CN114600803A - 一种斑马鱼cyp3a4代谢酶抑制模型、建立方法及应用 - Google Patents

一种斑马鱼cyp3a4代谢酶抑制模型、建立方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型、建立方法及应用，使用CYP3A4代谢酶抑制剂酮康唑与受试化合物共同作用于斑马鱼幼鱼，或者单独使用受试化合物作用于斑马鱼幼鱼，对比前后两者对斑马鱼的肝毒性大小，即可筛选出经CYP3A4代谢激活产生肝毒性的化合物。本发明利用斑马鱼繁殖时间短，产卵量高，身体透明，具有丰富代谢酶表达等优点，可以实现体内高效、快捷的代谢型药物的毒性评价和筛选。

Description

一种斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型、建立方法及应用
技术领域
本发明属于药物安全性评价领域，具体涉及一种斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型、建立方法及应用。
背景技术
药源性肝损伤(Drug-induced liver injury，DILI)是药物安全性评价重点关注的问题，目前，对药物引起药源性肝损伤的监测在临床诊断中仍缺少特定的生物标志物，当血液生化指标出现变化时，肝脏已经发生了组织病理性的改变。且临床前的评价体系无法完全正确指导药物的临床特征，增加了药物研发的挑战性。
通过药物代谢酶，特别是细胞色素P450(CYP)的代谢激活引起的药源性肝损伤是药物失效和停药的主要原因。在临床常用的前200个处方药物中有73％是经代谢酶代谢，其中经CYP超家族成员代谢的药物占75％；在CYP450介导的转化反应中，参与药物氧化代谢最多的酶是CYP3A4(46％)。因此，需要建立一个可预测性、高通量的临床前确认经CYP3A4代谢激活产生肝毒性的药物的方法。
目前，临床前评价代谢激活引起药源性肝损伤的方法主要分为体外实验和体内实验；体外实验一般使用CYP表型过表达或人肝微粒体共培养的细胞进行肝毒性预测，体内则采取动物的整体研究。但上述方法也存在一定的局限性，如体外实验不能模拟体内的动态循环过程以及组织药物的相互作用，检测肝毒性的灵敏度较低。
模式生物斑马鱼近年来在毒性评价中发挥着重要作用，斑马鱼具有繁殖时间短、产卵量高、身体透明、可通过光学显微镜观察到组织器官等优点，是一种高效、便捷的动物模型。斑马鱼基因组拥有人类细胞色素P450基因相同的直系同源物，其中主要负责药物代谢的CYP1-3家族与人类CYP基因的表达具有高度同源性，在核激素受体和CYP3A亚家族的诱导机制与人类相似。所以斑马鱼是一种适用于研究代谢型药源性肝损伤药物的模式生物，具有较高的使用价值。
白鲜皮，为芸香科多年生草本植物白鲜的根皮；研究表明，白鲜皮具有抗炎、抗菌、抗过敏等作用，目前临床上使用的主要为白鲜皮的复方制剂或提取物的某些成分。但有临床数据发现白鲜皮具有一定的肝毒性，其所致肝毒性的临床表现与常见肝病相似，可出现急性肝细胞损害、肝功能异常、黄疸、胆汁淤积、慢性肝炎伴纤维化等各种病理变化。有研究表明，代谢酶介导的生物活化是白鲜皮引发药源性肝损伤的主要作用机制。以白蜡树酮(Fraxinellone)为代表的几种呋喃环类化合物是白鲜皮中提取的主要活性成分，其本身的具备的呋喃环官能团可经CYP3A4代谢活化生成顺丁烯结构而产生肝毒性。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，为了高效、快捷的筛选确认出代谢型药源性肝损伤药物的肝毒性，本发明提供一种斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型、建立方法及应用，为临床的安全用药提供数据参考。
本发明第一目的在于提供一种斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型，所述抑制模型的作用对象为斑马鱼、选用的CYP3A4抑制剂为酮康唑，所述酮康唑的给药浓度为1～5μM；优选给药浓度为1μM。
本发明第二目的在于提供一种斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型的建立方法，包括：
步骤11、以受精后72h的斑马鱼幼鱼为作用对象，分别加入不同浓度氯吡格雷溶液，获取斑马鱼幼鱼半数致死的氯吡格雷浓度；具体为：
将受精后72h的斑马鱼幼鱼转移至6孔板中，分别加入不同浓度氯吡格雷溶液，如6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM；置于生态箱中，28℃恒温培养48h，统计氯吡格雷半数致死浓度(LD50)；其中，以log(氯吡格雷浓度)作为横坐标、致死率作为纵坐标，建立致死率随氯吡格雷浓度变化的曲线，取致死率50％所对应的氯吡格雷浓度作为斑马鱼幼鱼半数致死的氯吡格雷浓度，优选斑马鱼幼鱼半数致死的氯吡格雷浓度为60μM；
步骤12、以受精后72h的斑马鱼幼鱼为作用对象，分别加入半数致死率浓度氯吡格雷和不同浓度酮康唑的混合溶液，获取斑马鱼幼鱼未死亡所对应的酮康唑浓度，并将该酮康唑浓度作为所述抑制模型中酮康唑的给药浓度；具体为：
将受精后72h的斑马鱼幼鱼转移至6孔板中，分别加入半数致死率浓度氯吡格雷和不同浓度酮康唑(如1μM、5μM、25μM等)的混合溶液，置于生态箱中，28℃恒温培养48h，通过死亡率变化确定酮康唑最佳给药浓度，研究发现获取斑马鱼幼鱼未死亡所对应的酮康唑浓度为1～5μM，考虑到在保证斑马鱼CYP3A4表达抑制的同时尽量减少酮康唑使用，以减少参比化合物的体内的毒性影响，本发明优选酮康唑最佳给药浓度为1μM，将给药浓度为1μM的酮康唑作为斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制剂，建立斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型。
作为本发明的进一步改进，给药结束后，将6孔板置于水生生物显微镜下观察心脏是否跳动，统计斑马鱼死亡数量，实验进行3次，使用SPSS 20.0计算斑马鱼致死率及LD50。
本发明第三目的在于提供一种斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型的应用，所述应用为基于斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型筛选经CYP3A4代谢酶代谢产生肝毒性的代谢型药源性肝损伤药物(化合物)的应用，即通过抑制模型评价代谢型药源性肝损伤药物的肝毒性；其中，本发明的代谢型药源性肝损伤药物包括但不限于胺碘酮和白蜡树酮。
作为本发明的进一步改进，在所述应用中，具体筛选方法包括：
步骤21、斑马鱼胚胎的获取：斑马鱼自然交配后收集受精卵，使用胚胎培养液清洗并转移至含有培养液的玻璃缸中；具体为：
斑马鱼受精卵收集前一晚，将成年斑马鱼按照雌雄2：3比例分开置于装有隔板的透明的交配缸中，第二天光照开始时间(8：00am)拿出隔板，使雌雄斑马鱼混合并自由交配，交配1h后收集受精卵；收集所得受精卵使用1×E3胚胎培养液清洗并转移至含有1L 1×E3胚胎培养液的188mm玻璃缸中，24hpf置换新鲜的1×E3培养液并将死亡胚胎移除；
步骤22、化合物处理：48hpf后挑选斑马鱼幼鱼转移至多孔板中，72hpf移除多孔板中的培养液，并加入预配置好的含相应浓度药物溶液；具体为：
48hpf挑选发育阶段一致且健康无畸形的斑马鱼幼鱼转移至6孔板中，每孔10枚幼鱼，加入10ml 1×E3胚胎培养液继续培育至72hpf；72hpf进行斑马鱼幼鱼给药，移除每孔的培养液，立即加入5ml事先配置好的含相应浓度药物溶液，然后转移至28℃生态箱中，连续暴露48h；其中，
实验设置空白对照组、多个不同浓度的代谢型药源性肝损伤药物处理组、以及多个CYP3A4抑制剂与不同浓度代谢型药源性肝损伤药物共处理组；
步骤23、评价化合物肝毒性：斑马鱼幼鱼连续暴露于受试溶液液48h(120hpf)后，收集斑马鱼幼鱼用于评价化合物肝毒性。
作为本发明的进一步改进，在步骤1中，
E3胚胎培养液的配置方法如下：10×E3胚胎培养液中含有2927mg/l NaCl，127mg/l KCl，366mg/l CaCl2，396mg/l MgSO4；每次使用前使用灭菌后的双蒸水稀释10倍(1×E3)(5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mM CaCl2和0.33mM MgSO4)。
作为本发明的进一步改进，在步骤2中，
空白对照组使用溶液为1×E3胚胎培养液；
处理组分别为胺碘酮和白蜡树酮；
CYP3A4抑制剂为酮康唑；
共处理组的为酮康唑和各浓度化合物混合溶液。
更进一步，上述方法中，各实验组溶液中二甲基亚砜含量应低于0.5％，各实验组溶液PH为为6.8-7.8，温度保持28℃。
作为本发明的进一步改进，评价药物肝毒性包括：统计斑马鱼死亡数量、测量斑马鱼幼鱼肝区灰度值、测定斑马鱼幼鱼中的ROS含量和测定斑马鱼幼鱼中的ALT、AST含量；具体为：
步骤31、给药结束后，将6孔板置于水生生物显微镜下观察心脏是否跳动，统计斑马鱼死亡数量；实验进行3次，使用SPSS 20.0计算不同给药浓度下的斑马鱼致死率；
步骤32、给药结束后，六孔板中每孔加入60μl 2％苯佐三卡因对斑马鱼幼鱼进行麻醉；每组取10只麻醉后的斑马鱼幼鱼放置于带有凹槽的载玻片上，滴加适量的2％CMC-Na固定斑马鱼，使其保持侧卧体位；使用超景深显微镜记录观察斑马鱼肝脏形态，并使用Image J软件测量斑马鱼幼鱼肝区灰度值；
当实验组斑马鱼肝区灰度值降低，且与空白对照组相比达到统计学上的显著性差异(P<0.05)，即可判定斑马鱼出现肝脏损伤；肝脏灰度为肝脏区域平均灰度；
步骤33、给药结束后，对斑马鱼幼鱼中的ROS含量进行测定：
样本前处理：120hpf后，每实验组收集40尾斑马鱼幼鱼，使用遇冷PBS洗涤两次，按重量(g):体积(ml)＝1:9的比例加入预冷的缓冲液(0.32mM蔗糖，20mM HEPES，1mM MgCl2和0.5mM苯甲基磺酰氟)置于匀浆管中，在冰水浴条件下进行匀浆；匀浆液使用低温离心机3500转/分，离心10分钟；
离心后取20μl上清液加入至黑色96孔板中，补充无血清DMEM培养基至100μl，室温孵育5min；每孔加入100μl 20μM DCFH-DA稀释液中，于37℃下孵育20min；孵育结束后，将黑色96孔板放入荧光酶标仪中于，使用488nm激发波长，525nm发射波长实时检测荧光强度，荧光强度代表斑马鱼幼鱼中活性氧的含量；
步骤34、给药结束后，对斑马鱼幼鱼中的ALT、AST含量进行测定：
样本前处理：120hpf后，每实验组收集40尾斑马鱼幼鱼，按重量(g):体积(ml)＝1:9的比例加入0.9％生理盐水置于匀浆管中，在冰水浴条件下进行匀浆。匀浆液使用低温离心机3500转/分，离心10分钟；收集离心所得上清液通过试剂盒对ALT、AST含量进行测定。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明首次使用斑马鱼进行代谢型药源性肝损伤药物的筛选，使用酮康唑作为CYP3A4抑制剂与受试物进行共同给药，研究药物的体内代谢毒性；相比于体外预测模型具有稳定可靠、灵敏度高、重复性好等优点。
2、斑马鱼基因组拥有人类细胞色素P450基因相同的直系同源物，其中主要负责药物代谢的CYP1-3家族与人类CYP基因的表达具有高度同源性，在核激素受体和CYP3A亚家族的诱导机制与人类相似，对代谢型药源性肝损伤的结果预测性好；
3、斑马鱼幼鱼身体透明，受精后72h肝脏发育基本完成，可在光学显微镜下直接进行组织观察，更直观显示斑马鱼肝脏的损伤情况；
4、斑马鱼繁殖力高、成本低，且实验周期较短，相比于体内动物(大鼠、小鼠)实验具有更高的经济效益。
附图说明
图1为超景深显微镜下斑马鱼肝脏形态学照片；
图2为氯吡格雷诱导的斑马鱼浓度-死亡曲线；
图3为不同浓度氯吡格雷诱导斑马鱼肝脏损伤的形态学照片；
图4为不同浓度氯吡格雷对斑马鱼肝区的灰度值影响；
图5为不同浓度酮康唑抑制氯吡格雷诱导的肝脏损伤的形态学照片；
图6为不同浓度酮康唑对氯吡格雷诱导的肝脏损伤的肝区灰度值影响；
图7为酮康唑对胺碘酮诱导的肝脏损伤的肝区灰度值影响；
图8为酮康唑对胺碘酮诱导的肝脏损伤的ROS含量的影响；
图9为酮康唑对胺碘酮诱导的肝脏损伤的ALT、AST含量的影响；
图10为酮康唑对白蜡树酮诱导的肝脏损伤的肝区灰度值影响；
图11为酮康唑对白蜡树酮诱导的肝脏损伤的ROS含量的影响；
图12为酮康唑对白蜡树酮诱导的肝脏损伤的ALT、AST含量的影响；
图13为酮康唑对丙戊酸钠诱导的肝脏损伤的肝区灰度值影响；
图14为酮康唑对丙戊酸钠诱导的肝脏损伤的ROS含量的影响；
图15为酮康唑对丙戊酸钠诱导的肝脏损伤的ALT、AST含量的影响；
图16为基于斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型筛选经CYP3A4代谢激活产生肝毒性化合物的方法流程图。
符号说明：
A，斑马鱼的肝脏。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：
实验动物：野生型斑马鱼(斑马鱼，AB品系)购自中国上海鱼生物有限公司。将购买所得斑马鱼放置于水生生物饲养系统，在14/10的昼夜光周期，温度26℃条件下进行饲养。斑马鱼胚胎由成鱼自然配对产卵收集获得，在26±1℃的1×E3胚胎培养液中孵育。
试剂：氯吡格雷、胺碘酮和酮康唑均购自于MCE公司，分别用二甲基亚砜配置成100mM、50mM和10mM的储备液。白蜡树酮由中国医学科学院药物研究所植化课题室提供，用二甲基亚砜配置50mM储备液。以上储备液样品均置于-20℃保存，实验时用1×E3胚胎培养液稀释至所需浓度。
活性氧检测试剂盒购自索莱宝科技有限公司(中国北京)。ALT、AST试剂盒购自于南京程建成生物工程研究所(中国南京)。
实验仪器：水生生物显微镜(SZX-ILLK2002，Olympus)，超景深显微镜(VHX-2000，Keyence)，荧光酶标仪(ELX800UV，Dialab)。
下述实施例和对比例采用的方法流程如图16所示，斑马鱼肝脏区域如图1所示。
实施例1：斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型的中氯吡格雷剂量的选择
1.斑马鱼胚胎的获取
斑马鱼受精卵收集前一晚，将成年斑马鱼按照雌雄2：3比例分开置于装有隔板的透明的交配缸中，第二天光照开始时间(8：00am)拿出隔板，使雌雄斑马鱼混合并自由交配，交配1h后收集受精卵。收集所得受精卵使用1×E3胚胎培养液清洗并转移至含有1L 1×E3胚胎培养液的188mm玻璃缸中，24hpf置换新鲜的1×E3培养液并将死亡胚胎移除，48hpf挑选发育阶段一致且健康无畸形的斑马鱼幼鱼转移至6孔板中，每孔10枚幼鱼，每组3个平行孔，加入10ml 1×E3胚胎培养液继续培育至72hpf。
2.化合物处理
设置6个实验组：1个空白对照组，5个阳性对照组；空白对照组加入5ml1×E3胚胎培养液，阳性对照组分别加入5ml浓度为6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM的氯吡格雷溶液。
3.斑马鱼致死率及肝毒性
在水生生物显微镜下观察所有斑马鱼幼鱼，以确定死亡斑马鱼的数量。收集存活斑马鱼幼鱼置于超景深显微镜下观察肝区灰度，使用Image J软件定量分析。实验进行3次。
空白对照组斑马鱼肝脏结构正常，肝区透亮；6.25μM、12.5μM氯吡格雷处理组出现肝区发黑、透光性差等现象；25μM、50μM氯吡格雷处理组斑马鱼已经出现死亡，肝区发黑严重，轮廓模糊；100μM氯吡格雷处理组斑马鱼全部死亡。
SPSS 20.0版统计分析氯吡格雷LD50为60μM(如图2所示)。Image J软件定量分析，与空白对照组相比，氯吡格雷处理组斑马鱼肝脏灰度值均明显降低，具有统计学显著差异(P<0.05)，指示已经造成肝损伤(如图3、4所示)。
多篇文献报道，氯吡格雷经CYP3A4代谢产生毒性代谢物，并诱导肝脏损伤；本发明采用氯吡格雷作为阳性对照，根据实施例1显示结果，使用60μM氯吡格雷进一步探索CYP3A4抑制剂酮康唑的剂量选择，并评价CYP3A4抑制剂酮康唑对阳性药氯吡格雷的肝毒性减轻作用。
实施例2：斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型的中酮康唑剂量的选择
1.斑马鱼胚胎的获取
斑马鱼受精卵收集前一晚，将成年斑马鱼按照雌雄2：3比例分开置于装有隔板的透明的交配缸中，第二天光照开始时间(8：00am)拿出隔板，使雌雄斑马鱼混合并自由交配，交配1h后收集受精卵。收集所得受精卵使用1×E3胚胎培养液清洗并转移至含有1L 1×E3胚胎培养液的188mm玻璃缸中，24hpf置换新鲜的1×E3培养液并将死亡胚胎移除，48hpf挑选发育阶段一致且健康无畸形的斑马鱼幼鱼转移至6孔板中，每孔10枚幼鱼，每组3个平行孔，加入10ml 1×E3胚胎培养液继续培育至72hpf。
2.化合物处理
设置6个实验组：1个空白对照组，1个溶剂对照组，1个阳性对照组，3个CYP3A4抑制剂共处理组。空白对照组加入5ml 1×E3胚胎培养液，溶剂对照组加入5ml含0.5％二甲基亚砜的1×E3胚胎培养液，阳性对照组分别加入5ml浓度为60μM的氯吡格雷溶液。CYP3A4抑制剂共处理组分别加入5ml氯吡格雷(60μM)和不同浓度酮康唑(1μM、5μM、25μM)的混合溶液。
3.斑马鱼致死率及肝毒性
在水生生物显微镜下观察所有斑马鱼幼鱼，以确定死亡斑马鱼的数量。收集存活斑马鱼幼鱼置于超景深显微镜下观察肝区灰度，使用Image J软件定量分析。实验进行3次。
空白和溶剂对照组斑马鱼肝脏结构正常，肝区透亮；50μM氯吡格雷处理组斑马鱼致死率达到50％，存活斑马鱼肝区发黑严重，轮廓模糊。CYP3A4抑制剂共处理组斑马鱼死亡率降低，其中1μM酮康唑和5μM酮康唑共处理组斑马鱼未出现死亡，和50μM氯吡格雷处理组相比肝脏结构正常，肝区透亮，统计灰度值具有显著性差异(**P<0.01vs空白；##P<0.01vs氯吡格雷)；25μM酮康唑共处理组斑马鱼死亡率为10％，和50μM氯吡格雷处理组相比，肝区灰度值有所升高，具有显著性差异(*P<0.05vs空白；#P<0.05vs氯吡格雷)(如图5、6所示)。
与空白对照相比，1μM、5μM酮康唑共处理组斑马鱼幼鱼并未出现死亡，且明显抑制氯吡格雷的肝毒性。本发明为在保证斑马鱼CYP3A4表达抑制的同时尽量减少酮康唑使用，以减少参比化合物的体内的毒性影响。因此，选择使用1μM的酮康唑建立斑马鱼CYP3A4代谢酶的抑制模型。
基于实施例1～2，本发明建立的斑马鱼CYP3A4代谢酶的抑制模型为：CYP3A4为1μM的酮康唑，作用对象为斑马鱼。
实施例3：使用斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型评价胺碘酮的肝毒性
1.斑马鱼胚胎的获取：斑马鱼受精卵收集前一晚，将成年斑马鱼按照雌雄2：3比例分开置于装有隔板的透明的交配缸中，第二天光照开始时间(8：00am)拿出隔板，使雌雄斑马鱼混合并自由交配，交配1h后收集受精卵。收集所得受精卵使用1×E3胚胎培养液清洗并转移至含有1L 1×E3胚胎培养液的188mm玻璃缸中，24hpf置换新鲜的1×E3培养液并将死亡胚胎移除，48hpf挑选发育阶段一致且健康无畸形的斑马鱼幼鱼转移至6孔板中，每孔10枚幼鱼，每组3个平行孔，加入10ml 1×E3胚胎培养液继续培育至72hpf。
2.化合物处理：设置7个实验组：1个空白对照组，3个受试物处理组，3个CYP3A4抑制剂共处理组。空白对照组加入5ml 1×E3胚胎培养液，受试物处理组分别加入5ml浓度为10、20、40μM的胺碘酮溶液。CYP3A4抑制剂共处理组分别加入5ml酮康唑(1μM)和不同浓度胺碘酮(10、20、40μM)的混合溶液。
3.评价化合物肝毒性：斑马鱼幼鱼连续暴露于各实验组溶液48h后，收集斑马鱼幼鱼用于评价胺碘酮肝毒性。
(1)肝区灰度值
六孔板中每孔加入60μl 2％苯佐三卡因对斑马鱼幼鱼进行麻醉。每组取10只麻醉后的斑马鱼幼鱼放置于带有凹槽的载玻片上，滴加适量的2％CMC-Na固定斑马鱼，使其保持侧卧体位。使用超景深显微镜记录观察斑马鱼肝脏形态，并使用Image J软件测量斑马鱼幼鱼肝区灰度值。
空白对照组斑马鱼的肝脏透明、形态正常，而胺碘酮各处理组无出现斑马鱼死亡、畸形等情况，但伴随胺碘酮浓度增加，斑马鱼肝区变黑，肝区灰度值显著降低(*P<0.05，**P<0.01vs空白)。CYP3A4抑制剂共处理组肝脏形态逐渐恢复，肝区灰度值接近正常(如图7所示)。
(2)ROS含量测定
每实验组收集40尾斑马鱼幼鱼，使用遇冷PBS洗涤两次，按重量(g):体积(ml)＝1:9的比例加入预冷的缓冲液(0.32mM蔗糖，20mM HEPES，1mM MgCl2和0.5mM苯甲基磺酰氟)置于匀浆管中，在冰水浴条件下进行匀浆；匀浆液使用低温离心机3500转/分，离心10分钟；离心后取20μl上清液加入至黑色96孔板中，补充无血清DMEM培养基至100μl，室温孵育5min；每孔加入100μl 20μM DCFH-DA稀释液中，于37℃下孵育20min。
孵育结束后，将黑色96孔板放入荧光酶标仪中于，使用488nm激发波长，525nm发射波长实时检测荧光强度。
ROS水平与许多炎症损伤和细胞氧化应激有关，ROS变化趋势与细胞损伤呈正比例相关。
受试物处理组随着胺碘酮浓度增加，ROS水平呈显著性升高(**P<0.01vs空白)，而CYP3A4抑制剂共处理组与空白对照组相比有增加趋势，但没有显著性差异(如图8所示)。
(3)ALT、AST含量测定
每实验组收集40尾斑马鱼幼鱼，按重量(g):体积(ml)＝1:9的比例加入0.9％生理盐水置于匀浆管中，在冰水浴条件下进行匀浆。匀浆液使用低温离心机3500转/分，离心10分钟。收集离心所得上清液按照南京建成试剂盒说明书对ALT、AST含量进行测定。
当肝脏发生损伤时，ALT和AST在肝脏中发生积累，被广泛用作肝毒性评估的临床指标。
与空白对照相比，胺碘酮在20μM、40μM剂量下可显著升高斑马鱼体内的ALT、AST含量，引发肝毒性(**P<0.01vs空白)。而CYP3A4抑制剂共处理组与空白对照组相比无显著性差异(如图9所示)。
实验结果表明，胺碘酮经CYP3A4代谢激活产生肝毒性，在加入CYP3A4抑制剂酮康唑后可明显抑制胺碘酮肝毒性。
实施例4：使用斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型评价白蜡树酮肝毒性
1.斑马鱼胚胎的获取：斑马鱼受精卵收集前一晚，将成年斑马鱼按照雌雄2：3比例分开置于装有隔板的透明的交配缸中，第二天光照开始时间(8：00am)拿出隔板，使雌雄斑马鱼混合并自由交配，交配1h后收集受精卵。收集所得受精卵使用1×E3胚胎培养液清洗并转移至含有1L 1×E3胚胎培养液的188mm玻璃缸中，24hpf置换新鲜的1×E3培养液并将死亡胚胎移除，48hpf挑选发育阶段一致且健康无畸形的斑马鱼幼鱼转移至6孔板中，每孔10枚幼鱼，每组3个平行孔，加入10ml 1×E3胚胎培养液继续培育至72hpf。
2.化合物处理：设置7个实验组：1个空白对照组，3个受试物处理组，3个CYP3A4抑制剂共处理组。空白对照组加入5ml 1×E3胚胎培养液，受试物组分别加入5ml浓度为5、10、20μM的白蜡树酮溶液。CYP3A4抑制剂共处理组分别加入5ml酮康唑(1μM)和不同浓度白蜡树酮(5、10、20μM)的混合溶液。
3.评价化合物肝毒性：斑马鱼幼鱼连续暴露于各实验组溶液48h后，收集斑马鱼幼鱼用于评价白蜡树酮肝毒性。
(1)肝区灰度值
48h给药结束后，六孔板中每孔加入60μl 2％苯佐三卡因对斑马鱼幼鱼进行麻醉。每组取10只麻醉后的斑马鱼幼鱼放置于带有凹槽的载玻片上，滴加适量的2％CMC-Na固定斑马鱼，使其保持侧卧体位。使用超景深显微镜记录观察斑马鱼肝脏形态，并使用Image J软件测量斑马鱼幼鱼肝区灰度值。
与空白对照组相比，受试物处理组随着白蜡树酮浓度增加，斑马鱼肝区变黑，透光率降低，肝脏轮廓开始模糊。Image J软件测量斑马鱼幼鱼肝区灰度值与空白对照组相比显著降低(*P<0.05，**P<0.01vs空白)。CYP3A4抑制剂共处理组各剂量组与空白对照组相比无显著性差异(如图10所示)。
(2)ROS含量测定
根据实施例3的方法检测斑马鱼体内ROS水平。
与空白组相比，受试物处理组各剂量组都具有显著促氧化作用，斑马鱼体内ROS含量显著增加，具有统计学差异(**P<0.01vs空白)。CYP3A4抑制剂共处理组中各剂量组与空白对照组相比无显著性差异(如图11所示)。
(3)ALT、AST含量测定
根据实施例3的方法检测斑马鱼体内ALT、AST水平。
与空白对照相比，白蜡树酮在5μM剂量下，可略微升高斑马鱼体内ALT、AST含量，但无显著性差异；白蜡树酮在10μM、20μM剂量下可显著升高斑马鱼体内的ALT、AST含量(*P<0.05，**P<0.01vs空白)，引发肝毒性。CYP3A4抑制剂共处理组中各剂量组与空白对照组相比无显著性差异(如图12所示)。
实验结果表明，白蜡树酮主要经CYP3A4代谢激活产生肝毒性，在加入CYP3A4抑制剂酮康唑后可明显抑制白蜡树酮肝毒性。
对比例1：使用斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型评价丙戊酸钠肝毒性
1.斑马鱼胚胎的获取：斑马鱼受精卵收集前一晚，将成年斑马鱼按照雌雄2：3比例分开置于装有隔板的透明的交配缸中，第二天光照开始时间(8：00am)拿出隔板，使雌雄斑马鱼混合并自由交配，交配1h后收集受精卵。收集所得受精卵使用1×E3胚胎培养液清洗并转移至含有1L 1×E3胚胎培养液的188mm玻璃缸中。24hpf置换新鲜的1×E3培养液并将死亡胚胎移除。48hpf挑选发育阶段一致且健康无畸形的斑马鱼幼鱼转移至6孔板中，每孔10枚幼鱼，每组3个平行孔，加入10ml 1×E3胚胎培养液继续培育至72hpf。
2.化合物处理：设置7个实验组：1个空白对照组，3个受试物处理组，3个CYP3A4抑制剂共处理组。空白对照组加入5ml 1×E3胚胎培养液，受试物处理组分别加入5ml浓度为15、30、60μM的丙戊酸钠溶液。CYP3A4抑制剂共处理组分别加入5ml酮康唑(1μM)和不同浓度丙戊酸钠(15、30、60μM)的混合溶液。
3.评价化合物肝毒性：斑马鱼幼鱼连续暴露于各实验组溶液48h后，收集斑马鱼幼鱼用于评价丙戊酸钠肝毒性。
(1)肝区灰度值
48h给药结束后，六孔板中每孔加入60μl 2％苯佐三卡因对斑马鱼幼鱼进行麻醉。每组取10只麻醉后的斑马鱼幼鱼放置于带有凹槽的载玻片上，滴加适量的2％CMC-Na固定斑马鱼，使其保持侧卧体位。使用超景深显微镜记录观察斑马鱼肝脏形态，并使用Image J软件测量斑马鱼幼鱼肝区灰度值。
空白对照组斑马鱼的肝脏透明、形态正常，而受试物处理组随着丙戊酸钠浓度增加，斑马鱼幼鱼肝脏变黑，肝区灰度值显著降低(**P<0.01vs空白)。CYP3A4抑制剂共处理组与丙戊酸钠各剂量组相比无显著性差异(如图13所示)。
(2)ROS含量测定
根据实施例3的方法检测斑马鱼体内ROS水平。
溶剂对照组与空白组无显著性差异(**P<0.01vs空白)。受试物处理组，15μM、30μM、60μM剂量组斑马鱼体内ROS含量有显著性增加趋势。CYP3A4抑制剂共处理组与丙戊酸钠各剂量组相比无显著性差异(如图14所示)。
(3)ALT、AST含量测定
根据实施例3的方法检测斑马鱼体内ALT、AST水平。
与空白对照相比，胺碘酮在15μM、30μM、60μM剂量下可显著升高斑马鱼体内的ALT、AST含量，引发肝毒性。CYP3A4抑制剂共处理组与丙戊酸钠各剂量组相比无显著性差异，且与空白对照组相比显著升高(*P<0.05，**P<0.01vs空白)(如图15所示)。
根据上述实验结果，丙戊酸钠不经CYP3A4代谢激活产生肝毒性，在加入CYP3A4抑制剂酮康唑前后丙戊酸钠肝毒性没有改变。这说明本发明中使用酮康唑建立的斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型可以准确、定量的筛选出经CYP3A4代谢产生肝毒性的化合物。本发明实验结果灵敏度高、可操作性好。
结论：
本发明涉及一种高效、快捷的使用斑马鱼筛选经CYP3A4代谢激活产生肝毒性化合物的方法。根据上述实施例结果，本发明模型具有以下特点和优点：
1、首次使用酮康唑建立斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型，并使用氯吡格雷、胺碘酮、白蜡树酮和丙戊酸钠进行正反验证，确保了模型的可行性。
2、相较于常规的斑马鱼肝毒性化合物评价模型，本发明将镜下肝脏图像观察分析和临床生化指标检测相结合，可以用来特异性的筛选、评价经CYP3A4代谢产生肝毒性的化合物，准确度度更高。
3、相较于其他临床前评价代谢激活引起药源性肝损伤的方法，本发明使用的模型具有体外实验不具备的灵敏度高、预测性好等优点，具有体内动物(大、小鼠)实验不具备的成本低、耗时短等优点。
综上，本发明建立的斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型更适合临床前经CYP3A4代谢产生肝毒性化合物的高通量筛选。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型，其特征在于，
所述抑制模型选用的CYP3A4抑制剂为酮康唑，所述酮康唑的给药浓度为1～5μM。
2.如权利要求1所述的斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型，其特征在于，
所述酮康唑的给药浓度为1μM。
3.一种如权利要求1或2所述的斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型的建立方法，其特征在于，包括：
以受精后72h的斑马鱼幼鱼为作用对象，分别加入不同浓度氯吡格雷溶液，获取斑马鱼幼鱼半数致死的氯吡格雷浓度；
以受精后72h的斑马鱼幼鱼为作用对象，分别加入半数致死率浓度氯吡格雷和不同浓度酮康唑的混合溶液，获取斑马鱼幼鱼未死亡所对应的酮康唑浓度，并将该酮康唑浓度作为所述抑制模型中酮康唑的给药浓度。
4.如权利要求3所述的建立方法，其特征在于，斑马鱼幼鱼半数致死的氯吡格雷浓度为60μM。
5.一种如权利要求1或2所述的斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型的应用，其特征在于，所述应用为基于斑马鱼CYP3A4代谢酶抑制模型筛选经CYP3A4代谢酶代谢产生肝毒性的代谢型药源性肝损伤药物的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述代谢型药源性肝损伤药物包括但不限于胺碘酮和白蜡树酮。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在所述应用中，具体筛选方法包括：
步骤1、斑马鱼胚胎的获取：斑马鱼自然交配后收集受精卵，使用胚胎培养液清洗并转移至含有培养液的玻璃缸中；
步骤2、化合物处理：48hpf后挑选斑马鱼幼鱼转移至多孔板中，72hpf移除多孔板中的培养液，并加入预配置好的含相应浓度药物溶液；其中，实验设置空白对照组、多个不同浓度的代谢型药源性肝损伤药物处理组、以及多个CYP3A4抑制剂与不同浓度代谢型药源性肝损伤药物共处理组；
步骤3、评价化合物肝毒性：斑马鱼幼鱼连续暴露于各实验组溶液48h后，收集斑马鱼幼鱼用于评价药物肝毒性。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，在所述步骤1中，
所述胚胎培养液为1×E3胚胎培养液。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，在所述步骤2中，
48hpf应挑选发育阶段一致且健康无畸形的斑马鱼幼鱼；
多孔板中每孔加入相应浓度药物溶液为5ml；
空白对照组使用溶液为1×E3胚胎培养液。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，在所述步骤3中，评价药物肝毒性包括：
统计斑马鱼死亡数量；
测量斑马鱼幼鱼肝区灰度值；
测定斑马鱼幼鱼中的ROS含量；
测定斑马鱼幼鱼中的ALT、AST含量。
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