腔、通过吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道、穿粘膜、鼻或肠施用；肠外递送，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、关节内、胸骨内、滑膜内、肝内、病灶内、颅内、腹膜内、鼻内或眼内注射，或其他递送方式。
对于注射剂，本披露的药剂可以在水性溶液中进行配制和稀释，如在生理相容性缓冲液中，例如汉克氏(Hank′s)溶液、格林氏(Ringer′s)溶液、或生理盐水缓冲液。对于这种穿粘膜施用，在配制品中使用适于障碍物渗透的渗透剂。此类渗透剂是本领域公知的。
使用药学上可接受的惰性载体将本文公开的用于实施本披露的化合物配制成适于全身施用的剂量在本披露的范围内。通过适当选择载体和合适的制造方法，本披露的组合物，特别是配制成溶液的组合物，可以胃肠外施用，例如通过静脉内注射。
可以使用本领域熟知的药学上可接受的载体将化合物(例如寡核苷酸)容易地配制成适于口服施用的剂量。此类载体使得本披露的化合物被配制为片剂、丸剂、胶囊、液体、胶体、糖浆剂、药浆、悬浮液等，用于由被治疗的受试者(例如患者)口服摄取。
对于鼻或吸入递送，本披露的药剂也可以通过本领域技术人员已知的方法配制，并且可以包括例如但不限于增溶、稀释或分散物质(如，盐水、防腐剂(如苯甲醇)、吸收促进剂和碳氟化合物)的实例。
在某些实施例中，寡核苷酸和组合物递送至CNS。在某些实施例中，寡核苷酸和组合物递送至脑脊液。在某些实施例中，寡核苷酸和组合物施用至脑实质。在某些实施例中，寡核苷酸和组合物通过鞘内施用或脑室内施用而递送至动物/受试者。本文所述的寡核苷酸和组合物在中枢神经系统内的广泛分布可通过实质内施用、鞘内施用、或脑室内施用来实现。
在某些实施例中，肠胃外施用通过注射进行，例如通过针筒、泵等进行。在某些实施例中，注射是快速浓注。在某些实施例中，注射直接施用至组织，如纹状体、尾状核、皮质、海马体、和小脑。
在某些实施例中，特异性定位药剂的方法(如，通过快速浓注)将中值有效浓度(EC50)降低20、25、30、35、40、45或50倍。在某些实施例中，靶组织是脑组织。在某些实施例中，靶组织是纹状体组织。在某些实施例中，降低EC50是所希望的，因为这减少了在有需要的患者中实现药理学结果所需的剂量。
在某些实施例中，寡核苷酸通过注射或输注递送，每个月、每两个月、每90天、每3个月、每6个月一次；一年两次或一年一次。
适于在本披露中使用的药物组合物包括以下组合物，其中所述组合物包含有效量的活性成分以实现它的预期目标。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力之内，尤其是根据于本文提供的具体公开内容。
除活性成分外，这些药物组合物可以含有合适的药学上可接受的载体(包含赋形剂和助剂)，这些载体有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。用于口服施用而配制的制剂可以呈片剂、糖衣丸、胶囊或溶液的形式。
用于口服使用的药物制剂可通过以下方法获得：将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地研磨所得混合物，并加工所述颗粒混合物(如果希望的话，在添加合适的助剂之后)，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂尤其是填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC)、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮(povidone))。如果需要，可添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。
糖衣丸芯提供有合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，所述糖溶液可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆胶、聚乙二醇(PEG)、和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中，以用于标识或表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的插接式胶囊(push-fit capsule)以及由明胶与增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的密封式软胶囊。插接式胶囊可以包含与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇(PEG)中。此外，还可以添加稳定剂。
在一些实施例中，本文所述的任何DMD寡核苷酸或其组合、或包含本文所述的DMD寡核苷酸的任何组合物可以与本文所述的或本领域已知的任何药物制剂组合。
缀合物和另外的化学部分的某些实施例
在一些实施例中，提供的寡核苷酸任选地通过接头包含一个或多个另外的化学部分(例如，不同于核碱基、糖和/或核苷酸间键联等的典型部分)。在一些实施例中，化学部分是脂质部分。在一些实施例中，化学部分是碳水化合物部分。在一些实施例中，化学部分是靶向部分。在一些实施例中，化学部分是配体的部分。在一些实施例中，化学部分可以增加寡核苷酸向某些细胞器、细胞、组织、器官和/或生物的递送。在一些实施例中，化学部分增强一种或多种所希望的特性和/或活性。表中呈现了某些寡核苷酸中使用的某些示例化学部分(例如，表A1中的各种Mod)。在一些实施例中，化学部分包含一个或多个糖部分或其衍生物，例如葡萄糖、甘露糖等。在一些实施例中，化学部分是或包含脂质部分。在一些实施例中，化学部分是或包含维生素E部分。在一些实施例中，化学部分包含一个或多个肽部分。在一些实施例中，肽是细胞穿透肽。在一些实施例中，肽是蛋白质例如细胞表面受体的配体。在一些实施例中，肽是Tfr1肽。利用某些示例肽部分来制备表(例如表lA)中所述的寡核苷酸。在一些实施例中，化学部分包含一个或多个碱性部分。在一些实施例中，碱性部分在例如约pH 7.4下是带正电荷的。在一些实施例中，碱性部分是或包含胍部分。在一些实施例中，碱性部分是或包含-N(R1)2，其中每个R1独立地如本披露中所述。在一些实施例中，碱性部分是或包含-N(R1)3，其中每个R1独立地如本披露中所述。在一些实施例中，碱性部分是或包含-N＝C(N(R1)2)2，其中每个R1独立地如本披露中所述。在一些实施例中，每个R1独立地是如本披露中所述的R。在一些实施例中，每个R1独立地是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R1是甲基。在一些实施例中，一个或两个R1是相同的。在一些实施例中，每个R1均相同。在一些实施例中，至少一个R1不同于另一个R1。在一些实施例中，碱性部分是-N＝C(N(CH3)2)2。在一些实施例中，化学部分包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖、肽、脂质和/或碱性部分。在一些实施例中，数目是1。在一些实施例中，数目是2。在一些实施例中，数目是3。在一些实施例中，数目是4。在一些实施例中，数目是5。在一些实施例中，数目是6。在一些实施例中，化学部分包含蛋白质(例如靶细胞的受体蛋白质)的配体部分。在一些实施例中，配体是维生素E受体的配体。在一些实施例中，配体用于Tfr1受体。如本披露中所述和证明的化学部分包括并且可以用作碳水化合物部分、脂质部分、靶向部分等，并且可以提供多种功能，例如改善递送、一种或多种特性、活性等。
在一些实施例中，本披露提供包含其他化学部分的寡核苷酸，所述其他化学部分任选地经由接头连接至寡核苷酸部分。在一些实施例中，本披露提供包含(RD)b-LM1-LM2-LM3-的寡核苷酸，其中：
每个RD独立地是化学部分；
LM1、LM2和LM3各自独立地是L；并且
b是1-1000。
在一些实施例中，LM1、LM2和LM3各自独立地是共价键，或是选自具有1-5个杂原子的C1-10脂肪族基团和C1-10杂脂肪族基团的二价或多价任选地经取代的直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、-C(R′)2-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-；并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换。
在一些实施例中，LM1包含一个或多个-N(R′)-及一个或多个-C(O)-。在一些实施例中，接头(例如，L、LM等)或LM1是或包含
Figure BPA0000295055720006971
其中nL是1-8。在一些实施例中，接头或-LM1-LM2-LM3-是
Figure BPA0000295055720006981
或其盐形式，其中nL是1-8。在一些实施例中，接头或-LM1-LM2-LM3-是
Figure BPA0000295055720006982
或其盐形式，其中：
nL是1-8。
每个氨基基团独立地连接至一部分；并且
P原子连接至寡核苷酸的5′-OH。
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720006983
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720006991
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720006992
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720006993
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720007001
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720007002
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720007003
在一些实施例中，接头或LM1是或包含
Figure BPA0000295055720007004
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含：
Figure BPA0000295055720007011
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含：
Figure BPA0000295055720007012
在一些实施例中，接头是
Figure BPA0000295055720007013
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含：
Figure BPA0000295055720007021
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含：
Figure BPA0000295055720007022
在一些实施例中，nL是1-8。在一些实施例中，nL是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，nL是1。在一些实施例中，nL是2。在一些实施例中，nL是3。在一些实施例中，nL是4。在一些实施例中，nL是5。在一些实施例中，nL是6。在一些实施例中，nL是7。在一些实施例中，nL是8。
在一些实施例中，LM2是共价键或任选经取代的直链或支链二价基团，所述二价基团选自C1-10脂肪族基团及具有1-5个杂原子的C1-10杂脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选且独立地经以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、-C(R′)2-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-；并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换。在一些实施例中，LM2是共价键或任选经取代的直链或支链二价基团，所述二价基团选自C1-10脂肪族基团及具有1-5个杂原子的C1-10杂脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选且独立地经以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、-C(R′)2-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、或-P(O)(R′)-。在一些实施例中，LM2是共价键或任选经取代的直链或支链二价C1-10脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选且独立地经以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、-C(R′)2-、-O-、-S-、-N(R′)-或-C(O)-。在一些实施例中，LM2是-NH-(CH2)6-，其中-NH-结合至LM1。
在一些实施例中，LM3是-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)-、-OP(O)(SR′)-、-OP(O)(R′)-、-OP(O)(NR′)-、-OP(S)(OR′)-、-OP(S)(SR′)-、-OP(S)(R′)-、-OP(S)(NR′)-、-OP(R′)-、-OP(OR′)-、-OP(SR′)-、-OP(NR′)-、或-OP(OR′)[B(R′)3]-。在一些实施例中，LM3是-OP(O)(OR′)-或-OP(O)(SR′)-，其中-O-结合至LM2。在一些实施例中，P原子连接至糖单元、核碱基单元或核苷酸间键联。在一些实施例中，P原子经由形成P-O键而连接-OH基团。在一些实施例中，P原子经由形成P-O键而连接至5′-OH基团。
在一些实施例中，LM1是共价键。在一些实施例中，LM2是共价键。在一些实施例中，LM3是共价键。在一些实施例中，LM1是如本披露中所描述的LM2。在一些实施例中，LM1是如本披露中所描述的LM3。在一些实施例中，LM2是如本披露中所描述的LM1。在一些实施例中，LM2是如本披露中所描述的LM3。在一些实施例中，LM3是如本披露中所描述的LM1。在一些实施例中，LM3是如本披露中所描述的LM2。在一些实施例中，LM是如本披露中所描述的LM1。在一些实施例中，LM是如本披露中所描述的LM2。在一些实施例中，LM是如本披露中所描述的LM3。在一些实施例中，LM是LM1-LM2，其中LM1及LM2中的各者独立地如本披露中所描述。在一些实施例中，LM是LM1-LM3，其中LM1及LM3中的各者独立地如本披露中所描述。在一些实施例中，LM是LM2-LM3，其中LM2及LM3中的各者独立地如本披露中所描述。在一些实施例中，LM是LM1-LM2-LM3，其中LM1、LM2及LM3中的各者独立地如本披露中所描述。
在一些实施例中，各RD独立地是如本披露中所描述的化学部分。在一些实施例中，RD是另外的化学部分。在一些实施例中，RD是靶向部分。在一些实施例中，RD是或包含碳水化合物部分。在一些实施例中，RD是或包含脂质部分。在一些实施例中，RD是或包含例如细胞受体(诸如δ受体、去唾液酸糖蛋白受体等)的配体部分。在一些实施例中，配体部分是或包含茴香酰胺部分，其可是δ受体的配体部分。在一些实施例中，配体部分是或包含脂质。在一些实施例中，配体部分是或包含GalNAc部分，其可以是脱唾液酸糖蛋白受体的配体部分。在一些实施例中，RD选自任选地经取代的苯基、
Figure BPA0000295055720007041
Figure BPA0000295055720007042
其中n′是0或1，且各其他变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，Rs是F。在一些实施例中，Rs是OMe。在一些实施例中，Rs是OH。在一些实施例中，Rs是NHAc。在一些实施例中，Rs是NHCOCF3。在一些实施例中，R′是H。在一些实施例中，R是H。在一些实施例中，R2s是NHAc，且R5s是OH。在一些实施例中，R2s是对茴香酰基，且R5s是OH。在一些实施例中，R2s是NHAc，且R5s是对茴香酰基。在一些实施例中，R2s是OH，且R5s是对茴香酰基。在一些实施例中，RD选自
Figure BPA0000295055720007051
RD的其他实施例包括其他化学部分实施例，例如实例中所描述的那些化学部分实施例。
在一些实施例中，n′是1。在一些实施例中，n′是0。
在一些实施例中，n″是1。在一些实施例中，n″是2。
在一些实施例中，提供的寡核苷酸，例如DMD寡核苷酸，与另外的组分(化学部分)缀合。在一些实施例中，包含本文所述的任何DMD寡核苷酸或其组合的组合物可以与本文所述或本领域已知的任何化学部分缀合。
在一些实施例中，包含提供的寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含是以下中任一种的另外的组分：磺酰胺(碳酸酐酶IV抑制剂)；可切割脂质；运铁蛋白受体1(CD71，TfR)配体；OCTN2转运蛋白靶向(左旋肉碱)；Glut4和Glut1受体配体；甘露糖受体C1(Mrc1)和甘露糖6P受体(M6Pr)配体；可切割脂质；胆固醇；或肽(包括但不限于短传递肽或细胞穿透肽(CPP))。
已经设计和/或构建了多种寡核苷酸，这些寡核苷酸包含另外的组分，该另外的组分是、包含或衍生自：胆固醇；左旋肉碱(酰胺和氨基甲酸酯键)；叶酸；藤黄酸；可切割脂质(1，2-甘油二月桂酸酯和酯键)；胰岛素受体配体；CPP；葡萄糖(三触角和六触角)和甘露糖(三触角和六触角，α和β)；并且已经设计了这些另外的组分的各种合成方案和包含它们的寡核苷酸或衍生自它们的分子。
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含衍生自以下的另外的组分：
Figure BPA0000295055720007061
WV-DL-14也称为WV-DL-014。在一些实施例中，藤黄酸或其衍生物结合运铁蛋白受体(CD71)。
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含衍生自左旋肉碱的另外的组分，该左旋肉碱结合OCTN2转运蛋白。在一些实施例中，包含DMD寡核苷酸的组合物包含衍生自以下的另外的组分：
Figure BPA0000295055720007071
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含另外的组分，该另外的组分是磺酰胺或其衍生物。
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含衍生自以下中任一种的另外的组分：
Figure BPA0000295055720007072
Figure BPA0000295055720007073
Figure BPA0000295055720007081
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含另外的组分，该另外的组分是或包含以下或者包含以下的衍生物：
Figure BPA0000295055720007082
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含另外的组分，该另外的组分是或包含以下或者包含以下的衍生物：
Figure BPA0000295055720007091
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含衍生自以下中任一种的另外的组分：WV-DL-001、WV-DL-002、WV-DL-003、WV-DL-006、WV-DL-007、WV-DL-008、WV-DL-009、WV-DL-010、WV-DL-011、WV-DL-012或WV-D1-014，以及其他另外的组分，其中末端-COOH用于将另外的组分缀合至接头或寡核苷酸。在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含衍生自以下中任一种的另外的组分：WV-DL-001、WV-DL-002、WV-DL-003、WV-DL-006、WV-DL-007、WV-DL-008、WV-DL-009、WV-DL-010、WV-DL-011、WV-DL-012或WV-D1-014，以及其他另外的组分，其中末端-COOH用于将另外的组分缀合至接头，其中缀合过程将-COOH转化为连接接头的-C(O)-。在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含衍生自以下中任一种的另外的组分：WV-DL-001、WV-DL-002、WV-DL-003、WV-DL-006、WV-DL-007、WV-DL-008、WV-DL-009、WV-DL-010、WV-DL-011、WV-DL-012或WV-D1-014，以及其他另外的组分，其中末端-COOH用于将另外的组分缀合至接头，其中缀合过程用-C(O)-替换-COOH，该-C(O)-连接接头(例如L001)的-NH-。此处显示使用衍生自WV-DL-006的另外的组分进行该缀合过程的产品的非限制性实例：
Figure BPA0000295055720007092
其中WV-DL-005表示另外的组分。
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含是脂质的另外的组分。在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含是脂质(包括但不限于本文所述的脂质)的另外的组分。
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含另外的组分，其中另外的组分通过可切割的接头与寡核苷酸缀合。在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含是脂质的另外的组分，其中该脂质通过可切割的接头与寡核苷酸缀合。在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含是脂质(包括但不限于本文所述的脂质)的另外的组分，其中该脂质通过可切割的接头与寡核苷酸缀合。
在一些实施例中，可切割的接头包含酯。在一些实施例中，可切割的接头在细胞内可切割，从而允许寡核苷酸与另外的组分物理分离。
在一些实施例中，可切割的接头是或包含：
Figure BPA0000295055720007101
Figure BPA0000295055720007102
此处显示了通过可切割的接头与一种或多种脂质缀合的寡核苷酸的非限制性实例：
Figure BPA0000295055720007103
Figure BPA0000295055720007111
此处显示了寡核苷酸的非限制性实例，该寡核苷酸包含通过可切割的接头与寡核苷酸连接的、是硬脂酸的另外的组分：
Figure BPA0000295055720007112
其中硬脂酸表示另外的组分。
可用于通过可切割的接头缀合硬脂酸的非限制性试剂及其示例制备和用途如下所示：
Figure BPA0000295055720007113
此处显示了可用于通过可切割的接头缀合胆固醇衍生物的非限制性试剂及其示例制备：
Figure BPA0000295055720007121
在一些实施例中，包含寡核苷酸的组合物包含衍生自以下的另外的组分：
Figure BPA0000295055720007122
在一些实施例中，包含寡核苷酸的组合物包含衍生自以下中任一种的另外的组分：
Figure BPA0000295055720007123
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含甘露糖受体配体。在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含是甘露糖受体抑制剂的甘露糖受体配体。在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含衍生自以下中任一种的另外的组分：
Figure BPA0000295055720007131
Figure BPA0000295055720007141
其中箭头表示-COOH，可用于将另外的组分缀合至寡核苷酸(任选地通过接头)。
此处显示了用于制备包含甘露糖受体配体的另外的组分的程序的非限制性实例：
Figure BPA0000295055720007151
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含是配体(或其衍生物)的另外的组分，该配体结合葡萄糖或Glut4受体。在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含是配体(或其衍生物)的另外的组分，该配体结合葡萄糖受体。在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含是配体(或其衍生物)的另外的组分，该配体结合并抑制葡萄糖受体。在一些实施例中，结合葡萄糖或Glut4受体的配体(或其衍生物)是单、双、三或六触角。在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含衍生自以下的另外的组分：
Figure BPA0000295055720007161
此处显示了三触角葡萄糖受体抑制剂的合成程序的非限制性实例：
Figure BPA0000295055720007162
此处显示了六触角葡萄糖受体抑制剂的合成程序的非限制性实例：
Figure BPA0000295055720007171
在一些实施例中，寡核苷酸，例如DMD寡核苷酸包含另外的组分，其中该另外的组分通过受体介导的内吞作用增加了寡核苷酸的内化。
在一些实施例中，寡核苷酸例如DMD寡核苷酸包含另外的组分，其中该另外的组分是适体。
在一些实施例中，寡核苷酸，例如DMD寡核苷酸包含另外的组分，其中该另外的组分是适体，该适体是肽适体，RNA适体，DNA适体，或包含RNA核苷酸、DNA核苷酸、经修饰的核苷酸、和/或氨基酸和/或肽的适体。
在一些实施例中，寡核苷酸例如DMD寡核苷酸包含另外的组分，其中该另外的组分是结合受体的适体。
在一些实施例中，寡核苷酸例如DMD寡核苷酸包含另外的组分，其中该另外的组分是结合受体的适体，该受体是甘露糖受体、甘露糖-6-磷酸受体或运铁蛋白受体。
在一些实施例中，寡核苷酸例如DMD寡核苷酸包含另外的组分，其中该另外的组分是增加寡核苷酸的内化的适体。
在一些实施例中，寡核苷酸例如DMD寡核苷酸包含另外的组分，其中该另外的组分是通过受体介导的内吞作用增加寡核苷酸的内化的适体。
在一些实施例中，寡核苷酸例如DMD寡核苷酸包含另外的组分，其中该另外的组分是或包含肽。在一些实施例中，肽是细胞穿透肽(CPP)。在一些实施例中，CPP富含精氨酸。在一些实施例中，CPP具有或包含RRQPPRSISSHPC或RRQPPRSISSHP的氨基酸序列。
此处显示了将肽与DMD寡核苷酸缀合的程序的非限制性实例：
Figure BPA0000295055720007181
在一些实施例中，肽包含RC或RRC的氨基酸序列。
在一些实施例中，肽包含以下任一种的结构：
Figure BPA0000295055720007182
提供的寡核苷酸，例如DMD寡核苷酸，可以作为PMO与细胞穿透肽缀合。Yokota等人2012 Nucl.Acid Ther.[核酸疗法]22：306；Wu等人2009 Mol.Ther.[分子疗法]17：864-871；Goyenvalle等人2010 Mol.Ther.[分子疗法]18，198-205；Jearawiriyapaisarn等人2010 Cardiovasc.Res.[心血管研究]85，444-453.；Crisp等人2011 Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]20，413-421；Widrick等人2011；Wu等人2011 PLoS One 6，e19906。
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含一个或多个肽和/或肽标签。在一些实施例中，肽是或包含肌肉靶向七肽(MSP)。在一些实施例中，肌肉靶向七肽的序列是或包含ASSLNIAXB的序列。在一些实施例中，肽是或包含细胞穿透肽。在一些实施例中，细胞穿透肽的序列包含多个精氨酸。在一些实施例中，细胞穿透肽的序列是或包含RXRRBRRXRRBRXB。
在一些实施例中，肽的序列是或包含以下的序列：ASSLNIAXB、RXRRBRRXRRBRXB、RXRRXRRXRRXRXB、ASSLNIAXB-RXRRBRRXRRBRXB、RXRRBRRXRRBRXB-ASSLNIAXB，或包含ASSLNIAXB以及RXRRBRRXRRBRXB或RXRRXRRXRRXRXB中任一者的任何序列，其中R是L-精氨酸，X是6-氨基己酸并且B是β-丙氨酸。
可以将与富含精氨酸的细胞穿透肽(B-肽)融合的肌肉靶向七肽(MSP)缀合至提供的根据本披露的寡核苷酸。Yin等人2009 Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]18：4405-4414。Yokota等人2009 Arch.Neurol.[神经病学年鉴]66：32。
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含茴香酰胺或其衍生物。
在一些实施例中，包含寡核苷酸例如DMD寡核苷酸的组合物包含一个或多个胍鎓基团。据报道，vPMO是吗啉代寡聚体，其与树状聚合物支架上含有八个末端胍鎓基团的递送部分缀合，这些胍鎓基团使得能够进入细胞。Morcos等人2008 Biotechniques[生物技术]45：613-618；Yokota等人2012 Nucl.Acid Ther.[核酸疗法]22：306。
在一些实施例中，使用链条(leash)递送寡核苷酸，例如DMD寡核苷酸。链条的非限制性实例报告于以下：Gebski等人2003 Hum.Mol.Gen.[人类分子遗传学]12：1801-1811。
在一些实施例中，另外的化学部分是胆固醇；左旋肉碱(酰胺和氨基甲酸酯键)；叶酸；可切割脂质(1，2-甘油二月桂酸酯和酯键)；胰岛素受体配体；藤黄酸；CPP；葡萄糖(三触角和六触角)或甘露糖(三触角和六触角，α和β)。
表中描述了某些化学部分，例如脂质部分、碳水化合物部分、靶向部分等，以及用于将这类部分连接至寡核苷酸链(例如，通过糖、核碱基、核苷酸间键联等)的接头部分，作为实例；例如WO 2017/062862、WO 2017/192679、WO 2017/210647等中描述了一些此类化学和接头部分及用于其制备、与寡核苷酸链的缀合和使用的相关技术。
脂质
在一些实施例中，另外的化学部分/组分是脂质部分。在一些实施例中，本披露提供寡核苷酸组合物，这些组合物进一步包含一个或多个脂质。在一些实施例中，将脂质部分并入寡核苷酸可以提供意想不到的、大大改善的特性(例如，活性、毒性、分布、药代动力学等)。
可通过将活性化合物与脂质组合来获得组合物。在一些实施例中，脂质与活性化合物缀合。在一些实施例中，脂质不与活性化合物缀合。在一些实施例中，脂质包含C10-C40直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选经一个或多个C1-4脂肪族基团取代的C10-C40直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含C10-C60直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选经一个或多个C1-4脂肪族基团取代的C10-C60直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含C10-C80直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选经一个或多个C1-4脂肪族基团取代的C10-C80直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含C10-C100直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选经一个或多个C1-4脂肪族基团取代的C10-C100直链饱和或部分不饱和脂肪族链。
在一些实施例中，脂质包含任选地经取代的C10-C80饱和或部分不饱和脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被选自以下的任选地经取代的基团替换：C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基、-C≡C-、C1-C6杂脂肪族部分、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-和-C(O)O-，其中每个变量独立地如本文所定义和描述。在一些实施例中，脂质包含任选地经取代的C10-C80饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选地经取代的C10-C80直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选经一个或多个C1-4脂肪族基团取代的C10-C80直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选地经取代的C10-C60饱和或部分不饱和脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被选自以下的任选地经取代的基团替换：C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基、-C≡C-、C1-C6杂脂肪族部分、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-和-C(O)O-，其中每个变量独立地如本文所定义和描述。在一些实施例中，脂质包含任选地经取代的C10-C60饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选地经取代的C10-C60直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选经一个或多个C1-4脂肪族基团取代的C10-C60直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选地经取代的C10-C40饱和或部分不饱和脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被选自以下的任选地经取代的基团替换：C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基、-C≡C-、C1-C6杂脂肪族部分、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-和-C(O)O-，其中每个变量独立地如本文所定义和描述。在一些实施例中，脂质包含任选地经取代的C10-C40饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选地经取代的C10-C40直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含任选经一个或多个C1-4脂肪族基团取代的C10-C40直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含未经取代的C10-C80直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含不超过一个任选地经取代的C10-C80直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含两个或更多个任选地经取代的C10-C80直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含未经取代的C10-C60直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含不超过一个任选地经取代的C10-C60直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含两个或更多个任选地经取代的C10-C60直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含未经取代的C10-C40直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含不超过一个任选地经取代的C10-C40直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含两个或更多个任选地经取代的C10-C40直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质包含C10-C40直链饱和或部分不饱和脂肪族链。在一些实施例中，脂质选自由以下组成的组：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(顺-DHA)、喇叭藻酸和二亚油基。在一些实施例中，脂质不与寡核苷酸链缀合(无论是否通过一个或多个接头部分)。在一些实施例中，脂质任选地通过一个或多个接头部分与寡核苷酸链缀合。
在一些实施例中，脂质选自由以下组成的组：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(顺-DHA)、喇叭藻酸和二亚油基。在一些实施例中，脂质具有以下任一种的结构：
Figure BPA0000295055720007221
在一些实施例中，活性化合物是本文所述的寡核苷酸。在一些实施例中，活性化合物是能够介导肌营养不良蛋白中外显子的跳读的寡核苷酸。在一些实施例中，活性化合物是能够介导肌营养不良蛋白中外显子51的跳读的寡核苷酸。在一些实施例中，活性化合物是具有包含本文所述的任何核酸的任何序列或由所述序列组成的序列的核酸。在一些实施例中，活性化合物是具有包含表A1中所列的任何寡核苷酸的任何序列或由所述序列组成的序列的核酸。在一些实施例中，组合物包含脂质和活性化合物，且进一步包含选自以下的另一组分：另一脂质和靶向性化合物或部分。在一些实施例中，脂质包括但不限于：氨基脂质；两亲脂质；阴离子脂质；载脂蛋白；阳离子脂质；低分子量阳离子脂质；如CLinDMA和DLinDMA的阳离子脂质；可电离阳离子脂质；掩蔽组分；辅助脂质；脂肽；中性脂质；中性两性离子脂质；疏水性小分子；疏水性维生素；PEG-脂质；被一个或多个亲水性聚合物修饰的不带电脂质；磷脂；如1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺的磷脂；隐形脂质；固醇；胆固醇；以及靶向性脂质；以及本文所述或本领域所报道的任何其他脂质。在一些实施例中，组合物包含脂质和能够介导另一脂质的至少一种功能的另一脂质的一部分。在一些实施例中，靶向性化合物或部分能够使化合物(例如，包含脂质和活性化合物的组合物)靶向特定细胞或组织或者细胞或组织的亚组。在一些实施例中，靶向性部分被设计成用于利用特定靶标、受体、蛋白质或其他亚细胞组分的细胞特异性或组织特异性表达。在一些实施例中，靶向部分是将组合物靶向细胞或组织和/或结合至靶标、受体、蛋白质或其他亚细胞组分的配体(例如，小分子、抗体、肽、蛋白质、碳水化合物、适体等)。
在一些实施例中，并入脂质部分以递送活性化合物允许(例如，不阻止或干扰)活性化合物的功能。非限制性例示性脂质包括：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(顺-DHA)、喇叭藻酸和二亚油基。
在一些实施例中，脂质缀合(如与脂肪酸缀合)可改善寡核苷酸的一个或多个特性。在一些实施例中，脂质缀合改善递送。
在一些实施例中，如实验数据所支持，与脂质的缀合可以增加跳读效率。
在一些实施例中，用于递送活性化合物的组合物能够将活性化合物根据需要靶向特定细胞或组织。在一些实施例中，用于递送活性化合物的组合物能够将活性化合物靶向肌肉细胞或组织。在一些实施例中，本披露涉及与活性化合物的递送相关的组合物和方法，其中组合物包含活性化合物、脂质。在关于肌肉细胞或组织的一些实施例中，脂质选自：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(顺-DHA)、喇叭藻酸和二亚油基。制备了包含活性化合物(WV-942)和脂质的示例组合物，并且这些组合物能够将活性化合物递送至靶细胞和组织，例如肌肉细胞和组织。所用的示例脂质包括硬脂酸、油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、顺-DHA、喇叭藻酸和二亚油酸。
包含活性化合物和以下中任何一种的各种组合物：硬脂酸、油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、顺-DHA或喇叭藻酸，能够将活性化合物递送至各种组织，包括腓肠肌肌肉组织、心肌组织、股四头肌肌肉组织、腓肠肌肌肉组织和膈肌组织。
在一些实施例中，组合物包含脂质，该脂质选自：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(顺-DHA)、喇叭藻酸和二亚油基，并且活性化合物能够将活性化合物递送至肝外细胞和组织，例如肌肉细胞和组织。
在一些实施例中，脂质具有RLD-OH的结构，其中RLD是任选地经取代的C10-C80饱和或部分不饱和脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、-C≡C-、C1-C6杂脂肪族部分、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-N(R’)C(O)O-、-OC(O)N(R’)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-N(R’)S(O)2--SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-和-C(O)O-。在一些实施例中，脂质具有RLD-C(O)OH的结构。在一些实施例中，RLD是
Figure BPA0000295055720007241
Figure BPA0000295055720007251
本文描述了包含此类RLD基团的示例寡核苷酸，并且在WO 2017/062862中，RLD的描述通过引用并入本文。
在一些实施例中，脂质任选地通过接头部分与活性化合物缀合。在一些实施例中，接头是LM。在一些实施例中，接头是L。在一些实施例中，-L-包含二价脂肪族链。在一些实施例中，-L-包含磷酸酯基。在一些实施例中，-L-包含硫代磷酸酯基。在一些实施例中，-L-具有-C(O)NH-(CH2)6-OP(＝O)(S-)-的结构。在一些实施例中，-L-具有-C(O)NH-(CH2)6-OP(＝O)(O-)-的结构。
脂质，任选地通过接头，可以在各种合适的位置处与寡核苷酸缀合。在一些实施例中，脂质通过5′-OH基团缀合。在一些实施例中，脂质通过3′-OH基团缀合。在一些实施例中，脂质通过一个或多个糖部分缀合。在一些实施例中，脂质通过一种或多种碱基缀合。在一些实施例中，脂质通过一个或多个核苷酸间键联结合。在一些实施例中，寡核苷酸可包含多个缀合的脂质，这些脂质独立地通过其5′-OH、3′-OH、糖部分、碱基部分和/或核苷酸间键联缀合。
在一些实施例中，组合物包含寡核苷酸，例如DMD寡核苷酸，和选自以下的脂质：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(顺-DHA)、喇叭藻酸、花生四烯酸和二亚油基，其中脂质直接缀合至生物活性剂(脂质和生物活性剂之间没有接头插入)。在一些实施例中，组合物包含寡核苷酸，和选自以下的脂质：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十二碳六烯酸(顺-DHA)、喇叭藻酸和二亚油基，其中脂质直接缀合至生物活性剂(脂质和生物活性剂之间没有接头插入)。
在一些实施例中，组合物包含DMD寡核苷酸和本领域已知的任何脂质，其中脂质与寡核苷酸缀合或不与寡核苷酸缀合。
脂质的非限制性实例以及制备脂质和缀合脂质的方法在例如WO 2017/062862中提供，其脂质和相关方法通过引用并入本文。
靶向部分
在一些实施例中，另外的化学部分/组分是靶向部分。在一些实施例中，提供的组合物进一步包含靶向部分。在一些实施例中，将靶向部分与寡核苷酸链缀合。在一些实施例中，将生物活性剂与脂质和寡核苷酸链都缀合。根据本披露，可以使用各种靶向部分，例如脂质、抗体、肽、碳水化合物等。
可以根据本披露通过多种类型的方法将靶向部分并入提供的技术中。在一些实施例中，靶向部分与寡核苷酸以化学方式缀合。
在一些实施例中，提供的组合物包含两个或更多个靶向部分。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含两个或更多个缀合的靶向部分。在一些实施例中，两个或更多个缀合的靶向部分是相同的。在一些实施例中，两个或更多个缀合的靶向部分是不同的。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含不超过一个靶向部分。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含不同类型的缀合的靶向部分。在一些实施例中，提供的组合物的寡核苷酸包含相同类型的靶向部分。
靶向部分可以任选地通过接头与寡核苷酸缀合。本领域多种类型的接头可以根据本披露使用。在一些实施例中，接头包含磷酸酯基，其可例如用于通过与寡核苷酸合成中所使用的那些类似的化学方法来缀合靶向部分。在一些实施例中，接头包含酰胺、酯或醚基团。在一些实施例中，接头是LM。在一些实施例中，接头具有-L-的结构。与脂质相比，靶向部分可以通过相同或不同的接头缀合。
靶向部分，任选地通过接头，可以在各种合适的位置处与寡核苷酸缀合。在一些实施例中，靶向部分通过5′-OH基团缀合。在一些实施例中，靶向部分通过3′-OH基团缀合。在一些实施例中，靶向部分通过一个或多个糖部分缀合。在一些实施例中，靶向部分通过一个或多个碱基缀合。在一些实施例中，靶向部分通过一个或多个核苷酸间键联并入。在一些实施例中，寡核苷酸可包含多个缀合的靶向部分，这些靶向部分独立地通过其5′-OH、3′-OH、糖部分、碱基部分和/或核苷酸间键联缀合。靶向部分和脂质可以在相同、相邻和/或分开的位置处缀合。在一些实施例中，靶向部分在寡核苷酸的一端缀合，而脂质在另一端缀合。
在一些实施例中，靶向部分与靶细胞表面上的蛋白质相互作用。在一些实施例中，这样的相互作用促进内化成靶细胞。在一些实施例中，靶向部分包含糖部分。在一些实施例中，靶向部分包含多肽部分。在一些实施例中，靶向部分包含抗体。在一些实施例中，靶向部分是抗体。在一些实施例中，靶向部分包含抑制剂。在一些实施例中，靶向部分来自小分子抑制剂的部分。在一些实施例中，抑制剂是靶细胞表面上的蛋白质的抑制剂。在一些实施例中，抑制剂是碳酸酐酶抑制剂。在一些实施例中，抑制剂是在靶细胞表面上表达的碳酸酐酶抑制剂。在一些实施例中，碳酸酐酶是I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV或XVI。在一些实施例中，碳酸酐酶是膜结合的。在一些实施例中，碳酸酐酶是IV、IX、XII或XIV。在一些实施例中，抑制剂是针对IV、IX、XII和/或XIV。在一些实施例中，抑制剂是碳酸酐酶III抑制剂。在一些实施例中，抑制剂是碳酸酐酶IV抑制剂。在一些实施例中，抑制剂是碳酸酐酶IX抑制剂。在一些实施例中，抑制剂是碳酸酐酶XII抑制剂。在一些实施例中，抑制剂是碳酸酐酶XIV抑制剂。在一些实施例中，抑制剂包含或是磺酰胺(例如，描述于以下中的那些：Supuran，CT.Nature Rev Drug Discover[自然评论药物发现]2008，7，168-181，这些磺胺通过引用并入本文)。在一些实施例中，抑制剂是磺酰胺。在一些实施例中，靶细胞是肌肉细胞。
在一些实施例中，靶向部分是如本披露中定义和描述的RLD或RCD或RTD。在一些实施例中，RCD包含或是
Figure BPA0000295055720007271
在一些实施例中，RCD包含或
Figure BPA0000295055720007281
在一些实施例中，RCD包含或是
Figure BPA0000295055720007282
在一些实施例中，RTD是如本披露中所述的磺酰胺部分。在一些实施例中，RTD包含或是
Figure BPA0000295055720007283
在一些实施例中，RTD或RCD包含或是
Figure BPA0000295055720007284
在一些实施例中，RTD或RCD包含或是
Figure BPA0000295055720007291
在一些实施例中，RTD包含或是
Figure BPA0000295055720007292
在一些实施例中，RTD或RCD包含或是
Figure BPA0000295055720007293
在一些实施例中，RTD或RCD包含或是
Figure BPA0000295055720007301
在一些实施例中，RTD包含或是
Figure BPA0000295055720007302
在一些实施例中，RTD包含或是
Figure BPA0000295055720007303
在一些实施例中，RTD或RCD包含或是
Figure BPA0000295055720007304
在一些实施例中，RTD或RCD包含或是
Figure BPA0000295055720007311
在一些实施例中，RTD包含或是
Figure BPA0000295055720007312
在一些实施例中，RTD包含或是
Figure BPA0000295055720007313
在一些实施例中，RLD是包含或是脂质部分的靶向部分。在一些实施例中，X是O。在一些实施例中，X是S。
在一些实施例中，本披露提供了用于将各种部分缀合至寡核苷酸链的技术(例如，试剂、方法等)。在一些实施例中，本披露提供了用于将靶向部分缀合至寡核苷酸链的技术。在一些实施例中，本披露提供了包含用于缀合的靶向部分的酸，例如RLD-COOH。在一些实施例中，本披露提供用于缀合的接头，例如LLD。本领域普通技术人员理解，根据本披露，许多已知和广泛实践的技术可用于与寡核苷酸链缀合。在一些实施例中，提供的酸是
Figure BPA0000295055720007321
在一些实施例中，提供的酸是
Figure BPA0000295055720007322
在一些实施例中，提供的酸是
Figure BPA0000295055720007323
在一些实施例中，提供的酸是
Figure BPA0000295055720007324
在一些实施例中，提供的酸是脂肪酸，其可以提供脂质部分作为靶向部分。在一些实施例中，本披露提供了用于制备此类酸的方法和试剂。
在一些实施例中，可以将另外的化学部分，例如包含胍部分的化学部分，并入寡核苷酸中以改善一种或多种特性和/或活性。在一些实施例中，这种另外的化学部分可用于改善递送。在一些实施例中，另外的化学部分包含一个或多个具有如本文所述的式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1或H-d-2的结构的基团。在一些实施例中，另外的化学部分包含一个或多个具有如本文所述的式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、H-c-2、II-d-1或II-d-2的结构的基团。在一些实施例中，这种化学部分具有式R1-[-L-LP]n-的结构，其中每个LP独立地具有如本文所述的式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、H-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1或II-d-2的结构，并且每个其他变量独立地如本文所述。在一些实施例中，R1是-OH。在一些实施例中，R1是-H。在一些实施例中，每个L独立地是任选地经取代的二价C1-10脂肪族。在一些实施例中，每个L独立地是-(CH2)3-亚烷基。在一些实施例中，每个L独立地是C1-6亚烷基。在一些实施例中，每个LP独立地是n001
Figure BPA0000295055720007331
在一些实施例中，另外的化学部分是
Figure BPA0000295055720007332
在一些实施例中，另外的化学部分键合至寡核苷酸链的5’-端碳。在一些实施例中，可以例如使用试剂(包括以下所示试剂)将其并入：
Figure BPA0000295055720007333
在一些实施例中，另外的化学部分可以通过可切割基团，例如磷酸酯基，与寡核苷酸链连接，与寡核苷酸链(例如，在5′-端碳处)连接：
Figure BPA0000295055720007341
在一些实施例中，L是如本文所述糖部分。例如，在一些实施例中，L是
Figure BPA0000295055720007342
在一些实施例中，另外的化学部分是
Figure BPA0000295055720007343
在一些实施例中，其键合至寡核苷酸链的5’-端碳。在一些实施例中，可以例如使用试剂(包括以下所示试剂)将其并入：
Figure BPA0000295055720007344
在一些实施例中，本文所述的另外的化学部分可以包含一个或多个烷基链。在一些实施例中，本文所述的另外的化学部分可以包含一个或多个脂质部分。本领域技术人员理解的是，LP的许多其他实施例，包括中性核苷酸间键联部分，可用于另外的化学部分，例如n009。在一些实施例中，另外的化学部分是
Figure BPA0000295055720007345
在一些实施例中，另外的化学部分是
Figure BPA0000295055720007351
如本文所述，在一些实施例中，另外的化学部分可以键合至寡核苷酸链的5’-端碳。在一些实施例中，可以例如使用试剂(包括以下所示试剂)将另外的化学部分并入：
Figure BPA0000295055720007352
本领域技术人员将理解，根据本披露，可以利用许多其他技术，包括合成化学技术，以提供化合物，例如寡核苷酸、用于并入另外的化学部分的试剂等。
在一些实施例中，提供的化合物，例如试剂、产物(例如，寡核苷酸、亚酰胺等)等是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97％或99％纯。在一些实施例中，纯度是至少50％。在一些实施例中，纯度是至少75％。在一些实施例中，纯度是至少80％。在一些实施例中，纯度是至少85％。在一些实施例中，纯度是至少90％。在一些实施例中，纯度是至少95％。在一些实施例中，纯度是至少96％。在一些实施例中，纯度是至少97％。在一些实施例中，纯度是至少98％。在一些实施例中，纯度是至少99％。
组合疗法
在一些实施例中，除了提供的寡核苷酸或寡核苷酸组合物(例如，包含DMD寡核苷酸的组合物)之外，向受试者施用另外的治疗(包括但不限于，治疗剂或方法)。在一些实施例中，将包含一种或多种DMD寡核苷酸的组合物(两种或更多种组合物，每个包含DMD寡核苷酸)与另外的治疗一起施用至患者。
在一些实施例中，本披露涉及用于治疗肌肉营养不良，杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的方法，该方法包括(a)向易患该疾病或患有该疾病的受试者施用包含提供的寡核苷酸的组合物，和(b)向该受试者施用另外的治疗，该另外的治疗能够预防、治疗、减轻或减缓肌肉营养不良的进展。在一些实施例中，另外的治疗是包含第二寡核苷酸的组合物。
在一些实施例中，另外的治疗能够自身预防、治疗、减轻或减缓肌肉营养不良的进展。在一些实施例中，当与提供的寡核苷酸一起施用时，另外的治疗能够预防、治疗、减轻或减缓肌肉营养不良的进展。
在一些实施例中，在包含提供的寡核苷酸(例如，提供的DMD寡核苷酸)的组合物之前、之后、或同时，向受试者施用另外的治疗。在一些实施例中，组合物包含一种或多种DMD寡核苷酸和另外的治疗两者。在一些实施例中，一种或多种DMD寡核苷酸和一种或多种另外的治疗在分开的组合物中。在一些实施例中，本披露提供了用于组合疗法的技术(例如，组合物、方法等)，例如与其他治疗剂和/或医疗程序组合。在一些实施例中，提供的寡核苷酸和/或组合物可以与一个或多个其他治疗剂一起使用。在一些实施例中，提供的组合物包含提供的寡核苷酸、和一个或多个其他治疗剂。在一些实施例中，当与组合物中提供的寡核苷酸相比时，一个或多个其他治疗剂可以具有一个或多个不同的靶、和/或针对靶的一个或多个不同的机制。在一些实施例中，治疗剂是寡核苷酸。在一些实施例中，治疗剂是小分子药物。在一些实施例中，治疗剂是蛋白质。在一些实施例中，治疗剂是抗体。可以依照本披露利用许多治疗剂。例如，用于DMD的寡核苷酸可以与调节抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)产生的一种或多种治疗剂(抗肌萎缩蛋白相关蛋白调节剂)一起使用。在一些实施例中，抗肌萎缩蛋白相关蛋白调节剂促进抗肌萎缩蛋白相关蛋白的产生。在一些实施例中，抗肌萎缩蛋白相关蛋白调节剂是依珠卓米(ezutromid)。在一些实施例中，抗肌萎缩蛋白相关蛋白调节剂是
Figure BPA0000295055720007371
或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，提供的寡核苷酸或其组合物在一个或多个其他治疗剂和/或医疗程序之前、同时或之后施用。在一些实施例中，提供的寡核苷酸或其组合物与一个或多个其他治疗剂和/或医疗程序同时施用。在一些实施例中，提供的寡核苷酸或其组合物在一个或多个其他治疗剂和/或医疗程序之前施用。在一些实施例中，提供的寡核苷酸或其组合物在一个或多个其他治疗剂和/或医疗程序之后施用。在一些实施例中，提供的组合物包含一个或多个其他治疗剂。
在一些实施例中，将包含DMD寡核苷酸的组合物与另外的药剂共同施用，以改善目的DMD外显子的跳读。在一些实施例中，另外的药剂是抗体、寡核苷酸、蛋白质、或小分子。在一些实施例中，另外的药剂干扰参与剪接的蛋白质。在一些实施例中，另外的药剂干扰参与剪接的蛋白质，其中该蛋白质是SR蛋白质。
在一些实施例中，另外的药剂干扰参与剪接的蛋白质，其中该蛋白质是SR蛋白质，该蛋白质含有具有丝氨酸(S)和精氨酸(R)氨基酸残基的一个或多个长重复序列的蛋白质结构域。据报道，SR蛋白在细胞中严重磷酸化，并参与组成型和可替代的剪接。Long等人2009 Biochem.J.[生物化学杂志]417：15-27；Shepard等人2009 Genome Biol.[基因组生物学]10：242。在一些实施例中，另外的药剂是抑制或减少SR蛋白激酶的化学化合物。在一些实施例中，抑制或降低SR蛋白激酶的化学化合物是SRPIN340。SRPIN340报道在，例如，Fukuhura等人2006 Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]103：11329-11333中。在一些实施例中，化学化合物是对Cdc样激酶(Clk)具有特异性的激酶抑制剂，其也能够磷酸化SR蛋白质。在一些实施例中，对能够磷酸化SR蛋白质的Cdc样激酶(Clk)特异的激酶抑制剂是TG003。据报道，TG003在体外和体内均影响剪接。Nowak等人2010 J.Biol.Chem.[生物化学杂志]285：5532-5540；Muraki等人2004 J.Biol.Chem.[生物化学杂志]279：24246-24254；Yomoda等人2008 Genes Cells[基因细胞]13：233-244；以及Nishida等人2011 NatCommun.[自然通讯]2：308。
在一些实施例中，在患有肌肉营养不良的患者中，肌肉组织被脂肪和结缔组织替代，并且受影响的肌肉可能由于脂肪含量增加而看起来更大，这种情况称为假性肥大。在一些实施例中，将包含一种或多种DMD寡核苷酸的组合物与以下治疗一起施用：减少或预防脂肪或纤维或结缔组织的发展、或由脂肪或纤维或结缔组织替换肌肉组织。
在一些实施例中，包含一种或多种DMD寡核苷酸的组合物与以下治疗一起施用：减少或预防脂肪或纤维或结缔组织的发育、或由脂肪或纤维或结缔组织替换肌肉组织，其中该治疗是结缔组织生长因子(CTGF)的抗体、纤维化的中枢介质(例如，FG-3019)。在一些实施例中，将包含一种或多种DMD寡核苷酸的组合物与降低人体脂肪含量的药剂一起施用。
另外的治疗包括：通过免疫调节剂(例如，类固醇和转化生长因子-β抑制剂)减缓疾病的进展、诱导或引入可补偿肌纤维中肌营养不良蛋白缺乏的蛋白质(例如抗肌萎缩蛋白相关蛋白、双糖链蛋白聚糖、和层粘连蛋白)、或支持肌肉再生反应(例如肌肉生长抑制素和激活素2B)。
在一些实施例中，另外的治疗是能够恢复肌细胞内钙的正常平衡的小分子。
在一些实施例中，另外的治疗是能够通过校正称为雷诺丁受体钙通道复合物(RyR)的一种通道的活性来恢复肌细胞内钙的正常平衡的小分子。在一些实施例中，这种小分子是Rycal ARM210(ARMGO制药公司(ARMGO Pharma)，塔瑞镇(Tarry Town)，纽约)。
在一些实施例中，另外的治疗是类黄酮。
在一些实施例中，另外的治疗是类黄酮，如表儿茶素。表儿茶素是从可可树中收获的黑巧克力中发现的类黄酮，已在动物和人类中报道，其增加心脏和肌肉中新线粒体的产生(例如，线粒体生物发生)，同时刺激肌肉组织的再生。
在一些实施例中，另外的治疗是卵泡抑素基因治疗。
在一些实施例中，另外的治疗是卵泡抑素344的腺相关病毒递送，以增加肌肉力量并预防肌肉萎缩和纤维化。
在一些实施例中，另外的治疗是糖皮质激素。
在一些实施例中，另外的治疗是强的松。
在一些实施例中，另外的治疗是地夫可特。
在一些实施例中，另外的治疗是伐莫龙(vamorolone)(VBP15)。
在一些实施例中，另外的治疗是递送外源肌营养不良蛋白基因或合成形式或其部分，如微肌营养不良蛋白基因。
在一些实施例中，另外的治疗是递送外源肌营养不良蛋白基因或其部分(如微肌营养不良蛋白基因(如SGT-001))、用于递送合成的肌营养不良蛋白基因或微肌营养不良蛋白的腺相关病毒(AAV)载体介导的基因转移系统(实体生命科学公司(SolidBioSciences)，剑桥，马萨诸塞州)。
在一些实施例中，另外的治疗是干细胞治疗。
在一些实施例中，另外的治疗是类固醇。
在一些实施例中，另外的治疗是皮质类固醇。
在一些实施例中，另外的治疗是强的松。
在一些实施例中，另外的治疗是β-2激动剂。
在一些实施例中，另外的治疗是离子通道抑制剂。
在一些实施例中，另外的治疗是钙通道抑制剂。
在一些实施例中，另外的治疗是为黄原胶的钙通道抑制剂。在一些实施例中，另外的治疗是为甲基黄嘌呤的钙通道抑制剂。在一些实施例中，另外的治疗是己酮可可碱的钙通道抑制剂。在一些实施例中，另外的治疗是为选自以下的甲基黄嘌呤衍生物的钙通道抑制剂：己酮可可碱、呋喃茶碱、利索茶碱、丙戊茶碱、喷替茶碱、茶碱、托巴茶碱、阿比茶碱、恩丙茶碱、及其衍生物。
在一些实施例中，另外的治疗是心脏病或心血管疾病的治疗。
在一些实施例中，另外的治疗是血压药物。
在一些实施例中，另外的治疗是手术。
在一些实施例中，另外的治疗是手术以固定缩短的肌肉、拉直脊柱或治疗心脏或肺部问题。
在一些实施例中，另外的治疗是支架、助行器、站立助行器、或用于行走的其他机械辅助。
在一些实施例中，另外的治疗是运动和/或物理治疗。
在一些实施例中，另外的治疗是辅助通气。
在一些实施例中，另外的治疗是抗惊厥、免疫抑制剂、或便秘治疗。
在一些实施例中，另外的治疗是NF-κB的抑制剂。
在一些实施例中，另外的治疗包含水杨酸和/或二十二碳六烯酸(DHA)。
在一些实施例中，另外的治疗是依达奈珍(edasalonexent)(CAT-1004，Catabasis)，水杨酸、和二十二碳六烯酸(DHA)的缀合物。
在一些实施例中，另外的治疗是基于细胞的治疗。
在一些实施例中，另外的治疗是包含同种异体心球样(cardiosphere)衍生的细胞。
在一些实施例中，另外的治疗是加帽-1002(Capricor)。
变量的某些实施方式
在本披露中广泛地描述了变量的实施例。本领域技术人员理解的是，针对一个变量描述的实施例可以与其他变量的实施例任选地并且独立地组合，并且这种组合无论何时何地适当时都在本披露的范围内。当描述可以是这样的变量(例如R1，其可以是R)的一种变量时给出的变量(例如R)的实施例通常适用于可以是相同变量(例如Rs，其可以是R)的其他变量。在本披露的其他部分中还描述了许多变量的各种实施例。
在一些实施例中，PL是P(＝W)。在一些实施例中，PL是P。在一些实施例中，PL是手性P(P*)。在一些实施例中，PL是P→B(R′)3。
在一些实施例中，W是O。在一些实施例中，W是S。在一些实施例中，W是Se。在一些实施例中，W是-N(-L-R5)。
在一些实施例中，X是O。在一些实施例中，X是S。在一些实施例中，X是-N(-L-R5)-。在一些实施例中，-L-R5是-R，其与-L-R1的R基团(例如，L中的-C(R′)-)一起形成如在本披露中所述的双键或环。在一些实施例中，X是L。
在一些实施例中，Y是O。在一些实施例中，Y是S。在一些实施例中，Z是O。在一些实施例中，Z是S。在一些实施例中，Y是O并且Z是O。
在一些实施例中，W是O，Y是O并且Z是O。在一些实施例中，W是S，Y是O并且Z是O。
在一些实施例中，R1是-H。在一些实施例中，R1是-L-R。在一些实施例中，R1是卤素。在一些实施例中，R1是-CN。在一些实施例中，R1是-NO2。在一些实施例中，R1是-L-Si(R)3。在一些实施例中，R1是-OR。在一些实施例中，R1是-SR。在一些实施例中，R1是-N(R)2。
在一些实施例中，R1是如本披露中所述的R。
在一些实施例中，-X-L-R1包含或是手性助剂的任选地经取代的部分(例如，H-X-L-R1是任选地经取代的(例如，加帽的)手性助剂)，如用于手性受控的寡核苷酸合成中，例如在以下中描述的那些：US 20150211006、US 20150211006、WO 2017015555、WO2017015575、WO 2017062862或WO 2017160741，其各自的手性助剂通过引用并入本文。
在一些实施例中，-X-L-R1是-OR。在一些实施例中，-X-L-R1是-OH。在一些实施例中，-X-L-R1是-SR。在一些实施例中，-X-L-R1是-SH。
在一些实施例中，-X-L-R1是-R。在一些实施例中，R是-CH3。在一些实施例中，R是-CH2CH3。在一些实施例中，R是-CH2CH2CH3。在一些实施例中，R是-CH2OCH3。在一些实施例中，R是CH3CH2OCH2-。在一些实施例中，R是PhCH2OCH2-。在一些实施例中，R是HC≡C-CH2-。在一些实施例中，R是H3C-C≡C-CH2-。在一些实施例中，R是CH2＝CHCH2-。在一些实施例中，R是CH3SCH2-。在一些实施例中，R是-CH2COOCH3。在一些实施例中，R是-CH2COOCH2CH3。在一些实施例中，R是-CH2CONHCH3。
在一些实施例中，-X-L-R1是或包含胍部分。在一些实施例中，-X-L-R1是或包含
Figure BPA0000295055720007421
在一些实施例中，-X-L-R1是-L-Wz，其中Wz选自
Figure BPA0000295055720007422
Figure BPA0000295055720007423
Figure BPA0000295055720007424
其中R″是R′并且n是0-15。在一些实施例中，R′和R″独立地是
Figure BPA0000295055720007425
Figure BPA0000295055720007426
在一些实施例中，L是-O-CH2CH2-。在一些实施例中，n是0-3。在一些实施例中，每个Rs独立地是-H、-OCH3、-F、-CN、-CH3、-NO2、-CF3或-OCF3。在一些实施例中，R′和R″是相同的。在一些实施例中，R′和R″是不同的。
在一些实施例中，-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720007427
其中每个R′独立地如本披露中所述。在一些实施例中，两个不同氮原子上的两个R′一起形成如本披露中所述的任选地经取代的环。在一些实施例中，环是饱和的。在一些实施例中，环是单环的。在一些实施例中，环是3-10元的。在一些实施例中，环是3元的。在一些实施例中，环是4元的。在一些实施例中，环是5元的。在一些实施例中，环是6元的。在一些实施例中，环是7元的。在一些实施例中，除两个氮原子外，环不具有另外的环杂原子。
在一些实施例中，R5是如本披露中所述的R1。在一些实施例中，R5是-H。在一些实施例中，R5是如本披露中所述的R。
在一些实施例中，L是任选地经取代的二价亚甲基基团。在一些实施例中，L是-CH2-。在一些实施例中，每个L独立地是共价键，或选自C1-30脂肪族基团和具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C1-30杂脂肪族基团的二价、任选地经取代的直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被选自以下的任选地经取代的基团替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换。
在一些实施例中，L是共价键，或选自C1-30脂肪族基团和具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C1-30杂脂肪族基团的二价、任选地经取代的直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被选自以下的任选地经取代的基团替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换。在一些实施例中，L是共价键，或二价、任选地经取代的直链或支链C1-30脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被选自以下的任选地经取代的基团替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换。在一些实施例中，L是共价键，或具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的二价、任选地经取代的直链或支链C1-30杂脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被选自以下的任选地经取代的基团替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换。在一些实施例中，L是共价键，或选自C1-30脂肪族基团和具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C1-30杂脂肪族基团的二价、任选地经取代的直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被选自以下的任选地经取代的基团替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、或-C(O)O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换。在一些实施例中，L是共价键或任选经取代的直链或支链二价基团，所述二价基团选自C1-10脂肪族基团及具有1-5个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的C1-10杂脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选且独立地经选自以下的任选经取代的基团替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-和-C(O)O-，且一个或多个CH或碳原子任选且独立地被CyL替换。在一些实施例中，L是共价键或任选经取代的直链或支链二价基团，所述二价基团选自C1-10脂肪族基团及具有1-5个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的C1-10杂脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选且独立地经选自以下的任选经取代的基团替换：-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-和-C(O)O-。
在一些实施例中，L是共价键。在一些实施例中，L是任选经取代的二价C1-30脂肪族基团。在一些实施例中，L是具有1-10个独立地选自
Figure BPA0000295055720007451
氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的任选经取代的二价C1-30杂脂肪族基团。
在一些实施例中，脂肪族部分，例如L、Ls、LM、R等的那些，是单价或二价或多价的，并且(在任何任选的取代之前)可含有其范围内的任何数目的碳原子，例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30等。在一些实施例中，杂脂肪族部分，例如L、R等的那些，是单价或二价或多价的，并且(在任何任选的取代之前)可含有其范围内的任何数目的碳原子，例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30等。
在一些实施例中，接头的亚甲基单元，例如L、Ls、LM等，被-Cy-替换，其中-Cy-是如本披露所述的。在一些实施例中，一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-O-、-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(S)(OR′)-、或-P(S)(OR′)-取代。在一些实施例中，亚甲基单元被-O-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-S-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-N(R′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-C(O)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-S(O)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-S(O)2-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(O)(OR′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(O)(SR′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(O)(R′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(O)(NR′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(S)(OR′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(S)(SR′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(S)(R′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(S)(NR′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(R′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(OR′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(SR′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(NR′)-替换。在一些实施例中，亚甲基单元被-P(OR′)[B(R′)3]-替换。在一些实施例中，一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-O-、-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(S)(OR′)-、或-P(S)(OR′)-取代。在一些实施例中，亚甲基单元被-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-替换，其各自可独立地是核苷酸间键联。
在一些实施例中，L或Ls(例如，当Ls是L)，例如当连接至Rs或糖环时，是-CH2-。在一些实施例中，L-C(R)2-，其中至少一个R不是氢。在一些实施例中，L是-CHR-。在一些实施例中，R是氢。在一些实施例中，L是-CHR-，其中R不是氢。在一些实施例中，-CHR-的C是手性的。在一些实施例中，L是-(R)-CHR-，其中-CHR-的C是手性的。在一些实施例中，L是-(S)-CHR-，其中-CHR-的C是手性的。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-5脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-5烷基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-4脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-4烷基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-3脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-3烷基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C2脂肪族基团。在一些实施例中，R是任选地经取代的甲基。在一些实施例中，R是C1-6脂肪族基团。在一些实施例中，R是C1-6烷基。在一些实施例中，R是C1-5脂肪族。在一些实施例中，R是C1-5烷基。在一些实施例中，R是C1-4脂肪族。在一些实施例中，R是C1-4烷基。在一些实施例中，R是C1-3脂肪族。在一些实施例中，R是C1-3烷基。在一些实施例中，R是C2脂肪族基团。在一些实施例中，R是甲基。在一些实施例中，R是C1-6卤脂肪族基团。在一些实施例中，R是C1-6卤烷基。在一些实施例中，R是C1-5卤代脂肪族。在一些实施例中，R是C1-5卤代烷基。在一些实施例中，R是C1-4卤代脂肪族。在一些实施例中，R是C1-4卤代烷基。在一些实施例中，R是C1-3卤代脂肪族。在一些实施例中，R是C1-3卤代烷基。在一些实施例中，R是C2卤脂肪族基团。在一些实施例中，R是被一个或多个卤素取代的甲基。在一些实施例中，R是-CF3。在一些实施例中，L是任选地经取代的-CH＝CH-。在一些实施例中，L是任选地经取代的(E)-CH＝CH-。在一些实施例中，L是任选地经取代的(Z)-CH＝CH-。在一些实施例中，L是-C≡C-。
在一些实施例中，L包含至少一个磷原子。在一些实施例中，L的至少一个亚甲基单元被以下替换：-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-。
在一些实施例中，L与键联的磷键合(例如，当X是共价键时)，例如具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1或II-d-2、或其盐形式的键联的磷。在一些实施例中，这种键联是核苷酸间键联。在一些实施例中，这种键联是手性受控的核苷酸间键联。
在一些实施例中，L是-Cy-。在一些实施例中，L是-C≡C-。
在一些实施例中，L是二价、任选地经取代的、线性或支链C1-30脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元如本披露中所述任选且独立地被替换。在一些实施例中，L是具有1-10个杂原子的二价、任选地经取代的、线性或支链C1-30杂脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元如本披露中所述任选且独立地被替换。
在一些实施例中，本披露中的杂脂肪族，例如L、R(包括可以是R的任何变量)等的杂脂族基团包含
Figure BPA0000295055720007471
部分。在一些实施例中，＝N-直接键合至磷原子。在一些实施例中，杂脂肪族基团包含
Figure BPA0000295055720007472
部分。在一些实施例中，杂脂肪族基团包含
Figure BPA0000295055720007473
部分。在一些实施例中，这种部分直接键合至磷原子。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是异丙基。
在一些实施例中，-Cy-是任选地经取代的二价单环、双环或多环C3-20环脂肪族。在一些实施例中，-Cy-是任选地经取代的二价单环、双环或多环C6-20芳基。在一些实施例中，-Cy-是具有1-5个杂原子的任选地经取代的单环、双环或多环3-20元杂环基环。在一些实施例中，-Cy-是具有1-5个杂原子的任选地经取代的单环、双环或多环5-20元杂环基环，其中至少一个杂原子是氧。在一些实施例中，-Cy-是3-10元的。在一些实施例中，-Cy-是3元的。在一些实施例中，-Cy-是4元的。在一些实施例中，-Cy-是5元的。在一些实施例中，-Cy-是6元的。在一些实施例中，-Cy-是7元的。在一些实施例中，-Cy-是8元的。在一些实施例中，-Cy-是9元的。在一些实施例中，-Cy-是10元的。在一些实施例中，-Cy-是任选地经取代的二价四氢呋喃环。在一些实施例中，-Cy-是任选地经取代的呋喃糖部分。在一些实施例中，-Cy-是具有1-4个杂原子的任选地经取代的二价5元杂芳基环。在一些实施例中，至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，每个杂原子是氮。在一些实施例中，-Cy-是任选地经取代的二价三唑环。在一些实施例中，在一些实施例中，-Cy-是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720007481
在一些实施例中，-Cy-是
Figure BPA0000295055720007482
在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是异丙基。
在一些实施例中，CyL是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族基团、C6-20芳环、具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的5元至20元杂芳环及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷、硼及硅的杂原子的3元至20元杂环。在一些实施例中，CyL是三价的。在一些实施例中，CyL是四价的。在一些实施例中，部分，例如L、Ls、LM等中的一个或多个CH独立地被三价CyL基团取代。在一些实施例中，部分，例如L、Ls、LM等中的一个或多个碳原子独立地被四价CyL基团取代。在一些实施例中，部分，例如L、Ls、LM等中的一个或多个CH独立地被三价CyL基团取代，并且部分，例如L、Ls、LM等中的一个或多个碳原子独立地被四价CyL基团取代。
在一些实施例中，CyL是单环的。在一些实施例中，CyL是双环的。在一些实施例中，CyL是多环的。
在一些实施例中，CyL是饱和的。在一些实施例中，CyL是部分不饱和的。在一些实施例中，CyL是芳族的。在一些实施例中，CyL是或包含饱和环部分。在一些实施例中，CyL是或包含部分不饱和环部分。在一些实施例中，CyL是或包含芳环部分。
在一些实施例中，CyL是如本披露中所描述的任选地经取代的C3-20环脂肪族环(例如，针对R所描述但是四价的那些环脂肪族环)。在一些实施例中，环是任选地经取代的饱和C3-20环脂肪族环。在一些实施例中，环是任选地经取代的部分不饱和C3-20环脂肪族环。环脂肪族环可具有如本披露中所述的各种大小。在一些实施例中，环是3元、4元、5元、6元、7元、8元、9元或10元的。在一些实施例中，环是3元的。在一些实施例中，环是4元的。在一些实施例中，环是5元的。在一些实施例中，环是6元的。在一些实施例中，环是7元的。在一些实施例中，环是8元的。在一些实施例中，环是9元的。在一些实施例中，环是10元的。在一些实施例中，环是任选地经取代的环丙基部分。在一些实施例中，环是任选地经取代的环丁基部分。在一些实施例中，环是任选地经取代的环戊基部分。在一些实施例中，环是任选地经取代的环己基部分。在一些实施例中，环是任选地经取代的环庚基部分。在一些实施例中，环是任选地经取代的环辛基部分。在一些实施例中，环脂肪族环是环烷基环。在一些实施例中，环脂肪族环是单环的。在一些实施例中，环脂肪族环是双环的。在一些实施例中，环脂肪族环是多环的。在一些实施例中，环是如本披露中针对R所述的具有更高价的环脂肪族部分。
在一些实施例中，CyL是任选地经取代的6元至20元芳环。在一些实施例中，环是任选地经取代的三价或四价苯基部分。在一些实施例中，环是四价苯基部分。在一些实施例中，环是任选地经取代的萘部分。环可具有如本披露中所述的不同大小。在一些实施例中，芳基环是6元的。在一些实施例中，芳基环是10元的。在一些实施例中，芳基环是14元的。在一些实施例中，芳基环是单环的。在一些实施例中，芳基环是双环的。在一些实施例中，芳基环是多环的。在一些实施例中，环是如本披露中针对R所述的具有更高价的芳基部分。
在一些实施例中，CyL是具有1-10个例如独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的任选地经取代的5-20元杂芳环。在一些实施例中，CyL是具有1-10个例如独立地选自氧、氮及硫的杂原子的任选地经取代的5-20元杂芳环。在一些实施例中，CyL是具有1-4个例如独立地选自氧、氮及硫的杂原子的任选地经取代的5-6元杂芳环。在一些实施例中，CyL是具有1-4个例如独立地选自氧、氮及硫的杂原子的任选地经取代的5元杂芳环。在一些实施例中，CyL是具有1-4个例如独立地选自氧、氮及硫的杂原子的任选地经取代的6元杂芳环。在一些实施例中，如本披露中所述，杂芳基环可具有各种大小且含有各种数目和/或类型的杂原子。在一些实施例中，杂芳基环含有不超过一个杂原子。在一些实施例中，杂芳基环含有超过一个杂原子。在一些实施例中，杂芳基环含有不超过一种类型的杂原子。在一些实施例中，杂芳基环含有超过一种类型的杂原子。在一些实施例中，杂芳基环是5元的。在一些实施例中，杂芳基环是6元的。在一些实施例中，杂芳基环是8元的。在一些实施例中，杂芳基环是9元的。在一些实施例中，杂芳基环是10元的。在一些实施例中，杂芳基环是单环的。在一些实施例中，杂芳基环是双环的。在一些实施例中，杂芳基环是多环的。在一些实施例中，杂芳基环是核碱基部分，例如A、T、C、G、U等。在一些实施例中，环是如本披露中针对R所述的具有更高价的杂芳基部分。在一些实施例中，如在本披露中所述的接头中，CyL是
在一些实施例中，CyL是具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的3元至20元杂环。在一些实施例中，CyL是具有1-10个独立地选自氧、氮及硫的杂原子的3元至20元杂环。在一些实施例中，杂环基环是饱和的。在一些实施例中，杂环基环是部分不饱和的。杂环基环可具有如本披露中所述的各种大小。在一些实施例中，环是3元、4元、5元、6元、7元、8元、9元或10元的。在一些实施例中，环是3元的。在一些实施例中，环是4元的。在一些实施例中，环是5元的。在一些实施例中，环是6元的。在一些实施例中，环是7元的。在一些实施例中，环是8元的。在一些实施例中，环是9元的。在一些实施例中，环是10元的。杂环基环可含有各种数目和/或类型的杂原子。在一些实施例中，杂环基环含有不超过一个杂原子。在一些实施例中，杂环基环含有超过一个杂原子。在一些实施例中，杂环基环含有不超过一种类型的杂原子。在一些实施例中，杂环基环含有超过一种类型的杂原子。在一些实施例中，杂环基环是单环的。在一些实施例中，杂环基环是双环的。在一些实施例中，杂环基环是多环的。在一些实施例中，环是如本披露中针对R所述的具有更高价的杂环基部分。
如本领域普通技术人员容易理解的，许多合适的环部分在本披露中被广泛地描述并且可以根据本披露来使用，例如针对R所描述的那些环部分(其可以具有更高价的CyL)。
在一些实施例中，CyL是核酸中的糖部分。在一些实施例中，CyL是任选地经取代的呋喃糖部分。在一些实施例中，CyL是吡喃糖部分。在一些实施例中，CyL是DNA中发现的任选地经取代的呋喃糖部分。在一些实施例中，CyL是RNA中存在的任选地经取代的呋喃糖部分。在一些实施例中，CyL是任选地经取代的2′-脱氧呋喃核糖部分。在一些实施例中，CyL是任选地经取代的呋喃核糖部分。在一些实施例中，取代提供如本披露中所述的糖修饰。在一些实施例中，任选地经取代的2′-脱氧呋喃核糖部分和/或任选地经取代的呋喃核糖部分包含2′位处的取代。在一些实施例中，2′位是如本披露中所述的2′-修饰。在一些实施例中，2′-修饰是-F。在一些实施例中，2′-修饰是-OR，其中R如本披露中所述。在一些实施例中，R不是氢。在一些实施例中，CyL是修饰的糖部分，诸如LNA、α-L-LNA或GNA中的糖部分。在一些实施例中，CyL是经修饰的糖部分，诸如ENA中的糖部分。在一些实施例中，CyL是寡核苷酸的末端糖部分，其连接核苷酸间键联与核碱基。在一些实施例中，CyL是寡核苷酸的末端糖部分，例如当该末端任选经由接头连接至固体载体时。在一些实施例中，CyL是连接两个核苷酸间键联与核碱基的糖部分。本披露中广泛描述了示例糖和糖部分。
在一些实施例中，CyL是核碱基部分。在一些实施例中，核碱基是天然核碱基，如A、T、C、G、U等。在一些实施例中，核碱基是修饰的核碱基。在一些实施例中，CyL是选自A、T、C、G、U及5mC的任选地经取代的核碱基部分。本披露中广泛描述了示例核碱基和核碱基部分。
在一些实施例中，两个CyL部分彼此结合，其中一个CyL是糖部分且另一者是核碱基部分。在一些实施例中，这样的糖部分和核碱基部分形成核苷部分。在一些实施例中，核苷部分是天然的。在一些实施例中，核苷部分是经修饰的。在一些实施例中，CyL是选自以下的任选地经取代的天然核苷部分：腺苷、5-甲基尿苷、胞苷、鸟苷、尿苷、5-甲基胞苷、2′-脱氧腺苷、胸苷、2′-脱氧胞苷、2′-脱氧鸟苷、2′-脱氧尿苷及5-甲基-2′-脱氧胞苷。本披露中广泛描述了示例核苷和核苷部分。
环AL可以是单价、二价或多价的。在一些实施例中，环AL是单价的(例如，当g为0且无取代时)。在一些实施例中，环AL是二价的。在一些实施例中，环AL是多价的。在一些实施例中，环AL是二价的且是-Cy-。在一些实施例中，环AL是任选地经取代的二价三唑环。在一些实施例中，环AL是三价的且是CyL。在一些实施例中，环AL是四价的且是CyL。在一些实施例中，环AL是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720007521
在一些实施例中，-X-L-R1是任选地经取代的炔基。在一些实施例中，-X-L-R1是-C≡CH。在一些实施例中，炔基基团，例如-C≡CH，可以通过各种反应与多种试剂进行反应以提供进一步的修饰。例如，在一些实施例中，炔基基团可通过点击化学与叠氮化物反应。在一些实施例中，叠氮化物具有R1-N3的结构。
在一些实施例中，每个Rs独立地是如本披露中所述的-H、卤素、-CN、-N3、-NO、-NO2、-L-R′、-L-Si(R)3、-L-OR′、-L-SR′、-L-N(R′)2、-O-L-R′、-O-L-Si(R)3、-O-L-OR′、-O-LsSR′或-O-LsN(R′)2。
在一些实施例中，Rs是R′，其中R′如本披露中所述。在一些实施例中，Rs是R，其中R如本披露中所描述。在一些实施例中，Rs是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，Rs是甲基。在一些实施例中，Rs是任选经取代的C1-30杂脂肪族基团。在一些实施例中，Rs包含一个或多个硅原子。在一些实施例中，Rs是-CH2Si(Ph)2CH3。
在一些实施例中，Rs是-L-R′。在一些实施例中，Rs是-L-R′，其中-L-是任选地经取代的二价C1-30杂脂肪族基团。在一些实施例中，Rs是-CH2Si(Ph)2CH3。
在一些实施例中，Rs是-F。在一些实施例中，Rs是-Cl。在一些实施例中，Rs是-Br。在一些实施例中，Rs是-I。在一些实施例中，Rs是-CN。在一些实施例中，Rs是-N3。在一些实施例中，Rs是-NO。在一些实施例中，Rs是-NO2。在一些实施例中，Rs是-L-Si(R)3。在一些实施例中，Rs是-Si(R)3。在一些实施例中，Rs是-L-R′。在一些实施例中，Rs是-R′。在一些实施例中，Rs是-L-OR′。在一些实施例中，Rs是-OR′。在一些实施例中，Rs是-L-SR′。在一些实施例中，Rs是-SR′。在一些实施例中，Rs是-L-N(R′)2。在一些实施例中，Rs是-N(R′)2。在一些实施例中，Rs是-O-L-R′。在一些实施例中，Rs是-O-L-Si(R)3。在一些实施例中，Rs是-O-L-OR′。在一些实施例中，Rs是-O-L-SR′。在一些实施例中，Rs是-O-L-N(R′)2。在一些实施例中，Rs是如本披露中所描述的2′-修饰。在一些实施例中，Rs是-OR，其中R如本披露中所描述。在一些实施例中，Rs是-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基团。在一些实施例中，Rs是-OMe。在一些实施例中，Rs是-OCH2CH2OMe。在一些实施例中，Rs是如本披露中所述的R1s、R2s、R3s、R4s或R5s。
在一些实施例中，g是0-20。在一些实施例中，g是1-20。在一些实施例中，g是1-5。在一些实施例中，g是1。在一些实施例中，g是2。在一些实施例中，g是3。在一些实施例中，g是4。在一些实施例中，g为5。在一些实施例中，g是6。在一些实施例中，g是7。在一些实施例中，g是8。在一些实施例中，g是9。在一些实施例中，g是10。在一些实施例中，g是11。在一些实施例中，g是12。在一些实施例中，g是13。在一些实施例中，g是14。在一些实施例中，g是15。在一些实施例中，g是16。在一些实施例中，g是17。在一些实施例中，g是18。在一些实施例中，g是19。在一些实施例中，g是20。
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720007531
是
Figure BPA0000295055720007532
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720007533
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720007534
是
Figure BPA0000295055720007535
在一些实施例中，每个环A独立地是具有0-10个例如独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环。在一些实施例中，环A是任选地经取代的环，所述环如本披露中所述。在一些实施例中，环A包含氧环原子。在一些实施例中，环A是或包含糖部分的环。在一些实施例中，环是
Figure BPA0000295055720007536
在一些实施例中，环是
Figure BPA0000295055720007537
在一些实施例中，环是
Figure BPA0000295055720007538
在一些实施例中，环是双环，例如发现于LNA的糖部分中。
在一些实施例中，糖单元具有结构
Figure BPA0000295055720007541
其中每个变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，核苷单元具有结构
Figure BPA0000295055720007542
其中每个变量独立地如本披露中所述。
在一些实施例中，Ls是-C(R5s)2-，并且
Figure BPA0000295055720007543
如本披露中所述。在一些实施例中，Ls是-CHR5s-且
Figure BPA0000295055720007544
是如本披露中所述。在一些实施例中，Ls是-C(R)2-且
Figure BPA0000295055720007545
是如本披露中所述。在一些实施例中，Ls是-CHR-且
Figure BPA0000295055720007546
是如本披露中所述。
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720007547
是
Figure BPA0000295055720007548
BA在C1处连接，并且R1s、R2s、R3s、R4s和R5s各自独立地如本披露中所述。在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720007549
是
Figure BPA00002950557200075410
其中R2s如本披露中所述。在一些实施例中，
Figure BPA00002950557200075411
是
Figure BPA00002950557200075412
其中R2s不是-OH。在一些实施例中，
Figure BPA00002950557200075413
是
Figure BPA00002950557200075414
其中R2s和R4s是R，并且两个R基团与插入原子一起形成任选地经取代的环。在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720007551
或环A，是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720007552
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720007553
或环A，是
Figure BPA0000295055720007554
在一些实施例中，
Figure BPA0000295055720007555
或环A，是
Figure BPA0000295055720007556
在一些实施例中，R1s、R2s、R3s、R4s及R5s各自独立地是Rs，其中Rs如本披露中所描述。
在一些实施例中，R1s是Rs，其中Rs如本披露中所述。在一些实施例中，R1s在1′位置处(BA在1′位置处)。在一些实施例中，R1s是-H。在一些实施例中，R1s是-F。在一些实施例中，R1s是-Cl。在一些实施例中，R1s是-Br。在一些实施例中，R1s是-I。在一些实施例中，R1s是-CN。在一些实施例中，R1s是-N3。在一些实施例中，R1s是-NO。在一些实施例中，R1s是-NO2。在一些实施例中，R1s是-L-R′。在一些实施例中，R1s是-R′。在一些实施例中，R1s是-L-OR′。在一些实施例中，R1s是-OR′。在一些实施例中，R1s是-L-SR′。在一些实施例中，R1s是-SR′。在一些实施例中，R1s是L-L-N(R′)2。在一些实施例中，R1s是-N(R′)2。在一些实施例中，R1s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R1s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R1s是-OMe。在一些实施例中，R1s是-MOE。在一些实施例中，R1s是氢。在一些实施例中，一个1′位置处的Rs是氢，且另一1′位置处的Rs不是氢，如本文中所描述。在一些实施例中，两个1′位置处的Rs是氢。在一些实施例中，一个1′位置处的Rs是氢，且另一1′位置连接至核苷酸间键联。在一些实施例中，R1s是-F。在一些实施例中，R1s是-Cl。在一些实施例中，R1s是-Br。在一些实施例中，R1s是-I。在一些实施例中，R1s是-CN。在一些实施例中，R1s是-N3。在一些实施例中，R1s是-NO。在一些实施例中，R1s是-NO2。在一些实施例中，R1s是-L-R′。在一些实施例中，R1s是-R′。在一些实施例中，R1s是-L-OR′。在一些实施例中，R1s是-OR′。在一些实施例中，R1s是-L-SR′。在一些实施例中，R1s是-SR′。在一些实施例中，R1s是-L-N(R′)2。在一些实施例中，R1s是-N(R′)2。在一些实施例中，R1s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R1s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R1s是-OH。在一些实施例中，R1s是-OMe。在一些实施例中，R1s是-MOE。在一些实施例中，R1s是氢。在一些实施例中，一个R1s在1′位处是氢，且另一R1s在另一1′位处不是氢，如本文所述。在一些实施例中，两个1′位置处的R1s是氢。在一些实施例中，R1s是-O-L-OR′。在一些实施例中，R1s是-O-L-OR′，其中L是任选地经取代的C1-6亚烷基，并且R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R1s是-O-(任选地经取代的C1-6亚烷基)-OR′。在一些实施例中，R1s是-O-(任选地经取代的C1-6亚烷基)-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R1s是-OCH2CH2OMe。
在一些实施例中，R2s是Rs，其中Rs如本披露中所述。在一些实施例中，若2′位置处存在两个R2s，则一个R2s是-H且另一者不是-H。在一些实施例中，R2s在2′位置处(BA在1′位置处)。在一些实施例中，R2s是-H。在一些实施例中，R2s是-F。在一些实施例中，R2s是-Cl。在一些实施例中，R2s是-Br。在一些实施例中，R2s是-I。在一些实施例中，R2s是-CN。在一些实施例中，R2s是-N3。在一些实施例中，R2s是-NO。在一些实施例中，R2s是-NO2。在一些实施例中，R2s是-L-R′。在一些实施例中，R2s是-R′。在一些实施例中，R2s是-L-OR′。在一些实施例中，R2s是-OR′。在一些实施例中，R2s是-L-SR′。在一些实施例中，R2s是-SR′。在一些实施例中，R2s是L-L-N(R′)2。在一些实施例中，R2s是-N(R′)2。在一些实施例中，R2s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R2s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R2s是-OMe。在一些实施例中，R2s是-MOE。在一些实施例中，R2s是氢。在一些实施例中，一个2′位置处的Rs是氢，且另一2′位置处的Rs不是氢，如本文所述。在一些实施例中，两个2′位置处的Rs均是氢。在一些实施例中，一个2′位置处的Rs是氢，且另一2′位置连接至核苷酸间键联。在一些实施例中，R2s是-F。在一些实施例中，R2s是-Cl。在一些实施例中，R2s是-Br。在一些实施例中，R2s是-I。在一些实施例中，R2s是-CN。在一些实施例中，R2s是-N3。在一些实施例中，R2s是-NO。在一些实施例中，R2s是-NO2。在一些实施例中，R2s是-L-R′。在一些实施例中，R2s是-R′。在一些实施例中，R2s是-L-OR′。在一些实施例中，R2s是-OR′。在一些实施例中，R2s是-L-SR′。在一些实施例中，R2s是-SR′。在一些实施例中，R2s是-L-N(R′)2。在一些实施例中，R2s是-N(R′)2。在一些实施例中，R2s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R2s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R2s是-OH。在一些实施例中，R2s是-OMe。在一些实施例中，R2s是-MOE。在一些实施例中，R2s是氢。在一些实施例中，在2′位置处的一个R2s是氢，且在另一2′位置处的另一R2s不是氢，如本文所述。在一些实施例中，两个2′位置处的R2s均是氢。在一些实施例中，R2s是-O-L-OR′。在一些实施例中，R2s是-O-L-OR′，其中L是任选地经取代的C1-6亚烷基，并且R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R2s是-O-(任选地经取代的C1-6亚烷基)-OR′。在一些实施例中，R2s是-O-(任选地经取代的C1-6亚烷基)-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R2s是-OCH2CH2OMe。
在一些实施例中，R2s包含胍部分。在一些实施例中，R2s包含
Figure BPA0000295055720007571
在一些实施例中，R2s是-L-Wz，其中Wz选自
Figure BPA0000295055720007572
Figure BPA0000295055720007573
其中R″是R′并且n是0-15。在一些实施例中，R′和R″独立地是
Figure BPA0000295055720007574
Figure BPA0000295055720007575
在一些实施例中，L是-O-CH2CH2-。在一些实施例中，n是0-3。在一些实施例中，每个Rs独立地是-H、-OCH3、-F、-CN、-CH3、-NO2、-CF3或-OCF3。在一些实施例中，R′和R″是相同的。在一些实施例中，R′和R″是不同的。
在一些实施例中，R3s是Rs，其中Rs如本披露中所述。在一些实施例中，R3s在3′位置处(BA在1′位置处)。在一些实施例中，R3s是-H。在一些实施例中，R3s是-F。在一些实施例中，R3s是-Cl。在一些实施例中，R3s是-Br。在一些实施例中，R3s是-I。在一些实施例中，R3s是-CN。在一些实施例中，R3s是-N3。在一些实施例中，R3s是-NO。在一些实施例中，R3s是-NO2。在一些实施例中，R3s是-L-R’。在一些实施例中，R3s是-R′。在一些实施例中，R3s是-L-OR′。在一些实施例中，R3s是-OR′。在一些实施例中，R3s是-L-SR′。在一些实施例中，R3s是-SR′。在一些实施例中，R3s是-L-N(R′)2。在一些实施例中，R3s是-N(R′)2。在一些实施例中，R3s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R3s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R3s是-OMe。在一些实施例中，R3s是-MOE。在一些实施例中，R3s是氢。在一些实施例中，一个3′位置处的Rs是氢，且另一3′位置处的Rs不是氢，如本文所述。在一些实施例中，两个3′位置处的Rs均是氢。在一些实施例中，一个3′位置处的Rs是氢，且另一3′位置连接至核苷酸间键联。在一些实施例中，R3s是-F。在一些实施例中，R3s是-Cl。在一些实施例中，R3s是-Br。在一些实施例中，R3s是-I。在一些实施例中，R3s是-CN。在一些实施例中，R3s是-N3。在一些实施例中，R3s是-NO。在一些实施例中，R3s是-NO2。在一些实施例中，R3s是-L-R′。在一些实施例中，R3s是-R′。在一些实施例中，R3s是-L-OR′。在一些实施例中，R3s是-OR′。在一些实施例中，R3s是-L-SR′。在一些实施例中，R3s是-SR′。在一些实施例中，R3s是L-L-N(R′)2。在一些实施例中，R3s是-N(R′)2。在一些实施例中，R3s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R3s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R3s是-OH。在一些实施例中，R3s是-OMe。在一些实施例中，R3s是-MOE。在一些实施例中，R3s是氢。
在一些实施例中，R4s是Rs，其中Rs如本披露中所述。在一些实施例中，R4s在4′位处(BA在1′位处)。在一些实施例中，R4s是-H。在一些实施例中，R4s是-F。在一些实施例中，R4s是-Cl。在一些实施例中，R4s是-Br。在一些实施例中，R4s是-I。在一些实施例中，R4s是-CN。在一些实施例中，R4s是-N3。在一些实施例中，R4s是-NO。在一些实施例中，R4s是-NO2。在一些实施例中，R4s是-L-R’。在一些实施例中，R4s是-R′。在一些实施例中，R4s是-L-OR′。在一些实施例中，R4s是-OR′。在一些实施例中，R4s是-L-SR′。在一些实施例中，R4s是-SR′。在一些实施例中，R4s是-L-N(R′)2。在一些实施例中，R4s是-N(R′)2。在一些实施例中，R4s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R4s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R4s是-OMe。在一些实施例中，R4s是-MOE。在一些实施例中，R4s是氢。在一些实施例中，一个4′位置处的Rs是氢，且另一4′位置处的Rs不是氢，如本文所述。在一些实施例中，两个4′位置处的Rs均是氢。在一些实施例中，一个4′位置处的Rs是氢，且另一4′位置连接至核苷酸间键联。在一些实施例中，R4s是-F。在一些实施例中，R4s是-Cl。在一些实施例中，R4s是-Br。在一些实施例中，R4s是-I。在一些实施例中，R4s是-CN。在一些实施例中，R4s是-N3。在一些实施例中，R4s是-NO。在一些实施例中，R4s是-NO2。在一些实施例中，R4s是-L-R′。在一些实施例中，R4s是-R′。在一些实施例中，R4s是-L-OR′。在一些实施例中，R4s是-OR′。在一些实施例中，R4s是-L-SR′。在一些实施例中，R4s是-SR′。在一些实施例中，R4s是L-L-N(R′)2。在一些实施例中，R4s是-N(R′)2。在一些实施例中，R4s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R4s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R4s是-OH。在一些实施例中，R4s是-OMe。在一些实施例中，R4s是-MOE。在一些实施例中，R4s是氢。
在一些实施例中，R5s是Rs，其中Rs如本披露中所描述。在一些实施例中，R5s是R′，其中R如本披露中所描述。在一些实施例中，R5s是-H。在一些实施例中，两个或更多个R5s连接至同一碳原子，且至少一者不是-H。在一些实施例中，R5s不是-H。在一些实施例中，R5s是-F。在一些实施例中，R5s是-Cl。在一些实施例中，R5s是-Br。在一些实施例中，R5s是-I。在一些实施例中，R5s是-CN。在一些实施例中，R5s是-N3。在一些实施例中，R5s是-NO。在一些实施例中，R5s是-NO2。在一些实施例中，R5s是-L-R’。在一些实施例中，R5s是-R′。在一些实施例中，R5s是-L-OR′。在一些实施例中，R5s是-OR′。在一些实施例中，R5s是-L-SR′。在一些实施例中，R5s是-SR′。在一些实施例中，R5s是L-L-N(R′)2。在一些实施例中，R5s是-N(R′)2。在一些实施例中，R5s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R5s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R5s是-OH。在一些实施例中，R5s是-OMe。在一些实施例中，R5s是-MOE。在一些实施例中，R5s是氢。
在一些实施例中，R5s是如本披露中所述的任选地经取代的C1-6脂肪族基团，例如针对R或其他变量所述的C1-6脂肪族基团实施例。在一些实施例中，R5s是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R5s是任选地经取代的甲基，其中每个取代基(如果有的话)独立地包含不超过一个碳原子。在一些实施例中，R5s是任选地经取代的甲基，其中每个取代基(如果有的话)独立地是卤素。在一些实施例中，R5s是甲基。在一些实施例中，R5s是乙基。
在一些实施例中，R5s是适用于寡核苷酸合成的受保护羟基。在一些实施例中，R5s是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R5s是DMTrO-。用于根据本披露使用的示例保护基团是广泛已知的。对于其他实例，参见Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis[有机合成中的保护基团]，第2版；Wiley[威利出版社]：纽约，1991，以及US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US 20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192664、WO 2017/192679和/或WO 2017/210647，将其各自的保护基团通过引用特此并入。
在一些实施例中，R1s、R2s、R3s、R4s及R5s中的两者或多于两者是R，且可与一个或多个插入原子一起形成如本披露中所描述的环。在一些实施例中，R2s及R4s是一起形成环的R，且糖部分可是双环糖部分，例如LNA糖部分。
在一些实施例中，Ls是如本披露中所述的L。
在一些实施例中，Ls是-C(R5s)2-，其中每个R5s独立地如本披露中所描述。在一些实施例中，R5s中的一者是H且另一者不是H。在一些实施例中，R5s中无一者是H。在一些实施例中，Ls是-CHR5s-，其中每个R5s独立地如本披露中所描述。在一些实施例中，-C(R5s)2-的碳原子立体随机的。在一些实施例中，其具有R构型。在一些实施例中，其具有S构型。在一些实施例中，-C(R5s)2-是糖部分的任选地经取代的5′-C。在一些实施例中，-C(R5s)2-的C具有R构型。在一些实施例中，-C(R5s)2-的C具有S构型。如本披露中所描述，在一些实施例中，R5s是任选经取代的C1-6脂肪族基团；在一些实施例中，R5s是甲基。
在一些实施例中，所提供的化合物包含一个或多个任选地经取代的二价或多价环，例如环A、CyL、由两个或更多个R基团(R及可是R的变量(的组合))一起形成的环等等。在一些实施例中，环是如针对R所描述但是二价或多价的环脂肪族基团、芳基、杂芳基或杂环基。如本领域技术人员所理解的，如果满足其他变量(例如杂原子数、化合价等)的要求，则针对一个变量(例如环A)描述的环部分也可以适用于其他变量(例如CyL)。本披露中广泛描述了示例环。
在一些实施例中，环(例如任选地经取代的环A、R等)是具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的3-20元单环、双环或多环。
在一些实施例中，环可具有其范围内的任何大小，例如3元、4元、5元、6元、7元、8元、9元、10元、11元、12元、13元、14元、15元、16元、17元、18元、19元或20元。
在一些实施例中，环是单环的。在一些实施例中，环是饱和且单环的。在一些实施例中，环是单环且部分饱和的。在一些实施例中，环是单环且芳族的。
在一些实施例中，环是双环的。在一些实施例中，环是多环的。在一些实施例中，双环或多环包含两个或更多个单环部分，所述单环部分各自可以是饱和、部分饱和或芳族的，且所述单环部分各自可以不含有杂原子或含有1-10个杂原子。在一些实施例中，双环或多环包含饱和单环。在一些实施例中，双环或多环包含不含杂原子的饱和单环。在一些实施例中，双环或多环包含含有一个或多个杂原子的饱和单环。在一些实施例中，双环或多环包含部分饱和单环。在一些实施例中，双环或多环包含不含杂原子的部分饱和单环。在一些实施例中，双环或多环包含含有一个或多个杂原子的部分饱和单环。在一些实施例中，双环或多环包含芳族单环。在一些实施例中，双环或多环包含不含杂原子的芳族单环。在一些实施例中，双环或多环包含含有一个或多个杂原子的芳族单环。在一些实施例中，双环或多环包含饱和环和部分饱和环，其各自独立地含有一个或多个杂原子。在一些实施例中，双环包含饱和环和部分饱和环，其各自独立地不包含杂原子或包含一个或多个杂原子。在一些实施例中，双环包含芳环和部分饱和环，其各自独立地不包含杂原子或包含一个或多个杂原子。在一些实施例中，多环包含饱和环和部分饱和环，其各自独立地不包含杂原子或包含一个或多个杂原子。在一些实施例中，多环包含芳环和部分饱和环，其各自独立地不包含杂原子或包含一个或多个杂原子。在一些实施例中，多环包含芳环和饱和环，其各自独立地不包含杂原子或包含一个或多个杂原子。在一些实施例中，多环包含芳环、饱和环和部分饱和环，其各自独立地不包含杂原子或包含一个或多个杂原子。在一些实施例中，环包含至少一个杂原子。在一些实施例中，环包含至少一个氮原子。在一些实施例中，环包含至少一个氧原子。在一些实施例中，环包含至少一个硫原子。
如本领域技术人员根据本披露所理解的，环通常是任选地经取代的。在一些实施例中，环是未取代的。在一些实施例中，环是取代的。在一些实施例中，环在其碳原子中的一个或多个上是取代的。在一些实施例中，环在其杂原子中的一个或多个上是取代的。在一些实施例中，环在其碳原子中的一个或多个上和其杂原子中的一个或多个上是取代的。在一些实施例中，两个或更多个取代基可位于同一环原子上。在一些实施例中，所有可用环原子是取代的。在一些实施例中，并非所有可用环原子是取代的。在一些实施例中，在所提供的结构中，其中环被指示为连接至其他结构(例如，在
Figure BPA0000295055720007621
中的环A)，“任选地经取代的”是指除了已经连接的那些结构之外，其余的可取代的环位置(如果有的话)也是任选地经取代的。
在一些实施例中，环是二价或多价C3-30环脂肪族环。在一些实施例中，环是二价或多价C3-20环脂肪族环。在一些实施例中，环是二价或多价C3-10环脂肪族环。在一些实施例中，环是二价或多价的3-30元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，环是二价或多价的3-7元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，环是二价或多价的3元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，环是二价或多价的4元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，环是二价或多价的5元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，环是二价或多价的6元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，环是二价或多价的7元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，环是二价或多价的环己基环。在一些实施例中，环是二价或多价的环戊基环。在一些实施例中，环是二价或多价的环丁基环。在一些实施例中，环是二价或多价的环丙基环。
在一些实施例中，环是二价或多价的C6-30芳基环。在一些实施例中，环是二价或多价的苯环。
在一些实施例中，环是二价或多价的8-10元双环饱和环、部分不饱和环或芳基环。在一些实施例中，环是二价或多价的8-10元双环饱和环。在一些实施例中，环是二价或多价的8-10元双环部分不饱和环。在一些实施例中，环是二价或多价的8-10元双环芳基环。在一些实施例中，环是二价或多价的萘基环。
在一些实施例中，环是具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的二价或多价5-30元杂芳基环。在一些实施例中，环是具有1-10个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的二价或多价5-30元杂芳基环。在一些实施例中，环是具有1-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的二价或多价5-30元杂芳基环。在一些实施例中，环是具有1-5个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的二价或多价5-30元杂芳基环。
在一些实施例中，环是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价5-6元单环杂芳基环。在一些实施例中，环是具有1-3个独立地选自氮、硫和氧的杂原子的二价或多价5-6元单环杂芳基环。
在一些实施例中，环是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的二价或多价5元单环杂芳基环。在一些实施例中，环是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价6元单环杂芳基环。
在某些实施例中，环是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价8-10元双环杂芳基环。在一些实施例中，环是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，环是具有1-5个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价5，6-稠合杂芳基环。在某些实施例中，环是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价6，6-稠合杂芳基环。
在一些实施例中，环是具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的二价或多价3-30元杂环。在一些实施例中，环是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价3-7元饱和或部分不饱和的杂环。在某些实施例中，环是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价5-7元部分不饱和单环。在某些实施例中，环是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价5-6元部分不饱和单环。在某些实施例中，环是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价5元部分不饱和单环。在某些实施例中，环是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价6元部分不饱和单环。在某些实施例中，环是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价7元部分不饱和单环。在一些实施例中，环是具有一个选自氮、氧或硫的杂原子的二价或多价3元杂环。在一些实施例中，环是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价4元杂环。在一些实施例中，环是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价5元杂环。在一些实施例中，环是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价6元杂环。在一些实施例中，环是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价7元杂环。
在一些实施例中，环是具有1-5个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价7-10元双环饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，环是具有1-5个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价8-10元双环杂芳基环。
在一些实施例中，环是具有1-5个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价5，6-稠合杂芳基环。在某些实施例中，环是具有1-5个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的二价或多价6，6-稠合杂芳基环。
在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环(典型地是任选地经取代的)是除居间杂原子(如果有的话)之外不具有另外的杂原子的单环饱和5-7元环。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是除居间杂原子(如果存在的话)之外不具有另外的杂原子的单环饱和5元环。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是除居间杂原子(如果存在的话)之外不具有另外的杂原子的单环饱和6元环。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是除居间杂原子(如果存在的话)之外不具有另外的杂原子的单环饱和7元环。
在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是除居间杂原子(如果存在的话)之外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的双环、饱和环、部分不饱环或芳基5-30元环。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是除居间杂原子(如果存在的话)之外具有0-10个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的双环、饱和环、部分不饱环或芳基5-30元环。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是除居间杂原子(如果存在的话)之外不具有另外的杂原子的双环及饱和8-10元双环。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是除居间杂原子(如果存在的话)之外不具有另外的杂原子的双环及饱和8元双环。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是除居间杂原子(如果存在的话)之外不具有另外的杂原子的双环及饱和9元双环。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是除居间杂原子(如果存在的话)之外不具有另外的杂原子的双环及饱和10元双环。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是双环的，且包含与5元环稠合的5元环。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是双环的，且包含与6元环稠合的5元环。在一些实施例中，5元环包含一个或多个作为环原子的居间氮原子、磷原子和氧原子。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环包含具有如下骨架结构的环体系：
Figure BPA0000295055720007651
Figure BPA0000295055720007652
在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是除居间杂原子(如果存在的话)之外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的多环、饱和环、部分不饱环或芳基3-30元环。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是除居间杂原子(如果存在的话)之外具有0-10个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的多环、饱和环、部分不饱环或芳基3-30元环。
在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含5-10元单环，其环原子包含一个或多个居间氮原子、磷原子和/或氧原子。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含5-9元单环，其环原子包含一个或多个居间氮原子、磷原子和/或氧原子。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含5-8元单环，其环原子包含一个或多个居间氮原子、磷原子和/或氧原子。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含5-7元单环，其环原子包含一个或多个居间氮原子、磷原子和/或氧原子。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含5-6元单环，其环原子包含一个或多个居间氮原子、磷原子和/或氧原子。
在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含5元单环，其环原子包含一个或多个居间氮原子、磷原子和/或氧原子。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含6元单环，其环原子包含一个或多个居间氮原子、磷原子和/或氧原子。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含7元单环，其环原子包含一个或多个居间氮原子、磷原子和/或氧原子。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含8元单环，其环原子包含一个或多个居间氮原子、磷原子和/或氧原子。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含9元单环，其环原子包含一个或多个居间氮原子、磷原子和/或氧原子。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含10元单环，其环原子包含一个或多个居间氮原子、磷原子和/或氧原子。
在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含5元环，其环原子由碳原子以及居间氮原子、磷原子和氧原子组成。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含6元环，其环原子由碳原子以及居间氮原子、磷原子和氧原子组成。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含7元环，其环原子由碳原子以及居间氮原子、磷原子和氧原子组成。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含8元环，其环原子由碳原子以及居间氮原子、磷原子和氧原子组成。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含9元环，其环原子由碳原子以及居间氮原子、磷原子和氧原子组成。在一些实施例中，由两个或更多个基团一起形成的环是单环、双环或多环的且包含10元环，其环原子由碳原子以及居间氮原子、磷原子和氧原子组成。
在一些实施例中，本文所述的环是未取代的。在一些实施例中，本文所述的环是取代的。在一些实施例中，取代基是选自本披露中所提供的示例化合物中描述的那些取代基。
在一些实施例中，每个BA独立地是选自以下的任选地经取代的基团：具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C5-30杂芳基，以及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷、硼和硅的杂原子的C3-30杂环基；
每个环A独立地是具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环；并且
每个LP独立地具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。
在一些实施例中，每个BA独立地是具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的C5-30杂芳基，其中该杂芳基包含一个或多个选自氧和氮的杂原子；
每个环A独立地是具有0-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的5-10元单环或双环饱和环，其中该环包含至少一个氧原子；并且
每个LP独立地具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。
在一些实施例中，每个BA独立地是任选地经取代的A、T、C、G或U，或A、T、C、G或U的任选地经取代的互变异构体；
每个环A独立地是具有一个或多个氧原子的任选地经取代的5-7元单环或双环饱和环；并且
每个LP独立地具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。
在一些实施例中，各BA独立地是选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、胸腺嘧啶及尿嘧啶的任选经取代或受保护的核碱基；
每个环A独立地是具有一个或多个氧原子的任选地经取代的5-7元单环或双环饱和环；并且
每个LP独立地具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构，其中每个变量独立地如本披露中所述。
在一些实施例中，R5s-Ls-是-CH2OH。在一些实施例中，R5s-Ls-是-CH(R5s)-OH，其中R5s如本披露中所述。
在一些实施例中，BA是选自以下的任选地经取代的基团：C3-30环脂肪族，C6-30芳基，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C5-30杂芳基，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C3-30杂环基，天然核碱基部分和经修饰的核碱基部分。在一些实施例中，BA是选自以下的任选地经取代的基团：具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C5-30杂芳基，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C3-30杂环基，天然核碱基部分和经修饰的核碱基部分。在一些实施例中，BA是选自以下的任选地经取代的基团：具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C5-30杂芳基，天然核碱基部分和经修饰的核碱基部分。在一些实施例中，BA是具有1-10个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的任选地经取代的C5-30杂芳基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的天然核碱基及其互变异构体。在一些实施例中，BA是受保护的天然核碱基及其互变异构体。用于寡核苷酸合成的各种核碱基保护基团是已知的，且可依照本披露利用。在一些实施例中，BA是选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任选地经取代的核碱基及其互变异构体。在一些实施例中，BA是选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任选地受保护的核碱基及其互变异构体。
在一些实施例中，BA是任选地经取代的C3-30环脂肪族。在一些实施例中，BA是任选地经取代的C6-30芳基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的C3-30杂环基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的C5-30杂芳基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的天然碱基部分。在一些实施例中，BA是任选地经取代的经修饰的碱基部分。BA是选自以下的任选地经取代的基团：C3-30环脂肪族、C6-30芳基、C3-30杂环基和C5-30杂芳基。在一些实施例中，BA是选自以下的任选地经取代的基团：C3-30环脂肪族、C6-30芳基、C3-30杂环基、C5-30杂芳基和天然核碱基部分。
在一些实施例中，BA通过芳环连接。在一些实施例中，BA通过杂原子连接。在一些实施例中，BA通过芳环的环杂原子连接。在一些实施例中，BA通过芳环的环氮原子连接。
在一些实施例中，BA是天然核碱基部分。在一些实施例中，BA是任选地经取代的天然核碱基部分。在一些实施例中，BA是经取代的天然核碱基部分。在一些实施例中，BA是任选地经取代的A、T、C、U、或G，或任选地经取代的A、T、C、U、或G的互变异构体。在一些实施例中，BA是天然核碱基A、T、C、U或G。在一些实施例中，BA是选自以下的任选地经取代的基团：天然核碱基A、T、C、U和G。
在一些实施例中，BA是任选地经取代的嘌呤碱基残基。在一些实施例中，BA是受保护的嘌呤碱基残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的腺嘌呤残基。在一些实施例中，BA是受保护的腺嘌呤残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的鸟嘌呤残基。在一些实施例中，BA是受保护的鸟嘌呤残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的胞嘧啶残基。在一些实施例中，BA是受保护的胞嘧啶残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的胸腺嘧啶残基。在一些实施例中，BA是受保护的胸腺嘧啶残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的尿嘧啶残基。在一些实施例中，BA是受保护的尿嘧啶残基。在一些实施例中，BA是任选地经取代的5-甲基胞嘧啶残基。在一些实施例中，BA是受保护的5-甲基胞嘧啶残基。
在一些实施例中，s是0-20。在一些实施例中，s是1-20。在一些实施例中，s是1-5。在一些实施例中，s是1。在一些实施例中，s是2。在一些实施例中，s是3。在一些实施例中，s是4。在一些实施例中，s是5。在一些实施例中，s是6。在一些实施例中，s是7。在一些实施例中，s是8。在一些实施例中，s是9。在一些实施例中，s是10。在一些实施例中，s是11。在一些实施例中，s是12。在一些实施例中，s是13。在一些实施例中，s是14。在一些实施例中，s是15。在一些实施例中，s是16。在一些实施例中，s是17。在一些实施例中，s是18。在一些实施例中，s是19。在一些实施例中，s是20。
在一些实施例中，LP是核苷酸间键联。在一些实施例中，LP是具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、H-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的核苷酸间键联。在一些实施例中，LP是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，LP是非负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，LP是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，LP是负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，LP是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，LP是手性受控的核苷酸间键联。
在一些实施例中，z是1-1000。在一些实施例中，z+1是如本披露中所述的寡核苷酸长度。在一些实施例中，z是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 to 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。在一些实施例中，z是10-100。在一些实施例中，z是10-50。在一些实施例中，z是15-100。在一些实施例中，z是20-50。在一些实施例中，z不小于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。在一些实施例中，z不小于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14。在一些实施例中，z不大于50、60、70、80、90、100、150或200。在一些实施例中，z是5-50、10-50、14-50、14-45、14-40、14-35、14-30、14-25、14-100、14-150、14-200、14-250、14-300、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、15-25、15-100、15-150、15-200、15-250、15-300、16-50、16-45、16-40、16-35、16-30、16-25、16-100、16-150、16-200、16-250、16-300、17-50、17-45、17-40、17-35、17-30、17-25、17-100、17-150、17-200、17-250、17-300、18-50、18-45、18-40、18-35、18-30、18-25、18-100、18-150、18-200、18-250、18-300、19-50、19-45、19-40、19-35、19-30、19-25、19-100、19-150、19-200、19-250或19-300。在一些实施例中，z是10。在一些实施例中，z是11。在一些实施例中，z是12。在一些实施例中，z是13。在一些实施例中，z是14。在一些实施例中，z是15。在一些实施例中，z是16。在一些实施例中，z是17。在一些实施例中，z是18。在一些实施例中，z是19。在一些实施例中，z是20。在一些实施例中，z是21。在一些实施例中，z是22。在一些实施例中，z是23。在一些实施例中，z是24。在一些实施例中，z是25。在一些实施例中，z是26。在一些实施例中，z是27。在一些实施例中，z是28。在一些实施例中，z是29。在一些实施例中，z是30。在一些实施例中，z是31。在一些实施例中，z是32。在一些实施例中，z是33。在一些实施例中，z是34。
在一些实施例中，L3E是-L-或-L-L-。在一些实施例中，L3E是-L-。在一些实施例中，L3E是-L-L-。在一些实施例中，L3E是共价键。在一些实施例中，L3E是用于寡核苷酸合成的接头。在一些实施例中，L3E是用于固相寡核苷酸合成的接头。已知各种类型的接头且可根据本披露使用。在一些实施例中，接头是琥珀酸根接头(-O-C(O)-CH2-CH2-C(O)-)。在一些实施例中，接头是乙二酰基接头(-O-C(O)-C(O)-)。在一些实施例中，L3E是琥珀酰基-哌啶接头(SP)。在一些实施例中，L3E是琥珀酰基接头。在一些实施例中，L3E是Q-接头。在一些实施例中，L3E是-O-。
在一些实施例中，R3E是-R′、-L-R′、-OR′或固体支持物。在一些实施例中，R3E是如本披露中所述的-R′。在一些实施例中，R3E是如本披露中所述的-R。在一些实施例中，R3E是氢。在一些实施例中，R3E是-L-R′。在一些实施例中，R3E是-OR′。在一些实施例中，R3E是寡核苷酸合成的支持物。在一些实施例中，R3E是固体载体。在一些实施例中，固体支持物是CPG支持物。在一些实施例中，固体支持物是聚苯乙烯支持物。在一些实施例中，R3E是-H。在一些实施例中，-L3-R3E是-H。在一些实施例中，R3E是-OH。在一些实施例中，-L3-R3E是-OH。在一些实施例中，R3E是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R3E是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R3E是-OR′。在一些实施例中，R3E是-OH。在一些实施例中，R3E是-OR′，其中R′不是氢。在一些实施例中，R3E是-OR′，其中R′是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R3E是3’-端帽(例如，RNAi技术中使用的那些端帽)。
在一些实施例中，R3E是固体载体。在一些实施例中，R3E是寡核苷酸合成的固体载体。已知各种类型的固体载体且可根据本披露使用。在一些实施例中，固体载体是HCP。在一些实施例中，固体载体是CPG。
在一些实施例中，R′是-R、-C(O)R、-C(O)OR、或-S(O)2R，其中R如本披露中所述。在一些实施例中，R′是R，其中R如本披露中所述。在一些实施例中，R′是-C(O)R，其中R如本披露中所述。在一些实施例中，R′是-C(O)OR，其中R如本披露中所述。在一些实施例中，R′是-S(O)2R，其中R如本披露中所描述。在一些实施例中，R′是氢。在一些实施例中，R′不是氢。在一些实施例中，R′是R，其中R是如本披露中所描述的任选地经取代的C1-20脂肪族基团。在一些实施例中，R′是R，其中R是如本披露中所描述的任选地经取代的C1-20杂脂肪族基团。在一些实施例中，R′是R，其中R是如本披露中所描述的任选地经取代的C6-20芳基。在一些实施例中，R′是R，其中R是如本披露中所描述的任选地经取代的C6-20芳基脂肪族基团。在一些实施例中，R′是R，其中R是如本披露中所描述的任选地经取代的C6-20芳基杂脂肪族基团。在一些实施例中，R′是R，其中R是如本披露中所述的任选地经取代的5-20元杂芳基。在一些实施例中，R′是R，其中R是如本披露中所述的任选地经取代的3-20元杂环基。在一些实施例中，两个或更多个R′是R，且任选地且独立地一起形成如本披露中所述的任选地经取代的环。
在一些实施例中，各R独立地是-H，或选自以下的任选经取代的基团：C1-30脂肪族基团、具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的C1-30杂脂肪族基团、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族基团、具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的C6-30芳基杂脂肪族基团、具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的5元至30元杂芳基以及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的3元至30元杂环基。
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与所述原子一起形成除所述原子外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环；或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居间原子外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
在一些实施例中，每个R独立地是-H，或是选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C1-30杂脂肪族，C6-30芳基，C6-30芳基脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C6-30芳基杂脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的5-30元杂芳基，以及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与所述原子一起形成除所述原子外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居间原子外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
在一些实施例中，每个R独立地是-H，或是选自以下的任选地经取代的基团：C1-20脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C1-20杂脂肪族，C6-20芳基，C6-20芳基脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C6-20芳基杂脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的5-20元杂芳基，以及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的3-20元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与所述原子一起形成除所述原子外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环。
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居间原子外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环。
在一些实施例中，每个R独立地是-H，或是选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C1-30杂脂肪族，C6-30芳基，C6-30芳基脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C6-30芳基杂脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的5-30元杂芳基，以及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的3-30元杂环基。
在一些实施例中，每个R独立地是-H，或是选自以下的任选地经取代的基团：C1-20脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C1-20杂脂肪族，C6-20芳基，C6-20芳基脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的C6-20芳基杂脂肪族，具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的5-20元杂芳基，以及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的3-20元杂环基。
在一些实施例中，R是氢。在一些实施例中，R不是氢。在一些实施例中，R是选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族基团、具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的C1-30杂脂肪族基团、C6-30芳基、具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的5元至30元杂芳环以及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的3元至30元杂环。
在一些实施例中，R是氢或选自以下的任选地经取代的基团：C1-20脂肪族基团；苯基；3元至7元饱和或部分不饱和碳环；8元至10元双环饱和环、部分不饱和环或芳基环；具有1-4个独立地选自氮、氧及硫的杂原子的5元至6元单环杂芳基环；具有1-3个独立地选自氮、氧及硫的杂原子的4元至7元饱和或部分不饱和杂环；具有1-5个独立地选自氮、氧及硫的杂原子的7元至10元双环饱和或部分不饱和杂环；或具有1-5个独立地选自氮、氧及硫的杂原子的8元至10元双环杂芳基环。
在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-30脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-20脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-15脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-10脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是任选地经取代的己基、戊基、丁基、丙基、乙基或甲基。在一些实施例中，R是任选地经取代的己基。在一些实施例中，R是任选地经取代的戊基。在一些实施例中，R是任选地经取代的丁基。在一些实施例中，R是任选地经取代的丙基。在一些实施例中，R是任选地经取代的乙基。在一些实施例中，R是任选地经取代的甲基。在一些实施例中，R是己基。在一些实施例中，R是戊基。在一些实施例中，R是丁基。在一些实施例中，R是丙基。在一些实施例中，R是乙基。在一些实施例中，R是甲基。在一些实施例中，R是异丙基。在一些实施例中，R是正丙基。在一些实施例中，R是叔丁基。在一些实施例中，R是仲丁基。在一些实施例中，R是正丁基。在一些实施例中，R是-(CH2)2CN。
在一些实施例中，R是任选地经取代的C3-30环脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C3-20环脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的C3-10环脂肪族。在一些实施例中，R是任选地经取代的环己基。在一些实施例中，R是环己基。在一些实施例中，R是任选地经取代的环戊基。在一些实施例中，R是环戊基。在一些实施例中，R是任选地经取代的环丁基。在一些实施例中，R是环丁基。在一些实施例中，R是任选地经取代的环丙基。在一些实施例中，R是环丙基。
在一些实施例中，R是任选地经取代的3-30元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，R是任选地经取代的3-7元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，R是任选地经取代的3元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，R是任选地经取代的4元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，R是任选地经取代的5元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，R是任选地经取代的6元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，R是任选地经取代的7元饱和或部分不饱和碳环。在一些实施例中，R是任选地经取代的环庚基。在一些实施例中，R是环庚基。在一些实施例中，R是任选地经取代的环己基。在一些实施例中，R是环己基。在一些实施例中，R是任选地经取代的环戊基。在一些实施例中，R是环戊基。在一些实施例中，R是任选地经取代的环丁基。在一些实施例中，R是环丁基。在一些实施例中，R是任选地经取代的环丙基。在一些实施例中，R是环丙基。
在一些实施例中，当R是或包含环结构(例如环脂肪族团、环杂脂肪族、芳基、杂芳基等)时，所述环结构可以是单环、双环或多环的。在一些实施例中，R是或包含单环结构。在一些实施例中，R是或包含双环结构。在一些实施例中，R是或包含多环结构。
在一些实施例中，R是具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的任选地经取代的C1-30杂脂肪族基团。在一些实施例中，R是具有1-10个杂原子的任选地经取代的C1-20杂脂肪族基团。在一些实施例中，R是具有1-10独立地选自氧、氮、硫、磷或硅的杂原子的任选地经取代的C1-20杂脂肪族基团，其任选包括氮、硫、磷或硒的一种或多种经氧化形式。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-30杂脂肪族，其包含1-10个独立地选自
Figure BPA0000295055720007751
-N＝、≡N、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-O-、＝O、
Figure BPA0000295055720007752
的基团。
在一些实施例中，R是任选地经取代的C6-30芳基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R是苯基。在一些实施例中，R是取代的苯基。
在一些实施例中，R是任选地经取代的8-10元双环饱和环、部分不饱和环或芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的8-10元双环饱和环。在一些实施例中，R是任选地经取代的8-10元双环部分不饱和环。在一些实施例中，R是任选地经取代的8-10元双环芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的萘基。
在一些实施例中，R是具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的5-30元杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-10个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的任选地经取代的5-30元杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的5-30元杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的任选地经取代的5-30元杂芳基环。
在一些实施例中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的取代的5-6元单环杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的未取代的5-6元单环杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、硫和氧的杂原子的任选地经取代的5-6元单环杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的取代的5-6元单环杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、硫和氧的杂原子的未取代的5-6元单环杂芳基环。
在一些实施例中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5元单环杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6元单环杂芳基环。
在一些实施例中，R是具有一个选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5元单环杂芳基环。在一些实施例中，R选自任选地经取代的吡咯基、呋喃基或噻吩基。
在一些实施例中，R是具有两个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5元杂芳基环。在某些实施例中，R是具有一个氮原子以及选自硫或氧的另一杂原子的任选地经取代的5元杂芳基环。示例R基团包括但不限于任选地经取代的吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基或异噁唑基。
在一些实施例中，R是具有三个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5元杂芳基环。示例R基团包括但不限于任选地经取代的三唑基、噁二唑基或噻二唑基。
在一些实施例中，R是具有四个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5元杂芳基环。示例R基团包括但不限于任选地经取代的四唑基、噁三唑基和噻三唑基。
在一些实施例中，R是具有1-4个氮原子的任选地经取代的6元杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-3个氮原子的任选地经取代的6元杂芳基环。在其他实施例中，R是具有1-2个氮原子的任选地经取代的6元杂芳基环。在一些实施例中，R是具有四个氮原子的任选地经取代的6元杂芳基环。在一些实施例中，R是具有三个氮原子的任选地经取代的6元杂芳基环。在一些实施例中，R是具有两个氮原子的任选地经取代的6元杂芳基环。在某些实施例中，R是具有一个氮原子的任选地经取代的6元杂芳基环。示例R基团包括但不限于任选地经取代的吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基或四嗪基。
在某些实施例中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在其他实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在某些实施例中，R是具有1个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的吲哚基。在一些实施例中，R是任选地经取代的氮杂双环[3.2.1]辛基。在某些实施例中，R是具有2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的氮杂吲哚基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并咪唑基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并噻唑基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并噁唑基。在一些实施例中，R是任选地经取代的吲唑基。在某些实施例中，R是具有3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。
在一些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有两个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有三个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有四个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有五个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。
在某些实施例中，R是具有一个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的吲哚基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并呋喃基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并[b]噻吩基。在某些实施例中，R是具有两个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的氮杂吲哚基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并咪唑基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并噻唑基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并噁唑基。在一些实施例中，R是任选地经取代的吲唑基。在某些实施例中，R是具有三个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基或咪唑并吡啶基。在某些实施例中，R是具有四个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的嘌呤基、噁唑并嘧啶基、噻唑并嘧啶基、噁唑并吡嗪基、噻唑并吡嗪基、咪唑并吡嗪基、噁唑并哒嗪基、噻唑并哒嗪基或咪唑并哒嗪基。在某些实施例中，R是具有五个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。
在一些实施例中，R是任选地经取代的1，4-二氢吡咯并[3，2-b]吡咯基、4H-呋喃并[3，2-b]吡咯基、4H-噻吩并[3，2-b]吡咯基、呋喃并[3，2-b]呋喃基、噻吩并[3，2-b]呋喃基、噻吩并[3，2-b]噻吩基、1H-吡咯并[1，2-a]咪唑基、吡咯并[2，1-b]噁唑基或吡咯并[2，1-b]噻唑基。在一些实施例中，R是任选地经取代的二氢吡咯并咪唑基、1H-呋喃并咪唑基、1H-噻吩并咪唑基、呋喃并噁唑基、呋喃并异噁唑基、4H-吡咯并噁唑基、4H-吡咯并异噁唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并异噁唑基、4H-吡咯并噻唑基、呋喃并噻唑基、噻吩并噻唑基、1H-咪唑并咪唑基、咪唑并噁唑基或咪唑并[5，1-b]噻唑基。
在某些实施例中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在其他实施例中，R是具有1个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的喹啉基。在一些实施例中，R是任选地经取代的异喹啉基。在一些实施例中，R是具有2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的喹唑啉或喹喔啉。
在一些实施例中，R是具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的3-30元杂环。在一些实施例中，R是具有1-10个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-30元杂环。在一些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的3-30元杂环。在一些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-30元杂环。
在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的3-7元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的取代的3-7元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的未取代的3-7元饱和或部分不饱和的杂环。在某些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5-7元部分不饱和单环。在某些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5-6元部分不饱和单环。在某些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5元部分不饱和单环。在某些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6元部分不饱和单环。在某些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的7元部分不饱和单环。在一些实施例中，R是具有一个选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的3元杂环。在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的4元杂环。在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5元杂环。在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6元杂环。在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的7元杂环。
在一些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的3元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的4元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的7元饱和或部分不饱和的杂环。
在一些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的4元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是氮。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是氧。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是硫。在一些实施例中，R是具有2个氧原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有2个氮原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的4元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是氮。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是氧。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是硫。在一些实施例中，R是具有2个氧原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有2个氮原子的任选地经取代的4元部分不饱和的杂环。
在一些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的5元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的5元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是氮。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的5元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是氧。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的5元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是硫。在一些实施例中，R是具有2个氧原子的任选地经取代的5元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有2个氮原子的任选地经取代的5元部分不饱和的杂环。
在一些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6元饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的6元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的6元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是氮。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的6元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是氧。在一些实施例中，R是具有不超过1个杂原子的任选地经取代的6元部分不饱和的杂环，其中所述杂原子是硫。在一些实施例中，R是具有2个氧原子的任选地经取代的6元部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是具有2个氮原子的任选地经取代的6元部分不饱和的杂环。
在某些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和的杂环。在某些实施例中，R是任选地经取代的环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基、硫杂环丙烷基、硫杂环丁烷基、四氢苯硫基、四氢硫代吡喃基、硫杂环庚烷基、二氧戊环基、氧硫杂环戊烷基、噁唑烷基、咪唑烷基、噻唑烷基、二硫杂环戊烷基、二氧杂环己烷基、吗啉基、氧硫杂环己烷基、哌嗪基、硫代吗啉基、二噻烷基、二氧杂环庚烷基、氧氮杂环庚烷基、氧硫杂环庚基、二硫杂环庚基、二氮杂环庚基、二氢呋喃酮基、四氢吡喃酮基、氧杂环庚酮基、吡咯烷酮基、哌啶酮基、氮杂环庚酮基、二氢噻吩酮基、四氢硫代吡喃酮基、硫杂环庚酮基、噁唑烷酮基、氧氮杂环己酮基、氧氮杂环庚酮基、二氧杂环戊酮基、二氧杂环己酮基、二氧杂环庚酮基、氧硫杂环戊酮基、氧杂噻喃酮基、氧硫杂环庚酮基、噻唑烷酮基、噻嗪酮基、硫氮杂环庚酮基、咪唑烷酮基、四氢嘧啶酮基、二氮杂环庚酮基、咪唑烷二酮基、噁唑烷二酮基、噻唑烷二酮基、二氧杂环戊烷二酮基、氧硫杂环戊烷二酮基、哌嗪二酮基、吗啉二酮基、硫代吗啉二酮基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、吗啉基、硫代吗啉基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、四氢苯硫基或四氢硫代吡喃基。
在某些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5-6元部分不饱和单环。在某些实施例中，R是任选地经取代的四氢吡啶基、二氢噻唑基、二氢噁唑基或噁唑啉基基团。
在一些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的7-10元双环饱和或部分不饱和的杂环。在一些实施例中，R是任选地经取代的吲哚啉基。在一些实施例中，R是任选地经取代的异吲哚啉基。在一些实施例中，R是任选地经取代的1，2，3，4-四氢喹啉基。在一些实施例中，R是任选地经取代的1，2，3，4-四氢异喹啉基。在一些实施例中，R是任选地经取代的氮杂双环[3.2.1]辛基。
在一些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的8-10元双环杂芳基环。
在一些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有两个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的1，4-二氢吡咯并[3，2-b]吡咯基、4H-呋喃并[3，2-b]吡咯基、4H-噻吩并[3，2-b]吡咯基、呋喃并[3，2-b]呋喃基、噻吩并[3，2-b]呋喃基、噻吩并[3，2-b]噻吩基、1H-吡咯并[1，2-a]咪唑基、吡咯并[2，1-b]噁唑基或吡咯并[2，1-b]噻唑基。在一些实施例中，R是具有三个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的二氢吡咯并咪唑基、1H-呋喃并咪唑基、1H-噻吩并咪唑基、呋喃并噁唑基、呋喃并异噁唑基、4H-吡咯并噁唑基、4H-吡咯并异噁唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并异噁唑基、4H-吡咯并噻唑基、呋喃并噻唑基、噻吩并噻唑基、1H-咪唑并咪唑基、咪唑并噁唑基或咪唑并[5，1-b]噻唑基。在一些实施例中，R是具有四个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有五个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。
在一些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在其他实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在某些实施例中，R是具有一个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的吲哚基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并呋喃基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并[b]噻吩基。在某些实施例中，R是具有两个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的氮杂吲哚基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并咪唑基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并噻唑基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯并噁唑基。在一些实施例中，R是任选地经取代的吲唑基。在某些实施例中，R是具有三个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基或咪唑并吡啶基。在某些实施例中，R是具有四个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的嘌呤基、噁唑并嘧啶基、噻唑并嘧啶基、噁唑并吡嗪基、噻唑并吡嗪基、咪唑并吡嗪基、噁唑并哒嗪基、噻唑并哒嗪基或咪唑并哒嗪基。在某些实施例中，R是具有五个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的5，6-稠合杂芳基环。
在某些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在其他实施例中，R是具有一个选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的喹啉基。在一些实施例中，R是任选地经取代的异喹啉基。在一些实施例中，R是具有两个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的喹唑啉基、酞嗪基、喹喔啉基或萘啶基。在一些实施例中，R是具有三个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的吡啶并嘧啶基、吡啶并哒嗪基、吡啶并吡嗪基或苯并三嗪基。在一些实施例中，R是具有四个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。在一些实施例中，R是任选地经取代的吡啶并三嗪基、喋啶基、吡嗪并吡嗪基、吡嗪并哒嗪基、哒嗪并哒嗪基、嘧啶并哒嗪基或嘧啶并嘧啶基。在一些实施例中，R是具有五个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选地经取代的6，6-稠合杂芳基环。
在一些实施例中，R是任选地经取代的C6-30芳基脂肪族基团。在一些实施例中，R是任选地经取代的C6-20芳基脂肪族基团。在一些实施例中，R是任选地经取代的C6-10芳基脂肪族基团。在一些实施例中，芳基脂肪族的芳基部分具有6、10或14个芳基碳原子。在一些实施例中，芳基脂肪族的芳基部分具有6个芳基碳原子。在一些实施例中，芳基脂肪族的芳基部分具有10个芳基碳原子。在一些实施例中，芳基脂肪族的芳基部分具有14个芳基碳原子。在一些实施例中，芳基部分是任选地经取代的苯基。
在一些实施例中，R是具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的任选地经取代的C6-30芳基杂脂肪族基团。在一些实施例中，R是具有1-10个独立地选自氧、氮及硫的杂原子的任选地经取代的C6-30芳基杂脂肪族基团。在一些实施例中，R是具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的任选地经取代的C6-20芳基杂脂肪族基团。在一些实施例中，R是具有1-10个独立地选自氧、氮及硫的杂原子的任选地经取代的C6-20芳基杂脂肪族基团。在一些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的任选地经取代的C6-10芳基杂脂肪族基团。在一些实施例中，R是具有1-5个独立地选自氧、氮及硫的杂原子的任选地经取代的C6-10芳基杂脂肪族基团。
在一些实施例中，两个R基团任选地且独立地一起形成共价键。在一些实施例中，形成-C＝O。在一些实施例中，形成-C＝C-。在一些实施例中，形成-C≡C-。
在一些实施例中，同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与所述原子一起形成除所述原子外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。在一些实施例中，同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与所述原子一起形成除所述原子外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环。在一些实施例中，同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与所述原子一起形成除所述原子外具有0-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-10元单环、双环或多环。在一些实施例中，同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与所述原子一起形成除所述原子外具有0-3个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-6元单环、双环或多环。在一些实施例中，同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与所述原子一起形成除所述原子外具有0-3个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-5元单环、双环或多环。
在一些实施例中，两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居间原子外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。在一些实施例中，两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居间原子外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环。在一些实施例中，两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居间原子外具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-10元单环、双环或多环。在一些实施例中，两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居间原子外具有0-5个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-10元单环、双环或多环。在一些实施例中，两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居间原子外具有0-3个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-6元单环、双环或多环。在一些实施例中，两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居间原子外具有0-3个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-5元单环、双环或多环。
在一些实施例中，R基团中或由两个或更多个R基团一起形成的结构中的杂原子选自氧、氮和硫。在一些实施例中，所形成的环是3元、4元、5元、6元、7元、8元、9元、10元、11元、12元、13元、14元、15元、16元、17元、18元、19元或20元的。在一些实施例中，所形成的环是饱和的。在一些实施例中，所形成的环是部分饱和的。在一些实施例中，所形成的环是芳族的。在一些实施例中，所形成的环包含饱和环部分、部分饱和环部分或芳环部分。在一些实施例中，所形成的环包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个芳环原子。在一些实施例中，所形成的环含有不超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个芳环原子。在一些实施例中，芳环原子选自碳、氮、氧和硫。
在一些实施例中，由两个或更多个R基团(或选自R及可是R的变量的两个或多于两个基团)一起形成的环是C3-30环脂肪族基团、C6-30芳基、具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的5元至30元杂芳基或具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的3元至30元杂环基，环如针对R所描述但是二价或多价的。
如本领域技术人员所理解的，本披露中所述的R的实施例也可以独立地是可以是R的变量的实施例。
在一些实施例中，a是1-100。在一些实施例中，a是1-50。在一些实施例中，a是1-40。在一些实施例中，a是1-30。在一些实施例中，a是1-20。在一些实施例中，a是1-15。在一些实施例中，a是1-10。在一些实施例中，a是1-9。在一些实施例中，a是1-8。在一些实施例中，a是1-7。在一些实施例中，a是1-6。在一些实施例中，a是1-5。在一些实施例中，a是1-4。在一些实施例中，a是1-3。在一些实施例中，a是1-2。在一些实施例中，a是1。在一些实施例中，a是2。在一些实施例中，a是3。在一些实施例中，a是4。在一些实施例中，a是5。在一些实施例中，a是6。在一些实施例中，a是7。在一些实施例中，a是8。在一些实施例中，a是9。在一些实施例中，a是10。在一些实施例中，a大于10。
在一些实施例中，b是1-100。在一些实施例中，b是1-50。在一些实施例中，b是1-40。在一些实施例中，b是1-30。在一些实施例中，b是1-20。在一些实施例中，b是1-15。在一些实施例中，b是1-10。在一些实施例中，b是1-9。在一些实施例中，b是1-8。在一些实施例中，b是1-7。在一些实施例中，b是1-6。在一些实施例中，b是1-5。在一些实施例中，b是1-4。在一些实施例中，b是1-3。在一些实施例中，b是1-2。在一些实施例中，b是1。在一些实施例中，b是2。在一些实施例中，b是3。在一些实施例中，b是4。在一些实施例中，b是5。在一些实施例中，b是6。在一些实施例中，b是7。在一些实施例中，b是8。在一些实施例中，b是9。在一些实施例中，b是10。在一些实施例中，b是1。在一些实施例中，b是2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更大。
在一些实施例中，LLD是L。在一些实施例中，LLD是二价LM。
在一些实施例中，LM是如本披露中所描述的-LM1-LM2-LM3-。在一些实施例中，LM是如本披露中所描述的LM1。在一些实施例中，LM是如本披露中所描述的LM2。在一些实施例中，LM是如本披露中所描述的LM3。在一些实施例中，LM是如本披露中所述的L。
在一些实施例中，LM1是L。在一些实施例中，LM2是L。在一些实施例中，LM3是L。在一些实施例中，LM1是共价键。在一些实施例中，LM2是共价键。在一些实施例中，LM3是共价键。在一些实施例中，LM1是如本披露中所描述的LM2。在一些实施例中，LM1是如本披露中所描述的LM3。在一些实施例中，LM2是如本披露中所描述的LM1。在一些实施例中，LM2是如本披露中所描述的LM3。在一些实施例中，LM3是如本披露中所描述的LM1。在一些实施例中，LM3是如本披露中所描述的LM2。在一些实施例中，LM是如本披露中所描述的LM1。在一些实施例中，LM是如本披露中所描述的LM2。在一些实施例中，LM是如本披露中所描述的LM3。在一些实施例中，LM是LM1-LM2，其中LM1及LM2中的各者独立地如本披露中所描述。在一些实施例中，LM是LM1-LM3，其中LM1及LM3中的各者独立地如本披露中所描述。在一些实施例中，LM是LM2-LM3，其中LM2及LM3中的各者独立地如本披露中所描述。在一些实施例中，LM是LM1-LM2-LM3，其中LM1、LM2及LM3中的各者独立地如本披露中所描述。
在一些实施例中，LM1包含一个或多个-N(R′)-及一个或多个-C(O)-。在一些实施例中，接头或LM1是或包含
Figure BPA0000295055720007881
其中nL是1-8。在一些实施例中，接头或-LM1-LM2-LM3-是
Figure BPA0000295055720007882
或其盐形式，其中nL是1-8。在一些实施例中，接头或-LM1-LM2-LM3-是
Figure BPA0000295055720007883
或其盐形式，其中：
nL是1-8。
每个氨基基团独立地连接至一部分；并且
P原子连接至寡核苷酸的5′-OH。
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720007891
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720007892
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720007893
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720007901
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720007902
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720007903
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含
Figure BPA0000295055720007904
在一些实施例中，该接头或LM1是或包含
Figure BPA0000295055720007911
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含：
Figure BPA0000295055720007912
在一些实施例中，该部分和接头，或(RD)b-LM1-LM2-LM3-，是或包含：
Figure BPA0000295055720007913
在一些实施例中，nL是1-8。在一些实施例中，nL是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，nL是1。在一些实施例中，nL是2。在一些实施例中，nL是3。在一些实施例中，nL是4。在一些实施例中，nL是5。在一些实施例中，nL是6。在一些实施例中，nL是7。在一些实施例中，nL是8。
在一些实施例中，至少一个LM系直接结合于所提供的寡核苷酸的糖单元。在一些实施例中，直接结合于糖单元的LM将脂质部分并入寡核苷酸中。在一些实施例中，直接结合于糖单元的LM将碳水化合物部分并入寡核苷酸中。在一些实施例中，直接结合于糖单元的LM将RLD基团并入寡核苷酸中。在一些实施例中，直接结合于糖单元的LM将RCD基团并入寡核苷酸中。在一些实施例中，LM系经由寡核苷酸链的5′-OH直接结合。在一些实施例中，LM系经由寡核苷酸链的3′-OH直接结合。
在一些实施例中，至少一个LM是直接结合于所提供的寡核苷酸的核苷酸间键联单元。在一些实施例中，直接结合于核苷酸间键联单元的LM将脂质部分并入寡核苷酸中。在一些实施例中，直接结合于核苷酸间键联单元的LM将碳水化合物部分并入寡核苷酸中。在一些实施例中，直接结合于核苷酸间键联单元的LM将RLD基团并入寡核苷酸中。在一些实施例中，直接结合于核苷酸间键联单元的LM将RCD基团并入寡核苷酸中。
在一些实施例中，至少一个LM是直接结合于所提供的寡核苷酸的核碱基单元。在一些实施例中，直接结合于核碱基单元的LM将脂质部分并入寡核苷酸中。在一些实施例中，直接结合于核碱基单元的LM将碳水化合物部分并入寡核苷酸中。在一些实施例中，直接结合于核碱基单元的LM将RLD基团并入寡核苷酸中。在一些实施例中，直接结合于核碱基单元的LM将RCD基团并入寡核苷酸中。
在一些实施例中，LM是二价的。在一些实施例中，LM是多价的。在一些实施例中，LM是
Figure BPA0000295055720007921
其中LM直接结合于核碱基，例如如在：
Figure BPA0000295055720007931
在一些实施例中，LM是
Figure BPA0000295055720007932
在一些实施例中，LM是
Figure BPA0000295055720007933
在一些实施例中，LM是
Figure BPA0000295055720007941
在一些实施例中，LM是
Figure BPA0000295055720007942
在一些实施例中，接头部分，例如LM、LM1、LM2、LM3、L、Ls等，是或包含
Figure BPA0000295055720007943
在一些实施例中，接头部分，例如LM、LM1、LM2、LM3、L、Ls等，是或包含
Figure BPA0000295055720007944
在一些实施例中，RD是脂质部分。在一些实施例中，RD是靶向部分。在一些实施例中，RD是碳水化合物部分。在一些实施例中，RD是磺酰胺部分。在一些实施例中，RD是抗体或其片段。在一些实施例中，RD是如本披露中所述的RLD。在一些实施例中，RD是如本披露中所述的RCD。在一些实施例中，RD是如本披露中所述的RTD。
在一些实施例中，脂质部分具有RLD的结构。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、或C25至C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C35、C40、C45、C50、C60、C70、或C80脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-80脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-80脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-70脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-70脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-60脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-60脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-50脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-50脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-40脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-40脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C10-30脂肪族。在一些实施例中，RLD是任选地经取代的C20-30脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24或C25至C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C35、C40、C45、C50、C60、C70或C80脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-80脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-80脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-70脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-70脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-60脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-60脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-50脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-50脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-40脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-40脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C10-30脂肪族。在一些实施例中，RLD是未经取代的C20-30脂肪族。
在一些实施例中，RLD不是氢。在一些实施例中，RLD是脂质部分。在一些实施例中，RLD是靶向部分。在一些实施例中，RLD是包含碳水化合物部分的靶向部分。在一些实施例中，RLD是GalNAc部分。
在一些实施例中，RTD是RLD，其中RLD独立地如本披露中所描述。在一些实施例中，RTD是RCD，其中RCD独立地如本披露中所描述。在一些实施例中，RTD包含磺酰胺部分。在一些实施例中，RTD包含碳水化合物部分。在一些实施例中，RTD包含GalNAc部分。
在一些实施例中，RCD是任选经取代的直链或支链基团，该基团选自C1-30脂肪族基团及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷、硼及硅的杂原子的C1-30杂脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选且独立地经以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、-C(R′)2-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-或-OP(OR′)[B(R′)3]O-；且一个或多个碳原子任选且独立地经CyL替换。在一些实施例中，RCD是任选经取代的直链或支链基团，该基团选自C1-30脂肪族基团及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷、硼及硅的杂原子的C1-30杂脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选且独立地经以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、-C(R′)2-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-或-OP(OR′)[B(R′)3]O-；且一个或多个碳原子独立地经单糖、双糖或多糖部分替换。在一些实施例中，RCD是任选经取代的直链或支链基团，该基团选自C1-30脂肪族基团及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷、硼及硅的杂原子的C1-30杂脂肪族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选且独立地经以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、-C(R′)2-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-或-OP(OR′)[B(R′)3]O-；且一个或多个碳原子独立地经GalNac部分替换。
在一些实施例中，各RD独立地是如本披露中所描述的化学部分。在一些实施例中，RD是另外的化学部分。在一些实施例中，RD是靶向部分。在一些实施例中，RD是或包含碳水化合物部分。在一些实施例中，RD是或包含脂质部分。在一些实施例中，RD是或包含例如细胞受体(诸如δ受体、去唾液酸糖蛋白受体等)的配体部分。在一些实施例中，配体部分是或包含茴香酰胺部分，其可是δ受体的配体部分。在一些实施例中，配体部分是或包含脂质。在一些实施例中，配体部分是或包含GalNAc部分，其可以是脱唾液酸糖蛋白受体的配体部分。在一些实施例中，RD选自任选地经取代的苯基、
Figure BPA0000295055720007971
Figure BPA0000295055720007972
其中n′是0或1，且各其他变量独立地如本披露中所述。在一些实施例中，Rs是F。在一些实施例中，Rs是OMe。在一些实施例中，Rs是OH。在一些实施例中，Rs是NHAc。在一些实施例中，Rs是NHCOCF3。在一些实施例中，R′是H。在一些实施例中，R是H。在一些实施例中，R2s是NHAc，且R5s是OH。在一些实施例中，R2s是对茴香酰基，且R5s是OH。在一些实施例中，R2s是NHAc，且R5s是对茴香酰基。在一些实施例中，R2s是OH，且R5s是对茴香酰基。在一些实施例中，RD选自
Figure BPA0000295055720007973
Figure BPA0000295055720007981
RD的其他实施例包括其他化学部分实施例，例如实例中所描述的那些化学部分实施例。
在一些实施例中，RD、RLD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720007982
在一些实施例中，RD、RLD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720007983
在一些实施例中，RD、RLD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720007991
在一些实施例中，RD、RLD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720007992
在一些实施例中，RD、RLD、RCD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720007993
在一些实施例中，RD、RLD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720007994
在一些实施例中，RD、RLD、RCD或RTD是或包含-N(R1)2，其中每个R1独立地如本披露中所述。在一些实施例中，RD、RLD、RCD或RTD是或包含-N(R1)3，其中每个R1独立地如本披露中所述。在一些实施例中，RD、RLD、RCD或RTD是或包含一个或多个胍部分。在一些实施例中，RD、RLD、RCD或RTD是或包含-N＝C(N(R1)2)，其中每个R1独立地如本披露中所述。在一些实施例中，RD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720007995
在一些实施例中，RD、RLD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008001
在一些实施例中，RD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008002
在一些实施例中，RD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008003
在一些实施例中，RD、RCD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008004
在一些实施例中，RD、RLD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008005
在一些实施例中，RD、RCD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008011
在一些实施例中，RD、RLD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008012
在一些实施例中，RD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008013
在一些实施例中，RD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008021
在一些实施例中，RD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008022
在一些实施例中，RD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008023
在一些实施例中，RD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008031
在一些实施例中，RD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008032
在一些实施例中，RD、RCD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008033
在一些实施例中，RD、RCD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008041
在一些实施例中，RD、RCD或RTD是或包含
Figure BPA0000295055720008042
在一些实施例中，RD、RLD、RCD或RTD包含
Figure BPA0000295055720008051
在一些实施例中，RD、RLD、RCD或RTD包含
Figure BPA0000295055720008052
在一些实施例中，n′是1。在一些实施例中，n′是0。
在一些实施例中，n″是1。在一些实施例中，n″是2。
在一些实施例中，本披露的部分，例如杂脂肪族、杂芳基、杂环基、环等，可包含一个或多个杂原子。在一些实施例中，杂原子为不是碳且不是氢的任何原子。在一些实施例中，每个杂原子独立地选自硼、氮、氧、硫、硅和磷。在一些实施例中，每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硅和磷。在一些实施例中，每个杂原子独立地选自硼、氮、氧、硫和磷。在一些实施例中，每个杂原子独立地选自硼、氮、氧、硫和硅。在一些实施例中，每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在一些实施例中，至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，至少一个杂原子是氧。在一些实施例中，至少一个杂原子是硫。
在一些实施例中，y、t、n和m(例如，在立体化学模式中)独立地是1-20，如在本披露中所述的。在一些实施例中，y是1。在一些实施例中，y是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，y是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些实施例中，y是1。在一些实施例中，y是2。在一些实施例中，y是3。在一些实施例中，y是4。在一些实施例中，y是5。在一些实施例中，y是6。在一些实施例中，y是7。在一些实施例中，y是8。在一些实施例中，y是9。在一些实施例中，y是10。
在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，n是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，n是1-10。在一些实施例中，n是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是2、3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，n是3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，n是4、5、6、7或8。在一些实施例中，n是5、6、7或8。在一些实施例中，n是6、7或8。在一些实施例中，n是7或8。在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是2。在一些实施例中，n是3。在一些实施例中，n是4。在一些实施例中，n是5。在一些实施例中，n是6。在一些实施例中，n是7。在一些实施例中，n是8。在一些实施例中，n是9。在一些实施例中，n是10。
在一些实施例中，m是0-50。在一些实施例中，m是1-50。在一些实施例中，m是1。在一些实施例中，m是2-50。在一些实施例中，m是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，m是2、3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，m是3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，m是4、5、6、7或8。在一些实施例中，m是5、6、7或8。在一些实施例中，m是6、7或8。在一些实施例中，m是7或8。在一些实施例中，m是0。在一些实施例中，m是1。在一些实施例中，m是2。在一些实施例中，m是3。在一些实施例中，m是4。在一些实施例中，m是5。在一些实施例中，m是6。在一些实施例中，m是7。在一些实施例中，m是8。在一些实施例中，m是9。在一些实施例中，m是10。在一些实施例中，m是11。在一些实施例中，m是12。在一些实施例中，m是13。在一些实施例中，m是14。在一些实施例中，m是15。在一些实施例中，m是16。在一些实施例中，m是17。在一些实施例中，m是18。在一些实施例中，m是19。在一些实施例中，m是20。在一些实施例中，m是21。在一些实施例中，m是22。在一些实施例中，m是23。在一些实施例中，m是24。在一些实施例中，m是25。在一些实施例中，m是至少2。在一些实施例中，m是至少3。在一些实施例中，m是至少4。在一些实施例中，m是至少5。在一些实施例中，m是至少6。在一些实施例中，m是至少7。在一些实施例中，m是至少8。在一些实施例中，m是至少9。在一些实施例中，m是至少10。在一些实施例中，m是至少11。在一些实施例中，m是至少12。在一些实施例中，m是至少13。在一些实施例中，m是至少14。在一些实施例中，m是至少15。在一些实施例中，m是至少16。在一些实施例中，m是至少17。在一些实施例中，m是至少18。在一些实施例中，m是至少19。在一些实施例中，m是至少20。在一些实施例中，m是至少21。在一些实施例中，m是至少22。在一些实施例中，m是至少23。在一些实施例中，m是至少24。在一些实施例中，m是至少25。在一些实施例中，m至少大于25。
在一些实施例中，t是1-20。在一些实施例中，t是1。在一些实施例中，t是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，t是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，t是1-5。在一些实施例中，t是2。在一些实施例中，t是3。在一些实施例中，t是4。在一些实施例中，t是5。在一些实施例中，t是6。在一些实施例中，t是7。在一些实施例中，t是8。在一些实施例中，t是9。在一些实施例中，t是10。在一些实施例中，t是11。在一些实施例中，t是12。在一些实施例中，t是13。在一些实施例中，t是14。在一些实施例中，t是15。在一些实施例中，t是16。在一些实施例中，t是17。在一些实施例中，t是18。在一些实施例中，t是19。在一些实施例中，t是20。
在一些实施例中，t和m各自独立地是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少3。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少4。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少5。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少6。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少7。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少8。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少9。在一些实施例中，t和m各自独立地是至少10。
如本披露中使用的，在一些实施例中，“一个或多个”是1-200、1-150、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25。在一些实施例中，“一个或多个”是一个。在一些实施例中，“一个或多个”是两个。在一些实施例中，“一个或多个”是三个。在一些实施例中，“一个或多个”是四个。在一些实施例中，“一个或多个”是五个。在一些实施例中，“一个或多个”是六个。在一些实施例中，“一个或多个”是七个。在一些实施例中，“一个或多个”是八个。在一些实施例中，“一个或多个”是九个。在一些实施例中，“一个或多个”是十个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少一个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少两个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少三个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少四个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少五个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少六个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少七个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少八个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少九个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少十个。如本披露中使用的，在一些实施例中，“至少一个”是1-200、1-150、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些实施例中，“至少一个”是一个。在一些实施例中，“至少一个”是两个。在一些实施例中，“至少一个”是三个。在一些实施例中，“至少一个”是四个。在一些实施例中，“至少一个”是五个。在一些实施例中，“至少一个”是六个。在一些实施例中，“至少一个”是七个。在一些实施例中，“至少一个”是八个。在一些实施例中，“至少一个”是九个。在一些实施例中，“至少一个”是十个。
在一些实施例中，本披露提供了以下实施例：
1.一种寡核苷酸组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个手性受控的核苷酸间键联；以及
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个非负电荷的核苷酸间键联。
2.如实施例1所述的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物的特征在于，当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
3.一种寡核苷酸组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个手性受控的核苷酸间键联；以及
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
4.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸中的每个手性核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。
5.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个手性经修饰的核苷酸间键联在其手性键联磷处独立地具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的立体纯度(stereopurity)。
6.一种组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
该组合物是手性受控的，并且相对于具有相同的碱基序列、骨架键联模式、和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该组合物富集特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，其中：
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，该转录物的剪接发生改变，因为相对于在参考条件下所观察到的，核酸序列的包含水平增加了，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
7.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少一个Sp。
8.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少一个Rp。
9.一种组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；以及
3)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个非负电荷的核苷酸间键联；
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，该转录物的剪接发生改变，因为相对于在参考条件下所观察到的，核酸序列的包含水平增加了，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
10.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地是以下核苷酸间键联：该核苷酸间键联中的至少50％在pH 7.4下以其非负电荷形式存在。
11.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地是中性核苷酸间键联，其中该核苷酸间键联中的至少50％在pH 7.4下以其中性形式存在。
12.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联的该中性形式独立地具有不小于8、9、10、11、12、13或14的pKa。
13.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联的该中性形式，当其所连接的单元被-CH3替换时，独立地具有不小于8、9、10、11、12、13或14的pKa。
14.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该参考条件是不存在该组合物。
15.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该参考条件是存在参考组合物。
16.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该参考组合物是在其他方面相同的组合物，其中这些多种寡核苷酸不包含手性受控的核苷酸间键联。
17.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该参考组合物是在其他方面相同的组合物，其中这些多种寡核苷酸不包含非负电荷的核苷酸间键联。
18.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含一个或多个选自以下的骨架键联：磷酸二酯键联、硫代磷酸酯键联和二硫代磷酸酯键联。
19.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸各自包含一个或多个糖修饰。
20.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些糖修饰包含一个或多个选自以下的修饰：2′-O-甲基、2′-MOE、2′-F、吗啉代和双环糖部分。
21.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个糖修饰是2′-F修饰。
22.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸各自包含含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷单元的5’-端区域，这些核苷单元包含经2’-F修饰的糖部分。
23.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸各自包含含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷单元的3’-端区域，这些核苷单元包含经2’-F修饰的糖部分。
24.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸各自包含在5’-端区域和3’-区域之间的中间区域，该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含磷酸二酯键联的核苷酸单元。
25.一种组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；以及
3)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含：
1)5′-端区域，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的核苷单元；
2)3′-端区域，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的核苷单元；以及
3)在5′-端区域和3′-端区域之间的中间区域，该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含磷酸二酯键联的核苷酸单元。
26.如实施例25所述的组合物，其中该寡核苷酸组合物的特征在于，当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，该转录物的剪接发生改变，因为相对于在参考条件下所观察到的，核酸序列的包含水平增加了，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
27.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域包含1或多个不包含经2’-F修饰的糖部分的核苷单元。
28.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域包含1或多个不包含经2’-F修饰的糖部分的核苷单元。
29.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含1或多个不包含磷酸二酯键联的核苷酸单元。
30.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中包含该5’-端的经2′-F修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间键联的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷单元中的第一个是自该5’-端该寡核苷酸的第一个、第二个、第三个、第四个或第五个核苷单元，并且包含该3’-端的经2′-F修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间键联的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷单元中的最后一个是该寡核苷酸的最后一个、倒数第二个、倒数第三个、倒数第四个或倒数第五个核苷单元。
31.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的连续的核苷单元。
32.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域包含5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的连续的核苷单元。
33.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的连续的核苷单元。
34.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域包含5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的连续的核苷单元。
35.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域中包含经2’-F修饰的糖部分的两个核苷单元之间的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。
36.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域中包含经2’-F修饰的糖部分的两个核苷单元之间的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。
37.如实施例35或36所述的组合物，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。
38.如实施例35或36所述的组合物，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。
39.如实施例35或36所述的组合物，其中每个经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
40.如实施例35或36所述的组合物，其中每个经修饰的核苷酸间键联是手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
41.如实施例35或36所述的组合物，其中每个经修饰的核苷酸间键联是Sp手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
42.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个天然磷酸酯键联。
43.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个天然磷酸酯键联，每个磷酸酯键联独立地位于包含经2′-OR1修饰的糖部分的核苷单元和包含经2′-F修饰的糖部分的核苷单元之间或位于两个各自独立地包含经2′-OR1修饰的糖部分的核苷单元之间，其中R1是任选地经取代的C1-6烷基。
44.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联。
45.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联，每个核苷酸间键联独立地位于包含经2′-OR1修饰的糖部分的核苷单元和包含经2′-F修饰的糖部分的核苷单元之间或位于两个各自独立地包含经2′-OR1修饰的糖部分的核苷单元之间，其中R1是任选地经取代的C1-6烷基。
46.如实施例43或45所述的组合物，其中2′-OR1是2′-OCH3。
47.如实施例43或45所述的组合物，其中2′-OR1是2′-OCH2CH2OCH3。
48.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个手性经修饰的核苷酸间键联。
49.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续的手性经修饰的核苷酸间键联。
50.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域的每个核苷酸间键联是手性经修饰的核苷酸间键联。
51.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个手性经修饰的核苷酸间键联。
52.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续的手性经修饰的核苷酸间键联。
53.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域的每个核苷酸间键联是手性经修饰的核苷酸间键联。
54.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个手性经修饰的核苷酸间键联。
55.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续的手性经修饰的核苷酸间键联。
56.如实施例48-55中任一项所述的组合物，其中每个手性经修饰的核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。
57.如实施例48-55中任一项所述的组合物，其中每个手性经修饰的核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联，其中其手性受控的键联磷具有Sp构型。
58.如实施例48-57中任一项所述的组合物，其中每个手性经修饰的核苷酸间键联独立地是手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
59.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个非负电荷的核苷酸间键联。
60.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个中性核苷酸间键联。
61.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中中性核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。
62.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中中性核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联，该核苷酸间键联在其键联磷处独立于Rp或Sp。
63.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该碱基序列包含与该肌营养不良蛋白基因或其互补序列的20个碱基长的部分具有不超过5个错配的序列。
64.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸的碱基序列的长度不超过50个碱基。
65.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个独立于Rp或Sp的手性受控的中性。
66.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少5个独立于Rp或Sp的手性受控的中性。
67.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少6个独立于Rp或Sp的手性受控的中性。
68.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少10个独立于Rp或Sp的手性受控的中性。
69.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸能够介导该肌营养不良蛋白基因的一个或多个外显子的跳读。
70.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸能够介导该肌营养不良蛋白基因的外显子45、51或53的跳读。
71.如实施例70所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸能够介导该肌营养不良蛋白基因的外显子45的跳读。
72.如实施例70所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸能够介导该肌营养不良蛋白基因的外显子51的跳读。
73.如实施例70所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸能够介导该肌营养不良蛋白基因的外显子53的跳读。
74.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该组合物提供两个或更多个外显子的外显子跳读。
75.如实施例71所述的组合物，其中该碱基序列包含与表A1的序列具有不超过5个错配的序列。
76.如实施例71所述的组合物，其中该碱基序列包含或是表A1的序列。
77.如实施例71所述的组合物，其中该碱基序列是表A1的序列。
78.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸是选自表A1的寡核苷酸中的寡核苷酸。
79.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联。
80.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
81.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的非负电荷的核苷酸间键联。
82.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
83.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构。
84.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中翼包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联。
85.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中翼包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
86.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中翼包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的非负电荷的核苷酸间键联。
87.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中翼包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
88.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼结构或由其组成，并且其中仅一个翼包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联。
89.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中核心包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联。
90.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中核心包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
91.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中核心包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的非负电荷的核苷酸间键联。
92.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中核心包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
93.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的翼的核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联、天然磷酸酯核苷酸间键联或Rp手性核苷酸间键联。
94.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的翼的核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联或天然磷酸酯核苷酸间键联。
95.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的翼的核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联。
96.如实施例93-95中任一项所述的组合物，其中该百分比是50％或更多。
97.如实施例93-95中任一项所述的组合物，其中该百分比是60％或更多。
98.如实施例93-95中任一项所述的组合物，其中该百分比是75％或更多。
99.如实施例93-95中任一项所述的组合物，其中该百分比是80％或更多。
100.如实施例93-95中任一项所述的组合物，其中该百分比是90％或更多。
101.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸各自包含非负电荷的核苷酸间键联和天然磷酸酯核苷酸间键联。
102.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸各自包含非负电荷的核苷酸间键联、天然磷酸酯核苷酸间键联和Rp手性核苷酸间键联。
103.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中翼包含非负电荷的核苷酸间键联和天然磷酸酯核苷酸间键联。
104.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中翼包含非负电荷的核苷酸间键联、天然磷酸酯核苷酸间键联和Rp手性核苷酸间键联。
105.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中核心包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联。
106.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中相同寡核苷酸的所有非负电荷的核苷酸间键联均具有相同的构造。
107.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些非负电荷的核苷酸间键联各自独立地具有式II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构。
108.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些非负电荷的核苷酸间键联各自独立地具有式II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构。
109.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联，该核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。
110.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些特定类型的寡核苷酸在结构上是相同的。
111.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸各自包含任选地通过接头部分与该寡核苷酸的寡核苷酸链缀合的化学部分，其中该化学部分包含碳水化合物部分，肽部分，受体配体部分，或具有-N(R1)2、-N(R1)3或-N＝C(N(R1)2)2的结构的部分。
112.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸各自包含任选地通过接头部分与该寡核苷酸的寡核苷酸链缀合的化学部分，其中该化学部分包含胍部分。
113.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸各自包含任选地通过接头部分与该寡核苷酸的寡核苷酸链缀合的化学部分，其中该化学部分包含-N＝C(N(CH3)2)2。
114.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中具有与该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸相同构造的该组合物中的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的寡核苷酸是属于该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。
115.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中具有该特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的该组合物中的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的寡核苷酸是属于该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。
116.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中具有该特定寡核苷酸类型的碱基序列的该组合物中的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的寡核苷酸是属于该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。
117.如实施例114-116中任一项所述的组合物，其中该百分比是至少10％。
118.如实施例114-116中任一项所述的组合物，其中该百分比是至少50％。
119.如实施例114-116中任一项所述的组合物，其中该百分比是至少80％。
120.如实施例114-116中任一项所述的组合物，其中该百分比是至少90％。
121.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联是氨基磷酸酯键联。
122.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联包含胍部分。
123.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I：
Figure BPA0000295055720008201
或其盐形式，其中：
PL是P(＝W)、P或P→B(R′)3；
W是O、N(-L-R5)、S或Se；
R1和R5各自独立地是-H、-L-R’、卤素、-CN、-NO2、-L-Si(R’)3、-OR’、-SR’或-N(R’)2；
X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R5)-或L；
每个L独立地是共价键或选自具有1-10个杂原子的C1-30脂肪族基团和C1-30杂脂肪族基团的二价任选地经取代的直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被以下替换：CyL；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个R′独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居于它们之间的该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
124.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式I或其盐形式的结构。
125.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-1或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720008211
126.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式I-n-1或其盐形式的结构。
127.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-2或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720008212
128.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-3或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720008213
129.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式I-n-3或其盐形式的结构。
130.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-3或其盐形式的结构，其中来自一个-N(R′)2的一个R′和来自另一个-N(R′)2的一个R′与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，除居于之间的原子之外，该环还具有0-10个杂原子。
131.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式I-n-3或其盐形式的结构，其中来自一个-N(R′)2的一个R′和来自另一个-N(R′)2的一个R′与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，除居于之间的原子之外，该环还具有0-10个杂原子。
132.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-3或其盐形式的结构，其中来自一个-N(R′)2的一个R′和来自另一个-N(R′)2的一个R′与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的5元单环，该环具有不超过两个氮原子。
133.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式I-n-3或其盐形式的结构，其中来自一个-N(R′)2的一个R′和来自另一个-N(R′)2的一个R′与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的5元单环，该环具有不超过两个氮原子。
134.如实施例128-131中任一项所述的组合物，其中该形成的环是饱和环。
135.如实施例128-131中任一项所述的组合物，其中该形成的环是部分不饱和环。
136.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II：
Figure BPA0000295055720008221
或其盐形式，其中：
PL是P(＝W)、P或P→B(R′)3；
W是O、N(-L-R5)、S或Se；
X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R5)-或L；
R5是-H、-L-R′、卤素、-CN、-NO2、-L-Si(R′)3、-OR′、-SR′、或-N(R′)2；
环AL是具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环；
每个Rs独立地是-H、卤素、-CN、-N3、-NO、-NO2、-L-R′、-L-Si(R)3、-L-OR′、-L-SR′、-L-N(R′)2、-O-L-R′、-O-L-Si(R)3、-O-L-OR′、-O-L-SR′或-O-L-N(R′)2；
g是0-20；
每个L独立地是共价键或选自具有1-10个杂原子的C1-30脂肪族基团和C1-30杂脂肪族基团的二价任选地经取代的直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R′)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R′)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR′)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R′)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR′)-、-P(O)(SR′)-、-P(O)(R′)-、-P(O)(NR′)-、-P(S)(OR′)-、-P(S)(SR′)-、-P(S)(R′)-、-P(S)(NR′)-、-P(R′)-、-P(OR′)-、-P(SR′)-、-P(NR′)-、-P(OR′)[B(R′)3]-、-OP(O)(OR′)O-、-OP(O)(SR′)O-、-OP(O)(R′)O-、-OP(O)(NR′)O-、-OP(OR′)O-、-OP(SR′)O-、-OP(NR′)O-、-OP(R′)O-、或-OP(OR′)[B(R′)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被以下替换：CyL；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个R′独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居于它们之间的该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
137.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II或其盐形式的结构。
138.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-a-1：
Figure BPA0000295055720008241
或其盐形式。
139.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II-a-1或其盐形式的结构。
140.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-a-2：
Figure BPA0000295055720008242
或其盐形式。
141.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II-a-2或其盐形式的结构。
142.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-b-1：
Figure BPA0000295055720008251
或其盐形式的结构。
143.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II-b-1或其盐形式的结构。
144.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-b-2：
Figure BPA0000295055720008252
或其盐形式的结构。
145.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II-b-2或其盐形式的结构。
146.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-c-1：
Figure BPA0000295055720008253
或其盐形式的结构。
147.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II-c-1或其盐形式的结构。
148.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-c-2：
Figure BPA0000295055720008261
或其盐形式的结构。
149.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II-c-2或其盐形式的结构。
150.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-d-1：
Figure BPA0000295055720008262
或其盐形式的结构。
151.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II-d-1或其盐形式的结构。
152.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-d-2：
Figure BPA0000295055720008263
或其盐形式的结构。
153.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II-d-2或其盐形式的结构。
154.如实施例136-153中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联具有相同的结构。
155.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中(如果适用)不是非负电荷的核苷酸间键联的、这些多种寡核苷酸中的每个核苷酸间键联独立地具有式I的结构。
156.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸中的每个核苷酸间键联独立地具有式I的结构。
157.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个PL是P(＝W)。
158.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个PL独立地是P(＝W)。
159.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个W是O。
160.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个W是O。
161.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个Y是O。
162.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个Y是O。
163.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个Z是O。
164.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个Z是O。
165.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个X是O。
166.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个X是S。
167.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720008271
的结构。
168.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720008272
的结构。
169.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720008281
的结构。
170.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中对于不是非负电荷的核苷酸间键联的具有式I或其盐形式的每个核苷酸间键联，X独立地是O或S，并且-Ls-R5是-H(分别是天然磷酸酯键联或硫代磷酸酯键联)。
171.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸中的每个硫代磷酸酯键联(如果有的话)独立地是手性受控的核苷酸间键联。
172.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中至少一个非负电荷的核苷酸间键联是手性受控的寡核苷酸组合物。
173.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中至少一个非负电荷的核苷酸间键联是手性受控的寡核苷酸组合物。
174.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸包含靶向部分，其中该靶向部分通过接头独立地与寡核苷酸骨架连接。
175.如实施例174所述的组合物，其中该靶向部分是碳水化合物部分。
176.如实施例174或175所述的组合物，其中该靶向部分包含或是GalNAc部分。
177.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸包含脂质部分，其中该脂质部分通过接头独立地与寡核苷酸骨架连接。
178.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸包含(Np/Op)t[(Rp)n(Sp)m]y、(Np/Op)t[(Op)n(Sp)m]y、(Np/Op)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Op)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y、[(Rp)n(Sp)m]y、[(Op)n(Sp)m]y、[(Op/Rp)n(Sp)m]y、(Rp)t(Np)n(Rp)m、(Rp)t(Sp)n(Rp)m、(Rp)t[(Np/Op)n]y(Rp)m、(Rp)t[(Sp/Np)n]y(Rp)m、(Rp)t[(Sp/Op)n]y(Rp)m、(Np/Op)t(Np)n(Np/Op)m、(Np/Op)t(Sp)n(Np/Op)m、(Np/Op)t[(Np/Op)n]y(Np/Op)m、(Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m、(Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m、(Rp/Op)t(Np)n(Rp/Op)m、(Rp/Op)t(Sp)n(Rp/Op)m、(Rp/Op)t[(Np/Op)n]y(Rp/Op)m、(Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m或(Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m的骨架手性中心模式。
179.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸包含(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y的骨架手性中心模式。
180.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中y是1。
181.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中n是1。
182.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中t是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
183.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中t是4、5、6、7、8、9或10。
184.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中m是2、3、4、5、6、7、8、9或10。
185.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中m是4、5、6、7、8、9或10。
186.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸具有式O-I或其盐的结构。
187.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中式O-I中的LP独立地具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构。
188.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中
Figure BPA0000295055720008291
是
Figure BPA0000295055720008292
189.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中
Figure BPA0000295055720008293
是
Figure BPA0000295055720008294
190.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中
Figure BPA0000295055720008295
是
Figure BPA0000295055720008296
191.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中
Figure BPA0000295055720008297
是任选地经取代的
Figure BPA0000295055720008298
192.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中LP和环A之间的、式O-I中的Ls是-C(R5s)2-。
193.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中LP和环A之间的、式O-I中的Ls是-CH(R5s)-。
194.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中式O-I中的-L3E-R3E是-OH。
195.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸具有Ac-[-LLD-(RLD)a]b、Ac-[-LM-(RD)a]b、[(Ac)a-LM]b-RD、(Ac)a-LM-(Ac)b或(Ac)a-LM-(RD)b，或其盐的结构。
196.如实施例195所述的组合物，其中H-Ac、[H]a-Ac或[H]b-Ac是如实施例186-194中任一项所述的寡核苷酸。
197.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中在该组合物的条件下一个或多个非中性核苷酸间键联独立地作为盐形式存在。
198.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中在该组合物的条件下一个或多个负电荷的核苷酸间键联独立地作为盐形式存在。
199.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中在该组合物的条件下一个或多个负电荷的核苷酸间键联独立地作为金属盐存在。
200.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中在该组合物的条件下每个负电荷的核苷酸间键联独立地作为金属盐存在。
201.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中在该组合物的条件下每个负电荷的核苷酸间键联独立地作为钠盐存在。
202.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中每个负电荷的核苷酸间键联独立地是天然磷酸酯键联(其中性形式是-O-P(O)(OH)-O)或硫代磷酸酯核苷酸间键联(其中性形式是-O-P(O)(SH)-O)。
203.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中杂脂肪族、杂烷基、杂环基或杂芳基中的每个杂原子独立地是硼、氮、氧、硅、硫或磷。
204.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中杂脂肪族、杂烷基、杂环基或杂芳基中的每个杂原子独立地是氮、氧、硅、硫或磷。
205.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中杂脂肪族、杂烷基、杂环基或杂芳基中的每个杂原子独立地是氮、氧或硫。
206.一种药物组合物，该药物组合物包含如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸组合物、和药学上可接受的载体。
207.一种用于改变靶转录物的剪接的方法，该方法包括施用如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸组合物。
208.如实施例207所述的方法，其中相对于不存在该组合物，改变该靶转录物的剪接。
209.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该改变是相对于不存在该组合物，一个或多个外显子以增加的水平被跳读。
210.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该靶转录物是肌营养不良蛋白的前-mRNA。
211.如前述实施例中任一项所述的方法，其中肌营养不良蛋白的外显子51相对于不存在该组合物以增加的水平被跳读。
212.如实施例207-210中任一项所述的方法，其中肌营养不良蛋白的外显子53相对于不存在该组合物以增加的水平被跳读。
213.如实施例207-210中任一项所述的方法，其中肌营养不良蛋白的外显子45相对于不存在该组合物以增加的水平被跳读。
214.如前述实施例中任一项所述的方法，其中肌营养不良蛋白的两个或更多个外显子相对于不存在该组合物以增加的水平被跳读。
215.如前述实施例中任一项所述的方法，其中由外显子被跳读的mRNA编码的蛋白质提供比无外显子跳读的相应mRNA编码的蛋白质更好的一种或多种功能。
216.一种用于治疗肌肉营养不良，杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的方法，该方法包括向易患该疾病或患有该疾病的受试者施用如前述实施例中任一项所述的组合物。
217.一种用于治疗肌肉营养不良，杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的方法，该方法包括(a)向易患该疾病或患有该疾病的受试者施用如前述实施例中任一项所述的组合物，和(b)向该受试者施用另外的治疗。
218.如实施例217所述的方法，其中该另外的治疗能够预防、治疗、减轻或减缓肌肉营养不良、杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的进展。
219.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该另外的治疗包括施用如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该组合物的寡核苷酸具有不同的碱基序列。
220.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该另外的治疗包括施用如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该组合物的寡核苷酸具有不同的碱基序列并靶向不同的外显子。
221.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物剪接系统包含成肌细胞或肌小管。
222.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物剪接系统包含成肌细胞。
223.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物剪接系统包含成肌细胞，其在预分化0、4或7天后与该组合物接触。
224.一种包含组合的组合物，该组合包含：(a)如前述实施例中任一项所述的第一组合物；(b)如前述实施例中任一项所述的第二组合物；以及任选地(c)如前述实施例中任一项所述的第三组合物，其中该第一、第二和第三组合物是不同的。
实例
上述内容是对本披露的某些非限制性实施例的描述。因此，应理解，本文所述的披露的实施例仅说明本披露的原理的应用。本文对所示实施例的细节的引用并非旨在限制任何权利要求的范围。
用于制备、以及用于评估寡核苷酸和寡核苷酸组合物的特性和/或活性的多种方法是本领域广泛已知的并可以根据本披露加以利用，这些方法包括但不限于以下中描述的那些：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 2015/0211006、US 2017/0037399、WO 2017/015555、WO 2017/192664、WO 2017/015575、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194和WO 2019/055951，其每个的方法和试剂通过引用结合在此。在一些实施例中，本披露提供了用于制备寡核苷酸及其组合物(特别是包含中性骨架(例如，n001、n002、n003、n004、n005、n006、n007、n008、n009、n010等)的手性受控的寡核苷酸，及其手性受控的寡核苷酸组合物)的技术，以及评估和使用各种寡核苷酸及其组合物的技术。除其他事项外，申请人在本文中描述了用于制备、评估和使用所提供的寡核苷酸和寡核苷酸组合物的示例技术。
从下面描述的示例可以更全面地理解本披露的某些实施例的功能和优点。以下实施例旨在说明此类实施例的某些益处。
实例1.寡核苷酸组合物的示例合成
用于制备寡核苷酸及其组合物的技术是本领域众所周知的。在一些实施例中，使用在以下的一个或多个中描述的技术(例如，试剂(例如，固体支持物、偶联试剂、切割试剂、亚磷酰胺等)、手性助剂、溶剂(例如，用于反应、洗涤等)、循环、反应条件(例如，时间、温度等)等)来制备本披露的寡核苷酸和寡核苷酸组合物：US 9394333、US 9744183、US9605019、US 9598458、US 2015/0211006、US 2017/0037399、WO 2017/015555、WO 2017/192664、WO 2017/015575、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO 2018/237194和WO 2019/055951。
实例2.包含含有三唑部分或炔烃部分的核苷酸间键联的寡核苷酸的示例合成。
可以根据本披露制备各种类型的核苷酸间键联。在该实例中描述了包含含有三唑部分的核苷酸间键联的寡核苷酸的制备。如本领域技术人员所理解的，本文所述的技术可以容易地用于缀合各种期望的部分，例如衍生自GalNAc的那些、脂质、肽、配体等。除其他事项外，这种缀合可用于将寡核苷酸递送至各种目标系统(例如，中枢神经系统、肌肉、眼睛等)。
包含含有三唑部分的核苷酸间键联的示例寡核苷酸。
Figure BPA0000295055720008341
溶液相中二聚体制备的合成方案。
Figure BPA0000295055720008351
固体支持物上二聚体制备的合成方案。
Figure BPA0000295055720008361
Figure BPA0000295055720008371
三唑骨架寡核苷酸：
Figure BPA0000295055720008372
溶液相中二聚体制备的合成方案：
Figure BPA0000295055720008381
固体支持物上二聚体制备的合成方案：
Figure BPA0000295055720008382
Figure BPA0000295055720008391
炔烃骨架寡核苷酸：
Figure BPA0000295055720008401
固体支持物上二聚体制备的合成方案：
Figure BPA0000295055720008402
Figure BPA0000295055720008411
实例3.包含胍部分的氨基磷酸酯核苷酸间键联的示例合成
如本文说明的，依照本披露，可以从亚磷酸酯核苷酸间键联(包括立体纯的亚磷酸酯核苷酸间键联)容易地制备氨基磷酸酯核苷酸间键联。
Figure BPA0000295055720008412
在氩气氛在室温下，向亚酰胺(amidite)(474mg，0.624mmol，1.5当量，通过与干乙腈共蒸发并且在真空下持续最小12h预干燥)和TBS保护的醇(150mg，0.41mmol，通过与干乙腈共蒸发并且在真空下持续最小12h预干燥)在干乙腈(5.2ml)中的搅拌的溶液中添加5-(乙基硫代)-1H-四唑(ETT，2.08ml，0.6M，3当量)。将反应混合物搅拌5min，然后通过LCMS监测，然后添加2-叠氮基-1，3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐(356mg，1.24mmol，3当量)在乙腈(1ml)中的溶液。一旦反应完全(约5min后，通过LCMS监测)，然后添加三乙胺(0.17ml，1.24mmol，3当量)，并反应通过LCMS监测。将反应混合物在减压下浓缩然后再溶于二氯甲烷(50ml)中，用水(25ml)、饱和的碳酸氢钠水溶液(25ml)、和盐水(25ml)洗涤，并用硫酸镁干燥。在减压下将溶剂去除。将粗产物通过硅胶柱(80g)，使用DCM(5％三乙胺)和MeOH作为洗脱液进行纯化。收集含有产物的级分，并将溶剂蒸发。所得产物可含有三乙胺三盐酸盐(TEA.HCl)。为了去除盐，将产物再溶于DCM(50ml)中，并用饱和的水溶液碳酸氢钠(20ml)和盐水(20ml)洗涤，然后用硫酸镁干燥，并将溶剂蒸发。获得淡黄色固体。产率：440mg(89％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.34，-1.98。MS C51H65FN7O14Psi的计算值[M]+1078.17，观察值：1078.57[M+H]+。
Figure BPA0000295055720008421
立体纯的(Rp)二聚体的合成。
在氩气氛在室温下，向L-DPSE手性亚酰胺(1.87g，2.08mmol，1.5当量，通过与干乙腈共蒸发并且在真空下持续最小12h预干燥)和TBS保护的醇(500mg，1.38mmol，通过与干乙腈共蒸发并且在真空下持续最小12h预干燥)在干乙腈(18mL)中的搅拌的溶液中添加2-(1H-咪唑-1-基)乙腈三氟甲磺酸酯(CMIMT，5.54mL，0.5M，2当量)。将所得反应混合物搅拌5min，然后通过LCMS监测，然后添加2-叠氮基-1，3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐(1.18g，4.16mmol，3当量)在乙腈(2mL)中的溶液。一旦反应完全(约5min后，通过LCMS监测)，将反应混合物在减压下浓缩然后再溶于二氯甲烷(70mL)中，用水(40mL)、饱和的碳酸氢钠水溶液(40mL)和盐水(40mL)洗涤，并用硫酸镁干燥。在减压下将溶剂去除。将粗产物通过硅胶柱(120g)(使用DCM(5％三乙胺)和MeOH作为洗脱剂)纯化。收集含有产物的级分，并将溶剂蒸发。所得产物含有TEA.HCl盐。为了去除盐，将产物再溶于DCM(50mL)中，并用饱和的碳酸氢钠水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤，然后用硫酸镁干燥，并将溶剂蒸发。获得淡黄色泡沫固体。产率：710mg(47％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.38。MS C51H65FN7O14PSi的计算值[M]+1078.17，观察值：1078.19。
Figure BPA0000295055720008431
立体纯的(Sp)二聚体的合成
遵循与Rp二聚体相同的程序。代替L-DPSE手性亚酰胺，使用D-DPSE手性亚酰胺。获得淡黄色泡沫固体。产率：890mg(59％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.93。MS C51H65FN7O14PSi的计算值[M]+1078.17，观察值：1078.00。
在实例31P NMR(在δ0.0的磷酸内标)中，立体随机制剂分别在-1.34和-1.98显示两个峰；立体纯的Rp制剂在-1.93显示峰，并且立体纯的Sp制剂在-1.38显示峰。
实例4A.制备具有包含中性胍基团的核苷酸间键联的寡核苷酸
依照本披露中所述的技术，可以制备具有各种中性和/或阳离子的核苷酸间键联(例如，在生理pH)的寡核苷酸。下面说明的是包含代表性的此类核苷酸间键联的寡核苷酸的制备。
WV-11237是包含四个核苷酸间键联的寡核苷酸，其具有
Figure BPA0000295055720008432
结构(n001)向骨架引入中性性质并降低骨架的总负电荷。预期的分子量：7113.4。
例如，下面描述WV-11237的一种制备，这些制备包括某些合成条件和分析结果。简而言之，使用L-DPSE亚酰胺和典型的DPSE偶联循环(包含脱三苯甲基-＞偶联-＞预加帽(Pre-Cap)-＞硫醇化-＞后加帽(Post-Cap))构建立体纯核苷酸间键联。修饰对于n001核苷酸间键联的循环，并包含脱三苯甲基-＞偶联-＞二甲基咪唑鎓处理-＞后加帽。与某些氧化循环相比，例如，用I2-吡啶(pyr)-水来氧化P(III)的氧化步骤被二甲基咪唑鎓处理替换。
示例制备的某些条件和/或结果。
合成规模：127μmol
合成条件(立体纯的核苷酸间键联)
Figure BPA0000295055720008441
帽A＝N-甲基咪唑于乙腈中，20/80，v/v(20％∶80％＝NMI∶ACN(v/v))
帽B＝乙酸酐/2，6-二甲基吡啶/乙腈，20/30/50，v/v/v，20％∶30％∶50％＝Ac2O∶2，6-二甲基吡啶∶ACN(v/v/v)
合成条件(立体随机n001)
Figure BPA0000295055720008442
Figure BPA0000295055720008451
合成过程参数：
合成器：AKTA Oligopilot 100
固体支持物：CPG 2’氟-U(85umol/g)
合成规模：127umol；1.5gm
柱直径：20mm
柱体积：6.3mL
立体纯的偶联试剂：
单体：0.2M在MeCN(2’氟-dA-L-DPSE，2’氟-dG-L-DPSE，2’-OMe-A-L-DPSE)中；0.2M在20％异丁腈/MeCN(2’氟-dC-L-DPSE，2’氟-U-L-DPSE)中
去封闭：3％二氯乙酸(DCA)于甲苯中
活化剂：0.6M CMIMT，在MeCN中
硫化：0.2M苍耳烷氢化物，在吡啶中
帽A：N-甲基咪唑于乙腈中，20/80，v/v(20％NMI于MeCN中)
帽B：乙酸酐/2，6-二甲基吡啶/乙腈，20/30/50，v/v/v，(乙酸酐，二甲基吡啶，MeCN(20∶30∶50))
预加帽：净帽B
立体随机偶联试剂：
单体：0.2M，在MeCN(2’OMeA和2’OMeG)中
去封闭：3％DCA，在甲苯中
活化剂：0.6M ETT，在MeCN中
2-叠氮基-1，3-二甲基咪唑啉-六氟磷酸盐：0.1M，在MeCN中
帽A：20％NMI，在MeCN中
帽B：乙酸酐、二甲基砒啶、MeCN
脱保护条件：
通过首先用5M三乙胺三氢氟化物(TEA.HF)(在二甲基甲酰胺(DMSO)、H2O、三乙胺(pH6.8)中)处理支持物对一个罐进行脱保护。孵育：3h，室温，80μL/μmol。随后添加氨水(200μL/μmol)。孵育：24h，35℃。使用0.45μm过滤器对脱保护的材料无菌过滤。
产率：72O.D./μmol
TEA.HF在DMSO/水中配制5X溶液，5/1，v/v：
Figure BPA0000295055720008461
在示例粗UPLC色谱图中，有四个不同的峰，所有都具有7113.2的相同的所希望的分子量：
RT 面积 ％面积 身高
9 7.843 402732 16.75 212901
10 7.884 941388 39.14 327190
11 7.968 595232 24.75 275741
12 8.025 353090 14.68 150141
示例最终QC UPLC色谱图显示四个不同的峰，所有都具有7113.2的所希望的分子量(％纯度95.32)。粗LC-MS显示7113.2的所希望的分子量的单个峰(数据未显示)。示例最终QC LC-MS显示具有7113.1的所希望的分子量的主峰。
可以使用相似的循环条件或其变体制备其他寡核苷酸，这取决于每种寡核苷酸的特定化学性质。以下列出了某些寡核苷酸的MS数据：
Figure BPA0000295055720008462
Figure BPA0000295055720008471
实例4B.手性受控的非负电荷的核苷酸间键联
二聚体合成。
此程序是制得立体纯的二聚体磷酸酯骨架，然后将其并入寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸或ASO、单链的RNAi试剂或ssRNA等)的可选择位点。第二种方法是使用自动的寡核苷酸合成器合成分子以在特定位点或完全寡核苷酸处引入非负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联)。
Figure BPA0000295055720008481
Figure BPA0000295055720008491
Figure BPA0000295055720008501
一般实验程序(A)：在氩气氛下在室温下，向立体随机的亚酰胺(amidite)(474mg，0.624mmol，1.5当量，通过与干乙腈共蒸发并且将其保持在真空下持续最小12h预干燥)和TBS保护的醇(150mg，0.41mmol，通过与干乙腈共蒸发并且将其保持在真空下持续最小12h预干燥)在干乙腈(5.2mL)中的搅拌的溶液中添加5-(乙基硫代)-1H-四唑(ETT，2.08ml，0.6M，3当量)。将所得反应混合物搅拌5min，然后通过LCMS监测，然后添加2-叠氮基-1，3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐(356mg，1.24mmol，3当量)在乙腈(1mL)中的溶液。一旦反应完全(约5min后，通过LCMS监测)，然后添加三乙胺(0.17mL，1.24mmol，3当量)并通过LCMS监测。将反应混合物在减压下浓缩并然后再溶于二氯甲烷(50mL)，用水(25mL)、饱和水性碳酸氢钠(25mL)和盐水(25mL)洗涤，用硫酸镁干燥。在减压下将溶剂去除。将粗产物通过硅胶柱(80g)，使用DCM(2％三乙胺)和MeOH作为洗脱液进行纯化。收集含有产物的级分并蒸发。获得淡黄色固体1001。产率：440mg(89％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.34，-1.98。MS(ES)m/zC51H65FN7O14PSi的计算值[M]+1077.40，观察值：1078.57[M+H]+。
Figure BPA0000295055720008511
立体纯的(Rp)二聚体的一般实验程序(B)：在氩气氛下在室温下，向L(或)D-DPSE手性亚酰胺(1.87g，2.08mmol，1.5当量，通过与干乙腈共蒸发并且将其保持在真空下持续最小12h预干燥)和TBS保护的醇(500mg，1.38mmol，通过与干乙腈共蒸发并且将其保持在真空下持续最小12h预干燥)在干乙腈(18mL)中的搅拌的溶液中添加2-(1H-咪唑-1-基)乙腈三氟甲磺酸酯(CMIMT，5.54mL，0.5M，2当量)。将所得反应混合物搅拌5min，然后通过LCMS监测，然后添加2-叠氮基-1，3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐(1.18g，4.16mmol，3当量)在乙腈(2mL)中的溶液。一旦反应完全(约5min后，通过LCMS监测)，然后将反应混合物在减压下浓缩然后再溶于二氯甲烷(70mL)中，用水(40mL)、饱和的碳酸氢钠水溶液(40mL)和盐水(40mL)洗涤，用硫酸镁干燥。在减压下将溶剂去除。将粗产物通过硅胶柱(120g)，使用DCM(2％三乙胺)和MeOH作为洗脱液进行纯化。蒸发含有产物的级分。获得淡黄色泡沫固体1002。产率：710mg(47％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.38。MS(ES)m/z C51H65FN7O14PSi的计算值[M]+1077.40，观察值：1078.19[M+H]+。
Figure BPA0000295055720008521
立体纯的(Sp)二聚体1003：程序B遵循上文所示的。使用D-DPSE手性亚酰胺。获得淡黄色泡沫固体。产率：890mg(59％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.93。MS(ES)m/zC51H65FN7O14PSi的计算值[M]+1077.40，观察值：1078.00[M+H]+。
脱保护TBS基团的一般实验程序(C)：在rt下，向TBS保护的化合物(9.04mmol)在三氢氟化物(THF)(70mL)中的搅拌的溶液中添加TBAF(1.0M，13.6mmol)。将反应混合物在室温搅拌2-4h。LCMS显示没有剩余起始材料，然后浓缩，然后使用ISCO-combiflash系统(330g金rediSep高性能硅胶柱预平衡的3CV，2％TEA，在DCM中)和DCM/甲醇/2％TEA作为梯度洗脱液进行纯化。将含有柱级分的产物合并在一起并蒸发，然后在高真空下干燥得到纯的产物。
手性亚酰胺的一般实验程序(D)：在35℃，将TBS脱保护的化合物(2.5mmol)通过与80mL的无水甲苯(30mL x 2)共蒸发进行干燥，并在高真空下干燥过夜。然后将干燥的其溶于干THF(30mL)中，随后添加三乙胺(17.3mmol)，然后将反应混合物冷却至-65℃[对于鸟嘌呤味：在-65℃添加2.5mmol TMS-Cl；对于无鸟嘌呤味，未添加TMS-Cl]。通过注射器经2min将[(1R，3S，3aS)-1-氯-3-((甲基联苯甲硅烷基)甲基)四氢-1H，3H-吡咯并[1，2-c][1，3，2]氧杂氮杂磷杂茂(或)(1S，3R，3aR)-1-氯-3-((甲基联苯甲硅烷基)甲基)四氢-1H，3H-吡咯并[1，2-c][1，3，2]氧杂氮杂磷杂茂(1.8当量)的THF溶液添加至以上反应混合物中，然后逐渐温至室温。在20-30min，在室温，TLC以及LCMS指示起始材料转化为产物(反应时间：1h)。然后在氩气下使用无空气过滤管过滤反应混合物，用THF洗涤并在26℃在旋转蒸发仪下干燥得到粗固体材料，通过ISCO-combiflash系统(40g高rediSep高性能硅胶柱(用CH3CN/5％TEA的3CV，然后用DCM/5％TEA预平衡的3CV)，使用DCM/CH3CN/5％TEA作为溶剂(化合物10-40DCM/CH3CN/5％TEA中洗脱)进行纯化。蒸发后，将合并在一起的柱级分在高真空下干燥，得到白色固体，以给出分离的产率。
31P NMR(磷酸在80.0的内标)：1001：-1.34和-1.98。1002：-1.93。1003：-1.38。1001、1002、和1003的1H NMR证明了非对映异构体的多个氢的不同化学位移。LCMS显示两种非对映异构体的保留时间也不同。在一种情况下，观察到以下保留时间：1001为1.90和2.15，并且一种非对映异构体为1.92，另一种为非对映异构体为2.17。
Figure BPA0000295055720008531
化合物1004：随后是程序B和C，灰白色泡沫固体，产率：(36％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.23。MS(ES)m/z C47H54FN8O14P的计算值[M]+1004.34，观察值：1043.21[M+K]+。
化合物1005：使用程序D，灰白色泡沫固体，产率：(81％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ154.43，-2.52。MS(ES)m/z C66H76FN9O15P2Si的计算值[M]+1343.46，观察值：1344.85[M+H]+。
Figure BPA0000295055720008532
化合物1006：随后是程序B、和C，灰白色泡沫固体，产率：(47％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-2.54。MS(ES)m/z C47H54FN8O14P的计算值[M]+1004.34，观察值：1043.12[M+K]+。
化合物1007：使用程序D，灰白色泡沫固体，产率：(81％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ153.55，-2.20。MS(ES)m/z C66H76FN9O15P2Si的计算值[M]+1343.46，观察值：1344.75[M+H]+。
Figure BPA0000295055720008541
化合物1008：随后是程序B和C，灰白色泡沫固体，产率：(36％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.38。MS(ES)m/z C58H63FN13O13P的计算值[M]+1199.43，观察值：1200.76[M+H]+。
化合物1009：使用程序D，灰白色泡沫固体，产率：(60％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ157.26，-2.86。MS(ES)m/z C77H85FN14O14P2Si的计算值[M]+1538.55，观察值：1539.93[M+H]+。
Figure BPA0000295055720008551
化合物1010：随后是程序B和C，灰白色泡沫固体，产率：(36％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-2.82。MS(ES)m/z C58H63FN13O13P的计算值[M]+1199.43，观察值：1200.19[M+H]+。
化合物1011：使用程序D，灰白色泡沫固体，产率：(63％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ159.56，-2.99。MS(ES)m/z C77H85FN14O14P2Si的计算值[M]+1538.55，观察值：1539.83[M+H]+。
Figure BPA0000295055720008561
化合物1012：随后是程序B和C，灰白色泡沫固体，产率：(36％)。
Figure BPA0000295055720008562
Figure BPA0000295055720008563
31P NMR(162MHz，氯仿-d)δ-1.83.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ12.14(s，1H)，11.28(s，1H)，9.15(s，1H)，8.56(s，1H)，8.25-7.94(m，2H)，7.90(s，1H)，7.72-7.48(m，2H)，7.44(dd，J＝8.2，6.7Hz，2H)，7.35-7.26(m，2H)，7.24-7.02(m，8H)，6.81-6.56(m，4H)，6.04(d，J＝5.2Hz，1H)，5.67(d，J＝5.5Hz，1H)，4.83(dt，J＝8.6，4.4Hz，1H)，4.71-4.54(m，2H)，4.49(dt，J＝14.2，4.8Hz，2H)，4.35(ddt，J＝11.0，5.1，3.2Hz，1H)，4.28-4.09(m，2H)，3.68(s，6H)，3.37(d，J＝3.3Hz，7H)，3.33-3.17(m，5H)，2.82(s，5H)，2.74-2.60(m，1H)，1.92(s，2H)，1.72-1.50(m，1H)，1.08(d，J＝6.9Hz，3H)，0.94(d，J＝6.9Hz，3H)。MS(ES)m/z C59H66N13O14P的计算值1211.45[M]+，观察值：1212.42[M+H]+。
化合物1013：使用程序D，灰白色泡沫固体，产率：(78％)。
Figure BPA0000295055720008564
Figure BPA0000295055720008565
31P NMR(162MHz，氯仿-d)δ159.42，-2.47。MS(ES)m/z C78H88N14O15P2Si的计算值1550.57[M]+，观察值：1551.96[M+H]+。
Figure BPA0000295055720008571
化合物1014：随后是程序B和C，灰白色泡沫固体，产率：(30％)。
Figure BPA0000295055720008572
Figure BPA0000295055720008573
MS(ES)m/z C59H66N13O14P的计算值1211.45[M]+，观察值：1212.80[M+H]+。
化合物1015：使用程序D，灰白色泡沫固体，产率：(68％)。
Figure BPA0000295055720008574
Figure BPA0000295055720008575
MS(ES)m/z C78H88N14O15P2Si的计算值1550.57[M]+，观察值：1551.77[M+H]+。
化合物1016：使用程序D，灰白色泡沫固体，产率：(64％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ156.64，-2.67。MS(ES)m/z C78H88N14O15P2Si的计算值1550.57[M]+，观察值：1551.77[M+H]+。
Figure BPA0000295055720008581
使用磺酰基亚酰胺的对于立体纯的二聚体的一般实验程序(E)：在氩气氛下在室温下，向立体纯的磺酰基亚酰胺1017(259mg，0.275mmol，1.5当量)和TBS保护的醇(100mg，0.18mmol)在干乙腈(2mL)中的搅拌的溶液中添加2-(1H-咪唑-1-基)乙腈三氟甲磺酸酯(CMIMT，0.73mL，0.36mmol，0.5M，2当量)。所得反应混合物搅拌5min，并通过LCMS监测，然后添加乙酸酐(2M，在ACN中，0.18ml，0.36mmol，2当量)和二甲基砒啶(2M，在ACN中，0.18ml，0.36mmol，2当量)的混合物，然后搅拌约5min，然后添加2-叠氮基-1，3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐(104.7mg，0.367mmol，2当量)在乙腈(1mL)中的溶液。一旦反应完全(约5min后，通过LCMS监测)，然后添加三乙胺(0.13mL，0.91mmol，5当量)并通过LCMS监测。一旦反应完全，将其在减压下浓缩，然后再溶于二氯甲烷(50mL)中，用水(25mL)、饱和的碳酸氢钠水溶液(25mL)和盐水(25mL)洗涤，用硫酸镁干燥。在减压下将溶剂去除。将粗产物通过硅胶柱(80g)，使用DCM(2％三乙胺)和MeOH作为洗脱液进行纯化。收集含有产物的级分并蒸发。获得灰白色固体1018。产率：204mg(82％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.87。MS(ES)m/zC74H75FN10O14P的计算值[M]+1359.44，观察值：1360.39[M+H]+。
可以用于合成的另外的亚磷酰胺包括：
Figure BPA0000295055720008582
另外的有用的手性助剂包括：
Figure BPA0000295055720008591
Figure BPA0000295055720008592
其他亚磷酰胺和手性助剂，如以下中描述的那些：US 9695211、US 9605019、US 9598458、US 2013/0178612、US20150211006、US 20170037399、WO 2017/015555、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO2017/192664、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/223056和/或WO 2018/237194，其每个的手性助剂和亚磷酰胺通过引用结合。
实例4C.N2，N6-双(4-氨磺酰基苯甲酰)-L-赖氨酸的合成
Figure BPA0000295055720008593
步骤1.在0℃下，向4-氨磺酰基苯甲酸(10.00g，49.70mmol)和HOSu(6.29g，54.67mmol)在DMF(300mL)中的溶液中添加DCC(10.25g，49.70mmol)。将混合物在0℃下搅拌16小时。LCMS显示化合物已消耗。合并所得混合物，并与另一批粗产物(1g规模)一起进行后处理。过滤N，N′-二环己基脲(DCU)的白色悬浮液，并除去白色固体。将滤液浓缩以给出油状物。将该粗产物用热2-丙醇(50mL*3)洗涤以提供灰白色固体。获得呈白色固体的化合物(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)4-氨磺酰基苯甲酸酯(11.80g，38.66mmol，77.78％产率，97.713％纯度)(从10g批料的转化率得到)。对于两批反应，完全获得呈白色固体的化合物(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)4-氨磺酰基苯甲酸酯(13g)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.30(d，J＝8.4Hz，2H)，8.08(d，J＝8.3Hz，2H)，7.70(s，2H)，2.96-2.87(m，4H)；13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ＝170.62，161.47，150.32，131.40，127.65，127.18，26.04；HPLC纯度：97.71％。
步骤2.向(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)4-氨磺酰基苯甲酸酯(5.00g，16.76mmol)和(2S)-2，6-二氨基己酸(1.23g，8.38mmol)在H2O(50mL)和DMF(50.00mL)中的溶液中添加NaHCO3(2.11g，25.14mmol)。将混合物在15℃下搅拌16小时。LCMS显示检测到具有所希望的化合物的MS。将混合物在减压下浓缩以给出粗品(6g)。将粗品(3.5g)通过制备型HPLC(柱：Phenomenex luna C18 250*50mm*10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：1％-30％，20min)纯化。获得呈白色固体的N2，N6-双(4-氨磺酰基苯甲酰)-L-赖氨酸(1.40g，30.40％产率，93.268％纯度)和2.5g呈黄色固体的粗品。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝12.64(br s，1H)，8.80(br d，J＝7.5Hz，1H)，8.65(brt，J＝5.3Hz，1H)，8.04(d，J＝8.2Hz，2H)，7.99-7.95(m，2H)，7.95-7.84(m，4H)，7.48(br d，J＝11.6Hz，4H)，4.44-4.32(m，1H)，3.28(br d，J＝6.1Hz，2H)，1.94-1.71(m，3H)，1.63-1.36(m，4H)；13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ＝174.04，166.08，165.58，146.89，146.57，138.05，137.36，128.60，128.26，126.05，53.21，30.77，29.11，23.84.LCMS(M-H+)：511.0(M+H)+；HPLC纯度：93.268％。
实例4D.手性受控的寡核苷酸制剂-示例有用的手性助剂的示例技术
除其他事项外，本披露提供了用于制备手性受控的核苷酸间键联的技术(例如，手性助剂、亚磷酰胺、循环、条件、试剂等)。在一些实施例中，提供的技术特别可用于制备包含P-N＝(其中P是键联)的某些核苷酸间键联，例如，非负电荷的核苷酸间键联、中性核苷酸间键联等。在一些实施例中，该键联磷是三价的。在一些实施例中，该键联磷是五价的。在一些实施例中，此类核苷酸间键联具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构。在本文实例中描述了某些示例技术(手性助剂及其配制品、亚磷酰胺及其配制品、循环、条件、试剂等)。除其他事项外，当与参考手性助剂(例如，式O、P、Q、R或DPSE的手性助剂)相比时，此类手性助剂提供更温和的反应条件、更高的官能团相容性、可替代的脱保护和/或切割条件、更高的粗品和/或纯化的产率、更高的粗品纯度、更高的产物纯度、和/或更高的(或基本上相同的或相当的)立体选择性。
Figure BPA0000295055720008601
两个批次并行：在-70℃，向甲基苯磺酰基(102.93g，658.96mmol，1.5当量)在THF(600mL)的溶液中逐滴添加KHMDS(1M，658.96mL，1.5当量)，并缓慢地经30min温热至-30℃。然后将混合物冷却至-70℃。在-70℃，逐滴添加化合物1(150g，439.31mmol，1当量)在THF(400mL)中的溶液。将混合物在-70℃下搅拌3hr。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1，Rf＝0.1)指示化合物1被完全消耗，并且检测到一个具有较大极性的主要的新斑点。合并2个批次。将反应混合物通过添加饱和NH4Cl(水性，1000mL)淬灭，然后用EtOAc(1000mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出1000mL溶液。然后添加MeOH(600mL)，在减压下浓缩以给出1000mL溶液，然后过滤残余物并用MeOH(150mL)洗涤；将残余物用THF(1000mL)和MeOH(600mL)溶解，然后在减压下浓缩以给出1000mL溶液。然后过滤以给出残余物，并用MeOH(150mL)洗涤。并且再重复一遍。获得呈白色固体的化合物2(248g，粗品)。并将合并的母液在减压下浓缩以给出呈黄色油的化合物3(200g，粗品)。
化合物2：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.80(d，J＝7.5Hz，2H)，7.74-7.66(m，1H)，7.61-7.53(m，2H)，7.47(d，J＝7.5Hz，6H)，7.24-7.12(m，9H)，4.50-4.33(m，1H)，3.33(s，1H)，3.26(ddd，J＝2.9，5.2，8.2Hz，1H)，3.23-3.10(m，2H)，3.05-2.91(m，2H)，1.59-1.48(m，1H)，1.38-1.23(m，1H)，1.19-1.01(m，1H)，0.31-0.12(m，1H)。
化合物WV-CA-108的制备。
Figure BPA0000295055720008611
向化合物2(248g，498.35mmol，1当量)在THF(1L)中的溶液中添加HCl(5M，996.69mL，10当量)。将混合物在15℃搅拌1hr。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1，Rf＝0.03)指示化合物2被完全消耗，并且检测到一个具有较大极性的主要的新斑点。将所得混合物用MTBE(500mL x 3)洗涤。将合并的有机层用水(100mL)反萃取。将合并水层用5M NaOH水溶液调节至pH 12，并用DCM(500mL x 3)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥、过滤并浓缩以得到白色固体。获得呈白色固体的WV-CA-108(122.6g，粗品)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.95(d，J＝7.5Hz，2H)，7.66(t，J＝7.5Hz，1H)，7.57(t，J＝7.7Hz，2H)，4.03(ddd，J＝2.6，5.3，8.3Hz，1H)，3.37-3.23(m，2H)，3.20-3.14(m，1H)，2.91-2.75(m，3H)，2.69(br s，1H)，1.79-1.54(m，5H)；13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝139.58，133.83，129.28，127.98，67.90，61.71，59.99，46.88，25.98，25.84；LCMS[M+H]+：256.1.LCMS纯度：100％。SFC 100％纯度。
除其他事项外，本披露涵盖了以下认识：反应中使用的碱(例如，从化合物1到化合物2)可影响此类反应的立体选择性。某些示例结果如下所述：
Figure BPA0000295055720008621
Figure BPA0000295055720008631
化合物WV-CA-237的制备。
Figure BPA0000295055720008632
向化合物3(400.00g，803.78mmol)在THF(1.5L)中的溶液中添加HCl(5M，1.61L)。将混合物在15℃搅拌2hr。TLC指示化合物3被完全消耗，并且检测到一个具有较大极性的主要的新斑点。将所得混合物用MTBE(500mL x 3)洗涤。将合并水层用5M NaOH水溶液调节至pH 12，并用DCM(500mL x 1)和EtOAc(1000mL x 2)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤，并浓缩以得到棕色固体。获得呈棕色固体的WV-CA-237(100g，粗品)。
将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝3/1至乙酸乙酯∶甲醇＝1∶2)进行纯化以给出24g粗品。然后将4g残余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex luna C18 250 x50mm x 10um；流动相：[水(0.05％HCl)-ACN]；B％：2％→20％，15min)进行纯化以给出呈白色固体的所希望的化合物(2.68g，产率65％)。获得呈白色固体的WV-CA-237(2.68g)。WV-CA-237：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.98-7.88(m，2H)，7.68-7.61(m，1H)，7.60-7.51(m，2H)，4.04(dt，J＝2.4，5.6Hz，1H)，3.85(ddd，J＝3.1，5.6，8.4Hz，1H)，3.37-3.09(m，3H)，2.95-2.77(m，3H)，1.89-1.53(m，4H)，1.53-1.39(m，1H)；13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝139.89，133.81，133.70，129.26，129.16，128.05，127.96，68.20，61.77，61.61，61.01，60.05，46.67，28.02，26.24，25.93；LCMS[M+H]+：256.1.LCMS纯度：80.0％。SFC dr＝77.3∶22.7。
Figure BPA0000295055720008641
向化合物4(140g，410.02mmol)在THF(1400mL)中的溶液中添加甲基苯磺酰基(96.07g，615.03mmol)，然后在0.5hr添加KHMDS(1M，615.03mL)。将混合物在-70℃至-40℃搅拌3hr。TLC指示化合物4被消耗并且形成一个新的斑点。在0℃，将反应混合物通过添加饱和NH4Cl水溶液3000mL淬灭，然后用EtOAc(3000mL)稀释并用EtOAc(2000mL x 3)萃取。经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出残余物。向粗品中添加THF(1000mL)和MeOH(1500mL)，在45℃在减压下浓缩直至剩余约1000mL残余物，过滤固体。重复3次数。获得呈黄色固体的化合物5(590g，72.29％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.81(d，J＝7.5Hz，2H)，7.75-7.65(m，1H)，7.62-7.53(m，2H)，7.48(br d，J＝7.2Hz，6H)，7.25-7.11(m，9H)，4.50-4.37(m，1H)，3.31-3.11(m，3H)，3.04-2.87(m，2H)，1.60-1.48(m，1H)，1.39-1.24(m，1H)，1.11(dtd，J＝4.5，8.8，12.8Hz，1H)，0.32-0.12(m，1H)。
化合物WV-CA-236的制备。
Figure BPA0000295055720008642
向化合物5(283g，568.68mmol)在THF(1100mL)中的溶液中添加HCl(5M，1.14L)。将混合物在25℃搅拌2hr。TLC指示化合物5被消耗，并且形成两个新的斑点。将反应混合物用MTBE(1000mL x 3)洗涤，然后在0℃将水相通过添加NaOH(5M)进行碱化直至pH＝12，然后用DCM(1000mL x 3)萃取以给出残余物，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出残余物。获得呈黄色固体的化合物WV-CA-236(280g，1.10mol，96.42％产率)。
在0℃，将粗产物添加至HCl/EtOAc(1400mL，4M)，2hr后，过滤白色固体并用MeOH(1000mL x 3)洗涤固体。LCMS显示固体含有另一个峰(MS＝297)。然后向白色固体添加H2O(600mL)并用DCM(300mL x 3)洗涤。向水相添加NaOH(5M)直至pH＝12。然后用DCM(800mL)稀释，并用DCM(800mL x 4)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出产物。获得呈黄色固体的化合物WV-CA-236(280g)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.01-7.89(m，2H)，7.69-7.62(m，1H)，7.61-7.51(m，2H)，4.05(ddd，J＝2.8，5.2，8.4Hz，1H)，3.38-3.22(m，2H)，3.21-3.08(m，1H)，2.95-2.72(m，4H)，1.85-1.51(m，4H)；13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝139.75，133.76，129.25，127.94，67.57，61.90，60.16，46.86，25.86.LCMS[M+H]+：256.LCMS纯度：95.94.SFC纯度：99.86％。
Figure BPA0000295055720008651
在-70℃下，向1-甲氧基-4-甲基磺酰基-苯(36.82g，197.69mmol)在THF(500mL)中的溶液中添加KHMDS(1M，197.69mL)，0.5hr后在-70℃下添加在THF(400mL)中的化合物4(45g，131.79mmol)。将混合物在-70℃→-30℃下搅拌4hr，并且然后在-70℃下向混合物中添加KHMDS(1M，131.79mL)。将混合物在-70℃下搅拌1hr。TLC指示残留化合物4，并检测到两个新斑点。将反应混合物通过饱和NH4Cl(水性300mL)淬灭，然后用EtOAc(500mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出残余物。将残余物溶于THF(800mL)和MeOH(500mL)中，并然后在减压下浓缩直至剩下200mL溶剂。向混合物中添加MeOH(500mL)并在减压下浓缩至剩下200mL溶剂并出现固体。过滤固体以给出产物。重复研磨2次。获得呈棕色固体的化合物6(49.8g，71.61％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.73-7.66(m，2H)，7.46(d，J＝7.5Hz，6H)，7.24-7.11(m，9H)，7.04-6.96(m，2H)，4.37(td，J＝3.1，8.3Hz，1H)，3.94-3.88(m，3H)，3.36(s，1H)，3.26-3.10(m，3H)，3.00-2.89(m，2H)，1.58-1.45(m，1H)，1.37-1.23(m，1H)，1.15-1.00(m，1H)，0.26-0.10(m，1H)。
化合物WV-CA-241的制备。
Figure BPA0000295055720008661
向化合物6(50g，94.76mmol)在THF(250mL)中的溶液中添加HCl(5M，189.51mL)。将混合物在20℃搅拌3hr。TLC指示化合物6被消耗，并且形成两个新的斑点。将反应混合物用MTBE(200mL x 3)萃取并丢弃MTBE相。并且然后向水相中添加5M NaOH(水性)至pH＝9并用DCM(200mL x 5)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出产物。获得呈无色油状物的WV-CA-241(27g，98.10％产率，LCMS纯度：98.24％纯度)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.83-7.76(m，2H)，6.98-6.91(m，2H)，4.00(ddd，J＝2.9，5.0，8.4Hz，1H)，3.81(s，3H)，3.33-3.07(m，5H)，2.87-2.75(m，2H)，1.74-1.49(m，4H)；13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝163.79，131.10，130.21，114.44，67.66，61.88，60.25，55.69，46.85，25.84，25.81.LCMS[M+H]+：286.1.LCMS纯度：98.24％。SFC∶dr＝0.18∶99.82.LCMS纯度：99.9％；SFC纯度：99.82％。
Figure BPA0000295055720008662
在-60℃下，向2-甲基磺酰基丙烷(32.21g，263.59mmol)在THF(1200mL)中的溶液中滴加KHMDS(1M，263.59mL)，并经30min缓慢温热至-30℃。然后将混合物冷却至-70℃。将30min，在-70℃→60℃下滴加化合物4(60g，175.72mmol)在THF(300mL)中的溶液。将混合物在-70℃→60℃下搅拌2hr。TLC显示化合物4被消耗并且检测到新斑点。将反应混合物用饱和水性NH4Cl(800mL)淬灭，并然后用EtOAc(1L x 3)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。获得呈黄色油状物的化合物7(95g，粗品)。
化合物WV-CA-242的制备。
Figure BPA0000295055720008671
向化合物7(95g，204.90mmol)在THF(400mL)中的溶液中添加HCl(5M，409.81mL)。将混合物在0→25℃下搅拌2hr。TLC指示化合物7被消耗，并且形成一个新的斑点。将反应混合物用MTBE(300mL x 3)洗涤，然后在0℃将水相通过添加NaOH(5M)进行碱化直至pH＝12，然后用DCM(300mL x 3)萃取以给出残余物，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出残余物。获得呈黄色油状物的化合物WV-CA-242(45g，99.23％产率)。LCMS[M+H]+：222.0。
化合物WV-CA-242的纯化。
Figure BPA0000295055720008672
将WV-CA-242(45g，203.33mmol)、(E)-3-苯基丙-2-烯酸(30.12g，203.33mmol)在EtOH(450mL)中的溶液在80℃下搅拌1hr。将反应真空浓缩。将残余物溶于TBME(400mL)，并然后在80℃下搅拌15min，并然后向混合物中添加EtOH(20mL)和MeCN(30mL)，并然后将混合物过滤，并将滤饼用TBME(30mL x 2)洗涤并然后重复8次。获得呈红色固体的盐(35g，粗品)。
向盐(34g，92.02mmol)在H2O(20mL)中的溶液中添加5N NaOH水溶液(5M，36.81mL)。将混合物在25℃下搅拌10min。将反应用DCM(100mL x 8)萃取，并然后将有机相真空浓缩。获得呈灰白色固体的化合物WV-CA-242(18.9g，91.09％产率，LCMS纯度：98.16％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝4.13(ddd，J＝2.1，4.6，9.5Hz，1H)，3.38(spt，J＝6.9Hz，1H)，3.23-3.14(m，2H)，3.01(dd，J＝2.1，14.4Hz，1H)，2.95-2.91(m，2H)，1.83-1.60(m，4H)，1.40(dd，J＝4.0，6.8Hz，6H)；13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝67.45，61.71，53.93，53.42，46.80，25.86，5.43，16.03，14.17.LCMS[M+H]+：222.1.LCMS纯度：98.17％。
Figure BPA0000295055720008681
在-70℃下，向2-甲基-2-(甲基磺酰基)丙烷(14.96g，109.83mmol)在THF(150mL)中的溶液中滴加KHMDS(1M，109.83mL)，并经30min缓慢温热至-30℃。然后将混合物冷却至-70℃。在-70℃下滴加化合物4(25.00g，73.22mmol)在THF(100mL)中的溶液。将混合物在-70℃搅拌4hr。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1 Rf＝0.3)显示化合物4残留很少，并且检测到一个具有较大极性的主要的新斑点。通过添加饱和NH4Cl(水性，100mL)淬灭反应混合物，并然后用EtOAc(100mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出30mL溶液。然后添加MeOH(30mL)，在减压下浓缩以给出30mL溶液，然后过滤残余物并用MeOH(10mL)洗涤；将残余物用THF(30mL)和MeOH(30mL)溶解，然后在减压下浓缩以给出30mL溶液。然后过滤以给出残余物，并用MeOH(10mL)洗涤。并且再重复一次以给出21g白色固体和20g棕色油状物。获得呈白色固体的化合物8(21g，粗品)，并获得呈棕色油状物的化合物8A(20g，粗品)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.56(d，J＝7.5Hz，6H)，7.32-7.23(m，6H)，7.21-7.14(m，3H)，4.85-4.68(m，1H)，3.52-3.43(m，4H)，3.41(td，J＝3.8，8.1Hz，1H)，3.28(td，J＝8.5，11.9Hz，1H)，3.09-2.91(m，2H)，2.78(dd，J＝2.6，13.6Hz，1H)，1.65-1.50(m，1H)，1.37(s，10H)，1.16-0.98(m，2H)，0.39-0.21(m，1H)。LCMS[M+H]+：235.9。
化合物WV-CA-243的制备。
Figure BPA0000295055720008682
向化合物8(20g，41.87mmol)在THF(200mL)中的溶液中添加HCl(5M，83.74mL)。将混合物在15℃搅拌3hr。TLC指示化合物8被完全消耗，并且检测到一个具有较大极性的主要的新斑点。将所得混合物用MTBE(100mL x 3)洗涤。将合并水层用5M NaOH水溶液调节至pH12，并用DCM(50mL x 3)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥、过滤并浓缩以得到白色固体。获得呈白色固体的WV-CA-243(9g，90.42％产率，99％纯度)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ4.18(ddd，J＝2.8，5.8，8.2Hz，1H)，3.29-3.21(m，1H)，3.19(d，J＝2.6Hz，1H)，3.16-3.08(m，1H)，2.92(t，J＝6.6Hz，2H)，2.74(br s，1H)，1.92-1.81(m，1H)，1.81-1.61(m，3H)，1.42(s，10H)；13CNMR(101MHz，氯仿-d)δ＝68.01，62.00，59.73，49.79，46.96，26.77，25.80，23.22.LCMS[M+H]+：236.1.LCMS纯度：99.46％。
Figure BPA0000295055720008691
向Mg的(氯甲基)(苯基)硫烷(17.08g，702.90mmol，4当量)和I2(0.50g，1.97mmol，396.83uL，1.12-2当量)在THF(100mL)中的溶液中添加1，2-二溴乙烷(1.25g，6.63mmol，0.5mL，3.77-2当量)。一旦混合物变为无色，在10℃-20℃下滴加在THF(100mL)中的氯甲基硫烷基苯(111.51g，702.90mmol，4当量)持续1hr。添加后，将混合物在10℃-20℃下搅拌1hr，大部分Mg被消耗。并且然后在-78℃下将该混合物添加在化合物1(60g，175.72mmol，1当量)在THF(600mL)中的混合物中，将混合物在-78℃-20℃下搅拌4hr。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1，Rf＝0.26)指示残留化合物1并且形成两个新的斑点。通过在0℃下添加水(100mL)淬灭反应混合物，并然后用EtOAc(100mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝200/1至10∶1)纯化2次。获得呈白色固体的化合物9(80g，171.80mmol，97.77％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.52(d，J＝7.5Hz，6H)，7.31-7.09(m，14H)，4.24-4.14(m，1H)，3.54-3.44(m，1H)，3.30-3.18(m，1H)，3.08-2.96(m，1H)，2.91(s，1H)，2.80(d，J＝7.0Hz，2H)，1.69-1.53(m，1H)，1.39-1.30(m，1H)，1.15-1.01(m，1H)，0.30-0.12(m，1H)。
化合物WV-CA-244的制备。
Figure BPA0000295055720008701
向化合物9(80g，171.80mmol，1当量)在EtOAc(350mL)中的溶液中添加HCl(5M，266.30mL，7.75当量)。将混合物在15℃搅拌18hr。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1，Rf＝0.01)指示化合物9被消耗并形成了新斑点。将反应混合物用MTBE(200mL x 3)萃取并丢弃MTBE相。并且然后向水相中添加2M NaOH(水性)至pH＝9并用EtOAc(200mL x 5)萃取。将合并的有机层用盐水(200mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以给出粗产物。在70℃下向粗产物中添加EtOAc(100mL)。将混合物在70℃→20℃下搅拌1hr。将反应混合物过滤，并将滤饼干燥以给出产物。获得呈白色固体的WV-CA-244(31.9g，142.84mmol，94.66％产率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.37(d，J＝7.5Hz，2H)，7.26(t，J＝7.7Hz，2H)，7.20-7.12(m，1H)，3.74-3.65(m，1H)，3.24-3.15(m，1H)，3.13-3.00(m，2H)，3.00-2.21(m，4H)，1.77-1.59(m，4H)；13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝136.04，129.35，128.95，126.15，70.75，61.64，46.86，38.54，25.86，25.17.LCMS[M+H]+：224.1.LCMS纯度：99.57％。
Figure BPA0000295055720008702
在-70℃→-40℃下向4-甲基磺酰基苄腈(47.76g，263.59mmol，1.5当量)在THF(800mL)中的溶液中添加KHMDS(1M，263.59mL，1.5当量)，0.5hr后，在-70℃下，添加在THF(400mL)中的化合物4(60.00g，175.72mmol，1当量)。将该混合物在-70℃下搅拌2.5hr。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1，Rf＝0.4)表示化合物4已消耗，且有一个新斑点形成。通过在0℃下添加饱和NH4Cl(20mL)来淬灭反应混合物并用DCM(600mL x 3)萃取。经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出残余物。将残余物用MeOH(500mL x 5)洗涤以获得呈黄色固体的化合物10(28g，53.57mmol，30.49％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.84-7.74(m，2H)，7.73-7.65(m，2H)，7.32(d，J＝7.2Hz，6H)，7.15-6.99(m，9H)，4.20(td，J＝2.9，5.6Hz，1H)，3.22(ddd，J＝3.1，5.7，8.3Hz，1H)，3.12-3.03(m，2H)，3.02-2.92(m，1H)，2.90-2.77(m，2H)，1.39-1.26(m，1H)，1.20-0.93(m，2H)，0.13-0.11(m，1H)。
化合物WV-CA-238的制备。
Figure BPA0000295055720008711
向化合物10(28g，53.57mmol，1当量)在DCM(196mL)中的溶液中添加TFA(12.22g，107.15mmol，7.93mL，2当量)。将该混合物在0℃下搅拌3hr。TLC和LCMS指示化合物10已消耗，并且有两个新斑点形成。将反应混合物用MTBE(100mL x 3)洗涤，然后在0℃下将水相通过添加NaOH(5M)碱化直至pH＝12，并然后用DCM(50mL x 3)萃取以给出残余物，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出残余物。获得呈黄色固体的化合物WV-CA-238(9.5g，33.42mmol，62.38％产率，98.62％纯度)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.09(d，J＝8.4Hz，2H)，7.87(d，J＝8.4Hz，2H)，4.06(ddd，J＝2.9，4.9，8.3Hz，1H)，3.38-3.16(m，3H)，2.96-2.79(m，2H)，1.81-1.64(m，3H)，1.61-1.45(m，1H)。13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝144.05，132.88，128.93，117.48，117.15，67.63，61.50，60.09，46.83，25.88，25.55.LCMS[M+H]+：281.1.LCMS纯度：98.62％。SFC∶dr＝99.75∶0.25。
Figure BPA0000295055720008712
在-60℃下向甲基亚磺酰基苯(25g，178.31mmol，1.5当量)在THF(400mL)中的溶液中滴加KHMDS(1M，178.31mL，1.5当量)，并经30min缓慢温热至-30℃。然后将混合物冷却至-70℃。在-70℃下滴加化合物4(40.59g，118.88mmol，1当量)在THF(100mL)中的溶液。将混合物在-70℃→-50℃下搅拌2hr。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)显示残留化合物4。将反应混合物冷却至-70℃，另外添加KHMDS(1M，40mL)，并在-70℃→～-40℃下搅拌2hr。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)显示残留少量化合物4。用饱和NH4Cl(水性300mL)淬灭反应混合物并将分离的水层用EtOAc(200mL x 3)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩以提供呈黄色胶质的残余物，使残余物在MeOH(100mL)中结晶，过滤并用MeOH(50mL)冲洗以给出灰白色固体(17g)，并将滤液浓缩以提供黄色胶质(50g)。将白色固体产物(17g)再溶于THF(150mL)，并添加MeOH(80mL)，并将混合物浓缩以去除THF，过滤并干燥以给出灰白色固体，将该灰白色固体再溶于THF(150mL)，并添加MeOH(80mL)，并将混合物浓缩以去，滤并干燥以给出呈灰白色固体的产物(13g)。将滤液浓缩以给出4g粗品。无需进一步纯化。获得呈灰白色固体的产物化合物11(13g，26.99mmol，22.70％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.62-7.56(m，2H)，7.55-7.52(m，3H)，7.51-7.45(m，6H)，7.25-7.12(m，9H)，4.60(td，J＝2.4，10.1Hz，1H)，3.72(s，1H)，3.27-3.13(m，2H)，3.04-2.84(m，2H)，2.46(dd，J＝2.2，13.5Hz，1H)，1.71-1.53(m，1H)，1.42-1.28(m，1H)，1.07-0.90(m，1H)，0.37-0.21(m，1H)。
化合物WV-CA-247的制备。
Figure BPA0000295055720008721
向化合物11(13g，26.99mmol，1当量)在THF(45mL)中的溶液中添加HCl(5M，52.00mL，9.63当量)水溶液。将混合物在20℃搅拌2hr。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)显示反应完成。将所得混合物用MTBE(60mL x 3)洗涤。将合并水层用5M NaOH水溶液调节至pH 12，并用DCM(80mL x 3)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩以提供白色固体(5.8g)。无需进一步纯化。获得呈白色固体的化合物WV-CA-247(5.8g，24.17mmol，89.55％产率，99.74％纯度)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.67-7.60(m，2H)，7.55-7.42(m，3H)，4.17(ddd，J＝2.6，4.2，9.9Hz，1H)，3.74-3.23(brs，2H)，3.13(dt，J＝4.3，7.3Hz，1H)，2.96-2.74(m，4H)，1.81-1.52(m，4H)。13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝143.99，130.93，129.32，123.92，66.97，62.23，61.58，46.86，25.88，25.3.LCMS[M+H]+：240.LCMS纯度：99.74％。SFC∶dr＝99.48∶0.52。
Figure BPA0000295055720008731
在-20℃下，向1，3-二噻烷(13.21g，109.83mmol)在THF(250mL)中的溶液中添加n-BuLi(2.5M，29.29mL)，0.5hr后在-70℃下添加在THF(250mL)中的化合物1(25g，73.22mmol)。将该混合物在-70℃→20℃下搅拌16hr。TLC指示残留化合物4，并检测到一个新斑点。将反应混合物通过饱和NH4Cl(200mL)淬灭，并然后用EtOAc(200mL x 5)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过MPLC(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至10/1，5％TEA)纯化2次。获得呈黄色油状物的化合物12(16g，47.33％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.59(d，J＝7.0Hz，5H)，7.29-7.25(m，6H)，7.20-7.14(m，3H)，4.39(dd，J＝2.4，10.3Hz，1H)，4.03(ddd，J＝2.4，5.6，8.2Hz，1H)，3.38(d，J＝10.1Hz，1H)，3.28(ddd，J＝7.0，10.1，12.3Hz，1H)，3.07-2.99(m，1H)，2.93-2.85(m，1H)，2.63-2.54(m，1H)，2.34-2.18(m，2H)，1.97-1.82(m，2H)，1.59-1.45(m，1H)，1.22-1.11(m，1H)，0.22-0.06(m，1H)。
化合物WV-CA-246的制备。
Figure BPA0000295055720008732
向化合物12(16g，34.66mmol)在EtOAc(80mL)中的溶液中添加HCl(5M，69.31mL)。将混合物在15℃搅拌16hr。TLC指示化合物12已完全耗尽，并且形成了新的斑点。将反应混合物用TBME(100mL x 3)萃取并丢弃TBME相。并且然后向水相中添加5M NaOH(水性)至pH＝9并用DCM(100mL x 5)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以给出粗产物。将残余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex luna C18 250x50mm x10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-15％，20min和柱：Phenomenex luna(2)C18 250x 50x 10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-12％，20min)纯化。获得呈白色固体的WV-CA-246(4.2g，55.25％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝4.13(d，J＝7.2Hz，1H)，3.83(dd，J＝5.1，7.2Hz，1H)，3.49(dt，J＝5.1，7.3Hz，1H)，3.13-2.76(m，6H)，2.60(br s，2H)，2.20-2.05(m，1H)，2.04-1.90(m，1H)，1.89-1.62(m，4H)。13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝73.76，59.94，50.42，46.83，28.95，28.45，25.87，25.32.HPLC纯度：97.75％。LCMS[M+H]+：220.1.SFC∶dr＝0.22∶99.78。
Figure BPA0000295055720008741
在-70℃下，向N-甲基-N-苯基-乙酰胺(18.5g，124.00mmol)在THF(250mL)中的溶液中滴加KHMDS(1M，124.00mL)，并经30min缓慢温热至-30℃。然后将混合物冷却至-70℃。在-70℃下滴加化合物4(28.23g，82.67mmol)在THF(150mL)中的溶液。将该混合物在-70℃～-50℃下搅拌3hr。TLC显示反应几乎完成。将反应混合物饱和NH4Cl(水性，30mL)淬灭，并用EtOAc(25mL x 3)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩以提供呈黄色胶质的残余物。将粗品通过硅胶柱色谱法(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1、3∶1、1∶1、1∶2，5％TEA)纯化。获得呈白色固体的化合物13(38g，93.7％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.53(brd，J＝7.5Hz，6H)，7.44-7.31(m，4H)，7.26-7.09(m，12H)，4.46-4.40(m，1H)，3.90(br s，1H)，3.31-3.19(m，4H)，3.15-3.07(m，1H)，3.00-2.91(m，1H)，1.48-1.26(m，2H)，0.86-0.74(m，1H)，0.33-0.19(m，1H)。
化合物WV-CA-248的制备。
Figure BPA0000295055720008742
向化合物13(38g，77.45mmol)在THF(125mL)中的溶液中添加HCl(5M，152.00mL)水溶液。将该混合物在20℃下搅拌2hr。TLC显示反应完成。将所得混合物依次用MTBE(80mL x3)、EtOAc(100mL x 3)和DCM(100mL x 2)洗涤。将合并水层用5M NaOH水溶液调节至pH＝12，并用DCM(120mL x 3)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩以提供黄色胶质。WV-CA-248(15.2g，73.26％产率，92.7％纯度)的粗品呈黄色胶质。向WV-CA-248(14.5g，58.39mmol)在EtOH(150mL)中的溶液中添加(E)-3-苯基丙-2-烯酸(8.65g，58.39mmol)。将混合物在80℃下搅拌1hr。将混合物真空浓缩。将残余物溶于TBME(50mL)，并然后向混合物中添加MeCN(3mL)，混合物变得澄清，如何将溶液静置，并然后固体出现，并将混合物过滤，并将滤饼用TMBE(10mL x 2)洗涤，并且该滤饼为所希望的化合物。获得呈黄色固体的残余物(6.5g，粗品)。将残余物溶于H2O(10mL)，添加NaOH水溶液(5M，6.56mL，2当量)。将混合物在25℃下搅拌10min。混合物的pH为13。将溶液用DCM(40mL x 6)萃取，并将有机相真空浓缩。获得呈棕色油状物的化合物WV-CA-248(4g，91.74％产率，93.4％纯度)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.49-7.31(m，3H)，7.21(br d，J＝7.3Hz，2H)，4.00(td，J＝4.3，8.6Hz，1H)，3.48(br s，2H)，3.28(s，3H)，3.10-2.98(m，1H)，2.97-2.80(m，2H)，2.36-2.17(m，2H)，1.79-1.47(m，3H)，1.79-1.47(m，1H)。13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝172.38，143.42，129.89，128.04，127.27，69.90，62.29，46.77，37.98，37.23，25.99，25.65.LCMS[M+H]+：249.1.LCMS纯度：93.35％。SFC：SFC纯度de＝94.26％。
Figure BPA0000295055720008751
在-70℃～-40℃下，向甲基磺酰基甲烷(8.27g，87.86mmol)在THF(150mL)中的溶液中添加KHMDS(1M，87.86mL)，0.5hr后添加在THF(100mL)中的化合物1(20g，58.57mmol)。将混合物在-70℃搅拌1.5hr。TLC指示化合物4仍残留少量，并形成一个新斑点。通过在0℃下添加饱和NH4Cl(水性200mL)淬灭反应混合物，并然后用EtOAc(200mL)稀释并用EtOAc(200mL x 3)萃取。经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0→0∶1)纯化。获得呈黄色油状物的化合物14(12g，粗品，HNMR显示顺式/反式异构体比为约10∶1)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.58-7.47(m，7H)，7.26-7.22(m，5H)，7.20-7.13(m，3H)，4.51-4.46(m，1H)，3.99-3.88(m，1H)，3.48-3.39(m，1H)，3.21-2.97(m，4H)，2.96-2.91(m，3H)，2.68(br d，J＝14.6Hz，1H)，1.57-1.43(m，1H)，1.36-1.26(m，1H)，1.20-1.10(m，1H)，0.57-0.44(m，1H)，0.25-0.04(m，1H)。
WV-CA-252的制备。
Figure BPA0000295055720008761
向化合物14(18g，41.32mmol)在THF(82mL)中的溶液中添加HCl(5M，82.65mL)。将混合物在25℃搅拌3hr。TLC指示化合物14被消耗，并且形成两个新的斑点。将反应混合物用MTBE(50mL x 3)洗涤，然后在0℃将水相通过添加NaOH(5M)进行碱化直至pH＝12，然后用DCM(50mL x 6)萃取以给出残余物，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出残余物。获得呈黄色固体的粗品化合物WV-CA-252(6.5g，81.4％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝4.13(ddd，J＝1.8，4.0，9.7Hz，1H)，3.23(dt，J＝4.2，7.4Hz，1H)，3.18-3.09(m，1H)，3.05(s，4H)，3.00-2.90(m，3H)，1.95-1.68(m，4H)，1.67-1.48(m，1H)。LCMS[M+H]+：194.0。
Figure BPA0000295055720008762
将化合物1A(52.24g，241.62mmol)在THF(500mL)中的混合物脱气并用N2吹扫3次，并然后将混合物冷却至-70℃，并然后向混合物中添加LDA(2M，112.76mL)。将混合物在-40℃下搅拌30min，并然后在-70℃下向混合物中添加在THF(250mL)中的化合物1(55g，161.08mmol)。将混合物在N2气氛下在-70℃搅拌2hr。TLC指示化合物1被完全消耗，并且形成一个新的斑点。根据TLC，反应是干净的。将反应通过饱和水性NH4Cl(300mL)淬灭并然后用EtOAc(100mL x 3)萃取。将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物溶于MeOH(300mL)并过滤；滤饼为所希望的产物。获得呈白色固体的化合物2(53g，粗品)。
化合物WV-CA-245的制备。
Figure BPA0000295055720008771
向化合物15(72g，129.11mmol)在THF(400mL)中的溶液中添加HCl(5M，258.22mL)。将混合物在25℃搅拌1hr。LC-MS显示化合物15被完全消耗，并检测到一个具有所希望的质量的主峰。将反应用TBME(100mL x 3)萃取，添加5NNaOH水溶液至pH＝13，并然后用DCM(50mL x 3)萃取，并将合并的有机相真空浓缩。获得呈白色固体的WV-CA-245(38g，92.82％产率，99.5％纯度)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.81-7.71(m，4H)，7.58-7.44(m，6H)，4.01-3.92(m，1H)，3.16-3.09(m，1H)，2.92-2.79(m，2H)，2.63-2.44(m，2H)，1.82-1.60(m，4H)。13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝133.88，132.89，132.86，131.95，131.88，130.73，128.74，68.98，68.94，63.79，63.67，47.03，34.21，33.49，26.37，25.88.LCMS[M+H]+：316.1.LCMS纯度：99.45％。SFC：SFC纯度de＝99.5％。
Figure BPA0000295055720008772
在N2下，在-70℃下，向化合物1B(13.32g，87.86mmol)在THF(200mL)中的溶液中添加KHMDS(1M，82.00mL)，并然后将混合物在-70℃下搅拌10min，并然后向混合物中添加在THF(100mL)中的化合物1(20g，58.57mmol)，将反应在-70℃下搅拌30min。TLC指示化合物1被完全消耗，并且形成一个新的斑点。根据TLC，反应是干净的。将反应混合物用饱和水性NH4Cl(100mL)淬灭，并然后用EtOAc(50mL x 3)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝50∶1、20∶1、10∶1、1∶1、0∶1)纯化。获得呈黄色固体的化合物16(12g，粗品)。
化合物WV-CA-249的制备。
Figure BPA0000295055720008781
向化合物16(12g，24.34mmol)在THF(50mL)中的溶液中添加HCl水溶液(5M，48.68mL)。将混合物在25℃下搅拌30min。TLC指示化合物16被完全消耗，并且形成一个新的斑点。根据TLC，反应是干净的。将反应用TBME(100mL x 3)萃取，并然后向混合物中添加5NNaOH水溶液至pH＝13，用DCM(100mL x 3)萃取，并然后将有机相真空浓缩。获得呈黄色固体的WV-CA-249(5.36g，87.84％产率，100.00％纯度)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.64(s，1H)，7.49(d，J＝0.9Hz，2H)，3.88(td，J＝3.6，9.4Hz，1H)，3.24-3.16(m，1H)，3.02-2.89(m，3H)，2.78(dd，J＝9.4，14.0Hz，1H)，1.84-1.70(m，4H)。13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝143.11，134.94，132.60，132.33，130.12，117.63，111.52，70.86，62.02，46.76，37.90，25.88，24.21.LCMS[M+H]+：251.0.LCMS纯度：100.000％。SFC：SFC纯度de＝98.28％。
Figure BPA0000295055720008782
在20℃-25℃下，向硝基甲烷(30.59g，501.15mmol)在THF(300mL)中的溶液中添加KHMDS(1M，263.59mL)并搅拌1hr。在20℃-25℃下，将在THF(90mL)中的化合物1(30g，87.86mmol)添加至混合物中并搅拌0.5hr。TLC显示起始材料消耗最多，并形成所希望的产物。将混合物通过饱和NH4Cl水溶液(300mL)淬灭并用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。将有机相通过饱和NaCl水溶液(100mL×3)洗涤并用无水Na2SO4干燥，然后在减压下浓缩以去除溶剂。将粗产物通过MPLC(SiO2，乙酸乙酯/石油醚＝0％→20％)纯化以获得橙黄色固体的化合物17(26.55g，75.08％产率)。The product was detected by1H NMR.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.54-7.44(m，6H)，7.28-7.21(m，6H)，7.20-7.14(m，3H)，4.64(td，J＝3.0，9.4Hz，1H)，4.53-4.06(m，3H)，3.60-3.40(m，1H)，3.24-2.96(m，3H)，1.52-1.41(m，1H)，1.40-1.28(m，1H)，1.17-0.94(m，1H)，0.67-0.50(m，1H)，0.23(quin d，J＝8.8，11.6Hz，1H)。
化合物WV-CA-250的制备。
Figure BPA0000295055720008791
在20℃-25℃下，向化合物17(7.5g，18.63mmol)在EtOAc(35mL)中的溶液中添加HCl/EtOAc(4M，50mL)并搅拌1hr。TLC显示起始材料被完全消耗。倒入混合物的上清液，将瓶壁上的黄色胶质在减压下浓缩以去除溶剂。获得呈黄色胶质的WV-CA-250(2.10g，56.70％产率，98.927％纯度，HCl盐)。The product was detected by 1H NMR，13C NMR andLCMS.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝9.89-9.54(m，1H)，9.03-8.75(m，1H)，8.94(br s，1H)，4.97-4.78(m，1H)，4.65-4.35(m，2H)，3.70-3.41(m，4H)，3.22-3.03(m，2H)，2.06-1.65(m，4H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ＝79.42，79.00，67.89，66.82，61.53，60.77，45.44，45.25，26.93，24.57，23.95，23.81.LCMS[M+H]+：161.1，纯度：98.92％。
Figure BPA0000295055720008792
在0℃下向化合物苄基胺(30g，279.97mmol)和TEA(56.66g，559.95mmol)在DCM(60mL)中的溶液中添加在DCM(30mL)中的MsCl(38.49g，335.97mmol)。将混合物在O℃搅拌2hr。LC-MS显示化合物18A被消耗并检测到许多新峰。将反应混合物用HCl(1M，50mL x 3)和饱和NaHCO3(水性50mL x 3)洗涤。将有机层用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以给出残余物。TLC显示一个主要斑点。将残余物通过MPLC(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝5/1至1∶1)纯化。获得呈淡黄色固体的化合物18A(35g，67.49％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.44-7.24(m，5H)，4.82(br s，1H)，4.31(d，J＝6.2Hz，2H)，2.85(s，3H)。
Figure BPA0000295055720008793
在0℃下，向化合物18A(16.28g，87.86mmol)在THF(60mL)中的溶液中添加LDA(2M，87.86mL)。将混合物在0-25℃下搅拌0.5hr。并且然后在-70℃下将在THF(60mL)中的化合物1(15g，43.93mmol)添加至上述溶液中。将混合物在-70℃-25℃下搅拌4hr。TLC指示化合物1被完全消耗，并形成许多新斑点。向反应混合物中添加饱和NH4Cl(水性50mL)并用EtOAc(100mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过制备型TLC(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝5/1，2％TEA)纯化。获得呈黄色油状物的化合物18(22g，95.08％产率)。
化合物WV-CA-255的制备。
Figure BPA0000295055720008801
在0℃下，向化合物18(22g，41.77mmol)在EtOAc(15mL)中的溶液中添加HCl(4M在乙酸乙酯中，31.33mL)。将混合物在0-25℃下搅拌2hr。并且固体出现在反应混合物中。TLC指示化合物18被完全消耗，并形成许多新斑点。将反应混合物过滤。将滤饼溶于水(10mL)，用MTBE(40mL x 3)洗涤。向水相中添加Na2CO3(粉末)至pH＝8-9并用DCM(50mL x 5)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩以给出残余物。获得呈棕色固体的WV-CA-255(11g，92.60％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.46-7.25(m，5H)，4.65-3.72(m，5H)，3.14-3.01(m，3H)，2.95-2.77(m，2H)，1.89-1.34(m，4H)。13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝136.99，128.71，128.62，128.19，128.09，127.85，69.12，67.58，61.98，61.70，55.55，55.36，47.36，47.30，46.60，46.28，28.05，26.16，25.71，24.92.LCMS[M+H]+：285.0，LCMS纯度：99.8％。SFC∶dr(反式/顺式)＝32.36∶67.64。
Figure BPA0000295055720008802
向化合物二苄基胺(30g，152.07mmol)在DCM(250mL)中的溶液中添加TEA(15.39g，152.07mmol)。将混合物冷却至0℃，并向混合物中添加在DCM(50mL)中的MsCl(17.42g，152.07mmol)，并然后将混合物在25℃下搅拌12小时。LC-MS显示检测到所希望的质量。将反应通过H2O(100mL)淬灭并将有机相用H2O(100mL×3)萃取，将有机相通过Na2SO4干燥，并然后真空浓缩。无需进一步纯化。获得呈白色固体的化合物19A(39g，粗品)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.41-7.29(m，9H)，4.36(s，4H)，2.82-2.75(m，3H)。LCMS[M+H]+：298.0，纯度：86.6％。
Figure BPA0000295055720008811
在N2下，在-78℃至-70℃下，向化合物19A(19.36g，70.29mmol)在THF(200mL)中的溶液中滴加KHMDS(1M，76.15mL)。将混合物温热至40℃并搅拌0.5hr，然后冷却至-78℃。在-78℃至-70℃下，向混合物中添加在THF(100mL)中的化合物1(20g，58.57mmol)并在N2下搅拌1hr。TLC显示起始材料被完全消耗。将混合物通过饱和NH4Cl水溶液(200mL)淬灭并用乙酸乙酯(70mL×3)萃取。将有机相通过饱和NaCl水溶液(70mL×3)洗涤并用无水Na2SO4干燥，然后在减压下浓缩以去除溶剂，以获得呈黄色胶质的粗产物。将粗产物用甲醇(200mL)再溶解，并在20℃-25℃下静置12小时。将化合物19(20.4g，99.99％产率)从溶剂结晶，呈白色固体的，然后过滤并在真空中干燥。将滤液在减压下浓缩以去除溶剂，以给出呈棕色胶质的化合物20(28.4g，粗品)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.47-7.42(m，6H)，7.23-7.05(m，19H)，4.36(td，J＝3.0，8.6Hz，1H)，4.23-4.12(m，4H)，3.29-3.19(m，1H)，3.29-3.19(m，1H)，3.11(ddd，J＝7.1，9.5，12.1Hz，1H)，2.97-2.82(m，2H)，2.59(dd，J＝3.1，14.2Hz，1H)，1.37-1.27(m，1H)，1.24-1.14(m，1H)，1.00-0.92(m，1H)，0.16-0.02(m，1H)。
化合物WV-CA-263的制备。
Figure BPA0000295055720008821
在20℃-25℃下，向化合物19(20g，32.42mmol)在THF(100mL)中的溶液中添加HCl(5M，64.85mL)并搅拌0.5hr。TLC显示起始材料被完全消耗。将混合物用TBME(80mL×3)萃取，然后用NaOH水溶液(65mL，5M)将混合物的pH调节至11-13并用DCM(100mL×3)萃取。将有机相用无水Na2SO4干燥，并在减压下浓缩以去除溶剂。将粗产物不经任何纯化即用于下一步骤。获得呈白色固体的WV-CA-263(10.04g，82.68％产率，100％纯度)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.38-7.28(m，10H)，4.38(s，4H)，4.01(ddd，J＝2.6，5.6，8.5Hz，1H)，3.20-3.13(m，2H)，3.10-3.02(m，1H)，2.91(t，J＝6.5Hz，2H)，1.89(br d，J＝8.6Hz，1H)，1.82-1.66(m，4H)，1.62-1.52(m，1H)。13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝135.62，128.77，128.70，127.98，77.35，76.87(d，J＝31.5Hz，1C)，68.84，61.51，57.03，50.35，46.96，26.27，25.88.LCMS[M+H]+：375.1，纯度：100.00％。SFC∶dr＝99.55∶0.45。
Figure BPA0000295055720008822
在-70℃下，向3，3-二甲基丁-2-酮(11.00g，109.83mmol)在THF(125mL)中的溶液中滴加LDA(2M，54.91mL)，并在-70℃～-60℃下搅拌1hr。在-70℃～-60℃下滴加化合物1(25g，73.22mmol)在THF(125mL)中的溶液。将混合物在-70℃下搅拌1.5hr。TLC显示化合物1几乎被消耗。用饱和NH4Cl(水性200mL)淬灭反应混合物并将分离的水层用EtOAc(150mL x3)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩以提供呈淡黄色固体的残余物。将粗品通过硅胶柱色谱法(石油醚+5％TEA；石油醚∶乙酸乙酯(20∶1)+5％TEA)纯化。获得呈白色固体的化合物21(17g，52.6％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.37-7.25(m，6H)，7.03-6.95(m，6H)，6.94-6.84(m，3H)，4.22(td，J＝2.7，9.2Hz，1H)，3.09(td，J＝4.1，7.6Hz，1H)，3.04-2.92(m，2H)，2.75(ddd，J＝2.9，8.5，12.0Hz，1H)，2.26(dd，J＝9.3，17.0Hz，1H)，2.04(dd，J＝3.4，16.9Hz，1H)，1.43-1.24(m，2H)，1.14-1.01(m，1H)，0.84(s，9H)，0.81-0.71(m，1H)，0.09--0.07(m，1H)。
化合物WV-CA-289的制备。
Figure BPA0000295055720008831
向化合物21(16g，36.23mmol)在EtOAc(25mL)中的溶液中添加4M HCl/EtOAc(100mL)。将混合物在25℃搅拌0.5hr。TLC显示反应完成。将所得混合物过滤，并将固体在EtOAc(150mL)中搅拌，过滤并用EtOAc/MeOH(150mL/5mL)再研磨，过滤并干燥以提供呈白色固体的化合物WV-CA-289(7.5g，87.8％产率，HCl盐)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝4.43(ddd，J＝3.5，4.6，7.8Hz，1H)，3.71(dt，J＝3.5，8.0Hz，1H)，3.42-3.22(m，2H)，2.92(dd，J＝7.6，17.7Hz，1H)，2.73(dd，J＝4.9，17.7Hz，1H)，2.23-1.90(m，4H)，1.28-1.05(m，9H)。[M+H]+：200.1，纯度：100.00％。
Figure BPA0000295055720008832
在-70℃-0℃下，在0.5hr向甲基磺酰基苯(13.72g，87.86mmol)in在THF(100mL)中的溶液中添加LiHMDS(1M，87.86mL)，然后添加在THF(100mL)中的化合物4。将混合物在-70℃搅拌2.5hr。TLC指示化合物4仍残留少量，并形成两个新斑点。通过在0℃下添加饱和NH4Cl水溶液(300mL)淬灭反应混合物，用DCM(200mL x 3)萃取。经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩以给出残余物。向粗品中添加THF(100mL)和MeOH(150mL)，在45℃在减压下浓缩直至剩余约100mL残余物，过滤固体。重复3次。获得固体20g，将母液在减压下浓缩以获得呈黄色油状物的化合物22(20g，粗品)。获得呈白色固体的化合物(1R)-2-(苯磺酰基)-1-[(2R)-1-三苯甲基吡咯烷-2-基]乙醇(20g，68.61％产率)。
化合物WV-CA-290的制备。
Figure BPA0000295055720008841
在0℃下，向化合物22(20g，40.19mmol)在THF(80mL)中的溶液中添加HCl(5M，80.38mL)。将该混合物在25℃下搅拌2hr。TLC显示化合物22被消耗，并且有两个新斑点形成。将反应混合物用MTBE(50mL x 3)洗涤，然后在0℃将水相通过添加NaOH(5M)进行碱化直至pH＝12，然后用DCM(50mL x 3)萃取以给出残余物，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex luna C18 250x 50mm x 10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-15％，20min)纯化。获得呈黄色固体的化合物WV-CA-290(0.7g，6.78％产率，99.39％纯度)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.95-7.85(m，2H)，7.64-7.56(m，1H)，7.55-7.46(m，2H)，3.79(ddd，J＝3.2，5.4，8.4Hz，1H)，3.28-3.05(m，3H)，2.92-2.72(m，2H)，1.84-1.54(m，3H)，1.51-1.37(m，1H)。13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝139.81，133.74，129.19，128.07，68.15，61.55，60.97，46.67，28.03，26.27.SFC：(AD_MeOH_IPAm_10_40_25_35_6min)，100％纯度.LCMS[M+H]+：256.1.LCMS纯度：99.39％。
Figure BPA0000295055720008842
两个批次并行：在0℃下，向化合物叔丁基(甲基)硫烷(25g，239.89mmol)在MeOH(625mL)中的溶液中添加在H2O(625mL)中的单过硫酸氢钾(Oxone)(457.18g，743.67mmol)。将混合物在15℃搅拌12hr。HNMR显示化合物叔丁基(甲基)硫烷被完全消耗，并检测到所希望的化合物。合并两批反应混合物，过滤并在减压下浓缩以蒸发MeOH，并然后用EtOAc(400mL x 4)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩以给出残余物。获得呈无色油状物的化合物23A(55g，粗品)，confirmed by HNMR.1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.26(s，1H)，5.30(s，8H)，2.81(s，3H)，1.43(s，9H)。
Figure BPA0000295055720008851
在-70℃下，向化合物23A(50g，367.07mmol)在THF(510mL)中的溶液中滴加KHMDS(1M，367.07mL)，并经30min缓慢温热至-30℃。然后将混合物冷却至-70℃。在-70℃下滴加化合物1(83.56g，244.72mmol)在THF(340mL)中的溶液。将混合物在-70℃搅拌4hr。TLC显示化合物1仍残留少量，并且检测到一个具有较大极性的主要的新斑点。通过添加饱和NH4Cl(水性，800mL)淬灭反应混合物，并然后用EtOAc(500mL x 3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩以给出棕色油状物。将粗品用THF(300mL)溶解，然后在减压下浓缩(40℃)以给出150mL澄清溶液。然后添加至300mL MeOH中并在减压下浓缩以给出200mL溶液，然后过滤以给出残余物并用MeOH(10mL)洗涤。将母液在减压下浓缩以给出100mL溶液，然后过滤以给出残余物并用MeOH(10mL)洗涤。合并所有残余物，重复两次，以给出60g残余物。获得呈白色固体的化合物23(60g，粗品)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.56(d，J＝7.5Hz，6H)，7.32-7.23(m，6H)，7.21-7.14(m，3H)，4.85-4.68(m，1H)，3.41(td，J＝3.8，8.1Hz，1H)，3.28(td，J＝8.5，11.9Hz，1H)，3.09-2.91(m，2H)，2.78(dd，J＝2.6，13.6Hz，1H)，1.65-1.50(m，1H)，1.37(s，9H)，1.16-0.98(m，2H)，0.39-0.21(m，1H)。
化合物WV-CA-240的制备。
Figure BPA0000295055720008852
向化合物23(59g，123.52mmol)在THF(500mL)中的溶液中添加HCl(5M，247.04mL)。将混合物在20℃搅拌3hr。TLC指示化合物23被完全消耗，并且检测到一个具有较大极性的主要的新斑点。将所得混合物用MTBE(500mL x 3)洗涤。将合并水层用5M NaOH水溶液调节至pH 12，并用DCM(200mL x 3)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥、过滤并浓缩以得到白色固体。获得呈白色固体的WV-CA-240(23.6g，81.14％产率，99.95％纯度)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ＝4.18(ddd，J＝2.8，5.8，8.2Hz，1H)，3.29-3.21(m，1H)，3.19(d，J＝2.6Hz，1H)，3.16-3.08(m，1H)，2.92(t，J＝6.6Hz，2H)，2.74(br s，2H)，1.92-1.81(m，1H)，1.81-1.61(m，3H)，1.42(s，9H)。13CNMR(101MHz，氯仿-d)δ＝68.01，62.00，59.73，49.79，46.96，26.77，25.80，23.22.LCMS[M+H]+：236.1.LCMS纯度99.95％。
Figure BPA0000295055720008861
向WV-CA-108(37g，144.91mmol，1当量)在MeOH(370mL)中的溶液中添加丙-2-烯腈(7.69g，144.91mmol，9.61mL，1当量)。将混合物在20℃下搅拌3hr.，(TLC，石油醚∶乙酸乙酯＝1∶3，Rf＝0.31)显示WV-CA-108已完全消耗，并在LCMS中检测到一个具有所希望的MS的主峰。将反应混合物过滤并在减压下浓缩以给出残余物。获得呈白色固体的化合物24(44g，粗品)。LCMS[M+H]+：308.9。
化合物WV-CA-291的制备。
Figure BPA0000295055720008862
将化合物24(44g，142.67mmol，1当量)在DCM(220mL)和MeOH(220mL)中的溶液冷却至-78℃。然后添加mCPBA(36.93g，214.01mmol，1.5当量)和K2CO3(29.58g，214.01mmol，1.5当量)。添加后，将混合物在-78℃搅拌3hr。并将所得混合物在20℃搅拌12hr。LC-MS显示化合物24被完全消耗，并检测到一个具有所希望的MS的主峰。将反应混合物过滤并在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法纯化。将残余物通过快速硅胶色谱法(
Figure BPA0000295055720008863
220g
Figure BPA0000295055720008864
二氧化硅快速柱，洗脱剂为0～30％乙酸乙酯/石油醚梯度，100mL/min)纯化。获得呈黄色固体的WV-CA-291(12g，42.05mmol，29.47％产率，95.08％纯度)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝7.98-7.92(m，2H)，7.65(d，J＝7.5Hz，1H)，7.61-7.53(m，2H)，4.50-4.39(m，1H)，3.33-3.15(m，3H)，2.97-2.78(m，2H)，1.89-1.64(m，4H)。13CNMR(101MHz，氯仿-d)δ＝139.61，133.90，129.31，128.02，71.21，64.96，60.05，58.12，21.23，20.29.LCMS[M+H]+：272.0.LCMS纯度95.08％。
实例4E.手性受控的寡核苷酸制剂-示例有用的亚磷酰胺的示例技术
除其他事项外，本披露提供了用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺。在一些实施例中，提供的亚磷酰胺特别可用于制备手性受控的核苷酸间键联。在一些实施例中，提供的亚磷酰胺特别可用于制备包含P-N＝的手性受控的核苷酸间键联，例如，非负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联等。在一些实施例中，该键联磷是三价的。在一些实施例中，该键联磷是五价的。在一些实施例中，此类核苷酸间键联具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构。
氯衍生物的通用程序I：在一些实施例中，在示例程序中，在35℃在旋转蒸发器中通过将手性助剂(174.54mmol)与无水甲苯(80mL x 3)共沸蒸发进行干燥，并在真空下干燥过夜。在氩下通过套管(起始温度：-10.0℃，最大温度0℃，28min添加)，将溶于无水THF(200mL)中的此干燥的手性助剂(174.54mmol)和4-甲基吗啉(366.54mmol)的溶液添加至放置在三颈圆底烧瓶中的在无水THF(150mL)中的三氯膦经冰冷却的(异丙醇-干冰浴)溶液(37.07g，16.0mL，183.27mmol)中，并将反应混合物在15℃下温热1hr。之后，在氩下使用无气过滤管(Chemglass：过滤管，24/40 Inner Joints，80mm OD Medium Frit，Airfree，舒伦克公司(Schlenk))，将沉淀的白色固体通过真空过滤。在氩下在低温(25℃)，用旋转蒸发器去除溶剂，并将获得的粗半固体在真空下干燥过夜(约15h)，并直接用于下个步骤。
氯衍生物的通用程序I：在一些实施例中，在示例程序中，在35℃在旋转蒸发器中通过将手性助剂(174.54mmol)与无水甲苯(80mL x 3)共沸蒸发进行干燥，并在真空下干燥过夜。在氩下通过套管(起始温度：-10.0℃，最大温度0℃，28min添加)，将溶于无水THF(200mL)中的此干燥的手性助剂(174.54mmol)和4-甲基吗啉(366.54mmol)的溶液添加至放置在三颈圆底烧瓶中的在无水THF(150mL)中的三氯膦经冰冷却的(异丙醇-干冰浴)溶液(37.07g，16.0mL，183.27mmol)中，并将反应混合物在15℃下温热1hr。之后，在氩下使用无气过滤管(Chemglass：过滤管，24/40 Inner Joints，80mm OD Medium Frit，Airfree，舒伦克公司(Schlenk))，将沉淀的白色固体通过真空过滤。在氩下在低温(25℃)，用旋转蒸发器去除溶剂，并将获得的粗半固体在真空下干燥过夜(约15h)，并直接用于下个步骤。
偶联的通用程序III：在一些实施例中，在示例程序中，在35℃，将核苷(9.11mmol)通过与60mL无水甲苯(60mL x 2)共蒸发进行干燥，并在真空下过夜干燥。将干燥的核苷溶于干THF(78mL)中，随后添加三乙胺(63.80mmol)然后在氩下冷却至-5℃(对于2’F-dG/2’OMe-dG情况，使用0.95当量的TMS-Cl)。通过套管经3min添加粗品(从通用程序I(或)II制得，14.57mmol)的THF溶液，然后逐渐温至室温。在室温1hr后，TLC指示SM转化为产物(总反应时间1h)，然后在0℃将反应混合物用H2O(4.55mmol)淬灭，并且添加无水MgSO4(9.11mmol)并搅拌10min。然后将反应混合物使用无气过滤管在氩下进行过滤，THF用洗涤，并在26℃在旋转蒸发仪下干燥以得到白色粗品固体产物，将其在高真空下过夜干燥。将粗产物通过ISCO-Combiflash系统(用乙腈预平衡的rediSep高性能硅胶柱)，使用乙酸乙酯/己烷，用1％TEA作为溶剂(化合物在100％EtOAc/己烷/1％Et3N中洗脱)(对于2’F-dG情况，使用乙腈/乙酸乙酯与1％TEA)进行纯化。将合并在一起柱积分蒸发后，将残余物在高真空下干燥以得到呈白色固体的产物。
亚酰胺(1030-1039)的制备。
Figure BPA0000295055720008881
1030的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(73％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ153.32。(ES)m/z C47H50FN6O10PS的计算值：940.98[M]+，观察值：941.78[M+H]+。
1031的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(78％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ153.62。(ES)m/z C42H43FN3O10PS的计算值：831.85[M]+，观察值：870.58[M+K]+。
1032的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(68％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ153.95。(ES)m/z C44H46FN4O10PS的计算值：872.26[M]+，观察值：873.62[M+H]+。
1033的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。白色泡沫固体。产率：(87％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ151.70。(ES)m/z C50H48FN6O9PS的计算值：958.29[M]+，观察值：959.79，960.83[M+H]+。
1034的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(65％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ154.80。(ES)m/z C51H51N6O10PS的计算值：971.31[M]+，观察值：971.81[M+H]+。
1035的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(76％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ156.50。(ES)。(ES)m/z C53H55N6O11PS的计算值：1014.33[M]+，观察值：1015.81[M+H]+。
1036的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(78％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ156.40。(ES)。(ES)m/z C50H57N6O12PS的计算值：996.34[M]+，观察值：997.90[M+H]+。
1037的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(73％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ154.87。(ES)。(ES)m/z C46H52N3O12PS的计算值：901.30[M]+，观察值：940.83[M+K]+。
1038的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(75％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ154.94。(ES)m/z C53H57N4O12PS的计算值：1004.34[M]+，观察值：1005.86[M+H]+。
1039的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(80％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ153.52。(ES)m/z C44H47N4O10PS的计算值：854.28[M]+，观察值：855.41[M+H]+。
亚酰胺(1040-1049)的制备。
Figure BPA0000295055720008901
1040的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(78％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ157.80。(ES)m/z C47H50FN6O10PS的计算值：940.98[M]+，观察值：941.68[M+H]+。
1041的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(78％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ157.79。(ES)m/z C42H43FN3O10PS的计算值：831.85[M]+，观察值：870.68[M+K]+。
1042的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(78％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ158.07。(ES)m/z C44H46FN4O10PS的计算值：872.26[M]+，观察值：873.62[M+H]+。
1043的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。白色泡沫固体。产率：(86％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ156.48。(ES)m/z C50H48FN6O9PS的计算值：958.29[M]+，观察值：959.79，960.83[M+H]+。
1044的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(65％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ154.80。(ES)m/z C51H51N6O10PS的计算值：971.31[M]+，观察值：971.81[M+H]+。
1045的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(77％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ154.74。(ES)m/z C53H55N6O11PS的计算值：1014.33[M]+，观察值：1015.81[M+H]+。
1046的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(76％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ155.05。(ES)m/z C50H57N6O12PS的计算值：996.34[M]+，观察值：997.90[M+H]+。
1047的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(75％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ155.44。(ES)m/z C46H52N3O12PS的计算值：901.30[M]+，观察值：940.83[M+K]+。
1048的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(73％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ155.96。(ES)m/z C53H57N4O12PS的计算值：1004.34[M]+，观察值：1005.86[M+H]+。
1049的制备：通用程序I遵循通用程序III使用。灰白色泡沫固体。产率：(80％)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ156.37。(ES)m/z C44H47N4O10PS的计算值：854.28[M]+，观察值：855.31[M+H]+。
亚酰胺(1051)的制备。
Figure BPA0000295055720008911
1051的制备：使用通用程序II，然后使用通用程序III。灰白色泡沫固体。产率：(72％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ154.26。(ES)m/z C42H50FN4O10PS的计算值：852.29[M]+，观察值：853.52[M+H]+。
亚酰胺(1052)的制备。
Figure BPA0000295055720008912
1052的制备：使用通用程序II，然后使用通用程序III。灰白色泡沫固体。产率：(76％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ156.37。(ES)m/z C42H50FN4O10PS的计算值：852.29[M]+，观察值：853.52[M+H]+。
亚酰胺(1053、1054)的制备。
Figure BPA0000295055720008921
1053的制备：使用通用程序II，然后使用通用程序III。灰白色泡沫固体。产率：(80％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ156.62。(ES)m/z C47H50FN6O8PS的计算值：908.98[M]+，观察值：909.36[M+H]+。
1054的制备：使用通用程序II，然后使用通用程序III。灰白色泡沫固体。产率：(79％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ157.62。(ES)m/z C44H46FN4O8PS的计算值：840.90[M]+，观察值：841.67[M+H]+。
亚酰胺(1055)的制备。
Figure BPA0000295055720008922
1055的制备：使用通用程序II，然后使用通用程序III。白色泡沫固体。产率：(77％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ160.00。(ES)m/z C45H45FN5O10PS的计算值：897.26[M]+，观察值：898.74[M+H]+。
亚酰胺(1056)的制备。
Figure BPA0000295055720008931
1056的制备：使用通用程序II，然后使用通用程序III。灰白色泡沫固体。产率：(84％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ154.80。(ES)m/z C45H44ClFN5O8P的计算值：867.26[M]+，观察值：868.69[M+H]+。
亚酰胺(1057)的制备。
Figure BPA0000295055720008932
1057的制备：使用通用程序II，然后使用通用程序III。白色泡沫固体。产率：(91％)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ154.48。(ES)m/z C52H55FN5O10PS的计算值：991.34[M]+，观察值：992.87[M+H]+。
实例4F.用于手性受控的寡核苷酸制剂的示例技术-用于寡核苷酸合成的示例循环、条件、和试剂
在一些实施例中，本披露提供了特别可用于制备手性受控的核苷酸间键联的技术(例如，试剂、溶剂、条件、循环参数、切割方法、脱保护方法、纯化方法等)。在一些实施例中，此类核苷酸间键联(例如，非负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联等)包含P-N＝，其中P是键联磷。在一些实施例中，该键联磷是三价的。在一些实施例中，该键联磷是五价的。在一些实施例中，此类核苷酸间键联具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构。如本文所证明的，本披露的技术可以提供温和的反应条件、高官能团相容性、可替代的脱保护和/或切割条件、高粗品和/或纯化的产率、高粗品纯度、高产物纯度、和/或高立体选择性。
在一些实施例中，用于制备天然磷酸酯键联的循环包含以下或由其组成：脱保护(例如，脱三苯甲基化)、偶联、氧化(例如，使用I2/Pyr/水或本领域可用的其他合适的方法)和加帽(例如，本文所述的加帽2或本领域可用的其他合适的方法)。下面描述了一个示例循环，其中B1和B2独立地是核碱基。如本领域技术人员所理解的，各种修饰例(例如，糖修饰、碱基修饰等)是相容的并且可以包括在内。
Figure BPA0000295055720008941
在一些实施例中，用于制备非天然磷酸酯键联(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键联)的循环包含以下或由其组成：脱保护(例如，脱三苯甲基化)、偶联、第一加帽(例如，如本文所述的加帽-1)、修饰(例如，使用XH的硫醇化或本领域可用的其他合适的方法)、和第二加帽(例如，如本文所述的加帽-2、或本领域可用的其他合适的方法)。下面描述了一个示例循环，其中B1和B2独立地是核碱基。如本领域技术人员所理解的，各种修饰例(例如，糖修饰、碱基修饰等)是相容的并且可以包括在内。在一些实施例中，使用DPSE手性助剂的循环称为DPSE循环或DPSE亚酰胺循环。
Figure BPA0000295055720008951
在一些实施例中，用于制备非天然磷酸酯键联(例如，某些非负电荷的核苷酸间键联、中性核苷酸间键联等)(特别是包含P-N＝的那些，其中P是键联磷，和/或具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、III、或其盐形式的结构的那些)的循环包含脱保护(例如，脱三苯甲基化)、偶联、第一加帽(例如，如本文所述的加帽-1)、修饰(例如，使用ADIH(
Figure BPA0000295055720008952
2-叠氮基-1，3-二甲基-4，5-二氢-1H-咪唑-3-鎓六氟磷酸盐(V))或本领域可获得的其他合适方法)和第二加帽(例如，如本文所述的加帽-2或本领域可获得的其他合适方法)，或由其组成。下面描述了一个示例循环，其中B1和B2独立地是核碱基。在一些实施例中，在这样的循环中用于制备手性受控的核苷酸间键联的手性助剂包括如本文所述的吸电子基团，例如，具有包含吸电子基团的G2的各种手性助剂。在一些实施例中，G2包含如本文所述的-SO2R基团(例如，在一些实施例中，R是任选地经取代的苯基；在一些实施例中，R是任选地经取代的烷基(例如，叔丁基)；在一些实施例中，观察到为烷基的R(例如R为叔丁基(例如，WV-CA-240))可以提供与R是任选地经取代的苯基(例如，R是苯基(PSM))相当的结果)。如本领域技术人员所理解的，各种修饰例(例如，糖修饰、碱基修饰等)是相容的并且可以包括在内。在一些实施例中，使用PSM手性助剂的循环称为PSM循环或PSM亚酰胺循环。
Figure BPA0000295055720008961
可以依照本披露利用各种切割和脱保护方法。在一些实施例中，如本领域技术人员所理解的，可以鉴于以下调节切割和脱保护的参数(例如，碱、溶剂、温度、当量、时间等)：例如，待制备的寡核苷酸的结构(例如，核碱基、糖、核苷酸间键联、及其修饰/保护)、固体支持物、反应规模等。在一些实施例中，切割和脱保护包含一个、或者两个或更多个个体步骤。例如，在一些实施例中，利用两步骤切割和脱保护。在一些实施例中，切割和脱保护步骤包含在合适的溶剂(例如，DMSO/H2O)中，以合适的量(例如，约100或更多(例如，100±5)mL/mmol)含氟的试剂(例如，TEA-HF，任选地用另外的碱如TEA缓冲)，以及在合适的温度(例如，约0-100、0-80、0-50、0-40、0-30、0、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100℃(例如，在一个实例中，27℃±2℃))进行合适的时间段(例如，约l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或更多小时(例如，在一个实例中，6±0.5h))。在一些实施例中，切割和脱保护步骤包含在合适的溶剂(例如，水)(例如，浓NH4OH)，在合适的量(例如，约200或更多(例如，200±5)mL/mmol)的适合的碱基(例如，NR3)，并且在合适的温度(例如，约0-100℃、0-80℃、0-50℃、0-40℃、0-30℃、0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃(例如，在一个实例中，37℃±2℃))进行合适的时间段(例如，约l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或更多小时(例如，在一个实例中，24±1h))。在一些实施例中，切割和脱保护包含两个步骤或由两个步骤组成，其中一个步骤(例如，步骤1)是1x TEA-HF，以DMSO/H2O、100±5mL/mmol、27℃±2℃和6±0.5h，并且另一个步骤(例如，步骤2)是浓NH4OH、200±5mL/mmol、37℃±2℃和24±1h。本文描述了切割和脱保护过程的某些实例。
如本领域技术人员所理解的，寡核苷酸合成通常在固体支持物上进行。许多类型的固体支持物是可商购的和/或能以其他方式制备/获得，并且可以依照本披露利用。在一些实施例中，固体载体是CPG。在一些实施例中，固体支持物是NittoPhase HL。可以基于所希望的应用选择固体载体的类型和尺寸，并且在一些情况下，对于特定用途，一种类型的固体载体可以比另一种更好地进行。在一些实施例中，观察到对于某些配制品，与某些聚合物固体支持物(如NittoPhase HL)相比，CPG可以提供更高的粗品产率和/或纯度。
亚胺酸盐通常以合适的浓度溶于溶剂中。在一些实施例中，亚酰胺溶于ACN中。在一些实施例中，亚酰胺溶于两个或更多个溶剂的混合物中。在一些实施例中，亚酰胺溶于ACN和IBN(例如，20％ACN/80％IBN)的混合物。可以利用各种浓度的亚酰胺，并且可以鉴于具体的条件(例如，固体支持物、待制备的寡核苷酸、反应时间、规模等)进行调节。在一些实施例中，利用约0.01-0.5、0.05-0.5、0.1-0.5、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5M的浓度。在一些实施例中，利用约0.2M的浓度。在很多实施例中，亚酰胺溶液是干燥的。在一些实施例中，利用
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分子筛以干燥亚酰胺溶液(或保持亚酰胺溶液干燥)。在一些实施例中，利用在约15％-20％v/v的分子筛。
各种当量的亚酰胺可用于寡核苷酸合成中。如本领域技术人员将理解的，可以鉴于具体的条件(例如，固体支持物、待制备的寡核苷酸、反应时间、规模等)调节亚酰胺的当量，并且在合成期间可以利用相同的或不同的等价物。在一些实施例中，亚酰胺的当量是约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5或更多。在一些实施例中，合适的当量是约2。在一些实施例中，合适的当量是约2.5。在一些实施例中，合适的当量是约3。在一些实施例中，合适的当量是约3.5。在一些实施例中，合适的当量是约4。
许多活化剂是本领域可用的，并且可以依照本披露利用。在一些实施例中，活化剂是ETT。在一些实施例中，活化剂是CMIMT。在一些实施例中，将CMIMT用于手性受控的合成。如本领域技术人员所理解的，相同的或不同的活化剂可以用于不同的亚酰胺，并且能以不同的量利用。在一些实施例中，以约40％-100％，例如，40％、50％、60％、70％、80％或90％递送利用活化剂。在一些实施例中，递送是约60％(例如，对于ETT)。在一些实施例中，递送是约70％(例如，对于CMIMT)。在一些实施例中，活化剂/亚酰胺的摩尔比率是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。在一些实施例中，摩尔比率是约3-6。在一些实施例中，摩尔比率是约1。在一些实施例中，摩尔比率是约2。在一些实施例中，摩尔比率是约3。在一些实施例中，摩尔比率是约4。在一些实施例中，摩尔比率是约5。在一些实施例中，摩尔比率是约6。在一些实施例中，摩尔比率是约7。在一些实施例中，摩尔比率是约8。在一些实施例中，摩尔比率是约9。在一些实施例中，摩尔比率是约10。在一些实施例中，摩尔比率是约2-5、2-4或3-4(例如，对于ETT)。在一些实施例中，摩尔比率是约3.7(例如，对于ETT)。在一些实施例中，摩尔比率是约3-8、4-8、4-7、4-6、5-7、5-8或5-6(例如，对于CMIMT)。在一些实施例中，摩尔比率是约5.8(例如，对于CMIMT)。
如本领域技术人员所理解的，可以将各种合适的流速和反应时间用于寡核苷酸合成，并且可以根据待制备的寡核苷酸、规模、合成设置等进行调节。在一些实施例中，用于合成的再循环流速为约200cm/h。在一些实施例中，再循环时间是约1-10分钟。在一些实施例中，再循环时间是约8分钟。在一些实施例中，再循环时间是约10分钟。
许多技术可用于修饰P(III)键联，例如，在偶联后。例如，可以使用各种方法将P(III)键联转化为P(V)P(＝O)-型键联，例如，经由氧化。在一些实施例中，利用I2/Pyr/H2O。相似地，许多方法可用于将P(III)键联转化为P(V)P(＝S)-型键联，例如，经由硫化。在一些实施例中，如本文所示，XH用作硫醇化试剂。用于将P(III)键联转化为P(V)P(＝N-)-型键联的技术也是广泛可用的，并且可以依照本披露使用。在一些实施例中，如本文所示，采用ADIH。本文描述了合适的反应参数。在一些实施例中，将ADIH在约0.01-0.5、0.05-0.5、0.1-0.5、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5M的浓度下使用。在一些实施例中，ADIH的浓度是约0.25M。在一些实施例中，ADIH的浓度是约0.3M。在一些实施例中，将ADIH以约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-10，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45或50或更多当量使用。在一些实施例中，ADIH的当量是约7.5。在一些实施例中，ADIH的当量是约10。在一些实施例中，ADIH的当量是约15。在一些实施例中，ADIH的当量是约20。在一些实施例中，ADIH的当量是约23。在一些实施例中，ADIH的当量是约25。在一些实施例中，ADIH的当量是约30。在一些实施例中，ADIH的当量是约35。在一些实施例中，一个实验，以15.2当量、以及15min接触时间利用ADIH。在一些实施例中，取决于亚酰胺，可以调节试剂的浓度、当量、接触时间，例如，可以调节ADIH。
本披露的技术适合于各种规模的制备。在一些实施例中，以数百umol或更多进行合成。在一些实施例中，规模是约200umol。在一些实施例中，规模是约300umol。在一些实施例中，规模是约400umol。在一些实施例中，规模是约500umol。在一些实施例中，规模是约550umol。在一些实施例中，规模是约600umol。在一些实施例中，规模是约650umol。在一些实施例中，规模是约700umol。在一些实施例中，规模是约750umol。在一些实施例中，规模是约800umol。在一些实施例中，规模是约850umol。在一些实施例中，规模是约900umol。在一些实施例中，规模是约950umol。在一些实施例中，规模是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25、或更多mmol。在一些实施例中，规模是约1mmol或更多。在一些实施例中，规模是约2mmol或更多。在一些实施例中，规模是约5mmol或更多。在一些实施例中，规模是约10mmol或更多。在一些实施例中，规模是约15mmol或更多。在一些实施例中，规模是约20mmol或更多。在一些实施例中，规模是约25mmol或更多。
在一些实施例中，观察到的产率为85-90OD/umol(例如，对于10.2mmol合成为85,000OD/mmol，具有58.4％粗品纯度(％FLP))。
当用于制备包含手性受控的核苷酸间键联的寡核苷酸时，本披露的技术尤其可以提供各种优点，例如，包含P-N＝的那些，其中P是键联磷(例如，具有I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式等的核苷酸间键联)。例如，如本文所证明的，本披露的技术可以提供高粗品纯度和产率(例如，在很多实施例中，对于20-mer寡核苷酸，约55％-60％全长产物)，具有最少量的较短寡核苷酸(例如，来自不完全偶联、分解等)。除其他事项外，此类高粗品产率和/或纯度可以显著减少下游纯化并且可以显著降低生产成本和商品成本，并且在一些实施例中，极大地促进或使得大规模商业生产、临床试验和/或商业化销售成为可能。
用于制备手性受控的寡核苷酸组合物-WV-13864的示例程序。
以下描述了使用可控孔径玻璃(CPG)低堆积密度固体支持物(例如，2’-fC(乙酰基)，经由CNA接头CPG(
Figure BPA0000295055720009001
LBD))的用于制备WV-13864的示例程序。有用的亚磷酰胺包括5′-ODMTr-2′-F-dA(N6-Bz)-(L)-DPSE亚磷酰胺、5′-ODMTr-2′-F-dC(N4-Ac)-(L)-DPSE亚磷酰胺、5′-ODMTr-2′-F-dG(N2-iBu)-(L)-DPSE亚磷酰胺、5′-ODMTr-2′-F-dU-(L)-DPSE亚磷酰胺、5′-ODMTr-2′-OMe-G(N2-iBu)-(L)-DPSE亚磷酰胺、5′-ODMTr-2′-F-dC(N4-Ac)-(L)-PSM亚磷酰胺、5′-ODMTr-2′-F-dG(N2-iBu)-(L)-PSM亚磷酰胺、5’-DMT-2’-OMe-A(Bz)-β-氰基乙基亚磷酰胺、和5’-DMT-2’-OMe-C(Ac)-β-氰基乙基亚磷酰胺。
使用0.1M Xanthane氢化物溶液(XH)进行硫醇化。利用0.3M的在乙腈中的2-叠氮基-1，3-二甲基-咪唑啉六氟磷酸盐(ADIH)形成中性PN键联。氧化溶液是在吡啶/水中的0.04-0.06M碘，90/10，v/v。帽A是在乙腈中的N-甲基咪唑，20/80，v/v。帽B是乙酸酐/2，6-二甲基砒啶/乙腈，20/30/50，v/v/v。使用甲苯中的3％二氯乙酸进行去封闭。使用的NH4OH是28％-30％浓度的氢氧化铵。
脱三苯甲基。
为了开始合成，使5’-ODMTr-2’-F-dC(N4-Ac)-CPG固体支持物经受酸催化通过用甲苯中的3％(DCA)处理从5’-羟基去除DMTr保护基团。DMTr去除步骤通常用强烈的红色或橙色可视化，并且可以通过UV手表命令在436nm的波长下监测。
可以在合成循环开始时重复去除DMTr。在每种情况下，在脱三苯甲基化后，用乙腈洗涤支持物结合的材料，为下一步合成做准备。
偶联。
将亚酰胺以0.2M的浓度溶于乙腈(ACN)或溶于20％异丁腈(IBN)/80％ACN中，无需密度校正。在使用前，将溶液经分子筛
Figure BPA0000295055720009012
干燥不小于4h(15％-20％，v/v)。
Figure BPA0000295055720009011
Figure BPA0000295055720009021
利用双活化剂(CMIMT和ETT)偶联方法。将两个活化剂均以0.5M的浓度溶于ACN中。将CMIMT已用于手性受控的偶联，其中CMIMT与亚酰胺摩尔比率为5.833/1。将ETT用于标准亚酰胺(对于，天然磷酸酯键联)的偶联，其中ETT与亚酰胺摩尔比率为3.752/1。对于所有DPSE和PSM亚酰胺的再循环时间为10min，除了mG-L-DPSE的为8min。将所有标准亚酰胺偶联8min。
加帽-1(Cap-1或capping-1，第一加帽)。
使用了帽B(Ac2O/2，6-二甲基砒啶/MeCN(2∶3∶5，v/v/v))。在一些实施例中，加帽-1将仲胺基团加帽到，例如，手性助剂上。在一些实施例中，仲胺的不完全保护可能导致副反应，导致偶联失败的偶联或形成一种或多种副产物。在一些实施例中，加帽-1可能不是酯化的有效条件(例如，对于加帽未反应的5′-OH，是效率不及加帽-2(第二加帽)的条件)。
DPSE循环的硫醇化。
在加帽-1之后，用硫化试剂修饰亚磷酸酯中间体P(III)。在一个示例制备中，1.2CV(6-7当量)的硫化试剂(0.1M XH/吡啶-ACN，1∶1，v/v)经由流过模式经6min的接触时间通过合成柱递送以形成P(V)。
PSM循环的叠氮化物反应。
在加帽-1后，使用在ACN中的合适的试剂(例如，包含-N3，如ADIH)以形成中性核苷酸间键联(PN键联)。在示例准备中，在各自的循环中，利用对于fG-L-PSM，10.3当量的0.25MADIH经10min接触时间，并且对于fC-L-PSM，25.8当量的0.3M ADIH经15min接触时间。
标准核苷酸循环的氧化。
加帽-1步骤对于标准亚酰胺循环不是必须的。在将标准亚酰胺偶联到固体支持物上之后，用0.05M的碘/水/吡啶溶液氧化亚磷酸盐中间体(P(III))以形成P(V)。在示例制备中，3.5当量的氧化溶液递通过流通模式经2min接触时间送至柱用于有效氧化。
加帽-2(Cap-2或capping-2，第二加帽)。
对于每个循环的固相寡核苷酸合成的偶联效率为大约97％-100％，并且通过例如，DMTr阳离子的释放进行监测。将残余的未偶联5’-羟基基团(根据detrit监测，通常为1％-3％)在固体支持物上)用帽A(在乙腈中的20％N-甲基咪唑(NMI/ACN＝20/80，v/v))和帽B(20％∶30％∶50％＝Ac2O∶2，6-二甲基吡啶∶ACN(v/v/v))试剂(例如，1∶1)封闭。通过流通模式经0.8min接触时间将两种试剂(例如，0.4CV)递送至柱，以预防形成失败的序列。在此步骤中也可以保护未加帽的胺基团。
如本文所示，在一些实施例中，DPSE亚酰胺或DPSE循环是脱三苯甲基化->偶联->加帽-1(Cap-1或Capping-1，第一加帽)->硫醇化->加帽-2(加帽-1，后加帽，第二加帽)；在一些实施例中，PSM亚酰胺或PSM循环是脱三苯甲基化->偶联->加帽-1(Cap-1或Capping-1，第一加帽)->叠氮化物反应->加帽-2(加帽-1，后加帽，第二加帽)；在一些实施例中，标准亚酰胺或标准循环(传统的，非手性受控的)是脱三苯甲基化->偶联->氧化->加帽-2(加帽-1，后加帽，第二加帽)。
选择合成循环并重复直至达到所希望的长度。
胺洗涤。
在一些实施例中，提供的技术对于制备包含核苷酸间键联(包含P-N＝，其中P是键联磷)的寡核苷酸是特别地有效的。在一些实施例中，提供的技术包含将寡核苷酸中间体与碱接触。在一些实施例中，在达到所希望的寡核苷酸长度后进行接触。在一些实施例中，这样的接触提供了包含核苷酸间键联的寡核苷酸，这些核苷酸间键联包含P-N＝，其中P是键联磷(例如，具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的那些)。在一些实施例中，接触去除了手性助剂(例如，具有通过碳原子与分子的剩余部分连接的G2的那些，并且碳原子与至少一个吸电子基团(例如，WV-CA-231、WV-CA-236、WV-CA-240等)连接)。在一些实施例中，利用碱或碱溶液进行接触，该碱或碱溶液基本上不含OH-或水(无水)。在一些实施例中，碱是胺(例如，N(R)3)。在一些实施例中，胺具有NH(R)2的结构，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族；在一些实施例中，每个R独立地是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，碱是N，N-二乙胺(DEA)。在一些实施例中，碱溶液是20％DEA/ACN。在一些实施例中，这种与碱的接触降低了副产物水平，这些副产物在包含P-N＝的核苷酸间键联的一个或多个位置处具有天然磷酸酯键联。
在示例制备中，在完成寡核苷酸核苷酸合成循环后，通过经15min接触时间在乙腈中的5个柱体积的20％DEA进行柱上胺洗涤。
在一些实施例中，与碱接触也可以去除2-氰基乙基基团，用于构建标准天然磷酸酯键联。在一些实施例中，与碱接触提供天然磷酸酯键联(例如，以盐形式，其中阳离子是胺碱的对应的铵盐)。
切割和脱保护。
在与碱接触后，将寡核苷酸暴露于进一步的切割和脱保护。在示例性制备中，助剂去除(例如，DPSE)、切割和去保护是两步过程。在步骤1中，在27℃±2℃，用1x TEA-HF溶液(DMSO∶水∶TEA.3HF∶TEA＝43∶8.6∶2.8∶1＝v/v/v/v，100±5uL/umol)处理具有寡核苷酸的CPG固体支持物持续6±0.5h。然后在37℃±2℃，将大批的浆料用浓氢氧化铵(28％-30％，200±10mL/mmol)处理24±1h(步骤2)以释放寡核苷酸形成固体支持物。通过过滤收集粗产物。将滤液与固体支持物的洗涤液(例如，水)合并。在一些实施例中，观察到产率为约80-90OD/umole。
用于制备手性受控的寡核苷酸组合物-WV-13835的示例程序。
In an示例制备，从CPG 2’-F-U开始以1.2mmol规模制备WV-13835。将DPSE用作手性受控的核苷酸间键联的手性助剂。制备包含多个循环，中性循环包含解封步骤(在酸性条件下脱三苯甲基化)、偶联步骤(用DPSE亚磷酰胺)、修饰前加帽步骤(例如，帽B)、修饰步骤(例如，使用Pyr/CAN中的0.1M XH进行硫醇化)、修饰后加帽步骤(例如，在帽2条件(1∶1帽A+帽B)下)。在一些实施例中，循环包含修饰步骤，该修饰步骤是或包含用I2/Pyr/H2O进行氧化。切割和脱保护包括两个步骤，其中步骤一使用TEA-HF(在100mL/mmol和27℃±2.5℃下)，并且步骤2使用浓NH4OH(在200mL/mmol和37℃±2.5℃下)。总粗品产率是91800 OD(76500 OD/mmol)。净％FLP是53.6％并且NAP(脱盐后)％FLP是58.3％。粗品中的％FLP是1.71g。
用于制备手性受控的寡核苷酸组合物-WV-14791的示例程序。
在示例制备中，从CPG 2’-F-U开始以402umol规模制备WV-14791。使用DPSE作为手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联的手性助剂，并使用PSM作为手性受控的n001的手性助剂。制备包含多个循环，这些循环包含解封步骤(在酸性条件下脱三苯甲基化)、偶联步骤(用DPSE(用于手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联)或PSM亚磷酰胺(用于手性受控的n001核苷酸间键联))、修饰预加帽步骤(例如，帽B)、修饰步骤(例如，使用在Pyr/CAN中的0.1MXH针对硫代磷酸酯核苷酸间键联进行硫醇化，使用在CAN中的2-叠氮基-1，3-二甲基-咪唑啉六氟磷酸盐针对n001进行硫醇化)、修饰后加帽步骤(例如，在帽2条件(1∶1帽A+帽B)下)。在一些实施例中，循环包含修饰步骤，该修饰步骤是或包含用I2/Pyr/H2O进行氧化。总粗品产率是27000 OD(67.1OD/umol)。净％FLP是45.7％并且NAP(脱盐后)％FLP是51.8％。粗品中的％FLP是445mg。
用于制备手性受控的寡核苷酸组合物-WV-14344的示例程序。
在示例制备中，从CPG 2’-F-C开始以400umol规模制备WV-14344。DPSE用作手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联的手性助剂，并且PSM用作手性受控的n001的手性助剂。制备包含多个循环，这些循环包含解封步骤(在酸性条件下脱三苯甲基化)、偶联步骤(用DPSE(用于手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联)或PSM亚磷酰胺(用于手性受控的n001核苷酸间键联))、修饰预加帽步骤(例如，帽B)、修饰步骤(例如，使用在Pyr/CAN中的0.1M XH针对硫代磷酸酯核苷酸间键联进行硫醇化，使用在CAN中的2-叠氮基-1，3-二甲基-咪唑啉六氟磷酸盐针对n001进行硫醇化)、修饰后加帽步骤(例如，在帽2条件(1∶1帽A+帽B)下)。在一些实施例中，循环包含修饰步骤，该修饰步骤是或包含用I2/Pyr/H2O进行氧化。总粗品产率是32000 OD(80 OD/umol)。净％FLP是48.8％并且NAP(脱盐后)％FLP是59.2％。粗品中的％FLP是571mg。
另外的手性受控的寡核苷酸组合物的示例制备。
利用本文所述的技术制备包括手性受控的寡核苷酸组合物在内的各种寡核苷酸组合物。在一些实施例中，使用自动化固相合成来制备寡核苷酸组合物。使用填充有325mgCNA连接的核苷-CPG的TWISTTM柱10um/15um柱(GlenResearch，目录号20-0040)以25umol进行某些制备。下面显示了在25umol下手性受控的核苷酸间键联的示例循环和叠氮化物修饰剂。
Figure BPA0000295055720009061
Figure BPA0000295055720009062
循环完成后，将CPG支持物用在MeCN中的20％DEA处理12min，用干燥MeCN洗涤并在氩气和真空下干燥。将干燥的CPG支持物转移到15mL塑料管中，在28℃下用1X溶液(在H2O-DMSO中的1M HF-TEA(1∶5，v/v)，100uL/umol)处理6h，然后添加浓NH3(200uL/umol)，并在37℃下反应24h。将混合物冷却至室温并通过膜过滤去除CPG，并将产物通过LTQ和RP-UPLC分析(用MeCN线性梯度(1％-15％/15min)，在(10mM TEA，100mM HFIP于水中)中，在55℃下，以0.8mL/min的速率)。将粗品寡核苷酸通过AEX-HPLC(用20mM NaOH至2.5M NaCl洗脱)纯化，并脱盐以获得靶寡核苷酸组合物。
下面列出了示例制备，其粗UPLC纯度范围为从约9％至约58％。对于相同和/或其他寡核苷酸的制备，观察到较高的粗HPLC纯度。
Figure BPA0000295055720009071
除其他事项外，提供的技术提供的高粗品纯度和/或产率。在许多配制品(各种规模、试剂浓度、反应时间等)中，获得约55％-60％的粗品纯度(％FLP)，其具有最少量的较短寡核苷酸(例如，来自不完全偶联、分解、副反应)等。在很多实施例中，最显著的较短寡核苷酸的量不超过约2％-10％，通常不超过2％-4％(例如，在一些实施例中，低至约2％(最显著的较短寡核苷酸)是N-3))。
各种技术可用于寡核苷酸纯化，并且可以依照本披露使用。在一些实施例中，使用例如，AEX纯化、和/或UF/DF将粗产物进一步纯化(例如，超过90％纯度)。
使用本文所述的技术，在各种规模(从umol至mmol)制备包含不同的碱基序列、修饰(例如，核碱基、糖、和核苷酸间键联修饰)和/或其模式、键联磷立体化学和/或其模式等的各种寡核苷酸。此类寡核苷酸具有各种靶并且可以通过各种机制起作用。某些此类寡核苷酸呈现于本披露的表中。
如本领域技术人员所理解的，本文描述的实例仅用于说明。本领域技术人员将理解，可以根据例如仪器、规模、试剂、反应物、所希望的结果等来调整各种条件、参数等。使用依照本披露的各种技术可以进一步改进某些结果。除其他事项外，提供的寡核苷酸及其组合物可以提供显著改进的特性和/或活性，例如，在各种测定和体内模型中，并且可以特别用于预防和/或治疗各种病症、障碍、或疾病。在本文实例中提供了某些数据。
实例4G.某些用于并入Mod的试剂的合成
如本披露中所述，本披露的寡核苷酸可以包含除寡核苷酸链部分之外的其他多种另外的化学部分(例如，多种Mod)。在一些实施例中，本披露提供了包含本文所述的Mod的寡核苷酸。在一些实施例中，此类另外的部分提供了改善的性质，活性、递送等。在一些实施例中，本披露提供了有用的另外的化学部分，以及用于制备和并入此类另外的化学部分的技术。某些实例描述如下。本领域技术人员理解和与另外的化学部分(例如，结构、制备、并入、用途等)有关的各种技术，例如在US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US2015/0211006、US 2017/0037399、WO 2017/015555、WO 2017/192664、WO 2017/015575、WO2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/223056、WO2018/237194、WO 2019/055951等中所述的那些(其各自的此类技术通过引用独立地并入)可根据本披露使用。
5-((1，19-双((1，3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)-10-((3-((3-((1，3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸的合成。
Figure BPA0000295055720009091
步骤1.在0℃下，向15，15-双(13，13-二甲基-5，11-二氧代-2，12-二氧杂-6，10-二氮杂十四基)-2，2-二甲基-4，10，17-三氧代-3，13-二氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸苯甲酯(5g，4.95mmol，1当量)在DCM(50mL)中的溶液中添加TFA(16.93g，148.48mmol，10.99mL，30当量)。将混合物在0-25℃下搅拌2hr。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂。然后添加ACN(5mL)和MTBE(40mL)，过滤粘稠液体。获得呈微黄色油状物的粗品5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯(5.21g，粗品，3TFA)。LCMS：(M+H+)：710.6；(M+Na+)：732.7。
步骤2.向5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯(5.21g，粗品，3TFA)在DCM(35mL)中的溶液中添加DIEA(6.39g，49.45mmol，8.61mL，10当量)和2-氯-1，3-二甲基-4，5-二氢咪唑-1-鎓六氟磷酸盐(4.55g，16.32mmol，3.3当量)。将混合物在25℃搅拌15hr。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂。将粗品通过RP-MPLC(规格：C18，330g，20～35微米，
Figure BPA0000295055720009092
)纯化。获得呈黄色油状物的产物5-((1，19-双((1，3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)-10-((3-((3-((1，3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯(4.94g，粗品)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝7.39-7.29(m，5H)，3.70-3.62(m，28H)，3.45(q，J＝6.6Hz，7H)，3.30-3.26(m，6H)，3.08-2.99(m，21H)，2.47-2.39(m，9H)，2.23(t，J＝7.4Hz，2H)，1.92-1.78(m，10H)。
步骤3.向5-((1，19-双((1，3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)-10-((3-((3-((1，3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯(2g，2.00mmol，1当量)在THF(10mL)和H2O(2mL)中的溶液中添加LiOH.H2O(588.51mg，14.02mmol，7当量)。将该混合物在25℃下搅拌3hr。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂。将残余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex luna C18 250*50mm*10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-25％，20min)纯化。获得呈黄色胶质的5-((1，19-双((1，3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)-10-((3-((3-((1，3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸(0.6g，651.84umol，32.54％产率，98.66％纯度)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝8.03(br t，J＝5.6Hz，3H)，7.75(brt，J＝5.6Hz，3H)，7.08(s，1H)，3.62-3.54(m，24H)，3.34(q，J＝6.6Hz，7H)，3.12(q，J＝6.2Hz，5H)，2.96(s，18H)，2.30(br t，J＝6.4Hz，6H)，2.23-2.03(m，4H)，1.79-1.59(m，8H)；LCMS：(M/2+H+)：454.9；LCMS纯度：98.66％。
(E)-2-甲基-14，14-双((E)-2-甲基-3-吗啉代-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-3-吗啉代-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸的合成。
Figure BPA0000295055720009101
步骤1.向15，15-双(13，13-二甲基-5，11-二氧代-2，12-二氧杂-6，10-二氮杂十四基)-2，2-二甲基-4，10，17-三氧代-3，13-二氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸苯甲酯(5g，4.95mmol，1当量)在DCM(50mL)中的溶液中添加TFA(16.93g，148.48mmol，10.99mL，30当量)。将混合物在0-25℃下搅拌2hr。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂，然后添加ACN(50mL)和MTBE(500mL)，过滤粘稠液体。获得呈黄色油状物的粗品5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯(5.21g，粗品，3TFA)。LCMS：(M+H+)：710.6；(M+Na+)：732.5。
步骤2.向5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯(3.86g，3.67mmol，1当量，3TFA)在DCM(35.1mL)中的溶液中添加DIEA(4.73g，36.63mmol，6.38mL，10当量)和[[(Z)-(1-氰基-2乙氧基-2-氧代-亚乙基)氨基]氧基-吗啉代-亚甲基]-二甲基铵；六氟磷酸盐(5.18g，12.09mmol，3.3当量)。将混合物在25℃搅拌15hr。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂。通过ACN(15mL)溶解粗品，然后将其输入反相柱。将粗产物通过反相HPLC(0.75％TFA在水中，和乙腈)纯化。获得呈黄色油状物的粗品化合物(E)-2-甲基-14，14-双((E)-2-甲基-3-吗啉代-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-3-吗啉代-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸苯甲酯(4.14g，粗品)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ＝7.43-7.24(m，5H)，3.78(br s，13H)，3.72-3.64(m，12H)，3.50-3.36(m，13H)，3.27(br d，J＝8.6Hz，11H)，3.11-2.97(m，18H)，2.50-2.42(m，8H)，2.26(t，J＝7.4Hz，2H)，1.93-1.78(m，8H)。
步骤3.向(E)-2-甲基-14，14-双((E)-2-甲基-3-吗啉代-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-3-吗啉代-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸苯甲酯(2g，1.77mmol，1当量)在THF(1mL)和H2O(0.2mL)中的溶液中添加LiOH.H2O(519.71mg，12.38mmol，7当量)。将该混合物在25℃下搅拌3hr。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂。将残余物通过制备型HPLC(Phenomenex luna C18 250*50mm*10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-20％，20min)纯化。获得呈黄色胶质的化合物(E)-2-甲基-14，14-双((E)-2-甲基-3-吗啉代-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-3-吗啉代-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸(1.2g，1.14mmol，64.65％产率，99.16％纯度)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝7.99(br s，3H)，7.84(br s，3H)，7.06(s，1H)，3.67(br s，12H)，3.59-3.49(m，12H)，3.44-3.25(m，12H)，3.11(brs，12H)，3.02-2.81(m，17H)，2.31(br t，J＝6.1Hz，6H)，2.23-2.04(m，4H)，1.79-1.60(m，8H)。LCMS：(M/2+H+)：521.0；LCMS纯度：99.16％。
(S)-3-(二甲基氨基)-26-(3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酰胺基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16，20，27-四氧代-12-氧杂-2，4，8，15，21，28-六氮杂三十四烷-3-烯-34-酸的合成
Figure BPA0000295055720009121
步骤1.向3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸(10g，10.94mmol，5当量)在DMF(100mL)中的溶液中添加DIPEA(2.83g，21.88mmol，3.81mL，10当量)并然后添加(S)-6-(2，6-二氨基六酰胺基)己酸苯甲酯(924.07mg，2.19mmol，1当量，2HCl)，并然后在0℃下向混合物中滴加在DMF(10mL)中的HATU(1.91g，5.03mmol，2.3当量)。将反应混合物在25℃搅拌12hr。将混合物真空浓缩。将残余物通过制备型HPLC(TFA条件)纯化。柱：Phenomenex luna C 18250*50mm*10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％CH3CN：10％-35％，20min。获得呈黄色油状物的(S)-3-(二甲基氨基)-26-(3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酰胺基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16，20，27-四氧代-12-氧杂-2，4，8，15，21，28-六氮杂三十四烷-3-烯-34-酸苯甲酯(3.7g，粗品)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.01-7.77(m，10H)，7.63(br t，J＝4.9Hz，6H)，7.40-7.29(m，5H)，7.07(br d，J＝16.5Hz，2H)，5.08(s，2H)，4.18-4.07(m，1H)，3.63-3.46(m，24H)，3.10(br dd，J＝3.2，5.1Hz，25H)，3.00-2.78(m，79H)，2.39-2.23(m，18H)，2.15-1.98(m，20H)，1.72-1.13(m，31H)。LCMS：M/4+H+＝536.5。
步骤2.向化合物(S)-3-(二甲基氨基)-26-(3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酰胺基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16，20，27-四氧代-12-氧杂-2，4，8，15，21，28-六氮杂三十四烷-3-烯-34-酸苯甲酯(4.4g，2.05mmol，1当量)在THF(40mL)和H2O(8mL)中的溶液中添加LiOH.H2O(603.45mg，14.38mmol，7当量)。将该混合物在25℃下搅拌2hr。将混合物真空浓缩。将残余物通过制备型HPLC(TFA条件)纯化。柱：Phenomenex luna C 18 250*50mm*10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：2％-30％，20min。获得呈黄色油状物的化合物(S)-3-(二甲基氨基)-26-(3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酰胺基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16，20，27-四氧代-12-氧杂-2，4，8，15，21，28-六氮杂三十四烷-3-烯-34-酸(1.4g，678.84umol，33.04％产率，99.483％纯度)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝8.00(br t，J＝5.5Hz，6H)，7.91(br t，J＝5.6Hz，1H)，7.87-7.79(m，2H)，7.67(br t，J＝4.8Hz，5H)，7.15-7.01(m，2H)，4.17-4.10(m，1H)，3.70-3.43(m，24H)，3.16-3.06(m，24H)，3.05-2.75(m，76H)，2.30(br t，J＝6.4Hz，12H)，2.18(t，J＝7.4Hz，2H)，2.15-1.98(m，8H)，1.66(quin，J＝6.6Hz，17H)，1.48(quin，J＝7.4Hz，3H)，1.41-1.31(m，4H)，1.28-1.17(m，4H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ＝174.85，172.67，172.61，172.40，172.19，170.87，161.50，158.77(q，J＝35.2Hz，1C)，118.06，115.15，68.72，67.84，60.03，53.08，42.36，38.87，38.78，36.40，35.95，35.88，35.81，35.25，34.91，34.08，29.85，29.40，29.19，26.34，24.63，23.47，22.14.LCMS：M/3+H+＝684.7，纯度：99.48％。
(S)-6-(4-(4-(N-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢蝶啶-6-基)甲基)-2，2，2-三氟乙酰胺基)苯甲酰胺基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰胺基)己酸的合成。
Figure BPA0000295055720009141
步骤1.向(S)-4-(((苄基氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酸(14g，47.41mmol，1当量)在THF(150mL)中的溶液中添加TEA(14.39g，142.23mmol，19.80mL，3当量)，然后在0-5℃下添加6-氨基己酸酯6-氨基己酸叔丁酯(11.54g，61.63mmol，1.3当量)并搅拌0.5小时。在0-5℃下，将T3P(60.34g，94.82mmol，56.39mL，50％纯度，2当量)添加至混合物中并在20℃-25℃下搅拌12小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1∶1，Rf＝0.35)显示起始材料已完全消耗。将混合物在减压下浓缩以去除溶剂，并且然后用乙酸乙酯(100mL)再溶解。将有机相通过饱和水性NaHCO3(50mL×3)洗涤并经无水Na2SO4干燥。将粗产物通过MPLC(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1∶1)纯化以获得呈黄色油状物的(S)-6-(4-(((苄基氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰胺基)己酸叔丁酯(19.7g，粗品)。
步骤2.将(S)-6-(4-(((苄基氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰胺基)己酸叔丁酯(15g，32.29mmol，1当量)和Pd/C(10g，10％纯度)在THF(300mL)中的混合物在真空中抽空并用H2(15Psi)回填三次，然后在20℃-25℃下搅拌6小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1∶1，Rf＝0)显示起始材料已完全消耗。将混合物过滤并在减压下浓缩以去除大部分溶剂。将粗产物不经任何纯化即用于下一步骤。获得呈无色液体(在溶剂中)的(S)-6-(4-氨基-5-甲氧基-5-氧代戊酰胺基)己酸叔丁酯(10.67g，31.42mmol，97.31％产率，97.303％纯度)。LCMS：M+H+＝331.2，纯度：97.70％。
步骤3.在20℃-25℃下，向4-(N-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢蝶啶-6-基)-甲基)-2，2，2-三氟乙酰胺基)苯甲酸(8.28g，25.06mmol，1.1当量)和DIPEA(8.83g，68.33mmol，11.90mL，3当量)在DMSO(20mL)中的混合物中添加HATU(8.66g，22.78mmol，1当量)和(S)-6-(4-氨基-5-甲氧基-5-氧代戊酰胺基)己酸叔丁酯并搅拌12小时。将混合物用H2O(20mL)稀释并用乙酸乙酯(20mL×3)萃取。将有机相在减压下浓缩以去除溶剂。将粗产物通过MPLC(SiO2，甲醇/乙酸乙酯＝2∶5)纯化以获得呈棕色胶质的(S)-6-(4-(4-(N-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢蝶啶-6-基)甲基)-2，2，2-三氟乙酰胺基)苯甲酰胺基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰胺基)己酸叔丁酯(26.2g，粗品)。LCMS：M+H+＝721.2。
步骤4.在0-5℃下，向叔丁基(S)-6-(4-(4-(N-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢蝶啶-6-基)甲基)-2，2，2-三氟乙酰胺基)苯甲酰胺基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰胺基)己酸叔丁酯(13.1g，11.39mmol，1当量)在DCM(100mL)中的溶液中添加TFA(7.79g，68.35mmol，5.06mL，6当量)并将混合物在35℃-40℃下搅拌12小时。将混合物在减压下浓缩以去除溶剂。将粗产物通过HPLC检测并通过制备型HPLC(柱：Phenomenex luna C18 250*50mm*10um；流动相：[水(0.05％HCl)-ACN]；B％：15％-35％，20min)纯化以获得(S)-6-(4-(4-(N-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢蝶啶-6-基)甲基)-2，2，2-三氟乙酰胺基)苯甲酰胺基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰胺基)己酸(1.51g，1.88mmol，32.96％产率，82.627％纯度)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝8.92(br d，J＝7.1Hz，1H)，8.74(s，1H)，7.93(br d，J＝8.4Hz，3H)，7.83(br t，J＝5.5Hz，1H)，7.66(br d，J＝8.3Hz，2H)，5.18(s，2H)，5.06-4.52(m，3H)，4.45-4.32(m，1H)，3.63(s，2H)，3.00(q，J＝6.2Hz，2H)，2.25-2.13(m，4H)，2.12-2.03(m，1H)，1.99-1.87(m，1H)，1.46(quin，J＝7.5Hz，2H)，1.35(td，J＝7.4，14.9Hz，2H)，1.27-1.15(m，2H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ＝174.91，172.83，171.50，166.02，159.47，153.27，149.15，142.22，134.71，129.15，128.99，128.64，54.27，52.97，52.38，38.79，34.05，32.16，29.29，26.76，26.40，24.66.LCMS：M+H+＝665.2。
实例5.N6-硬脂酰基-N2-(4-氨磺酰基苯甲酰)-L-赖氨酸的合成
Figure BPA0000295055720009161
步骤1.在15℃下，向硬脂酸(8.00g，28.12mmol)在DCM(210mL)中的溶液中添加1-羟基吡咯烷-2，5-二酮(3.24g，28.12mmol)，然后添加EDCI(5.39g，28.12mmol)。将混合物在15℃下搅拌21hr。TLC显示残余部分硬脂酸。另外添加1-羟基吡咯烷-2，5-二酮(0.32g)和EDCI(1.07g)。在15℃下继续搅拌8hr。TLC显示反应完成。将溶剂在减压下蒸发。将残余物溶于DCM(300mL)并将溶液用水(200mL)洗涤；然后将水相用DCM(2*100mL)反萃取。将合并的有机相干燥(MgSO4)并将溶剂在减压下蒸发以产生呈白色固体的2，5-二氧代吡咯烷-1-基硬脂酸酯。无需进一步纯化。将粗产物2，5-二氧代吡咯烷-1-基硬脂酸酯(10.70g，粗品)不经进一步纯化即用于下一步骤。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)Rf＝0.79。
步骤2.向(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(4.49g，18.24mmol)和2，5-二氧代吡咯烷-1-基硬脂酸酯(5.80g，15.20mmol)在DMF(20mL)中的溶液中添加DIPEA(5.89g，45.60mmol，7.96mL)。将混合物在20℃下搅拌20小时。TLC和LCMS显示反应完成。将得到的混合物在减压下浓缩至干。将残余物与9g粗品化合物合并，在水(200mL)和EtOAc(300mL)和DCM(80mL)之间分配。将分离的水层用EtOAc(300mL*3)萃取。将合并的有机层用水(100mL*2)洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并浓缩以提供呈白色固体的的产物(14.5g)。将粗产物化合物N2-(叔丁氧基羰基)-N6-硬脂酰基-L-赖氨酸(7.70g，粗品)不经进一步纯化即用于下一步骤。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝11.29(br s，1H)，7.97(s，1H)，5.88(br s，1H)，5.24(br d，J＝7.3Hz，1H)，4.21(br d，J＝5.1Hz，1H)，3.17(q，J＝6.5Hz，2H)，2.11(t，J＝7.6Hz，2H)，1.79(br s，1H)，1.64(dt，J＝7.9，14.0Hz，1H)，1.58-1.42(m，4H)，1.41-1.28(m，11H)，1.18(br s，29H)，0.81(t，J＝6.7Hz，3H)；LCMS：(M+Na+)：535.3；TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)Rf＝0.01。
步骤3.向N2-(叔丁氧基羰基)-N6-硬脂酰基-L-赖氨酸(12.50g，24.38mmol)在DCM(120mL)中的溶液中添加TFA(46.20g，405.20mmol，30mL)。将混合物在15℃下搅拌4.5hr。LCMS显示反应几乎完成。将所得混合物在带水泵的旋转蒸发器上减压下浓缩以给出灰色粗固体。将粗产物化合物N6-硬脂酰基-L-赖氨酸(12.80g，粗品，TFA盐)不经进一步纯化即用于下一步骤。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝8.19(br s，3H)，7.77-7.65(m，1H)，3.88(br d，J＝4.9Hz，1H)，3.02(br d，J＝5.5Hz，2H)，2.03(br t，J＝7.3Hz，2H)，1.75(br s，2H)，1.56-1.34(m，6H)，1.24(s，28H)，0.86(br t，J＝6.4Hz，3H)；LCMS：(M+H+)：413.3。
步骤4.向化合物N6-硬脂酰基-L-赖氨酸(5.00g，9.49mmol，TFA盐)在DMF(150mL)中的溶液中添加化合物2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-氨磺酰基苯甲酸酯(3.98g，13.34mmol)，然后添加DIPEA(9.40g，72.73mmol，12.70mL)。将混合物在80℃下搅拌18hr。LCMS显示反应完成。将所得混合物在减压下浓缩直至剩余20mL残余物混合物。向残余物中添加DCM(80mL)和石油醚(50mL)。在15℃下静置36br后，将沉淀的固体过滤并干燥，以给出呈浅黄色固体的产物(1.9g)。将滤液浓缩至干并用ACN(100mL)研磨，过滤，并将滤饼干燥，以给出粗品(2.4g)。浓缩滤液，以给出油状混乱粗品。无需进一步纯化。获得呈淡黄色固体的N6-硬脂酰基-N2-(4-氨磺酰基苯甲酰)-L-赖氨酸(1.90g，33.60％产率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.19-11.82(m，1H)，8.74(br d，J＝5.7Hz，1H)，8.04(br d，J＝6.6Hz，2H)，7.91(br d，J＝7.1Hz，2H)，7.74(br s，1H)，7.49(br s，2H)，4.35(br s，1H)，3.02(br s，2H)，2.02(br s，2H)，1.80(br s，2H)，1.23(br s，31H)，0.86(br s，3H)；13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ174.06，172.39，165.94，146.85，137.28，128.54，125.99，53.24，38.55，35.88，31.76，30.69，29.50，29.41，29.24，29.18，25.78，23.72，22.55，14.39；LCMS：(M+H+)：596.4，纯度：89.89％。
实例6. 18-氧代-18-((4-氨磺酰基苯乙基)氨基)十八烷酸的合成
Figure BPA0000295055720009181
向十八烷二酸(4.90g，15.58mmol)和4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺(3.12g，15.58mmol)在DCM(50mL)中的溶液中添加HATU(7.11g，18.70mmol)和DIPEA(6.04g，46.74mmol，8.16mL)。将混合物在10℃下搅拌16小时。将所得混合物在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过CH3CN(100mL*2)洗涤以给出呈白色固体的粗产物(11g)。将1g粗品通过DMSO/DMF(V/V＝3∶1，20mL)溶解，通过制备型HPLC(柱：Phenomenex luna C18 250*50mm*10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：45％-75％，20min)纯化以给出40mg呈白色固体的产物。向10g粗品中添加CH3CN/H2O(V/V＝4∶1，100mL)并保持在超声仪器中持续30min，然后过滤以给出滤饼，将滤饼通过石油醚(20mL)和乙酮(20mL)洗涤。将滤饼在减压下浓缩以给出6g呈黄色固体的产物。获得呈黄色固体的化合物18-氧代-18-((4-氨磺酰基苯乙基)氨基)十八烷酸(6.00g，77.53％产率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝7.86(br t，J＝5.3Hz，1H)，7.71(d，J＝8.2Hz，2H)，7.35(d，J＝7.9Hz，2H)，7.27(s，2H)，3.26(q，J＝6.6Hz，3H)，2.75(br t，J＝7.2Hz，2H)，2.15(t，J＝7.3Hz，1H)，2.00(br t，J＝7.3Hz，2H)，1.44(br d，J＝6.6Hz，4H)，1.21(s，23H)，1.06(d，J＝6.6Hz，3H)。LCMS：(M+H+)：497.3，纯度67.72％。
实例7. 1，7，14-三氧代-12，12-双((3-氧代-3-((3-(4-氨磺酰基苯甲酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(4-氨磺酰基苯基)-10-氧杂-2，6，13-三氮杂十八烷-18-酸的合成
Figure BPA0000295055720009191
步骤1.将3，3′-((2-氨基-2-((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)甲基)丙烷-1，3-二基)双(氧基))二丙酸二叔丁酯(4.0g，7.91mmol)和二氢-2H-吡喃-2，6(3H)-二酮(0.903g，7.91mmol)在THF(40mL)中的溶液在50℃下搅拌3小时并在rt下搅拌3小时。LC-MS显示出所希望的产物。将溶剂蒸发以给出5-((9-((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)甲基)-2，2，16，16-四甲基-4，14-二氧代-3，7，11，15-四氧杂十七碳烷-9-基)氨基)-5-氧代戊酸，将其不经纯化直接用于下一步骤。
步骤2.向5-((9-((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)甲基)-2，2，16，16-四甲基-4，14-二氧代-3，7，11，15-四氧杂十七烷-9-基)氨基)-5-氧代戊酸(4.90g，7.91mmol)及(溴甲基)苯(1.623g，9.49mmol)于DMF中的溶液中添加无水K2CO3(3.27g，23.73mmol)。将混合物在40℃下搅拌4小时并在室温下搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸发。将反应混合物用EtOAc稀释，用水洗涤，经无水硫酸钠干燥，在减压下浓缩，以给出残余物，将残余物通过ISCO纯化(用在己烷中的10％EtOAc至在己烷中的50％EtOAc洗脱)，以给出呈无色油状物的3，3′-((2-(5-(苄氧基)-5-氧代戊酰胺基)-2-((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)甲基)丙烷-1，3-二基)双(氧基))二丙酸二叔丁酯(5.43g，7.65mmol，产率97％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.41-7.28(m，5H)，6.10(s，1H)，5.12(s，2H)，3.72-3.60(m，12H)，2.50-2.38(m，8H)，2.22(t，J＝7.3Hz，2H)，1.95(p，J＝7.4Hz，2H)，1.45(s，27H)；MS(ESI)，710.5(M+H)+。
步骤3.将3，3′-((2-(5-(苄氧基)-5-氧代戊酰胺基)-2-((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)甲基)丙烷-1，3-二基)双(氧基))二丙酸二叔丁酯(5.43g，7.65mmol)在甲酸(50mL)中的溶液在室温下搅拌48小时。LC-MS显示反应不完全。将溶剂在减压下蒸发。将粗产物再溶解于甲酸(50mL)中并在室温下搅拌6小时。LC-MS显示反应完成。将溶剂在减压下蒸发，在减压下与甲苯(3X)共蒸发，并在真空下干燥，以给出呈白色固体的3，3′-((2-(5-(苄氧基)-5-氧代戊酰胺基)-2-((2-羧基乙氧基)甲基)丙烷-1，3-二基)双(氧基))二丙酸(4.22g，7.79mmol，产率100％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ12.11(s，3H)，7.41-7.27(m，5H)，6.97(s，1H)，5.07(s，2H)，3.55(d，J＝6.4Hz，6H)，2.40(t，J＝6.3Hz，6H)，2.37-2.26(m，2H)，2.08(t，J＝7.3Hz，2H)，1.70(p，J＝7.4Hz，2H)；MS(ESI)，542.3(M+H)+。
步骤4.在0℃下向3，3′-((2-(5-(苄氧基)-5-氧代戊酰胺基)-2-((2-羧基乙氧基)甲基)丙烷-1，3-二基)双(氧基))二丙酸(4.10g，7.57mmol)和HOBt(4.60g，34.1mmol)在DCM(60mL)和DMF(15mL)中的溶液中添加(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯(5.94g，34.1mmol)、EDAC HCl盐(6.53g，34.1mmol)和DIPEA(10.55ml，60.6mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟并在室温下搅拌20小时。LC-MS显示反应不完全。将EDAC HCl盐(2.0g)和(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯(1.0g)添加至反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌4小时。蒸发溶剂以给出残余物，将残余物溶于EtOAc(300mL)中，用水(1X)、饱和碳酸氢钠(2X)、10％柠檬酸(2X)和水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩，以给出残余物，将残余物通过ISCO(80g金筒)纯化(用DCM至在DCM中的30％MeOH洗脱)，以给出呈白色固体的15，15-双(13，13-二甲基-5，11-二氧代-2，12-二氧杂-6，10-二氮杂十四基)-2，2-二甲基-4，10，17-三氧代-3，13-二氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸苯甲酯5(6.99g，6.92mmol，产率91％)。1H NMR(500MHz，氯仿-d)δ7.35(t，J＝4.7Hz，5H)，6.89(s，3H)，6.44(s，1H)，5.22(d，J＝6.6Hz，3H)，5.12(s，2H)，3.71-3.62(m，12H)，3.29(q，J＝6.2Hz，6H)，3.14(q，J＝6.5Hz，6H)，2.43(dt，J＝27.0，6.7Hz，8H)，2.24(t，J＝7.2Hz，2H)，1.96(p，J＝7.5Hz，2H)，1.69-1.59(m，6H)，1.43(d，J＝5.8Hz，27H)；MS(ESI)：1011.5(M+H)+。
步骤5.向15，15-双(13，13-二甲基-5，11-二氧代-2，12-二氧杂-6，10-二氮杂十四基)-2，2-二甲基-4，10，17-三氧代-3，13-二氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸苯甲酯(1.84g，1.821mmol)在DCM(40mL)中的溶液中添加2，2，2-三氟乙酸(7.02ml，91mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发，以给出呈无色油状物的5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氮杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯。MS(ESI)，710.6(M+H)+。
步骤6.向4-氨磺酰基苯甲酸(1.466g，7.28mmol)和HATU(2.77g，7.28mmol)在DCM(40mL)中的溶液中，然后是在DMF(4.0mL)中的5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯(1.293g，1.821mmol)。将混合物在室温下搅拌5hr。将溶剂在减压下蒸发以给出残余物，将残余物通过ISCO(40g金柱)(用DCM至在DCM中的50％MeOH洗脱)纯化以给出1，7，14-三氧代-12，12-双((3-氧代-3-((3-(4-氨磺酰基苯甲酰胺基)丙基)氨基)-丙氧基)甲基)-1-(4-氨磺酰基苯基)-10-氧杂-2，6，13-三氮杂十八烷-18-酸苯甲酯(0.36g，0.286mmol，16％产率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.60(t，J＝5.6Hz，3H)，7.96-7.81(m，15H)，7.44(s，6H)，7.35-7.23(m，5H)，7.04(s，1H)，5.02(s，2H)，3.50(t，J＝6.9Hz，6H)，3.48(s，6H)，3.23(q，J＝6.6Hz，6H)，3.06(q，J＝6.6Hz，6H)，，2.29(t，J＝7.4Hz，2H)，2.24(t，J＝6.5Hz，6H)，2.06(t，J＝7.4Hz，2H)，1.69-1.57(m，8H)。
步骤7.向用Ar冲洗的圆底烧瓶中添加10％Pd/C(80mg，0.286mmol)和EtOAc(15mL)。添加1，7，14-三氧代-12，12-双((3-氧代-3-((3-(4-氨磺酰基苯甲酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(4-氨磺酰基苯基)-10-氧杂-2，6，13-三氮杂十八烷-18-酸苯甲酯(360mg)在甲醇(15mL)中的溶液，然后滴加二乙基(甲基)硅烷(0.585g，5.72mmol)。将混合物在室温下搅拌3hr。LC-MS显示反应完成，用EtOAc稀释，并通过硅藻土过滤，用在EtOAc中的20％MeOH洗涤，在减压下浓缩以给出呈白色固体的1，7，14-三氧代-12，12-双((3-氧代-3-((3-(4-氨磺酰基苯甲酰胺基)丙基)-氨基)丙氧基)甲基)-1-(4-氨磺酰基苯基)-10-氧杂-2，6，13-三氮杂十八烷-18-酸(360mg，100％产率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.60(t，J＝5.6Hz，3H)，7.94-7.81(m，15H)，7.44(s，6H)，7.04(s，1H)，3.50(t，J＝6.9Hz，6H)，3.48(s，6H)，3.23(q，J＝6.6Hz，6H)，3.06(q，J＝6.6Hz，6H)，，2.24(t，J＝6.4Hz，6H)，2.14(t，J＝7.5Hz，2H)，2.05(t，J＝7.4Hz，2H)，1.66-1.57(m，8H)；MS(ESI)，1170.4(M+H)+。
实例8. 2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-氧代-4-((4-氨磺酰基苯乙基)氨基)丁酸酯的合成
Figure BPA0000295055720009221
步骤1.将4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺(20g，99.87mmol)、四氢呋喃-2，5-二酮(9.99g，99.87mmol)在THF(200mL)中的溶液在60℃下搅拌16hr。将反应混合物用HCl(水性，1M，100mL)稀释并用EtOAc(200mL*3)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL*2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以给出呈白色固体的4-氧代-4-((4-氨磺酰基苯乙基)氨基)丁酸(17g，55.60mmol，55.67％产率，98.228％纯度)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝7.94(t，J＝5.7Hz，1H)，7.72(d，J＝7.9Hz，2H)，7.37(d，J＝8.3Hz，2H)，3.30-3.20(m，2H)，2.75(t，J＝7.2Hz，2H)，2.53-2.44(m，4H)，2.44-2.35(m，3H)，2.32-2.23(m，2H)。LCMS：(M+H+)：301.1。
步骤2.在0℃-5℃下，向4-氧代-4-((4-氨磺酰基苯乙基)氨基)丁酸(17g，56.60mmol)和HOSu(10.42g，90.57mmol)在DMF(200mL)中的溶液中添加DCC(18.69g，90.57mmol，18.32mL)。将混合物在0-5℃下搅拌16hr。LCMS显示反应未完成。将混合物在15℃下搅拌16hr。LCMS显示反应完成，并且检测到具有所希望的MS的一个主峰。过滤N，N′-二环己基脲(DCU)的白色悬浮液，并除去白色固体。将滤液浓缩成油状物。将该粗产物用热2-丙醇(60mL*3)洗涤，提供灰白色固体。向粗产物中添加THF(100mL)，并添加石油醚(50mL)并搅拌30min，然后过滤以给出呈白色固体的2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-氧代-4-((4-氨磺酰基苯乙基)氨基)丁酸酯(8g，16.58mmol，29.29％产率，82.36％纯度)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝8.12-7.96(m，1H)，7.71(br d，J＝7.9Hz，2H)，7.37(br d，J＝8.2Hz，2H)，3.58(br t，J＝6.7Hz，1H)，3.30-3.21(m，2H)，2.89-2.70(m，8H)，2.58(s，1H)，2.42(br t，J＝6.7Hz，2H)；LCMS：(M+H+))：398.0，LCMS纯度：82.36％。
实例9. 4-氧代-4-((4-氨磺酰基苯基)氨基)丁酸的合成
Figure BPA0000295055720009222
向4-氨基苯磺酰胺(2.0g，11.61mmol)和四氢呋喃-2，5-二酮(1.16g，11.61mmol)的固体试剂中添加THF(30mL)。将反应混合物在60℃下搅拌4hr，并且沉淀出白色固体。将反应混合物冷却至室温，并过滤，以给出白色固体。将白色固体真空干燥以给出4-氧代-4-(4-氨磺酰基苯胺)丁酸(2.115g，67％产率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.31(s，1H)，7.74(s，4H)，7.23(s，2H)，2.65-2.51(m，4H)。
实例10. 3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙基硬脂酸酯的合成
Figure BPA0000295055720009231
步骤1.将丙烷-1，3-二醇(9.80g，128.75mmol，9.33mL)、吡啶(2.61g，33.01mmol，2.66mL)在CHCl3(50mL)中的混合物脱气并用N2吹扫3次，并且然后在0℃下向混合物中滴加在CHCl3(50mL)中的硬脂酰氯(10g，33.01mmol)并在N2气氛下在20℃下搅拌20hr。将混合物用EtOAc(50mL*2)萃取并将合并的有机层用1N HCl(50mL*2)、水性NaHCO3(50mL*2)、H2O(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO2，乙酸乙酯/石油醚＝2％，12.5％)纯化以提供呈白色胶质的3-羟基丙基硬脂酸酯(9g)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝4.24(t，J＝6.06Hz，2H)，3.69(t，J＝5.95Hz，2H)，2.31(t，J＝7.50Hz，2H)，1.87(q，J＝6.06Hz，2H)，1.56-1.68(m，2H)，1.22-1.31(m，24H)，0.88(t，J＝6.73Hz，3H)；TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)Rf＝0.54。
步骤2.向3-羟基丙基硬脂酸酯(9g，26.27mmol)、TEA(3.99g，39.41mmol，5.49mL)在DCM(160mL)中的混合物中滴加4-硝基苯基氯甲酸酯(6.35g，31.53mmol)在DCM(20mL)中的溶液，然后脱气并在0℃下用N2吹扫3次，并然后将混合物在N2气氛下在20℃下搅拌16hr。TLC指示化合物被完全消耗，并形成许多新斑点。根据TLC，反应是干净的。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂。将残余物通过柱色谱法(SiO2，乙酸乙酯/石油醚＝0％，5％)纯化以提供呈灰白色固体的3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙基硬脂酸酯(5.73g，11.29mmol，42.96％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.29(d，J＝9.21Hz，2H)，7.39(d，J＝9.21Hz，2H)，4.39(t，J＝6.36Hz，2H)，4.24(t，J＝6.14Hz，2H)，2.32(t，J＝7.45Hz，2H)，2.11(t，J＝6.36Hz，2H)，1.57-1.68(m，2H)，1.21-1.32(m，28H)，0.88(t，J＝6.80Hz，3H)；13C NMR(101MHz，氯仿-d)δ＝173.73，155.44，152.40，145.37，125.30，121.74，66.00，60.22，34.21，31.91，29.68，29.67，29.64，29.60，29.30，27.92，24.91，22.69，14.12；TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)Rf＝0.72。
实例11.(R)-3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙烷-1，2-二基二(十二酸)酯的合成
Figure BPA0000295055720009241
在室温下向4-硝基苯基氯甲酸酯(69.51mg，0.34mmol)在THF(3.0ml)中的溶液中添加(S)-3-羟基丙烷-1，2-二基二(十二酸)酯(1，2-甘油二月桂酸酯)和DIPEA(0.11ml，0.66mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3hr。将溶剂在减压下蒸发，用EtOAc稀释，用水洗涤，经硫酸钠干燥，浓缩以给出所希望的产物(R)-3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙烷-1，2-二基二(十二酸)酯(204mg，100％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.22(d，J＝8.9Hz，2H)，7.32(d，J＝8.9Hz，2H)，5.32-.528(m，1H)，4.34-4.09(m，4H)，2.31-2.23(m，4H)，1.58-0.79(m，42H)。
实例12. 4，10，17-三氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-13-氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸的合成
Figure BPA0000295055720009251
步骤1：向15，15-双(13，13-二甲基-5，11-二氧代-2，12-二氧杂-6，10-二氮杂十四基)-2，2-二甲基-4，10，17-三氧代-3，13-二氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸苯甲酯(0.95g，0.940mmol)在DCM(5mL)中的溶液中添加TFA(5mL)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。LC-MS显示反应完成。将溶剂在减压下蒸发，以给出呈无色油状物的5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氮杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯。将其不经纯化直接用于下一步骤。
步骤2：向5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯(0.46mmol)在DCM(6mL)中的溶液中添加HOBt(62.16mg，0.46mmol)、HBTU(558.24mg，1.47mmol)、DIPEA(1.2mL，6.9mmol)以及4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酸(1.10g，1.61mmol)在乙腈(5mL)中的溶液。将反应混合物在rt下搅拌3hr。将溶剂在减压下蒸发以给出残余物，将残余物用EtOAc稀释，用水洗涤，经无水硫酸钠干燥以给出残余物，将残余物通过ISCO(24g金柱)(用DCM至在DCM中的20％洗脱)纯化以给出4，10，17-三氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-13-氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-烯酸苯甲酯(1.14g，91.7％)。MS(ESI)，1353.6((M/2+H)+。
步骤3.向4，10，17-三氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-13-氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-烯酸苯甲酯(1.09g，0.400mmol)在EtOAc(50mL)中的溶液中添加10％Pd-C(200mg)。将反应混合物在氢气球下在rt搅拌4hr。LC-MS显示反应未完成。将反应混合物添加到另外的10％Pd-C(300mg)中并氢气球下在室温下搅拌24hr。将反应混合物过滤，用EtOAc/MeOH洗涤，浓缩以给出4，10，17-三氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-13-氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸(1.055g，100％)。MS(ESI)，1308.1((M/2+H)+。
实例13. 5-(4-(4，6-双((3，9，13，20，26-五氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-29-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-17-氧杂-4，8，14，21，25-五氮杂二十九烷基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸的合成
Figure BPA0000295055720009261
Figure BPA0000295055720009271
步骤1至2。向在THF(30mL)中的固体试剂2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪(0.500g，2.71mmol)中添加3-氨基丙酸叔丁酯HCl盐(0.985g，5.42mmol)和DIPEA(2.36ml，13.56mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。LC-MS显示所希望的产物；MS(ESI)：402.4(M+H)+。将溶剂在减压下蒸发以给出残余物，将其直接用于下一步。向3，3′-((6-氯-1，3，5-三嗪-2，4-二基)双(氮亚烷基))二丙酸二叔丁酯(1.052g，2.71mmol)在乙腈(50mL)中的溶液中添加5-氧代-5-(哌嗪-1-基)戊酸苯甲酯(1.103g，3.80mmol)和K2CO3(2.248g，16.27mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜并在50℃下搅拌。用EtOAc稀释，过滤并在减压下浓缩以给出残余物，将该残余物通过ISCO(40g金)(用在己烷中的20％EtOAc至在己烷中的50％EtOAc洗脱)纯化以给出呈白色固体的3，3′-((6-(4-(5-(苄基氧基)-5-氧代正戊酰基)哌嗪-1-基)-1，3，5-三嗪-2，4-二基)双(氮亚烷基))二丙酸二叔丁酯(1.13g，64％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.43-7.30(m，5H)，5.15(s，2H)，3.75(brs，4H)，3.63(brs，6H)，3.43(brs，2H)，2.51(q，J＝7.0，6.5Hz，6H)，2.42(t，J＝7.4Hz，2H)，2.09-1.96(m，2H)，1.48(s，18H)；MS(ESI)：656.6(M+H)+。
步骤3.将3，3′-((6-(4-(5-(苄基氧基)-5-氧代正戊酰基)哌嗪-1-基)-1，3，5-三嗪-2，4-二基)双(氮亚烷基))二丙酸二叔丁酯(1.10g，1.68mmol)在甲酸(20mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。LC-MS显示反应未完成并且溶剂被蒸发。将甲酸(20mL)添加至反应混合物中并将反应混合物在室温下搅拌5hr。LC-MS显示反应完成。将溶剂浓缩，与甲苯(2X)共蒸发并真空干燥过夜以给出呈白色固体的3，3′-((6-(4-(5-(苯甲氧基)-5-氧代正戊酰基)哌嗪-1-基)-1，3，5-三嗪-2，4-二基)双(氮亚烷基))二丙酸(0.91g，100％产率)。MS(ESI)，544.2(M+H)+。
步骤4.向在0℃下的3，3′-((6-(4-(5-(苄基氧基)-5-氧代正戊酰基)哌嗪-1-基)-1，3，5-三嗪-2，4-二基)双(氮亚烷基))二丙酸(0.91g，1.68mmol)和HOBt(0.76g，4.36mmol)在DCM(30mL)和DMF(3mL)中的溶液中添加(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯(0.840g，4.36mmol)、EDC HCl盐(0.836g，4.36mmol)和DIPEA(1.460ml，8.39mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟并在室温下搅拌20hr。蒸发溶剂以给出残余物，将残余物溶于EtOAc(300mL)中，用水(1X)、饱和碳酸氢钠(2X)、10％柠檬酸(2X)和水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩，以给出残余物，将残余物通过ISCO(80g金筒)纯化(用DCM至在DCM中的30％MeOH洗脱)，以给出呈白色固体的5-(4-(4，6-双((3-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸苯甲酯(1.11g，77％产率)。MS(ESI)：857.5(M+H)+。
步骤5.向5-(4-(4，6-双((3-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸苯甲酯(75.93mg，0.090mmol)在DCM(3mL)中的溶液中添加TFA(0.5mL)。将反应混合物在室温搅拌3hr。在减压下蒸发溶剂，无需纯化即可直接用于下一步。MS(ESI)：656.3(M+H)+。
步骤6.向4，10，17-三氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-13-氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸(580mg，0.222mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加HBTU(84.1mg，0.220mmol)、HOBt(11.99mg，0.09mmol)和DIPEA(0.15ml，0.890mmol)。将反应混合物在rt下搅拌5分钟并将5-(4-(4，6-双((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸苯甲酯TFA盐(0.090mmol)在乙腈中的溶液添加至反应混合物中。将反应混合物在rt下搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸发以给出残余物，将该残余物通过ISCO(24g金)纯化(用DCM至在DCM中的40％MeOH洗脱)以给出5-(4-(4，6-双((3，9，13，20，26-五氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-29-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-17-氧杂-4，8，14，21，25-五氮杂二十九烷基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸苯甲酯(300mg，57.8％)。MS(ESI)，1950.6((M/3+H)+。
步骤7.向5-(4-(4，6-双((3，9，13，20，26-五氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-29-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-17-氧杂-4，8，14，21，25-五氮杂二十九烷基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸苯甲酯(300mg，0.05mmol)在EtOAc(10ml)中的溶液中添加10％Pd-C(100mg)。将反应混合物在氢气球下在rt下搅拌过夜。LC-MS显示反应未完成。向反应混合物中添加MeOH(1mL)和三乙基硅烷(2mL)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。LC-MS显示所希望的产物。将反应混合物过滤，用EtOAc/MeOH洗涤，并在减压下浓缩以给出残余物，将该残余物通过ISCO(50g C18筒)纯化(用1％TFA水溶液至100％乙腈洗脱)并冻干以给出呈白色固体的5-(4-(4，6-双((3，9，13，20，26-五氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-29-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-17-氧杂-4，8，14，21，25-五氮杂二十九烷基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸(120mg，40.6％产率)。MS(ESI)，1920((M/3+H)+。
实例14. 5-(4-(4，6-双((3，9，13，20，26-五氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-30-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-17-氧杂-4，8，14，21，25-五氮杂三十烷基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸的合成
Figure BPA0000295055720009301
Figure BPA0000295055720009311
步骤1.向5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酸(2.43g，5.43mmol)在DCM中的溶液中添加HBTU(2.06g，5.43mmol)、HOBt(183.36mg，1.36mmol)和DIPEA(4.73ml，27.14mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟并添加5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯TFA盐(1.36mmol)在乙腈中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌3小时。将溶剂在减压下浓缩，以给出残余物，将残余物通过ISCO(80g金筒)纯化(用在DCM中的5％MeOH至在DCM中的60％MeOH洗脱)，以给出5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酸苯甲酯(2.22g，81.8％)。MS(ESI)：1002(M/2+H)+。
步骤2.向5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酸苯甲酯(2.20g，1.1mmol)在EtOAc(30mL)和MeOH(3mL)中的溶液中缓慢添加10％Pd-C(300mg)和三乙基硅烷(1.8mL，11.3mmol)。将反应混合物在室温搅拌1hr。将反应混合物通过硅藻土过滤并浓缩以给出5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酸。MS(ESI)，1912(M+H)+。
步骤3.向5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酸(1911mg，0.580mmol)在DCM(30mL)中的溶液中添加HBTU(266mg，0.700mmol)、HOBt(31.56mg，0.23mmol)和DIPEA(0.81ml，4.67mmol)。将反应混合物在rt下搅拌10分钟并将5-(4-(4，6-双((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸苯甲酯TFA盐(0.23mmol)在乙腈(5mL)中的溶液添加至反应混合物中。将反应混合物在rt下搅拌3hr。将溶剂在减压下蒸发以给出残余物，将该残余物通过ISCO(24g金)纯化(用DCM至在DCM中的50％MeOH洗脱)以给出5-(4-(4，6-双((3，9，13，20，26-五氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-30-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-17-氧杂-4，8，14，21，25-五氮杂三十烷基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸苯甲酯(430mg，41.4％)。MS(ESI)，1482.1(M/3+H)+。
步骤4.向5-(4-(4，6-双((3，9，13，20，26-五氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-30-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-17-氧杂-4，8，14，21，25-五氮杂三十烷基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸苯甲酯(420mg，0.090mmol)在EtOAc(15mL)和MeOH(2mL)中的溶液中添加10％Pd-C(200mg)。将反应混合物在氢气球下在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过硅藻土过滤，用在EtOAc中的50％MeOH洗涤，并在减压下浓缩以给出5-(4-(4，6-双((3，9，13，20，26-五氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-30-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-17-氧杂-4，8，14，21，25-五氮杂三十烷基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸。MS(ESI)，1452.0(M/3+H)+。
实例15. 3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙基(4E，8E，12E，16E)-4，8，13，17，21-五甲基二十二碳-4，8，12，16，20-五烯酸酯的合成
Figure BPA0000295055720009331
步骤1.向喇叭藻酸(2.00g，4.992mmol)在DCM(20mL)中的溶液中添加1，3-丙二醇(1.8mL，24.96mmol)、EDC(1.91g，9.984mmol)和DMAP(30.5mg)。将反应混合物在rt下搅拌5hr。LC-MS显示反应完成。将反应混合物浓缩，用EtOAc(100mL)稀释，依次用1N HC水溶液(20ml)、饱和NaHCO3水溶液(20mL)、水(10mL)和盐水(5mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩以给出残余物，将残余物通过ISCO(40g金筒)(使用在己烷中的0-100％EtOAc作为梯度)纯化以给出3-羟基丙基(4E，8E，12E，16E)-4，8，13，17，21-五甲基二十二碳-4，8，12，16，20-五烯酸酯(1.129g，49％产率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ5.15-5.02(m，5H)，4.46(t，J＝5.1Hz，1H)，4.06(t，J＝6.6Hz，2H)，3.45(td，J＝6.3，5.1Hz，2H)，2.40-2.31(m，2H)，2.20(t，J＝7.6Hz，2H)，2.08-1.90(m，16H)，1.70(p，J＝6.4Hz，2H)，1.64(d，J＝1.5Hz，3H)，1.56(m，15H)；MS(ESI)，481.3(M+Na)+。
步骤2.向在0℃下的3-羟基丙基(4E，8E，12E，16E)-4，8，13，17，21-五甲基二十二碳-4，8，12，16，20-五烯酸酯(1.12g，2.4416mmol)在无水DCM(12.5mL)中的溶液中添加TEA(0.68mL)，并缓慢添加4-硝基苯基氯甲酸酯(C738mg)在无水DCM(5ml)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌40min，并在室温下搅拌过夜。将反应混合物浓缩以给出残余物，将残余物通过ISCO(40金筒)(用在己烷中的0-50％EtOAc洗脱)纯化以给出3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙基(4E，8E，12E，16E)-4，8，13，17，21-五甲基二十二碳-4，8，12，16，20-五烯酸酯(1.06g，70％产率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.34-8.29(m，2H)，7.58-7.51(m，2H)，5.13-5.01(m，5H)，4.32(t，J＝6.3Hz，2H)，4.13(t，J＝6.3Hz，2H)，2.44-2.34(m，2H)，2.21(t，J＝7.6Hz，2H)，2.07-1.87(m，18H)，1.63(d，J＝1.5Hz，3H)，1.55(m，15H)。
实例16.某些化学部分以及包含某些化学部分的寡核苷酸的制备。
在一些实施例中，本披露提供了可以并入寡核苷酸的化学部分。在一些实施例中，化学部分是靶向部分。在一些实施例中，化学部分是碳水化合物部分。在一些实施例中，化学部分是脂质部分。在一些实施例中，可将化学部分并入寡核苷酸中以改善一种或多种特性、活性和/或递送。在本实例中描述了某些化学部分，它们的制备以及包含此类部分的寡核苷酸。本领域技术人员能理解的是，这样的化学部分也可以并入具有其他碱基序列、修饰等的寡核苷酸中。
3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸的合成
Figure BPA0000295055720009341
步骤1.在0℃下向15，15-双(13，13-二甲基-5，11-二氧代-2，12-二氧杂-6，10-二氮杂十四基)-2，2-二甲基-4，10，17-三氧代-3，13-二氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸苯甲酯(9.0g，8.91mmol)在DCM(100mL)中的溶液中添加TFA(30.47g，267.27mmol，19.79mL)。将混合物在0-15℃下搅拌4hr。使混合物形成两个相。分离下层相，并减压浓缩，以给出粗品。获得呈黄色油状物的5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯TFA盐(13g)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)位移＝7.39-7.27(m，5H)，5.12(s，2H)，3.70-3.63(m，13H)，3.32-3.30(m，2H)，3.26(s，2H)，2.94(t，J＝7.3Hz，7H)，2.49-2.38(m，9H)，2.23(t，J＝7.4Hz，2H)，1.94-1.78(m，9H)。LCMS：M+H+＝710.2。
步骤2.向5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯TFA盐(13g)在DCM(200mL)中的溶液中添加DIPEA(15.97g，123.58mmol，21.53mL)和HATU(15.51g，40.78mmol)。将混合物在15℃搅拌15hr。LCMS显示化合物2被消耗并且检测到所希望的的MS。将混合物在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过制备型HPLC(柱：Agela innovalods-2 250*80mm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：8％-38％，20min)纯化以给出呈棕色油状物的化合物3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸苯甲酯(6.5g，52.37％产率)。LCMS：M/2+H+＝503.1。
步骤3.向化合物3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸苯甲酯(5.7g，5.68mmol)在MeOH(30mL)和H2O(6mL)中的溶液中添加LiOH.H2O(1.67g，39.73mmol)。将混合物在15℃下搅拌2hr。LCMS显示化合物3被消耗并且检测到所希望的的MS。将混合物在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex luna C18 250*50mm*10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-25％，20min)纯化。获得呈黄色胶质的3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸(2.09g，2.25mmol，40％产率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)位移＝8.07(br t，J＝5.7Hz，3H)，7.75(br t，J＝5.0Hz，3H)，7.08(s，1H)，3.63-3.45(m，12H)，3.09(q，J＝6.1Hz，11H)，2.88(br d，J＝15.3Hz，36H)，2.29(br t，J＝6.4Hz，6H)，2.18(t，J＝7.5Hz，2H)，2.12-2.06(m，2H)，1.65(br t，J＝6.6Hz，8H)。13CNMR(101MHz，DMSO-d6)位移＝173.10，170.88，169.27，159.88，157.61，157.27，156.93，156.58，119.48，116.56，113.63，110.70，67.13，66.27，58.46，40.77，34.82，34.34，33.88，31.87，28.23，19.66，0.00.LCMS：M+H+＝915.7，纯度：98.265％。
5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酸的合成
Figure BPA0000295055720009361
步骤1.将苯基甲醇(864.10g，7.99mol)、化合物1(100g，998.85mmol)和阳离子交换树脂(1.92g，998.85mmol.)的混合物在75℃下伴随N2搅拌4hr，并然后将混合物在N2气氛下在20℃搅拌12hr。TLC显示化合物1被完全消耗，并检测到两个主峰。将反应混合物过滤，然后将残余物用DCM(500mL)洗涤。将反应混合物在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至3∶1)纯化以得到呈无色油状物的化合物2(62g，29.81％产率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.41-7.27(m，5H)，5.11(s，2H)，3.62(t，J＝6.4Hz，2H)，2.39(t，J＝7.3Hz，2H)，1.77-1.70(m，2H)，1.65-1.51(m，2H)；TLC(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)Rf＝0.20。
步骤2.向化合物3(350g，896.66mmol.)在DMF(2L)中的溶液中添加乙酸肼(99.10g，1.08mol)。将混合物在60℃下搅拌5hr。TLC显示起始材料已消耗。将混合物浓缩以去除大多数溶剂并添加水(500mL)，并将混合物用EtOAc(500mL*3)萃取。将合并的有机物经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩以得到棕色油状物的化合物4(310g，粗品)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.49(t，J＝9.9Hz，1H)，5.39(d，J＝3.5Hz，1H)，5.06-4.99(m，1H)，4.84(dd，J＝3.5，10.1Hz，1H)，4.25-4.17(m，2H)，4.13-4.02(m，2H)，2.04-1.96(m，12H)；TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1∶1)，Rf＝0.43。
步骤3.在0℃下，向化合物4(310g，890.03mmol.)在DCM(1.5L)中的溶液中添加2，2，2-三氯乙腈(1.16kg，8.01mol)。向混合物中滴加DBU(271.00g，1.78mol)，在0℃下溶于DCM(1L)。将混合物在20℃下搅拌1h。TLC显示起始材料已消耗。浓缩混合物以得到粗品。将混合物通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝20∶1、10∶1、5∶1)纯化以获得呈黄色油状物的化合物5(90g，20.52％产率)。1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.70(s，1H)，6.56(br d，J＝3.1Hz，1H)，5.57(t，J＝9.8Hz，1H)，5.24-5.08(m，2H)，4.35-4.15(m，2H)，2.11-1.99(m，12H)；TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1∶1)Rf＝0.31。
步骤4.向化合物5(89.5g，181.66mmol)和化合物2(75.66g，363.31mmol)在DCM(800mL)中的溶液中添加4AMS(90g)，将混合物在-30℃下搅拌30min。将TMSOTf(40.37g，181.66mmol.)添加至反应中并将混合物在25℃下搅拌3hr。LCMS和TLC显示起始材料已被消耗，并且LCMS显示发现了de-Ac MS。添加饱和NaHCO3(水性，100mL)并将混合物用DCM(150mL*3)萃取。将合并的有机物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到粗品。总计获得呈黄色油状物的苄基化合物6和化合物6A(98g)的混合物，将混合物直接用于下一步骤。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝2∶1)Rf＝0.38。
步骤5.将混合物化合物6和化合物6A(98g粗品)溶于吡啶(150mL)中并然后添加Ac2O(150mL)。将混合物在20℃下搅拌12h。TLC显示起始材料已消耗。浓缩混合物以得到粗品。将混合物通过MPLC(二氧化硅，石油醚/乙酸乙酯＝20∶1、10∶1、05∶1)纯化以得到呈黄色油状物的化合物6(41g，41.84％产率)和12g粗品。1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.39-7.31(m，5H)，5.23-4.93(m，3H)，4.48(d，J＝7.9Hz，1H)，4.37-4.22(m，1H)，4.17-4.05(m，1H)，3.92-3.81(m，1H)，3.71-3.63(m，1H)，3.48(td，J＝6.3，9.8Hz，1H)，2.44-2.32(m，2H)，2.09-1.98(m，12H)，1.75-1.53(m，4H)；LCMS：(M+Na+)：561.0；SFC：de％：100％；TLC(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)Rf＝0.14。
步骤6.在N2气氛下，向化合物7(19.5g，36.21mmol)在EtOAc(200mL)中的溶液中添加Pd/C(4g，17.64mmol，10％纯度)。将悬浮液脱气并用H2吹扫3次。将混合物在H2(25Psi)下在20℃搅拌2hr。LCMS和TLC显示起始材料已消耗。将混合物过滤，将滤饼用MeOH(50mL*3)洗涤并将合并的滤液浓缩以得到粗品。将混合物通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1、1∶1、1∶3)纯化以获得呈白色固体的5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酸7(23.9g，51.72mmol，71.41％产率，97.03％LCMS纯度)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.24-5.17(m，1H)，5.12-4.96(m，2H)，4.50(d，J＝7.9Hz，1H)，4.26(dd，J＝4.7，12.3Hz，1H)，4.20-4.02(m，1H)，3.95-3.85(m，1H)，3.75-3.64(m，1H)，3.55-3.46(m，1H)，2.42-2.32(m，2H)，2.15-1.99(m，12H)，1.76-1.57(m，4H)；13CNMR(101MHz，氯仿-d)：δ＝178.85，170.71，170.30，169.40，169.35，100.71，72.81，71.74，71.25，69.37，68.42，61.94，33.36，28.59，21.09，20.70，20.56；LCMS：(M-H+)：447.1，LCMS纯度：97.03％；TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1∶1)Rf＝0.03。
5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酸的合成
Figure BPA0000295055720009381
Figure BPA0000295055720009391
步骤1：向15，15-双(13，13-二甲基-5，11-二氧代-2，12-二氧杂-6，10-二氮杂十四基)-2，2-二甲基-4，10，17-三氧代-3，13-二氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸苯甲酯(2.15g，2.1282mmol)在DCM(20mL)中的溶液中添加TFA(5mL)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。LC-MS显示反应完成。将溶剂在减压下蒸发，以给出呈无色油状物的5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氮杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯。将其不经纯化直接用于下一步骤。
步骤2：向5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酸(3.817g，8.51mmol)在DMF(20mL)中的溶液中添加DIPEA(5.66mL，31.92mmol)和HATU(2.824g，7.45mmol)，然后添加5-((1，19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5，15-二氧代-8，12-二氧杂-4，16-二氧杂十九烷-10-基)氨基)-5-氧代戊酸苯甲酯(2.1282mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。将溶剂在减压下蒸发，以给出残余物，将残余物通过ISCO(120g金柱)纯化(用DCM至在DCM中的50％MeOH洗脱)，以给出含有一些杂质的5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酸苯甲酯(5.08g，120％)。MS(ESI)，1001.4((M/2+H)+。
步骤3.向5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酸苯甲酯(5.08g)在EtOAc(100mL)和MeOH(10mL)中的溶液中添加10％Pd-C(500mg)。将反应混合物在氢气球下在rt搅拌4hr。LC-MS显示反应完成。将反应混合物过滤，用EtOAc/MeOH洗涤，浓缩以给出45，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酸(4.60g，95％)。MS(ESI)，1912((M+H)+。
(S)-5，11，18，22-四氧代-16，16-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-28-(5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酰胺基)-14-氧杂-6，10，17，23-四氮杂二十九烷-29-酸的合成
Figure BPA0000295055720009411
步骤1：向5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酸(987mg，0.520mmol)在乙腈(3mL)和DCM(10ml)中的溶液中添加DIPEA(0.27mL，1.55mmol)和HATU(150mg，0.400mmol)，然后添加L-赖氨酸苯甲酯二-4-甲苯磺酸盐(100mg，0.170mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂以给出残余物，将残余物通过ISCO(40g金柱)(用DCM至在DCM中的30％MeOH洗脱)纯化以给出(S)-5，11，18，22-四氧代-16，16-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-28-(5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酰胺基)-14-氧杂-6，10，17，23-四氮杂二十九烷-29-酸苯甲酯(433mg，63％)，其含有一些杂质。MS(ESI)，1342.0((M/3+H)+。
步骤3.向(S)-5，11，18，22-四氧代-16，16-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-28-(5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酰胺基)-14-氧杂-6，10，17，23-四氮杂二十九烷-29-酸苯甲酯(430mg)在EtOAc(15mL)和MeOH(3mL)中的溶液中添加10％Pd-C(100mg)。将反应混合物在氢气球下在rt搅拌4hr。LC-MS显示反应完成。将反应混合物过滤，用EtOAc/MeOH洗涤，浓缩以给出(S)-5，11，18，22-四氧代-16，16-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-28-(5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酰胺基)-14-氧杂-6，10，17，23-四氮杂二十九烷-29-酸(400mg，94％)。MS(ESI)，1968((M/2+H)+。
WV-12567的合成
Figure BPA0000295055720009431
向WV-12566在0.4ml NMP和0.57ml水中的溶液中添加DIPEA(20μL)，并添加3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙基(4E，8E，12E，16E)-4，8，13，17，21-五甲基二十二碳-4，8，12，16，20-五烯酸酯(20mg)在NMP(0.40mL)中的溶液。将反应混合物在35℃下摇动12小时。MS显示起始材料已消失。将粗产物在RP HPLC(C8)(使用在水中的50mM TEAA和乙腈)上纯化，并脱盐以获得1.77mg的缀合物WV-12567。去卷积质量：7362；计算的分子量：7360。
WV-12570的合成
Figure BPA0000295055720009432
向(4E，8E，12E，16E)-4，8，13，17，21-五甲基二十二碳-4，8，12，16，20-戊烯酸(喇叭藻酸)(6.4mg，16μmol)和HATU(5.4mg，14.4μmol)的溶液中添加DIPEA(17μL)。将混合物在rt下摇动30min。将反应混合物添加到WV 12569(12.4mg，1.6μmol)在水(0.20mL)和NMP(0.20ml)中的溶液中并在35℃下搅拌2hr。MS显示起始材料已消失。将粗产物在RP(C-8)HPLC(使用在水中的50mM TEAA和乙腈)上纯化，并脱盐以获得2.10mg的缀合物WV-12570。去卷积质量：8172；计算的分子量：8170。
WV-14333的合成
Figure BPA0000295055720009441
向4，10，17-三氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-13-氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸(25.4mg，9.72μmol)在乙腈(0.50mL)中的溶液中添加HATU(3.32mg，8.75μmol)和DIPEA(8.5μL)。将反应混合物在室温搅拌30分钟。将反应混合物添加至WV-12566(16.7mg，2.43μmol)在0.5mL水中的溶液中。将反应混合物在30℃下搅拌2hr，并且LC-MS显示反应完成。将反应混合物转移到压力管中，并添加4ml 28％-30％氢氧化铵。将反应混合物在35℃下搅拌过夜。LC-MS显示反应完全脱保护。将粗产物通过ISCO(经由30g C18筒，用50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得12.8mg的缀合物WV-14333。去卷积质量：8224；计算的分子量：8221。
WV-14332的合成
Figure BPA0000295055720009442
将4-硝基苯基(2，5，7，8-四甲基-2-(4，8，12-三甲基十三烷基)苯并二氢吡喃-6-基)碳酸酯(7.24mg，12.15μmol)和DIPEA(8.50μL)在NMP(0.20ml)中的溶液添加至WV-12566(16.7mg，2.43μmol)在0.5ml DMSO和0.05mL水中的溶液中。将反应混合物在40℃下摇动3小时。LC-MS显示反应非常干净。将粗产物冻干，在RP(C-8)HPLC(使用在水中的50mM TEAA和乙腈)上纯化，并脱盐以获得10mg的缀合物WV-14332。去卷积质量：7335；计算的分子量：7334。
WV-14346的合成
Figure BPA0000295055720009451
向3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸(75.26mg，82.34μmol)在DMF(1.0mL)中的溶液中添加DIPEA(123μL，0.823mmol)和HATU(28.1mg，74.12μmol)。将反应混合物在室温搅拌15分钟。将反应混合物添加至WV-12566(113.22mg，16.47μmol)在1.50ml DMSO和0.50mL水中的溶液中。将反应混合物在rt下摇动2小时。LC-MS显示反应完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得84.3mg的缀合物WV-14346。去卷积质量：7772；计算的分子量：7771。
WV-14335的合成
Figure BPA0000295055720009461
步骤1.将3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸-OSu(9.08mg)在DMF(1.0mL)中的溶液添加至WV-12566(100mg，14.54)在1.5ml 0.5M磷酸钠缓冲液(pH＝8)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌1hr。LC-MS显示反应完成。用水稀释，冻干以给出所希望的产物。
WV-14335的合成
步骤1.将3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸-OSu(9.08mg)在DMF(1.0mL)中的溶液添加至WV-12566(100mg，14.54)在1.5ml 0.5M磷酸钠缓冲液(pH＝8)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌1hr。LC-MS显示反应完成。用水稀释，冻干以给出所希望的产物。
步骤2.将H-RRQPPRSISSHPC-OH(5.47mg，3.6umol)在DMF(0.85ml)和0.1M碳酸氢钠(0.15ml)中的溶液添加至上述在0.1M碳酸氢钠(0.50mL)中的产物(步骤1)(12mg，1.8μmol)中。将反应混合物在rt下摇动1.5小时。LC-MS显示反应完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得3.0mg的缀合物WV-14335。去卷积质量：8485；计算的分子量：8482。
WV-14347的合成
Figure BPA0000295055720009471
将Ac-CHAIYPRH-OH(3.74mg，3.6μmol)在DMF(0.85mL)和0.1M NaHCO3(0.15mL)中的溶液添加至在0.10M NaHCO3(0.50mL)中的SPDP寡核苷酸(WV-14335的步骤1产物)(12mg，1.8μmol)中。将反应混合物在室温下摇动1.5小时。LC-MS显示反应完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得8.8mg的缀合物WV-14347。去卷积质量：8003；计算的分子量：7999。
WV-14348的合成
Figure BPA0000295055720009472
将Ac-CTHRPPMWSPVWP-OH(5.88mg，3.6μmol)在DMF(0.85mL)和0.1M NaHCO3(0.15mL)中的溶液添加至在0.10M NaHCO3(0.50mL)中的SPDP寡核苷酸(WV-14335的步骤1产物)(12mg，1.8μmol)中。将反应混合物在室温下摇动1.5小时。LC-MS显示反应完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得4.1mg的缀合物WV-14348。去卷积质量：8602；计算的分子量：8597。
WV-15074的合成
Figure BPA0000295055720009481
步骤1.将2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(8.25mg，24.71μmol)在DMF(0.30mL)中的溶液添加至在DMSO(1.50mL)和水(0.5mL)中的WV-12566(113.22mg，16.47μmol)和DIPEA(31μL，173μmol)中。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。LC-MS显示反应几乎完成。
步骤2.将Ac-CHAIYPRH-OH(38.47mg，37.1μmol)在DMF(0.50mL)中的溶液添加至上述反应混合物中。将反应混合物在室温搅拌2hr。LC_MS显示反应已完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得66.0mg的缀合物WV-15074。去卷积质量：8133；计算的分子量：8132。
WV-15075的合成
Figure BPA0000295055720009491
步骤1.将2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(1.3mg，3.99μmol)在DMF(0.10mL)中的溶液添加至WV-12566(16.7mg，2.49μmol)和DIPEA(3.5μL)在DMSO(0.30mL)和水(0.10mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下摇动1hr。LC-MS显示反应几乎完成。
步骤2.将Ac-CTHRPPMWSPVWP-OH(9.8mg，6.0μmol)在DMF(0.20mL)中的溶液添加至上述反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。LC_MS显示反应完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得8.9mg的缀合物WV-15075。去卷积质量：8735；计算的分子量：8730。
WV-15076的合成
Figure BPA0000295055720009501
步骤1.将2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-((2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(1.3mg，3.99umol)在DMF(0.10mL)中的溶液添加至WV-12566(16.7mg，2.49μmol)和DIPEA(3.5μL)在DMSO(0.30mL)和水(0.10mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下摇动1hr。LC-MS显示反应几乎完成。
步骤2.将H-RRQPPRSISSHPC-OH(9.1mg，6.0μmol)在DMF(0.20mL)中的溶液添加至上述反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。LC_MS显示反应完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得4.7mg的缀合物WV-15076。去卷积质量：8735；计算的分子量：8730。
WV-15367的合成
Figure BPA0000295055720009511
向5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酸(13.9mg，7.29μmol)在DMF(0.50mL)中的溶液中添加DIPEA(6.3μL，36.4μmol)和HATU(2.3mg，6.0μmol)。将反应混合物在室温搅拌30分钟。将反应混合物添加至WV-12566(16.7mg，2.43μmol)在0.30ml DMSO和0.10mL水中的溶液中。将反应混合物在rt下摇动2小时。LC_MS显示反应已完成。向反应混合物中添加28％-30％氢氧化铵，在40℃下搅拌3hr。LC_MS显示反应完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得9.2mg的缀合物WV-15367。去卷积质量：8269；计算的分子量：8263。
WV-15368的合成
Figure BPA0000295055720009521
向5-(4-(4，6-双((3，9，13，20，26-五氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-30-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-17-氧杂-4，8，14，21，25-五氮杂三十烷基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸(31.7mg，7.29μmol)在DMF(0.50mL)中的溶液中添加DIPEA(6.3μL 36.4μmol)和HATU(2.3mg，6.0μmol)。将反应混合物在室温搅拌30分钟。将反应混合物添加至WV-12566(16.7mg，2.43μmol)在0.30ml DMSO和0.10mL水中的溶液中。将反应混合物在rt下摇动2小时。LC_MS显示反应已完成。向反应混合物中添加28％-30％氢氧化铵(1.0mL)，在40℃下搅拌5hr。LC_MS显示反应完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得7.5mg的缀合物WV-15368。去卷积质量：10206；计算的分子量：10200。
WV-15882的合成
Figure BPA0000295055720009531
向5，12，18-三氧代-7，7-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-22-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-9-氧杂-6，13，17-三氮杂二十二碳酸(102mg，53.43μmol)在DMF(1.0mL)中的溶液中添加DIPEA(46.8μL，266.5μmol)和HATU(13.5mg，35.68μmol)。将反应混合物在室温搅拌30分钟。将反应混合物添加至WV-12566(122.65mg，17.84μmol)在1.5ml DMSO和0.50mL水中的溶液中。将反应混合物在rt下摇动1.5小时。LC_MS显示反应已完成。向反应混合物中添加28％-20％氢氧化铵(5.0mL)，并在35℃下搅拌1.5hr。LC_MS显示反应完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得83.8mg的缀合物WV-15882。去卷积质量：8263；计算的分子量：8264。
一些实例涉及靶向Malat1的寡核苷酸。这些寡核苷酸中的一些在本文其他地方和/或下文描述。
Figure BPA0000295055720009541
Figure BPA0000295055720009551
Figure BPA0000295055720009561
在表A1的图例或本文其他地方描述了修饰(例如，由Mod后跟数字指定，诸如Mod097、Mod074等)。
WV-13809的合成
Figure BPA0000295055720009562
将4-硝基苯基(2，5，7，8-四甲基-2-(4，8，12-三甲基十三烷基)苯并二氢吡喃-6-基)碳酸酯(活化的维生素E)(15mg，25μmol)和DIPEA(21μL)在NMP(0.20ml)中的溶液添加至WV-9696在0.5ml DMSO和0.05ml水中的溶液中。将反应混合物在50℃下摇动2hr。LC-MS显示反应完成。将粗产物冻干，在RP(C-8)HPLC(使用在水中的50mM TEAA和乙腈)上纯化，并脱盐以获得4.90mg的缀合物WV-13809。去卷积质量：7451；计算的分子量：7451。
WV-14349的合成
Figure BPA0000295055720009571
向3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸(19.61mg，21.45μmol)在DMF(0.30mL)中的溶液中添加DIPEA(75μL)和HATU(7.32mg，19.31μmol)。将反应混合物在室温搅拌20分钟。将反应混合物添加至WV-9696(30mg，4.29μmol)在0.4ml DMSO和0.10mL水中的溶液中。将反应混合物在rt下摇动过夜。LC_MS显示反应未完成。向3-(二甲基氨基)-14，14-双(3-(二甲基氨基)-2-甲基-9-氧代-12-氧杂-2，4，8-三氮杂十三碳-3-烯-13-基)-2-甲基-9，16-二氧代-12-氧杂-2，4，8，15-四氮杂二十碳-3-烯-20-酸(10mg)在DMF(0.10mL)中的溶液中添加DIPEA(38μL)和HATU(3.7mg)。将反应混合物在室温搅拌20分钟。将反应混合物添加至上述含有WV-9696的反应混合物中。将反应混合物在30℃下搅拌2hr。LC_MS显示反应完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得9.1mg的缀合物WV-14349。去卷积质量：7893；计算的分子量：7889。
WV8448的合成
Figure BPA0000295055720009581
将4，10，17-三氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(4-(((2R，3R，4S，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(((2R，3R，5R，6R)-3，4，5-三(苯甲酰基氧基)-6-((苯甲酰基氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-13-氧杂-5，9，16-三氮杂二十一烷-21-酸(57mg，21.8μmol)、HATU(7.5mg，19.6μmol)和DIPEA(14.6mg，109μmol)在DMF(2.0mL)中的溶液在室温下搅拌15分钟。向该溶液中添加75mg(10.9μmol)的在1ml水中的WV7557。将反应混合物搅拌60分钟，以得到所希望的产物。将该产物与NH4OH一起在40℃下加热3hr。LC_MS显示反应完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得39.73mg的缀合物WV-8448。去卷积质量：8233；计算的分子量：8227。
WV8927的合成
Figure BPA0000295055720009591
向藤黄酸(21mg，33.6μmol)在2ml干的DMF中的溶液中添加HATU(11.5mg，30.2μmol)和DIPEA(3.6mg，28μmol)，并充分涡旋。向该溶液中添加在水(1ml)中的WV7557(42mg，5.6μmol)，并摇动4小时。LC分析指示形成了产物，但残留起始材料。添加另外6当量的藤黄酸-HATU复合物(最初使用相同量)并充分摇动2小时。LC分析指示形成了更多的产物。将反应混合物用水(10ml)稀释。过量的藤黄酸沉淀出来。将该沉淀物滤出并将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得19mg的缀合物WV-8927。去卷积质量：7496；计算的分子量：7492。
WV-7558的合成
Figure BPA0000295055720009592
向4-氨磺酰基苯甲酸(7.3mg，36μmol)在DMF(2.0mL)中的溶液中添加HATU(12.4mg，32.7μmol)和DIPEA(46mg，360μmol)，并涡旋。2分钟后，添加在1ml水中的WV7557(50mg，7.27μmol)并充分摇动。60分钟后，将反应混合物用水(5ml)稀释并过滤。将滤液通过RP柱色谱法(C-18)纯化并脱盐以获得产物(17mg)。质量计算值：7064；去卷积质量：7068。
WV-7559的合成
Figure BPA0000295055720009601
向4-氧代-4-((4-氨磺酰基苯乙基)氨基)丁酸(8.7mg，29μmol)在DMF(2.0mL)中的溶液中添加HATU(9.9mg，26μmol)和DIPEA(37mg，290μmol)，并涡旋。2分钟后，添加在1ml水中的WV7557(40mg，5.81μmol)并充分摇动。30分钟后，将反应混合物用水(5ml)稀释并过滤。将滤液通过RP柱色谱法(C-18)纯化并脱盐以获得产物(13mg)。质量计算值：7163；去卷积质量：7166。
Figure BPA0000295055720009602
向WV7557(62mg，9μmol)在水(0.5ml)和DMF(2.5ml)中的溶液中添加DIPEA(11.6mg，90μmol)并充分搅拌。向该溶液中添加3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸-OSu(4mg，12.6μmol)并充分搅拌2h。将粗产物用水稀释并在ISCO(C18柱)(使用50mM TEAA和乙腈)上纯化。获得的产物量：46mg。
WV-8929的合成
Figure BPA0000295055720009611
向寡核苷酸(WV7557衍生物，23.5mg，3.3μmol)在水-DMF(2ml+1ml)混合物中的溶液中添加DIPEA(8.52mg，66μmol)并涡旋5分钟。向该溶液中添加H-RRQPPRSISSHPC-OH(10mg，6.6μmol)并再次涡旋5分钟。12小时后，通过LC-MS分析该反应混合物。LC_MS显示反应已完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐，以获得14mg的缀合物WV-8929。去卷积质量：8496；计算的分子量：8490。
WV-8930的合成
Figure BPA0000295055720009621
向寡核苷酸(WV7557衍生物，23.5mg，3.3μmol)在水-DMF(2ml+1ml)混合物中的溶液中添加DIPEA(8.52mg，66μmol)并涡旋5分钟。向该溶液中添加H-Arg-Arg-Cys-OH(4mg，10μmol)并涡旋5分钟。12小时后，通过LC-MS分析该反应混合物。LC_MS显示反应已完成。将反应混合物用水稀释并高速真空以干燥。将粗产物通过RP-HPLC(用在水中的50mM TEAA至乙腈洗脱)纯化，并脱盐以获得5mg的缀合物WV-8930。去卷积质量：7405；计算的分子量：7401。
WV8931的合成
Figure BPA0000295055720009622
将WV7557(20mg，2.91μmol)在0.47ml水中的溶液用DIPEA(3.76mg，29.1μmol)处理并充分涡旋5分钟。向该溶液中添加(3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环五[a]菲-3-基(4-硝基苯基)碳酸酯(活化的胆固醇衍生物)(10.50mg，19μmol)在NMP(1.0ml)中的溶液。溶液变得略带黄色。将其在40度摇动12小时。获得亮黄色溶液。LC-MS分析指示形成了产物。用水将该溶液稀释至10ml，过滤并在RP-HPLC(使用C-8柱)上纯化并脱盐。获得的产物量：18mg；去卷积质量：7298；计算的分子量：7293。
WV8934的合成
Figure BPA0000295055720009631
将左旋肉碱(3mg，17.5μmol)和HATU(6mg，16μmol)混合在一起，并制成1ml DMF溶液。添加DIPEA(5.7mg，44μmol)并充分搅拌3分钟。向该溶液中添加WV-7557(30mg，4.4mmol)在0.5ml水中的溶液并充分搅拌30分钟。溶液的LC-MS分析指示形成了产物。但是反应混合物中存在起始寡核苷酸。再添加4当量的附加的左旋肉碱/HATU复合物，并充分搅拌2h。将反应混合物用水稀释并将粗产物在RP(C-18)柱上纯化以获得产物。获得的产物量：12mg，计算的质量：7025；去卷积质量：7029。
WV-9390的合成
Figure BPA0000295055720009641
向5-氧代-5-(4-(4-((2，8，12，19，25-五氧代-14，14-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-29-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-16-氧杂-3，7，13，20，24-五氮杂二十九烷基)氨基)-6-((3，9，13，20，26-五氧代-15，15-双((3-氧代-3-((3-(5-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-30-(((2S，3S，4S，5R，6R)-3，4，5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-17-氧杂-4，8，14，21，25-五氮杂三十烷基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)戊酸(15mg，3.5μmol)和HATU(1.33mg，3.5μmol)在DMF(1.0ml)中的溶液中添加DIPEA(4.5mg，35μmol)并涡旋2分钟。向该溶液中添加在水(0.5ml)中的WV7557(12mg，1.74μmol)并摇动60分钟。向其中添加5ml水并将溶剂在真空下去除。将粗产物在RP柱(C-8)上纯化以获得乙酰化产物(质量计算值：10207，去卷积质量：10212)。将该产物溶于5ml30％氢氧化铵溶液中，并在40摄氏度加热6小时。在真空下除去溶剂，并将粗产物在RP柱(C-8)上纯化以获得产物。获得的产物量(10mg)。计算的质量：10205；获得的去卷积质量：10205。
WV 9430的合成
Figure BPA0000295055720009651
向1，7，14-三氧代-12，12-双((3-氧代-3-((3-(4-氨磺酰基苯甲酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(4-氨磺酰基苯基)-10-氧杂-2，6，13-三氮杂十八烷-18-酸(5.14mg，1.45μmol)在DMF中的溶液中添加HATU(1.5mg，3.96μmol)和DIPEA(2mg，15μmol)。将反应混合物在室温搅拌2分钟。添加WV7557在0.4ml水中的溶液并充分摇动。30分钟后，将反应混合物用水(5ml)稀释并过滤。将滤液通过RP柱色谱法(C-18)纯化并脱盐以获得产物WV-9430(6mg)。质量计算值：8032；去卷积质量：8031。
WV-9385的合成
Figure BPA0000295055720009661
将WV7557(48mg，6.9μmol)溶于1ml NMP和0.5ml水中。将DIPEA(14mg，103.5μmol)添加至该溶液中。涡旋5分钟。向该溶液中添加在1ml NMP中的3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙基硬脂酸酯(14mg，27.6μmol)。将反应混合物过滤并将滤液通过RP柱色谱法(C-8)纯化以获得产物。将纯化的材料脱盐，并获得11mg产物。质量计算值：7250；去卷积质量：7254。
WV-7560的合成
Figure BPA0000295055720009662
将12，12-双((3-((3-(4-甲氧基苯甲酰胺基)丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-1-(4-甲氧基苯基)-1，7，14-三氧代-10-氧杂-2，6，13-三氮杂二十五烷-25-酸(三触角茴香酰胺)(32.5mg，29μmol)、HATU(10mg，26.1μmol)和DIPEA(28mg，58μmol)溶于2ml DMF中。2分钟后，添加在1ml水中的WV7557(100mg，15μmol)并充分摇动。60分钟后，将反应混合物用水(5ml)稀释并过滤。将滤液通过RP柱色谱法(C-8)纯化并脱盐以获得产物(55mg)。质量计算值：7983；去卷积质量：7987。
WV-7408的合成
Figure BPA0000295055720009671
将WV 3356(40mg，5.3μmol)和DIPEA(7mg，53μmol)在2ml DMF中的悬浮液涡旋五分钟。向该悬浮液中添加2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-氨磺酰基苯甲酸酯(8mg，26.5μmol)在1mlDMF中的溶液。将反应混合物摇动12小时。之后，将反应混合物用5ml水稀释并过滤。将滤液通过RP(C-18)柱色谱法纯化并脱盐以获得产物(20mg)。质量计算值：7596；去卷积质量：7594。
WV7409的合成
Figure BPA0000295055720009672
将4-氧代-4-((4-氨磺酰基苯乙基)氨基)丁酸(2.16mg，7.2μmol)、HATU(2.32mg，6.1μmol)和DIPEA(3.1mg，24μmol)的溶液溶于1ml DMF中并涡旋。2分钟后，添加在0.5ml水中的WV3356(18mg，2.4μmol)并充分摇动。60分钟后，将反应混合物用水(5ml)稀释并过滤。通过RP柱色谱法(C-18)纯化滤液，并脱盐以获得产物(9mg)。质量计算值：7694；去卷积质量：7695。
WV-7430的合成
Figure BPA0000295055720009681
向WV3356(32mg，4.3μmol)在DMF(2.0mL)中的溶液中添加DIPEA(5.8mg，43μmol)，添加(R)-3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙烷-1，2-二基二(十二酸)酯(11mg，17.6μmol)在乙腈(1.0mL)中的溶液。将反应混合物在40℃下摇动12小时。LC-MS分析指示形成了产物。将反应混合物用水稀释并过滤。将滤液通过RP柱色谱法(C-8)纯化以获得产物。将纯化的材料脱盐，并获得11mg产物。质量计算值：7895，去卷积质量：7896。
WV-7419的合成
Figure BPA0000295055720009682
向WV-2809(56mg，7.5μmol，125mg支持物)在DMF(2.0mL)中的悬浮液中添加DIPEA(19.3mg，150μmol)并充分涡旋5分钟。向该悬浮液中添加18-氧代-18-((4-(N-(2，2，2-三氟乙酰基)氨磺酰基)苯乙基)氨基)十八烷酸全氟苯基酯(12mg，15μmol)并在室温下摇动12小时。将固体支持物用乙腈(20ml X 3)洗涤并干燥。将该支持物用在乙腈(1ml)中的20％DEA处理10分钟。通过过滤去除DEA溶液。将固体支持物用乙腈(20ml X 3)洗涤并干燥。将固体支持物与2ml的30％氢氧化铵一起加热12小时。滤出支持物，并将滤液冻干以去除溶剂。通过RP柱色谱法(C-8)纯化粗产物，并脱盐以获得产物(7mg)。质量计算值：7906，去卷积质量：7909。
WV-7519的合成
Figure BPA0000295055720009691
向WV2809(60mg，8μmol，150mg支持物)在2ml NMP中的悬浮液中添加DIPEA(11mg，80μmol)并充分涡旋5分钟。向该悬浮液中添加(8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环五[a]菲-3-基氯甲酸酯(15mg，33μmol)并在室温下摇动12小时。将固体支持物用乙腈(20ml X 3)洗涤并干燥。将该支持物用在乙腈(1ml)中的20％DEA处理10分钟。通过过滤去除DEA溶液。将固体支持物用乙腈(20ml X 3)洗涤并干燥。将固体支持物与2ml的30％氢氧化铵一起在50℃下加热12小时。滤出支持物，并将滤液冻干以去除溶剂。通过RP柱色谱法(C-8)纯化粗产物，并脱盐以获得产物(20mg)。质量计算值：7840，去卷积质量：7841。
WV-7422的合成
Figure BPA0000295055720009701
向WV2809(56mg，7.5μmol，125mg支持物)在2ml DMF中的悬浮液中添加DIPEA(19.3mg，150μmol)并充分涡旋5分钟。向该悬浮液中添加3-(4-(N-(2，2，2-三氟乙酰基)氨磺酰基)苯基)丙酸全氟苯基酯(37mg，75μmol)并在室温下摇动12小时。将固体支持物用乙腈(20ml X 3)洗涤并干燥。将该支持物用在乙腈(1ml)中的20％DEA处理10分钟。通过过滤去除DEA溶液。将固体支持物用乙腈(20ml X 3)洗涤并干燥。将固体支持物与2ml的30％氢氧化铵一起在50℃下加热12小时。滤出支持物，并将滤液冻干以去除溶剂。通过RP柱色谱法(C-8)纯化粗产物，并脱盐以获得产物(18mg)。质量计算值：7638，去卷积质量：7641。
WV-7421的合成
Figure BPA0000295055720009702
将在2ml NMP中的2-(4-氨磺酰基苯基)乙酸(17.2mg，80μmol)、HATU(28mg，76molμ)和DIPEA(20.6mg，160μmol)充分涡旋2分钟。向该悬浮液中添加WV2809(60mg，8μmol，150mg支持物)并在室温下充分摇动12小时。将固体支持物用乙腈(20ml X 3)洗涤并干燥。将该支持物用在乙腈(1ml)中的20％DEA处理10分钟。通过过滤去除DEA溶液。将固体支持物用乙腈(20ml X 3)洗涤并干燥。将固体支持物与2ml的30％氢氧化铵一起在50℃下加热12小时。滤出支持物，并将滤液冻干以去除溶剂。通过RP柱色谱法(C-18)纯化粗产物，并脱盐以获得产物(20mg)。质量计算值：7624，去卷积质量：7627。
WV-7417的合成
Figure BPA0000295055720009711
将1，7，14-三氧代-12，12-双((3-氧代-3-((3-(4-氨磺酰基苯甲酰胺基)丙基)氨基)丙氧基)甲基)-1-(4-氨磺酰基苯基)-10-氧杂-2，6，13-三氮杂十八烷-18-酸(40mg，34μmol)、HATU(12mg，76μmol)和DIPEA(44mg，340μmol)在2ml NMP中的悬浮液充分涡旋3分钟。向该悬浮液中添加WV2809(60mg，8μmol，150mg支持物)并在40℃下充分摇动12小时。将固体支持物用乙腈(20ml X 3)洗涤并干燥。将该支持物用在乙腈(1ml)中的20％DEA处理10分钟。通过过滤去除DEA溶液。将固体支持物用乙腈(20ml X 3)洗涤并干燥。将固体支持物与2ml的30％氢氧化铵一起在50℃下加热12小时。滤出支持物，并将滤液冻干以去除溶剂。通过RP柱色谱法(C-18)纯化粗产物，并脱盐以获得产物(10mg)。质量计算值：8579，去卷积质量：8577。
实例17.胺的脱保护的通用程序
Figure BPA0000295055720009721
将15.2g NHBoc胺溶于无水DCM(100ml)中，随后在室温下逐滴添加TFA(50ml)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下去除溶剂，然后与甲苯(2 x 50mL)共蒸发，接着不经任何进一步纯化即用于下一步骤。CD3OD中的NMR确认NHBoc脱保护。
实例18.茴香酰胺形成的通用程序
Figure BPA0000295055720009722
步骤A：在RT下将来自前一步骤的粗品胺溶于DCM(100ml)和Et3N(10当量)的混合物中。在此过程期间，将反应混合物用水浴冷却。然后，在氩气气氛下在RT下，向反应混合物中逐滴添加4-甲氧基苯甲酰氯(4当量)，持续搅拌3h。将反应混合物用水稀释并用DCM萃取。将有机层用水性NaHCO3、1N HCl、盐水萃取，随后用硫酸镁干燥，蒸发至干。使用DCM-MeOH作为洗脱剂，将粗产物通过二氧化硅柱色谱法纯化。
步骤B：在氩气下，在适当大小的RBF中，将粗胺(0.27当量)、酸和HOBt(1当量)溶于DCM与DMF(2∶1)的混合物中。在持续搅拌下，将EDAC.HCl(1.25当量)分批添加至反应混合物中。15分钟后，将反应混合物冷却至约10℃，然后经5分钟的时段添加DIEA(2.7当量)。将反应混合物缓慢升温至环境温度，并在氩气下搅拌过夜。TLC指示反应完成，TLC条件DCM∶MeOH(9.5∶0.5)。在减压下去除溶剂，然后向残留物中添加水，且分离出胶状固体。倾析出透明溶液，并将固体残余物溶于EtOAc中，并相继用水、10％水性柠檬酸、水性NaHCO3接着用饱和盐水洗涤。将有机层分离并且经硫酸镁干燥。在减压下去除溶剂，然后将粗产物用二氧化硅柱纯化，以得到纯产物。
Figure BPA0000295055720009731
使用上述程序B，由胺经2个步骤获得茴香酰胺，产率为32％：1H MMR(CDCl3)：δ＝7.74(d，6H)，7.44(t，2H)，7.34(t，1H)，7.26(m，5H)，7.05(m，3H)，6.83(d，6H)，6.46(s，1H)，5.01(s，2H)，3.75(s，9H)，3.57(m，12H)，3.37(m，6H)，3.25(m，6H)，2.31(m，8H)，2.11(m，2H)，1.84(m，2H)，1.62(m，6H)ppm。
Figure BPA0000295055720009732
使用上述程序A，由胺经2个步骤获得茴香酰胺，产率为57％：1H NMR(CDCl3)：δ＝7.75(m，3H)，7.73(d，6H)，7.43(t，3H)，7.25(m，5H)，6.80(d，6H)，6.51(brs，1H)，5.01(s，2H)，3.72(s，9H)，3.58(m，6H)，3.21(m，12H)，2.33(t，3H)，2.25(t，2H)，2.02(t，2H)，1.64(q，6H)，1.52(p，2H)，1.41(q，2H)，1.12(m，12H)ppm。
脱苄基作用的通用程序。
Figure BPA0000295055720009741
将苄酯(10g)溶于乙酸乙酯(100ml)与甲醇(25ml)的混合物中，然后在氩气气氛下添加1g Pd/C(10％钯含量)，接着将反应混合物置于真空且用氢气冲洗，并在RT下在H2气氛下搅拌3h。TLC指示反应完成，通过硅藻土垫过滤并用甲醇洗涤，蒸发至干，以得到泡沫状白色固体。
Figure BPA0000295055720009742
产率98％，1H NMR(CD3OD)：δ＝8.35(t，1H)，8.01(t，1H)，7.82(d，6H)，7.27(d，1H)，6.99(d，6H)，3.85(s，9H)，3.68(m，12H)，3.41(m，6H)，3.29(m，6H)，2.42(m，6H)，2.31(q，2H)，2.21(td，2H)，1.80(m，8H)ppm。
Figure BPA0000295055720009743
产率94％，1H NMR(CD3OD)：δ＝8.36(t，2H)，8.02(t，2H)，7.82(d，6H)，7.23(d，1H)，6.98(d，6H)，3.85(s，9H)，3.70(s，6H)，3.67(t，6H)，3.41(q，4H)，3.28(m，8H)，2.42(t，6H)，2.27(t，2H)，2.13(t，2H)，1.79(p，6H)，1.54(dp，4H)，1.25(m，12H)ppm。
实例19.用于裸式给药的患者成肌细胞的“预分化”时间线
可以依照本披露利用各种技术，例如描述在以下的那些：US 9394333、US9744183、US 9605019、US 9598458、US 2015/0211006、US 2017/0037399、WO 2017/015555、WO 2017/192664、WO 2017/015575、WO 2017/062862、WO 2017/160741、WO 2017/192679、和WO 2017/210647等以评估本披露的技术的特性和/或活性。在一些实施例中，与合适的参考技术(例如，基于寡核苷酸的立体随机组合物的技术，其具有相同的碱基序列但在生理pH下没有中性和/或阳离子核苷酸间键联)相比，本披露的技术(例如，寡核苷酸和组合物及其使用方法)证明出乎意料优异结果。以下描述的是可用于评估本披露中所述的寡核苷酸的特性和/或活性的示例性技术。本领域技术人员理解，可以改变/修改下面说明的条件，并且另外和/或可替代地，可以根依照本披露利用其他合适的试剂、温度、条件、时间段、量等。
维持患者来源的成肌细胞系：
将DMDΔ52和DMDΔ45-52成肌细胞维持在补充有5％FBS、1X青霉素-链霉素、和1XL-谷氨酰胺的完全骨骼肌生长培养基(Promocell公司，海德堡，德国)中。用Matrigel∶DMEM溶液(1∶100)涂覆烧瓶或平板持续合适的一段时间，例如30min，之后通过抽吸去除Matrigel∶DMEM溶液，然后将细胞接种到完全骨骼肌生长培养基(Skeletal Muscle GrowthMedium)中。
标准给药程序(预分化0天)
在第1天：用Matrigel∶DMEM溶液涂覆合适的细胞生长容器，例如6孔板或24孔板。在例如37℃、5％CO2的条件下孵育合适的一段时间(例如，30min)。抽吸并将适量的细胞接种到细胞生长容器中，例如150K细胞/孔(总共1500μl的完全生长培养基，6孔板中)和30K细胞/孔(500ul的生长培养基，24孔板中)。在合适的条件下孵育合适的时间，例如37℃、5％CO2过夜。
在第2天：制备合适的分化培养基，例如DMEM+5％马血清+10μg/ml胰岛素。在分化培养基中制备合适的寡核苷酸稀释液，例如30uM、10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM的系列稀释液。从贴壁细胞中抽吸生长培养基，并将寡核苷酸∶分化培养基溶液添加至细胞。直至收获细胞，寡核苷酸保留在细胞上(没有培养基改变)。
在第6天：获得RNA。在典型的程序中，例如用冷PBS洗涤适量的细胞(例如来自24孔板的孔的细胞)，然后添加适量的用于RNA提取和样品储存/RNA提取的试剂，例如，在24孔板中的500ul/孔TRIZOL并在-80℃的冷冻板或继续RNA提取以获得RNA。
在第8天：获得蛋白质。在典型的程序中，将适量的细胞(例如6孔板孔中的细胞)例如用冷PBS洗涤。然后添加适量的合适的切割缓冲液-例如，在典型的程序中，200ul/孔的RIPA补充有用于6孔板的蛋白酶抑制剂。切割后，可以储存样品，例如在-80℃冷冻，或继续进行蛋白质提取。
可以采用其他合适的程序，例如，以下描述的那些程序。如本领域技术人员所理解的，可以修改许多参数(如试剂、温度、条件、时间段、量等)。
4天预分化给药程序
在第1天：用Matrigel∶DMEM溶液涂覆6孔板或24孔板。在37℃、5％CO2孵育30min。抽吸，接种150K细胞/孔(总共1500μl的完全生长培养基，6孔板中)和30K细胞/孔(500ul的生长培养基，24孔板中)。在37℃、5％CO2孵育过夜。
在第2天：如下制备分化培养基：DMEM+5％马血清+10μg/ml胰岛素。抽吸生长培养基并用分化培养基取代。
在第6天：细胞分化4天。在分化培养基中制备寡核苷酸稀释液，例如30uM、10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM的系列稀释液。从贴壁细胞中抽吸分化培养基，并将寡核苷酸∶分化培养基溶液添加至细胞。直至收获细胞，寡核苷酸保留在细胞上(没有培养基改变)。
在第10天：用冷PBS洗涤24孔板中的细胞，在24孔板中添加500ul/孔TRIZOL并在-80℃冷冻板或继续RNA提取。
在第12天：用冷PBS洗涤6孔板中的细胞。添加200ul/孔的RIPA，补充有蛋白酶抑制剂。在-80℃冷冻板或继续进行蛋白质提取。
7天预分化给药程序
在第1天：用Matrigel∶DMEM溶液涂覆6孔板或24孔板。在37℃、5％CO2孵育30min。抽吸，接种150K细胞/孔(总共1500μl的完全生长培养基，6孔板中)和30K细胞/孔(500ul的生长培养基，24孔板中)。在37℃、5％CO2孵育过夜。
在第2天：如下制备分化培养基：DMEM+5％马血清+10μg/ml胰岛素。抽吸生长培养基并用分化培养基取代。
在第9天：细胞分化7天。在分化培养基中制备寡核苷酸稀释液，例如30uM、10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM的系列稀释液。从贴壁细胞中抽吸分化培养基，并将寡核苷酸∶分化培养基溶液添加至细胞。直至收获细胞，寡核苷酸保留在细胞上(没有培养基改变)。
在第13天：用冷PBS洗涤24孔板中的细胞，在24孔板中添加500ul/孔TRIZOL并在-80℃冷冻板或继续RNA提取。
在第15天：用冷PBS洗涤6孔板中的细胞。添加200ul/孔的RIPA，补充有蛋白酶抑制剂。在-80℃冷冻板或继续进行蛋白质提取。
10天预分化给药程序
在第1天：用Matrigel∶DMEM溶液涂覆6孔板或24孔板。在37℃、5％CO2孵育30min。抽吸，接种150K细胞/孔(总共1500μl的完全生长培养基，6孔板中)和30K细胞/孔(500ul的生长培养基，24孔板中)。在37℃、5％CO2孵育过夜。
在第2天：如下制备分化培养基：DMEM+5％马血清+10μg/ml胰岛素。抽吸生长培养基并用分化培养基取代。
在第12天：细胞分化10天。在分化培养基中制备寡核苷酸稀释液，例如30uM、10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM的系列稀释液。从贴壁细胞中抽吸分化培养基，并将寡核苷酸∶分化培养基溶液添加至细胞。直至收获细胞，寡核苷酸保留在细胞上(没有培养基改变)。
在第16天：用冷PBS洗涤24孔板中的细胞，在24孔板中添加500ul/孔TRIZOL并在-80℃冷冻板或继续RNA提取。
在第18天：用冷PBS洗涤6孔板中的细胞。添加200ul/孔的RIPA，补充有蛋白酶抑制剂。在-80℃冷冻板或继续进行蛋白质提取。
实例20.多外显子跳读测定
本文所述的测定可以适于以每种变体的频率(定量)检测任何基因的剪接变体。以DMD外显子43-外显子64为例。
除其他事项外，该测定的独特之处在于，在具有独特的PCR柄序列(其可以是与基因组或转录组序列无同源性的任何序列)的逆转录引物中引入了独特的分子标识符(UMI)。因此，每个cDNA都有其独特的UMI(条形码)，其可用于以后的测序分析中，以消除PCR和测序对较小扩增子的偏差。
在典型过程中，步骤包括：使用在5′-端含有PCR柄的反向RT引物，然后使用8-16个随机并入的核苷酸的序列(其在外显子64中产生UMI/条形码和反向互补序列)(表中的反向RT引物)来引发通过RT试剂盒(例如，SuperScript IV，赛默飞世尔公司，马萨诸塞州剑桥市)进行的反转录。然后进行初级和巢式PCR，以扩增用于PacBio远程测序或OxfordNanopore MinION平台的基因特异性片段。
NGS序列(BAM文件)被映射到参考序列(例如DMD)以识别剪接变体(外显子连接)。在每个剪接变体中计数UMI，并通过每个变体中的UMI计数除以所有变体中的总UMI计数来计算变体的频率。
图2显示了此过程的图解。
示例反向RT引物：
5′-CAGTGGTATCAACGCAGAGTACG-NNNNNNNN-ctgagaatctgacattattcagg-3′
5’-大写字母＝N1结合序列(巢式次级)
N.....N＝UMI
下划线＝外显子64中的基因特异性序列
正向引物(外显子43)：
F巢式＝5’-gaagctctctcccagcttgat-3’
除其他事项外，本披露提供了以下示例实施例：
1.一种寡核苷酸组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个手性受控的核苷酸间键联；以及
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
2.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物是肌营养不良蛋白转录物。
3.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物的剪接发生改变，使得外显子45、51或53或者多个外显子的跳读水平增加。
4.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸中的每个手性核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。
5.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个手性经修饰的核苷酸间键联在其手性键联磷处独立地具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的立体纯度。
6.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该碱基序列是或包含表A1中任何寡核苷酸的碱基序列或包含该序列的15个连续碱基。
7.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
8.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联，该核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。
9.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个中性核苷酸间键联，该中性核苷酸间键联是或包含三唑、中性三唑、炔烃或环状胍。
10.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该寡核苷酸类型包括以下中的任一项：胆固醇；左旋肉碱(酰胺和氨基甲酸酯键)；叶酸；藤黄酸；可切割脂质(1，2-甘油二月桂酸酯和酯键)；胰岛素受体配体；CPP；葡萄糖(三触角和六触角)或甘露糖(三触角和六触角，α和β)。
11.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该寡核苷酸类型是表A1中列出的任何寡核苷酸。
12.一种组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
该组合物是手性受控的，并且相对于具有相同的碱基序列、骨架键联模式、和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋制剂，该组合物富集特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，其中：
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，该转录物的剪接发生改变，因为相对于在参考条件下所观察到的，外显子的跳读水平增加，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
13.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物是肌营养不良蛋白转录物。
14.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该外显子是DMD外显子45、51或53或多个DMD外显子，并且其中该转录物的剪接发生改变，使得外显子45、51或53或者多个外显子的跳读水平增加。
15.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少一个Sp。
16.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少一个Rp。
17.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该组合物是手性纯的组合物。
18.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个手性经修饰的核苷酸间键联在其手性键联磷处独立地具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的立体纯度。
19.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该碱基序列是或包含表A1中任何寡核苷酸的碱基序列或包含该序列的15个连续碱基。
20.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
21.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联，该核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。
22.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个中性核苷酸间键联，该中性核苷酸间键联是或包含三唑、中性三唑、炔烃或环状胍。
23.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该寡核苷酸类型包括以下中的任一项：胆固醇；左旋肉碱(酰胺和氨基甲酸酯键)；叶酸；藤黄酸；可切割脂质(1，2-甘油二月桂酸酯和酯键)；胰岛素受体配体；CPP；葡萄糖(三触角和六触角)或甘露糖(三触角和六触角，α和β)。
24.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该寡核苷酸类型是表A1中列出的任何寡核苷酸。
25.一种组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；以及
3)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个非负电荷的核苷酸间键联；
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，该转录物的剪接发生改变，因为相对于在参考条件下所观察到的，外显子的跳读水平增加，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
26.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物是肌营养不良蛋白转录物。
27.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该外显子是DMD外显子45、51或53或多个DMD外显子，并且该转录物的剪接发生改变，使得外显子45、51或53或者多个外显子的跳读水平增加。
28.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地是以下核苷酸间键联：该核苷酸间键联中的至少50％在pH 7.4下以其非负电荷形式存在。
29.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地是中性核苷酸间键联，其中该核苷酸间键联中的至少50％在pH 7.4下以其中性形式存在。
30.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联的该中性形式独立地具有不小于8、9、10、11、12、13或14的pKa。
31.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联的该中性形式，当其所连接的单元被-CH3替换时，独立地具有不小于8、9、10、11、12、13或14的pKa。
32.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该参考条件是不存在该组合物。
33.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该参考条件是存在参考组合物。
34.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该参考组合物是在其他方面相同的组合物，其中这些多种寡核苷酸不包含手性受控的核苷酸间键联。
35.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该参考组合物是在其他方面相同的组合物，其中这些多种寡核苷酸不包含非负电荷的核苷酸间键联。
36.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含一个或多个选自以下的骨架键联：磷酸二酯键联、硫代磷酸酯键联和二硫代磷酸酯键联。
37.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸各自包含一个或多个糖修饰。
38.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些糖修饰包含一个或多个选自以下的修饰：2′-O-甲基、2′-MOE、2′-F、吗啉代和双环糖部分。
39.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个糖修饰是2′-F修饰。
40.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸各自包含含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷单元的5’-端区域，这些核苷单元包含经2’-F修饰的糖部分。
41.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸各自包含含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷单元的3’-端区域，这些核苷单元包含经2’-F修饰的糖部分。
42.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸各自包含在5’-端区域和3’-区域之间的中间区域，该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含磷酸二酯键联的核苷酸单元。
43.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该碱基序列是或包含表A1中任何寡核苷酸的碱基序列或包含该序列的15个连续碱基。
44.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
45.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联，该核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。
46.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个中性核苷酸间键联，该中性核苷酸间键联是或包含三唑、中性三唑、炔烃或环状胍。
47.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该寡核苷酸类型包括以下中的任一项：胆固醇；左旋肉碱(酰胺和氨基甲酸酯键)；叶酸；藤黄酸；可切割脂质(1，2-甘油二月桂酸酯和酯键)；胰岛素受体配体；CPP；葡萄糖(三触角和六触角)或甘露糖(三触角和六触角，α和β)。
48.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该寡核苷酸类型是表A1中列出的任何寡核苷酸。
49.一种组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；以及
3)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含：
1)5’-端区域，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的核苷单元；
2)3’-端区域，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的核苷单元；和
3)在5’-端区域和3’-区域之间的中间区域，该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含磷酸二酯键联的核苷酸单元。
50.如实施例43或49所述的组合物，其中该寡核苷酸组合物的特征在于，当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，该转录物的剪接发生改变，因为相对于在参考条件下所观察到的，外显子的跳读水平增加，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
51.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物是肌营养不良蛋白转录物。
52.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该外显子是DMD外显子45、51或53或多个DMD外显子，并且该转录物的剪接发生改变，使得外显子45、51或53或者多个外显子的跳读水平增加。
53.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域包含1或多个不包含经2’-F修饰的糖部分的核苷单元。
54.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域包含1或多个不包含经2’-F修饰的糖部分的核苷单元。
55.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含1或多个不包含磷酸二酯键联的核苷酸单元。
56.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中包含该5’-端的经2′-F修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间键联的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷单元中的第一个是自该5’-端该寡核苷酸的第一个、第二个、第三个、第四个或第五个核苷单元，并且包含该3’-端的经2′-F修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间键联的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷单元中的最后一个是该寡核苷酸的最后一个、倒数第二个、倒数第三个、倒数第四个或倒数第五个核苷单元。
57.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的连续的核苷单元。
58.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域包含5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的连续的核苷单元。
59.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的连续的核苷单元。
60.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域包含5、6、7、8、9、10或更多个包含经2’-F修饰的糖部分的连续的核苷单元。
61.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中包含5’-端区域的经2’-F修饰的糖部分的两个核苷单元之间的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。
62.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中包含3’-端区域的经2’-F修饰的糖部分的两个核苷单元之间的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。
63.如实施例61或62所述的组合物，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。
64.如实施例61或62所述的组合物，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。
65.如实施例61或62所述的组合物，其中每个经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
66.如实施例61或62所述的组合物，其中每个经修饰的核苷酸间键联是手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
67.如实施例61或62所述的组合物，其中每个经修饰的核苷酸间键联是Sp手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
68.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个天然磷酸酯键联。
69.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个天然磷酸酯键联，每个磷酸酯键联独立地位于包含经2’-OR1修饰的糖部分的核苷单元和包含经2′-F修饰的糖部分的核苷单元之间或位于两个各自独立地包含经2’-OR1修饰的糖部分的核苷单元之间，其中R1是任选地经取代的C1-6烷基。
70.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联。
71.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联，每个核苷酸间键联独立地位于包含经2’-OR1修饰的糖部分的核苷单元和包含经2′-F修饰的糖部分的核苷单元之间或位于两个各自独立地包含经2’-OR1修饰的糖部分的核苷单元之间，其中R1是任选地经取代的C1-6烷基。
72.如实施例69或71所述的组合物，其中2’-OR1是2’-OCH3。
73.如实施例69或71所述的组合物，其中2’-OR1是2’-OCH2CH2OCH3。
74.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个手性经修饰的核苷酸间键联。
75.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该5’-端区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续的手性经修饰的核苷酸间键联。
76.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中5’-端区域的每个核苷酸间键联是手性经修饰的核苷酸间键联。
77.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个手性经修饰的核苷酸间键联。
78.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该3’-端区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续的手性经修饰的核苷酸间键联。
79.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中3’-端区域的每个核苷酸间键联是手性经修饰的核苷酸间键联。
80.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个手性经修饰的核苷酸间键联。
81.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续的手性经修饰的核苷酸间键联。
82.如实施例74-81中任一项所述的组合物，其中每个手性经修饰的核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。
83.如实施例74-81中任一项所述的组合物，其中每个手性经修饰的核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联，其中其手性受控的键联磷具有Sp构型。
84.如实施例74-83中任一项所述的组合物，其中每个手性经修饰的核苷酸间键联独立地是手性受控的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
85.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个非负电荷的核苷酸间键联。
86.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该中间区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个中性核苷酸间键联。
87.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中中性核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。
88.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中中性核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联，该核苷酸间键联在其键联磷处独立于Rp或Sp。
89.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该碱基序列包含与该肌营养不良蛋白基因或其互补序列的20个碱基长的部分具有不超过5个错配的序列。
90.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸的碱基序列的长度不超过50个碱基。
91.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个独立于Rp或Sp的手性受控的中性。
92.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少5个独立于Rp或Sp的手性受控的中性。
93.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少6个独立于Rp或Sp的手性受控的中性。
94.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架手性中心模式包含至少10个独立于Rp或Sp的手性受控的中性。
95.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸能够介导该肌营养不良蛋白基因的一个或多个外显子的跳读。
96.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸能够介导该肌营养不良蛋白基因的外显子45、51或53的跳读。
97.如实施例96所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸能够介导该肌营养不良蛋白基因的外显子45的跳读。
98.如实施例96所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸能够介导该肌营养不良蛋白基因的外显子51的跳读。
99.如实施例96所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸能够介导该肌营养不良蛋白基因的外显子53的跳读。
100.如实施例97所述的组合物，其中该碱基序列包含与本文披露的任何寡核苷酸的序列具有不超过5个错配的序列。
101.如实施例97所述的组合物，其中该碱基序列包含或是本文披露的任何寡核苷酸的序列。
102.如实施例97所述的组合物，其中该碱基序列是本文披露的任何寡核苷酸的碱基序列。
103.如实施例97所述的组合物，其中该碱基序列包含与本文披露的任何寡核苷酸的序列具有不超过5个错配的序列。
104.如实施例97所述的组合物，其中该碱基序列包含或是本文披露的任何寡核苷酸。
105.如实施例97所述的组合物，其中该碱基序列是本文披露的任何寡核苷酸。
106.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸是本文披露的任何寡核苷酸。
107.如实施例18所述的组合物，其中该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸是本文披露的任何寡核苷酸。
108.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该碱基序列是或包含表A1中任何寡核苷酸的碱基序列或包含该序列的15个连续碱基。
109.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
110.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联。
111.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
112.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的非负电荷的核苷酸间键联。
113.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
114.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构。
115.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中翼包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联。
116.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中翼包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
117.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中翼包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的非负电荷的核苷酸间键联。
118.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中翼包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
119.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼结构或由其组成，并且其中仅一个翼包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联。
120.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中核心包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联。
121.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中核心包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
122.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中核心包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的非负电荷的核苷酸间键联。
123.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸包含翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心结构，并且其中核心包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的手性受控的非负电荷的核苷酸间键联。
124.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的翼的核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联、天然磷酸酯核苷酸间键联或Rp手性核苷酸间键联。
125.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的翼的核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联或天然磷酸酯核苷酸间键联。
126.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的翼的核苷酸间键联独立地是非负电荷的核苷酸间键联。
127.如实施例124-126中任一项所述的组合物，其中该百分比是50％或更多。
128.如实施例124-126中任一项所述的组合物，其中该百分比是60％或更多。
129.如实施例124-126中任一项所述的组合物，其中该百分比是75％或更多。
130.如实施例124-126中任一项所述的组合物，其中该百分比是80％或更多。
131.如实施例124-126中任一项所述的组合物，其中该百分比是90％或更多。
132.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸各自包含非负电荷的核苷酸间键联和天然磷酸酯核苷酸间键联。
133.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸各自包含非负电荷的核苷酸间键联、天然磷酸酯核苷酸间键联和Rp手性核苷酸间键联。
134.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中翼包含非负电荷的核苷酸间键联和天然磷酸酯核苷酸间键联。
135.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中翼包含非负电荷的核苷酸间键联、天然磷酸酯核苷酸间键联和Rp手性核苷酸间键联。
136.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中核心包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非负电荷的核苷酸间键联。
137.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中相同寡核苷酸的所有非负电荷的核苷酸间键联均具有相同的构造。
138.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些非负电荷的核苷酸间键联各自独立地具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构。
139.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些非负电荷的核苷酸间键联各自独立地具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构。
140.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些非负电荷的核苷酸间键联各自独立地具有式II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构。
141.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些非负电荷的核苷酸间键联各自独立地具有式II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2、或其盐形式的结构。
142.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联，该核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。
143.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该骨架键联模式包含至少一个中性核苷酸间键联，该中性核苷酸间键联是或包含三唑、中性三唑、炔烃或环状胍。
144.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该寡核苷酸类型包括以下中的任一项：胆固醇；左旋肉碱(酰胺和氨基甲酸酯键)；叶酸；藤黄酸；可切割脂质(1，2-甘油二月桂酸酯和酯键)；胰岛素受体配体；CPP；葡萄糖(三触角和六触角)或甘露糖(三触角和六触角，α和β)。
145.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该寡核苷酸类型是表A1中列出的任何寡核苷酸。
146.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸各自包含任选地通过接头部分与该寡核苷酸的寡核苷酸链缀合的化学部分，其中该化学部分包含碳水化合物部分，肽部分，受体配体部分，或具有-N(R1)2、-N(R1)3或-N＝C(N(R1)2)2的结构的部分。
147.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸各自包含任选地通过接头部分与该寡核苷酸的寡核苷酸链缀合的化学部分，其中该化学部分包含胍部分。
148.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些寡核苷酸各自包含任选地通过接头部分与该寡核苷酸的寡核苷酸链缀合的化学部分，其中该化学部分包含-N＝C(N(CH3)2)2。
149.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中具有该特定寡核苷酸类型的碱基序列的该组合物中的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的寡核苷酸是属于该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。
150.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中具有该特定寡核苷酸类型的碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的该组合物中的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的寡核苷酸是属于该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。
151.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些特定类型的寡核苷酸在结构上是相同的。
152.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联是氨基磷酸酯键联。
153.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联包含胍部分。
154.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I：
Figure BPA0000295055720009921
Figure BPA0000295055720009931
或其盐形式，其中：
PL是P(＝W)、P或P→B(R’)3；
W是O、N(-L-R5)、S或Se；
R1和R5各自独立地是-H、-L-R’、卤素、-CN、-NO2、-L-Si(R’)3、-OR’、-SR’或-N(R’)2；
X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R5)-或L；
每个L独立地是共价键或选自具有1-10个杂原子的C1-30脂肪族基团和C1-30杂脂肪族基团的任选地经取代的二价直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换；C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR’)-、-P(O)(SR’)-、-P(O)(R’)-、-P(O)(NR’)-、-P(S)(OR’)-、-P(S)(SR’)-、-P(S)(R’)-、-P(S)(NR’)-、-P(R’)-、-P(OR’)-、-P(SR’)-、-P(NR’)-、-P(OR’)[B(R’)3]-、-OP(O)(OR’)O-、-OP(O)(SR’)O-、-OP(O)(R’)O-、-OP(O)(NR’)O-、-OP(OR’)O-、-OP(SR’)O-、-OP(NR’)O-、-OP(R’)O-或-OP(OR’)[B(R’)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个R′独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居于它们之间的该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
155.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式I或其盐形式的结构。
156.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-1或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720009941
157.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式I-n-1或其盐形式的结构。
158.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-2或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720009942
159.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-3或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720009943
160.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式I-n-3或其盐形式的结构。
161.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-3或其盐形式的结构，其中来自一个-N(R’)2的一个R′和来自另一个-N(R’)2的一个R′与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，除居于之间的原子之外，该环还具有0-10个杂原子。
162.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式I-n-3或其盐形式的结构，其中来自一个-N(R’)2的一个R′和来自另一个-N(R’)2的一个R′与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，除居于之间的原子之外，该环还具有0-10个杂原子。
163.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-3或其盐形式的结构，其中来自一个-N(R’)2的一个R′和来自另一个-N(R’)2的一个R′与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的5元单环，该环具有不超过两个氮原子。
164.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式I-n-3或其盐形式的结构，其中来自一个-N(R’)2的一个R′和来自另一个-N(R’)2的一个R′与居于它们之间的原子一起形成任选地经取代的5元单环，该环具有不超过两个氮原子。
165.如实施例159-162中任一项所述的组合物，其中该形成的环是饱和环。
166.如实施例159-162中任一项所述的组合物，其中该形成的环是部分不饱和环。
167.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-4或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720009951
168.如实施例167所述的组合物，其中La是共价键。
169.如实施例167所述的组合物，其中La是-N(R1)-。
170.如实施例167所述的组合物，其中La是-N(R’)-。
171.如实施例167所述的组合物，其中La是-N(R)-。
172.如实施例167所述的组合物，其中La是-S(O)-。
173.如实施例167所述的组合物，其中La是-S(O)2-。
174.如实施例167所述的组合物，其中La是-S(O)2N(R’)-。
175.如实施例167-174中任一项所述的组合物，其中Lb是共价键。
176.如实施例167-174中任一项所述的组合物，其中Lb是-N(R1)-。
177.如实施例167-174中任一项所述的组合物，其中Lb是-N(R’)-。
178.如实施例167-174中任一项所述的组合物，其中Lb是-N(R)-。
179.如实施例167-174中任一项所述的组合物，其中Lb是-S(O)-。
180.如实施例167-174中任一项所述的组合物，其中Lb是-S(O)2-。
181.如实施例167-174中任一项所述的组合物，其中Lb是-S(O)2N(R’)-。
182.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II：
Figure BPA0000295055720009961
或其盐形式，其中：
PL是P(＝W)、P或P→B(R’)3；
W是O、N(-L-R5)、S或Se；
X、Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R5)-或L；
R5是-H、-L-R’、卤素、-CN、-NO2、-L-Si(R’)3、-OR’、-SR’或-N(R’)2；
环AL是具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环；
每个Rs独立地是-H、卤素、-CN、-N3、-NO、-NO2、-L-R’、-L-Si(R)3、-L-OR’、-L-SR’、-L-N(R’)2、-O-L-R’、-O-L-Si(R)3、-O-L-OR’、-O-L-SR’或-O-L-N(R’)2；
g是0-20；
每个L独立地是共价键或选自具有1-10个杂原子的C1-30脂肪族基团和C1-30杂脂肪族基团的任选地经取代的二价直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR’)-、-P(O)(SR’)-、-P(O)(R’)-、-P(O)(NR’)-、-P(S)(OR’)-、-P(S)(SR’)-、-P(S)(R’)-、-P(S)(NR’)-、-P(R’)-、-P(OR’)-、-P(SR’)-、-P(NR’)-、-P(OR’)[B(R’)3]-、-OP(O)(OR’)O-、-OP(O)(SR’)O-、-OP(O)(R’)O-、-OP(O)(NR’)O-、-OP(OR’)O-、-OP(SR’)O-、-OP(NR’)O-、-OP(R’)O-或-OP(OR’)[B(R’)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个R′独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居于它们之间的该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
183.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II或其盐形式的结构。
184.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-a-1：
Figure BPA0000295055720009981
或其盐形式。
185.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-a-2：
Figure BPA0000295055720009982
或其盐形式。
186.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II-a-1或II-a-2或其盐形式的结构。
187.如实施例182-186中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-b-1：
Figure BPA0000295055720009983
或其盐形式的结构，其中g是0-18。
188.如实施例182-187中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-b-2：
Figure BPA0000295055720009984
或其盐形式的结构，其中g是0-18。
189.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II-b-1或II-b-2或其盐形式的结构。
190.如实施例182-188中任一项所述的组合物，其中环AL是具有0-10个杂原子(除式II-b-1或II-b-2的两个氮原子外)的任选地经取代的3-20元单环。
191.如实施例182-188中任一项所述的组合物，其中环AL是任选地经取代的5元单环饱和环。
192.如实施例182-191中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-c-1：
Figure BPA0000295055720009991
或其盐形式的结构，其中g是0-4。
193.如实施例182-193中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式II-c-2：
Figure BPA0000295055720009992
或其盐形式的结构，其中g是0-4。
194.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地具有式II-c-1或II-c-2或其盐形式的结构。
195.如实施例182-193中任一项所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联具有相同的结构。
196.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中(如果适用)不是非负电荷的核苷酸间键联的、这些多种寡核苷酸中的每个核苷酸间键联独立地具有式I的结构。
197.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸中的每个核苷酸间键联独立地具有式I的结构。
198.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个PL是P(＝W)。
199.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个PL独立地是P(＝W)。
200.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个W是O。
201.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个W是O。
202.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个W是S。
203.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个W独立地是N(-L-R5)。
204.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个核苷酸间键联独立地具有式III或其盐形式的结构：
Figure BPA0000295055720010001
205.如实施例204所述的组合物，其中PN是P(＝N-L-R5)。
206.如实施例204所述的组合物，其中PN是
Figure BPA0000295055720010002
207.如实施例204所述的组合物，其中PN是
Figure BPA0000295055720010003
208.如实施例207所述的组合物，其中La是共价键。
209.如实施例207所述的组合物，其中La是-N(R1)-。
210.如实施例207所述的组合物，其中La是-N(R’)-。
211.如实施例207所述的组合物，其中La是-N(R)-。
212.如实施例207所述的组合物，其中La是-S(O)-。
213.如实施例207所述的组合物，其中La是-S(O)2-。
214.如实施例207所述的组合物，其中La是-S(O)2N(R’)-。
215.如实施例204所述的组合物，其中PN是
Figure BPA0000295055720010011
216.如实施例204所述的组合物，其中PN是
Figure BPA0000295055720010012
217.如实施例204所述的组合物，其中PN是
Figure BPA0000295055720010013
218.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个Y是O。
219.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个Y是O。
220.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个Z是O。
221.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个Z是O。
222.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个X是O。
223.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中一个或多个X是S。
224.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720010014
的结构。
225.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720010015
的结构。
226.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BPA0000295055720010016
的结构。
227.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中对于不是非负电荷的核苷酸间键联的具有式I或其盐形式的每个核苷酸间键联，X独立地是O或S，并且-L-R1是-H(分别是天然磷酸酯键联或硫代磷酸酯键联)。
228.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸中的每个硫代磷酸酯键联(如果有的话)独立地是手性受控的核苷酸间键联。
229.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中至少一个非负电荷的核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联。
230.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中至少一个非负电荷的核苷酸间键联是手性受控的核苷酸间键联。
231.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸包含靶向部分，其中该靶向部分通过接头独立地与寡核苷酸骨架连接。
232.如实施例231所述的组合物，其中该靶向部分是碳水化合物部分。
233.如实施例231或232所述的组合物，其中该靶向部分包含或是GalNac部分。
234.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸包含脂质部分，其中该脂质部分通过接头独立地与寡核苷酸骨架连接。
235.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中在该组合物的条件下一个或多个非中性核苷酸间键联独立地作为盐形式存在。
236.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中在该组合物的条件下一个或多个负电荷的核苷酸间键联独立地作为盐形式存在。
237.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中在该组合物的条件下一个或多个负电荷的核苷酸间键联独立地作为金属盐存在。
238.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中在该组合物的条件下每个负电荷的核苷酸间键联独立地作为金属盐存在。
239.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中在该组合物的条件下每个负电荷的核苷酸间键联独立地作为钠盐存在。
240.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸作为盐存在，其中每个负电荷的核苷酸间键联独立地是天然磷酸酯键联(其中性形式是-O-P(O)(OH)-O)或硫代磷酸酯核苷酸间键联(其中性形式是-O-P(O)(SH)-O)。
241.一种寡核苷酸组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个手性受控的核苷酸间键联；以及
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个非负电荷的核苷酸间键联。
242.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中至少一个非负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。
243.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中中性核苷酸间键联是或包含三唑、中性三唑、炔烃或环状胍。
244.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物的特征在于，当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
245.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中该转录物是肌营养不良蛋白转录物。
246.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中该转录物的剪接发生改变，使得外显子45、51或53或者多个外显子的跳读水平增加。
247.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物能够介导靶基因的敲低。
248.一种寡核苷酸组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含胆固醇；左旋肉碱(酰胺和氨基甲酸酯键)；叶酸；可切割脂质(1，2-甘油二月桂酸酯和酯键)；胰岛素受体配体；藤黄酸；CPP；葡萄糖(三触角和六触角)或甘露糖(三触角和六触角，α和β)。
249.如实施例248所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个手性受控的核苷酸间键联。
250.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该寡核苷酸组合物的特征在于，当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
251.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物是肌营养不良蛋白转录物。
252.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物的剪接发生改变，使得外显子45、51或53或者多个外显子的跳读水平增加。
253.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该寡核苷酸组合物能够介导靶基因的敲低。
254.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中每个杂原子独立地是硼、氮、氧、硅、硫或磷。
255.一种药物组合物，该药物组合物包含如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸组合物、和药学上可接受的载体。
256.一种用于改变靶转录物的剪接的方法，该方法包括施用如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸组合物。
257.如实施例256所述的方法，其中相对于不存在该组合物，改变该靶转录物的剪接。
258.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该改变是相对于不存在该组合物，一个或多个外显子以增加的水平被跳读。
259.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该靶转录物是肌营养不良蛋白的前-mRNA。
260.如前述实施例中任一项所述的方法，其中肌营养不良蛋白的外显子45相对于不存在该组合物以增加的水平被跳读。
261.如前述实施例中任一项所述的方法，其中肌营养不良蛋白的外显子51相对于不存在该组合物以增加的水平被跳读。
262.如实施例256-259中任一项所述的方法，其中肌营养不良蛋白的外显子53相对于不存在该组合物以增加的水平被跳读。
263.如前述实施例中任一项所述的方法，其中由外显子被跳读的mRNA编码的蛋白质提供比无外显子跳读的相应mRNA编码的蛋白质更好的一种或多种功能。
264.一种用于治疗肌肉营养不良、杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的方法，该方法包括向易患该疾病或患有该疾病的受试者施用如前述实施例中任一项所述的组合物。
265.一种用于治疗肌肉营养不良、杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的方法，该方法包括向易患该疾病或患有该疾病的受试者施用包含本文所披露的任何寡核苷酸的组合物。
266.一种用于治疗肌肉营养不良、杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的方法，该方法包括(a)向易患该疾病或患有该疾病的受试者施用包含本文所披露的任何寡核苷酸的组合物，和(b)向该受试者施用另外的治疗，该另外的治疗能够预防、治疗、减轻或减缓肌肉营养不良、杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的进展。
267.如实施例266所述的方法，其中该另外的治疗是第二寡核苷酸。
268.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物剪接系统包含成肌细胞或肌小管。
269.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物剪接系统包含成肌细胞。
270.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该转录物剪接系统包含成肌细胞，其在预分化0、4或7天后与该组合物接触。
271.一种包含组合的组合物，该组合包含：(a)如前述实施例中任一项所述的第一组合物；(b)如前述实施例中任一项所述的第二组合物；和任选地(c)如前述实施例中任一项所述的第三组合物，其中该第一、第二和第三组合物是不同的。
272.一种用于制备寡核苷酸或其寡核苷酸组合物的方法，该方法包括提供具有以下结构的化合物：
Figure BPA0000295055720010061
或其盐。
273.一种用于制备寡核苷酸或其寡核苷酸组合物的方法，该方法包括提供具有以下结构的化合物：
Figure BPA0000295055720010062
或其盐。
274.一种用于制备寡核苷酸或其寡核苷酸组合物的方法，该方法包括提供具有以下结构的化合物：
Figure BPA0000295055720010063
Figure BPA0000295055720010064
或其盐。
275.如实施例272-274中任一项所述的方法，其中该化合物是立体化学纯的。
276.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、CA-6、CA-7、CA-8、CA-9、CA-10、CA-11或CA-12的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
277.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-2的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
278.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-3的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
279.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-4的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
280.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-5的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
281.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-6的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
282.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-7的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
283.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-8的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
284.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-9的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
285.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-10的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
286.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-11的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
287.如实施例272-275中任一项所述的方法，其中该化合物是表CA-12的化合物，或其相关的非对映异构体或对映异构体。
288.一种用于制备寡核苷酸或其寡核苷酸组合物的方法，该方法包括提供包含手性助剂部分的亚磷酰胺化合物，该手性助剂部分具有以下的结构：
Figure BPA0000295055720010071
Figure BPA0000295055720010081
289.一种用于制备寡核苷酸或其寡核苷酸组合物的方法，该方法包括提供具有以下的结构的亚磷酰胺化合物：
Figure BPA0000295055720010082
Figure BPA0000295055720010083
或其盐。
290.如实施例272-289中任一项所述的方法，其中W1是-NG5-。
291.如实施例272-290中任一项所述的方法，其中G5以及G3和G4之一一起形成具有0-3个杂原子(除-NG5-的氮原子之外)的任选地经取代的3-8元饱和环。
292.如实施例272-290中任一项所述的方法，其中G5以及G3和G4之一一起形成不具有杂原子(除-NG5-的氮原子之外)的任选地经取代的5元饱和环。
293.如实施例272-292中任一项所述的方法，其中W2是-O-。
294.如实施例272-293中任一项所述的方法，其中G2包含吸电子基团。
295.如实施例272-293中任一项所述的方法，其中G2是被一个或多个吸电子基团取代的甲基。
296.如实施例294-295中任一项所述的方法，其中吸电子基团是-CN，-NO2，卤素，-C(O)R1，-C(O)OR’，-C(O)N(R’)2，-S(O)R1，-S(O)2R1，-P(W)(R1)2，-P(O)(R1)2，-P(O)(OR’)2或-P(S)(R1)2，或者是被-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2或-P(S)(R1)2中的一个或多个取代的芳基或杂芳基。
297.如实施例294-295中任一项所述的方法，其中吸电子基团是-CN，-NO2，卤素，-C(O)R1，-C(O)OR’，-C(O)N(R’)2，-S(O)R1，-S(O)2R1，-P(W)(R1)2，-P(O)(R1)2，-P(O)(OR’)2或-P(S)(R1)2，或者是被-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2或-P(S)(R1)2中的一个或多个取代的苯基。
298.如实施例294-295中任一项所述的方法，其中吸电子基团是-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2、或-P(S)(R1)2。
299.如实施例272-294中任一项所述的方法，其中G2是-L’-L”-R’，其中L’是-C(R)2-或任选地经取代的-CH2-，并且L”是共价键、-P(O)(R’)-、-P(O)(R’)O-、-P(O)(OR’)-、-P(O)(OR’)O-、-P(O)[N(R’)]-、-P(O)[N(R’)]O-、-P(O)[N(R’)][N(R’)]-、-P(S)(R’)-、-S(O)2-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-S(O)-、-C(O)-或-C(O)N(R’)-。
300.如实施例272-294中任一项所述的方法，其中G2是-L’-L”-R’，其中L’是-C(R)2-或任选地经取代的-CH2-，并且L”是-P(O)(R’)-、-P(O)(R’)O-、-P(O)(OR’)-、-P(O)(OR’)O-、-P(O)[N(R’)]-、-P(O)[N(R’)]O-、-P(O)[N(R’)][N(R’)]-、-P(S)(R’)-、-S(O)2-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-S(O)-、-C(O)-或-C(O)N(R’)-。
301.如实施例272-300中任一项所述的方法，其中G2是-L’-S(O)2R’。
302.如实施例301所述的方法，其中R’是任选地经取代的C1-6脂肪族。
303.如实施例301所述的方法，其中R’是任选地经取代的C1-6烷基。
304.如实施例301所述的方法，其中R’是甲基、异丙基或叔丁基。
305.如实施例301所述的方法，其中R’是任选地经取代的苯基。
306.如实施例301所述的方法，其中R’是苯基。
307.如实施例301所述的方法，其中R’是经取代的苯基。
308.如实施例272-300中任一项所述的方法，其中G2是-L’-P(O)(R’)2。
309.如实施例308所述的方法，其中一个R’是任选地经取代的C1-6脂肪族。
310.如实施例308所述的方法，其中一个R’是任选地经取代的C1-6烷基。
311.如实施例308所述的方法，其中一个R’是任选地经取代的苯基。
312.如实施例308所述的方法，其中一个R’是苯基。
313.如实施例308所述的方法，其中一个R’是经取代的苯基。
314.如实施例309-313中任一项所述的方法，其中另一个R’是任选地经取代的C1-6脂肪族。
315.如实施例309-313中任一项所述的方法，其中另一个R’是任选地经取代的C1-6烷基。
316.如实施例309-313中任一项所述的方法，其中另一个R’是任选地经取代的苯基。
317.如实施例309-313中任一项所述的方法，其中另一个R’是苯基。
318.如实施例309-313中任一项所述的方法，其中另一个R’是经取代的苯基。
319.如实施例299-318中任一项所述的方法，其中L’是-C(R’)2-。
320.如实施例299-318中任一项所述的方法，其中L’是任选地经取代的-CH2-。
321.如实施例299-318中任一项所述的方法，其中L’是-CH2-。
322.如实施例272-321中任一项所述的方法，该方法包括提供一种或多种另外的化合物，其中每种化合物独立地是如实施例272-321中任一项所述的化合物。
323.如实施例322所述的方法，其中另外的化合物具有与该化合物不同的结构。
324.如实施例322所述的方法，其中在另外的化合物中，G2是-L’-Si(R)3，其中每个R独立地不是-H。
325.如实施例322所述的方法，其中在另外的化合物中，G2是-CH2SiCH3Ph2。
326.如实施例272-325中任一项所述的方法，该方法包括一个或多个循环，每个循环独立地包括以下或由其组成：
1)去封闭；
2)偶联；
3)任选地第一加帽；
4)修饰；和
5)任选地第二加帽。
327.一种用于制备寡核苷酸或其组合物的方法，该方法包括一个或多个循环，每个循环独立地包括以下或由其组成：
1)去封闭；
2)偶联；
3)任选地第一加帽；
4)修饰；以及
5)任选地第二加帽。
328.如实施例326-327中任一项所述的方法，其中至少一个循环包含1)至5)或由其组成。
329.如实施例326-328中任一项所述的方法，其中这些步骤从1)至5)顺序进行。
330.如实施例326-329中任一项所述的方法，其中进行所述这些循环直至获得所希望的长度的寡核苷酸。
331.如实施例326-330中任一项所述方法，其中去封闭去除5’--OH上的保护基团并提供游离5′-OH。
332.如实施例331所述的方法，其中该保护基团是R’-C(O)-。
333.如实施例331所述的方法，其中该保护基团是DMTr。
334.如实施例331-333中任一项所述的方法，该方法包括使待去封闭的寡核苷酸与酸接触。
335.如实施例272-334中任一项所述的方法，该方法包括偶联，该偶联包括：1)提供亚磷酰胺；和2)使亚磷酰胺与寡核苷酸反应，其中在该亚磷酰胺的磷与该寡核苷酸的5′-OH之间形成P-O键。
336.如实施例272-335中任一项所述的方法，该方法包括偶联，该偶联包括：1)提供亚磷酰胺；和2)使亚磷酰胺与寡核苷酸反应，其中在该亚磷酰胺的磷与该寡核苷酸的5′-OH之间形成P-O键，其中该亚磷酰胺是如实施例288-321中任一项所述的化合物。
337.如实施例272-336中任一项所述的方法，该方法包括偶联，该偶联包括：1)提供亚磷酰胺；和2)使亚磷酰胺与寡核苷酸反应，其中在该亚磷酰胺的磷与该寡核苷酸的5′-OH之间形成P-O键，其中该亚磷酰胺是如实施例288-293中任一项所述的化合物，其中G2是-L’-Si(R)3，其中每个R独立地不是-H。
338.如实施例337所述的方法，其中G2是-CH2SiCH3Ph2。
339.如实施例336-338中任一项所述的方法，其中该偶联形成核苷酸间键联，其具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的立体选择性。
340.如实施例339所述的方法，其中该形成的核苷酸间键联是具有式I或其盐形式的核苷酸间键联。
341.如实施例340所述的方法，其中-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720010121
Figure BPA0000295055720010122
342.如实施例340或341所述的方法，其中PL是P。
343.如实施例272-342中任一项所述的方法，该方法包括偶联，该偶联包括：1)提供亚磷酰胺；和2)使亚磷酰胺与寡核苷酸反应，其中在该亚磷酰胺的磷与该寡核苷酸的5′-OH之间形成P-O键，其中该亚磷酰胺是用于寡核苷酸合成的标准亚磷酰胺，其中该磷原子键合至受保护的核苷、-N(i-Pr)2和2-氰基乙基。
344.如实施例272-343中任一项所述的方法，该方法包括第一加帽，该第一加帽包括：1)提供酰化试剂，和2)使寡核苷酸与该酰化试剂接触，其中该第一加帽将核苷酸间键联的氨基基团加帽。
345.如实施例272-344中任一项所述的方法，该方法包括第一加帽，该第一加帽形成具有式I或其盐形式的核苷酸间键联，其中-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720010131
Figure BPA0000295055720010132
346.如实施例345所述的方法，其中PL是P并且R1是-C(O)R。
347.如实施例272-346中任一项所述的方法，其中第一加帽在如实施例339所述的每次偶联后进行。
348.如实施例272-347中任一项所述的方法，该方法包括修饰步骤，该修饰步骤是或包含硫化。
349.如实施例348所述的方法，其中该硫化将＝S安装在键联磷上。
350.如实施例348或349所述的方法，其中该硫化形成具有式I或其盐形式的核苷酸间键联，其中PL是P(＝S)。
351.如实施例350所述的方法，其中-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720010133
Figure BPA0000295055720010134
352.如实施例351所述的方法，其中R1是-C(O)R。
353.如实施例272-352中任一项所述的方法，该方法包括修饰步骤，该修饰步骤是或包括氧化。
354.如实施例348所述的方法，其中该硫化将＝O安装在键联磷上。
355.如实施例272-354中任一项所述的方法，该方法包括修饰步骤，该修饰步骤将＝N-L-R5安装在键联磷上。
356.如实施例272-354中任一项所述的方法，该方法包括修饰步骤，该修饰步骤将键联磷转化为
Figure BPA0000295055720010141
Figure BPA0000295055720010142
357.如实施例272-356中任一项所述的方法，该方法包括修饰步骤，该修饰步骤包括使该寡核苷酸与叠氮基咪唑啉盐接触。
358.如实施例272-356中任一项所述的方法，该方法包括修饰步骤，该修饰步骤包括使该寡核苷酸与包含
Figure BPA0000295055720010143
Figure BPA0000295055720010144
的化合物接触。
359.如实施例272-356中任一项所述的方法，该方法包括修饰步骤，该修饰步骤包括使该寡核苷酸与具有
Figure BPA0000295055720010151
Q-或
Figure BPA0000295055720010152
Q-的结构的化合物接触，其中Q-是阴离子。
360.如实施例359所述的方法，其中Q-是F-、Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、TfO-、Tf2N-、AsF6 -、ClO4 -或SbF6 -。
361.如实施例360所述的方法，其中Q-是PF6 -。
362.如实施例272-362中任一项所述的方法，其中修饰步骤形成具有式I或其盐形式的核苷酸间键联，其中PL是P(＝N-L-R5)。
363.如实施例272-362中任一项所述的方法，其中修饰步骤形成具有式III或其盐形式的核苷酸间键联。
364.如实施例362或363所述的方法，其中-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720010153
Figure BPA0000295055720010154
365.如实施例364所述的方法，其中R1是-C(O)R。
366.如实施例272-365中任一项所述的方法，该方法包括第二加帽，该第二加帽将游离5’-OH加帽。
367.如实施例272-366中任一项所述的方法，该方法包括第二加帽，该第二加帽将游离5’-OH加帽，其中在每个循环中均进行第二加帽。
368.如实施例272-366中任一项所述的方法，该方法包括第二加帽，该第二加帽将游离5’-OH加帽，其中在每个循环中均进行第二加帽，该每个循环后接着是另一个循环。
369.如实施例366-368中任一项所述的方法，其中5’-OH被加帽为-OAc。
370.如实施例272-369中任一项所述的方法，其中将该寡核苷酸附接至固体支持物。
371.如实施例370所述的方法，其中该固体支持物是CPG。
372.如实施例370-371中任一项所述的方法，该方法包括接触，其中使该寡核苷酸与碱基接触。
373.如实施例372所述的方法，其中该接触在基本上不存在水的情况下进行。
374.如实施例372或373所述的方法，其中该接触是在寡核苷酸脱保护和切割之前达到该寡核苷酸长度之后进行的。
375.如实施例372-374中任一项所述的方法，其中该碱是具有NR3的结构的胺碱。
376.如实施例375所述的方法，其中该碱是三乙胺。
377.如实施例375所述的方法，其中该碱是N，N-二乙胺。
378.如实施例372-377中任一项所述的方法，其中该接触去除手性助剂。
379.如实施例372-378中任一项所述的方法，其中该接触去除-X-L-R1基团。
380.如实施例379所述的方法，其中-X-L-R1是
Figure BPA0000295055720010161
Figure BPA0000295055720010162
381.如实施例372-380中任一项所述的方法，其中该接触形成具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1或II-d-2的核苷酸间键联，其中PL是P(O)。
382.如实施例364-381中任一项所述的方法，其中G2包含吸电子基团。
383.如实施例364-382中任一项所述的方法，其中G2是被一个或多个吸电子基团取代的甲基。
384.如实施例382-383中任一项所述的方法，其中吸电子基团是-CN，-NO2，卤素，-C(O)R1，-C(O)OR’，-C(O)N(R’)2，-S(O)R1，-S(O)2R1，-P(W)(R1)2，-P(O)(R1)2，-P(O)(OR’)2或-P(S)(R1)2，或者是被-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2或-P(S)(R1)2中的一个或多个取代的芳基或杂芳基。
385.如实施例382-383中任一项所述的方法，其中吸电子基团是-CN，-NO2，卤素，-C(O)R1，-C(O)OR’，-C(O)N(R’)2，-S(O)R1，-S(O)2R1，-P(W)(R1)2，-P(O)(R1)2，-P(O)(OR’)2或-P(S)(R1)2，或者是被-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2或-P(S)(R1)2中的一个或多个取代的苯基。
386.如实施例382-383中任一项所述的方法，其中吸电子基团是-CN、-NO2、卤素、-C(O)R1、-C(O)OR’、-C(O)N(R’)2、-S(O)R1、-S(O)2R1、-P(W)(R1)2、-P(O)(R1)2、-P(O)(OR’)2、或-P(S)(R1)2。
387.如实施例364-386中任一项所述的方法，其中G2是-L’-L”-R’，其中L’是-C(R)2-或任选地经取代的-CH2-，并且L”是共价键、-P(O)(R’)-、-P(O)(R’)O-、-P(O)(OR’)-、-P(O)(OR’)O-、-P(O)[N(R’)]-、-P(O)[N(R’)]O-、-P(O)[N(R’)][N(R’)]-、-P(S)(R’)-、-S(O)2-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-S(O)-、-C(O)-或-C(O)N(R’)-。
388.如实施例364-386中任一项所述的方法，其中G2是-L’-L”-R’，其中L’是-C(R)2-或任选地经取代的-CH2-，并且L”是-P(O)(R’)-、-P(O)(R’)O-、-P(O)(OR’)-、-P(O)(OR’)O-、-P(O)[N(R’)]-、-P(O)[N(R’)]O-、-P(O)[N(R’)][N(R’)]-、-P(S)(R’)-、-S(O)2-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-S(O)-、-C(O)-或-C(O)N(R’)-。
389.如实施例364-388中任一项所述的方法，其中G2是-L’-S(O)2R’。
390.如实施例389所述的方法，其中R’是任选地经取代的C1-6脂肪族。
391.如实施例389所述的方法，其中R’是任选地经取代的C1-6烷基。
392.如实施例389所述的方法，其中R’是甲基、异丙基或叔丁基。
393.如实施例389所述的方法，其中R’是任选地经取代的苯基。
394.如实施例389所述的方法，其中R’是苯基。
395.如实施例389所述的方法，其中R’是经取代的苯基。
396.如实施例364-388中任一项所述的方法，其中G2是-L’-P(O)(R’)2。
397.如实施例396所述的方法，其中一个R’是任选地经取代的C1-6脂肪族。
398.如实施例396所述的方法，其中一个R’是任选地经取代的C1-6烷基。
399.如实施例396所述的方法，其中一个R’是任选地经取代的苯基。
400.如实施例396所述的方法，其中一个R’是苯基。
401.如实施例396所述的方法，其中一个R’是经取代的苯基。
402.如实施例397-401中任一项所述的方法，其中另一个R’是任选地经取代的C1-6脂肪族。
403.如实施例397-401中任一项所述的方法，其中另一个R’是任选地经取代的C1-6烷基。
404.如实施例309-313中任一项所述的方法，其中另一个R’是任选地经取代的苯基。
405.如实施例309-313中任一项所述的方法，其中另一个R’是苯基。
406.如实施例309-313中任一项所述的方法，其中另一个R’是经取代的苯基。
407.如实施例387-406中任一项所述的方法，其中L’是-C(R’)2-。
408.如实施例387-406中任一项所述的方法，其中L’是任选地经取代的-CH2-。
409.如实施例387-406中任一项所述的方法，其中L’是-CH2-。
410.如实施例372-409中任一项所述的方法，其中该接触去除2’-氰基乙基。
411.如实施例372-410中任一项所述的方法，其中该接触形成天然磷酸酯键联或其盐形式。
412.如实施例272-410中任一项所述的方法，该方法包括去除另一个手性助剂或基团，该手性助剂或基团具有与如实施例378-410中任一项所述的不同的结构。
413.如实施例272-410中任一项所述的方法，该方法包括去除
Figure BPA0000295055720010191
Figure BPA0000295055720010192
其中G2是-L’-Si(R)3，其中每个R独立地不是-H。
414.如实施例413所述的方法，其中G2是-CH2SiCH3Ph2。
415.如实施例412-414中任一项所述的方法，该方法包括使寡核苷酸与氟化物接触。
416.如实施例412-414中任一项所述的方法，该方法包括使寡核苷酸与包含TEA-HF和碱的溶液接触。
417.如实施例272-416中任一项所述的方法，该方法包括从固体支持物切割寡核苷酸。
418.如实施例272-417中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸或其组合物是如实施例1-254中任一项所述的寡核苷酸或组合物。
419.如实施例272-321中任一项所述的化合物，或相关的非对映异构体或对映异构体。
420.一种寡核苷酸，其中该寡核苷酸是WV-20104、WV-20103、WV-20102、WV-20101、WV-20100、WV-20099、WV-20098、WV-20097、WV-20096、WV-20095、WV-20094、WV-20106、WV-20119、WV-20118、WV-13739、WV-13740、WV-9079、WV-9082、WV-9100、WV-9096、WV-9097、WV-9106、WV-9133、WV-9148、WV-9154、WV-9898、WV-9899、WV-9900、WV-9906、WV-9907、WV-9908、WV-9909、WV-9756、WV-9757、WV-9517、WV-9714、WV-9715、WV-9519、WV-9521、WV-9747、WV-9748、WV-9749、WV-9897、WV-9898、WV-9900、WV-9899、WV-9906、WV-9912、WV-9524、WV-9912、WV-9906、WV-9900、WV-9899、WV-9899、WV-9898、WV-9898、WV-9898、WV-9898、WV-9898、WV-9897、WV-9897、WV-9897、WV-9897、WV-9897、WV-9747、WV-9714、WV-9699、WV-9517、WV-9517、WV-13409、WV-13408、WV-12887、WV-12882、WV-12881、WV-12880、WV-12880、WV-WV12880、WV-12878、WV-12877、WV-12877、WV-12876、WV-12873、WV-12872、WV-12559、WV-12559、WV-12558、WV-12558、WV-12557、WV-12556、WV-12556、WV-12555、WV-12555、WV-12554、WV-12553、WV-12129、WV-12127、WV-12125、WV-12123、WV-11342、WV-11342、WV-11341、WV-11341、WV-11340、WV-10672、WV-10671、WV-10670、WV-10461、WV-10455、WV-9897、WV-9898、WV-13826、WV-13827、WV-13835、WV-12880、WV-14344、WV-13864、WV-13835、WV-14791、WV-14344、WV-13754、WV-13766，、WV-11086、WV-11089、WV-17859、WV-17860、WV-20070、WV-20073、WV-20076、WV-20052、WV-20099、WV-20049、WV-20085、WV-20087、WV-20034、WV-20046、WV-20052、WV-20061、WV-20064、WV-20067、WV-20092、WV-20091、WV-20093、WV-20084、WV-9738、WV-9739、WV-9740、WV-9741、WV-15860、WV-15862、WV-11084、WV-11086、WV-11088、WV-11089、WV-14522、WV-14523、WV-17861、WV-17862、WV-13815、WV-13816、WV-13817、WV-13780、WV-17862、WV-17863、WV-17864、WV-17865、WV-17866、WV-20082、WV-20081、WV-20080、WV-20079、WV-20076、WV-20075、WV-20074、WV-20073、WV-20072、WV-20071、WV-20064、WV-20059、WV-20058、WV-20057、WV-20056、WV-20053、WV-20052、WV-20051、WV-20050、WV-20049、WV-20094、WV-20095、或其盐形式。
等效物
已经描述了本披露的一些说明性实施例，对于本领域技术人员来说显而易见的是，前述仅仅是说明性的而非限制性的，仅作为示例呈现。许多修改和其他说明性实施例在本领域普通技术人员的范围内，并且预期落入本披露的范围内。特别地，尽管本文呈现的许多示例涉及方法行为或系统元素的特定组合，但应理解，那些行为和那些元素能以其他方式组合以实现相同的目标。仅结合一个实施例讨论的行为、元素和特征不旨在从其他实施例中的相似角色中排除。此外，对于在以下权利要求中列举的一个或多个手段加功能限制(如果有的话)，这些手段不旨在限于本文披露的用于执行所列举功能的手段，而是旨在覆盖用于执行该列举的功能的任何手段(现在已知或以后开发的)。
在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数术语来修改权利要求元素，这本身并不表示一个权利要求元素相对于另一权利要求元素的任何优先、居先或次序，或执行方法的行为的时间顺序，而是仅用作标记，以区分具有相同名称的一个权利要求元素与具有相同名称的另一元素(但用于序数词)以区分权利要求元素。类似地，使用a)、b)等或i)、ii)等本身并不意味权利要求中的步骤的任何优先、居先或次序。类似地，在说明书中使用这些术语本身并不意味任何需要的优先、居先或次序。
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。本披露限于所提供的示例的范围。实施例旨在说明本发明的一个或多个方面，并且其他功能上等同的实施例也在本发明的范围内。除了本文示出和描述的那些之外，各种修改将通过前述描述对于本领域技术人员变得清楚并且处于所附权利要求的范围内。本发明的每个实施例不一定涵盖本发明的优点和目的。

Claims (53)

1.一种寡核苷酸组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个手性受控的核苷酸间键联；以及
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个非负电荷的核苷酸间键联。
2.一种寡核苷酸组合物，该组合物包含多种属于特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，该特定寡核苷酸类型由以下定义：
1)碱基序列；
2)骨架键联模式；
3)骨架手性中心模式；以及
4)骨架磷修饰模式，
其中：
该多种中的寡核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个手性受控的核苷酸间键联；以及
该寡核苷酸组合物的特征在于：当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
3.如权利要求2所述的寡核苷酸，其中该骨架键联模式包含至少一个非负电荷的核苷酸间键联。
4.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物，其中当该寡核苷酸组合物与转录物剪接系统中的转录物接触时，相对于在参考条件下所观察到的，该转录物的剪接发生改变，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物、及其组合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸，其中一个或多个非负电荷的核苷酸间键联独立地是手性受控的。
6.如权利要求5所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I：
Figure FPA0000295055710000021
或其盐形式，其中：
PL是P(＝W)、P或P→B(R’)3；
W是O、N(-L-R5)、S或Se；
R1和R5各自独立地是-H、-L-R’、卤素、-CN、-NO2、-L-Si(R’)3、-OR’、-SR’或-N(R’)2；
X是-N(-L-R5)-；
Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R5)-或L；
每个L独立地是共价键或选自具有1-10个杂原子的C1-30脂肪族基团和C1-30杂脂肪族基团的任选地经取代的二价直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR’)-、-P(O)(SR’)-、-P(O)(R’)-、-P(O)(NR’)-、-P(S)(OR’)-、-P(S)(SR’)-、-P(S)(R’)-、-P(S)(NR’)-、-P(R’)-、-P(OR’)-、-P(SR’)-、-P(NR’)-、-P(OR’)[B(R’)3]-、-OP(O)(OR’)O-、-OP(O)(SR’)O-、-OP(O)(R’)O-、-OP(O)(NR’)O-、-OP(OR’)O-、-OP(SR’)O-、-OP(NR’)O-、-OP(R’)O-或-OP(OR’)[B(R’)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个R’独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居于它们之间的该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
7.如权利要求5所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-3：
Figure FPA0000295055710000031
或其盐形式的结构，其中：
PL是P(＝W)、P或P→B(R’)3；
W是O、N(-L-R5)、S或Se；
R1和R5各自独立地是-H、-L-R’、卤素、-CN、-NO2、-L-Si(R’)3、-OR’、-SR’或-N(R’)2；
Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R5)-或L；
每个L独立地是共价键或选自具有1-10个杂原子的C1-30脂肪族基团和C1-30杂脂肪族基团的任选地经取代的二价直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR’)-、-P(O)(SR’)-、-P(O)(R’)-、-P(O)(NR’)-、-P(S)(OR’)-、-P(S)(SR’)-、-P(S)(R’)-、-P(S)(NR’)-、-P(R’)-、-P(OR’)-、-P(SR’)-、-P(NR’)-、-P(OR’)[B(R’)3]-、-OP(O)(OR’)O-、-OP(O)(SR’)O-、-OP(O)(R’)O-、-OP(O)(NR’)O-、-OP(OR’)O-、-OP(SR’)O-、-OP(NR’)O-、-OP(R’)O-或-OP(OR’)[B(R’)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个R’独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子一起形成除居于它们之间的该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
8.如权利要求5所述的组合物，其中非负电荷的核苷酸间键联具有
Figure FPA0000295055710000051
的结构。
9.如权利要求8所述的组合物，其中该非负电荷的核苷酸间键联
Figure FPA0000295055710000052
是手性受控的并且是Rp。
10.如权利要求8所述的组合物，其中该转录物是肌营养不良蛋白转录物。
11.如权利要求10所述的组合物，其中该转录物的剪接发生改变，使得外显子45、51或53或者多个外显子的跳读水平增加。
12.如权利要求8所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸中的每个手性核苷酸间键联独立地是手性受控的核苷酸间键联。
13.如权利要求8所述的组合物，其中该碱基序列是或包含表A1中任何寡核苷酸的碱基序列或包含其15个连续碱基。
14.如权利要求11所述的组合物，其中该寡核苷酸类型包括以下中的任何一种：胆固醇；左旋肉碱(酰胺和氨基甲酸酯键)；叶酸；藤黄酸；可切割脂质(1，2-甘油二月桂酸酯和酯键)；胰岛素受体配体；CPP；葡萄糖(三触角和六触角)或甘露糖(三触角和六触角，α和β)。
15.如权利要求11所述的组合物，其中每个非负电荷的核苷酸间键联独立地是以下核苷酸间键联：该核苷酸间键联中的至少50％在pH 7.4下以其非负电荷形式存在。
16.如权利要求11所述的组合物，其中这些多种寡核苷酸各自包含一个或多个糖修饰。
17.如权利要求16所述的组合物，其中一个或多个糖修饰是2′-F修饰。
18.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中每个杂原子独立地是硼、氮、氧、硅、硫或磷。
19.一种药物组合物，该药物组合物包含如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸组合物、和药学上可接受的载体。
20.一种用于改变靶转录物的剪接的方法，该方法包括施用如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸组合物。
21.如权利要求20所述的方法，其中该靶转录物是肌营养不良蛋白的前-mRNA。
22.如权利要求21所述的方法，其中相对于不存在该组合物，肌营养不良蛋白的外显子45以增加的水平被跳读。
23.如权利要求21所述的方法，其中相对于不存在该组合物，肌营养不良蛋白的外显子51以增加的水平被跳读。
24.如权利要求21所述的方法，其中相对于不存在该组合物，肌营养不良蛋白的外显子53以增加的水平被跳读。
25.一种用于治疗肌肉营养不良、杜氏肌肉营养不良(DMD)或贝克肌肉营养不良(BMD)的方法，该方法包括向易患该疾病或患有该疾病的受试者施用如前述权利要求中任一项所述的组合物。
26.一种用于制备寡核苷酸或其寡核苷酸组合物的方法，其中该寡核苷酸包含一个或多个非负电荷的核苷酸间键联，该方法包括提供具有以下结构的亚磷酰胺化合物：
Figure FPA0000295055710000071
Figure FPA0000295055710000072
或其盐，
其中：
R5s独立地是R’或-OR’；
每个BA独立地是选自以下的任选地经取代的基团：C3-30环脂肪族、C6-30芳基、具有1-10个杂原子的C5-30杂芳基、具有1-10个杂原子的C3-30杂环基、天然核碱基部分和经修饰的核碱基部分；
每个Rs独立地是-H、卤素、-CN、-N3、-NO、-NO2、-L-R’、-L-Si(R)3、-L-OR’、-L-SR’、-L-N(R’)2、-O-L-R’、-O-L-Si(R)3、-O-L-OR’、-O-L-SR’或-O-L-N(R’)2；
每个s独立地是0-20；
每个Ls独立地是-C(R5s)2-或L；
每个L独立地是共价键或选自具有1-10个杂原子的C1-30脂肪族基团和C1-30杂脂肪族基团的任选地经取代的二价直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR’)-、-P(O)(SR’)-、-P(O)(R’)-、-P(O)(NR’)-、-P(S)(OR’)-、-P(S)(SR’)-、-P(S)(R’)-、-P(S)(NR’)-、-P(R’)-、-P(OR’)-、-P(SR’)-、-P(NR’)-、-P(OR’)[B(R’)3]-、-OP(O)(OR’)O-、-OP(O)(SR’)O-、-OP(O)(R’)O-、-OP(O)(NR’)O-、-OP(OR’)O-、-OP(SR’)O-、-OP(NR’)O-、-OP(R’)O-或-OP(OR’)[B(R’)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个环A独立地是具有0-10个独立地选自氧、氮、硫、磷和硅的杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环；
G1、G2、G3、G4、G5和G8各自独立地是R1；
每个R1独立地是-H、-L-R’、卤素、-CN、-NO2、-L-Si(R’)3、-OR’、-SR’或-N(R’)2；
每个R′独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与其插入原子一起形成除所述插入原子外具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环；并且
其中G2包含吸电子基团。
27.如权利要求26所述的方法，其中G5以及G3和G4之一一起形成具有0-3个杂原子-除-NG5-的氮原子之外-的任选地经取代的3-8元饱和环。
28.如权利要求26所述的方法，其中该寡核苷酸包含具有
Figure FPA0000295055710000091
的结构的核苷酸间键联。
29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中G2包含吸电子基团。
30.如权利要求29所述的方法，其中G2是-L’-S(O)2R’，其中L’是任选地经取代的-CH2-。
31.如权利要求30所述的方法，其中R’是任选地经取代的C1-6脂肪族。
32.如权利要求30所述的方法，其中R’是叔丁基。
33.如权利要求30所述的方法，其中R’是任选地经取代的苯基。
34.如权利要求30所述的方法，其中R’是苯基。
35.如权利要求29所述的方法，该方法包括一个或多个循环，每个循环独立地包括以下或由以下组成：
1)去封闭；
2)偶联；
3)任选地第一加帽；
4)修饰；和
5)任选地第二加帽。
36.一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含具有式III的结构的核苷酸间键联：
Figure FPA0000295055710000101
其中：
PN是P(＝N-L-R5)、
Figure FPA0000295055710000102
Figure FPA0000295055710000103
Q-是阴离子；
R1和R5各自独立地是-H、-L-R’、卤素、-CN、-NO2、-L-Si(R’)3、-OR’、-SR’或-N(R’)2；
Y和Z各自独立地是-O-、-S-、-N(-L-R5)-或L；
每个L独立地是共价键或选自具有1-10个杂原子的C1-30脂肪族基团和C1-30杂脂肪族基团的任选地经取代的二价直链或支链基团，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被以下替换：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C＝C-、具有1-5个杂原子的二价C1-C6杂脂肪族基团、-C(R’)2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R’)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR’)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R’)-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR’)-、-P(O)(SR’)-、-P(O)(R’)-、-P(O)(NR’)-、-P(S)(OR’)-、-P(S)(SR’)-、-P(S)(R’)-、-P(S)(NR’)-、-P(R’)-、-P(OR’)-、-P(SR’)-、-P(NR’)-、-P(OR’)[B(R’)3]-、-OP(O)(OR’)O-、-OP(O)(SR’)O-、-OP(O)(R’)O-、-OP(O)(NR’)O-、-OP(OR’)O-、-OP(SR’)O-、-OP(NR’)O-、-OP(R’)O-或-OP(OR’)[B(R’)3]O-，并且一个或多个CH或碳原子任选地且独立地被CyL替换；
每个-Cy-独立地是选自以下的任选地经取代的二价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个CyL独立地是选自以下的任选地经取代的三价或四价基团：C3-20环脂肪族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环以及具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个R’独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-30脂肪族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂肪族、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基、以及具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地一起形成共价键，或
同一原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环，或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与其插入原子一起形成除所述插入原子外具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环；并且
-X-L-R1是
Figure FPA0000295055710000111
Figure FPA0000295055710000112
其中G2包含吸电子基团。
37.如权利要求36所述的寡核苷酸，其中G2是-L’-S(O)2R’，其中L’是任选地经取代的-CH2-。
38.如权利要求37所述的寡核苷酸，其中R’是任选地经取代的C1-6脂肪族。
39.如权利要求38所述的寡核苷酸，其中R’是叔丁基。
40.如权利要求37所述的寡核苷酸，其中R’是任选地经取代的苯基。
41.如权利要求40所述的寡核苷酸，其中R’是苯基。
42.如权利要求36-41中任一项所述的寡核苷酸，其中R1是-C(O)R’。
43.如权利要求42所述的寡核苷酸，其中R’是-CH3。
44.如权利要求36-41中任一项所述的寡核苷酸，其中Q-是F-、Cl-、Br-、BF4 -、PF6 -、TfO-、Tf2N-、AsF6 -、ClO4 -或SbF6 -。
45.如权利要求36-44中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸附接至固体支持物上。
46.如权利要求45所述的寡核苷酸，其中该固体支持物是CPG。
47.一种用于制备寡核苷酸的方法，该方法包括使如权利要求36-46中任一项所述的寡核苷酸与碱接触。
48.如权利要求47所述的方法，其中该接触在基本上不存在水的情况下进行。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中该接触是在寡核苷酸脱保护和切割之前达到该寡核苷酸长度之后进行的。
50.如权利要求47-49中任一项所述的方法，其中该碱是具有NR3的结构的胺碱。
51.如权利要求50所述的方法，其中该碱是N，N-二乙胺。
52.如示例实施例1-420中任一项所述的寡核苷酸、化合物或方法。
53.一种寡核苷酸，其中该寡核苷酸是WV-20104、WV-20103、WV-20102、WV-20101、WV-20100、WV-20099、WV-20098、WV-20097、WV-20096、WV-20095、WV-20094、WV-20106、WV-20119、WV-20118、WV-13739、WV-13740、WV-9079、WV-9082、WV-9100、WV-9096、WV-9097、WV-9106、WV-9133、WV-9148、WV-9154、WV-9898、WV-9899、WV-9900、WV-9906、WV-9907、WV-9908、WV-9909、WV-9756、WV-9757、WV-9517、WV-9714、WV-9715、WV-9519、WV-9521、WV-9747、WV-9748、WV-9749、WV-9897、WV-9898、WV-9900、WV-9899、WV-9906、WV-9912、WV-9524、WV-9912、WV-9906、WV-9900、WV-9899、WV-9899、WV-9898、WV-9898、WV-9898、WV-9898、WV-9898、WV-9897、WV-9897、WV-9897、WV-9897、WV-9897、WV-9747、WV-9714、WV-9699、WV-9517、WV-9517、WV-13409、WV-13408、WV-12887、WV-12882、WV-12881、WV-12880、WV-12880、WV-WV12880、WV-12878、WV-12877、WV-12877、WV-12876、WV-12873、WV-12872、WV-12559、WV-12559、WV-12558、WV-12558、WV-12557、WV-12556、WV-12556、WV-12555、WV-12555、WV-12554、WV-12553、WV-12129、WV-12127、WV-12125、WV-12123、WV-11342、WV-11342、WV-11341、WV-11341、WV-11340、WV-10672、WV-10671、WV-10670、WV-10461、WV-10455、WV-9897、WV-9898、WV-13826、WV-13827、WV-13835、WV-12880、WV-14344、WV-13864、WV-13835、WV-14791、WV-14344、WV-13754、WV-13766，、WV-11086、WV-11089、WV-17859、WV-17860、WV-20070、WV-20073、WV-20076、WV-20052、WV-20099、WV-20049、WV-20085、WV-20087、WV-20034、WV-20046、WV-20052、WV-20061、WV-20064、WV-20067、WV-20092、WV-20091、WV-20093、WV-20084、WV-9738、WV-9739、WV-9740、WV-9741、WV-15860、WV-15862、WV-11084、WV-11086、WV-11088、WV-11089、WV-14522、WV-14523、WV-17861、WV-17862、WV-13815、WV-13816、WV-13817、WV-13780、WV-17862、WV-17863、WV-17864、WV-17865、WV-17866、WV-20082、WV-20081、WV-20080、WV-20079、WV-20076、WV-20075、WV-20074、WV-20073、WV-20072、WV-20071、WV-20064、WV-20059、WV-20058、WV-20057、WV-20056、WV-20053、WV-20052、WV-20051、WV-20050、WV-20049、WV-20094、WV-20095、或其盐形式。
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